{"paper_id":"73790020-4e53-4e9b-8938-1e18445fa9a0","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \n \n \nVANESSA SILVESTRE INNOCENTI GIORGI \n \n \n \n \n \n \nL-carnitina e ácidos graxos ômega-3 previnem danos meióticos em oócitos \nbovinos maturados in vitro com fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2018 \n\nVANESSA SILVESTRE INNOCENTI GIORGI \n \n \n \n \nL-carnitina e ácidos graxos ômega-3 previnem danos meióticos em \noócitos bovinos maturados in vitro com fluido folicular de mulheres inférteis \ncom endometriose \n \n \nVersão Original \n \n \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto da Universidade de São Paulo \npara obtenção do título de Doutor em Ciências \nMédicas. \n \nÁrea de Concentração: Ginecologia e \nObstetrícia (opção: Biologia da Reprodução) \n \nOrientadora: Profª Drª Paula Andrea de \nAlbuquerque Salles Navarro \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2018 \n\nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n         Giorgi, Vanessa Silvestre Innocenti \n      L-carnitina e ácidos graxos ômega -3 previnem danos \nmeióticos em oócitos bovinos maturados in vitro  com fluido \nfolicular de mulheres inférteis com endometriose, 2018. \n \n               134 p. : il. ; 30 cm \n \nTese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto/USP. Área de concentração: Ginecologia e \nObstetrícia \n               Orientador: Navarro, Paula A de Albuquerque Sales. \nVersão Original \n \n       1. Endometriose. 2. Infertilidade feminina. 3. Fluido folicular. 4. \nQualidade oocitári a. 5. L -carnitina. 6. Ômega -3. 7. Ácido \ndocosahexaenóico. 8. Ácido eicosapentaenoico. 9. Antioxidante. \n10. β-oxidação. \n \n \n \n\n \n \nFOLHA DE APROVAÇÃO \n\nNome: GIORGI, V. S. I.  \nTítulo: L-carnitina e ácidos graxos ômega -3 previnem danos meióticos em oócitos \nbovinos maturados in vitro  com fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose. \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto da Universidade de São Paulo \npara obtenção do título de Doutor em Ciências \nMédicas. \n \n \nAprovado em: \n \n \nBanca Examinadora \n \nProf. Dr. ________________________________________________ \nInstituição: ______________________________________________ \nJulgamento: _____________________________________________ \n \nProf. Dr. ________________________________________________ \nInstituição: ______________________________________________ \nJulgamento: _____________________________________________ \n \nProf. Dr. ________________________________________________ \nInstituição: ______________________________________________ \nJulgamento: _____________________________________________ \n \nProf. Dr. ________________________________________________ \nInstituição: ______________________________________________ \nJulgamento: _____________________________________________ \n\n \n \nDEDICATÓRIA \n \n\n \nÀ minha família, com amor, admiração e gratidão por toda compreensão, carinho, \napoio, presença e incansável apoio ao longo do período de elaboração deste \ntrabalho. \n\n \n \nAGRADECIMENTOS \n \n\nGosto de pensar que essa é a parte em que devo tentar cometer o menor \nnúmero de esquecimentos possíveis, por dois motivos: 1º: nenhuma tese é perfeita, \nsempre há vírgulas faltando, erros ortográficos, margens fora dos padrões, etc. E 2º: \né bem provável que os meus leitores mais especiais (a minha família) se atenham \napenas a esta seção (e é bem compreensível). Então, vou caprichar. \nHá quase sete anos atrás iniciei a minha aventura na dedicaçã o exclusiva a \npós-graduação. Longe da família, amigos e namorado comecei a me aprofundar ao \nmundo da infertilidade e da endometriose  repleto de interrogações . E se não \nbastasse a complexidade, surgiu o estresse oxidativo, os antioxidantes e a beta -\noxidação! E por tudo isso e muito mais, tenho muito a agradecer ao doutorado, fase \nda minha vida que me mostrou minhas fragilidades e me ensinou a superá -las. \nEntretanto, nada seria possível nes ta caminhada, se ela fosse solitária, e foram \nmuitas as pessoas que me ajudaram nesta empreitada. \nInicialmente, gostaria de agradecer às pacientes doadoras de fluido folicular. \nSempre muito interessadas e simpáticas, ouviam muito atentas o que eu tinha para \nfalar (e pedir). Cada amostra de fluido folicular doada foi armazena da com muito \ncarinho e boas intenções . Com esperança, aguardo que um dia,  todo esse estudo \nseja aplicável clinicamente. \nDurante o recrutamento das pacientes, contei com uma equipe enorme e \nsempre disposta. Agradeço imensamente à equipe de enfermagem: Auxi, Marisa, Dri \ne Sandra e a todos os residentes que passaram pelo Lab de GO e me auxiliaram \ncom dúvidas clínicas e realizaram as punções foliculares. Doutores Stael, Nani, Erci, \nAnderson, Well, que quando me viam de roupinha azul e caixa de isopor na s mãos, \njá diziam “ - Sem meio, primeiro folículo do primeiro ovário” . Obrigada por toda a \ngentileza e carinho. \nÀ equipe de embriologia, Cris, Roberta, Camila e Thalita, que pelo pass \nthrough recebiam um tubinho com a designação “esse é da Vanessa”, e se \nanimavam j unto comigo quando tinha óvulo ou células. Muito obrigada, meninas, \nvocês são incríveis! \nÀs queridas andrologistas, Marilda e Fabi, que me ensinaram o que é \nespermograma e me apoiaram em muitoss momentos importantes. Obrigada, \nqueridas! \nÀs meninas da dosagem hormonal, Albina e Tati, pela simpatia e cordialidade \nem todos os momentos. \n\nÀ Cidinha, que mudou o laboratório de cultivo e me fez ver como era difícil \ntrabalhar sem o apoio dela. Cidinha, obrigada por cada ovário aspirado, por cada \nbronca e risada, e p or todos os dias que você NÃO estava de férias.  Sua \ncontribuição foi inestimável. \nAgradeço ao Ricardo Pereira por todas as coletas de ovários no abatedouro \nde Sertãozinho. \nÀs queridas Cris Brent, Océlia e Gisele, pela confiança, bom convívio e \nconselhos. Obrigada pelo profissionalismo e risadas. \nInestimável agradecimento à Bete Milani, que sempre com muita simpatia , me \najudou em todos os “pepinos” no confocal. Obrigada pela paciência e por todo o \nconhecimento. \nÀ Cris Padovan, que me faz rir nas situações m ais inusitadas. Obrigada pelo \napoio enquanto estive com os experimentos no Multiusuário, obrigada pela amizade! \nAos demais funcionários do Multiusuário, Lilian, Ronaldo, Paula e Estela, por \nme acolherem durante um mês de experimentos fora do HC. \nÀ Drª Juli ana Meola que, gentilmente, cedeu seu laboratório recém montado \npara a continuação dos meus experimentos enquanto o Lab GO estava fechado em \nreforma. Obrigada por ser um exemplo de profissional e amiga, tenho você no fundo \ndo meu coração. \nAo Drº Rui Ferria ni pelo apoio científico e financeiro. Obrigada por ser uma \npessoa inspiradora, e por sempre ter contribuído com a minha formação na pós -\ngraduação. \nAos docentes do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia  (especialmente \nos docentes do Lab de GO: Ana Carol ina Sá, Rosana, Rui) pela cordialidade, \nconhecimentos e boa convivência. \nAos funcionários do oitavo andar do HC, Suélen, Ilza, Gabi, Rosana, \nReinaldo, Ricardo e Suleimy, obrigada por todos os socorros e orientações, sempre \ncom muita simpatia e empenho. \nA todos os envolvidos na pós -graduação em Ginecologia e Obstetrícia da \nFMRP-USP, à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível \nSuperior – Código de Financiamento 001 ) e à FAEPA (Fundação de Amparo ao \nEnsino, Pesquisa e Assistência do HC -FMRP) pe lo suporte, bolsa e incentivo \nfinanceiro. \n\nÀs alunas e ex-alunas do cultivo, por todos ensinamentos, protocolos, dúvidas \ncompartilhadas, ovários aspirados… obrigada sempre pela boa convivência e bom \nsenso. \nÀs alunas e ex-alunas do grupo de endometriose (especialmente Michi, Carol \nMantovani, Lili, Bruna Gazeto , Elisa)…obrigada, meninas, por todos os prontuários \nrevisados, artigos compartilhados. Uma pós -graduação não se faz sozinha, e é \nmuito bom ter pessoas como vocês na minha jornada, exemplos de profission alismo, \ncompetência e generosidade. Vocês estão no meu coração! \nAos alunos e ex-alunos do grupo de pesquisa da Drª Paula Navarro, Paulinha, \nDú, Thalita, Fer Veronese, Iara, Ricardo Pimentel, Marcela, Malu, Aline, Mayra,, \nJhenifer, pelo bom convívio, amizade e generosidade. \nAos pós -graduandos e ex -pós-graduandos do Laboratório de GO, pela \namizade e pelo incentivo diário.  \nAgradeço também, aos amigos de fora da PG (amigos(as) de infância, \namigos(as) da faculdade, e amigas do antigo lab), que mesmo de longe se mpre me \napoiaram e escutaram as minhas incertezas. \nÀ minha orientadora, Drª Paula Navarro, que ao longo desses 7 anos teve um \nárduo trabalho em me ensinar sobre pesquisa, e por me aconselhar em diversas \nsituações pessoais. Paula, você é uma pessoa iluminad a e sou eternamente grata \npor todos os ensinamentos e exemplos. \nÀ minha avó Edméa ( in memorian), por todas as preces aos anjos da guarda \ne à Santa Filomena. A srª faz falta! \nAo meu grande amor , Thiago, que sempre ilumina meus pensamentos e \nmeus dias. Obrig ada por todo o carinho , compreensão e paciência nessa longa \ncaminhada... obrigada pelo maior presente de nossas vidas , agora somos 3 ! Te \namo. \nÀs melhores irmãs do mundo, Anna Paula e Bruna, obrigada por serem \nminhas melhores amigas, por serem meus exemplos  de vida, por serem meu ponto \nde equilíbrio. Amo muito vocês. \nÀ melhor mãe do mundo, Ivone. Obrigada por confiar em mim, por me apoiar \nnas horas mais difíc eis, por me acalentar com beijos e guloseimas, por ser meu \nexemplo de vida, por nunca me esconder as dificuldades do mundo. Mãe, aqui estou \nterminando o doutorado, e este título é SEU.  Obrigada por não ter desistido daquela \n\ncriança que chorava e não queria ir para escola. Te amo muito muito. Prometo me \nesforçar muito para ser 1% da mãe que você é. \nAo melhor pai do mundo, Fábio. Obrigada por ser o cara que resolve tudo e \nfaz qualquer situação ficar mais fácil. Obrigada pelos socorros de urgência. Obrigada \npelo carinho, pelo suporte e, principalmente, pelos conselhos. Você é um exemplo \npara mim, mostrando qu e faculdade e títulos acadêmicos não resumem inteligência \ne caráter. Obrigada por cuidar de mim. Te amo muito.  \nMeu muiiito obrigada a todos!! \n \n\n \n \nEPÍGRAFE \n \n\n \n \nPor vezes, sentimos que aquilo que fazemos \nnão é senão uma gota de água no mar. Mas \no mar seria menor se lhe faltasse uma gota. \nMadre Teresa de Calcutá \n \n\n \n \nRESUMO \n \n\nGIORGI, Vanessa Silvestre Innocenti. L-carnitina e ácidos graxos ômega -3 \nprevinem danos meióticos em oócitos bovinos maturados in vitro com fluido \nfolicular de mulheres inférteis com en dometriose. Tese (Doutorado em Ciências \nMédicas) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, \nRibeirão Preto, 2018. \nNo presente estudo avaliamos o impacto da adição de fluido folicular ( FF) de mulheres \ninférteis sem e com endometriose em estágios iniciais (I/II) e avançados [(III/IV) sem e com \nendometrioma] ao meio de maturação in vitro (MIV) sobre as taxas de normalidade meiótica \nde oócitos bovinos. Avaliamos se a L-carnitina (LC) e os ácidos graxos ômega-3 [n3, ácidos \ndocosahexaenóico (DHA) e eicosapentaenoico (EPA)]  são capazes de prevenir os danos \nmeióticos em oócitos bovinos induzidos por FF de mulheres inférteis com endometriose I/II e \nIII/IV durante a MIV. Para isso, realizamos um estudo experimental utilizando modelo \nbovino. Trinta e duas amostras de FF foram colhidas de 24 mulheres inférteis com \nendometriose (8 com I/II, 8 com III/IV sem endometrioma e 8 III/IV com endometrioma no \nciclo) e 8 sem endometriose (controle) que foram submetidas à estimulação ovariana \ncontrolada p ara realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Complexos \ncumulus-oócitos (CCOs) imaturos de bovinos foram submetidos à MIV divididos em 9 \ngrupos: sem FF (sem -FF), com 1% de FF de mulheres inférteis sem endometriose \n(FFControle) e com endo metriose (FFEI/II, FFEIII/IV e FFEendometrioma) suplementados \nou não com LC  (0,6mg/mL) e ácidos graxos ômega -3 (0,4 nM de DHA e 0,6 nM de EPA)  \n(FFControle+LC+n3, FFEI/II+ LC+n3, FFEIII/IV+ LC+n3 e FFEendometrioma+ LC+n3). Após \n22-24h de MIV, os oócitos foram denudados, fixados e armazenados para realização de \nimunofluorescência para visualização do fuso meiótico e cromossomos por microscopia \nconfocal. As taxas de metáfase II (MII) e de MII normais foram comparadas entre os 9 \ngrupos utilizando o teste do qui -quadrado (p<0,05). Um total de 1686 CCOs imaturos foram \nsubmetidos à MIV, e 1401 oócitos foram visualizados por microscopia confocal. A adição de \nFF de mulheres com endometriose ao meio de MIV  reduziu a taxa de MII normais (FFEI/II: \n62,2%, FFEIII/IV: 70,2% e FFEendometrioma: 72,7%) comparado aos grupos sem -FF \n(87,2%) e FFControle (87,2 %). O grupo FFEendometrioma (69,3%) apresentou a menor \ntaxa de MII comparado a todos os  demais grupos (sem-FF: 91,9% , FFControle: 89,2% , \nFFControle+LC+n3: 89,2% , FFEI/II: 85,4% , FFEI/II+LC+n3: 85,3% , FFEIII/IV: 80,7% , \nFFEIII/IV+LC+n3: 90,8% , FFEndometrioma+LC+n3: 86,4%). O grupo FFEIII/IV apresentou \nmenor taxa de MII comparado ao grupo sem -FF. No grupo com FFControle, a adição de \nLC+n3 não alterou as taxas de MII (89,2% vs 89,2) e de MII normais (87,2% vs 82,5%). No \ngrupo FFEI/II, a adição de LC+n3  aumentou a taxa de MII normais (84,5% vs. 62,2%). No \ngrupo FFEIII/IV a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (70,2% vs 84,1%) e de \nMII (90,8%), que passou a ser  semelhante a dos grupos sem -FF e FFControle . No grupo \nFFEendometrioma a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (86,4%), comparado \nao grupo FFEendometrioma (69,3 %), a qual foi similar a dos  grupos sem-FF e FFControle. \nPortanto, o FF de mulheres com endometriose p rejudica o fuso meiótico e o alinhamento \ncromossômico de oócitos bovinos, independentemente, do estágio da doença. Entretanto, o \navanço da endometriose e a presença de endometrioma parecem ter um impacto ainda \nmais negativo na qualidade oocitária, prejudic ando também a maturação nuclear. A adição \nde LC+n3 previne os danos meióticos oocitários provocados pelo FF de mulheres com \nendometriose em estágios iniciais e avançados. Dessa forma, sugerimos que inflamação, o \nestresse oxidativo e a desregulação da β -oxidação são fatores envolvidos na alteração da \nqualidade oocitária e, consequente,  piora da fertilidade natural de mulheres com \nendometriose. \n \nPalavras-chave: Endometriose. Infertilidade feminina. Fluido folicular. Qualidade oocitária. L-\ncarnitina. Ômega-3. Ácido docosahexaenóico . Ácido eicosapentaenoico . Antioxidante. β-\noxidação. \n\n \n \nABSTRACT \n\nGIORGI, Vanessa Silvestre Innocenti. L-carnitine and omega-3 fatty acids prevent \nmeiotic damages in bovine oocytes matured in vitro with follicular fluid from \ninfertile women with endometriosis. Thesis (Doctoral Degree in Medical Sciences) \n– Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, \nBrazil, 2018. \nIn the present study, we evaluated the impact of the addition o f follicular fluid (FF) from \ninfertile women without and with endometriosis in the early (I/II) and advanced stages [(III/IV) \nwith and without endometrioma ] to the in vitro  maturation (IVM) medium on the meiotic \nnormality rates of bovine oocytes. We evalua ted whether L-carnitine (LC) and omega-3 fatty \nacids [n3, docosahexaenoic (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA)] were able to prevent \nbovine meiotic oocyte damage induced by FF from infertile women with endometriosis  in \nstages I/II and III/IV during IVM. For this, we performed an experimental study using bovine \nmodel. Thirty-two FF samples were collected from 24 infertile women with endometriosis (8 \nwith I/II, 8 with III/IV without endometrioma and 8 III/IV with endometrioma in the cycle) and 8 \nwithout endo metriosis (control) who underwent to controlled ovarian  stimulation for \nintracytoplasmic sperm injection. Immature cumulus oocytes complexes(COCs) of bovines \nwere submitted to IVM divided into 9 groups: without FF  (No-FF), with 1% FF of infertile \nwomen wit hout endometriosis (FFControl) and with endometriosis (FFEI/II, FFEIII/IV and \nFFEendometrioma) supplemented or not with LC (0.6  mg/mL) and omega-3 fatty acids (0.4 \nnM DHA and 0.6 nM EPA) (FFControl+LC+n3, FFEI/II+LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 and \nFFEendometrioma+LC+n3). After 22 -24h of IVM, the oocytes were denuded, fixed and \nstored for subsequent immunofluorescence to visualize the meiotic spindle and \nchromosomes by confocal microscopy. The  metaphase II (MII)  and normal MII rates were \ncompared between the 9 group s using the chi -square test (p <0.05). A total of 1686 \nimmature COCs were submitted to IVM, and 1401 oocytes were visualized by confocal \nmicroscopy. Addition of FF from women with endometriosis to the IVM medium decreased \nthe rate of normal MII (FFEI/II: 6 2.2%, FFEIII/IV: 70.2% and FFEendometrioma: 72.7%) \ncompared to the No-FF (87.2%) and FFControl (87.2%)  groups. The FFEendometrioma \ngroup (69.3%) presented the lowest rate of MII compared to all other groups ( No-FF: 91.9%, \nFFControl: 89.2%, FFControl+L C+n3: 89.2%, FFEI/II: 85.4%, FFEI/II+LC+n3: 85.3%, \nFFEIII/IV: 80.7%, FFEIII/IV+LC+n3: 90.8%, FFEndometrioma+L C+n3: 86.4%). The FFEIII/IV \ngroup had a lower MII rate compared to the No-FF group. In the group with FFControl, the \naddition of LC+n3 did not change th e rates of MII (89.2% vs 89.2%) and normal MII (87.2% \nvs 82.5%). In the FFEI/II group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (84.5% \nvs 62.2%). In the FFEIII/IV group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate \n(70.2% vs 84.1%) and MII (90.8%), which was similar to that of the No-FF and FFControl. In \nthe FFEendometrioma group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate ( 69.3% vs \n86.4%) which was similar to No-FF and FFControl groups. Therefore, the FF of women with \nendometriosis impairs the meiotic spindle and the chromosomal alignment of bovine oocytes, \nregardless of the stage of the disease. However, the progression of endometriosis and the \npresence of endometrioma appear to have an even more negative impact on oocyte quality , \nand also impairs nuclear maturation. The addition of LC+ n3 prevents meiotic oocyte \ndamages induced by FF from women with endometriosis in the early and advanced stages. \nThus, we suggest that inflammation, oxidative stress and deregulation of β -oxidation are \nfactors involved in the alteration of oocyte quality and, consequently, worsening of the natural \nfertility of women with endometriosis. \n \nKeywords: Endometriosis. Female i nfertility. Follicular fluid. Oocyte quality. L -carnitine. \nOmega-3. Docosahexaenoic acid. Eicosapentaenoic acid. Antioxidant. β-oxidation. \n \n \n\n \n \nLISTA DE FIGURAS \n\n \nFigura 1: β-oxidação mitocondrial de ácidos graxos e sua regulação.............................. 42 \nFigura 2: Estrutura química da molécula de L -carnitina (nome IUPAC: 3 -Hidroxi-4-\ntrimetilamonio-butanoato; fórmula molecular: C7H15NO3; massa molar: 161,199 \ng/mol)................................................................................................................................ 44 \nFigura 3: Estrutura química das moléculas de ácidos graxos ômega -3: A -) Ácido \neicosapentaenoico (EPA) e B-) Ácido docosahexaenóico (DHA)..................................... 47 \nFigura 4: Vias metabólicas de síntese de ácidos graxos ômega-3 e ômega-6................. 48 \nFigura 5: Síntese e ações de mediadores lipídicos produzidos a partir dos ácidos \naraquidônico (AA), eicosapentaenoico (EPA) e docosahexaenóico (DHA)...................... 48 \nFigura 6: Estágios de maturação nuclear de oócitos bovinos maturados in vitro e analisados \npor microscopia confocal.  A -) Metáfase I; B) Telófase I; C -) Metáfase II; D -) Ativação \nPartenogenética(TelófaseII).............................................................................................. 61 \nFigura 7: Posição de visualização do fuso meiótico de oócitos bovinos em metáfase II \nmaturados in vitro e visualizados por microscopia confocal. A -) Polar (fuso não ana lisável), \nB-)Sagital(analisável)........................................................................................................ 62 \nFigura 8: Classificação de oócitos bovinos maturados in vitro, em metáfase II analisáveis, de \nacordo com a organizaç ão do fuso meiótico e alinhamento cromossômico analisados por \nmicroscopia confocal. A -), B -) e C -) representam anormais e D -) \nnormal............................................................................................................................... 63 \nFigura 9: Desenho experimental............................................................................ ............65 \nFigura 10: Fluxograma ilustrando recrutamento, inclusão e seguimento de mulheres inférteis \ndoadoras de fluido folicular............................................................................................... 69 \nFigura 11: Alterações meióticas oocitárias mais significativas encontradas em cada grupo: A-\n) Metáfase II normal no grupo FFControle; B -) Metáfase I no grupo FFEendometrioma; C-) a \nF-) Metáfase II anormal nos grupos FFEI/II, FFEIII/IV, FFEendometrioma e \nFFEendometioma+LC+n3, respectivamente ....................................................................74 \n \n \n \n\n \n \nLISTA DE TABELAS \n \n\nTabela 1: Variáveis clínicas e r esposta à estimulação ovariana controlada das \nmulheres inférteis doadoras de fluido folicular sem endometriose (controle), com \nendometriose em estágios iniciais (EI/II) e em estágios avançados sem \nendometrioma (EIII/IV) e com endometrioma \n(Eendometrioma)........................................................................................................70 \nTabela 2: Estágios de maturação nuclear, e porcentagem de oócitos em MII normais \nmaturados in vitro em meio sem adição de FF (sem-FF), com adição de 1% de FF de \npacientes inférteis sem endometriose (FFControle), com endometriose leve (FFEI/II), \ncom endometriose moderada/grave sem endometrioma (FFEIII/IV) ou com \nendometriose moderada/grave com endometrioma (FFEndometrioma), \nsuplementado com 0,6mg/mL de L -Carnitina, 0,4 nM de ácido docosahexaenóico e \n0,6 nM de ácido eicosapentaenóico (LC+n3) visualizados por microscopia \nconfocal......................................................................................................................73 \n  \n \n\n \n \nLISTA DE ABREVIATURAS \n\n \n \n8OHdG 8-hidróxi-2'-deoxiguanosina \nAA Ácido Araquidônico \nACO Anticoncepcional Combinado Oral \nADP Adenosina Difosfato \nAL Ácido Linoléico \nALA Ácido α-linolênico \nAP Ativação Partenogenética \nASRM Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva \nATP Adenosina Trifosfato \nCAT Capacidade Antioxidante Total \nCCO Complexo Cumulus Oócito \nCFA Contagem de Folículos Antrais \nCoA Coenzima A \nCOX-2 Cicloxigenase-2 \nCP Corpúsculo Polar \nCPT1 Carnitina Palmitoil Transferase I \nCPT2 Carnitina Palmitoil Transferase II \nDGLA Ácido di-homo-γ-linolênico \nDHA Ácido Docosahexaenóico \nDMSO Dimetilsulfóxido \nDNA Ácido Desoxirribonucléico \nDPA Ácido Docosapentaenóico \nEO Estresse Oxidativo \nEOC Estimulação Ovariana Controlada \nEPA Ácido Eicosapentaenóico \nERO Espécie Reativa do Oxigênio \nETA Ácido Eicosatetraenóico \nFF Fluido Folicular \nFITC Isotiocianato de fluoresceína \nFIV Fertilização in vitro \nFMRP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nFOX1 Total de Hidroperóxidos \nFSH Hormônio Folículo Estimulante \nGLA Ácido γ-linolênico \n\nGnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas \nGSH Glutationa Reduzida \nHC Hospital das Clínicas \nhCG Gonadotrofina Coriônica Humana \nHIV Vírus da Imunodeficiência Humana \nICSI Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoide \nIMC Índice de Massa Corpórea \nLC L-carnitina \nLOX Lipoxigenase \nLT Leucotrieno \nMDA Malondialdeído \nMI Metáfase I \nMII Metáfase II \nMIV Maturação in vitro \nNAC N-acetil-cisteína \nOCTN Transportador Catônico Orgânico \nPBS Tampão Fosfato Salino \nPG Prostaglandina \nPUFA Ácido Graxo Poli-insaturado \nRNA Ácido Ribonucleico \nRT-PCR Reação quantitativa em cadeia da polimerase \nSBF Soro Bovino Fetal \nSDA Ácido Estearidônico \nSOD Superóxido Dismutase \nTCA Ciclo do Ácido Tricarboxílico \nTHA Ácido Tetracosahexaenóico \nTI Telófase I \nTPA Ácido Tetracosapentaenóico \nTRA Técnicas de Reprodução Assistida \nVLPSC Videolaparoscopia \nUSP Universidade de São Paulo \n \n\n \n \nSUMÁRIO \n\n1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 27 \n2. REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................... 33 \n2.1. Endometriose, estresse oxidativo e infertilidade ................................. 34 \n2.2. Fluido Folicular ........................................................................................ 37 \n2.3. Competência oocitária e fuso meiótico ................................................. 39 \n2.4. β-oxidação e qualidade oocitária ........................................................... 41 \n2.5. L-carnitina ................................................................................................ 44 \n2.6. Ácidos graxos ômega-3 .......................................................................... 46 \n3. OBJETIVOS ................................................................................................. 50 \n3.1. Objetivo geral .......................................................................................... 51 \n3.2. Objetivos específicos.............................................................................. 51 \n4. MATERIAS E MÉTODOS ............................................................................ 52 \n4.1. Seleção de pacientes doadoras de fluido folicular .............................. 53 \n4.1.1.Critérios de inclusão ................................................................................ 53 \n4.2. Captação oocitária, coleta e processamento de amostras de fluido \nfolicular.............................................................................................................54 \n4.3. Estimulação Ovariana Controlada ......................................................... 55 \n4.4. Coleta de ovários bovinos, recuperação e classificação dos complexos \ncumulus-oócito... ............................................................................................ 56 \n4.5. Maturação in vitro ................................................................................... 56 \n4.6. Preparo das soluções de L-carnitina e dos ácidos graxos ômega-3 .. 58 \n4.6.1 L-carnitina.................................................................................................58 \n4.6.2 Ácidos graxos ômega-3............................................................................58 \n4.7. Imunofluorescência para visualização de microtúbulos e \ncromossomos..................................................................................................59 \n4.8. Classificação oocitária baseada na morfologia do fuso meiótico e no \nalinhamento cromossômico por microscopia confocal...............................59 \n4.9. Obtenção da variável primária.................................................................63 \n4.10. Obtenção de variáveis secundárias......................................................64 \n4.11.Obtenção das variáveis clínicas secundárias.......................................64 \n4.12. Desenho experimental............................................................................65 \n\n4.13.Análise estatística....................................................................................65 \n4.14. Cálculo Amostral.....................................................................................66 \n5. RESULTADOS ......................................................................................... ....67 \n5.1. Recrutamento de pacientes doadoras de FF ........................................ 68 \n5.2. Dados clínicos doadoras de FF...............................................................69 \n5.3. Maturação in vitro e microscopia confocal............................................70 \n6. DISCUSSÃO..................................................................................................75 \n7. CONCLUSÕES ............................................................................................ 83 \nBIBLIOGRAFIA ............................................................................................... 85 \nAPÊNDICE A: Caracterização das pacientes doadoras de fluidos foliculares \nutilizados em cada replicata de maturação in vitro de oócitos bovinos............102 \nAPÊNDICE B: Dados de estágios de maturação nuclear, e porcentagem de oócitos \nem MII normais de acordo com as oito replicatas de maturação in vitro de oócitos \nbovinos realizadas............................................................................................103 \nMANUSCRITO ...................................................................................... .........104 \n \n\n27 \n \n \n \n1. INTRODUÇÃO \n \n\n28 \n \nA e ndometriose é uma doença ginecológica, inflamatória e estrógeno \ndependente, caracterizada pela presença e pelo crescimento de tecido endometrial \n(glândulas e estroma) fora da cavidade uterina  (KENNEDY et al., 2005). Dor pélvica, \ndismenorreia, dispa reunia e infertilidade são alguns dos sintomas frequentes da \nendometriose que, por outro lado, pode ser assintomática  (KENNEDY et al., 2005; \nBELLELIS et al., 2010; SINGH et al., 2014).  \nEstudos populacionais estimam uma prevalência de 0,8 -6% de endometriose  \nna população global (MOEN; SCHEI , 1997; ABBAS et al. , 2012; FULDEORE; \nSOLIMAN, 2017). Entretanto, a prevalência da endometriose aumenta para 25 -50% \nna população de mulheres inférteis, e entre as mu lheres com endometriose, \naproximadamente, 30 -50% apresentam problemas com infertilidade  (MISSMER et \nal., 2004) . Um estudo avaliando uma grande coorte de mulheres em idade \nreprodutiva (<35 anos), reportou um risco de infertilidade duas vezes maior em \nmulheres com endometriose comparado àquelas mulheres sem a doença \n(MEULEMAN et al., 2009).  \nEntretanto, a endometriose é uma doe nça heterogênea com lesões \nperitoneais variando de um simples implante peritoneal superficial de 1 mm até a \npresença de grandes endometriomas e obliteração do fundo de saco de Douglas  \n(ASRM, 1997), e ainda mais raro, endometriose fora da cavidade pélvica  (CHAMIÉ \net al. , 2018) . A Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) , visando \npadronizar os estágios da endometriose, propôs um sistema de classificação \nbaseado na localização (peritônio, ovários), tamanho e profundidade das lesões  de \nendometriose, presença de obliteração do fundo de saco de Douglas e presença e \ntipos de ade rências afetando ovários e tubas uterinas  (ASRM, 1997) . Uma \npontuação é designada para cada tipo de achado, e então, a endometriose é \nclassificada como mínima (estágio I – pontuação de 1 -5), leve (estágio II – \npontuação de 6-15), moderada (estágio III – pontuação de 16-40) e grave (estágio IV \n– pontuação de >40) (ASRM, 1997). \nFica claro que mulheres que apresentam estágios mais  avançados da \nendometriose (III/IV) podem apresentar um comprometimento anatômico da \ncavidade pélvica dificulta ndo a ovulação, a captação do óvulo pelas f ímbrias das \ntubas uterinas, a fertilização, o transporte tubário do embrião e, possivelmente, a \nimplantação embrionária (DE ZIEGLER ; BORGHESE; CHAPRON,  2010), \njustificando a infertilidade. \n\n29 \n \nEstudo utilizando modelo primata não -humano (babuínos), avaliou o impacto \ndos quatro estágios de endometrios e sobre a fertilidade natural após acasalamentos \nao longo de vários ciclos sexuais (D'HOOGHE et al., 1996) e reportaram que a taxa \nde fecundidade por ciclo foi maior nas fêmeas livres de endometriose (controle) e \ncom EI (22%) comparado ao grupo de fêmeas  com EII, EIII e EIV (12%) \n(D'HOOGHE et al. , 1996) . O grupo controle e EI apresentaram maior taxa de \ngestação por ciclo (19% e 24,4%, respectivamente) do que os grupos EII (9,6%), EIII \n(7,5%) e EIV (12,5%) (D'HOOGHE et al., 1996). Esses dados sugerem que o avanço \nda endometriose apresenta impacto negativo sobre a fertilidade natural. \nA presença de endometrioma também parece prejudicar a fertilidade feminina. \nO e ndometrioma é considerado um “pseudocisto” formado, na maioria dos casos, \npela invaginação do córtex ovariano (BROSENS et al., 2013). Cerca de 20-40% das \nmulheres com endometriose  apresentam endometrioma  (REDWINE, 1999; \nVERCELLINI et al. , 2003) , que pode  criar um ambiente citotóxic o ao \ndesenvolvimento folicular (PAFFONI et al., 2018), diminuindo o  número de folículos \nmaduros no cór tex ovariano adjacente  (MANESCHI et al. , 1993; KITAJIMA et al. , \n2011). \nEntretanto, mesmo nos estágios iniciais da doença (I/II) , quando não se \nobserva um comprometimento anatômico da cavidade pélvica, já é observad a uma \ndiminuição da taxa da fecundidade mensal comparada com mulheres inférteis sem \ncausa aparente (BÉRUBÉ et al., 1998; PARAZZINI, 1999) evidenciando uma relação \ncausal entre infertilidade e endometriose mesmo nos estágios iniciais.  \nÉ no ambiente folicular que ocorre a maturação e o desenvolvimento \noocitário. O estresse oxidativo ( EO) presente no ambiente peritoneal de mulheres \ncom endometriose pode refletir no compartimento sistêmico do organismo e afetar o \nambiente folicular, comprometendo a qualidade oocitária e, consequentemente, o \npotencial reprodutivo dessas  pacientes (DA BROI; NAVARRO , 2016). O EO ocorre \nquando há um desequilíbrio entre espéci es reativas e antioxidantes. Espécies \nreativas do oxigênio (EROs) são produtos intermediários do metabolismo celular \nnormal (LOUSSE et al., 2012). Para se  auto protegerem dos efeitos deletérios d as \nEROs, as células desenvolveram um sistema antioxidante para limitar e inativar as \nEROs, além de reparar os danos oxidativos estabelecidos (LOUSSE et al., 2012). \nO EO pode danificar diversas proteínas intracelulares (STADTMAN, 1992; \nBERLETT; STADTMAN , 1997)  importantes para a organização do fuso celular \n\n30 \n \n(ANTONIO et al., 2000; FUNABIKI; MURRAY, 2000; ABRIEU et al., 2001) podendo \npromover lesões no material genético  e induzir o inadequado alinhamento \ncromossômico (BECKMAN; AMES , 1998; LIMOLI et al. , 1998) . As anomalias \nmeióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência do desenvolvimento celular \npor meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do oócito em completar a \nmaturação, tornando-se incapaz de ser fertilizado, até a ocorrência  de erros que não \nimpossibilitem a fertilização, mas comprometam o desenvolvimento embrionário pré \ne/ou pós -implantação, bem como a viabilidade futura do concepto (PAVLOK; \nLUCAS-HAHN; NIEMANN, 1992; LONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001). \nProgramas de doação de óvulos indicam que a qualidade oocitária é um fator \nrelevante no sucesso das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA)  em mulheres \ncom endometriose (GARCIA-VELASCO; ARICI , 1999; GARRIDO et al. , 2000) . \nSimón e colaboradores  (1994) observ aram taxas de implantação e de gestação \nsemelhantes em mulheres com e sem endometriose que receberam oócitos de \ndoadoras sem a doença  (SIMÓN et al., 1994). Entretanto, as taxas de implantação \nforam menores em mulheres sem a doença que receberam oócitos de mulheres com \nendometriose (SIMÓN et al., 1994). \nOócitos humanos são extremamente raros e seu uso em estudos invasivos \ngeralmente não é viável porque impede sua utilização nas TRA. Desta forma, \nestudos avaliando células do cumulus ou fluido folicular ( FF) podem auxiliar no \nentendimento da aquisição da competência oocitária (DA BROI et al., 2018a). \nEstudo prévio de nosso grupo reportou que a adição de FF de mulheres \ninférteis com endometriose leve  ao meio de maturação in vitro  (MIV) de oócitos  \nbovinos compromete a qualidade dos ó vulos bovinos (avaliada por meio do \nalinhamento cromossômico e organização do fuso meiótico ) quando comparado à \nadição de FF de mulheres inférteis sem endometriose  (DA BROI et al. , 2014). Os \nantioxidantes L -carnitina (LC) e N -acetil-cisteína (NAC) preveniram esses danos \nmeióticos oocitários , indicando que o EO está envolvido na etiopatogênese da \ninfertilidade relacionada à endometriose , entretanto, a LC foi superior à NAC e \npreveniu completamente esses danos (GIORGI et al., 2016).  \nA LC, além de sua função antioxidante, apresenta papel fundamental na \ngeração de energia pela célula, pois sua principal função biológica é transportar \nácidos graxos de cadeia longa do citosol para as mitocôndrias onde ocorre a β -\noxidação, um processo qu e resulta na esterificação da LC para formar derivados de \n\n31 \n \nacil-Carnitina, produzindo energia na forma de adenosina trifosfato ( ATP) (EVANS; \nFORNASINI, 2003). A ꞵ-oxidação é essencial para a retomada da meiose oocitária e \nmaturação nuclear em camundongos (DOWNS; MOSEY; KLINGER , 2009; \nPACZKOWSKI et al. , 2013; VALSANGKAR; DOWNS , 2013) , suínos e bovinos \n(PACZKOWSKI et al., 2013).  \nÁcidos graxos podem ser captados do FF pelas células da granulosa  ou \nestarem armazenados intracelularmente  no oócito  em gotas lipídicas na forma de  \ntriacilglicerídeos e em fosfolipídios de membrana  (DUNNING; RUSSEL; ROBKER , \n2014), sendo que a oxidação de uma molécula de ácido graxo (ácido palmítico) \ngera, aproximadamente, 106 ATPs comparado aos 30 ATPs gerados pela oxidação \nde uma molécula de glicose ( DUNNING; RUSSEL; ROBKER, 2014).  \nApesar de resultados conflitantes (CHAVARRO et al., 2007; CHAVARRO et \nal., 2007; WAKEFIELD et al., 2008; JUNGHEIM et al., 2011), estudos em animais e \nhumanos sugerem que uma dieta rica em ácidos graxos ômega -3 tem um impacto \npositivo na fertilidade, possivelmente devido a efeitos sobre a qualidade oocitária e a \nimplantação embrionária (HAMMICHE et al., 2011; NEHRA et al., 2012; MORAN et \nal., 2016). Estudo utilizando indução de endometriose em modelo murino, observou \nque a administração de ômega-3 previne a formação de lesões cística s de \nendometriose peritoneal (TOMIO et al., 2013). E estudo in vitro, sugeriu que ômega-\n3 suprime a sobrevivência de células de lesão de endometriose, possivelmente por \ncontrolar o EO e a inflamação (GAZVANI et al., 2001) . Dois importantes ácidos \ngraxos ômega-3 são: o ácido docosahexaenóico (DHA) e o ácido eicosapentaenóico \n(EPA).  \nHá dois estudos avaliando a adição de ômega -3 ao meio de MIV de oócitos \nbovinos (OSEIKRIA et al., 2016; NIKOLOFF et al., 2017). Oseikria e colaboradores \n(2016) mostraram que, em baixas concentrações , DHA aument a a competência \noocitária avaliada pelo aumento das  taxas de clivagem e de formação de \nblastocistos após ativação partenogenética. Nikoloff e  colaboradores (2017) \nmostraram que a adição de  EPA melhora a qualidade oocitária observada pelo \naumento da expansão das células do cumulus. \nNão há na literatura estudos avaliando o impacto do estágio da endometriose \nsobre a qualidade oocitária e a po ssível prevenção de danos oocitários com a \nadministração combinada de LC, DHA e EPA. \n\n32 \n \nDessa forma, hipotetizamos que: I-) os estágios avançados da endometriose \n(III/IV) têm impacto mais negativo sobre a qualidade oocitária do que os estágios \niniciais (I/II) da doença; II-) em mulheres com endometriose em estágios avançados \n(III/IV), a  presença de endometrioma no ciclo prejudica a inda mais a  qualidade \noocitária; e III-) LC e ácidos graxos ômega -3 previnem danos meióticos oocitários \nem mulheres inférteis com endometriose; \n \n\n33 \n \n \n \n2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA \n\n34 \n \n2.1. Endometriose, estresse oxidativo e infertilidade \n \nA endometriose , como já mencionado anteriormente, é definida como a \npresença de tecido endometrial fora da cavidade uterina   e pode ser assintomática \nou estar associada à dor (que manifesta -se como dismenorreia, dispareunia \nprofunda, disque sia e disúria) e à infertilidade  (KENNEDY et al. , 2005) . É uma \ndoença conhecida como estrógeno dependente visto que, em geral, a endometriose  \nmanifesta-se durante os anos reprodutivos da mulher (com um pico entre 25 e 35  \nanos) (PARAZZINI et al., 2017).  \nEm meados de 1800, endometriose p eritoneal, extraperitoneal, infiltração \nprofunda, endometrioma ovariano e adenomiose foram agrupados sob o nome \n\"adenomioma\" (BENAGIANO; BROSENS , 201 1). Somente na década de 1920 a \nadenomiose e a endometriose tornaram -se entidades separadas (BENAGIANO; \nBROSENS; LIPPI , 2014) . Em 1925, Sampson criou o termo “endometriose” para \nrelatar a presença de ilhas de mucosa uterina na cavidade peritoneal (BENAGIANO; \nBROSENS, 2006).  \nHá controvérsias sobre a origem  dos tipos de endometriose  (NISOLLE; \nDONNEZ, 1997), e portanto, são inúmeras as teorias que tentam explicar a origem \nda doença.  A teoria da metaplasia celômica propõe que células mesoteliais \ncelômicas do tecido peritoneal normal ou da superfície ovar iana sofram metaplasia e \nse transform em em tecido endometrial ectópico (IWANOFF, 1898) . As teorias dos \nremanescentes embrionários dos ductos de Muller, propõem que células \nembrionárias provenientes desses ductos embrionários, quando ativadas por algum \nmecanismo desconhecido, originam células seme lhantes às do endométrio original \n(VON RECKLINGHAUSEN, 1895; RUSSELL, 1899). A teoria da metástase benigna \nexplica a endometriose a p artir da disseminação linfática e/ou venosa de células \nendometriais (HALBAN, 1924; SAMPSON, 1927). E ainda u ma outra teoria propõe \nque células tronco originadas da medula óssea  se diferenciam em células \nendometriais (SASSON; TAYLOR, 2008). \nSampson é o autor da teoria, atualmente, mais bem aceita s obre a \netiopatogênese da endometriose, a teoria da menstruação retrógrada e implantação \n(SAMPSON, 1927). Essa teoria postula que células provenientes da descamação do \nendométrio, durante a menstruação , sofrem um refluxo pelas tubas uterinas até a \ncavidade pélvica onde se estabilizam e sobrevivem (SAMPSON, 1927). No entanto, \n\n35 \n \nmenstruação retrógrada acomete a maior ia das mulheres com tubas pérvias, mas a \nendometriose se desenvolve somente em 10 -15% delas (LOUSSE et al. , 2012) , \nenfatizando o papel de outros fatores n a patogênese da endometriose (BURNEY; \nGIUDICE, 2012). \nTambém são várias as teorias que tentam explicar a formação do \nendometrioma. Uma delas postula que células endo metriais da parede pélvica se \naderem à superfície do ovário, o córtex ovariano invagina e o fluido de cor \n“chocolate” típico é formado pelo acúmulo de restos menstruais resultantes do \nsangramento dos implantes de endometriose ativos (VIGANÒ et al. , 2013) . Uma \nsegunda teoria postula que devido aos implantes endometriais, o ovário adere ao \nligamento largo, essa aderência induz inflamação que leva a ovulação nesse local, e \nentão, as células endometriais invadem o corpo lúteo recém -formado constituindo \num pseudo-cisto (VERCELLINI et al., 2009). E ainda, uma outra teoria apoia a teoria \nda metaplasia celômica e diz que o mesotélio do ovário se invaginaria no córtex \novariano e que a metaplasia dessas células originariam o endometrioma (DONNEZ \net al., 1996). \nO conteúdo presente no interior do endometrioma é caracterizado por um \nacúmulo de ferro e seus derivados, tornando o ambiente tóxico e hostil à \nfoliculogênese (SANCHEZ et al., 2014). Através da reação de Fenton, o ferro livre \npode gerar EROs provocando danos a macromoléculas essenciais  [ácido \ndesoxirribonucleico (DNA) , proteínas e lipídios ] para o funcionamento celular \n(JOMOVA; VALKO, 2011) e qualidade oocitária. \nIndependentemente do tipo de lesão e da origem das células endometriais \nectópicas, alguns mecanismos parecem contribuir para o desenvolvimento da \ndoença, como: número e quantidade de fluxos menstrua is, alterações da sinalização \ndo estrogênio, resistência a progesterona, inflamação exacerbada e EO (BURNEY; \nGIUDICE, 2012; VERCELLINI et al. , 2014; DONNEZ et al. , 2016; PATEL et al. , \n2018). \nEm mulheres, com endomet riose há um aumento da ativação de macrófagos \nna cavidade peritoneal (GAZVANI; TEMPLETON , 2002) , gerando um ambiente \nhostil, que interfere na atividade normal de outras células peritoneais, favorecendo o \ndesenvolvimento de  implantes de endometriose  (LOUSSE et al. , 2012)  e \ncontribuindo para a formação de adesões peritoneais e angiogênese (TANBO; \nFEDORCSAK, 2017) . Os macrófagos na cavidade peritoneal de mulheres com \n\n36 \n \nendometriose acumulam ferro, provavelmente, como resultado da presença \nexcessiva de sangue na pelve (VAN LANGENDONCKT ; CASANAS-ROUX; \nDONNEZ, 2002) . O ferro livre (não conjugado à proteína s) estimula a geração de \nEROs, promovendo o EO, que por sua vez favorece a progressão da endometriose \nvia dano peritoneal, exposição do tecido conjuntivo, neoangiogênese e proliferação \ncelular endometrial aumentada (LOUSSE et al., 2012; VERCELLINI et al., 2014).  \nEstudos sugerem que EO esteja relacionado com a patogênese da \ninfertilidade relacionada à endometriose (AGARWAL; GUPTA; SHARMA , 2005; DA \nBROI; NAVARRO, 2016; SCUTIERO et al., 2017). No soro, mulheres inférteis com \nendometriose apresentam diminuição da atividade da superóxido dismutase (SOD) \n(PRIETO et al. , 2012)  e da capacidade antioxidante total ( CAT) (DA BROI  et al. , \n2016; NASIRI et al. , 2017; DA BROI  et al. , 2018 b), e aumento dos níveis de \nmalondialdeído (MDA) (NASIRI et al., 2017) e de total de hidroperóxidos (FOX1) (DA \nBROI et al., 2018b) comparado a mulheres sem a doença. E no FF, há um aumento \nde peróxidos lipídicos (NASIRI et al., 2017), EROs, MDA, óxido nítrico (SINGH et al., \n2013b) e de 8 -hidroxi-2’-deoxiguanosina (8OHdG) (DA BROI et al., 2016; DA BROI \net al., 2018b), e uma diminuição da CAT, SOD, da catalase, glutationa peroxidase, \nglutationa redutase e vitaminas A, C e E (PRIETO et al., 2012; SINGH et al., 2013b; \nNASIRI et al., 2017) comparado a mulheres sem a doença. \nAlterações do ambiente folicular pelo EO na endometriose podem prejudicar a \nqualidade oocitária por causar danos diretos ao DNA (DA BROI  et al. , 2016) , \nprejudicar a organização do fuso meiótico (DA BROI et al., 2014; GOUD et al., 2014) \ne o funcionamento mitocondrial (XU et al. , 2015) , e ainda alterar a zona pelúcida \n(GOUD et al., 2014). \n \n\n37 \n \n2.2. Fluido Folicular \n \nO FF é uma solução ligeiramente viscosa, cor de palha e de pH próximo a \n7,0 encontrado no interior de folículos ovarianos a partir da fase antral inicial entre as \ncamadas das células da granulosa (EDWARDS, 1974). Essa solução é derivada do \nplasma sanguíneo e de produtos secretados pelo o ócito, células da granulosa  e da \nteca (RODGERS; IRVING-RODGERS, 2010). \nAtravés da rede de capilares tecais, o plasma sanguíneo forma um exsudato \nentre as camadas de células da granulosa, por isso a semelhança na composição do \nFF e plasma (RODGERS; IRVING-RODGERS, 2010). Com relação a componentes \nde baixo peso molecular, o FF e plasma são extremamente semelhantes, entretanto, \neles diferem com relação a proteínas de tamanho maior que 100kDa, sendo estas \nmenos concentradas no FF (GOSDEN et al., 1988). Isso acontece, pois a barreira \nhemato-folicular, localizada na lâmina basal do folíc ulo e nos capilares tecais, \nimpede a passagem de compostos maiores que 100kDa do plasma para o FF \n(SHALGI et al. , 1973; ZHOU et al. , 2007) . Essa barreira também dificulta a \npassagem de grandes moléculas produzidas p elo oócito e células da granulosa do \nFF para o sangue, estabilizando assim um potencial gradiente osmótico (RODGERS; \nIRVING-RODGERS, 2010) , que possibi lita o crescimento do folículo ovariano \nhumano até 23 mm podendo apresentar até 5 mL de FF (BÄCHLER et al., 2014). \n A composição do FF varia de acordo com o crescimento folicular e reflete \nprocessos fisiológicos e patológicos (EDWARDS, 1974) , sendo considerado um \ninstrumento para determinaç ão de biomarcadores da qualidade oocitária (REVELLI \net al., 2009; DUMESIC et al., 2015) . O FF também controla o fim da meiose \n(SIRARD; RICHARD; MAYES , 1998) , e auxilia na atração (EISENBACH, 1999) , \nmotilidade (MBIZVO; BURKMAN; ALEXANDER , 1990)  e reação acrossômica (DE \nJONGE et al., 1993) dos espermatozoides. \nAlguns estudos reportam alterações em marcadores inflamatórios  (XU et al., \n2006; FALCONER et al., 2009; LAMAITA et al., 2012; WANG et al., 2012; SINGH et \nal., 2013a; CHOI et al. , 2015; SINGH et al. , 2016; SANTANAM, ZONERAICH; \nPARTHASARATHY, 2017; WU et al. , 2017; ZHANG et al. , 2017) , hormonais \n(PELLICER et al., 1998; SMITH et al., 2002; WUNDER et al., 2005; FALCONER et \nal., 2009) e relacionados ao EO (PRIETO et al., 2012; LIU et al., 2013; SINGH et al., \n2013b; CHOI et al., 2015; DA BROI et al., 2016; DE LIMA et al., 2017; NASIRI et al., \n\n38 \n \n2017; DA BROI  et al. , 2018b) no FF de mulheres com endometriose  comparado \nàquelas mulheres sem a doença. Outros estudos comparam a composição do FF de \nmulheres com endometriose em estágios iniciais versus endometriose avançada  \n(PELLICER et al. , 1998; CUNHA-FILHO et al. , 2003;  SANTANAM, ZONERAICH; \nPARTHASARATHY, 2017; ZHANG et al., 2017). E, também há estudos avaliando o \nimpacto da presença de endometrioma na composição do FF de mulheres com \nendometrioma unilateral (OPØIEN et al., 2013; SANCHEZ; PAPALEO, et al. , 2014; \nBENAGLIA et al., 2015; NAKAGAWA et al., 2016; GIACOMINI et al., 2017).  \n \n\n39 \n \n2.3. Competência oocitária e fuso meiótico celular \n \nO fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II (MII) é uma e strutura em \nforma de barril, temporária e dinâmica, composta por microtúbulos formados por \ndímeros de tubulina que se polimerizam e despolimerizam nos diversos estágios do \nciclo celular (CHOI et al. , 2007)  e associada ao córtex oocitário e sua rede de \nmicrofilamentos subcorticais (KIM et al. , 1998; WANG; KEEFE , 2002; \nMANDELBAUM et al. , 2004) , sendo essencial para garantir a fidelidade da \nsegregação cromossômica durante a meiose (VOLARCIK et al. , 1998; VAN \nBLERKOM; DAVIS, 2001; DE SANTIS et al., 2005). Desta forma, a fecundação e o \ndesenvolvimento embrionário dependem da integridade morfológica e funcional \ndesta estrutura celular. \nAlém disso, o fuso é extremamente sensível à ação de diversos fatores (HU et \nal., 2001; EICHENLAUB-RITTER; SHEN; TINNEBERG, 2002; MULLEN et al., 2004), \nentre os quais o EO, passível de promover anomalias meióticas, instabilidade \ncromossômica, aumento da apoptose e comprometimento do desenvolvimento \nembrionário pré -implantação (LIU et al. , 2003; NAVARRO; LIU; KEEFE,  2004; \nNAVARRO et al., 2006). Estudos avaliando os potenciais mecanismos envolvidos na \ngênese das alterações do fuso celular relacionadas ao EO, evi denciaram que o \nmesmo pode danificar diversas proteínas intracelulares (STADTMAN, 1992; \nBERLETT; STADTMAN, 1997), algumas das quais, importantes para a organização \ndo fuso celular (ANTONIO et al., 2000; FUNABIKI; MURRAY, 2000; ABRIEU et al., \n2001) podendo promover lesões no DNA e induzir o inadequado alinhamento \ncromossômico (BECKMAN; AMES, 1998; LIMOLI et al., 1998). \nAs anomalias meiót icas podem, por sua vez, contribuir para a falência do \ndesenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do \noócito em completar a maturação, tornando -se incapaz de ser fertilizado, até a \nocorrência de erros que não impossibil item a fertilização, mas comprometam o \ndesenvolvimento embrionário pré e/ou pós -implantação, bem como a viabilidade \nfutura do concepto ( PAVLOK; LUCAS-HAHN; NIEMANN, 1992; LONERGAN et al., \n1994; ARMSTRONG, 2001; MIAO et al., 2018). \nUm estudo de Mansour e colaboradores  (2009) demonstrou que o fluido \nperitoneal de mulheres com endometriose pode promover anomalias nos \nmicrotúbulos e cromossomos de oócitos de camundongos, além de aumento da \n\n40 \n \napoptose embrionária  (MANSOUR et al. , 2009) . Estas anomalias foram reduzidas \napós suplementação do meio de cultivo com LC, um antioxidante, sugerindo que \nsubstâncias presentes no fluido peritoneal de portadoras desta doença promovem \ncomprometimento da qualidade oocitária e embrionária, tendo o EO como provável \nmediador (MANSOUR et al., 2009).  \nEstudos evidenciaram que o FF de pacientes com endometriose apresenta \naumento dos níveis de espécies reativas e di minuição da CAT (PRIETO et al., 2012; \nSINGH et al. , 2013b) . O aumento de  EROs no FF pode afetar a qualidade e o \ndesenvolvimento embrionário (DAS et al., 2006; YALÇINKAYA et al., 2013). Estudos \nde nosso grupo mostraram que o FF de mulheres inférteis com endometriose leve \ncompromete expressivamente o fuso meiótico de oócitos bovinos maturados in vitro, \nmesmo na menor concentração testada (1%) (DA BROI et al., 2014; GIORGI et al., \n2016); sendo o EO um fator envolvido , visto que a adição de antioxidantes \npreveniram esses danos, ao menos parcialmente (GIORGI et al., 2016). \n\n41 \n \n \n2.4. β-oxidação e qualidade oocitária \n \nQualidade oocitária pode ser definida como a competência do oócito retomar \na meiose (quebra da vesícula germinativa) atingindo o estágio de MII, acumular \nácidos ribonucleicos (RNAs), proteínas, lipídios e reorganizar as or ganelas de seu \ncitoplasma, ou seja, ter condições para ser fertilizado por um espermatozoide e ter \nrecursos suficientes para prover o desenvolvimento embrionário até a implantação. \nDurante a maturação oocitária, o oócito cresce e gradualmente adquire \ncompetência de ser fertilizado e de se desenvolver em um embrião e, \nsubsequentemente, um feto (DUNNING et al. , 2010) . Qualidade oocitária e \ncompetência de desenvolvimento estão intimamente associadas com metabolismo e \ntaxa metabólica do complexo cumulus oócito (CCO) (BIGGERS, WHITTINGHAM, \nDONAHUE, 1967; DOWNS; HUNZICKER -DUNN, 1995; SUGIURA; PENDOLA; \nEPPIG, 2005; PREIS; SEIDEL; GARDNER, 2007; THOMPSON; LANE; GILCHRIST, \n2007). Lipídios são potenciais recursos de ATP através da ꞵ -oxidação de ácidos \ngraxos nas mitocôndrias (DUNNING et al., 2010), sendo que a oxidação de um ácido \npalmítico (C16H32O2) gera 106 ATP s e de uma glicose  (C6H12O6) gera, \naproximadamente, 30 ATPs ( DUNNING; RUSSEL; ROBKER, et al., 2014). \nNo FF, os ácidos grax os podem estar livres (ligados ou não a  proteínas) \nou estarem no interior de lipoproteínas. Dessa forma, os ácidos graxos presentes no \nFF podem entrar no CCO de duas formas: I -) podem atravessar diretamente a \nbicamada lipídica; ou II-) podem ser carreados por uma proteína transportadora que \nativa receptores específicos  na membrana plasmática permitindo a entrada no \ninterior da célula (células da granulosa e/ou oócito)  (DUNNING; RUSSEL; ROBKER, \net al., 2014).  \nAlém das fontes extracelulares, ácidos graxos na forma de triacilglicerol \npodem ser armazenados em membranas celulares e no interior das células do \ncumulus e oócitos em gotas lipídicas no citosol  ( DUNNING; RUSSEL; ROBKER  et \nal., 2014) . Essas gotas lipídicas são circundad as por uma monocamada de \nfosfolipídios coberta por uma capa de proteínas da família perilipina (que regula o \ntamanho das gotas e que limita a ação de lipases) permitindo a atividade lipolítica \nmediante condições metabólicas e hormonais ( DUNNING; RUSSEL; ROBKER  et \nal., 2014).  \n\n42 \n \nA primeira etapa para ocorrer a ꞵ -oxidação é a entrada de ácidos graxos \nna matriz mitocondrial  (local onde se encontram as enzimas específicas  para essa \nvia metabólica), entretanto, ácidos graxos de cadeia longa presentes no citosol não \nconseguem atravessar a membrana mitocondrial  (SCHULZ, 1991). Portanto, esses \ncompostos são ativados pela enzima acil -Coenzima A(CoA) sintetase, gerando acil -\nCoA (FRITZ; MARQUIS, 1965; SCHULZ, 1991; EVANS; FORNASINI, 2003). Então, \nacil-carnitina é formada a partir da transesterificação d e acil-CoA e pela enzima \ncarnitina palmitoil transferase I (CPT1) presente na membrana exter na da \nmitocôndria  (FRITZ; MARQUIS, 1965; SCHULZ, 1991; EVANS; FORNASINI, 2003). \nA enzima acil-carnitina translocase age transferindo o complexo acil -carnitina para a \nenzima carnitina palmitoil transferase II (CPT2) , presente na membrana interna da \nmitocôndria, que então regenera a carnitina e acil -CoA  (FRITZ; MARQUIS , 1965; \nSCHULZ, 1991; EVANS; FORNASINI , 2003) . A acil -Coa entra na β -oxidação \ngerando ATP   (FRITZ; MARQUIS , 1965; SCHULZ, 1991; EVANS; FORNASINI, \n2003). A Figura 1 ilustra o processo de β-oxidação mitocondrial. \n \nFigura 1: β-oxidação mitocondrial de ácidos graxos e sua regulação \n \nO transporte de ácidos graxos de cadeia longa (acil -CoA) para a matriz mitocondrial é catalisada \npela CPT1, que requer a presença de carnitina para formar acil -carnitina. Dentro da mitocôndria, a \nCPT2 restaura a acil -CoA que entra na β -oxidação gerando acetil -CoA que, por sua vez, gera ATP \natravés do TCA e da cadeia transportadora de elétrons. Nota: ADP: Adenosina Difosfato, ATP: \nAdenosina Trifosfato; CPT1: Carnitina Palmitoil Transferase I; CPT2: Carnitina Palmitoil Tr ansferase \nII; CoA: Coenzima A; TCA: Ciclo do Ácido Tricarboxílico .. Iimagem adaptada de (DUNNING; \nROBKER, 2012). \n \n \n\n43 \n \nDunning e colaboradores (2010) avaliaram a ꞵ-oxidação em CCOs através \nda quantificação de 3H2O no meio de cultivo in vitro gerado a partir da oxidação de  \n[3H]palmitato e pela expressão de mRNA Cptb1 durante a maturação oocitária e \ndesenvolvimento embrionár io in vivo  utilizando modelo murino (DUNNING et al. , \n2010). O estudo mostrou que a expressão de Cptb1 aumenta seguindo a \nadministração de gonadotrofina coriônica humana ( hCG), que induz a maturação \noocitária e a ovulação, e os níveis de 3H2O também aumentam em CCOs maturados \nin vitro  comparados àqueles imaturos (DUNNING et al. , 2010) . A importância do \nmetabolismo de lipídios para a competência oocitária e o desenvolvimento \nembrionário foi demonstrada pela taxa de desenvolvimento embrionário in vitro  \nutilizando um inibidor (etomoxir - inibe CPT1) ou um ativador (L C) da ꞵ -oxidação \n(DUNNING et al., 2010). O etomoxir prejudicou o desenvolvimento de blastocistos e \na LC ativou a ꞵ-oxidação e melhorou a taxa de formação de blastocistos (DUNNING \net al., 2010). \n \n \n\n44 \n \n2.5. L-carnitina \n \nA carnitina é uma amina quaternária (3 -hidroxi-4-N-trimetilamino-butanoato) \ncuja fórmula molecular é C 7H15NO3 e peso molecular 161,199 g/mol  (Figura 2) . A \nsíntese de carnitina no organismo ocorre a partir de dois aminoácidos essenciais, a \nlisina e a metionina, sendo indispensável a presença de ferro, ácido ascórbico, \nniacina e vitamina B6 (EVANS; FORNASINI, 2003), e LC também pode ser obtida a \npartir da alimentação, principalmente, através de carnes vermelhas.  \n \nFigura 2: Estrutura química da molécula de L -carnitina (nome IUPAC: 3 -Hidroxi-4-\ntrimetilamonio-butanoato; fórmula molecular: C7H15NO3; massa molar: 161,199 g/mol). \n \n \nO oócito e as células do cumulus não expressam enzimas relacionadas a \ntodas as etapas da  síntese de L C, entretanto, expressam tod o o maquinário \nenzimático necessário para a β -oxidação (MONTJEAN et al. , 2012) . Por ser uma \nmolécula hidrossolúvel, a  LC presente no FF ou adi cionada ao meio de MIV  deve \nentrar nas células do cumulus e oócitos através dos transportadores catiônicos \norgânicos (OCTN  – em inglês  Organic Cation Transporters ), localizados na \nsuperfície da membrana plasmática (TAMAI et al., 1998). \nComo antioxidante, a L C diminui os níveis de produtos da peroxidação \nlipídica e peróxido de hidrogênio (H 2O2) (YAZAKI et al., 2013). A suplementação oral \ncom LC diminui os níveis de MDA, aumenta a atividade sérica das enzimas catalase, \nSOD e glutationa peroxidase em pacientes com doença arterial coronariana (LEE et \nal., 2014). \n\n45 \n \nDevido a sua função no metabolismo energético e sua propriedade \nantioxidante, a LC também tem sido utilizada durante a MIV oocitária. Em modelo \nexperimental suíno, LC aumentou a taxa de formação de blastocistos após ativação \npartenogenética (AP), diminuiu apoptose em blastocistos, diminuiu níveis de EROs \nnos oócitos e aumentou os níveis de  glutationa reduzida (GSH) oocitário (WU et al., \n2011). Em outro estudo, também utilizando modelo suíno, a LC aumentou a taxa de \nmaturação nuclear oocitária, aumentou a taxa de clivagem, assim  como aumentou a \ndensidade mitocondrial oocitária e diminuiu os níveis de EROs (SOMFAI et al. , \n2011). Em modelo bovino, a LC aumentou a taxa de maturação nuclear oocitária e \naumentou a taxa de formação de blastocist os (CHANKITISAKUL et al. , 2013; \nPHONGNIMITR et al. , 2013) . E em  modelo murino, a LC aumentou a taxa de \nmaturação nuclear oocitária e melhorou a atividade e distribuição mitocondrial de \noócitos (MOAWAD et al., 2014). \nMansour e colaboradores  (2009) avali aram o efeito de L C em prevenir \ndanos ao fuso celular de oócitos murinos em contato com fluido peritoneal de \nmulheres com endometriose. Este estudo mostrou que a L C foi capaz de prevenir os \ndanos meióticos oocitários, além de diminuir apoptose embrionária  (MANSOUR et \nal., 2009). \n\n46 \n \n2.6. Ácidos graxos ômega-3 \n \nÁcidos graxos são compostos orgânicos do tipo ácido carboxílico que podem \nser classificados de acordo com sua estrutura molecular em saturados , \nmonoinsaturados e poli-insaturados (PUFAs) e de acordo com a possibilidade de ser \nou não sintet izado no organismo em , respectivamente,  não-essencial e essencial \n(TVRZICKA et al. , 2011) . Ácidos graxos são geralmente apresentados como  uma \nfórmula esquemática (C:p n -x) que indica o número de carbonos (C), o número de \ninsaturações (p) e a posição da primeira insaturação a partir do grupo metila terminal \n(x). Como exemplo, neste trabalho, utilizamos o ácido eicosapentaenóico (EPA, 20:5 \nn-3) e o ácido docosahexaenóico (DHA, 22:6 n-3). \nOs PUFAs são categorizados em: ômegas-3, ômegas-6 e ômegas-9. PUFAs \nsão essenciais para garantir uma adequada fluidez de membranas celulares  \n(TVRZICKA et al. , 2011) . A s duplas ligações entre carbonos, em condições \nfisiológicas, preferencialmente, apresentam -se na configuração cis, ou seja, os dois \nhidrogênios da ligação covalente posicionam -se do mesmo lado, causando uma \ndeflexão de 30º na molécula, o que a faz ocupar um maior espaço, diminuindo as \nforças de van der Waals  e influenciando a fluidez e funcionamento das membranas \nbiológicas (TVRZICKA et al., 2011). \nIntracelularmente, os ácidos graxos armazenados em fosfolipídios de \nmembrana podem ser liberados com a ativação da enzima fosfolipase A2 mediada \npor proteínas quinase C dependentes de Ca2+. O PUFA liberado do fosfolipídio pode \nser metabolizado a eicosanóides ou docosanóides ou pode mediar reações , como \npor exemplo, estimular a expressão do maquinário oxidativo mitocondrial e promover \na β-oxidação (FLACHS et al., 2005). \nEPA [nome IUPAC: Ácido (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z) -eicosa- 5,8,11,14,17-\npentenóico; fórmula molecular:C 20H30O2; massa molar: 302,451 g/mol] e o DHA \n[nome IUPAC: Ácido (4Z ,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoico; \nfórmula molecular: C 22H32O2; massa molar: 328,488 g/mol] são representantes dos \nPUFAs ômega-3 (Figura 3). Nos mamíferos, a partir da ação de enzimas elongases \ne dessaturases é possível sintetizar EPA e DHA a partir de seu  precursor ácido α-\nlinolênico (ALA, 18:3 n -3) encontrado, principalmente, em sementes e folhas de \nalgumas plantas (soja, linhaça, etc) e em seus óleos (TVRZICKA et al. , 2011) . \nEntretanto, a s enzimas necessária para a síntese de PUFAs ômega -3 são as \n\n47 \n \nmesmas necessárias para a síntese de PUFAs  ômega-6, sendo um processo \nbastante limitado, a conversão de ALA a EPA e DHA (WATHES; ABAYASEKARA; \nAITKEN, 2007). \n \nFigura 3: Estrutura química das moléculas de ácido s graxos ômega -3: A -) Ácido \neicosapentaenoico (EPA) e B-) Ácido docosahexaenóico (DHA) \n \n \nOs PUFAs ômega-6 são sintetizados a partir do ácido linoleico (AL, 18:2 n-6). \nAL é con vertido em ácido γ -linolênico (GLA, 18:3, n -6) pela ação da enzima Δ -6-\ndessaturase e GLA é elongado para formar ácido di -homo-γ-linolênico (DGLA, 20:3, \nn-6). DGLA pode também ser convertido a ácido araquidônico ( AA, 20:4, n-6) pela \nação da enzima Δ -5-dessaturase (Figura 4) . AA é o precursor da série 2 de \nprostaglandinas ( PGs) e a série 4 de leucotrienos (LTs) , que apresentam alto \npotencial inflamatório (Figura 5).   \nE a síntese de ômega -3 segue a seguinte via: ALA é convertido em ácido \nestearidônico (SDA, 1 8:4 n -3) pela enzima Δ -6-dessaturase, que sofre a ação de \nelongase convertendo-se em ácido eiscosatetraenóico (ETA, 20:4 n -3) que é, então, \nconvertido a EPA pela enzima Δ -5-dessaturase (Figura 4). EPA é precursor da série \n3 de PGs , série 5 de LTs  e série 5  de resolvinas, que apresentam baixo potencial \ninflamatório e ação anti-inflamatória (Figura 5). \nA via de conversão de EPA a DHA (22:6 n ‐3) envolve a adição de dois \ncarbonos ao EPA para formar ácido docosapentaenóico (DPA, 22:5 n ‐3), adição de \nmais dois carbonos para produzir ácido tetracosapentaenóico (TPA, 24:5 n ‐3) que é \n\n\n48 \n \nentão convertido a  ácido tetracosahexaenóico (THA, 24:6 n ‐3) pela Δ -6-\ndessaturase, o THA é transportado para os peroxissomos onde dois carbonos são \nremovidos na β ‐oxidação para formar D HA (Figura 4) . DHA é precursor de \ndocosanóides anti-inflamatórios tais como resolvinas e protectinas (Figura 5). \n \nFigura 4: Vias metabólicas de síntese de ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 \n \n \nFigura 5: Síntes e e ações de mediadores lipídicos produzidos a partir dos ácidos \naraquidônico (AA), eicosapentaenoico (EPA) e docosahexaenóico (DHA).  \n \nNota: COX: ciclooxigenase; LOX: lipoxigenase; LT: leucotrieno; PG: prostaglandina.  \n \n \n\n\n49 \n \nEstudos utilizando modelos exper imentais de indução cirúrgica de \nendometriose, mostraram efeitos benéficos da suplementação da dieta com ácidos \ngraxos ômega -3 sobre a redução  do tamanho de lesões de endometriose e \ndiminuição da produção local de mediadores inflamatórios em ratos (NETSU et al., \n2008; AKYOL et al. , 2016)  e em coelho (ATTAMAN et al. , 2014) . Estudo in vitro  \nreportou que ácidos graxos ômega-3 suprimem o crescimento e a sobrevivência in \nvitro de células endometriais de mulheres com e sem endometriose (GAZVANI et al., \n2001). Hopeman e colaboradores (2015) avaliaram a relação entre níveis circulantes \nde PUFAs em mulheres com e sem endometriose e reportaram que mulheres com \naltos níveis séricos de EPA tinham um risco 82% menor em ter endometriose \ncomparado a mulheres com níveis baixos de EPA (HOPEMAN et al., 2015). \nOseikria e colaboradores  (2016) avaliaram a adição de diversas \nconcentrações de DHA durante a MIV de oócitos bovinos sobre qualidade e \ncompetência oocitária. Os autores observaram que nas concentrações testadas (0, \n1, 10 e 100 uM), DHA não teve efeito sobre a viabilidade oocitária e taxa de \nmaturação (OSEIKRIA et al., 2016). A concentração de 1uM de DHA durante a MIV \npromoveu uma maior taxa de clivagem e de formação de blastocisto após AP \ncomparada com o grupo controle (OSEIKRIA et al., 2016). A concentração de 10 uM \nnão teve efeito sobre ess as taxas, e a concentração de 100 uM diminuiu \nsignificativamente a clivagem (OSEIKRIA et al., 2016). \nE Nikoloff e colaboradores  (2017) avaliaram a adição de diversas \nconcentrações de EPA durante a MIV de oócitos bovinos sobre a taxa de maturação, \ngenotoxicidade e citotoxicidade. A taxa de maturação não foi alterada pela adição de \n1 nM e de 1 uM de DHA, entretanto, 1 mM significativamente diminuiu a taxa de \nmaturação comparado ao grupo controle  (NIKOLOFF et al. , 2017) . 1 nM de DHA \naumentou a expansão das células do cumulus após MIV co mparado ao controle  \n(NIKOLOFF et al., 2017). Entretanto, 1 nM de DHA aumentou a frequência de danos \nao DNA em células do cumulus (eletroforese em gel de célula única) comparado ao \ncontrole, 1 uM aumentou a taxa de apoptose em células do cumulus (Anexina V) \ncomparado ao grupo controle e 1 mM diminuiu a viabilidade celular ( Tripan blue ), \naumentou apoptose e diminuiu atividade mitocondrial (teste do MTT) de células do \ncumulus comparado ao controle (NIKOLOFF et al., 2017). \n\n50 \n \n \n \n3. OBJETIVOS \n\n51 \n \n3.1. Objetivo geral:  \n \nAvaliar o impacto da adição de FF de mulheres inférteis com e sem \nendometriose e a suplementação com L C e ácidos graxos ômega-3 ao meio de MIV \nsobre a maturação nuclear e as taxas de normalidade meiótica de oócitos bovinos. \n \n3.2. Objetivos específicos: \n \n1. Comparar o impacto do FF de mulheres inférteis com endometriose em \nestágios iniciais (EI/II) e avançados [sem endometrioma (EIII/IV) e com \nendometrioma (Eendometrioma)] ao do FF de mulher es sem endometriose \n(FFControle) adicionados ao meio de maturação in vitro (MIV) sobre a maturação \nnuclear e as taxas de normalidade meiótica de oócitos bovinos  avaliados por \nmicroscopia confocal.  \n2. Avaliar se a LC e os ácidos graxos ômega -3 (DHA e EPA)  são capazes de \nprevenir os danos meióticos em oócitos bovinos induzidos por FF de mulheres \ninférteis com endometriose em estágios iniciais (I/II) e avançados (III/IV) durante \na maturação in vitro (MIV). \n\n52 \n \n \n \n4. MATERIAIS E MÉTODOS \n \n\n53 \n \nRealizamos um estudo experimental previamente aprovado pelo Comitê de \nÉtica em Pesquisa do Hospital das Clí nicas (HC) da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP) (Processo HCRP nº \n12201/2008) e pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da FMRP - USP \n(nº 169/2008). Optamos pelo uso de modelo experimental bovino, em vi rtude da \nsimilaridade no tamanho e morfologia ovarianos de humano e bovino, por ambas as \nespécies serem monovulatórias e policíclicas e por ser um material abundante, de \nbaixo custo, de fácil manipulação (MALHI; ADAM S; SINGH , 2005; SANTOS; \nSCHOEVERS; ROELEN, 2014). \n  \n4.1. Seleção de pacientes doadoras de fluido folicular \n \nComo doadoras de FF, foram elegíveis todas as pacientes submetidas à \nestimulação ovariana controlada (EOC)  para a realização de injeção \nintracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) junto ao Setor de Reprodução Humana \ndo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP -USP, no período de Março \na Outubro de 2013 e Maio/2016 a Setembro/2017.  Todas as pacientes elegíveis que \nnão apresentaram cancelamento ini cial do ciclo de EOC e que completaram os \ncritérios de inclusão (abaixo) foram convidadas a participar da pesquisa. \n \n4.1.1. Critérios de inclusão  \n \n• Idade < 40 anos; \n• Índice de massa corpórea (IMC) < 30 kg/m²; \n• Concentração sérica do hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro dia do \nciclo menstrual < 15 mUI/mL; \n• Ausência de anovulação crônica;  \n• Ausência de hidrossalpinge; \n• Ausência de  doenças crônicas (tais como diabetes melitus, hipertensão \narterial), doença cardiovascular, dislipidemia, lúpus eritematoso  sistêmico ou \nqualquer outra doença reumatológica; \n• Ausência de endocrinopatias descompensadas e não tratadas;  \n• Ausência de infecção por vírus da imunodeficiência humana ( HIV) ou \nqualquer infecção ativa;  \n\n54 \n \n• Não ser tabagista e etilista; \n• Não ter usado medicações hormonais ou anti-inflamatórios hormonais ou não \nhormonais durante os 6 meses subsequentes à inclusão neste estudo.  \n• Exame de videolaparoscopia prévio. \nO grupo controle foi composto por mulheres inférteis devido a fatores tubários \ne/ou cujo cônjuge apresentava infertilidade (fator masculino), sendo que todas as \npacientes foram submetidas pr eviamente ao exame de videolaparoscopia para \ninspeção da cavidade pélvica/abdominal e exclusão de endometriose.  \nO grupo endometriose foi subdividido em endometriose em estági os iniciais \n(mínima ou leve, EI/II), endometriose avançada (moderada ou grave , III/IV ) sem a \npresença de endometrioma no ciclo (EIII/IV) e endometriose avançada com \nendometrioma no ciclo (Eendometrioma). O exame de videolaparoscopia prévio foi \nrealizado pa ra diagnóstico e classificação da endometriose de acordo com os \ncritérios da ASRM  (ASRM, 1997) . As mulheres do grupo Eendometrioma \napresentaram endometrioma no ciclo de EOC visualizado por ultrassonografia \ntransvaginal. \n O recrutamento de pacientes foi realizado em duas etapas: primeiramente, os \nprontuários foram analisados para avaliação de elegibilidade, verificação de exames \ne condição clínica da paciente, posteriormente, as pacientes foram brevemente \nentrevistadas para exclusão de qualquer dúvida com relação ao seu estado de \nsaúde e estilo de vida. \n \n4.2. Captação oocit ária, coleta e processamento  de amostras de fluido \nfolicular \n \nAmostras de FF foram obtidas durante a captação oocitária para realização \nde ICSI. Para evitar possível interferência de sucessivas punções ovarianas , FF foi \nobtido apenas do primeiro folículo ( diâmetro ≥ 15 mm) do primeiro ovário \npuncionado.  \nEssas amostras foram imediatamente levadas ao laboratório  de embriologia, \nonde as embriologistas checaram a presença de oócito e/ou células da granulosa. \nOs oócitos foram separados do FF para utilização dur ante a s TRA e o FF foi \ncentrifugado a 300 g por 10 minutos, aliquotado e armazenado a -80ºC. \n\n55 \n \n As amostras que não continham  oócito e/ou células da granulosa foram \nexcluídas, visto que, nesses casos, não seria possível afirmar que o folículo ovariano \npuncionado apresentava um oócito em processo de maturação.  \nFF de uma paciente de cada grupo (grupo controle, grupo endometriose em \nestágios iniciais, grupo endometriose em estágios avançados sem endometrioma e \ngrupo endometriose em estágios avançados com endome trioma) fo i utilizado \nindividualmente em apenas em um experimento. \n \n4.3. Estimulação ovariana controlada \n \nNo Setor de Reprodução Humana do HC -FMRP, todas as pacientes \nrealizaram um exame de ultrassonografia transvaginal prévio ao início da EOC (pré -\nbasal), quan do a nticoncepcional oral combinado (ACO) (Miranova®, Bayer ou \nLevel®, Biolab) foi prescrito com o objetivo de sincronizar e programar o início da \nEOC.  \nPortanto, ACO foi iniciado no período menstrual do ciclo precedente à EOC e \nutilizado diariamente até ci nco dias antes da data prevista para o início da EOC .e \nrealização do ultrassom transvaginal basal.  \nDe acordo com as caracterí sticas de cada paciente, dois protocolos de EOC \ndistintos foram aplicados como descrito a seguir: \n- Protocolo antagonista flexível: gonadotrofinas (150-300 UI/dia) foram administradas \nnos primeiros seis dias de EOC, com a dose diária ajustada de acordo com o \ncrescimento folicular. Antagonistas do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH -\nganirelix ou cetrorelix 0,25 mg/dia) foram i niciados no dia em que a média do \ndiâmetro do maior folículo foi ≥ 14 mm. \n- Protocolo de estimulação mínima (citrato de clomifeno mais gonadotrofinas e \nantagonista de GnRH): citrato de clomifeno (100 mg/dia) foi administrado durante os \nprimeiros cinco dias  de EOC e as gonadotrofinas (150 UI/dia) foram administradas \nnos dias dois e quatro, e diariamente a partir do dia seis. O antagonista de GnRH \n(ganirelix ou cetrorelix 0,25 mg/dia) foi iniciado no dia em que o diâmetro médio do \nmaior folículo foi ≥ 14 mm. \nO hCG recombinante (250 μg, Ovidrel®, Serono, Brasil) ou hCG urinário \n(10,000 IU, Choriomon®, Meizler, Brasil) foi administrado quando pelo menos um \n\n56 \n \nfolículo com 18 mm de diâmetro médio estava presente. Os oócitos foram captados \n34 a 36 horas após a administração do hCG recombinante, e a fase lútea foi mantida \npela administração da progesterona micronizada (600 mg/dia). \n \n4.4. Coleta de ovários bovinos, recuperação e classificação dos complexos \ncumulus-oócito \n \nOs ovários bovinos foram coletados no frigorífico Bar ra Mansa S.A, localizado \nno muncípio de Sertãozinho – SP (há 20 Km de Ribeirão Preto) e transportados em \nrecipiente térmico contendo solução salina (NaCl a 0,9%) a 35-38,5ºC.  \nNo laboratório, os ovários foram borrifados com álcool 70% e lavados e \nmantidos em solução salina contendo sulfato de estreptomicina (5 µg/mL) em banho-\nmaria a 38,5º. Utilizando uma seringa de 10 mL e agulha de 22G, os folículos \novarianos com tamanho entre 2 - 8 mm foram aspirados, e o conteúdo depositado \nem cálice cônico estéril manti do a 38,5ºC. Após o término da aspiração folicular, o \nconteúdo aspirado permaneceu 10 minutos em repouso para deposição dos CCOs. \nEntão, o cálice contendo os CCOs foram levados à cabine de  fluxo laminar \npara serem observados em lupa e classificados de acor do com suas características \nmorfológicas. Apenas os CCOs com citoplasma homogêneo, circundado por três ou \nmais camadas compactas de células do cumulus, mesmo que parcialmente, foram \nselecionados (ADONA; LIMA VERDE LEAL, 2004; FERREIRA et al., 2009a).  \n4.5. Maturação in vitro \n \nOs CCOs selecionados foram lavados e manipulados em meio TCM 199 com \n25 mM de HEPES [ ácido N -(2-hidroxietilo)-piperazina-N'-2-etanesulfónico], L -\nglutamina e sais de Hank (Life Technologies GIBCO® 12350-039) suplementado com \n20 µg/mL de piruvato de sódio, 10 µg/mL de gentamicina e 5% de soro bovino fetal \ninativado (SBF - GIBCO 10270-098) (meio de bancada).  \nEntão, após a seleção morfológica, CCOs foram lavados em meio TCM 199 \ncom 25 mM de HEPES, 2,2 g/L de bicarbonato de sódio, L-glutamina e sais de Earle \n(Life Technologies GIBCO® 12340-030) suplementado com 50 µg/mL de piruvato de \nsódio, 50 µg/mL de gentamicina, 1 µg/mL de estradiol, 20 µg/mL de FSH, 10% de \n\n57 \n \nsoro bovino fetal (SBF)  e 2,5 UI/mL de hCG (C horulon®) (meio de MIV)  e foram \nseparados aleatoriamente em 9 grupos experimentais (conforme abaixo): \n1-) sem-FF: sem adição de FF ou LC ou ácidos graxos ômega 3; \n2-) FFControle: com 1% de FF de paciente controle; \n3-) FFControle+LC+n3: com 1% de FF de paci ente controle + 0,6mg/mL de LC + 0,4 \nnM de DHA + 0,6 nM de EPA; \n4-) FFEI/II: com 1% de FF de pacientes EI/II; \n5-) FFEI/II+LC+n3: com 1% de FF de paciente EI/II + 0,6mg/mL de LC + 0,4 nM de  \nDHA + 0,6 nM de EPA; \n6-) FFEIII/IV: com 1% de FF de pacientes com EIII/IV sem endometrioma; \n7-) FFEIII/IV+ LC+n3: com 1% de FF de paciente EIII/IV sem endometrioma + \n0,6mg/mL de LC + 0,4 nM de DHA + 0,6 nM de EPA; \n8-) FFEndometrioma: com 1% de FF de paciente EIII/IV com endometrioma; \n9-) FFEndometrioma+LC+n3: com 1% de FF de paciente EIII/IV com endometrioma \n+ 0,6mg/mL de LC + 0,4 nM de DHA + 0,6 nM de EPA; \n Após 22 -24 horas de MIV, as células do cumulus foram separadas dos \noócitos através de turbilhamento (pipetagem repetitiva) em meio de bancada em \nplacas de vidro escavad as. Os oócitos desnudos foram fixados e mantidos por 30 \nminutos a 38,5ºC em um tampão para estabilização de microtúbulos contendo 0,1 M \nde Pipes, 5 nM de MgCl2.6H2O, 2,5 nM de EGTA, 0,01% aprotinina, 1 nM DTT, 1 μM \nde Taxol, 0,5% Triton -X e 2% de formaldeí do a 37%. O pool de oócito s de cada \ngrupo foi armazenado em tubos de fundo cônico de 600 μL contendo 100 μL de \nsolução fixadora em geladeira até a realização dos experimentos de \nimunofluorescência. \nVisto que, durante a MIV oocitária, de acordo com cada gru po de tratamento, \nfoi realizada a adição de FF, de LC e de ácidos graxos ômega -3 (DHA e EPA), \noptamos por concentrar o meio supracitado (meio de MIV) em 4%. O meio \n\n58 \n \nconcentrado 4% foi diluído até uma concentração normal naqueles grupos com \nadição de FF, LC e ácidos graxos ( FFControle+LC+n3, FFEI/II +LC+n3, \nFFEIII/IV+LC+n3 e FFEndometrioma+LC+n3), já nos demais grupos, a concentração \nfoi normalizada adicionando-se meio TCM 199  (Life Technologies GIBCO® 12340 -\n030) puro filtrado; e assim conseguimos um ajuste da s substâncias adicionadas \nindispensável ao processo de MIV. Os CCOs foram cultivados em gotas de 400 µL \n(aproximadamente, 20 oócitos por gota), a 38,5ºC, 95% de umidade, 5% de CO 2 \ndurante 22-24h, em placas NUNC® em um sistema de cultivo sem óleo mineral. \nDurante as MIVs , optamos por utilizar uma concentração de 1% de FF visto \nque estudo prévio do grupo (DA BROI  et al. , 2014)  testou a adição de quatro \ndiferentes concentrações de FF de mulheres inférteis com endometriose leve ( 1%, \n5%, 10% e  15%) ao meio MIV e não reportou  efeito dose -dependente. Assim, no \npresente estudo, optamos por utilizar a menor concentração de FF testada (1%).  \n \n4.6. Preparo das soluções de L-carnitina e dos ácidos graxos ômega-3 \n \n4.6.1. L-carnitina: \n \nA concentração de LC ( Sigma Aldrich C0283) utilizada para suplementar os \nexperimentos de MIV conforme será descrito a seguir foi de 0,6 mg/mL (MANSOUR \net al., 2009; GIORGI et al., 2016). \nA solução estoque foi preparada em uma concentração 100 vezes maior que \na solução trabalho (solução estoque: 60 mg/mL de LC) com água de injeção, filtrada \nem filtro de poros de 0,22 μm, aliquotada e armazenada a -20ºC. \n  \n4.6.2. Ácidos graxos ômega 3 \n \nA concentração final de ácidos graxos ômega 3 utilizada para suplemen tar os \nexperimentos de MIV conforme descritos a seguir foi de 1 nM  (NIKOLOFF et al. , \n2017). Sendo que 0,4 nM foi DHA ( Sigma Aldrich  D2534) e 0,6 nM EPA ( Sigma \nAldrich E2011). A proporção de 2:3 DHA /EPA foi escolhida baseando-se na \ncomposição de suplementos comerciais a base de óleo de peixe (Omega-3 das \n\n59 \n \nmarcas Essential®; Sidney Oliveira ®; Equaliv®; Country Life®; Solgar®; \nCatarienense®) e em suplementos utilizados em ensaios clínicos randomizados [180 \nmg de EPA e 120 mg de DHA para mulheres com síndrome dos  ovários policísticos \nque desejavam realizar TRA (NADJARZADEH et al., 2015), 1200mg de EPA e 800 \nmg de DHA para mulheres obesas grávidas (HAGHIAC et al., 2015), 180 mg de EPA \ne 120 mg de DHA para  jovens mulheres com dismenorreia (RAHBAR; \nASGHARZADEH; GHORBANI, 2012)]. \nAs soluções estoques dos ácidos graxos fo ram preparadas em uma \nconcentração 100 vezes maior que a s concentrações finais  (soluções estoque: 40 \nnM de DHA e 60 nM de EPA) com dimetilsulfóxido ( DMSO), filtrad as em filtro de \nporos de 0,22 μm e armazenadas a -20ºC. \n \n4.7. Imunofluorescência para visualização de microtúbulos e cromossomos \n \nOs oócitos fixados foram retirados do fundo do tubo contendo solução \nfixadora e foram lavados 2 vezes em meio de lavagem tampão Salina Fosfato (PBS - \nPhosphate Buffer Saline) suplementado com 0,02% NaN3, 0,01% Triton X-100, 0,2% \nleite seco sem gordura, 2% soro de cabra, 2% de albumina sérica bovina e 0,1 M de \nglicina e mantidos nessa solução de lavagem em estufa a 38ºC para bloqueio. Após \n2 horas, os oócitos foram incubados com anticorpo primário anti-β-tubulina (Sigma \nT5293) overnigth a 4-8ºC.  \nEntão, os oócitos foram novamente lavados em solução de lavagem e \nincubados com anticorpo policlonal anti -IgG de camundongo conjugado com \nisotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:500, MP BIO 0855514) a 38,5º C por 2h. Os \noócitos foram submetidos a mais uma lavagem e, então, foram marcados com \nHoechst 33342 (10 mg/mL) em meio de montagem Vectashield (H-1000, Vector, \nBurlingame, CA, EUA) sobre uma lâmina de vidro coberta por uma lamínula. As \namostras foram visualizadas utilizando um microscópio confocal de alta performance \n(Confocal Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Mannheim, Alemanha) em aumento \nóptico de 40X e os lasers Diodo 405 UV e HeNe 543. \n \n4.8. Classificação oocitária baseada na morfologia do fuso meiótico e no \nalinhamento cromossômico por microscopia confocal \n \n\n60 \n \nOs oócitos foram classificados de acordo com o estágio de maturação \nnuclear: em metáfase I (MI – presença de uma placa metafásica no interior do \noócito), telófase I (TI – presença de dois conjuntos crom ossômicos interligados por \nfuso meiótico); ou metáfase II [MII - presença de uma placa metafásica no interior do \noócito e de um corpúsculo polar (CP) entre o oócito e sua zona pelúcida]; ou como \nAP (caracterizado pela extrusão espontânea de um segundo CP s em ter ocorrido \nfertilização; ou caracterizada por telófase II) (Figura 6). \nOs oócitos em MII foram subdivididos como analisáveis e não analisáveis de \nacordo com a posição de visualização da placa metafásica. Os oócitos foram \nconsiderados analisáveis quand o o fuso meiótico podia ser visualizado em uma \nposição lateral ou sagital (microfilamentos observados em uma posição longitudinal, \nsendo possível a visualização dos dois polos do fuso meiótico) e os cromossomos \ndispostos em linha na região mediana do fuso e, considerados não analisáveis \nquando o fuso foi observado em uma posição polar (JU et al., 2005), que impede \numa visão detalhada do fuso.  \nOócitos em MII analisáveis foram classificados como “normais” quando \napresentaram fuso meiótico em forma de barril com microtúbulos organizados de um \npolo a outro, cromossomos alinhados na placa metafá sica no equador do fuso e \npresença de um CP; ou considerados como “anormais” quando apresentaram fuso \nmeiótico alterado (dimensão longitudinal reduzida, microtúbulos desorganizados ou \nausentes) e/ou configuração cromossômica alterada (dispersos ou deslocad os do \nplano da placa metafásica). \n \n \n\n61 \n \nFigura 6: Estágios de maturação nuclear de oócitos bovinos maturados in vitro e analisados \npor microscopia confocal.  A -) Metáfase I; B) Telófase I; C -) Metáfase II;  D-) Ativação \nPartenogenética(TelófaseII) \n \nNota: Em verde , marcação para fuso meiótico com anticorpo monoclonal anti -β-tubulina e anticorpo \nsecundário conjugado com FITC. Em azul, marcação para material genético com Hoechst 33342.  CP: \ncorpúsculo polar. Barra branca no canto direito inferior: escala de 10 µm. \n \n\n62 \n \nFigura 7: Posição de visualização do fuso meiótico de oócitos bovinos em metáfase II \nmaturados in vitro e visualizados por microscopia confocal. A -) Polar (fuso não analisável),  \nB-)Sagital(analisável)  \n \nNota: Em verde, marcação para fuso meiótico com anticorpo monoclonal anti -β-tubulina e anticorpo \nsecundário conjugado com FITC. Em azul, marcação para material genético com Hoechst 33342. \nBarra branca no canto direito inferior: escala de 10 µm. \n \n\n63 \n \nFigura 8: Classificação de oócitos bovinos maturados in vitro, em metáfase II analisáveis, de \nacordo com a organização do fuso meiótico e alinhamento cromossômico analisados por \nmicroscopia confocal. A -), B -) e C -) representam anormais e D -) normal . \n \nNota: A-) Fuso normal, cromossomos desalinhados; B -) Fuso inc ompleto e cromossomos alinhados; \nC-) Fuso anormal e cromossomos desalinhados e D -) Fuso normal e cromossomos alinhados (MII \nnormal). Em verde, marcação para fuso meiótico com anticorpo monoclonal anti -β-tubulina e \nanticorpo secundário conjugado com FITC. Em azul, marcação para material genético com Hoechst \n33342. Barra branca no canto direito inferior: escala de 10 µm. Seta branca indica cromossomos \ndesalinhados \n \n4.9. Obtenção da variável primária \n \nA porcentagem de MII normais foi obtida dividindo o número de MII normais \npelo número de MII analisáveis. \n\n64 \n \n  \n4.10. Obtenção das variáveis secundárias \n \n• Taxa de MI: número de MI dividido pelo número de oócitos visualizados por \nconfocal \n• Taxa de TI: número de TI dividido pel o número de oócitos visualizados por \nconfocal \n• Taxa de AP: número de AP dividido pelo número de oócitos visualizados por \nconfocal \n• Taxa de MII:  número de MII dividido pelo número de oócitos visualizados por \nconfocal \n• Taxa de MII analisáveis: número de oócitos  MII visualizados em posição \nsagital/lateral divididos pelo número total de oócitos MII \n   \n4.11. Obtenção das variáveis clínicas secundárias \n \n• Idade: foi obtida a partir da data de nascimento e data da captação oocitária \n(anos); \n• IMC: divisão do peso em kg pela altura ao quadrado em m (kg/m²); \n• FSH: níveis séricos de FSH no 3º dia do ci clo menstrual dosados por \nquimioluminescência (UI/L); \n• Tempo de infertilidade: intervalo de tempo que o casal mantém relações sexuais \nsem uso de contraceptivos (meses); \n• Tempo entre videolaparoscopia e captação oocitária: intervalo de tempo entre a \nrealização do exame de videolaparoscopia e a captação oocitária (meses); \n• Contagem de folículos antrais (CFA basal): número total de folículos ovarianos \nantrais avaliado por meio de ultrassonografia transvaginal no dia de início da EOC \n(n); \n• Espessura endometrial: medida da espessura do endométrio avaliada por meio \nde ultrassonografia transvaginal no dia de início da EOC (mm) \n• Duração da EOC: tempo decorrido do início da EOC até a administração do hCG \nrecombinante (dias); \n• Oócitos captados: número de CCOs obtidos pela punção ovariana após 34 -36 h \nda administração do hCG (n); \n\n65 \n \n• Oócitos maduros: número de oócitos MII obtidos pela punção ovariana após 34 -\n36 h da administração do hCG (n); \n \n4.12. Desenho experimental \n \nAbaixo a Figura 9 ilustra o desenho experimental realizado neste estudo. \n \nFigura 9: Desenho experimental \n \n  \n4.13. Análise estatística \n \nOs dados foram analisados usando o software RStudio versão 1.0.153, 2009 -\n2017 [R Core Team (2017). R: A language and environment for statistical computing. \nR Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-\nproject.org/]. Os resultados foram apresentados em tabelas (Tabelas 1 e 2).  \nA Tabela 1 mostra os dados clínicos referentes às pacientes doadoras de FF. \nOs dados foram apresentados como mediana e intervalos interquartis . As variáveis \nnão paramétrica s: Idade (anos), IMC (kg/m 2), FSH sérico no 3º dia do ciclo \nmenstrual (UI/mL), temp o de infertilidade (anos), tempo entre realização da \nvideolaparoscopia e captação oocitária (em meses), CFA basal (nº de folículos), \n\n66 \n \nespessura do endométrio no dia de início da EOC (mm), duração da EOC (dias), nº \nde oócitos captados e nº de oócitos MII captados foram comparados entre os grupos \nControle, EI/II, EIII/IV e Eendometrioma utilizando o teste de Kruskall Wallis  com pós \nteste de Dunn. \nA Tabela 2 mostra os dados coletados a partir da realização das MIVs e \nimunofluorescências dos oócitos bovinos. As variáveis categóricas (porcentagem de \nMI, porcentagem de TI, porcentagem de AP, porcentagem de MII, porcentagem de \nMII analisáveis, porcentagem de MII normais) foram comparadas entre os grupos \nutilizando o teste do qui-quadrado. \nPara todos os testes foi adotado um nível de significância em p< 0,05. \n \n4.14. Cálculo amostral \n \nCom base em estudos prévios de nosso grupo (DA BROI et al., 2014; GIORGI \net al., 2016) que demonstraram uma diferença na porcentagem de MII normais de \n~30% entre os grupos sem -FF e FFEI/II, e considerando um poder de teste de 80% \n(β=0,2 e α=0,05), um total de 87 oócitos em MII analisáveis por grupo seriam \nnecessários. \n\n67 \n \n \n \n5. RESULTADOS \n \n\n68 \n \nOito experimentos foram realizados, e FF de uma paciente de cada grupo \n(grupo controle, grupo endometriose em estágios iniciais, grupo endometriose em \nestágios avançados sem endometrioma e grupo endometriose em estágios \navançados com endometrioma) fo i utilizado individualmente em cada um dos \nexperimentos. \n  \n5.1. Recrutamento de pacientes doadoras de FF \n \nEntre março de 2013 e outubro de 2013, e entre maio de 2016 a setembro de \n2017, um total de 1171 prontuários foram avaliados para elegibilidade no Setor de \nReprodução Assistida do HC-FMRP. Destes prontuários, 630 foram considerados \nnão elegíveis pois o casal realiz ou outro tratamento que não ICSI (inseminação \nintrauterina, transferência de embrião congelado).  \nDos 541 casos submetidos à ICSI , 115 apresenta ram os critérios de \nelegibilidade, entretanto, 27 tiveram o ciclo de EOC cancelado devido à presença de \nfolículo dominante. Portanto, 88 mulheres foram convidadas a participar da pesquisa \ne 83 delas concordaram e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. \nDestas 83 pacientes, 12 tiv eram o ciclo de EOC cancelado devido à má resposta à \nEOC. Portanto, 71 mulheres foram submetidas ao procedimento de captação \noocitária (17 Controle, 16 EI/II, 20 EIII/IV e 18 Eendometrioma). \nDas 71 mulheres submetidas à captação oocitária, 32 apresentaram amostra \ninadequada devido à contaminaçã o por sangue à inspeção visual ou por não \napresentarem nenhum oócito em MII captado. Um total de 39 amostras (12 Controle, \n8 EI/II, 11 EIII/IV e 8 Eendometrioma) foram processadas e armazenadas a -196ºC \naté futura utilização (características das amostras d e FF utilizadas estão registradas \nno APÊNDICE A). \n \n\n69 \n \nFigura 10: Fluxograma ilustrando recrutamento, inclusão e seguimento de mulheres inférteis \ndoadoras de fluido folicular \n \n \n5.2. Dados clínicos doadoras de FF \n \nA Tabela 1 mostra os dados  clínicos das 32 pacientes com amostras de FF \nutilizadas nos 8 experimentos de MIV. Não houve diferença na idade, IMC,  níveis \nséricos de FSH , tempo entre videolaparoscopia e captação oocitária, CFA basal, \nespessura endometrial, duração da EOC, oócitos capt ados, oócitos maduros  e \nembriões clivados. Houve uma diferença entre o grupo controle e E endometrioma \ncom relação ao tempo de infertilidade (p=0,0275). \n \n \n \n \n \n \n \n\n70 \n \nTabela 1: Variáveis clínicas  e resposta à estimulação ovariana controlada das mulheres \ninférteis doadoras de fluido folicular sem endometriose (controle), com endometriose em \nestágios iniciais (EI/II) e em estágios avançados sem endometrioma (EIII/IV) e com \nendometrioma (Eendometrioma). \n  Controle  \n(n=8) \nE I/II  \n(n=8) \nE III/IV  \n(n=8) \nE \nendometrioma  \n(n=8) \n \nIdade (anos)  36 (35,5 – \n37,3) 34 (33,5 - 37) 33 (29 - 34) 34,5 (33 – \n36,3) p =0,1907 \nIMC (kg/m²) 24,6 (23,8 – \n27,9) \n21,9 (21,8 - \n27,4) \n24,8 (24,6 – \n27,3) \n21,8 (20,8 – \n25,2) p =0,3259 \nFSH (UI/L) 8,2 (7,9 – 9,7) 4,4 (4,4 – 5,3) 5,2 (3,8 – 7,8) 5,6 (4,1 - 8,4) p= 0,1890 \nTempo infertilidade \n(meses) \n114 (93 - \n135)* 84 (81 - 84) 108 (66 - 111) 48 (45 - 60)* *p=0,0275 \nTempo entre \nVLPSC e EOC \n(meses) \n57 (53,8 – \n70,5) 23 (32,8 - 75) 68 (10,3 - 79) 34 (30 – 49,5) p =0,3282 \nCFA basal (n) 8,0 (7,5- 8) 7 (7 – 9,5) 9,0 (3,8 - 11) 8,0 (3- 13) p=0,9533 \nEndométrio (mm) 3,3 (2,9 – 3,9) 7,3 (2,9 – 5,5) 4,6 (3,2 – 6,9) 4,5 (3,4 – 5,2) p=0,6850 \nDuração EOC \n(dias) 8 (8 – 9,3) 9 (9 – 10,5) 10 (9 - 10) 10 (9,5 – 11,3) p=0,2115 \nOócitos captados \n(n) 3 (2 - 4) 4 (3,8 – 5,5) 4 (3,5 - 8) 2 (1 – 4,3) p =0,1873 \nOócitos maduros \n(n) 3 (2 – 3,3) 4 (3,8 – 5,5) 4 (3,5 – 7,5) 2 (1 – 4,3) p =0,2084 \nNota: As variáveis são reportadas como mediana e intervalos  interquartis. IMC: índice de massa \ncorpórea; FSH: hormônio folículo esti mulante; CFA basal: contagem de folículos antrais; EOC: \nestimulação ovariana controlada ; VLPSC: videolaparoscopia . Grupos comparados por meio  do \nteste de Kruskall Wallis com pós teste de Dunn (p<0,05). \n \n5.3. Maturação in vitro e microscopia confocal \n \nPara os 8  experimentos de MIV realizados entre novembro/2017 e \njaneiro/2018, um total de 240 ovários bovinos foram aspirados, e um total de 1686 \nCCOs imaturos foram submetidos à MIV. Após a MIV, um total de 1561 oócitos  \ndesnudados foram fixados para realização de i munofluorescência e 1401 oócitos \n\n71 \n \nforam visualizados por microscopia confocal (167 oócitos estavam em MI, 25 em TI, \n1188 em MII e 21 sofreram AP). Dos 1188 oócitos em MII, 735 foram considerados \nanalisáveis (isto é, visualizados em uma posição sagital ou la teral) e 453 foram \nconsiderados não analisáveis (visão polar).  \nNão houv e diferença na taxa de  TI (p=0,05467), AP  (p=0,8854) e MII \nanalisáveis (p=0,5651) entre os nove grupos experimentais (Tabela 1). \nA taxa de oócitos em MI foi de 6,0% no grupo sem -FF, sendo semelhante a  \ndos grupos FFControle (6,1%, p=1), FFControle+ LC+n3 (11,7%, p=0,1247), FF EI/II \n(12,7%, p=0,07406), FF EI/II+LC+n3 (9,8%, p=0,3085), FF EIII/IV+LC+n3 (7,7%, \np=0,7314) e FFEndometrioma+LC+n3 (11,1%, p=0,166). A taxa de MI foi menor nos \ngrupos sem-FF e FFControle quando comparad a a dos grupos FFEIII/IV (16,9%; vs \nsem-FF: p= 0,00504; vs FFC: p=0,00537) e FFEndometrioma (24,7%; vs sem -FF: \np<0,0001; vs FFC: p<0,0001). A adição de LC e ômega -3 não alterou a taxa de MI \nnos grupos FFControle (6,1% vs 11,7%, p=0,1292) e FF EI/II (12,7% vs 9,8%, \np=0,5288), mas reduziu a taxa de MI nos grupos FFEIII/IV ( FFEIII/IV+LC+n3: 7,7% \nvs 16,9%, p=0,0259)  e FFEendometrioma ( FFEendometrioma+LC+n3: 11,1% vs \n24,7%, p=0,0028). \nA taxa de MII foi de 91,9% no grupo sem -FF, sendo semelhante aos grupos \nFFControle (89,2%, p=0,5389), FFControle+ LC+n3 (89,2%, p=0,06992), FF EI/II \n(85,4%, p=0,1069), FF EI/II+LC+n3 (85,3%, p=0,09598), FF EIII/IV+LC+n3 (90,8%, \np=0,8999) e FFEndometrioma+ LC+n3 (86,4%, p=0,1681). A menor taxa de MII foi \nencontrada no grupo FFEndometrioma (69,3%) que diferiu dos demais 8 grupos ( vs \nsem-FF: p<0,0001; vs FFControle: p<0,0001; vs FFControle+LC+n3: p=0,00194; vs \nFFEI/II: p=0,00114; vs FFEI/II+LC+n3: p=0,00117; vs FFEIII/IV: p=0,02681; vs \nFFEIII/IV+LC+n3: p<0,0001; vs FFEndometrioma+LC+n3: p=0,00044). O grupo sem-\nFF apresentou maior taxa de MII comparado ao s grupos FFEIII/IV (80,7%, \np=0,00681) e FFEendometrioma (p<0,0001). A adição de LC e ômega -3 não alterou \na taxa de MII nos grupos  FFControle (FFControle vs FFControle+LC+n3: p=0,3122), \nFFEI/II (FFEI/II vs FFEI/II+LC+n3: p=1). No entanto, a adição de LC e ômega -3 \naumentou a taxa de MII  nos grupos FFEIII/IV  (FFEIII/IV vs FFEIII/IV+LC+n3: \np=0,0190) e FFEendometrioma (FFEendometrioma vs FFEendometrioma+LC+n3: \np=0,0004). \nA porcentagem de MII meioticamente normais foi de 87,2% no grupo sem -FF, \nsendo similar a dos grupos FFControle (87,2%, p=1 , poder de teste: 5% ), \n\n72 \n \nFFControle+LC+n3 (82,5%, p=0,54 , poder de teste: 7% ), FF EI/II+LC+n3 (84,5%, \np=0,7615, poder de teste: 6% ), FFEIII/IV+LC+n3 (84,1%, p=0,7122, poder de teste: \n6%) e FFEndometrioma+ LC+n3 (75,3%, p=0,0623 , poder de teste: 14%). A \nporcentagem de MII normais no grupo sem -FF foi significativamente maior do que \nnos grupos FF EI/II (62,2%, p=0,00023), FF EIII/IV (70,2%, p=0,0092) e \nFFEndometrioma (72,7%, p=0,03497). A porcentagem de MII normais no grupo \nFFControle também foi significativamente maior do que nos grupos FF EI/II \n(p=0,00059), FFEIII/IV (p=0,01523) e FFEndometrioma (p=0,0486). A adição de L C \ne ácidos graxos ômega-3 durante a MIV não alterou a taxa de MII normais no grupo \nFFControle (p=0,5792, poder de teste: 7%) e com FFEndometrioma (p=0,865, poder \nde teste: 5% ), mas aumentou essa taxa nos grupos com FF EI/II (p=0,00205) e \nFFEIII/IV (p=0,04995). Apesar dos grupo s FFEndometrioma (72,7%) e \nFFEndometrioma+LC+n3 (75,3%) não diferirem com relação à porcentagem de MII \nnormais (p=0,865), o grupo  FFEndometrioma+LC+n3 teve porcentagem de MII \nnormais semelhante aos grupos sem -FF (p=0,062 , poder de teste: 14% ) e \nFFControle (p=0,083, poder de teste: 14%).  \n \n\n73 \n \nTabela 2: Estágios de maturação nuclear, e porcentagem de oócitos em MII normais maturados in vitro em meio sem adição de FF (sem -FF), \ncom adição de 1% de FF de pacientes inférteis sem endometriose (FFControle), com endom etriose leve (FF EI/II), com endometriose \nmoderada/grave sem endometrioma (FF EIII/IV) ou com endometriose moderada/grave com endometrioma (FFEndometrioma), suplementado \ncom 0,6mg/mL de L-Carnitina, 0,4 nM de ácido docosahexaenóico e 0,6 nM de ácido eicosapentaenóico (LC+n3) visualizados por microscopia \nconfocal. \n Oócitos \nfixados \npós-MIV  \nn \nVisualizados \nn \nMI \nn (%) \nT1 \nn (%) \nAP \nn (%) \nMII \nTotal de MII \nn (%) \nAnalisáveis \nn (%) \nNormais \nn (%) \nsem-FF 167 149 9(6,0%)a 2 (1,3%) 1 (0,7%) 137 (91,9%)a 94 (68,6%) 82 (87,2%)a \nFFControle 163 148 9 (6,1%)a 5 (3,4%) 2 (1,4%) 132 (89,2%)ab 78 (59,1%) 68 (87,2%)a \nFFControle \n+LC+n3 179 163 19 (11,7%)ab 3 (1,8%) 3 (1,8%) 138 (89,2%)ab 80 (58,0%) 66 (82,5%)ab \nFFEI/II 178 158 20 (12,7%)ab 1 (0,6%) 2 (1,3%) 135 (85,4%)ab 82 (60,7%) 51 (62,2%)c \nFFEI/II \n+LC+n3 186 163 16 (9,8%)ab 4 (2,5%) 4 (2,5%) 139 (85,3%)ab 84 (60,4%) 71 (84,5%)ad \nFFEIII/IV 185 166 28 (16,9%)bc 2 (1,2%) 2 (1,2%) 134 (80,7%)b 84 (62,7%) 59 (70,2%)bc \nFFEIII/IV \n+LC+n3 163 142 11 (7,7%)a 1 (0,7%) 1 (0,7%) 129 (90,8%)a 82 (63,6%) 69 (84,1%)ad \nFFEndometrioma 163 150 37 (24,7%)c 7 (4,7%) 2 (1,3%) 104 (69,3%)c 66 (63,5%) 48 (72,7%)bcd \nFFEndometrioma \n+LC+n3 177 162 18 (11,1%)ab 0 (0%) 4 (2,5%) 140 (86,4%)ab 85 (60,7%) 64 (75,3%)abc \nNota: MIV: maturação in vitro; MI = metáfase I; TI = telófase I; MII = metáfase II; AP = ativação partenogenética. Analisáveis: oócitos com fuso fixado em uma \nvisão lateral ou sagital. Dados são resultados de 8 replicatas utilizando fluido folicular de pacientes controles, com endom etriose leve, com endometriose \ngrave sem endometrioma e com endometrioma. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística, p<0,05, usando te ste de qui-quadrado. \n\n74 \n \nFigura 11: Alterações meióticas oocitárias mais sign ificativas encontradas em cada grupo: A -) \nMetáfase II normal no grupo FFControle; B -) Metáfase I no grupo FFEendometrioma; C -) a F -) \nMetáfase II anormal nos grupos FFEI/II, FFEIII/IV, FFEendometrioma e FFEendometioma+LC+n3, \nrespectivamente \n \nNota: Em verd e, marcação para  fuso meiótico com anticorpo monoclonal anti -β-tubulina e anticorpo \nsecundário conjugado com FITC. Em azul, marcação para material genético com Hoechst 33342. \nBarra branca no canto direito inferior: escala de 10 µm. Seta branca indica cromossomos \ndesalinhados. \n\n75 \n \n \n \n6. DISCUSSÃO \n\n76 \n \nApesar da estreita relação entre endometriose e infertilidade, os mecanismos \netiopatogênicos envolvidos na diminuição da fertilidade natural dessas mulheres \npermanecem desconhecidos.  Neste estudo, demonstramos que o FF de mulheres  \ninférteis com endometriose quando adicionado ao meio de MIV de oócitos bovinos \nprovoca diminuição da qualidade oocitária (avaliada neste estudo pelo bloqueio da \nmaturação nuclear e comprometimento da organização do fuso e cromossomos de \noócitos em MII ) quando  comparado ao FF de mulheres inférteis sem a doença. A \npresença de endometrioma no ciclo de EOC apresenta um impacto ainda mais \nprejudicial à qualidade oocitária, afetando, principalmente, a maturação nuclear. A \nadição de LC e de ácidos graxos ômega -3 (DHA e EPA)  preveniu esses danos, \nressaltando o papel do  EO e de alterações da β-oxidação na piora da qualidade de \noócitos de mulheres com endometriose  em estágios iniciais e avançados (com e \nsem endometrioma). \nIndependentemente do estágio, nossos achados, usando modelo \nexperimental bovino, evidenciam que a endometriose afeta a quali dade oocitária \nreduzindo a porcentagem de oócitos em MII com fuso normal e cromossomos \nalinhados comparada a dos  grupos sem-FF e com FF controle.  O fuso meiótico de \noócitos é uma estrutura dinâmica, que alinha e segrega os cromossomos durante a \nmeiose, for mado pela polimerização de subunidades α e β  da proteína tubulina \nassociada a mais de 100 outras proteínas (WITTMANN; HYMAN; DESAI , 2001) . \nVários fatores podem  alterar o fuso, sendo o EO, um deles (SHARMA; AZEEM; \nAGARWAL, 2013) . Radicais livres são moléculas contendo elétrons \ndesemparelhados, e que devido a essa instabilidade de elétrons, pode danificar \ndiretamente as proteínas do fuso (e outras macromoléculas celulares, como o DNA) \nprovocando desarranjos estruturais e funcionais (SALVI et al. , 2001) . Excesso de \nradicais livres também pode alterar o potencial de mem brana da mitocôndria, \nlevando a uma diminuição da produção de ATP e, consequente, desestruturação do \nfuso meiótico (ZHANG et al., 2006). \nNossos achados corroboram achados anteriores do nosso grupo,  \ndemonstrando que adição de 1% de FF de mulheres inférteis com endometriose em \nestágios iniciais ao meio de MIV de oócitos bovinos prejudica a organização do fuso \nmeiótico e o alinhamento cromossômico de oócitos em MII (DA BROI et al., 2014; \nGIORGI et al. , 2016) . Pela primeira vez, evidenciamos que o FF de mulheres \ninférteis com endometriose em estágios avançados (com e sem endometrioma) \n\n77 \n \ntambém compromete a normalidade meiótica de oócitos bovinos submetidos a MIV \nna presença destes FF na concentração de 1%.   \nEntretanto, Hamdan e colaboradores (2016), utilizando modelo murino, não \nobservaram alteração de fuso meiótico e alinhamento cromossômico quando os \noócitos foram maturados com FF de mulheres com endometriose grave; discordando \nde nossos resultados. No estudo de H amdan e colaboradores (2016), as doadoras \nde FF foram previamente submetidas ao exame de videolaparoscopia para \ndiagnóstico, tratamento e estadiamento da endometriose de acordo com os critérios \nda ASRM, entretanto não houve menção da presença de infertilid ade e \nendometrioma como critério de inclusão/exclusão. Outras diferenças entre o \npresente estudo e o trabalho de Hamdan e colaboradors (2016) são: o tempo de \nincubação e a concentração de FF utilizada (Hamdan e colaboradores incubaram os \noócitos em uma con centração de 15 -50% de FF por 18h).  Dessa forma, \nhipotetizamos que a discordância de resultados entre o nosso estudo e o estudo de \nHamdan e colaboradores (2016) relativos à organização do fuso meiótico deve -se, \nprincipalmente, ao modelo experimental utiliz ado. Morfologicamente e \nfisiologicamente oócitos de diferentes espécies apresentam diferenças, mesmo que \nsutis (SANTOS; SCHOEVERS; ROELEN , 2014) , entretanto, revisão avaliando as \ncaracterísticas oocitárias de bovinos, murinos , suínos e humanos, sugeriu que p ara \nestudos avaliando toxicologia reprodutiva (que no nosso caso seria a exposição a \num ambiente com EO) os modelos bovinos e suínos seriam mais adequados que o \nmodelo murino  para representar oócitos humanos  (SANTOS; SCHOEVERS; \nROELEN, 2014).  \nApesar disso, Hamdan e colaboradores (2016)  avaliaram alterações \ncromossômicas por outra metodologia, a  fosforilação da histona H2AX (marcador de \ndano ao DNA e, portanto, ao cromossomo ), e reportaram uma maior quantidade de \nfocos de fosforilação da histona H2AX nos  oócitos incubados com FF de \nendometriose grave comparado aos grupos sem FF e com FF controle , indicando \ncomprometimento dos cromossomos de oócitos de mulheres com endometriose \ngrave, corroborando , ao menos em parte, os  nossos achados (HAMDAN et al. , \n2016). \nA taxa de maturação nuclear também foi avaliada no estudo de Hamdan e \ncolaboradores (2016), que observaram que o FF de mulheres sem endometriose \nnão afetou a taxa de maturação oocitária comparada ao gru po sem adição de FF \n\n78 \n \n(HAMDAN et al. , 2016) . Entretanto, o FF de mulheres com endometriose grave \n(tanto a adição de 15% quanto 50%), prejudicou a taxa de maturação oocitária in \nvitro (HAMDAN et al., 2016). Os autores desse estudo sugerem que a diminuição da \ntaxa de extrusão de CP no grupo incubado com FF de endometriose deve ser \nresultante de danos ao DNA provocados pelo EO (HAMDAN et al. , 2016) . Um \ntrabalho de nosso grupo mostrou que o FF de mulheres inférteis com endometriose \napresenta um aumento dos níveis de 8OHdG (marcador de dano  oxidativo ao DNA) \ncomparado a mulheres inférteis sem a do ença (DA BROI et al., 2016). Desta forma, \nHamdan e colaboradores (2016) corroboram nossos resultados  que o FF de \nmulheres inférteis com endometriose avançada (com e sem endometrioma) \ncompromete a maturação nuclear oocitária (maior taxa de MI e menor taxa de MII) \nquando comparado ao FF de mulheres  inférteis sem endometriose  e com \nendometriose em estágios iniciais.  \nMostramos que a adição de FF de mulheres inférteis com endometrioma no \nciclo diminui a taxa de maturação nuclear quando comparado aos demais grupos, \ninclusive, aquele contendo FF de mulheres com endometriose III/IV sem \nendometrioma no ciclo . Neste contexto, estudos prévios evidenciaram que o FF \nobtido de folículos de ovários contendo endometrioma apresentam maiores níveis de \nferro livre e ferritin a comparado s a FF obtido d e ovários livre de endometrioma, e \nessa concentração parece aumentar quanto maior a proximidade do folículo com o \nendometrioma (SANCHEZ et al., 2014; BENAGLIA et al., 2015).  \nNo presente estudo, no grupo Eendometrioma, utilizamos tanto amostras de \nFF obtidas de ovário ipsilateral (2/8) como contralateral ao endometrioma (6/8) \n(APÊNDICE A). Estudo avaliando m ulheres com endometrioma unilateral comparou \nos resultados de  fertilização in vitro  (FIV) de oócitos provenientes do ovário \nipsilateral e contralateral ao endometrioma, e não relatou diferenças nos números de \noócitos captados , de embriões viáveis, assim como nas taxas de fertilização e de \nclivagem (FILIPPI et al., 2014). Portanto, embora, o conteúdo folicular de ferro seja \nalterado pela presença de endometrioma (SANCHEZ et al., 2014; BENAGLIA et al., \n2015), os resultados de TRA parecem não ser alterados comparando ambos ovários \nde mulheres com endometriose com endometrioma unilateral (FILIPPI et al., 2014).  \nEmbora o trabalho de Filippi e colaboradores (2014) não tenha comparado os \nresultados de FIV entre mulheres com e sem endometrioma, sugerimos que, a lém \ndo efeito negativo do contato  direto do endometrioma com o córtex ovariano \n\n79 \n \nadjacente sobre a foliculogênese (KITAJIMA et al., 2011; KURODA et al., 2012), a \npresença de endometrioma no ciclo interfere no compartimento sistêmico do \norganismo (soro) (CARMONA et al. , 2012; SANTULLI et a l., 2013) , afetando o \nambiente folicular do ovário contralateral (nos casos de endometrioma unilateral) \nalterando também o FF. Análise proteômica por espectrometria de massa do FF de \nmulheres com endometrioma unilateral (amostra de FF ipsilateral e contra lateral) e \nsem endometriose (controle) identificou 535 proteínas expressas, sendo 139 comuns \naos 3 grupos (endometrioma, ovário sem endometrioma e controle)  (REGIANI et al., \n2015). Análise de enriquecimento foi realizada a partir da composição do ovário com \nendometrioma e ovário sem endometrioma, sendo que ambos grupos apresentaram \nproteínas com funções similares, demonstrando o impacto da endometriose (ou \npresença de um endometrioma ativo no ciclo, independentemente da proximidade \nfolicular) sobre a composição do FF (REGIANI et al., 2015). \nLC e ácidos graxos ômega -3 prev eniram os danos meióticos oocitários \nprovocados pelo FF de mulheres inférteis com endometriose, independentemente do \nestágio da doença e da presença ou não de endometrioma . Estudo prévio de nosso \ngrupo mostrou que a adição de LC previne os danos ao fuso meiótico de oócitos \nbovinos maturados in vitro na presença de FF de mulheres com endometriose leve \n(taxa de MII normais  aumentou de 51,35% para 80,61% com LC ) (GIORGI et al. , \n2016). Contudo, p ela primeira vez, mostramos que a  adição conjunta de LC e de \nácidos graxos ômega -3 previne os danos oocitários (tanto em nível de maturação \nnuclear quanto de organização d o fuso e alinhamento cromossômico em oócitos \nMII).  \nRecente revisão destacou o importante papel da carnitina sobre a f ertilidade \nfeminina discutindo estudos in vivo  e in vitro  envolvendo humanos ou modelos \nanimais, e os possíveis mecanismos de ação  da LC  na melhora da fertilidade \nfeminina (AGARWAL;GUPTA; DURAIRAJANAYAGAM, 2018) . Por outro lado,  \nestudos experimentais mostram que suplementação com ômega -3 melhora a \nqualidade oocitária (NEHRA et al. , 2012) , regula o endométrio (WATERS et al. , \n2014) e aumenta a taxa de prenhez (WATHES; ABAYASEKARA; AITKEN, 2007).  \nTanto a LC quanto os ácidos graxos  estão envolvidos n a β -oxidação que é \numa importante via mitocondrial de produção de energia durante a maturação \noocitária e desenvolvimento embrionário inicial (DOWNS; MOSEY; KLINGER, 2009; \nDUNNING et al. , 2010; DUNNING; ROBKER , 2012;  PACZKOWSKI et al. , 2013; \n\n80 \n \nVALSANGKAR; DOWNS, 2013; DUNNING; RUSSEL; ROBKER, 2014; DUNNING et \nal., 2014) . Oócitos de mulheres inférteis com endometriose mínima ou leve \napresentam alterações mitocondriais avaliadas por microscopia eletrônica de \ntransmissão e por reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-PCR) (XU et al., \n2015). E,  embora neste trabalho não investigamos as mitocôndrias oocitária,  \nsugerimos que o  EO presente no  FF de mulheres  inférteis com endom etriose \n(PRIETO et al., 2012; SINGH et al., 2013b; DA BROI; NAVARRO, 2016; HAMDAN et \nal., 2016; NASIRI et al. , 2017) , altere o  funcionamento mitocondrial, contribuindo \ncom a piora da qualidade oocitária  (ZHANG et al., 2006; XU et al., 2015). A LC e os \nácidos graxos ômega-3 ativariam a β-oxidação, normalizando os níveis de A TP que \né essencial para a aquisição da competência oocitária (VAN BLERKOM ; DAVIS; \nLEE., 1995; FERREIRA et al., 2009b). \nTambém sugerimos que os ácidos graxos ômega -3 tenham agido modulando \na ação da enzima cicloxigenase-2 ( COX-2) (DERECKA et al. , 2008)  nos oócitos \nmaturados in vitro com FF de mulheres com endometrio se. A COX-2 está envolvida \ncom metabolismo lipídico e inflamação  e é codificada pelo gene PTGS2 (O'NEILL; \nFORD-HUTCHINSON, 1993) . Estudo de nosso grupo mostrou diminuição da \nexpressão do gene PTGS2 em células do cumulus de mulheres com endometriose \ncomparado a mulheres inférteis sem a doença submetidas à EOC pa ra ICSI (DA \nLUZ et al., 2017). Desta forma, é possível  que o FF de mulheres com endometr iose \n(neste estudo, especialmente, III/IV) altere o funcionamento da COX -2 nos CCOs, \ndiminuindo a expressão de PTGS2, o que afetaria a maturação nuclear oocitária e a \nresolução da meiose I.  E os ácidos graxos ômega -3 devem ter modulado a COX -2 \nque poderia promover o funcionamento normal do gene PTGS2, e, por \nconsequência, normalizar a taxa de maturação nuclear (MAREI et al., 2014) \nEmbora há estudos controversos (KIM et al., 2013; KHANAKI et al., 2014) e \nevidências fracas sobres os efeitos benéficos do ômega -3 para a endometriose \n(GAZVANI et al., 2001; MISSMER et al., 2004; NETSU et al., 2008; ATTAMAN et al., \n2014; HOPEMAN et al. , 2015; AKYOL et al. , 2016) , os ácidos graxos ômega -3 \nparecem estar envolvidos com a supressão da progressão da endometriose, \nprovavelmente modulando a inflamação em favor da síntese de r esolvinas \n(DMITRIEVA; SUESS; SHIRLEY, 2014) o que poderia impactar diretamente no alívio \nda dor . Recente estudo clínico registrado no ISRCTN (ISRCTN44202346) pretende \navaliar a eficácia do ômega -3 no tratamento da dor relacionada à endometriose com \n\n81 \n \num estudo duplo-cego utilizando dois braços de estudo: i) uso de ômega -3 (Omacor \n1000mg 2 vezes ao dia) e ii) cápsula de azeite de oliva com semelhante aspecto \n(ABOKHRAIS et al., 2018). \nEntretanto, não há estudos avaliando o uso de PUFA omega -3 na melhora \nda in fertilidade relacionada à endometriose. Estudo de coorte prospectivo (n=100) \navaliou a relação entre níveis séricos de PUFA n-6 e n-3 sobre os resultados de TRA \ne observou que maiores níveis sérios de ômega -3 estavam associados a uma maior \nprobabilidade de  gestação clínica e nascidos vivos por ciclo iniciado (CHIU et al. , \n2018). Mirabi e colaboradores (2017) também observa ram uma maior concentração \nde EPA no soro de mulheres submetidas às técnicas d e TRA que engravidaram \ncomparadas àquelas que não engravidaram, no entanto, quando essa comparação \nfoi realizada utilizando amostras de FF, nenhuma diferença foi encontrada (MIRABI \net al., 2017). \nAvaliando os dados clínicos dos grupos de doadoras de FF (FFControle, \nFFEI/II, FF EIII/IV e FFEendometrioma), observamos uma diferença na duração da \ninfertilidade entre os grupos FFControle e FFEendometrioma. Acreditamos que essa \ndiferença não seja importante neste estudo, vi sto que a mediana das idades (este \nsim, um fator relacionado a piora da qualidade oocitária) entre os grupos não diferiu.  \nNosso estudo trouxe contribuições inéditas para a elucidação da \netiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. Porém, co ntamos com \nalgumas limitações. I-) Utilizamos FF de mulheres submetidas à EOC, tornando \nquestionável a extrapolação dos resultados para ciclos naturais; porém, o grupo \ncontrole também foi submetido a protocolos de bloqueio hipofisário semelhantes. II-) \nPara a classificação da endometriose utilizamos os critérios da ASRM, e não \npodemos saber se a utilização de outros critérios [como por exemplo o índice de \nfertilidade (ADAMSON; PASTA, 2010)] poderiam levar a resultados semelhantes. I II-\n) Utilizamos o FF apenas do primeiro folículo aspirado de cada paciente, pois n ão \nsabemos se a prorrogação da anestesia e repetidas punções ovarianas \npromoveriam EO folicular; todavia, não podemos afirmar que FFs de diferentes \nfolículos teriam o mesmo impacto durante a MIV sobre o oócito.  IV-) Além disso, os \ndados obtidos a partir de  estudos com modelos animais pode não necessariamente \nser extrapolado s para os seres humanos e estudos  com oócitos de mulheres \ninférteis com endometriose maturados in vivo  seriam importantes para confirmar \nnossos resultados. V) Pequena casuística avaliada relativa ao número de amostras \n\n82 \n \nde FF dos quatro grupos avaliados, o que limita a generalização de nossos achados. \nTodavia, nossos restritivos critérios de elegibilidade para as doadoras de FF, \nimportante para aumentar a validade interna dos resultados, e a  limitada indicação \nde videolaparoscopia na abordagem atual da infertilidade, tornaram bastante difícil a \ninclusão de mais pacientes e estudos com maiores casuísticas são importantes para \nconfirmar nossos achados. \nAtualmente, os tratamentos disponíveis par a a infertilidade relacionada à \nendometriose são cirúrgicos e/ou as TRA (KENNEDY et al., 2005) que são invasivos \ne/ou de elevado custo, com consequente baixo acesso populacional. Portanto, \nnovas abordagens terapêuticas seriam essenciais para auxiliar milhares de mulheres \natingidas por essa doenç a. Devido às propriedades da LC e dos ácidos graxos \nômega-3, a combinação de tratamento cirúrgico com a suplementação dessas \nsubstâncias poderia impedir a recorrência e/ou progressão da endometriose (devido \nà ação antioxidante da LC e anti -inflamatória dos  ácidos graxos ômega -3) e \nmelhorar a fertilidade natural (por prevenir o EO, o comprometimento da beta \noxidação e os danos oocitários) visto que o as TRA não são acessíveis a todas as \nmulheres. Nossos achados estimulam o delineamento de estudos clínicos \ninvestigando o impacto da suplementação conjunta de LC e ácidos graxos ômega -3 \nna melhora da fertilidade natural de mulheres inférteis com endometriose. \n \n\n83 \n \n \n7. CONCLUSÕES \n \n\n84 \n \nI-) O FF de mulheres inférteis com endometriose, independentemente do estágio da \ndoença, diminui a taxa de MII normais quando adicionado ao meio de MIV de oócitos \nbovinos, comparado à adição de FF de mulheres inférteis sem endometriose. \nEntretanto, o FF de mulheres inférteis com endometriose em estágios avançados \n(III/IV) prejudica a taxa de maturação nuclear comparado ao grupo sem -FF, o que \nnão é observado no grupo com FF de mulheres inférteis com endometriose em \nestágios iniciais.  E o  FF de mulheres inférteis com endometrioma, quando \nadicionado ao meio de MIV de oócitos bovinos, diminui a ta xa de maturação nuclear \ncomparado à adição de FF de mulheres inférteis sem endometriose, com \nendometriose em estágios iniciais e com endometriose em estágios avançados sem \nendometrioma. Portanto, a avanço do estágio da endometriose , assim como a \npresença de endometrioma no ciclo (mesmo que contralateral), apresentam impacto \nmais deletério sobre a qualidade oocitária. \n \nII-) A suplementação do meio de MIV de oócitos bovinos com L C e ácidos graxos \nômega-3 (DHA e EPA) preveniu os danos meióticos oocitários prov ocados pela \nadição do FF de mulheres inférteis com endometriose (em todos os estágios). Dessa \nforma, sugerimos que o estado inflamatório e de estresse oxidativo ex acerbado, \nassim como, a desregulação da β -oxidação podem estar envolvidos na piora da \nqualidade oocitária, com consequente prejuízo da fertilidade natural de mulheres \ncom endometriose.  \n \n\n85 \n \n \nBIBLIOGRAFIA \n \n\n86 \n \n \nABBAS, S.  et al. Prevalence a nd incidence of diagnosed endometriosis and risk of \nendometriosis in patients with endometriosis -related symptoms: findings from a \nstatutory health insurance-based cohort in Germany. Eur J Obstet Gynecol Reprod \nBiol, v. 160, n. 1, p. 79-83, 2012.  \n \nABOKHRAIS, I. M.  et al. A pilot randomised double blind controlled trial of the \nefficacy of purified fatty acids for the treatment of women with endometriosis -\nassociated pain (PurFECT): study protocol. Pilot Feasibility Stud, v. 4, p. 83,  2018.  \n \nABRIEU, A.  et  al. Mps1 is a kinetochore -associated kinase essential for the \nvertebrate mitotic checkpoint. Cell, v. 106, n. 1, p. 83-93, 2001.  \n \nADAMSON, G. D.; PASTA, D. J. Endometriosis fertility index: the new, validated \nendometriosis staging system. Fertil Steril, v. 94, n. 5, p. 1609-15, 2010.  \n \nADONA, P. R.; LIMA VERDE LEAL, C. Meiotic inhibition with different cyclin -\ndependent kinase inhibitors in bovine oocytes and its effects on maturation and \nembryo development. Zygote, v. 12, n. 3, p. 197-204, 2004.  \n \nAGARWAL, A.; GUPTA, S.; SHARMA, R. Oxidative stress and its implications in \nfemale infertility - a clinician's perspective. Reprod Biomed Online, v. 11, n. 5, p. \n641-50, 2005.  \n \nAGARWAL, A.; SENGUPTA, P.; DURAIRAJANAYAGAM, D. Role of L -carnitine in \nfemale infertility. Reprod Biol Endocrinol, v. 16, n. 1, p. 5, 2018.  \n \nAKYOL, A.  et al. Efficacies of vitamin D and omega -3 polyunsaturated fatty acids on \nexperimental endometriosis. Taiwan J Obstet Gynecol, v. 55, n. 6, p. 835 -839, \n2016.  \n \nANTONIO, C.  et al. Xkid, a chromokinesin required for chromosome alignment on \nthe metaphase plate. Cell, v. 102, n. 4, p. 425-35, 2000.  \n \nARMSTRONG, D. T. Effects of maternal age on oocyte developmental competence. \nTheriogenology, v. 55, n. 6, p. 1303-22, 2001.  \n \nASRM. Revised Ameri can Society for Reproductive Medicine classification of \nendometriosis: 1996. Fertil Steril, v. 67, n. 5, p. 817-21, 1997.  \n \nATTAMAN, J. A.  et al. The anti -inflammatory impact of omega -3 polyunsaturated \nFatty acids during the establishment of endometriosis -like lesions. Am J Reprod \nImmunol, v. 72, n. 4, p. 392-402, 2014.  \n \nBECKMAN, K. B.; AMES, B. N. The free radical theory of aging matures. Physiol \nRev, v. 78, n. 2, p. 547-81, 1998.  \n \nBELLELIS, P.  et al. Epidemiological and clinical aspects of pelvic endo metriosis–a \ncase series. Rev Assoc Med Bras (1992), v. 56, n. 4, p. 467-71, 2010.  \n \n\n87 \n \nBENAGIANO, G.; BROSENS, I. History of adenomyosis. Best Pract Res Clin \nObstet Gynaecol, v. 20, n. 4, p. 449-63, 2006.  \n \nBENAGIANO, G; BROSENS, I . Who identified endometrios is? Fertil Steril, v. 95, n. \n1, p. 13-6, 2011.  \n \nBENAGIANO, G.; BROSENS, I.; LIPPI, D. The history of endometriosis. Gynecol \nObstet Invest, v. 78, n. 1, p. 1-9,  2014.  \n \nBENAGLIA, L.  et al. Intrafollicular iron and ferritin in women with ovarian \nendometriomas. Acta Obstet Gynecol Scand, v. 94, n. 6, p. 646-53, 2015.  \n \nBERLETT, B. S.; STADTMAN, E. R. Protein oxidation in aging, disease, and \noxidative stress. J Biol Chem, v. 272, n. 33, p. 20313-6, 1997. \n  \nBIGGERS, J. D.; WHITTINGHAM, D. G.; DONAHUE, R. P. T he pattern of energy \nmetabolism in the mouse oöcyte and zygote. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 58, n. 2, \np. 560-7, 1967.  \n \nBROSENS, I.  et al. Early stage management of ovarian endometrioma to prevent \ninfertility. Facts Views Vis Obgyn, v. 5, n. 4, p. 309-14,  2013.  \n \nBURNEY, R. O.; GIUDICE, L. C. Pathogenesis and pathophysiology of \nendometriosis. Fertil Steril, v. 98, n. 3, p. 511-9, 2012. \n \nBÄCHLER, M.  et al. Species -specific differences in follicular antral sizes result from \ndiffusion-based limitations on the thickness of the granulosa cell layer. Mol Hum \nReprod, v. 20, n. 3, p. 208-21, 2014.  \n \nBÉRUBÉ, S.  et al. Fecundity of infertile women with minimal or mild endometriosis \nand women with unexplained infertility. The Canadian Collaborative Group on \nEndometriosis. Fertil Steril, v. 69, n. 6, p. 1034-41, 1998.  \n \nCARMONA, F.  et al. Ovarian endometrioma but not deep infiltrating endometriosis is \nassociated with increased serum levels of interleukin -8 and interleukin -6. J Reprod \nImmunol, v. 95, n. 1-2, p. 80-6, 2012.  \n \nCHAMIÉ, L. P.  et al. Atypical Sites of Deeply Infiltrative Endometriosis: Clinical \nCharacteristics and Imaging Findings. Radiographics, v. 38, n. 1, p. 309-328, 2018.  \n \nCHANKITISAKUL, V.  et al. Supplementation of maturation medium with L -carnitine \nimproves cryo-tolerance of bovine in vitro matured oocytes. Theriogenology, v. 79, \nn. 4, p. 590-8, 2013.  \n \nCHAVARRO, J. E.  et al. Dietary fatty acid intakes and the risk of ovulatory infertility. \nAm J Clin Nutr, v. 85, n. 1, p. 231-7, 2007.  \n \nCHAVARRO, J. E. et al . A prospective study of polyunsaturated fatty acid levels in \nblood and prostate cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, v. 16, n. 7, p. \n1364-70, 2007. \n\n88 \n \n \nCHIU, Y. H.  et al. Serum omega -3 fatty acids and treatment outcomes among \nwomen un dergoing assisted reproduction. Hum Reprod, v. 33, n. 1, p. 156 -165, \n2018. \n \nCHOI, W. J.  et al. Oxidative stress and tumor necrosis factor -alpha-induced \nalterations in metaphase II mouse oocyte spindle structure. Fertil Steril, v. 88, n. 4 \nSuppl, p. 1220-31, 2007.  \n \nCHOI, Y. S.  et al. Alteration in the intrafollicular thiol -redox system in infertile women \nwith endometriosis. Reproduction, v. 149, n. 2, p. 155-62, 2015.  \n \nCUNHA-FILHO, J. S.  et al. Insulin-like growth factor (IGF)-1 and IGF binding protein-\n1 and -3 in the follicular fluid of infertile patients with endometriosis. Hum Reprod, v. \n18, n. 2, p. 423-8, 2003. \n \nD'HOOGHE, T. M.  et al. The cycle pregnancy rate is normal in baboons with stage I \nendometriosis but decreased in primates with stage II an d stage III-IV disease. Fertil \nSteril, v. 66, n. 5, p. 809-13, 1996. \n \nDA BROI, M. G.  et al. Follicular fluid from infertile women with mild endometriosis \nmay compromise the meiotic spindles of bovine metaphase II oocytes. Hum Reprod, \nv. 29, n. 2, p. 315-23, 2014. \n \nDA BROI, M. G.  et al. Increased concentration of 8 -hydroxy-2'-deoxyguanosine in \nfollicular fluid of infertile women with endometriosis. Cell Tissue Res, 2016. \n \nDA BROI, M. G.; NAVARRO, P. A. Oxidative stress and oocyte quality: \nethiopathogenic m echanisms of minimal/mild endometriosis -related infertility. Cell \nTissue Res, v. 364, n. 1, p. 1-7, 2016. \n \nDA BROI, M. G.  et al. Influence of follicular fluid and cumulus cells on oocyte quality: \nclinical implications. J Assist Reprod Genet, v. 35, n. 5, p. 735-751, 2018. \n \nDA BROI, M. G.  et al  Oocyte oxidative DNA damage may be involved in \nminimal/mild endometriosis -related infertility. Mol Reprod Dev, v. 85, n. 2, p. 128 -\n136, 2018. \n \nDA LUZ, C. M.  et al. PTGS2 down-regulation in cumulus cells of infertile women with \nendometriosis. Reprod Biomed Online, v. 35, n. 4, p. 379-386, 2017. \n \nDAS, S.  et al. Reactive oxygen species level in follicular fluid --embryo quality marker \nin IVF? Hum Reprod, v. 21, n. 9, p. 2403-7, 2006. \n \nDE JONGE, C. J.  et al. The acroso me reaction-inducing effect of human follicular \nand oviductal fluid. J Androl, v. 14, n. 5, p. 359-65, 1993. \n \nDE LIMA, C. B.  et al. Follicular fluid lipid peroxidation levels in women with \nendometriosis during controlled ovarian hyperstimulation. Hum Fertil (Camb), v. 20, \nn. 1, p. 48-54, 2017.  \n\n89 \n \n \nDE SANTIS, L.  et al. Polar body morphology and spindle imaging as predictors of \noocyte quality. Reprod Biomed Online, v. 11, n. 1, p. 36-42, 2005. \n \nDE ZIEGLER, D.; BORGHESE, B.; CHAPRON, C. Endometriosis and infer tility: \npathophysiology and management. Lancet, v. 376, n. 9742, p. 730-8, 2010. \n \nDERECKA, K.  et al. A PPAR -independent pathway to PUFA -induced COX -2 \nexpression. Mol Cell Endocrinol, v. 287, n. 1-2, p. 65-71, 2008. \n \nDMITRIEVA, N.; SUESS, G.; SHIRLEY, R. R esolvins RvD1 and 17(R) -RvD1 \nalleviate signs of inflammation in a rat model of endometriosis. Fertil Steril, v. 102, n. \n4, p. 1191-6, 2014. \n \nDONNEZ, J.  et al. Large ovarian endometriomas. Hum Reprod, v. 11, n. 3, p. 641 -\n6, 1996. \n \nDONNEZ, J.  et al. Oxidat ive stress in the pelvic cavity and its role in the \npathogenesis of endometriosis. Fertil Steril, v. 106, n. 5, p. 1011-1017, 2016. \n \nDOWNS, S. M.; HUNZICKER -DUNN, M. Differential regulation of oocyte maturation \nand cumulus expansion in the mouse oocyte -cumulus cell complex by site -selective \nanalogs of cyclic adenosine monophosphate. Dev Biol, v. 172, n. 1, p. 72-85, 1995. \n \nDOWNS, S. M.; MOSEY, J. L.; KLINGER, J. Fatty acid oxidation and meiotic \nresumption in mouse oocytes. Mol Reprod Dev, v. 76, n. 9, p. 844-53, 2009. \n \nDUMESIC, D. A.  et al. Oocyte environment: follicular fluid and cumulus cells are \ncritical for oocyte health. Fertil Steril, v. 103, n. 2, p. 303-16, 2015. \n \nDUNNING, K. R.  et al. Beta -oxidation is essential for mouse oocyte developmental \ncompetence and early embryo development. Biol Reprod, v. 83, n. 6, p. 909 -18, \n2010. \n \nDUNNING, K. R.; ROBKER, R. L. Promoting lipid utilization with l -carnitine to \nimprove oocyte quality. Anim Reprod Sci, v. 134, n. 1-2, p. 69-75, 2012.  \n \nDUNNING, K. R.  et al.  Regulation of fatty acid oxidation in mouse cumulus -oocyte \ncomplexes during maturation and modulation by PPAR agonists. PLoS One, v. 9, n. \n2, p. e87327,  2014. \n \nDUNNING, K. R.; RUSSELL, D. L.; ROBKER, R. L. Lipids and oocyte developmental \ncompetence: the role of fatty acids and β -oxidation. Reproduction, v. 148, n. 1, p. \nR15-27, 2014. \n \nEDWARDS, R. G. Follicular fluid. J Reprod Fertil, v. 37, n. 1, p. 189-219, 1974.  \n \nEICHENLAUB-RITTER, U.; SHEN, Y.; TINNEBERG, H. R. Manipulation of the \noocyte: possible dam age to the spindle apparatus. Reprod Biomed Online, v. 5, n. \n2, p. 117-24, 2002. \n\n90 \n \n \nEISENBACH, M. Mammalian sperm chemotaxis and its association with capacitation. \nDev Genet, v. 25, n. 2, p. 87-94,  1999. \n \nEVANS, A. M.; FORNASINI, G. Pharmacokinetics of L -carnitine. Clin \nPharmacokinet, v. 42, n. 11, p. 941-67,  2003. \n \nFALCONER, H.  et al. IVF outcome in women with endometriosis in relation to \ntumour necrosis factor and anti -Müllerian hormone. Reprod Biomed Online, v. 18, \nn. 4, p. 582-8, 2009. \n \nFERREIRA, E. M.   et al. Prematuration of bovine oocytes with butyrolactone I \nreversibly arrests meiosis without increasing meiotic abnormalities after in vitro \nmaturation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v. 145, n. 1, p. 76-80, 2009. \n \nFERREIRA, E. M.  et al. . Cytoplasmic maturation of bovine oocytes: structural and \nbiochemical modifications and acquisition of developmental competence. \nTheriogenology, v. 71, n. 5, p. 836-48, 2009.  \n \nFILIPPI, F.  et al. Ovarian endometriomas and oocyte quality: insights from in vitro \nfertilization cycles. Fertil Steril, v. 101, n. 4, p. 988-93.e1, 2014. \n \nFLACHS, P.  et al. Polyunsaturated fatty acids of marine origin upregulate \nmitochondrial biogenesis and induce beta -oxidation in white fat. Diabetologia, v. 48, \nn. 11, p. 2365-75, 2005. \n \nFRITZ, I. B.; MARQUIS, N. R. The role of acylcarnitine esters and carnitine \npalmityltransferase in the transport of fatty acyl groups across mitochondrial \nmembranes. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 54, n. 4, p. 1226-33, 1965. \n \nFULDEORE, M. J.; SOLIMAN, A. M. P revalence and Symptomatic Burden of \nDiagnosed Endometriosis in the United States: National Estimates from a Cross -\nSectional Survey of 59,411 Women. Gynecol Obstet Invest, v. 82, n. 5, p. 453 -461,  \n2017. \n \nFUNABIKI, H.; MURRAY, A. W. The Xenopus chromokinesi n Xkid is essential for \nmetaphase chromosome alignment and must be degraded to allow anaphase \nchromosome movement. Cell, v. 102, n. 4, p. 411-24, 2000. \n \nGARCIA-VELASCO, J. A.; ARICI, A. Is the endometrium or oocyte/embryo affected \nin endometriosis? Hum Reprod, v. 14 Suppl 2, p. 77-89, 1999. \n \nGARRIDO, N.  et al. Follicular hormonal environment and embryo quality in women \nwith endometriosis. Hum Reprod Update, v. 6, n. 1, p. 67-74, 2000. \n \nGAZVANI, M. R.  et al. High omega -3:omega-6 fatty acid ratios in cultur e medium \nreduce endometrial -cell survival in combined endometrial gland and stromal cell \ncultures from women with and without endometriosis. Fertil Steril, v. 76, n. 4, p. 717-\n22, 2001. \n \n\n91 \n \nGAZVANI, R.; TEMPLETON, A. Peritoneal environment, cytokines and angi ogenesis \nin the pathophysiology of endometriosis. Reproduction, v. 123, n. 2, p. 217 -26, \n2002. \n \nGIACOMINI, E.  et al. Characteristics of follicular fluid in ovaries with endometriomas. \nEur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v. 209, p. 34-38, 2017. \n \nGIORGI, V. S .  et al. N -Acetyl-Cysteine and l -Carnitine Prevent Meiotic Oocyte \nDamage Induced by Follicular Fluid From Infertile Women With Mild Endometriosis. \nReprod Sci, v. 23, n. 3, p. 342-51, 2016. \n \nGOSDEN, R. G.  et al. Physiological factors underlying the format ion of ovarian \nfollicular fluid. J Reprod Fertil, v. 82, n. 2, p. 813-25, 1988. \n \nGOUD, P. T.  et al. Dynamics of nitric oxide, altered follicular microenvironment, and \noocyte quality in women with endometriosis. Fertil Steril, v. 102, n. 1, p. 151-159.e5, \n2014. \n \nHAGHIAC, M.  et al. Dietary Omega -3 Fatty Acid Supplementation Reduces \nInflammation in Obese Pregnant Women: A Randomized Double -Blind Controlled \nClinical Trial. PLoS One, v. 10, n. 9, p. e0137309,  2015. \n \nHALBAN, J. Metastatic hysteroadenosis: Wien klin Wochenschr. 37: 1205-1206 p. \n1924. \n \nHAMDAN, M.  et al. The sensitivity of the DNA damage checkpoint prevents oocyte \nmaturation in endometriosis. Sci Rep, v. 6, p. 36994, 2016. \n \nHAMMICHE, F.  et al. Increased preconception omega -3 polyunsaturated fatt y acid \nintake improves embryo morphology. Fertil Steril, v. 95, n. 5, p. 1820-3, 2011. \n \nHOPEMAN, M. M.  et al. Serum Polyunsaturated Fatty Acids and Endometriosis. \nReprod Sci, v. 22, n. 9, p. 1083-7, 2015. \n \nHU, Y.  et al. Effects of low O2 and ageing on sp indles and chromosomes in mouse \noocytes from pre-antral follicle culture. Hum Reprod, v. 16, n. 4, p. 737-48, 2001. \n \nIWANOFF, N. Dusiges cystenhaltiges uterusfibromyom compliciert durch \nsarcom und carcinom: Monatsch Geburtshilfe Gynakol. 7: 295-300 p. 1898. \n \nJOMOVA, K.; VALKO, M. Importance of iron chelation in free radical -induced \noxidative stress and human disease. Curr Pharm Des, v. 17, n. 31, p. 3460 -73,  \n2011. \n \nJU, J. C.  et al. Heat shock reduces developmental competence and alters spindle \nconfiguration of bovine oocytes. Theriogenology, v. 64, n. 8, p. 1677-89, 2005. \n \nJUNGHEIM, E. S.  et al. Elevated serum α -linolenic acid levels are associated with \ndecreased chance of pregnancy after in vitro fertilization. Fertil Steril, v. 96, n. 4, p. \n880-3, 2011. \n\n92 \n \n \nKENNEDY, S.  et al. ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of \nendometriosis. Hum Reprod, v. 20, n. 10, p. 2698-704, 2005. \n \nKHANAKI, K.  et al. High ω-3:ω-6 fatty acids ratio increases fatty acid binding protein \n4 and extracellular secretory phos pholipase A2IIa in human ectopic endometrial \ncells. Iran J Reprod Med, v. 12, n. 11, p. 755-64, 2014. \n \nKIM, N. H.  et al. Microtubule and microfilament organization in maturing human \noocytes. Hum Reprod, v. 13, n. 8, p. 2217-22, 1998. \n  \nKIM, T. H.  et al. Differences in omega-3 and fatty acid profiles between patients with \nendometriosis and those with a functional ovarian cyst. J Obstet Gynaecol, v. 33, n. \n6, p. 597-600, 2013. \n \nKITAJIMA, M.  et al. Endometriomas as a possible cause of reduced ovarian reserv e \nin women with endometriosis. Fertil Steril, v. 96, n. 3, p. 685-91, 2011. \n \nKURODA, M.  et al. Histological assessment of impact of ovarian endometrioma and \nlaparoscopic cystectomy on ovarian reserve. J Obstet Gynaecol Res, v. 38, n. 9, p. \n1187-93, 2012. \n \nLAMAITA, R. M.  et al. Evaluation of N -acetilglucosaminidase and myeloperoxidase \nactivity in patients with endometriosis -related infertility undergoing intracytoplasmic \nsperm injection. J Obstet Gynaecol Res, v. 38, n. 5, p. 810-6, 2012. \n \nLEE, B. J.  et a l. Effects of L -carnitine supplementation on oxidative stress and \nantioxidant enzymes activities in patients with coronary artery disease: a randomized, \nplacebo-controlled trial. Nutr J, v. 13, p. 79,  2014. \n \nLIMOLI, C. L.  et al. Apoptosis, reproductive f ailure, and oxidative stress in Chinese \nhamster ovary cells with compromised genomic integrity. Cancer Res, v. 58, n. 16, p. \n3712-8, 1998. \n  \nLIU, F.  et al. The expression and role of oxidative stress markers in the serum and \nfollicular fluid of patients with endometriosis. Clin Exp Obstet Gynecol, v. 40, n. 3, p. \n372-6,  2013. \n \nLIU, L.  et al. Oxidative stress contributes to arsenic -induced telomere attrition, \nchromosome instability, and apoptosis. J Biol Chem, v. 278, n. 34, p. 31998 -2004, \n2003. \n  \nLONERGAN, P.  et al. Effect of follicle size on bovine oocyte quality and \ndevelopmental competence following maturation, fertilization, and culture in vitro. Mol \nReprod Dev, v. 37, n. 1, p. 48-53, 1994. \n  \nLOUSSE, J. C.  et al. Peritoneal endometriosis is an infla mmatory disease. Front \nBiosci (Elite Ed), v. 4, p. 23-40, 2012. \n \n\n93 \n \nMALHI, P. S.; ADAMS, G. P.; SINGH, J. Bovine model for the study of reproductive \naging in women: follicular, luteal, and endocrine characteristics. Biol Reprod, v. 73, \nn. 1, p. 45-53, 2005. \n \nMANDELBAUM, J.  et al. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human \noocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v. 113 Suppl 1, p. S17-23, 2004. \n \nMANESCHI, F.  et al. Ovarian cortex surrounding benign neoplasms: a histologic \nstudy. Am J Obstet Gynecol, v. 169, n. 2 Pt 1, p. 388-93, 1993. \n \nMANSOUR, G.  et al. L -carnitine supplementation reduces oocyte cytoskeleton \ndamage and embryo apoptosis induced by incubation in peritoneal fluid from patients \nwith endometriosis. Fertil Steril, v. 91, n. 5 Suppl, p. 2079-86, 2009.  \n \nMAREI, W. F.  et al. Role of PTGS2 -generated PGE2 during gonadotrophin -induced \nbovine oocyte maturation and cumulus cell expansion. Reprod Biomed Online, v. \n28, n. 3, p. 388-400, 2014. \n \nMBIZVO, M. T.; BURKMAN, L. J.; ALEXANDER, N.  J. Human follicular fluid \nstimulates hyperactivated motility in human sperm. Fertil Steril, v. 54, n. 4, p. 708 -\n12, 1990. \n \nMEULEMAN, C.  et al. High prevalence of endometriosis in infertile women with \nnormal ovulation and normospermic partners. Fertil Ste ril, v. 92, n. 1, p. 68 -74, \n2009.  \n \nMIAO, Y.  et al. The protective role of melatonin in porcine oocyte meiotic failure \ncaused by the exposure to benzo(a)pyrene. Hum Reprod, v. 33, n. 1, p. 116 -127, \n2018. \n \nMIRABI, P.  et al. The role of fatty acids on ICSI  outcomes: a prospective cohort \nstudy. Lipids Health Dis, v. 16, n. 1, p. 18, 2017.  \n \nMISSMER, S. A.  et al. Incidence of laparoscopically confirmed endometriosis by \ndemographic, anthropometric, and lifestyle factors. Am J Epidemiol, v. 160, n. 8, p. \n784-96, 2004. \n \nMOAWAD, A. R.  et al. l -carnitine supplementation during vitrification of mouse \ngerminal vesicle stage -oocytes and their subsequent in vitro maturation improves \nmeiotic spindle configuration and mitochondrial distribution in metaphase II oocytes.  \nHum Reprod, 2014. \n \nMOEN, M. H.; SCHEI, B. Epidemiology of endometriosis in a Norwegian county. \nActa Obstet Gynecol Scand, v. 76, n. 6, p. 559-62, 1997. \n \nMONTJEAN, D.  et al. Carnitine content in the follicular fluid and expression of the \nenzymes involved in beta oxidation in oocytes and cumulus cells. J Assist Reprod \nGenet, v. 29, n. 11, p. 1221-5, 2012. \n \n\n94 \n \nMORAN, L. J.  et al. Altered Preconception Fatty Acid Intake Is Associated with \nImproved Pregnancy Rates in Overweight and Obese Women Undertaking in Vit ro \nFertilisation. Nutrients, v. 8, n. 1, 2016. \n \nMULLEN, S. F.  et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of \nhuman oocytes, and the relevance to cryopreservation. Hum Reprod, v. 19, n. 5, p. \n1148-54, 2004. \n \nNADJARZADEH, A.  et al. Effe ct of Omega -3 Supplementation on Visfatin, \nAdiponectin, and Anthropometric Indices in Women with Polycystic Ovarian \nSyndrome. J Reprod Infertil, v. 16, n. 4, p. 212-20, 2015. \n \nNAKAGAWA, K.  et al. Measurement of oxidative stress in the follicular fluid of \ninfertility patients with an endometrioma. Arch Gynecol Obstet, v. 293, n. 1, p. 197 -\n202, 2016. \n \nNASIRI, N.  et al. Oxidative Stress Statues in Serum and Follicular Fluid of Women \nwith Endometriosis. Cell J, v. 18, n. 4, p. 582-587, 2017. \n \nNAVARRO, P. A.  et al. Arsenite induces aberrations in meiosis that can be \nprevented by coadministration of N -acetylcysteine in mice. Fertil Steril, v. 85 Suppl \n1, p. 1187-94, 2006. \n \nNAVARRO, P. A.; LIU, L.; KEEFE, D. L. In vivo effects of arsenite on meiosis, \npreimplantation development, and apoptosis in the mouse. Biol Reprod, v. 70, n. 4, \np. 980-5, 2004. \n \nNEHRA, D.  et al. Prolonging the female reproductive lifespan and improving egg \nquality with dietary omega-3 fatty acids. Aging Cell, v. 11, n. 6, p. 1046-54, 2012.  \n \nNETSU, S.  et al. Oral eicosapentaenoic acid supplementation as possible therapy \nfor endometriosis. Fertil Steril, v. 90, n. 4 Suppl, p. 1496-502, 2008. \n \nNIKOLOFF, N.  et al. Effect of eicosapentaenoic acid on bovine cumulus -oocyte \ncomplex in vitro. Cell Biol Int, v. 41, n. 5, p. 505-513, 2017. \n \nNISOLLE, M.; DONNEZ, J. Peritoneal endometriosis, ovarian endometriosis, and \nadenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entities. Fertil \nSteril, v. 68, n. 4, p. 585-96, 1997. \n \nO'NEILL, G. P.;  FORD-HUTCHINSON, A. W. Expression of mRNA for \ncyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 in human tissues. FEBS Lett, v. 330, n. 2, \np. 156-60, 1993. \n \nOPØIEN, H. K.  et al. Do endometriomas induce an inflammatory reaction in nearby \nfollicles? Hum Reprod, v. 28, n. 7, p. 1837-45, 2013. \n \nOSEIKRIA, M.  et al. N -3 polyunsaturated fatty acid DHA during IVM affected oocyte \ndevelopmental competence in cattle. Theriogenology, v. 85, n. 9, p. 1625 -1634.e2, \n2016.  \n\n95 \n \n \nPACZKOWSKI, M.  et al. Comparative importance of fatty ac id beta -oxidation to \nnuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and \nporcine cumulus oocyte complexes. Biol Reprod, v. 88, n. 5, p. 111, 2013. \n \nPAFFONI, A.  et al. The Gametotoxic Effects of the Endometrioma Content: Insig hts \nFrom a Parthenogenetic Human Model. Reprod Sci, p. 1933719118777637, 2018.  \n \nPARAZZINI, F. Ablation of lesions or no treatment in minimal -mild endometriosis in \ninfertile women: a randomized trial. Gruppo Italiano per lo Studio dell'Endometriosi. \nHum Reprod, v. 14, n. 5, p. 1332-4, 1999.  \n \nPARAZZINI, F.  et al. Epidemiology of endometriosis and its comorbidities. Eur J \nObstet Gynecol Reprod Biol, v. 209, p. 3-7, 2017. \n \nPATEL, B. G.  et al. Pathogenesis of endometriosis: Interaction between Endocrine \nand inflammatory pathways. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2018.  \n \nPAVLOK, A.; LUCAS -HAHN, A.; NIEMANN, H. Fertilization and developmental \ncompetence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. \nMol Reprod Dev, v. 31, n. 1, p. 63-7, 1992.  \n \nPELLICER, A.  et al. The follicular endocrine environment in stimulated cycles of \nwomen with endometriosis: steroid levels and embryo quality. Fertil Steril, v. 69, n. \n6, p. 1135-41, 1998. \n \nPELLICER, A.  et al . The follicular endocrine enviro nment in stimulated cycles of \nwomen with endometriosis: steroid levels and embryo quality. Fertil Steril, v. 69, n. \n6, p. 1135-41, 1998. \n \nPHONGNIMITR, T.  et al. Effect of L -carnitine on maturation, cryo -tolerance and \nembryo developmental competence of bov ine oocytes. Anim Sci J, v. 84, n. 11, p. \n719-25, 2013. \n \nPREIS, K. A.; SEIDEL, G. E.; GARDNER, D. K. Reduced oxygen concentration \nimproves the developmental competence of mouse oocytes following in vitro \nmaturation. Mol Reprod Dev, v. 74, n. 7, p. 893-903, 2007.  \n \nPRIETO, L.  et al. Analysis of follicular fluid and serum markers of oxidative stress in \nwomen with infertility related to endometriosis. Fertil Steril, v. 98, n. 1, p. 126 -30, \n2012.  \n \nRAHBAR, N.; ASGHARZADEH, N.; GHORBANI, R. Effect of omega -3 fatty acids on \nintensity of primary dysmenorrhea. Int J Gynaecol Obstet, v. 117, n. 1, p. 45 -7, \n2012. \n \nREDWINE, D. B. Ovarian endometriosis: a marker for more extensive pelvic and \nintestinal disease. Fertil Steril, v. 72, n. 2, p. 310-5, 1999. \n \n\n96 \n \nREGIANI, T.  et al. Follicular fluid alterations in endometriosis: label -free proteomics \nby MS(E) as a functional tool for endometriosis. Syst Biol Reprod Med, v. 61, n. 5, \np. 263-76,  2015. \n \nREVELLI, A.  et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical \nmarkers to metabolomics. Reprod Biol Endocrinol, v. 7, p. 40,  2009. \n \nRODGERS, R. J.; IRVING -RODGERS, H. F. Formation of the ovarian follicular \nantrum and follicular fluid. Biol Reprod, v. 82, n. 6, p. 1021-9, 2010. \n \nRUSSELL, W. Aberrant portio ns of the mullerian duct found in an ovary. \nOvarian cysts of mullerian origin: Bull Johns Hopkins Hosp 1899. \n \nSALVI, A.  et al. Structural damage to proteins caused by free radicals: asessment, \nprotection by antioxidants, and influence of protein binding. Biochem Pharmacol, v. \n61, n. 10, p. 1237-42, 2001. \n \nSAMPSON, J. A. Metastatic or Embolic Endometriosis, due to the Menstrual \nDissemination of Endometrial Tissue into the Venous Circulation. Am J Pathol, v. 3, \nn. 2, p. 93-110.43, 1927. \n \nSANCHEZ, A. M.  et a l. Iron availability is increased in individual human ovarian \nfollicles in close proximity to an endometrioma compared with distal ones. Hum \nReprod, v. 29, n. 3, p. 577-83, 2014.  \n \nSANCHEZ, A. M.  et al . The distinguishing cellular and molecular features o f the \nendometriotic ovarian cyst: from pathophysiology to the potential endometrioma -\nmediated damage to the ovary. Hum Reprod Update, v. 20, n. 2, p. 217-30, 2014.  \n \nSANTANAM, N.; ZONERAICH, N.; PARTHASARATHY, S. Myeloperoxidase as a \nPotential Target in Wo men With Endometriosis Undergoing IVF. Reprod Sci, v. 24, \nn. 4, p. 619-626, 2017.  \n \nSANTOS, R. R.; SCHOEVERS, E. J.; ROELEN, B. A. Usefulness of bovine and \nporcine IVM/IVF models for reproductive toxicology. Reprod Biol Endocrinol, v. 12, \np. 117, 2014.  \n \nSANTULLI, P.  et al. Interleukin -19 and interleukin-22 serum levels are decreased in \npatients with ovarian endometrioma. Fertil Steril, v. 99, n. 1, p. 219-26, 2013.  \n \nSASSON, I. E.; TAYLOR, H. S. Stem cells and the pathogenesis of endometriosis. \nAnn N Y Acad Sci, v. 1127, p. 106-15, 2008.  \n \nSCHULZ, H. Beta oxidation of fatty acids. Biochim Biophys Acta, v. 1081, n. 2, p. \n109-20, 1991.  \n \nSCUTIERO, G.  et al. Oxidative Stress and Endometriosis: A Systematic Review of \nthe Literature. Oxid Med Cell Longev, v. 2017, p. 7265238,  2017. \n \n\n97 \n \nSHALGI, R.  et al. Proteins of human follicular fluid: the blood -follicle barrier. Fertil \nSteril, v. 24, n. 6, p. 429-34, 1973. \n \nSHARMA, R. K.; AZEEM, A.; AGARWAL, A. Spindle and chromosomal alterations in \nmetaphase II oocytes. Reprod Sci, v. 20, n. 11, p. 1293-301, 2013.  \n \nSIMÓN, C.  et al. Outcome of patients with endometriosis in assisted reproduction: \nresults from in-vitro fertilization and oocyte donation. Hum Reprod, v. 9, n. 4, p. 725-\n9, 1994.  \n \nSINGH, A. K.  et al. Altered c irculating levels of matrix metalloproteinases 2 and 9 \nand their inhibitors and effect of progesterone supplementation in women with \nendometriosis undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril, v. 100, n. 1, p. 127-34.e1, \n2013a. \n \nSINGH, A. K.  et al . Ma rkers of oxidative stress in follicular fluid of women with \nendometriosis and tubal infertility undergoing IVF. Reprod Toxicol, v. 42, p. 116-24, \n2013b.  \n \nSINGH, A. K.  et al . Intrafollicular interleukin -8, interleukin -12, and adrenomedullin \nare the promis ing prognostic markers of oocyte and embryo quality in women with \nendometriosis. J Assist Reprod Genet, v. 33, n. 10, p. 1363-1372, 2016.  \n \nSINGH, N.  et al. Effect of endometriosis on implantation rates when compared to \ntubal factor in fresh non donor in vitro fertilization cycles. J Hum Reprod Sci, v. 7, n. \n2, p. 143-7, 2014. \n \nSIRARD, M. A.; RICHARD, F.; MAYES, M. Controlling meiotic resumption in bovine \noocytes: a review. Theriogenology, v. 49, n. 2, p. 483-97, 1998.  \n \nSMITH, M. P.  et al. Total cortisol  levels are reduced in the periovulatory follicle of \ninfertile women with minimal-mild endometriosis. Am J Reprod Immunol, v. 47, n. 1, \np. 52-6, 2002. \n \nSOMFAI, T.  et al. Enhancement of lipid metabolism with L -carnitine during in vitro \nmaturation improves nuclear maturation and cleavage ability of follicular porcine \noocytes. Reprod Fertil Dev, v. 23, n. 7, p. 912-20,  2011. \n \nSTADTMAN, E. R. Protein oxidation and aging. Science, v. 257, n. 5074, p. 1220 -4, \n1992. \n \nSUGIURA, K.; PENDOLA, F. L.; EPPIG, J. J. Ooc yte control of metabolic \ncooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. \nDev Biol, v. 279, n. 1, p. 20-30, 2005. \n \nTAMAI, I.  et al. Molecular and functional identification of sodium ion -dependent, high \naffinity human carnitine transporter OCTN2. J Biol Chem, v. 273, n. 32, p. 20378-82, \n1998.  \n \n\n98 \n \nTANBO, T.; FEDORCSAK, P. Endometriosis -associated infertility: aspects of \npathophysiological mechanisms and treatment options. Acta Obstet Gynecol \nScand, v. 96, n. 6, p. 659-667, 2017. \n \nTHOMPSON, J. G.; LANE, M.; GILCHRIST, R. B. Metabolism of the bovine cumulus -\noocyte complex and influence on subsequent developmental competence. Soc \nReprod Fertil Suppl, v. 64, p. 179-90,  2007. \n \nTOMIO, K.  et al. Omega -3 polyunsaturated Fatty acids supp ress the cystic lesion \nformation of peritoneal endometriosis in transgenic mouse models. PLoS One, v. 8, \nn. 9, p. e73085,  2013. \n \nTVRZICKA, E.  et al. Fatty acids as biocompounds: their role in human metabolism, \nhealth and disease --a review. Part 1: classi fication, dietary sources and biological \nfunctions. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, v. 155, n. \n2, p. 117-30, 2011. \n \nVALSANGKAR, D.; DOWNS, S. M. A requirement for fatty acid oxidation in the \nhormone-induced meiotic maturation of mouse oocytes. Biol Reprod, v. 89, n. 2, p. \n43, 2013.  \n \nVAN BLERKOM, J.; DAVIS, P. Differential effects of repeated ovarian stimulation on \ncytoplasmic and spindle organization in metaphase II mouse oocytes matured in vivo \nand in vitro. Hum Reprod, v. 16, n. 4, p. 757-64, 2001. \n \nVAN BLERKOM, J.; DAVIS, P. W.; LEE, J. ATP content of human oocytes and \ndevelopmental potential and outcome after in -vitro fertilization and embryo transfer. \nHum Reprod, v. 10, n. 2, p. 415-24, 1995. \n \nVAN LANGENDONCKT, A.; CASANAS -ROUX, F.; DONNEZ, J. Iron overload in the \nperitoneal cavity of women with pelvic endometriosis. Fertil Steril, v. 78, n. 4, p. 712-\n8, 2002.  \n \nVERCELLINI, P.  et al. Coagulation or excision of ovarian endometriomas? Am J \nObstet Gynecol, v. 188, n. 3, p. 606-10, 2003. \n \nVERCELLINI, P.  et al.. 'Blood On The Tracks' from corpora lutea to endometriomas. \nBJOG, v. 116, n. 3, p. 366-71, 2009. \n \nVERCELLINI, P.  et al. . Endometriosis: pathogenesis and treatment. Nat Rev \nEndocrinol, v. 10, n. 5, p. 261-75, 2014. \n \nVIGANÒ, P.  e t al. Unravelling the ovarian endometrioma pathogenesis: \"The long \nand winding road\" across the various theories.  Journal of Ednometriosis and \nPelvic Pain Disorders. v 5, p 62-67,. 2013. \n \nVOLARCIK, K.  et al. The meiotic competence of in -vitro matured huma n oocytes is \ninfluenced by donor age: evidence that folliculogenesis is compromised in the \nreproductively aged ovary. Hum Reprod, v. 13, n. 1, p. 154-60, 1998. \n \n\n99 \n \nVON RECKLINGHAUSEN, F. Die Adenomyome und cystadenome der uterus und \ntubenwandung: Berli. klin. Wonchenschr. 8 1895. \n \nWAKEFIELD, S. L.  et al. Maternal supply of omega -3 polyunsaturated fatty acids \nalter mechanisms involved in oocyte and early embryo development in the mouse. \nAm J Physiol Endocrinol Metab, v. 294, n. 2, p. E425-34, 2008. \n \nWANG, J.  et al. Follicular fluid levels of prostaglandin E2 and the effect of \nprostaglandin E2 on steroidogenesis in granulosa -lutein cells in women with \nmoderate and severe endometriosis undergoing in vitro fertilization and embryo \ntransfer. Chin Med J (Engl), v. 125, n. 22, p. 3985-90, 2012.  \n \nWANG, W. H.; KEEFE, D. L. Prediction of chromosome misalignment among in vitro \nmatured human oocytes by spindle imaging with the PolScope. Fertil Steril, v. 78, n. \n5, p. 1077-81, 2002. \n \nWATERS, S. M.  et al. Effect of dietar y n -3 polyunsaturated fatty acids on \ntranscription factor regulation in the bovine endometrium. Mol Biol Rep, v. 41, n. 5, \np. 2745-55, 2014.  \n \nWATHES, D. C.; ABAYASEKARA, D. R.; AITKEN, R. J. Polyunsaturated fatty acids \nin male and female reproduction. Biol Reprod, v. 77, n. 2, p. 190-201, 2007. \n \nWITTMANN, T.; HYMAN, A.; DESAI, A. The spindle: a dynamic assembly of \nmicrotubules and motors. Nat Cell Biol, v. 3, n. 1, p. E28-34, 2001. \n \nWU, G.  et al. Intrafollicular inflammatory cytokines but not steroid horm one \nconcentrations are increased in naturally matured follicles of women with proven \nendometriosis. J Assist Reprod Genet, v. 34, n. 3, p. 357-364, 2017.  \n \nWU, G. Q.  et al. L -carnitine enhances oocyte maturation and development of \nparthenogenetic embryos in pigs. Theriogenology, v. 76, n. 5, p. 785-93, 2011.  \n \nWUNDER, D. M.  et al. Steroids and protein markers in the follicular fluid as \nindicators of oocyte quality in patients with and without endometriosis. J Assist \nReprod Genet, v. 22, n. 6, p. 257-64, 2005.  \n \nXU, B.  et al. Oocyte quality is decreased in women with minimal or mild \nendometriosis. Sci Rep, v. 5, p. 10779, 2015. \n \nXU, H.  et al. Regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted \n(RANTES) and monocyte chemotactic protein 1 in fol licular fluid accumulate \ndifferentially in patients with and without endometriosis undergoing in vitro \nfertilization. Fertil Steril, v. 86, n. 6, p. 1616-20, 2006. \n \nYALÇINKAYA, E.  et al. Effect of follicular fluid NO, MDA and GSH levels on in vitro \nfertilization outcomes. J Turk Ger Gynecol Assoc, v. 14, n. 3, p. 136-41,  2013.  \n \nYAZAKI, T.  et al. L -carnitine improves hydrogen peroxide -induced impairment of \nnuclear maturation in porcine oocytes. Anim Sci J, v. 84, n. 5, p. 395-402, 2013.  \n\n100 \n \nZHANG, Q. F.  et al. Relationship between resistin and IL-23 levels in follicular fluid in \ninfertile patients with endometriosis undergoing IVF -ET. Adv Clin Exp Med, v. 26, n. \n9, p. 1431-1435, 2017. \n \nZHANG, X.  et al. Deficit of mitochondria -derived ATP during oxidative stress impairs \nmouse MII oocyte spindles. Cell Res, v. 16, n. 10, p. 841-50, 2006.  \n \nZHOU, H.  et al. Involvement of follicular basement membrane and vascular \nendothelium in blood follicle barrier formation of mice revealed by 'in vivo \ncryotechnique'. Reproduction, v. 134, n. 2, p. 307-17, 2007.  \n \n\n101 \n \n \n \nAPÊNDICES \n \n\n102 \n \nAPÊNDICE A: Caracterização das pacientes doadoras de fluidos foliculares \nutilizados em cada replicata de maturação in vitro de oócitos bovinos \n Grupo Idade IMC Protocolo de EOC Endometrioma \nMIV 1 \nControle 34 24,6 Estimulação mínima - \nEI/II 34 21,9 Estimulação mínima - \nEIII/IV 33 24,7 Estimulação mínima - \nE endometrioma 33 20,9 Estimulação mínima Contralateral \nMIV2 \nControle 36 24,9 Antagonista flexível - \nEI/II 39 21,4 Antagonista flexível - \nEIII/IV 37 24,9 Antagonista flexível - \nE endometrioma 36 22,6 Antagonista flexível Contralateral \nMIV3 \nControle 38 21,7 Estimulação mínima - \nEI/II 37 25,0 Estimulação mínima - \nEIII/IV 33 24,9 Estimulação mínima - \nE endometrioma 34 20,3 Estimulação mínima Contralateral \nMIV4 \nControle 33 27,9 Antagonista flexível - \nEI/II 31 29,8 Antagonista flexível - \nEIII/IV 29 27,6 Antagonista flexível - \nE endometrioma 32 27,4 Antagonista flexível Contralateral \nMIV5 \nControle 37 24,5 Antagonista flexível - \nEI/II 37 27,6 Antagonista flexível - \nEIII/IV 38 28,0 Antagonista flexível - \nE endometrioma 37 20,9 Antagonista flexível Contralateral \nMIV6 \nControle 36 24,6 Antagonista flexível - \nEI/II 35 22,3 Antagonista flexível - \nEIII/IV 29 24,1 Antagonista flexível - \nE endometrioma 38 19,5 Antagonista flexível Ipsilateral \nMIV7 \nControle 36 27,9 Antagonista flexível - \nEI/II 34 27,4 Antagonista flexível - \nEIII/IV 33 27,3 Antagonista flexível - \nE endometrioma 34 29,4 Antagonista flexível Ipsilateral \nMIV8 \nControle 38 29,4 Antagonista flexível - \nEI/II 32 21,6 Antagonista flexível - \nEIII/IV 29 21,7 Antagonista flexível - \nE endometrioma 35 24,5 Antagonista flexível Contralateral \n \n\n103 \n \nAPÊNDICE B: Dados de estágios de maturação nuclear, e porcentagem de oócitos em MII normais de acordo com as oito \nreplicatas de maturação in vitro de oócitos bovinos realizadas. \n Oócitos \nfixados \npós-MIV \nn \nVisualizados \nn \nMI \nn (%) \nT1 \nn (%) \nAP \nn (%) \nMII \nTotal de MII \nn (%) \nAnalisáveis \nn (%) \nNormais \nn (%) \nMIV 1 166 161 37(22,9%)a 3 (1,9%) 0 (0%) 121 (75,2%)c 87 (71,9%)a 71 (81,6%) \nMIV 2 220 198 21 (10,6%)bc 2 (1,0%) 2 (1,0%) 173 (87,4%)ab 110 (63,6%) 90 (81,8%) \nMIV 3 260 230 35 (15,2%)ab 7 (3,0%) 4 (1,7%) 184 (80,0%)bc 126 (68,5%)a 103 (81,7%) \nMIV 4 223 222 26 (11,7%)bc 2 (0,9%) 5 (2,3%) 189 (85,1%)ab 115 (60,8%) 89 (77,4%) \nMIV 5 213 215 14 (6,5%)c 2 (0,9%) 4 (1,9%) 195 (90,7%)a 107 (54,9%)b 80 (74,8%) \nMIV 6 144 100 14 (14,0%) 3 (3,0%) 0 (0%) 83 (83,0%)ab 46 (55,4%)b 35 (76,1%) \nMIV 7 178 150 12 (8,0%)bc 2 (1,3%) 5 (3,3%) 131 (87,3%)ab 74 (56,5%)b 58 (78,4%) \nMIV 8 157 125 8 (6,4%)c 4 (3,2%) 1 (8,0%) 112 (89,6%)a 70 (62,5%) 52 (74,3%) \nNota-se: MIV: maturação in vitro; MI = metáfase I; TI = telófase I; MII = metáfase II; AP = ativação partenogenética. Analisáveis:  oócitos com fuso \nfixado em uma visão lateral ou sagital. Cada replicata foi realizada dividindo o nº de oócitos em 9 grupos ( sem-FF, FFControle, \nFFControle+LC+AG, FFEleve, FFEleve+LC+AG, FFEgrave, FFEgrave+LC+AG, FFendometrioma e FFendometrioma+LC+AG)  Letras diferentes \nna mesma coluna indicam diferença estatística, p<0,05, usando teste de qui-quadrado. \n\n104 \n \n \n \nMANUSCRITO A SER SUBMETIDO PARA \nHUMAN REPRODUCTION \n\n105 \n \nTitle: L-carnitine and omega-3 fatty acids prevent meiotic damages in bovine oocytes 1 \nmatured in vitro with follicular fluid from infertile women with endometriosis 2 \nRunning title: Endometriosis, L-carnitine and omega-3 3 \n 4 \nVSI Giorgi1*; RA Ferriani1,2; PAS Navarro1,2. 5 \n 6 \n1 Human Reproduction Division, Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty 7 \nof Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil. 8 \n2 National Institute of Hormones and Women’s Health,  National Council for Scientific 9 \nand Technological Development (CNPq), Brazil. 10 \n 11 \n*Corresponding author: 12 \nE-mail: vanessasig@gmail.com (VSIG) 13 \n 14 \n 15 \n16 \n\n106 \n \nAbstract 17 \nStudy question: Does supplementation of in vitro maturation (IVM) medium with  L-18 \ncarnitine (LC) and omega -3 fatty acids [docosahexaenoic (DHA) and 19 \neicosapentaenoic acids (EPA)] prevent oocyte damag es induced by follicular fluid 20 \n(FF) from infertile women with endometriosis in early (minimal/mild – EI/II) and 21 \nadvanced stages [moderate/severe (EIII/IV) without or with endometrioma 22 \n(Eendometrioma)]?  23 \nSummary answer:  LC and omega -3 fatty acids prevent da mages on nuclear 24 \nmaturation and on meiotic spindle assembly and chromosome alignment of bovine 25 \noocytes matured in vitro with FF from endometriosis I/II and III/IV stages. 26 \nWhat is known already:  One of the possible mechanisms involved in infertility 27 \nrelated to endometriosis is the poor oocyte quality. During acquisition of oocyte 28 \ncompetence, adequate ATP levels is fundamental to polar body extrusion and 29 \nmeiotic spindle assembly. β -oxidation is an important mitochondrial pathway to 30 \ngenerate ATP from fatty aci ds oxidation, and LC play transferring long -chain fatty 31 \nacids (like omega-3 fatty acids) from cytosol to mitochondrial matriz. 32 \nStudy design, size, duration: Experimental study using bovine model. Thirty two FF 33 \nsamples were obtained of March to October 2013 , and May/2016 to September/2017 34 \nfrom infertile women who underwent ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm 35 \ninjection (ICSI) [8 with EI/II, 8 with EIII/IV, 8 with Eendometrioma and 8 with tubal 36 \nand/or male factor infertility (control group)]. IVM ex periments were performed 37 \nbetween November 2017 and January 2018 using immature bovine oocytes. 38 \nParticipants/materials, setting, methods:  Immature bovine oocytes obtained of 39 \novaries from slaughterhouse were submitted to IVM divided into 9 groups: no FF (No-40 \nFF), with 1% FF from infertile women without endometriosis (CFF), with EI/II, EIII/IV 41 \n\n107 \n \nand Eendometrioma, with the addition of LC and omega -3 fatty acids (LC+n3). Eight 42 \nreplicates were performed using an individual FF of each group. After 22-24 h of IVM, 43 \nthe oocytes were denuded, fixed and fluorescently labelled for the morphological 44 \nvisualization of microtubules and chromatin by confocal microscopy. Nuclear 45 \nmaturation rate and normal methaphase II (MII) rate were analyzed by chi -square 46 \ntest (p<0.05). 47 \nMain results and the role of chance:  Addition of LC+n3 restored maturation rate 48 \nincreasing methaphase II (MII) rate in groups with EIII/IV (80.7% vs 90.8%: 49 \np=0.0190) and Eendometrioma (69.3% vs 86.4%: p=0.0004), and it prevented 50 \ndamages in spindle and chromosome alignment in MII oocytes in groups EI/II (62.2% 51 \nvs 84.5%, p=0.00205) and EIII/IV (70.2% vs 84.1%, p=0.04995). FF from EI/II 52 \n(62.2%), EIII/IV (70.2%) and Eendometrioma (72.7%) decreased normal MII rate 53 \ncompared to No -FF (87.2% vs EI/II: p=0.0002; vs EIII/IV: p=0.0092; vs 54 \nEendometrioma: p=0.0350) and CFF (87.2%  vs EI/II: p=0.0006; vs EIII/IV: p=0.0152; 55 \nvs Eendometrioma: p=0.0486). EI/II (85.4%) did not alter nuclear maturation rate, but 56 \nEIII/IV (80.7%) and Eendometrioma (69.3%) decreased total MII rate compa red to 57 \nNo-FF (91.9% vs EIII/IV: p=0.0068; vs Eendometrioma: p<0.0001) and CFF (89.2% 58 \nvs EIII/IV: p=0.054; vs Eendometrioma: p<0.0001), and Eendometrioma had lower 59 \ntotal MII rate compared to another groups including EIII/IV (p=0.0268) 60 \nLimitations, reasons for caution: Due to the rigorous criteria for the selection of FF 61 \ndonors, the sample size of the present study was small. We used FF from women 62 \nwho underwent ovarian stimulation, a fact that renders questionable the extrapolation 63 \nof the result to natural cy cles. In addition, this was an experimental study; therefore, 64 \nstudies using in vivo matured oocytes from infertile women with endometriosis will be 65 \nimportant to confirm the present results. 66 \n\n108 \n \n Wider implications of the findings: The present results elucidate  part of the 67 \netiopathogenic mechanisms of infertility related to endometriosis, suggesting that 68 \noxidative stress and β -oxidation alterations are factors involved in worst of oocyte 69 \nquality in women with endometriosis. We observed which FF from endometriosi s, 70 \nregardless of stage of disease, damages meiotic spindle assembly and chromosome 71 \nalignment of bovine MII oocytes; however, EIII/IV (with and withou endometrioma) 72 \nalso had nuclear maturation impairment, and presence of endometrioma had further 73 \nnegative im pact in oocyte maturation. Besides that, we demonstrated that LC+n3 74 \nsupplementation during IVM fully prevented the deleterious effects of the FF from 75 \nwomen with endometriosis on the nuclear maturation and oocyte spindle, and 76 \ntherefore, we ask whether the u se of LC and ômega -3 could improve the natural 77 \nfertility and/or the results of in vitro fertilisation of women with endometriosis. 78 \n Study funding/competing interest(s):  This study was supported by  the 79 \nCoordination of Improvement of Higher Level Personnel, Brazil. The authors declare 80 \nno conflict of interest. 81 \nTrial registration number: Not applicable. 82 \nKey words:  Endometriosis; Female infertility; Follicular fluid; Oocyte quality; L -83 \ncarnitine; Omega -3; Docosahexaenoic acid; Eicosapentaenoic acid; Antioxidant; β-84 \noxidation. 85 \n86 \n\n109 \n \nIntroduction 87 \nEndometriosis is a gynecological, inflammatory and estrogen dependent 88 \ndisease, characterized by the presence and growth of endometrial tissue (glands and 89 \nstroma) outside the uterine cavity (Kennedy, et al., 2005) . The prevalence of 90 \nendometriosis is 25 -50% in the population of infertile women, and among women 91 \nwith endometriosis, approximately 30-50% have problems with infertility (Missmer, et 92 \nal., 2004).  93 \nThe American Society of Medicine Reproductive (ASRM) classif ies 94 \nendometriosis in 4 stages: minimal (I), mild (II), moderate (III) and s evere (IV) 95 \n(ASRM, 1997) . In most of cases of endometriosis in advanced stages (III/IV), it is 96 \neasy justify infertility due to pelvic anatomical alterations by adhesions, deep lesion 97 \nand endometrioma, hampering ovulation, the tubal transport of the embryo and, 98 \npossibly, the embryonic implantation (de Ziegler, et al., 2010) . However, even in the 99 \ninitial cases of endometriosis (I/II), when there is no anatomical alteration of the 100 \npelvic cavity, a decrease in the monthly fertility rate is reported (Bérubé, et al., 1998, 101 \nParazzini, 1999). 102 \nAlthough controversial, studies have suggested worsening of oocyte quality as 103 \none of the events responsible for the infertility related to endometriosis (Barcelos, et 104 \nal., 2009, Da Broi, et al., 2014, Mansour, et al., 2010, Pellicer, et al., 2001) , but the 105 \nmechanisms leading to this impairment is unknown (Dı́az, et al., 2000, Simón, et al., 106 \n1994). Study using oocyte donation program reported similar implantation and 107 \npregnancy rates in women with and without endometriosis who received oocytes 108 \nfrom endometriosis -free donor, however, implantation rates were lower in women 109 \nwithout the disease who received oocytes from women with endometriosis (Simón, et 110 \nal., 1994). 111 \n\n110 \n \nHuman oocytes are extremely rare and their use in  invasive studies is 112 \ngenerally not feasible because it prevents their use in Assisted Reproductive 113 \nTechniques (ART). Thus, studies evaluating cumulus cells or follicular fluid (FF) could 114 \nhelp understanding the acquisition of oocyte competence (Da Broi, et al., 2018). 115 \nAddition of FF from infertile women with mild endometriosis to the in v itro 116 \nmaturation (IVM) medium of bovine oocytes compromises the quality of bovine 117 \noocytes (evaluated through chromosomal alignment and meiotic spindle 118 \norganization) when compared to the addition of FF from infertile women without 119 \nendometriosis (Da Broi, Malvezzi, Paz, Ferriani and Navarro, 2014). The antioxidants 120 \nL-carnitine (LC) and N-acetyl-cysteine (NAC) prevented such meiotic oocyte damage, 121 \nindicating that oxidative stress (OS) is involved in the etiopathogenesis of 122 \nendometriosis-related infertility, however, LC was superior to NAC, preventing, 123 \ncompletely such damage (Giorgi, et al., 2016). 124 \nLC, in addition to its antioxidant function, plays a fundamental role in cell 125 \nenergy generation, since its main biological function is to transport long chain fatty 126 \nacids from the cytosol to the mitochondria where β-oxidation occurs, a process that 127 \nresults in the esterification of LC to form acyl -Carnitine derivatives, producing energy 128 \nin the form of ATP (Evans and Fornasini, 2003) . Ꞵ-oxidation is essential for the 129 \nresumption of oocyte meiosis and nuclear maturation in mice (Downs, et al., 2009, 130 \nPaczkowski, et al., 2013, Valsangkar and Downs, 2013) , swine and cattle 131 \n(Paczkowski, Silva, Schoolcraft and Krisher, 2013). 132 \nOxidation of a molecule of fatty acid (palmitic acid) generates approximately 133 \n106 ATPs compared to 30 ATPs produced by oxidation of a glucose molecule 134 \n(Dunning, et al., 2014) . Fatty acids can be cl assified as saturated, monounsaturated 135 \nand polyunsaturated (PUFA). Mammals, including humans, fail to synthesize 136 \n\n111 \n \nadequate amounts of omega -3 and omega -6 PUFAs (Wathes, et al., 2007) . Two 137 \nimportant omega -3 fatty acids are: docosahexaenoic acid (DHA) and 138 \neicosapentaenoic acid (EPA). 139 \nThere are two studies evaluating the addition of omega -3 to the IVM medium  140 \nof bovine oocyte (Nikoloff, et al., 2017, Oseikria, et al., 2016) . Oseikria et al. (2016) 141 \nshowed that, at low concentrations, DHA increases oocyte competence assessed by 142 \nincreased cleavage rates and blastocyst form ation after parthenogenetic activation. 143 \nNikoloff et al. (2017) showed that the addition of EPA improves the oocyte quality 144 \nobserved by increased cumulus cell expansion. 145 \nThere are no studies in the literature evaluating the impact of the 146 \nendometriosis stage on oocyte quality and the possible prevention of oocyte damage 147 \nwith the combined administration of LC, DHA and EPA.  Therefore, our primary 148 \nobjective was to evaluate the impact of the addition of LC and DHA/EPA (n3) to the 149 \nIVM medium containing FF from inf ertile women with and without endometriosis on 150 \nnuclear maturation and organization of the meiotic spindle and chromosomes in 151 \nbovine oocytes by confocal microscopy. And as secondary objective, we evaluated 152 \nthe impact of the endometriosis stage on bovine ooc yte quality (nuclear maturation 153 \nand organization of the meiotic spindle and chromosomes) by adding FF from 154 \nwomen with and without endometriosis in the early and advanced stages (with and 155 \nwithout endometrioma) to the IVM medium of bovine oocytes. 156 \n157 \n\n112 \n \nMaterials and Methods 158 \nWe performed an experimental study previously approved by the Research 159 \nEthics Committee of the Hospital das Clínicas of the Medical School of Ribeirão 160 \nPreto (HC -FMRP), University of São Paulo (USP) (Process HCRP nº 12201/2008) 161 \nand by the Ethic s Committee in Animal Experimentation of FMRP - USP (nº 162 \n169/2008).  163 \nWe used bovine ovaries from local slaughterhouse. And bovine model was 164 \nchose due to the similarity in human and bovine ovarian size and morphology, 165 \nbecause both species are mono -ovulatory and polycyclic and because it is an 166 \nabundant material, low cost, easily manipulated (Malhi, et al., 2005, Santos, et al., 167 \n2014). 168 \n 169 \nPatient selection and follicular fluid collection 170 \nFF samples were obtained during March to October/2013 and May/2016 to 171 \nSeptember/2017 from infertile women who underwent ovarian stimulation for 172 \nintracytoplasmic sperm injection (ICSI) in the Sector of Human Reproduction, 173 \nDepartment of Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribei rão Preto, 174 \nUniversity of São Paulo (FMRP -USP). All patients gave written informed consent to 175 \nparticipate.  176 \nInclusion criteria were as follows: age <40 years; body mass index (BMI) ≤ 30 177 \nkg/m²; serum concentration of follicle stimulating hormone (FSH) on the third day of 178 \nthe menstrual cycle ≤ 12 mIU/mL; absence of chronic anovulation; presence of 179 \nhydrosalpinx or of chronic diseases such as diabetes mellitus or any other 180 \nendocrinopathy; absence of cardiovascular disease; absence of dyslipidemia; 181 \nabsence of systemic lupus erythematosus or any other rheumatologic disease; 182 \n\n113 \n \nabsence of HIV infection or any active infection; be no -smoking; have not use 183 \nvitamins, hormonal or non -hormonal medications during a period of 6 months before  184 \nthe inclusion in the study; have undergone to a videolaparoscopy examination. 185 \nThe control group consisted of infertile women due to tubal factors and/or 186 \nwhose mate had infertility (male factor). All patients were s ubmitted to 187 \nvideolaparoscopy examination for inspection of the pelvic / abdominal cavity and 188 \nexclusion of endometriosis. 189 \nThe endometriosis group was subdivided into early stage endometriosis 190 \n(minimal or mild, EI/II) and advanced endometriosis (moderate or severe) without 191 \n(EIII/IV) or with endometrioma in the cycle (Eendometrioma). Previous 192 \nvideolaparoscopy was performed for the diagnosis and classification of 193 \nendometriosis according to ASRM criteria (Asrm, 1997). Eendometrioma group 194 \npresented endometrioma in the cycle visualized by transvaginal ultrasonography. 195 \n 196 \nProtocol of controlled ovarian stimulation 197 \nAccording to the characteristics of each patient, two distinct protocols of 198 \ncontrolled ovarian stimulation (COS) were applied as described below: 199 \n- Flexible antagonist protocol: gonadotrophins (150 -300 IU / day) were 200 \nadministered in the first six days of COS, with the dose adjusted daily according to 201 \nfollicular growth.  202 \n- Minimal stimulation protocol (clomiphene citrate plus gonadotrophins and 203 \nGnRH antagonist ): clomiphene citrate (100 mg / day) was administered during the 204 \nfirst five days of COS and gonadotrophins (150 IU / day) were given on days two and 205 \nfour, and daily from day six. 206 \n\n114 \n \nThe GnRH antagonist (ganirelix or cetrorelix 0.25 mg/day) was started when 207 \nthe mean diameter of the largest follicle was ≥ 14 mm.  Recombinant hCG (250 μg, 208 \nOvidrel®, Serono, Brazil) or urinary hCG (10,000 IU, Choriomon®, Meizler, Brazil) 209 \nwas administered when at least one follicle with a mean diameter of 18 mm was 210 \npresent. Oocytes w ere collected 34 to 36 hours after the administration of 211 \nrecombinant hCG, and the luteal phase was maintained by administration of 212 \nmicronized progesterone (600 mg / day). 213 \nBefore COS, oral contraceptive (Miranova®, Bayer or Level®, Biolab) was 214 \nprescribed for all patients with the goal of synchronizing and scheduling the start of 215 \nthe COS. 216 \n 217 \nCollection and processing of FF samples 218 \nFF samples were obtained during oocyte recovery to perform ICSI. To avoid 219 \npossible interference of successive ovarian punctures, FF was obtained from the first 220 \nfollicle (diameter ≥ 15 mm) of the first ovary punctured. 221 \nThese samples were immediately taken to the embryology laboratory, where 222 \nembryologists checked for the presence of oocytes and/or granulosa cells. Oocytes 223 \nwere separated from the FF for use during ART and the FF was centrifuged at 300 g 224 \nfor 10 minutes, aliquoted and stored at -80ºC. 225 \n  Samples that did not contain oocyte and/or granulosa cells were excluded, 226 \nsince in these cases it would not be possible to state that the ov arian follicle 227 \npunctured had an oocyte in the process of maturation. 228 \nFF was collected from 39 infertile women, 12 withou t endometriosis, 8 with 229 \nEI/II, 11 with EIII/IV without endometrioma and 8 with endometrioma. 230 \n\n115 \n \nFor this study, FF sample of each patient w as used ju st one time in each 8 231 \nbovine IVM performed. 232 \n 233 \nOocyte collection  234 \nBovine ovaries were collected immediately after slaughter and transported in 235 \nphysiological saline at 35 -38.5ºC. In the laboratory, follicles measuring 2 to 8 mm 236 \nwere aspirated and on ly cumulus-oocyte complexes (COCs) with homogeneous 237 \ncytoplasm and at least three layers of cumulus oophorus cells were selected (Adona 238 \nand Lima Verde Leal, 2004, Ferreira, et al., 2009). 239 \n 240 \nIn vitro maturation (IVM) 241 \nCOCs were cultured in 400 µL drops of culture medium for IVM (approximately 242 \n20 oocytes per drop) at 38.5ºC, 95% humidity and 5% CO 2 (Adona and Lima Verde 243 \nLeal, 2004, Ferreira, Vireque, Adona, Ferriani and Navarro, 200 9, Hashimoto, et al., 244 \n2002) in a culture system without mineral oil. The IVM medium used was TCM -199 245 \ncontaining Earle’s salts and bicarbonate (Invitrogen, Gibco Laboratories Life 246 \nTechnologies, Inc., Grand Island, NY, USA) supplemented with 0.4 mM sodium 247 \npyruvate, 0.5 µg/mL gentamicin, 5 µg/mL FSH, 2.5 UI/mL hCG (Chorulon®), 1 µg/mL 248 \nestradiol and 10% foetal calf serum (FCS; Gibco). 249 \nDuration of IVM was 22-24 h. 250 \n 251 \nPreparation of antioxidant (N-acetyl-cysteine and L-carnitine) solutions 252 \nL-carnitine 253 \nThe concentration of LC (Sigma Aldrich C0283) used to supplement the IVM 254 \nexperiments as described below was 0.6 mg/mL  (Giorgi, Da Broi, Paz, Ferriani and 255 \n\n116 \n \nNavarro, 2016, Mansour, et al., 2009) . The stock solution was prepared at  a 256 \nconcentration 100 times higher than the working solution (stock solution: 60 mg/mL 257 \nLC) with injection water, filtered through a 0.22 μm pore filter, aliquoted and stored at 258 \n-20 ° C. 259 \n 260 \nOmega 3 Fatty Acids 261 \nThe final concentration of omega -3 fatty acids use d to supplement the IVM 262 \nexperiments as described below was 1 nM (Nikoloff, Pascua, Anchordoquy, 263 \nAnchordoquy, Sirini, Seoane and Furnus, 2017) . Being that 0.4 nM was DHA (Sigma 264 \nAldrich D2534) and 0.6 nM EPA (Sigma Aldrich E2011). The  ratio of 2:3 DHA/EPA 265 \nwas chosen based on the composition of commercial supplements based on fish oil 266 \n(Omega-3 Essential® brands: Sidney Oliveira®, Equaliv®, Country Life®, Solgar®, 267 \nCatarienense® ) and supplements used in randomized clinical trials [180 mg  of EPA 268 \nand 120 mg of DHA for women with polycystic ovary syndrome who wanted to 269 \nperform ART (Nadjarzadeh, et al., 2015) , 1200 mg of EPA and 800 mg of DHA for 270 \nobese women (Haghiac, et al., 2015), 180 mg of EPA and 120 mg of  DHA for young 271 \nwomen with dysmenorrhea (Rahbar, et al., 2012)]. 272 \nStock solutions of the fatty acids were prepared in a concentration 100 fold 273 \nhigher than the final concentrations (stock solutions: 40 nM DHA and 60 nM EPA) 274 \nwith DMSO, filtered through a 0.22 μm pore filter and stored at -20 ° C. 275 \n 276 \nFixation and immunofluorescence for the visualization of microtubules and 277 \nchromosomes 278 \nAfter IVM, cumulus cells were separated from the oocytes by pipetting. The 279 \noocytes we re fixed and left to stand for 30 minutes in a buffer for microtubule 280 \n\n117 \n \nstabilization (Ferreira, Vireque, Adona, Ferriani and Navarro, 2009, Liu, et al., 1998) . 281 \nThe oocytes were washed and blocked during 2 hours at 37 ºC in washing medium 282 \nconsisting of phosphate buffer saline (PBS) supplemented with 0.02% NaN 3, 0.01% 283 \nTriton X-100, 0.2% defatted dry milk, 2% goat serum, 2% bovine serum albumin, and 284 \n0.1 M glycine. The oocytes were incubated overnight at 4ºC with an anti -β-tubulin 285 \nmurine monoclonal antibody (1:1000) and were washed and incubated with a 286 \nsecondary fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti -mouse IgG antibody 287 \n(1:500. Zymed Laboratories, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) at 38.5ºC for 2 h. The 288 \noocytes were submitted to an additional washing and were labelled with Hoechst 289 \n33342 (10 mg/mL) in Vectashield mounti ng medium (H -1000, Vector, Burlingame, 290 \nCA, USA) on a glass slide covered with a coverslip. The samples were visualized 291 \nusing a high -performance confocal microscope (Confocal Leica TCS SP5, Leica 292 \nMicrosystems, Mannheim, Germany) at 40X magnification with 40 5 nm Diode UV 293 \nand 543 nm HeNe lasers. 294 \n 295 \nOocyte classification based on meiotic spindle morphology and chromosome 296 \nalignment 297 \nBased on the stage of nuclear maturation, the oocytes were classified as 298 \nmetaphase I (MI), telophase I (TI) or metaphase II (MII), or as parthenogenetically 299 \nactivated (PA). MII oocytes were subdivided into analyzable and non -analyzable 300 \ngroups according to the position of visualization of the metaphase plate.  The oocytes 301 \nwere considered analyzable  when the meiotic spindle was visualized i n a lateral or 302 \nsagittal position and non -analyzable when the spindle was observed in a polar 303 \nposition  (Ju, et al., 2005) . MII oocytes were classified as “normal” when they 304 \nexhibited a barrel-shaped meiotic spindle with microtubules organized from one pole 305 \n\n118 \n \nto the other, chromosomes aligned on the metaphase plate at the equator of the 306 \nspindle (Figure 1D) and the presence of a polar body (PB), or classified as 307 \n“abnormal” when they showed an altered meiotic spindle (reduced longitudinal 308 \ndimension, disorganized or absent microtubules, dispersed or dislocated from the 309 \nplane of the metaphase plate) (Figure 1A -C). PA was characterized by the 310 \nspontaneous extrusion of a second PB without the occurrence of fertilization or 311 \ntelophase II. 312 \n 313 \n\n119 \n \nFigure 1: Classification of bovine oocytes matured in vitro, in metaphase II, according to the \norganization of the meiotic spindle and chromosomal alignment analyzed by confocal \nmicroscopy. A -) to C -) represent abnormal and D -) normal MII.  \n \nNote: A -) Normal spindle, misaligned chromosomes; B -) Incomplete spindle and aligned \nchromosomes; C -) Ab normal spindle and misaligned chromosomes and D -) Normal spindle and \naligned chromosomes (normal MII). In green, meiotic spindle labeled with monoclonal antibody anti -β-\ntubulin and secondary antibody conjugated to FITC. In blue, label for genetic material wi th Hoechst \n33342. White bar in lower right corner: 10 μm scale. White arrow indicates misaligned chromosomes  \n 314 \nExperimental design 315 \nFigure 2 illustrates the experimental design performed in this study. 316 \n 317 \n\n120 \n \nFigura 2: Experimental design 318 \n 319 \nStatistical analysis 320 \nData were analyzed using RStudio software version 1.0.153, 2009 -2017 [R 321 \nCore Team (2017). A: A language and environment for statistical computing. R 322 \nFoundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R -323 \nproject.org/]. The results were presented in a table. 324 \nThe categorical variables (percentage of MI, percentage of TI, percentage of 325 \nPA, percentage of MII, percentage of MII analysable, percentage of normal MII) were 326 \ncompared between the groups using the chi-square test, with the level of significance 327 \nset at p< 0.05. 328 \n 329 \nSample Calculation 330 \nBased on previous studies by our group (Da Broi, Malvezzi, Paz, Ferriani and 331 \nNavarro, 2014, Giorgi, Da Broi, Paz, Ferriani and Navarro, 2016) that demonstrated a 332 \n\n121 \n \ndifference in the percentage of normal MII of ~ 30% between the No -FF and FFEI/ II 333 \ngroups, and considering a test power of 80% (β = 0.2 and α = 0.05), a total of 87 334 \nanalyzing oocytes per group could be required. Therefore, our test power ranged 335 \nfrom 68-83%. 336 \n 337 \nResults 338 \nEight IVM experiments were performed, and one FF sample of each group  339 \nwas used individually in each of the experiments. 340 \n 341 \nFlow-chart of selection of FF donors 342 \nFigure 3 represents Flow-chart of selection of FF donors. 343 \nFigure 3: Flow-chart of recruitment of patients donors of follicular fluid 344 \n 345 \n\n122 \n \nA total of 39 FF samples were pr ocessed and stored at -196 ° C until further 346 \nuse. The choice of samples in each experiment was chosen based on age, BMI and 347 \nCOS protocol. Table 1 shows characteristics of FF donors used in each group. 348 \nTable 1: Clinical variables, response to controlled ovarian stimulation, and ICSI results of infertile donor 349 \nwomen with no endometriosis (control), with endometriosis in the early stages (EI / II) and in advanced 350 \nstages without endometrioma (EIII / IV) and with endometrioma (Eendometrioma) 351 \n  Control  \n(n=8) \nE I/II  \n(n=8) \nE III/IV  \n(n=8) \nE \nendometrioma  \n(n=8) \n \nAge (years) 36 (35.5 – \n37.3) 34 (33.5 - 37) 33 (29 - 34) 34.5 (33 – \n36.3) p =0.1907 \nBMI (kg/m²) 24.6 (23.8 – \n27.9) 21.9 (21.8 - 27.4) 24.8 (24.6 – \n27.3) \n21.8 (20.8 – \n25.2) p =0.3259 \nFSH (UI/L) 8.2 (7.9 – 9.7) 4.4 (4.4 – 5.3) 5.2 (3.8 – 7.8) 5.6 (4.1 - 8.4) p= 0.1890 \nDuration of \ninfertility \n(months) \n114 (93 - \n135)* 84 (81 - 84) 108 (66 - 111) 48 (45 - 60)* *p=0.0275 \nTime vlpsc and \nCOS (months) \n57 (53.8 – \n70.5) 23 (32.8 - 75) 68 (10.3 - 79) 34 (30 – 49.5) p =0.3282 \nBasal CFA (n) 8.0 (7.5- 8) 7 (7 – 9.5) 9.0 (3.8 - 11) 8.0 (3- 13) p=0.9533 \nEndometrium \n(mm) 3.3 (2.9 – 3.9) 7.3 (2.9 – 5.5) 4.6 (3.2 – 6.9) 4.5 (3.4 – 5.2) p=0.6850 \nCOS duration \n(dias) 8 (8 – 9.3) 9 (9 – 10.5) 10 (9 - 10) 10 (9.5 – 11.3) p=0.2115 \nRecovery \noocytes (n) 3 (2 - 4) 4 (3.8 – 5.5) 4 (3.5 - 8) 2 (1 – 4.3) p =0.1873 \nMature oocytes \n(n) 3 (2 – 3.3) 4 (3.8 – 5.5) 4 (3.5 – 7.5) 2 (1 – 4.3) p =0.2084 \nNote: The variables are reported as median and interquartile ran ges. BMI: body mass index; FSH: \nfollicle stimulating hormone; CFA: count of antral follicles; COS: controlled ovarian stimulation ; \nvlpsc: videolaparoscopy. Compared groups by Kruskall Wallis test with Dunn post test (p <0.05).  \n 352 \nIn vitro maturation and confocal microscopy 353 \n\n123 \n \nDuring the 8 IVM experiments performed between November 2017 and 354 \nJanuary 2018, a total of 1686 immature COCs were submitted to IVM. After IV M, 355 \ncumulus cells were removed , a total of 1561 oocytes were fixed for 356 \nimmunofluorescence and 1401 oocytes were visualized by confocal microscopy (167 357 \noocytes were in MI, 25 in TI, 1188 in MII and 21 were parthenogenetically activated). 358 \nOf the 1188 oocytes in MII, 735 were considered analyzable (ie, viewed in a sagittal 359 \nor lateral position) and 453 were considered non-analyzing (polar view). 360 \nThere were no differences in the TI (p = 0.05467), AP (p = 0.8854) and 361 \nanalyzable MI (p = 0.5651) among the nine experimental groups (Table 2).  362 \nAbout MI rate,  No-FF group ( 6.0%) had similar rate to FFC (6.1%, p = 1),  363 \nFFC+LC+n3 (11.7%, p=0.1277 ), FFEI/II (12.7%, p=0.07406) , FFEI/II+LC+n3 (9.8%, 364 \np=0.3085), FFEIII/IV+LC+n3 (7.7%, p=0.3085), and FFEndometrioma+LC+ n3 365 \n(11.1%, p=0.166). The MI rate was lower in the  No-FF and FFC groups when 366 \ncompared to the FFEIII/IV (16.9%; vs No-FF: p=0.00504; vs FFC: p = 0.00537) and 367 \nFFEndometrioma (24.7%, vs No-FF: p<0.0001, vs. FFC: p<0.0001). The addition of 368 \nLC and omega -3 did not alter the MI rate in the FFC (6.1% vs 11.7%, p=0.192) and 369 \nFFEI/II (12.7% vs 9.8%, p=0.5288). However, the FF EIII/IV+LC+n3 group presented 370 \na lower MI rate than FFEIII/IV (7.7% vs 16.9%, p=0.0259), as well as 371 \nFFEendometrioma+LC+n3 and FFEendometrioma (11,1% vs 24.7%, p=0.0028). 372 \nThe MII rate was 91.9% in the No-FF group, being similar to  FFC group 373 \n(89.2%, p=0.5389) , FFC+LC+ n3 (84.7%, p=0.06992),  FFEI/II (85.4%, p=0 .1069), 374 \nFFEI/II+LC+n3 (85.3%, p=0 .09598), FFEIII/IV+LC+n3 (90.8%, p=0.1069)  and 375 \nFFEndometrioma+LC+n3 (86.4%, p = 0.1681). The lowest MII rate was found in the 376 \nFFEndometrioma group (69.3%), which differed f rom the other 8 groups ( vs No-FF: 377 \np<0.0001; vs FFC: p<0.0001; vs FFC+LC+n3: p=0.00194, vs FFEI/II: p=0.00114, vs 378 \n\n124 \n \nFFEI/II+LC+n3: p=0.00117, vs FFEIII/IV: p=0.02681, vs FFEIII/IV+LC+n3: p<0.0001; 379 \nvs FFEndometrioma+LC+n3: p=0.00044). The No-FF group had a hig her rate of MII 380 \ncompared to the FFEIII/IV group (80.7%, p=0.00681). The FFC group (89.2%) 381 \npresented MII rate similar to the FFC+LC+ n3 group (89.2%, p=0.3122), as well as 382 \nthe FFEI/II+LC+ n3 group (85.3%) was similar to the FFEI/II group (85.4%, p = 1). 383 \nHowever, the addition of LC and omega -3 in the FFEIII/IV and FFEendometrioma 384 \ngroups increased the rate of MII [(FFEIII/IV vs. FFEIII/IV+LC+ n3: p=0.0190) and 385 \n(FFEendometrioma vs FFEendometrioma+LC+n3: p=0.0004)]. 386 \nThe percentage of meiotic normal MII was 87.2% in  the No-FF group, being 387 \nsimilar to the FFC (87.2%, p=1), FFC+LC+ n3 (82.5%, p=0 .54), FFEI/II+LC+n3 388 \n(84.5%, p = 0.7615) , FFEIII/IV+LC+n3 (84.1%, p=0.7122) and 389 \nFFEndometrioma+LC+n3 (7 5.3%, p =0.0623). The percentage of normal MII in the 390 \nNo-FF group was signifi cantly higher than FFEI/II (62.2%, p=0.00023), FFEIII/IV 391 \n(70.2%, p=0.0092) and FFEndometrioma (72.7%, p=0.03497). The percentage of 392 \nnormal MII in the FFC was also significantly higher than FFEI/II (p=0.00059), 393 \nFFEIII/IV (p=0.01523) and FFEndometrioma group s (p=0.0486). The addition of LC 394 \nand omega-3 fatty acids during IVM did not alter the  rate of normal MII in the FFC 395 \ngroup (p=0.5792) and FFEndometrioma (p=0.865), but  LC+n3 increased the rate in 396 \nthe FFEI/II (p=0.00205) and FFEIII /IV (p=0.04995). Although t he FFEndometrioma 397 \n(72.7%) and FFEndometrioma+LC +n3 (75.3%) groups had similar  percentage of 398 \nnormal MII (p=0.865), the FFEndometrioma+LC+ n3 group had similar normal MII 399 \npercentage to the No-FF (p = 0.062) and FFC (p = 0.083).400 \n\n125 \n \nTable 2: Stages of nuclear maturation, and percentage of normal MII oocytes matured in vitro in medium without folicular fluid (no-FF), with addition of 1% FF from \ninfertile patients without endometriosis (FFC), with early endometriosis (FFEI/II), with advanced endometriosis without (FFEIII/IV) or with endometrioma \n(FFEendometrioma), supplemented with 0.6mg/mL L-Carnitine, 0.4nM docosahexaenoic acid, and 0.6 nM eicosapentaenoic acid (LC+n3) visualized by confocal \nmicroscopy. \n Fixed \noocytes \nafter IVM \nn \nViewed by \nconfocal \nn \nMI \nn (%) \nTI \nn (%) \nPA \nn (%) \nMII \nTotal MII \nn (%) \nAnalyzable \nn (%) \nNormal \nn (%) \nNo-FF 167 149 9(6.0%)a 2 (1.3%) 1 (0.7%) 137 (91.9%)a 94 (68.6%) 82 (87.2%)a \nFFC 163 148 9 (6.1%)a 5 (3.4%) 2 (1.4%) 132 (89.2%)ab 78 (59.1%) 68 (87.2%)a \nFF+LC+n3 179 163 19 (11.7%)ab 3 (1.8%) 3 (1.8%) 138 (89.2%)ab 80 (58.0%) 66 (82.5%)ab \nFFEI/II 178 158 20 (12.7%)ab 1 (0.6%) 2 (1.3%) 135 (85.4%)ab 82 (60.7%) 51 (62.2%)c \nFFEI/II \n+LC+n3 186 163 16 (9.8%)ab 4 (2.5%) 4 (2.5%) 139 (85.3%)ab 84 (60.4%) 71 (84.5%)ad \nFFEIII/IV 185 166 28 (16.9%)bc 2 (1.2%) 2 (1.2%) 134 (80.7%)b 84 (62.7%) 59 (70.2%)bc \nFFEIII/IV \n+LC+n3 163 142 11 (7.7%)a 1 (0.7%) 1 (0.7%) 129 (90.8%)a 82 (63.6%) 69 (84.1%)ad \nFFEndometrioma 163 150 37 (24.7%)c 7 (4.7%) 2 (1.3%) 104 (69.3%)c 66 (63.5%) 48 (72.7%)bcd \nFFEndometrioma \n+LC+n3 177 162 18 (11.1%)ab 0 (0%) 4 (2.5%) 140 (86.4%)ab 85 (60.7%) 64 (75.3%)abc \nNote: IVM: in vitro maturation; MI=metaphase I; TI=telophase I; MII=metaphase II; P A=parthenogenetic activation. Analyzable: oocytes with sp indles fixed in \nlateral or sagittal view. Data are results of 8 replicates using follicular fluid from control patients, with mild endometrio sis, with severe endometriosis without \nendometrioma and with endometrioma. Different letters in the same column ind icate statistical difference, p <0.05, using chi-square test. \n\n126 \n \nDiscussion 401 \nDespite the close relationship between endometriosis and infertility, the 402 \netiopathogenic mechanisms involved in the reduction of the natural fertility of these 403 \nwomen remain unknown.  In this study, we demonstrated that the FF of infertile 404 \nwomen with endometriosis when added to the IVM medium of bovine oocytes causes 405 \na decrease in oocyte quality (assessed in this study by nuclear maturation  blocking 406 \nand impairment of spindle organizati on and oocyte chromosomes in MII) when 407 \ncompared FF of infertile women without the disease. The presence of endometrioma 408 \nin the EOC cycle has an even more detrimental impact on oocyte quality, mainly 409 \naffecting nuclear maturation. The addition of LC and omeg a-3 fatty acids (DHA and 410 \nEPA) prevented such damage, highlighting the role of EO and β -oxidation alterations 411 \nin worsening oocyte quality in early and advanced endometriosis women (with and 412 \nwithout without endometrioma). 413 \nRegardless of the stage, our finding s, using bovine experimental model, show 414 \nthat endometriosis affects oocyte quality by reducing the percentage of oocytes in MII 415 \nwith normal spindle and aligned chromosomes compared to the no-FF and FF control 416 \ngroups. The meiotic spindle of oocytes is a dyn amic structure, which aligns and 417 \nsecretes the chromosomes during meiosis, f ormed by the polymerization of α and β 418 \nsubunits of the tubulin protein associated with more than 100 other proteins 419 \n(Wittmann, et al., 2001) . Several factors may alter the spindle, with EO being one of 420 \nthem (Sharma, et al., 2013) . Excess free radicals can directly damage spindle 421 \nproteins (and other cellular macromolecules, such as DNA)  (Salvi, et al., 2001)  and 422 \nmay also alter the membrane potential of the mitochondria, leading to a decrease in 423 \nATP production and consequent destruction of the meiotic spindle  (Zhang, et al., 424 \n2006). 425 \n\n127 \n \nOur findings corroborate previous findings from our group, demonstrating that 426 \naddition of 1% FF from infertile women with endometriosis in early stages to the IVM 427 \nmedium of bovine oocytes impairs the meiotic spindle arrangement and the 428 \nchromosomal alignment of oocytes in MII (Da Broi, Malvezzi, Paz, Ferriani and 429 \nNavarro, 2014, Giorgi, Da Broi, Paz, Ferriani and Navarro, 2016) . For the first time, 430 \nwe showed that FF of infertile women with advanced endometriosis (with and without 431 \nendometrioma) also compromised the meiotic normality of bovine oocytes submitted 432 \nto IVM in the presence of these FF at the concentration of 1%. 433 \nHowever, Hamdan et al. (2016), using murine model, did not observe meiotic 434 \nspindle alteration and chromosomal alignment when oocytes were matured with FF 435 \nfrom women with severe endometriosis; disagreei ng with our results. In the study by 436 \nHamdan et al. (2016), FF donors were previously submitted to videolaparoscopy for 437 \ndiagnosis, treatment and staging of endometriosis according to the ASRM criteria. 438 \nHowever, there was no mention of the presence of infert ility and endometrioma as 439 \ncriteria for inclusion / exclusion. Other differences between the present study and the 440 \nwork of Hamdan and collaborators (2016) are: incubation time and FF concentration 441 \nused (Hamdan and coworkers incubated the oocytes at a concen tration of 15 -50% 442 \nFF for 18h). Thus, we hypothesize that the disagreement of results between our 443 \nstudy and the study by Hamdan and collaborators (2016) regarding the organization 444 \nof the meiotic spindle is mainly due to the experimental model used. Morpholo gically 445 \nand physiologically, oocytes of different species present differences, even if subtle 446 \n(Santos, Schoevers and Roelen, 2014) ; however, a review evaluating the oocyte 447 \ncharacteristics of bovine, murine, swine and humans, suggested that for studies 448 \nevaluating reproduct ive toxicology if it would be exposure to an EO environment) 449 \n\n128 \n \nbovine and swine models would be more adequate than the murine model to 450 \nrepresent human oocytes(Santos, Schoevers and Roelen, 2014). 451 \nDespite this, Hamdan et al. (2016) evaluated chromosomal alterations by 452 \nanother methodology, phosphorylation of histone H2AX (marker of DNA damage 453 \nand, therefore, to the chromosome), and reported a greater amount of histone H2AX 454 \nphosphorylation foci in incubated oocytes with FF of severe endometriosis compared 455 \nto the no -FF and FF co ntrol groups, indicating the involvement of the oocyte 456 \nchromosomes of women with severe endometriosis, at least in part confirming our 457 \nfindings (Hamdan, et al., 2016). 458 \nThe nuclear maturation rate was also evaluated in the study  by Hamdan et al. 459 \n(2016), who observed that the FF of women without endometriosis did not affect the 460 \noocyte maturation rate compared to the group without FF (Hamdan, Jones, Cheong 461 \nand Lane, 2016) . However, the F F of women with severe endometriosis (both the 462 \naddition of 15% and 50%), impaired the in vitro  oocyte maturation rate (Hamdan, 463 \nJones, Cheong and Lane, 2016). The authors of this study suggest that the decrease 464 \nin PB extrusion rate in the group incubated with FF from endometriosis women 465 \nshould be the result of DNA damage caused by OS (Hamdan, Jones, Cheong and 466 \nLane, 2016) . A study of our group showed that the FF of infe rtile women with 467 \nendometriosis presents an increase in the levels of 8OHdG (marker of oxidative DNA 468 \ndamage) compared to infertile women without the disease (Da Broi, et al., 2016) . 469 \nThus, Hamdan and collaborators (2016) corroborate our findings that the FF of 470 \ninfertile women with adv anced endometriosis (with and without endometrioma) 471 \ncompromises oocyte nuclear maturation (higher MI rate and lower MIII rate) when 472 \ncompared to FF of infertile women without endometriosis and with endometriosis in 473 \nthe early stages. 474 \n\n129 \n \nWe have shown that the a ddition of FF from infertile women with 475 \nendometrioma in the cycle decreases the nuclear maturation rate (represented by the 476 \nhigher MI rate and lower MII rate) when compared to the other groups, including  that 477 \ncontaining FF from women with endometriosis III /IV without endometrioma. 478 \nEndometrioma is a type of endometriosis lesion in the ovary forming a \"pseudocyst\" 479 \ncontaining in it a \"chocolate\" coloring fluid formed by cellular debris of endometriosis 480 \nand blood (Brosens, et al., 2013) . The content present insid e the endometrioma is 481 \ncharacterized by an accumulation of iron and its derivatives, making the environment 482 \ntoxic and hostile to folliculogenesis  (Sanchez, et al., 2014) . Analysis of FF by mass 483 \nspectrometry identified 535 expressed proteins, being 139 common t o groups of FF 484 \nfrom endometrioma, ovary without endometrioma and control (Regiani, et al., 2015) . 485 \nEnrichment analysis was performed from the ovary compo sition with endometrioma 486 \nand ovary without endometrioma  (Regiani, Cordeiro, da Costa, Salgueiro, Cardozo, 487 \nCarvalho, Perkel, Zylbersztejn, Cedenho and Lo Turco, 2015) . Both groups 488 \npresented proteins with similar roles, demonstrating the impact of endometriosis (or 489 \npresence of an active endometrioma in the cycle, regardles s of the follicular 490 \nproximity) on the FF composition (Regiani, Cordeiro, da Costa, Salgueiro, Cardozo, 491 \nCarvalho, Perkel, Zylbersztejn, Cedenho and Lo Turco, 2015). 492 \nLC and omega-3 fatty acids prevented meiotic oocyte damage mediated by FF 493 \nfrom women with endometriosis regardless of disease stage and presence of 494 \nendometrioma. A previous study of our group showed that the addition of LC 495 \nprevented damage to the meiotic spindle of bovine oocytes matured in vitro  in the 496 \npresence of FF from women with mild endometriosis (normal MII rate increased from 497 \n51.35% to 80.61% with LC) (Giorgi, Da Broi, Paz, Ferriani and Navarro , 2016) . 498 \nHowever, for the first time, we have shown that the combined addition of LC and 499 \n\n130 \n \nomega-3 fatty acids prevents oocyte damage (both at nuclear maturation and 500 \nchromosome alignment and meiotic spindle assembly in MII oocytes). 501 \nRecent review highlighte d the important role of carnitine in female fertility by 502 \ndiscussing in vivo and in vitro studies involving humans or animal models, and the 503 \npossible mechanisms of LC action in improving female fertility (Agarwal, et al., 2018). 504 \nAnd experimental studies show that supplementation with omega -3 improves oocyte 505 \nquality (Nehra, et al., 2012) , regulates the endometrium (Waters, et al., 2014)  and 506 \nincreases the pregnancy rate (Wathes, Abayasekara and Aitken, 2007). 507 \nLC is an antioxidant and reduces OS and lipotoxicity by eliminating free 508 \nradicals and excess of palmitate from the endoplasmi c reticulum; and by decreasing 509 \nrates of apoptosis promoting oocyte growth and development (Agarwal, Sengupta 510 \nand Durairajanayagam, 2018). OS is a factor involved in worsening oocyte quality in 511 \nwomen with endometriosis, and murine oocytes incubated with FF from women with 512 \nsevere endometriosis present higher ROS levels  compared to oocytes incubated 513 \nwithout FF and with FF control (Hamdan, Jones, Cheong and Lane, 2016).  514 \nLC and fatty acids are involved in β-oxidation which is an important pathway of 515 \nenergy production during oocyte maturation and early embryonic development  516 \n(Downs, Mosey and Klinger, 2009, Dunning, et al., 2014, Dunning, et al., 2010, 517 \nDunning and Robker, 2012, Dunning, Russell and Robker, 2014, Paczkowski, Silva, 518 \nSchoolcraft and Krisher, 2013, Valsangkar and Downs, 2013) . Oocytes from infertile 519 \nwomen with minimal or mild endometriosis present mitochondrial alterations 520 \nevaluated by transmission electron microscopy and by quantitative polymerase chain 521 \nreaction (RT-PCR) (Xu et al., 2015). And, although we did not investigate the oocyt e 522 \nmitochondria in this study, we suggest that FF from women with endometriosis, 523 \nshould alter mitochondrial function, contributing to worsening oocyte quality. 524 \n\n131 \n \nEvaluating the clinical data of the FF donor groups (FFC, FFEI/II, FFEIII/IV 525 \nand FFEendometrioma) , we observed a difference  in the duration of infertility 526 \nbetween the FFC and FFEendometrioma groups. We believe that this difference is 527 \nnot important in this study, since the median age (this one, a factor related to 528 \nworsening oocyte quality) between the groups did not differ. 529 \nOur study has brought unprecedented contributions to the elucidation of the 530 \netiopathogenesis of infertility related to endometriosis. However, we do have some 531 \nlimitations. I-) We used FF of women submitted to COS, making the extrapol ation of 532 \nthe results to natural cycles questionable; however, the control group was also 533 \nsubmitted to similar pituitary block protocols. II -) We use only FF from the first 534 \naspirated follicle of each patient, since we do not know if the prolongation of 535 \nanesthesia and repeated ovarian punctures would promote follicular OS; however, 536 \nwe cannot say that FF from different follicles would have the same impact during IVM 537 \non the oocyte.  III-) In addition, data obtained from animal model studies may not 538 \nnecessarily be extrapolated to humans and studies with oocytes from infertile women 539 \nwith endometriosis in vivo matured would be important to confirm our results. 540 \nTherefore, FF from infertile women with endometriosis damages meiotic 541 \nspindle assembly and chromosome align ment of MII bovine oocytes, and FF from 542 \nadvanced endometriosis besides damaging the meiotic spindle, also impairs nuclear 543 \nmaturation. Also, FF from women with endometrioma compromise even more nuclear 544 \nmaturation. Supplementation with LC and omega -3 fatty a cids prevented all these 545 \nbovine oocyte damages. 546 \nCurrently available treatments for infertility related to endometriosis are 547 \nsurgical and/or ART (Kennedy, Bergqvist, Chapron, D'Hooghe, Dunselman, Greb, 548 \nHummelshoj, Prentice, Saridogan and G roup, 2005) that are invasive and/or costly, 549 \n\n132 \n \nwith consequent low population access. Therefore, new therapeutic approaches 550 \nwould be essential to help thousands of women affected by this disease. Due to the 551 \nproperties of LC and omega -3 fatty acids, the comb ination of surgical treatment with 552 \nthe supplementation of these substances could prevent the recurrence and/or 553 \nprogression of endometriosis (due to the antioxidant action of LC and anti -554 \ninflammatory of omega -3 fatty acids) and improve natural fertility (by  preventing OS, 555 \nimpaired beta oxidation and oocyte damage) since ART is not accessible to all 556 \nwomen. Our findings stimulate the design of clinical studies investigating the impact 557 \nof joint supplementation of LC and omega -3 fatty acids on improving the natu ral 558 \nfertility of infertile women with endometriosis. 559 \n 560 \nReferences 561 \nAdona PR, Lima Verde Leal C. Meiotic inhibition with different cyclin-dependent kinase inhibitors in 562 \nbovine oocytes and its effects on maturation and embryo development. Zygote 2004;12: 197-204. 563 \nAgarwal A, Sengupta P, Durairajanayagam D. Role of L-carnitine in female infertility. Reprod Biol 564 \nEndocrinol 2018;16: 5. 565 \nASRM. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. 566 \nFertil Steril 1997;67: 817-821. 567 \nBarcelos ID, Vieira RC, Ferreira EM, Martins WP, Ferriani RA, Navarro PA. Comparative analysis of the 568 \nspindle and chromosome configurations of in vitro-matured oocytes from patients with 569 \nendometriosis and from control subjects: a pilot study. Fertil Steril 2009;92: 1749-1752. 570 \nBrosens I, Puttemans P, Gordts S, Campo R, Benagiano G. Early stage management of ovarian 571 \nendometrioma to prevent infertility. Facts Views Vis Obgyn 2013;5: 309-314. 572 \nBérubé S, Marcoux S, Langevin M, Maheux R. Fecundity of infertile women with minimal or mild 573 \nendometriosis and women with unexplained infertility. The Canadian Collaborative Group on 574 \nEndometriosis. Fertil Steril 1998;69: 1034-1041. 575 \nDa Broi MG, de Albuquerque FO, de Andrade AZ, Cardoso RL, Jordão Junior AA, Navarro PA. 576 \nIncreased concentration of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in follicular fluid of infertile women with 577 \nendometriosis. Cell Tissue Res 2016. 578 \nDa Broi MG, Giorgi VSI, Wang F, Keefe DL, Albertini D, Navarro PA. Influence of follicular fluid and 579 \ncumulus cells on oocyte quality: clinical implications. J Assist Reprod Genet 2018;35: 735-751. 580 \nDa Broi MG, Malvezzi H, Paz CC, Ferriani RA, Navarro PA. Follicular fluid from infertile women with 581 \nmild endometriosis may compromise the meiotic spindles of bovine metaphase II oocytes. Hum 582 \nReprod 2014;29: 315-323. 583 \nde Ziegler D, Borghese B, Chapron C. Endometriosis and infertility: pathophysiology and 584 \nmanagement. Lancet 2010;376: 730-738. 585 \nDı ́az I, Dı ́az I, Navarro J, Blasco L, Simón C, Pellicer A, Remohı ́ J. Impact of stage iii–iv endometriosis on 586 \nrecipients of sibling oocytes: matched case-control study. Fertility and Sterility 2000;74: 31-34. 587 \n\n133 \n \nDowns SM, Mosey JL, Klinger J. Fatty acid oxidation and meiotic resumption in mouse oocytes. Mol 588 \nReprod Dev 2009;76: 844-853. 589 \nDunning KR, Anastasi MR, Zhang VJ, Russell DL, Robker RL. Regulation of fatty acid oxidation in 590 \nmouse cumulus-oocyte complexes during maturation and modulation by PPAR agonists. PLoS One 591 \n2014;9: e87327. 592 \nDunning KR, Cashman K, Russell DL, Thompson JG, Norman RJ, Robker RL. Beta-oxidation is essential 593 \nfor mouse oocyte developmental competence and early embryo development. Biol Reprod 2010;83: 594 \n909-918. 595 \nDunning KR, Robker RL. Promoting lipid utilization with l-carnitine to improve oocyte quality. Anim 596 \nReprod Sci 2012;134: 69-75. 597 \nDunning KR, Russell DL, Robker RL. Lipids and oocyte developmental competence: the role of fatty 598 \nacids and β-oxidation. Reproduction 2014;148: R15-27. 599 \nEvans AM, Fornasini G. Pharmacokinetics of L-carnitine. Clin Pharmacokinet 2003;42: 941-967. 600 \nFerreira EM, Vireque AA, Adona PR, Ferriani RA, Navarro PA. Prematuration of bovine oocytes with 601 \nbutyrolactone I reversibly arrests meiosis without increasing meiotic abnormalities after in vitro 602 \nmaturation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2009;145: 76-80. 603 \nGiorgi VS, Da Broi MG, Paz CC, Ferriani RA, Navarro PA. N-Acetyl-Cysteine and l-Carnitine Prevent 604 \nMeiotic Oocyte Damage Induced by Follicular Fluid From Infertile Women With Mild Endometriosis. 605 \nReprod Sci 2016;23: 342-351. 606 \nHaghiac M, Yang XH, Presley L, Smith S, Dettelback S, Minium J, Belury MA, Catalano PM, Hauguel-de 607 \nMouzon S. Dietary Omega-3 Fatty Acid Supplementation Reduces Inflammation in Obese Pregnant 608 \nWomen: A Randomized Double-Blind Controlled Clinical Trial. PLoS One 2015;10: e0137309. 609 \nHamdan M, Jones KT, Cheong Y, Lane SI. The sensitivity of the DNA damage checkpoint prevents 610 \noocyte maturation in endometriosis. Sci Rep 2016;6: 36994. 611 \nHashimoto S, Minami N, Takakura R, Imai H. Bovine immature oocytes acquire developmental 612 \ncompetence during meiotic arrest in vitro. Biol Reprod 2002;66: 1696-1701. 613 \nJu JC, Jiang S, Tseng JK, Parks JE, Yang X. Heat shock reduces developmental competence and alters 614 \nspindle configuration of bovine oocytes. Theriogenology 2005;64: 1677-1689. 615 \nKennedy S, Bergqvist A, Chapron C, D'Hooghe T, Dunselman G, Greb R, Hummelshoj L, Prentice A, 616 \nSaridogan E, Group ESIGfEaEGD. ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of endometriosis. 617 \nHum Reprod 2005;20: 2698-2704. 618 \nLiu L, Ju JC, Yang X. Differential inactivation of maturation-promoting factor and mitogen-activated 619 \nprotein kinase following parthenogenetic activation of bovine oocytes. Biol Reprod 1998;59: 537-545. 620 \nMalhi PS, Adams GP, Singh J. Bovine model for the study of reproductive aging in women: follicular, 621 \nluteal, and endocrine characteristics. Biol Reprod 2005;73: 45-53. 622 \nMansour G, Abdelrazik H, Sharma RK, Radwan E, Falcone T, Agarwal A. L-carnitine supplementation 623 \nreduces oocyte cytoskeleton damage and embryo apoptosis induced by incubation in peritoneal fluid 624 \nfrom patients with endometriosis. Fertil Steril 2009;91: 2079-2086. 625 \nMansour G, Sharma RK, Agarwal A, Falcone T. Endometriosis-induced alterations in mouse 626 \nmetaphase II oocyte microtubules and chromosomal alignment: a possible cause of infertility. Fertil 627 \nSteril 2010;94: 1894-1899. 628 \nMissmer SA, Hankinson SE, Spiegelman D, Barbieri RL, Marshall LM, Hunter DJ. Incidence of 629 \nlaparoscopically confirmed endometriosis by demographic, anthropometric, and lifestyle factors. Am 630 \nJ Epidemiol 2004;160: 784-796. 631 \nNadjarzadeh A, Dehghani-Firouzabadi R, Daneshbodi H, Lotfi MH, Vaziri N, Mozaffari-Khosravi H. 632 \nEffect of Omega-3 Supplementation on Visfatin, Adiponectin, and Anthropometric Indices in Women 633 \nwith Polycystic Ovarian Syndrome. J Reprod Infertil 2015;16: 212-220. 634 \nNehra D, Le HD, Fallon EM, Carlson SJ, Woods D, White YA, Pan AH, Guo L, Rodig SJ, Tilly JL et al. 635 \nProlonging the female reproductive lifespan and improving egg quality with dietary omega-3 fatty 636 \nacids. Aging Cell 2012;11: 1046-1054. 637 \nNikoloff N, Pascua AM, Anchordoquy JM, Anchordoquy JP, Sirini MA, Seoane A, Furnus CC. Effect of 638 \neicosapentaenoic acid on bovine cumulus-oocyte complex in vitro. Cell Biol Int 2017;41: 505-513. 639 \n\n134 \n \nOseikria M, Elis S, Maillard V, Corbin E, Uzbekova S. N-3 polyunsaturated fatty acid DHA during IVM 640 \naffected oocyte developmental competence in cattle. Theriogenology 2016;85: 1625-1634.e1622. 641 \nPaczkowski M, Silva E, Schoolcraft WB, Krisher RL. Comparative importance of fatty acid beta-642 \noxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and 643 \nporcine cumulus oocyte complexes. Biol Reprod 2013;88: 111. 644 \nParazzini F. Ablation of lesions or no treatment in minimal-mild endometriosis in infertile women: a 645 \nrandomized trial. Gruppo Italiano per lo Studio dell'Endometriosi. Hum Reprod 1999;14: 1332-1334. 646 \nPellicer A, Navarro J, Bosch E, Garrido N, Garcia-Velasco JA, Remohí J, Simón C. Endometrial quality in 647 \ninfertile women with endometriosis. Ann N Y Acad Sci 2001;943: 122-130. 648 \nRahbar N, Asgharzadeh N, Ghorbani R. Effect of omega-3 fatty acids on intensity of primary 649 \ndysmenorrhea. Int J Gynaecol Obstet 2012;117: 45-47. 650 \nRegiani T, Cordeiro FB, da Costa LoV, Salgueiro J, Cardozo K, Carvalho VM, Perkel KJ, Zylbersztejn DS, 651 \nCedenho AP, Lo Turco EG. Follicular fluid alterations in endometriosis: label-free proteomics by MS(E) 652 \nas a functional tool for endometriosis. Syst Biol Reprod Med 2015;61: 263-276. 653 \nSalvi A, Carrupt P, Tillement J, Testa B. Structural damage to proteins caused by free radicals: 654 \nasessment, protection by antioxidants, and influence of protein binding. Biochem Pharmacol 655 \n2001;61: 1237-1242. 656 \nSanchez AM, Viganò P, Somigliana E, Panina-Bordignon P, Vercellini P, Candiani M. The distinguishing 657 \ncellular and molecular features of the endometriotic ovarian cyst: from pathophysiology to the 658 \npotential endometrioma-mediated damage to the ovary. Hum Reprod Update 2014;20: 217-230. 659 \nSantos RR, Schoevers EJ, Roelen BA. Usefulness of bovine and porcine IVM/IVF models for 660 \nreproductive toxicology. Reprod Biol Endocrinol 2014;12: 117. 661 \nSharma RK, Azeem A, Agarwal A. Spindle and chromosomal alterations in metaphase II oocytes. 662 \nReprod Sci 2013;20: 1293-1301. 663 \nSimón C, Gutiérrez A, Vidal A, de los Santos MJ, Tarín JJ, Remohí J, Pellicer A. Outcome of patients 664 \nwith endometriosis in assisted reproduction: results from in-vitro fertilization and oocyte donation. 665 \nHum Reprod 1994;9: 725-729. 666 \nSimón C, Gutiérrez A, Vidal A, de los Santos MJ, Tarín JJ, Remohí J, Pellicer A. Outcome of patients 667 \nwith endometriosis in assisted reproduction: results from in-vitro fertilization and oocyte donation. 668 \nHuman Reproduction 1994;9: 725-729. 669 \nValsangkar D, Downs SM. A requirement for fatty acid oxidation in the hormone-induced meiotic 670 \nmaturation of mouse oocytes. Biol Reprod 2013;89: 43. 671 \nWaters SM, Coyne GS, Kenny DA, Morris DG. Effect of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on 672 \ntranscription factor regulation in the bovine endometrium. Mol Biol Rep 2014;41: 2745-2755. 673 \nWathes DC, Abayasekara DR, Aitken RJ. Polyunsaturated fatty acids in male and female reproduction. 674 \nBiol Reprod 2007;77: 190-201. 675 \nWittmann T, Hyman A, Desai A. The spindle: a dynamic assembly of microtubules and motors. Nat 676 \nCell Biol 2001;3: E28-34. 677 \nZhang X, Wu XQ, Lu S, Guo YL, Ma X. Deficit of mitochondria-derived ATP during oxidative stress 678 \nimpairs mouse MII oocyte spindles. Cell Res 2006;16: 841-850. 679","source_license":"CC0","license_restricted":false}