L-carnitina e ácidos graxos ômega-3 previnem danos meióticos em oócitos bovinos maturados >i/i< com fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose

GIORGI, Vanessa Silvestre Innocenti. L-carnitine and omega-3 fatty acids prevent meiotic damages in bovine oocytes matured in vitro with follicular fluid from infertile women with endometriosis. Thesis (Doctoral Degree in Medical Sciences) – Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil, 2018. In the present study, we evaluated the impact of the addition o f follicular fluid (FF) from infertile women without and with endometriosis in the early (I/II) and advanced stages [(III/IV) with and without endometrioma ] to the in vitro maturation (IVM) medium on the meiotic normality rates of bovine oocytes. We evalua ted whether L-carnitine (LC) and omega-3 fatty acids [n3, docosahexaenoic (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA)] were able to prevent bovine meiotic oocyte damage induced by FF from infertile women with endometriosis in stages I/II and III/IV during IVM. For this, we performed an experimental study using bovine model. Thirty-two FF samples were collected from 24 infertile women with endometriosis (8 with I/II, 8 with III/IV without endometrioma and 8 III/IV with endometrioma in the cycle) and 8 without endo metriosis (control) who underwent to controlled ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature cumulus oocytes complexes(COCs) of bovines were submitted to IVM divided into 9 groups: without FF (No-FF), with 1% FF of infertile women wit hout endometriosis (FFControl) and with endometriosis (FFEI/II, FFEIII/IV and FFEendometrioma) supplemented or not with LC (0.6 mg/mL) and omega-3 fatty acids (0.4 nM DHA and 0.6 nM EPA) (FFControl+LC+n3, FFEI/II+LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 and FFEendometrioma+LC+n3). After 22 -24h of IVM, the oocytes were denuded, fixed and stored for subsequent immunofluorescence to visualize the meiotic spindle and chromosomes by confocal microscopy. The metaphase II (MII) and normal MII rates were compared between the 9 group s using the chi -square test (p <0.05). A total of 1686 immature COCs were submitted to IVM, and 1401 oocytes were visualized by confocal microscopy. Addition of FF from women with endometriosis to the IVM medium decreased the rate of normal MII (FFEI/II: 6 2.2%, FFEIII/IV: 70.2% and FFEendometrioma: 72.7%) compared to the No-FF (87.2%) and FFControl (87.2%) groups. The FFEendometrioma group (69.3%) presented the lowest rate of MII compared to all other groups ( No-FF: 91.9%, FFControl: 89.2%, FFControl+L C+n3: 89.2%, FFEI/II: 85.4%, FFEI/II+LC+n3: 85.3%, FFEIII/IV: 80.7%, FFEIII/IV+LC+n3: 90.8%, FFEndometrioma+L C+n3: 86.4%). The FFEIII/IV group had a lower MII rate compared to the No-FF group. In the group with FFControl, the addition of LC+n3 did not change th e rates of MII (89.2% vs 89.2%) and normal MII (87.2% vs 82.5%). In the FFEI/II group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (84.5% vs 62.2%). In the FFEIII/IV group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (70.2% vs 84.1%) and MII (90.8%), which was similar to that of the No-FF and FFControl. In the FFEendometrioma group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate ( 69.3% vs 86.4%) which was similar to No-FF and FFControl groups. Therefore, the FF of women with endometriosis impairs the meiotic spindle and the chromosomal alignment of bovine oocytes, regardless of the stage of the disease. However, the progression of endometriosis and the presence of endometrioma appear to have an even more negative impact on oocyte quality , and also impairs nuclear maturation. The addition of LC+ n3 prevents meiotic oocyte damages induced by FF from women with endometriosis in the early and advanced stages. Thus, we suggest that inflammation, oxidative stress and deregulation of β -oxidation are factors involved in the alteration of oocyte quality and, consequently, worsening of the natural fertility of women with endometriosis.

Endometriosis. Female i nfertility. Follicular fluid. Oocyte quality. L -carnitine. Omega-3. Docosahexaenoic acid. Eicosapentaenoic acid. Antioxidant. β-oxidation. LISTA DE FIGURAS Figura 1: β-oxidação mitocondrial de ácidos graxos e sua regulação.............................. 42 Figura 2: Estrutura química da molécula de L -carnitina (nome IUPAC: 3 -Hidroxi-4- trimetilamonio-butanoato; fórmula molecular: C7H15NO3; massa molar: 161,199 g/mol)................................................................................................................................ 44 Figura 3: Estrutura química das moléculas de ácidos graxos ômega -3: A -) Ácido eicosapentaenoico (EPA) e B-) Ácido docosahexaenóico (DHA)..................................... 47 Figura 4: Vias metabólicas de síntese de ácidos graxos ômega-3 e ômega-6................. 48 Figura 5: Síntese e ações de mediadores lipídicos produzidos a partir dos ácidos araquidônico (AA), eicosapentaenoico (EPA) e docosahexaenóico (DHA)...................... 48 Figura 6: Estágios de maturação nuclear de oócitos bovinos maturados in vitro e analisados por microscopia confocal. A -) Metáfase I; B) Telófase I; C -) Metáfase II; D -) Ativação Partenogenética(TelófaseII).............................................................................................. 61 Figura 7: Posição de visualização do fuso meiótico de oócitos bovinos em metáfase II maturados in vitro e visualizados por microscopia confocal. A -) Polar (fuso não ana lisável), B-)Sagital(analisável)........................................................................................................ 62 Figura 8: Classificação de oócitos bovinos maturados in vitro, em metáfase II analisáveis, de acordo com a organizaç ão do fuso meiótico e alinhamento cromossômico analisados por microscopia confocal. A -), B -) e C -) representam anormais e D -) normal............................................................................................................................... 63 Figura 9: Desenho experimental............................................................................ ............65 Figura 10: Fluxograma ilustrando recrutamento, inclusão e seguimento de mulheres inférteis doadoras de fluido folicular............................................................................................... 69 Figura 11: Alterações meióticas oocitárias mais significativas encontradas em cada grupo: A- ) Metáfase II normal no grupo FFControle; B -) Metáfase I no grupo FFEendometrioma; C-) a F-) Metáfase II anormal nos grupos FFEI/II, FFEIII/IV, FFEendometrioma e FFEendometioma+LC+n3, respectivamente ....................................................................74 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Variáveis clínicas e r esposta à estimulação ovariana controlada das mulheres inférteis doadoras de fluido folicular sem endometriose (controle), com endometriose em estágios iniciais (EI/II) e em estágios avançados sem endometrioma (EIII/IV) e com endometrioma (Eendometrioma)........................................................................................................70 Tabela 2: Estágios de maturação nuclear, e porcentagem de oócitos em MII normais maturados in vitro em meio sem adição de FF (sem-FF), com adição de 1% de FF de pacientes inférteis sem endometriose (FFControle), com endometriose leve (FFEI/II), com endometriose moderada/grave sem endometrioma (FFEIII/IV) ou com endometriose moderada/grave com endometrioma (FFEndometrioma), suplementado com 0,6mg/mL de L -Carnitina, 0,4 nM de ácido docosahexaenóico e 0,6 nM de ácido eicosapentaenóico (LC+n3) visualizados por microscopia confocal......................................................................................................................73 LISTA DE ABREVIATURAS 8OHdG 8-hidróxi-2'-deoxiguanosina AA Ácido Araquidônico ACO Anticoncepcional Combinado Oral ADP Adenosina Difosfato AL Ácido Linoléico ALA Ácido α-linolênico AP Ativação Partenogenética ASRM Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva ATP Adenosina Trifosfato CAT Capacidade Antioxidante Total CCO Complexo Cumulus Oócito CFA Contagem de Folículos Antrais CoA Coenzima A COX-2 Cicloxigenase-2 CP Corpúsculo Polar CPT1 Carnitina Palmitoil Transferase I CPT2 Carnitina Palmitoil Transferase II DGLA Ácido di-homo-γ-linolênico DHA Ácido Docosahexaenóico DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido Desoxirribonucléico DPA Ácido Docosapentaenóico EO Estresse Oxidativo EOC Estimulação Ovariana Controlada EPA Ácido Eicosapentaenóico ERO Espécie Reativa do Oxigênio ETA Ácido Eicosatetraenóico FF Fluido Folicular FITC Isotiocianato de fluoresceína FIV Fertilização in vitro FMRP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto FOX1 Total de Hidroperóxidos FSH Hormônio Folículo Estimulante GLA Ácido γ-linolênico GnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas GSH Glutationa Reduzida HC Hospital das Clínicas hCG Gonadotrofina Coriônica Humana HIV Vírus da Imunodeficiência Humana ICSI Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoide IMC Índice de Massa Corpórea LC L-carnitina LOX Lipoxigenase LT Leucotrieno MDA Malondialdeído MI Metáfase I MII Metáfase II MIV Maturação in vitro NAC N-acetil-cisteína OCTN Transportador Catônico Orgânico PBS Tampão Fosfato Salino PG Prostaglandina PUFA Ácido Graxo Poli-insaturado RNA Ácido Ribonucleico RT-PCR Reação quantitativa em cadeia da polimerase SBF Soro Bovino Fetal SDA Ácido Estearidônico SOD Superóxido Dismutase TCA Ciclo do Ácido Tricarboxílico THA Ácido Tetracosahexaenóico TI Telófase I TPA Ácido Tetracosapentaenóico TRA Técnicas de Reprodução Assistida VLPSC Videolaparoscopia USP Universidade de São Paulo SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 27 2. REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................... 33 2.1. Endometriose, estresse oxidativo e infertilidade ................................. 34 2.2. Fluido Folicular ........................................................................................ 37 2.3. Competência oocitária e fuso meiótico ................................................. 39 2.4. β-oxidação e qualidade oocitária ........................................................... 41 2.5. L-carnitina ................................................................................................ 44 2.6. Ácidos graxos ômega-3 .......................................................................... 46 3. OBJETIVOS ................................................................................................. 50 3.1. Objetivo geral .......................................................................................... 51 3.2. Objetivos específicos.............................................................................. 51 4. MATERIAS E MÉTODOS ............................................................................ 52 4.1. Seleção de pacientes doadoras de fluido folicular .............................. 53 4.1.1.Critérios de inclusão ................................................................................ 53 4.2. Captação oocitária, coleta e processamento de amostras de fluido folicular.............................................................................................................54 4.3. Estimulação Ovariana Controlada ......................................................... 55 4.4. Coleta de ovários bovinos, recuperação e classificação dos complexos cumulus-oócito... ............................................................................................ 56 4.5. Maturação in vitro ................................................................................... 56 4.6. Preparo das soluções de L-carnitina e dos ácidos graxos ômega-3 .. 58 4.6.1 L-carnitina.................................................................................................58 4.6.2 Ácidos graxos ômega-3............................................................................58 4.7. Imunofluorescência para visualização de microtúbulos e cromossomos..................................................................................................59 4.8. Classificação oocitária baseada na morfologia do fuso meiótico e no alinhamento cromossômico por microscopia confocal...............................59 4.9. Obtenção da variável primária.................................................................63 4.10. Obtenção de variáveis secundárias......................................................64 4.11.Obtenção das variáveis clínicas secundárias.......................................64 4.12. Desenho experimental............................................................................65 4.13.Análise estatística....................................................................................65 4.14. Cálculo Amostral.....................................................................................66 5. RESULTADOS ......................................................................................... ....67 5.1. Recrutamento de pacientes doadoras de FF ........................................ 68 5.2. Dados clínicos doadoras de FF...............................................................69 5.3. Maturação in vitro e microscopia confocal............................................70 6. DISCUSSÃO..................................................................................................75 7. CONCLUSÕES ............................................................................................ 83 BIBLIOGRAFIA ............................................................................................... 85 APÊNDICE A: Caracterização das pacientes doadoras de fluidos foliculares utilizados em cada replicata de maturação in vitro de oócitos bovinos............102 APÊNDICE B: Dados de estágios de maturação nuclear, e porcentagem de oócitos em MII normais de acordo com as oito replicatas de maturação in vitro de oócitos bovinos realizadas............................................................................................103 MANUSCRITO ...................................................................................... .........104 27 1. INTRODUÇÃO 28 A e ndometriose é uma doença ginecológica, inflamatória e estrógeno dependente, caracterizada pela presença e pelo crescimento de tecido endometrial (glândulas e estroma) fora da cavidade uterina (KENNEDY et al., 2005). Dor pélvica, dismenorreia, dispa reunia e infertilidade são alguns dos sintomas frequentes da endometriose que, por outro lado, pode ser assintomática (KENNEDY et al., 2005; BELLELIS et al., 2010; SINGH et al., 2014). Estudos populacionais estimam uma prevalência de 0,8 -6% de endometriose na população global (MOEN; SCHEI , 1997; ABBAS et al. , 2012; FULDEORE; SOLIMAN, 2017). Entretanto, a prevalência da endometriose aumenta para 25 -50% na população de mulheres inférteis, e entre as mu lheres com endometriose, aproximadamente, 30 -50% apresentam problemas com infertilidade (MISSMER et al., 2004) . Um estudo avaliando uma grande coorte de mulheres em idade reprodutiva (<35 anos), reportou um risco de infertilidade duas vezes maior em mulheres com endometriose comparado àquelas mulheres sem a doença (MEULEMAN et al., 2009). Entretanto, a endometriose é uma doe nça heterogênea com lesões peritoneais variando de um simples implante peritoneal superficial de 1 mm até a presença de grandes endometriomas e obliteração do fundo de saco de Douglas (ASRM, 1997), e ainda mais raro, endometriose fora da cavidade pélvica (CHAMIÉ et al. , 2018) . A Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) , visando padronizar os estágios da endometriose, propôs um sistema de classificação baseado na localização (peritônio, ovários), tamanho e profundidade das lesões de endometriose, presença de obliteração do fundo de saco de Douglas e presença e tipos de ade rências afetando ovários e tubas uterinas (ASRM, 1997) . Uma pontuação é designada para cada tipo de achado, e então, a endometriose é classificada como mínima (estágio I – pontuação de 1 -5), leve (estágio II – pontuação de 6-15), moderada (estágio III – pontuação de 16-40) e grave (estágio IV – pontuação de >40) (ASRM, 1997). Fica claro que mulheres que apresentam estágios mais avançados da endometriose (III/IV) podem apresentar um comprometimento anatômico da cavidade pélvica dificulta ndo a ovulação, a captação do óvulo pelas f ímbrias das tubas uterinas, a fertilização, o transporte tubário do embrião e, possivelmente, a implantação embrionária (DE ZIEGLER ; BORGHESE; CHAPRON, 2010), justificando a infertilidade. 29 Estudo utilizando modelo primata não -humano (babuínos), avaliou o impacto dos quatro estágios de endometrios e sobre a fertilidade natural após acasalamentos ao longo de vários ciclos sexuais (D'HOOGHE et al., 1996) e reportaram que a taxa de fecundidade por ciclo foi maior nas fêmeas livres de endometriose (controle) e com EI (22%) comparado ao grupo de fêmeas com EII, EIII e EIV (12%) (D'HOOGHE et al. , 1996) . O grupo controle e EI apresentaram maior taxa de gestação por ciclo (19% e 24,4%, respectivamente) do que os grupos EII (9,6%), EIII (7,5%) e EIV (12,5%) (D'HOOGHE et al., 1996). Esses dados sugerem que o avanço da endometriose apresenta impacto negativo sobre a fertilidade natural. A presença de endometrioma também parece prejudicar a fertilidade feminina. O e ndometrioma é considerado um “pseudocisto” formado, na maioria dos casos, pela invaginação do córtex ovariano (BROSENS et al., 2013). Cerca de 20-40% das mulheres com endometriose apresentam endometrioma (REDWINE, 1999; VERCELLINI et al. , 2003) , que pode criar um ambiente citotóxic o ao desenvolvimento folicular (PAFFONI et al., 2018), diminuindo o número de folículos maduros no cór tex ovariano adjacente (MANESCHI et al. , 1993; KITAJIMA et al. , 2011). Entretanto, mesmo nos estágios iniciais da doença (I/II) , quando não se observa um comprometimento anatômico da cavidade pélvica, já é observad a uma diminuição da taxa da fecundidade mensal comparada com mulheres inférteis sem causa aparente (BÉRUBÉ et al., 1998; PARAZZINI, 1999) evidenciando uma relação causal entre infertilidade e endometriose mesmo nos estágios iniciais. É no ambiente folicular que ocorre a maturação e o desenvolvimento oocitário. O estresse oxidativo ( EO) presente no ambiente peritoneal de mulheres com endometriose pode refletir no compartimento sistêmico do organismo e afetar o ambiente folicular, comprometendo a qualidade oocitária e, consequentemente, o potencial reprodutivo dessas pacientes (DA BROI; NAVARRO , 2016). O EO ocorre quando há um desequilíbrio entre espéci es reativas e antioxidantes. Espécies reativas do oxigênio (EROs) são produtos intermediários do metabolismo celular normal (LOUSSE et al., 2012). Para se auto protegerem dos efeitos deletérios d as EROs, as células desenvolveram um sistema antioxidante para limitar e inativar as EROs, além de reparar os danos oxidativos estabelecidos (LOUSSE et al., 2012). O EO pode danificar diversas proteínas intracelulares (STADTMAN, 1992; BERLETT; STADTMAN , 1997) importantes para a organização do fuso celular 30 (ANTONIO et al., 2000; FUNABIKI; MURRAY, 2000; ABRIEU et al., 2001) podendo promover lesões no material genético e induzir o inadequado alinhamento cromossômico (BECKMAN; AMES , 1998; LIMOLI et al. , 1998) . As anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência do desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do oócito em completar a maturação, tornando-se incapaz de ser fertilizado, até a ocorrência de erros que não impossibilitem a fertilização, mas comprometam o desenvolvimento embrionário pré e/ou pós -implantação, bem como a viabilidade futura do concepto (PAVLOK; LUCAS-HAHN; NIEMANN, 1992; LONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001). Programas de doação de óvulos indicam que a qualidade oocitária é um fator relevante no sucesso das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA) em mulheres com endometriose (GARCIA-VELASCO; ARICI , 1999; GARRIDO et al. , 2000) . Simón e colaboradores (1994) observ aram taxas de implantação e de gestação semelhantes em mulheres com e sem endometriose que receberam oócitos de doadoras sem a doença (SIMÓN et al., 1994). Entretanto, as taxas de implantação foram menores em mulheres sem a doença que receberam oócitos de mulheres com endometriose (SIMÓN et al., 1994). Oócitos humanos são extremamente raros e seu uso em estudos invasivos geralmente não é viável porque impede sua utilização nas TRA. Desta forma, estudos avaliando células do cumulus ou fluido folicular ( FF) podem auxiliar no entendimento da aquisição da competência oocitária (DA BROI et al., 2018a). Estudo prévio de nosso grupo reportou que a adição de FF de mulheres inférteis com endometriose leve ao meio de maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos compromete a qualidade dos ó vulos bovinos (avaliada por meio do alinhamento cromossômico e organização do fuso meiótico ) quando comparado à adição de FF de mulheres inférteis sem endometriose (DA BROI et al. , 2014). Os antioxidantes L -carnitina (LC) e N -acetil-cisteína (NAC) preveniram esses danos meióticos oocitários , indicando que o EO está envolvido na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose , entretanto, a LC foi superior à NAC e preveniu completamente esses danos (GIORGI et al., 2016). A LC, além de sua função antioxidante, apresenta papel fundamental na geração de energia pela célula, pois sua principal função biológica é transportar ácidos graxos de cadeia longa do citosol para as mitocôndrias onde ocorre a β - oxidação, um processo qu e resulta na esterificação da LC para formar derivados de 31 acil-Carnitina, produzindo energia na forma de adenosina trifosfato ( ATP) (EVANS; FORNASINI, 2003). A ꞵ-oxidação é essencial para a retomada da meiose oocitária e maturação nuclear em camundongos (DOWNS; MOSEY; KLINGER , 2009; PACZKOWSKI et al. , 2013; VALSANGKAR; DOWNS , 2013) , suínos e bovinos (PACZKOWSKI et al., 2013). Ácidos graxos podem ser captados do FF pelas células da granulosa ou estarem armazenados intracelularmente no oócito em gotas lipídicas na forma de triacilglicerídeos e em fosfolipídios de membrana (DUNNING; RUSSEL; ROBKER , 2014), sendo que a oxidação de uma molécula de ácido graxo (ácido palmítico) gera, aproximadamente, 106 ATPs comparado aos 30 ATPs gerados pela oxidação de uma molécula de glicose ( DUNNING; RUSSEL; ROBKER, 2014). Apesar de resultados conflitantes (CHAVARRO et al., 2007; CHAVARRO et al., 2007; WAKEFIELD et al., 2008; JUNGHEIM et al., 2011), estudos em animais e humanos sugerem que uma dieta rica em ácidos graxos ômega -3 tem um impacto positivo na fertilidade, possivelmente devido a efeitos sobre a qualidade oocitária e a implantação embrionária (HAMMICHE et al., 2011; NEHRA et al., 2012; MORAN et al., 2016). Estudo utilizando indução de endometriose em modelo murino, observou que a administração de ômega-3 previne a formação de lesões cística s de endometriose peritoneal (TOMIO et al., 2013). E estudo in vitro, sugeriu que ômega- 3 suprime a sobrevivência de células de lesão de endometriose, possivelmente por controlar o EO e a inflamação (GAZVANI et al., 2001) . Dois importantes ácidos graxos ômega-3 são: o ácido docosahexaenóico (DHA) e o ácido eicosapentaenóico (EPA). Há dois estudos avaliando a adição de ômega -3 ao meio de MIV de oócitos bovinos (OSEIKRIA et al., 2016; NIKOLOFF et al., 2017). Oseikria e colaboradores (2016) mostraram que, em baixas concentrações , DHA aument a a competência oocitária avaliada pelo aumento das taxas de clivagem e de formação de blastocistos após ativação partenogenética. Nikoloff e colaboradores (2017) mostraram que a adição de EPA melhora a qualidade oocitária observada pelo aumento da expansão das células do cumulus. Não há na literatura estudos avaliando o impacto do estágio da endometriose sobre a qualidade oocitária e a po ssível prevenção de danos oocitários com a administração combinada de LC, DHA e EPA. 32 Dessa forma, hipotetizamos que: I-) os estágios avançados da endometriose (III/IV) têm impacto mais negativo sobre a qualidade oocitária do que os estágios iniciais (I/II) da doença; II-) em mulheres com endometriose em estágios avançados (III/IV), a presença de endometrioma no ciclo prejudica a inda mais a qualidade oocitária; e III-) LC e ácidos graxos ômega -3 previnem danos meióticos oocitários em mulheres inférteis com endometriose; 33 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 34 2.1. Endometriose, estresse oxidativo e infertilidade A endometriose , como já mencionado anteriormente, é definida como a presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina e pode ser assintomática ou estar associada à dor (que manifesta -se como dismenorreia, dispareunia profunda, disque sia e disúria) e à infertilidade (KENNEDY et al. , 2005) . É uma doença conhecida como estrógeno dependente visto que, em geral, a endometriose manifesta-se durante os anos reprodutivos da mulher (com um pico entre 25 e 35 anos) (PARAZZINI et al., 2017). Em meados de 1800, endometriose p eritoneal, extraperitoneal, infiltração profunda, endometrioma ovariano e adenomiose foram agrupados sob o nome "adenomioma" (BENAGIANO; BROSENS , 201 1). Somente na década de 1920 a adenomiose e a endometriose tornaram -se entidades separadas (BENAGIANO; BROSENS; LIPPI , 2014) . Em 1925, Sampson criou o termo “endometriose” para relatar a presença de ilhas de mucosa uterina na cavidade peritoneal (BENAGIANO; BROSENS, 2006). Há controvérsias sobre a origem dos tipos de endometriose (NISOLLE; DONNEZ, 1997), e portanto, são inúmeras as teorias que tentam explicar a origem da doença. A teoria da metaplasia celômica propõe que células mesoteliais celômicas do tecido peritoneal normal ou da superfície ovar iana sofram metaplasia e se transform em em tecido endometrial ectópico (IWANOFF, 1898) . As teorias dos remanescentes embrionários dos ductos de Muller, propõem que células embrionárias provenientes desses ductos embrionários, quando ativadas por algum mecanismo desconhecido, originam células seme lhantes às do endométrio original (VON RECKLINGHAUSEN, 1895; RUSSELL, 1899). A teoria da metástase benigna explica a endometriose a p artir da disseminação linfática e/ou venosa de células endometriais (HALBAN, 1924; SAMPSON, 1927). E ainda u ma outra teoria propõe que células tronco originadas da medula óssea se diferenciam em células endometriais (SASSON; TAYLOR, 2008). Sampson é o autor da teoria, atualmente, mais bem aceita s obre a etiopatogênese da endometriose, a teoria da menstruação retrógrada e implantação (SAMPSON, 1927). Essa teoria postula que células provenientes da descamação do endométrio, durante a menstruação , sofrem um refluxo pelas tubas uterinas até a cavidade pélvica onde se estabilizam e sobrevivem (SAMPSON, 1927). No entanto, 35 menstruação retrógrada acomete a maior ia das mulheres com tubas pérvias, mas a endometriose se desenvolve somente em 10 -15% delas (LOUSSE et al. , 2012) , enfatizando o papel de outros fatores n a patogênese da endometriose (BURNEY; GIUDICE, 2012). Também são várias as teorias que tentam explicar a formação do endometrioma. Uma delas postula que células endo metriais da parede pélvica se aderem à superfície do ovário, o córtex ovariano invagina e o fluido de cor “chocolate” típico é formado pelo acúmulo de restos menstruais resultantes do sangramento dos implantes de endometriose ativos (VIGANÒ et al. , 2013) . Uma segunda teoria postula que devido aos implantes endometriais, o ovário adere ao ligamento largo, essa aderência induz inflamação que leva a ovulação nesse local, e então, as células endometriais invadem o corpo lúteo recém -formado constituindo um pseudo-cisto (VERCELLINI et al., 2009). E ainda, uma outra teoria apoia a teoria da metaplasia celômica e diz que o mesotélio do ovário se invaginaria no córtex ovariano e que a metaplasia dessas células originariam o endometrioma (DONNEZ et al., 1996). O conteúdo presente no interior do endometrioma é caracterizado por um acúmulo de ferro e seus derivados, tornando o ambiente tóxico e hostil à foliculogênese (SANCHEZ et al., 2014). Através da reação de Fenton, o ferro livre pode gerar EROs provocando danos a macromoléculas essenciais [ácido desoxirribonucleico (DNA) , proteínas e lipídios ] para o funcionamento celular (JOMOVA; VALKO, 2011) e qualidade oocitária. Independentemente do tipo de lesão e da origem das células endometriais ectópicas, alguns mecanismos parecem contribuir para o desenvolvimento da doença, como: número e quantidade de fluxos menstrua is, alterações da sinalização do estrogênio, resistência a progesterona, inflamação exacerbada e EO (BURNEY; GIUDICE, 2012; VERCELLINI et al. , 2014; DONNEZ et al. , 2016; PATEL et al. , 2018). Em mulheres, com endomet riose há um aumento da ativação de macrófagos na cavidade peritoneal (GAZVANI; TEMPLETON , 2002) , gerando um ambiente hostil, que interfere na atividade normal de outras células peritoneais, favorecendo o desenvolvimento de implantes de endometriose (LOUSSE et al. , 2012) e contribuindo para a formação de adesões peritoneais e angiogênese (TANBO; FEDORCSAK, 2017) . Os macrófagos na cavidade peritoneal de mulheres com 36 endometriose acumulam ferro, provavelmente, como resultado da presença excessiva de sangue na pelve (VAN LANGENDONCKT ; CASANAS-ROUX; DONNEZ, 2002) . O ferro livre (não conjugado à proteína s) estimula a geração de EROs, promovendo o EO, que por sua vez favorece a progressão da endometriose via dano peritoneal, exposição do tecido conjuntivo, neoangiogênese e proliferação celular endometrial aumentada (LOUSSE et al., 2012; VERCELLINI et al., 2014). Estudos sugerem que EO esteja relacionado com a patogênese da infertilidade relacionada à endometriose (AGARWAL; GUPTA; SHARMA , 2005; DA BROI; NAVARRO, 2016; SCUTIERO et al., 2017). No soro, mulheres inférteis com endometriose apresentam diminuição da atividade da superóxido dismutase (SOD) (PRIETO et al. , 2012) e da capacidade antioxidante total ( CAT) (DA BROI et al. , 2016; NASIRI et al. , 2017; DA BROI et al. , 2018 b), e aumento dos níveis de malondialdeído (MDA) (NASIRI et al., 2017) e de total de hidroperóxidos (FOX1) (DA BROI et al., 2018b) comparado a mulheres sem a doença. E no FF, há um aumento de peróxidos lipídicos (NASIRI et al., 2017), EROs, MDA, óxido nítrico (SINGH et al., 2013b) e de 8 -hidroxi-2’-deoxiguanosina (8OHdG) (DA BROI et al., 2016; DA BROI et al., 2018b), e uma diminuição da CAT, SOD, da catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e vitaminas A, C e E (PRIETO et al., 2012; SINGH et al., 2013b; NASIRI et al., 2017) comparado a mulheres sem a doença. Alterações do ambiente folicular pelo EO na endometriose podem prejudicar a qualidade oocitária por causar danos diretos ao DNA (DA BROI et al. , 2016) , prejudicar a organização do fuso meiótico (DA BROI et al., 2014; GOUD et al., 2014) e o funcionamento mitocondrial (XU et al. , 2015) , e ainda alterar a zona pelúcida (GOUD et al., 2014). 37 2.2. Fluido Folicular O FF é uma solução ligeiramente viscosa, cor de palha e de pH próximo a 7,0 encontrado no interior de folículos ovarianos a partir da fase antral inicial entre as camadas das células da granulosa (EDWARDS, 1974). Essa solução é derivada do plasma sanguíneo e de produtos secretados pelo o ócito, células da granulosa e da teca (RODGERS; IRVING-RODGERS, 2010). Através da rede de capilares tecais, o plasma sanguíneo forma um exsudato entre as camadas de células da granulosa, por isso a semelhança na composição do FF e plasma (RODGERS; IRVING-RODGERS, 2010). Com relação a componentes de baixo peso molecular, o FF e plasma são extremamente semelhantes, entretanto, eles diferem com relação a proteínas de tamanho maior que 100kDa, sendo estas menos concentradas no FF (GOSDEN et al., 1988). Isso acontece, pois a barreira hemato-folicular, localizada na lâmina basal do folíc ulo e nos capilares tecais, impede a passagem de compostos maiores que 100kDa do plasma para o FF (SHALGI et al. , 1973; ZHOU et al. , 2007) . Essa barreira também dificulta a passagem de grandes moléculas produzidas p elo oócito e células da granulosa do FF para o sangue, estabilizando assim um potencial gradiente osmótico (RODGERS; IRVING-RODGERS, 2010) , que possibi lita o crescimento do folículo ovariano humano até 23 mm podendo apresentar até 5 mL de FF (BÄCHLER et al., 2014). A composição do FF varia de acordo com o crescimento folicular e reflete processos fisiológicos e patológicos (EDWARDS, 1974) , sendo considerado um instrumento para determinaç ão de biomarcadores da qualidade oocitária (REVELLI et al., 2009; DUMESIC et al., 2015) . O FF também controla o fim da meiose (SIRARD; RICHARD; MAYES , 1998) , e auxilia na atração (EISENBACH, 1999) , motilidade (MBIZVO; BURKMAN; ALEXANDER , 1990) e reação acrossômica (DE JONGE et al., 1993) dos espermatozoides. Alguns estudos reportam alterações em marcadores inflamatórios (XU et al., 2006; FALCONER et al., 2009; LAMAITA et al., 2012; WANG et al., 2012; SINGH et al., 2013a; CHOI et al. , 2015; SINGH et al. , 2016; SANTANAM, ZONERAICH; PARTHASARATHY, 2017; WU et al. , 2017; ZHANG et al. , 2017) , hormonais (PELLICER et al., 1998; SMITH et al., 2002; WUNDER et al., 2005; FALCONER et al., 2009) e relacionados ao EO (PRIETO et al., 2012; LIU et al., 2013; SINGH et al., 2013b; CHOI et al., 2015; DA BROI et al., 2016; DE LIMA et al., 2017; NASIRI et al., 38 2017; DA BROI et al. , 2018b) no FF de mulheres com endometriose comparado àquelas mulheres sem a doença. Outros estudos comparam a composição do FF de mulheres com endometriose em estágios iniciais versus endometriose avançada (PELLICER et al. , 1998; CUNHA-FILHO et al. , 2003; SANTANAM, ZONERAICH; PARTHASARATHY, 2017; ZHANG et al., 2017). E, também há estudos avaliando o impacto da presença de endometrioma na composição do FF de mulheres com endometrioma unilateral (OPØIEN et al., 2013; SANCHEZ; PAPALEO, et al. , 2014; BENAGLIA et al., 2015; NAKAGAWA et al., 2016; GIACOMINI et al., 2017). 39 2.3. Competência oocitária e fuso meiótico celular O fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II (MII) é uma e strutura em forma de barril, temporária e dinâmica, composta por microtúbulos formados por dímeros de tubulina que se polimerizam e despolimerizam nos diversos estágios do ciclo celular (CHOI et al. , 2007) e associada ao córtex oocitário e sua rede de microfilamentos subcorticais (KIM et al. , 1998; WANG; KEEFE , 2002; MANDELBAUM et al. , 2004) , sendo essencial para garantir a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose (VOLARCIK et al. , 1998; VAN BLERKOM; DAVIS, 2001; DE SANTIS et al., 2005). Desta forma, a fecundação e o desenvolvimento embrionário dependem da integridade morfológica e funcional desta estrutura celular. Além disso, o fuso é extremamente sensível à ação de diversos fatores (HU et al., 2001; EICHENLAUB-RITTER; SHEN; TINNEBERG, 2002; MULLEN et al., 2004), entre os quais o EO, passível de promover anomalias meióticas, instabilidade cromossômica, aumento da apoptose e comprometimento do desenvolvimento embrionário pré -implantação (LIU et al. , 2003; NAVARRO; LIU; KEEFE, 2004; NAVARRO et al., 2006). Estudos avaliando os potenciais mecanismos envolvidos na gênese das alterações do fuso celular relacionadas ao EO, evi denciaram que o mesmo pode danificar diversas proteínas intracelulares (STADTMAN, 1992; BERLETT; STADTMAN, 1997), algumas das quais, importantes para a organização do fuso celular (ANTONIO et al., 2000; FUNABIKI; MURRAY, 2000; ABRIEU et al., 2001) podendo promover lesões no DNA e induzir o inadequado alinhamento cromossômico (BECKMAN; AMES, 1998; LIMOLI et al., 1998). As anomalias meiót icas podem, por sua vez, contribuir para a falência do desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do oócito em completar a maturação, tornando -se incapaz de ser fertilizado, até a ocorrência de erros que não impossibil item a fertilização, mas comprometam o desenvolvimento embrionário pré e/ou pós -implantação, bem como a viabilidade futura do concepto ( PAVLOK; LUCAS-HAHN; NIEMANN, 1992; LONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001; MIAO et al., 2018). Um estudo de Mansour e colaboradores (2009) demonstrou que o fluido peritoneal de mulheres com endometriose pode promover anomalias nos microtúbulos e cromossomos de oócitos de camundongos, além de aumento da 40 apoptose embrionária (MANSOUR et al. , 2009) . Estas anomalias foram reduzidas após suplementação do meio de cultivo com LC, um antioxidante, sugerindo que substâncias presentes no fluido peritoneal de portadoras desta doença promovem comprometimento da qualidade oocitária e embrionária, tendo o EO como provável mediador (MANSOUR et al., 2009). Estudos evidenciaram que o FF de pacientes com endometriose apresenta aumento dos níveis de espécies reativas e di minuição da CAT (PRIETO et al., 2012; SINGH et al. , 2013b) . O aumento de EROs no FF pode afetar a qualidade e o desenvolvimento embrionário (DAS et al., 2006; YALÇINKAYA et al., 2013). Estudos de nosso grupo mostraram que o FF de mulheres inférteis com endometriose leve compromete expressivamente o fuso meiótico de oócitos bovinos maturados in vitro, mesmo na menor concentração testada (1%) (DA BROI et al., 2014; GIORGI et al., 2016); sendo o EO um fator envolvido , visto que a adição de antioxidantes preveniram esses danos, ao menos parcialmente (GIORGI et al., 2016). 41 2.4. β-oxidação e qualidade oocitária Qualidade oocitária pode ser definida como a competência do oócito retomar a meiose (quebra da vesícula germinativa) atingindo o estágio de MII, acumular ácidos ribonucleicos (RNAs), proteínas, lipídios e reorganizar as or ganelas de seu citoplasma, ou seja, ter condições para ser fertilizado por um espermatozoide e ter recursos suficientes para prover o desenvolvimento embrionário até a implantação. Durante a maturação oocitária, o oócito cresce e gradualmente adquire competência de ser fertilizado e de se desenvolver em um embrião e, subsequentemente, um feto (DUNNING et al. , 2010) . Qualidade oocitária e competência de desenvolvimento estão intimamente associadas com metabolismo e taxa metabólica do complexo cumulus oócito (CCO) (BIGGERS, WHITTINGHAM, DONAHUE, 1967; DOWNS; HUNZICKER -DUNN, 1995; SUGIURA; PENDOLA; EPPIG, 2005; PREIS; SEIDEL; GARDNER, 2007; THOMPSON; LANE; GILCHRIST, 2007). Lipídios são potenciais recursos de ATP através da ꞵ -oxidação de ácidos graxos nas mitocôndrias (DUNNING et al., 2010), sendo que a oxidação de um ácido palmítico (C16H32O2) gera 106 ATP s e de uma glicose (C6H12O6) gera, aproximadamente, 30 ATPs ( DUNNING; RUSSEL; ROBKER, et al., 2014). No FF, os ácidos grax os podem estar livres (ligados ou não a proteínas) ou estarem no interior de lipoproteínas. Dessa forma, os ácidos graxos presentes no FF podem entrar no CCO de duas formas: I -) podem atravessar diretamente a bicamada lipídica; ou II-) podem ser carreados por uma proteína transportadora que ativa receptores específicos na membrana plasmática permitindo a entrada no interior da célula (células da granulosa e/ou oócito) (DUNNING; RUSSEL; ROBKER, et al., 2014). Além das fontes extracelulares, ácidos graxos na forma de triacilglicerol podem ser armazenados em membranas celulares e no interior das células do cumulus e oócitos em gotas lipídicas no citosol ( DUNNING; RUSSEL; ROBKER et al., 2014) . Essas gotas lipídicas são circundad as por uma monocamada de fosfolipídios coberta por uma capa de proteínas da família perilipina (que regula o tamanho das gotas e que limita a ação de lipases) permitindo a atividade lipolítica mediante condições metabólicas e hormonais ( DUNNING; RUSSEL; ROBKER et al., 2014). 42 A primeira etapa para ocorrer a ꞵ -oxidação é a entrada de ácidos graxos na matriz mitocondrial (local onde se encontram as enzimas específicas para essa via metabólica), entretanto, ácidos graxos de cadeia longa presentes no citosol não conseguem atravessar a membrana mitocondrial (SCHULZ, 1991). Portanto, esses compostos são ativados pela enzima acil -Coenzima A(CoA) sintetase, gerando acil - CoA (FRITZ; MARQUIS, 1965; SCHULZ, 1991; EVANS; FORNASINI, 2003). Então, acil-carnitina é formada a partir da transesterificação d e acil-CoA e pela enzima carnitina palmitoil transferase I (CPT1) presente na membrana exter na da mitocôndria (FRITZ; MARQUIS, 1965; SCHULZ, 1991; EVANS; FORNASINI, 2003). A enzima acil-carnitina translocase age transferindo o complexo acil -carnitina para a enzima carnitina palmitoil transferase II (CPT2) , presente na membrana interna da mitocôndria, que então regenera a carnitina e acil -CoA (FRITZ; MARQUIS , 1965; SCHULZ, 1991; EVANS; FORNASINI , 2003) . A acil -Coa entra na β -oxidação gerando ATP (FRITZ; MARQUIS , 1965; SCHULZ, 1991; EVANS; FORNASINI, 2003). A Figura 1 ilustra o processo de β-oxidação mitocondrial. Figura 1: β-oxidação mitocondrial de ácidos graxos e sua regulação O transporte de ácidos graxos de cadeia longa (acil -CoA) para a matriz mitocondrial é catalisada pela CPT1, que requer a presença de carnitina para formar acil -carnitina. Dentro da mitocôndria, a CPT2 restaura a acil -CoA que entra na β -oxidação gerando acetil -CoA que, por sua vez, gera ATP através do TCA e da cadeia transportadora de elétrons. Nota: ADP: Adenosina Difosfato, ATP: Adenosina Trifosfato; CPT1: Carnitina Palmitoil Transferase I; CPT2: Carnitina Palmitoil Tr ansferase II; CoA: Coenzima A; TCA: Ciclo do Ácido Tricarboxílico .. Iimagem adaptada de (DUNNING; ROBKER, 2012). 43 Dunning e colaboradores (2010) avaliaram a ꞵ-oxidação em CCOs através da quantificação de 3H2O no meio de cultivo in vitro gerado a partir da oxidação de [3H]palmitato e pela expressão de mRNA Cptb1 durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionár io in vivo utilizando modelo murino (DUNNING et al. , 2010). O estudo mostrou que a expressão de Cptb1 aumenta seguindo a administração de gonadotrofina coriônica humana ( hCG), que induz a maturação oocitária e a ovulação, e os níveis de 3H2O também aumentam em CCOs maturados in vitro comparados àqueles imaturos (DUNNING et al. , 2010) . A importância do metabolismo de lipídios para a competência oocitária e o desenvolvimento embrionário foi demonstrada pela taxa de desenvolvimento embrionário in vitro utilizando um inibidor (etomoxir - inibe CPT1) ou um ativador (L C) da ꞵ -oxidação (DUNNING et al., 2010). O etomoxir prejudicou o desenvolvimento de blastocistos e a LC ativou a ꞵ-oxidação e melhorou a taxa de formação de blastocistos (DUNNING et al., 2010). 44 2.5. L-carnitina A carnitina é uma amina quaternária (3 -hidroxi-4-N-trimetilamino-butanoato) cuja fórmula molecular é C 7H15NO3 e peso molecular 161,199 g/mol (Figura 2) . A síntese de carnitina no organismo ocorre a partir de dois aminoácidos essenciais, a lisina e a metionina, sendo indispensável a presença de ferro, ácido ascórbico, niacina e vitamina B6 (EVANS; FORNASINI, 2003), e LC também pode ser obtida a partir da alimentação, principalmente, através de carnes vermelhas. Figura 2: Estrutura química da molécula de L -carnitina (nome IUPAC: 3 -Hidroxi-4- trimetilamonio-butanoato; fórmula molecular: C7H15NO3; massa molar: 161,199 g/mol). O oócito e as células do cumulus não expressam enzimas relacionadas a todas as etapas da síntese de L C, entretanto, expressam tod o o maquinário enzimático necessário para a β -oxidação (MONTJEAN et al. , 2012) . Por ser uma molécula hidrossolúvel, a LC presente no FF ou adi cionada ao meio de MIV deve entrar nas células do cumulus e oócitos através dos transportadores catiônicos orgânicos (OCTN – em inglês Organic Cation Transporters ), localizados na superfície da membrana plasmática (TAMAI et al., 1998). Como antioxidante, a L C diminui os níveis de produtos da peroxidação lipídica e peróxido de hidrogênio (H 2O2) (YAZAKI et al., 2013). A suplementação oral com LC diminui os níveis de MDA, aumenta a atividade sérica das enzimas catalase, SOD e glutationa peroxidase em pacientes com doença arterial coronariana (LEE et al., 2014). 45 Devido a sua função no metabolismo energético e sua propriedade antioxidante, a LC também tem sido utilizada durante a MIV oocitária. Em modelo experimental suíno, LC aumentou a taxa de formação de blastocistos após ativação partenogenética (AP), diminuiu apoptose em blastocistos, diminuiu níveis de EROs nos oócitos e aumentou os níveis de glutationa reduzida (GSH) oocitário (WU et al., 2011). Em outro estudo, também utilizando modelo suíno, a LC aumentou a taxa de maturação nuclear oocitária, aumentou a taxa de clivagem, assim como aumentou a densidade mitocondrial oocitária e diminuiu os níveis de EROs (SOMFAI et al. , 2011). Em modelo bovino, a LC aumentou a taxa de maturação nuclear oocitária e aumentou a taxa de formação de blastocist os (CHANKITISAKUL et al. , 2013; PHONGNIMITR et al. , 2013) . E em modelo murino, a LC aumentou a taxa de maturação nuclear oocitária e melhorou a atividade e distribuição mitocondrial de oócitos (MOAWAD et al., 2014). Mansour e colaboradores (2009) avali aram o efeito de L C em prevenir danos ao fuso celular de oócitos murinos em contato com fluido peritoneal de mulheres com endometriose. Este estudo mostrou que a L C foi capaz de prevenir os danos meióticos oocitários, além de diminuir apoptose embrionária (MANSOUR et al., 2009). 46 2.6. Ácidos graxos ômega-3 Ácidos graxos são compostos orgânicos do tipo ácido carboxílico que podem ser classificados de acordo com sua estrutura molecular em saturados , monoinsaturados e poli-insaturados (PUFAs) e de acordo com a possibilidade de ser ou não sintet izado no organismo em , respectivamente, não-essencial e essencial (TVRZICKA et al. , 2011) . Ácidos graxos são geralmente apresentados como uma fórmula esquemática (C:p n -x) que indica o número de carbonos (C), o número de insaturações (p) e a posição da primeira insaturação a partir do grupo metila terminal (x). Como exemplo, neste trabalho, utilizamos o ácido eicosapentaenóico (EPA, 20:5 n-3) e o ácido docosahexaenóico (DHA, 22:6 n-3). Os PUFAs são categorizados em: ômegas-3, ômegas-6 e ômegas-9. PUFAs são essenciais para garantir uma adequada fluidez de membranas celulares (TVRZICKA et al. , 2011) . A s duplas ligações entre carbonos, em condições fisiológicas, preferencialmente, apresentam -se na configuração cis, ou seja, os dois hidrogênios da ligação covalente posicionam -se do mesmo lado, causando uma deflexão de 30º na molécula, o que a faz ocupar um maior espaço, diminuindo as forças de van der Waals e influenciando a fluidez e funcionamento das membranas biológicas (TVRZICKA et al., 2011). Intracelularmente, os ácidos graxos armazenados em fosfolipídios de membrana podem ser liberados com a ativação da enzima fosfolipase A2 mediada por proteínas quinase C dependentes de Ca2+. O PUFA liberado do fosfolipídio pode ser metabolizado a eicosanóides ou docosanóides ou pode mediar reações , como por exemplo, estimular a expressão do maquinário oxidativo mitocondrial e promover a β-oxidação (FLACHS et al., 2005). EPA [nome IUPAC: Ácido (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z) -eicosa- 5,8,11,14,17- pentenóico; fórmula molecular:C 20H30O2; massa molar: 302,451 g/mol] e o DHA [nome IUPAC: Ácido (4Z ,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoico; fórmula molecular: C 22H32O2; massa molar: 328,488 g/mol] são representantes dos PUFAs ômega-3 (Figura 3). Nos mamíferos, a partir da ação de enzimas elongases e dessaturases é possível sintetizar EPA e DHA a partir de seu precursor ácido α- linolênico (ALA, 18:3 n -3) encontrado, principalmente, em sementes e folhas de algumas plantas (soja, linhaça, etc) e em seus óleos (TVRZICKA et al. , 2011) . Entretanto, a s enzimas necessária para a síntese de PUFAs ômega -3 são as 47 mesmas necessárias para a síntese de PUFAs ômega-6, sendo um processo bastante limitado, a conversão de ALA a EPA e DHA (WATHES; ABAYASEKARA; AITKEN, 2007). Figura 3: Estrutura química das moléculas de ácido s graxos ômega -3: A -) Ácido eicosapentaenoico (EPA) e B-) Ácido docosahexaenóico (DHA) Os PUFAs ômega-6 são sintetizados a partir do ácido linoleico (AL, 18:2 n-6). AL é con vertido em ácido γ -linolênico (GLA, 18:3, n -6) pela ação da enzima Δ -6- dessaturase e GLA é elongado para formar ácido di -homo-γ-linolênico (DGLA, 20:3, n-6). DGLA pode também ser convertido a ácido araquidônico ( AA, 20:4, n-6) pela ação da enzima Δ -5-dessaturase (Figura 4) . AA é o precursor da série 2 de prostaglandinas ( PGs) e a série 4 de leucotrienos (LTs) , que apresentam alto potencial inflamatório (Figura 5). E a síntese de ômega -3 segue a seguinte via: ALA é convertido em ácido estearidônico (SDA, 1 8:4 n -3) pela enzima Δ -6-dessaturase, que sofre a ação de elongase convertendo-se em ácido eiscosatetraenóico (ETA, 20:4 n -3) que é, então, convertido a EPA pela enzima Δ -5-dessaturase (Figura 4). EPA é precursor da série 3 de PGs , série 5 de LTs e série 5 de resolvinas, que apresentam baixo potencial inflamatório e ação anti-inflamatória (Figura 5). A via de conversão de EPA a DHA (22:6 n ‐3) envolve a adição de dois carbonos ao EPA para formar ácido docosapentaenóico (DPA, 22:5 n ‐3), adição de mais dois carbonos para produzir ácido tetracosapentaenóico (TPA, 24:5 n ‐3) que é 48 então convertido a ácido tetracosahexaenóico (THA, 24:6 n ‐3) pela Δ -6- dessaturase, o THA é transportado para os peroxissomos onde dois carbonos são removidos na β ‐oxidação para formar D HA (Figura 4) . DHA é precursor de docosanóides anti-inflamatórios tais como resolvinas e protectinas (Figura 5). Figura 4: Vias metabólicas de síntese de ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 Figura 5: Síntes e e ações de mediadores lipídicos produzidos a partir dos ácidos araquidônico (AA), eicosapentaenoico (EPA) e docosahexaenóico (DHA). Nota: COX: ciclooxigenase; LOX: lipoxigenase; LT: leucotrieno; PG: prostaglandina. 49 Estudos utilizando modelos exper imentais de indução cirúrgica de endometriose, mostraram efeitos benéficos da suplementação da dieta com ácidos graxos ômega -3 sobre a redução do tamanho de lesões de endometriose e diminuição da produção local de mediadores inflamatórios em ratos (NETSU et al., 2008; AKYOL et al. , 2016) e em coelho (ATTAMAN et al. , 2014) . Estudo in vitro reportou que ácidos graxos ômega-3 suprimem o crescimento e a sobrevivência in vitro de células endometriais de mulheres com e sem endometriose (GAZVANI et al., 2001). Hopeman e colaboradores (2015) avaliaram a relação entre níveis circulantes de PUFAs em mulheres com e sem endometriose e reportaram que mulheres com altos níveis séricos de EPA tinham um risco 82% menor em ter endometriose comparado a mulheres com níveis baixos de EPA (HOPEMAN et al., 2015). Oseikria e colaboradores (2016) avaliaram a adição de diversas concentrações de DHA durante a MIV de oócitos bovinos sobre qualidade e competência oocitária. Os autores observaram que nas concentrações testadas (0, 1, 10 e 100 uM), DHA não teve efeito sobre a viabilidade oocitária e taxa de maturação (OSEIKRIA et al., 2016). A concentração de 1uM de DHA durante a MIV promoveu uma maior taxa de clivagem e de formação de blastocisto após AP comparada com o grupo controle (OSEIKRIA et al., 2016). A concentração de 10 uM não teve efeito sobre ess as taxas, e a concentração de 100 uM diminuiu significativamente a clivagem (OSEIKRIA et al., 2016). E Nikoloff e colaboradores (2017) avaliaram a adição de diversas concentrações de EPA durante a MIV de oócitos bovinos sobre a taxa de maturação, genotoxicidade e citotoxicidade. A taxa de maturação não foi alterada pela adição de 1 nM e de 1 uM de DHA, entretanto, 1 mM significativamente diminuiu a taxa de maturação comparado ao grupo controle (NIKOLOFF et al. , 2017) . 1 nM de DHA aumentou a expansão das células do cumulus após MIV co mparado ao controle (NIKOLOFF et al., 2017). Entretanto, 1 nM de DHA aumentou a frequência de danos ao DNA em células do cumulus (eletroforese em gel de célula única) comparado ao controle, 1 uM aumentou a taxa de apoptose em células do cumulus (Anexina V) comparado ao grupo controle e 1 mM diminuiu a viabilidade celular ( Tripan blue ), aumentou apoptose e diminuiu atividade mitocondrial (teste do MTT) de células do cumulus comparado ao controle (NIKOLOFF et al., 2017). 50 3. OBJETIVOS 51 3.1. Objetivo geral: Avaliar o impacto da adição de FF de mulheres inférteis com e sem endometriose e a suplementação com L C e ácidos graxos ômega-3 ao meio de MIV sobre a maturação nuclear e as taxas de normalidade meiótica de oócitos bovinos. 3.2. Objetivos específicos: 1. Comparar o impacto do FF de mulheres inférteis com endometriose em estágios iniciais (EI/II) e avançados [sem endometrioma (EIII/IV) e com endometrioma (Eendometrioma)] ao do FF de mulher es sem endometriose (FFControle) adicionados ao meio de maturação in vitro (MIV) sobre a maturação nuclear e as taxas de normalidade meiótica de oócitos bovinos avaliados por microscopia confocal. 2. Avaliar se a LC e os ácidos graxos ômega -3 (DHA e EPA) são capazes de prevenir os danos meióticos em oócitos bovinos induzidos por FF de mulheres inférteis com endometriose em estágios iniciais (I/II) e avançados (III/IV) durante a maturação in vitro (MIV). 52 4. MATERIAIS E MÉTODOS 53 Realizamos um estudo experimental previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clí nicas (HC) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP) (Processo HCRP nº 12201/2008) e pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da FMRP - USP (nº 169/2008). Optamos pelo uso de modelo experimental bovino, em vi rtude da similaridade no tamanho e morfologia ovarianos de humano e bovino, por ambas as espécies serem monovulatórias e policíclicas e por ser um material abundante, de baixo custo, de fácil manipulação (MALHI; ADAM S; SINGH , 2005; SANTOS; SCHOEVERS; ROELEN, 2014). 4.1. Seleção de pacientes doadoras de fluido folicular Como doadoras de FF, foram elegíveis todas as pacientes submetidas à estimulação ovariana controlada (EOC) para a realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) junto ao Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP -USP, no período de Março a Outubro de 2013 e Maio/2016 a Setembro/2017. Todas as pacientes elegíveis que não apresentaram cancelamento ini cial do ciclo de EOC e que completaram os critérios de inclusão (abaixo) foram convidadas a participar da pesquisa. 4.1.1. Critérios de inclusão • Idade < 40 anos; • Índice de massa corpórea (IMC) < 30 kg/m²; • Concentração sérica do hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro dia do ciclo menstrual < 15 mUI/mL; • Ausência de anovulação crônica; • Ausência de hidrossalpinge; • Ausência de doenças crônicas (tais como diabetes melitus, hipertensão arterial), doença cardiovascular, dislipidemia, lúpus eritematoso sistêmico ou qualquer outra doença reumatológica; • Ausência de endocrinopatias descompensadas e não tratadas; • Ausência de infecção por vírus da imunodeficiência humana ( HIV) ou qualquer infecção ativa; 54 • Não ser tabagista e etilista; • Não ter usado medicações hormonais ou anti-inflamatórios hormonais ou não hormonais durante os 6 meses subsequentes à inclusão neste estudo. • Exame de videolaparoscopia prévio. O grupo controle foi composto por mulheres inférteis devido a fatores tubários e/ou cujo cônjuge apresentava infertilidade (fator masculino), sendo que todas as pacientes foram submetidas pr eviamente ao exame de videolaparoscopia para inspeção da cavidade pélvica/abdominal e exclusão de endometriose. O grupo endometriose foi subdividido em endometriose em estági os iniciais (mínima ou leve, EI/II), endometriose avançada (moderada ou grave , III/IV ) sem a presença de endometrioma no ciclo (EIII/IV) e endometriose avançada com endometrioma no ciclo (Eendometrioma). O exame de videolaparoscopia prévio foi realizado pa ra diagnóstico e classificação da endometriose de acordo com os critérios da ASRM (ASRM, 1997) . As mulheres do grupo Eendometrioma apresentaram endometrioma no ciclo de EOC visualizado por ultrassonografia transvaginal. O recrutamento de pacientes foi realizado em duas etapas: primeiramente, os prontuários foram analisados para avaliação de elegibilidade, verificação de exames e condição clínica da paciente, posteriormente, as pacientes foram brevemente entrevistadas para exclusão de qualquer dúvida com relação ao seu estado de saúde e estilo de vida. 4.2. Captação oocit ária, coleta e processamento de amostras de fluido folicular Amostras de FF foram obtidas durante a captação oocitária para realização de ICSI. Para evitar possível interferência de sucessivas punções ovarianas , FF foi obtido apenas do primeiro folículo ( diâmetro ≥ 15 mm) do primeiro ovário puncionado. Essas amostras foram imediatamente levadas ao laboratório de embriologia, onde as embriologistas checaram a presença de oócito e/ou células da granulosa. Os oócitos foram separados do FF para utilização dur ante a s TRA e o FF foi centrifugado a 300 g por 10 minutos, aliquotado e armazenado a -80ºC. 55 As amostras que não continham oócito e/ou células da granulosa foram excluídas, visto que, nesses casos, não seria possível afirmar que o folículo ovariano puncionado apresentava um oócito em processo de maturação. FF de uma paciente de cada grupo (grupo controle, grupo endometriose em estágios iniciais, grupo endometriose em estágios avançados sem endometrioma e grupo endometriose em estágios avançados com endome trioma) fo i utilizado individualmente em apenas em um experimento. 4.3. Estimulação ovariana controlada No Setor de Reprodução Humana do HC -FMRP, todas as pacientes realizaram um exame de ultrassonografia transvaginal prévio ao início da EOC (pré - basal), quan do a nticoncepcional oral combinado (ACO) (Miranova®, Bayer ou Level®, Biolab) foi prescrito com o objetivo de sincronizar e programar o início da EOC. Portanto, ACO foi iniciado no período menstrual do ciclo precedente à EOC e utilizado diariamente até ci nco dias antes da data prevista para o início da EOC .e realização do ultrassom transvaginal basal. De acordo com as caracterí sticas de cada paciente, dois protocolos de EOC distintos foram aplicados como descrito a seguir: - Protocolo antagonista flexível: gonadotrofinas (150-300 UI/dia) foram administradas nos primeiros seis dias de EOC, com a dose diária ajustada de acordo com o crescimento folicular. Antagonistas do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH - ganirelix ou cetrorelix 0,25 mg/dia) foram i niciados no dia em que a média do diâmetro do maior folículo foi ≥ 14 mm. - Protocolo de estimulação mínima (citrato de clomifeno mais gonadotrofinas e antagonista de GnRH): citrato de clomifeno (100 mg/dia) foi administrado durante os primeiros cinco dias de EOC e as gonadotrofinas (150 UI/dia) foram administradas nos dias dois e quatro, e diariamente a partir do dia seis. O antagonista de GnRH (ganirelix ou cetrorelix 0,25 mg/dia) foi iniciado no dia em que o diâmetro médio do maior folículo foi ≥ 14 mm. O hCG recombinante (250 μg, Ovidrel®, Serono, Brasil) ou hCG urinário (10,000 IU, Choriomon®, Meizler, Brasil) foi administrado quando pelo menos um 56 folículo com 18 mm de diâmetro médio estava presente. Os oócitos foram captados 34 a 36 horas após a administração do hCG recombinante, e a fase lútea foi mantida pela administração da progesterona micronizada (600 mg/dia). 4.4. Coleta de ovários bovinos, recuperação e classificação dos complexos cumulus-oócito Os ovários bovinos foram coletados no frigorífico Bar ra Mansa S.A, localizado no muncípio de Sertãozinho – SP (há 20 Km de Ribeirão Preto) e transportados em recipiente térmico contendo solução salina (NaCl a 0,9%) a 35-38,5ºC. No laboratório, os ovários foram borrifados com álcool 70% e lavados e mantidos em solução salina contendo sulfato de estreptomicina (5 µg/mL) em banho- maria a 38,5º. Utilizando uma seringa de 10 mL e agulha de 22G, os folículos ovarianos com tamanho entre 2 - 8 mm foram aspirados, e o conteúdo depositado em cálice cônico estéril manti do a 38,5ºC. Após o término da aspiração folicular, o conteúdo aspirado permaneceu 10 minutos em repouso para deposição dos CCOs. Então, o cálice contendo os CCOs foram levados à cabine de fluxo laminar para serem observados em lupa e classificados de acor do com suas características morfológicas. Apenas os CCOs com citoplasma homogêneo, circundado por três ou mais camadas compactas de células do cumulus, mesmo que parcialmente, foram selecionados (ADONA; LIMA VERDE LEAL, 2004; FERREIRA et al., 2009a). 4.5. Maturação in vitro Os CCOs selecionados foram lavados e manipulados em meio TCM 199 com 25 mM de HEPES [ ácido N -(2-hidroxietilo)-piperazina-N'-2-etanesulfónico], L - glutamina e sais de Hank (Life Technologies GIBCO® 12350-039) suplementado com 20 µg/mL de piruvato de sódio, 10 µg/mL de gentamicina e 5% de soro bovino fetal inativado (SBF - GIBCO 10270-098) (meio de bancada). Então, após a seleção morfológica, CCOs foram lavados em meio TCM 199 com 25 mM de HEPES, 2,2 g/L de bicarbonato de sódio, L-glutamina e sais de Earle (Life Technologies GIBCO® 12340-030) suplementado com 50 µg/mL de piruvato de sódio, 50 µg/mL de gentamicina, 1 µg/mL de estradiol, 20 µg/mL de FSH, 10% de 57 soro bovino fetal (SBF) e 2,5 UI/mL de hCG (C horulon®) (meio de MIV) e foram separados aleatoriamente em 9 grupos experimentais (conforme abaixo): 1-) sem-FF: sem adição de FF ou LC ou ácidos graxos ômega 3; 2-) FFControle: com 1% de FF de paciente controle; 3-) FFControle+LC+n3: com 1% de FF de paci ente controle + 0,6mg/mL de LC + 0,4 nM de DHA + 0,6 nM de EPA; 4-) FFEI/II: com 1% de FF de pacientes EI/II; 5-) FFEI/II+LC+n3: com 1% de FF de paciente EI/II + 0,6mg/mL de LC + 0,4 nM de DHA + 0,6 nM de EPA; 6-) FFEIII/IV: com 1% de FF de pacientes com EIII/IV sem endometrioma; 7-) FFEIII/IV+ LC+n3: com 1% de FF de paciente EIII/IV sem endometrioma + 0,6mg/mL de LC + 0,4 nM de DHA + 0,6 nM de EPA; 8-) FFEndometrioma: com 1% de FF de paciente EIII/IV com endometrioma; 9-) FFEndometrioma+LC+n3: com 1% de FF de paciente EIII/IV com endometrioma + 0,6mg/mL de LC + 0,4 nM de DHA + 0,6 nM de EPA; Após 22 -24 horas de MIV, as células do cumulus foram separadas dos oócitos através de turbilhamento (pipetagem repetitiva) em meio de bancada em placas de vidro escavad as. Os oócitos desnudos foram fixados e mantidos por 30 minutos a 38,5ºC em um tampão para estabilização de microtúbulos contendo 0,1 M de Pipes, 5 nM de MgCl2.6H2O, 2,5 nM de EGTA, 0,01% aprotinina, 1 nM DTT, 1 μM de Taxol, 0,5% Triton -X e 2% de formaldeí do a 37%. O pool de oócito s de cada grupo foi armazenado em tubos de fundo cônico de 600 μL contendo 100 μL de solução fixadora em geladeira até a realização dos experimentos de imunofluorescência. Visto que, durante a MIV oocitária, de acordo com cada gru po de tratamento, foi realizada a adição de FF, de LC e de ácidos graxos ômega -3 (DHA e EPA), optamos por concentrar o meio supracitado (meio de MIV) em 4%. O meio 58 concentrado 4% foi diluído até uma concentração normal naqueles grupos com adição de FF, LC e ácidos graxos ( FFControle+LC+n3, FFEI/II +LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 e FFEndometrioma+LC+n3), já nos demais grupos, a concentração foi normalizada adicionando-se meio TCM 199 (Life Technologies GIBCO® 12340 - 030) puro filtrado; e assim conseguimos um ajuste da s substâncias adicionadas indispensável ao processo de MIV. Os CCOs foram cultivados em gotas de 400 µL (aproximadamente, 20 oócitos por gota), a 38,5ºC, 95% de umidade, 5% de CO 2 durante 22-24h, em placas NUNC® em um sistema de cultivo sem óleo mineral. Durante as MIVs , optamos por utilizar uma concentração de 1% de FF visto que estudo prévio do grupo (DA BROI et al. , 2014) testou a adição de quatro diferentes concentrações de FF de mulheres inférteis com endometriose leve ( 1%, 5%, 10% e 15%) ao meio MIV e não reportou efeito dose -dependente. Assim, no presente estudo, optamos por utilizar a menor concentração de FF testada (1%). 4.6. Preparo das soluções de L-carnitina e dos ácidos graxos ômega-3 4.6.1. L-carnitina: A concentração de LC ( Sigma Aldrich C0283) utilizada para suplementar os experimentos de MIV conforme será descrito a seguir foi de 0,6 mg/mL (MANSOUR et al., 2009; GIORGI et al., 2016). A solução estoque foi preparada em uma concentração 100 vezes maior que a solução trabalho (solução estoque: 60 mg/mL de LC) com água de injeção, filtrada em filtro de poros de 0,22 μm, aliquotada e armazenada a -20ºC. 4.6.2. Ácidos graxos ômega 3 A concentração final de ácidos graxos ômega 3 utilizada para suplemen tar os experimentos de MIV conforme descritos a seguir foi de 1 nM (NIKOLOFF et al. , 2017). Sendo que 0,4 nM foi DHA ( Sigma Aldrich D2534) e 0,6 nM EPA ( Sigma Aldrich E2011). A proporção de 2:3 DHA /EPA foi escolhida baseando-se na composição de suplementos comerciais a base de óleo de peixe (Omega-3 das 59 marcas Essential®; Sidney Oliveira ®; Equaliv®; Country Life®; Solgar®; Catarienense®) e em suplementos utilizados em ensaios clínicos randomizados [180 mg de EPA e 120 mg de DHA para mulheres com síndrome dos ovários policísticos que desejavam realizar TRA (NADJARZADEH et al., 2015), 1200mg de EPA e 800 mg de DHA para mulheres obesas grávidas (HAGHIAC et al., 2015), 180 mg de EPA e 120 mg de DHA para jovens mulheres com dismenorreia (RAHBAR; ASGHARZADEH; GHORBANI, 2012)]. As soluções estoques dos ácidos graxos fo ram preparadas em uma concentração 100 vezes maior que a s concentrações finais (soluções estoque: 40 nM de DHA e 60 nM de EPA) com dimetilsulfóxido ( DMSO), filtrad as em filtro de poros de 0,22 μm e armazenadas a -20ºC. 4.7. Imunofluorescência para visualização de microtúbulos e cromossomos Os oócitos fixados foram retirados do fundo do tubo contendo solução fixadora e foram lavados 2 vezes em meio de lavagem tampão Salina Fosfato (PBS - Phosphate Buffer Saline) suplementado com 0,02% NaN3, 0,01% Triton X-100, 0,2% leite seco sem gordura, 2% soro de cabra, 2% de albumina sérica bovina e 0,1 M de glicina e mantidos nessa solução de lavagem em estufa a 38ºC para bloqueio. Após 2 horas, os oócitos foram incubados com anticorpo primário anti-β-tubulina (Sigma T5293) overnigth a 4-8ºC. Então, os oócitos foram novamente lavados em solução de lavagem e incubados com anticorpo policlonal anti -IgG de camundongo conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:500, MP BIO 0855514) a 38,5º C por 2h. Os oócitos foram submetidos a mais uma lavagem e, então, foram marcados com Hoechst 33342 (10 mg/mL) em meio de montagem Vectashield (H-1000, Vector, Burlingame, CA, EUA) sobre uma lâmina de vidro coberta por uma lamínula. As amostras foram visualizadas utilizando um microscópio confocal de alta performance (Confocal Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Mannheim, Alemanha) em aumento óptico de 40X e os lasers Diodo 405 UV e HeNe 543. 4.8. Classificação oocitária baseada na morfologia do fuso meiótico e no alinhamento cromossômico por microscopia confocal 60 Os oócitos foram classificados de acordo com o estágio de maturação nuclear: em metáfase I (MI – presença de uma placa metafásica no interior do oócito), telófase I (TI – presença de dois conjuntos crom ossômicos interligados por fuso meiótico); ou metáfase II [MII - presença de uma placa metafásica no interior do oócito e de um corpúsculo polar (CP) entre o oócito e sua zona pelúcida]; ou como AP (caracterizado pela extrusão espontânea de um segundo CP s em ter ocorrido fertilização; ou caracterizada por telófase II) (Figura 6). Os oócitos em MII foram subdivididos como analisáveis e não analisáveis de acordo com a posição de visualização da placa metafásica. Os oócitos foram considerados analisáveis quand o o fuso meiótico podia ser visualizado em uma posição lateral ou sagital (microfilamentos observados em uma posição longitudinal, sendo possível a visualização dos dois polos do fuso meiótico) e os cromossomos dispostos em linha na região mediana do fuso e, considerados não analisáveis quando o fuso foi observado em uma posição polar (JU et al., 2005), que impede uma visão detalhada do fuso. Oócitos em MII analisáveis foram classificados como “normais” quando apresentaram fuso meiótico em forma de barril com microtúbulos organizados de um polo a outro, cromossomos alinhados na placa metafá sica no equador do fuso e presença de um CP; ou considerados como “anormais” quando apresentaram fuso meiótico alterado (dimensão longitudinal reduzida, microtúbulos desorganizados ou ausentes) e/ou configuração cromossômica alterada (dispersos ou deslocad os do plano da placa metafásica). 61 Figura 6: Estágios de maturação nuclear de oócitos bovinos maturados in vitro e analisados por microscopia confocal. A -) Metáfase I; B) Telófase I; C -) Metáfase II; D-) Ativação Partenogenética(TelófaseII) Nota: Em verde , marcação para fuso meiótico com anticorpo monoclonal anti -β-tubulina e anticorpo secundário conjugado com FITC. Em azul, marcação para material genético com Hoechst 33342. CP: corpúsculo polar. Barra branca no canto direito inferior: escala de 10 µm. 62 Figura 7: Posição de visualização do fuso meiótico de oócitos bovinos em metáfase II maturados in vitro e visualizados por microscopia confocal. A -) Polar (fuso não analisável), B-)Sagital(analisável) Nota: Em verde, marcação para fuso meiótico com anticorpo monoclonal anti -β-tubulina e anticorpo secundário conjugado com FITC. Em azul, marcação para material genético com Hoechst 33342. Barra branca no canto direito inferior: escala de 10 µm. 63 Figura 8: Classificação de oócitos bovinos maturados in vitro, em metáfase II analisáveis, de acordo com a organização do fuso meiótico e alinhamento cromossômico analisados por microscopia confocal. A -), B -) e C -) representam anormais e D -) normal . Nota: A-) Fuso normal, cromossomos desalinhados; B -) Fuso inc ompleto e cromossomos alinhados; C-) Fuso anormal e cromossomos desalinhados e D -) Fuso normal e cromossomos alinhados (MII normal). Em verde, marcação para fuso meiótico com anticorpo monoclonal anti -β-tubulina e anticorpo secundário conjugado com FITC. Em azul, marcação para material genético com Hoechst 33342. Barra branca no canto direito inferior: escala de 10 µm. Seta branca indica cromossomos desalinhados 4.9. Obtenção da variável primária A porcentagem de MII normais foi obtida dividindo o número de MII normais pelo número de MII analisáveis. 64 4.10. Obtenção das variáveis secundárias • Taxa de MI: número de MI dividido pelo número de oócitos visualizados por confocal • Taxa de TI: número de TI dividido pel o número de oócitos visualizados por confocal • Taxa de AP: número de AP dividido pelo número de oócitos visualizados por confocal • Taxa de MII: número de MII dividido pelo número de oócitos visualizados por confocal • Taxa de MII analisáveis: número de oócitos MII visualizados em posição sagital/lateral divididos pelo número total de oócitos MII 4.11. Obtenção das variáveis clínicas secundárias • Idade: foi obtida a partir da data de nascimento e data da captação oocitária (anos); • IMC: divisão do peso em kg pela altura ao quadrado em m (kg/m²); • FSH: níveis séricos de FSH no 3º dia do ci clo menstrual dosados por quimioluminescência (UI/L); • Tempo de infertilidade: intervalo de tempo que o casal mantém relações sexuais sem uso de contraceptivos (meses); • Tempo entre videolaparoscopia e captação oocitária: intervalo de tempo entre a realização do exame de videolaparoscopia e a captação oocitária (meses); • Contagem de folículos antrais (CFA basal): número total de folículos ovarianos antrais avaliado por meio de ultrassonografia transvaginal no dia de início da EOC (n); • Espessura endometrial: medida da espessura do endométrio avaliada por meio de ultrassonografia transvaginal no dia de início da EOC (mm) • Duração da EOC: tempo decorrido do início da EOC até a administração do hCG recombinante (dias); • Oócitos captados: número de CCOs obtidos pela punção ovariana após 34 -36 h da administração do hCG (n); 65 • Oócitos maduros: número de oócitos MII obtidos pela punção ovariana após 34 - 36 h da administração do hCG (n); 4.12. Desenho experimental Abaixo a Figura 9 ilustra o desenho experimental realizado neste estudo. Figura 9: Desenho experimental 4.13. Análise estatística Os dados foram analisados usando o software RStudio versão 1.0.153, 2009 - 2017 [R Core Team (2017). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R- project.org/]. Os resultados foram apresentados em tabelas (Tabelas 1 e 2). A Tabela 1 mostra os dados clínicos referentes às pacientes doadoras de FF. Os dados foram apresentados como mediana e intervalos interquartis . As variáveis não paramétrica s: Idade (anos), IMC (kg/m 2), FSH sérico no 3º dia do ciclo menstrual (UI/mL), temp o de infertilidade (anos), tempo entre realização da videolaparoscopia e captação oocitária (em meses), CFA basal (nº de folículos), 66 espessura do endométrio no dia de início da EOC (mm), duração da EOC (dias), nº de oócitos captados e nº de oócitos MII captados foram comparados entre os grupos Controle, EI/II, EIII/IV e Eendometrioma utilizando o teste de Kruskall Wallis com pós teste de Dunn. A Tabela 2 mostra os dados coletados a partir da realização das MIVs e imunofluorescências dos oócitos bovinos. As variáveis categóricas (porcentagem de MI, porcentagem de TI, porcentagem de AP, porcentagem de MII, porcentagem de MII analisáveis, porcentagem de MII normais) foram comparadas entre os grupos utilizando o teste do qui-quadrado. Para todos os testes foi adotado um nível de significância em p< 0,05. 4.14. Cálculo amostral Com base em estudos prévios de nosso grupo (DA BROI et al., 2014; GIORGI et al., 2016) que demonstraram uma diferença na porcentagem de MII normais de ~30% entre os grupos sem -FF e FFEI/II, e considerando um poder de teste de 80% (β=0,2 e α=0,05), um total de 87 oócitos em MII analisáveis por grupo seriam necessários. 67 5. RESULTADOS 68 Oito experimentos foram realizados, e FF de uma paciente de cada grupo (grupo controle, grupo endometriose em estágios iniciais, grupo endometriose em estágios avançados sem endometrioma e grupo endometriose em estágios avançados com endometrioma) fo i utilizado individualmente em cada um dos experimentos. 5.1. Recrutamento de pacientes doadoras de FF Entre março de 2013 e outubro de 2013, e entre maio de 2016 a setembro de 2017, um total de 1171 prontuários foram avaliados para elegibilidade no Setor de Reprodução Assistida do HC-FMRP. Destes prontuários, 630 foram considerados não elegíveis pois o casal realiz ou outro tratamento que não ICSI (inseminação intrauterina, transferência de embrião congelado). Dos 541 casos submetidos à ICSI , 115 apresenta ram os critérios de elegibilidade, entretanto, 27 tiveram o ciclo de EOC cancelado devido à presença de folículo dominante. Portanto, 88 mulheres foram convidadas a participar da pesquisa e 83 delas concordaram e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Destas 83 pacientes, 12 tiv eram o ciclo de EOC cancelado devido à má resposta à EOC. Portanto, 71 mulheres foram submetidas ao procedimento de captação oocitária (17 Controle, 16 EI/II, 20 EIII/IV e 18 Eendometrioma). Das 71 mulheres submetidas à captação oocitária, 32 apresentaram amostra inadequada devido à contaminaçã o por sangue à inspeção visual ou por não apresentarem nenhum oócito em MII captado. Um total de 39 amostras (12 Controle, 8 EI/II, 11 EIII/IV e 8 Eendometrioma) foram processadas e armazenadas a -196ºC até futura utilização (características das amostras d e FF utilizadas estão registradas no APÊNDICE A). 69 Figura 10: Fluxograma ilustrando recrutamento, inclusão e seguimento de mulheres inférteis doadoras de fluido folicular 5.2. Dados clínicos doadoras de FF A Tabela 1 mostra os dados clínicos das 32 pacientes com amostras de FF utilizadas nos 8 experimentos de MIV. Não houve diferença na idade, IMC, níveis séricos de FSH , tempo entre videolaparoscopia e captação oocitária, CFA basal, espessura endometrial, duração da EOC, oócitos capt ados, oócitos maduros e embriões clivados. Houve uma diferença entre o grupo controle e E endometrioma com relação ao tempo de infertilidade (p=0,0275). 70 Tabela 1: Variáveis clínicas e resposta à estimulação ovariana controlada das mulheres inférteis doadoras de fluido folicular sem endometriose (controle), com endometriose em estágios iniciais (EI/II) e em estágios avançados sem endometrioma (EIII/IV) e com endometrioma (Eendometrioma). Controle (n=8) E I/II (n=8) E III/IV (n=8) E endometrioma (n=8) Idade (anos) 36 (35,5 – 37,3) 34 (33,5 - 37) 33 (29 - 34) 34,5 (33 – 36,3) p =0,1907 IMC (kg/m²) 24,6 (23,8 – 27,9) 21,9 (21,8 - 27,4) 24,8 (24,6 – 27,3) 21,8 (20,8 – 25,2) p =0,3259 FSH (UI/L) 8,2 (7,9 – 9,7) 4,4 (4,4 – 5,3) 5,2 (3,8 – 7,8) 5,6 (4,1 - 8,4) p= 0,1890 Tempo infertilidade (meses) 114 (93 - 135)* 84 (81 - 84) 108 (66 - 111) 48 (45 - 60)* *p=0,0275 Tempo entre VLPSC e EOC (meses) 57 (53,8 – 70,5) 23 (32,8 - 75) 68 (10,3 - 79) 34 (30 – 49,5) p =0,3282 CFA basal (n) 8,0 (7,5- 8) 7 (7 – 9,5) 9,0 (3,8 - 11) 8,0 (3- 13) p=0,9533 Endométrio (mm) 3,3 (2,9 – 3,9) 7,3 (2,9 – 5,5) 4,6 (3,2 – 6,9) 4,5 (3,4 – 5,2) p=0,6850 Duração EOC (dias) 8 (8 – 9,3) 9 (9 – 10,5) 10 (9 - 10) 10 (9,5 – 11,3) p=0,2115 Oócitos captados (n) 3 (2 - 4) 4 (3,8 – 5,5) 4 (3,5 - 8) 2 (1 – 4,3) p =0,1873 Oócitos maduros (n) 3 (2 – 3,3) 4 (3,8 – 5,5) 4 (3,5 – 7,5) 2 (1 – 4,3) p =0,2084 Nota: As variáveis são reportadas como mediana e intervalos interquartis. IMC: índice de massa corpórea; FSH: hormônio folículo esti mulante; CFA basal: contagem de folículos antrais; EOC: estimulação ovariana controlada ; VLPSC: videolaparoscopia . Grupos comparados por meio do teste de Kruskall Wallis com pós teste de Dunn (p<0,05). 5.3. Maturação in vitro e microscopia confocal Para os 8 experimentos de MIV realizados entre novembro/2017 e janeiro/2018, um total de 240 ovários bovinos foram aspirados, e um total de 1686 CCOs imaturos foram submetidos à MIV. Após a MIV, um total de 1561 oócitos desnudados foram fixados para realização de i munofluorescência e 1401 oócitos 71 foram visualizados por microscopia confocal (167 oócitos estavam em MI, 25 em TI, 1188 em MII e 21 sofreram AP). Dos 1188 oócitos em MII, 735 foram considerados analisáveis (isto é, visualizados em uma posição sagital ou la teral) e 453 foram considerados não analisáveis (visão polar). Não houv e diferença na taxa de TI (p=0,05467), AP (p=0,8854) e MII analisáveis (p=0,5651) entre os nove grupos experimentais (Tabela 1). A taxa de oócitos em MI foi de 6,0% no grupo sem -FF, sendo semelhante a dos grupos FFControle (6,1%, p=1), FFControle+ LC+n3 (11,7%, p=0,1247), FF EI/II (12,7%, p=0,07406), FF EI/II+LC+n3 (9,8%, p=0,3085), FF EIII/IV+LC+n3 (7,7%, p=0,7314) e FFEndometrioma+LC+n3 (11,1%, p=0,166). A taxa de MI foi menor nos grupos sem-FF e FFControle quando comparad a a dos grupos FFEIII/IV (16,9%; vs sem-FF: p= 0,00504; vs FFC: p=0,00537) e FFEndometrioma (24,7%; vs sem -FF: p<0,0001; vs FFC: p<0,0001). A adição de LC e ômega -3 não alterou a taxa de MI nos grupos FFControle (6,1% vs 11,7%, p=0,1292) e FF EI/II (12,7% vs 9,8%, p=0,5288), mas reduziu a taxa de MI nos grupos FFEIII/IV ( FFEIII/IV+LC+n3: 7,7% vs 16,9%, p=0,0259) e FFEendometrioma ( FFEendometrioma+LC+n3: 11,1% vs 24,7%, p=0,0028). A taxa de MII foi de 91,9% no grupo sem -FF, sendo semelhante aos grupos FFControle (89,2%, p=0,5389), FFControle+ LC+n3 (89,2%, p=0,06992), FF EI/II (85,4%, p=0,1069), FF EI/II+LC+n3 (85,3%, p=0,09598), FF EIII/IV+LC+n3 (90,8%, p=0,8999) e FFEndometrioma+ LC+n3 (86,4%, p=0,1681). A menor taxa de MII foi encontrada no grupo FFEndometrioma (69,3%) que diferiu dos demais 8 grupos ( vs sem-FF: p<0,0001; vs FFControle: p<0,0001; vs FFControle+LC+n3: p=0,00194; vs FFEI/II: p=0,00114; vs FFEI/II+LC+n3: p=0,00117; vs FFEIII/IV: p=0,02681; vs FFEIII/IV+LC+n3: p<0,0001; vs FFEndometrioma+LC+n3: p=0,00044). O grupo sem- FF apresentou maior taxa de MII comparado ao s grupos FFEIII/IV (80,7%, p=0,00681) e FFEendometrioma (p<0,0001). A adição de LC e ômega -3 não alterou a taxa de MII nos grupos FFControle (FFControle vs FFControle+LC+n3: p=0,3122), FFEI/II (FFEI/II vs FFEI/II+LC+n3: p=1). No entanto, a adição de LC e ômega -3 aumentou a taxa de MII nos grupos FFEIII/IV (FFEIII/IV vs FFEIII/IV+LC+n3: p=0,0190) e FFEendometrioma (FFEendometrioma vs FFEendometrioma+LC+n3: p=0,0004). A porcentagem de MII meioticamente normais foi de 87,2% no grupo sem -FF, sendo similar a dos grupos FFControle (87,2%, p=1 , poder de teste: 5% ), 72 FFControle+LC+n3 (82,5%, p=0,54 , poder de teste: 7% ), FF EI/II+LC+n3 (84,5%, p=0,7615, poder de teste: 6% ), FFEIII/IV+LC+n3 (84,1%, p=0,7122, poder de teste: 6%) e FFEndometrioma+ LC+n3 (75,3%, p=0,0623 , poder de teste: 14%). A porcentagem de MII normais no grupo sem -FF foi significativamente maior do que nos grupos FF EI/II (62,2%, p=0,00023), FF EIII/IV (70,2%, p=0,0092) e FFEndometrioma (72,7%, p=0,03497). A porcentagem de MII normais no grupo FFControle também foi significativamente maior do que nos grupos FF EI/II (p=0,00059), FFEIII/IV (p=0,01523) e FFEndometrioma (p=0,0486). A adição de L C e ácidos graxos ômega-3 durante a MIV não alterou a taxa de MII normais no grupo FFControle (p=0,5792, poder de teste: 7%) e com FFEndometrioma (p=0,865, poder de teste: 5% ), mas aumentou essa taxa nos grupos com FF EI/II (p=0,00205) e FFEIII/IV (p=0,04995). Apesar dos grupo s FFEndometrioma (72,7%) e FFEndometrioma+LC+n3 (75,3%) não diferirem com relação à porcentagem de MII normais (p=0,865), o grupo FFEndometrioma+LC+n3 teve porcentagem de MII normais semelhante aos grupos sem -FF (p=0,062 , poder de teste: 14% ) e FFControle (p=0,083, poder de teste: 14%). 73 Tabela 2: Estágios de maturação nuclear, e porcentagem de oócitos em MII normais maturados in vitro em meio sem adição de FF (sem -FF), com adição de 1% de FF de pacientes inférteis sem endometriose (FFControle), com endom etriose leve (FF EI/II), com endometriose moderada/grave sem endometrioma (FF EIII/IV) ou com endometriose moderada/grave com endometrioma (FFEndometrioma), suplementado com 0,6mg/mL de L-Carnitina, 0,4 nM de ácido docosahexaenóico e 0,6 nM de ácido eicosapentaenóico (LC+n3) visualizados por microscopia confocal. Oócitos fixados pós-MIV n Visualizados n MI n (%) T1 n (%) AP n (%) MII Total de MII n (%) Analisáveis n (%) Normais n (%) sem-FF 167 149 9(6,0%)a 2 (1,3%) 1 (0,7%) 137 (91,9%)a 94 (68,6%) 82 (87,2%)a FFControle 163 148 9 (6,1%)a 5 (3,4%) 2 (1,4%) 132 (89,2%)ab 78 (59,1%) 68 (87,2%)a FFControle +LC+n3 179 163 19 (11,7%)ab 3 (1,8%) 3 (1,8%) 138 (89,2%)ab 80 (58,0%) 66 (82,5%)ab FFEI/II 178 158 20 (12,7%)ab 1 (0,6%) 2 (1,3%) 135 (85,4%)ab 82 (60,7%) 51 (62,2%)c FFEI/II +LC+n3 186 163 16 (9,8%)ab 4 (2,5%) 4 (2,5%) 139 (85,3%)ab 84 (60,4%) 71 (84,5%)ad FFEIII/IV 185 166 28 (16,9%)bc 2 (1,2%) 2 (1,2%) 134 (80,7%)b 84 (62,7%) 59 (70,2%)bc FFEIII/IV +LC+n3 163 142 11 (7,7%)a 1 (0,7%) 1 (0,7%) 129 (90,8%)a 82 (63,6%) 69 (84,1%)ad FFEndometrioma 163 150 37 (24,7%)c 7 (4,7%) 2 (1,3%) 104 (69,3%)c 66 (63,5%) 48 (72,7%)bcd FFEndometrioma +LC+n3 177 162 18 (11,1%)ab 0 (0%) 4 (2,5%) 140 (86,4%)ab 85 (60,7%) 64 (75,3%)abc Nota: MIV: maturação in vitro; MI = metáfase I; TI = telófase I; MII = metáfase II; AP = ativação partenogenética. Analisáveis: oócitos com fuso fixado em uma visão lateral ou sagital. Dados são resultados de 8 replicatas utilizando fluido folicular de pacientes controles, com endom etriose leve, com endometriose grave sem endometrioma e com endometrioma. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística, p<0,05, usando te ste de qui-quadrado. 74 Figura 11: Alterações meióticas oocitárias mais sign ificativas encontradas em cada grupo: A -) Metáfase II normal no grupo FFControle; B -) Metáfase I no grupo FFEendometrioma; C -) a F -) Metáfase II anormal nos grupos FFEI/II, FFEIII/IV, FFEendometrioma e FFEendometioma+LC+n3, respectivamente Nota: Em verd e, marcação para fuso meiótico com anticorpo monoclonal anti -β-tubulina e anticorpo secundário conjugado com FITC. Em azul, marcação para material genético com Hoechst 33342. Barra branca no canto direito inferior: escala de 10 µm. Seta branca indica cromossomos desalinhados. 75 6. DISCUSSÃO 76 Apesar da estreita relação entre endometriose e infertilidade, os mecanismos etiopatogênicos envolvidos na diminuição da fertilidade natural dessas mulheres permanecem desconhecidos. Neste estudo, demonstramos que o FF de mulheres inférteis com endometriose quando adicionado ao meio de MIV de oócitos bovinos provoca diminuição da qualidade oocitária (avaliada neste estudo pelo bloqueio da maturação nuclear e comprometimento da organização do fuso e cromossomos de oócitos em MII ) quando comparado ao FF de mulheres inférteis sem a doença. A presença de endometrioma no ciclo de EOC apresenta um impacto ainda mais prejudicial à qualidade oocitária, afetando, principalmente, a maturação nuclear. A adição de LC e de ácidos graxos ômega -3 (DHA e EPA) preveniu esses danos, ressaltando o papel do EO e de alterações da β-oxidação na piora da qualidade de oócitos de mulheres com endometriose em estágios iniciais e avançados (com e sem endometrioma). Independentemente do estágio, nossos achados, usando modelo experimental bovino, evidenciam que a endometriose afeta a quali dade oocitária reduzindo a porcentagem de oócitos em MII com fuso normal e cromossomos alinhados comparada a dos grupos sem-FF e com FF controle. O fuso meiótico de oócitos é uma estrutura dinâmica, que alinha e segrega os cromossomos durante a meiose, for mado pela polimerização de subunidades α e β da proteína tubulina associada a mais de 100 outras proteínas (WITTMANN; HYMAN; DESAI , 2001) . Vários fatores podem alterar o fuso, sendo o EO, um deles (SHARMA; AZEEM; AGARWAL, 2013) . Radicais livres são moléculas contendo elétrons desemparelhados, e que devido a essa instabilidade de elétrons, pode danificar diretamente as proteínas do fuso (e outras macromoléculas celulares, como o DNA) provocando desarranjos estruturais e funcionais (SALVI et al. , 2001) . Excesso de radicais livres também pode alterar o potencial de mem brana da mitocôndria, levando a uma diminuição da produção de ATP e, consequente, desestruturação do fuso meiótico (ZHANG et al., 2006). Nossos achados corroboram achados anteriores do nosso grupo, demonstrando que adição de 1% de FF de mulheres inférteis com endometriose em estágios iniciais ao meio de MIV de oócitos bovinos prejudica a organização do fuso meiótico e o alinhamento cromossômico de oócitos em MII (DA BROI et al., 2014; GIORGI et al. , 2016) . Pela primeira vez, evidenciamos que o FF de mulheres inférteis com endometriose em estágios avançados (com e sem endometrioma) 77 também compromete a normalidade meiótica de oócitos bovinos submetidos a MIV na presença destes FF na concentração de 1%. Entretanto, Hamdan e colaboradores (2016), utilizando modelo murino, não observaram alteração de fuso meiótico e alinhamento cromossômico quando os oócitos foram maturados com FF de mulheres com endometriose grave; discordando de nossos resultados. No estudo de H amdan e colaboradores (2016), as doadoras de FF foram previamente submetidas ao exame de videolaparoscopia para diagnóstico, tratamento e estadiamento da endometriose de acordo com os critérios da ASRM, entretanto não houve menção da presença de infertilid ade e endometrioma como critério de inclusão/exclusão. Outras diferenças entre o presente estudo e o trabalho de Hamdan e colaboradors (2016) são: o tempo de incubação e a concentração de FF utilizada (Hamdan e colaboradores incubaram os oócitos em uma con centração de 15 -50% de FF por 18h). Dessa forma, hipotetizamos que a discordância de resultados entre o nosso estudo e o estudo de Hamdan e colaboradores (2016) relativos à organização do fuso meiótico deve -se, principalmente, ao modelo experimental utiliz ado. Morfologicamente e fisiologicamente oócitos de diferentes espécies apresentam diferenças, mesmo que sutis (SANTOS; SCHOEVERS; ROELEN , 2014) , entretanto, revisão avaliando as características oocitárias de bovinos, murinos , suínos e humanos, sugeriu que p ara estudos avaliando toxicologia reprodutiva (que no nosso caso seria a exposição a um ambiente com EO) os modelos bovinos e suínos seriam mais adequados que o modelo murino para representar oócitos humanos (SANTOS; SCHOEVERS; ROELEN, 2014). Apesar disso, Hamdan e colaboradores (2016) avaliaram alterações cromossômicas por outra metodologia, a fosforilação da histona H2AX (marcador de dano ao DNA e, portanto, ao cromossomo ), e reportaram uma maior quantidade de focos de fosforilação da histona H2AX nos oócitos incubados com FF de endometriose grave comparado aos grupos sem FF e com FF controle , indicando comprometimento dos cromossomos de oócitos de mulheres com endometriose grave, corroborando , ao menos em parte, os nossos achados (HAMDAN et al. , 2016). A taxa de maturação nuclear também foi avaliada no estudo de Hamdan e colaboradores (2016), que observaram que o FF de mulheres sem endometriose não afetou a taxa de maturação oocitária comparada ao gru po sem adição de FF 78 (HAMDAN et al. , 2016) . Entretanto, o FF de mulheres com endometriose grave (tanto a adição de 15% quanto 50%), prejudicou a taxa de maturação oocitária in vitro (HAMDAN et al., 2016). Os autores desse estudo sugerem que a diminuição da taxa de extrusão de CP no grupo incubado com FF de endometriose deve ser resultante de danos ao DNA provocados pelo EO (HAMDAN et al. , 2016) . Um trabalho de nosso grupo mostrou que o FF de mulheres inférteis com endometriose apresenta um aumento dos níveis de 8OHdG (marcador de dano oxidativo ao DNA) comparado a mulheres inférteis sem a do ença (DA BROI et al., 2016). Desta forma, Hamdan e colaboradores (2016) corroboram nossos resultados que o FF de mulheres inférteis com endometriose avançada (com e sem endometrioma) compromete a maturação nuclear oocitária (maior taxa de MI e menor taxa de MII) quando comparado ao FF de mulheres inférteis sem endometriose e com endometriose em estágios iniciais. Mostramos que a adição de FF de mulheres inférteis com endometrioma no ciclo diminui a taxa de maturação nuclear quando comparado aos demais grupos, inclusive, aquele contendo FF de mulheres com endometriose III/IV sem endometrioma no ciclo . Neste contexto, estudos prévios evidenciaram que o FF obtido de folículos de ovários contendo endometrioma apresentam maiores níveis de ferro livre e ferritin a comparado s a FF obtido d e ovários livre de endometrioma, e essa concentração parece aumentar quanto maior a proximidade do folículo com o endometrioma (SANCHEZ et al., 2014; BENAGLIA et al., 2015). No presente estudo, no grupo Eendometrioma, utilizamos tanto amostras de FF obtidas de ovário ipsilateral (2/8) como contralateral ao endometrioma (6/8) (APÊNDICE A). Estudo avaliando m ulheres com endometrioma unilateral comparou os resultados de fertilização in vitro (FIV) de oócitos provenientes do ovário ipsilateral e contralateral ao endometrioma, e não relatou diferenças nos números de oócitos captados , de embriões viáveis, assim como nas taxas de fertilização e de clivagem (FILIPPI et al., 2014). Portanto, embora, o conteúdo folicular de ferro seja alterado pela presença de endometrioma (SANCHEZ et al., 2014; BENAGLIA et al., 2015), os resultados de TRA parecem não ser alterados comparando ambos ovários de mulheres com endometriose com endometrioma unilateral (FILIPPI et al., 2014). Embora o trabalho de Filippi e colaboradores (2014) não tenha comparado os resultados de FIV entre mulheres com e sem endometrioma, sugerimos que, a lém do efeito negativo do contato direto do endometrioma com o córtex ovariano 79 adjacente sobre a foliculogênese (KITAJIMA et al., 2011; KURODA et al., 2012), a presença de endometrioma no ciclo interfere no compartimento sistêmico do organismo (soro) (CARMONA et al. , 2012; SANTULLI et a l., 2013) , afetando o ambiente folicular do ovário contralateral (nos casos de endometrioma unilateral) alterando também o FF. Análise proteômica por espectrometria de massa do FF de mulheres com endometrioma unilateral (amostra de FF ipsilateral e contra lateral) e sem endometriose (controle) identificou 535 proteínas expressas, sendo 139 comuns aos 3 grupos (endometrioma, ovário sem endometrioma e controle) (REGIANI et al., 2015). Análise de enriquecimento foi realizada a partir da composição do ovário com endometrioma e ovário sem endometrioma, sendo que ambos grupos apresentaram proteínas com funções similares, demonstrando o impacto da endometriose (ou presença de um endometrioma ativo no ciclo, independentemente da proximidade folicular) sobre a composição do FF (REGIANI et al., 2015). LC e ácidos graxos ômega -3 prev eniram os danos meióticos oocitários provocados pelo FF de mulheres inférteis com endometriose, independentemente do estágio da doença e da presença ou não de endometrioma . Estudo prévio de nosso grupo mostrou que a adição de LC previne os danos ao fuso meiótico de oócitos bovinos maturados in vitro na presença de FF de mulheres com endometriose leve (taxa de MII normais aumentou de 51,35% para 80,61% com LC ) (GIORGI et al. , 2016). Contudo, p ela primeira vez, mostramos que a adição conjunta de LC e de ácidos graxos ômega -3 previne os danos oocitários (tanto em nível de maturação nuclear quanto de organização d o fuso e alinhamento cromossômico em oócitos MII). Recente revisão destacou o importante papel da carnitina sobre a f ertilidade feminina discutindo estudos in vivo e in vitro envolvendo humanos ou modelos animais, e os possíveis mecanismos de ação da LC na melhora da fertilidade feminina (AGARWAL;GUPTA; DURAIRAJANAYAGAM, 2018) . Por outro lado, estudos experimentais mostram que suplementação com ômega -3 melhora a qualidade oocitária (NEHRA et al. , 2012) , regula o endométrio (WATERS et al. , 2014) e aumenta a taxa de prenhez (WATHES; ABAYASEKARA; AITKEN, 2007). Tanto a LC quanto os ácidos graxos estão envolvidos n a β -oxidação que é uma importante via mitocondrial de produção de energia durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial (DOWNS; MOSEY; KLINGER, 2009; DUNNING et al. , 2010; DUNNING; ROBKER , 2012; PACZKOWSKI et al. , 2013; 80 VALSANGKAR; DOWNS, 2013; DUNNING; RUSSEL; ROBKER, 2014; DUNNING et al., 2014) . Oócitos de mulheres inférteis com endometriose mínima ou leve apresentam alterações mitocondriais avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão e por reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-PCR) (XU et al., 2015). E, embora neste trabalho não investigamos as mitocôndrias oocitária, sugerimos que o EO presente no FF de mulheres inférteis com endom etriose (PRIETO et al., 2012; SINGH et al., 2013b; DA BROI; NAVARRO, 2016; HAMDAN et al., 2016; NASIRI et al. , 2017) , altere o funcionamento mitocondrial, contribuindo com a piora da qualidade oocitária (ZHANG et al., 2006; XU et al., 2015). A LC e os ácidos graxos ômega-3 ativariam a β-oxidação, normalizando os níveis de A TP que é essencial para a aquisição da competência oocitária (VAN BLERKOM ; DAVIS; LEE., 1995; FERREIRA et al., 2009b). Também sugerimos que os ácidos graxos ômega -3 tenham agido modulando a ação da enzima cicloxigenase-2 ( COX-2) (DERECKA et al. , 2008) nos oócitos maturados in vitro com FF de mulheres com endometrio se. A COX-2 está envolvida com metabolismo lipídico e inflamação e é codificada pelo gene PTGS2 (O'NEILL; FORD-HUTCHINSON, 1993) . Estudo de nosso grupo mostrou diminuição da expressão do gene PTGS2 em células do cumulus de mulheres com endometriose comparado a mulheres inférteis sem a doença submetidas à EOC pa ra ICSI (DA LUZ et al., 2017). Desta forma, é possível que o FF de mulheres com endometr iose (neste estudo, especialmente, III/IV) altere o funcionamento da COX -2 nos CCOs, diminuindo a expressão de PTGS2, o que afetaria a maturação nuclear oocitária e a resolução da meiose I. E os ácidos graxos ômega -3 devem ter modulado a COX -2 que poderia promover o funcionamento normal do gene PTGS2, e, por consequência, normalizar a taxa de maturação nuclear (MAREI et al., 2014) Embora há estudos controversos (KIM et al., 2013; KHANAKI et al., 2014) e evidências fracas sobres os efeitos benéficos do ômega -3 para a endometriose (GAZVANI et al., 2001; MISSMER et al., 2004; NETSU et al., 2008; ATTAMAN et al., 2014; HOPEMAN et al. , 2015; AKYOL et al. , 2016) , os ácidos graxos ômega -3 parecem estar envolvidos com a supressão da progressão da endometriose, provavelmente modulando a inflamação em favor da síntese de r esolvinas (DMITRIEVA; SUESS; SHIRLEY, 2014) o que poderia impactar diretamente no alívio da dor . Recente estudo clínico registrado no ISRCTN (ISRCTN44202346) pretende avaliar a eficácia do ômega -3 no tratamento da dor relacionada à endometriose com 81 um estudo duplo-cego utilizando dois braços de estudo: i) uso de ômega -3 (Omacor 1000mg 2 vezes ao dia) e ii) cápsula de azeite de oliva com semelhante aspecto (ABOKHRAIS et al., 2018). Entretanto, não há estudos avaliando o uso de PUFA omega -3 na melhora da in fertilidade relacionada à endometriose. Estudo de coorte prospectivo (n=100) avaliou a relação entre níveis séricos de PUFA n-6 e n-3 sobre os resultados de TRA e observou que maiores níveis sérios de ômega -3 estavam associados a uma maior probabilidade de gestação clínica e nascidos vivos por ciclo iniciado (CHIU et al. , 2018). Mirabi e colaboradores (2017) também observa ram uma maior concentração de EPA no soro de mulheres submetidas às técnicas d e TRA que engravidaram comparadas àquelas que não engravidaram, no entanto, quando essa comparação foi realizada utilizando amostras de FF, nenhuma diferença foi encontrada (MIRABI et al., 2017). Avaliando os dados clínicos dos grupos de doadoras de FF (FFControle, FFEI/II, FF EIII/IV e FFEendometrioma), observamos uma diferença na duração da infertilidade entre os grupos FFControle e FFEendometrioma. Acreditamos que essa diferença não seja importante neste estudo, vi sto que a mediana das idades (este sim, um fator relacionado a piora da qualidade oocitária) entre os grupos não diferiu. Nosso estudo trouxe contribuições inéditas para a elucidação da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. Porém, co ntamos com algumas limitações. I-) Utilizamos FF de mulheres submetidas à EOC, tornando questionável a extrapolação dos resultados para ciclos naturais; porém, o grupo controle também foi submetido a protocolos de bloqueio hipofisário semelhantes. II-) Para a classificação da endometriose utilizamos os critérios da ASRM, e não podemos saber se a utilização de outros critérios [como por exemplo o índice de fertilidade (ADAMSON; PASTA, 2010)] poderiam levar a resultados semelhantes. I II- ) Utilizamos o FF apenas do primeiro folículo aspirado de cada paciente, pois n ão sabemos se a prorrogação da anestesia e repetidas punções ovarianas promoveriam EO folicular; todavia, não podemos afirmar que FFs de diferentes folículos teriam o mesmo impacto durante a MIV sobre o oócito. IV-) Além disso, os dados obtidos a partir de estudos com modelos animais pode não necessariamente ser extrapolado s para os seres humanos e estudos com oócitos de mulheres inférteis com endometriose maturados in vivo seriam importantes para confirmar nossos resultados. V) Pequena casuística avaliada relativa ao número de amostras 82 de FF dos quatro grupos avaliados, o que limita a generalização de nossos achados. Todavia, nossos restritivos critérios de elegibilidade para as doadoras de FF, importante para aumentar a validade interna dos resultados, e a limitada indicação de videolaparoscopia na abordagem atual da infertilidade, tornaram bastante difícil a inclusão de mais pacientes e estudos com maiores casuísticas são importantes para confirmar nossos achados. Atualmente, os tratamentos disponíveis par a a infertilidade relacionada à endometriose são cirúrgicos e/ou as TRA (KENNEDY et al., 2005) que são invasivos e/ou de elevado custo, com consequente baixo acesso populacional. Portanto, novas abordagens terapêuticas seriam essenciais para auxiliar milhares de mulheres atingidas por essa doenç a. Devido às propriedades da LC e dos ácidos graxos ômega-3, a combinação de tratamento cirúrgico com a suplementação dessas substâncias poderia impedir a recorrência e/ou progressão da endometriose (devido à ação antioxidante da LC e anti -inflamatória dos ácidos graxos ômega -3) e melhorar a fertilidade natural (por prevenir o EO, o comprometimento da beta oxidação e os danos oocitários) visto que o as TRA não são acessíveis a todas as mulheres. Nossos achados estimulam o delineamento de estudos clínicos investigando o impacto da suplementação conjunta de LC e ácidos graxos ômega -3 na melhora da fertilidade natural de mulheres inférteis com endometriose. 83 7. CONCLUSÕES 84 I-) O FF de mulheres inférteis com endometriose, independentemente do estágio da doença, diminui a taxa de MII normais quando adicionado ao meio de MIV de oócitos bovinos, comparado à adição de FF de mulheres inférteis sem endometriose. Entretanto, o FF de mulheres inférteis com endometriose em estágios avançados (III/IV) prejudica a taxa de maturação nuclear comparado ao grupo sem -FF, o que não é observado no grupo com FF de mulheres inférteis com endometriose em estágios iniciais. E o FF de mulheres inférteis com endometrioma, quando adicionado ao meio de MIV de oócitos bovinos, diminui a ta xa de maturação nuclear comparado à adição de FF de mulheres inférteis sem endometriose, com endometriose em estágios iniciais e com endometriose em estágios avançados sem endometrioma. Portanto, a avanço do estágio da endometriose , assim como a presença de endometrioma no ciclo (mesmo que contralateral), apresentam impacto mais deletério sobre a qualidade oocitária. II-) A suplementação do meio de MIV de oócitos bovinos com L C e ácidos graxos ômega-3 (DHA e EPA) preveniu os danos meióticos oocitários prov ocados pela adição do FF de mulheres inférteis com endometriose (em todos os estágios). Dessa forma, sugerimos que o estado inflamatório e de estresse oxidativo ex acerbado, assim como, a desregulação da β -oxidação podem estar envolvidos na piora da qualidade oocitária, com consequente prejuízo da fertilidade natural de mulheres com endometriose. 85 BIBLIOGRAFIA 86 ABBAS, S. et al. Prevalence a nd incidence of diagnosed endometriosis and risk of endometriosis in patients with endometriosis -related symptoms: findings from a statutory health insurance-based cohort in Germany. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v. 160, n. 1, p. 79-83, 2012. ABOKHRAIS, I. M. et al. A pilot randomised double blind controlled trial of the efficacy of purified fatty acids for the treatment of women with endometriosis - associated pain (PurFECT): study protocol. Pilot Feasibility Stud, v. 4, p. 83, 2018. ABRIEU, A. et al. Mps1 is a kinetochore -associated kinase essential for the vertebrate mitotic checkpoint. Cell, v. 106, n. 1, p. 83-93, 2001. ADAMSON, G. D.; PASTA, D. J. Endometriosis fertility index: the new, validated endometriosis staging system. Fertil Steril, v. 94, n. 5, p. 1609-15, 2010. ADONA, P. R.; LIMA VERDE LEAL, C. Meiotic inhibition with different cyclin - dependent kinase inhibitors in bovine oocytes and its effects on maturation and embryo development. Zygote, v. 12, n. 3, p. 197-204, 2004. AGARWAL, A.; GUPTA, S.; SHARMA, R. Oxidative stress and its implications in female infertility - a clinician's perspective. Reprod Biomed Online, v. 11, n. 5, p. 641-50, 2005. AGARWAL, A.; SENGUPTA, P.; DURAIRAJANAYAGAM, D. Role of L -carnitine in female infertility. Reprod Biol Endocrinol, v. 16, n. 1, p. 5, 2018. AKYOL, A. et al. Efficacies of vitamin D and omega -3 polyunsaturated fatty acids on experimental endometriosis. Taiwan J Obstet Gynecol, v. 55, n. 6, p. 835 -839, 2016. ANTONIO, C. et al. Xkid, a chromokinesin required for chromosome alignment on the metaphase plate. Cell, v. 102, n. 4, p. 425-35, 2000. ARMSTRONG, D. T. Effects of maternal age on oocyte developmental competence. Theriogenology, v. 55, n. 6, p. 1303-22, 2001. ASRM. Revised Ameri can Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril, v. 67, n. 5, p. 817-21, 1997. ATTAMAN, J. A. et al. The anti -inflammatory impact of omega -3 polyunsaturated Fatty acids during the establishment of endometriosis -like lesions. Am J Reprod Immunol, v. 72, n. 4, p. 392-402, 2014. BECKMAN, K. B.; AMES, B. N. The free radical theory of aging matures. Physiol Rev, v. 78, n. 2, p. 547-81, 1998. BELLELIS, P. et al. Epidemiological and clinical aspects of pelvic endo metriosis–a case series. Rev Assoc Med Bras (1992), v. 56, n. 4, p. 467-71, 2010. 87 BENAGIANO, G.; BROSENS, I. History of adenomyosis. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, v. 20, n. 4, p. 449-63, 2006. BENAGIANO, G; BROSENS, I . Who identified endometrios is? Fertil Steril, v. 95, n. 1, p. 13-6, 2011. BENAGIANO, G.; BROSENS, I.; LIPPI, D. The history of endometriosis. Gynecol Obstet Invest, v. 78, n. 1, p. 1-9, 2014. BENAGLIA, L. et al. Intrafollicular iron and ferritin in women with ovarian endometriomas. Acta Obstet Gynecol Scand, v. 94, n. 6, p. 646-53, 2015. BERLETT, B. S.; STADTMAN, E. R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem, v. 272, n. 33, p. 20313-6, 1997. BIGGERS, J. D.; WHITTINGHAM, D. G.; DONAHUE, R. P. T he pattern of energy metabolism in the mouse oöcyte and zygote. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 58, n. 2, p. 560-7, 1967. BROSENS, I. et al. Early stage management of ovarian endometrioma to prevent infertility. Facts Views Vis Obgyn, v. 5, n. 4, p. 309-14, 2013. BURNEY, R. O.; GIUDICE, L. C. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil Steril, v. 98, n. 3, p. 511-9, 2012. BÄCHLER, M. et al. Species -specific differences in follicular antral sizes result from diffusion-based limitations on the thickness of the granulosa cell layer. Mol Hum Reprod, v. 20, n. 3, p. 208-21, 2014. BÉRUBÉ, S. et al. Fecundity of infertile women with minimal or mild endometriosis and women with unexplained infertility. The Canadian Collaborative Group on Endometriosis. Fertil Steril, v. 69, n. 6, p. 1034-41, 1998. CARMONA, F. et al. Ovarian endometrioma but not deep infiltrating endometriosis is associated with increased serum levels of interleukin -8 and interleukin -6. J Reprod Immunol, v. 95, n. 1-2, p. 80-6, 2012. CHAMIÉ, L. P. et al. Atypical Sites of Deeply Infiltrative Endometriosis: Clinical Characteristics and Imaging Findings. Radiographics, v. 38, n. 1, p. 309-328, 2018. CHANKITISAKUL, V. et al. Supplementation of maturation medium with L -carnitine improves cryo-tolerance of bovine in vitro matured oocytes. Theriogenology, v. 79, n. 4, p. 590-8, 2013. CHAVARRO, J. E. et al. Dietary fatty acid intakes and the risk of ovulatory infertility. Am J Clin Nutr, v. 85, n. 1, p. 231-7, 2007. CHAVARRO, J. E. et al . A prospective study of polyunsaturated fatty acid levels in blood and prostate cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, v. 16, n. 7, p. 1364-70, 2007. 88 CHIU, Y. H. et al. Serum omega -3 fatty acids and treatment outcomes among women un dergoing assisted reproduction. Hum Reprod, v. 33, n. 1, p. 156 -165, 2018. CHOI, W. J. et al. Oxidative stress and tumor necrosis factor -alpha-induced alterations in metaphase II mouse oocyte spindle structure. Fertil Steril, v. 88, n. 4 Suppl, p. 1220-31, 2007. CHOI, Y. S. et al. Alteration in the intrafollicular thiol -redox system in infertile women with endometriosis. Reproduction, v. 149, n. 2, p. 155-62, 2015. CUNHA-FILHO, J. S. et al. Insulin-like growth factor (IGF)-1 and IGF binding protein- 1 and -3 in the follicular fluid of infertile patients with endometriosis. Hum Reprod, v. 18, n. 2, p. 423-8, 2003. D'HOOGHE, T. M. et al. The cycle pregnancy rate is normal in baboons with stage I endometriosis but decreased in primates with stage II an d stage III-IV disease. Fertil Steril, v. 66, n. 5, p. 809-13, 1996. DA BROI, M. G. et al. Follicular fluid from infertile women with mild endometriosis may compromise the meiotic spindles of bovine metaphase II oocytes. Hum Reprod, v. 29, n. 2, p. 315-23, 2014. DA BROI, M. G. et al. Increased concentration of 8 -hydroxy-2'-deoxyguanosine in follicular fluid of infertile women with endometriosis. Cell Tissue Res, 2016. DA BROI, M. G.; NAVARRO, P. A. Oxidative stress and oocyte quality: ethiopathogenic m echanisms of minimal/mild endometriosis -related infertility. Cell Tissue Res, v. 364, n. 1, p. 1-7, 2016. DA BROI, M. G. et al. Influence of follicular fluid and cumulus cells on oocyte quality: clinical implications. J Assist Reprod Genet, v. 35, n. 5, p. 735-751, 2018. DA BROI, M. G. et al Oocyte oxidative DNA damage may be involved in minimal/mild endometriosis -related infertility. Mol Reprod Dev, v. 85, n. 2, p. 128 - 136, 2018. DA LUZ, C. M. et al. PTGS2 down-regulation in cumulus cells of infertile women with endometriosis. Reprod Biomed Online, v. 35, n. 4, p. 379-386, 2017. DAS, S. et al. Reactive oxygen species level in follicular fluid --embryo quality marker in IVF? Hum Reprod, v. 21, n. 9, p. 2403-7, 2006. DE JONGE, C. J. et al. The acroso me reaction-inducing effect of human follicular and oviductal fluid. J Androl, v. 14, n. 5, p. 359-65, 1993. DE LIMA, C. B. et al. Follicular fluid lipid peroxidation levels in women with endometriosis during controlled ovarian hyperstimulation. Hum Fertil (Camb), v. 20, n. 1, p. 48-54, 2017. 89 DE SANTIS, L. et al. Polar body morphology and spindle imaging as predictors of oocyte quality. Reprod Biomed Online, v. 11, n. 1, p. 36-42, 2005. DE ZIEGLER, D.; BORGHESE, B.; CHAPRON, C. Endometriosis and infer tility: pathophysiology and management. Lancet, v. 376, n. 9742, p. 730-8, 2010. DERECKA, K. et al. A PPAR -independent pathway to PUFA -induced COX -2 expression. Mol Cell Endocrinol, v. 287, n. 1-2, p. 65-71, 2008. DMITRIEVA, N.; SUESS, G.; SHIRLEY, R. R esolvins RvD1 and 17(R) -RvD1 alleviate signs of inflammation in a rat model of endometriosis. Fertil Steril, v. 102, n. 4, p. 1191-6, 2014. DONNEZ, J. et al. Large ovarian endometriomas. Hum Reprod, v. 11, n. 3, p. 641 - 6, 1996. DONNEZ, J. et al. Oxidat ive stress in the pelvic cavity and its role in the pathogenesis of endometriosis. Fertil Steril, v. 106, n. 5, p. 1011-1017, 2016. DOWNS, S. M.; HUNZICKER -DUNN, M. Differential regulation of oocyte maturation and cumulus expansion in the mouse oocyte -cumulus cell complex by site -selective analogs of cyclic adenosine monophosphate. Dev Biol, v. 172, n. 1, p. 72-85, 1995. DOWNS, S. M.; MOSEY, J. L.; KLINGER, J. Fatty acid oxidation and meiotic resumption in mouse oocytes. Mol Reprod Dev, v. 76, n. 9, p. 844-53, 2009. DUMESIC, D. A. et al. Oocyte environment: follicular fluid and cumulus cells are critical for oocyte health. Fertil Steril, v. 103, n. 2, p. 303-16, 2015. DUNNING, K. R. et al. Beta -oxidation is essential for mouse oocyte developmental competence and early embryo development. Biol Reprod, v. 83, n. 6, p. 909 -18, 2010. DUNNING, K. R.; ROBKER, R. L. Promoting lipid utilization with l -carnitine to improve oocyte quality. Anim Reprod Sci, v. 134, n. 1-2, p. 69-75, 2012. DUNNING, K. R. et al. Regulation of fatty acid oxidation in mouse cumulus -oocyte complexes during maturation and modulation by PPAR agonists. PLoS One, v. 9, n. 2, p. e87327, 2014. DUNNING, K. R.; RUSSELL, D. L.; ROBKER, R. L. Lipids and oocyte developmental competence: the role of fatty acids and β -oxidation. Reproduction, v. 148, n. 1, p. R15-27, 2014. EDWARDS, R. G. Follicular fluid. J Reprod Fertil, v. 37, n. 1, p. 189-219, 1974. EICHENLAUB-RITTER, U.; SHEN, Y.; TINNEBERG, H. R. Manipulation of the oocyte: possible dam age to the spindle apparatus. Reprod Biomed Online, v. 5, n. 2, p. 117-24, 2002. 90 EISENBACH, M. Mammalian sperm chemotaxis and its association with capacitation. Dev Genet, v. 25, n. 2, p. 87-94, 1999. EVANS, A. M.; FORNASINI, G. Pharmacokinetics of L -carnitine. Clin Pharmacokinet, v. 42, n. 11, p. 941-67, 2003. FALCONER, H. et al. IVF outcome in women with endometriosis in relation to tumour necrosis factor and anti -Müllerian hormone. Reprod Biomed Online, v. 18, n. 4, p. 582-8, 2009. FERREIRA, E. M. et al. Prematuration of bovine oocytes with butyrolactone I reversibly arrests meiosis without increasing meiotic abnormalities after in vitro maturation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v. 145, n. 1, p. 76-80, 2009. FERREIRA, E. M. et al. . Cytoplasmic maturation of bovine oocytes: structural and biochemical modifications and acquisition of developmental competence. Theriogenology, v. 71, n. 5, p. 836-48, 2009. FILIPPI, F. et al. Ovarian endometriomas and oocyte quality: insights from in vitro fertilization cycles. Fertil Steril, v. 101, n. 4, p. 988-93.e1, 2014. FLACHS, P. et al. Polyunsaturated fatty acids of marine origin upregulate mitochondrial biogenesis and induce beta -oxidation in white fat. Diabetologia, v. 48, n. 11, p. 2365-75, 2005. FRITZ, I. B.; MARQUIS, N. R. The role of acylcarnitine esters and carnitine palmityltransferase in the transport of fatty acyl groups across mitochondrial membranes. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 54, n. 4, p. 1226-33, 1965. FULDEORE, M. J.; SOLIMAN, A. M. P revalence and Symptomatic Burden of Diagnosed Endometriosis in the United States: National Estimates from a Cross - Sectional Survey of 59,411 Women. Gynecol Obstet Invest, v. 82, n. 5, p. 453 -461, 2017. FUNABIKI, H.; MURRAY, A. W. The Xenopus chromokinesi n Xkid is essential for metaphase chromosome alignment and must be degraded to allow anaphase chromosome movement. Cell, v. 102, n. 4, p. 411-24, 2000. GARCIA-VELASCO, J. A.; ARICI, A. Is the endometrium or oocyte/embryo affected in endometriosis? Hum Reprod, v. 14 Suppl 2, p. 77-89, 1999. GARRIDO, N. et al. Follicular hormonal environment and embryo quality in women with endometriosis. Hum Reprod Update, v. 6, n. 1, p. 67-74, 2000. GAZVANI, M. R. et al. High omega -3:omega-6 fatty acid ratios in cultur e medium reduce endometrial -cell survival in combined endometrial gland and stromal cell cultures from women with and without endometriosis. Fertil Steril, v. 76, n. 4, p. 717- 22, 2001. 91 GAZVANI, R.; TEMPLETON, A. Peritoneal environment, cytokines and angi ogenesis in the pathophysiology of endometriosis. Reproduction, v. 123, n. 2, p. 217 -26, 2002. GIACOMINI, E. et al. Characteristics of follicular fluid in ovaries with endometriomas. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v. 209, p. 34-38, 2017. GIORGI, V. S . et al. N -Acetyl-Cysteine and l -Carnitine Prevent Meiotic Oocyte Damage Induced by Follicular Fluid From Infertile Women With Mild Endometriosis. Reprod Sci, v. 23, n. 3, p. 342-51, 2016. GOSDEN, R. G. et al. Physiological factors underlying the format ion of ovarian follicular fluid. J Reprod Fertil, v. 82, n. 2, p. 813-25, 1988. GOUD, P. T. et al. Dynamics of nitric oxide, altered follicular microenvironment, and oocyte quality in women with endometriosis. Fertil Steril, v. 102, n. 1, p. 151-159.e5, 2014. HAGHIAC, M. et al. Dietary Omega -3 Fatty Acid Supplementation Reduces Inflammation in Obese Pregnant Women: A Randomized Double -Blind Controlled Clinical Trial. PLoS One, v. 10, n. 9, p. e0137309, 2015. HALBAN, J. Metastatic hysteroadenosis: Wien klin Wochenschr. 37: 1205-1206 p. 1924. HAMDAN, M. et al. The sensitivity of the DNA damage checkpoint prevents oocyte maturation in endometriosis. Sci Rep, v. 6, p. 36994, 2016. HAMMICHE, F. et al. Increased preconception omega -3 polyunsaturated fatt y acid intake improves embryo morphology. Fertil Steril, v. 95, n. 5, p. 1820-3, 2011. HOPEMAN, M. M. et al. Serum Polyunsaturated Fatty Acids and Endometriosis. Reprod Sci, v. 22, n. 9, p. 1083-7, 2015. HU, Y. et al. Effects of low O2 and ageing on sp indles and chromosomes in mouse oocytes from pre-antral follicle culture. Hum Reprod, v. 16, n. 4, p. 737-48, 2001. IWANOFF, N. Dusiges cystenhaltiges uterusfibromyom compliciert durch sarcom und carcinom: Monatsch Geburtshilfe Gynakol. 7: 295-300 p. 1898. JOMOVA, K.; VALKO, M. Importance of iron chelation in free radical -induced oxidative stress and human disease. Curr Pharm Des, v. 17, n. 31, p. 3460 -73, 2011. JU, J. C. et al. Heat shock reduces developmental competence and alters spindle configuration of bovine oocytes. Theriogenology, v. 64, n. 8, p. 1677-89, 2005. JUNGHEIM, E. S. et al. Elevated serum α -linolenic acid levels are associated with decreased chance of pregnancy after in vitro fertilization. Fertil Steril, v. 96, n. 4, p. 880-3, 2011. 92 KENNEDY, S. et al. ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of endometriosis. Hum Reprod, v. 20, n. 10, p. 2698-704, 2005. KHANAKI, K. et al. High ω-3:ω-6 fatty acids ratio increases fatty acid binding protein 4 and extracellular secretory phos pholipase A2IIa in human ectopic endometrial cells. Iran J Reprod Med, v. 12, n. 11, p. 755-64, 2014. KIM, N. H. et al. Microtubule and microfilament organization in maturing human oocytes. Hum Reprod, v. 13, n. 8, p. 2217-22, 1998. KIM, T. H. et al. Differences in omega-3 and fatty acid profiles between patients with endometriosis and those with a functional ovarian cyst. J Obstet Gynaecol, v. 33, n. 6, p. 597-600, 2013. KITAJIMA, M. et al. Endometriomas as a possible cause of reduced ovarian reserv e in women with endometriosis. Fertil Steril, v. 96, n. 3, p. 685-91, 2011. KURODA, M. et al. Histological assessment of impact of ovarian endometrioma and laparoscopic cystectomy on ovarian reserve. J Obstet Gynaecol Res, v. 38, n. 9, p. 1187-93, 2012. LAMAITA, R. M. et al. Evaluation of N -acetilglucosaminidase and myeloperoxidase activity in patients with endometriosis -related infertility undergoing intracytoplasmic sperm injection. J Obstet Gynaecol Res, v. 38, n. 5, p. 810-6, 2012. LEE, B. J. et a l. Effects of L -carnitine supplementation on oxidative stress and antioxidant enzymes activities in patients with coronary artery disease: a randomized, placebo-controlled trial. Nutr J, v. 13, p. 79, 2014. LIMOLI, C. L. et al. Apoptosis, reproductive f ailure, and oxidative stress in Chinese hamster ovary cells with compromised genomic integrity. Cancer Res, v. 58, n. 16, p. 3712-8, 1998. LIU, F. et al. The expression and role of oxidative stress markers in the serum and follicular fluid of patients with endometriosis. Clin Exp Obstet Gynecol, v. 40, n. 3, p. 372-6, 2013. LIU, L. et al. Oxidative stress contributes to arsenic -induced telomere attrition, chromosome instability, and apoptosis. J Biol Chem, v. 278, n. 34, p. 31998 -2004, 2003. LONERGAN, P. et al. Effect of follicle size on bovine oocyte quality and developmental competence following maturation, fertilization, and culture in vitro. Mol Reprod Dev, v. 37, n. 1, p. 48-53, 1994. LOUSSE, J. C. et al. Peritoneal endometriosis is an infla mmatory disease. Front Biosci (Elite Ed), v. 4, p. 23-40, 2012. 93 MALHI, P. S.; ADAMS, G. P.; SINGH, J. Bovine model for the study of reproductive aging in women: follicular, luteal, and endocrine characteristics. Biol Reprod, v. 73, n. 1, p. 45-53, 2005. MANDELBAUM, J. et al. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human oocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v. 113 Suppl 1, p. S17-23, 2004. MANESCHI, F. et al. Ovarian cortex surrounding benign neoplasms: a histologic study. Am J Obstet Gynecol, v. 169, n. 2 Pt 1, p. 388-93, 1993. MANSOUR, G. et al. L -carnitine supplementation reduces oocyte cytoskeleton damage and embryo apoptosis induced by incubation in peritoneal fluid from patients with endometriosis. Fertil Steril, v. 91, n. 5 Suppl, p. 2079-86, 2009. MAREI, W. F. et al. Role of PTGS2 -generated PGE2 during gonadotrophin -induced bovine oocyte maturation and cumulus cell expansion. Reprod Biomed Online, v. 28, n. 3, p. 388-400, 2014. MBIZVO, M. T.; BURKMAN, L. J.; ALEXANDER, N. J. Human follicular fluid stimulates hyperactivated motility in human sperm. Fertil Steril, v. 54, n. 4, p. 708 - 12, 1990. MEULEMAN, C. et al. High prevalence of endometriosis in infertile women with normal ovulation and normospermic partners. Fertil Ste ril, v. 92, n. 1, p. 68 -74, 2009. MIAO, Y. et al. The protective role of melatonin in porcine oocyte meiotic failure caused by the exposure to benzo(a)pyrene. Hum Reprod, v. 33, n. 1, p. 116 -127, 2018. MIRABI, P. et al. The role of fatty acids on ICSI outcomes: a prospective cohort study. Lipids Health Dis, v. 16, n. 1, p. 18, 2017. MISSMER, S. A. et al. Incidence of laparoscopically confirmed endometriosis by demographic, anthropometric, and lifestyle factors. Am J Epidemiol, v. 160, n. 8, p. 784-96, 2004. MOAWAD, A. R. et al. l -carnitine supplementation during vitrification of mouse germinal vesicle stage -oocytes and their subsequent in vitro maturation improves meiotic spindle configuration and mitochondrial distribution in metaphase II oocytes. Hum Reprod, 2014. MOEN, M. H.; SCHEI, B. Epidemiology of endometriosis in a Norwegian county. Acta Obstet Gynecol Scand, v. 76, n. 6, p. 559-62, 1997. MONTJEAN, D. et al. Carnitine content in the follicular fluid and expression of the enzymes involved in beta oxidation in oocytes and cumulus cells. J Assist Reprod Genet, v. 29, n. 11, p. 1221-5, 2012. 94 MORAN, L. J. et al. Altered Preconception Fatty Acid Intake Is Associated with Improved Pregnancy Rates in Overweight and Obese Women Undertaking in Vit ro Fertilisation. Nutrients, v. 8, n. 1, 2016. MULLEN, S. F. et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Hum Reprod, v. 19, n. 5, p. 1148-54, 2004. NADJARZADEH, A. et al. Effe ct of Omega -3 Supplementation on Visfatin, Adiponectin, and Anthropometric Indices in Women with Polycystic Ovarian Syndrome. J Reprod Infertil, v. 16, n. 4, p. 212-20, 2015. NAKAGAWA, K. et al. Measurement of oxidative stress in the follicular fluid of infertility patients with an endometrioma. Arch Gynecol Obstet, v. 293, n. 1, p. 197 - 202, 2016. NASIRI, N. et al. Oxidative Stress Statues in Serum and Follicular Fluid of Women with Endometriosis. Cell J, v. 18, n. 4, p. 582-587, 2017. NAVARRO, P. A. et al. Arsenite induces aberrations in meiosis that can be prevented by coadministration of N -acetylcysteine in mice. Fertil Steril, v. 85 Suppl 1, p. 1187-94, 2006. NAVARRO, P. A.; LIU, L.; KEEFE, D. L. In vivo effects of arsenite on meiosis, preimplantation development, and apoptosis in the mouse. Biol Reprod, v. 70, n. 4, p. 980-5, 2004. NEHRA, D. et al. Prolonging the female reproductive lifespan and improving egg quality with dietary omega-3 fatty acids. Aging Cell, v. 11, n. 6, p. 1046-54, 2012. NETSU, S. et al. Oral eicosapentaenoic acid supplementation as possible therapy for endometriosis. Fertil Steril, v. 90, n. 4 Suppl, p. 1496-502, 2008. NIKOLOFF, N. et al. Effect of eicosapentaenoic acid on bovine cumulus -oocyte complex in vitro. Cell Biol Int, v. 41, n. 5, p. 505-513, 2017. NISOLLE, M.; DONNEZ, J. Peritoneal endometriosis, ovarian endometriosis, and adenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entities. Fertil Steril, v. 68, n. 4, p. 585-96, 1997. O'NEILL, G. P.; FORD-HUTCHINSON, A. W. Expression of mRNA for cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 in human tissues. FEBS Lett, v. 330, n. 2, p. 156-60, 1993. OPØIEN, H. K. et al. Do endometriomas induce an inflammatory reaction in nearby follicles? Hum Reprod, v. 28, n. 7, p. 1837-45, 2013. OSEIKRIA, M. et al. N -3 polyunsaturated fatty acid DHA during IVM affected oocyte developmental competence in cattle. Theriogenology, v. 85, n. 9, p. 1625 -1634.e2, 2016. 95 PACZKOWSKI, M. et al. Comparative importance of fatty ac id beta -oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biol Reprod, v. 88, n. 5, p. 111, 2013. PAFFONI, A. et al. The Gametotoxic Effects of the Endometrioma Content: Insig hts From a Parthenogenetic Human Model. Reprod Sci, p. 1933719118777637, 2018. PARAZZINI, F. Ablation of lesions or no treatment in minimal -mild endometriosis in infertile women: a randomized trial. Gruppo Italiano per lo Studio dell'Endometriosi. Hum Reprod, v. 14, n. 5, p. 1332-4, 1999. PARAZZINI, F. et al. Epidemiology of endometriosis and its comorbidities. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v. 209, p. 3-7, 2017. PATEL, B. G. et al. Pathogenesis of endometriosis: Interaction between Endocrine and inflammatory pathways. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2018. PAVLOK, A.; LUCAS -HAHN, A.; NIEMANN, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Mol Reprod Dev, v. 31, n. 1, p. 63-7, 1992. PELLICER, A. et al. The follicular endocrine environment in stimulated cycles of women with endometriosis: steroid levels and embryo quality. Fertil Steril, v. 69, n. 6, p. 1135-41, 1998. PELLICER, A. et al . The follicular endocrine enviro nment in stimulated cycles of women with endometriosis: steroid levels and embryo quality. Fertil Steril, v. 69, n. 6, p. 1135-41, 1998. PHONGNIMITR, T. et al. Effect of L -carnitine on maturation, cryo -tolerance and embryo developmental competence of bov ine oocytes. Anim Sci J, v. 84, n. 11, p. 719-25, 2013. PREIS, K. A.; SEIDEL, G. E.; GARDNER, D. K. Reduced oxygen concentration improves the developmental competence of mouse oocytes following in vitro maturation. Mol Reprod Dev, v. 74, n. 7, p. 893-903, 2007. PRIETO, L. et al. Analysis of follicular fluid and serum markers of oxidative stress in women with infertility related to endometriosis. Fertil Steril, v. 98, n. 1, p. 126 -30, 2012. RAHBAR, N.; ASGHARZADEH, N.; GHORBANI, R. Effect of omega -3 fatty acids on intensity of primary dysmenorrhea. Int J Gynaecol Obstet, v. 117, n. 1, p. 45 -7, 2012. REDWINE, D. B. Ovarian endometriosis: a marker for more extensive pelvic and intestinal disease. Fertil Steril, v. 72, n. 2, p. 310-5, 1999. 96 REGIANI, T. et al. Follicular fluid alterations in endometriosis: label -free proteomics by MS(E) as a functional tool for endometriosis. Syst Biol Reprod Med, v. 61, n. 5, p. 263-76, 2015. REVELLI, A. et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reprod Biol Endocrinol, v. 7, p. 40, 2009. RODGERS, R. J.; IRVING -RODGERS, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod, v. 82, n. 6, p. 1021-9, 2010. RUSSELL, W. Aberrant portio ns of the mullerian duct found in an ovary. Ovarian cysts of mullerian origin: Bull Johns Hopkins Hosp 1899. SALVI, A. et al. Structural damage to proteins caused by free radicals: asessment, protection by antioxidants, and influence of protein binding. Biochem Pharmacol, v. 61, n. 10, p. 1237-42, 2001. SAMPSON, J. A. Metastatic or Embolic Endometriosis, due to the Menstrual Dissemination of Endometrial Tissue into the Venous Circulation. Am J Pathol, v. 3, n. 2, p. 93-110.43, 1927. SANCHEZ, A. M. et a l. Iron availability is increased in individual human ovarian follicles in close proximity to an endometrioma compared with distal ones. Hum Reprod, v. 29, n. 3, p. 577-83, 2014. SANCHEZ, A. M. et al . The distinguishing cellular and molecular features o f the endometriotic ovarian cyst: from pathophysiology to the potential endometrioma - mediated damage to the ovary. Hum Reprod Update, v. 20, n. 2, p. 217-30, 2014. SANTANAM, N.; ZONERAICH, N.; PARTHASARATHY, S. Myeloperoxidase as a Potential Target in Wo men With Endometriosis Undergoing IVF. Reprod Sci, v. 24, n. 4, p. 619-626, 2017. SANTOS, R. R.; SCHOEVERS, E. J.; ROELEN, B. A. Usefulness of bovine and porcine IVM/IVF models for reproductive toxicology. Reprod Biol Endocrinol, v. 12, p. 117, 2014. SANTULLI, P. et al. Interleukin -19 and interleukin-22 serum levels are decreased in patients with ovarian endometrioma. Fertil Steril, v. 99, n. 1, p. 219-26, 2013. SASSON, I. E.; TAYLOR, H. S. Stem cells and the pathogenesis of endometriosis. Ann N Y Acad Sci, v. 1127, p. 106-15, 2008. SCHULZ, H. Beta oxidation of fatty acids. Biochim Biophys Acta, v. 1081, n. 2, p. 109-20, 1991. SCUTIERO, G. et al. Oxidative Stress and Endometriosis: A Systematic Review of the Literature. Oxid Med Cell Longev, v. 2017, p. 7265238, 2017. 97 SHALGI, R. et al. Proteins of human follicular fluid: the blood -follicle barrier. Fertil Steril, v. 24, n. 6, p. 429-34, 1973. SHARMA, R. K.; AZEEM, A.; AGARWAL, A. Spindle and chromosomal alterations in metaphase II oocytes. Reprod Sci, v. 20, n. 11, p. 1293-301, 2013. SIMÓN, C. et al. Outcome of patients with endometriosis in assisted reproduction:

from in-vitro fertilization and oocyte donation. Hum Reprod, v. 9, n. 4, p. 725- 9, 1994. SINGH, A. K. et al. Altered c irculating levels of matrix metalloproteinases 2 and 9 and their inhibitors and effect of progesterone supplementation in women with endometriosis undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril, v. 100, n. 1, p. 127-34.e1, 2013a. SINGH, A. K. et al . Ma rkers of oxidative stress in follicular fluid of women with endometriosis and tubal infertility undergoing IVF. Reprod Toxicol, v. 42, p. 116-24, 2013b. SINGH, A. K. et al . Intrafollicular interleukin -8, interleukin -12, and adrenomedullin are the promis ing prognostic markers of oocyte and embryo quality in women with endometriosis. J Assist Reprod Genet, v. 33, n. 10, p. 1363-1372, 2016. SINGH, N. et al. Effect of endometriosis on implantation rates when compared to tubal factor in fresh non donor in vitro fertilization cycles. J Hum Reprod Sci, v. 7, n. 2, p. 143-7, 2014. SIRARD, M. A.; RICHARD, F.; MAYES, M. Controlling meiotic resumption in bovine oocytes: a review. Theriogenology, v. 49, n. 2, p. 483-97, 1998. SMITH, M. P. et al. Total cortisol levels are reduced in the periovulatory follicle of infertile women with minimal-mild endometriosis. Am J Reprod Immunol, v. 47, n. 1, p. 52-6, 2002. SOMFAI, T. et al. Enhancement of lipid metabolism with L -carnitine during in vitro maturation improves nuclear maturation and cleavage ability of follicular porcine oocytes. Reprod Fertil Dev, v. 23, n. 7, p. 912-20, 2011. STADTMAN, E. R. Protein oxidation and aging. Science, v. 257, n. 5074, p. 1220 -4, 1992. SUGIURA, K.; PENDOLA, F. L.; EPPIG, J. J. Ooc yte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Dev Biol, v. 279, n. 1, p. 20-30, 2005. TAMAI, I. et al. Molecular and functional identification of sodium ion -dependent, high affinity human carnitine transporter OCTN2. J Biol Chem, v. 273, n. 32, p. 20378-82, 1998. 98 TANBO, T.; FEDORCSAK, P. Endometriosis -associated infertility: aspects of pathophysiological mechanisms and treatment options. Acta Obstet Gynecol Scand, v. 96, n. 6, p. 659-667, 2017. THOMPSON, J. G.; LANE, M.; GILCHRIST, R. B. Metabolism of the bovine cumulus - oocyte complex and influence on subsequent developmental competence. Soc Reprod Fertil Suppl, v. 64, p. 179-90, 2007. TOMIO, K. et al. Omega -3 polyunsaturated Fatty acids supp ress the cystic lesion formation of peritoneal endometriosis in transgenic mouse models. PLoS One, v. 8, n. 9, p. e73085, 2013. TVRZICKA, E. et al. Fatty acids as biocompounds: their role in human metabolism, health and disease --a review. Part 1: classi fication, dietary sources and biological functions. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, v. 155, n. 2, p. 117-30, 2011. VALSANGKAR, D.; DOWNS, S. M. A requirement for fatty acid oxidation in the hormone-induced meiotic maturation of mouse oocytes. Biol Reprod, v. 89, n. 2, p. 43, 2013. VAN BLERKOM, J.; DAVIS, P. Differential effects of repeated ovarian stimulation on cytoplasmic and spindle organization in metaphase II mouse oocytes matured in vivo and in vitro. Hum Reprod, v. 16, n. 4, p. 757-64, 2001. VAN BLERKOM, J.; DAVIS, P. W.; LEE, J. ATP content of human oocytes and developmental potential and outcome after in -vitro fertilization and embryo transfer. Hum Reprod, v. 10, n. 2, p. 415-24, 1995. VAN LANGENDONCKT, A.; CASANAS -ROUX, F.; DONNEZ, J. Iron overload in the peritoneal cavity of women with pelvic endometriosis. Fertil Steril, v. 78, n. 4, p. 712- 8, 2002. VERCELLINI, P. et al. Coagulation or excision of ovarian endometriomas? Am J Obstet Gynecol, v. 188, n. 3, p. 606-10, 2003. VERCELLINI, P. et al.. 'Blood On The Tracks' from corpora lutea to endometriomas. BJOG, v. 116, n. 3, p. 366-71, 2009. VERCELLINI, P. et al. . Endometriosis: pathogenesis and treatment. Nat Rev Endocrinol, v. 10, n. 5, p. 261-75, 2014. VIGANÒ, P. e t al. Unravelling the ovarian endometrioma pathogenesis: "The long and winding road" across the various theories. Journal of Ednometriosis and Pelvic Pain Disorders. v 5, p 62-67,. 2013. VOLARCIK, K. et al. The meiotic competence of in -vitro matured huma n oocytes is influenced by donor age: evidence that folliculogenesis is compromised in the reproductively aged ovary. Hum Reprod, v. 13, n. 1, p. 154-60, 1998. 99 VON RECKLINGHAUSEN, F. Die Adenomyome und cystadenome der uterus und tubenwandung: Berli. klin. Wonchenschr. 8 1895. WAKEFIELD, S. L. et al. Maternal supply of omega -3 polyunsaturated fatty acids alter mechanisms involved in oocyte and early embryo development in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab, v. 294, n. 2, p. E425-34, 2008. WANG, J. et al. Follicular fluid levels of prostaglandin E2 and the effect of prostaglandin E2 on steroidogenesis in granulosa -lutein cells in women with moderate and severe endometriosis undergoing in vitro fertilization and embryo transfer. Chin Med J (Engl), v. 125, n. 22, p. 3985-90, 2012. WANG, W. H.; KEEFE, D. L. Prediction of chromosome misalignment among in vitro matured human oocytes by spindle imaging with the PolScope. Fertil Steril, v. 78, n. 5, p. 1077-81, 2002. WATERS, S. M. et al. Effect of dietar y n -3 polyunsaturated fatty acids on transcription factor regulation in the bovine endometrium. Mol Biol Rep, v. 41, n. 5, p. 2745-55, 2014. WATHES, D. C.; ABAYASEKARA, D. R.; AITKEN, R. J. Polyunsaturated fatty acids in male and female reproduction. Biol Reprod, v. 77, n. 2, p. 190-201, 2007. WITTMANN, T.; HYMAN, A.; DESAI, A. The spindle: a dynamic assembly of microtubules and motors. Nat Cell Biol, v. 3, n. 1, p. E28-34, 2001. WU, G. et al. Intrafollicular inflammatory cytokines but not steroid horm one concentrations are increased in naturally matured follicles of women with proven endometriosis. J Assist Reprod Genet, v. 34, n. 3, p. 357-364, 2017. WU, G. Q. et al. L -carnitine enhances oocyte maturation and development of parthenogenetic embryos in pigs. Theriogenology, v. 76, n. 5, p. 785-93, 2011. WUNDER, D. M. et al. Steroids and protein markers in the follicular fluid as indicators of oocyte quality in patients with and without endometriosis. J Assist Reprod Genet, v. 22, n. 6, p. 257-64, 2005. XU, B. et al. Oocyte quality is decreased in women with minimal or mild endometriosis. Sci Rep, v. 5, p. 10779, 2015. XU, H. et al. Regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) and monocyte chemotactic protein 1 in fol licular fluid accumulate differentially in patients with and without endometriosis undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril, v. 86, n. 6, p. 1616-20, 2006. YALÇINKAYA, E. et al. Effect of follicular fluid NO, MDA and GSH levels on in vitro fertilization outcomes. J Turk Ger Gynecol Assoc, v. 14, n. 3, p. 136-41, 2013. YAZAKI, T. et al. L -carnitine improves hydrogen peroxide -induced impairment of nuclear maturation in porcine oocytes. Anim Sci J, v. 84, n. 5, p. 395-402, 2013. 100 ZHANG, Q. F. et al. Relationship between resistin and IL-23 levels in follicular fluid in infertile patients with endometriosis undergoing IVF -ET. Adv Clin Exp Med, v. 26, n. 9, p. 1431-1435, 2017. ZHANG, X. et al. Deficit of mitochondria -derived ATP during oxidative stress impairs mouse MII oocyte spindles. Cell Res, v. 16, n. 10, p. 841-50, 2006. ZHOU, H. et al. Involvement of follicular basement membrane and vascular endothelium in blood follicle barrier formation of mice revealed by 'in vivo cryotechnique'. Reproduction, v. 134, n. 2, p. 307-17, 2007. 101 APÊNDICES 102 APÊNDICE A: Caracterização das pacientes doadoras de fluidos foliculares utilizados em cada replicata de maturação in vitro de oócitos bovinos Grupo Idade IMC Protocolo de EOC Endometrioma MIV 1 Controle 34 24,6 Estimulação mínima - EI/II 34 21,9 Estimulação mínima - EIII/IV 33 24,7 Estimulação mínima - E endometrioma 33 20,9 Estimulação mínima Contralateral MIV2 Controle 36 24,9 Antagonista flexível - EI/II 39 21,4 Antagonista flexível - EIII/IV 37 24,9 Antagonista flexível - E endometrioma 36 22,6 Antagonista flexível Contralateral MIV3 Controle 38 21,7 Estimulação mínima - EI/II 37 25,0 Estimulação mínima - EIII/IV 33 24,9 Estimulação mínima - E endometrioma 34 20,3 Estimulação mínima Contralateral MIV4 Controle 33 27,9 Antagonista flexível - EI/II 31 29,8 Antagonista flexível - EIII/IV 29 27,6 Antagonista flexível - E endometrioma 32 27,4 Antagonista flexível Contralateral MIV5 Controle 37 24,5 Antagonista flexível - EI/II 37 27,6 Antagonista flexível - EIII/IV 38 28,0 Antagonista flexível - E endometrioma 37 20,9 Antagonista flexível Contralateral MIV6 Controle 36 24,6 Antagonista flexível - EI/II 35 22,3 Antagonista flexível - EIII/IV 29 24,1 Antagonista flexível - E endometrioma 38 19,5 Antagonista flexível Ipsilateral MIV7 Controle 36 27,9 Antagonista flexível - EI/II 34 27,4 Antagonista flexível - EIII/IV 33 27,3 Antagonista flexível - E endometrioma 34 29,4 Antagonista flexível Ipsilateral MIV8 Controle 38 29,4 Antagonista flexível - EI/II 32 21,6 Antagonista flexível - EIII/IV 29 21,7 Antagonista flexível - E endometrioma 35 24,5 Antagonista flexível Contralateral 103 APÊNDICE B: Dados de estágios de maturação nuclear, e porcentagem de oócitos em MII normais de acordo com as oito replicatas de maturação in vitro de oócitos bovinos realizadas. Oócitos fixados pós-MIV n Visualizados n MI n (%) T1 n (%) AP n (%) MII Total de MII n (%) Analisáveis n (%) Normais n (%) MIV 1 166 161 37(22,9%)a 3 (1,9%) 0 (0%) 121 (75,2%)c 87 (71,9%)a 71 (81,6%) MIV 2 220 198 21 (10,6%)bc 2 (1,0%) 2 (1,0%) 173 (87,4%)ab 110 (63,6%) 90 (81,8%) MIV 3 260 230 35 (15,2%)ab 7 (3,0%) 4 (1,7%) 184 (80,0%)bc 126 (68,5%)a 103 (81,7%) MIV 4 223 222 26 (11,7%)bc 2 (0,9%) 5 (2,3%) 189 (85,1%)ab 115 (60,8%) 89 (77,4%) MIV 5 213 215 14 (6,5%)c 2 (0,9%) 4 (1,9%) 195 (90,7%)a 107 (54,9%)b 80 (74,8%) MIV 6 144 100 14 (14,0%) 3 (3,0%) 0 (0%) 83 (83,0%)ab 46 (55,4%)b 35 (76,1%) MIV 7 178 150 12 (8,0%)bc 2 (1,3%) 5 (3,3%) 131 (87,3%)ab 74 (56,5%)b 58 (78,4%) MIV 8 157 125 8 (6,4%)c 4 (3,2%) 1 (8,0%) 112 (89,6%)a 70 (62,5%) 52 (74,3%) Nota-se: MIV: maturação in vitro; MI = metáfase I; TI = telófase I; MII = metáfase II; AP = ativação partenogenética. Analisáveis: oócitos com fuso fixado em uma visão lateral ou sagital. Cada replicata foi realizada dividindo o nº de oócitos em 9 grupos ( sem-FF, FFControle, FFControle+LC+AG, FFEleve, FFEleve+LC+AG, FFEgrave, FFEgrave+LC+AG, FFendometrioma e FFendometrioma+LC+AG) Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística, p<0,05, usando teste de qui-quadrado. 104 MANUSCRITO A SER SUBMETIDO PARA HUMAN REPRODUCTION 105 Title: L-carnitine and omega-3 fatty acids prevent meiotic damages in bovine oocytes 1 matured in vitro with follicular fluid from infertile women with endometriosis 2 Running title: Endometriosis, L-carnitine and omega-3 3 4 VSI Giorgi1*; RA Ferriani1,2; PAS Navarro1,2. 5 6 1 Human Reproduction Division, Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty 7 of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil. 8 2 National Institute of Hormones and Women’s Health, National Council for Scientific 9 and Technological Development (CNPq), Brazil. 10 11 *Corresponding author: 12 E-mail: [email protected] (VSIG) 13 14 15 16 106

17 Study question: Does supplementation of in vitro maturation (IVM) medium with L-18 carnitine (LC) and omega -3 fatty acids [docosahexaenoic (DHA) and 19 eicosapentaenoic acids (EPA)] prevent oocyte damag es induced by follicular fluid 20 (FF) from infertile women with endometriosis in early (minimal/mild – EI/II) and 21 advanced stages [moderate/severe (EIII/IV) without or with endometrioma 22 (Eendometrioma)]? 23 Summary answer: LC and omega -3 fatty acids prevent da mages on nuclear 24 maturation and on meiotic spindle assembly and chromosome alignment of bovine 25 oocytes matured in vitro with FF from endometriosis I/II and III/IV stages. 26 What is known already: One of the possible mechanisms involved in infertility 27 related to endometriosis is the poor oocyte quality. During acquisition of oocyte 28 competence, adequate ATP levels is fundamental to polar body extrusion and 29 meiotic spindle assembly. β -oxidation is an important mitochondrial pathway to 30 generate ATP from fatty aci ds oxidation, and LC play transferring long -chain fatty 31 acids (like omega-3 fatty acids) from cytosol to mitochondrial matriz. 32 Study design, size, duration: Experimental study using bovine model. Thirty two FF 33 samples were obtained of March to October 2013 , and May/2016 to September/2017 34 from infertile women who underwent ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm 35 injection (ICSI) [8 with EI/II, 8 with EIII/IV, 8 with Eendometrioma and 8 with tubal 36 and/or male factor infertility (control group)]. IVM ex periments were performed 37 between November 2017 and January 2018 using immature bovine oocytes. 38 Participants/materials, setting, methods: Immature bovine oocytes obtained of 39 ovaries from slaughterhouse were submitted to IVM divided into 9 groups: no FF (No-40 FF), with 1% FF from infertile women without endometriosis (CFF), with EI/II, EIII/IV 41 107 and Eendometrioma, with the addition of LC and omega -3 fatty acids (LC+n3). Eight 42 replicates were performed using an individual FF of each group. After 22-24 h of IVM, 43 the oocytes were denuded, fixed and fluorescently labelled for the morphological 44 visualization of microtubules and chromatin by confocal microscopy. Nuclear 45 maturation rate and normal methaphase II (MII) rate were analyzed by chi -square 46 test (p<0.05). 47 Main results and the role of chance: Addition of LC+n3 restored maturation rate 48 increasing methaphase II (MII) rate in groups with EIII/IV (80.7% vs 90.8%: 49 p=0.0190) and Eendometrioma (69.3% vs 86.4%: p=0.0004), and it prevented 50 damages in spindle and chromosome alignment in MII oocytes in groups EI/II (62.2% 51 vs 84.5%, p=0.00205) and EIII/IV (70.2% vs 84.1%, p=0.04995). FF from EI/II 52 (62.2%), EIII/IV (70.2%) and Eendometrioma (72.7%) decreased normal MII rate 53 compared to No -FF (87.2% vs EI/II: p=0.0002; vs EIII/IV: p=0.0092; vs 54 Eendometrioma: p=0.0350) and CFF (87.2% vs EI/II: p=0.0006; vs EIII/IV: p=0.0152; 55 vs Eendometrioma: p=0.0486). EI/II (85.4%) did not alter nuclear maturation rate, but 56 EIII/IV (80.7%) and Eendometrioma (69.3%) decreased total MII rate compa red to 57 No-FF (91.9% vs EIII/IV: p=0.0068; vs Eendometrioma: p<0.0001) and CFF (89.2% 58 vs EIII/IV: p=0.054; vs Eendometrioma: p<0.0001), and Eendometrioma had lower 59 total MII rate compared to another groups including EIII/IV (p=0.0268) 60 Limitations, reasons for caution: Due to the rigorous criteria for the selection of FF 61 donors, the sample size of the present study was small. We used FF from women 62 who underwent ovarian stimulation, a fact that renders questionable the extrapolation 63 of the result to natural cy cles. In addition, this was an experimental study; therefore, 64 studies using in vivo matured oocytes from infertile women with endometriosis will be 65 important to confirm the present results. 66 108 Wider implications of the findings: The present results elucidate part of the 67 etiopathogenic mechanisms of infertility related to endometriosis, suggesting that 68 oxidative stress and β -oxidation alterations are factors involved in worst of oocyte 69 quality in women with endometriosis. We observed which FF from endometriosi s, 70 regardless of stage of disease, damages meiotic spindle assembly and chromosome 71 alignment of bovine MII oocytes; however, EIII/IV (with and withou endometrioma) 72 also had nuclear maturation impairment, and presence of endometrioma had further 73 negative im pact in oocyte maturation. Besides that, we demonstrated that LC+n3 74 supplementation during IVM fully prevented the deleterious effects of the FF from 75 women with endometriosis on the nuclear maturation and oocyte spindle, and 76 therefore, we ask whether the u se of LC and ômega -3 could improve the natural 77 fertility and/or the results of in vitro fertilisation of women with endometriosis. 78 Study funding/competing interest(s): This study was supported by the 79 Coordination of Improvement of Higher Level Personnel, Brazil. The authors declare 80 no conflict of interest. 81 Trial registration number: Not applicable. 82 Key words: Endometriosis; Female infertility; Follicular fluid; Oocyte quality; L -83 carnitine; Omega -3; Docosahexaenoic acid; Eicosapentaenoic acid; Antioxidant; β-84 oxidation. 85 86 109

87 Endometriosis is a gynecological, inflammatory and estrogen dependent 88 disease, characterized by the presence and growth of endometrial tissue (glands and 89 stroma) outside the uterine cavity (Kennedy, et al., 2005) . The prevalence of 90 endometriosis is 25 -50% in the population of infertile women, and among women 91 with endometriosis, approximately 30-50% have problems with infertility (Missmer, et 92 al., 2004). 93 The American Society of Medicine Reproductive (ASRM) classif ies 94 endometriosis in 4 stages: minimal (I), mild (II), moderate (III) and s evere (IV) 95 (ASRM, 1997) . In most of cases of endometriosis in advanced stages (III/IV), it is 96 easy justify infertility due to pelvic anatomical alterations by adhesions, deep lesion 97 and endometrioma, hampering ovulation, the tubal transport of the embryo and, 98 possibly, the embryonic implantation (de Ziegler, et al., 2010) . However, even in the 99 initial cases of endometriosis (I/II), when there is no anatomical alteration of the 100 pelvic cavity, a decrease in the monthly fertility rate is reported (Bérubé, et al., 1998, 101 Parazzini, 1999). 102 Although controversial, studies have suggested worsening of oocyte quality as 103 one of the events responsible for the infertility related to endometriosis (Barcelos, et 104 al., 2009, Da Broi, et al., 2014, Mansour, et al., 2010, Pellicer, et al., 2001) , but the 105 mechanisms leading to this impairment is unknown (Dı́az, et al., 2000, Simón, et al., 106 1994). Study using oocyte donation program reported similar implantation and 107 pregnancy rates in women with and without endometriosis who received oocytes 108 from endometriosis -free donor, however, implantation rates were lower in women 109 without the disease who received oocytes from women with endometriosis (Simón, et 110 al., 1994). 111 110 Human oocytes are extremely rare and their use in invasive studies is 112 generally not feasible because it prevents their use in Assisted Reproductive 113 Techniques (ART). Thus, studies evaluating cumulus cells or follicular fluid (FF) could 114 help understanding the acquisition of oocyte competence (Da Broi, et al., 2018). 115 Addition of FF from infertile women with mild endometriosis to the in v itro 116 maturation (IVM) medium of bovine oocytes compromises the quality of bovine 117 oocytes (evaluated through chromosomal alignment and meiotic spindle 118 organization) when compared to the addition of FF from infertile women without 119 endometriosis (Da Broi, Malvezzi, Paz, Ferriani and Navarro, 2014). The antioxidants 120 L-carnitine (LC) and N-acetyl-cysteine (NAC) prevented such meiotic oocyte damage, 121 indicating that oxidative stress (OS) is involved in the etiopathogenesis of 122 endometriosis-related infertility, however, LC was superior to NAC, preventing, 123 completely such damage (Giorgi, et al., 2016). 124 LC, in addition to its antioxidant function, plays a fundamental role in cell 125 energy generation, since its main biological function is to transport long chain fatty 126 acids from the cytosol to the mitochondria where β-oxidation occurs, a process that 127

in the esterification of LC to form acyl -Carnitine derivatives, producing energy 128 in the form of ATP (Evans and Fornasini, 2003) . Ꞵ-oxidation is essential for the 129 resumption of oocyte meiosis and nuclear maturation in mice (Downs, et al., 2009, 130 Paczkowski, et al., 2013, Valsangkar and Downs, 2013) , swine and cattle 131 (Paczkowski, Silva, Schoolcraft and Krisher, 2013). 132 Oxidation of a molecule of fatty acid (palmitic acid) generates approximately 133 106 ATPs compared to 30 ATPs produced by oxidation of a glucose molecule 134 (Dunning, et al., 2014) . Fatty acids can be cl assified as saturated, monounsaturated 135 and polyunsaturated (PUFA). Mammals, including humans, fail to synthesize 136 111 adequate amounts of omega -3 and omega -6 PUFAs (Wathes, et al., 2007) . Two 137 important omega -3 fatty acids are: docosahexaenoic acid (DHA) and 138 eicosapentaenoic acid (EPA). 139 There are two studies evaluating the addition of omega -3 to the IVM medium 140 of bovine oocyte (Nikoloff, et al., 2017, Oseikria, et al., 2016) . Oseikria et al. (2016) 141 showed that, at low concentrations, DHA increases oocyte competence assessed by 142 increased cleavage rates and blastocyst form ation after parthenogenetic activation. 143 Nikoloff et al. (2017) showed that the addition of EPA improves the oocyte quality 144 observed by increased cumulus cell expansion. 145 There are no studies in the literature evaluating the impact of the 146 endometriosis stage on oocyte quality and the possible prevention of oocyte damage 147 with the combined administration of LC, DHA and EPA. Therefore, our primary 148

was to evaluate the impact of the addition of LC and DHA/EPA (n3) to the 149 IVM medium containing FF from inf ertile women with and without endometriosis on 150 nuclear maturation and organization of the meiotic spindle and chromosomes in 151 bovine oocytes by confocal microscopy. And as secondary objective, we evaluated 152 the impact of the endometriosis stage on bovine ooc yte quality (nuclear maturation 153 and organization of the meiotic spindle and chromosomes) by adding FF from 154 women with and without endometriosis in the early and advanced stages (with and 155 without endometrioma) to the IVM medium of bovine oocytes. 156 157 112

158 We performed an experimental study previously approved by the Research 159 Ethics Committee of the Hospital das Clínicas of the Medical School of Ribeirão 160 Preto (HC -FMRP), University of São Paulo (USP) (Process HCRP nº 12201/2008) 161 and by the Ethic s Committee in Animal Experimentation of FMRP - USP (nº 162 169/2008). 163 We used bovine ovaries from local slaughterhouse. And bovine model was 164 chose due to the similarity in human and bovine ovarian size and morphology, 165 because both species are mono -ovulatory and polycyclic and because it is an 166 abundant material, low cost, easily manipulated (Malhi, et al., 2005, Santos, et al., 167 2014). 168 169 Patient selection and follicular fluid collection 170 FF samples were obtained during March to October/2013 and May/2016 to 171 September/2017 from infertile women who underwent ovarian stimulation for 172 intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in the Sector of Human Reproduction, 173 Department of Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribei rão Preto, 174 University of São Paulo (FMRP -USP). All patients gave written informed consent to 175 participate. 176 Inclusion criteria were as follows: age <40 years; body mass index (BMI) ≤ 30 177 kg/m²; serum concentration of follicle stimulating hormone (FSH) on the third day of 178 the menstrual cycle ≤ 12 mIU/mL; absence of chronic anovulation; presence of 179 hydrosalpinx or of chronic diseases such as diabetes mellitus or any other 180 endocrinopathy; absence of cardiovascular disease; absence of dyslipidemia; 181 absence of systemic lupus erythematosus or any other rheumatologic disease; 182 113 absence of HIV infection or any active infection; be no -smoking; have not use 183 vitamins, hormonal or non -hormonal medications during a period of 6 months before 184 the inclusion in the study; have undergone to a videolaparoscopy examination. 185 The control group consisted of infertile women due to tubal factors and/or 186 whose mate had infertility (male factor). All patients were s ubmitted to 187 videolaparoscopy examination for inspection of the pelvic / abdominal cavity and 188 exclusion of endometriosis. 189 The endometriosis group was subdivided into early stage endometriosis 190 (minimal or mild, EI/II) and advanced endometriosis (moderate or severe) without 191 (EIII/IV) or with endometrioma in the cycle (Eendometrioma). Previous 192 videolaparoscopy was performed for the diagnosis and classification of 193 endometriosis according to ASRM criteria (Asrm, 1997). Eendometrioma group 194 presented endometrioma in the cycle visualized by transvaginal ultrasonography. 195 196 Protocol of controlled ovarian stimulation 197 According to the characteristics of each patient, two distinct protocols of 198 controlled ovarian stimulation (COS) were applied as described below: 199 - Flexible antagonist protocol: gonadotrophins (150 -300 IU / day) were 200 administered in the first six days of COS, with the dose adjusted daily according to 201 follicular growth. 202 - Minimal stimulation protocol (clomiphene citrate plus gonadotrophins and 203 GnRH antagonist ): clomiphene citrate (100 mg / day) was administered during the 204 first five days of COS and gonadotrophins (150 IU / day) were given on days two and 205 four, and daily from day six. 206 114 The GnRH antagonist (ganirelix or cetrorelix 0.25 mg/day) was started when 207 the mean diameter of the largest follicle was ≥ 14 mm. Recombinant hCG (250 μg, 208 Ovidrel®, Serono, Brazil) or urinary hCG (10,000 IU, Choriomon®, Meizler, Brazil) 209 was administered when at least one follicle with a mean diameter of 18 mm was 210 present. Oocytes w ere collected 34 to 36 hours after the administration of 211 recombinant hCG, and the luteal phase was maintained by administration of 212 micronized progesterone (600 mg / day). 213 Before COS, oral contraceptive (Miranova®, Bayer or Level®, Biolab) was 214 prescribed for all patients with the goal of synchronizing and scheduling the start of 215 the COS. 216 217 Collection and processing of FF samples 218 FF samples were obtained during oocyte recovery to perform ICSI. To avoid 219 possible interference of successive ovarian punctures, FF was obtained from the first 220 follicle (diameter ≥ 15 mm) of the first ovary punctured. 221 These samples were immediately taken to the embryology laboratory, where 222 embryologists checked for the presence of oocytes and/or granulosa cells. Oocytes 223 were separated from the FF for use during ART and the FF was centrifuged at 300 g 224 for 10 minutes, aliquoted and stored at -80ºC. 225 Samples that did not contain oocyte and/or granulosa cells were excluded, 226 since in these cases it would not be possible to state that the ov arian follicle 227 punctured had an oocyte in the process of maturation. 228 FF was collected from 39 infertile women, 12 withou t endometriosis, 8 with 229 EI/II, 11 with EIII/IV without endometrioma and 8 with endometrioma. 230 115 For this study, FF sample of each patient w as used ju st one time in each 8 231 bovine IVM performed. 232 233 Oocyte collection 234 Bovine ovaries were collected immediately after slaughter and transported in 235 physiological saline at 35 -38.5ºC. In the laboratory, follicles measuring 2 to 8 mm 236 were aspirated and on ly cumulus-oocyte complexes (COCs) with homogeneous 237 cytoplasm and at least three layers of cumulus oophorus cells were selected (Adona 238 and Lima Verde Leal, 2004, Ferreira, et al., 2009). 239 240 In vitro maturation (IVM) 241 COCs were cultured in 400 µL drops of culture medium for IVM (approximately 242 20 oocytes per drop) at 38.5ºC, 95% humidity and 5% CO 2 (Adona and Lima Verde 243 Leal, 2004, Ferreira, Vireque, Adona, Ferriani and Navarro, 200 9, Hashimoto, et al., 244 2002) in a culture system without mineral oil. The IVM medium used was TCM -199 245 containing Earle’s salts and bicarbonate (Invitrogen, Gibco Laboratories Life 246 Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA) supplemented with 0.4 mM sodium 247 pyruvate, 0.5 µg/mL gentamicin, 5 µg/mL FSH, 2.5 UI/mL hCG (Chorulon®), 1 µg/mL 248 estradiol and 10% foetal calf serum (FCS; Gibco). 249 Duration of IVM was 22-24 h. 250 251 Preparation of antioxidant (N-acetyl-cysteine and L-carnitine) solutions 252 L-carnitine 253 The concentration of LC (Sigma Aldrich C0283) used to supplement the IVM 254 experiments as described below was 0.6 mg/mL (Giorgi, Da Broi, Paz, Ferriani and 255 116 Navarro, 2016, Mansour, et al., 2009) . The stock solution was prepared at a 256 concentration 100 times higher than the working solution (stock solution: 60 mg/mL 257 LC) with injection water, filtered through a 0.22 μm pore filter, aliquoted and stored at 258 -20 ° C. 259 260 Omega 3 Fatty Acids 261 The final concentration of omega -3 fatty acids use d to supplement the IVM 262 experiments as described below was 1 nM (Nikoloff, Pascua, Anchordoquy, 263 Anchordoquy, Sirini, Seoane and Furnus, 2017) . Being that 0.4 nM was DHA (Sigma 264 Aldrich D2534) and 0.6 nM EPA (Sigma Aldrich E2011). The ratio of 2:3 DHA/EPA 265 was chosen based on the composition of commercial supplements based on fish oil 266 (Omega-3 Essential® brands: Sidney Oliveira®, Equaliv®, Country Life®, Solgar®, 267 Catarienense® ) and supplements used in randomized clinical trials [180 mg of EPA 268 and 120 mg of DHA for women with polycystic ovary syndrome who wanted to 269 perform ART (Nadjarzadeh, et al., 2015) , 1200 mg of EPA and 800 mg of DHA for 270 obese women (Haghiac, et al., 2015), 180 mg of EPA and 120 mg of DHA for young 271 women with dysmenorrhea (Rahbar, et al., 2012)]. 272 Stock solutions of the fatty acids were prepared in a concentration 100 fold 273 higher than the final concentrations (stock solutions: 40 nM DHA and 60 nM EPA) 274 with DMSO, filtered through a 0.22 μm pore filter and stored at -20 ° C. 275 276 Fixation and immunofluorescence for the visualization of microtubules and 277 chromosomes 278 After IVM, cumulus cells were separated from the oocytes by pipetting. The 279 oocytes we re fixed and left to stand for 30 minutes in a buffer for microtubule 280 117 stabilization (Ferreira, Vireque, Adona, Ferriani and Navarro, 2009, Liu, et al., 1998) . 281 The oocytes were washed and blocked during 2 hours at 37 ºC in washing medium 282 consisting of phosphate buffer saline (PBS) supplemented with 0.02% NaN 3, 0.01% 283 Triton X-100, 0.2% defatted dry milk, 2% goat serum, 2% bovine serum albumin, and 284 0.1 M glycine. The oocytes were incubated overnight at 4ºC with an anti -β-tubulin 285 murine monoclonal antibody (1:1000) and were washed and incubated with a 286 secondary fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti -mouse IgG antibody 287 (1:500. Zymed Laboratories, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) at 38.5ºC for 2 h. The 288 oocytes were submitted to an additional washing and were labelled with Hoechst 289 33342 (10 mg/mL) in Vectashield mounti ng medium (H -1000, Vector, Burlingame, 290 CA, USA) on a glass slide covered with a coverslip. The samples were visualized 291 using a high -performance confocal microscope (Confocal Leica TCS SP5, Leica 292 Microsystems, Mannheim, Germany) at 40X magnification with 40 5 nm Diode UV 293 and 543 nm HeNe lasers. 294 295 Oocyte classification based on meiotic spindle morphology and chromosome 296 alignment 297 Based on the stage of nuclear maturation, the oocytes were classified as 298 metaphase I (MI), telophase I (TI) or metaphase II (MII), or as parthenogenetically 299 activated (PA). MII oocytes were subdivided into analyzable and non -analyzable 300 groups according to the position of visualization of the metaphase plate. The oocytes 301 were considered analyzable when the meiotic spindle was visualized i n a lateral or 302 sagittal position and non -analyzable when the spindle was observed in a polar 303 position (Ju, et al., 2005) . MII oocytes were classified as “normal” when they 304 exhibited a barrel-shaped meiotic spindle with microtubules organized from one pole 305 118 to the other, chromosomes aligned on the metaphase plate at the equator of the 306 spindle (Figure 1D) and the presence of a polar body (PB), or classified as 307 “abnormal” when they showed an altered meiotic spindle (reduced longitudinal 308 dimension, disorganized or absent microtubules, dispersed or dislocated from the 309 plane of the metaphase plate) (Figure 1A -C). PA was characterized by the 310 spontaneous extrusion of a second PB without the occurrence of fertilization or 311 telophase II. 312 313 119 Figure 1: Classification of bovine oocytes matured in vitro, in metaphase II, according to the organization of the meiotic spindle and chromosomal alignment analyzed by confocal microscopy. A -) to C -) represent abnormal and D -) normal MII. Note: A -) Normal spindle, misaligned chromosomes; B -) Incomplete spindle and aligned chromosomes; C -) Ab normal spindle and misaligned chromosomes and D -) Normal spindle and aligned chromosomes (normal MII). In green, meiotic spindle labeled with monoclonal antibody anti -β- tubulin and secondary antibody conjugated to FITC. In blue, label for genetic material wi th Hoechst 33342. White bar in lower right corner: 10 μm scale. White arrow indicates misaligned chromosomes 314 Experimental design 315 Figure 2 illustrates the experimental design performed in this study. 316 317 120 Figura 2: Experimental design 318 319 Statistical analysis 320 Data were analyzed using RStudio software version 1.0.153, 2009 -2017 [R 321 Core Team (2017). A: A language and environment for statistical computing. R 322 Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R -323 project.org/]. The results were presented in a table. 324 The categorical variables (percentage of MI, percentage of TI, percentage of 325 PA, percentage of MII, percentage of MII analysable, percentage of normal MII) were 326 compared between the groups using the chi-square test, with the level of significance 327 set at p< 0.05. 328 329 Sample Calculation 330 Based on previous studies by our group (Da Broi, Malvezzi, Paz, Ferriani and 331 Navarro, 2014, Giorgi, Da Broi, Paz, Ferriani and Navarro, 2016) that demonstrated a 332 121 difference in the percentage of normal MII of ~ 30% between the No -FF and FFEI/ II 333 groups, and considering a test power of 80% (β = 0.2 and α = 0.05), a total of 87 334 analyzing oocytes per group could be required. Therefore, our test power ranged 335 from 68-83%. 336 337

338 Eight IVM experiments were performed, and one FF sample of each group 339 was used individually in each of the experiments. 340 341 Flow-chart of selection of FF donors 342 Figure 3 represents Flow-chart of selection of FF donors. 343 Figure 3: Flow-chart of recruitment of patients donors of follicular fluid 344 345 122 A total of 39 FF samples were pr ocessed and stored at -196 ° C until further 346 use. The choice of samples in each experiment was chosen based on age, BMI and 347 COS protocol. Table 1 shows characteristics of FF donors used in each group. 348 Table 1: Clinical variables, response to controlled ovarian stimulation, and ICSI results of infertile donor 349 women with no endometriosis (control), with endometriosis in the early stages (EI / II) and in advanced 350 stages without endometrioma (EIII / IV) and with endometrioma (Eendometrioma) 351 Control (n=8) E I/II (n=8) E III/IV (n=8) E endometrioma (n=8) Age (years) 36 (35.5 – 37.3) 34 (33.5 - 37) 33 (29 - 34) 34.5 (33 – 36.3) p =0.1907 BMI (kg/m²) 24.6 (23.8 – 27.9) 21.9 (21.8 - 27.4) 24.8 (24.6 – 27.3) 21.8 (20.8 – 25.2) p =0.3259 FSH (UI/L) 8.2 (7.9 – 9.7) 4.4 (4.4 – 5.3) 5.2 (3.8 – 7.8) 5.6 (4.1 - 8.4) p= 0.1890 Duration of infertility (months) 114 (93 - 135)* 84 (81 - 84) 108 (66 - 111) 48 (45 - 60)* *p=0.0275 Time vlpsc and COS (months) 57 (53.8 – 70.5) 23 (32.8 - 75) 68 (10.3 - 79) 34 (30 – 49.5) p =0.3282 Basal CFA (n) 8.0 (7.5- 8) 7 (7 – 9.5) 9.0 (3.8 - 11) 8.0 (3- 13) p=0.9533 Endometrium (mm) 3.3 (2.9 – 3.9) 7.3 (2.9 – 5.5) 4.6 (3.2 – 6.9) 4.5 (3.4 – 5.2) p=0.6850 COS duration (dias) 8 (8 – 9.3) 9 (9 – 10.5) 10 (9 - 10) 10 (9.5 – 11.3) p=0.2115 Recovery oocytes (n) 3 (2 - 4) 4 (3.8 – 5.5) 4 (3.5 - 8) 2 (1 – 4.3) p =0.1873 Mature oocytes (n) 3 (2 – 3.3) 4 (3.8 – 5.5) 4 (3.5 – 7.5) 2 (1 – 4.3) p =0.2084 Note: The variables are reported as median and interquartile ran ges. BMI: body mass index; FSH: follicle stimulating hormone; CFA: count of antral follicles; COS: controlled ovarian stimulation ; vlpsc: videolaparoscopy. Compared groups by Kruskall Wallis test with Dunn post test (p <0.05). 352 In vitro maturation and confocal microscopy 353 123 During the 8 IVM experiments performed between November 2017 and 354 January 2018, a total of 1686 immature COCs were submitted to IVM. After IV M, 355 cumulus cells were removed , a total of 1561 oocytes were fixed for 356 immunofluorescence and 1401 oocytes were visualized by confocal microscopy (167 357 oocytes were in MI, 25 in TI, 1188 in MII and 21 were parthenogenetically activated). 358 Of the 1188 oocytes in MII, 735 were considered analyzable (ie, viewed in a sagittal 359 or lateral position) and 453 were considered non-analyzing (polar view). 360 There were no differences in the TI (p = 0.05467), AP (p = 0.8854) and 361 analyzable MI (p = 0.5651) among the nine experimental groups (Table 2). 362 About MI rate, No-FF group ( 6.0%) had similar rate to FFC (6.1%, p = 1), 363 FFC+LC+n3 (11.7%, p=0.1277 ), FFEI/II (12.7%, p=0.07406) , FFEI/II+LC+n3 (9.8%, 364 p=0.3085), FFEIII/IV+LC+n3 (7.7%, p=0.3085), and FFEndometrioma+LC+ n3 365 (11.1%, p=0.166). The MI rate was lower in the No-FF and FFC groups when 366 compared to the FFEIII/IV (16.9%; vs No-FF: p=0.00504; vs FFC: p = 0.00537) and 367 FFEndometrioma (24.7%, vs No-FF: p<0.0001, vs. FFC: p<0.0001). The addition of 368 LC and omega -3 did not alter the MI rate in the FFC (6.1% vs 11.7%, p=0.192) and 369 FFEI/II (12.7% vs 9.8%, p=0.5288). However, the FF EIII/IV+LC+n3 group presented 370 a lower MI rate than FFEIII/IV (7.7% vs 16.9%, p=0.0259), as well as 371 FFEendometrioma+LC+n3 and FFEendometrioma (11,1% vs 24.7%, p=0.0028). 372 The MII rate was 91.9% in the No-FF group, being similar to FFC group 373 (89.2%, p=0.5389) , FFC+LC+ n3 (84.7%, p=0.06992), FFEI/II (85.4%, p=0 .1069), 374 FFEI/II+LC+n3 (85.3%, p=0 .09598), FFEIII/IV+LC+n3 (90.8%, p=0.1069) and 375 FFEndometrioma+LC+n3 (86.4%, p = 0.1681). The lowest MII rate was found in the 376 FFEndometrioma group (69.3%), which differed f rom the other 8 groups ( vs No-FF: 377 p<0.0001; vs FFC: p<0.0001; vs FFC+LC+n3: p=0.00194, vs FFEI/II: p=0.00114, vs 378 124 FFEI/II+LC+n3: p=0.00117, vs FFEIII/IV: p=0.02681, vs FFEIII/IV+LC+n3: p<0.0001; 379 vs FFEndometrioma+LC+n3: p=0.00044). The No-FF group had a hig her rate of MII 380 compared to the FFEIII/IV group (80.7%, p=0.00681). The FFC group (89.2%) 381 presented MII rate similar to the FFC+LC+ n3 group (89.2%, p=0.3122), as well as 382 the FFEI/II+LC+ n3 group (85.3%) was similar to the FFEI/II group (85.4%, p = 1). 383 However, the addition of LC and omega -3 in the FFEIII/IV and FFEendometrioma 384 groups increased the rate of MII [(FFEIII/IV vs. FFEIII/IV+LC+ n3: p=0.0190) and 385 (FFEendometrioma vs FFEendometrioma+LC+n3: p=0.0004)]. 386 The percentage of meiotic normal MII was 87.2% in the No-FF group, being 387 similar to the FFC (87.2%, p=1), FFC+LC+ n3 (82.5%, p=0 .54), FFEI/II+LC+n3 388 (84.5%, p = 0.7615) , FFEIII/IV+LC+n3 (84.1%, p=0.7122) and 389 FFEndometrioma+LC+n3 (7 5.3%, p =0.0623). The percentage of normal MII in the 390 No-FF group was signifi cantly higher than FFEI/II (62.2%, p=0.00023), FFEIII/IV 391 (70.2%, p=0.0092) and FFEndometrioma (72.7%, p=0.03497). The percentage of 392 normal MII in the FFC was also significantly higher than FFEI/II (p=0.00059), 393 FFEIII/IV (p=0.01523) and FFEndometrioma group s (p=0.0486). The addition of LC 394 and omega-3 fatty acids during IVM did not alter the rate of normal MII in the FFC 395 group (p=0.5792) and FFEndometrioma (p=0.865), but LC+n3 increased the rate in 396 the FFEI/II (p=0.00205) and FFEIII /IV (p=0.04995). Although t he FFEndometrioma 397 (72.7%) and FFEndometrioma+LC +n3 (75.3%) groups had similar percentage of 398 normal MII (p=0.865), the FFEndometrioma+LC+ n3 group had similar normal MII 399 percentage to the No-FF (p = 0.062) and FFC (p = 0.083).400 125 Table 2: Stages of nuclear maturation, and percentage of normal MII oocytes matured in vitro in medium without folicular fluid (no-FF), with addition of 1% FF from infertile patients without endometriosis (FFC), with early endometriosis (FFEI/II), with advanced endometriosis without (FFEIII/IV) or with endometrioma (FFEendometrioma), supplemented with 0.6mg/mL L-Carnitine, 0.4nM docosahexaenoic acid, and 0.6 nM eicosapentaenoic acid (LC+n3) visualized by confocal microscopy. Fixed oocytes after IVM n Viewed by confocal n MI n (%) TI n (%) PA n (%) MII Total MII n (%) Analyzable n (%) Normal n (%) No-FF 167 149 9(6.0%)a 2 (1.3%) 1 (0.7%) 137 (91.9%)a 94 (68.6%) 82 (87.2%)a FFC 163 148 9 (6.1%)a 5 (3.4%) 2 (1.4%) 132 (89.2%)ab 78 (59.1%) 68 (87.2%)a FF+LC+n3 179 163 19 (11.7%)ab 3 (1.8%) 3 (1.8%) 138 (89.2%)ab 80 (58.0%) 66 (82.5%)ab FFEI/II 178 158 20 (12.7%)ab 1 (0.6%) 2 (1.3%) 135 (85.4%)ab 82 (60.7%) 51 (62.2%)c FFEI/II +LC+n3 186 163 16 (9.8%)ab 4 (2.5%) 4 (2.5%) 139 (85.3%)ab 84 (60.4%) 71 (84.5%)ad FFEIII/IV 185 166 28 (16.9%)bc 2 (1.2%) 2 (1.2%) 134 (80.7%)b 84 (62.7%) 59 (70.2%)bc FFEIII/IV +LC+n3 163 142 11 (7.7%)a 1 (0.7%) 1 (0.7%) 129 (90.8%)a 82 (63.6%) 69 (84.1%)ad FFEndometrioma 163 150 37 (24.7%)c 7 (4.7%) 2 (1.3%) 104 (69.3%)c 66 (63.5%) 48 (72.7%)bcd FFEndometrioma +LC+n3 177 162 18 (11.1%)ab 0 (0%) 4 (2.5%) 140 (86.4%)ab 85 (60.7%) 64 (75.3%)abc Note: IVM: in vitro maturation; MI=metaphase I; TI=telophase I; MII=metaphase II; P A=parthenogenetic activation. Analyzable: oocytes with sp indles fixed in lateral or sagittal view. Data are results of 8 replicates using follicular fluid from control patients, with mild endometrio sis, with severe endometriosis without endometrioma and with endometrioma. Different letters in the same column ind icate statistical difference, p <0.05, using chi-square test. 126

401 Despite the close relationship between endometriosis and infertility, the 402 etiopathogenic mechanisms involved in the reduction of the natural fertility of these 403 women remain unknown. In this study, we demonstrated that the FF of infertile 404 women with endometriosis when added to the IVM medium of bovine oocytes causes 405 a decrease in oocyte quality (assessed in this study by nuclear maturation blocking 406 and impairment of spindle organizati on and oocyte chromosomes in MII) when 407 compared FF of infertile women without the disease. The presence of endometrioma 408 in the EOC cycle has an even more detrimental impact on oocyte quality, mainly 409 affecting nuclear maturation. The addition of LC and omeg a-3 fatty acids (DHA and 410 EPA) prevented such damage, highlighting the role of EO and β -oxidation alterations 411 in worsening oocyte quality in early and advanced endometriosis women (with and 412 without without endometrioma). 413 Regardless of the stage, our finding s, using bovine experimental model, show 414 that endometriosis affects oocyte quality by reducing the percentage of oocytes in MII 415 with normal spindle and aligned chromosomes compared to the no-FF and FF control 416 groups. The meiotic spindle of oocytes is a dyn amic structure, which aligns and 417 secretes the chromosomes during meiosis, f ormed by the polymerization of α and β 418 subunits of the tubulin protein associated with more than 100 other proteins 419 (Wittmann, et al., 2001) . Several factors may alter the spindle, with EO being one of 420 them (Sharma, et al., 2013) . Excess free radicals can directly damage spindle 421 proteins (and other cellular macromolecules, such as DNA) (Salvi, et al., 2001) and 422 may also alter the membrane potential of the mitochondria, leading to a decrease in 423 ATP production and consequent destruction of the meiotic spindle (Zhang, et al., 424 2006). 425 127 Our findings corroborate previous findings from our group, demonstrating that 426 addition of 1% FF from infertile women with endometriosis in early stages to the IVM 427 medium of bovine oocytes impairs the meiotic spindle arrangement and the 428 chromosomal alignment of oocytes in MII (Da Broi, Malvezzi, Paz, Ferriani and 429 Navarro, 2014, Giorgi, Da Broi, Paz, Ferriani and Navarro, 2016) . For the first time, 430 we showed that FF of infertile women with advanced endometriosis (with and without 431 endometrioma) also compromised the meiotic normality of bovine oocytes submitted 432 to IVM in the presence of these FF at the concentration of 1%. 433 However, Hamdan et al. (2016), using murine model, did not observe meiotic 434 spindle alteration and chromosomal alignment when oocytes were matured with FF 435 from women with severe endometriosis; disagreei ng with our results. In the study by 436 Hamdan et al. (2016), FF donors were previously submitted to videolaparoscopy for 437 diagnosis, treatment and staging of endometriosis according to the ASRM criteria. 438 However, there was no mention of the presence of infert ility and endometrioma as 439 criteria for inclusion / exclusion. Other differences between the present study and the 440 work of Hamdan and collaborators (2016) are: incubation time and FF concentration 441 used (Hamdan and coworkers incubated the oocytes at a concen tration of 15 -50% 442 FF for 18h). Thus, we hypothesize that the disagreement of results between our 443 study and the study by Hamdan and collaborators (2016) regarding the organization 444 of the meiotic spindle is mainly due to the experimental model used. Morpholo gically 445 and physiologically, oocytes of different species present differences, even if subtle 446 (Santos, Schoevers and Roelen, 2014) ; however, a review evaluating the oocyte 447 characteristics of bovine, murine, swine and humans, suggested that for studies 448 evaluating reproduct ive toxicology if it would be exposure to an EO environment) 449 128 bovine and swine models would be more adequate than the murine model to 450 represent human oocytes(Santos, Schoevers and Roelen, 2014). 451 Despite this, Hamdan et al. (2016) evaluated chromosomal alterations by 452 another methodology, phosphorylation of histone H2AX (marker of DNA damage 453 and, therefore, to the chromosome), and reported a greater amount of histone H2AX 454 phosphorylation foci in incubated oocytes with FF of severe endometriosis compared 455 to the no -FF and FF co ntrol groups, indicating the involvement of the oocyte 456 chromosomes of women with severe endometriosis, at least in part confirming our 457 findings (Hamdan, et al., 2016). 458 The nuclear maturation rate was also evaluated in the study by Hamdan et al. 459 (2016), who observed that the FF of women without endometriosis did not affect the 460 oocyte maturation rate compared to the group without FF (Hamdan, Jones, Cheong 461 and Lane, 2016) . However, the F F of women with severe endometriosis (both the 462 addition of 15% and 50%), impaired the in vitro oocyte maturation rate (Hamdan, 463 Jones, Cheong and Lane, 2016). The authors of this study suggest that the decrease 464 in PB extrusion rate in the group incubated with FF from endometriosis women 465 should be the result of DNA damage caused by OS (Hamdan, Jones, Cheong and 466 Lane, 2016) . A study of our group showed that the FF of infe rtile women with 467 endometriosis presents an increase in the levels of 8OHdG (marker of oxidative DNA 468 damage) compared to infertile women without the disease (Da Broi, et al., 2016) . 469 Thus, Hamdan and collaborators (2016) corroborate our findings that the FF of 470 infertile women with adv anced endometriosis (with and without endometrioma) 471 compromises oocyte nuclear maturation (higher MI rate and lower MIII rate) when 472 compared to FF of infertile women without endometriosis and with endometriosis in 473 the early stages. 474 129 We have shown that the a ddition of FF from infertile women with 475 endometrioma in the cycle decreases the nuclear maturation rate (represented by the 476 higher MI rate and lower MII rate) when compared to the other groups, including that 477 containing FF from women with endometriosis III /IV without endometrioma. 478 Endometrioma is a type of endometriosis lesion in the ovary forming a "pseudocyst" 479 containing in it a "chocolate" coloring fluid formed by cellular debris of endometriosis 480 and blood (Brosens, et al., 2013) . The content present insid e the endometrioma is 481 characterized by an accumulation of iron and its derivatives, making the environment 482 toxic and hostile to folliculogenesis (Sanchez, et al., 2014) . Analysis of FF by mass 483 spectrometry identified 535 expressed proteins, being 139 common t o groups of FF 484 from endometrioma, ovary without endometrioma and control (Regiani, et al., 2015) . 485 Enrichment analysis was performed from the ovary compo sition with endometrioma 486 and ovary without endometrioma (Regiani, Cordeiro, da Costa, Salgueiro, Cardozo, 487 Carvalho, Perkel, Zylbersztejn, Cedenho and Lo Turco, 2015) . Both groups 488 presented proteins with similar roles, demonstrating the impact of endometriosis (or 489 presence of an active endometrioma in the cycle, regardles s of the follicular 490 proximity) on the FF composition (Regiani, Cordeiro, da Costa, Salgueiro, Cardozo, 491 Carvalho, Perkel, Zylbersztejn, Cedenho and Lo Turco, 2015). 492 LC and omega-3 fatty acids prevented meiotic oocyte damage mediated by FF 493 from women with endometriosis regardless of disease stage and presence of 494 endometrioma. A previous study of our group showed that the addition of LC 495 prevented damage to the meiotic spindle of bovine oocytes matured in vitro in the 496 presence of FF from women with mild endometriosis (normal MII rate increased from 497 51.35% to 80.61% with LC) (Giorgi, Da Broi, Paz, Ferriani and Navarro , 2016) . 498 However, for the first time, we have shown that the combined addition of LC and 499 130 omega-3 fatty acids prevents oocyte damage (both at nuclear maturation and 500 chromosome alignment and meiotic spindle assembly in MII oocytes). 501 Recent review highlighte d the important role of carnitine in female fertility by 502 discussing in vivo and in vitro studies involving humans or animal models, and the 503 possible mechanisms of LC action in improving female fertility (Agarwal, et al., 2018). 504 And experimental studies show that supplementation with omega -3 improves oocyte 505 quality (Nehra, et al., 2012) , regulates the endometrium (Waters, et al., 2014) and 506 increases the pregnancy rate (Wathes, Abayasekara and Aitken, 2007). 507 LC is an antioxidant and reduces OS and lipotoxicity by eliminating free 508 radicals and excess of palmitate from the endoplasmi c reticulum; and by decreasing 509 rates of apoptosis promoting oocyte growth and development (Agarwal, Sengupta 510 and Durairajanayagam, 2018). OS is a factor involved in worsening oocyte quality in 511 women with endometriosis, and murine oocytes incubated with FF from women with 512 severe endometriosis present higher ROS levels compared to oocytes incubated 513 without FF and with FF control (Hamdan, Jones, Cheong and Lane, 2016). 514 LC and fatty acids are involved in β-oxidation which is an important pathway of 515 energy production during oocyte maturation and early embryonic development 516 (Downs, Mosey and Klinger, 2009, Dunning, et al., 2014, Dunning, et al., 2010, 517 Dunning and Robker, 2012, Dunning, Russell and Robker, 2014, Paczkowski, Silva, 518 Schoolcraft and Krisher, 2013, Valsangkar and Downs, 2013) . Oocytes from infertile 519 women with minimal or mild endometriosis present mitochondrial alterations 520 evaluated by transmission electron microscopy and by quantitative polymerase chain 521 reaction (RT-PCR) (Xu et al., 2015). And, although we did not investigate the oocyt e 522 mitochondria in this study, we suggest that FF from women with endometriosis, 523 should alter mitochondrial function, contributing to worsening oocyte quality. 524 131 Evaluating the clinical data of the FF donor groups (FFC, FFEI/II, FFEIII/IV 525 and FFEendometrioma) , we observed a difference in the duration of infertility 526 between the FFC and FFEendometrioma groups. We believe that this difference is 527 not important in this study, since the median age (this one, a factor related to 528 worsening oocyte quality) between the groups did not differ. 529 Our study has brought unprecedented contributions to the elucidation of the 530 etiopathogenesis of infertility related to endometriosis. However, we do have some 531 limitations. I-) We used FF of women submitted to COS, making the extrapol ation of 532 the results to natural cycles questionable; however, the control group was also 533 submitted to similar pituitary block protocols. II -) We use only FF from the first 534 aspirated follicle of each patient, since we do not know if the prolongation of 535 anesthesia and repeated ovarian punctures would promote follicular OS; however, 536 we cannot say that FF from different follicles would have the same impact during IVM 537 on the oocyte. III-) In addition, data obtained from animal model studies may not 538 necessarily be extrapolated to humans and studies with oocytes from infertile women 539 with endometriosis in vivo matured would be important to confirm our results. 540 Therefore, FF from infertile women with endometriosis damages meiotic 541 spindle assembly and chromosome align ment of MII bovine oocytes, and FF from 542 advanced endometriosis besides damaging the meiotic spindle, also impairs nuclear 543 maturation. Also, FF from women with endometrioma compromise even more nuclear 544 maturation. Supplementation with LC and omega -3 fatty a cids prevented all these 545 bovine oocyte damages. 546 Currently available treatments for infertility related to endometriosis are 547 surgical and/or ART (Kennedy, Bergqvist, Chapron, D'Hooghe, Dunselman, Greb, 548 Hummelshoj, Prentice, Saridogan and G roup, 2005) that are invasive and/or costly, 549 132 with consequent low population access. Therefore, new therapeutic approaches 550 would be essential to help thousands of women affected by this disease. Due to the 551 properties of LC and omega -3 fatty acids, the comb ination of surgical treatment with 552 the supplementation of these substances could prevent the recurrence and/or 553 progression of endometriosis (due to the antioxidant action of LC and anti -554 inflammatory of omega -3 fatty acids) and improve natural fertility (by preventing OS, 555 impaired beta oxidation and oocyte damage) since ART is not accessible to all 556 women. Our findings stimulate the design of clinical studies investigating the impact 557 of joint supplementation of LC and omega -3 fatty acids on improving the natu ral 558 fertility of infertile women with endometriosis. 559 560

561 Adona PR, Lima Verde Leal C. Meiotic inhibition with different cyclin-dependent kinase inhibitors in 562 bovine oocytes and its effects on maturation and embryo development. Zygote 2004;12: 197-204. 563 Agarwal A, Sengupta P, Durairajanayagam D. Role of L-carnitine in female infertility. Reprod Biol 564 Endocrinol 2018;16: 5. 565 ASRM. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. 566 Fertil Steril 1997;67: 817-821. 567 Barcelos ID, Vieira RC, Ferreira EM, Martins WP, Ferriani RA, Navarro PA. Comparative analysis of the 568 spindle and chromosome configurations of in vitro-matured oocytes from patients with 569 endometriosis and from control subjects: a pilot study. Fertil Steril 2009;92: 1749-1752. 570 Brosens I, Puttemans P, Gordts S, Campo R, Benagiano G. Early stage management of ovarian 571 endometrioma to prevent infertility. Facts Views Vis Obgyn 2013;5: 309-314. 572 Bérubé S, Marcoux S, Langevin M, Maheux R. Fecundity of infertile women with minimal or mild 573 endometriosis and women with unexplained infertility. The Canadian Collaborative Group on 574 Endometriosis. Fertil Steril 1998;69: 1034-1041. 575 Da Broi MG, de Albuquerque FO, de Andrade AZ, Cardoso RL, Jordão Junior AA, Navarro PA. 576 Increased concentration of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in follicular fluid of infertile women with 577 endometriosis. Cell Tissue Res 2016. 578 Da Broi MG, Giorgi VSI, Wang F, Keefe DL, Albertini D, Navarro PA. Influence of follicular fluid and 579 cumulus cells on oocyte quality: clinical implications. J Assist Reprod Genet 2018;35: 735-751. 580 Da Broi MG, Malvezzi H, Paz CC, Ferriani RA, Navarro PA. Follicular fluid from infertile women with 581 mild endometriosis may compromise the meiotic spindles of bovine metaphase II oocytes. Hum 582 Reprod 2014;29: 315-323. 583 de Ziegler D, Borghese B, Chapron C. Endometriosis and infertility: pathophysiology and 584 management. Lancet 2010;376: 730-738. 585 Dı ́az I, Dı ́az I, Navarro J, Blasco L, Simón C, Pellicer A, Remohı ́ J. Impact of stage iii–iv endometriosis on 586 recipients of sibling oocytes: matched case-control study. Fertility and Sterility 2000;74: 31-34. 587 133 Downs SM, Mosey JL, Klinger J. Fatty acid oxidation and meiotic resumption in mouse oocytes. Mol 588 Reprod Dev 2009;76: 844-853. 589 Dunning KR, Anastasi MR, Zhang VJ, Russell DL, Robker RL. Regulation of fatty acid oxidation in 590 mouse cumulus-oocyte complexes during maturation and modulation by PPAR agonists. PLoS One 591 2014;9: e87327. 592 Dunning KR, Cashman K, Russell DL, Thompson JG, Norman RJ, Robker RL. Beta-oxidation is essential 593 for mouse oocyte developmental competence and early embryo development. Biol Reprod 2010;83: 594 909-918. 595 Dunning KR, Robker RL. Promoting lipid utilization with l-carnitine to improve oocyte quality. Anim 596 Reprod Sci 2012;134: 69-75. 597 Dunning KR, Russell DL, Robker RL. Lipids and oocyte developmental competence: the role of fatty 598 acids and β-oxidation. Reproduction 2014;148: R15-27. 599 Evans AM, Fornasini G. Pharmacokinetics of L-carnitine. Clin Pharmacokinet 2003;42: 941-967. 600 Ferreira EM, Vireque AA, Adona PR, Ferriani RA, Navarro PA. Prematuration of bovine oocytes with 601 butyrolactone I reversibly arrests meiosis without increasing meiotic abnormalities after in vitro 602 maturation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2009;145: 76-80. 603 Giorgi VS, Da Broi MG, Paz CC, Ferriani RA, Navarro PA. N-Acetyl-Cysteine and l-Carnitine Prevent 604 Meiotic Oocyte Damage Induced by Follicular Fluid From Infertile Women With Mild Endometriosis. 605 Reprod Sci 2016;23: 342-351. 606 Haghiac M, Yang XH, Presley L, Smith S, Dettelback S, Minium J, Belury MA, Catalano PM, Hauguel-de 607 Mouzon S. Dietary Omega-3 Fatty Acid Supplementation Reduces Inflammation in Obese Pregnant 608 Women: A Randomized Double-Blind Controlled Clinical Trial. PLoS One 2015;10: e0137309. 609 Hamdan M, Jones KT, Cheong Y, Lane SI. The sensitivity of the DNA damage checkpoint prevents 610 oocyte maturation in endometriosis. Sci Rep 2016;6: 36994. 611 Hashimoto S, Minami N, Takakura R, Imai H. Bovine immature oocytes acquire developmental 612 competence during meiotic arrest in vitro. Biol Reprod 2002;66: 1696-1701. 613 Ju JC, Jiang S, Tseng JK, Parks JE, Yang X. Heat shock reduces developmental competence and alters 614 spindle configuration of bovine oocytes. Theriogenology 2005;64: 1677-1689. 615 Kennedy S, Bergqvist A, Chapron C, D'Hooghe T, Dunselman G, Greb R, Hummelshoj L, Prentice A, 616 Saridogan E, Group ESIGfEaEGD. ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of endometriosis. 617 Hum Reprod 2005;20: 2698-2704. 618 Liu L, Ju JC, Yang X. Differential inactivation of maturation-promoting factor and mitogen-activated 619 protein kinase following parthenogenetic activation of bovine oocytes. Biol Reprod 1998;59: 537-545. 620 Malhi PS, Adams GP, Singh J. Bovine model for the study of reproductive aging in women: follicular, 621 luteal, and endocrine characteristics. Biol Reprod 2005;73: 45-53. 622 Mansour G, Abdelrazik H, Sharma RK, Radwan E, Falcone T, Agarwal A. L-carnitine supplementation 623 reduces oocyte cytoskeleton damage and embryo apoptosis induced by incubation in peritoneal fluid 624 from patients with endometriosis. Fertil Steril 2009;91: 2079-2086. 625 Mansour G, Sharma RK, Agarwal A, Falcone T. Endometriosis-induced alterations in mouse 626 metaphase II oocyte microtubules and chromosomal alignment: a possible cause of infertility. Fertil 627 Steril 2010;94: 1894-1899. 628 Missmer SA, Hankinson SE, Spiegelman D, Barbieri RL, Marshall LM, Hunter DJ. Incidence of 629 laparoscopically confirmed endometriosis by demographic, anthropometric, and lifestyle factors. Am 630 J Epidemiol 2004;160: 784-796. 631 Nadjarzadeh A, Dehghani-Firouzabadi R, Daneshbodi H, Lotfi MH, Vaziri N, Mozaffari-Khosravi H. 632 Effect of Omega-3 Supplementation on Visfatin, Adiponectin, and Anthropometric Indices in Women 633 with Polycystic Ovarian Syndrome. J Reprod Infertil 2015;16: 212-220. 634 Nehra D, Le HD, Fallon EM, Carlson SJ, Woods D, White YA, Pan AH, Guo L, Rodig SJ, Tilly JL et al. 635 Prolonging the female reproductive lifespan and improving egg quality with dietary omega-3 fatty 636 acids. Aging Cell 2012;11: 1046-1054. 637 Nikoloff N, Pascua AM, Anchordoquy JM, Anchordoquy JP, Sirini MA, Seoane A, Furnus CC. Effect of 638 eicosapentaenoic acid on bovine cumulus-oocyte complex in vitro. Cell Biol Int 2017;41: 505-513. 639 134 Oseikria M, Elis S, Maillard V, Corbin E, Uzbekova S. N-3 polyunsaturated fatty acid DHA during IVM 640 affected oocyte developmental competence in cattle. Theriogenology 2016;85: 1625-1634.e1622. 641 Paczkowski M, Silva E, Schoolcraft WB, Krisher RL. Comparative importance of fatty acid beta-642 oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and 643 porcine cumulus oocyte complexes. Biol Reprod 2013;88: 111. 644 Parazzini F. Ablation of lesions or no treatment in minimal-mild endometriosis in infertile women: a 645 randomized trial. Gruppo Italiano per lo Studio dell'Endometriosi. Hum Reprod 1999;14: 1332-1334. 646 Pellicer A, Navarro J, Bosch E, Garrido N, Garcia-Velasco JA, Remohí J, Simón C. Endometrial quality in 647 infertile women with endometriosis. Ann N Y Acad Sci 2001;943: 122-130. 648 Rahbar N, Asgharzadeh N, Ghorbani R. Effect of omega-3 fatty acids on intensity of primary 649 dysmenorrhea. Int J Gynaecol Obstet 2012;117: 45-47. 650 Regiani T, Cordeiro FB, da Costa LoV, Salgueiro J, Cardozo K, Carvalho VM, Perkel KJ, Zylbersztejn DS, 651 Cedenho AP, Lo Turco EG. Follicular fluid alterations in endometriosis: label-free proteomics by MS(E) 652 as a functional tool for endometriosis. Syst Biol Reprod Med 2015;61: 263-276. 653 Salvi A, Carrupt P, Tillement J, Testa B. Structural damage to proteins caused by free radicals: 654 asessment, protection by antioxidants, and influence of protein binding. Biochem Pharmacol 655 2001;61: 1237-1242. 656 Sanchez AM, Viganò P, Somigliana E, Panina-Bordignon P, Vercellini P, Candiani M. The distinguishing 657 cellular and molecular features of the endometriotic ovarian cyst: from pathophysiology to the 658 potential endometrioma-mediated damage to the ovary. Hum Reprod Update 2014;20: 217-230. 659 Santos RR, Schoevers EJ, Roelen BA. Usefulness of bovine and porcine IVM/IVF models for 660 reproductive toxicology. Reprod Biol Endocrinol 2014;12: 117. 661 Sharma RK, Azeem A, Agarwal A. Spindle and chromosomal alterations in metaphase II oocytes. 662 Reprod Sci 2013;20: 1293-1301. 663 Simón C, Gutiérrez A, Vidal A, de los Santos MJ, Tarín JJ, Remohí J, Pellicer A. Outcome of patients 664 with endometriosis in assisted reproduction: results from in-vitro fertilization and oocyte donation. 665 Hum Reprod 1994;9: 725-729. 666 Simón C, Gutiérrez A, Vidal A, de los Santos MJ, Tarín JJ, Remohí J, Pellicer A. Outcome of patients 667 with endometriosis in assisted reproduction: results from in-vitro fertilization and oocyte donation. 668 Human Reproduction 1994;9: 725-729. 669 Valsangkar D, Downs SM. A requirement for fatty acid oxidation in the hormone-induced meiotic 670 maturation of mouse oocytes. Biol Reprod 2013;89: 43. 671 Waters SM, Coyne GS, Kenny DA, Morris DG. Effect of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on 672 transcription factor regulation in the bovine endometrium. Mol Biol Rep 2014;41: 2745-2755. 673 Wathes DC, Abayasekara DR, Aitken RJ. Polyunsaturated fatty acids in male and female reproduction. 674 Biol Reprod 2007;77: 190-201. 675 Wittmann T, Hyman A, Desai A. The spindle: a dynamic assembly of microtubules and motors. Nat 676 Cell Biol 2001;3: E28-34. 677 Zhang X, Wu XQ, Lu S, Guo YL, Ma X. Deficit of mitochondria-derived ATP during oxidative stress 678 impairs mouse MII oocyte spindles. Cell Res 2006;16: 841-850. 679