Papel de MICA na endometriose

biológico, e desenvolvimento deste trabalho. Pela amizade e colaboração! À equipe da citometria, Janinha, Sandra e Dani, pelo apoio e discussões científicas, tão proveitosas, e que contribuíram para o aprimoramento deste trabalho. Obrigada companheirismo! As queridas amigas Priscila Ramos, Amanda Cabral e Bianca Natali, pelas orientações iniciais nos experimentos de células NK e citometria de fluxo, e pelas discussões que tanto me ajudaram. Obrigada pela paciência e carinho! A querida Dra. Lea Demarchi, por todo auxílio na obtenção das imagens de imunohistoquímica. Obrigada pelo apoio e atenção! A amiga Marta Privato, pela organização e apoio administrativo durante todo o desenvolvimento do Projeto Temático Endometriose, fundamentais para o andamento deste estudo. Pela amizade e incentivo! À Dra. Mari Sogayar pela disponibilização de reagentes/células, e à Dra. Ana Claudia Carreira pelo estabelecimento da linhagem celular e discussões científicas. Obrigada pelo apoio. À Dra. Karina Carvalho pela disponibilização do protocolo de atividade NK, e à Dra. Ana Eduarda Carvalho, ambas pela padronização inicial deste protocolo. A Cadiele Reichert e Debora Levy pelo auxílio na análise estatística da curva ROC. Muito obrigada pelo apoio e disponibilidade! A todos os meus amigos do laboratório de Imunologia, Selminha, Déia, Elaine, Washington, Simone, Rafael, Raquel, Edil, Soninha, Jair, à toda equipe do HLA, em especial a Clodô, Helcio e Carlos Sergio, à toda equipe da Alergia e OXI, ao querido amigo Leo da imuno, às amigas Fê Alegria, Karen e Ruth, à Karlinha, Giu, Luri e a todos os demai s alunos, bem como a tantos outros amigos que certamente falhei em citar... A todos, o meu muito obrigada pelo companheirismo, apoio e alegrias que me proporcionam. Cada um, da sua forma, colaborou para o meu crescimento nesta caminhada. A querida Eleni, secretária da pós -graduação, pela paciência e apoio que nunca faltaram! Obrigada por toda ajuda! Obrigada, minha pequena grande Raizinha, onde quer que você esteja! Pelo seu exemplo de alegria e perseverança. A todas as mulheres participantes deste e studo, que mesmo em seus momentos mais difíceis e de incerteza, acreditaram que a ciência poderia trazer respostas à compreensão da sua doença. Meus sinceros agradecimentos. A minha família... A minha mãe , agradeço a vida e todo amor . Seu exemplo de det erminação e os ensinamentos que deixou, foram o maior incentivo na busca deste sonho... Ao meu pai querido, que, dentro de suas dificuldades, nunca mediu esforços para minha formação. Obrigada pelo seu carinho e apoio. Aos meus queridos irmãos, Franci sco Cesar, Rogerio e Ricardo, pelo carinho e incentivo, e pelas alegrias que me fortaleceram nesta caminhada. Desculpem pelos momentos de ausência...É tão bom ter vocês ao meu lado! As minhas cunhadas Ana e Rode, pelo apoio e amizade de irmãs, e aos meus sobrinhos, Marina, Rafael, Maira e Enzo, pelo carinho e alegrias! Ao meu sogro, Sr. Danilo, pelo incentivo e carinho de um pai. Aos meus tesouros... A você, Cá, meu companheiro de vida , obrigada por todo apoio e carinho que recebi. Você é parte da m inha conquista, pois sei que o meu sonho passou a ser o nosso sonho. Obrigada por tudo, sempre e sempre! Ao meu amado filho Lucas, pelo incentivo e carinho nesta etapa de minha vida. Ter você ao meu lado me fez mais forte. Tenho certeza de que aprendemos muito nesta caminhada.... A Deus, que guiou meus caminhos e me deu saúde e forças para chegar até aqui. “A ciência se compõe de erros que, por sua vez, são os passos até a verdade.” Julio Verne “O tempo muito me ensinou: Ensinou a amar a vida, Não desistir de lutar, Renascer na derrota, Renunciar às palavras e pensamentos negativos, Acreditar nos valores humanos, e a ser otimista. Aprendi que mais vale tentar do que recuar... Antes acreditar do que duvidar, Que o que vale na vida, Não é o ponto de partida e sim a nossa caminhada.” Cora Coralina “Se a gente ri, a gente resiste. A alegria é a força que se extrai da vida.” Germano Coelho SUMÁRIO Lista de siglas, símbolos e abreviaturas Lista de figuras Lista de tabelas 1. INTRODUÇÃO……………………………………………………………………....................2 1.1 Endometriose…................................................................................................................2 1.1.1 Definição e classificação...................................................................................................2 1.1.2 Patogênese, fisiologia e progressão da endometriose.....................................................4 1.2 Fisiologia do ciclo menstrual e imunobiologia da endometriose.......................................6 1.2.1 Fisiologia do ciclo menstrual.............................................................................................6 1.2.2 Imunobiologia da endometriose......................................................................................11 1.3 Células Natural Killer na endometriose...........................................................................18 1.4 MICA - Major Histocompatibility Class I Chain-related A……………………...................29 2. OBJETIVOS...................................................................................................................35 2.1 Objetivo geral ................................ ................................ ................................ .. .............35 2.2 Objetivos específicos ................................ ................................ ...................... .............35 3. MÉTODOS……………………………………………………………………….....................37 3.1 Participantes da pesquisa ..............................................................................................37 3.2 Casuística....................................................................................................................... 37 3.3 Dados clínicos e critérios de seleção..............................................................................38 3.4 Material biológico ...........................................................................................................39 3.5 Delineamento do estudo.................................................................................................40 3.6 PCR quantitativa em tempo real: expressão gênica de MICA........................................41 3.6.1 Extração de RNA total.....................................................................................................41 3.6.2 Tratamento com DNAse e análise da qualidade do RNA total.......................................42 3.6.3 Síntese de cDNA............................................................................................................43 3.6.4 Seleção de primers.........................................................................................................43 3.6.5 Reações de qRT-PCR....................................................................................................44 3.7 Imunohistoquímica: expressão proteica de MICA..........................................................45 3.7.1 Avaliação da expressão proteica de MICA.....................................................................46 3.8 ELISA para pesquisa de MICA solúvel...........................................................................47 3.9 Atividade efetora de células NK......................................................................................48 3.9.1 Análise quantitativa das subpopulações de células NK e expressão do receptor NKG2D e das citocinas IFN-γ e IL-10, na condição ex vivo ..........................................51 3.9.2 Análise da atividade efetora de células NK frente a estímulo com células K562...........54 3.9.2.1 Cultivo de células K562 e bloqueio da proteína MICA na superfície celular.............. 55 3.9.2.2 Análise da expressão de MICA em células K562 pré e pós o bloqueio de MICA.......56 3.9.2.3 Frequência e intensidade de expressão de moléculas CD107a. IFN-γ e IL-10, nas subpopulações de células NK......................................................................................57 3.10 Avaliação da atividade citotóxica de células NK.............................................................60 3.10.1 Marcação das células K562 com CFSE..........................................................................61 3.10.2 Cocultura de PBMC:K562 (E:A) e marcação para morte celular....................................62 3.11 Análise estatística...........................................................................................................63 4. RESULTADOS ................................ ................................ ............................... .............66 4.1 Expressão gênica de MICA ...........................................................................................67 4.2 Expressão proteica de MICA..........................................................................................68 4.2.1 Expressão proteica de MICA no epitélio glandular e estroma........................................68 4.2.2 Expressão proteica de MICA em relação à fase do ciclo menstrual...............................73 4.2.3 Expressão proteica de MICA em relação aos estádios da endometriose.......................76 4.2.4 Expressão proteica de MICA na profunda de retossigmóide e retrocervical..................76 4.3 Pesquisa de MICA solúvel..............................................................................................77 4.3.1 Níveis de sMICA no soro e fluido peritoneal em mulheres com endometriose e controles.........................................................................................................................78 4.3.2 Níveis de sMICA nos diferentes estádios da endometriose...........................................79 4.3.3 Níveis de sMICA nas diferentes fases do ciclo menstrual..............................................81 4.3.4 Níveis de sMICA em relação aos tipos de endometriose...............................................83 4.3.5 Níveis de sMICA e expressão gênica de MICA..............................................................85 4.3.6 Análise de correlação entre os níveis de sMICA e a expressão de MICA in situ...........86 4.3.7 Pesquisa de nível de sMICA como potencial parâmetro preditivo para a endometriose..................................................................................................................87 4.4 Células NK e subpopulações: análises quantitativas e funcionais.................................87 4.4.1 Análise quantitativa das subpopulações de células NK e expressão de NKG2D, IFN-γ e IL10....................................................................................................................88 4.4.1.1 Subpopulações NK: na condição ex vivo.....................................................................88 4.4.1.2 Expressão de NKG2D em subpopulações NK: na condição ex vivo...........................91 4.4.1.3 Expressão de moléculas IFN-γ e IL-10: na condição ex vivo......................................94 4.4.2 Expressão de moléculas CD107a, IFN-γ e IL-10 frente a estímulo com células K562................................................................................................................................96 4.4.2.1 CD107a, IFN-γ e IL-10: na condição estado basal da cultura, sem estímulo..............96 4.4.2.2 Moléculas de atividade NK: na condição com estímulo com células K562...............105 4.4.2.3 Na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA.....................113 4.4.3 Expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e relação com níveis de MICA solúvel..........................................................................................120 4.4.3.1 Moléculas vs MICA solúvel: na condição basal de cultura.........................................120 4.4.3.2 Moléculas vs MICA solúvel: na condição de estímulo com células K562..................121 4.4.3.3 Moléculas vs MICA solúvel: na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA..............................................................................................123 4.4.4 Expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e relação com estádios da endometriose.....................................................................................127 4.4.4.1 Moléculas vs estádios: na condição basal de cultura.................................................127 4.4.4.2 Moléculas vs estádios: na condição de estímulo com células K562..........................131 4.4.4.3 Expressão de moléculas vs estádios: na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA.....................................................................................134 4.4.5 Expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10 e relação com às fases do ciclo menstrual..............................................................................................................141 4.4.5.1 Expressão das moléculas e fases do ciclo: condição basal de cultura......................141 4.4.5.2 Expressão das moléculas e fases do ciclo: estímulo com células K562....................142 4.4.5.3 Expressão das moléculas e fase do ciclo: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA...................................................................................................................144 4.4.6 Citotoxicidade pelas células NK....................................................................................149 4.4.6.1 Citotoxicidade contra células K562 sem bloqueio e com bloqueio para MICA...........149 4.4.6.2 Citotoxicidade e relação com os estádios da endometriose...................................... 151 4.4.6.3 Citotoxicidade e análise de correlação com níveis de MICA solúvel..........................153 4.4.6.4 Citotoxicidade e relação com as fases do ciclo menstrual..........................................153 4.4.6.5 Análise de correlação entre citotoxicidade induzida pelas células NK e a expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10...................................................157 5. DISCUSSÃO.................................................................................................................161 6. CONCLUSÕES.............................................................................................................186 7. ANEXOS.......................................................................................................................189 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 249 LISTA DE SIGLAS, SIMBOLOS E ABREVIATURAS ADAM A Disintegrin and Metalloproteinase, desintegrina e metaloproteinase ADCC Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, citotoxicidade celular dependente de anticorpo AR Ácido Retinóico ASRM American Society for Reproductive Medicine, Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva AUC Area Under Curve, área sob a curva Ac (s) Anticorpo (s) bp base pairs, pares de bases CAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa cDNA complementary DNA, DNA complementar COX 2 Cyclooxygenase (COX)-2, cicloxigenase 2 Ct Threshold Cicle, ciclo de limiar CTR Grupo Controle CFSE Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester, éster succinimidílico da carboxifluoresceína CCND1 Cyclin D1, ciclina D1 DC Dendritic Cells, células dendríticas DEPC Dietilpirocarbonato DNA Deoxyribonucleic Acid, ácido desoxirribonucleico DNI Doença Ginecológica Não Inflamatória dNTP deoxynucleoside triphosphate, desoxirribonucleotídeo trifosfatado DO Densidade Óptica DP Desvio Padrão EDT Endometriose Ef Eficiência de amplificação EIR Escore de Imunorreatividade ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ensaio de imunoabsorção enzimática ERP5 Endopasmic Reticulum Protein 5, proteína 5 do retículo endoplasmático FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Fc Região do Fragmento cristalizável FcγRIIIA Receptor IIIa para a porção Fc da imunoglobulina G, IgG FMO Fluorescence Minus One, fluorescência menos um FOXP3 Forkhead box P3, fator de transcrição nuclear P3 FP Fluido Peritoneal FSC Forward Scatter, dispersão frontal de luz FSH Follicle-Stimulating Hormone, hormônio folículo estimulante GPER1 G protein-coupled estrogen receptor 1, receptor 1 de estrogênio acoplado à proteína G GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos GREB1 Growth Regulating Estrogen Receptor Binding 1, fator de ligação 1 do receptor de estrogênio regulador do crescimento GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone, hormônio liberador de gonadotrofina HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo HLA Human Leukocyte Antigen, antígeno leucocitário humano IFN-γ Interferon-gama IL Interleucina KIR Killer Imunoglobulin like Receptor LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1, ou CD107a LAQ Mulheres controles provenientes de laparoscopia para laqueadura tubária M Molar MASP1 Mannose-Associated Serine Protease 1, serina-protease 1associada à manose. MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein 1, proteína quimiotática de monócitos-1 med Mediana MFI Median Fluorescence Intensity, mediana de intensidade de fluorescência mg Miligrama MHC Major Histocompatibility Complex, complexo principal de histocompatibilidade MICA Major Histocompatibility Class I Chain-related A MIF Macrophage migration Inhibitory Fator, fator inibidor da migração de macrófago min Minuto(s) mL Mililitro(s) mM Milimolar MMP Matrix Metalloproteinase Protein, proteína metaloproteinase de matriz mRNA messenger Ribonucleic Acid, ácido ribonucleico (RNA) mensageiro NK Natural killer, célula matadora natural NF-κB Nuclear Factor-kappa B, fator nuclear kappa B NKG2D Natural Killer- group 2, member D, membro D do grupo 2 de receptores de células natural killer NKreg Célula Natural Killer reguladora ns não significante ON Over-nigth, por uma noite OVA Endometriose Ovariana PASS programa estatístico Power Analysis Sample Size PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell, células mononucleares do sangue periférico PBS Phosphate Buffered Saline, tampão fosfato-salino PCR Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase pg Picograma (s) PROF (Prof.) Endometriose Profunda PROL Fase Proliferativa do ciclo menstrual qRT-PCR quantitative Real Time PCR, PCR quantitativo em tempo real q.s.p. Quantidade suficiente para RANTES Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Secreted, regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais rASRM Revised American Society for Reproductive Medicine, 1996 RC Retrocervical RE Receptor de Estrogênio RIN RNA Integrity Number, pontuação de integridade para o RNA RNA Ribonucleic Acid, ácido ribonucleico ROC Receiver Operating Characteristic Curve RP Receptor de Progesterona RS Retossigmóide R10 Roswell Park Memorial Institute, RPMI, meio de cultura celular adicionado de 10% de soro fetal bovino SECRET Fase Secretora do ciclo menstrual sMICA MICA solúvel SSC Side Scatter, dispersão lateral de luz SUP Endometriose Superficial TA Temperatura Ambiente TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TGF-β Transforming Growth Fator Beta, fator de transformação do crescimento beta Th T helper cell, linfócito T auxiliar TNF-α Tumor Necrosis Factor Alpha, fator de necrose tumoral alfa TRAIL TNF- Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand, ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral uNK Células NK uterinas VEGF-A Vascular Endothelial Growth Factor A, fator de crescimento vascular endotelial A VEGFR-2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2, receptor 2 do fator de crescimento vascular endotelial vs abreviatura de versus, do latim, em comparação com ºC Grau Celsius % porcentagem LISTA DE FIGURAS Figura 1 Representação esquemática das principais funções das células NK, no contexto de células saudáveis e tumorais/estressadas......................................22 Figura 2 Principais receptores inibidores e ativadores nas células NK, e seus ligantes em célula alvo.....................................................................................................23 Figura 3 Ativação de vias relacionadas ao receptor NKG2D............................................25 Figura 4 Mecanismos básicos de ação das células NK....................................................26 Figura 5 Papel duplo de MICA como molécula alvo para imunovigilância por células NK e como mediadora do escape imunológico de tumor/células estressadas.........................................................................................................30 Figura 6 Desenho do estudo.............................................................................................41 Figura 7 Esquema resumido do protocolo para avaliação da atividade efetora de células NK, baseado na degranulação da molécula CD107a, expressão das citocinas IFN- e IL-10 e na sua atividade citotóxica....................................50 Figura 8 Estratégia de análise para determinação das subpopulações de células NK circulantes e subpopulações NK com expressão de NKG2D, de mulheres com endometriose e controles............................................................54 Figura 9 Estratégia de análise para expressão de MICA em células K562......................57 Figura 10 Estratégia de análise para determinação das subpopulações de células NK circulantes, com expressão de CD107a, IFN-γ e IL-10, em mulheres com endometriose e controles....................................................................................60 Figura 11 Estratégia de análise para determinação da atividade citotóxica de células NK contra células K562...................................................................................... 63 Figura 12 Expressão de mRNA de MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles...............................................................................67 Figura 13 Expressão do gene MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual.............................................................................................................68 Figura 14 Escore de imunorreatividade para expressão proteica de MICA em glândula (epitélio) e estroma, e representação da expressão em endométrio eutópico...............................................................................................................69 Figure 15 Exemplos representativos de expressão da proteína MICA, por imunohistoquímica, em lesão de retossigmóide e em endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles..................................................71 Figura 16 Comparação dos escores de imunorreatividade (EIR) de expressão de MICA na lesão profunda, endométrio eutópico de mulheres dos grupos endometriose e controle..................................................................................... 72 Figura 17 Porcentagem de casos positivos com baixa ou alta expressão proteica de MICA no epitélio glandular, de acordo com os escores de imunorreatividade (EIR)................................................................................................................... 73 Figura 18 Escores de imunorreatividade de expressão proteica de MICA no epitélio glandular e estroma na lesão profunda e endométrio eutópico de mulheres do grupo endometriose e no endométrio eutópico de mulheres do grupo controle, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual...............74 Figura 19 Comparação da expressão de MICA entre as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, na lesão de endometriose profunda e nos endométrios eutópicos de mulheres com endometriose e de controles................................. 75 Figura 20 Escore de imunorreatividade para a expressão da proteína MICA na lesão profunda e no endométrio eutópico de mulheres com EDT em estádios iniciais e avançados da endometriose, e no endométrio eutópico do grupo CTR.................................................................................................................... 76 Figura 21 Escore de imunorreatividade para a expressão da proteína MICA em lesões profundas de endometriose retossigmóide e retrocervical..................................77 Figura 22 Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL) no soro e fluido peritoneal (FP) de mulheres com endometriose (EDT) e controles (CTR).......................................78 Figura 23 Análise de correlação entre os níveis de sMICA no soro e no fluído peritoneal (FP), em mulheres com endometriose (EDT) e controles (CTR)........................79 Figura 24 Distribuição dos níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres com endometriose e de controles.......................................................79 Figura 25 Comparação dos níveis MICA solúvel entre mulheres em estádios iniciais (I/II) e avançados (III/IV) da endometriose e controles, no soro e no fluido peritoneal.............................................................................................................80 Figura 26 Níveis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com endometriose em diferentes estádios da endometriose e em controles.............81 Figura 27 Distribuição dos níveis de MICA solúvel, no soro e fluido peritoneal (FP) de mulheres com endometriose e de controles, nas diferentes fases do ciclo menstrual.............................................................................................................82 Figura 28 Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL), no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com endometriose e de controles saudáveis, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual............................................................................82 Figura 29 Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL) no soro e no FP de mulheres com endometriose de acordo com o local de acometimento da doença, e no grupo controle................................................................................................84 Figura 30 Análises de correlação entre os valores de 1/∆Ct para mRNA de MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, e os níveis de MICA solúvel........................................................................................85 Figura 31 Análise de correlação entre os níveis de sMICA, no soro e no fluido peritoneal, e a expressão proteica in situ de MICA em epitélio glandular..........86 Figura 32 Porcentagem das subpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose e de controles, na condição ex vivo.............................................89 Figura 33 Comparação entre a frequência de células NK totais (A) e das subpopulações CD56dim (B) e CD56dimCD16+ (C) entre estádios iniciais (I/II) da endometriose e controles....................................................................... 90 Figura 34 Porcentagem (%) de células com expressão de NKG2D nas subpopulações NK circulantes em mulheres com endometriose e controles saudáveis, na condição ex vivo.............................................................................................92 Figura 35 Análise da frequência de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, entre as subpopulações de células NK, nos grupos EDT e CTRs, no estado basal de cultura (sem estímulo) .............................................................99 Figura 36 Comparação da frequência de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição basal, sem estímulo............................101 Figura 37 Análise de correlação entre a porcentagem de células com expressão de moléculas de atividade efetora de células NK, na subpopulação CD56dim circulante, de mulheres com endometriose, na condição basal de cultura, sem estímulo.....................................................................................................104 Figura 38 Alterações significativas ocorridas após o estímulo com K562 (Est. K562), em relação à condição sem estímulo, em mulheres com endometriose e controles.........................................................................................................108 Figura 39 Comparação da intensidade de expressão de moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK na subpopulação CD56bright circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição após estímulo com células K562..................................................................................................... 109 Figura 40 Análise de correlação entre as frequências de células positivas, e entre as intensidades de expressão de moléculas de atividade efetora de células NK, em subpopulações de células NK circulantes, de mulheres do grupo controle, na condição após estímulo com K562............................................... 111 Figura 41 Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas e expressão de moléculas de atividade efetora de células NK, em subpopulações de células NK circulantes, com níveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e controles, na condição basal de cultura, sem estímulo.................................................................................................... 121 Figura 42 Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas para a expressão de IFN-y em subpopulações de células NK circulantes, com níveis de MICA solúvel no fluido peritoneal de mulheres com endometriose e de controles, na condição com estímulo com células K562.......................... 123 Figura 43 Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas para a expressão CD107a em subpopulações de células NK circulantes, com níveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e de controles, na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA........... 125 Figura 44 Comparação da porcentagem (%) de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição basal de cultura, sem estímulo.................................................... 129 Figura 45 Comparação da porcentagem de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição com estímulo com células K562.................................................. 132 Figura 46 Comparação da porcentagem (%) de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para molécula MICA..................................................................................................136 Figura 47 Frequência de expressão (%) de IFN-y em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas diferentes fases do ciclo menstrual, na condição basal de cultura, sem estímulo.............................................................................................................142 Figura 48 Frequência da porcentagem (%) de expressão das moléculas IFN-y e IL-10 em subpopulações de células NK circulantes, de mulheres com endometriose e de controles, nas diferentes fases do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562..................................................... 143 Figura 49 Comparação da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas diferentes fases do ciclo menstrual, na condição com estímulo com células K562...................................................144 Figura 50 Porcentagem (%) de células com expressão de CD107a e IL-10 e intensidade de expressão de IL-10, em subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose e em controles, em diferentes fases do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA..................................................................................... 145 Figura 51 Intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, em diferentes fases do ciclo menstrual, na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA......................................... 147 Figura 52 Comparações da citotoxicidade (CTX) pelas células NK circulantes entre mulheres com endometriose e controles...........................................................150 Figura 53. Citotoxicidade pelas células NK circulantes de mulheres com endometriose e de controles, contra células K562 e K562 bloqueadas para MICA................151 Figura 54. Citotoxicidade pelas células NK circulantes frente a células K562 e células K562 bloqueadas para MICA, nos diferentes estádios da endometriose.................................................................................................... 151 Figura 55. Citotoxicidade pelas células NK circulantes de mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e de controles.......................................152 Figura 56. Porcentagem (%) de morte de células K562 e células K562 após o bloqueio da proteína MICA, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, em mulheres com endometriose e controles....................................................154 Figura 57. Comparações da frequência de morte de células K562 com e sem bloqueio da proteína MICA, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, entre os grupos de mulheres com endometriose e controles...........................155 Figura 58. Comparações da frequência de morte de células K562, e de células K562BLOQ, entre as diferentes fases do ciclo, no grupo de mulheres com endometriose e controles................................................................................. 156 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Características clínicas e demográficas das mulheres com endometriose e controles...........................................................................................................66 Tabela 2 Escore de imunorreatividade para epitélio glandular e estroma da expressão da proteína MICA, na lesão profunda de endometriose e no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e controles........................................ 70 Tabela 3 Níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres com endometriose e de controles...............................................................................78 Tabela 4 Distribuição das lesões de endometriose segundo os tipos e estádios da endometriose.......................................................................................................83 Tabela 5 Medianas das frequências de subpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose e de controles, na condição ex vivo......................90 Tabela 6 Comparação da frequência de células com expressão do receptor NKG2D, e intensidade de expressão, em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição ex vivo..................93 Tabela 7 Análise de correlação da frequência, e da intensidade de expressão, de NKG2D nas subpopulações de células NK, com os níveis de MICA solúvel, no grupo de mulheres com endometriose e controles........................................94 Tabela 8 Porcentagem de células com expressão de IFN-y ou IL-10, e intensidades de expressão, em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles saudáveis, na condição ex vivo.........................95 Tabela 9 Análise da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, nas subpopulações de células NK, entre grupos EDT e CTRs, na condição basal de cultura, sem estímulo..........................................................100 Tabela 10 Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose e controles, na condição basal de cultura, sem estímulo.............................................................................................................103 Tabela 11 Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e das intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose (A) e controles (B), entre as condições sem estímulo e após estímulo com células K562..............................................................................................106 Tabela 12 Comparação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição após estímulo com células K562....... 110 Tabela 13 Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose (A) e controles (B), na condição após estímulo com células K562......................................................................................................112 Tabela 14 Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e das intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose (A) e controles (B), entre as condições após estímulo K562, e após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA............................. 114 Tabela 15 Comparação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e entre as sus intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição de estímulo com K562 bloqueadas para a proteína MICA........................................................................................117 Tabela 16 Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e entre suas intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose (A) e controles (B), na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA............................................................... 119 Tabela 17 Balanço dos principais resultados da correlação entre a expressão de moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e níveis de MICA solúvel...............................................................................................................126 Tabela 18 Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e entre controles, na condição basal de cultura, sem estímulo.................................................... 130 Tabela 19 Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição estímulo com células K562............................................................... 133 Tabela 20 Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA.....................137 Tabela 21 Balanço dos principais resultados da expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e sua relação com estádios de endometriose.....................................................................................................138 Tabela 22 Balanço das principais diferenças das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e suas intensidades de expressão, entre os grupos endometriose e controles, e relação com a fase do ciclo menstrual..................................................................................... 148 Tabela 23 Análise de correlação entre a citotoxicidade contra células K562 e K562 bloqueadas para MICA, com a frequência ou intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, em mulheres do grupo controle...............158 Tabela 24 Análise de correlação entre a citotoxicidade contra células K562 e K562 bloqueadas para MICA, com a frequência ou intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, em mulheres com endometriose..............159 RESUMO Marin MLAC. Papel de MICA na endometriose [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2022. A endometriose (EDT) é uma doença caracterizada pela presença de epitélio semelhante ao endométrio e/ou estroma , fora do endométrio e miométrio, com alterações imunológicas que incluem a redução da atividade citotóxica de células NK e TCD8+. MICA ( Major Histocompatibility Complex class I Chain-related A) é uma molécula, principalmente, induzida por estresse biológico, e sua forma solúvel (sMICA) modula, negativamente, a expressão do seu receptor NKG2D , em células NK e TCD8+αβT, reduzindo a resposta citotóxica. Investigamos o papel de MICA na fisiopatologia da EDT, analis ando diversos parâmetros biológicos, e considerando seus estádios e sítios de acometimento, assim como a potencial participação de MIC A solúvel (sMICA) na deficiência da atividade efetora de células NK. A expressão gênica de MICA (qRT-PCR) no endométrio eutópico (EDT, n=29; CTR, n= 23) não mostrou diferença entre os grupos ( p >0,05). No entanto, a sua expressão proteica (imunohistoquímica) mostrou maior frequência de “alta” expressão no epitélio glandular do endométrio eutópico na EDT, em relação ao CTR ( p= 0,0134), sugerindo haver alterações imunológicas em células endometriais, envolvendo MICA, previamente à sua migração e instalação ec tópica, sugerindo, assim, seu papel na resposta inflamatória e como fonte de sMICA. Os níveis de sMICA (ELISA) foram maiores no grupo EDT (n=161; soro, p= 0,0004; FP, p< 0,0001), tanto nos estádios iniciais (soro, p= 0,0114; FP, p= 0,00 52) como nos avançados da doença (soro, p= 0,0001; FP, p< 0,0001), em relação aos CTRs (n=76), também associados à doença profunda (PROF) (soro, p= 0,003; FP , p= 0,0004) e PROF + ovariana (OVA) (soro, p< 0,0001; FP, p< 0,0001), em relação aos CTRs. Esses resultados sugerem o envolvimento de sMICA na fisiopatologia da endometriose, na sua progressão e/ou gravidade. A menor frequência da subpopulação citotóxica CD56 dimCD16+ (p= 0,0456) (citometria de fluxo), na EDT, pode contribuir para a deficiência de citotoxicidade observada na doença. Por outro lado, a maior intensidade de expressão do receptor ativador, NKG2D, em NK (p= 0,0402) (citometria de fluxo), na EDT, e particularmente, na subpopulação CD56 brightCD16+ (p= 0,033) nos estádios iniciais, indica maior potencial de ativação das células NK na EDT, e nos estádios iniciais da doença. Observamos deficiência de citotoxicidade pelas células NK, na EDT ( p= 0,0144) (cocultura e citometria de fluxo) , principalmente em estádios avançados ( p= 0,0115), em concordância com a literatura. A citotoxicidade pelas células NK, na presença de estímulo com células alvo bloqueadas para MICA (mimetiz ando o efeito de sMICA), foi menor apenas em estádios iniciais, na comparação ao estímulo sem bloqueio ( p= 0,0313), e menor também em relação ao grupo CTR (p= 0,0181). Esses dados, juntamente com a correlação negativa entre os níveis de sMICA e a expressão de NKG2D nas células NK (CD56 brightCD16+, r= -0,6, p= 0,0167), sugerem que os altos níveis de sMICA podem inibir a expressão de NKG2D e, consequentemente, a função efetora das células NK, principalmente nos estádios iniciais da doença, quando detectamos maior expressão de NKG2D nas células NK. A maior expressão de IFN -γ na EDT (cocultura e citometria de fluxo) , na condição basal, sem estímulo, é concordante com a condição inflamatória da doença, em curso. No entanto, na condição de estímulo, houve menor expressão de CD107a (CD56 dim, p= 0,0308), IFN-γ (CD56 bright, p= 0,001) e IL-10 (CD56 bright, p= 0,0222) (cocultura e citometria de fluxo) , na EDT, indicando deficiência nas respostas efetora e imunorreguladora de células NK, quando desafiadas. O bloqueio para MICA , in vitro, não alterou a expressão dessas moléculas, nas células NK, em nenhum dos grupos, sugerindo que sMICA não afeta, de forma robusta, a expressão dessas moléculas (cocultura e citometria de fluxo) , ao menos no contexto in vitro . No entanto, a correlação negativa entre os níveis de sMICA e a expressão de CD107a (CD56bright, r= -0,7, p= 0,0057), observada apenas na EDT, sugere que, in vivo, sMICA tenha um efeito negativo na via de degranulação, possivelmente, em combinação com outros distúrbios imunoló gicos na doença. Em conjunto, os nossos resultados apoiam o envolvimento MICA na fisiopatologia da EDT, e de sMICA contribuindo para a deficiência da atividade citotóxica das células NK. MICA pode exercer papeis tanto pró -inflamatório como imunorregulador, contribuindo para geração/manutenção de um contexto biológico misto, de inflamação descontrolada e imunossupressão, prejudicando a eliminação adequada de tecidos endometriais ectópicos e no reestabelecimento da homeostase. Descritores: Endometriose; MI CA; NKG2D; Células NK; Citotoxicidade NK; CD107 a; Interferon-gama; IL-10.

Marin MLAC. Role of MICA in Endometriosis [thesis]. São Paulo: “Faculty of Medicine, University of São Paulo”; 2022 Endometriosis (EDT ) is a disease characterized by the presence of endometrium -like epithelium and/or stroma outside the endometrium and myometrium, usually with an associated inflammatory process , presenting immunological alterations including Natural Killer (NK) and TCD8+ cell deficient cytotoxic activity. MICA (MHC, Major Histocompatibility Complex class I Chain-related A) molecule is mainly induced by biological stress, and its soluble form (sMICA) negatively modulates the expression of NKG2D receptor, on NK e TCD8+αβT cells, reducing their cytotoxic activity. We investigated the role of MICA in the pathophysiology of EDT, analyzing several biological parameters, and considering disease stages and sites of involvement, as well as the potential participation of sMICA in the deficiency of NK cells effector activity. MICA gene expression (qRT-PCR) in eutopic endometrium (EDT, n=29; CTR, n=23) showed no difference between groups ( p> 0.05). However, MICA protein expression (immunohistochemistry) showed a higher frequency of “high” expression in eutopic endometrial glandular epithelium in EDT, in relation to CTRs ( p= 0.0134), suggesting immunological alterations in endometrial cells, involving MICA, before their ectopic migration and installation. This suggests that MICA’s u pregulation has role in the inflammatory response, as well as a source of sMICA. Soluble MICA levels (ELISA) were higher in EDT (n=161; serum, p= 0.0004; FP, p< 0.0001), both in the initial (serum, p= 0.0114; FP, p= 0. 0052) and advanced stages of the disease (serum, p=0.0001; FP, p< 0.0001), in relation to CTRs (n=76), and also associated with deep (DE) (serum, p= 0.003; FP, p= 0.0004) and DE + ovarian disease (OMA), (serum, p< 0.0001; FP, p< 0.0001), in relation to CTRs. These results point out sMICA’s in volvement in endometriosis pathophysiology, disease severity and progression. The lower frequency of the CD56dimCD16+ cytotoxic subpopulation (p= 0.0456) (flow cytometry), in EDT, may contribute to the cytotoxicity deficiency observed in the disease. On other hand, the higher expression of the activator receptor, NKG2D, on NK cells in EDT ( p= 0.0402) (flow cytometry) and particularly in the early stages of EDT for the CD56brightCD16+ subset (p= 0.033), indicates a greater potential for NK cell activation in EDT, and in the early stage of the disease. We also observed NK cell cytotoxicity deficiency in EDT ( p= 0.0144) (coculture and flow cytometry) , mainly in the advanced stages (p= 0.0115), in agreement with the literature. NK cell cytotoxicity, induced by stimulus with target cells blocked for MICA (mimicking the effect of soluble MICA), was lower only in early stages ( p= 0.0313), and also lower in relation to the CTR group (p= 0.0181). These data, together with the negative correlation between sMICA levels and NKG2D expression on NK cells (CD56 brightCD16+, r= -0.6, p= 0.0167), suggest that high levels of sMICA may inhibit the expression of NKG2D and, consequently, NK cells’ effector function, especially in the early stages of the disease, when greater expres sion of NKG2D in NK cells is detected. The higher expression of IFN -γ in the basal condition in EDT (coculture and flow cytometry), is consistent with the ongoing inflammatory process of the disease. However, when stimulated in vitro NK cells in EDT showed lower expression of CD107a (CD56 dim, p= 0.0308), IFN-γ (CD56bright, p= 0.001) and IL-10 (CD56bright, p= 0.0222) (coculture and flow cytometry) , indicating NK cell functional deficiency in both effector and immunoregulatory responses, upon challenge. Blocking MICA, in vitro, did not alter the expression of these molecules (coculture and flow cytometry) , in NK cells in any of the groups, suggesting that sMICA has no robust effect on the expression of these molecules, at least in vitro . Nevertheless, the negative correlation between sMICA levels and CD107a expression (CD56 bright, r= -0.7, p= 0.0057), observed only in EDT, suggests that, in vivo , sMICA may have a negative effect on the degranulation pathway, possibly in synergy with other immunological dysfunctions in the disease. Taken together, our results support the involvement of MICA in the pathophysiology of EDT, and that sMICA contributes to the impairment of NK cell cytotoxic activity. MICA can play both, pro-inflammatory and immunoregulatory roles, contributing to the generation/maintenance of a mixed biological settin g, of uncontrolled inflammation and immunosuppression, impairing the adequate elimination of ectopic endometrial tissues and reestablishment of homeostasis.

Endometriosis; MICA; soluble MICA; NKG2D; NK cells; NK cytotoxicity; CD107a, Interferon-gamma; IL-10. _______________________________________________INTRODUÇÃO 2 1. INTRODUÇÃO 1.1 Endometriose 1.1.1 Definição e classificação A endometriose (EDT) é uma doença inflamatória caracterizada pela presença de epitélio, e/ou estroma, similar ao endométrio, fora do endométrio e miométrio (Tomassetti et al. 2021) sendo, frequentemente, acompanhada de fibrose e aderências (Zondervan et a l., 2018). A prevalência exata da doença não é bem estabelecida, no entanto, estima -se que afete de 10 a 15% das mulheres em idade fértil (Giudice, 2010) Tem como sintomas característicos: dor pélvica grave (durante e após o ato sexual - dispareunia de profundidade; dismenorreia, e/ou dor acíclica), alterações intestinais (tenesmo, disquezia e hematoquezia) e urinárias cíclicas (disúria e hem atúria), além de associação com infertilidade (Berkley et al., 2005). Assim sendo, a EDT pode, de forma significante, impactar a saúde e a qualidade de vida de mulheres afetadas pela doença (Giudice e Kao 2004). O diagnóstico da doença é realizado, inicialmente, por meio da sintomatologia e história clínica da paciente, em associação ao exame físico ginecológico (Borreli, 2015a). Exames de imagem, como ultrassonografia transvag inal com preparo intestinal, ressonância nuclear magnética, ecoendoscopia e ultrassom transretal são considerados exames de auxílio ao diagnóstico (Abrao et al., 2007). No entanto, o diagnóstico definitivo é obtido por meio de exame histológico da lesão suspeita (Abrão et al., 2000) obtida, na sua maior parte, por meio de cirurgia laparoscópica (Borreli 2015a). A EDT já teve várias formas de classificação baseadas em diferentes abordagens e critérios (Chapron et al., 2003; Hassa et al., 2009). Muito recentemente, foi definida uma nova classificação para a EDT, pela Associação Americana de Laparoscopistas Ginecológicos (AAGL) (Abrao et al. 2021) , com o objetivo de melhor pontuar os níveis de complexidade cirúrgica intra -operatória e examinar sua associaçã o com a dor relatada pela paciente e a ocorrência de infertilidade. No nosso estudo, foi utilizada a classificação proposta pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva e revisada em 1996 (Revised American Society for Reproductive Medicine, rASRM, 1996) (Canis et al. 1997) que, até então, vinha sendo a classificação mais amplamente utilizada. Trata-se de uma classificação cirúrgica que utiliza como base a extensão da doença durante o procedimento cirúrgico, baseando-se no tamanho da lesão, localização dos implantes de tecido endometrial e extensão das adesões. Segundo um sistema de pontuação, ela divide a EDT em diferentes estádios: I (1 -5 pontos), II (6 -15 pontos), III (16 -40 pontos) e IV (> 40 pontos) (Apresentado no Item 7, Anexos; Anexos III e 3 IV). Segundo tal classificação, o estádio I é considerado como EDT mínima, estádio II, leve, estádio III, moderada e estádio IV, como EDT grave. Desta forma, em relação à gravidade da doença, podemos considerar I e II como os estádios mais leves, e os estádios III e IV, como os mais graves da doença. É importante salientar que, embora a classificação rASRM seja amplamente utilizada e aceita mundialmente, é consenso entr e especialistas que ela apresenta limitações (Andres et al. 2018) . Tal sistema de classificação não leva em consideração a presença da doença profunda em diferentes locais, como liga mentos uterossacros, bexiga, vagina e o intestino, bem como não descreve, adequadamente, os locais de acometimento da doença (Andres et al. 2018) , tendo sido , portanto, como acima ci tado, recentemente atualizada (Abrao et al., 2021). Além da classificação cirúrgica da EDT, há também uma classificação segundo a localização e profundidade das lesões. São definidos 3 fenótipos: EDT: superficial (SUP), EDT ovariana ( OVA; endometrioma) e EDT do septo retovaginal, esta, mais recentement e caracterizada como EDT profunda (PROF) (Kamergorodsky et al., 2009). A doença superficial é caracterizada por lesões peritoneais, geralmente no peritônio pélvico; a ovariana pode apresentar-se com implantes superficiais no ovário ou cistos com conteúd o achocolatado, derivado de repetidas hemorragias do foco endometriótico no cisto, durante a menstruação. A doença PROF representa 20% dos casos de endometriose (Chapron et al. , 1999) e é considerada a forma mais agressiva da doença (Abrão et al. , 2015), com sintomas mais graves qu ando comparada à EDT superficial, incluindo dismenorreia grave e infertilidade (Abrão et al ., 2015). Caracteriza -se por lesões com infiltração com profundidade igual ou superior a 5mm em estruturas anatômicas ou órgãos como, por exemplo, ligamentos uterossacros, ureteres, bexiga, região retrocervical, retossigmóide, íleo terminal e apêndice cecal (Cornillie et al., 1990). Porém, dentre os diferentes locais e apresentações da doença PROF, o acometimento retovaginal e retossigmóide é considerado dos mais incapacitantes (Borreli 2015) , sendo associado à perda da qualidade de vida de mulhe res acometidas (Dubernard et al., 2006). É importante salientar que, apesar de descritos 3 fenótipos clínicos para a endometriose, em muitos casos, eles podem coexistir em uma mesma paciente, sendo considerada uma doença multifocal (Eres et al., 2018). Além das classificações já apresentadas, a EDT é também classificada, histologicamente, em dois tipos: EDT estromal (presença de estroma morfologicamente similar ao do endométrio eutópico em qualquer fase do ciclo menstrual) e EDT gl andular (presença de epitélio co m sinais de hemorragia prévia com hemossiderófagos e fibrose) (Abrao et al., 2003). É importante salientar que recentes avanços na ca racterização da doença têm sugerido uma modificação na atual definição histológica (ainda não estabelecida), incluindo a fibrose como um componente da lesão endometrial, de forma a reconsiderar a definição histológica, previamente definida, como “uma condição fibrótica na qual o estroma e o epitélio endometrial podem ser identificados” (Vigano et al., 2018). 4 1.1.2 Patogênese, fisiopatologia e progressão da endometriose Desde os primeiros achados de tecido de implantes do endométrio em ovário (Russel, 1899), diversas hipóteses têm sido propostas para a patogênese e progressão da EDT. Tais hipóteses não são excludentes e podem contribuir de forma complementar, para a compreensão da patogênese e da fisiopatologia da endometriose. A hipótese mais aceita para a origem de células endometriais em localização ectópica é, possivelmente, a frequente ocorrência da menstruação retrógrada (Sampson 1927b). Na menstruação retrógrada, o tecido endometrial reflui pelas tubas de Falópio até a cavidade peritoneal, facilitando a sua implantação e desenvolvimento no peritônio e/ou órgãos pélvicos. A detecção de detritos mens truais na cavidade peritoneal durante a menstruação, em condição fisiológica, é uma evidência de que tecido endometrial acessa, f isiologicamente, sítios fora do útero (Liu e Hitchcock, 1986). Além disso, dados epidemiológicos mostram haver um risco aumentado da doença qu ando há maior "exposição" à menstruação, seja por aumento do sangramento menstrual, ciclo mais curto, duração e maior número de menstruações (Missmer et al., 2004), obstrução d o fluxo uterino (Barbieri 1998) e anormalidades fisiológicas na contratilidade uterina (Salamanca e Beltran, 1995), indicando serem relevantes também, a quantidade e o tempo de exposição de restos menstruais que podem acessar sítios anatômicos fora do útero. Assim sendo, além da menstruação retrógrada, existem dados que apontam a possibilidade de outros mecanismos envolvidos na origem das células endometriais ectópicas, como as seguintes condições e hipóteses: 1) metaplasia celômica : células mesoteliais do p eritônio se diferenciariam em tecido endometrial, possivelmente, influenciadas por estímulos hormonais, infecciosos ou ambientais; 2) ativação de restos embriogênicos: uma diferenciação aberrante ou migração de dutos Müllerianos poderia levar ao “espalhame nto” de células durante a organogênese; 3) disseminação metastática (hematogênica ou linfática) : células endometriais viáveis sairiam do endométrio pela circulação sanguínea ou linfática, de maneira similar à metástase tumoral, favorecendo a ocorrência de endometriose longe do útero, onde se implantariam form ando lesões endometrióticas (Sampson, 1927a). A disseminação linfática poderia, pelo menos em parte, explicar a presença de tecido endometrial em vasos linfáticos e linfonodos (Aoki, 1967; Borrelli et al., 2015), bem como as raras ocorrências de endometriose em pulmões (Hobbs e Bortnick, 1940) e f ígado (Liu et al., 2015); 4) células tronco : células tronco extrauterinas/progenitoras originadas da medula óssea (como linhagens mesenquimais) poderiam se diferenciar, ect opicamente, em tecido endometrial . No entanto, essas outras possibilidades de origens da ocorrência de tecido endometrial fora do útero, parecem ser menos frequentes. 5 Embora a menstruação retrógrada explique o deslocamento físico do tecido endometrial para fora do útero, deve -se considerar que esse é um processo fisiológico muito comum, ocorrendo em até 90% das mulheres que menstruam. No entanto, uma vez que a prevalência de endometriose varia em torno de 10%, este fator, isoladamente, não explica a ocorrência de EDT, e outros fatores devem contribuir facilit ando o implante e desenvolvimento do tecido endometrial (lesões) fora da do útero (Burney e Giudice, 2012). Após a ocorrência ectópica de células endometriais, vários fatores podem contribuir para a formação das lesões endometrióticas. Dentre eles, podemos cita r a fixação e penetração na superfície peritoneal (na menstruação retrógrada como origem), proliferação celular, invasão, angiogênese, neurogênese e inflamação, fatores esses, possivelmente, envolvidos no desencadeamento da dor (Zondervan et al., 2018). Variações gênicas, como polimorfismos nos genes WNT4 (do inglês, Wnt Famil y Member 4 ) e GREB1(do inglês, Growth Regulating Estrogen Receptor Binding 1 (revisado em Borghese et al., 2017) bem como variações epigenéticas, como metilação anormal em fatores de transição (GATA6 e SF1 -do inglês, Steroidogenic Factor 1) e no gene E RB2 (do inglês, Encoding Estrogen Receptor 2 , que codifica o receptor ER β, do inglês, Estrogen Receptor Beta), também parecem contribuir para a etiologia da doença (revisado em Borghese et al., 2017). Destacamos que a hipometilação no gene ERB2, na EDT, gera uma falha na repressão da expressão do receptor ERβ, que passa a ser superexpresso no endométrio ectópico, em relação ao eutópico, de mulheres com EDT (Monsivais et al., 2014). Ademais, a lterações metabólicas, como o aumento do metabolismo de vitamina A, e consequente diminuição, parece s er relevante para a etiologia da endometriose. O ácido retinóico (AR), metabólito fisiológico ativo da vitamina A (retinol), controla diversos processos biológicos, como diferenciação, apoptose e sobrevivência celular, via sinalização por receptores nucleares em células alvo (RARs, do inglês, retinoic acid receptor) (revisado em Jiang et al., 2018). Sua via de ativação está envolvida na proliferação de epitélios e a transformação de células estromais endometriais em células deciduais especializadas. Portanto, a sinalização deficiente em ácido retinóico pode impl icar em aumento da proliferação e invasão celular, bem como limitar a apoptose celular de células endometriais ectópicas. Além disso, estrogênio (via receptor β), descrito como aumentado em tecido endometrial ectópico (Bulun, 2009), também pode suprimir a catalisação da conversão de retinaldeído em AR, via supressão da enzima ALDH1A1 (do inglês, Aldehyde Dehydrogenases), catalisadora da conversão de retinaldeído em AR (Deng et al., 2003). Ademais, e de maneira relevante, também o microambiente da lesão interage e regula tais fatores biológicos por meio uma variedade de fatores hormonais e celulares (revisado em Zondervan et al., 2018), a serem discutidos adiante. Considerando que o sistema imune é, fisiologicamente, capaz de detectar e eliminar tecidos em desenvolvimento em locais “anormais ”, é relevante explorar o seu papel no contexto da endometriose. Nesse sentido, vários estudos indicam que mulheres com EDT 6 apresentam diversas disfunções imunológicas, contribuindo de forma relevante para a eliminação ineficiente do endométrio ectópico e favorecendo a sua implantação. Assim, a condição imunológica da mulher com EDT é fundamental no desenvolvimento e na progressão da doença (Giudice e Kao, 2004). 1.2 Fisiologia do ciclo menstrual e imunobiologia da endometriose Durante cada período menstrual, as células somáticas, presentes na região funcional do endométrio, começam a sofrer apoptose, uma resposta biológica que reduz a chance dessas células sobreviverem e crescerem ectopicamente, dentro da cavidade peritoneal (Herington et al., 2011). Neste contexto, vamos destacar, inicialmente, a fisiologia normal do ciclo menstrual, de forma a facilitar o entendimento da imunobiologia da endometriose. 1.2.1 Fisiologia do ciclo menstrual Estruturalmente, o endométrio humano é composto pelas camadas basal e funcional, esta, eliminada durante a menstruação e regenerada, na ausência de gravidez (revisado em (Vallvé-Juanico et al., 2019). É composto ainda de dois compartime ntos teciduais: epitélio e estroma. O epitélio endometrial tem a função de promover a implantação do embrião e também tem papel na defesa contra a infecção (Kelly et al., 2001). O estroma consiste, principalmente, de fibroblastos, alguns mac rófagos e células T, mas poucas células B e células NK (Kelly et al., 2001). As glândulas tubulares, revestidas por epitélio, vão desde a superfície endometrial até a base do estroma (revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). O ciclo menstrual, embora contínuo, inicia -se no primeiro dia de menstruação e termina no último dia, antes da próxima menstruação. Tem duração média de 28 dias, podendo variar de 25 a, aproximadamente, 32 dias (Silberstein e Merriam, 2000).O funcionamento ovariano fisiológico envolve atividades coordenadas do hipotálamo, hipófise e ovários. O hipotálamo secreta o hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH , do inglês, Gonadotropin-Releasing Hormone); a hipófise, secreta o hormônio luteinizante (LH , do inglês, Luteinizing Hormone ) e hormônio folículo estimulante (FSH , do inglês, Follicle-stimulating Hormone); o ovário, secreta estrogênio e progesterona, inibinas, ativinas, e outros moduladores ovarianos. Complementar a esse processo, o endométrio uterino responde aos hormônios estrogênio e progesterona, com produção de prostagl andinas (Silberstein e Merriam, 2000). A morfologia do endométrio, sua proliferação, diferenciação de seus componentes celulares bem como a presença de células imunes, variam ao longo do ciclo sob a influência, principalmente, de estrogênio e progesterona (revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). 7 O ciclo menstrual pode ser dividido em duas fases, a fase folicular ou proliferativa, e a fase lútea ou secretora. A fase proliferativa inicia -se no primeiro dia da menstruação e segue até a ovulação, geralmente no 14º dia. Portanto, consider ando-se um ciclo médio de 28 dias, compreende de 1-14o dia do ciclo. A fase secretora compreende os 14 dias restantes do ciclo (15-28o dia) (revisado em Reed e Carr, 2000). Durante o ciclo menstrual, os hormônios esteróides ovarianos, estr ogênio e progesterona, regulam a função endometrial e a menstruação (Maybin e Critchley, 2015). O endométrio menstrual apresenta características clássicas de inflamação, como edema de tecido e influxo de células do sistema imune, sendo considerado um processo fisiológico e rigidamente regulado (Critchley et al., 2001). Tanto o ovário como o endométrio apresentam um processo de inflamação fisiológica repetido, durante a ovulação e a menstruação, respectivamente, ao longo da vida reprodutiva da mulher (Rae e Hillier, 2005). Células como m acrófagos, neutrófilos e células NK participam da proteção imunológica da mucosa uterina e estão envolvidas no remodelamento endometrial (Salamonsen et al., 2002), decidu alização e implantação embrionária e, na ausência de gravidez, facilitam o processo de menstruação (Salamonsen e Lathbury, 2000). A maior parte das células imunes, no endométrio, são tecido residentes, mas parte pode migrar da circulação periférica (Lee et al., 2015). Elas estão espalhadas po r todo estroma e também entre as células epiteliais, na camada funcional. Na fase proliferativa do ciclo, as células T são a maior parte dos leucócitos, seguidas por células NK e macrófagos (Lee et al., 2015). Na camada basal do endométrio, são formados agregados linfóides compostos por células B e circundadas por células TCD8+ citotóxicas, as quais são também circundadas por macrófagos (Yeaman et a l., 2001). Os macrófagos compreendem, aproximadamente, 1 -2% das células do endométrio e, em torno de 10% do total de células imunes endometriais, na fase proliferativa do ciclo (Salamonsen et al., 2002). Essa fre quência é alterada durante as fases do ciclo, sugerindo haver uma regulação por estrogênio e progesterona (Berbic et al., 2009). As células NK uterinas (uNK) compreendem cerca de 30-40% (Manaster e Mandelboim, 2008) de leucócitos totais, na fase proliferativa do ciclo. Durante a fase proliferativa, o hormônio FSH estimula o ovário a produzir o estrogênio, no entanto, a reparação e regeneração do tecido endometrial, pós menstruação, é independente desse hormôni o ( revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). Entretanto, posteriormente, du rante toda a fase proliferativa, o estrogênio induz a mitose de todos os constituintes celulares, incluindo epitélio luminal e gl andular, fibroblastos estromais e componentes vasculares ( revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). O estrogênio estimula a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF, do inglês, Vascular Endothelial Growth Factor ) no endométrio uterino (Cullinan-Bove e Koos, 1993), com consequente aumento da sua vascularização. C élulas do sistema imune, como células TCD4, TCD8, linfócitos B, células NK, monócitos e DCs (do inglês, Dendritic Cells) plasmocitóides, 8 apresentam receptores de estrogênio e podem ter suas funções moduladas por esse hormônio (Kovats, 2015). Foi demonstrado que o estrogênio modula a expressão de citocinas e quimiocinas por DCs derivadas de monócitos humanos (revisado em Hafner et al., 2013). Por conseguinte, o estrogênio aumenta a produção de interleucina (IL) -12 por DCs, que atua em células Th1, desencadeando a produção de IFN -γ por essas células, caracteriz ando, portanto, o envolvimento do estrogênio na ativação de respostas imunes adaptativas (revisado em Hafner et al., 2013). Também as células Treg estão aumentadas, no endométrio, na presença de estrogênio, durante a fase proliferativa do ciclo, diminuindo durante a fase secretora (Arruvito et al., 2007), possivelmente via interação do receptor α de estrogênio (ERα , do inglês, Estrogen Receptor α ) e o promotor do fator de transcrição de FOXP3 (do inglês, Forkhead Box P3) (Adurthi et al., 2017). Este aumento de Treg, antes da ovulação, sugere seu envolvimento na preparação adequada do endométrio à implantação de embriões. Atuam inibindo a atividade citotóxica de células do sistema imune, bem como a atividade efetora de outros tipos de células, por meio da secr eção de citocinas imunossupressoras, como IL-10 e TGF-β (do inglês, Transforming Growth Fator Beta) (Arruvito et al., 2007), mantendo um ambiente com característica, provavelmente, de imunotolerância (Sakaguchi et al., 2010). Após a perda da camada funcional do endométrio, na menstruação, no início da fase proliferativa do ciclo, níveis crescentes de estrogênio participam do reparo e crescimento do endométrio a partir da ca mada basal (Osteen et al., 2003), bem como do aumento da expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) (do inglês, Matrix Metalloproteinase Protein). Alguns estudos indicam que a ativação da transcrição do gene MMP ocorra, principalmente via ligação do receptor de estrogênio com a proteína ativadora -1 (AP -1, do inglês, Activator Protein 1) (Teyssier et al., 2001). De forma coordenada com o remodelamento endometrial, numerosas MMPs são expressas em áreas de crescimento ativo do endométrio, durante toda a fase proliferativa (Rodgers et al., 1994). MMP-7 é expressa em células epi teliais, enquanto as células do estroma expressam mRNAs para MMP-1, MMP-2 e MMP-11, e baixa expressão para MMP-3 (Rodgers et al., 1994). A proteína MMP -9, mas não mRNA, foi identificada em células epiteliais e em associação com células imunes residentes (Skinner et al., 1999). Também os TIMPs (do inglês, Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, inibidores teciduais de metaloproteinases) são geralmente co -expressos com MMPs, modul ando o controle da reparação tecidual (Osteen et al., 2003). Em recente trabalho (Crona et al., 2021), a análise do perfil de citocinas no plasma de sangue menstrual de mulheres saudáveis indicou a presença de altas conce ntrações de IL-6, IL-1β e IL-8 (ou CXCL8, C-X-C Motif Chemokine Ligand 8), na comparação com o perfil de citocinas no sangue periférico, pareado, dessas mulheres. No entanto, os níveis de IL -2, IL- 12p70, XCL1/linfotactina e IFN -γ foram menores do que os ní veis periféricos. Estes dados indicam haver um padrão distinto de citocinas no sangue menstrual em relação do sangue 9 periférico. Neste mesmo estudo, também observaram que as citocinas analisadas no plasma sanguíneo menstrual não tiveram diferença entre as fases do ciclo menstrual. Uma vez atingindo altos níveis de estrogênio, ocorre a inibição da secreção de FSH pela hipófise. A diminuição do FSH e o aumento do estrogênio estimulam a hipófise a secretar o hormônio LH, que induz a ovulação (Maybin e Critchley, 2015). Após a ovulação, o corpo lúteo passa a secretar altos níveis de progesterona contribuindo na manutenção da receptividade endometrial, em caso de fertilização. Durante a fase secretora (pós -ovulação, e até a menstruação), a progesterona atua sobre o endométrio previamente estimulado com estrogênio, lev ando à sua decidualização. A decidualização é caracterizada pela transformação das células endometriais estromais em células deciduais secretoras (Gellersen et al., 2007). Alteração e/ou quebra neste processo de diferenciação do endométrio estão associadas a uma série de distúrb ios como endometriose e adenomiose, sendo também importante causa de infertilidade e distúrbios menstruais (Brosens, 1998). As respostas celulares à progesterona são, predominantemente, mediadas pelo receptor de progesterona (RP), um membro da superfamília de fatores de transcrição induzíveis de ligante (Parker, 1993). Na ausência de ligação com progesterona, o RP é mantido num complexo inativo contendo proteínas de choque térmico HSP90 (Pratt 1990) e HSP70 (Estes et al., 1987). O RP te m, pelo menos, duas isoformas, RPA e RPB, presentes durante a fase proliferativa do ciclo, tanto em glândula, como no estroma endometrial, ocorrendo um declínio significativo nas c élulas epiteliais gl andulares na fase secretora do ciclo. Por outro lado, os RP persistem no estroma endometrial da camada funcional ao longo da fase secretora, com predomínio da isoforma A (Wang et al., 1998). Assim, as células estromais do endométrio permanecem responsivas à progesterona durante toda a fase secretora. Em relação a expressão proteica do RP em células do sistema imune, embora a progesterona tenha efeitos funcionais em células como linfócitos, monócitos, macrófagos e células dendríticas, o seu mecanismo de ação (ou seja, proteínas alvo) não está claramente definido, com alguns estudos sugerindo a expressão do receptor (Butts et al., 2007; Szekeres-Bartho et al., 1990), e outros não (Mansour et al., 1994). Em contraste com a fase proliferativa do ciclo, na fase secretora tardia, as células uNK (CD56brightCD16-) estão em maior frequência, compreendendo, aproximadamente 70 -80% do total de leucócitos. Os macrófagos atingem cerca de 30% e as células T diminuem para menos de 10% (Flynn et al., 2000) dos leucócitos endometriais. Células dendríticas imaturas (iDC, CD1a +CD209+HLADRlow) estão descritas em número aumentado na camada basal, nas fases secretora e menstrual (Marbaix, 2005). No entanto, em relação às DCs maduras (mDC, CD83 high/HLA-DRhigh), há um estudo indicando ausência de alteração de frequência ao longo do ciclo (Marbaix 2005) e outro com um aumento na camada basal do endométrio, nas fases secretora e menstrual do ciclo menstrual (King et al., 1996). 10 O aumento de iDC durante a fase secretora/menstrual sugere um papel dessas células na menstruação (Marbaix, 2005). Nesse sentido, as iDCs produzem MMPs que são importantes neste processo (Marbaix, 2005). Além disso, iDCs também produzem citocinas e quimiocinas, como IL -6, IL -10, IL -12, TNFα, RANTES (do inglês, Regulated on Activation Normal T-cell Expressed e Secreted ) e MCP-1, que poderiam promover a menstruação ou facilitar a nidação do embrião e regular outras populações celulares (Schulke et al., 2008). Em relação às ci tocinas na fase secretora do ciclo, embora no estudo em sangue menstrual acima descrito (Crona Guterstam et al., 2021), não tenha sido observada diferença nos seus níveis de expressão, entre as diferentes fases do ciclo menstrual, a análise de expressão gênica em sangue per iférico mostrou que a expressão IFN -γ está diminuída na fase secretora/lútea, comparada com a fase proliferativa/folicular (Dosiou et al., 2004). Ao final da fase secretora, e na ausência de gravidez, o corpo lúteo regride, caus ando um relevante declínio nos níveis de progesterona circulantes (Maybin e Critchley, 2015). Esse contexto fisiológico gera uma resposta inflamatória local no endométrio, envolvendo infiltração de leucócitos, liberação de citocinas, edema e ativação de metaloproteinases de matriz (Jabbour et al., 2006), resultando na perda da camada funcional do endométrio (cerca de dois terços superiores), correspondendo ao período menstrual do ciclo. Várias células do sistema imune participam do processo de fisiológico da menstruação, algumas com importante função na eliminação de restos menstruais (“ clearence uterino”) (Berbic e Fraser, 2013). Após a queda da progesterona, há um aumento significativo da população de leucócitos endometriais (Salamonsen e Lathbury, 2000), compreendendo de 6 -15% do número total de células no endométrio (Salamonsen e Lathbury, 2000). Já volt ando à fase proliferativa, no período menstrual, as c élulas dendríticas (imaturas e maduras) e outras células apresentadoras de antígenos (APCs , o inglês Antigen-Presenting C ell) estão envolvidas no processo de “limpeza”, particip ando da captura e apresentação antígenos endometriais e ativ ando células T, facilit ando a eliminação de restos endometriais (Berbic e Fraser, 2013). Os neutrófilos, princip ais mediadores da resposta inflamatória, respondem à inflamação local, migr ando, rapidamente, para o endométrio “inflamado”, onde podem sobreviver por vários dias, devido à diminuição de sua atividade apoptótica, induzida por mediadores pró-inflamatórios e hipóxia (Ward et al., 1999). Há um aumento do número de macrófagos dando-se início ao processo de a poptose de células endometriais e à fagocitose de restos celulares eliminados durante a menstruação (Berbic et al., 2009). Embora a queda da progesterona tenha um importante papel no início da menstruação, a sua diminuição também promove o aumento da expressão de MMPs, por células epiteliais estroma is e neutrófilos (Salamonsen e Woolley, 1999). Os neutrófilos contêm altos níveis de MMPs e têm a capacidade de ativar MMPs residentes, contribuindo para a ruptura endometrial (Gaide Chevronnay et al., 2012). As MMPs funcionam como 11 mediadores da “ruptura” do endométrio , uma vez que degradam os componentes da matriz extracelular (Marbaix et al., 1996). Durante a menstruação, as células presentes na região funcional do endométrio e as que compõem o material de menstruação retrógrada, começam a sofrer apoptose (Herington et al., 2011). Estes restos celulares, presentes na cavidade peritoneal, sã o, posteriormente, eliminados por células do sistema imune, como macrófagos, células NK (do inglês, natural killer) e células T citotóxicas, sem que ocorra um processo inflamatório significante e duradouro ( Dmowski et al., 2001). Alguns estudos mostram a existência de uma atividade citotóxica fisiológica mediada por células NK contra células endometriais autólogas (Oosterlynck et al., 1991; Viganò et al., 1991; Hirata et al., 1994). As células NK agiriam como um "sistema de limpeza peritoneal" ( clearence) envolvido na eliminação eficaz de células endometriais ectópicas, evitando assim, sua implantação e crescimento ( revisado em Hafner et al., 2013). A ação dessas células é finamente regulada, negativamente, favorecendo a resposta imune específica contra células refluídas, e não contra o tecido peritoneal normal. Alterações nesses processos biológicos da fisiologia da menstruação podem levar a distúrbios ginecológicos e também integram a fisiopatologia da endometriose. 1.2.2. Imunobiologia da endometriose A endometriose é um processo patogênico que envolve múltiplas desregulações imunológicas, bem como desregulações de interações imuno-endócrinas. Primeiramente podemos citar que o próprio endométrio eutópico de mulheres com EDT apresenta características diferentes qu ando comparado ao endométrio de mulheres saudáveis. Tais características englobam diversos aspectos, incluindo disfunções imunológicas, endócrinas e bioquímicas, bem como alterações genéticas que, de forma combinada, desempenham um papel importante na patogên ese e fisiopatologia da endometriose (revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). O endométrio eutópico de mulheres com EDT apresenta um aumento da expressão do gene anti-apoptótico BCL-2 (do inglês, B-celllymphoma 2) (Jones et al., 1998), diminuindo a capacida de apoptótica de células endometriais deliberadas durante a menstruação, indicando um aumento da viabilidade dessas células, facilit ando sua sobrevivência e implantação ectópica (Dmowski et al., 2001). A apoptose espontânea está dim inuída em glândulas endometriais de mulheres com EDT, especialmente durante a fase secretora tardia/menstrual e na fase proliferativa precoce (Dmowski et al., 2001). De fato, as células endometriais de mulheres com EDT apresentam maior capacidade de implantação (Kyama et al., 2008), angiogênese (Donnez et al., 1998) e proliferação (Wingfield et al., 1995; Bourlev et al., 2006), com diversos fatores envolvidos, e discutidos abaixo. 12 As células endometriais, que possuem menor capacidade apoptótica, chegam na cavidade abdominal (células endometriais ectópicas) e invadem o tecido local. Como na EDT há maior capacidade de implantação (Kyama et al., 2008) e angiogênese (Donnez et al., 1998), o crescimento das células endometriais ectópicas leva à formação das lesões endometrióticas (revisado em Liu e Lang, 2011). A compreensão de como as células endometriais aderem, ectopicamente, aos ovários, ligamentos e superfícies peritoneais e como, uma vez aderidas, essas células proliferam, adquirem suplemento sanguíneo e resultam em endometrio se, continua sendo alvo de constantes pesquisas. Dentre os principais possíveis mecanismos envolvidos no estabelecimento e progressão da doença estão a intensa resposta inflamatória em mulheres geneticamente suscetíveis, a transição epitelial -mesenquimal, disfunção imunológica e da presença de um ambiente metabólico e endócrino favorável nessas mulheres ( revisado em Zondervan et al., 2018). A EDT é considerada uma doença estrogênio dependente (Bulun, 2009), uma vez que esse hormônio contribui para o crescimento celular ( revisado em Zondervan et al.,, 2018). A enzima aromatase (que converte androgênio em estrogênio) está ausente no endométrio de mulheres sadias (Baxendale e Reed, 1981). Porém, nas mulheres com EDT, há altos níveis da enzima aromatase e baixos níveis da enzima 17-beta-hidroxi-esteróide-desidrogenase-22 (conversora de estradiol em estrona), tanto no tecido endometrial eutópico como no ectópico. Como consequência, há um nível maior de estrogênio nesses locais. Essa alta concentração de estrogênio, associada ao aumento de receptores de estrogênio (Bulun, 2009), ativam genes envolvidos na proliferação celular, tais como GREB1 , MYC ( c-myc, família de p roto- oncogenes que codifica uma fosfoproteína nuclear com papel na progressão do ciclo celular, apoptose e transformação celular) e CCND1 (do inglês, Cyclin D1; gene que codifica uma proteína que funciona na regulação de Cinases Dependentes de Ciclina (CDK)), no ciclo celular. A maior presença de estrogênio em tecido endometrial ectópico, além de favorecer a proliferação de células endometriais, estimula a produção de prostagl andinas, pela ativação da enzima cicloxigenase 2 (COX 2, do inglês, Cyclo-Oxygenase 2), que pode estimular ainda mais a aromatase, contribuindo para a manutenção dos implantes endometrióticos e para a manutenção de ambiente inflamatório (Attar e Bulun, 2006). A produção excessiva de estrogênio também tem ação na resposta imune, contribuindo para a inibição da fagocitose por macrófagos, as principais células responsáveis pela eliminação dos restos celulares na cavidade peritoneal (Sidell et al., 2002). O estrogênio age em várias vias de sinalização do macrófago, influenci ando, em particular, naquelas relacionadas à habilidade de manter o recrutamento de células inflamatórias e no remodelamento de tecidos inflamados [ MPAK, do inglês, Mitogen-Activated Protein Kinases, proteína quinase ativada por mitógeno (Seval et al., 2006), PI3K/AKT, do inglês, Phosphatidylinositol 3-Kinase, fostatidilinositol-3 quinase/proteína quinase B ) (Kayisli et al., 2004) e NF-κB (do inglês, Nuclear Factor Kappa - 13 light-chain-enhancer of activated B cells , fator nuclear kappa) (McKay e Cidlowski, 1999)]. Sua desregulação pode ter, como consequência, a sobrevivência de células ectópicas e a promoção da vascularização das lesões (revisado em Cakmak et al., 2009). As disfunções hormonal e imunológica, na EDT, caminham juntas, uma vez que além dos macrófagos, diversas células imunes, como linfócitos T, linfócitos B, eosinófilos e neutrófilos também expressam o receptor funcional de estrogênio , GPER1 (do inglês, G Protein-coupled Estrogen Receptor 1, receptor 1 de estrogênio acoplado à proteína G) (Notas et al., 2020). Além da produção local de estrogênio, a resistência à progesterona presente nas mulheres com endometriose, pode contribuir para a fisiopatologia da doença. Foram observados baixos nívei s de receptores de progesterona e a ausência da sua isoforma B, tanto no endométrio eutópico (Burney et al., 2007), como no ectópico (Bulun et al. 2006), quando comparados às mulheres saudáveis. A desregulação da expressão dos receptores de progesterona, ou mesmo alterações nas vias de sinalização causam resistência à progesterona em até 30% das mulheres com EDT (Vercellini et al., 2013). Nest e caso, a diminuição da ação de progesterona, que tem impactos anti-inflamatórios (Bulun et al., 2006), também parece contribuir para a sobrevida/implantação de implantes endometriais e para a manutenção de inflamação local. Em resumo, alterações hormonais também podem contribuir no aumento da capacidade de células endometriai s ectópicas proliferarem, no aumento da adesão ao mesotélio peritoneal ( revisado em Ahn et al., 2015) e/ou na diminuição da capacidade do sistema imune em eliminar essas células da cavidade peritoneal (Sidell et al., 2002). A sobrevivência dos implantes endometrióticos na parede peritoneal depende do suprimento sanguíneo para o fornecimento de oxigênio e nutrientes às lesões em desenvolvimento. As lesões endometrióticas são altamente vascularizadas, indic ando que a angiogênese e/ou a vasculogênese devem estar envolvidas no sucesso da sua implantação (Nisolle et al., 1993). Análoga ao processo de vascularização dos tumores, a EDT pode utilizar de mecanismos de angiogênese e vasculogênese, que contribuem no estabelecendo de uma rede vascular própria e na sua manutenção (revisado em Ahn et al., 2015). Assim, as lesões endometrióticas se estabelecem em microambiente onde os mediadores inflamatórios se mantêm presentes. Considerando-se que o endométrio humano normal sofre proliferação, diferenciação e regeneração a cada ciclo menstrual, há atividade angiogênica inata, sob regulação do estrogênio, de forma que juntamente com o crescimento endometrial, ocorre proliferação e regeneração também da vasculatura endometrial, a cada ciclo (revisado em Ahn et al., 2015). Esse processo fisiológico parece estar desregulado na EDT, uma vez que o end ométrio eutópico de mulheres com endometriose apresenta maior densidade de microvasos, maior expressão de VEGF-A (fator de crescimento vascular endotelial A) no epitélio glandular e de VEGFR-2 ( do inglês, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor -2, receptor do fator de 14 crescimento vascular endotelial 2) nos vasos sanguíneos. Tais fatores corroboram o envolvimento de angiogênese e neovascularização de lesões, contribuindo no estabelecimento da doença (Bourlev et al., 2006). Além disso, VEGF atua como um fator de sobrevivência, prevenindo a morte apoptótica de células endoteliais microvasculares (Watanabe e Dvorak, 1997). Ainda outros elementos importantes na fisiopatologia da endometriose envolvem a maior capacidade de adesão dos fragmentos endometriais, descrita na EDT be m como concentrações elevadas de MMP e do ativador do plasminogênio, no endométrio eutópico de mulheres com EDT (Klemmt et al., 2007). Em conjunto, esses dados sugerem haver aumento da proteólise dos fragmentos endometriais que saem para a cavidade peritoneal, via menstruação retrógrada, facilitando o estabelecimento como lesões endometrióticas (Gilabert-Estellés et al., 2003). De fato, níveis de MMP -9, que tam bém tem atividade imunorreguladora (Lavini-Ramos et al., 2017) estão elevados em amostras de soro de mulheres com EDT (Becker et al., 2010). A MMP-9 degrada o colágeno e a elastina, induz a neovascularização, acelera a expansão das células endoteliais vasculares e aumenta o fluxo sanguíneo (De Sanctis et al., 2011). Ainda no contexto de ação d e MMPs na fisiopatologia da EDT, o mecanismo de desenvolvimento embrionário, transição epitélio -mesênquima, ou transição mesênquima - epitélio é reconhecido como mais um componente na fisiopatologia da EDT. Esse tipo de alteração tecidual ocorre num contexto de inflamação crônica, onde células epiteliais adquirem um fenótipo mesenquimal invasivo (com modificações na expressão de moléculas de adesão como perda de E -caderina e ganho de N -caderina), com aumento de fator de crescimento e da expressão de metalopro teinase de matriz, facilitando a proliferação celular (revisado em Zondervan et al., 2018). A transição epitélio -mesênquima também é considerada, dentre os mecanismos ativo sem células tumorais durante a invasão celular e metástase (Orlichenko e Radisky, 2008). No entanto, não há estudos que indiquem, exatamente, que tipo de transição epitélio-mesênquima ocorre na EDT (Yang e Yang, 2017). Foi observado que estímulos, como hipóxia e estrogênio, podem, por diferentes vias, ativar esse processo na doença, envolvendo fatores como TGF -β e a via da sinalização, Wnt, estimulando a proliferação e migração celular (Yang e Yang, 2017). Outros mecanismos discutidos como importantes no estabelecimento e progressão da EDT são relacionados às disfunções do sistema imune dessas mulheres, considerado incapaz de reconhecer e/ou montar uma resposta imune efetora adequada e eliminar os fragmentos de endométrio na cavidade pélvica. É possível que os próprios fragmentos endometriais também adquiram a capacidade de evasão da resposta imune, qu ando na cavidade pélvica, havendo, provavelmente, uma combinação de fatores imunológicos e endometriais alterados na doença (revisado em Ahn et al., 2015). As alterações imunológicas já relatadas nas mulheres com EDT incluem tanto disfunções da imunidade mediada por cél ulas como na imunidade humoral. No contexto 15 humoral, foram observados depósitos de IgG e de Fator 3 do sistema complemento (C3) no endométrio eutópico de pacientes com endometriose, com correspondente diminuição dos níveis de complemento total no soro (Weed e Arquembourg, 1980), indicando a ocorrência de ativação da cascata do complemento. Também foi observada maior expressão gênica e proteica de vários componentes do sistema complemento em mulheres com EDT, em relação ao endométrio normal de mulheres controles (CTRs) (Suryawanshi et al., 2014). Dentre eles, o fator 7 do complemento (C7), considerado altamente expresso, além do fator B, D, H e MASP1 (do inglês, mannose-associated serine protease 1, serina -protease associada à manose). A maioria das proteínas do complemento tem expressão em células epiteliais glandulares endometrióticas , sugerindo que a ativação do sistema complemento pode ser, inicialmente, um processo envolvido na eliminação de células endometrióticas, mas sem eficácia, e que, possivelmente contribui para o processo de inflamação crônica da EDT, como já descrito em outras doenças (revisado em Ricklin et al., 2010). Ainda em relação a alterações humorais, foi observada uma maior frequência de reconhecimento de antígenos endometriais (extrato tecidual eutópico e ectópico) por anticorpos IgG, presentes tanto no soro como no fluido peritoneal (FP), de mulheres com EDT, em relação a mulheres saudáveis (Mathur et al., 1990). Há também descritos maiores níveis de autoanticorpos contra fosfolipí deos, histonas, polinucleotí deos (Gleicher et al ., 1987) e músculo liso (Taylor et al., 1991) em relação a mulheres CTRs, sem a doença. Estes achados su gerem haver uma maior exposição de autoantígenos no endométrio eutópico e ectópico de mulheres com EDT desencade ando processos de autoimunidade patológica, possivelmente, compondo a fisiopatologia da doença. Assim, o excesso de proteínas endometriais em lo calização extrauterina, poderia contribuir para uma resposta autoimune inflamatória, na EDT. Apesar desses achados, indicando a ocorrência de resposta imune humoral dirigida a autoantígenos e ativação da cascata do complemento, sugerindo um componente de a utoimunidade patológica, na EDT, não se sabe, ao certo, o quanto o processo autoimune é importante na fisiopatologia da EDT. Enquanto alguns estudos, como os acima citados, focam no conceito de EDT com características de autoimunidade patológica, cada vez mais acumulam -se dados também mostrando alterações na função de diversas células do sistema imune. Diversos estudos indicam que a vigilância imunológica nas mulheres com EDT está prejudicada e que as células do sistema imune, tanto as residentes, como as recrutadas para a cavidade abdominal, parecem ser incapazes de responder de forma adequada à permanência de células endometriais ectópicas, tanto em relação ao seu reconhecimento, como quanto à sua eliminação (Dmowski e Braun 2004; Herington et al., 2011). Nesse sentido, destacamos que as células da resposta imune inata estão intensamente envolvidas na patofisiologia da doença, incluindo neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células NK (Symons et al., 2018). 16 Os neutrófilos, as células primárias da resposta imune inata a serem recrutadas para locais com inflamação – infecção e/ou dano tecidual (Petri e Sanz, 2018), no contexto da EDT, são encontrados numa maior frequência no fluido peritoneal dessas pacientes, em relação às mulheres sem a doença (Tariverdian et al., 2009). Este achado é, possivelmente, resultado de concentrações elevadas de citocinas, como a IL-8, com função quimiotática para neutrófilos, no plasma e fluido peritoneal de mulheres com EDT quando comparado aos de mulheres CTRs, sem a doença (Monsanto et al., 2016). Células como macrófagos, DCs e mastócitos contribuem para a resposta inflamatória inicial, participando na eliminação das células ectópicas, mesmo que de forma insuficiente, dando início à reparação do tecido peritoneal que sofreu injúria (Herington et al., 2011). A fagocitose por macrófagos é auxiliada por metaloproteinases de matriz (MMP) e pela expressão do receptor scavenger, CD36, promovendo a degradação (Osteen et al., 2003) e eliminação de restos celulares (Febbraio et al., 2001), que chegam na cavidade abdominal. Embora o número de macrófagos seja maior no líquido peritoneal (Hill et al., 1988) e no endométrio eutópico (Berbic et al., 2009) de mulheres com EDT, em comparação com mulheres CTRs, esses macrófagos apresentam uma redução na expressão e atividade da MMP-9 (Wu et al., 2005) e redução de expressão do receptor CD36 (de Villiers et al., 1994). Como consequência, ocorre uma diminuição da capacidade fagocítica e de degradaçã o de detritos por esses macrófagos (Chuang et al ., 2009; Halme et al., 1984). A presença de macrófagos ativados na cavidade peritoneal, independentemente de sua capacidade fagocítica, contribui para as maiores concentrações de c itocinas pró -inflamatórias e quimiotáticas, já observadas no fluido peritoneal de mulheres com endometriose, em relação às mulheres CTRs. São descritos níveis maiores de MIF (do inglês, Macrophage migration Inhibitory Fator) (Kats et al., 2002), TNF-α (do inglês, Tumor necrosis fator alpha) (Eisermann et al., 1988), Interleucina (IL) 1β, IL -6 (Harada et al., 1997), IFN-γ (do inglês, Interferon gamma) (Podgaec et al., 2007; Bellelis et al., 2019), IL-8, RANTES , MCP-1 (do inglês, Monocyte Chemoattractant Protein 1) (Akoum et al., 1996), IL-7 e IL-15 (Bellelis et al., 2019). Em condições fisiológicas, os macrófagos participam da e liminação de resíduos celulares provenientes da menstruação, bem como da regeneração de tecidos e angiogênese (revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). Macrófagos M2, com propriedade anti -inflamatória são predo minantes na condição fisiológica , indicando que o endométrio eutópico em mulheres saudáveis apresentam um ambiente anti-inflamatório, que permite a implantação do embrião. No entanto, na EDT, a principal população de macrófagos no endométrio eutópico são os M1, com propriedade pró -inflamatória, conferindo, portanto, um microambiente endometrial com característica mais infla matória, nessas mulheres (revisado em Vallvé- Juanico et al., 2019). Além disso, diferentemente de DCs, os macrófagos não aumentam na fase secretora do ciclo, contribuindo para a manutenção de restos endometriais, que podem sobreviver e migrar para a cavidade peritoneal, favorecendo sua implantação e desenvolvimento de lesões ectópicas (revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). 17 As células dendríticas, DCs, com função relevante na apresentação de antígenos e na modulação da resposta imune dependente de linfócitos T, também apresentam alterações funcionais nas mulheres com EDT. As DCs imaturas (CD1a+) que, em geral, têm predomínio de atividade imunorregula dora, estão em maior densidade nas lesões peritoneais, quando comparada à densidade observada no tecido peritoneal, livre de lesão das mesmas mulheres, ou ao tecido peritoneal de mulheres sem EDT, no qual estão ausentes (Schulke et al., 2009). Essa s mesmas DCs avaliadas no endométrio eutópico das mulheres com EDT, apresentam-se em maior densidade na camada basal do endométrio durante a fase proliferativa do ciclo menstrual, em comparação com as mulheres CTRs, sem a doença, na mesma fase do ciclo. As DCs maduras (CD83+), com alta capacidade de apresentação antigênica, têm uma significativa menor densidade no endométrio eutópico de mulheres com EDT, tanto na camada basal como na funcional, em relação às mulheres saudáveis, em todas as fases do ciclo (Schulke et al., 2009). Essas alterações sugerem uma possível alteração primária da função imune já no endométrio eutópico das mulheres com EDT, com uma menor capacidade de apresentação antigênica e ativação da função efetora linfocitária. A fisiopatologia da EDT, pode ainda envo lver células T reguladoras (Treg), que têm funções no controle da resposta imune inflamatória. Estas células produzem citocinas imunorreguladoras, como IL -10 e TGF -β (do inglês, Transforming Growth Factor Beta) (Nandakumar et al., 2009), podendo atuar na inibição da ativação de macrófagos, da proliferação de células T e B, na função de DCs e NKs, além da redução da at ividade das células T efetoras (Sakaguchi et al., 2006), tendo importante função na manutenção da tolerância ao próprio. Foi observado um maior número de células Treg que expressam o fator de transcrição FOXP3 (do inglês, forkhead Box P3) no endométrio eutópico (imunohistoquímica) nas mulheres com EDT na fase proliferativa precoce e durante toda a fase secretora do ciclo menstrual, em comparação às mulheres saudáveis (Berbic et al., 2010). Esse dado sugere que no microambiente do endométrio eutópico das mulheres doentes haja uma menor capacidade efetora de células T envolvidas no reconhecimento de antígenos endometriais que chegam à cavidade perito neal, permitindo sua sobrevivência e facilitando sua implantação em sítios ectópicos. Também há relatos de maiores níveis de IL - 10 e IL-4 no fluido peritoneal de mulheres com EDT, em relação a mulheres CTRs saudáveis, além de razões de citocinas anti -inflamatórias/pró-inflamatórias (regula/inflama) IL -4/IFN-, IL-4/IL-2, IL-10/IFN-, IL-10/IL-2 (Podgaec et al., 2007). Esses dados indicam que, além da presença de um perfil inflamatório de resposta imune (Th1), citocinas com perfil, predominantemente, imunorregulador (Th2) também participam da fisiopatologia da EDT. A presença deste perfil regulador é também corr oborada por outro estudo que identificou a presença de um maior número de células com fenótipo, predominantemente, regula, CD4+CD25high, no fluido peritoneal de mulheres com EDT, com maior expressão de mRNA de Foxp3 nestas células (Podgaec et al., 2012), em relação às mulheres sem a doença. Além disso, a expressão de mRNA para as citocinas com padrão regulador, IL-4 e IL- 18 10 mais elevada em linfócitos, tanto do sa ngue periférico como do tecido endometrial, em mulheres com EDT em relação a mulheres CTRs, sem a doença (Antsiferova et al., 2005). Corroborando este achado, há relatos de uma predominância de IL -4 e IL -10 no FP de mulheres com EDT profunda (Podgaec et al., 2010), refletindo a ativação de mecanismos imunorreguladores, provavelmente, de forma descontrolada, gerando uma condição de imunossupressão com prejuízo na resposta imune efetora no sítio de acometimento da doença. Além das células acima c itadas com possível envolvimento no estabelecimento e progressão da EDT, especial atenção tem sido dirigida à contribuição de células NK na resposta imune na EDT e, mais especificamente, ao seu envolvimento no escape imunológico dos fragmentos endometriais ectópicos da cavidade peritoneal (Thiruchelvam et al., 2015). Vários estudos descrevem alterações funcionais e/ou fenotípicas, tanto local (microambiente da lesão) (Oosterlynck et al., 1992; Wu et al., 2000; Maeda et al., 2002) como sistêmicas (Wilson et al., 1994; Maeda et al., 2002), de células NK, na EDT, porém os mecanismos associados a tais alterações na doença ainda são objeto de investigação. 1.3 Células Natural Killer na endometriose As células NK compreendem, aproximadamente, 10 -15% dos linfócit os circulantes, e apresentam papel importante na resposta imune inata. São caracterizadas pelo fenótipo CD3‐CD56+ (CD3, marcador específico para linfócitos T; CD56; isoforma da molécula de adesão neural). Podem ainda ser subdivididas, fenotipicamente, em d uas subpopulações distintas, CD56 bright e CD56 dim, com base na densidade de CD56 (bright, alta expressão, e dim, baixa expressão) na superfície celular (Fehniger et al., 2003). A subpopulação CD56 dim compreende cerca de 90% das células NKs circulantes, sendo consideradas maduras e, predominantemente, citotóxicas e produtoras de citocinas após estimulação com células -alvo (Caligiuri, 2008). A subpopulação CD56 bright é, geralmente, considerada mais proliferativa, e com capacidade para a produção de citocinas após estimulação com IL -12 e IL-18, mas com uma baixa atividade citotóxica em repouso (Caligiuri, 2008). As células CD56bright (Fehniger et al., 2003) podem deixar os vasos sanguíneos e se constituírem como a maioria das células NK encontradas dos nódulos linfáticos ou em tecidos deciduais de mulheres grávidas. Nesses tecidos deciduais constituem cerca de 70% dos linfócitos da decídua no primeiro trimestre, com papel na promoção da angiogênese na gravidez (Zhang et al., 2011). Alguns estudos sugerem que a s células NK CD56 bright sejam derivadas de células precursoras hematopoiéticas CD34+ e dêem origem às células CD56 dim, uma vez que são as que aparecem primeiro após o transplante de células tronco hematopoiéticas e em modelos de diferenciação de NK, in vitro, com estímulo de citocinas (revisado em Freud e Caligiuri, 2006). 19 A expressão de CD57, em células CD56dim, está associada à maturação e função das células NK, que inclui alta atividade citolítica e produção de citocinas. Ademais, células CD56dimCD16+CD57+ produzem IFN -γ e têm atividade ci totóxica mais potente quando estimuladas via CD16 (Lopez-Vergès et al., 2010). A atribuição clássica de funções para as células CD56 dim, como, predominantemente, citotóxicas e CD56bright, como produtoras de citocinas, tem sido alvo de debate, uma vez que há estudos mostrando respostas citotóxicas aumentadas de células NK CD56 bright após estimulação com citocinas, bem como ampla produção de c itocinas por células NK CD56 dim após o reconhecimento de ligantes em células alvo ou anticorpos (Freud et al., 2017). Em estudo recente (Schwane et al., 2020) confirmou-se, por meio de agrupamento hierárquico não supervisionado, a identificação de 70 moléculas com expressão diferencial no repertório de receptores de células NK CD56 bright e CD56 dim, os quais foram associados a várias funções das células NK. As células CD3 -CD56+ podem, ou não, apresentar a molécula C D16 (FcγRIIIA, receptor para a porção Fc da imunoglobulina G, IgG) cuja ligação com IgG promove citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC, do inglês, Antibody- dependent cellular cytotoxicity) (Caligiuri, 2008). C élulas NK maduras circulantes (CD56dimCD16+) apresentam uma potente função efetora via ADCC (revisado em Morvan e Lanier, 2016). Células CD56 dimCD16+ são as mais citotóxicas e também as mais frequentes no sangue periférico (90 -95%) (Campbell et al., 2001; Cooper et al., 2001a). Mediadas por quimiocinas, podem seguir para tecidos periféricos durante as respo stas inflamatórias, liberando perforina e granzima capazes de induzir, rapidamente, citotoxicidade (Campbell et al., 2001). A menor frequên cia de NK no sangue (5 -10%) são das células CD56 brightCD16−. Elas expressam receptores de endereçamento ( homing) para locais periféricos inflamados, que exercem uma baixa citotoxicidade (Campbell et al., 2001; Cooper et al., 2001b). Com base na densidade de expressão na superfície celular, d e forma geral, são definidas cinco subpopulações de células NK no sangue periférico humano: 1) CD56brightCD16-(50-70% das célula s CD56 bright), 2) CD56 bright CD16+ (30–50% das células CD56bright), 3) CD56+/dimCD16-, 4) CD56dimCD16+ e 5) CD56-CD16+ (Poli et al., 2009). As células NK não expressam receptores de antí genos específicos de células T ou B (Vivier e Ugolini, 2009). Apresentam distribuição normal restrita, principalmente, ao sangue periférico, medula óssea, baço e fígado e, em condições fisiológicas, com frequência restrita em linfonodos ou órgãos linfáticos, migrando para esses locais nas fases iniciais de processos inflamatórios (Dogra et al., 2020). C onsideradas como membro da recém - descoberta família das células linfóides inatas (ILC , do inglês, Innate Lymphoid Cell ), as células NK foram reclassificadas como ILC -1 (Vivier et al., 2018), sendo caracterizadas, predominantemente, por sua atividade citotóxica e pela produção da citocina IFN -γ. No 20 entanto, diferentemente dos linfócitos TCD8+ citotóxicos, exercem sua função citolítica sem a necessidade de ativação prévia (Moretta et al., 2002). Após a firme adesão da célula NK à célula -alvo, ocorre a formação de uma sinapse imunológica, onde os grânulos citotóxicos (vesículas lisossomais) são, então, polarizados em direção à sinapse, fundindo-se com a membrana da célula NK (Orange, 2008). O mecanismo de indução de morte da célula alvo envolve a degranulação desses grânulos que contêm proteínas tóxicas, perforina e granzima, e as proteínas de membrana associadas aos lisossomas-1 (LAMP1, do inglês, Lysosomal-Associated Membrane Protein 1, ou CD107a), LAMP2 (CD107b) e LAMP3 (CD63) (Peters et al., 1991). As perforinas criam poros na membrana celular da célula alvo e, com a posterior liberação da proteína citotóxica, granzima, é desencadeada a morte celular por apoptose, por diferentes vias ( revisado em Prager e Watzl, 2019). As granzimas induzem a ativação de caspases, disfunção mitocondrial, ou apoptose independente de caspases. Dentro desses grânulos, as granzimas formam complexos com o proteoglicano serglicina, mantendo-se inativas em função dos baixos, pH e concentração de cálcio e, desta maneira, protegendo as células NKs (e/ou TCD8+) de danos por seus grânulos tóxicos (revisado em Prager e Watzl, 2019). Nas células citotóxicas, NK e TCD8+, CD107a (LAMP -1) é considerada a proteína mais abundante nessas vesículas intracelulares. Dessa forma, a análise da expressão de CD107a é considerada uma medida de degranulação d e vesículas intracelulares por essas células (Alter et al., 2004). Algumas doenças são descritas como associadas a um mecanismo deficiente de degranulação (Marcenaro et al., 2006; Shabrish et al., 2019). Em pacientes com anemia de Falconi, foi observada deficiência na expressão de CD 107a por células NK estimuladas, em relação à expressão em CTRs saudáveis, que, associada a uma menor citotoxicidade dessas células e a altos níveis de IFN-γ, sugere haver uma relação com a hiperinflamação descrita na doença (Shabrish et al., 2019). Além da degranulação dos grânulos líticos, a morte de células alvo por células NK também pode ocorrer por meio de receptores de morte, expressos na superfície de células NK: FasL (do inglês, Fas Ligand, Fas ligante) e TRAIL (do inglês, TNF- Tumor Necrosis Factor- Related Apoptosis-Inducing Ligand, ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral), que se ligam aos receptores Fas e TRAIL-R1 e/ou -R2, respectivamente, nas células alvo. Como resultado dessa ligação, ocorre ativação de caspases, disfunção mitocondrial e apoptose da célula alvo (revisado em Prager e Watzl, 2019). A ação das cél ulas NK é fortemente regulada por ações integradas entre sinais inibidores e ativadores, e mediada pela ligação entre esses receptores, presentes em sua superfície celular, com seus ligantes, presentes na célula alvo (Cooper et al., 2001a) (Figura 1). Os receptores inibidores expressos nas células NK (Figura 2) possuem um imunorreceptor baseado em tirosina (ITIM) (do inglês, Immunoreceptor Tyrosine -based Inhibitory Motif), presente no domínio citoplasmático dessas moléculas . Segundo a teoria do 21 “missing-self” (ausência do própr io) (Ljunggren e Kärre, 1990), n a presença de moléculas HLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I próprias (HLA-A, B, -C), resíduos de tirosina dos motivos ITIM sofrem fosforilação, frequentemente, por uma quinase da família Src, mantendo alta afinidade de ligação de receptores inibidores . A presença de fosfatases “desliga” os receptores ativadores e o desfecho final é a ausência de ativação das células NK (Lanier, 1998) (Figura 1). Os principais receptore s inibidores envolvidos nesse processo são os receptores inibidores da família KIR ( Killer Imunoglobulin like Receptor ), que é altamente polimórfica e também inclui receptores ativadores (Middleton et al., 2002). Além dos receptores KIR, outros receptores inibidores também são expressos em células NK como CD94/NKG2A, membro A da família de receptores de lectina tipo C (do inglês, C-type lectin receptor), receptores leucócitos Ig -like (LIRs, do inglês, Leukocyte Ig-like R eceptors,) e os transcritos Ig -like (ILTs) ( Ig-like transcripts ), que reconhecem moléculas HLA classe I não clássicas expressas nas células (molécula próprias, self) ( revisado em Morvan e Lanier, 2016). Além dos receptores KIR inibitórios, o receptor NKG2A, que reconhece a molécula não clássica, HLA -E, também está envolvido na educação de células NK, um processo de maturação funcional que permite a inibição de células NK, quando do reconhecimento do próprio (self) (Anfossi et al., 2006). Na ausência ou diminuição da expressão de moléculas HLA de classe I (células identificadas como “não-próprias”, “missing-self”) para ligação com receptores inibidores KIR, como ocorre, frequentemente, na infecção viral ou na transformação maligna, as células NK são ativadas, ocorrendo a lise da célula alvo (Kärre et al., 1986) (Figura 1). Uma outra forma de ativação de células NK pode correr quando há uma super expressão de ligantes próprios em células alvo (“ induced self”), como na condição de estresse biológico (como tumor, infecção). Neste caso, esses ligantes podem ser reconhecidos pelos receptores ativadores em células NK, sobrepondo os sinais in ibitórios e induzi ndo a lise das células -alvo. Além disso, anticorpos específicos ligados a antígenos em células alvo, podem ainda se ligar ao receptor CD16, em células NK, induzindo a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (revisado em Morvan e Lanier, 2016) (Figura 1). 22 Figura 1. Representação esquemática das principais funções das células NK, no contexto de células saudáveis e tumorais/estressadas. A) Um equilíbrio de sinais entre os receptores inibidores e ativadores regula o reconhecimento de células saudáveis, por células natural killer(NK); B) As células tumorais que regulam ne gativamente a expressão das moléculas HLA de classe I são detectadas como "ausência do próprio" (ausência do próprio, “ missing-self”) e são lisadas por células NK; C) As células tumorais/estressadas podem superexpressar ligantes induzidos por estresse (lig antes próprios induzidos, “ induced-self”), reconhecidos por receptores ativadores em células NK, que anulam os sinais inibitórios e induzem a lise das células -alvo; D) Anticorpos específicos a antígenos tumorais ligam-se à molécula CD16 e induzem citotoxic idade mediada por células NK dependente de anticorpos (ADCC). Adaptada de Morvan e Lanier, 2016. Além dos receptores KIR ativadores, dentre os receptores ativadores expressos em células NK, destacamos o receptor NKG2D, membro da família de receptores semelhantes à lectina tipo C ( C type lectin family; que inclui CD94/NKG2C, CD94/NKG2E, CD94/NKG2F), a família dos receptores de citotoxicidade natural (NCR, do inglês, Natural Cytotoxicity Receptors), incluindo os receptores NKp30, NKp44 e NKp46, e o receptor para Fc IgG, CD16 (revisado em Morvan e Lanier, 2016) (Figura 2). 23 Figura 2. Principais receptores inibidores e ativadores nas células NK, e seus ligantes em célula alvo. BAT3, transcrito 3 a ssociado ao antígeno leucocitário humano (HLA) -B; CRTAM, molécula associada às células T restritas à molécula HLA de classe I; HA, hemaglutinina; HLA -E, moléculas de histocompatibilidade HLA de classe I, cadeia alfa E; IgG, imunoglobulina G; LFA -1, antíge no-1 associado à função leucocitária; LLT1, transcrito 1 tipo lectina; TIGIT, imunoglobulina de células T e domínio ITIM. Adaptado de Chan et al., 2014. Há dois tipos de receptores CD16. O CD16 do tipo A (FCγRIII A) é expresso em células NK (Selvaraj et al., 1989), monócitos (Passlick et al., 1989), macrófagos (Perussia e Ravetch, 1991) e trofoblastos placentários (Nishikiori et al., 1993) na forma de uma proteína transmembranária ancorada em polipep tídeo. O CD16 do tipo B (FCγRIII B) é expresso em neutrófilos, com domínios extracelulares homólogos ao CD16A, mas diferenciados pela ligação com glicosilfosfatidilinositol (Romee et al., 2013). Após a ligação da molécula CD16 com a porção Fc dos anticorpos IgG, na superfície da célula alvo, há indução de uma série de sinais intracelulares, resultando em atividade efetora citotóxica, por meio de ADCC. O receptor de ativação CD16A em células NK (daqui em diante descrito apenas como CD16) do sangue periférico é expresso uniformemente, quase que exclusivamente, na subpopulação CD56 dim; as células CD56bright expressam pouco, ou, n ão expressam, CD16 (Romee et al., 2013). Após a estimulação por mitógenos, e também em cocultura com células alvo tumorais, pode ocorrer regulação negativa da molécula CD16, mediada pela desintegrina e metaloprotease ADAM17 (Tumor Necrosis Fator - TNF- converting enzyme, ou TACE), uma enzima envolvida na clivagem de L -selectina (Romee et al., 2013). Tal processo pode ser importante para a modulação da expressão de CD16, com possível comprometimento da função efetora das células NK, via ADCC. O receptor tipo lectina ( do inglês, lectin-like) NKG2D (do inglês, natural-killer group 2, member D), expresso em células NKs, TCD8αβ+ e T  (Pardoll, 2001). NKG2D tem como 24 ligantes as moléculas MICA e B ( Major Histocompatibility Class I Chain-realted A e B, molécula do Complexo Principal de Histocompatibilidade classe I relacionadas ) e ULBP1 e 2 (UL16-binding protein, proteína ligadora UL -16), expressas, predominantemente (mas não exclusivamente), em células epiteliais ou em células em situação de estresse (“ induced-self”) (Diefenbach e Raulet, 2001) (Figura 2). Como acima citado, a sinalização gerada pela ligação de NKG2D com esses novos ligantes próprios, mesmo na presença da ligação HLA -próprio- receptor inibidor, suplanta os níveis de inibição, ativando as células NK (Moretta et al., 2002). Essa ativação funcionaria como um sistema de reserva, frente à maior dem anda funcional de células NK, em caso de estresse celular, tendo o receptor NKG2D um papel essencial na citotoxicidade (Bauer et al., 1999) e na indução de produção de IFN-γ (revisado em Zwirner et al., 2007) por células NK (Figura 3). Em semelhança a outros receptores da família CD94/NKG2, o receptor NKG2D apresenta-se na forma de um homodímero (Figura 3), com um curto domínio intracitoplasmático sem propriedade de sinalização (Raulet, 2003). Cada homodímero de NKG2D se liga a dois homodímeros da proteína ativador a de DNAX, de 10 kDa ( DAP10, do inglês, DNAX-activating Protein 10) e, por meio de uma arginina carregada positivamente nesse domínio, NKG2D se liga a um ácido aspártico, carregado negativamente, no domínio transmembranário da molécula DAP10 (Garrity et al., 2005). DAP10 possui um motivo baseado em tirosina YxxM que recruta e ativa a subunidade p85 da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-K) e a proteína 2 ligada ao receptor do fator de crescimento (Grb2 , do inglês, Growth Factor Receptor-Bound Protein 2). Sugere-se que esta cascata de sinalização seja a principal responsável pela citotoxicidade e/ou sobrevivência das células alvo por células NK (Bauer et al., 1999). Uma das hipóteses para a variabilidade de ligantes para esse receptor (NKG2DL), expressos em condição de estresse, é que a diversidade de liga ntes reduziria as chances de escape imunológico das células alvo (Diefenbach et al., 2003). Embora a expressão de NKG2D esteja, especialmente, associada à atividade citotóxica por células NK, ela também pode funcionar como uma molécula coestimuladora, em células citotóxicas T CD8+, e não apenas um mediador direto de citotoxicidade (Diefenbach et al., 2002). 25 Figura 3. Ativação de vias relacionadas ao receptor NKG2D. A ligação de NKG2D com seu ligante, na célula alvo, ativa várias vias moleculares em células NK, q ue são mediadas pela molécula de sinalização DAP10. A citotoxicidade de células NK podem ser ativada s por meio da fosfolipase C Gama 2 (PLC2), c -Jun-NH (2) - terminal quinase (JNK) e fosfatidilinositol 3 -hidroxiquinase PI3K. A liberação de grânulo é ativad a pelas vias PLC2 e PI3K. A via JAK -STAT5 (Transdutor de Janus quinase 2-Sinal e Ativador de A via de transcrição 5) resulta na liberação de citocinas. Adaptado de Siemaszko et al., 2021). Além da citotoxicidade direta por meio da liberação de grânulos tóxicos (granzima e perforina), receptores de morte (Fa sL e TRAIL) e CD16 (ADCC), as células NK possuem papel relevante na regulação da imunidade inata e adaptativa (Zhang et al., 2006a), por meio da secreção de citocinas, fatores de crescimento e quimiocinas (Ferlazzo e Münz, 2004) (Figura 4). Uma vez ativadas, as células NK produzem citocinas, principalmen te, Interferon gama (IFN -γ), e Fator de necrose tumoral alfa (TNF -α), as quais aumentam a sua citotoxicidade e recrutam monócitos/macrófagos, DCs, células T e células B, atu ando como agentes promotores de apoptose em células tumorais/infectadas (Seeger et al., 2014; Gross et al., 2013). IFN-γ tem função imunomoduladora na resposta de célula T, promovendo, entre outras funções, a polarização TH1 e ativação de célula T CD8 + (Martín-Fontecha et al., 2004). Atua na ativação de macrófagos e promove o aumento da apresenta ção de antígenos por meio da regulação positiva de moléculas de MHC (Complexo Principal de Histocompatibilidade - do inglês, Major Histocompatilibity Complex) de classe I e classe II. Em conjunto, essas ações contribuem na imunidade contra tumores, antimic robiana e antiviral (Schroder et al., 2004) (Figura 4). De forma semelhante às células Th1 e Th2 diferenciadas, in vitro, na presença de citocinas IL-12 e IL -4 (Kimura e Nakayama, 2005), subtipos de células NK humanas podem ter um perfil distinto de citocinas, baseado na produção, ou não, de IFN - γ (Deniz et al., 2002). As células NK com produção predominante de IFN - (NK1, semelhantemente às Th1) quase não produzem IL-4, IL-5 e IL-13 (Deniz et al., 2002). Por outro lado, as células NK não 26 secretoras (ou alguma secreção) de IFN - (NK2, semelhantemente às Th2) produzem IL -4, IL-5 e, principalmente, IL-13 (Deniz et al., 2002) (Figura 4). Figura 4. Mecanismos básicos de ação das células NK. As células NK podem ter ação na atividade citotóxica inata, bem como modular a imunidade inata e adaptativa. A) como células matadoras naturais, detectam níveis de expressão de ligantes induzidos por estresse (“ induced self”) bem como níveis diminuídos, ou ausentes, da expressão de moléculas MHC de classe I (“ missing self” ), em células alvo, que podem ser reconh ecidos por receptores ativadores ou inibitórios respectivamente, cujo equilíbrio determina a ativação dessas células; B) após a ativação, as células NK podem induzir a lise das células alvo por meio da secreção de grânulos citotóxicos, contendo, granzima B e perforina, a interação entre receptores de morte/ ligante e pela citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC); C) Por outro lado, células NK ativadas podem secretar uma variedade de citocinas e quimiocinas que promovem o recrutamento e a matur ação e de células dendríticas (DC), que podem modular ainda mais a resposta de células T, incluindo a ativação, e/ou inibição, de células T CD8 + citotóxica e de células Thelper (Th). Adaptada de Wang et al., 2021. As células NK induzem sinais que promovem a maturação de DCs com produção de citocinas, com aumento da função de células TCD4+ e diferenciação para células Th1 e modulam, positivamente, respostas efetoras de células T, principalmente pela produção de IFN-γ. Por outro lado, podem também regular negativamente a atividade efetora de outras células do sistema imune (Zhang et al., 2006b). Células NK têm a capacidade de “suprimir” processos inflamatórios contra diversos patógenos por meio da produção de IL -10 (Perona-Wright et al., 2009). Em modelo experimental de leishmaniose visceral, células NKs secretoras de IL -10, presentes em granuloma de baço e fígado, foram capazes de inibir a proteção contra o parasita, e a 27 produção desta citocina esteve associada a um processo inflamatório crônico durante a infecção com Leishmania donovani (intravenosa) (Maroof et al., 2008). Em infecções induzidas por Toxoplasma gondii, Listeria monocytogenes e Yersinia pestis, a citocina IL -12 secretada por DC induziu a produção de gr andes quantidades de IL - 10 por células NK que, por sua vez, inibiu a secreção de IL -12 por DC (Perona-Wright et al., 2009). Ainda neste estudo, foi observado que a produção de IL -10 por células NK pode diminuir os processos inflamatórios. Também observaram que, quando os camundongos são desafiados com patógenos que não levam à infecção disseminada, como o vírus da gripe ou cepa atenuada de Yersinia pestis não disseminada, as células NK secretam IFN -γ, mas não secretam IL-10. Esses resultados sugerem que a ''força'' do desafio microbiano é traduzida na secreção de IL-12, que por sua vez modula a resposta das células NK: estimuladora no caso do IFN-γ, e inibitória, no caso de uma maior secreção de IL-10 (Vivier e Ugolini, 2009). Em humanos, a produção de IL -10 por células NK foi detectada em pac ientes com infecção por vírus C da hepatite (De Maria et al., 2007), bem como, a produção de IL -10 por NK foi associada a um efeito supressor na proliferação de células TCD4+ antígeno específica (Deniz et al., 2008). Neste último estudo, foi observado que apenas parte das células NK foram capazes de produzir IL-10, ex vivo, sugerindo haver um subgrupo secretor específico dessas células. O su bgrupo de células NK produtoras de IL -10 foi proposto serem células NK reguladoras (NKreg), com importante papel regulador, tanto na imunidade inata quanto na adaptativa, sendo caracterizadas, fenotipicamente, como células NK CD56 brightCD16-/+ (Zhang et al., 2006b). As células NK CD56 brightCD16- (ou CD16low) são mais abundantes em tecidos linfóides secundários (gânglios linfáticos e tonsilas) e são caracterizadas pela b aixa citotoxicidade. Quando estimuladas, estas células produzem altos níveis de citocinas exercendo, primariamente, uma função reguladora (Fauriat et al., 2010). Em contraste, a população CD56 dimCD16+ é caracterizada pela baixa produção citocinas (IFN - e TNF-α) e alta capacidade citotóxica (Fauriat et al., 2010). As principais citocinas produzidas por células NKreg CD56 brightCD16- são IFN-γ, TNF- α, GM-CSF (do inglês, Granulocyte-macrophage colony-stimulating fator, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) , IL -10 e IL -13, dependendo das condições de estímulo (celular ou citocinas) e do microambiente (Fauriat et al., 2010; Poli et al., 2009). O efeito imunorregulador das NKregs CD56 brightCD16- foi observado em algumas doenças autoimunes, tais como esclerose múltipla, com supressão da resposta T a autoantígenos e indução de apoptose de c élulas T ativadas (Jiang et al., 2011). Além disso, células NK do sangue periférico CD56 bright e CD56 dim produtoras de IL -10 estão aumentadas no início da gravidez comparadas aos números em mulheres com aborto espontâneo (Higuma-Myojo et al., 2005). Também foi observado que parte das NKs da decídua também secretam IL -10 28 (Deniz et al., 2008). Em conjunto, esses dados m ostram a existência de células NK com atividade imunorreguladora. No contexto imunossupressor da endometriose, as células NKreg poderiam participar da modulação negativa na apresentação antigênica de antígenos endometriais ectópicos e prejudicar a ativaçã o de células TCD8+ citotóxicas, contribuindo para a fisiopatologia da doença. Diversos estudos indicam haver uma diminuição da atividade citotóxica de células NK em mulheres com EDT, quando comparada àquela de mulheres CTRs, sem a doença (Oosterlynck et al., 1991; Oosterlynck et al., 1992; Tanaka et al., 1992; Iwasaki et al., 1993). Esta parece ser uma alteração imunológica relevant e na EDT, uma vez que, a lém de macrófagos e neutrófilos que chegam à cavidade peritoneal, u ma das principais células implicadas na eliminação do tecido endometrial ectópico é a célula NK (Oosterlynck et al., 1991). IL-10 e TGF-β1 estimulam a proliferação e invasão de células endometriais estromais in vitro, bem como o crescimento de lesões ectópicas in vivo (Liu et al., 2017). Além disso, IL- 10 produzida por células Th17 pode cooperar com a citocina IL -17A, promovendo o crescimento, adesão, invasão e implan tação de células endometriais estromais ectópicas, e reduzindo a apoptose in vitro e in vivo (Chang et al., 2017). A diminuição da atividade citotóxica de células NK na EDT é descrita como mais pronunciada nas fases moderadas e graves da doença (Oosterlynck et al., 1991; Garzetti et al., 1995; Wilson et al., 1994). O número absoluto e/ou a porcentagem de células NK em mulheres com EDT estão descritos de forma variável em alguns estudos, como diminuído em tecido uterino de m odelo experimental da doença (Ota et al., 2002), aumentado no fluido peritoneal de mulheres em estádios iniciais da EDT (Hill et al., 1988) e aumentado no sangue periférico nos casos de doença profunda de retossigmóide (Dias et al., 2012), quando comparados aos de mulheres CTRs sem a doença. Porém, os mecanismos pelos quais a atividade citotó xica está diminuída, ainda não estão bem compreendidos, podendo haver tanto alterações funcionais intrínsecas dessas células, como a presença de fatores solúveis implicados nessa disfunção. Considerando que MICA é uma molécula induzida por células em con dição de estresse biológico, ela pode ser expressa como antígenos próprios induzidos (“ induced self”) (Figura 1) e reconhecida por células NK, via receptor de ativação, NKG2D. Após reconhecimento e ativação dessas células, são desencadeadas suas ações por meio de citotoxicidade e produção de citocinas, especialmente IFN -γ. Tais ações, podem envolver regulação imunológica com atividades tanto pró, com produção da citocina inflamatória, IFN - γ, como anti -inflamatórias, com produção de IL -10. Além disso, MICA n a sua forma solúvel pode, de alguma forma, modular negativamente na atividade citotóxica dessas células NK. 29 1.4 MICA - Major Histocompatibility Class I Chain-related A As moléculas MICA são codificadas pelo gene MICA, localizado no cromossomo 6, na região de classe I do MHC, e são altamente polimórficas (Bahram, 2000). Diferentemente das moléculas HLA classe I clássicas (HLA -A, B e C), as moléculas codificadas pelo gene MICA não p articipam da apresentação de peptí deos e não estão associadas à cadeia 2- microglobulina (Groh et al., 1996). A molécula MICA é descrita como expressa, constitutivamente, em epitélio gastrointestinal, células endoteliais e fibroblastos (Zwirner et al., 1999). No entanto, sua expressão também foi observada em células epiteliais de fígado, pâncreas, estômago, brônquios, bexiga, ureter, mama, amígdala e timo, localizada, predominantemente, intracelularmente (citoplasma) e com baixa expressão na membrana celular (Ghadially et al., 2017). MICA é uma molécula que pode ser induzida em diferentes tipos celulares em situação de estresse biológico, incluindo transformação mal igna (Gasser et al., 2005), infecção por patógenos (Lodoen e Lanier, 2006), bem como na presença de choque térmico (Groh et al., 1996) e estresse oxidativo (Peraldi et al., 2009). Com base nessas características, surgiu o conceito de MICA como uma molécula “ induced-sef” (próprio induzido), funcionando como um alerta ao sistema imune, em condições patológicas e de estresse (Carapito e Bahram, 2015) (Figura 5). MICA tem como ligante, até o momento, o receptor de ativação de lise celular NKG2D, expresso em células NK, TCD8+ e T (Pardoll, 2001), como acima citado. A interação MICA- NKG2D induz a lise de células alvo, por células NK, e pode ainda fornecer coestímulo para as respostas de células T CD8+ citotóxicas (Groh et al., 2001). A falha na expressão de MICA, na situação de estresse celular, pode levar à falha no estímulo efetor de citotoxicidade, e consequente disseminação de infecção intracelula r ou tumorigênese/metástase (Carapito e Bahram, 2015). Na condição de transformação maligna, MICA de membrana é sugerida como um “marcador” inicial de vigilância tumoral ( revisado em Nausch e Cerwenka, 2008). Corroborando esta hipótese, um estudo recente de revisão sistemática e meta -análise mostrou haver associação entre a alta expressão de MICA de membrana (imunohistoquímica) e a boa evolução de câncer do aparelho digestivo (Zhao et al., 2017). A molécula MICA pode também ser encontrada na forma solúvel (sMICA). Os mecanismos propostos para a produção de MICA solúvel envolvem a clivagem proteolítica por metaloproteinases de matriz (MMPs) (Matusali et al., 2013), principalmente, MMP2 (Yang et al., 2014), MMP9 (Sun et al., 2011) e MMP14 (Liu et al., 2010) e por desintegrina e metaloproteinases (ADAMs, do inglês, A Disintegrin And Metalloproteinase ) (Waldhauer et al., 2008; Liu et al., 2010) como, ADAM10 (Zingoni et al., 2020) e ADAM17 (Waldhauer et al., 2008). Além da ação de proteases, MICA também pode ser liberada em exossomas (Whiteside 2013) (Figura 5). 30 As MMPs estão amplamente implicadas na destruição da matriz extracelular, invasão da membrana basal e angiogênese (Reiss et al., 2006). Muitas ADAMs são proteases presas à membrana sendo uma das suas principais funções, a clivagem proteolítica de ectodomínios de proteínas transmembranárias, incluindo citocinas, fatores de crescimento e moléculas de adesão celular, da superfície celular (White 2003) . Muitas ADAMs são frequentemente superexpressas em tumores e acredita -se que desempenhem papé is importantes em diferentes etapas da tumorigênese (White 2003) . Destacamos que as MMP2 e MMP9, envolvidas na clivagem de MICA, também têm importante função na imunorregulação de células tronco mesenquimais (MSC, do inglês, Mesenchymal Stem Cells) humanas derivadas de tecido adiposo, e envolvidas na atividade imunossupressora dessas células (Lavini-Ramos et al., 2017), podendo também ter contribuição na imunossupressão, na EDT. Figura 5. Papel duplo de MICA como molécula alvo par a imunovigilância por células NK e como mediadora do escape imunológico de tumor/células estressadas . MICA expressa na superfície celular como, por exemplo, de células tumorais/estressadas pode ser reconhecida pelas células NK, pelo receptor NKG2D, promovendo uma resposta citotóxica que leva à eliminação dessas células (imunovigilância). No entanto, MICA pode se associar com a chaperona ERp5 e, por meio de uma clivagem proteolítica mediada por ADAM10, ADAM17 e MMP14, gerar sMICA, promovendo uma regulação ne gativa de NKG2D e comprometimento das funções efetoras das células NK, facilitando assim o escape imunológico do tumor/células estressadas (imunoevasão). Adaptado de Fuertes et al., 2021 . MICA solúvel interage com seu receptor NKG2D, promovendo a endocitose e degradação do complexo MICA -NKG2D, comprometendo assim, a atividade citolítica de células NK e T citotóxicas (Boukouaci et al., 2013; Groh et al., 2002). Esse mecanismo de ação parece estar envolvido em diversos tumores, como carcinoma hepático (Luo et al., 2020), mieloma múltiplo (Zingoni et al., 2018) e câncer cervical (Arreygue-Garcia et al., 2008) contribuído para a evasão tumoral. Além disso, essa interação pode resultar na expansão de células imunossupressoras TCD4+ NKG2D+, também colaborando para evasão imune do tumor (Groh et al., 2006). 31 A ligação de MICA de membrana ao receptor de ativação, NKG2D, está diretamente relacionada com a variação dos domínios externos da molécula e à afinidade de interação, que pode variar também com polimorfismos genéticos (Isernhagen et al., 2016). Algumas variantes gênicas de MICA codificam proteínas com diferentes afinidades de ligação com seu receptor, afetando o limiar de ativação de células NK e a modulação de células T (Isernhagen et al., 2016). A afinidade diferencial está associada a uma substituição entre os aminoácidos metionina (Met) ou valina (Val), no resíduo 129 da molécula (Steinle et al., 2001). A variante MICA-129Met fornece uma sinalização NKG2D mais forte, lev ando ao aumento da degranulação e produção IFN -γ por células NK, em relação à variante MICA -129Val. No entanto, essa ligação mais forte também é capaz de desencadear mais rapidamente a regulação negativa de NKG2D da superfície da célula NK (internalização/degradação) e, portanto, diminuir ainda mais a atividade citotóxica desse receptor, via MICA (Isernhagen et al., 2015). No entanto, a avaliação funcional desse dimorfismo na patogênese de doenças requer uma avaliação cuidadosa. Outro polimorfismo funcional do gene MICA envolve a inserção de nucleotí deos logo antes da região transmembranária da molécula (grupo de alelos MICA5.1), ocasionando uma alteração no quadro de leitura de bases ( frameshit) e a inserção de uma âncora de glicosilfostatidilinositol (GPI) (Ashiru et al., 2013). Essa âncora é respons ável pelo recrutamento dessas variantes da proteína MICA para microdomínios de membrana resistentes a detergentes ( lipid-rafts) e, portanto, para vesículas extracelulares (exossomas) (Ashiru et al., 2013). Esses alelos, cujas moléculas codificadas são ancoradas por GPI, são frequentemente referidos como o grupo de alelos MICA5.1, sendo muito frequentes em várias populações humanas no mundo todo (Pérez-Rodríguez et al., 2002; Gao et al., 2006), sendo o alelo MICA*008 mais frequente em várias populações, inclusive na brasileira, como relatado por nosso grupo (Marin et al., 2004). É impor tante destacar que, assim como MICA solúvel derivada da ação de metaloproteinases clivadas da membrana celular, MICA presente em exossomas, também pode diminuir a expressão de NKG2D (Clayton et al., 2008), colaborando para a evasão imune de células tumorais e/ou infectadas. Níveis elevados de sMICA são encontrados em diversos tipos de cânceres, principalmente em estádios mais avançados da doença, sugerindo participar dos mecanismos de imunossupressão no câncer. Nesse sentido, níveis elevados de sMICA têm sido associados a um pior prognóstico (Salih et al., 2002; Kumar et al., 2012), sendo considerado um potencial marcador prognóstico em vários tipos de cânceres, segundo estudo de revisão sistemática e meta-análise (Zhao et al., 2017). Embora a EDT seja, em geral, considerada uma doença benigna, devido à sua estrutura histológica preservada (Cannistra, 2004), ela comparti lha características fisiopatológicas com o câncer, como ocorrência de invasão celular e crescimento desordenado, além de neovascularização e uma diminuição no número de células em apoptose (Swiersz, 2002). Como nas doenças malignas, os implantes endometrióticos podem 32 disseminar-se para a cavidade abdominal e, também para locais mais distantes. As células endometriais ectópicas se ligam, invadem e penetram nos tecidos e, muitas vezes, se manifestam como lesões profundas infiltrantes. Porém, ao contrário das lesões mali gnas, a EDT não resulta em um estado proliferativo ou catabólico incessante e, raramente é fatal (Swiersz, 2002). Não obstante, alguns estudos encontraram associações significativas entre a prevalência de EDT e câncer de ovário ( revisado em Heidemann et al., 2014). As citocinas inflamatórias TNF -α, IL -1β, e IL -6, presentes em níveis maiores no fluido peritoneal nas mulheres com EDT (Eisermann et al., 1988; Harada et al., 1997), também são elevadas em sobrenadante de cultura de epitélio de câncer ovariano, quando comparados àqueles das CTRs saudáveis (Szlosarek et al., 2006). A visão dominante na comunidade científica é considerar EDT como uma doença inflamatória crônica. Consider ando que MICA é uma molécula induzida em dive rsos tipos celulares em condição de estresse, levantamos a hipótese de que o ambiente inflamatório peritoneal poderia contribuir para o estresse local favorecendo, inicialmente, o aumento da expressão de MICA na superfície de células endometrióticas (estádios iniciais da doença), ou mesmo no endométrio eutópico alterado nessas mulheres (Brosens et al., 2012), funcionando como um “sinal de alerta biológico”. Com a evolução da doença (estádios III e IV) e, por ação de metaloproteinases, poderia haver liberação de MICA da forma solúvel em níveis elevados. Nesse sentido, é sabido que lesões endometrióti cas podem produzir TGF -β (Cruz e Reis 2015), citocina esta que também estimula a expressão de MICA na superfície celular e sua posterior liberação na forma solúvel (Klöß et al., 2015). MICA solúvel, por sua vez, pode modular negativamente a expressão de seu receptor, NKG2D, em células NK e T CD8+, reduzindo a resposta citotóxica destas células. Corroborando esta hipótese, alguns trabalhos sugerem que fatores solúveis presentes no soro ou no fluido peritoneal ( microambiente das lesões) interagem com as células NK, inibindo a resposta efetora contra as células endometriais ectópicas. Em concordância com esta hipótese, o tratamento de células NK com soro de mulheres com endometriose (Kanzaki et al., 1992; Tanaka et al., 1992), bem como com flu ído peritoneal e folicular (Oosterlynck et al., 1993), mostrou uma diminuição da atividade citotóxica quando comparado ao tratamento com mulheres sem EDT. De maneira semelhante, fatores solúveis, ta mbém presentes no sobrenadante de cultura de células estromais de endométrio de mulheres com endometriose, foram capazes de suprimir a atividade citotóxica de células NK (Somigliana et al., 1996). Ainda concordante com essa hipótese, foram observados níveis mais elevados de sMICA no fluido peritoneal de mulheres com EDT, em relação aos encontrados em mulheres CTRs, sem a doença (incluindo outras doenças benignas) (González-Foruria et al., 2015). Defeitos na habilidade de células NK e T citotóxic as em reconhecer e eliminar o endométrio extrauterino têm sido considerados cruciais na patogênese da endometriose e MICA poderia ter um papel na imunopatologia dessa doença 33 Considerando que a deficiência funcional de células NK citotóxicas tem sido impli cada na fisiopatologia da endometriose, e que a molécula MICA tem sua expressão celular induzida por estresse biológico, levantamos a hipótese do potencial papel de MICA na imunopatologia da endometriose. Ademais, uma vez que sua forma solúvel (sMICA) modu la negativamente a expressão de seu receptor, NKG2D, em células NK, sMICA pode ter envolvimento na diminuição da atividade funcional de células NK nessa doença, contribuindo de forma relevante na eliminação ineficiente de tecido endometrial ectópico e para o estabelecimento/desenvolvimento da doença. Consideramos também que a proteína MICA, na sua forma solúvel, tem potencial implicação na evolução/gravidade da doença, podendo ser modulada positivamente pelos hormônios sexuais envolvidos nas diferentes fases do ciclo menstrual. ___________________________________________________OBJETIVOS 35 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Testar a hipótese do envolvimento de MICA na imunopatologia da endometriose, inclusive contribuindo para a deficiência da atividade efetora de células NK. 2.2 Objetivos específicos Determinar se na endometriose: 1) há perfil diferencial dos níveis de sMICA, da expressão proteica de MICA, da frequência e de subpopulações de células NK circulantes: • em relação às diferentes fases do ciclo menstrual e potenciais efeitos hormonais • em relação à gravidade da doença e/ou em relação a tipos morfológicos da doença 2) há alteração da expressão gênica diferencial de MICA no endométrio eutópico, sugerindo a existência de algum desequilíbrio imunobiológico prévio ao deslocamento de tecido endometrial. _____________________________________________________MÉTODOS 37 3. MÉTODOS 3.1 Participantes da pesquisa As participantes da pesquisa incluídas no estudo foram mulheres diagnosticadas com endometriose (grupo endometriose, EDT, n=173) e mulheres sem endometriose (grupo controle, CTR, n=86), submetidas à cirurgia laparoscópica e análise histopat ológica, garantindo, portanto, a confirmação do diagnóstico da doença ou da ausência da mesma nos respectivos grupos. O grupo CTR foi constituído por mulheres saudáveis submetidas à laqueadura tubária ( LAQ, n=60) ou ao tratamento cirúrgico de outras doença s ginecológicas não inflamatórias (DNI, n=26). Salientamos que, sempre que possível, as mesmas pacientes (grupos EDT e CTR) foram incluídas em todas as abordagens de análise deste estudo. Todas as mulheres incluídas neste estudo foram provenientes do Serviço de Endometriose do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - HCFMUSP (grupo EDT) ou do Setor de Planejamento Familiar do HCFMUSP (grupo CTR). Foi concedida autorização prévia, com assinatura dos Termos de Consentimento Livre e Esclarecido-TCLE (Anexos I-A e -B), para utilização de informações clínicas, bem como para a coleta do material biológico. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq, No 0505/07 e 0386/11) do HCFMUSP (Anexo II, -A, -B e -C). 3.2 Casuística O número amostral, para cada abordagem experimental do estudo, foi definido com base em cálculo amostral prévio, lev ando-se em conta a variabilidade dos dados (estimativa de desvio padrão dentro de cada grupo, em estudos já realizados), a diferença esperada entre os grupos, o nível de significância e o poder do teste. Foi estabelecido um nível de significância de 5% e um poder do teste de 80%. Para a variável contínua “concentração de MICA solúvel (pg/mL) bus camos encontrar uma diferença entre caso e controle de 0,4, com uma variação igual a 1 (n=100). Na ausência de dados na literatura científica específicos para expressão gênica e proteica de MICA em endometriose, foram utilizados estudos de MICA em câncer. Para as variáveis expressão gênica-mRNA e expressão proteica, o “n” amostral estimado foi de 23, busc ando-se encontrar uma diferença entre caso e controle de 30, com uma variação estimada de 35 (Basu et al., 2008; Textor et al., 2008). Para a variável “análise funcional de células NK” (medida em porcentagem), buscamos encontrar uma diferença entre caso e controle de 10, com uma variação igual a 10,5, com “n” amostral de 19 (González-Foruria et al., 2015; Oosterlynck et al., 38 1992). Programa estatístico utilizado: Power Analysis Sample Size (PASS). Salientamos que este foi o número estimado, mas o número real de sujeitos de pesquisa atingido, para alguns estudos, foi maior, conforme apresentado adiante, no Desenho do Estudo (item 3.5, Figura 6). 3.3 Dados clínicos e critérios de seleção Em relação aos dados clínicos das pacientes, as informações referentes aos tipos de endometriose foram obtidas a partir dos registros nos relatórios cirúrgicos, feitos em formulário específico (Anexo III). A avaliação do estádio da doença foi baseada no critério de classificação da rASRM, 1996 (Canis et al., 1997) (Anexo IV). Sempre que possível, biópsias de endométrio coletadas durante as cirur gias tiveram a datação determinada por análise anatomopatológica (Anatomia Patológica do HCFMUSP), com o objetivo de determinar a fase do ciclo menstrual em que se encontrava a mulher, na data da laparoscopia. Na ausência da datação histológica, a fase do ciclo foi determinada contando-se os dias a partir do primeiro dia da data do último período menstrual, informada pela paciente. De acordo com o local de acometimento da doença, a endometriose foi classificada como endometriose peritoneal, endometriose ov ariana ou endometriose profunda infiltrativa (Nisolle e Donnez, 1997). Os grupos foram caracterizados como: SUP: lesões na superfície do peritônio; OVA: endometriose ovariana, com ou sem doença peritoneal e sem endometriose profunda; PROF: endometriose profunda com ou sem en dometriose peritoneal e sem endometriose ovariana; PROF + OVA: profunda na presença de OVA. Os critérios adotados para a seleção das participantes da pesquisa foram os abaixo descritos. Critérios de inclusão: • Mulheres dos grupos endometriose e controle, submetidas à cirurgia laparoscópica • Endometriose comprovada histologicamente, no caso do grupo EDT • mulheres em idade fértil, com períodos menstruais eumenorréicos, com intervalo entre os ciclos variando de 26-45 dias. Critérios de exclusão • Presença de sinais clínicos de doença autoimune e/ou câncer; • Doença inflamatória no caso do grupo CTR • Presença de sinais clínicos ou laboratoriais de infecção ginecológica; • Uso de terapia hormonal (análogos do GnRH mensais, progestágenos e contraceptivos hormonais) nos últimos 3 meses antecedentes à coleta da amostra, ou por seis meses com o uso de análogos do GnRH de ação trimestral. 39 3.4 Material biológico Parte das amostras utilizadas neste estudo foram provenientes do “Banco de Tecidos e Fluidos Corporais de Paci entes com Endometriose” cuja coleta de amostras teve aprovação pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq, nº0505/07; Anexo II- A) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). Outra part e foi obtida de coleta prospectiva, integrante do Projeto Temático FAPESP2010/10338-0, “Endometriose: bases moleculares da resposta imunológica”, também previamente aprovado pela comissão de Ética do HCFMUSP (CAPPesq nº 0386/11; Anexo II - B e -C), o qual in cluiu parte do presente estudo. A coleta e armazenamento das amostras seguiu o protocolo proposto pela The World Endometriosis Research Foundation (WERF) Endometriosis Phenome e Biobanking Harmonisation Project (EPHect) (Becker et al., 2014; Rahmioglu et al., 2014). • Sangue periférico: Soro: Obtido de, aproximadamente, 5 mL de amostra de sangue coletado sem anticoagulante, antes da indução anestésica. As amostras de sangue foram centrifugadas a 1300g, por 10 minutos (min), para obtenção do soro. As alíquotas de soro foram armazenadas a -80 ºC, até o momento do uso. Utilização: pesquisa de MICA solúvel. Sangue heparinizado: (10-20mL) utilizado para obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC, do inglês Peripheral Blood Mononuclear Cells ). As amostras de PBMC foram, posteriormente, criopreservadas (nitrogênio líquido) até o momento do uso. Utilização: análise da atividade efetora de células NK. • Fluido peritoneal (FP): coletado no início da laparoscopia, logo após as punções com os trocáteres, por meio de aspiração em seringa estéril (em média de 1 a 5mL). As amostras foram centrifugadas a 1300g, por 10min, para sepa ração da fração celular. Os sobrenadantes foram armazenados em tubos de congelamento estéreis, em freezer a - 80ºC, até o momento do uso. Utilização: pesquisa de MICA solúvel. • Tecidos: endométrio eutópico - de mulheres dos grupos EDT e CTR endométrio ectópico - lesão de endometriose profunda (grupo EDT). A coleta de biópsia de endométrio eutópico foi realizada por aspiração, utilizando-se Pipelle de Cornier (Laboratoire CCD, Paris, França), no início da cirurgia. Parte da lesão (EDT) 40 e do endométrio eut ópico (EDT e CTR) foi encaminhada à divisão de Anatomia Patológica do HCFMUSP para análise histopatológica de rotina. Outra parte dos tecidos (lesão de endometriose profunda e endométrio eutópico) foi armazenada em criotubo e, imediatamente, congelada em n itrogênio líquido e, posteriormente, transferida para freezer -80 ºC, onde permaneceu até o momento de uso. As amostras das lesões de endometriose profunda foram constituídas de lesão de endometriose intestinal de retossigmóide ou de lesão de endometriose retrocervical. Utilização: • endométrio eutópico: análise da expressão gênica e proteica de MICA. • lesão de endometriose profunda: análise da expressão proteica de MICA. 3.5 Delineamento do estudo Trata-se de um estudo analítico, observacional e t ransversal. As mulheres do grupo EDT foram avaliadas clinicamente, pela história, exame físico e de imagem (ultrassonografia pélvica e/ou transvaginal e, por ressonância magnética, quando indicada) de acordo com a indicação clínica, para confirmação da EDT e posterior indicação cirúrgica. Uma vez selecionadas, as mulheres foram submetidas à laparoscopia, seguindo a rotina habitual do serviço de Endometriose, do HC -FMUSP. As mulheres do grupo CTR foram avaliadas, no ato operatório, quanto à presença macroscó pica de EDT e, em caso de suspeita, foi realizada a coleta do tecido para exame histopatológico. Em caso positivo para a doença, a paciente foi excluída do grupo CTR. Na Figura 6 apresentamos o desenho do estudo, incluindo as variáveis teóricas e operacionais relacionadas a cada abordagem experimental do mesmo. 41 Figura 6. Desenho do estudo. Variáveis teóricas: avaliação de perfil diferencial de expressão gênica e proteica de MICA e dos níveis de MICA solúvel (sMICA ), sistemicamente (soro) e no microamb iente da lesão (fluido peritoneal), entre mulheres com EDT e controles saudáveis, e avaliação do potencial envolvimento de MICA na função de células NK, na EDT. Variáveis operacionais: expressão proteica de MICA por imunohistoquímica; expressão gênica de M ICA por PCR quantitativa em tempo real (qRT - PCR), pesquisa de MICA solúvel por ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e avaliação da atividade efetora de células NK por meio da avaliação de células NK que expressam CD107a, IFN -γ e IL-10 e da citotoxicidade contra células K562; EDT: grupo endometriose, CTR: grupo controle, PBMC: células mononucleares do sangue periférico; mRNA: ácido rib onucleico mensageiro; K562: linhagem de células de leucemia mielóide crônica humana. 3.6 PCR quantitativa em tempo real: expressão gênica de MICA A análise da expressão de mRNA para o gene MICA foi realizada por qRT -PCR (reação de polimerização em cadeia quantitativa em tempo real) após a extração do RNA total de tecido de endométrio eutópico (grupo EDT e grupo CTR) e preparo da síntese de DNA complementar (cDNA). Foi também realizada a seleção dos primers (iniciadores) específicos para o gene MICA e primers endógenos, utilizados para o controle da expressão. 3.6.1 Extração de RNA total As amostras de tecido endometrial (aproximadamente 100mg) foram descongeladas em gelo, ressuspensas em 1mL de Trizol® (solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina ( Invitrogen, Waltham, EUA) e transferidas para tubos de 2mL (livres de 42 RNase/DNase), contendo esferas metálicas ( Omni International Inc ., Kennesaw, Georgia, EUA) (em gelo). Em seguida, os tubos foram transferidos para o homogeneizador de tecidos Precellys® (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, França). Neste equipamento, foram realizados 3 ciclos de centrifugação/homogeneização a 4700g, por 15 segundos (seg), com pausa de 20seg a cada ciclo, com temperatura (T°) mantida entre 2-8ºC, para obtenção de um homogenato tecidual. A partir do homogenato de tecido em solução de Trizol®, deu -se prosseguimento à extração de RNA, segundo o protocolo do fabricante. Foram adicionados ao tubo 200µl de clorofórmio, seguindo-se com agitação vigorosa (15s eg) e incubação por 3min, em TA. Após centrifugação por 12.000g, 15min, a 4ºC, houve separação em três fases (aquosa, interface e orgânica). A fase aquosa, a qual contém o RNA, foi transferida para um novo tubo, onde foram adicionados 500µl de álcool isopropílico, seguindo-se de inversão do tubo para precipitação do RNA. Após incubação por 10min, TA, os tubos foram centrifugados a 12.000g, por 10min, a 4ºC. Após o descarte do sobrenadante, foram adicionados 500µl de etanol 75%, seguindo -se com centrifugação a 7500g, por 5min, a 4ºC. O sobrenadante foi retirado com auxílio de micropipeta e o tubo foi mantido aberto, por 5 min, TA, para secagem do RNA, favorecendo, assim, a evaporação dos resíduos de etanol. Em seguida, o RNA foi ressuspenso em 10 -30µl de ág ua livre de RNase ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA). A concentração de RNA total (ng/µl) foi verificada utilizando-se o espectrofotômetro NanoDrop®ND-1000 (Thermo Fi sher Scientific , EUA), em comprimento de onda ( ) 260nm. Além da concentração, foram ava liadas a razão das absorbâncias 260/ 280nm, indicativa do grau de contaminação por proteínas (ideal= 1,8 - 2,0), e a razão 260/230nm para avaliação de possíveis contaminantes químicos (ideal= 2,0- 2,2). Em seguida, os tubos contendo RNA foram mantidos a -80ºC. 3.6.2 Tratamento com DNase e análise da qualidade do RNA total Para evitar a presença de DNA contaminante, o RNA extraído foi submetido a tratamento com DNas e ( deoxirribonuclease; Thermo Fisher Scientific , EUA), conforme recomendação do fabricante. Foram adicionadas 2U de DNase-I (1U/µl), 20U de RNaseOUTTM (inibidor de ribonuclease recombinante, 40U/µl) ( Thermo Fisher Scientific , EUA), 2µl de solução tampão 5X Buffer 1 st Strand (Thermo Fisher Scientific , EUA), e água DEPC (Dietilpirocarbonato), (Sigma -Aldrich, Alemanha) quantidade suficiente para (q.s.p.) 10µl, seguindo-se de incubações a 37ºC, por 10min, e a 75ºC, por 5min. A integridade e pureza do RNA tota l foram avaliadas utilizando-se o equipamento 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies , EUA). Esta análise baseia -se no princípio de separação eletroforética em matriz de gel aplicado nos capilares de um chip que contém uma mistura de fluoróforos e marcadore s de peso molecular. A ligação dos fluoróforos aos marcadores e ao 43 RNA resulta em fluorescência que é então quantificada, permitindo a separação dos RNAs ribossômicos 18S e 28S e a atribuição de um número de integridade (RIN, do inglês, RNA Integrity Number). O valor de RIN é gerado, automaticamente, pelo programa do equipamento, variando de 1-10. RNAs com valores de RIN ≥ 5 são considerados adequados para a técnica de qRT-PCR (Fleige e Pfaffl 2006). Após as avaliações de qualidade d as amostras de RNA total, as mesmas foram mantidas a -80ºC até o momento da sua utilização para a síntese de cDNA. No Anexo V, Figura 1 está um exemplo da representação gráfica da integridade de uma amostra de RNA gerada pelo programa, bem como os valores de RIN determinados para cada amostra (Anexo V, Tabela 1). 3.6.3 Síntese de cDNA A síntese de cDNA (DNA complementar) foi realizada a partir de 1µg de RNA total, ao qual foram adicionados: 1µl de desoxinucleotí deoos trifosfatados (dNTP, a 10mM) ( Invitrogen, EUA), 1µl de primer OligodT18 (500 µg/mL) ( Invitrogen, EUA) e 1µl de água livre de DNase/RNase (volume final = 13µl), seguindo -se de incubação a 65ºC por 10min, e posterior manutenção em gelo. Em seguida, foram adicionados: 4µl do tampão da enzima SuperScript® III (Buffer 5x; Invitrogen, EUA), 1µl de Ditiotreitol (0,1M) ( Invitrogen, EUA), 0,5µl de RNaseOUTTM a 40U/µl (Invitrogen, EUA), 1µl da enzima transcriptase reversa SuperScript® III, a 200U µl (Invitrogen, EUA) e 0,5 µl água livre de RNase/DNase (20µl de solução por tubo). A reação de síntese de cDNA ocorreu em 3 ciclos de incubação: 25ºC por 10min, 55ºC por 2h e 75ºC por 15min, em termociclador Veriti (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA). Por fim, foi adicionado 1µl de RNaseH ( Fermentas, Waltham, Massachusetts, EUA ) a cada reação, com posterior incubações a 37ºC, por 30min, e a 72 ºC, por 10min. As amostras de cDNA foram então diluídas na proporção 1:3, em água livre de DNase/RNase e estocadas a -20ºC, até o momento do uso para as reações de qRT-PCR. 3.6.4 Seleção dos primers A análise de expressão do gene MICA foi realizada por qRT -PCR utilizando-se primers (iniciadores) específicos para o gene MICA (Martín-Pagola et al., 2003), que amplificam parte da região gênica que codifica para os domínios extracelulares 1 e 2 da molécula MICA, respectivamente. Como gene normalizador da expressão do gene MICA, foi utilizado o gene endógeno, β-actina. O desenho do primer para β-actina foi realizado com o auxílio do programa Primer Express ® Programa v.2.0 ( Applied Biosystems , EUA). A sequência dos primers de β-actina foi extraída do banco de dados genômicos NCBI Reference Sequence , 44 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore; acesso NG_007992.1). Os primers selecionados respeitaram as características de 18-25 bases, To de anelamento entre 57-61oC e conteúdo de bases CG de 40 -60%. No Anexo V, Tabela 2 estão apresentadas as s equências e características físico-químicas dos pares de primers utilizados. Após a padronização, a concentração ideal dos primers, tanto para o gene MICA como para o gene controle, β-actina, foi definida como 100mM, consider ando-se a menor concentração onde o Ct, e o perfil da curva de amplificação, apresentaram as menores variações em relação às maiores concentrações e com uma menor formação de dímeros de primers. Foram também verificadas as eficiências de amplificação (Ef) desses primers, bem como foi selecionada a concentração ideal de cDNA a ser utilizada na qRT -PCR. Para o cálculo da Ef do produto, foi utilizada a fórmula Ef = 10 -1/a ou Ef (%) = (Ef -1) x 100 (exemplos de curvas de amplificação e cálculos das eficiências dos primers estão apresentadas no Anexo V, Figura 2). O resultado das Efs foram de 1,86 (86%) para o primer MICA e 1,91 (91%) para o primer β-actina. A diluição de cDNA considerada adequada para a reação foi de 1:30. V alores de eficiência entre 1,8 -2,2 indicam reprodutibilidade e exatidão na cinética de amplificação (Pfaffl, 2001). 3.6.5 Reações de qRT-PCR As reações de qRT -PCR foram realizadas em triplicata, em placas para leitura óptica de 96 poços ( Applied Biosystems, EUA) utiliz ando-se o equipamento Perkin-Elmer ABI Prism 7500 sequence detection system (Applied Biosystems, EUA), seladas com selo adesivo óptico (Applied Biosystems, EUA. O reagente Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, EUA), possui dNTPs, enzima DNA polimerase, solução tampão, além dos fluoróforos ROXTM e SYBR® Green (SYBR® Green Master Mix, Applied Biosystems, EUA). A cada poço de reação foram adicionados 6μL do reagente Fast SYBR® Green Master Mix , 3μL da solução de primers (foward e reverse) e 3 μL da amostra de cDNA diluída 1:30. A reação de amplificação ocorreu em 40 ciclos de 15seg a 94ºC, seguida de 1min a 60ºC. A intensidade de fluorescência na reação foi determinada pelo cálculo do ΔRn (ΔRn = Rn+ - Rn-), onde Rn + representa a intensidade de emissão do SYBR Green / intensidade de emissão do ROX, em um dado momento da reação; Rn - representa a intensidade de emi ssão do SYBR Green / intensidade de emissão do ROX, antes da amplificação. O fluoróforo ROX funciona como controle interno passivo na reação (emissão de fluorescência de intensidade constante durante toda a reação). Durante os ciclos iniciais da reação não há produto de amplificação, e os valores de ΔRn permanecem na linha de base (fluorescência do ROX >SYBR Green ). Durante a fase logarítmica da reação ocorre acúmulo dos produtos de amplificação, levando o ΔRn a ultrapassar a linha de base. Para a quantific ação relativa foi estabelecido um valor de ΔRn, correspondente à linha de corte ( Threshold), ponto da curva 45 onde se inicia a amplificação exponencial promovida por cada par de primers. O ciclo em que a ΔRn cruza o ponto de corte corresponde ao “ciclo de co rte” ou Threshold Cicle ( Ct) da amostra, é relativo à quantidade de mRNA alvo presente na amostra. As amostras de endométrios eutópicos (CTR e EDT) foram amplificadas para os genes MICA e β-actina. A expressão do gene MICA foi avaliada em relação ao gene endógeno, para uma mesma amostra. Foi baseada no cálculo do ΔCt, onde os valores de ΔCt representam a diferença de expressão entre o gene alvo (Ct MICA) e o gene endógeno (Ct β -actina). Para tanto, foi utilizada a formula ΔCt = Ct MICA – Ct β-actina, onde Ct representa o valor médio de Ct da triplicata de amostra. Desta forma, q uanto menor o valor de ΔCt, maior será a quantidade de mRNA do gene alvo presente na amostra. Neste estudo, optamos, em alguns resultados, por representar o valor do ΔCt por 1/ΔCt, de forma a facilitar a apresentação gráfica e a interpretação dos resultados de expressão gênica. 3.7 Imunohistoquímica: expressão proteica de MICA A pesquisa da proteína MICA em tecidos foi realizada pela técnica de imunohistoquímica, utilizando-se método imunoenzimático indireto. A identificação de antígeno foi baseada no método do complexo biotina -avidina-peroxidase, com revelação com o cromógeno diaminobenzidina (DAB), associado a peróxido de hidrogênio. Nas mulheres do grupo EDT (n=29) foram ana lisadas biópsias de lesão de EDT profunda (endométrio ectópico: lesão de retossigmóide ou retrocervical) e do respectivo endométrio eutópico. Nas mulheres do grupo CTR (n=23), foram analisadas as biópsias do endométrio eutópico. Os tecidos das biópsias ac ima descritos, já previamente fixados em formalina e incluídos em parafina para análise histopatológica na Divisão de Anatomia Patológica do HCFMUSP, foram cortados em micrótomo (aproximadamente 3μm) e montados em lâminas de vidro silanizadas ( Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA). Foram também preparados cortes histológicos adicionais para a realização da padronização da titulação dos anticorpos (Acs). Como controle positivo da expressão proteica de MICA, foram utilizados cortes de tecido de câncer ce rvical (epitelial). Os cortes e montagens das lâminas para a imunohistoquímica deste estudo foram realizados pelo Laboratório de Histologia e Imuno histoquímica, Departamento de Patologia da FMUSP. Inicialmente, as lâminas foram desparafinadas em xilol, a quente (estufa a 60-65ºC, por 5min) e, posteriormente, submetidas a 3 banhos de xilol a frio. Seguiu -se de 2 etapas para hidratação, com banhos em etanol 95% e 70%, com lavagens em água corrente e água deionizada a cada banho, seguindo -se de banho em ácido fórmico puro (3min) e novas lavagens em água corrente e água deionizada, e finalizada em tampão PBS1x. 46 A recuperação antigênica foi obtida por alta T o, 125º, por 1min, em panela de pressão (S2800-Dakocytomation, Bensalem, Pensilvania, EUA) utilizando-se tampão citrato 10mM, pH6. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com água oxigenada 3%, por 5min, por quatro vezes. Em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente, água destilada e em solução tampão fosfato -salina PBS/Tween® (solução deterg ente tamponante). Após essas etapas, foi adicionado, sobre cada corte de tecido, o Ac primário anti -MICA biotinilado (goat IgG Human MICA Biotinylated Antibody, BAF1300, R&D Systems, Mineápolis, Minesota, EUA), 1:100, previamente titulado, com posterior in cubação ON, em câmara úmida (4 -8ºC). As lâminas foram então lavadas por 3 vezes, em solução tampão fosfato -salina PBS 1x, por 3min cada lavagem. Em seguida, foi adicionado o Ac secundário IgG -HRP (anti-goat IgG -HRP, do inglês horseradish peroxidase ) (1:10 0) e as lâminas foram incubadas, por 30min a 37ºC, seguindo-se de mais 3 lavagens com PBS (por 3min). Em seguida as lâminas foram imersas em solução de peróxido de hidrogênio associado ao cromógeno DAB (diaminobenzidina). Após cerca de 5min, as lâminas fo ram lavadas em água corrente, por 10min, e contra - coradas com Hematoxilina de Harris, seguido de nova lavagem em água corrente, por 5min e desidratadas em seguidos banhos de etanol (1min em cada): etanol 70%, etanol 95% e 3 banhos de etanol 100%. As lâmina s foram então diafanizadas em 3 banhos de xilol (1min cada) e adicionadas as lamínulas sobre os cortes (com resina sintética), para posterior análise microscópica. Uma vez havendo a presença do antígeno MICA, o complexo resultante (biotina- HRP) reage com o peróxido de hidrogênio/DAB, emitindo uma coloração amarronzada. Como teste para controle negativo de expressão, o Ac primário foi substituído por solução salina tamponada (PBS). As lâminas de controle positivo foram processadas de maneira semelhante às lâminas de amostras em teste. 3.7.1 Avaliação da expressão proteica de MICA A expressão proteica de MICA foi avaliada base ando-se em escores, de acordo com a intensidade de marcação (0=sem marcação; 1=fraca; 2=moderada; 3=forte) e a porcentagem de célu las positivas (0= negativo; 1=1 –25%; 2=26 –50%; 3=51 –75%; 4=76 –100%). Esta análise foi realizada tanto para pesquisa da proteína MICA na glândula (epitélio) como no estroma, no mesmo tecido. O produto obtido pela multiplicação entre o escore de intensidade e o escore da porcentagem de células positivas (que variou entre 0 e 12) definiu o escore de imunorreatividade (EIR). Portanto, obtivemos um EIR para glândula e outro para estroma. Posteriormente, o EIR do epitélio glandular foi também categorizado como ex pressão alta ou baixa, base ando-se no valor da mediana de expressão do EIR do epitélio glandular no endométrio eutópico do grupo CTR (baixa, ≤ mediana; alta, > mediana). A avaliação microscópica (leitura) das lâminas de imunohistoquímica foi realizada por um médico patologista. 47 3.8 ELISA para pesquisa de MICA solúvel A pesquisa de MICA solúvel (sMICA) foi realizada pela técnica de ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay), utilizando-se o kit comercial “ Kit Duo Set Human MICA” (R&D Systems, EUA), segundo o protocolo do fabricante. A pesquisa de sMICA foi realizada em soro e fluido peritoneal (FP), pareados, de mulheres com e sem EDT (grupo CTR). Como parâmetro de detecção, foi utilizada uma curva padrão para a proteína MICA ( Human MICA St andard) nas concen trações 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,25pg/mL, como sugerido pelo fabricante do kit, sendo o limite de detecção do teste considerado 31,25pg/mL. Todos os testes (curva padrão e amostras teste) foram realizados em duplicata. Para o teste, foram util izadas microplacas de alta ligação com 96 poços e fundo chato (Nunc MaxiSorp , Roschester, New York, EUA), que foram previamente sensibilizadas com anticorpo (Ac) de captura (anti -MICA humano, 2µg/mL) ( 100µl) overnight (ON), em temperatura ambiente (TA). Após três lavagens (200µl cada) com tampão de lavagem [PBS 1x (Phosphate-Buffered Saline -solução salina tamponada; GIBCO- Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA ) contendo 0,05% de Tween 20 ( Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) (pH final=7,2-7,4)], foi rea lizado o bloqueio da placa com 200 µl de tampão de diluição comercial (PBS com 1% albumina de soro bovino – BSA, pH=7,2-7,4; R&D Systems, EUA), seguindo-se de incubação por 2h, em TA. Após três novas lavagens com tampão de lavagem (200 µl cada), foram adic ionados 100µl dos padrões da proteína MICA nas concentrações acima descritas, previamente diluídas em tampão de diluição, de acordo com o desenho de distribuição da placa. Foram também distribuídos 100µl das respectivas amostras de soro e fluido peritoneal (puras, sem diluição). Após 2h de incubação (TA) e 3 novas lavagens com tampão de lavagem (200 µl), foram adicionados 100 µl do Ac de detecção (anti -MICA humano biotinilado, 400ng/mL) ( R&D Systems, EUA), seguindo-se de mais 2h de incubação, TA. Após lavagem , foram adicionados 100µl de estreptoavidina conjugada com peroxidase (R&D Systems, EUA) (1:200). Após 20min (TA) foram realizadas novas lavagens (200 µl de tampão de lavagem) e adição de 100 µl da solução de substrato enzimático [H 2O2 e tetrametilbenzidina (R&D Systems, EUA)] (1:1). Após incubação por 20min, em TA, a placa foi bloqueada com 50 µl de ácido sulfúrico 2N. A leitura das densidades ópticas (DOs) foi efetuada a 450nm, em Leitora de ELISA ( Bio-Tek Instruments, Inc. - µQuant, Winooski, Vermont, EUA). As análises dos dados foram realizadas utilizando-se o programa KC Junior (Bio-Tek Instruments, Inc ., Winooski, Vermont, EUA). Para a curva padrão de sMICA foi criada uma curva logística de 4 parâmetros (4 -PL), a partir da qual foram gerados os dados das concentrações das amostras teste. Para análise estatística dos dados, valores abaixo do limite de detecção (31,25pg/mL) foram considerados como 30pg/mL e apresentados ao longo dos resultados como <31,25pg/mL. 48 3.9 Atividade efetora de células NK A avaliação da atividade efetora de células NK incluiu 3 abordagens de análises: i) Análise quantitativa das subpopulações de células NK, frequência (%) e intensidade de expressão (MFI) do receptor NKG2D, e das citocinas IFN-γ e IL-10, nessas subpopulações, na condição ex vivo. ii) Análise da atividade citotóxica pelas células NK frente a células alvo K562 (linhagem de células de leucemia mieloide crônica humana) (Lozzio e Lozzio 1977) sem bloqueio e com bloqueio para a proteína MICA, na superfície celular. iii) Análise da frequência e intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL - 10 em subpopulações de células NK, na condição basal - sem estímulo -, na presença de estímulo com células alvo K562 e com células K562 bloqueadas para MICA. O bloqueio de MICA teve como objetivo representar a presença de MICA solúvel, uma vez que sua presença tem sido descrita como envolvida na diminuição/comprometimento da atividade de células NK (Boukouaci et al., 2013; Groh et al., 2002). Os ensaios foram realizados utilizando-se PBMC de mulheres com EDT e de CTRs provenientes de laqueadura tubária (CTRs saudáveis), como fonte de células NK efetoras, previamente congeladas e mantidas em nitrogênio líquido até o momento do uso. A Figura 7 apresenta o esquema resumido do protocolo envolvendo as células NK. • Separação, congelamento e descongelamento de PBMCs As PBMCs foram isoladas de sangue heparinizado por meio de centrifugação por gradiente de densidade Histopaque 1077® (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) (Boyum, 1974). Inicialmente, o sangue foi diluído (1:2 a 1:3) em solução fisiológica e, cuidadosamente, colocado sobre 4mL de Histopaque, com posterior centrifugação (500g, 30min). A camada da interface (células mononucleares) foi, cuidadosamente, coletada e lavada por 2 vezes (450g, 8min e 100g, 8min), em solução fisiológica. Em seguida, as células foram contadas em Câmara de Neubauer e avaliadas quanto à viabilidade celular, utilizando-se o corante vital Tripan-blue 0,4% (Invitrogen, EUA), na diluição 1:2. Alíquotas de, aproximadamente, 2x10 6– 8 x10 6 células/mL foram criopreservadas em nitrogênio líquido, em solução contendo 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) e 90% de soro bovino fetal (FBS) ( GIBCO-Thermo Fisher , Massachusetts, EUA). Para o descongelamento celular, os criotubos foram retirados do nitrogênio líquido e colocados em banho-maria a 37ºC, até o início do descongelamento. A inda com pequena “pérola” de gelo, a suspensão celular foi levemente homogeneizada e transferida para um tubo de 15mL com fundo cônico (Corning, Tamaulipas, México) contendo 10 mL de meio R10 [meio RPMI 1640 ( Roswell Park Memorial Institute Medium, GIBCO-Life Technologies , Carlsbad, 49 Califórnia, EUA), contendo 10% soro fetal bovino - FBS (do inglês, Fetal Bovine Serum , GIBCO- Life Technologies , EUA), 2 mM de L -glutamina ( GIBCO- Life Technologies , EUA), 10.000U/mL penicilina -estreptomicina ( GIBCO- Life Technologies , EUA), 10mM Hepes (GIBCO- Life Technologies , EUA), 1mM de piruvato de sódio ( GIBCO- Life Technologies , Carlsbad, Califórnia, EUA), e 55 M 2 -mercaptoetanol ( GIBCO- Life Technologies , EUA)], aquecida a 37°C. A suspensão celular foi centrifugada a 350g, por 8min, seguindo -se de mais uma lavagem (350g, 8min) em 10mL de meio R10. Após esta etapa, foi realizada a contagem de células e análise da viabilidade celular ( Tripan-blue 0,4%; Invitrogen, EUA), em Câmara de Neubauer, e ajuste de concentração para cada ensaio específico. . 50 Figura 7. Esquema resumido do protocolo para avaliação da atividade efetora de células NK, baseado na degranulação da molécul a CD107a, expressão das citocinas IFN - e IL -10 e na sua atividade citotóxica. PBMC: células mononucleares do sangue periférico; ex vivo: condição após descongelamento celular e descanso de 1h, 37 oC, 5% CO2, sem estímulo; E: células efetoras (PBMCs, fonte de célula s NK); A: células alvo, K562; h, hora, K562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína MICA; CFSE: corante fluorescente, do inglês -Carboxyfluorescein succinimidyl ester, K562*CFSE: células K562 marcadas com o corante fluorescente CFSE, K562*CFSEBLOQ: cé lulas K562 marcadas com CFSE e bloqueadas para a molécula MICA; marcação LIVE/DEAD: marcação com corante LIVE/DEAD™ FixableAqua, para avaliação da viabilidade celular. 51 Parte das PBMCs descongeladas foi utilizada para imunofenotipagem de células NK , expressão de NKG2D, IFN-γ e IL -10 (1-2 x 10 6 células), na condição ex vivo, e parte para o ensaio de atividade efetora de células NK (5-10 x 106 células). As células para imunofenotipagem de células NK e análise de células produtoras de citocinas foram incubadas por 1h, a 37oC, 5%CO2, em 4mL meio R10, em tubo de 15mL, com inclinação de ≈45o e tampa afrouxada (considerada condição ex vivo). As células para a análise de atividade efetora de células NK foram incubadas por 16 - 18h, a 37 oC, 5%CO 2, em tubo de 15mL contendo 4mL meio R10 adicionado de 1 g/mL de DNase (Sigma Aldrich, EUA), mantendo a tampa afrouxada. 3.9.1 Análise quantitativa das subpopulações de células NK e expressão do receptor NKG2D e das citocinas IFN-γ e IL-10, na condição ex vivo Tais análises foram realiza das por citometria de fluxo, em PBMC de mulheres com endometriose (n=21) e de mulheres do grupo controle (n=20). Após o descongelamento e descanso celular de 1h, foram adicionados 6mL de meio RPMI puro (q.s.p 10mL) ao tubo, seguindo -se de centrifugação ( 450g, 5min). O botão celular foi ressuspenso em 1mL de PBS1x, seguido de contagem de células e a avaliação da viabilidade celular ( Tripan-blue 0,4%), em Câmara de Neubauer. Somente células com viabilidade acima de 85% foram utilizadas no experimento. As reações foram realizadas em tubos para citometria de fluxo, onde foram distribuídos o volume correspondente a 5 x10 5 células, sempre que possível (mínimo de 2 x10 5 para cada tubo), por tubo, de acordo com o painel de anticorpos (Acs) a ser utilizado. Poster iormente, foi adicionado 1mL de PBS1x, seguindo -se de centrifugação ( 450g, 5min) e descarte do sobrenadante. Em seguida, foi realizada a marcação de antígenos de superfície celular (CD3, CD56, CD16 e NKG2D) e intracelulares (IFN-γ e IL-10), para cada amostra (EDT ou CTR). • Marcação de antígenos de superfície celular Para a marcação de antígenos de superfície celular, nas PBMCs, foi utilizado um painel de Acs, previamente titulados, contendo: anti-CD3 APC H-7 (1:30; clone SK7; BD Biosciences, EUA), anti -CD16 PE -Cy7 ( 1:40; clone 3G8; BD Biosciences , EUA), anti -CD56 BV421 ( 1:20; clone NC AM16.2; BD Biosciences , EUA), anti -NKG2D Percp Cy5.5 ( 1:30; clone1D11;BD Biosciences, EUA) e o marcador de vi abilidade celular LIVE/DEAD (AmCyan) (1:100; LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Stain , Invitrogen, EUA). A mistura de Acs foi preparada em PBS1x, para um volume final de 50μl, consider ando-se as diluições de uso de cada Ac, a qual foi distribuída diretamente sobre o botão celular. Como controle negativo de marcação, 52 utilizamos um tubo com PBMC na ausência de qualquer marc ação com Ac (somente com o diluente, PBS 1x). As células (PBMCs) e os Acs foram homogeneizados e incubados por 30min, em TA, ao abrigo da luz. Após incubação, foram adicionados 500µl de PBS 1x e a suspensão celular foi novamente centrifugada (450g, 5min), seguindo-se para a marcação de proteínas intracelulares, conforme delineamento do estudo (mapa). • Marcação de antígenos intracelulares Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e foram adicionados 100 µl do reagente de fixação celular A (Life Technologies, EUA), seguindo-se de incubação por 15min, ao abrigo da luz, e posterior adição de 400µl de tampão de lavagem para citometria (PBS -1x + 2% Soro Fetal Bovino + 0,02% Azida Sódica) e centrifugação (450g, 5min). Em seguida, foram adicionados 50μL de uma mistura contendo os Acs anti -IL-10 PE (1:10; clone JES3-19F1; BD Biosciences, EUA) e anti-IFN-γ APC ( 1:30; clone 4SW.B3; Biolegend, San Diego, Califórnia, EUA), diluídos na solução B de permeabilização ( Life Technologies, EUA) de acordo com o título previamente definido em titulação. Como controle negativo para as fluorescências dos Acs IL -10 e IFN -, foi utilizada a estratégia Fluorescence Minus One (FMO), onde foram colocados todos os Acs monoclonais do painel do experimento, exceto para um desses Acs, conferindo seus respectivos controles (Roederer, 2001). Após a adição da mistura de Acs intracelulares, os tubos foram incubados por 40min, TA, ao abrigo da luz. Em seguida, foram adicionados 400µl de tampão de lavagem para citometria, seguindo -se de nova centrifugação (450g, 5min). As células foram então ressuspensas em 400µl de tamp ão de lavagem para citometria e mantidas a 4 oC, até a aquisição em citômetro de fluxo. • Aquisição das amostras e análise por citometria de fluxo A aquisição das amostras foi realizada no citômetro de fluxo BD FACSCanto TMII (BD Biosciences, EUA), utilizando-se o programa BD FACSDiva v.6.1.3 (BD Biosciences, EUA). Inicialmente, foi realizada uma análise das condições eletrônicas e ópticas do equipamento, utilizando-se o reagente Cytometer Setup e Tracking (CST, BD Biosciences , EUA). Para a compensação dos lasers, foi utilizada uma mistura de microesferas, negativa (sem capacidade de ligação; BD™ CompBead Plus Negative Control -BSA) e de microesferas que se ligam à cadeia leve K da imunoglobulina ( CompBeads anti -mouse IgK; BD Biosciences , EUA), as quais foram marcadas com os fluorocromos utilizados no ensaio. Em seguida, foi definida uma região em linfócitos ( gate), com base nos parâmetros de dispersão frontal do laser (FSC, Forward Scatter, correspondente ao tamanho celular) e de dispersão lateral do laser (SSC, Sider Scatter, correspondente à complexidade/granulosidade 53 celular). As células NK apresentam as mesmas características morfológicas correspondentes à FSC e SSC de linfócitos, tendo sido adquiridos, em citômetro de fluxo, um total mínimo de 2 x 105 eventos (células) nesta região, para posterior análise. • Estratégia de análise A análise dos dados foi realizada utilizando-se o programa FlowJo v.10 ( Tree Star , Ashle, Oregon, EUA). Inicialmente, foi selecionada a região de linfócitos, com base nos par âmetros FSC-A (Forward Scatter Area ) e de dispersão lateral do laser, SSC-A (Sider Scatter Area ). Em seguida, foi selecionada a região com células vivas, identificada com o uso do marcador de viabilidade LIVE/DEAD (AmCyan) (Invitrogen, EUA). Na região de c élulas vivas, foram então selecionadas células negativas para a marcação com o Ac anti -CD3 (CD3 -). As células de interesse, NK, são caracterizadas fenotipicamente como CD3 -CD56+CD16+/-. A partir das células CD3-, as células NK foram identificadas utilizando-se os parâmetros CD16 (eixo X) vs CD56 (eixo Y). A partir das células CD56 +, foram discriminadas as subpopulações CD56 bright e CD56dim. Dentro destas subpopulações, foram ainda discriminadas as subpopulações CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-. Foram avaliadas também as células NK totais, que incluem: subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+. Para todas as subpopulações, foram avaliadas a frequência (%) de células com expressão, e a me diana de intensidade de expressão (MFI), do receptor NKG2D e das citocinas IFN -γ e IL -10. A estratégia de análise para determinação das subpopulações de células NK e do receptor NKG2D, está apresentada na Figura 8. A estratégia de análise da % de subpopulações de células NK com expressão, e a da intensidade de expressão para as citocinas IFN -γ e IL -10 (marcação intracelular), estão apresentadas adiante, na Figura 9 (item 3.9.2.2). 54 Figura 8. Estratégia de análise para determinação das subpopulações de células NK circulantes e subpopulações NK com expressão de NKG2D, de mulheres com endometriose e controles . A) dispersão frontal (tamanho) (FSC -A, Forward Scatter Area ) e dispersão lateral (granularidade) (SSC -A, Sider Scatter Area ) para determinação da região de linfócitos; B) determinação de viabilidade celular – seleção de células vivas; C) seleção de células CD3 - (exclusão de CD3 +); D) identificação de subpopulações de células NK totais, que incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; E) identificação de subpopulações CD56dim e CD56bright; F) identificação de subpopulações CD56 dim e CD56 brigth, na presença ou ausência da molécula CD16 ( CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-); G) expressão de NKG2D, a partir das subpopulações identificadas nas regiões apresentadas nos itens E e F. 3.9.2 Análise da atividade efetora de células NK frente a estímulo com células K562 Como parte do ensaio funcional, as moléculas CD107a (represen tando a degranulação de vesículas – liberação de granzima e perforina) e das citocinas IFN - e IL-10 (representando a ativação de células NK ), foram avaliadas quanto à suas frequências (%) e intensidades da expressão (MFI) nas subpopulações de células NK, frente ao estímulo com células K562. Essas análises foram realizadas com PBMCs (fonte de células NK) de mulheres do grupo ETD (n= 21) e do grupo CTR (n= 20) nas condições: i) frente a células K562 (estímulo com células K562), ii) frente a células K562 n a presença de bloqueio para a proteína MICA 55 (estímulo com células K562BLOQ), representando a presença MICA solúvel, iii) na ausência de estímulo (sem células K562), apenas PBMCs. 3.9.2.1 Cultivo de células K562 e bloqueio da proteína MICA na superfície celular • Cultivo de células K562 As células K562 utilizadas neste estudo foram gentilmente cedidas pela Prof. Dra. Mari Sogayar (Núcleo de Terapia Celular e Molecular – NUCEL, USP). Após o descongelamento (mesmo protocolo de descongelamento de PBMCs, item 3.9), as células foram mantidas em meio R10 (garrafas de 250mL; Nunc, Rochester, New York, EUA), por 8-10 dias de cultura, com troca de meio, em média, a cada 2 dias. Em seguida, as células foram recuperadas e lavadas por centrifugação (300g, por 8min), em meio R10, e ressuspensas em 2mL de PBS 1x. Após esta etapa, foi realizada a contagem de células e verificação da viabilidade celular com o corante vital Trypan Blue 0,4%, utilizando-se Câmara de Neubauer. Somen te suspensões celulares com viabilidade acima de 85% foram utilizadas para os experimentos. • Bloqueio da proteína MICA na superfície celular Para o bloqueio da proteína MICA na superfície das células K562, foi utilizado o Ac anti-MICA não marcado (MAB1 300, mouse anti-human IgG 2B, clone 159227; R&D Systems, EUA), na diluição 1:10 (em PBS 1x), previamente titulado (ANEXO VI). Foram bloqueadas, em média, 1x10 6 células K562, para cada amostra (EDT ou CTR), para a composição dos ensaios. Consider ando-se o nú mero de amostras a serem analisadas, o volume correspondente a 0,5 x 10 6 de células K562 foi transferido para 2 poços de uma placa estéril de fundo U ( Nunc, EUA). Os poços foram completados com PBS 1x (q.s.p. 200 µl), seguindo - se de centrifugação a 450g, p or 5min. Após o completo descarte do sobrenadante (inversão), foram adicionados 50µl do Ac anti -MICA 1:10, diretamente ao botão celular, seguindo -se com leve homogeneização, com micropipeta. Após incubação por 30min (TA), o volume de cada poço foi transferido para um tubo de 15m L estéril, com lavagem de cada poço (PBS 1x), para recuperação celular. Após centrifugação (450g, por 5min), as células K562 foram ressuspensas em 1mL de meio R10, seguindo -se de contagem celular e verificação da viabilidade celular (Trypan Blue 0,4%) em Câmara de Neubauer. 56 3.9.2.2 Análise da expressão de MICA em células K562 pré e pós o bloqueio de MICA A expressão da proteína MICA foi avaliada, antes e após o bloqueio de MICA, com o objetivo de verificar a eficiência do bl oqueio. A expressão foi avaliada por citometria de fluxo, utilizando-se o Ac anti-MICA PE, previamente titulado (1:50, em PBS1x) (Anexo VI) (FAB1300, mouse anti-human IgG2, PE-conjugated anti-MICA, clone 159227; R&D Systems, EUA), o qual reconhece o mesmo epítopo antigênico do Ac anti-MICA não marcado (mesmo clone, 159227) utilizado para o bloqueio de MICA na superfície de células K562. Um total de 2 -5 x105 células (com e sem bloqueio) foi transferido para tubos de citometria de fluxo e a marcação da proteína MICA foi realizada segundo o protocolo de marcação para antígenos de superfície celular, acima descrito (item 3.9.1). Neste mesmo teste, foi também incluído o marcador de viabilidade celular LIVE/DEAD (1:100, em PBX 1x). Como controle negativo de expres são de MICA, foi incluído apenas a suspensão celular de K562, com e sem bloqueio, na ausência de Ac anti-MICA-PE (apenas o diluente, PBS 1x). A aquisição das células K562 foi realizada no citômetro de fluxo BD FACSCantoTMII utilizando-se o programa BD FACSDiva, v.6.1.3. Inicialmente, foi realizada a análise das condições eletrônicas e ópticas do equipamento, e a compensação dos lasers (conforme item 3.9.1) utilizando-se a mistura de microesferas BD™ CompBeads (BD Biosciences , EUA) marcadas com os mesmos fluorocromos utilizados neste ensaio. Após a compensação dos lasers, foi realizada a aquisição de 2x 105 células K562 com base nos parâmetros FSC -A ( Forward Scatter Area ) e de dispersão lateral do laser, SSC-A (Sider Scatter Area) considerando-se o total de células (all cells). • Estratégia de análise A análise da expressão de MICA em células K562 foi realizada utilizando-se o programa FlowJo v.10 (Tree Star, EUA). A expressão foi avaliada em células K562, com e sem bloqueio para MICA, no conjunto total d e células adquiridas ( all cells ). Inicialmente, foi selecionada a região com células vivas, por meio do marcador de viabilidade LIVE/DEAD. As células vivas são fracamente marcadas, correspondendo às células descoladas para a esquerda do eixo X. Na Figura 9 está apresentada a estratégia de análise da expressão de MICA em células K562. 57 Figura 9. Estratégia de análise para expressão de MICA em células K562. A) células K562 totais (all cells), de acordo com dispersão frontal (tamanho) (FSC -A, Forward Scatter Area) e dispersão lateral (granularidade) (SSC-A, Sider Scatter Area); B) determinação de viabilidade celular – seleção de células vivas, por meio do corante LIVE/DEAD; C) região de corte para MICA: controle negativo para expressão de MICA; D) expressão positiva para MICA, com base na região de corte do controle negativo. 3.9.2.3 Frequência e intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10, nas subpopulações de células NK A frequência de células que expressam CD107a, IFN-γ e IL-10, e suas intensidades de expressão, foram avaliadas em células efetoras (E): NK totais, subpopulações CD56 bright e CD56dim, e nas subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, nas condições: i) sem estímulo, ii) com estímulo de células alvo (A) K562, iii) com estímulo de células alvo (A) K562 bloqueadas para MICA. A proporção de células E:A para ensaio de cocultura foi definida em ensaio prévio como 5:1 (Anexo X). Após o descongelamento e lavagem (item 3.9), as PBMCs foram ressuspens as em 4mL de meio R10 com 1g/mL de DNase (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) (tubo de 15mL) e foram mantidas em repouso por 16 -18h, em posição inclinada 45 o, com tampas afrouxadas, a 37°C, em incubadora umidificada e 5% de CO2. Após o período de incubação, as suspensões de PBMCs e de células K562, que estavam mantidas em cultura, foram centrifugadas (450g, 8min) e ressuspensas em meio R10, contadas e verificadas quanto a sua viabilidade ( Tripan-blue 0,4%), em Câmara de Neubauer. Parte das células K562 foram bloqueadas para a proteína MICA (K562BLOQ), segundo o item 58 3.9.2.1. As células K562 tiveram sua concentração e viabilidade celular, novamente, avaliadas após o bloqueio para MICA. Uma vez avaliadas as concentrações de células vivas de PBMCs, cé lulas K562 e K562BLOQ, foi calculado o volume de cada suspensão celular (efetora e alvo) a ser utilizada no ensaio, de forma a manter a proporção E:A (PBMC:K562) de 5:1, sendo fixada, sempre que possível, a quantidade de 1x10 5 de células alvo. Os volumes f oram transferidos para uma placa de cultura celular de 96 poços, fundo U, de acordo com o mapa do experimento. Como controle de morte celular para PBMCs e células K562 (com e sem bloqueio) e da expressão espontânea de CD107a e de citocinas (controle negativo) em PBMC, tanto células K562 como PBMC foram incluídas no ensaio sem qualquer estímulo, apenas com meio R10. Como controle positivo de morte de células alvo, foi incluído no ensaio um poço com células K562 acrescidas de Tween 20 (0,1% final) ( Merck& Co. , EUA). Para cada amostra de PBMC do estudo (EDT e CTR), sempre que possível, devido ao número limitante de células, foi incluído um poço como controle positivo de ativação de células NK, com estímulo de PMA (forbol -12- miristato-13-acetato, 1g/mL) e ionomicina (1g/mL) (Sigma Aldrich, EUA). Após a distribuição das células, de acordo com o mapa do experimento, foi adicionado 1µl do Ac anti -CD107a FITC ( BD Biosciences , EUA). A adição desse Ac, no início da cocultura, teve como objetivo garantir que qualquer expressão de CD107, após de granulação pela célula NK, pudesse ser detectada. A expressão de CD107 na superfície celular é uma medida da degranulação (granzima e perforina) de vesículas intracelulares por linfócitos, incluindo células NK (Aktas et al., 2009). O volume final foi ajustado para 200µl, com meio R10. Em seguida, as placas foram mantidas a 37ºC, por 1h, em atmosfera de 5% CO2. Após este período de incubação, foram adicionados 0,5µl de brefeldina A ( BD GolgiPlug; BD Biosciences, EUA) e 0,5µl d e monensina ( Golgi-Stop; BD Biosciences, EUA) nos poços correspondentes, seguindo-se de nova incubação por mais 5 h, a 37 oC, em 5% de CO2. A adição de monensina tem como objetivo inibir o transporte de proteínas do retículo citoplasmático para o complexo d e Golgi (Mollenhauer et al., 1990). A brefeldina A tem a mesma função, porém bloqueia o transporte proteico numa etapa anterior à monoensina (Fujiwara et al., 1988). Portanto, ambas permitem o acúmulo intracelular de proteínas, facilitando sua detecção em células produtoras com a utilização de marcação florescente, na análise por citometria de fluxo. Após a incubação total de 6h, a placa foi centrifugada (450g, 5min) e o sobrenadante descartado por inversão rápida. As células foram ressuspensas em 200µl de tampão PBS1x e transferidas para tubos de citometria. Após mais uma lavagem com PBS1x (45 0g, 5min), deu- se seguimento à marcação de antígenos de superfície e intracelulares com Acs marcados com fluorocromos específicos, segundo o protocolo descrito acima (item 3.9.1). Para a marcação de antígenos de superfície foi utilizado o mesmo painel de Acs utilizado no ensaio na condição ex vivo, exceto o Ac NKG2D : anti-CD3 APC H -7 (1:30), anti- CD16 PE-Cy7 (1:40), anti-CD56 BV421 (1:20) e o marcador de viabilidade celular LIVE/DEAD 59 (1:100; LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Stain, Invitrogen, EUA). Para a marcação de IFN-γ e IL-10 (intracelulares) foram utilizados os mesmos Acs, previamente descritos para a condição ex vivo (IFN-γ APC e IL -10 PE). A marcação para CD107a ocorrera previamente, com a adição do Ac anti- CD107a FITC na primeira hora de incubação da cocultura. Como controle negativo para as fluorescências dos Acs IL -10 e IFN-, e para CD107a (como parte da cocultura ), foi utilizada a estratégia Fluorescence Minus One (FMO), onde foram colocados todos os Acs monoclonais do painel do experimento, exceto pa ra um desses Acs, conferindo seus respectivos controles (Roederer, 2001). Após a anál ise das condições eletrônicas e ópticas do equipamento, e da compensação dos lasers (já descritos no item 3.9.1), foi realizada a aquisição das células da cocultura (PBMC + K562) (mínimo de 2 x 105 células, em all cells) com base nos parâmetros FSC-A e SSC -A. A análise dos dados foi realizada utilizando-se o programa FlowJo v.10. A estratégia de análise está apresentada na Figura 10. 60 IFN-γ 3,44 Figura 10. Estratégia de análise para determinação das subpopulações de células NK circulantes, com exp ressão de C D107a, IFN -γ e IL -10, em mulheres com endometriose e controles. A) dispersão frontal (tamanho) (FSC -A, Forward Scatter Area ) e dispersão lateral (granularidade) (SSC -A, Sider Scatter Area ) para determinação da região de linfócitos; B) determinação de viabi lidade celular – seleção de células vivas; C) seleção de células CD3 - (exclusão de CD3+); D) identificação de subpopulações de células NK totais, que incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; E) identificação de subpopulações CD56dim e CD56bright; F) identificação de subpopulações CD56 dim e CD56 brigth, na presença ou ausência da molécula CD16 ( CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-); G) expressão de CD107a, a partir das subpopula ções identificadas nos itens E e F; H) expressão de IFN -γ, a partir das subpopulações identificadas nos itens E e F; I) expressão de IL -10, a partir das subpopulações identificadas nos itens E e F. 3.10 Avaliação da atividade citotóxica de células NK A capacidade citotóxica de células NK de mulheres com EDT (n=21) e de mulheres saudáveis do grupo CTR (n=20) foi avaliada após cocultura de PBMC (fonte de células NK efetoras, E) com células alvo (A) K562 e com células K562 bloqueadas para a proteína MICA (K562BLOQ). O bloqueio para MICA no ensaio teve como objetivo representar a presença de 61 MICA solúvel, descrito como com envolvimento na diminuição da atividade citolítica de células NK e T citotóxicas (Boukouaci et al., 2013; Groh et al., 2002). A análise foi realizada por citometria de fluxo, avaliando-se a frequência (%) de morte das células alvo, K562. Inicialmente, as células K562 foram marcadas com o corante fluorescente éster succinimidílico da carboxifluoresc eína, CFSE (K562*CFSE), com o objetivo de discriminá -las das PBMCs, na cocultura. Após a marcação com CFSE, parte das células foi também bloqueada para a molécula MICA, conforme descrito no item 3.9.2.1 3.10.1 Marcação das células K562 com CFSE Foram marcadas com CFSE, 2x105 células K562 vivas, para cada ensaio com paciente (EDT ou CTR). As células K562 que estavam sendo mantidas em cultura (8 -10 dias) foram recuperadas em tubos plásticos de 15mL e lavadas por centrifugação com meio RPMI sem soro (450g, 8min). Após o descarte total do sobrenadante, as células K562 foram ressuspensas em 10mL de PBS 1x, e novamente lavadas (450g, 5min) para a eliminação de qualquer possível resíduo de soro (proteína) contido no meio de cultura R10 e que pudesse gerar ligação inespecífica com CFSE. Em seguida, as células K562 foram ressuspensas em PBS 1x, contadas e avaliadas quanto à sua viabilidade ( Tripan-Blue, 04%), em Câmara de Neubauer. Para a marcação de CFSE, o total de 2x10 5 células K562 vivas foi dividido em 4 tub os de 15mL (0,5x10 5 células cada). Os tubos foram completados para 5mL com PBS1x, e submetidos a nova centrifugação (450g, 8min). O sobrenadante de cada tubo foi cuidadosamente descartado, seguindo-se com inversão do tubo sobre papel absorvente, para descarte total do diluente. Em seguida, foram adicionados 500µl de uma solução de CFSE 0,3µM, diretamente sobre no botão celular, seguindo com incubação, por 10min, a 37 oC, ao abrigo da luz, com homogeneização após os primeiros 5min. Após esta incubação, foram adicionados 5mL de meio R10 à suspensão celular, com o objetivo de parar a reação. A suspensão celular foi novamente incubada por mais 10min, TA, ao abrigo da luz. Em seguida, o tubo foi centrifugado (450g, 8min) e as células K562 ressuspensas em meio R10, para posterior contagem e avaliação de viabilidade celular com Tripan-blue 0,4% (Câmara de Neubauer). Somente suspensões celulares de células K562 com viabilidade acima de 85% foram utilizadas no ensaio. 62 3.10.2 Cocultura de PBMC: K562 (E:A) e marcação para morte celular As PBMCs de mulheres do grupo EDT e do grupo CTR foram previamente descongeladas e mantidas por 16 -18h, 37oC, 5%CO2, em 4mL de meio R10 (volume final de 4mL) com 1 g/mL de DNase (Sigma Aldrich, EUA) em tubo de 15mL, com inclinaç ão de ≈45 o e tampa afrouxada (obs.: mesmas amostras utilizadas na avaliação de células com expressão de CD107a, IFN-γ e IL-10, item 3.9.2.3). Em seguida, as células foram lavadas em meio R10 (q.s.p 15mL, 450g, 8min), contadas (Câmara de Neubauer) e avaliad as quanto à sua viabilidade celular com Tripan-blue 0,4%. Somente as suspensões de PBMCs com viabilidade acima de 85% foram utilizadas no ensaio. As células efetoras (E) PBMCs (fonte de células NK) foram então incubadas com células alvo (A) K562 marcadas com CFSE e também com células marcadas com CFSE e bloqueadas para MICA, na proporção 5:1 (E:A) em placa de cultura estéril de 96 poços, fundo U (Nunc, EUA), conforme mapa de distribuição, previamente preparado para o ensaio. As células foram cultivadas num volume total de 200μl de meio R10, tendo sido utilizadas 20.000 células-alvo. Como control e positivo de morte celular, foram utilizadas células K562 na presença de Tween20 0,1% e, como controle de morte espontânea, foram utilizadas as células K562 (marcadas com CFSE, com e s em bloqueio para MICA) cultivadas apenas na presença de meio R10. Em cada ensaio, foi também incluído um poço contendo apenas PBMC (1x10 5 células), de forma a avaliar a viabilidade celular no final do experimento, com a marcação do marcador LIVE/DEAD AmCyan. Após cultura de 4h, a 37 oC, 5% de CO 2, a placa foi centrifugada (450g, 5min) e as suspensões celulares (células da cocultura, células K562 e PBMC sozinhas) foram transferidas para tubos de citometria de fluxo, previamente identifica dos. Após lavagem com PBS1x (400μL) e descarte do sobrenadante, foram adicionados 50μl de uma mistura com marcador de viabilidade celular LIVE/DEAD (1:100), em PBS1x, diretamente sobre o botão celular. A marcação seguiu o protocolo para marcação de antígenos de superfície celular (item 3.9.1). As células K562 (controles, cultivadas somente com me io R10) foram avaliadas quanto à expressão proteica de MICA, utilizando-se o Ac anti -MICA (FAB 1300, 1:50). O protocolo de marcação, aquisição e análise da expressão de MICA em células K562 está descrito acima, no item 3.9.2.2 A marcação de células K562 e K562BLOQ cultivadas sozinhas (sem PBMC) com o marcador de viabilidade LIVE/DEAD indicou a frequência (%) de morte espontânea dessas células. Quando presente na cocultura com PBMC (do grupo EDT ou CTR), a frequência (%) de morte de células K562 correspondeu à morte específica na amostra. A atividade citotóxica de células NK da amostra foi avaliada pela frequência (%) de morte de células K562, calculada pela fórmula: 63 A análise dos dados foi realizada utilizando-se o programa FlowJo v.10 e a estratégia de análise para citotoxicidade de células NK contra células K562 (com e sem bloqueio para MICA) está apresentada na Figura 11. Figura 11. Estratégia de análise pa ra determinação da atividade citotóxica de células NK contra células K562. A) gráfico representativo de todas as células E:A adquiridas ( all cells ); B) gráfico representativo de células K562 positivas para a marcação CSFE ( corante fluorescente éster succinimidílico da carboxifluoresceína); C) gráfico representativo de células K562 positivas para CSFE e para o marcador de viabilidade celular LIVE/DEAD , indicando células mortas; E: células PBMC efetoras (fonte de células NK); A: células alvo K562; PBMC: células mononucleares do sangue periférico. 3.11 Análise estatística A análise da normalidade de distribuição dos dados foi realizada pelo teste de Shapiro- Wilk. As comparações de variáveis contínuas e com distribuição normal foram realizadas pelo teste para métrico Teste t e apresentadas por média e desvio padrão. As variáveis sem distribuição normal, foram analisadas pelos testes não -paramétricos Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis com pós -teste de comparação múltipla de Dunn ( quando mais de 2 comparações) e fora m apresentadas por medianas com valores de mínimo e máximo. A análise dos dados das variáveis qualitativas (nominais e ordinais) entre os grupos com e sem endometriose, foram comparadas pelo teste qui-quadrado ( 2) ou teste exato de Fisher, quando aplicável (n≤ 5). Para a análise de correlação entre os dados foi utilizado o teste não paramétrico de Spearman. Para os níveis de sMICA, no soro e no fluido peritoneal, foram criadas curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) para gerar um ponto de corte co m melhor sensibilidade e especificidade que pudesse discriminar as mulheres com EDT, em relação às mulheres do grupo CTR. A acurácia/desempenho do teste é representada pela área sob a curva (AUC, 64 Area Under Curve ), uma vez que a mesma leva em consideração todos os valores de sensibilidade e especificidade para cada valor da variável do teste (sMICA). Quanto maior o poder do teste em discriminar as mulheres com EDT, das do grupo CTR, mais a curva se aproxima do canto superior esquerdo, no ponto que represent a a sensibilidade e 1 - especificidade do melhor valor de corte (Lopes et al., 2014). Desta forma, foram considerados ideais os valores de AUC que se mais se aproximaram de 1, sendo que valores 0,7 ≤ AUC < 0,8 foram considerados como de discriminação aceitáveis (Tape, 2015). Para as análises estatísticas dos dados de sMICA, valores abaixo do limite de detecção (31,25pg/mL) foram considerados como 30pg/mL. As análises estatísticas foram realizadas no programa estatístico GraphPad Prism 6 (GraphPad Programa, Inc ., EUA) , exceto para a curva ROC, realizada utilizando-se o programa SPSS ( Statistical Package for Social Science ), versão 22. Foram considerado s significantes os valores de p< 0,05. ___________________________________________RESULTADOS 66 4. RESULTADOS Na Tabela 1 estão apresentadas as características clínicas e demográficas das mulheres do grupo EDT e mulheres do grupo CTR, participantes do presente estudo. Tabela 1. Características clínicas e demográficas das mulheres com endometriose e controles. Variáveis EDT (n=173) CTR (n=86) p Idade (mediana, min-max) 35 (21-50) 34 (21-50) ns* Infertilidade 87 (50,3) 0 (0,0) <0,0001 Dismenorreia 161 (93,0) 19 (22,0) <0,0001 Dispareunia de profundidade 123 (71,1) 4 (4,7) <0,0001 Dor pélvica crônica 84 (48,6) 8 (9,3) <0,0001 Alteração intestinal cíclica 146 (84,4) 7 (8,1) <0,0001 Alteração urinária cíclica 57 (32,9) 0 (0,0) <0,0001 Fase do ciclo proliferativa 24 (13,9) 42 (48,8) ns secretora 44 (25,4) 32 (37,2) ns desconhecida 36 (20,8) 12 (13,9) Estádio da EDT I 24 (13,9) NA II 42 (24,3) NA III 33 (19,1) NA IV 74 (42,7) NA Tipo de EDT SUP 13 (7,5) NA OVA 11 (6,4) NA PROF 108 (62,4) NA PROF + OVA 41 (23,7) NA EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle ( laqueadura tubária, n=60 e doenças não inflamatóri as, n=26, que incluem: mioma, n=16; mioma na presença de cisto benigno ovariano, n=3; lise de aderências, n=1; laparoscopia diagnóstica sem achado clínico, n=6); EVA: escala visual analógica de dor; estádios da endometriose de acordo com Revised American S ociety for Reproductive Medicine (rASRM, 199 6); I: EDT mínima; II: EDT leve; III: EDT moderada; IV: EDT grave; SUP: lesões na superfície do peritônio ; OVA: endometriose ovariana, com ou sem doença peritoneal e sem endometriose profunda; PROF: endometriose profunda com ou sem endometriose peritoneal e sem endometriose ovariana; PROF + OVA: endometriose profunda na presença de OVA; valores indicados para os grupos EDT e CTR são representados pelo número em cada grupo, de acordo com a variável e porcentagem correspondente, em parênteses – n (%), exceto para a variável idade; NA: não se aplica; valores de p determinados pelo teste de qui-quadrado ou exato de Fischer, *valor de p determinado pelo teste de Mann-Whitney. 67 4.1 Expressão gênica de MICA A análise de expressão do gene MICA (mRNA) foi realizada no endométrio eutópico das mulheres com EDT (n=24) e de CTRs saudáveis, sem EDT e que foram submetidas à laqueadura tubária (n=23). A análise foi realizada por qRT - PCR e o cálculo da quantificação relativa p elo método de Pfaffl (Pfaffl, 2001), consider ando-se a eficiência individual de amplificação de primers para o gene MICA e o gene β-actina, como gene endógeno para normalização do teste. Os valores médios de Cts das triplicatas testadas referentes à amplificação desses genes, os valores correspondentes de ΔCt e as características clínicas das mulheres com e sem EDT, estão apresentados no Anexo VII, Tabela 1. Na Figura 12 estão apresentados os valores de 1/∆Ct nos respectivos endométrios eutópicos. Tais valores referem -se à diferença entre as médias de Ct da expressão do gene MICA e do gene β-actina. A comparação da expressão gênica entre os dois gr upos não mostrou diferença significativa (p= 0,3427, teste de Mann-Whitney): EDT, média, 0,094 (±0,01) e mediana, 0,09 (0,07 -0,12, min-max); CTR, média, 0,097 (±0,01) e mediana, 0,1 (0,08 -0,13, min-max). 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 1 / C t s ( M IC A -  a c t in a ) C T R (n = 2 3 )E D T (n = 2 4 ) p = n s e n d o m é trio e u tó p ic o e n d o m é trio e u tó p ic o Figura 12. Expressão de mRNA de MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles. Expressão de mRNA de MICA normalizada pelo gene endógeno β-actina; valores de ∆Ct representados como 1/∆Ct; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; as barras horizontais representam a mediana; valor de p determinado pelo teste de Mann-Whitney; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); os valores de ∆Ct fo ram representados por 1/∆Ct, de forma a indicarem valores crescentes quanto à expressão gênica. A expressão do gene MICA também foi avaliada nas diferentes fases do ciclo menstrual. Sete mulheres do grupo EDT estavam na fase proliferativa (1 o ao 14o dia do ciclo), (7/24, 29,2%), 16 na fase secretora (15 o ao 28 o dia do ciclo) (16/24, 66,7%) e, para 1 (1/24, 4,1%), não foi possível obter a informação. No grupo CTR, 13 mulheres estavam na fase proliferativa (13/23, 56,5%), 7 na fase secretora (7/23, 30,4) e, em 3 casos (3/23, 13%), não foi possível obter a informação. Não foram observadas diferenças nos níveis de expressão de mRNA de MICA (1/∆C) em endométrio, tanto para o grupo EDT ( p= 0,3456) como para o 68 grupo CTR ( p= 0,2377), entre as diferentes fases do ciclo menstrual. A comparação entre os grupos EDT e CTR, tanto na fase proliferativa como na secretora, também não mostrou diferença da expressão do gene MICA (EDT: p= 0,7409; CTR: p= 0,0596) (teste de Mann- Whitney) (Figura 13). P ro lif. S e c re t. P ro lif. S e c re t. 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 1 / C t s ( M IC A -  a c t in a ) e n d o m é trio e u tó p ic o E D T e n d o m é trio e u tó p ic o C T R n = 7 n = 1 6 n = 1 3 n = 7 p = n s p = n s p = n s p = n s Figura 13. Expressão do gene MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual. Prolif: fase proliferativa (1o-14o dia); Secret: fase secretora (15o- 28o dia); EDT: grupo endomet riose; CTR: grupo controle; ∆Ct: diferença entre a expressão do gene alvo, MICA, e o gene normalizador endógeno, β-Actina; as barras horizontais representam a mediana; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 4.2 Expressão proteica de MICA A análise da expressão da proteína MICA foi realizada por imunohistoquímica em 29 mulheres com EDT profunda e em 22 mulheres CTRs saudáveis, provenientes de laqueadura tubária, por laparoscopia. No grupo EDT foi realizada pesquisa da proteína MICA em tecido de endométrio eutópico e de lesão de EDT profunda (15 casos de lesão de retossigmóide e 14 de retrocervical) e, no grupo CTR, no endométrio eutópico. As análises foram baseadas na intensidade de expressão e fr equência de positividade de marcação (%) para a proteína MICA, avaliadas tanto em epitélio glandular como no estroma. Foi calculado um escore de imunorreatividade (EIR) para ambos (epitélio glandular e estroma), definido pela multiplicação do escore de int ensidade de expressão de MICA pelo escore de frequência da expressão de MICA (descrito em Métodos, item 3.7.1). 4.2.1 Expressão proteica de MICA no epitélio glandular e estroma A expressão de MICA no epitélio glandular e no estroma foi baseada no EIR de MIC A (escore da intensidade x escore da frequência) (descrito em Métodos, item 3.7.1). A expressão no epitélio glandular foi maior que a expressão no estroma, tanto no endométrio do grupo CTR 69 [mediana 2 (1 -8, min-max) vs 1 (0-2, min-max); p< 0,0001], como na lesão profunda de EDT [mediana 2 (0 -8, min -max) vs 0 (0 -3, min -max); p<0,0001] e no endométrio eutópico de mulheres com EDT [mediana 3 (0 -12, min-max) vs 0 (0-3, min-max), p<0,0001] (valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney) (Figura 14). Os va lores de média e mediana dos escores de imunorreatividade em glândula e estroma estão apresentados na Tabela 2. Na Figura 15 estão exemplos representativos da expressão da proteína MICA nos tecidos de lesão endometrial e de endométrio eutópico de mulheres com EDT e do grupo CTR. Os escores de frequência e intensidade de expressão da proteína MICA em epitélio glandular e estroma, individualizados, para o grupo EDT e CTR, e dados clínicos estão no Anexo VIII, Tabela 1. L e s ã o p ro fu n d a E D T (n = 2 9 ) g lâ n d u la e s tro m a -2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 e s c o re d e im u n o rre a tiv id a d e (E IR ) (ep itélio ) p < 0 ,0 0 0 1 A ) E n d o m é trio e u tó p ic o E D T (n = 2 9 ) g lâ n d u la e s tro m a -2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 e s c o re d e im u n o rre a tiv id a d e (E IR ) (ep itélio ) p < 0 ,0 0 0 1 B ) E n d o m é trio e u tó p ic o C T R (n = 2 3 ) g lâ n d u la e s tro m a -2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 e s c o re d e im u n o rre a tiv id a d e (E IR ) p < 0 ,0 0 0 1 C ) (ep itélio ) Figura 14. Escore de imunorreatividade para expressão proteica de MICA em glândula (epitélio) e estroma, e representação da expressão em endométrio eutópico. A) lesão profunda de EDT ; B) endométrio eutópico de mulheres com EDT; C) endométrio eutópico de mulheres CTRs saudáveis; EIR: escore de imunorreatividade, definido pela multiplicação do escore de intensidade de expressão de MICA pelo escore de frequência da expressão de MICA; as barras horizontais repre sentam a mediana; linha pontilhada: valor zero para EIR; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; reação de imunohistoquímica; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 70 Tabela 2. Escore de imunorreatividade para epitélio glandular e e stroma da expressão da proteína MICA, na lesão profunda de endometriose e no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e controles. P 86 RC 0 0 1 0 C 43 1 1 P 99 RC 1 0 1 0 C 44 2 1 P 103 RC 2 0 4 2 C 45 2 1 P 104 RC 3 0 12 0 C 47 1 1 P105 RC 4 0 8 2 C 48 1 1 P 108 RC 6 1 6 1 C 85 1 1 P 110 RC 2 1 12 2 C 51 2 2 P 118 RC 3 1 12 2 C 57 1 1 P 119 RC 6 2 2 1 C 79 1 1 P 121 RC 6 3 2 1 C 58 2 2 P 124 RC 8 3 6 3 C 60 2 2 P 143 RC 1 0 1 0 C 61 1 1 P 149 RC 0 0 6 0 C 63 2 1 P 187 RC 6 1 1 0 C 64 2 1 P 188 RC 1 0 1 0 C 84 2 1 P 78 RS 6 2 6 2 C 68 1 1 P 79 RS 3 1 3 1 C 80 2 1 P 96 RS 1 0 9 0 C 71 8 0 P 97 RS 2 2 1 0 C 70 4 0 P 100 RS 1 1 3 0 C 73 8 0 P 126 RS 0 0 3 0 C 75 8 0 P 128 RS 8 3 2 3 C 83 4 0 P 139 RS 0 0 2 0 C 86 4 0 P 144 RS 3 0 6 0 P 147 RS 1 0 2 1 P 158 RS 2 0 12 0 P 185 RS 1 1 1 1 P 186 RS 1 1 3 1 P 189 RS 4 0 8 0 Média (DP) Mediana 2 0 3 (min-máx) (0-8) (0-3) (0-12) Endométrio eutópico 2,70 (2,3) 0,87 (0,63) 2,0 (1-8) 1,0 (0-2) Lesão Endométrio eutópico Tecido EIR Glândula EIR Estroma EIR Glândula EIR Estroma Código CTR EIR Glândula EIR Estroma 0 (0-3) 4,66 (3,85) 3,00 (2,45) 0,79 (1,01) 0,79 (0,98) Código EDT ENDOMETRIOSE CONTROLES ID: identificação das participantes do estudo; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; RC: lesão de endometriose retrocervical (n=15); RS: lesão de endometriose retossigmóide (n=14); DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; glândula: epitélio glandular; EIR: escore de imunorreatividade (definido pelo escore de intensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão de MICA). 71 Figure 15. Exemplos representativos de expressão da proteína MICA, por imunohistoquímica, em lesão de retossigmóide e em endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles. A) Endométrio eutópico de mulher controle saudável, controle negativo da reação; B) Endométrio eutópico de mulher controle saudável com marcação de MICA em epitélio glandular (EP) (seta); C) Endométrio eutópico de mulher com endometriose, c ontrole negativo da reação; D) Endométrio eutópico de mulher com endometriose com marcação de MICA em epitélio glandular (EP) e estroma (ES) (setas); E) Lesão de endometriose profunda de retossigmóide, controle negativo da reação; F) Lesão de endometriose profunda de retossigmóide, com marcação de MICA em epitélio glandular (EP) e estroma (ES) (setas); Objetiva 20 x. 72 Na comparação da expressão de MICA entre os diferentes tecidos (EDT e/ou CTR) não observamos diferenças significativas, tanto na glândula com o no estroma (teste de Mann- Whitney) (Figura 16): EIR glandular (epitélio glandular): • lesão vs endométrio eutópico EDT, p=0,1029 • lesão vs endométrio CTR, p=0,8925 • endométrio eutópico EDT vs endométrio eutópico CTR, p=0,0576 EIR estromal: • lesão vs endométrio eutópico EDT, p=0,9829 • lesão vs endométrio CTR, p=0,3182 • endométrio eutópico EDT vs endométrio eutópico CTR, p=0,3795. -1 0 1 2 3 4 6 8 1 0 1 2 E D T C T R E IR p a ra M IC A n o e p ité lio g la n d u la r n = 2 3n = 2 9 A ) p = n s p = 0 ,0 5 7 6 (n s )p = n s E p ité lio g la n d u la r le s ã o e n d o m é trio e u tó p ic o e n d o m é trio e u tó p ic o -1 0 1 2 3 4 E D T C T R E IR p a ra M IC A n o e s tro m a n = 2 3n = 2 9 B ) p = n s p = n sp = n s E s tro m a le s ã o e n d o m é trio e u tó p ic o e n d o m é trio e u tó p ic o Figura 16. Comparação dos escores de imunorre atividade (EIR) de expressão de MICA na lesão profunda, endométrio eutópico de mulheres dos grupos endometriose e controle. A) EIR glandular (epitélio); B) EIR estromal ; EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore da intensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; end.: endométrio; lesão: lesão profunda de EDT; análise realizada por imunohistoquímica; as barras horizontais representam a mediana; linha pontilh ada: valor zero para EIR; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann- Whitney. Tomando-se o epitélio glandular como base de análise, foi observado que 93,1% (27/29) das mulheres com EDT tiveram positividade em lesão (endométrio ectópico) e 96,55% (28/29) em endométrio eutópico. Todos os casos positivos para expressão de MICA na lesão foram também positivos no endométrio eutópico, pareado. Apesar de EIRs mais baixos (não significantes), 100% das mulheres do grupo CTR (23/23) apresentaram alguma positividade no epitélio glandular do endométrio eutópico. Os escores de imunorreatividade em epitélio glandular foram também avaliados em relação ao nível de expressão, “alto” ou “baixo”, tom ando-se como base a mediana de expressão do grupo CTR (mediana= 2,0). Assim, consideramos escores 2,0, como alta expressão. Do total de 27 casos positivos na EDT para 73 expressão de MICA na lesão, 13 (48%) foram considerados como de alta expressão e 14 (52%) como de baixa expressão. No endométrio eutópico das mulheres do grupo EDT, do total de 28 casos positivos, 17 (61%) tiveram alta expressão e 11 (39%), baixa expressão de MICA. No endométrio eutópico das mulheres do grupo CTR, apesar de todos serem positivos para expressão de MICA (n= 23), somente 6 (26%) tiver am alta expressão. Assim sendo, a frequência de expressão proteica de MICA considerada “alta” no endométrio eutópico de mulheres do grupo EDT foi maior do que a frequência de expressão “alta” no endométrio do grupo CTR (p= 0,0134, teste de qui-quadrado). No entanto, não foram observadas diferenças para as frequências de “alta” ou “baixa” expressão de MICA entre a lesão e endométrio eutópico de mulheres com EDT ( p= 0,3495) e endométrio CTR ( p= 0,1092) (teste de qui- quadrado) (Figura 17). le s ã o e n d o m é tr io e n d o m é tr io 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 P o s itiv id a d e M IC A e m ep ité lio g la n d u la r (% ) b a ix a e x p re s s ã o a lta e x p re s s ã op = 0 ,0 1 3 4 5 2 % (1 4 /2 7 ) 2 6 % (6 /2 3 ) 7 4 % (1 7 /2 3 ) 6 1 % (1 7 /2 8 ) 3 9 % (1 1 /2 8 ) 4 8 % (1 3 /2 7 ) e u tó p ic o E D T e u tó p ic o C T R Figura 17. Porcentagem de casos positivos com baixa ou alta expressão proteica de MICA no epitélio glandular, de acordo com os escores de imunorreatividade (EIR). Reação de imunohistoquímica; expressão proteica de MICA baseada na mediana do EIR do grupo controle (baixa, 2); análise em casos considerados positivos para expressão no epitélio (lesão profunda de EDT, n=27; endométrio eutópico de mulheres com EDT, n=28; endométrio eutópico de mulheres CTR, n=23); EDT: grupo endometriose; CT R: grupo controle; EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore da intensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; valor de p determinado pelo teste de qui-quadrado. 4.2.2 Expressão proteica de MICA em relação à fase do ciclo menstrual Do total de 29 mulheres do grupo EDT estudadas para a expressão proteica de MICA, 13 (45%) estavam na fase proliferativa (estrogênica) do ciclo menstrual e 16 (55%) na fase secretora (progestacional). No grupo CTR, 16/23 (70% ) estavam na fase proliferativa e 7/23 (30%) na fase secretora. Comparamos a expressão de MICA, tanto no epitélio glandular como no estroma, nos diferentes tecidos dos grupos de estudo (lesão profunda e endométrio eutópico de mulheres do grupo EDT e endom étrio de mulheres do grupo CTR). Não observamos diferença na expressão de MICA tanto no epitélio glandular como no estroma ( p> 0,05, teste de Mann- 74 Whitney) nem na EDT (lesão vs endométrio eutópico) nem entre EDT e CTRs (lesão ou endométrio eutópico de mulh eres com EDT vs endométrio eutópico de mulheres CTRs) (Figura 18). A estatística descritiva (média e mediana) dos escores representativos no epitélio glandular e estroma dos grupos EDT e CTR, está apresentada no Anexo VIII, Tabela 2A. -1 0 1 2 3 4 6 8 1 0 1 2 P R O L IF E R A T IV A (e p ité lio g la n d u la r ) E IR p a r a M IC A n o e p ité lio g la n d u la r A ) E D T n = 1 3 C T R n = 1 6 p = n s p = n s p = n s le s ã o p ro fu n d a e n d o m e trio e u tó p ic o e n d o m e trio e u tó p ic o -1 0 1 2 3 4 6 8 1 0 1 2 S E C R E T O R A (e p ité lio g la n d u la r ) E IR p a r a M IC A n o e p ité lio g la n d u la r B ) E D T n = 1 6 C T R n = 7 p = 0 ,0 5 6 0 (n s ) p = n s p = 0 ,0 5 2 6 (n s ) le s ã o p ro fu n d a e n d o m é trio e u tó p ic o e n d o m é trio e u tó p ic o -1 0 1 2 3 4 P R O L IF E R A T IV A (e s tr o m a ) E IR p a r a M IC A n o e s tro m a C ) E D T n = 1 3 C T R n = 1 6 p = n s p = 0 ,0 5 9 2 (n s ) p = n s le s ã o p ro fu n d a e n d o m é trio e u tó p ic o e n d o m é trio e u tó p ic o -1 0 1 2 3 4 S E C R E T O R A (e s tro m a ) E IR p a r a M IC A n o e s tro m a D ) E D T n = 1 6 C T R n = 7 p = n s p = n s p = n s le s ã o p ro fu n d a e n d o m é trio e u tó p ic o e n d o m é trio e u tó p ic o Figura 18. Escores de imunorreatividade de expressão proteica de MICA no epitélio glandular e estroma na lesão profunda e endométrio eutópico de mulheres do grupo endometriose e no endométrio eutópico de mulheres do grupo controle, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual. A) EIR de expressão de MICA no epitélio glandular, na fase proliferativa; B) EIR de expressão de MICA no epitélio glandular, na fase secretora; C) EIR de expressão de MICA no estroma, na fase proliferativa; D) EIR de expressão de MICA no estroma, na fase secretora; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão proteica de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; as barras horizontais representam a mediana; f ase proliferativa: 1o– 14o dia do ciclo; fase secretora: 15 o – 30o dia do ciclo; análise realizada por imunohistoquímica; linha pontilhada: valor de zero para EIR; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. Na comparação da expressão de MICA nos tecidos entre as fases do ciclo, considerando o epitélio glandular e o estroma, observamos diferenças significantes apenas para o grupo CTR (Figura 19). Encontramos maior expressão de MICA no epitélio glandular 75 do endométrio eutópico do grupo CTR, na fase secretora do ciclo (p= 0,0043). No entanto, no estroma do endométrio eutópico de CTR , observamos maior expressão de MICA na fase proliferativa do ciclo (p= 0,0074) (valores de p determinados pelo teste de Mann- Whitney). A estatística descritiva dos escores representativos nas fases do ciclo menstrual está apresentada em Anexo VIII, Tabela 2B. P R O L . S E C R . P R O L . S E C R . P R O L . S E C R . 0 2 4 8 1 2 E IR p a r a M IC A n o e p ité lio g la n d u la r p = 0 ,0 0 4 3 A ) le s ã o E D T e n d o m é tr io e u tó p ic o E D T e n d o m é tr io e u tó p ic o C T R n = 1 3 n = 1 6 n = 7n = 1 6n = 1 6n = 1 3 E p ité lio g la n d u la r p = n s p = n s P R O L . S E C R . P R O L . S E C R . P R O L . S E C R . -1 0 1 2 3 4 E IR p a r a M IC A n o e s tro m a B ) p = 0 ,0 0 7 4 le s ã o E D T e n d o m é tr io e u tó p ic o E D T e n d o m é tr io e u tó p ic o C T R n = 1 3 n = 1 6 n = 7n = 1 6n = 1 6n = 1 3 E s tro m a p = n s p = n s Figura 19. Comparação da expressão de MICA entre as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, na lesão de endometriose profunda e nos endométrios eutópicos de mulheres com endometriose e de controles. A ) expressão de MICA no epitélio glandular; B) expressão de MICA no estroma; CTR: grupo controle; PROL: fase proliferativa (1o - 14o dia do ciclo); SECR: fase secretora (15 o - 30o dia do ciclo); EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão proteica de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; as barras horizontais representam a mediana; linha pontilhada: valor zero para EIR; análise realizada por imunohistoquímica; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 76 4.2.3 Expressão proteica de MICA em relação aos estádios da endometriose A expressão de MICA na lesão profunda e no endométrio eutópico de mulheres com EDT, considerando o epitélio glandular e estroma não mostrou perfil diferencial entre os estádios iniciais (I/II) e os avançados da doença (III/IV), e desses, em relação ao grupo CTR (p> 0,05, teste Mann-Whitney) (Figura 20). A estatística descritiva total (epitélio glandular e estroma) dos escores representativos dos estádios da doença está apresentada no Anexo VIII, Tabela 2C. I/II III/IV I/II III/IV C T R 0 5 1 0 1 5 E IR p a ra M IC A n o e p ité lio g la n d u la r le s ã o e n d o m é trio e u tó p ic o e n d o m é trio e u tó p ic o p = n s p = n s p = n s p = n s I/II III/IV I/II III/IV C T R 0 1 2 3 4 E IR p a ra M IC A n o e s tro m a le s ã o e n d o m é trio e u tó p ic o e n d o m é trio e u tó p ic o p = n s p = n s p = n s p = n s Figura 20. Escore de imunorreatividade para a expressão da proteína MICA na lesão profunda e no endométrio eutópico de mulheres com EDT em estádios iniciais e avançados da endometriose, e no endométrio eutópico do grupo CTR. A) EIR para MICA no epitélio glandular; B) EIR para MICA no estroma; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle ; I / II: estádios iniciais da endometriose; III / IV: estádios avançados da endometrio se de acordo com a rASRM; EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão proteica de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; análise realizada por reação de imunohistoquímica; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 4.2.4 Expressão proteica de MICA na lesão profunda de retossigmóide e retrocervical A expressão de MICA não teve perfil diferencial entre as lesões profundas de retossigmóide (n=15) e retrocervica l (n=14), tanto no epitélio glandular como no estroma, (epitélio glandular: EDT retossigmóide vs retrocervical, p= 0,2760; estroma: EDT retossigmóide vs retrocervical, p= 0,9578 (Figura 21). A estatística descritiva total (média e mediana) dos escores representativos, de acordo com a localização da doença profunda, está apresentada no Anexo VIII, Tabela 2D. Considerando o todos os dados de expressão proteica de MICA nos grupos EDT e CTR, incluindo os parâmetros fase do ciclo menstrual, estádios e tipo de l esão profunda, podemos resumir que a expressão proteica de MICA foi maior no epitélio glandular, em ambos os grupos, tanto no endométrio eutópico (EDT e CTR) como na lesão profunda de EDT. No entanto, as principais diferenças entre os grupos foram: i) maior frequência de alta expressão de MICA em epitélio glandular do endométrio eutópico do grupo EDT; ii) maior expressão de 77 MICA no epitélio glandular do endométrio de mulheres do grupo CTR, na fase secretora do ciclo menstrual; iii) maior expressão de MICA no estroma do endométrio de mulheres do grupo CTR, na fase proliferativa do ciclo menstrual; essas diferenças ( ii e iii) são perdidas no grupo EDT. r e to s s ig m ó id e r e tr o c e r v ic a l -1 0 1 2 3 4 6 8 E IR p a ra M IC A n o e p ité lio g la n d u la r p = n s A ) E D T n = 1 4 E D T n = 1 5 E p ité lio g la n d u la r r e to s s ig m ó id e r e tr o c e r v ic a l -1 0 1 2 3 4 E IR p a r a M IC A n o e s tro m a p = n s B ) E D T n = 1 4 E D T n = 1 5 E s tro m a Figura 21. Escore de imunorreatividade para a expressã o da proteína MICA em lesões profundas de endometriose retossigmóide e retrocervical. A) epitélio glandular; B) estroma; EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore de intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de frequência de expre ssão MICA; análise realizada por imunohistoquímica; as barras horizontais representam a mediana do EIS; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 4.3 Pesquisa de MICA solúvel A pesquisa de MICA sol úvel (sMICA) foi realizada por ELISA, no soro e no FP, de 161 mulheres com EDT (média etária de 34,85 anos ± 6,29) e de 76 mulheres CTRs saudáveis (média etária de 35,48 anos ± 6,73). O grupo CTR foi composto de 50 mulheres submetidas à laparoscopia para l aqueadura tubária (LAQ) e por 26 mulheres submetidas à videolaparoscopia, por presença de doença ginecológica não inflamatória (DNI) ou para laparoscopia diagnóstica (descrito no item 3.1), mas sem EDT. Para as análises estatísticas, os valores abaixo do l imite de detecção (31,25pg/mL) , foram uniformizados como 30pg/mL e, descritos, ao longo dos resultados, como < 31,25pg/mL. Com o objetivo de avaliar a homogeneidade do grupo CTR, foi realizada, inicialmente, uma análise estatística entre os dois “subgrupo s” de CTRs (LAQ e DNI), não tendo sido observadas diferenças entre os mesmos (soro e FP, p≥ 0,05, Teste de Mann Whitney ), confirmando tratar-se de um grupo CTR homogêneo e válido considerá -lo conjuntamente para o presente estudo (Anexo IX, Figura 1). 78 4.3.1 Níveis de sMICA no soro e fluido peritoneal em mulheres com endometriose e controles Os ní veis de sMICA identificados nas mulheres com EDT foram maiores no FP (mediana 60, 30–893 min-max) em comparação aos níveis séricos (mediana < 31,25; < 31,25- 55 min-max; p< 0,0001). Esta mesma diferença foi observada no grupo CTR (FP, mediana <3 1,25, <3 1,25–239 min-max; soro, mediana < 31,25, < 31,25-82 min-max, p< 0,0001) (valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney) (Figura 22 e Tabela 3). S o r o F P 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 5 0 5 0 0 7 5 0 1 0 0 0 p < 0 ,0 0 0 1 E D T (n = 1 6 1 ) s M IC A (p g /m L ) A ) 3 1 ,2 5 S o r o F P 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 p < 0 ,0 0 0 1 C T R (n = 7 6 ) s M IC A (p g /m L ) B ) 3 1 ,2 5 Figura 22. Distribuição dos níveis de sMICA (pg/m L) no soro e fluido peritoneal (FP) de mulheres com endometriose (EDT) e controles (CTR). A) níveis de sMICA em mulheres com EDT; B) níveis de sMICA em mulheres CTR; ensaio realizado por ELISA; a linha tracejada representa o limite inferior de detecção do teste (31,25pg/mL); as barras horizontais representam a mediana; valores de p determinados pelo teste Mann–Whitney. Tabela 3. Níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres com endometriose e de controles. Mediana (min-max) p CTR (n=76) Soro <31,25 (<31,25-82,0) FP <31,25 (<31,25-239,0) EDT (n=161) Soro <31,25 (<31,25-155,0) FP 60 (<31,25-893,0) 46,56 (±23,86) <0,0001120,50 (±149,40) sMICA (pg/mL) Média (±DP) <31,25 (±6,36) <0,000152,48 (±44,79) EDT: grupo endometriose; C TR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peritoneal; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; n: número de amostras analisadas em cada grupo; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. Foi observada correlação positiva entre os níveis de sMICA, no soro e no FP, em ambos os grupos (EDT, r= 0,5, p< 0,0001; CTR, r= 0,3, p= 0,004; teste de correlação de Spearman) (Figura 23). 79 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 r= 0 ,5 p < 0 ,0 0 0 1 s M IC A (p g /m L ) n o s o ro s M IC A (p g /m L ) n o F P 3 1 ,2 5 A ) E D T (n = 1 6 1 ) 0 5 0 1 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 r= 0 ,3 p = 0 ,0 0 4 s M IC A (p g /m L ) n o s o ro s M IC A (p g /m l) n o F P 3 1 ,2 5 C T R (n = 7 6 )B ) Figura 23. Análise de correlação entre os níveis de sMICA no soro e no fluído peritoneal (FP), em mulheres com endometriose (EDT) e controles (CTR). A) mulheres com EDT; B) mulheres CTRs; ensaio realizado por ELISA ; o limite mínimo de detecção do teste foi de 31,25pg/mL; valores de r e p determinados pelo teste de correlação de Spearman. Os níveis de sMICA foram maiores na EDT do que no grupo CTR, tanto no soro ( p= 0,0004) como no FP (p< 0,0001) (Teste de Mann-Whitney) (Figura 24). E D T C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 S o ro n = 1 6 1 n = 7 6 p = 0 ,0 0 0 4 s M IC A (p g /m L ) 3 1 ,2 5 A ) E D T C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 5 0 0 7 5 0 1 0 0 0 F lu id o p e rito n e a l n = 1 6 1 n = 7 6 p < 0 ,0 0 0 1 s M IC A (p g /m L ) 3 1 ,2 5 B ) Figura 24. Distribuição dos níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres com endometriose e de controles. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; A) níveis de sMICA no soro; B) níveis de sMI CA no fluido peritoneal; ensaio realizado por ELISA; a linha tracejada representa o limite mínimo de detecção do teste (31,25pg/mL); a s barras horizontais representam a mediana; valores de p determinados pelo teste Mann-Whitney. 4.3.2 Níveis de sMICA nos diferentes estádios da endometriose Os níveis de sMICA, no soro e FP, foram comparados entre mulheres em estádios iniciais (I/II, n=6 4) e avançados (III/IV, n=97) da EDT, e desses em relação ao grupo CTR (n=76). Análise geral entre os 3 grupos (CTR, EDT I/ II e EDT III/IV) mostrou diferenças nos níveis de sMICA entre eles, tanto no soro ( p= 0,0006) como no FP ( p< 0,0001) (teste de Kruskal-Wallis). Na análise comparativa entre 2 grupos, não houve diferença nos níveis de sMICA entre estádios iniciais e avançados da doença (p≥ 0,05) (Figura 25) (soro e FP). Porém, 80 tanto mulheres em estádios iniciais como em estádios avançados apresentaram níveis de sMICA maiores do que CTRs saudáveis (soro e FP) (EDT inicial vs CTR: soro, p= 0,0114; FP, p= 0,0052) (EDT avançada vs CTR: soro, p= 0,0001; FP, p< 0,0001) (teste de Mann-Whitney) (Figura 25). Valores de média e mediana dos grupos analisados estão apresentados no Anexo IX, Tabela 1. I / II III / IV C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 S o ro p = 0 ,0 1 1 4 p = 0 ,0 0 0 1 n = 7 6n = 6 4 n = 9 7 A )s M IC A (p g /m L ) 3 1 ,2 5 p = n s I / II III / IV C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 5 0 0 7 5 0 1 0 0 0 p < 0 ,0 0 0 1 p = 0 ,0 0 5 2 s M IC A (p g /m L ) B ) 3 1 ,2 5 n = 7 6n = 6 4 n = 9 7 F lu id o p e rito n e a l p = n s Figura 25. Comparação dos nívei s MICA solúvel entre mulheres em estádios iniciais (I/II) e avançados (III/IV) da endometriose e controles, no soro e no fluido peritoneal. A) níveis de sMICA no soro; B) níveis de sMICA no FP; ensaio realizado por ELISA ; sMICA: MICA solúvel; CTR: grupo controle; FP: fluido peritoneal; linha tracejada: limite inferior de detecção do teste (31,25pg/mL); estádios de acordo com a rASRM; as barras horizontais representam a mediana; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney; ns: não significante. A comparação dos níveis de sMICA entre os quatro diferentes estádios da EDT (I, n=24; II, n=40; III, n=34; IV, n=63) e o grupo CTR também mostrou diferença significativa, tanto no soro como no FP ( p = 0,0004 e p < 0,0001, respectivamente; Teste de Kruskal-Wallis). No entanto, observamos que mulheres em estádios II, III e IV mostraram níveis mais elevados de sMICA (soro e FP), em relação ao grupo CTR ( p< 0,05) (Figura 26) e mulheres em estádio inicial mínimo (I) tiveram níveis de sMICA sem diferença estatísti ca em relação àqueles do grupo CTR (soro e FP; p≥ 0,05) (Figura 26) (teste de Mann-Whitney). 81 I II III IV C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 S o ro p = 0 ,0 0 0 3 p = 0 ,0 0 6 7 p < 0 ,0 0 0 1 e s tá d io s E D T s M IC A (p g /m l) n = 7 6n = 2 4 n = 4 0 n = 3 4 n = 6 3 A ) 3 1 ,2 5 F lu id o p e rito n e a l I II III IV C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 5 0 0 1 0 0 0 e s tá d io s E D T p = 0 ,0 0 0 4 p < 0 ,0 0 0 1 p = 0 ,0 0 6 7 s M IC A (p g /m l) n = 7 6n = 2 4 n = 4 0 n = 3 4 n = 6 3 3 1 ,2 5 B ) Figura 26. Níveis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com endometriose em diferentes estádios da endometriose e em controle s. A) níveis de sMICA no soro; B) níveis de sMICA no fluido peritoneal; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; I: EDT inicial, mínima; II, EDT inicial, leve; III: EDT avançada, moderada; IV: EDT avançada, grave - estádios de aco rdo com a rASRM; ensaio realizado por ELISA; linha tracejada: limite inferior de detecção do teste (31,25pg/mL), as barras horizontais representam a mediana; valores de p determinados pelo teste de Mann–Whitney. 4.3.3 Níveis de sMICA nas diferentes fases do ciclo menstrual No grupo EDT, 62 mulheres estavam na fase proliferativa e 99 na secretora do ciclo menstrual. No grupo CTR, 37 mulheres estavam em fase proliferativa e 29 na secretora; para 10 mulheres não foi possível obter a informação. No grupo CTR, foram observados níveis de sMICA maiores no soro, na fase secretora (progestacional) do ciclo, em relação à fase proliferativa ( p= 0,0389). No FP, não foram observadas diferenças entre as diferentes fases do ciclo menstrual ( p= 0,4522) (Figura 27). Os valores de p foram determinados pelo teste de Mann-Whitney. No grupo EDT, não foram observadas diferenças nos níveis de sMICA entre as diferentes fases do ciclo menstrual, tanto no soro ( p= 0,7472) como no FP ( p= 0,4053), sendo mantidos os maiores níveis no FP (Figura 27). Na análise comparativa dos níveis de sMICA entre os grupos, observamos os maiores níveis de sMICA no FP do grupo EDT, independentemente da fase do ciclo (Proliferativa: FP, EDT vs CTR, p= 0,0278; Secretora: FP, EDT vs CTR, p= 0,0003). No ent anto, no soro, os maiores níveis de sMICA, em relação ao grupo CTR ocorreu na fase proliferativa (estrogênica) do ciclo, (Proliferativa: soro, EDT vs CTR, p= 0,0012; Secretora: Soro, EDT vs CTR, p= 0,1056, ns) (Figura 28) (teste de Mann-Whitney). 82 p ro life ra tiv a s e c re to ra p ro life ra tiv a s e c re to ra 0 5 0 1 0 0 1 5 0 5 0 0 1 0 0 0 S o ro F P s M IC A (p g /m L ) n = 6 2 n = 6 2n = 9 9 n = 9 9 3 1 ,2 5 A ) E D T p = n s p = n s p ro life ra tiv a s e c re to ra p ro life ra tiv a s e c re to ra 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 3 0 0 s M IC A (p g /m L ) 3 1 ,2 5 S o ro F P n = 3 7 n = 3 7n = 2 9 n = 2 9 B ) C T R p = 0 ,0 3 8 9 p = n s Figura 27. Distribuição dos níveis de MICA solúvel, no soro e fluido peritoneal (FP) de mulheres com endometriose e de controles, nas diferentes fases do ciclo menstrua l. A) níveis de sMICA em mulheres com EDT ; B) níveis de sMICA no grupo CTR; fase p roliferativa: 1 o– 14o dia do ciclo; fase secretora: 15o – 30o dia do ciclo; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; análise realizada por ELISA; a linha tracejada indica o limite inferior de detecção do teste (31,25pg/mL); as barras horizontais representam as medianas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05 ); valor de p determinado teste de Mann–Whitney. E D T C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 P ro life ra tiv a : s o ro s M IC A (p g /m L ) 3 1 ,2 5 A ) p = 0 ,0 0 1 2 n = 6 2 n = 3 7 E D T C T R 0 1 0 0 2 0 0 4 0 0 8 0 0 s M IC A (p g /m L ) 3 1 ,2 5 B ) p = 0 ,0 2 7 8 n = 6 2 n = 3 7 P ro life ra tiv a : F P E D T C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 S e c re to ra : s o ro s M IC A (p g /m L ) 3 1 ,2 5 C ) n = 9 9 n = 2 9 p = n s E D T C T R 0 1 0 0 2 0 0 4 0 0 8 0 0 S e c re to ra : F P s M IC A (p g /m L ) 3 1 ,2 5 D ) p = 0 ,0 0 0 3 n = 9 9 n = 2 9 Figura 28. Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL), no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com endometriose e de controles saudáveis, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual. A) e B) níveis de sMICA na fase proliferativa do ciclo, no soro e FP, respectivamente; C) e D) níveis de sMICA na fase secretora do ciclo, no soro e FP, respectivamente; fase proliferativa: 1o - 14o dia do ciclo; fase secretora: 15 o - 30o dia do ciclo; ensaio realizado por ELISA; sMICA: MICA solúvel, FP, fluido peritoneal; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; a linha tracejada indica o limite de detecção do teste (31,25pg/mL); as barras horizontais representam as mediana; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann–Whitney. 83 4.3.4 Níveis de sMICA em relação aos tipos de endometriose Os níveis de sMICA ( soro e FP) foram analisados de acordo com os tipos de endometriose. Com base nesse parâmetro, as mulheres foram agrupadas em: EDT peritoneal sem outros locais de acometimento (SUP, n=13), EDT ovariana, com ou sem doença peritoneal e sem EDT profunda (OVA, n=11), EDT profunda, com ou sem doença peritoneal e sem doença ovariana (PROF, n=99) e PROF na presença de OVA (PROF + OVA, n=38). Na comparação entre o grupo EDT e o grupo CTR, foram observadas diversas diferenças nos níveis de sMICA, tanto no soro como n o FP (Figura 29). Os valores de p foram determinados pelo teste de Mann–Whitney. Soro: maiores níveis em: OVA ( p= 0,0041), PROF ( p= 0,0033) e PROF +OVA ( p< 0,0001), comparativamente ao grupo CTR FP: maiores níveis em: OVA ( p= 0,0223), PROF ( p= 0,0004) e PROF +OVA ( p< 0,0001), comparativamente ao grupo CTR Destacamos que os níveis mais elevados foram observados na presença de doença profunda (PROF e PROF+OVA). No entanto, devemos considerar que a presença de doença profunda foi mais frequente do que as de mais formas e, a maior parte das mulheres (97/161, 60,2%) apresentava estádio mais grave da doença (III/IV), onde ocorreu maior frequência de doença profunda, conforme apresentado na Tabela 4. Não foi observada diferença entre os níveis de sMICA (soro e FP ) entre mulheres com doença SUP e mulheres do grupo CTR (p≥0,05) (Figura 29). Tabela 4 . Distribuição das lesões de endometriose segundo os tipos e estádios da endometriose I/II III/IV Tipos EDT n (%) n (%) SUP 13 (8,1) NA OVA 0 (0,0) 11 (6,8) PROF 50 (31,1) 49 (30,4) PROF+OVA 1 (0,6) 37 (23,0) Total 64 (39,8) 97 (60,2) Estádios EDT: endometriose; SUP: lesão superficial; OVA: EDT ovariana, com ou sem doença peritoneal e sem EDT profunda; PROF: EDT profunda com o u sem EDT peritoneal e sem EDT ovariana; OVA+PROF: PROF na presença de OVA; NA: não se aplica devido à ausência de casos nesta condição; I/II: estádios iniciais (mínimo/leve) da endometriose; III/IV: estádios avançados (moderado/grave) da endometriose, de acordo com a rASRM; n: número de amostras analisadas em cada grupo. 84 S U P O V A P R O F P R O F + O V A C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 n = 1 3 n = 1 1 n = 9 9 n = 3 8 s M IC A (p g /m L ) A ) 3 1 ,2 5 n = 7 6 p = 0 ,0 0 4 1 p = 0 ,0 0 3 3 p < 0 ,0 0 0 1 S o ro p = n s S U P O V A P R O F P R O F + O V A C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 5 0 0 1 0 0 0 n = 1 3 n = 1 1 n = 9 9 n = 3 8 s M IC A (p g /m L ) B ) 3 1 ,2 5 n = 7 6 p = 0 ,0 2 2 3 p = 0 ,0 0 0 4 p < 0 ,0 0 0 1 F lu id o p e rito n e a l p = n s Figura 29. Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL) no soro e no FP de mulheres com endometriose de acordo com o local de acometi mento da doença, e no grupo controle. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; SUP: EDT superficial; OVA: EDT ovariana; PROF: EDT profunda; PROF+OVA: EDT profunda na presença de EDT ovariana; e nsaio realizado por ELISA; a linha tracejada indica o limi te inferior de detecção do teste (31,25pg/mL); as barras horizontais representam as medianas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05 ); valores de p determinados pelo teste de Mann–Whitney. Os valores das concentrações de sMICA (soro e FP) e os dados clínicos individualizados de ambos os grupos estudados estão apresentados no Anexo IX, Tabela 2. No Anexo IX, Tabela 3, estão apresentadas as concentrações (média e mediana) de sMICA no soro e fluido peritoneal, de acordo com a fase do ciclo menstrual (3A), estádio e tipos de endometriose (3B). 85 4.3.5 Níveis de sMICA e expressão gênica de MICA Analisamos a ocorrência, ou não, de correlação entre os níveis de sMICA (soro e FP) e a expressão do gene MICA. No grupo EDT, das 24 mulheres avaliadas para expressão de mRNA de MICA (Resultados, Item 4.2), 16 também foram avaliadas para os níveis de sMICA No grupo CTR, 14/23 foram avaliadas tam bém para os níveis de sMICA (soro e FP). No entanto, em ambos os grupos não observamos correlação ( p≥ 0,05, teste de correlação de Spearman) (Figura 30). A análise da expressão do gene MICA em relação aos estádios da doença não foi realizada, pois a maior parte de mulheres (23/24, 95,8% ) estava em estádio avançado da doença (III e IV). 0 .0 6 0 .0 8 0 .1 0 0 .1 2 0 .1 4 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 / C t m R N A M IC A e n d o m é t r io e u t ó p ic o s M IC A s o r o ( p g /m L ) p = n s A ) E D T (n = 1 6 ) 0 .0 6 0 .0 8 0 .1 0 0 .1 2 0 .1 4 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 / C t m R N A M IC A e n d o m é t r io e u t ó p ic o s M IC A F P ( p g /m L ) p = n s B ) E D T (n = 1 6 ) 0 .0 7 0 .0 8 0 .0 9 0 .1 0 0 .1 1 0 .1 2 0 .1 3 0 5 1 01 0 2 0 3 0 1 / C t m R N A M IC A e n d o m é t r io e u t ó p ic o s M IC A s o r o ( p g /m L ) p = n s C ) C T R (n = 1 4 ) 0 .0 7 0 .0 8 0 .0 9 0 .1 0 0 .1 1 0 .1 2 0 .1 3 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 1 / C t m R N A M IC A e n d o m é t r io e u t ó p ic o s M IC A F P ( p g /m L ) p = n s D ) C T R (n = 1 4 ) Figura 30. Análises de correlação entre os valores de 1/∆C t para mRNA de MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, e os níveis de MICA solúvel. A) 1/∆Ct no endométrio EDT vs sMICA no soro; B) 1/∆Ct no endométrio EDT vs sMICA no FP; C)1/∆Ct no endométrio CTR vs sMICA no soro; D) 1/∆Ct no endométrio CTR vs sMICA no FP; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; FP: fluido peritoneal; sMICA: MICA solúvel; níveis de sMICA determinados por ELISA; ∆Ct: diferença entre a expressão do gene alvo, MICA, e o gene normalizador endógeno, β-Actina; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de correlação de Spearman. 86 4.3.6 Análise de correlação entre os níveis de sMICA e a expressão de MICA in situ A análise de correlação entre a expressão proteica in-situ de MICA (lesão e endométrio eutópico do grupo EDT, e endométrio eutópico do grupo CTR) e os níveis de sMICA (soro e FP) foi realizada em 23 mulheres do grupo EDT e em 17 mulheres do grupo CTR, considerando-se os EIRs em glândula e estroma. Não foi observada correlação entre os níveis de sMICA, tanto do soro, como do FP, e a expressão proteica in-situ de MICA na lesão e no endométrio eutópico de mulheres com EDT, tanto em glândula como em estroma. No entanto, foi observada correlação positiva entre os níveis de s MICA no soro de mulheres CTR e a expressão de MICA no epitélio glandular (r= 0,7, p= 0,0063; teste de correlação de Spearman) (Figura 31). Não foi observada correlação entre sMICA no FP e expressão de MICA em epitélio glandular, nem entre os níveis de sMIC A, tanto do soro, como do FP, e a expressão proteica in-situ de MICA no estroma. Na Figura 31 estão apresentados alguns exemplos de análise de correlação (análise de correlação de Spearman). 0 5 1 0 1 5 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 E IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r) e n d o m é trio e u tó p ic o s M IC A s o ro (p g /m L ) p = n s A ) E D T (n = 2 3 ) 0 5 1 0 1 5 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 E IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r) e n d o m é trio e u tó p ic o s M IC A F P (p g /m L ) p = n s B ) E D T (n = 2 3 ) 0 2 4 6 8 1 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 E D T (n = 2 3 ) E IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r) L e s ã o s M IC A s o ro (p g /m L ) C ) p = n s 0 2 4 6 8 1 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 E IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r) L e s ã o s M IC A F P (p g /m L ) E D T (n = 2 3 )D ) p = n s 0 2 4 6 8 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 C T R (n = 1 7 ) E IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r) e n d o m é trio e u tó p ic o s M IC A s o ro (p g /m L ) E ) r= 0 ,7 p = 0 ,0 0 6 3 0 2 4 6 8 1 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 E IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r) e n d o m é trio e u tó p ic o s M IC A F P (p g /m L ) C T R (n = 1 7 )F ) p = n s Figura 31. Análise de correlação entre os níveis de sMICA, no soro e no fluido peritoneal, e a expressão proteica in situ de MICA em epitélio glandular. A), C) e E) níveis sMICA no soro e EIR MICA; B) D) e F) níveis sMICA no fluido peritoneal (FP) e EIS MICA; níveis de sMICA avaliados por ensaio de ELISA; análise de expressão in situ da proteína MICA realizada por imunohistoquímica; EIR: escore de imunorreati vidade, definido pelo escore de intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; sMICA: MICA solúvel; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle, valores de r e p determinados pelo teste de correlação de Spearman. 87 4.3.7 Pesquisa de nível de sMICA como potencial parâmetro preditivo para a endometriose. A análise da curva ROC (do inglês, Receiver Operating Characteristic Curve ) foi realizada com objetivo de identificar a sensibilidade e especificidade dos níveis de sMICA, no soro e no fluido peritoneal, de forma a identificar um possível valor de corte para discriminar mulheres com EDT e mulheres CTRs, sem a doença (capacidade preditiva). De forma geral, os valores da AUC são interpretados como: excelente (> 0,9), bom (0,8-0,9), fraco (0,7-0,80), pobre (0,6-0,7) e não discriminatório (0,5-0,6) (Tape, 2015). Criamos curvas ROC para níveis de sMICA no soro e FP, para os subgrupos: 1) grupo total de mulheres com EDT, 2) mulheres com EDT inicial (I/II) e avançada (III/IV), 3) mulheres com EDT em estádios de I a IV. No grupo total de mulheres com EDT, não foram encontrados valores que pudessem discriminar, adequadamente, doentes e não doentes, nem no soro nem FP. No soro, a AUC foi de 0,604 (IC 95%, 0,53-0,68) e para o FP de 0,660 (IC 95%, 0,59-0,73). A análise da curva ROC para estádios iniciais (I/II) e avançados (III/IV) também não indicou valores de AUC discriminatórios para mulheres com EDT [estádios iniciais, soro: AUC de 0,578 (IC 95%, 0,48- 0,68); FP: AUC 0,619 (IC 95%, 0,52-0,71); estádios avançados, soro: AUC de 0,623 (IC 95%, 0,54-0,71); FP: AUC de 0,684 (IC 95%, 0,61-0,76)]. Na avaliação da curva ROC para níveis de sMICA no FP, apenas em mulheres com EDT em estádio IV, o mais grave da doença, observamos valor discriminatório fraco de nível de sMICA. O valor de corte para níveis de sMICA no FP foi de 40pg/mL, com 67% de sensibilidade e 67% especificidade (33% de casos falso positivos), e uma AUC de 0,704 (IC 95%, 0,61 -0,79). Para sMICA no soro, no estádio IV, tivemos: valor de corte= 3 4,8pg/mL, sensibilidade= 33% e especificidade= 95% (5% de falsos positivos), AUC: 0,638 (IC 95%: 0,54- 0,73). Os valores de corte, AUC, sensibilidade e especificidade de todos os subgrupos analisados (total de mulheres com EDT, estádios iniciais e avançados , e estádios I a IV da EDT e a representação gráfica das curvas ROC para níveis de sMICA no soro e no FP de mulheres com EDT em estádio IV estão apresentados no Anexo IX (Tabela 4 e Figura 2, respectivamente). 4.4 Células NK e subpopulações: análises quantitativas e funcionais Com o objetivo de avaliar a atividade efetora de células NK na EDT, quantificamos as subpopulações de células NK e expressão do receptor NKG2D e das moléculas IFN -γ e IL-10. Analisamos também a expressão de moléculas envolvidas na ativação de células NK, CD107a, IFN -y e IL -10, frente ao estímulo com as células K562 e células K562 células 88 bloqueadas para a proteína MICA (K562BLOQ), em células NK totais e suas subpopulações, bem como a capacidade citotóxica de células NK, frente aos mesmos estímulos. 4.4.1 Análise quantitativa das subpopulações de células NK e expressão de NKG2D, IFN-γ e IL-10 A quantificação de subpopulações de células NK nos grupos EDT e CTR foi realizada por citometria de fluxo, na condição ex vivo e na condição basal de cultura (6h de cultura). Avaliamos a porcentagem (%) de diferentes subpopulações de NK com expressão das moléculas NKG2D, IFN -γ e IL -10, assim como a intensidade de expressão (mediana de intensidade de fluorescência, MFI) dessas moléculas nas subpopulações de NK. 4.4.1.1 Subpopulações NK: na condição ex vivo Como condição ex vivo, consideramos amostras de PBMC apó s o descongelamento celular e descanso por 1-1:30h, a 37oC, 5% CO2, em meio R10 (Métodos, item 3.9.1). Para cad a participante da pesquisa foram analisadas as% das subpopulações CD56bright e CD56dim, e das subpopulações CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56dimCD16+ e CD56dimCD16-. Para as comparações dos grupos foi utilizado o teste de Mann-Whitney. ► Grupo CTR: observamos maior frequência das subpopulações CD56dim (Figura 32): • CD56dim vs CD56bright (p< 0,0001) • CD56dimCD16+ vs CD56dimCD16- (p< 0,0001) • CD56dimCD16+ vs CD56brightCD16+(p< 0,0001) • CD56dimCD16+ vs CD56brightCD16- (p< 0,0001) • CD56dimCD16- vs CD56brightCD16+ (p< 0,0001) ► Grupo EDT : de forma semelhante ao encontrado no grupo saudável, encontramos maior frequência das subpopulações CD56dim (Figura 32): • CD56dim vs CD56bright (p< 0,0001) • CD56dimCD16+ vs CD56dimCD16- (p= 0,002) • CD56dimCD16+ vs CD56brightCD16+(p< 0,0001) • CD56dimCD16+ vs CD56brightCD16- (p< 0,0001) • CD56dimCD16- vs CD56brightCD16+ (p< 0,0001) Assim, as proporções entre as diferentes subpopulações de NK estão preservadas na EDT. 89 CD56 dim (n=21) CD56 bright (n=21) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 E D T % d e c é lu la s p < 0 ,0 0 0 1 A ) CD56 dim (n=19) CD56 bright (n= 19) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 C T R % d e c é lu la s p < 0 ,0 0 0 1 B ) CD56 dim CD16 + (n=21) CD56 dim CD16 - (n=21) CD56 bright CD16 + (n=19) CD56 bright CD16 - (n=21) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 E D T % d e c é lu la s C ) p = 0 ,0 0 2 p < 0 ,0 0 0 1 p < 0 ,0 0 0 1 p < 0 ,0 0 0 1 p < 0 ,0 0 0 1 CD56 dim CD16 + (n=19) CD56 dim CD16 - (n=19) CD56 bright CD16 + (n=17) CD56 bright CD16 - (n=19) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 C T R % d e c é lu la s D ) p < 0 ,0 0 0 1 p < 0 ,0 0 0 1 p < 0 ,0 0 0 1 p < 0 ,0 0 0 1 p < 0 ,0 0 0 1 Figura 32. Porcentagem das subpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose e de controles, na condição ex vivo. A) e C) grupo endometriose (EDT); B e D) grupo controle (CTR); Linha pontilhada: indica o valor de zero de % de células; as barras horizontais representam as medianas da porcentagem de expressão em cada subpopulação de células NK, valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. ► Grupo EDT vs grupo CTR : as subpopulações de NK tiveram porcentagens semelhantes entre os grupos, exceto para a subpopulação CD56 dimCD16+, descrita como citotóxica (27,5% vs 21,6%; p= 0,0456, teste T não pareado) que teve menor frequência no grupo EDT (Tabela 5). 90 Tabela 5. Medianas das frequências de subpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose e de controles, na condição ex vivo. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; em negrito: valor de p considerado significante; em vermelho: maior valor de mediana entre os grupos analisados; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney; *valores de p determinados pelo teste T não pareado. A análise das subpopulações de célula NK de acordo com a estratificação por estádios da EDT, indicou que a menor frequência da subpopulação CD56 dimCD16+ observadas na EDT, esteve associada aos estádios iniciais da doença (I/II), na comparação com o grupo CTR saudável (EDT: média 15,9 ± 10,7 vs CTR 29,9 ± 17,2, p= 0,0333, teste T não pareado). Além dessa subpopulação, também foi observado que NK totais (EDT: médi a 30,3±15,6 vs CTR 46,3±18,4, p= 0,0337, teste T não pareado) e a subpopulação CD56 dim (EDT: média 24,6 ± 13,9 vs CTR 38,5 ± 17,1, p= 0,044, teste T não pareado) também tiveram menor expressão na EDT inicial (Figura 33). As demais subpopulações não tiveram diferenças tanto em relação à EDT avançada nem em relação ao grupo CTR (p= ns). I/II C T R 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 F re q . e x p re s s ã o (% ) N K to ta is p = 0 ,0 3 3 7 A ) n = 9 n = 1 9 I/II C T R 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 F re q . e x p re s s ã o (% ) C D 5 6 d im p = 0 ,0 4 4 B ) n = 9 n = 1 9 I/II C T R 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 F re q . e x p re s s ã o (% ) C D 5 6 d im C D 1 6 + p = 0 ,0 3 3 3 C ) n = 9 n = 1 9 Figura 33. Comparação entre a frequência de células NK totais (A) e das subpopulações CD56 dim (B) e CD56 dimCD16+ (C) entre estádios iniciais (I/II) da endometriose e controles. I/II: estádios iniciais da endometriose de acordo com a rASRM; CTR: grupo controle; as barras horizontais representam a média dos valores; NK totais: incluem as subpopula ções CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; Freq.; frequência; valores de p determinados pelo teste T não pareado. EDT mediana CTR mediana (n) (%) (n) (%) NK totais 21 35,6 19 48,9 0,0553* CD56dim 21 33,3 19 39,5 0,1061 CD56bright 21 3,6 19 2,8 0,4813 CD56dimCD16+ 21 21,6 19 27,5 0,0456* CD56dimCD16- 21 9,1 19 7,7 0,4364 CD56brightCD16+ 19 1,3 16 1,0 0,9025 CD56brightCD16- 21 1,8 19 1,8 0,9733 Subpopulações p 91 4.4.1.2 Expressão de NKG2D em subpopulações NK: na condição ex vivo Também avaliamos a expressão do receptor da proteína MICA, NKG2D, em células NK e em suas subpopulações . Os valores de p foram determinados pelo teste de Mann-Whitney (Figura 34). ► Grupo CTR : maior % de células com expressão de NKG2D na subpopulação CD56bright, descrita como mais prod utora de citocina, em relação à subpopulação CD56 dim (p= 0,0029), descrita com maior propriedade citotóxica. Observamos também (Figura 34, B e D): NKG2D (%): • CD56brightCD16+ > CD56dimCD16+ (p= 0,0224) • CD56brightCD16- > CD56dimCD16+ (p= 0,0009) • CD56brightCD16- > CD56dimCD16- (p= 0,0266) ► Grupo EDT : maior % de células com expressão de NKG2D na subpopulação CD56bright em relação à subpopulação CD56 dim (p= 0,0499), de forma semelhante ao grupo saudável Observamos também (Figura 34 A e C): NKG2D (%): • CD56brightCD16+ > CD56dimCD16+ (p= 0,0199) • CD56brightCD16+ > CD56dimCD16- (p= 0,0026) (não encontrada na EDT • CD56brightCD16- > CD56dimCD16- (p= 0,0402) ► Grupo EDT vs grupo CTR: Na análise comparativa entre os grupos na condição ex vivo não foi observada diferença na % de e xpressão do receptor NKG2D (Tabela 6). No entanto, houve uma maior intensidade de expressão (MFI) de NKG2D em NK totais ( p= 0,0402) e nas subpopulações CD56 dim (p= 0,0334) e CD56 brightCD16+ (p= 0,0221) em mulheres com EDT, em relação aos CTRs saudáveis (valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney). Além disso, a análise estratificada por estádio, indicou que a mediana de intensidade de fluorescência para NKG2D em células CD56 brightCD16+ foi maior em mulheres em estádio s iniciais da doença (mediana , 655, min -max, 484 -1395), na comparação com o grupo CTR (mediana, 367, min-max, 3-1483; p= 0,033, teste de Mann-Whitney) (Figura 34E). 92 CD56 dim (n= 18) CD56 bright (n= 18) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 E D T E x p re s s ã o N K G 2 D (% ) p = 0 ,0 4 9 9 A ) CD56 dim (n=18) CD56 bright (n= 18) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 C T R E x p re s s ã o N K G 2 D (% ) p = 0 ,0 0 2 9 B ) CD56 dim CD16 + (n=18) CD56 dim CD16 - (n=18) CD56 bright CD16 + (n= 16) CD56 bright CD16 - (n=18) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 E D T E x p re s s ã o N K G 2 D (% ) p = 0 ,0 1 9 9 p = 0 ,0 0 2 6 p = 0 ,0 4 0 2 C ) CD56 dim CD16 + (n= 18) CD56 dim CD16 - (n= 18) CD56 bright CD16 + (n= 15) CD56 bright CD16 - (n= 18) 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 C T R E x p re s s ã o N K G 2 D (% ) D ) p = 0 ,0 0 0 9 p = 0 ,0 2 6 6 p = 0 ,0 2 2 4 I/II III/IV C T R 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 E x p re s s ã o N K G 2 D (M F I) p = 0 ,0 3 3 C D 5 6 b rig h tC D 1 6 + e s tá d io s E D T n = 7 n = 9 E ) Figura 3 4. Porcentagem (%) de células com expressão de NKG2D nas subpopulações NK circulantes em mulheres com endometriose e controles saudáveis, e expressão de acordo com estádios da doença, na condição ex vivo . A -D) expressão de NKG2D nas subpopulações NK; E) expressão NKG2D , na subpopulação CD56brightCD16+, entre estádios da E DT e CTR ; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; I/II: estádios iniciais da EDT; III/IV: estádios avançados da EDT, de acordo com a rASRM; barras horizontais representam as medianas da % de expressão; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 93 Tabela 6 . Comparação da frequência de células com expressão do receptor NKG2D, e intensidade de expres são, em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição ex vivo. EDT CTR p* p ‡ (n) % MFI (n) % MFI NK totais 18 14,4 311,5 18 16,5 185,5 0,6561 0,0402 CD56dim 18 14,1 312,0 18 15,6 191,0 0,8329 0,0334 CD56brigth 18 26,8 508,0 18 35,4 503,0 0,3348 0,8945 CD56dimCD16+ 18 15,3 303,0 18 15,3 3,0 0,4863 0,0599 CD56dimCD16- 18 10,0 352,5 18 16,4 384,0 0,0986 0,9875 CD56brightCD16+ 16 34,1 605,0 15 26,3 367,0 0,6187 0,0221 CD56brightCD16- 18 20,2 466,5 18 35,5 519,0 0,2262 0,7130 Subpopulações NKG2D NKG2D EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; %: frequência de expressão, dada em mediana da porcentagem; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; *valor de p referente à mediana de porcentagem de expressão entre EDT e CTR ;‡valor de p referente à MFI entre EDT e CTR; em negrito: valores de p significantes ( p<0,05); em vermelho: valor da maior mediana significativa entre os grupos; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. Realizamos também a análise de correl ação entre a expressão ( frequência, % e intensidade de expressão, MFI) de NKG2D, em células NK, e os níveis de sMICA, no soro e FP. Observamos correlações negativas em relação aos níveis de sMICA no soro, e apenas no grupo EDT. A correlação negativa entre a % e níveis de sMICA foram para as subpopulações: CD56dimCD16- (r= -0,5, p= 0,0429), CD56bright (r= -0,5, p= 0,0446) e CD56 brightCD16+ (r= -0,6, p= 0,0167) e CD56 bright CD16- (r= -0,5, p= 0,0429). Entre MFI de NKG2D e sMICA no soro, a presença de correlaç ão negativa foi observada para: NK totais (r= -0,5, p= 0,0467) e para as subpopulações CD56dim (r= -0,5, p= 0,0467), CD56bright (r= -0,5, p=0,02), CD56brightCD16+ (r= - 0,6, p= 0,0167) e CD56brightCD16- (r= -0,5, p= 0,0319) (Correlação de Spearman) (Tabela 7). 94 Tabela 7. Análise de correlação da frequência, e intensidade de expressão, de NKG2D nas subpopulações de células NK , com os níveis de MICA solúvel, no grupo de mulheres com endometriose e controles. EDT EDT (n) r p r p (n) r p p NK totais 18 -0,4 ns -0,5 0,0467 18 -0,3 ns -0,4 ns CD56dim 18 -0,4 ns -0,5 0,0467 18 -0,2 ns -0,4 ns CD56brigth 18 -0,5 0,0446 -0,5 0,0200 18 -0,1 ns -0,3 ns CD56dimCD16+ 18 -0,3 ns -0,1 ns 16 -0,3 ns -0,3 ns CD56dimCD16- 18 -0,5 0,0429 -0,4 ns 18 -0,4 ns -0,4 ns CD56brightCD16+ 16 -0,6 0,0167 -0,6 0,0167 18 -0,2 ns -0,4 ns CD56brightCD16- 18 -0,5 0,0429 -0,5 0,0319 18 -0,3 ns -0,3 ns CTR CTR (n) r p r p (n) r p p NK totais 15 0,2 ns -0,02 ns 15 0,3 ns 0,2 ns CD56dim 15 0,2 ns 0,0 ns 15 0,3 ns 0,2 ns CD56brigth 15 0,3 ns 0,2 ns 15 0,1 ns 0,3 ns CD56dimCD16+ 15 0,2 ns 0,2 ns 15 0,3 ns 0,4 ns CD56dimCD16- 15 0,2 ns 0,2 ns 15 -0,1 ns -0,2 ns CD56brightCD16+ 14 0,4 ns 0,1 ns 14 0,5 ns 0,4 ns CD56brightCD16- 15 0,2 ns 0,1 ns 15 -0,01 ns 0,1 ns Subpopulações sMICA FP vs Subpopulações sMICA FP vssMICA soro vs NKG2D (%) NKG2D (MFI) NKG2D (%) NKG2D (MFI) sMICA soro vs NKG2D (%) NKG2D (MFI) NKG2D (%) NKG2D (MFI) EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; em negrito: valores de p considerados significantes ( p< 0,05) e respectivos valores de r ; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação ; ns: não significante (p≥ 0,05), valores de p e r determinados pelo t este de correlação de Spearman. 4.4.1.3 Expressão das moléculas IFN-γ e IL-10: na condição ex vivo Ainda na condição ex vivo, foram analisadas a frequência (%) de células positivas para IFN-y e IL -10, e a intensidade de expressão (MFI) dessas moléculas (Tabela 8). Para as comparações entre os grupos, EDT e CTR, e para a determinação dos respectivos valores de p, foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney. • IFN-y: observamos maior % de células produtoras de IFN-y em mulheres com EDT, em relação ao grupo CTR, nas subpopulações: % de IFN-γ: • CD56dim: EDT > CTR (p= 0,0205) • CD56dimCD16+: EDT > CTR (p= 0,0271) Não foram observadas diferenças significativas para a intensidade de expressão de IFN-y (p≥ 0,05). • IL-10: não houve diferença na % de células, entre EDT e CTRs saudáveis. 95 No entanto, encontramos maior intensidade de expressão em mulheres com EDT, em relação ao grupo CTR, em todas as populações analisadas: MFI de IL-10: • NK totais: EDT > CTR (p= 0,0037) • CD56dim: EDT > CTR (p= 0,0066) • CD56bright: EDT > CTR (p= 0,0003) • CD56dimCD16+: EDT > CTR (p= 0,0105) • CD56dimCD16-: EDT > CTR (p= 0,0039) • CD56brightCD16+: EDT > CTR (p= 0,0061) • CD56brightCD16-: EDT > CTR (p= 0,0025) Tabela 8. Porcentagem de células com expressão de IFN-y ou IL -10, e intensidades de expressão, em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles saudáveis, na condição ex vivo. Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med min-max (n) med min-max p (n) med min-max (n) med min-max p NK totais 21 2,2 0,71-13,6 19 1,8 0,2-7,5 0,0818 21 0,4 0,3-1,9 19 0,5 0,2-1,6 0,6534 CD56dim 21 2,4 1,0-13,5 19 1,8 0,3-6,5 0,0205 21 0,4 0,1-1,9 19 0,5 0,0-1,7 0,3435 CD56brigth 21 3,3 0,0-8,5 19 1,5 0,3-6,5 0,2055 21 0,4 0,0-1,6 19 0,3 0,4-1,7 0,8775 CD56dimCD16+ 21 2,5 1,2-13,0 19 1,7 0,2-8,1 0,0271 21 0,5 0,1-2,4 19 0,5 0,2-1,5 0,4646 CD56dimCD16- 21 2,8 0,4-13,1 19 1,7 0,4-7,5 0,2499 21 0,4 0,0-1,9 19 0,6 0,2-1,4 0,1185 CD56brightCD16+ 19 3,3 0,0-11,5 16 1,1 0,0-15,8 0,0719 19 0,7 0,0-4,4 16 0,4 0,0-1,8 0,0523 CD56brightCD16- 21 2,6 0,4-18,6 19 2,4 0,6-11,7 0,7532 21 0,5 0,0-3,6 19 0,3 0,0-2,3 0,8236 Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med min-max (n) med min-max p (n) med min-max (n) med min-max p NK totais 21 49 29-200 19 48 3-168 0,7683 21 145 3-286 19 3 3-249 0,0037 CD56dim 21 49 29-199 19 48 3-168 0,7529 21 147 3-305 19 3 3-351 0,0066 CD56brigth 21 39 3-207 19 37 3-176 0,5596 21 240 93-429 19 164 56-251 0,0003 CD56dimCD16+ 21 51 29-210 19 66 3-168 0,7631 21 86 3-613 19 3 3-255 0,0105 CD56dimCD16- 21 49 23-180 19 50 3-177 0,6928 21 189 132-306 19 162 122-197 0,0039 CD56brightCD16+ 19 45 3-204 16 49 3-184 0,7630 19 207 3-481 16 33 3-306 0,0061 CD56brightCD16- 21 37 3-207 19 32 3-169 0,2669 21 241 141-443 19 204 88-236 0,0025 IFN-γ (% de expressão) IL-10 (% de expressão) IFN-γ (intensidade de expressão, MFI) IL-10 (intensidade de expressão, MFI) EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; med: mediana; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; em negrito: valores de p significantes (p< 0,05); em vermelho: valor da maior mediana significativa entre os grupos analisados; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 96 4.4.2 Expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL -10 frente a estímulo com células K562 A atividade efetora das células NK foi avaliada, tanto em relação à frequência (%) como à intensidade (MFI) de expressão, das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, em células NK totais e em suas subpopulações. Avaliamos esses parâmetros frente aos estímulos com as células K562 (K562) e células K562 previamente bloqueadas para a proteína MICA (K562BLOQ). O bloqueio de MICA nas células K562 teve como objetivo representar o potencial efeito da presença de MICA solúvel em inibir a interação com a molécula NKG2D, e medir seu imp acto na atividade citotóxica de células NK (Boukouaci et al., 2013; Groh et al., 2002). A magnitude de expressão de tais moléculas foi também avaliada quanto à sua possível associação com estádios da EDT e fases do ciclo menstrual. Como controle de expressão, foi incluída a condição basal de cultura, sem estímulo. A % de células K562 com expressão de MICA, e sua intensidade de expressão (MFI), foram analisadas em cada experimento de cocultura (PBMC + K562) (Anexo X, Tabela 1). A mediana da frequência de células K562 positivas (avaliada em 11/13 ensaios) para a expressão de MICA foi de 42,2% e, MICA em células K562 bloqueadas (K562BLOQ) foi de 13,1% correspondendo a uma mediana de bloqueio de 63,6%. O bloqueio de MICA afetou menos a sua intensidade de expressão, com mediana de bloqueio de 33,9%. 4.4.2.1 CD107a, IFN-y e IL-10: na condição estado basal de cultura, sem estímulo No estado basal de cultura (sem estímulo), foram analisadas a frequência e a intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL -10, entre as subpopulações de células NK, nos grupos EDT e CTRs. Os resultados referentes à % de expressão estão apresentados na Figura 35 e, da intensidade de expressão das moléculas, no Anexo X, Tabela 2. ► Grupo CTR: • CD107a: para a expressão de CD107a, no grupo CTR, observamos diferenças significantes, tanto para a % como para a intensidade de expressão, entre várias subpopulações de células NK (pCD56dimCD16+ (p CD56bright (p CD56brightCD16+ (p CD56brightCD16- (p CD56dim (p CD56dim (p CD56dim (p CD56dimCD16+ (p CD56dimCD16- (p CD56dimCD16+ (p CD56dimCD16+ (p CD56dimCD16- (p CD56dimCD16- (p< 0,05) De forma geral, observamos que a maior frequência para CD107a esteve associada às células CD56dim e, de maior intensidade de expressão, às células CD56bright. • IFN-γ: não observamos diferença, tanto para a % ( p= 0,0746) como para a intensidade de expressão de IFN-γ (p= 0,3973 (teste de Kruskal-Wallis), entre as subpopulações NK. • IL-10: observamos diferença entre as subpopulações de NK, apenas para a intensidade de expressão de IL-10 (p CD56dimCD16+ (p NK totais (p CD56dim (p CD56dimCD16+ (p CD56brightCD16+ (p NK totais (p CD56dim (p CD56dimCD16+ (p< 0,01) A maior parte das diferenças estiveram associadas à maior intensidade de expressão para células CD56bright. ► Grupo EDT: • CD107a: observamos diferenças significantes, tanto na % como na intensidade de expressão (MFI), de CD107a, entre várias subpopulações de células NK (p CD56bright (p CD56brightCD16- (p NK totais (p CD56dim (p CD56dimCD16+ (p CD56dimCD16- (p NK totais (p CD56brightCD16- (pCD56brightCD16-(pCD56brightCD16-(p< 0,0001)(não encontrada no CTR) A maior frequência de expressão de CD107a esteve associada à presença de células CD56dim+. No entanto, para intensidade de expressão, tanto CD56bright+ como CD56dim+, tiveram associação. • IFN-γ: não observamos diferenças tanto para a % ( p= 0,4093) de IFN -γ como para a intensidade de expressão ( p= 0,8755), entre as subpopulações de NK (teste de Kruskal- Wallis). • IL-10: não observamos diferença da % de expressão de IL -10 entre as subpopulações de NK, mas tivemos diferenças para intensidade de expressão de IL -10 (p= 0,0164, teste de Kruskal-Wallis). Na comparação entre duas subpopulações celulares, observamos: MFI para IL-10: • CD56bright > NK totais (p= 0,0358) (não encontrada no CTR) • CD56bright > CD56dim (p= 0,0293) (não encontrada no CTR) • CD56brightCD16- > CD56dimCD16+ (p= 0,0329) • CD56brightCD16- > CD56dim > (p= 0,0104) • CD56dimCD16- > CD56dim (p= 0,0199) • CD56dimCD16- > CD56dimCD16+ (p= 0,0477) De forma geral, a maior parte das diferenças para intensidade de fluorescência de IL - 10, no grupo EDT, estiveram associadas à maior intensidade de expressão da subpopulação CD56bright. A subpopulação CD56 brightCD16+ não foi analisada para o grupo EDT devido ao baixo número de amostras que atingiram o valor de corte válido na aquisição no citômetro de fluxo (≥ 100). 99 NK totais (n=20) CD56 dim (n=20) CD56 bright (n=18) CD56 dim CD16 + (n=19) CD56 dim CD16 - (n=19) CD56 bright CD16 + (n=9) CD56 bright CD16 - (n=17) 0 2 4 6 2 0 4 0 6 0 8 0 C T R : C D 1 0 7 a (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s A ) * ********** NK totais (n=20) CD56 dim (n=20) CD56 bright (n=18) CD56 dim CD16 + (n=19) CD56 dim CD16 - (n=19) CD56 bright CD16 + (n=9) CD56 bright CD16 - (n=15) 0 2 4 6 2 0 4 0 6 0 8 0 C T R : IF N -  (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s B ) NK totais (n=16) CD56 dim (n=16) CD56 bright (n=16) CD56 dim CD16 + (n=16) CD56 dim CD16 - (n=15) CD56 bright CD16 + (n=8) CD56 bright CD16 - (n=13) 0 2 4 6 2 0 4 0 6 0 8 0 C T R : IL -1 0 (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s C ) NK totais (n=21) CD56 dim (n=21) CD56 bright (n=18) CD56 dim CD16 + (n=20) CD56 dim CD16 - (n=20) CD56 bright CD16 - (n=16) 0 2 4 6 2 0 4 0 6 0 8 0 E D T : C D 1 0 7 a (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s D ) ** * NK totais (n=21) CD56 dim (n=20) CD56 bright (n=18) CD56 dim CD16 + (n=20) CD56 dim CD16 - (n=20) CD56 bright CD16 - (n=16) 0 2 4 6 2 0 4 0 6 0 8 0 E D T : IF N -  (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s E ) NK totais (n=17) CD56 dim (n=18) CD56 bright (n=15) CD56 dim CD16 + (n=17) CD56 dim CD16 - (n=17) CD56 bright CD16 + (n=4) CD56 bright CD16 - (n=13) 0 2 4 6 2 0 4 0 6 0 8 0 E D T : IL -1 0 (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s D ) Figura 35. Análise da frequência de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10, entre as subpopulações de células NK, nos grupos EDT e CTRs, no estado basal de cultura (sem estímulo). EDT: grupo endometriose; CTR grupo controle; NK totais: in cluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; as barras horizontais representam as medianas das frequências de expressão de cada grupo; linha pontilhada: indica o valor de zero para porcentagem (%) de célu las com expressão; valores de p determinados pelo teste de Kruskal-Wallis com pós teste de Dunn; *p< 0,05, **p< 0,01, *** p< 0,001, *** p< 0,001, **** p< 0,0001. 100 A % e a intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL -10 nas subpopulações NK for am também comparadas entre os grupos, EDT e CTRs. Para todas as análises, utilizamos o teste não paramétrico de Mann-Whitney (análises de %, Figura 36; análises MFI, Tabela 9). A subpopulação CD56 brightCD16+ não foi analisada no grupo CTR devido ao baixo n úmero de amostras que atingiram o valor de corte válido para aquisição no citômetro de fluxo (≥ 100 eventos). Tabela 9. Análise da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL -10, nas subpopulações de células NK, entre grupos EDT e CTRs, na condição basal de cultura, sem estímulo. EDT CTR EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 21 358,0 20 336,0 ns 21 83,9 20 97,2 ns 17 127,0 16 49,1 0,0281 CD56dim 21 350,0 20 327,5 ns 21 83,6 20 99,4 ns 18 119,0 16 37,0 0,0428 CD56bright 18 469,0 18 452,0 ns 18 80,8 18 92,6 ns 15 90,1 14 3,0 ns CD56dimCD16+ 20 9,3 19 8,6 ns 20 2,5 19 1,5 ns 17 0,9 16 0,6 ns CD56dimCD16- 20 303,0 19 340,0 ns 20 80,1 19 122,1 ns 17 144,0 15 139,0 ns CD56brightCD16+ 4 498,0 9 489,0 NA 4 70,2 9 114,0 NA 4 72,7 8 82,8 NA CD56brightCD16- 16 462,0 17 438,0 ns 16 69,0 15 104,0 ns 13 158,0 13 143,0 ns Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) Subpopulações CD107a IFNγ IL-10 EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); med: mediana; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação, na análise entre os gr upos EDT e CTR; em negrito: valores de p significantes na análise entre os grupos (<0,05); em vermelho: maior valor de mediana entre os grupos analisados; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 101 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 0 2 4 6 8 1 0 5 0 1 0 0 N K T O T A IS % d e c é lu la s E D T C T R n = 2 1 n = 2 1 n = 1 7 n = 2 0 n = 2 0 n = 1 6 p = 0 ,0 1 9 4 A ) C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 0 2 4 6 8 1 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 d im % d e c é lu la s E D T C T R n = 2 1 n = 2 0 n = 1 5 n = 2 0 n = 2 0 n = 1 4 p = 0 ,0 0 8 3 B ) C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 0 2 4 6 8 1 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 C D 5 6 b rig h t % d e c é lu la s E D T C T R n = 1 8 n = 1 8 n = 1 5 n = 1 8 n = 1 8 n = 1 4 C ) C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 0 2 4 6 8 1 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 d im C D 1 6 + % d e c é lu la s E D T C T R n = 2 0 n = 2 0 n = 1 7 n = 1 9 n = 1 9 n = 1 6 D ) C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 0 2 4 6 8 1 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 d im C D 1 6 - % d e c é lu la s E D T C T R n = 2 0 n = 2 0 n = 1 7 n = 1 9 n = 1 9 n = 1 7 p = 0 ,0 4 9 2 E ) C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 0 2 4 6 8 1 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 b rig h tC D 1 6 - % d e c é lu la s E D T C T R (n = 2 1 ) (n = 2 1 ) (n = 1 7 ) (n = 2 1 ) (n = 2 1 ) (n = 1 7 ) p < 0 ,0 0 0 1 F ) Figura 36. Comparação da frequência de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10, nas subpopulações de células NK circul antes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição basal, sem estímulo. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney; n: número de mulheres analisadas para cada molécula, em cada grupo; as barras horizontais representam as medianas de porcentagem de expressão de cada molécula. ❖ Análise de correlação entre as moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK, na condição basal, sem estímulo: Avaliamos se há correlação entre as frequências e/ou intensidades de expressão das moléculas CD107a e IFN -y e IL -10, na condição basal de cultura. As análises, com a determinação dos valores de p e r, foram realizadas pelo teste de correlação de Spearman. 102 ► Grupo CTR: observamos correlações positivas entre: • CD107a e IL-10 (para a MFI) nas populações celulares abaixo (correlações observadas apenas no grupo CTR): • NK totais (r= 0,6, p=0,0171) • CD56dim (r= 0,6, p=0,0244) • CD56bright (r= 0,7, p=0,0016) • CD56dimCD16+ (r= 0,5, p=0,0395) • CD56brightCD16- (r= 0,8, p=0,0014) ► Grupo EDT: foram observadas correlações positivas entre: • CD107a e IL -10 (para %), em células com fenótipo descrito com maior citotoxicidade, CD56dim (r= 0,5, p= 0,0479) (correlação observada apenas no grupo EDT; no grupo CTR a correlação foi com MFI). • IFN-y e IL -10 (para %), em células com fenótipo descrito com maior citotoxicidade: CD56dim (r= 0,7, p=0,0036) e CD56 dimCD16- (r=0,5, p=0,0465) (correlação observada apenas no grupo EDT). • IFN-y e CD107a (para MFI), em células CD56bright (r= 0,5, p= 0,0326), CD56dimCD16+ (r= 0,5, p= 0,0452) e CD56 brightCD16- (r= 0,6, p= 0,0257). Destacamos que as sub populações CD56bright + são descritas com propriedade imunorreguladora (correlações observadas apenas no grupo EDT). Na Tabela 10 estão apresentados os dados significantes de correlação, nos grupos EDT e CTRs saudáveis, tanto para a frequência de células produtoras como para a intensidade de produção (MFI), em cada subpopulação de células NK. Na Figura 37 estão apresentados exemplos de correlações entre as expressões de moléculas de ativação NK, para a subpopulação CD56dim. A subpopulação CD56 brightCD16+ não foi analisada no grupo EDT, uma vez que não atingiu o número mínimo de eventos adquiridos no citômetro de fluxo (≥ 100). 103 Tabela 10. Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose e controles, na condição basal de cultura, sem estímulo. A) Grupo endometriose Sem estímulo (frequência de células com expressão, %) EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 21 ns ns 17 ns ns CD56dim 18 0,0036 0,7 21 ns ns 18 0,0479 0,5 CD56brigth 15 ns ns 18 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 17 0,0465 0,5 20 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 21 ns ns 17 ns ns CD56dim 18 ns ns 21 ns ns 18 ns ns CD56brigth 15 ns ns 18 0,0326 0,5 15 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 20 0,0452 0,5 17 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 13 ns ns 16 0,0257 0,6 13 ns ns IFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10 Subpopulações Subpopulações IFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10 B) Grupo controle Sem estímulo (frequência de células com expressão, %) CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) NK totais 16 ns ns 20 ns ns 16 ns ns CD56dim 16 ns ns 20 ns ns 16 ns ns CD56brigth 16 ns ns 18 ns ns 16 ns ns CD56dimCD16+ 16 ns ns 19 ns ns 16 ns ns CD56dimCD16- 16 ns ns 19 ns ns 16 ns ns CD56brightCD16+ 8 ns ns 9 ns ns 8 ns ns CD56brightCD16- 13 ns ns 15 ns ns 13 ns ns Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) NK totais 16 ns ns 20 ns ns 16 0,0171 0,6 CD56dim 16 ns ns 20 ns ns 16 0,0244 0,6 CD56brigth 16 ns ns 18 ns ns 16 0,0016 0,7 CD56dimCD16+ 16 ns ns 19 ns ns 16 0,0395 0,5 CD56dimCD16- 16 ns ns 19 ns ns 16 ns ns CD56brightCD16+ 8 ns ns 9 ns ns 8 ns ns CD56brightCD16- 13 ns ns 15 ns ns 13 0,0014 0,8 IFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10 IFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10 Subpopulações EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; n: núm ero de pares de dados analisados em cada subpopulação celular; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); em negrito: valores de p considerados significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correspondem a correlações diferenciais entre os grupos EDT e CTR; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação ; ns: não significante (p≥ 0,05), valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 104 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 -5 0 5 1 0 1 5 2 0 IL -1 0 (% ) IF N -  ( % ) r= 0 ,7 p = 0 ,0 0 3 6 C D 5 6 dim (n = 1 8 )A ) 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 IL -1 0 (% ) C D 1 0 7 a (% ) r= 0 ,5 p = 0 ,0 4 7 9 C D 5 6 dim (n = 1 8 )B ) Figura 37. Análise de correlação entre a porcentagem de células com expressão de moléculas de atividade efetora de células NK, na subpopulação CD56 dim circulante, de mulheres com endometriose, na condição basal de cultura, sem estímulo. A) correlação entre as porcentagens (%) de expressão das moléculas IFN -y e IL -10; B) correlação entre as % de expressão das moléculas CD107a e IL-10; n= números de pares de dados analisados; valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 105 4.4.2.2....Moléculas de atividade NK: na condição com estímulo com células K562 Inicialmente, realizamos uma análise pareada para a e xpressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, para as condições sem estímulo e após o estímulo com K562, com o objetivo de avaliar a presença de alteração significativa de expressão, com o estímulo. Foram realizadas análises pareadas das amostras, separad amente, dentro dos grupos EDT e CTR, em células NK totais e em suas subpopulações, utilizando-se o teste de Wilcoxon. ► Grupo CTR: o estímulo com células K562 induziu um aumento significativo de CD107a e IFN-y, tanto na % de células positivas como na inte nsidade de expressão, em quase todas as subpopulações de NK, exceto para IFN-y em células CD56brightCD16+ (p≥ 0,05). Para IL-10, houve um aumento de MFI na presença do estímulo K562 na subpopulação CD56 dimCD16-, mas sem modificação na% de células (Tabela 11). ► Grupo EDT : o estímulo com células K562 também induziu um aumento da % de células com expressão de CD107a e de IFN -y, em todas as subpopulações de NK, exceto para as células CD56 brightCD16+, da mesma forma como observado no grupo CTR. Também houve au mento da intensidade de expressão para CD107a, mas, diferentemente do grupo CTR, não para IFN-y, nas mesmas subpopulações, exceto na subpopulação CD56 brightCD16+. Houve diminuição de MFI para IL -10 nas subpopulações CD56 bright (p= 0,0173) e CD56dimCD16- (p= 0,0359) (no grupo CTR, houve aumento de IL -10 na subpopulação CD56dimCD16-). Para % de células, assim como no grupo CTR, não houve modificação na % de células produtoras de IL-10 (p> 0,05, teste de Wilcoxon) (Tabela 11). As modificações ocorridas após o estímulo com células K562, em relação à condição sem estímulo, nos grupos EDT e CTR estão descritas na Tabela 11 . Na Figura 38 apresentamos algumas modificações significativas ocorridas após o estímulo com K562 106 Tabela 11. Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e das intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose (A) e controles (B), entre as condições sem estímulo e após estímulo com células K562. A) Grupo endometriose EDT SE K562 EDT SE K562 EDT SE K562 (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p NK totais 21 7,8 23,2 <0,0001 21 1,7 5,0 0,0009 17 0,7 0,9 ns CD56dim 21 8,9 27,5 <0,0001 21 2,1 5,2 0,0009 18 0,7 0,7 ns CD56brigth 17 5,1 23,0 <0,0001 17 1,7 5,2 0,0005 15 0,4 0,7 ns CD56dimCD16+ 20 9,3 29,1 <0,0001 20 2,5 5,7 0,0020 17 0,9 0,8 ns CD56dimCD16- 20 25,7 39,2 <0,0001 20 1,9 8,3 0,0013 17 0,9 0,7 ns CD56brightCD16+ 4 5,0 14,6 NA 4 0,6 2,1 NA 4 0,9 1,4 NA CD56brightCD16- 16 5,6 31,0 <0,0001 16 2,8 8,2 0,0182 13 1,3 1,4 ns EDT SE K562 EDT SE K562 EDT SE K562 (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p NK totais 21 358,0 422,0 <0,0001 21 84 80,7 ns 17 127,0 115,0 ns CD56dim 21 350,0 411,0 <0,0001 21 84 83,2 ns 18 119,0 113,5 ns CD56brigth 17 463,0 529,0 0,0003 17 71 69,0 ns 15 143,0 138,0 0,0173 CD56dimCD16+ 20 347,0 412,5 <0,0001 20 76 78,9 ns 17 90,1 94,2 ns CD56dimCD16- 20 303,0 378,0 <0,0001 20 80 91,0 ns 17 144,0 139,0 0,0359 CD56brightCD16+ 4 498,0 557,0 NA 4 70 66,9 NA 4 72,7 44,5 NA CD56brightCD16- 16 462,0 543,5 0,0010 16 69 72,0 ns 13 158,0 142,0 ns SE x K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 SE x K562 (frequência de células com expressão, %) CD107a IFN-γ IL-10 Subpopulações Subpopulações EDT: grupo endometriose; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); SE: condição basal, sem estímulo; K562: estímulo com células K562; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+med: mediana; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; em negrito: valores de p considerados significantes (<0,05, na análise entre SE e K562); em negrito e sublinhado: diferença ausente no grupo CTR; em vermelho: valores de medianas significantes aumentadas em relação à condição SE; em azul: valores de medianas significantes e diminuído s em relação à condição SE; ns: não significantes (p≥ 0,05); NA: não analisado; valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. 107 Continuação da Tabela 11. Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e das intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com e ndometriose e controles, entre as condições sem estímulo e após estímulo com células K562 B) Grupo controle CTR SE K562 CTR SE K562 CTR SE K562 (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p NK totais 20 8,5 30,6 <0,0001 20 1,1 5,7 <0,0001 16 0,6 0,6 ns CD56dim 20 10,9 32,3 <0,0001 20 1,1 5,7 <0,0001 16 0,6 0,6 ns CD56brigth 17 6,9 29,9 <0,0001 17 1,1 6,2 0,0001 14 0,9 0,9 ns CD56dimCD16+ 18 8,3 38,3 <0,0001 18 1,4 5,1 0,0003 16 0,6 0,7 ns CD56dimCD16- 19 18,3 34,7 0,0005 19 1,3 9,2 <0,0001 15 0,7 0,8 ns CD56brightCD16+ 8 2,7 19,5 0,0078 8 1,1 2,3 ns 7 0,0 1,0 ns CD56brightCD16- 17 5,3 38,1 <0,0001 15 0,3 8,2 0,0002 13 0,8 0,6 ns CTR SE K562 CTR SE K562 CTR SE K562 (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p NK totais 20 336,0 441,5 0,0001 20 97,2 112,5 0,0153 16 49,1 81,8 ns CD56dim 20 327,5 433,5 <0,0001 20 99,4 113,5 0,0140 16 37,0 77,6 ns CD56brigth 17 444,0 539,0 <0,0001 17 92,7 126,0 0,0079 14 131,5 133,0 ns CD56dimCD16+ 18 322,0 391,5 0,0016 18 86,9 94,5 0,0159 16 3,0 13,4 ns CD56dimCD16- 19 340,0 455,0 0,0005 19 122,0 143,0 0,0237 15 138,0 140,0 0,0244 CD56brightCD16+ 8 466,0 533,0 0,0078 8 111,5 123,5 ns 7 84,8 108,0 ns CD56brightCD16- 17 438,0 522,0 <0,0001 15 104,0 127,0 0,0151 13 143,0 154,0 ns SE x K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 SE x K562 (frequência de células com expressão, %) CD107a IFN-γ IL-10 Subpopulações Subpopulações CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); SE: condição basal, sem estímulo; K562: estímulo com células K562 NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; med: mediana; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; em negrito: valores de p considerados significantes (<0,05, na análise entre SE e K562); em negrito e sublinhado: diferença ausente no grupo EDT; em vermelho: valores de mediana aumentados em relação à condição SE; ns: não significantes (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. 108 S E E s t. K 5 6 2 0 1 0 2 0 3 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 C T R : C D 5 6 d im (n = 2 0 ) C D 1 0 7 a (% ) p < 0 ,0 0 0 1 A ) S E E s t. K 5 6 2 0 5 1 0 1 5 2 0 3 0 4 0 C T R : C D 5 6 d im (n = 2 0 ) IF N  (% ) p < 0 ,0 0 0 1 B ) S E E s t. K 5 6 2 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 C T R : C D 5 6 d im C D 1 6 - (n = 1 5 ) IL -1 0 (M F I) p = 0 ,0 2 4 4 C ) S E E s t. K 5 6 2 0 1 0 2 0 3 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 E D T : C D 5 6 d im (n = 2 1 ) C D 1 0 7 a (% ) p < 0 ,0 0 0 1 D ) S E E s t. K 5 6 2 0 5 1 0 1 5 2 0 3 0 4 0 E D T : C D 5 6 d im (n = 2 1 ) IF N -  (% ) p = 0 ,0 0 0 9 E ) S E E s t. K 5 6 2 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 E D T : C D 5 6 d im C D 1 6 - (n = 1 7 ) IL -1 0 (M F I) p = 0 ,0 3 5 9 F ) Figura 38. Alterações significativas ocorridas após o estímulo com K562 (Est. K562), em relação à condição sem estímulo, em mulheres com endometriose e controles. A) frequência de expressão de CD107a na subpopulação CD56 dim, em CTR; B) frequência de expressão de IFN-y na subpopulação CD56dim, em CTR; C) intensidade de expressão (MFI) de IL -10 na subpopulação CD56 dimCD16-, em CTR; D) frequência de expressão de CD107a na subpopulação CD56 dim, na EDT; E) frequência de expressão de IFN-y na subpopulação CD56 dim, na EDT; F) intensidade de expressão (MFI) de IL -10 na subpopulação CD56 dimCD16-, na EDT; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; SE: condição basal, sem estímulo; valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. ► Grupo EDT vs grupo CTR: na comparação da expressão (% e MFI) das moléculas de atividade NK entre os grupos EDT e CTR, frente ao estímulo com células K562, observamos algumas diferenças (Figura 3 9 e Tabela 12) (valores de p determinados pelo teste de Mann- Whitney): • CD107a: apesar de não ter havido diferenças entre os grupos na condição sem estímulo, na presença de estímulo, observamos: - % de CD107a: EDT < CTR, em células CD56brightCD16-, p= 0,0455 - MFI para CD107a: EDT < CTR, em células: • NK totais p= 0,0233 • CD56dim p= 0,0308 • CD56bright p= 0,0097 • IFN-y: a diferença observada para a maior % de células com expressão de IFN- y na EDT, na condição sem estímulo (Figura 36), foi perdida na condição de estímulo com células K562. No entanto, com est ímulo, observamos menor MFI na EDT, em 109 relação ao grupo CTR, em quase todas as subpopulações celulares de NK (Figura 37 e Tabela 12): - MFI para IFN-y: EDT < CTR, em células: • NK totais p= 0,0233 • CD56dim p= 0,0308 • CD56dimCD16+ p= 0,0143 • CD56bright p= 0,0097 • CD56brightCD16- p= 0,0135 • IL-10: não foi observada diferença para a % de células entre os grupos. Porém, observamos menor intensidade de expressão de IL -10 no grupo EDT em relação ao grupo CTR: - MFI para IL-10: EDT < CTR, na subpopulação: CD56bright (p= 0,0222) Na Figura 39 apresentamos alguns exemplos de diferenças significantes na intensidade de expressão de CD107a, IFN -y ou IL -10, entre os grupos EDT e CTR, na subpopulação CD56bright. Na Tabela 12 estão os d ados de diferenças significantes para as moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK, CD107a, IFN-y ou IL-10, entre os grupos EDT e CTR, tanto para a frequência de células com produção, como para a intensidade de produção (MFI), nas diferentes subpopulações de células NK. E D T C T R -5 0 0 5 0 1 0 0 2 5 0 5 0 0 7 5 0 C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 ) C D 1 0 7 a (M F I) p = 0 ,0 0 9 7 A ) n = 1 7 n = 1 7 E D T C T R -1 0 0 -5 0 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 ) IF N -  ( M F I) p = 0 ,0 0 9 7 B ) n = 1 7 n = 1 7 E D T C T R -4 0 -2 0 0 2 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 ) IL -1 0 (M F I) C ) p = 0 ,0 2 2 2 n = 1 5 n = 1 4 Figura 3 9. Comparação da intensidade de expressão de moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK na subpopulação CD56 bright circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição após estímulo com células K562. A) MFI de CD107a; B) MFI de IFN-y; C) MFI de IL -10; linha pontilhada: indica o valor de zero para MFI; as barras horizontais representam as medianas de MFI de c ada grupo; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana e intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); valores de p determinados pelo teste de Mann- Whitney. 110 Tabela 12 . Comparação entre as frequências de células com expressão d as moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição após estímulo com células K562. EDT CTR EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 21 14,5 20 20,7 ns 21 3,6 20 4,2 ns 17 -0,1 16 0,0 ns CD56dim 21 16,4 20 21,6 ns 21 4,1 20 4,2 ns 18 -0,1 16 0,1 ns CD56bright 17 18,2 17 23,0 ns 17 4,1 17 4,7 ns 15 0,1 14 -0,3 ns CD56dimCD16+ 20 20,4 18 28,6 ns 20 3,0 18 3,6 ns 17 -0,1 16 0,4 ns CD56dimCD16- 20 17,1 19 16,2 ns 20 5,7 19 8,2 ns 17 -0,1 15 0,1 ns CD56brightCD16+ 4 11,1 8 19,1 NA 4 3,2 8 1,2 NA 4 1,1 7 0,8 NA CD56brightCD16- 16 20,3 17 31,3 0,0445 16 6,1 15 8,2 ns 13 -0,1 13 0,0 ns EDT CTR EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 21 54,0 20 98,5 0,0233 21 -0,3 20 14,8 0,0278 17 0,0 16 4,7 ns CD56dim 21 51,0 20 97,0 0,0308 21 -0,4 20 15,6 0,0474 18 0,0 16 1,5 ns CD56brigth 17 57,0 17 102,0 0,0097 17 -1,3 17 13,3 0,0010 15 -10,0 14 1,5 0,0222 CD56dimCD16+ 20 59,0 18 75,5 ns 20 -3,3 18 17,0 0,0143 17 0,0 16 0,0 ns CD56dimCD16- 20 103,0 19 106,0 ns 20 7,0 19 14,0 ns 17 -12,0 15 -5,0 ns CD56brightCD16+ 4 59,0 8 109,0 NA 4 -3,4 8 2,5 NA 4 -8,0 7 11,0 NA CD56brightCD16- 16 60,5 17 115,0 ns 16 1,4 15 10,1 0,0135 13 -14,0 13 -4,0 ns Subpopulações Subpopulações CD107a IFNγ IL-10 Estímulo com K562 (frequência de células com expressão, %) CD107a IFNγ IL-10 Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; med: mediana; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; estímulo com K562: descont ando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; NA: não analisado; em negrito: valores de p considerados significantes (p<0,05); em vermelho: valor da maior mediana significativa entre os grupos EDT e CTR; ns: não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. Análises de correlação entre as moléculas envolvidas na atividade de células NK, após o estímulo com células K562: As análises para avaliar se há presença de correlação entre a expressão das moléculas CD107a e IFN -y e IL -10 foram realizadas, tanto para a % como para a intensidade de expressão (MFI). Os valores de p e r foram determinados pelo teste de correlação de Spearman (Tabela 13): ► Grupo CTR: correlações positivas entre: • IFN-y e CD1 07a (para % de expressão), em quase todas as subpopulações celulares: NK totais (r=0,7, p=0,0007), CD56 dim (r=0,6, p=0,0058), CD56 bright (r=0,6, p=0,0064) e CD56 dimCD16- (r=0,7, p=0,0011) (todas as correlações presentes apenas no grupo CTR). 111 ► Grupo EDT: correlações positivas entre: • IFN-y e IL -10 (para intensidade de expressão) nas subpopulações: CD56 dim (r=0,6, p=0,0048), CD56 bright (r=0,7, p= 0,0024), CD56 dimCD16+ (r=0,5, p= 0,0302) e CD56dimCD16- (r=0,6, p= 0,015) (Correlações previamente observadas na condição basal, sem estímulo - para a frequência de expressão; todas essas correlações não foram observadas no grupo CTR). Na Figura 40 estão apresentados alguns exemplos de correlações positivas observadas em ambos os grupos de estudo. Na Tabela 13 est ão apresentados os dados significantes de correlações observadas nos grupos EDT e CTR, tanto para a frequência como para a intensidade de produção, em cada subpopulação de células NK. 5 1 0 1 5 2 0 -2 0 0 2 0 4 0 6 0 IF N -  ( % ) C D 1 0 7 a ( % ) C T R : C D 5 6 d im (n = 2 0 ) r= 0 ,6 p = 0 ,0 0 5 8 A ) -5 0 5 1 0 1 5 2 0 4 0 6 0 8 0 IF N -  ( % ) C D 1 0 7 a ( % ) C T R : C D 5 6 b rig h t (n = 2 0 ) r= 0 ,6 p = 0 ,0 0 6 4 B ) Figura 40. A nálise de correlação entre as frequências de células positivas, e entre as intensidades de expressão de moléculas de atividade efetora de células NK, em subpopulações de células NK circulantes, de mulheres do grupo controle, na condição após estímulo com K 562. A) correlação entre as frequências de expressão de IFN -y e CD0107, em células CD56dim; B) correlação entre as frequências de expressão de IFN -y e CD 107a, em CD56 bright; CTR: grupo controle; n: número de pares de dados analisados; valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 112 Tabela 13. Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circula ntes, em mulheres com endometriose (A) e controles (B), na condição após estímulo com células K562. A) Grupo endometriose EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 21 ns ns 17 ns ns CD56dim 18 ns ns 21 ns ns 18 ns ns CD56brigth 15 ns ns 17 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 21 ns ns 17 ns ns CD56dim 18 0,0048 0,6 21 ns ns 18 ns ns CD56brigth 17 0,0024 0,7 17 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 17 0,0302 0,5 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 17 0,0150 0,6 20 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns CD107a x IL-10IFN-γ x IL-10 Estímulo com K562 (frequência de células com expressão, %) IFN-γ x CD107a IFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10 Subpopulações Subpopulações Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) B) Grupo controle CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) NK totais 16 ns ns 20 0,0007 0,7 16 0,0436 -0,5 CD56dim 16 ns ns 20 0,0058 0,6 16 ns ns CD56brigth 15 ns ns 17 0,0064 0,6 14 ns ns CD56dimCD16+ 16 ns ns 18 ns ns 16 ns ns CD56dimCD16- 15 ns ns 19 0,0011 0,7 15 ns ns CD56brightCD16+ 7 ns ns 8 ns ns 7 ns ns CD56brightCD16- 13 ns ns 15 ns ns 13 ns ns Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) NK totais 16 ns ns 20 ns ns 16 ns ns CD56dim 16 ns ns 20 ns ns 16 ns ns CD56brigth 15 ns ns 17 ns ns 14 ns ns CD56dimCD16+ 16 ns ns 18 ns ns 16 ns ns CD56dimCD16- 15 ns ns 19 ns ns 15 ns ns CD56brightCD16+ 7 ns ns 8 ns ns 7 ns ns CD56brightCD16- 13 ns ns 15 ns ns 13 ns ns Subpopulações IFN-γ x IL-10 Estímulo com K562 (frequência de células com expressão, %) Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10 IFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10 EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expre ssão); estímulo com K562: descont ando-se o valor basal (sem estímulo), NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; em negrito: valore s de p significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correspondem a correlações diferenciais entre os grupos EDT e CTR; ns: não significante (p≥ 0,05), NA: não analisado; valores de p e r determinados pelo t este de correlação de Spearman. 113 4.4.2.3 Na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA O bloqueio de MICA nas células K562 (K562BLOQ), represent ando o potencial efeito da presença de sMICA, praticamente não induziu modificações (Tabela 1 4), em relaç ão aos eventos que ocorreram na condição com o estímulo com K562, sem bloqueio (Tabela 13). Houve apenas duas mudanças, estatisticamente significantes, e apenas no grupo EDT: diminuição da porcentagem de células produtoras de IL -10 nas subpopulações CD56 bright (p= 0,0479) e CD56 brightCD16- (p=0,0105) (Tabela 14 A). Ou seja, com o bloqueio de MICA, permaneceram as mesmas modificações induzidas pelo estímulo com K562, na ausência de bloqueio (valores de p determinados pelo teste pareado de Wilcoxon). 114 Tabela 14. Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10, e das intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose (A) e controles (B), entre as condições após es tímulo K562, e após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. A) Grupo endometriose EDT K562 K562BLOQ EDT K562 K562BLOQ EDT K562 K562BLOQ (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p NK totais 21 14,5 16,8 ns 21 3,6 3,0 ns 17 -0,1 -0,2 ns CD56dim 21 16,4 18,5 ns 21 4,1 3,1 ns 18 -0,1 -0,1 ns CD56brigth 15 17,7 18,4 ns 15 4,3 4,3 ns 13 0,1 -0,1 0,0479 CD56dimCD16+ 20 20,3 29,0 ns 20 5,9 6,4 ns 17 0,8 0,6 ns CD56dimCD16- 20 17,1 20,5 ns 20 5,7 6,0 ns 17 -0,1 -0,1 ns CD56brightCD16+ 4 11,1 6,4 NA 4 2,1 6,4 NA 4 5,1 2,3 NA CD56brightCD16- 16 20,3 25,0 ns 16 6,1 3,3 ns 13 -0,1 -0,6 0,0105 EDT K562 K562BLOQ EDT K562 K562BLOQ EDT K562 K562BLOQ (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p NK totais 21 54,0 57,0 ns 21 -0,3 0,5 ns 17 -12,0 -15,0 ns CD56dim 21 51,0 69,0 ns 21 -0,4 2,1 ns 18 0,0 0,4 ns CD56brigth 15 60,0 65,0 ns 15 0,0 -0,3 ns 13 -5,7 -15,0 ns CD56dimCD16+ 20 59,0 55,5 ns 20 -3,3 -0,1 ns 17 0,0 0,0 ns CD56dimCD16- 20 103,0 121,5 ns 20 7,0 9,9 ns 17 -12,0 -6,0 ns CD56brightCD16+ 4 59,0 54,5 NA 4 -3,4 -5,4 NA 4 -8,0 -6,0 NA CD56brightCD16- 16 60,5 70,5 ns 16 1,4 2,0 ns 13 -14,0 -14,0 ns CD107a IFN-γ IL-10 K562 x K562BLOQ (frequência de células com expressão, %) CD107a IFN-γ IL-10 Subpopulações Subpopulações K562 x K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) EDT: grupo endometriose; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); K562: estímulo com células K562 descontando-se o valor basal (sem estímulo; K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontado do valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; med: mediana; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; em negrito : valores de p significantes (p<0,05); em negrito e sublinhado: diferença ausente no grupo CTR; em azul: valor da mediana diminuída em relação ao estímulo com K562 sem bloqueio; ns: não significante ( p≥ 0,05); NA: não analisado; valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. 115 Continuação Tabela 14. Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10, e das intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose (A) e controles (B), entre as condições após estímulo K562, e após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. B) Grupo controle CTR K562 K562BLOQ CTR K562 K562BLOQ CTR K562 K562BLOQ (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p NK totais 19 21,2 17,3 ns 19 4,2 4,5 ns 14 0,0 0,3 ns CD56dim 19 22,0 22,0 ns 19 4,2 4,4 ns 14 0,1 0,3 ns CD56brigth 16 24,7 22,6 ns 16 5,2 5,6 ns 12 -1,8 -1,3 ns CD56dimCD16+ 17 29,1 25,8 ns 17 3,3 3,1 ns 13 0,4 0,5 ns CD56dimCD16- 18 16,0 13,9 ns 18 12,7 11,3 ns 14 -0,2 0,2 ns CD56brightCD16+ 7 21,2 30,3 ns 7 0,3 0,9 ns 5 0,0 0,3 ns CD56brightCD16- 15 38,0 22,0 ns 14 8,3 6,2 ns 11 0,0 0,0 ns CTR K562 K562BLOQ CTR K562 K562BLOQ CTR K562 K562BLOQ (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p NK totais 19 108,0 87,0 ns 19 17,0 18,0 ns 14 4,7 19,8 ns CD56dim 19 107,0 87,0 ns 19 17,0 20,1 ns 14 1,5 21,2 ns CD56brigth 16 102,5 112,0 ns 16 14,1 15,8 ns 12 1,5 3,7 ns CD56dimCD16+ 17 76,0 94,0 ns 17 18,0 20,0 ns 13 0,0 0,0 ns CD56dimCD16- 18 102,0 83,0 ns 18 11,5 11,0 ns 14 -5,5 -2,5 ns CD56brightCD16+ 7 126,0 99,0 ns 7 2,0 6,4 ns 5 1,7 4,0 ns CD56brightCD16- 15 121,0 157,0 ns 14 10,3 9,8 ns 11 -2,0 -12,0 ns K562 x K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 CD107a IFN-γ K562 x K562BLOQ (frequência de células com expressão, %) IL-10 Subpopulações Subpopulações CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade d e fluorescência (intensidade de expressão); K562: estímulo com células K562 descontando-se o valor basal (sem estímulo; K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; med: mediana; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+;n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; ns: não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. 116 Apesar de o bloqueio de MICA, praticamente, não ter modificado o que ocorreu com o estímulo com K562, na análise do balanço final entre os grupos EDT e CTRs (teste de Mann- Whitney), na condição de bloqueio, observamos algumas diferenças significativas: (i) Menor intensidade de expressão de IFN-y no grupo EDT em 5 populações celulares, NK totais ( p= 0,0084), CD56 dim (p= 0,0128), CD56 bright (p= 0,0308), CD56 dimCD16+ (p= 0,0126) e CD56brightCD16- (p= 0,0308), em comparação com o grupo CTR (valores de p determinados pelo teste de Mann Whitney ) (Tabela 15). Destacamos que essas diferenças já eram estatisticamente significantes na condição sem bloqueio, para as mesmas populações (Tabela 12); (ii) Ainda em relação a IFN -y, o bloqueio induziu uma diferença significativa que não havia na condição apenas com estímulo K562: menor frequência de células CD56 brightCD16- produtoras de IFN-y no grupo EDT (p= 0,0275, teste de Mann Whitney) (Tabela 15); (iii) As outras diferenças encontradas entre os grupos EDT e CTR, após o bloqueio de MICA, foram em relação à IL -10: menor porcentagem de células CD56 dim produtoras de IL-10, no grupo EDT ( p= 0,0067); e menor intensidade de expressão de IL -10 no grupo EDT, para célula s NK totais ( p= 0,0308), em relação ao grupo CTR. Essas diferenças não foram significativas na condição após estímulo com K562 sem bloqueio (Tabela 12). Encontramos também menor intensidade de expressão de IL-10 na população de células CD56bright (p= 0,0329) do grupo EDT, mas essa diferença já era significativa na condição após estímulo K562 sem bloqueio (Tabela 12); (valores de p determinados pelo teste de Mann Whitney ). Esses dados comparativos, entre os grupos EDT e CTR, estão apresentados na Tabela 15. Em relação à expressão de CD107a, é interessante destacar que a diferença de menor % de células produtoras para CD56 brightCD16- no grupo EDT, em relação ao grupo CTR, observada na condição após estímulo com células K562 ( p= 0,0445, teste de Mann-Whitney; (Tabela 12), desapareceu na condição K562 com bloqueio de MICA ( p= ns, teste de Mann- Whitney; Tabela 15). O mesmo ocorreu para a intensidade de expressão de CD107a, para NK totais (p= 0,0233) CD56dim (p= 0,0308) e CD56 bright (p= 0,0097) (Tabela 12) na condição após estímulo com células K562; desapareceu a diferença de menor intensidade de expressão na EDT, em relação ao rupo CTR, na condição K562 com bloqueio de MICA ( p= ns, teste de Mann-Whitney; Tabela 15). Ou seja, com bloqueio de MICA, não observamos diferenças significativas para CD107a entre os grupos EDT e CTR (Tabela 15), apesar de terem ocorrido diferenças na condição de estímulo com K562 sem bloqueio (Tabela 12). Todos os dados das análises individuais de mulheres dos grupos CTR e EDT, tanto para a frequência (%) como para a intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN -y e 117 IL-10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo com células K562, e com células K562 pós bloqueio para MICA, estão apresentados no Anexo X, Tabela 3. Tabela 15 . Comparação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 e entre as sus intensidades de expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição de estímulo com K562 bloqueadas para a proteína MICA. EDT CTR EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 21 16,8 19 17,3 ns 21 3,0 19 4,5 ns 17 -0,2 14 0,3 ns CD56dim 21 18,5 19 22,0 ns 21 3,1 19 4,4 ns 18 -0,1 14 0,3 0,0067 CD56brigth 16 17,3 17 24,1 ns 16 3,4 17 5,8 ns 13 -0,1 13 -0,1 ns CD56dimCD16+ 20 29,0 17 25,8 ns 20 1,8 17 3,1 ns 17 0,0 13 0,5 ns CD56dimCD16- 20 20,5 18 13,9 ns 20 6,0 18 5,0 ns 17 -0,1 14 0,2 ns CD56brightCD16+ 4 14,4 7 30,3 NA 4 6,4 7 0,9 NA 4 1,1 5 0,3 NA CD56brightCD16- 16 25,0 15 22,0 ns 16 3,3 14 8,9 0,0275 13 -0,6 11 0,0 ns EDT CTR EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 21 57,0 19 87,0 ns 21 0,5 19 18,0 0,0084 17 0,0 14 19,8 0,0308 CD56dim 21 69,0 19 87,0 ns 21 2,1 19 20,1 0,0128 18 0,4 14 21,2 ns CD56brigth 16 61,5 17 81,0 ns 16 -0,7 14 8,0 0,0308 13 -15,0 13 8,0 0,0329 CD56dimCD16+ 20 55,5 17 94,0 ns 20 -0,1 17 20,0 0,0126 17 0,0 13 0,0 ns CD56dimCD16- 20 121,5 18 83,0 ns 20 9,9 18 11,0 ns 17 -6,0 14 -2,5 ns CD56brightCD16+ 4 54,5 7 99,0 NA 4 -5,4 7 6,4 NA 4 -6,0 6 9,8 NA CD56brightCD16- 16 70,5 15 157,0 ns 16 2,0 14 9,8 0,0308 13 -14,0 11 -12,0 ns Estímulo com K562BLOQ (frequência de células com expressão, %) CD107a IFNγ IL-10 Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFNγ IL-10 Subpopulações Subpopulações EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; em negrito: valores de p significantes (p<0,05); em vermelho: valor da maior mediana significante entre os grupos EDT e CTR; ns: não significante ( p≥ 0,05); NA: não analisado; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. ❖ Análise de correlação entre a expressão das moléculas envolvidas na atividade de células NK, após o estímulo com células K562 bloqueadas para MICA: As análises para avali ação da ocorrência ou não de correlação foram realizadas, tanto para a % como para a intensidade de expressão. Os valores de p e r foram determinados pelo teste de correlação de Spearman (Tabela 16): ► Grupo CTR: algumas correlações foram mantidas, outras perdidas, e novas surgidas, na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA: • IFN-y e CD107a : correlações positivas para % de expressão: mantiveram -se algumas correlações positivas para as populações celulares previamente encontradas na condição de estímulo com K562 sem bloqueio: NK totais (r=0,5, p= 0,0161), CD56dim 118 (r= 0,5, p= 0,0169), e CD56 dimCD16- (r= 0,8, p= 0,0001) e surgiu outra, CD56brightCD16- (r= 0,7, p= 0,0088). • IFN-y e IL-10: correlações positivas para intensidade de expressão, nas subpopulações CD56bright (r=0,6, p=0,0381) e CD56 brightCD16- (r=0,8, p=0,0027) (correlações ausentes na condição K562 sem bloqueio). • CD107a e IL -10: correlação negativa para intensidade de expressão para a subpopulação CD56 dimCD16+ (r= -0,6, p= 0,0485) (correlação ausente na condição K562 sem bloqueio). ► Grupo EDT: algumas correlações foram mantidas, outras perdidas, e novas surgidas, na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA: • IFN-y e IL -10: para % expressão, nas subpopulações: CD56 dim (r=0,5, p=0,0326) (correlação positiva ) e CD56 bright (r= -0,7, p= 0,0182) ( correlação negativa ) (não observadas com estímulo com K562 sem bloqueio). Para a intensidade de expressão: correlação positiva em NK totais (r=0,6, p=0,0173) (não observada sem bloqueio); CD56 dim (r=0,6, p=0,0068) e CD56 bright (r=0,7, p= 0,0054) (previamente observadas na condição com K562 sem bloqueio); as correlações CD56 dimCD16- e CD56dimCD16- observadas na condição sem bloqueio, foram perdidas na condição de K562 bloqueada para MICA. • CD107a e IFN-y: para % de expressão, novas correlações positivas: em NK totais (r=0,4, p= 0,0451) e CD56 dim (r=0,5, p= 0,0175). Essas correlações também foram observadas no grupo CTR. Na Tabela 16 estão apresentados os dados significantes de correlações observadas nos grupos EDT e CTR, tanto para a frequência como para a intensidade de produção das moléculas, em cada subpopulação de células NK. 119 Tabela 16. Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 e entre suas intensidades de exp ressão, nas subpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose (A) e controles (B), na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. A) Grupo endometriose EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 21 0,0451 0,4 17 ns ns CD56dim 18 0,0326 0,5 21 0,0175 0,5 18 ns ns CD56brigth 13 0,0182 -0,7 16 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) NK totais 17 0,0173 0,6 21 ns ns 17 ns ns CD56dim 18 0,0068 0,6 21 ns ns 18 ns ns CD56brigth 13 0,0054 0,7 16 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10IFN-γ x IL-10 Estímulo com K562BLOQ (frequência de células com expressão, %) IFN-γ x CD107a Subpopulações Subpopulações Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a x IL-10IFN-γ x IL-10 B) Grupo controle CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) NK totais 13 ns ns 19 0,0161 0,5 17 ns ns CD56dim 14 ns ns 19 0,0169 0,5 14 ns ns CD56brigth 13 ns ns 17 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 13 ns ns 17 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16- 14 ns ns 18 0,0001 0,8 14 ns ns CD56brightCD16+ 5 ns ns 7 ns ns 5 ns ns CD56brightCD16- 11 ns ns 14 0,0088 0,7 13 ns ns Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) NK totais 14 ns ns 19 ns ns 17 ns ns CD56dim 14 ns ns 19 ns ns 14 ns ns CD56brigth 13 0,0381 0,6 17 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 13 ns ns 17 ns ns 13 0,0485 -0,6 CD56dimCD16- 14 ns ns 18 ns ns 14 ns ns CD56brightCD16+ 5 ns ns 7 ns ns 5 ns ns CD56brightCD16- 11 0,0027 0,8 14 ns ns 13 ns ns Subpopulações IFN-γ x IL-10 IFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a Estímulo com K562BLOQ (frequência de células com expressão, %) CD107a x IL-10 Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10 EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontando-se o valor basal (sem estímulo); n: número de pares de dados analisados para cada subpopulação ; em negrito: valores de p significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correspondem a correlações diferenciais entre os grupos EDT e CTR; as análises foram realizadas a partir de valores de mediana da porcentagem de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 e de suas MFIs, nas diferentes subpopulações de NK; ns: não significante (p≥ 0,05); NA: não analisado; valores de p e r determinados pelo t este de correlação de Spearman. 120 4.4.3 Expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e relação aos níveis de MICA solúvel Uma vez que MICA solúvel pode diminuir a ativi dade citotóxica de células NK via ligação e internalização do receptor NKG2D, avaliamos a presença de correlação entre os níveis de MICA solúvel (sMICA) no soro (sistêmico) ou no fluido peritoneal (FP; no local da lesão) e a expressão das moléculas importa ntes na atividade efetora (CD107a, IFN -y) e reguladora de células NK (IL -10) (% e intensidade) no grupo CTR e EDT. Esta análise foi realizada em células NK totais e suas subpopulações: CD56 bright e CD56 dim, com ou sem a expressão da molécula CD16, também e nvolvida na citotoxicidade pelas células NK, mas via ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpos). As análises foram realizadas para as condições: basal de cultura (sem estímulo), com estímulo de células K562 e com estímulo de células K562 bloqueadas para MICA (K562BLOQ). Ressaltamos que não foi realizada a análise para a subpopulação CD56brightCD16+, em mulheres com EDT, uma vez que poucas amostras tiveram número de eventos igual ou maior ou de 100 (valor de corte para análise). Todas as anális es de correlação, com determinação de valores de r e p, f oram realizadas pelo teste de correlação de Spearman. 4.4.3.1 Moléculas vs MICA solúvel: na condição basal de cultura ► Grupo CTR: • CD107a e sMICA: observamos duas correlações positivas: i) % de células CD107a + e sMICA no fluido peritoneal, em células: NK totais (r=0,5, p= 0,0316) e CD56dimCD16- (r=0,6, p= 0,0249) (Figura 41). • IFN-y e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de IFN-y e níveis de sMICA totais (negativos e positivos, no soro ou FP). • IL-10 e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de IL-10 e níveis de sMICA totais (soro ou FP). 121 ► Grupo EDT: • CD107a e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de CD107a e níveis de sMICA (soro ou FP). • IFN-y e sMICA: observamos correlação positiva (Figura 41): i) % de células IFN -y + e níveis de sMICA no soro , nas subpopul ações: CD56dim (r=0,5, p= 0,0393) e CD56dimCD16+ (r=0,5, p= 0,0277) • IL-10 e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de IL-10 e níveis de sMICA (soro ou FP). Os dados significantes das análises de correlação entre a frequênci a de células positivas ou entre a intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 com níveis de sMICA (soro e FP) estão no Anexo X, Tabela 4. 0 2 0 4 0 6 0 8 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 C T R : C D 5 6 d im C D 1 6 - (n = 1 7 ) C D 1 0 7 a (% ) s M IC A p g /m L (F P ) A ) r= 0 ,6 p = 0 ,0 2 4 9 0 5 1 0 1 5 2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 IF N -  (% ) s M IC A p g /m L ( s o r o ) B ) E D T : C D 5 6 d im (n = 2 1 ) r= 0 ,5 p = 0 ,0 3 9 3 Figura 41. Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas e expressão de moléculas de atividade efetora de células NK, em subpopulações de células NK circulantes, com níveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e controles, na condição basal de cultura, sem estímulo. A ) correlação entre as frequências de expressão de CD0107 e níveis de sMICA em fluido peritoneal, na subpopulação CD56 dimCD16-, no grupo CTR; B) correlação entre as frequências de expressão de IFN-y e níveis de sMICA no soro, na subpopulação CD56 dim, no grupo EDT; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peritoneal; n: número de pares de dados analisados; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 4.4.3.2 Moléculas vs MICA solúvel: na condição de estímulo com células K562 ► Grupo CTR: 122 • CD107a e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de CD107a com estímulo com células K562 e níveis de sMICA do grupo total de positivos e negativos (soro ou FP). • IFN-y e sMICA: observamos duas correlações negativas: i) % de células IFN -y + e níveis de sMICA no FP , na subpopulação CD56bright (r=-0,7, p= 0,0032) (Figura 42). ii) intensidade de expressão de IFN -y e níveis de sMICA no soro , na subpopulação CD56brightCD16- (r=-0,7, p= 0,014). • IL-10 e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de IL-10 com estímulo com células K562 e níveis de sMICA do grupo total de positivos e negativos (soro ou FP). Os dados das análises de correlação estão apresentados no Anexo X, Tabela 5A. ► Grupo EDT: Também na endometriose, observamos diversas correlações negativas, sendo apenas uma semelhante àquelas observadas no grupo CTR (Figura 42, e Anexo X, Tabela 5B): • CD107a e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de CD107a com estímulo com células K562 e níveis de sMICA do grupo total de positivos e negativos (soro ou FP). • IFN-y e sMICA: observamos correlações negativas: i) % de células IFN -y+ e níveis de sMICA no soro , na subpopulação CD56brightCD16- (r= -0,5, p= 0,0413) (semelhante ao grupo CTR, na mesma subpopulação, mas para MFI) ii) % de células IFN -y+ e níveis de sMICA no FP , nas populações ( correlações negativas não observadas no grupo CTR): • NK totais (r= -0,5, p= 0,0279), • CD56dim (r= -0,5, p= 0,0373), • CD56dim CD16+ (r= -0,5, p= 0,0468) • CD56dim CD16- (r= -0,6, p= 0,0076) iii) intensidade de expressão de IFN -y e níveis de sMICA no FP , nas subpopulações (correlações negativas não observadas no grupo CTR): • CD56dim (r= -0,4, p=0,0434) • CD56dimCD16+ (r= -0,5, p=0,0488) • CD56dimCD16- (r= -0,5, p=0,0435) 123 • IL-10 e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de IL -10 com estímulo com células K562 e níveis de sMICA do grupo total de positivos e negativos (soro ou FP) (p≥ 0,05, correlação de Spearman). -5 0 5 1 0 1 5 1 0 0 2 0 0 3 0 0 C T R : C D 5 6 b rig h t (n = 1 5 ) IF N -  (% ) s M I C A p g / m L ( F P ) A ) r= -0 ,7 p = 0 ,0 0 3 2 -1 0 1 0 2 0 -2 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 E D T : C D 5 6 d im (n = 2 1 ) IF N -  ( % ) s M I C A p g / m L ( F P ) B ) r= -0 ,5 p = 0 ,0 3 7 3 Figura 42. Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas para a expressão de IFN-y em subpopulações de células NK circulantes, com níve is de MICA solúvel no fluido peritoneal de mulheres com endometriose e de controles, na condição com estímulo com células K562. A) correlação entre as frequências de expressão de IFN -y e níveis de sMICA em fluido peritoneal (FP), na subpopulação CD56 bright, em CTRs; B) correlação entre as frequências de expressão de IFN -y e níveis de sMICA no FP, na subpopulação CD56 dim, no grupo EDT; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; n: número de pares de dados analisados; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 4.4.3.3 Moléculas vs MICA solúvel: na condição estímulo com células K562 bloqueadas para MICA Observamos que, após o estímulo com células K562 bloqueadas para MICA (K562BLOQ), algumas correlações foram mantidas em relação à condição de estímulo com K562 sem bloqueio. Destacamos também, que novas correlações foram detectadas na presença de K562BLOQ, que representa a presença de MICA solúvel. ► Grupo CTR: Foram observadas tanto correlações positivas como negativas (Figura 4 3 e Anexo X, Tabela 6): • CD107a e sMICA: observamos correlação positiva: i) % de células CD107a+ e níveis sMICA no FP, na subpopulação CD56brightCD16+ (r= 0,8, p= 0,0476) ( correlação positiva não encontrada na condição com estímulo de K562 sem bloqueio para MICA) (Correlação de Spearman). • IFN-y e sMICA: observamos correlação negativa: 124 ii) intensidade de expressão de IFN -y e níveis sMICA no soro, na subpopulação CD56 brightCD16- (r= -0,7, p= 0,0152) ( correlação negativa, semelhante à encontrada na condição com estímulo de K562 sem bloqueio) (Correlação de Spearman). • IL-10 e sMICA: observamos correlações negativas: iii) de células IL-10+ e níveis de MICA no soro, para as subpopulações: • CD56dim (r= -0,6, p= 0,0175) • CD56dimCD16+ (r= -0,6, p= 0,0455) (correlação negativa não encontrada na condição com estímulo de K562 sem bloqueio para MICA) (Correlação de Spearman). iv) intensidade de expressão de IL -10 e níveis de sM ICA no soro , para as subpopulações ( correlações negativas , ausentes com estímulo de K562 sem bloqueio) (Correlação de Spearman): • NK totais (r= -0,7, p= 0,0105) • CD56dim (r= -0,7, p= 0,0152) • CD56dimCD16+ (r= -0,6, p= 0,0417) • CD56dimCD16- (r= -0,7, p= 0,0012) ► Grupo EDT: foram observadas apenas correlações negativas (Figura 43 e Anexo X, Tabela 6) • CD107a e sMICA: i) % de células CD107a+ e níveis de MICA no soro, para a subpopulação CD56dimCD16+ (r= -0,5, p= 0,0192) ( correlação negativa não encontrada na condição com estímulo de K562 sem bloqueio para MICA) (Correlação de Spearman). ii) intensidade de expressão de CD107a e níveis de sMICA no soro, em células CD56brightCD16- (r= -0,5, p= 0,0390) ( correlação negativa não observada no estímulo de K562 sem bloqueio, e não encontrada no grupo CTR ) (Correlação de Spearman). iii) intensidade de expressão de CD107a e níveis de sMICA no FP, em células CD56bright (r= -0,7, p= 0,0057) (correlação negativa não observada no estímulo de K562 sem bloqueio, e não enc ontrada no grupo CTR ) (Correlação de Spearman). • IFN-y e sMICA: 125 i) % de células IFN-y+ e níveis de sMICA no soro, em células NK totais (r= -0,5, p=0,0366) (semelhante àquela encontrada na condição com estímulo com K562 sem bloqueio, mas foi para células CD56 brightCD16-; correlação negativa não encontrada no grupo CTR) ii) % de células IFN -y+ e níveis de sMICA no FP, na subpopulação CD56dimCD16- (r= -0,5, p=0,0444) (semelhante ao encontrado na condição com estímulo com K562 sem bloqueio, mas com perda de correlaçã o para células NK totais, CD56 dim e CD56 dimCD16-; correlação negativa não encontrada no grupo CTR) (Correlação de Spearman). • IL-10 e sMICA: iii) % de células IL-10+ e níveis de sMICA no soro, na subpopulação CD56dim (r= -0,5, p=0,0427) ( correlação negativa não observada no estímulo de K562 sem bloqueio; mas semelhante a encontrada no grupo CTR) 0 2 0 4 0 6 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 C D 1 0 7 a (% ) s M IC A p g /m L (s o ro ) C T R : C D 5 6 b rig h tC D 1 6 + (n = 7 )A ) r= 0 ,8 p = 0 ,0 4 7 6 -4 0 -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 E D T : C D 5 6 d im C D 1 6 + (n = 2 0 ) C D 1 0 7 a (% ) s M IC A p g /m L (s o ro ) B ) r= -0 ,5 p = 0 ,0 1 9 2 Figura 4 3. Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas para a expressão CD107a em subpopulações de células NK circulantes, com níveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e de controles, na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. A) correlação entre as frequências de expressão de CD107a e níveis de sMICA no sor o, na subpopulação CD56brightCD16+, em CTRs; B) correlação entre as frequências de expressão de CD107a e níveis de sMICA no soro, na subpopulação CD56dimCD16+, no grupo EDT; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peri toneal; n: número de pares de dados analisados; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. Na Tabela 17, apresentamos um balanço dos principais resultados da correlaçã o entre a expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL-10, e os níveis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal. 126 Tabela 17. Balanço dos principais resultados da correlação entre a expressão de moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e níveis de MICA solúvel. NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; sMICA: MICA solúvel; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; FP: fluido peritoneal; em negrito e sublinhado: corr elações diferenciais entre o grupo EDT e CTR; em vermelho: correlações positivas; em azul: correlações negativas; SC: sem correlação; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 127 Resumo do balanço dos principais resultados da correlação entre a expressão de moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e níveis de MICA solúvel: Na condição basal, sem estímulo, mulheres do grupo CTR tiveram correlações positivas en tre a % CD107a e níveis de sMICA no FP e entre a intensidade de expressão de IFN -γ. Diferentemente do grupo CTR, apenas na EDT houve correlação positiva entre a % de IFN-γ e níveis de sMICA no soro. Na condição de estímulo com células K562, tanto mulheres do grupo CTR como do grupo EDT apresentaram correlações negativas para a expressão de IFN-γ (% e intensidade) e níveis de sMICA no soro e FP. No entanto, mulheres com EDT apresentaram correlações negativas em um maior número de subpopulações celulares, algumas ausentes no grupo CTR, e também ausentes na condição sem estímulo. No entanto, a presença do bloqueio de células K562 para MICA resultou em novas correlações negativas, tanto entre a % de células produtoras de IL -10 como para a intensidade de expressã o, e níveis de sMICA no soro, em ambos os grupos, CTR e EDT. Tais correlações estiveram ausentes na condição de estímulo sem bloqueio de MICA (exceto para % de células CD56dimCD16+) e na condição basal de cultura (sem estímulo). 4.4.4 Expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e relação com estádios da endometriose A expressão de moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10 (frequência e intensidade -MFI) por células NK e subpopulações foi analisada em relação aos estádios da EDT, iniciais ( I e II) e avançados (III e IV) e, destes, em relação ao grupo CTR. A análise foi realizada na condição basal de cultura (sem estímulo), e com estímulo de células K562 com e sem bloqueio, para células NK totais e suas subpopulações. Para todas as análises c omparativas entre os grupos usamos o teste de Mann-Whitney. A subpopulação CD56brightCD16+ de mulheres com EDT não foi analisada, pois poucas amostras atingiram o valor de corte (≥ 100 eventos na aquisição do citômetro). 4.4.4.1 Moléculas vs estádios: na condição basal de cultura • CD107a: não houve diferença na frequência de células produtoras entre EDT inicial e avançada e nem entre EDT inicial e CTR (Figura 4 4). No entanto, observamos uma menor intensidade de expressão na EDT avançada vs EDT inicial (n a subpopulação CD56 dimCD16-, p= 0,0368) (Tabela 18A). Na comparação entre EDT inicial e CTR, não foi observada diferença na % expressão (Figura 4 4), mas houve maior intensidade de expressão na EDT em células NK totais (p= 0,0238) e na subpopulação CD56 dimCD16+ (p= 0,0293) (Tabela 18B). Na análise entre EDT avançada vs CTR, observamos menor % de expressão de células produtoras de CD107a na EDT avançada, para a subpopulação CD56 dimCD16- (p= 0,0445) (Figura 4 4) bem 128 como menor intensidade de expressão nessa mes ma subpopulação celular ( p= 0,0185), descrita como de maior propriedade citotóxica, na EDT avançada (Tabela 18C). Em resumo, na EDT avançada há menor expressão de CD107a, na % ou intensidade, mesmo na ausência de estímulo in vitro, principalmente, na subpopulação CD56dimCD16-. • IFN-y: maior frequência de células produtoras na EDT avançada vs EDT inicial (CD56dim, p=0,047) (Figura 4 4), mas sem diferença para intensidade de expressão, em qualquer subpopulação celular (Tabela 18A). Na comparação entre EDT ini cial e CTR, mulheres com EDT inicial apresentaram maior frequência de células produtoras de IFN -y (CD56brightCD16-, p=0,0056) (Figura 4 4), mas não apresentaram diferenças para intensidade de expressão (Tabela 18B). Para EDT avançada vs CTR, mulheres com ED T avançada apresentaram maior frequência de células produtoras de IFN -y (NK totais, p=0,0061; CD56dim, p=0,0008; CD56 dimCD16-, p= 0,0423 e CD56brightCD16-, p=0,0003) (Figura 4 4) e maior intensidade de expressão na subpopulação CD56brightCD16- (p= 0,0163) (Tabela 18C). Em contraste com CD107a, a expressão de IFN -y nas células NK foi, em geral, maior na EDT avançada, ora na sua % ora na sua intensidade de expressão, ou ambas, seja na comparação com o grupo EDT inicial ou grupo CTR. Algumas dessas diferenças foram em relação às células NK totais, às CD56dime às CD56brightCD16-. . • IL-10: maior frequência de células com expressão na EDT avançada, em comparação à inicial (em células NK totais, p=0,0145 e na subpopulação CD56 dimCD16+, p=0,022) (Figura 44), mas se m diferença para a intensidade de expressão (Tabela 18A). Entre o grupo EDT inicial e grupo CTR, não houve diferença na frequência de células produtoras (Figura 4 4), mas houve maior intensidade de expressão na EDT inicial, em várias subpopulações celulares (em NK totais, p= 0,0198, CD56 dim, p= 0,0437 e CD56 dimCD16-, p= 0,0238) (Tabela 18B). Essa maior intensidade de marcação para IL -10 em células NK totais e CD56 dim, já havia sido observada na comparação entre o grupo total de mulheres com EDT e CTR, independentemente do estádio da doença (como descrito no item 4.4.2.1). Na comparação entre o grupo EDT avançada e grupo CTR, assim como para EDT inicial, não foi observada qualquer diferença na frequência de células produtoras de IL -10 (Figura 44). No entanto, houve uma maior intensidade de expressão de IL -10 na EDT avançada, na subpopulação CD56dimCD16+ (p= 0,0434) (Tabela 18C). A expressão de IL -10 nas células NK, na condição basal de cultura, segue um padrão mais semelhante à molécula IFN -y. Ou seja, de modo geral, detectamos maior expressão de IL-10 (% ou intensidade de expressão) no estádio avançado da doença, tanto para células NK totais como para algumas subpopulações CD56dim. 129 I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR 0 5 1 0 5 0 1 0 0 N K to ta is (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 1 4 5 p = 0 ,0 0 6 1 A ) C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR 0 5 1 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 d im (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 4 7 p = 0 ,0 0 0 8 B ) C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR 0 1 0 2 0 3 0 C D 5 6 b rig h t (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s C ) C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 I/II III/IV CTR I/II IIII/IV CTR I/II III/IV CTR 0 5 1 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 d im C D 1 6 + (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 2 2 0 D ) C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR 0 5 1 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 d im C D 1 6 - (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 4 4 5 E ) p = 0 ,0 4 2 3 C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 I/II III/IV CTR I/II IIII/IV CTR I/II III/IV CTR 0 5 1 0 5 0 1 0 0 C D 5 6 b rig C D 1 6 - (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 0 5 6 p = 0 ,0 0 0 3 F ) C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 Figura 44. Comparação da porcentagem (%) de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádi os iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição basal de cultura, sem estímulo. CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a rASRM; sem estímulo: condiçã o basal de cultura; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; linha pontilhada: indica o valor de zero para a % de células; as barras horizontais representam as medianas de porcentagem de expressão de cada molécula; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 130 Tabela 18. Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e entre controles, na condição basal de cultura, sem estímulo. A) EDT inicial vs EDT avançada Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 9 361,0 12 336,0 ns 9 105,0 12 77,6 ns 8 130,5 9 97,4 ns CD566dim 9 356,0 12 331,0 ns 9 101,0 12 77,3 ns 9 125,0 9 93,7 ns CD56bright 7 475,0 11 463,0 ns 7 155,0 11 70,8 ns 7 168,0 8 133,0 ns CD56dimCD16+ 8 349,5 12 341,5 ns 8 109,9 12 76,3 ns 8 8,9 9 123,0 ns CD56dimCD16- 8 342,5 12 278,0 0,0368 8 127,0 12 78,7 ns 8 147,5 9 129,0 ns CD56brightCD16+ 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 6 480,0 10 454,0 ns 6 122,30 10 69,0 ns 5 169,0 8 144,0 ns Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 I/II III/IV I/II III/IV I/II III/IV B) EDT inicial vs CTRs Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 9 361,0 20 336,0 0,0238 9 105,0 20 97,2 ns 8 130,5 16 49,1 0,0198 CD566dim 9 356,0 20 327,5 ns 9 101,0 20 99,4 ns 9 125,0 16 37,0 0,0437 CD56bright 7 475,0 18 452,0 ns 7 155,0 18 92,6 ns 7 168,0 16 131,5 ns CD56dimCD16+ 8 349,5 19 322,0 0,0293 8 109,9 19 93,3 ns 8 8,9 16 3,0 ns CD56dimCD16- 8 342,5 19 340,0 ns 8 127,0 19 122,0 ns 8 147,5 16 139,0 0,0238 CD56brightCD16+ 1 NA 9 NA NA 1 NA 9 NA NA 1 NA 8 NA NA CD56brightCD16- 6 480,0 17 438,0 ns 6 122,3 15 1,0 ns 5 169,0 13 143,0 ns CTR Sem estímulo (intensidade de expressão) CD107a IFN-γ IL-10 I/II CTR I/II CTR I/II C) EDT avançada vs CTRs Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 12 336,0 20 336,0 ns 12 77,55 20 97,2 ns 9 97,4 16 49,1 ns CD566dim 12 331,0 20 327,5 ns 12 77,3 20 99,4 ns 9 93,7 16 37,0 ns CD56bright 11 463,0 18 452,0 ns 11 70,8 18 92,6 ns 8 133,0 16 131,5 ns CD56dimCD16+ 12 341,5 19 322,0 ns 12 76,3 19 93,3 ns 9 123,0 16 3,0 0,0434 CD56dimCD16- 12 278,0 19 340,0 0,0185 12 78,7 19 122,0 ns 9 129,0 16 139,0 ns CD56brightCD16+ 3 NA 9 NA NA 3 NA 9 NA NA 3 NA 8 NA NA CD56brightCD16- 10 454,0 17 438,0 ns 10 69,0 15 104,0 0,0163 8 144,0 13 143,0 ns Sem estímulo (intensidade de expressão) CD107a IFN-γ IL-10 III/IV CTR III/IV CTR III/IV CTR EDT: grupo endometriose: CTR: grupo controle: I/II: estádios iniciais da endomet riose, III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expr essão); med: mediana; ns: valores de p não significantes ( p≥ 0,05);em negrito: valores de p significantes na comparação entre os grupos; em vermelho: valor da maior mediana significante na comparação entre os grupos; n: número de amostras analisadas para c ada subpopulação de células NK ; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 131 4.4.4.2 Moléculas vs estádios: na condição de estímulo com células K562 • CD107a: o estímulo co m K562 induziu um aumento na % de células produtoras de CD107a, em ambos os estádios da EDT (iniciais e avançados). No entanto, houve uma menor frequência de células produtoras de CD107a nos estádios avançados, na comparação com estádios iniciais (CD56dimCD16+, p=0,0055) (Figura 45) e menor intensidade de expressão (CD56dimCD16+, p=0,0068) (Tabela 19A). A análise entre mulheres do grupo EDT inicial e o grupo CTR não mostrou diferenças significativas, tanto para a frequência como para a intensidade de expre ssão da molécula CD107a, nas diferentes subpopulações de células NK avaliadas (Figura 45 e Tabela 19B). Na comparação entre EDT avançada e CTRs, mulheres em estádios avançados apresentaram menor frequência de células produtoras de CD107a (NK totais, p=0,0332 e nas subpopulações CD56dimCD16-, p=0,0116 e CD56brightCD16-p=0,0404) (Figura 45). Além disso, mulheres com EDT avançada também apresentaram menor intensidade de expressão em relação ao grupo CTR (NK totais, p=0,0043, CD56 dim, p=0,0065, CD56 bright, p=0,0097 e CD56dimCD16+, p=0,0044) (Tabela 19C). Em resumo, o estímulo com células K562 não alterou a menor expressão (% e intensidade) da molécula CD107a na EDT avançada, tanto em relação à EDT inicial como para o grupo CTR saudável, mantendo-se semelhante à condição basal, sem estímulo. Essa menor expressão ocorreu, principalmente, em células CD56dim. • IFN-y: na comparação entre a EDT inicial e avançada , não foi observada nenhuma diferença significativa, tanto para a frequência (%) como para a intensidade de expressão, em nenhuma subpopulação celular. No entanto, entre EDT inicial e o grupo CTR , na condição com o estímulo com células K562, observamos uma menor intensidade de expressão na EDT inicial, em células NK totais ( p= 0,0308), CD56 bright (p= 0,0019) e CD56brightCD16- (p= 0,0184) (Tabela 19B). Também, mulheres com EDT avançada apresentaram menor intensidade de expressão em relação ao grupo CTR (CD56brigth, p= 0,0203 e CD56dimCD16+, p= 0,0420) (Tabela 19C). Ou seja, para as células CD56 bright, a menor intensidade de expressão de IFN -y, ocorreu tanto em estádios iniciais quanto aos avançados da endometriose, na comparação com CTRs. Considerando esses resultados de forma integrada, podemos dizer que, apesar de observamos maior expressão de IFN -y na EDT, pri ncipalmente, na EDT avançada, na condição basal (sem estímulo), quando as células NK são estimuladas in vitro com células K562, tanto mulheres com EDT inicial como EDT avançada, apresentam menor expressão do que mulheres do grupo CTR, em células CD56bright e CD56dim. • IL-10: não foram observadas diferenças (%, Figura 4 5 e MFI, Tabela 19A) entre mulheres em EDT inicial e avançada, nem entre EDT avançada e o grupo CTR , nas 132 diferentes subpopulações de NK. Porém, após estímulo com células K562, apesar dos baixos valores em ambos os grupos, foi observada uma menor intensidade de expressão em estádios iniciais da EDT, na comparação com mulheres CTRs (Tabela 19B) (CD56 bright, p=0,0042 e CD56brightCD16-, p= 0,0430). De forma geral, podemos considerar que a maior exp ressão de IL -10 em células NKs na EDT avançada, observada na condição basal de cultura, deixou de existir após o estímulo com células K562, mantendo-se tanto em relação à EDT inicial como aos CTRs saudáveis. I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -1 0 0 1 0 2 0 4 0 6 0 8 0 N K to ta l (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 3 3 2 A ) C D 1 0 7 a IL -1 0IF N -  I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 d im (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s B ) C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s C ) C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 d im C D 1 6 + (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 0 5 5 D ) p = 0 ,0 1 1 6 C D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 d im C D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s F ) IF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a I/II III/IV CTR I/II IIII/IV CTR I/II III/IV CTR -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 b rig h t C D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s G ) p = 0 ,0 4 0 4 IF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a Figura 45. Comparação da porcentagem de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulan tes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição com estímulo com células K562. CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+; estímulo K562: estímulo com células K562; linha pontilhada: indica o valor de zero para % de células; as barras horizontais representam as medianas da porcentagem de expressão de cada molécula; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 133 Tabela 19. Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição de estímulo com células K562. A) EDT inicial vs EDT avançada Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 9 86,0 12 49,5 ns 9 -5,1 12 -2,9 ns 8 -6,5 9 9,6 ns CD566dim 9 88,0 12 42,5 ns 9 -4,2 12 2,9 ns 9 0,0 9 2,8 ns CD56bright 7 44,0 10 58,5 ns 7 -18 10 0,1 ns 7 -41,0 8 -5,4 ns CD56dimCD16+ 8 71,0 12 36,0 0,0068 8 0,25 12 -3,2 ns 8 0,0 9 0,0 ns CD56dimCD16- 8 126,5 12 79,5 ns 8 2,65 12 9,7 ns 8 -12,5 9 -12,0 ns CD56brightCD16+ 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 6 84,0 10 60,5 ns 6 -9,85 10 2,0 ns 5 -19,0 8 -1,5 ns I/II III/IV CD107a IFN-γ Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) IL-10 I/II III/IV I/II III/IV B) EDT inicial vs CTRs Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 9 86,0 20 98,5 ns 9 -5,1 20 14,8 0,0308 8 -6,5 16 4,7 ns CD566dim 9 88,0 20 95,5 ns 9 -4,2 20 15,6 ns 9 0 16 1,51 ns CD56bright 7 44,0 17 102,0 ns 7 -18,0 17 13,3 0,0019 7 -41,0 14 1,5 0,0042 CD56dimCD16+ 8 71,0 18 75,5 ns 8 0,3 18 17,0 ns 8 0,0 16 0,0 ns CD56dimCD16- 8 126,5 19 106,0 ns 8 2,7 19 14,0 ns 8 -12,5 15 -5,0 ns CD56brightCD16+ 1 NA 8 NA NA 1 NA 8 NA NA 1 NA 7 NA NA CD56brightCD16- 6 84,0 17 115,0 ns 6 -9,9 15 10,1 0,0184 5 -19,0 13 -4,0 0,0430 CTR I/II CTR I/II CTRI/II Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 C) EDT avançada vs CTRs Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 12 49,5 20 98,5 0,0043 12 3,0 20 14,8 ns 9 9,6 16 4,7 ns CD566dim 12 42,5 20 96,5 0,0065 12 2,9 20 15,6 ns 9 2,8 16 1,5 ns CD56bright 10 58,5 17 102,0 0,0097 10 0,1 17 13,3 0,0203 8 -5,4 14 1,5 ns CD56dimCD16+ 12 36,0 18 75,5 0,0044 12 -3,3 18 17,0 0,0420 9 0,0 16 0,0 ns CD56dimCD16- 12 79,5 19 106,0 ns 12 9,7 19 14,0 ns 9 -12,0 15 -5,0 ns CD56brightCD16+ 3 NA 8 NA NA 3 NA 8 NA NA 3 NA 7 NA NA CD56brightCD16- 10 60,5 17 115,0 ns 10 2,0 15 10,1 ns 8 -1,5 13 -4,0 ns CTRIII/IV CTR III/IV CTR III/IV Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16- , CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensida de de expressão); K562: estímulo com células K562 descontando-se o valor basal (sem estímulo);valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; med: mediana; ns: valores de p não significantes ( p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes na comparação entre os grupos; em vermelho: valor da maior mediana significante na comparação entre os grupos; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do ci tômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann- Whitney. 134 4.4.4.3 Expressão de moléculas vs estádios: na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA O estímulo na presença de bloqueio de MICA na superfície celular das células K56 2, representando a presença de MICA solúvel, de forma geral, não levou a diferenças na % de células com expressão de CD107a, IFN -y ou IL -10, nas diferentes subpopulações de células NK (Figura 46). Analisando diferenças em relação aos estádios da doença, destacamos: • CD107a: houve menor intensidade de expressão de CD107a na EDT avançada, em relação à EDT inicial, em células CD56 dimCD16+(p=0,0266) sem nenhuma outra diferença para as demais subpopulações (Tabela 20A). Na comparação entre EDT inicial e CTRs , o estímulo com células K562 bloqueadas, assim como ocorreu no estímulo com K562 sem bloqueio, não mostrou diferenças (% de células e MFI) para CD107a (Figura 46 e Tabela 20B). Também não houve diferença entre EDT avançada e CTRs , tanto para % de células (Fi gura 4 6) como para intensidade de expressão (Tabela 20C), deix ando de existir as diferenças existentes na condição com estímulo de células K562 sem bloqueio (Figura 43 e Tabela 19C). Em resumo, com o estímulo de células K562 bloqueadas para MICA na superf ície celular houve perda da diferença de menor % de expressão na EDT avançada, em relação à EDT inicial e CTRs, observada com estímulo de célula K562 sem bloqueio. No entanto, mesmo na presença de bloqueio, foi mantida a menor intensidade de expressão de C D107a na EDT avançada em relação à inicial, mantendo -se semelhante à condição basal e com estímulo de células K562 sem bloqueio. • IFN-y: da mesma forma como observado na condição com estímulo de células K562 sem bloqueio (Figura 4 5 e Tabela 19A), na presen ça de bloqueio para MICA na superfície celular, não foram observadas diferenças entre EDT inicial e avançada (frequência, %, Figura 46, e MFI, Tabela 20A). Na comparação entre EDT inicial e CTRs, foi observada uma menor % de células produtoras de IFN -y na EDT inicial, em células CD56 brightCD16- (p= 0,0326) (Figura 46) e, assim como ocorreu com estímulo de K562 sem bloqueio, uma menor MFI, em NK totais (p= 0,0491) (Tabela 20B), na EDT inicial. Observamos também que, com o bloqueio, houve perda da diferença d a maior intensidade de expressão em células CD56bright e CD56brightCD16- nos CTRs com estímulo de K562 em relação à EDT inicial (p= 0,0019 e p= 0,0184, respectivamente; Tabela 19B, com estímulo sem bloqueio (Tabela 20B). No entanto, a maior MFI observada n o grupo CTR após estímulo com células K562 sem bloqueio, em NK totais ( p= 0,0308), foi mantida em relação à EDT inicial, mesmo na presença de bloqueio de MICA na superfície celular (p= 0,0491) (Tabela 20B). Na comparação entre EDT avançada e CTRs, observa mos menor MFI na EDT avançada (NK totais, p= 0,0220 e em CD56dim, p= 0,0248) (Tabela 20C), diferenças essas 135 não observadas com o estímulo com K562 sem bloqueio (Tabela 20C). Além, disso, as diferenças previamente observadas para MFI, com K562 sem bloqueio (CD56brigth, p= 0,0203, e CD56 dimCD16+, p= 0,0420 ), foram mantidas com células K562 bloqueadas para MICA (CD56brigth, p= 0,0060 e CD56dimCD16+, p= 0,0349) (Tabela 20C). De forma geral, o bloqueio para MICA levou tanto à perda como à manutenção de algumas diferenças para IFN -y (% ou MFI), em relação à condição de estímulo com células K562 sem bloqueio. Não houve alteração na ausência de diferenças (% e MFI) entre EDT inicial e avançada, mas foi observada uma menor intensidade de expressão de IFN -y na EDT avançada (em NK totais e em CD56dim) em relação aos CTRs. O bloqueio também levou a uma menor % de células CD56 brightCD16- produtoras de IFN -y na EDT inicial em relação às CTRs saudáveis, não observada sem bloqueio, bem como à perda da diferença da maior intensidade de expressão em células CD56 bright e CD56brightCD16- nos CTRs em relação à EDT inicial. Algumas dessas diferenças ocorreram, principalmente, em relação às células CD56bright, já descritas como maiores produtoras de citocinas. • IL-10: assim como oc orreu na condição apenas com estímulo de células K562, na presença de K562 com bloqueio de MICA, não houve diferença entre EDT inicial e avançada (%, Figura 4 6, e MFI, Tabela 20A). Também não observamos diferença entre EDT avançada e CTRs, tanto para % (Figura 46) como para MFI (Tabela 20C), em nenhuma subpopulação celular. No entanto, na comparação entre EDT inicial e CTRs, apesar da baixa % de expressão de IL -10 em CD56 dim, nos dois grupos estudados, o bloqueio de MICA mostrou uma menor % de expressão de células produtoras de IL -10, na EDT inicial do que nos CTRs, para células CD56 dim (p= 0,01) (Figura 46). Além disso, com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, deixou de existir a menor MFI de IL -10 em células CD56brightCD16- na EDT inicial , detectada na condição com o estímulo com K562 sem bloqueio (p= 0,043, Tabela 19B). No entanto, a maior intensidade de expressão de IL-10 em mulheres em EDT inicial em relação aos CTRs, previamente observada em CD56 bright após estímulo com células K562 sem bloqu eio ( p=0,0042), foi mantida com K562 com bloqueio para MICA (p=0,0264, teste de Mann-Whitney) (Tabela 20). Assim como ocorreu para IFN -y, o estímulo com células bloqueadas para MICA levou tanto à perda como à manutenção de algumas diferenças (% ou MFI), e m relação à condição de estímulo com células K562 sem bloqueio na relação com os estádios da doença. Não houve modificação na ausência de diferenças (% e MFI) entre EDT inicial e avançada, fic eo mantidas as maiores % para IL-10 para EDT avançada, apenas na condição sem estímulo. Em relação à condição sem bloqueio, na presença de bloqueio de MICA na superfície celular, houve uma menor % de expressão IL -10, na EDT inicial do que no grupo CTR (em células CD56dim), mas deixou de existir a menor MFI de IL -10 em células CD56 brightCD16- na EDT inicial, na comparação com o grupo CTR. 136 Na Tabela 21 ( -A, -B, -C) está apresentado um balanço dos principais resultados da expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora e imunorreguladora de células NK e sua relação com estádios da endometriose. I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -1 0 0 1 0 2 0 4 0 6 0 8 0 N K to ta l (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) % d e c é lu la s A ) IF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -2 0 -1 0 -5 0 5 1 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 d im (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 1 B ) IF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -1 0 0 1 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) % d e c é lu la s C ) IF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -4 0 -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 d im C D 1 6 + (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) % d e c é lu la s D ) IF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a I/II III/IV CTR I/II CTR III/IV I/II III/IV CTR -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 d im C D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) % d e c é lu la s E ) IF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR I/II III/IV CTR -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 C D 5 6 b rig h tC D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) % d e c é lu la s F ) p = 0 ,0 3 2 6 IF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a Figura 46. Comparação da porcentagem (%) de expressã o das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para molécula MICA. CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a rASRM; A) células NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; B) subpopulação CD56dim; C) subpopulação CD56bright; D) subpopulação CD56dimCD16+; E) subpopulação CD56dimCD16- ; F) subpopulação CD56 brightCD16-; estímulo K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; linha pontilhada: indica o valor de zero para % de células, as barras horizontais representam as medianas da porcentagem de expressão de cada molécula; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 137 Tabela 20. Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na condição de estímulo com células K 562 bloqueadas para MICA. A) EDT inicial vs EDT avançada Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 9 83,0 12 44,0 ns 9 0,5 12 -0,6 ns 8 -4,0 9 0,0 ns CD566dim 9 87,0 12 41,0 ns 9 4,4 12 0,2 ns 9 0,7 9 0,0 ns CD56bright 5 116,0 11 55,0 ns 5 -1,0 11 -0,3 ns 5 -22,0 8 -11,0 ns CD56dimCD16+ 8 120,0 12 46,0 0,0306 8 1,4 12 -0,1 ns 8 1,5 9 0,0 ns CD56dimCD16- 8 144,0 12 73,5 ns 8 18,0 12 4,8 ns 8 -4,5 9 -9,0 ns CD56brightCD16+ 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 6 83,0 10 70,5 ns 6 -5,4 10 2,2 ns 5 -19,0 8 -13,0 ns Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 I/II III/IV I/II III/IV I/II III/IV B) EDT inicial vs CTRs Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 9 83 19 87,0 ns 9 0,5 19 18,0 0,0491 8 -4,0 14 19,8 ns CD566dim 9 87,0 19 87,0 ns 9 4,4 19 20,1 ns 9 0,7 14 21,2 ns CD56bright 5 116,0 17 81,0 ns 5 -1,0 17 8,0 ns 5 -22,0 13 8,0 0,0264 CD56dimCD16+ 8 120,0 17 94,0 ns 8 1,4 17 20,0 ns 8 1,5 13 0,0 ns CD56dimCD16- 8 144,0 18 83,0 ns 8 18,0 18 11,0 ns 8 -4,5 14 -2,5 ns CD56brightCD16+ 1 NA 7 NA NA 1 NA 7 NA NA 1 NA 5 NA NA CD56brightCD16- 6 83,0 15 157,0 ns 6 -5,4 14 9,8 ns 5 -19,0 11 -12,0 ns Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 I/II CTR I/II CTR I/II CTR C) EDT avançada vs CTRs Subpopulações (n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 12 44,0 19 87,0 ns 12 -0,55 19 18,0 0,0220 9 0,0 14 19,8 ns CD566dim 12 41,0 19 87,0 ns 12 0,20 19 20,1 0,0248 9 0,0 14 21,2 ns CD56bright 11 55,0 17 81,0 ns 11 -0,30 17 8,0 0,0060 9 -11,0 13 8,0 ns CD56dimCD16+ 12 46,0 17 94,0 ns 12 -0,10 17 20,0 0,0349 9 0,0 13 0,0 ns CD56dimCD16- 12 73,5 18 83,0 ns 12 4,75 18 11,0 ns 9 -9,0 14 -2,5 ns CD56brightCD16+ 3 NA 7 NA NA 3 NA 7 NA NA 1 NA 5 NA NA CD56brightCD16- 10 70,5 15 157,0 ns 10 2,15 14 9,8 ns 8 -13,0 11 -12,0 ns Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 III/IV CTR III/IV CTR III/IV CTR EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontando--se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores on de o valor basal foi maior do que com estímulo; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); med: mediana; ns: valores de p não significantes (p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes na comparação entre os grupos; em vermelho: valor da maior mediana significante na comparação entre os grupos; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: amostras não analisada s (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 138 Tabela 21. Balanço dos principais resultados da expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e sua relação com estádios da endometriose A) Condição basal de cultura, sem estímulo p Subpopulações grupos p Subpopulações ns todas I/II > III/IV 0,0368 CD56dimCD16- I/II ≈ CTR ns todas I/II > CTR 0,0238 NK totais I/II > CTR 0,0293 CD56dimCD16+ 0,0445 CD56dimCD16- III/IV < CTR 0,0185 CD56dimCD16- p Subpopulações grupos p Subpopulações 0,0470 CD56dim ns todas 0,0056 CD56brightCD16- ns todas 0,0061 NK totais 0,0163 CD56brightCD16- 0,0008 CD56dim 0,0423 CD56dimCD16- 0,0003 CD56brightCD16- grupos p Subpopulações grupos p Subpopulações 0,0145 NK totais ns todas 0,0220 CD56dimCD16+ ns todas 0,0198 NK totais 0,0437 CD56dim 0,0238 CD56dimCD16- ns todas 0,0434 CD56dimCD16+ Análise para intensidade de expressão Condição basal de cultura, sem estímulo Análise para frequência de células produtoras CD107a (MFI) IFN-γ (%) IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI) I/II CTR III/IV > CTR III/IV > CTR III/IV > CTR III/IV > CTR grupos grupos I/II ≈ III/IV I/II CTR I/II > CTR I/II > CTR III/I > CTR III/IV CTR I/II < III/IV CD107a (%) IL-10 (%) CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); ns: valores de p não significantes (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. Resumo: Na condição basal , sem estímulo, mu lheres em estádio avançado da EDT tiveram menor intensidade de expressão nas células produtoras de CD107a do que mulheres em estádios iniciais, apesar de não terem apresentado diferença na frequência dessas células . Além disso, mulheres em estádios avançad os apresentaram menor frequência de células produtoras e menor intensidade de expressão CD107a, do que o grupo CTR. Mulheres em estádios iniciais apresentaram maior intensidade de expressão de CD107a do que CTRs. A frequência de células produtoras de IFN-y foi maior na doença, tanto em estádio iniciais quanto avançados, em relação aos CTRs. Estádios avançados também tiveram maior frequência células produtoras de IFN-y na comparação com mulheres em estádios iniciais. Quanto à IL-10, mulheres em estádios avan çados tiveram maior frequência de células produtoras do que as mulheres em estádios iniciais. Para intensidade de expressão de IL -10, tanto estádios iniciais como avançado, apresentaram maior MFI do que mulheres do grupo CTRs. 139 Continuação da Tabela 21. Balanço dos principais resultados da expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e sua relação com estádios da endometriose. B) Condição de estímulo com células K562 CD107a (%) p Subpopulações grupos p Subpopulações 0,0055 CD56dimCD16+ 0,0068 CD56dimCD16+ ns todas ns todas 0,0332 NK totais 0,0043 NK totais 0,0116 CD56dimCD16- 0,0065 CD56dim 0,0404 CD56brightCD16- 0,0097 CD56bright 0,0044 CD56dimCD16+ p Subpopulações grupos p Subpopulações ns todas ns todas ns todas 0,0308 NK totais 0,0019 CD56bright 0,0184 CD56brightCD16- ns todas 0,0203 CD56bright 0,0420 CD56dimCD16+ p Subpopulações grupos p Subpopulações ns todas ns todas ns todas 0,0042 CD56bright 0,0430 CD56brightCD16- ns todas ns todas III/IV < CTR IFN-γ (%) I/II < CTR I/II < CTR III/IV ≈ CTR III/IV ≈ CTR IL-10 (MFI) grupos I/II ≈ III/IV I/II ≈ III/IV I/II < CTR I/II < CTR III/IV ≈ CTR III/IV < CTR IL-10 (%) I/II ≈ CTR IFN-γ (MFI) grupos I/II ≈ III/IV I/II ≈ III/IV I/II ≈ CTR I/II < CTR III/IV < CTR III/IV < CTR III/IV < CTR III/IV < CTR III/IV III/IVI/II > III/IV I/II ≈ CTR III/IV < CTR III/IV < CTR Estímulo com células K562 Análise para frequência de células produtoras Análise para intensidade de expressão CD107a (MFI) I/II ≈ CTR CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/ IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); ns: valores de p não significantes (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. Resumo: Na condição com estímulo de células K562 , observamos que mulheres em estádios avançados da EDT tiveram menor frequência de células com produção de CD107a e menor intensidade de expressão nas células produtoras, em relação às mulheres em estádios iniciais. Essa menor frequência e intensidade de expressão de CD107a em mulheres em estádios avançados, foi observada em relação a mulheres do grupo CTR. Para IFN-γ, a frequência de células produtoras e a intensidade de expressão foram semelhantes entres os estádios, mas houve menor intensidade de expressão na EDT, em ambos os estádios, do que mulheres CTRs. Também para IL-10, tanto mulheres em estádios iniciais como avançados, apresentaram menor intensidade de expressão do que CTRs, mas sem diferença para frequência de células produtoras e intensidade de expressão de IL -10 entre os diferentes estádios. 140 Continuação da Tabela 21. Balanço dos principais resultados da expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e sua relação com estádios da endometriose. C) Condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA p Subpopulações grupos p Subpopulações ns todas 0,0306 CD56dimCD16+ ns todas ns todas ns todas ns todas p Subpopulações grupos p Subpopulações ns todas ns todas 0,0326 CD56brightCD16- 0,0491 CD56brightCD16- ns todas 0,022 NK totais 0,0248 CD56dim 0,0060 CD56bright 0,0349 CD56dimCD16+ p Subpopulações grupos p Subpopulações ns todas ns todas 0,01 CD56dim 0,0264 CD56dimCD16- ns todas ns todas CD107a (%) I/II ≈ III/IV I/II ≈ III/IV I/II < CTR I/II < CTR I/II ≈ CTR III/IV ≈ CTR III/IV ≈ CTR IFN-γ (%) IFN-γ (MFI) I/II ≈ III/IV Estímulo com células K562BLOQ Análise para frequência de células produtoras Análise para intensidade de expressão CD107a (MFI) grupos I/II > III/IV III/IV ≈ CTR III/IV ≈ CTR III/IV < CTR III/IV < CTR III/IV < CTR IL-10 (%) IL-10 (MFI) I/II ≈ III/IV I/II < CTR I/II < CTR III/IV ≈ CTR III/IV < CTR I/II ≈ CTR grupos I/II ≈ III/IV grupos CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estád ios avançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); ns: valores de p não significantes (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. Resumo: Com estímulo de células K562 bloqueadas para MICA , as diferenças observadas sem bloqueio para frequência de células produtoras de CD107a foram perdidas, mantendo -se semelhantes entre estádios e entre estádios e CTRs. Foi mantida apenas a maior intensidade de expressão em mulheres em estádios iniciais em relação aos avançados. O bloqueio não alterou a maior intensidade de expressão de IFN-y para estádios iniciais e avançados, na compar ação com mulheres do grupo CTR. No entanto, o bloqueio resultou numa menor frequência de células produtoras dessa citocina, em mulheres em estádios iniciais comparadas aos CTRs. Para IL-10, o boqueio de MICA resultou em menor frequência de células produtor as e menor intensidade de expressão dessa citocina na EDT inicial em relação aos CTRs, mas foi mantida a semelhança (% e MFI) entre os estádios. 141 4.4.5 Expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10 e relação com às fases do ciclo menstrual A frequência (%) de células produtoras de CD107a, IFN -y ou IL-10 e a intensidade de expressão (MFI) dessas moléculas em células NK e subpopulações, foram analisadas de acordo com as fases do ciclo menstrual: proliferativa/estrogênica (1º ao 14º dia do ciclo) e secretora/progestacional (15º ao 28º dia do ciclo). Os dados obtidos em relação às fases do ciclo em mulheres com EDT foram comparados aos de mulheres CTRs saudáveis. As análises foram realizadas para as três condições de estudo: basal de cultura (sem estímulo), com estímulo com células K562, e após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, em células NK totais e nas subpopulações de NK. A subpopulação CD56 brightCD16+ de mulheres com EDT não foi analisada, pois poucas amostras atingiram o valor de corte (≥ 100 eventos na aquisição do citômetro). 4.4.5.1 Expressão das moléculas e fases do ciclo: condição basal de cultura A % de células com expressão de CD107a, IFN -y ou IL -10, e a intensidade de expressão dessas moléculas, não apresentaram diferenças entre as fases proliferativa e secretora, tanto no grupo de mulheres com EDT como no grupo CTR, nas diferentes subpopulações de células NK (p=ns) (Anexo X, Tabela 7). Todas as comparações de variáveis contínuas foram feitas pelo teste estatístico de Mann-Whitney. Na comparação das fases entre os grupos EDT e CTR , não observamos diferenças para CD107a e IL-10 (% e MFI) nas diferentes subpopulações celulares (p= ns, teste de Mann- Whitney) (Anexo X, Tabela 8). No entanto, para IFN -y, observamos que mulheres com EDT apresentaram maiores % de células CD56 dim produtoras dessa citocina na fase proliferativa do ciclo (p= 0,0252), do que mulheres do grupo CTR (Figura 47) Observamos que c élulas CD56 brightCD16- também apresentaram maiores % de expressão de IFN-y na EDT, em relação ao grupo CTR, mas isto ocorreu independentemente da fase do ciclo, uma vez que essa maior frequência ocorreu tanto na fase proliferativa ( p= 0,0101) como na secretora do ciclo (p= 0,0041) (Figura 47). 142 E D T C T R 0 2 4 6 8 C D 5 6 d im IF N -  (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 2 5 2 A ) P ro life ra tiv a n = 8 n = 1 1 E D T C T R 0 2 4 6 8 C D 5 6 b rig h tC D 1 6 - IF N -  (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s B ) P ro life ra tiv a p = 0 ,0 1 0 1 n = 5 n = 8 E D T C T R 0 2 4 6 8 1 0 2 0 3 0 C D 5 6 b rig h tC D 1 6 - IF N -  (s e m e s tím u lo ) % d e c é lu la s p = 0 ,0 0 4 C ) S e c re to ra n = 1 1 n = 7 Figura 47. Frequência de expressão (%) de IFN -y em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e contro les, nas diferentes fases do ciclo menstrual, na condição basal de cultura, sem estímulo. A e B) fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); C) fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; linha pontilhada: indica o valor de zero de % de células; as barras horizontais representam as medianas da porcentagem de expressão de IFN -y em cada grupo de estudo, para a subpopulação celular específica; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 4.4.5.2 Expressão das moléculas e fases do ciclo: estímulo com células K562 Todas as comparações entre os grupos foram feitas pelo teste estatístico de Mann- Whitney) (Figura 48 e Anexo X, Tabela 9). ► Grupo CTR: • CD107a: não foi observada diferença, tanto para % de células como para intensidade de expressão, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo. • IFN-y: não foi observada diferença, tanto para % de células como para intensidade de expressão, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo. • IL-10:% de células CD56 dimCD16: proliferativa > secretora (p= 0,0281). Não houve diferença para a intensidade de expressão. ► Grupo EDT: • CD107a: não foi observada diferença, tanto para % de células como para intensidade de expressão, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo. • -IFN-y: não foi observada diferença, tanto para % de células como para intensidade de expressão, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo. • IL-10:% de células CD56 dim: proliferativa > secretora (p= 0,0302) Não houve diferença para a intensidade de expressão (semelhante ao observado no grupo CTR). 143 p ro life ra tiv a s e c re to ra -2 0 -1 0 0 1 0 2 0 IF N -  (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s n = 8 n = 1 3 A ) p = n s E D T : C D 5 6 d im p ro life ra tiv a s e c re to ra -2 -1 0 1 2 4 IL -1 0 (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s n = 6 n = 1 2 p = 0 ,0 3 0 2 B ) E D T : C D 5 6 d im p ro life ra tiv a s e c re to ra -2 -1 0 1 2 IL 1 0 (e s tím u lo K 5 6 2 ) % d e c é lu la s C T R : C D 5 6 d im C D 1 6 + C ) n = 8 n = 8 p = 0 ,0 2 8 1 Figura 4 8. Frequência da porcentagem (%) de expressão das moléculas IFN-y e IL -10 em subpopulações de células NK circulantes, de mulheres com endometriose e de controles, nas diferentes fases do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo contro le; fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo);estímulo com células K562: valores do estímulo descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o val or basal foi maior do que com estímulo; n: número de amostras avaliadas em cada fase do grupo; linha pontilhada: indica o valor de zero para % de células; as barras horizontais representam as medianas da porcentagem de expressão nas diferentes fases do cic lo menstrual; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. ► Grupo EDT vs grupo CTR: Na análise da % de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10 entre grupos, na condição com estímulo de K562, não foram observadas diferenças significativas, n as diferentes fases do ciclo menstrual (Anexo X, Tabela 10). No entanto, para MFI, foram observadas diferenças para as três moléculas (Figura 49) (os valores de p foram determinados pelo teste de Mann-Whitney). • CD107a: EDT < CTRs, na fase secretora, nas s ubpopulações CD56bright (p=0,0032) e em CD56brightCD16- (p=0,0259) • IFN-y: EDT < CTRs , na fase proliferativa, nas subpopulações CD56 bright (p= 0,019) e CD56brightCD16- (p= 0,0186) • IL-10: EDT < CTRs, na fase proliferativa, em células NK totais (p= 0,0295) 144 E D T C T R 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 S e c re to ra : C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 ) C D 1 0 7 a (M F I) p = 0 ,0 0 3 2 A ) n = 1 2 n = 8 E D T C T R -1 0 0 -5 0 0 2 5 5 0 P ro life ra tiv a : C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 ) IF N -  ( M F I) p = 0 ,0 1 9 B ) n = 5 n = 9 E D T C T R -1 0 0 -5 0 0 5 0 1 0 0 P ro life ra tiv a : N K to ta is (e s tím u lo K 5 6 2 ) IL -1 0 (M F I) p = 0 ,0 2 9 5 C ) n = 5 n = 8 Figura 49. Comparação da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e control es, nas diferentes fases do ciclo menstrual, na condição com estímulo com células K562. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo ); estímulo com células K562: valores do estímulo descontando-se o valor basal(sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; MFI; mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número de amostras avaliadas em cada grupo; as barras horizontais representam as medianas de MFI de expressão nas diferentes fases do ciclo menstrual; linha pontilhada: indica o valor de zero de MFI; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 4.4.5.3 Expressão das moléculas e fase do ciclo: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA Na presença de bloqueio para a molécula MICA na superfície celular das células K562, observamos poucas mudanças em relação à condição com estímulo apenas com K562, se m bloqueio. (Figura 50 e Anexo X, Tabela 11). Nas análises da % de células com expressão e intensidade da expressão (MFI), entre as fases do ciclo, em cada grupo (EDT e CTR) separadamente, e entre os grupos, observamos: ► Grupo CTR: • CD107a: maior % de células CD56 brightCD16- produtoras de CD107a na fase proliferativa do ciclo (p= 0,0012). Essa diferença não foi encontrada na condição com estímulo com células K562 sem bloqueio. Não foi observada diferença para MFI. • IFN-γ: assim como ocorreu na presença de estímulo com K562, não houve diferença na % de células que expressaram essa citocina, nem na intensidade de expressão (MFI). • IL-10: detectamos maior MFI em células CD56 dimCD16- (p= 0,007) na fase proliferativa do ciclo (mesma diferença já observada na ausência de bloqueio, para % de expressão). 145 ► Grupo EDT: • CD107a: não foi encontrada diferença (% e MFI) para a expressão de CD107a entre as fases do ciclo • IFN-γ: assim como ocorreu na presença de estímulo com K562, não houve diferença na % de células nem na intensidade de expressão (MFI). • IL-10: não foi encontrada diferença (% e MFI) para a expressão de IL -10 entre as fases do ciclo. Na condição de estímulo sem bloqueio, observamos maior % de IL - 10 em CD56dim, na fase proliferativa. A maior % de células CD56dim produtoras de IL-10 na fase proliferativa, na condição de estímulo apenas com K562 (p= 0,0302, Figura 4 8), deixou de existir como estímulo com K562 bloqueadas para MICA de superfície (p= 0,4936) (Figura 50). p ro life ra tiv a s e c re to ra -5 0 5 2 0 4 0 6 0 C D 1 0 7 a (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) % d e c é lu la s C T R : C D 5 6 b rig h tC D 1 6 -A ) p = 0 ,0 0 0 1 2 n = 7 n = 6 p ro life ra tiv a s e c re to ra -4 0 -2 0 0 2 0 4 0 IL -1 0 (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) M F I B ) C T R : C D 5 6 d im C D 1 6 - n = 7 n = 7 p = 0 ,0 0 7 p ro life ra tiv a s e c re to ra -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 % d e c é lu la s C ) E D T : C D 5 6 d im IL -1 0 (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) n = 6 n = 1 2 p = n s Figura 50. Porcentagem (%) de células com expressão de CD107a e IL -10 e intensidade de expressão de IL -10, em subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose e em controles, em diferentes fases do ciclo menstrual, na condição de estí mulo com células K562 bloqueadas para MICA. A e B) grupo controle (CTR), C) grupo endometriose (EDT); fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo com células K562BLOQ : K562 bloqueada para a proteína MICA - valores descontando-se o valor basal(sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo ; MFI; mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número de amostras avaliadas em cada fase do ciclo; as barras horizontais representam as medianas da porcentagem de expressão ou de MFI, nas diferentes fases do ciclo menstrual; linha pontilhada: indica o valor de zero para % ou MFI; ns; valor de p não significante ( p≥ 0,05 ), valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. ► Grupo EDT vs grupo CTR: Na análise comparativa entre os grupos, na condição de bloqueio para MICA, observamos diferenças para as três moléculas envolvidas na atividade efetora e imunorreguladora de células NK (Figura 51 e Anexo X, Tabela 12). Para todas as análises utilizamos o teste não paramétrico de Mann-Whitney. • CD107a: foi mantida a mesma diferença de menor intensidade de expressão de CD107a na EDT em comparação com o grupo CTR, na fase secretora, 146 na subpopulação CD56 bright (p= 0,0336), previamente observada na condição sem bloqueio (p= 0,0032, Figura 49). Foi perdida a diferença encontrada na condição sem bloqueio , de menor intensidade de expressão de CD107a, na EDT, na fase secreto ra do ciclo, na subpopulação CD56brightCD16- (p= 0, 0754). • IFN-γ: as diferenças ocorreram apenas para MFI, assim como observamos para a condição sem bloqueio. Observamos menor intensidade de expressão na EDT do que no grupo CTR, na fase proliferativa do c iclo em células: NK totais ( p= 0,001), CD56dim (p= 0,0021), CD56dimCD16- (p= 0,0033), CD56bright (p= 0,0013), CD56brightCD16- (p= 0,0051). As diferenças observadas de expressão de IFN-γ para as subpopulações CD56 bright e CD56brightCD16-, previamente descri tas com o estímulo com K562 sem bloqueio (Anexo X, Tabela 10), não foram alteradas na condição de estímulo com bloqueio para MICA. • IL-10: menor intensidade de expressão em CD56 dimCD16- (p= 0,0385), na EDT, na fase proliferativa. Ressaltamos que a difere nça, previamente observada de menor intensidade de expressão para IL -10 na EDT, com estímulo sem bloqueio (em NK totais, p= 0,0295), deixou de existir na presença de estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA ( p= 0,0730, teste de Mann-Whitney) (Anexo X, Tabela 12). O balanço das principais diferenças das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e suas intensidades de expressão, entre os grupos EDT e CTR, e relação com as fases do ciclo menstrual, está apresentado na Tabela 22. 147 E D T C T R -4 0 -2 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 S e c re to ra : C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) C D 1 0 7 a (M F I) p = 0 ,0 3 3 6 A ) n = 9 n = 9 E D T C T R -1 0 0 -5 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 S e c re to ra : C D 5 6 b rig h tC D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) C D 1 0 7 a (M F I) B ) p = n s n = 1 1 n = 8 E D T C T R -1 0 0 -5 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 P ro life ra tiv a : C D 5 6 dim (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) IF N g (M F I) p = 0 ,0 0 2 1 C ) n = 8 n = 1 0 E D T C T R -1 0 0 -8 0 -6 0 -2 0 0 2 0 4 0 P ro life ra tiv a : C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) IF N g (M F I) p = 0 ,0 0 1 3 D ) n = 6 n = 8 E D T C T R -6 0 -4 0 -2 0 0 2 0 4 0 P ro life ra tiv a : C D 5 6 dim C D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) IL -1 0 (M F I) E ) p = 0 ,0 3 8 5 n = 6 n = 7 E D T C T R -1 0 0 -5 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 P ro life ra tiv a : N K to ta is (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q ) IL -1 0 (M F I) F ) p = 0 ,0 7 3 (n s ) n = 5 n = 6 Figura 51. Intensidade de expressão das moléculas CD107a , IFN-y ou IL-10 em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, em diferentes fases do ciclo menstrual, na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA – valores descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo ; MFI; mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número de amostras avaliadas em cada grupo; as barras horizontais representam as medianas de MFI nos d iferentes grupos; linha pontilhada: indica o valor de zero para MFI; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann- Whitney. 148 Tabela 22. Balanço das principais diferenças das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10, e suas intensidades de expressão , entre os grupos endometriose e controles, e relação com a fase do ciclo menstrual. Prolif. Prolif. CD107a EDT ≈ CTR CD107a EDT ≈ CTR IFN-γ IFN-γ EDT ≈ CTR CD56dim EDT > CTR CD56brightCD16- EDT > CTR CD56brightCD16- EDT > CTR IL-10 EDT ≈ CTR IL-10 EDT ≈ CTR Prolif. Prolif. CD107a EDT ≈ CTR CD107a EDT ≈ CTR CD56bright EDT < CTR CD56brightCD16- EDT < CTR IFN-γ EDT ≈ CTR IFN-γ EDT ≈ CTR CD56bright EDT < CTR CD56brightCD16- EDT < CTR IL-10 EDT ≈ CTR IL-10 EDT ≈ CTR NK totais EDT < CTR Prolif. Prolif. CD107a EDT ≈ CTR CD107a EDT ≈ CTR CD56bright EDT < CTR IFN-γ EDT ≈ CTR IFN-γ CD56dim EDT < CTR CD56dimCD16- EDT < CTR CD56bright EDT < CTR CD56brightCD16- EDT < CTR IL-10 EDT ≈ CTR IL-10 CD56dimCD16- EDT < CTR EDT ≈ CTR EDT ≈ CTREDT ≈ CTR MFI% % % MFI MFI EDT ≈ CTR EDT ≈ CTR Secret. Secret. EDT ≈ CTR EDT ≈ CTR Secret. EDT ≈ CTR EDT ≈ CTR Secret. Estímulo com K562BLOQ Estímulo com K562 Secret. Secret. EDT ≈ CTR EDT ≈ CTR EDT ≈ CTR EDT ≈ CTR Condição basal de cultura, sem estímulo EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Prolif: fase proliferativa do ciclo menstrual ( 1º ao 14º dia do ciclo); Secret: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; em vermelho: valores do grupo considerados ma iores, na comparação entre os grupos analisados; em azul: valores do grupo considerados menores, na comparação entre os grupos analisados;≈: resultados semelhantes. Resumo: Na condição basal de cultura, sem estímulo, mulheres com EDT apresentaram maior frequência de células produtoras de IFN -γ na fase proliferativa/estrogênica. No entanto, na presença de estímulo, com e sem bloqueio de MICA, a frequência de células produtoras de IFN-γ tornaram-se semelhantes aos controles saudáveis. Porém, na presença de estímulo com células K562, a intensidade de expressão de IFN -γ e IL -10 passaram a ser menores na EDT do que em controles. Essa diferença foi observada em um maior número de subpopulações NK, principalmente para IFN-γ, quando na presença de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. 149 4.4.6 Citotoxicidade pelas células NK A capacidade citotóxica (CTX) de células NK circulantes, no grupo de mulheres com EDT (n=21) e em mulheres controles saudáveis (n=20), foi avaliada pela % de morte de células K562 e de células K562 bloqueadas para a molécula MICA, representa ndo a presença de MICA solúvel. A % de células K562 e de K562 bloqueadas para MICA com expressão de MICA foi analisada em cada data do ensaio CTX, uma vez que nem todas as PBMCs foram testadas para a sua capacidade citotóxica no mesmo dia. A mediana da frequência de células K562 marcadas com o corante fluorescente CFSE (K562*CFSE) e positivas para a expressão de MICA foi de 51,5% e, em células K562*CFSE e bloqueadas para MICA (K562*CFSEBLOQ) foi de 28,8%, correspondendo a uma mediana de bloqueio de MICA de 39,8% (Anexo XI, Tabela 15). Apesar de ainda considerado como baixo bloqueio, seu o impacto para a intensidade de expressão (MFI) foi considerado equivalente ao da frequência de expressão de MICA, 3 2,6%, considerando-se a mediana de intensidade de expressão (MFI) pré -bloqueio de 1914 e, pós - bloqueio, de 1114 (Anexo X, Tabela 13). 4.4.6.1 Citotoxicidade contra células K562 sem bloqueio e com bloqueio para MICA. A análise comparativa da CTX entre os grupos (EDT e CTR) foi analisada nas condições de CTX contra as células K562 sem e com bloqueio para MICA (teste de Mann- Whitney) (Figura 52). • CTX contra K562 sem bloqueio: ► Grupo EDT vs grupo CTR: CTX EDT < CTX CTRs (medianas: 7,7% vs 11,5%, p= 0,0144) • CTX contra K562 bloqueadas para MICA: ► Grupo EDT vs grupo CTR: CTX EDT < CTX CTR (medianas 5,9% vs 12,45%, p= 0,0259) 150 E D T C T R 0 2 0 4 0 6 0 % d e m o rte p = 0 ,0 1 4 4 n = 2 1 n = 2 0 A ) a lv o : c é lu la s K 5 6 2 E D T C T R 0 2 0 4 0 6 0 a lv o : c é lu la s K 5 6 2 B L O Q % d e m o rte p = 0 ,0 2 5 9 n = 2 1 n = 2 0 B ) Figura 5 2. Comparações da citotoxicidade (CTX) pelas células NK circulantes entre mulheres com endometriose e controles. A) CTX contra células K562 ; B) CTX contra células K562 bloqueadas para a proteína MICA (K562BLOQ); valores de CTX contra K56 2 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; linha pontilhada: valor zero de % de células mortas; as ba rras horizontais representam as medianas nos diferentes grupos; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. Cada grupo de estudo, CTR e EDT, foi também analisado de forma pareada, para as condições de CTX contra células K562 sem e com o bloquei o da proteína MICA na superfície celular (teste de Wilcoxon) (Figura 53). ► Grupo CTR: não houve diferença na CTX contra células K562, sem e com o ‘bloqueio de MICA No grupo CTR, a mediana de % de CTX contra células K562 foi de 11,5 % (0,5% - 35,2%) e contra células K562BLOQ foi de 12,5% (0,5%- 34,9%) (p= 0,4524) ► Grupo EDT: não houve diferença na CTX contra células K562, sem e com o bloqueio de MICA No grupo EDT, a mediana de frequência de CTX contra K562 foi 7,7% ( -1,6%- 29,1%) e contra células K562BLOQ foi de 5,9% (-4,7%- 55,4%) (p= 0,3784) Ressaltamos que, de forma geral, com o bloqueio da molécula MICA tivemos modificação em relação à condição sem bloqueio. Os resultados da CTX de células K562 e de K562BLOQ, frente a cada amostra estudada, e a % de bloqueio de MICA correspondente, para cada experimento, estão apresentados no Anexo X, Tabela 14. 151 K 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q 0 2 0 4 0 6 0 C T R % d e m o rte p = n s A ) n = 2 0 K 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q 0 2 0 4 0 6 0 E D T % d e m o rte p = n s B ) n = 2 1 Figura 5 3. Citotoxicidade pelas células NK circulantes de mulheres com endometriose e de controles, contra células K562 e K562 bloqueadas para MICA. A) CTR: grupo controle; B) EDT: grupo endometriose; K562BLOQ células K562 bloqueadas para MICA; valores de CTX contra K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; ns: va lor de p não significante (p≥ 0,05 ); linha pontilhada: valor zero de % de morte; valor de p determinado pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. 4.4.6.2 Citotoxicidade e relação com os estádios da endometriose i) Análise da CTX contra células alvo K562, antes e após o bloqueio para MICA O bloqueio levou a uma diminuição significante da porcentagem de CTX nos estádios iniciais da doença (med 5,1%, -4,7-12,9, min-max), em relação à CTX contra K562 sem bloqueio (med 10,3%, 1,8 - 21,3, min-max) (p= 0,0313, teste de Wilcoxon). No entanto, o bloqueio de MICA não induziu diferença na CTX dos estádios avançados da doença (K562: med 7,4%, -1,6-29,1, min-max; K562BLOQ: med 7%, -1,2-55,4, min-max; p= 0,4322, teste de Wilcoxon) (Figura 54). K 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q 0 1 0 2 0 3 0 E D T in ic ia l (I/II) C T X (% ) A ) p = 0 ,0 3 1 3 n = 9 K 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q 0 1 0 2 0 3 0 4 0 6 0 E D T a v a n ç a d a (III/IV ) C T X (% ) B ) p = n s n = 1 2 Figura 5 4. Citotoxicidade pelas células NK circulantes frente a células K562 e células K562 bloqueadas para MICA, nos diferentes estádios da endometriose. EDT: grupo endometriose; K562BLOQ: células bloqueadas para a proteína MICA; I/II, estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; A) mulheres com EDT em estádios iniciais; B) mulheres com EDT em estádios avançado; valores de % de morte de K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo , linha pontilhada: valor zero de % de células mortas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05 ); citotoxicidade avaliad a por porcentagem (%) de morte de células K562; valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. 152 ii) Análise da CTX contra células alvo K562 entre mulheres em estádios iniciais e avançados da EDT, e o grupo CTR. A CTX contra célul as K562 não mostrou diferença na comparação entre estádios iniciais (10,3%, 1,8 - 21,30) e avançados da doença (7,35%, -1,6 - 29,1) (p= 0,6885, teste de Mann-Whitney). O mesmo foi observado entre mulheres em estádios iniciais em comparação com CTRs saudáve is ( 11,5%, 0,5 –35,2) ( p= 0,1792, teste de Mann-Whitney). No entanto, observamos que mulheres com EDT avançada apresentaram menor CTX (7,35%, -1,6 - 29,1) em relação ao grupo CTR saudável (11,5%, 0,5–35,2) (p= 0,0115, teste de Mann-Whitney) (Figura 55). iii) Análise da CTX contra células alvo K562 bloqueadas para MICA, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da EDT, e o grupo CTR A CTX contra células K562BLOQ também não mostrou diferença na comparação entre estádios iniciais (med 5,1%, -4,7-12,9, min-max) e avançados da EDT (med 7,0%, -1,2-55,4, min-max) (p= 0,4322, teste de Mann-Whitney). Mulheres com EDT avançada (med 7,0%, -1,2- 55,4, min-max) também não apresentaram diferença em relação à CTX de CTRs saudáveis (med 12,5%, 0,5 -34,9, min -max) na compa ração com bloqueio ( p= 0,1725, teste de Mann- Whitney). Diferentemente da CTX contra células K562 sem bloqueio, a CTX contra células K562BLOQ foi menor na EDT inicial (med 5,1%, -4,7-12,9, min-max), em relação aos CTRs saudáveis (med 12,5%,0,5-34,9, min-max) (p= 0,0181, teste de Mann-Whitney (Figura 55). I / II III /IV C T R -5 0 5 1 0 1 5 2 0 4 0 6 0 % d e m o rte c o n tra c é lu la s K 5 6 2 p = 0 ,0 1 1 5 n = 9 n = 1 2 n = 2 0 A ) I / II III /IV C T R -5 0 5 1 0 1 5 2 0 4 0 6 0 % d e m o rte c o n tra c é lu la s K 5 6 2 B L O Q p = 0 ,0 1 8 1 n = 9 n = 1 2 n = 2 0 B ) Figura 5 5. Citotoxicidade pelas células NK circulantes de mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e de controles. A) CTX contra células K562; B) CTX contra células K562 bloqueadas para MICA; CTX: citotoxicidade; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; CTR: grupo controle; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; valores de CTX contra células K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; linha pontilhada: valor zero de % de células mortas; citotoxicidade avaliada por porcentagem (%) de morte de células K562; as barras horizontais representam as medianas nos diferentes grupos; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 153 4.4.6.3 Citotoxicidade e análise de correlação com níveis de MICA solúvel A CTX (% de morte) induzida pelas células NK circulantes contra células K562, e células K562 com bloqueio para MICA, foi avaliada em relação à variação dos níveis de MICA solúvel (sMICA) (sistêmico, soro, e no microambiente da lesão, fluido peritoneal - FP). Não observamos correlação entre a % de morte de células K562 e níveis de sMICA, tanto no soro como no FP, em nenhum grupo de estudo (CTR: soro, r=0,02, p= 0,9511 e FP, r= -0,2, p= 0,3609; EDT: soro, r= 0,04, p= 0,8769 e FP, r= 0,2, p= 0,4806) (teste de correlação de Spearman) (Anexo X, Figura 1). De forma semelhante ao encontrado para a condição contra K562 sem bloqueio, a CTX contra células K562 bloqueadas para a proteína MICA também não mostrou correlação com níveis de sMICA no soro e no FP, em ambos os grupos (CTR: soro, r=0,03, p= 0,8833 e FP, r= -0,02, p= 0,9170; EDT: soro, r=0,1, p= 0,6807 e FP, r= -0,5, p= 0,0538) (teste de correlação de Spearman) (Anexo X, Figura 2). Uma vez que os níveis de sMICA foram, neste estudo, descritos como maiore s na EDT avançada (Resultados, item 4.3), avaliamos também se houve correlação entre a citotoxicidade contra as células K562, e contra células K562 bloqueadas para MICA, e os níveis de sMICA (soro e FP) em mulheres com EDT, estratificadas para os estádios da doença. Não foram observadas diferenças significativas para a correlação entre a CTX e sMICA (soro e FP), tanto nos estádios iniciais como avançados da doença ( p= ns, teste de correlação de Spearman) (Anexo XI, Tabela 15). 4.4.6.4 Citotoxicidade e relação com as fases do ciclo menstrual i) Nos grupos EDT e CTR, frente a células K562 com e sem bloqueio de MICA Tanto na fase proliferativa como na fase secretora, ambos os grupos não apresentaram diferença na CTX (% de morte), antes (K562) e após o bloqu eio de MICA(K562BLOQ). Os valores de p foram determinados pelo teste de Wilcoxon (Figura 56). • Fase proliferativa: ► Grupo CTR: a mediana de % de morte contra células K 562 foi de 16,6% (2,7 -35,2, min-max) e, contra células K562BLOQ foi de 13,2% (2,0-27,7, min-max) (p= 0,1934) ► Grupo EDT: a mediana de CTX cont ra K562 foi 6,3% (1,8 -10,3, min-max) e, contra células K562BLOQ foi de 4,5% (-4,7-26,3, min-max) (p> 0,9999) 154 • Fase secretora: ► Grupo CTR: a mediana de % de morte de K562 foi de 10,1% (0,5-19,0, min-max) e, conta células K562BLOQ, foi de 11,75% (0,5-34,9, min-max) (p= 0,6175) ► Grupo EDT: a mediana de CTX contra K562 foi de 9,4% (-1,6-9,4, min-max) e, contra células K562BLOQ foi de 7,8% (-1,2-55,4, min-max) (p= 0,2036) K 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q 0 1 0 2 0 3 0 4 0 C T R : p ro life ra tiv a (n = 1 0 ) % d e m o rte A ) p = n s K 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q 0 1 0 2 0 3 0 4 0 C T R : s e c re to ra (n = 1 0 ) % d e m o rte B ) p = n s K 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q 0 1 0 2 0 3 0 E D T : p ro life ra tiv a (n = 8 ) % d e m o rte C ) p = n s K 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q 0 1 0 2 0 3 0 4 0 6 0 E D T : s e c re to ra (n = 1 3 ) % d e m o rte D ) p = n s Figura 56. Porcentagem (%) de morte de células K562 e células K562 após o bloqueio da proteína MICA, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, em mulheres com endometriose e controles. CTR: grupo controle; EDT: grupo endometriose; K562BLOQ: células K562 boqueadas para MICA; valores de CTX contra células K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; linha pontilhada: valor zero de % de células mortas; citotoxicidade avaliada por porcentagem (%) de morte de células K562; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. ii) Entre grupos, EDT e CTRs, frente a células K562 com e sem bloqueio de MICA Os valores de p das análises comparativas entre os grupos foram determinados pelo teste de Mann-Whitney. • Fase proliferativa: Mulheres com EDT apresentaram menor % de morte (CTX) contra células K562 (que expressam MICA) (6,3%, 1,8 -10,3) em relação às mulheres CTRs (16,6%, 2,7 -35,2, min- max) (p= 0,0044) (Figura 5 7). No entanto, para CTX contra cé lulas K562BLOQ não houve diferença entre o grupo EDT (4,5%, -4,7-26,3, min-max) e o grupo CTR (13,2%, 2,0-27,7, min-max) (p= 0,1799). 155 • Fase secretora: Não houve diferença entre os grupos estudados. Mulheres com EDT apresentaram mediana de % de morte, CTX, contra células K562 de 9,4% ( -1,6-29,1, min-max), semelhante à de mulheres CTRs, 10,1% (0,5 -19,0, min -max) ( p= 0,6814). Para a CTX contra células K562BLOQ, o grupo EDT apresentou mediana de 7,7% (-1,2-55,4, min-max) e, no grupo CTR, de 11,75% (0,5-34,9, min-max) (p= 0,2139) (Figura 57). E D T C T R 0 1 0 2 0 3 0 4 0 P ro life ra tiv a m o rte K 5 6 2 (% ) p = 0 ,0 0 4 4 n = 8 n = 1 0 A ) E D T C T R 0 1 0 2 0 3 0 4 0 P ro life ra tiv a m o rte K 5 6 2 B L O Q (% ) p = n s n = 8 n = 1 0 B ) E D T C T R 0 1 0 2 0 3 0 4 0 S e c re to ra m o rte K 5 6 2 (% ) C ) n = 1 3 n = 1 0 p = n s E D T C T R 0 1 0 2 0 3 0 4 0 6 0 S e c re to ra m o rte K 5 6 2 B L O Q (% ) D ) p = n s n = 1 3 n = 1 0 Figura 57. Comparações da frequência de morte de células K562 com e sem bloqueio da proteína MICA, nas f ases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, entre os grupos de mulheres com endometriose e controles. A e C) citotoxicidade frente a células K562; B e D) citotoxicidade frente a células K562 bloqueadas para MICA; CTR: grupo controle; EDT: grupo endo metriose; CTX: citotoxicidade; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; valores de CTX contra células K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estím ulo; linha pontilhada: valor zero de % de células mortas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); as barras horizontais representam as medianas nos diferentes grupos; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. iii) Citotoxicidade entre as fases do ciclo menstrual, na EDT e CTRs, frente às células K562 com e sem bloqueio de MICA A comparação da CTX entre as diferentes fases do ciclo, tanto o grupo EDT como o grupo CTR, não mostrou diferença frente a células K562 e frente a células K562 bloqueada s para MICA. Os valores de p foram determinados pelo teste de Mann-Whitney (Figura 58). 156 • CTX contra células K562: ► Grupo CTR: a mediana de % de morte na fase proliferativa foi de 16,6% (2,7 -35,2, min-max) e, na fase secretora, de 10,1% (0,5-19,0, min-max) (p=0,1230) ► Grupo EDT: a mediana da % de morte na fase proliferativa foi de 6,3%, (1,8 -10,3, min-max) e, na fase secretora, de 9,4% (-1,6-29,1, min-max) (p=0,1688) • CTX contra células K562BLOQ: ► Grupo CTR: mediana de % de morte na fase proliferativa foi de 13,2 % (2,0 -27,7, min-max) e, na fase secretora, de 10,5% (0,5-19,0, min-max) (p=0,4224) ► Grupo EDT: a mediana de % morte na fase proliferativa foi de 4,5 % ( -4,7-26,3, min- max) e, na fase secretora, de 7,7% (-1,2-55,4, min-max) (p=0,3638) p ro life ra tiv a s e c re to ra 0 1 0 2 0 3 0 4 0 C T R % d e m o rte K 5 6 2 p = n s n = 1 0 n = 1 0 A ) p ro life ra tiv a s e c re to ra 0 1 0 2 0 3 0 4 0 C T R % d e m o rte K 5 6 2 B L O Q p = n s B ) n = 1 0 n = 1 0 p ro life ra tiv a s e c re to ra 0 1 0 2 0 3 0 4 0 E D T % d e m o rte K 5 6 2 C ) n = 8 n = 1 3 p = n s p ro life ra tiv a s e c re to ra 0 1 0 2 0 3 0 4 0 6 0 E D T % d e m o rte K 5 6 2 B L O Q D ) p = n s n = 8 n = 1 3 Figura 58. Comparações da frequência de morte de células K562, e de células K562BLOQ, entre as diferentes fases do ciclo, no grupo de mulheres com endometriose e controles. A e C) citotoxicidade frente a células K562 ; B e D) citotoxicidade frente a células K56 2 bloqueadas para MICA; CTR: grupo controle; EDT: grupo endometriose; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; valores de CTX contra células K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de mort e espontânea foi maior do que com estímulo ; linha pontilhada: valor zero de % de células mortas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05 ); as barras horizontais representam as medianas nos diferentes grupos; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 157 4.4.6.5 Análise de correlação entre citotoxicidade induzida pelas células NK e a expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 A análise de correlação de CTX de células NK foi feita em relação à frequência de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, em células NK e subpopulações, e suas intensidades de expressão (MFI), frente a células K562 e a frente células K562 bloqueadas para MICA. Os valores de r e p foram determinados pelo teste de correlação de Spearman. • CTX contra células K562 vs CD107a, IFN-y ou IL-10 As únicas correlações observadas foram em relação à molécula CD107a, em ambos os grupos, EDT e CTR: ► Grupo CTR: tivemos correlações positivas entre CTX e a % de células CD56 bright (r= 0,5, p= 0,0397) e CD56 brightCD16- (r= 0,8, p= 0,001) e entre CTX e intensidade de expressão de CD107a em células CD56dim (r= 0,5, p= 0,0405) (Tabela 23A): ► Grupo EDT: somente observamos correlação positiva de CTX com intensidade de expressão de CD107a na subpopulação CD56dimCD16- (r= 0,5, p= 0,0474) Tabela 24A): Chama a atenção que a correlação da CTX com % de CD107a para o grupo CTR foi apenas para células com p resença da molécula CD56 bright. Para MFI, em ambos os grupos, a correlação foi para células com baixa expressão da molécula CD56dim. • CTX contra células K562 bloqueadas para MICA vs CD107a, IFN-y ou IL-10 No ensaio de CTX tendo como célula alvo K562 bloqueadas para MICA, houve perda de todas as correlações para CD107a (frequência e MFI), tanto na EDT como em CTRs (Tabela 23B). Para IFN-γ e IL -10, no grupo CTR, foram mantidas as ausências de correlações com CTX. No entanto, na EDT, diferentemente do estímulo de células NK com K562 sem bloqueio, no ensaio de CTX com células K562 bloqueadas para MICA surgiram correlações positivas da CTX com intensidade de expressão de IFN -γ (r= 0,5, p= 0,0478) e com a % de expressão de IL-10 (r= 0,6, p= 0,0135), ambas para células CD56dimCD16- (Tabela 24B). 158 Tabela 23. Análise de correlação entre a citotoxicidade contra células K562 e K562 bloqueadas para MICA, com a frequência ou intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, em mulheres do grupo controle. A) CTX contra células K562 no grupo controle CTR (n) p r (n) p r (n) p r NK totais 19 ns ns 19 ns ns 15 ns ns CD566dim 19 ns ns 19 ns ns 15 ns ns Cd56bright 16 0,0397 0,5 16 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16- 18 ns ns 18 ns ns 14 ns ns CD56brightCD16+ 8 ns ns 8 ns ns 7 ns ns CD56brightCD16- 16 0,0010 0,8 14 ns ns 12 ns ns CTR (n) p r (n) p r (n) p r NK totais 19 ns ns 19 ns ns 15 ns ns CD566dim 19 0,0405 0,5 19 ns ns 13 ns ns Cd56bright 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16- 18 ns ns 18 ns ns 14 ns ns CD56brightCD16+ 8 ns ns 8 ns ns 7 ns ns CD56brightCD16- 16 ns ns 14 ns ns 12 ns ns Subpopulações Subpopulações Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX Estímulo com K562 (frequência de expressão, % ) CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX B) CTX contra células K562BLOQ no grupo controle CTR (n) p r (n) p r (n) p r NK totais 18 ns ns 18 ns ns 13 ns ns CD566dim 18 ns ns 18 ns ns 13 ns ns Cd56bright 16 ns ns 16 ns ns 12 ns ns CD56dimCD16+ 16 ns ns 16 ns ns 12 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 13 ns ns CD56brightCD16+ 7 ns ns 7 ns ns 5 ns ns CD56brightCD16- 14 ns ns 13 ns ns 10 ns ns CTR (n) p r (n) p r (n) p r NK totais 18 ns ns 18 ns ns 13 ns ns CD566dim 18 ns ns 18 ns ns 13 ns ns Cd56bright 16 ns ns 16 ns ns 12 ns ns CD56dimCD16+ 16 ns ns 16 ns ns 12 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 13 ns ns CD56brightCD16+ 7 ns ns 7 ns ns 5 ns ns CD56brightCD16- 14 ns ns 13 ns ns 10 ns ns Subpopulações Subpopulações IL-10 x CTX CD107a x CTX IFN-γ x CTX Estímulo com K562BLOQ (frequência de expressão, % ) CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de inten sidade de fluorescência (intensidade de expressão); K562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína MICA; n: número de pares de dados analisados para cada subpopulação; as análises foram realizadas a partir de valores da mediana de porcentagem de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10 e de suas MFIs, nas diferentes subpopulações de NK; ns: não significante (p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes (p<0,05) e respectivos valores de r; valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 159 Tabela 24. Análise de correlação entre a citotoxicidade contra células K562 e K562 bloqueadas para MICA , com a frequência ou intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, em mulheres com endometriose. A) CTX contra células K562 no grupo endometriose EDT (n) p r (n) p r (n) p r NK totais 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns CD566dim 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns Cd56bright 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 ns ns 4 ns ns 4 ns ns CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns EDT (n) p r (n) p r (n) p r NK totais 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns CD566dim 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns Cd56bright 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 0,0474 0,5 20 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 ns ns 4 ns ns 4 ns ns CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns Subpopulações Subpopulações CD107a x CTX IFN-γ x CTX CD107a x CTX IFN-γ x CTX Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) IL-10 x CTX Estímulo com K562 (frequência de expressão, % ) IL-10 x CTX B) CTX contra células K562BLOQ no grupo endometriose EDT (n) p r (n) p r (n) p r NK totais 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns CD566dim 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns Cd56bright 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 17 0,0135 0,6 CD56brightCD16+ 4 ns ns 4 ns ns 4 ns ns CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns EDT (n) p r (n) p r (n) p r NK totais 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns CD566dim 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns Cd56bright 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 0,0478 0,5 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 ns ns 4 ns ns 4 ns ns CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns Subpopulações Subpopulações Estímulo com K562BLOQ (frequência de expressão, % ) Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX EDT: grupo endometriose; NK totais : incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); K562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína MICA; n: número de pares de dado s analisados para cada subpopulação; em negrito: valores de p significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r; as análises foram realizadas a partir de valores da mediana de porcentagem de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 e de s uas MFIs, nas diferentes subpopulações de NK; ns: não significante (p≥ 0,05 ; valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. ____________________________________________________DISCUSSÃO 161 5. DISCUSSÃO Os resultados deste estudo corroboram nossa hipótese do papel da molécula MICA na fisiopatologia da endometriose e que MICA solúvel pode contribuir para a deficiência da atividade citotóxica de células NK, na doença. Como balanço geral, nossos dados mostraram que o endométrio eutópico de mulheres com EDT apresentam u ma maior frequência de alta expressão da proteína MICA em contraste ao endométrio saudável, indicando já haver alterações imunológicas de células endometriais, com envolvimento de MICA, mesmo antes da sua migração e instalação ectópica. Observamos maiores níveis de MICA solúvel, sistêmicos e no microambiente peritoneal, na EDT. Esses níveis foram associados a estádios avançados e a sítios de maior gravidade da doença, sugerindo a participação de MICA solúvel na sua gravidade e, possivelmente, na progressão da doença. Além disso, mulheres com EDT apresentaram menor citotoxicidade pelas células NK, deficiência essa também associada a estádios avançados da doença, em concordância com dados da literatura e indicando a maior deficiência da atividade funcional d e NK, provavelmente, também na progressão da EDT. A menor frequência da subpopulação com propriedade citotóxica, CD56 dimCD16+, soma -se ao achado de menor citotoxicidade na doença. Ademais, a maior expressão do receptor NKG2D nas células NK, apenas nos estádios iniciais da EDT, pode implicar em maior estímulo de ativação das nessas células, em fases mais precoces da doença. Testamos o potencial efeito de MICA solúvel na atividade efetora de células NK, por meio do experimento de bloqueio de MICA, in vitro . O bloqueio de MICA impactou numa menor citotoxicidade comparada ao estímulo sem bloqueio, apenas em mulheres em estádios iniciais da doença, em relação às mulheres saudáveis, sugerindo o envolvimento de MICA solúvel na deficiência da atividade citotóxica de células NK, nos estádios iniciais da doença. No estado basal de cultura, mulhe res com EDT apresentaram maior expressão da citocina inflamatória IFN -γ e da citocina imunorreguladora IL -10, nas células NK, refletindo o estado inflamatório da doença, com impacto nas células NK. A menor de expressão de CD107a, IFN-γ e IL-10 nas células NK e sua menor citotoxicidade, na condição de estímulo, indica haver deficiência na ativação dessas células, na EDT, quando desafiadas com estímulo. A condição de bloqueio para MICA, mimetiz ando o efeito de MICA solúvel, não alterou a expressão das moléculas CD107a, IFN-γ e IL-10, nas células NK, indicando pouco impacto na expressão dessas moléculas, por células NK, nem na EDT nem em mulheres saudáveis, pelo menos in vitro. No entanto, a correlação negativa entre níveis de MICA solúvel ( in vivo) e a expressão de CD107a, apenas na condição de bloqueio de MICA, na EDT, sugere que, in vivo, MICA solúvel pode contribuir para a inibição da degranulação das células NK na doença, prejudicando sua atividade citotóxica. Agora, discutiremos nossos dados de forma mais aprofundada, procurando estabelecer interconexões entre eles, visando melhor interpretação biológica, assim como com a literatura. 162 Com o objetivo de avaliar a potencial participação de MICA na fisiopatologia da EDT, analisamos, incialmente, sua expressão gênica no endométrio eutópico de mulheres com EDT e comparamos com o grupo CTR saudável. Nossos resultados indicaram não haver diferença na expressão gênica de MICA entre os grupos de estudo. Este dado sugere que a expressão gênica de MICA em mulheres com EDT se mantém semelhante à condição fisiológica, a despeito do endométrio dessas mulheres apresentarem diversas alterações, como funções imunológicas e endócrinas, num contexto inflamatório, em relação a mulheres sem doença (Sharpe-Timms, 2001; Ulukus et al., 2006). Mesmo considerando a escassez de estudos analisando a expressão gêni ca e proteica de MICA no endométrio eutópico, na EDT, identificamos um estudo (Xu, 2019) que foi concordante com a ausência de diferença de expressão de mRNA de MICA, aqui observada. A expressão gênica de MICA, nesse estudo, também não indicou diferença em relação ao endométrio ectópico. Nesse sentido, destacamos que, embora consideremos relevante a análise pareada da lesão endometrial para o estudo de expressão gênica de MICA, optamos por não realizar esta análise, devido à dificuldade técnica para a obtenção de tecid o endometrial puro da lesão, não sendo, portanto, uma amostra representativa. Não obstante, quando realizamos uma análise mais refinada, considerando a expressão proteica de MICA no epitélio (simultaneamente, frequência e intensidade de expressão, que denominamos de escore de imunorreatividade - EIR), encontramos uma maior frequência de alta expressão de MICA no epitélio do endométrio eutópico de mulheres com EDT, em relação ao endométrio de mulheres saudáveis. Esse dado sugere que a ocorrência de estímulo prévio nesse endométrio tenha promovido o aumento de expressão da proteína MICA, antes mesmo de seu deslocamento e desenvolvimento ectópico. Tal estímulo pode estar relacionado ao próprio microambiente do endométrio eutópico das mulheres doentes, como já descrito antes, ter maior expressão de VEGF -A, presença de estresse oxidativo, resistência à progesterona, entre outros fatores, caracterizando um microambiente inflamatório (revisado em Brosens et al., 2012). No entanto, permanece em aberto o que desencadeia o processo inflamatório e onde ele se inicia. Assim, em concordância com outras alterações relatadas para o endométrio eutópico de mulheres com EDT, como disfunções imunológicas e endócrinas (Sharpe-Timms, 2001; Ulukus et al., 2006), nossos dados de maior escore de imunorreatividade de MICA, na EDT, também convergem para a interpretação da quebra da homeostase do microambiente uterino. Destacamos que a indução e/ou aumen to da expressão das moléculas MICA, em situação de estresse biológico, pode estar relacionada com a presença de um segmento do promotor gênico semelhante aos do gene da proteína 70 de choque térmico (HSP70), tendo sua expressão regulada por tais elementos (Groh et al., 1996). No contexto da EDT, também é descrito que a proteína HSP70 está mais expressa no endométrio eutópico dessas mulheres, em comparação ao endométrio eutópico de mulheres CTR, sem a doença (Ota et al., 1997; Imamura et al., 2014), e também em relação às lesões ectópicas (Ota et al., 1997). Esses 163 dados colocam a HSP70 como uma p ossível molécula importante na modulação positiva da expressão de MICA, no contexto de estresse celular e da perturbação da homeostase nesse microambiente, na doença. Além disso, a inflamação do endométrio eutópico na EDT está também associada à produção d e radicais livres e a sinais de estresse oxidativo (Agarwal et al., 2008), que também estão associados ao aumento de expressão de MICA, e na sua liberação na forma de exossomas (Hedlund et al., 2011), apoiando nossa interpretação. Ademais, é possível que os maiores escores de imunorreatividade (EIR) para a expressão de MICA no epitélio glandular, em ambos os grupos de estudo, possam também estar relacionados à intensa atividade funcional a ele associado, assim como por uma possível ação autócrina de TGF -β produzido por esse epitélio, e que poderia também contribuir p ara a indução de maior de expressão de MICA (Song et al., 2015). Em alguns estudos sugerem-se o potencial envolv imento de TGF -β na patogênese da EDT, participando na sobrevivência de endométrio ectópico, aument ando a proliferação celular, podendo facilitar a capacidade invasiva do endométrio (Shin-ichi Komiyama et al., 2007) Ainda no que diz respeito à expressão proteica de MICA, esperávamos encontrar maior expressão no endométrio ectópico da lesão, em relação ao eutópico, na EDT. No entanto, apesar de não termos observado essa diferença, não podemos descartar que, em algum momento da evolução da doença, tenha havido uma maior expressão de MICA e, no contexto de intenso processo inflamatório, tenha ocorrido maior liberação na sua forma solúvel, seja por clivagem via MMPs e ADAMs, detectadas em maior expressão na EDT (revisado em Ke et al., 2021), ou via exossomas (Whiteside, 2013). Um estudo da literatura sobre a expressão proteica de MICA na EDT (Xu 2019) indicou, diferentemente do nosso resultado de expressão proteica, ausência de diferença na expressão de MICA entre o endométrio eutópico de mulheres com EDT e o do grupo CTR. Destacamos que essa diferença pode ser devido às diferentes abordagens técnicas utilizadas nos estudos. Ademais, salientamos que, diferentemente dos nossos grupos de estudo (EDT e CTR), a análise de expressão gênica e proteica desse estudo (Xu 2019) foi realizada em endométrios eutópicos de mulheres apenas com EDT ovariana e, no grupo CTR, em endométrio eutópico de mulheres com presença de doença benigna (cisto ovariano), não havendo o parâmetro do endométrio saudável. As mulheres com EDT também tiveram níveis maiores de MICA solúvel (sMICA), tanto sistemicamente (no soro) como no microambiente da lesão (fluido peritoneal), do que mulheres do grupo CTR, indicando haver desregulação da imunobiologia de MICA, na doença. De maneira complementar, analisamos os níveis de sMICA em relação aos estádios e tipos de doença. No entanto, inicialmente, gostaríamos de apontar a vigente discussão, na comunidade científica, sobre quais parâmetros são adequados para avaliar a progressão da doença em mulheres com EDT. Embora haja limitações nos modelos animais disponíveis para EDT, devido à etiopatogenia multifatorial da doença, alguns modelos indicam a ocorrência de 164 progressão da doença (revisado em Bruner-Tran et al., 2018). Após a implantação ectópica de células endometriais, há progressão da lesão, no entanto, não encontramos dados sobre a atividade imunológica nesses modelos . Ademais, dados em mulheres com EDT também sustentam a interpretação de haver progressão da doença . Em estudo avaliando-se a citotoxicidade pré e pós a remoção total, ou parcial, das lesões de EDT avançada (Garzetti et al., 1995), mostrou-se haver manutenção da deficiência de citotoxicidade na EDT, em relação ao grupo controle. A deficiência de citotoxicidade permaneceu onde houv e remoção macroscópica total da lesão, indicando permanência da disfunção imunológica. Salientamos que a avaliação imunológica foi realizada com 4 -8 semanas pós-cirurgia, não sendo possível, portanto, saber se a homeostase imunológica poderia ser resgatada posteriormente. Ademais, destacamos que a avaliação da lesão é macroscópica, não sendo possível excluir a permanência de lesão residual microscópica (Garzetti et al., 1995). Com base nesses dados, interpretamos que a EDT pode cursar com progressão e maior gravidade. Nossos resultados mostraram maiores níveis d e sMICA a partir do estádio II (leve) da doença, sendo mantido nos estádios mais avançados da doença, III (moderado) e IV (grave), tanto no soro, como no FP, em relação ao grupo CTR. Em contraste, não foram observadas diferenças entre os níveis de sMICA de mulheres com EDT que estavam no estádio inicial I (endometriose mínima) e mulheres CTR, sugerindo que os níveis de sMICA, nesse estádio, sejam insuficientes para inibir a atividade citotóxica de células NK, descrita ser pouco comprometida neste estádio da doença (Wilson et al., 1994). Na análise estratificada por estádio, identificamos diferenças, tanto sistemicamente (no soro) como no microambiente peritoneal (FP), entre os estádios I e II, e I e IV. De forma geral, esses resultados indicam uma associação de maiores níveis de sMICA com estádios mais avançados da doença e sugerem que o excesso de sMICA pode contribuir para a progressão da doença. Salientamos que o excesso de sMICA pode contribuir para a internalização/degradação do receptor NKG2D (Groh et al., 2002), via ligação sMICA -NKG2D, e contribuir para a menor atividade efetora de células NK e, consequentemente, para o maior comprometimento na eliminação de células endometriais ectópicas. Ademais, esses dados, especi almente, em relação ao microambiente da lesão (FP), com maiores níveis de sMICA, sustentam a nossa hipótese do potencial envolvimento de MICA, também na forma solúvel, na fisiopatologia da doença e, especialmente em seus estádios avançados. É possível que os maiores níveis de sMICA no FP de mulheres com EDT sejam reflexo do microambiente inflamatório do peritônio dessas mulheres, como relatado ter presença aumentada de células do sistema imune, como macrófagos, células TCD4+, TCD8+ e células NK (Osuga et al., 2011; revisto em Ulukus et al., 2006) e de diversas citocinas inflamatórias (Podgaec et al., 2007; Bellelis et al., 2019). De forma não excludente, d evemos considerar que, ao menos em parte, os maiores níveis de sMICA sejam induzidos pelas citocinas TGF-β e IL-15, bem como por espécies reativas de oxigênio (ROS) e pela ação conjunta de MMPs. Vale destacar que a citocina TGF -β é descrita com maior expressão proteica no epitélio 165 glandular de cistos endometrióticos de mulheres com EDT, em relação a endométrios normais (Komiyama et al., 2007) e que seus níveis, tanto no soro como no FP, foram associados, de forma progressiva, a estádios mais avançados da doença (Pizzo et al., 2002). Além disso, salientamos que TGF -β tem a capacidade de estimular a expressão proteica de MICA, bem como sua liberação na forma solúvel (SONG et al., 2015). Ademais, também a citocina IL-15 é expressa em maiores níveis (mRNA e proteína) no endométrio ectópico (Chegini et al., 2003) e é capaz de induzir a expressão de MICA (Van Audenaerde et al., 2017; Jinushi et al., 2003). Além disso, a IL -15 é o bservada em níveis elevados no FP de mulheres com EDT, quando comparados aos de mulheres CTRs (Chegini et al., 2003; Bellelis et al., 2019). Em relação ao microambiente peritoneal de mulheres com EDT, o aumento de sMICA pode ter ocorrido poster iormente a uma expressão inicial aumentada de MICA de membrana, dentro de um contexto inflamatório continuado (estresse biológico), com liberação sincronizada na sua forma solúvel e, portanto, não mais detectável, como aumentada, nas células endometriais. Também vale a pena apontar que o ferro, proveniente de refluxo menstrual, potencializa a toxicidade de oxigênio e nitrogênio, pela liberação de radicais livres, induzindo dano celular e proliferação (Kumar e Beyopadhyay, 2005). A liberação dos produtos pró - inflamatórios e os sinais de estresse oxidativo gerados por espécies reativas de oxigênio (ROS) podem estimular a expressão de moléculas MICA (Peraldi et al., 2009), amplificando o microambiente inflamatório. As células endometriais aderida s ao peritônio, ou a outras superfícies de órgãos peritoneais, uma vez express ando MICA, poderiam sofrer a ação de MMPs, lev ando à liberação de MICA na forma solúvel, no FP (revisado em Kyama et al., 2003). Depois da ligação ao peritônio, as células endometriais invadem a matriz extracelular, num processo, principalmente, mediado por metaloproteinases. As MMPs são prod uzidas por tecido endometrial eutópico e ectópico e parecem participar de forma ativa no estabelecimento e progressão da doença (revisado em Zhou e Nothnick, 2005). Neste sentido, foi observado que implantes endometrióticos têm alta expressão de diversas MMPs, incluindo MMP2 e MMP9 (revisado em Zhou e Nothnick, 2005), as quais são mediadoras da clivagem de MICA para a forma solúvel (Yang et al., 2014). Ademais, as MMP2/9 têm função imunorreguladora (Lavini- Ramos et al., 2017) e poderiam contribuir para o estado de imunossupressão que ocorre na EDT, especialmente na EDT avançada (Rached et al., 2019). Além do fluido peritoneal, também encontramos maiores níveis de MICA solúvel no soro, na EDT, indicando haver uma repercussão sistêmica da desregulação envolvendo MICA solúvel, concordante com a interconexão entre circulação e microambiente peritoneal (Solass et al., 2016). Isto é, o peritônio consiste em uma camada de células mesoteliais, em uma base de tecido conjuntivo, perfundida com vasos sanguíneos e linfáticos (Solass et al., 2016), de forma que sMICA presente nesse microambiente pode seguir, via circulação sanguínea e ser detectada sistemicamente (no soro). Além disso, o aumento da angiogênese/vascularização, que ocorre nos locais de implante de tecido endometrial (Tariverdian et al., 2007), também 166 pode favorecer a circulação sistêmica dessa proteína. A correlação positiva que encontramos entre os níveis de sMICA no soro e FP, em ambos os grupos de estudo, é concordante com essa interpretação. Destacamos já ter sido relatado, na literatura, que o tratamento de células NK com soro de mulheres com EDT, com altos níveis de sMICA observado no presente estudo , diminui a atividade citotóxica dessas células, de maneira dose dependente, compar ando-se ao tratamento com soro de mulheres sadias (Kanzaki et al., 1992; Tanaka et al., 1992). De forma semelhante, fatores solúveis presentes no sobrenadante de cultura de células estromais de endométrio de mulheres com EDT são capazes de suprimir a ativ idade citotóxica de células NK (Somigliana et al., 1996). Estes achados apoiam o envolvimento de fatores solúveis na deficiência da atividade citotóxica de células NK e reforçam a nossa hipótese do potencial envolvimento de MICA solúvel na fisiopatologia da EDT. De forma semelhante ao g rupo EDT, mas em níveis menores, os níveis de sMICA no microambiente peritoneal (FP) de mulheres CTRs (laqueadura e doença benigna) também foi maior do que os níveis encontrados, sistemicamente, nessas mulheres. Nesse sentido, podemos sugerir que sMICA ten ha papel fisiológico na manutenção da homeostase, inclusive no ambiente peritoneal. Nossos achados de níveis de sMICA, no grupo CTR, estão em concordância com outros estudos que identificaram sMICA no soro mulheres saudáveis (Bargostavan et al., 2016; Arreygue-Garcia et al., 2008). Ademais, a presença de sMICA no FP de mulheres CTR com presença de doença benigna, mas, sem EDT, também foi relatada (González-Foruria et al., 2015). Como acima citado, nosso grupo de mulheres CTRs foi constituído por mulheres saudáveis, provenientes de laqueadura tubária, e de mulheres com doença benigna, mas sem diferença na expressão de sMICA (no soro e FP) entre esses dois grupos, sendo considerado um grupo CTR adequado para o estudo. Outra importante questão analisada neste estudo foi a relação entre os níveis de sMICA e os tipos doença, su perficial, ovariana e doença profunda. A ausência de perfil diferencial dos níveis de sMICA entre os diferentes sítios da doença, sugere que o ambiente inflamatório parece se manter semelhante quanto aos estímulos à expressão de MICA, nos diferentes tipos de doença. Ou seja, nossos resultados nos levam a pensar que a expressão constitutiva de MICA na superfície de células endometrióticas, independentemente do local de acometimento da doença, poderia funcionar como uma fonte contínua de MICA solúvel que, ligando-se ao seu receptor NKG2D, favoreceria a sua internalização e subsequente degradação lisosssomal. Porém, é relevante apontar que, quando comparamos os níveis de sMICA de mulheres com diferentes tipos/sítios de localização da doença, em relação ao grupo CTR, observamos níveis progressivamente maiores, de acordo com os tipos descritos como mais graves da doença (Koninckx et al., 1991; Tosti et al., 2015), a saber: ovariana, doença profunda e doença profunda na presença de doe nça ovariana. Os maiores níveis de sMICA foram ainda identificados no microambiente inflamatório da lesão (fluido peritoneal) em mulheres com acometimento ovariano e profundo. Frente a esse resultado , podemos 167 interpretar que MICA pode estar envolvida na fisiopatologia da doença e associada a contextos inflamatórios progressivos, de acordo com o tipo/localização da doença É interessante apontar que, na doença SUP, considerada a mais leve (Cornillie et al., 1990), não obser vamos níveis diferenciais de sMICA em relação aos CTRs, sugerindo um menor potencial de comprometimento da atividade citotóxica de células NK, mediado, ao menos em parte, pela interação sMICA -NKG2D. Implantes superficiais são considerados estádios iniciais da doença (Cornillie et al., 1990), corroborando nossos resultados de ausência de diferença dos níveis de sMICA (no soro e FP), entre EDT superficial e CTRs. Ressaltamos que, dos 13 casos de doença SUP, em nosso estudo, 1 1 (85%) estavam em estádio I. Considerando esses desfechos, é possível interpretar que os níveis equivalentes de sMICA entre a doença SUP e CTRs levariam a um menor comprometimento na eliminação de células endometrióticas viáveis na cavidade peritoneal, vi a citotoxicidade de células NK e TCD8+. Nossos resultados de maiores níveis de sMICA, especialmente nas doenças consideradas mais graves, reforçam a interpretação da participação de sMICA na fisiopatologia da EDT, e apoiam os dados da literatura de maior c omprometimento da atividade de células NK nas formas mais graves da doença (Oosterlynck et al., 1992; Tanaka et al., 1992; Wilson et al., 1994; Garzetti et al., 1995). Em concordância com nossos resultados, em outro estudo, também foram observados maiores níveis de sMICA no FP de mulheres com EDT, em relação ao grupo CTR , sem a doença (González-Foruria et al., 2015). Neste estudo também observaram que os maiores níveis de sMICA, no FP, estiveram associados à doença profunda, em relação ao grupo CTR . No entanto, diferentemente dos nossos achados, neste estudo, não foi observada diferença em relação à doença OVA. Não obstante, foi concordante quanto aos níveis semelhantes de sMICA entre a doença SUP e CTRs. É importante salientar que, neste estudo, 40% das mulheres, tanto do grupo EDT e como do CTR, estavam em uso de hormônio, o que poderia, por si, gerar um estímulo à expressão de MICA (Basu et al., 2008). Além disso, para a análise dos dados, os autores (González-Foruria et al., 2015) excluíram os níveis de sMICA considerados indete ctáveis, gerando um viés aos resultados encontrados . Salientamos que nesse estudo não foram avaliados os níveis sistêmicos de sMICA (soro). Ademais, diferentemente de nossos achados, em outro estudo (Guo et al., 2016) não se observou diferença na expressão de sMICA no FP de mulheres com EDT profunda e ovariana, em relação às mulheres com doença benigna, tampouco em relação aos estádios da doença. É possível, que neste estudo, os níveis de sMICA observados no grupo CTR, composto apenas por mulheres com doença benigna, não tenha sido possível discriminar uma possível diferença entre os estádios da doença. Salientamos que, apesar de nosso grupo de estudo para avaliação de níveis de sMICA ter sido composto por mulheres sadias provenientes de laqueadura tubária e também de mulheres com doença benigna, não houve diferença significante dos níveis de sMICA entre esses grupos, sendo, portanto, consideramos um grupo controle adequado para este estudo. 168 A despeito das limitações para se avaliar a progressão da endometriose na história natural da doença, frente aos nossos achados, consideramos ser válida a interpretação de que a molécula MICA solúvel possa estar envolvida no processo de progressão/gravidade da EDT. Consideramos que os dados de MICA solúvel, apresentados em nosso estudo, fortalecem a interpretação dessa molécula ter potencial de modular, negativamente, a atividade funcional de células NK, possivelmente, promovendo a diminuição da expressão do receptor NKG2D. Esse mecanismo pode contribuir na ineficiência da eliminação de células endometriais do microambiente peritoneal, por m eio de células NK, facilitando o estabelecimento e desenvolvimento da endometriose Para avaliar se havia uma deficiência quantitativa de células NK, ou de suas subpopulações, contribuindo para a menor da atividade NK descrita na EDT (Oosterlynck et al., 1992; Tanaka et al., 1992), analisamos as porcentagens de tais células circ ulantes, na condição ex vivo . Observamos diferença apenas para a subpopulação CD56 dimCD16+, com menor frequência em mulheres com EDT. Considerando que esta subpopulação é descrita ter maior capacidade citotóxica em relação às células CD56bright e, por expressar o receptor de Fc (FcγRIIIA - CD16), que pode também mediar citotoxicidade dependente de complemento (ADCC) (Cooper et al., 2001b; Vivier et al., 2008), interpretamos que sua menor frequência no sangue periférico possa também contribuir, ao menos em parte, para a deficiência de citotoxicidade pelas células NKs, descrita na doença (Oosterlynck et al., 1992; Wilson et al., 1994). Salientamos que a subpopulação CD56 dimCD16+ compreende, aproximadamente, 90 - 95% do total de células NK circulantes, enquanto a subpopulação CD56brightCD16- NK, com maior propriedade de produção de citocinas, compreende, aproximadamente, 5 –10% do total de células NK circulantes (Vivier et al., 2008). Vale destacar que, a deficiência quantitativa não é global e sim de uma subpopulação de células NK. Além dos dados apresentados, ressaltamos que quando a frequência das subpopulações foi estratificada por estádio, observamos uma menor frequência de células NK totais e, mais u ma vez, das subpopulações CD56 dim e CD56 dim com expressão de CD16 (CD56dimCD16+) em estádios iniciais doença (I e II). Esses resultados sugerem que, além do envolvimento na menor atividade funcional dessas células na EDT, a menor frequência dessas células, com propriedade citotóxica, pode ter envolvimento na progressão da doença. Uma menor frequência em estádios menos graves, poderia somar na disfunção de células NK, dificultando a eliminação de células endometriais ectópicas e facilitando sua implantação e estabelecimento da doença. No entanto, surge a pergunta sobre por que não observamos tal diferença também em estádios avançados? É possível que, com a progressão da doença e maior declínio da capacidade efetora de células NK, como relatado, mesmo sem haver deficiência quantitativa das células NK na EDT avançada, a sua alteração funcional, aliada a outras disfunções imunológicas, componham um cenário desfavorável ao controle do processo inflamatório. 169 Quando comparamos com a literatura, encontramos dados discordantes sobre a frequência de células NK no sangue periférico. Foram observadas tanto porcentagens maiores de células NK (fenótipo CD3 -CD56+CD16+) no sangue periférico de mulheres com EDT profunda de retossigmóide e em estádios avançados (II/IV), em relação a estádios iniciais e ao grupo CTRs, sem EDT (Dias et al., 2012), como também ausência de diferença quantitativa (Ho et al., 1995; Matsuoka et al., 2005) dessas células, na comparação com C TRs, sem a doença. Também para a frequência de células NK, no fluido peritoneal, não há uma homogeneidade de resultados, havendo relatos de maiores porcentagens em estádios iniciais da EDT (Hill et al., 1988) e também ausência d e diferença (Ho et al., 1995), em relação ao grupo CTR, sem a doença. No entanto, a variação quantitativa de células observada entre esses estudos, pode, possivelmente, ser devida a diferenças técnicas na caracterização dessas células, bem como diferentes grupos de estudo. Na análise da expressão do receptor de ativação, NKG2D, observamos um perfil diferencial de maior expressão na EDT, que também f oi associado a estádios iniciais da doença (I/II, gravidade mínima e leve), na subpopulação CD56 brightCD16+, em relação às mulheres CTRs saudáveis. A maior expressão de NKG2D em estádios iniciais, pode ser interpretada como um possível mecanismo que envolv a uma maior ativação de células NK e sua maior mobilização, especialmente no início da doença, possivelmente devida a uma resposta imune mais competente dessas mulheres, por células NK, ao menos, via esse receptor. Em acordo com esta hipótese, sugere -se que mulheres com EDT inicial podem ser imunologicamente mais ativas do que as que estão em estádios mais avançados da doença (Odukoya et al., 1996). Considerando nossos dados, a maior expressão de NKG2D, somada à maior frequência de alta expressão de MICA no en dométrio eutópico de mulheres com EDT, sugere um contexto que favorece a ativação continuada das células NK. A maior ativação de células NK, e mesmo de células TCD8+, que também expressam NKG2D (Pardoll, 2001), pode favorecer a resposta imune inata e adaptativa, via a produção de citocinas inflamatórias e quimiocinas, que medeiam a migração de macrófagos, apresentação antigênica por DCs e ativação de células T, contribuin do para a amplificação do processo inflamatório da doença, mesmo que sem capacidade resolutiva. Em concordância com esta interpretação, em um estudo com modelo experimental de carcinoma hepatocelular em camundongos deficientes para o receptor NKG2D, comparado com camundongos não deficientes (wild type), sugere que a expressão desse receptor pode levar a uma alta produção de citocinas inflamatórias (IFN -γ, IL-6 e IL-12) e acúmulo de células NK, células T natural killer (NKT) e macrófagos (Sheppard et al., 2018). Além disso, uma vez que a ligação MICA solúvel (sMICA) -NKG2D pode resultar na modulação negativa (internalização) de NKG2D, avaliamos também a existência, ou não, de correlação entre os níveis de sMICA, in vivo , e a expressão de NKG2D em células NK. Observamos correlações negativas sistemicamente (soro) apenas nas mulheres com 170 endometriose, tanto para frequência como para a intensidade de expressão (MFI) de NKG2D . Esta correlação negativa pode indicar que, mesmo com maior expressão desse receptor na doença, a ativação celular pode não ser eficiente, frente aos maiores níveis de MICA na forma solúvel, provavelmente, impact ando negativamente na sua menor expressão, no decorrer da evolução da doença. A variação quantitativa inversa dessas moléculas sugere que a presença de maiores níveis de MICA solúvel, apenas na EDT, pode regular negativamente este receptor, via sua internalização. Este resultado pode compreender um mecanismo de evasão imune na doença, por células NK e também de TCD8+, via receptor NKG2D, contribuindo para a dimi nuição da capacidade de eliminação de células endometriais ectópicas. Além disso, esses dados são concordantes com os dados da literatura mostrando diminuição da expressão de NKG2D associada ao aumento de MICA solúvel, no contexto tumoral (Groh et al., 2002; Jinushi et al., 2008). Salientamos que não encontramos outros relatos na literatura sobre qualquer correlação entre a expressão de NKG2D e MICA na forma solúvel, na EDT. Uma questão central na hipótese testada em nosso estudo é como as diferentes moléculas, relevantes na atividade das células NK, se relacionam com sua atividade citotóxica, e como MICA poderia participar da disfunção imunológica, na EDT. Nesse sentido, analisamos a citotoxicidade pelas células NK, busc ando as diferentes potenciais relações com essas moléculas. Esta análise foi realizada na condição de estímulo com as células K562 e na presença de células K56 2 bloqueadas para MICA (K562BLOQ) na superfície celular, com o objetivo de mimetizar a presença de MICA solúvel, in vitro. Relembramos que as células K562 são caracterizadas pela ausência, ou baixa expressão, de moléculas HLA classe I, torn ando- as susceptí veis à ação de receptores ativadores de NK (West et al., 1977). Além disso, as células tumorais K562 expressam moléculas MICA (Epling-Burnette et al., 2007) que se ligam ao receptor ativador NKG2D, funcionando como alvo de citotoxicidade por células NK. Nossos resultados indicaram que mulheres com EDT apresentam uma menor citotoxicidade, especialmente em estádios avançados da doença, em relação às mulheres CTRs saudáveis. Esses achados confirmam os d ados da literatura indicando diminuição da atividade citotóxica de células NK na EDT e, mais pronunciada, nas fases moderadas e graves da doença ( estádios avançados da doença, III e IV) (Oosterlynck et al., 1992; Wilson et al., 1994; Garzetti et al., 1995). Ademais, com o objetivo de avaliar o potencial envolvimento de sMICA na citotoxicidade de células NK, na EDT, analisa mos também a citotoxicidade por células NK frente ao estímulo com bloqueio para MICA, nas células alvo. O bloqueio não alterou a citotoxicidade previamente observada, na condição sem bloqueio, mantendo -se menor na EDT, na comparação com CTRs. No entanto, quando comparamos, tanto os estádios iniciais como avançados da EDT, nas condições antes e após o bloqueio de MICA (mimetiz ando a presença de MICA solúvel), observamos que o bloqueio diminuiu ainda mais a citotoxicidade, apenas nos estádios iniciais da doen ça. Além disso, também na condição com bloqueio, apenas mulheres em estádios iniciais tiveram diminuição adicional da citotoxicidade na 171 comparação com o grupo CTR. Salientamos que essa diferença de menor citotoxicidade em estádios iniciais da EDT, não foi observada na presença de estímulo sem bloqueio. Frente a esses achados, podemos interpretar que mulheres em estádios iniciais da EDT (I/II), as quais apresentam níveis de sMICA, in vivo, menores do que mulheres em estádios avançados da doença (III/IV), apr esentam uma maior sensibilidade ao bloqueio, com impacto negativo na citotoxicidade, ao menos na condição in vitro. Destacamos, como acima descrito, que a maior expressão do receptor de ativação NKG2D em células NK, na EDT, esteve associada a seus estádios iniciais. É possível que os maiores níveis de MICA solúvel in vivo, tanto sistêmicos como no microambiente peritoneal, em mulheres em estádios avançados da EDT, identificados neste estudo, possam ter provocado uma saturação de ligações com NKG2D e, talvez , até levado à exaustão das células NK, não permitindo, assim, a detecção de alterações da citotoxicidade, pós bloqueio da proteína MICA, in vitro. Além disso, também p odemos levantar como hipótese que, in vivo, com a progressão da doença e a exposição crô nica e continuada das células NK a níveis altos de MICA solúvel, na EDT, possa haver alteração da sensibilidade ao bloqueio, in vitro, ou mesmo envolver outros distúrbios imunológicos. De fato, embora não tenhamos observado uma correlação inversa entre os níveis de sMICA (soro e FP) e citotoxicidade por células NK, a menor citotoxicidade identificada em estádios avançados da doença, em relação ao grupo CTR, apoia essa interpretação. Ademais, embora não tenhamos observado menor citotoxicidade nos estádios i niciais da doença, em relação às mulheres CTRs saudáveis, podemos considerar que as subpopulações CD56dim e CD56dimCD16+, caracterizadas por uma maior atividade citotóxica (Cooper et al., 2001a) em relação às células CD56bright+, e observadas em menor frequência em estádios iniciais da EDT, em re lação aos CTRs saudáveis, podem ter relevância no contexto geral de menor atividade citolítica na doença, aqui observada e confirmada em outros estudos (Tanaka et al., 1992; Garzetti et al., 1995). De forma complementar à avaliação do potencial papel de sMICA na citotoxicidade por células NK de mulheres com EDT, em experimentos in vitro, analisamos também se havia correlação entre a citotoxicidade e os níveis, in vivo, de sMICA. A ausência de uma correlação, positiva ou negativa, entre citotoxicidade e níveis de sMICA, tanto sistemicamente como no microambiente peritoneal da lesão (grupo EDT), e também no microambiente peritoneal fisiológico (grupo CTR), corroboram nossos achados de pouco, ou nenhum impacto de sMICA na citotoxicidade de células NK, tanto na EDT, e até mesmo na saúde. Na ausência de estudos funcionais com esse enfoque de análise, na EDT, podemos destacar que, em diversos tipos de cânceres (Klöß et al., 2015; Luo et al., 2020), há relatos de citotoxicidade por células NK comprometi da, na presença de sMICA, e mediada pela ligação sMICA-receptor NKG2D e posterior internalização desse receptor (Groh et al., 2002). No entanto, salientamos que não encontramos correlação entre a citoto xicidade e a expressão do receptor de ativação NKG2D em células NK, sugerindo que, mesmo com a maior expressão 172 de NKG2D e menor citotoxicidade, na EDT, a frequência desse receptor parece não impactar no balanço final da citotoxicidade de células NK. Com o objetivo de explorar diferentes vias moleculares da atividade efetora de células NK, avaliamos as expressões das moléculas CD 107a, IFN -y e também da citocina imunorreguladora, IL -10, em células NK totais e suas subpopulações, frente aos mesmos desafios de estímulos utilizados no estudo de atividade citotóxica (K562 e K562BLOQ). Além da condição com estímulo, a expressão dessas moléculas foi também avaliada na condição sem estímulo, que corresponde à condição basal, provavelmente refletindo o que ocorre in vivo, seja no contexto fisiológico (CTR), seja na EDT. A expressão das moléculas CD107 a e IFN-γ nos traz, de maneira complementar à citotoxicidade, informação sobre a capacidade de degranulação e ativação de células NK, respetivamente, e, a citocina reguladora, IL -10, sobre o potencial papel de células NKreg na imunorregulação da EDT. Primeiramente, a análise na condição basal, na ausência de estímulo, mostrou que a expressão de CD107a por células NK, e em suas subpopulações, não teve diferença entre os grupos EDT e CTR. Estes dados indicam que a expressão da molécula CD107a não impacta em diferença no potencial na degranulação de células NK, na condição basal, na doença, em relação à condição fisiológica. Esse dado pode ser interpretado como a existência de algum grau de deficiência no processo de degranulação, na EDT, uma vez que na doenç a há um processo inflamatório em curso, de forma que esperávamos um grau de ativação maior e, no entanto, o nível de degranulação está semelhante ao encontrado na condição fisiológica. Porém, em um estudo observou -se menor expressão da proteína CD107a em t ecido endometrial ectópico de mulheres com EDT, em relação ao tecido endometrial eutópico de mulheres CTRs, sem a doença (Lubis et al., 2018). A diferença encontrada entre o nosso estudo (análise por citometria de fluxo), e o estudo da literatura citado (análise por imunohistoquímica), pode estar relacionada às diferentes abordagens empregadas - expressão sistêmica e local, respectivamente - para avaliação da molécula envolvida na degranulação, CD107a. Ainda em relação à condição basal, sem estímulo, observamos maior expressão de IFN-γ e de IL -10, em células NK de mulheres com EDT, do que no grupo CTR saudável. A maior expressão de IFN -γ, nessa condição, indica a existência de ativação, em curso, de células NK, corrobor ando a existência de uma condição inflamatória basal, na ED T. No contexto desse processo imunopatológico, a maior expressão de IFN -γ, na doença, pode também indicar a presença de uma regulação positiva, benéfica, ao processamento e apresentação de antígenos endometriais ectópicos por DCs e também recrutamento e ativação de macrófagos. Macrófagos ativados são capazes de produzir mais citocinas inflamatórias, como TNF -α, IL-1, IL-6, IL-8, e IL -12 (Gmyrek et al., 2008) que podem recrutar ainda mais macrófagos, e também células T, para o microambiente peritoneal. No entanto, apesar do intenso estímulo inflamatório, é relatado que esses macrófagos apresentam uma reduzida capacidade de fagocitose, na doença (Chuang et al ., 2009; 173 Dmowski et al. , 1990), com deficiência na eliminação de células endometriais ectópicas, favorecendo a manutenção de um ambiente inflamatório basal descontrolado. Ainda no contexto inflamatório, desencadeado pela maior expressão de IFN-γ pelas células NK, também é relatado que, na EDT, os macrófagos do microambiente peritoneal expressam níveis maiores de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e de prostaglandinas derivada de COX-2 (PGE2), em relação às mulheres saudáveis (Wu et al., 2002). COX2/PGE2 favorecem a implantação e crescimento de células endometriais ectópicas, bem como contribuem para a angiogênese (Banu et al., 2008) e sintomas clín icos, como de dor e infertilidade na doença (Burney e Giudice, 2012). Desatacamos que tal condição inflamatória envolve não apenas o microambiente peritoneal da lesão, mas também, como mencionamos, o endométrio eutópico dessas mulheres com diversas disfunções, como a resistência à progesterona, expressão de aromatas e, maiores níveis de IL-6 (revisado em Burney e Giudice, 2012). Ainda na condição basal, sem estímulo, numa análise mais refinada, observamos uma maior frequência de células com expressão de IFN -γ nos estádios avançados, em relação aos estádios iniciais da doença, e também uma maior expressão de IFN -γ em ambos os es tádios, em relação ao grupo CTR. Esses achados reforçam nossa interpretação de uma maior condição inflamatória na doença, mais pronunciada, em seus estádios avançados. Embora possamos considerar a ocorrência de ativação de células NK, evidenciada pela maio r expressão de IFN-γ, em relação aos CTRs, devemos destacar a menor capacidade citotóxica observada nessas mulheres, também em nosso estudo. Essas informações se complementam e indicam que, a despeito da ativação de células NK, no balanço geral, ocorre um prejuízo na capacidade de eliminação de células endometriais ectópicas. Em relação à citocina imunorreguladora, IL -10, sua maior expressão em células NK de mulheres com EDT, em relação ao grupo CTR, na condição basal, sem estímulo, ocorreu independentemente do estádio da doença. Além disso, destacamos que a maior frequência de expressão de IL -10, tanto na EDT como em CTR, ocorreu na subpopulação CD56 bright, que inclui as células NKs com propriedade imunorreguladora (Zhang et al., 2006a). No entanto, na comparação entre os grupos, EDT e CTR, a maior expressão de IL -10 foi observada em células CD56 dim, na EDT. Talvez, a maior expressão de IL -10, na doença, justamente na subpopulação de células NKs com maior propriedade citotóxica, em relação à subpopulação CD56bright, possa também contribuir para a deficiência da atividade efetora das células NK. O processo patológico, na EDT, poderia promover um maior estímulo à produção dess a citocina reguladora. Ainda que a expressão de IL -10, por células NK, tenha sido considerada muito baixa, podemos interpretar que as células NK produtoras dessa citocina possam estar implicadas, em algum grau, na regulação negativa da condição inflamatóri a basal da doença. Nesse contexto, e na qualidade de citocina imunorreguladora, a IL -10, na EDT, pode modular, negativamente, a apresentação antigênica de peptí deos antigênicos oriundos de células endometriais ectópicas, por células DCs, a ativação de célu las T, bem como a migração de macrófagos, para o microambiente peritoneal da lesão. Essas interpretações, em conjunto, 174 contribuiriam para o menor clearence de tecido endometrial ectópico , por células NK, na doença. Quando comparamos esses dados com os da literatura envolvendo IL -10, na EDT, alguns estudos indicam ausência de diferença em níveis de IL10 solúvel, tanto no soro como no FP (D’Hooghe et al., 2001; Jiang et al., 2019) de mulheres com EDT, na comparação com CTRs. No entanto, concordantes com a maior expressão de IL-10 por células NK, na condição basal, neste nosso estudo, outros estudos observaram maiores níveis de IL -10 no soro de mulheres com EDT, na comparação com mulheres CTR saudáveis e/ou CTR com outras doenças ginecológicas (Suen et al., 2014; Nea et al., 2020), bem como no FP de mulheres com EDT (Podgaec et al., 2007; Jaeger-Lansky et al., 2018). No entanto, destacamos que , nesses estudos , a análise foi de I L-10 solúvel e não nas células NK. Ademais, em alguns estudos em EDT, relata -se que a secreção de IL -10 estimula a proliferação e invasão de células endometriais es tromais in vitro, bem como o crescimento de lesões ectópicas in vivo (Liu et al., 2017). Também foi observado que IL -10 coopera com a citocina IL -17A, promovendo o crescimento, adesão, invasão e implantação de células endometriais estromais ectópicas, e reduzindo a apoptose in vitro e in vivo (Chang et al., 2017). Esses dados apoiam nossos resultados e a interpretação do envolvimento da IL -10 no estabelecimento e evolução da doença, contribuindo para um perfil regulador das células NK, também associado a um perfil inflamatório, devido, à maior expressão da citocina inflamatória, IFN -γ, na mesma condição de análise. Na busca de uma conexão entre a expressão de IL -10 e moléculas MICA, ainda que não seja um estudo em EDT, vale mencionar que, na presença de IL -10, células tumorais de melanoma apresentaram uma diminuição da expressão de MICA (mRNA e na superfície celular) (Serrano et al., 2011), sugerindo mais um mecanismo de regulação negativa da ativação de células NK, via NKG2D, favorecendo o escape da vigilância imunológica. Ainda na condição basal, sem estímulo in vitro, também observamos uma correlação positiva entre as citocinas IL -10 e IFN -γ, apenas na EDT. Considerando o que a condição basal, na doença, provavelmente, reflete o processo fisiopatológico em curso, in vivo, embora IL-10 possa regular negativamente a expressão de IFN -γ, podemos interpretar que a variação conjunta dessas moléculas, que têm atividades funcionais antagônicas, compreende algum grau de controle do processo inflamatório da doença. Após a análise da expressão das moléculas CD107, IFN -γ e IL -10 por células NKs na condição basal de cul tura, sem estímulo, discutiremos agora nossos resultados da expressão dessas moléculas por células NK, frente às células K562. Para interpretar os resultados dos ensaios realizados in vitro, estimulando as células NK das mulheres com EDT, comparativamente às saudáveis, precisamos apontar algumas questões para facilitar as interpretações. Primeiramente, as mulheres com EDT têm diferenças quantitativas em relação às populações de células NK, com menor frequência da subpopulação CD56dimCD16+, apresentadas em nosso trabalho. Além disso, essas mulheres 175 também têm uma condição basal diferencial, provavelmente, refletindo a condição inflamatória in vivo. Seu organismo está submetido a estímulos inflamatórios de forma crônica, devido ao processo patológico em curso há algum tempo, enquanto as mulheres CTRs saudáveis, não. Desta forma, quando analisamos os resultados dos diferentes parâmetros imunológicos relacionados às células NK, na condição basal, sem estímulo, in vitro, essas questões dever ser consideradas. Por outro lado, quando analisamos os resultados dos diferentes parâmetros de células NK frente a um estímulo in vitro – no caso com células K562 - estamos adicionando uma sobrecarga de dem anda funcional às células NK, vis ando verificar a sua capacidade de resposta frente a mais desafios. No contexto da EDT, poderíamos ponderar sobre se as células NKs, que já estão sob constante estímulo in vivo , pelo processo fisiopatológico em curso, teriam ainda mais capacidade funcional efetora, para responder a novas dem andas. Ambos os grupos responderam ao estímulo, com aumento da expressão das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10, exceto para IL -10, no grupo EDT, onde houve diminuição da expressão, mas observamos algumas diferenças importantes. Em relação à molécula CD107a, observamos que todas as subpopulações de células NK tiveram aumento de sua expressão , em ambos os grupos de estudo (exceto na subpopulação CD56 brightCD16+). Esse aumento de CD107a pós estímulo, em relação ao estado basal, sem estímulo, teve uma correlação positiva com a atividade citotóxica, tanto na EDT como no grupo CTR, indicando haver preservação da ação sincrônica nessa via de ativação de células NK em ambos os grupos. No entanto, na comparação entre os grupos (EDT e CTR), encontramos uma menor expressão de CD107a, na EDT, nas mesmas subpopulações de células NK. Ademais, essa menor expressão de CD107a, frente ao desafio de estímulo, foi menor em mulheres com EDT em estádio avançado da doença (moderado e grave), tanto na comparação aos estádios iniciais (m ínimo e leve) da EDT como ao grupo CTR saudável. Considerando o envolvimento de CD107a na atividade efetora de células NK e seu potencial envolvimento na deficiência da citotoxicidade dessas células, esses dados indicam haver deficiência na degranulação do s grânulos tóxicos, granzima e perforina, por células NK de mulheres com EDT, especialmente em estádios avançados, e com provável contribuição na deficiência na eliminação de células endometriais ectópicas. Portanto, embora as células NK de mulheres com ED T tenham capacidade de degranulação, frente a um estímulo adicional, ela ocorre em menor magnitude do que a encontrada em mulheres CTRs saudáveis. Assim como observamos para CD107a, todas as subpopulações de células NK (exceto CD56brightCD16+) tiveram aumento de expressão IFN-γ, frente ao estímulo, em ambos os grupos de estudo, em relação à condição sem estímulo. No entanto, mais uma vez, na comparação entre os grupos, houve uma menor de expressão de IFN-γ, na EDT, em relação ao grupo CTR, nas mesmas sub populações de células NK. Ademais, essa menor expressão de IFN -γ frente ao desafio do estímulo ocorreu tanto em mulheres em estádios avançados como em estádios iniciais da EDT, em relação ao grupo CTR, saudável. Portanto, a menor expressão de IFN -γ por cél ulas NK, independentemente dos estádios da doença, indica uma 176 menor ativação dessas células, com possível impacto negativo na resposta imune efetora no microambiente da lesão. Além disso, a menor expressão de IFN -γ, associada à menor expressão de CD107a, nessa mesma condição, indica haver uma resposta efetora deficiente de NK, frente ao estímulo, e destacando uma dupla deficiência da atividade de células NK na EDT: deficiência de atividade via IFN-γ e de degranulação. Também é interessante apontar que, ap esar da expressão de IFN -γ em células NK ser mais alta, na condição basal, do que em mulheres saudáveis, frente ao desafio com células K562, a resposta a resposta de IFN-γ das células NK, na EDT, não atinge a magnitude da resposta observada na saúde. Ademais, destacamos que no desafio do estímulo in vitro , tanto mulheres em estádios avançados como em estádios iniciais tiveram menor expressão de IFN -γ, do que mulheres do grupo CTR, saudáveis. Portanto, a menor expressão de IFN -γ por células NK, independentem ente dos estádios da doença, confere uma menor ativação dessas células e comprometimento da resposta imune efetora no microambiente da lesão. Destacamos que em um estudo semelhante ao nosso (Muharam et al., 2021) houve resultado discordante a este, com ausência de diferença de expressão de CD107a e IFN -γ por células NK, frente às células K562, entre mulheres com EDT e mulheres CTRs saudáveis. No entanto, é possível que essa diferença de re sultados possa estar associada ao tamanho amostral analisado naquele estudo, considerado pouco representativo (EDT, n=9; CTR, n=7). Somando-se a estes resultados e, diferentemente do grupo de mulheres CTRs saudáveis, não encontramos correlação positiva e ntre a expressão de CD10 7a e IFN -γ, na EDT. Essa ausência de sincronia na cinética de expressão dessas moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK, e apenas na EDT, pode impactar no mecanismo de degranulação e na ativação de células NK, acrescentando novo elemento dis funcional das células NK na doença. Podemos também acrescentar que, considerando que as mulheres com EDT vivem um estímulo inflamatório continuado de células endometriais ectópicas no microambiente peritoneal, é possível que tenha ocorrido uma perda na capacidade de resposta sincronizada das células NK frente aos desafios, talvez por exaustão, ou por outros distúrbios da homeostase celular, ainda não conhecidos. Estes dados contrastam com a correlação positiva dessas moléculas, quando células NK de mulheres saudáveis são desafiadas com estímulo, indicando haver mobilização molecular de forma sincronizada, provavelmente, relevante na ativação fisiológica de células NK. Ainda na condição de estímulo, analisamos a expressão na citocina reguladora IL -10. No entanto, diferentemente da condição basal, frente ao desafio do estímulo, a expressão de IL-10 por células NK teve respostas opostas nos grupos EDT e CTR. O aumento de IL -10, observado no grupo CTR, sugere que, mesmo frente à ativação de células NK, indicado pelo aumento de IFN -γ e CD107a, nesta condição, a expressão da citocina reguladora também aumenta, com provável relevância na manutenção de homeostase. Em contraste, na EDT, frente ao desafio imune, ocorreu diminuição da expressão de IL -10 nas células NK, 177 corroborando a existência de desregulação das células NK, na EDT, também envolvendo a IL - 10, e com possível contribuição para o descontrole da condição inflamatória. Embora essa diminuição da expressão de IL -10 em células NK, pós estímulo, possa sugerir um a manutenção de atividade efetora de células NK, na EDT, devido à ocorrência de aumento de IFN-γ e CD107a observado pós estímulo, devemos salientar que, no balanço comparativo final entre os grupos, a menor expressão de IL -10, IFN-γ e CD107a na doença, frente ao desafio imune, indica um prejuízo na atividade efetora e re guladora de células NK. Destacamos que essa menor expressão de IL -10, frente ao estímulo com células K562, foi mais acentuada nos estádios iniciais da doença, em comparação com CTRs saudáveis. Esse achado pode indicar a existência de mecanismos imunológico s reguladores diferenciais no início da doença, onde ocorre maior expressão do receptor NKG2D e menor comprometimento da atividade citotóxica de células NK. Nossos achados de expressão de IL-10, IFN -γ e CD107a sustentam a hipótese de ocorrência de algum grau de excesso de atividade imunorreguladora nas células NK, na EDT, promovendo um contexto, simultaneamente, com inflamação descontrolada e imunossupressão. Em seguida, analisamos se há re lação entre a variação da expressão da citocina IL -10, em relação à expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora inflamatória de células NK, IFN -γ e CD107a. Frente ao desafio do estímulo, assim como observado na condição basal, sem estímulo, obs ervamos uma correlação positiva entre expressão da citocina IL -10 e IFN -γ, apenas em mulheres com EDT, sustent ando a nossa interpretação de que, in vivo , esteja ocorrendo algum grau de regulação ao estímulo continuado da inflamação crônica na doença. Reforçando a hipótese do potencial impacto de sMICA na deficiência da atividade de células NK na EDT, avaliamos se há correlação entre a expressão das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 por células NK, e suas subpopulações, e os níveis in vivo de sMICA (soro e fluido peritoneal), frente ao desafio do estímulo. Embora ambos os grupos (EDT e CTR) tenham apresentado aumento de expressão de CD107a pós estímulo com células K562 e que, no balanço final entre os grupos, houve menor expressão de CD107a, na EDT, não observamos correlação entre a expressão de CD107a e níveis de sMICA em ambos os grupos, no soro e FP. Salientamos que, nesta análise, buscamos avaliar se a exposição prévia a níveis diferenciais de sMICA, in vivo , tem impacto na capacidade das células NK responderem a um estímulo, in vitro . Neste caso, devemos ponderar que as células NK habitaram (in vivo) um ambiente biológico com diferentes níveis de sMICA (EDT e saúde), e poderiam impactar em respostas funcionais distintas, dependo do contexto biológico de maiores ou menores níveis de sMICA. Desta forma, a ausência de correlação entre CD107a e sMICA, observada na EDT, tanto sistemicamente como no ambiente da lesão, sugere que, mesmo com os maiores níveis de sMICA observados no contexto biológico da doença, n ão há impacto significativo na resposta de degranulação. No entanto, relembramos que a despeito da capacidade de 178 responder ao estímulo, com aumento de expressão de CD107a, na EDT, a sua expressão final ainda foi significativamente menor do que na saúde (CT Rs). Quando analisamos a correlação entre a expressão de IFN -γ por células NK e os níveis, in vivo, de sMICA, observamos que ambos os grupos de estudo tiveram correlação negativa. Este dado sugere que maiores níveis de sMICA induzam menor capacidade de ativação das c élulas NK, via IFN-γ, ou vice e versa, tanto na saúde e como na doença. Como essa correlação foi encontrada também na condição de saúde (CTR), podemos interpretar que, in vivo , sMICA tenha papel na regulação da ativação da produção de IFN -γ nas células NK. Ademais, como os níveis de sMICA são significativamente maiores na EDT, é provável que esse seja um mecanismo de regulação negativa de ativação de células NK, in vivo, provavelmente mais acentuado, na doença. Em relação à expressão de IL -10 por células N K e níveis de sMICA in vivo, na EDT, não encontramos correlação entre essas moléculas. Este dado sugere que, na doença, a expressão de IL-10 nas células NK não seja regulada pelos níveis de sMICA. Por outro lado, na saúde, observamos uma correlação negativ a entre a expressão de IL -10 nas células NK e níveis de sMICA sistêmicos, sugerindo que quando células NK são desafiadas com estímulo, sMICA regule negativamente, também, a expressão de IL-10 na saúde. Além da análise da expressão das moléculas CD107a, IFN-γ e IL-10 frente ao estímulo, foram realizadas análises de expressão dessas moléculas também frente ao estímulo com células alvo bloqueadas para MICA, visando explorar o potencial efeito de sMICA na atividade das células NK. No que diz respeito à validad e interna desses nossos experimentos, mimetizando o efeito de MICA solúvel, destacamos que o bloqueio da proteína MICA na superfície de células K562 não foi 100% e nem ocorreu de forma homogênea em todos os experimentos. Mas, não houve variação no padrão de estímulo de células NK que pudesse ser explicada por essa variável experimental, em relação à intensidade de bloqueio. De forma geral, os resultados com bloqueio não mostraram modificações expressivas na atividade dessas células, na comparação ao estímu lo sem bloqueio, independentemente dos estádios da doença. No entanto, devemos considerar que nossos experimentos mimetizam a ação sMICA, in vitro, e que não podemos descartar que, in vivo, sMICA possa, sim, ter um papel na atividade efetora de células NK. Ou seja, in vivo, MICA solúvel poderia atuar em combinação com outros fatores que têm efeito deletério na atividade efetora das células NK. Essa interpretação faz sentido, uma vez que os processos biológicos na saúde e na doença são, na sua gr ande maioria, complexos, e envolvem a ação coordenada, e mesmo sinérgica, e/ou antagônica, de diversas moléculas e tipos celulares. Nesse sentido, destacamos que a molécula imunorreguladora HLA de classe I não clássica, HLA -G, também na sua forma solúvel, foi observad a em níveis maiores no soro de mulheres em estádios avançados da doença (Rached et al., 2019), em relação a mulheres saudáveis, possivelmente contribuindo para o comprometimento da atividade efetora de células NK, na EDT. Ademais, outras moléculas, podem somar a este contexto mais imunorregulador, que pode culminar em algum grau de imunossupressão. A maior frequência do gene KIR2DL2, que codifica para o 179 receptor inibitório KIR2DL2, em células NK, em mulheres euro -descendentes com doença profunda (Marin et al., 2021), bem como do gene KIR2DL1 (Matsuoka et al., 2005), também apoiam o envolvimento de outras moléculas no contexto de menor ativação de células NK, na EDT. Não obstante, a diferença de menor expressão de CD107a, na EDT, na condição sem bloqueio, deixou de existir, pós bloqueio. Is so ocorreu pois, embora sem diferença estatisticamente significante, houve uma diminuição na expressão de CD107a por células NK no grupo CTR, tornando os grupos sem diferença de expressão de CD107a. Com base nesse achado, podemos interpretar que o grupo CT R saudável, que apresenta níveis fisiológicos de sMICA, e menores do que o grupo EDT, apresenta uma maior sensibilidade ao bloqueio no impacto negativo na expressão de CD107a, ao menos na condição in vitro. Concordante com nossos achados de CD107a no grupo CTR, a presença de sMICA em sangue de cordão umbilical humano sadio, também foi descrita como envolvida em menor expressão da CD107a e na atividade citotóxica de células NK contra células K562, sugerindo um mecanismo adicional de tolerância na gravidez (Cox et al., 2015). Podemos levantar como hipótese que, in vivo, a exposição continuada das células NK a níveis altos de MICA solú vel, na EDT, pode alterar a sensibilidade ao bloqueio, in vitro. Em relação às citocinas IFN -γ e IL -10, também não houve alteração nas suas expressões por células NK, na presença de bloqueio. No entanto, a menor expressão de IFN - γ, observada na EDT, tanto na condição de estímulo quanto na condição de estímulo com bloqueio, é ainda mais relevante quando se considera a maior expressão dessa citocina, nas células NK, na condição inflamatória basal, e também na condição ex -vivo, na EDT, na comparação com mulheres saudáveis. Ademais, a manutenção da menor expressão de IFN-γ e IL -10, na EDT, com ambos os estímulos (com e sem bloqueio para MICA), sugere a manutenção da menor ativação de células NK e da regulação negativa, por essas moléculas, respectivamente. Esses dados podem indicar que MICA solúvel, representada pelo b loqueio de MICA, em nosso experimento, não tem papel expressivo na variação/sincronia na expressão dessas moléculas. Destacamos que n ão encontramos outros relatos na literatura sobre a relação de sMICA e a citocina IL-10. Reforçando a potencial relação de sMICA na deficiência da atividade de células NK, na EDT, avaliamos se há correlação entre os níveis, in vivo, de sMICA (no soro e fluido peritoneal) e a expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL -10 por células NK, frente ao estímulo com células bloqueadas para MICA, in vitro. Consideramos que relacionar os níveis, in vivo, de sMICA com a expressão dessas moléculas, na condição de bloqueio, oferece maior sensibilidade para a avaliação do potencial efeito de MICA solúvel na atividade de células NK, uma vez que permite considerar também o efeito do convívio, in vivo, das células NK com um ambiente de maiores ou menores níveis de sMICA. Observamos uma correlação positiva no grupo CTR entre os n íveis de sMICA, in vivo, no peritônio (pg/mL) e a expressão de CD107a, por células NK, frente ao estímulo com 180 bloqueio. É possível que, na condição de saúde em ambiente biológico com níveis fisiológicos menores de sMICA, ocorra variação sincronizada, possi velmente, um mecanismo de mútua regulação entre essas duas moléculas (sMICA-CD107a). No entanto, isso não ocorreu de uma forma global, em todas as subpopulações NK. Detectamos a correlação positiva apenas na subpopulação CD56 brightCD16+, descrita com maior capacidade de produção de citocinas, indicando haver sensibilidade diferencial de diferentes subpopulações de células NK, ao potencial efeito de MICA solúvel. No entanto, vale apontar que o nosso tamanho amostral é limitado, por isso essas interpretações devem ser consideradas com cautela. De forma importante e em contraste com a correlação positiva em saudáveis, na EDT, observamos uma correlação negativa entre MICA solúvel ( in vivo) e a expressão de CD107a na condição com bloqueio de MICA. Esse dado suger e que, na EDT, a presença de maiores níveis de MICA solúvel poderia contribuir para uma menor degranulação e comprometimento na atividade citotóxica de células NK, como observamos na condição de estímulo. Ademais, em relação à expressão de IL -10 e níveis de sMICA, in vivo , na EDT, na condição de estímulo com células bloqueadas, foi observada uma correlação negativa, não existente na condição sem bloqueio, mas previamente observada, apenas sem bloqueio, em CTRs. Podemos interpretar que, na doença, a presenç a do bloqueio, represent ando a oferta de mais MICA solúvel, associada à condição de células previamente já expostas a maiores níveis de MICA solúvel, in vivo, gerou uma sincronia inversa da IL-10 e sMICA, diferentemente do observado na condição de estímulo . Uma vez que essa correlação negativa foi observada em ambos os grupos de estudo, mas modificada com o bloqueio, apenas no grupo EDT, podemos interpretar que os níveis , in vivo , mais elevados de sMICA, na doença, possam regular negativamente, de forma mai s efetiva, a expressão da citocina IL -10 na doença, contribuindo para uma menor regulação da homeostase pelas células NK, e para a manutenção do processo inflamatório envolvido na imunopatologia da EDT. De forma global, os experimentos com células K562 b loqueadas para MICA, mimetizando a presença de MICA solúvel, indicam que, ao menos in vitro, sMICA tem baixo impacto na expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL -10, por células NK, na EDT. As modificações observadas na expressão dessas moléculas, em rela ção à condição de estímulo sem bloqueio ocorreram, de forma geral, no grupo CTR, onde as células NK estiveram em ambientes biológicos com níveis menores de sMICA. É possível que que, in vivo, a exposição continuada das células NK, a níveis altos de MICA so lúvel, como ocorre na EDT, possa alterar a sensibilidade dessas células frente ao bloqueio, in vitro. Destacamos que a correlação negativa entre MICA solúvel ( in vivo) e a expressão de CD107a, na presença de bloqueio de MICA, na EDT, indica que MICA solúve l pode impactar, de forma relevante, em menor degranulação por células NK na doença. Ademais, também a correlação negativa entre a expressão de IL10 por células NK, na condição de bloqueio, e níveis de sMICA in vivo, sugere que os maiores níveis de sMICA, na EDT, impactam em menor expressão da citocina imunorreguladora IL-10, por células NK, contribuindo para a menor resposta imune reguladora 181 das células NK, na doença, e manutenção do processo inflamatório imunopatológico nela envolvido. Avaliamos nossos r esultados, também, em relação às fases do ciclo menstrual, na doença e, consequentemente, possíveis influências hormonais. No entanto, devemos considerar que há diferenças imunológicas e hormonais importantes, em relação aos diferentes momentos de ambas as fases do ciclo menstrual, introduzindo vieses importantes em relação às interpretações biológicas. Assim, embora sendo um dos objetivos dos nosso estudo, devido a essas questões e à uma limitação de tamanho amostral, não consideramos consistente usar os n ossos resultados para a elaboração de uma conclusão em relação às fases do ciclo menstrual. Não obstante, discutimos potenciais efeitos hormonais em relação aos nossos resultados de MICA, MICA solúvel e atividade NK, considerando a fase proliferativa com p redomínio de estrogênio, e a fase secretora com predomínio de progesterona. Porém, essa discussão deve ser considerada com reservas. Em relação aos níveis de sMICA, a ausência de diferença entre as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, na E DT (no soro e FP) sugere haver pouco impacto de ação hormonal na regulação dos níveis de sMICA, na doença. Nossos achados foram diferentes de um estudo utilizando linhagem celular de câncer pulmonar, onde foi observado que estrogênio modulou positivamente a ação de ADAM17, resultando em aumento de sMICA (Ren et al., 2015). Na análise comparativa dos níveis de sMICA entre os grupos (EDT vs CTR), os maiores níveis de sMICA, no soro, apenas na fase proliferativa, pode ter relação com os maiores níveis de estrogênio presentes nesta fase do ciclo menstrual (revisado em Hafner et al., 2013). É possível que esse hormônio possa ter promovido um aumento de expressão de MICA e, posteriormente, ocorrido sua clivagem na forma de proteína solúvel. Algun s autores já mostraram que estrogênio aumentou a expressão de mRNA e da proteína MICA, na superfície de células de uma linhagem epitelial uterina e no endométrio uterino de mulheres com doenças ginecológicas, mediada por receptor de estrogênio (Basu et al., 2008). Um possível mecanismo para esse aumento pode estar relacionado ao fato do promotor do gene MICA (posição-46, relativo ao sítio de início de tra nscrição) possuir uma sequência consensus do Elemento de Resposta ao Estrogênio (ERE), em humanos (Basu et al., 2008). O receptor de estrogênio, uma vez ligado com alta afinidade à essa sequência, ativaria, também, a expressão gênica de MICA, em resposta ao estrogênio (Klinge, 2001). Ademais, tanto o tecido endometrial eutópico, como o ectópico, das mulheres com EDT, expressam altos níveis de aromatase (conversora de androgênio em estrogênio), ausente no endométrio de mulheres saudáveis (Kitawaki et al., 2002; Bulun et al., 2001), e baixos níveis da enzima 17 beta-hidroxi- esteróide-desidrogenase-22 (conversora de estradiol em estrona, sua forma menos ativa) (Zeitoun et al., 1998). Também já foi observado que tanto a expressão de mRNA como níveis de MICA/B solúveis de linhagem de adenocarcinoma têm aumento na presença de estrogênio (Ren et al., 2015). Além disso, o estrogênio foi capaz de aumentar a expressão da metaloproteinase ADAM17, que foi associada à secreção de MICA/B, e levou à diminuição do 182 receptor NKG2D na superfície de células NK92, comprometendo a a tividade citotóxica dessas células (Ren et al., 2015), apoiando a hipótese de possível clivagem de MICA gerando a forma solúvel. No entanto, não encontramos uma explicação adequada para a ausência de maiores níveis de sMICA também no ambiente peritoneal (FP), na mesma fase estrogênica do ciclo Procurando relacionar o contexto diferencial dos hormônios sexuais na atividade efetora de células NK, observamos que a menor atividade citotóxica na EDT, acima descrita, ocorreu na fase proliferativa do ciclo, possivelmente, relacionada aos maiores níveis de estrogênio associados à doença (Bulun, 2009). Apoiando nossa interpretação, o aumento de níveis séricos de estrogênio é descrito ter correlação inversa com a atividade de células NK (Garzetti et al., 1995). Essa menor citotoxicidade por células NK, provavelmente, impacta diretamente no aumento da sobrevivência e implantação de teci do endometrial ectópico. Ademais, esse resultado pode ter relação com os maiores níveis de MICA solúvel observados nessa mesma fase do ciclo, como observado neste estudo. Também analisamos a expressão das moléculas de atividade efetora NK, CD107a, IFN-γ e IL-10, nas condições sem estímulo e com os estímulos com e sem bloqueio para MICA, nas diferentes fases do ciclo. Essa análise teve como objetivo avaliar o potencial envolvimento dos hormônios sexuais na expressão dessas moléculas, associado ao possível impacto de MICA solúvel, representado pelo bloqueio de MICA, na atividade funcional de células NK, na EDT. Identificamos que a maior expressão de IFN -γ, previamente observada na condição basal, sem estímulo, esteve associada à fase proliferativa da doença, podendo estar associada ao aumento de estrogênio nesta fase do ciclo, bem como com a condição inflamatória associada a esta fase do ciclo menstrual, especialmente na inicial e tardia. De fato, estrogênio regula o promotor gênico de IFN -γ (Fox et al., 1991) aumentando os níveis dessa citocina (Karpuzoglu-Sahin et al., 2001; Fox et al., 1991). Ademais, a fase proliferativa (após menstruação) de mulheres com EDT é caracterizada por números aumentados de várias células do sistema imune, incluindo macrófagos, cé lulas NK uterinas e DCs imaturas (Matarese et al., 2003). O estímulo inflamatório continuado, devido à presença de células endometriais na cavidade uterina (Berbic e Fraser, 2013), pode estimular a expressão e/ou produção da citocina inflamatória, IFN-γ, por essas células, contribuindo para a manutenção da condição inflamatória basal da doença. Quando analisamos o envolvimento dos hormônios sexuais na expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK, agora na condição de estímu lo com células K562, observamos uma resposta diferente da observada na condição basal. A despeito dos maiores níveis de estrogênio nesta fase do ciclo, no desafio do estímulo, mulheres com EDT tiveram menor expressão de IFN-γ, nas células NK, do que mulher es saudáveis. Este achado nos leva a interpretar que o estrogênio mantém a maior expressão dessa citocina na saúde, com ativação celular adequada, o que é perdida na doença, na condição de estímulo, na EDT. A presença dos maiores níveis de estrogênio na fa se proliferativa do ciclo também 183 parece ter papel na expressão da citocina imunorreguladora, IL -10, na EDT. Observamos, apenas nesta fase do ciclo, que a expressão de IL-10, por células NK, foi menor na doença do que na saúde ( CTR). Este resultado sugere q ue estrogênio tenha um papel na regulação negativa da expressão de IL-10 nas células NK, na EDT, contribuindo para a perda e/ou diminuição da homeostase na doença, frente ao estímulo. Salientamos que o estrogênio é descrito na literatura com efeitos difere ntes, aumentando ou mesmo diminuindo a expressão de IL -10, dependendo do tipo celular envolvido (Lang, 2004). As m odificações de menor expressão de IFN -γ e IL -10, observadas na fase proliferativa, na presença de estímulo, em relação à condição basal, na EDT, não foram alteradas na condição de bloqueio para MICA em células K562, sugerindo que sMICA tenha pouco impacto na expressão dessas citocinas, nesta mesma fase do ciclo. Na fase secretora, quando os níveis de progesterona estão aumentados, não houve diferença na expressão das moléculas envolvidas na ativação de células NK, entre os grupos de estudo, na condição basal, sem estímulo. No entanto, frente ao estímulo, observamos uma menor expressão de CD107a, na EDT, na comparação com CTRs saudáveis, nessa fase do ciclo. Esse dado sugere um impacto negativo da progesterona na degranulação de células NK na doença. A menor expressão de CD107a, na fase secretora, do grupo EDT, pode estar associada à resistência à progesterona já descrita nessas mulheres (Bulun et al., 2006). Lesões endometrióticas apresentam, de forma geral, redução na e xpressão de receptores de progesterona, e ausência do receptor -β, quando comparada à expressão do endométrio eutópico (Attia et al., 2000). De forma indireta, mas concordante com nossos achados, linfócitos da decídua uterina apresentam menor porcentagem de células com expressão de perforina, na presença de progesterona, a qual é liberada de vesículas lisossomais, com exposição da molécula CD107a (Laškarin et al., 2002), indicando efeito negativo da progesterona na citotoxicidade. A menor expressão de CD107a, na EDT, na fase secretora do ciclo foi mantida na condição de bloqueio para MICA, sugerindo que sMICA tenha pouco impacto na expressão dessa molécula, e, possivelmente, na degranulação por células NK, nesta fase do ciclo. Dentro de uma perspectiva de tradução clíni ca dos nossos resultados, destacamos que, atualmente, diversas estratégias terapêuticas têm sido desenvolvidas com o objetivo de modular a resposta citotóxica de células NK, especialmente contra tumores. (Spear et al., 2013; Schmiedel e Meelboim, 2018; Ferrari de Andrade et al., 2018). Tomando como base tais estudos, e traduzindo para o contexto da EDT, uma das possíveis estratégias, seria a reparação e/ou indução de ligantes para o rece ptor de ativação NKG2D, especialmente MICA, favorecendo a ativação, tanto de células NK como TCD8 citotóxicas e, dificult ando, ao menos em parte, a evasão imune na eliminação de células endometriais fora do útero. Além disso, ainda na perspectiva terapêuti ca, o bloqueio da liberação de MICA na forma solúvel, ou prevenção dela, por meio de anticorpos ( Ferrari de Andrade et al., 2018) e/ou inibidores de MMPs (Shiraishi et al., 2016) e ADAMs (Otoyama et al., 2021), poderia contribuir para inibir, ou 184 mesmo restaurar, a expressão de NKG2D, em caso de sua internalização após ligação com sMICA. Consideramos que uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos no contexto da deficiência de células NK, e também de células TCD8+, bem como daqueles que regulam a expressão tanto de ligantes como do próprio receptor NKG2D, na endometriose, deve contribuir para estudos de maneira a potencializar a resposta imune na doença. Em resumo, consideramos que a principal contribuição do nosso trabalho é destacar o papel da molécula MICA na fisiopatologia da endometriose, exercendo, atividades pró - inflamatória e imunorreguladora. Os achados d e maior frequência de alta expressão da proteína MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose, associados aos altos níveis de MICA na forma solúvel, especialmente na doença avançada e em sítios de maior gravidade, nos permitem concluir que MICA tem um papel relevante na fisiopatologia da doença, bem como possível envolvimento na sua progressão e gravidade. A deficiência da atividade citotóxica somada a alterações da expressão de moléculas envolvidas na atividade efetora - CD107a e IFN-γ - e imunorreguladora - IL-10- de células NK, sugere a existência de disfunções, tanto na capacidade efetora como imunorreguladora dessas células. Em conclusão, nosso trabalho contribui para a melhor compreensão da disfunção imunológica na endometriose, coloc ando a molécula MICA com potencial envolvimento na disfunção das células NK, integrando a fisiopatologia da doença. ________________________________________________CONCLUSÕES 186 6. CONCLUSÕES 1. A maior frequência de alta expressão proteica de MICA no endométrio eutópico, na endometriose, indica a ocorrência de alterações imunológicas precoces, envolvendo MICA, nas células endometriais, antes mesmo da sua migração e instalação ectópica. 2. Os maiores níveis de MICA solúvel, tanto sistêmi cos como no microambiente peritoneal da lesão, na endometriose, sugerem sua participação na fisiopatologia da doença, assim como a prévia ocorrência de alta expressão de MICA de membrana, provavelmente, gerando também repercussão sistêmica. 3. A maior expre ssão do receptor NKG2D nas células NK, apenas nos estádios iniciais da endometriose, sugere a ocorrência, in vivo , de maior estímulo de ativação das células NK, em fases mais precoces da doença, quando ainda há menor prejuízo da atividade citotóxica. 4. A correlação negativa entre a expressão de NKG2D e níveis de MICA solúvel, na endometriose, sugere que os altos níveis de MICA solúvel podem inibir a expressão de NKG2D e, consequentemente, a função efetora das células NK. 5. A maior expressão da citocina inflamatória, IFN-γ, e da imunorreguladora, IL-10, nas células NK, na endometriose , apenas na condição basal, indica a ocorrência de ativação, in vivo , de células NK com perfis INFLAMA e REGULA. A correlação positiva entre a expressão de IL-10 e IFN-γ, que têm atividades funcionais opostas, apenas na endometriose , sugere desregulação da atividade das células NK, com prejuízo da sua atividade citotóxica. 6. A menor expressão de CD107a, IFN-γ e IL-10, em células NK, na endometriose, quando desafiadas com o estímulo, indica a existência de disfunção das células NK, na sua capacidade de resposta efetora, envolvendo a degranulação, a produção de IFN-γ, e também a resposta imunorreguladora, com produção de IL10. 7. Observamos menor expressão de CD107a, nas células NK e stimuladas, aliada à sua menor capacidade citotóxica e os maiores níveis de MICA solúvel, tanto sistêmicos como no microambiente peritoneal, principalmente na endometriose avançada e em sítios de maior gravidade da doença. Esses dados sugerem que com a mai or gravidade e progressão da doença ocorre maior comprometimento da atividade efetora das células NK, inclusive com deficiência de degranulação e participação de MICA solúvel. 187 8. A menor citotoxicidade induzida pelo bloqueio de MICA em células alvo, apenas em estádios iniciais da endometriose, juntamente com a ocorrência de correlação negativa entre os níveis de MICA solúvel e a expressão de NKG2D nas células NK, sugerem que os altos níveis de MICA solúvel podem inibir a expressão de NKG2D e, consequentement e, a função efetora das células NK, principalmente nos estádios iniciais da doença, quando detectamos maior expressão de NKG2D nas células NK. 9. A condição de bloqueio para MICA, in vitro, não alterou a expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL -10, nas células NK, nem na endometriose nem na condição saudável, sugerindo que MICA, na sua forma solúvel, tenha pouco ou nenhum impacto na expressão dessas moléculas, nas células NK, ao menos in vitro. 10. A correlação negativa entre níveis de MICA solúvel ( in vivo) e a expressão de CD107a, nas células NK, apenas na endometriose, e apenas na condição experimental com bloqueio de MICA, sugere que, in vivo, MICA solúvel, talvez em ação sinérgica com ou tras moléculas, desempenhe um papel na inibição da degranulação das células NK. 11. A menor frequência de células NK com o fenótipo CD56 dimCD16+, na endometriose, sugere que a deficiência quantitativa de células NK com o fenótipo de maior atividade citotóxica, também compõe o conjunto de distúrbios imunológicos na doença. 12. Em conjunto, nossos resultados apoiam a hipótese de que MICA tem participação relevante na imunopatologia da endometriose, podendo exercer papeis, pró - inflamatório e imunorregulador. MICA p ode contribuir para geração/manutenção de um estado biológico misto, de inflamação descontrolada e imunossupressão, ineficaz na eliminação adequada de tecidos endometriais ectópicos e no reestabelecimento da homeostase. _________________________ANEXOS 189 7. ANEXOS ANEXO I - Termos de Consentimento Livre e Esclarecido-TCLE A) Termo de Consentimento aplicado a pacientes com endometriose. 190 Continuação – Termo de Consentimento aplicado a pacientes com endometriose. 191 Continuação - Termo de Consentimento aplicado a pacientes com endometriose. 192 Continuação - Termo de Consentimento aplicado às mulheres com endometriose. 193 B) Termo de Consentimento aplicado a mulheres do grupo controle 194 Continuação - Termo de Consentimento aplicado a pacientes controles 195 Continuação - Termo de Consentimento aplicado a pacientes controles 196 Continuação - Termo de Consentimento aplicado a pacientes controles 197 ANEXO II: Aprovações do Comitê de Ética referentes ao presente estudo. A) “Banco de Tecidos e Fluidos Corporais de pacientes com endometriose” 198 B) Projeto Temático “Endometriose: Bases moleculares da Resposta Imunológica”. 199 C) Emenda ao Projeto Temático para o presente projeto de Doutorado. 200 ANEXO III - Relatório Cirúrgico. 201 Continuação- Relatório Cirúrgico. 202 ANEXO IV- Formulário de estadiamento da ASRM. 203 ANEXO V. Análise da qualidade das amostras de RNA e primers utilizados na reação de PCR em tempo real Figura 1. Representação gráfica da integridade de RNA gerada pelo software do equipamento 2100 Bioanalyzer. A. Gráfico indicativo dos picos 18S e 28S do RNA; B. Gel virtual com as b eas representativas de 28S e 18S; RIN (RNA integrity number); P98: identificação da paciente. Tabela 1. Análise da qualidade e integridade das amostras de RNA de mulheres com endometriose e controles. ID ID EDT Razão 260/280nm RIN CTR Razão 260/280nm RIN P 57 1,9 6,1 C 30 2,0 5,9 P 63 1,9 6,5 C 31 2,0 6,4 P 66 1,9 5,0 C 37 2,0 7,1 P 72 1,9 7,4 C 38 2,0 6,0 P 78 1,9 6,9 C 42 2,0 6,9 P 81 1,9 6,0 C 43 1,8 6,8 P 88 1,9 7,2 C 44 2,0 7,5 P 90 2,0 7,2 C 47 2,0 5,5 P 93 2,0 7,2 C 48 1,8 6,4 P 97 2,0 6,9 C 50 2,0 7,3 P 98 1,9 7,3 C 53 1,9 6,4 P 107 2,0 6,7 C 54 2,0 6,3 P 112 1,5 5,5 C 57 2,0 5,0 P 113 1,7 6,5 C 58 2,0 5,1 P 159 1,5 7,5 C 70 1,9 5,0 P 161 1,9 5,4 C 75 1,7 7,0 P 177 2,0 7,2 C 77 1,8 6,5 P 178 1,8 5,0 C 78 1,6 6,6 P 179 1,8 5,0 C 79 2,0 6,2 P 180 1,7 5,1 C 80 2,0 6,3 P 181 2,0 5,4 C 81 1,7 5,1 P 182 2,0 5,8 C 82 1,8 6,9 P 183 1,8 5,2 C 83 1,9 8,1 P 184 1,8 5,4 Endométrio ENDOMETRIOSE CONTROLES Endométrio ID: identificação; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; RIN: do inglês, RNA Tintegrity number – valores gerados pelo software do equipamento 2100 Bioanalyzer. 204 Tabela 2. Sequências e características físico-químicas dos pares de primers MICA e β -actina, e produto de amplificação do gene MICA. Bp; pares de bases; NG; número do gene na base de dados NCBI; 5'→3': sentido de elongação do ácido nucleico - da extremidade fosfatada 5' para a extrem idade 3' hidroxilada; foward: primer iniciador da fita senso (5'→3') do ácido nucléico; reverse: primer iniciador da fita anti-senso (3'→5') do ácido nucleico; Tm: do inglês melting point; CG: percentual de bases Citosina e Guanina. A) Primer alvo: gene MICA MICA diluição cDNA diluição cDNA log da diluição média Cts Eficiência 1/30 0,0333333 -1,4771213 30,71 1,86028 1/60 0,0166667 -1,7781513 31,59 1/120 0,0083333 -2,0791812 32,72 1/240 0,0041667 -2,3802112 33,47 1/280 0,0020833 -2,6812482 34,91 B) Primer utilizado para o gene normalizador, β-actina diluição cDNA diluição cDNA log da diluição média Cts Eficiência 1/30 0,0333333 -1,4771213 19,97 1,91471 1/60 0,0166667 -1,7781513 21,14 1/120 0,0083333 -2,0791812 22,13 1/240 0,0041667 -2,3802112 23,05 1/280 0,0020833 -2,6812482 24,35 β-ACTINA Figura 2. Representação gráfica do cálculo da eficiência dos primers para os genes MICA e β- actina. A regressão linear dos valores de Cts em função do logaritmo da respectiva diluição de cDNA forneceu o coeficiente angular da reta (a, em y=ax+b), que foi utilizado para o cálculo da eficiência de amplificação (Ef) do produto, segundo a fórmula: Ef = 10 -1/a ou Ef (%) = (Ef -1) x 100. 205 ANEXO VI. Titulação do Ac anti -MICA PE e anti -MICA não marcad o, e avaliação da proporção células efetoras: alvo (E:A). • Titulação do Ac anti -MICA PE (FAB1300, mouse anti -human IgG 2, PE -conjugated anti-MICA, clone 159227; R&D, Minneapolis, EUA): para a titulação foram utilizadas as diluições 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100, realizadas em tampão de lavagem citometria de fluxo ((PBS- 1x + 2% Soro Fetal Bovino + 0,02% Azida Sódica). O teste foi realizado com células K562 (linhagem de células de leucemia mieloide crônica humana) e células Hela (câncer cervical humano) (ambas do adas pela Dra. Mar i Sogayar, NUCEL, Núcleo de Terapia Celular e Molecular, FMUSP ) com 8 -10 dias de cultivo celular. 2 x 10 5 células (K562 e Hela) foram ressuspensas em tampão de lavagem e distribuídas em tubos FACs (BD Bioscience, San Jose, Califórnia, EUA) e foram incubadas com o Ac nas diluições específicas, por 30min, ao abrigo da luz. Em seguida, foram adicionados 500µl do tampão de lavagem e os tubos foram centrifugados a 450g, por 5min. Após mais 2 lavagens, as células foram ressuspensas em 400 µl de tampão de lavagem para aquisição no citômetro de fluxo BD FACs Canto II (BD Bioscience, EUA). A melhor diluição deu -se para a menor diluição que gerou a melhor definição de positividade da molécula MICA na população ´em estudo, e com menor presença de ligação inespecífica, definida como 1:50. • Titulação do Ac anti-MICA não marcado (MAB1300, mouse anti-human IgG2B, clone 159227; R&D Systems, USA), utilizado para bloqueio de MICA na superfície celular: para a titulação do foram utilizadas as diluições 1:2, 1:5, 1:10 e o Ac puro. O ensaio foi realizado com 2 x 10 5 células (K562 e Hela) em tampão de lavagem, distribuídas em tubos FACs. Após centrifugação e retirada do sobrenadante, foi adicionado o 1 o Ac, anti-MICA não marcado, nas diluições específicas, seguido de incubação, por 30min, ao abrigo da luz. Em seguida, foram adicionados 500µl de tampão de lavagem e os tubos foram centrifugados a 300g, por 5min. Esta etapa foi realizada por 2 vezes. Após a retirada do sobrenadante, foi adicionado o conjugado (Ac secundário), rabbit anti-mouse Alexa Fluor 633 (clone A21063, Invitrogen, EUA) na diluição 1:200, seguindo-se com incubação por mais 30min, ao abrigo da luz. Em seguida, foram adicionados 500µl de tampão de lavagem, seguindo -se com nova lavagem dos tubos (300g, 5min). Após mais 2 lavagens, as células foram ressuspensas em 400 µl de tampão de lavagem para aquisição no citômetro de fluxo. A melhor diluição deu-se para a menor diluição que gerou a melhor definição de positividade da molécula MICA na população ´em estudo, e com menor presença de ligação inespecífica, definida como 1:10. • Avaliação da proporção células efetoras – alvo (E:A): a linhagem celular K562 foi mantida por 8 -10 dias em cultura (meio R10) e utilizada como células alvo (A) e as PBMCs isoladas de mulheres CTR e EDT, como células efetoras (E). As PBMCs foram descongeladas 206 (Métodos, item 3.7), lavadas em meio R10, a 400g, por 8 min. Após avaliação da concentração e viabilidade celular, as PBMCs foram ressuspensas em 4 mL de R10 com 1g/mL de DNAse (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) e mantidas em repouso por 16 -18, em posição inclinada a 45o, com tampas soltas, em incubadora de CO2 umidificada, a 37° C. O ensaio seguiu o protocolo descrito em Métodos, item 3.9.2, para a identificação da expressão de IFN-γ e CD107a. Foram avaliadas as proporções E:A: 10:1, 5:1 e 2:1, de forma a padronizar a melhor condição para o ensaio, base ando-se na produção de CD107a e IFN -. A melhor proporção E:A foi a que gerou a maior expressão de ambas as moléculas em células NK, em ao menos 3 amostras de PBMC de mulheres com endometriose e mulheres controles saudáveis, definida como 1:5. As aquisições foram realizadas no citômetro de fluxo BD FACs Canto II (BD Bioscience, USA) (Métodos, item 3.9.1). 207 ANEXO VII. Expressão gênica de MICA Tabela 1. Valores de Ct e ∆Ct referentes à expressão do gene MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, e respectivos dados clínicos. A) Grupo endometriose ID EDT Ct MICA Ct β-Actina ΔCt Fase ciclo Estádio (ASRM) Localização EDT Idade P 57 30,321 21,290 9,031 S III PF 26 P 63 29,623 19,028 10,595 S IV PF 33 P 66 31,601 18,762 11,407 S IV PF 30 P 72 31,598 19,593 12,005 S IV PF 33 P 78 31,835 18,417 13,418 S IV PF 27 P 81 29,913 18,716 11,196 P IV PF 34 P 88 30,331 19,411 10,920 S IV PF + OVA 33 P 90 32,429 21,472 10,957 S IV PF 29 P 93 29,247 20,553 8,694 P IV PF 25 P 97 30,148 20,190 9,958 S IV PF 42 P 98 30,276 19,317 10,958 P IV PF 26 P 107 32,451 21,318 11,133 S III PF + OVA 33 P 112 31,357 21,759 9,598 S IV PF 37 P 113 31,381 20,548 10,833 S IV PF 38 P 159 33,282 22,012 11,270 S II PF 37 P 161 32,436 21,563 10,873 S IV PF 38 P 177 30,125 19,715 10,410 P IV PF + OVA 40 P 178 33,005 23,340 9,665 NR IV PF 37 P 179 31,741 20,564 11,177 S IV PF 36 P 180 32,230 21,935 10,295 P IV PF + OVA 43 P 181 31,316 19,592 11,724 S IV PF 30 P 182 29,335 20,659 8,676 S IV PF 35 P 183 29,791 19,705 10,086 P IV PF 29 P 184 35,676 22,164 13,511 P IV PF 32 Média (DP) 31,310 (1,5) 20,484 (1,3) 10,776 (1,2) 33,5 (4,9) Endométrio Dados clínicos e cirúrgicos ID: identificação do paciente; Ct: Threshold cicle (média de triplicata); ΔCt = Ct MICA - Ct β-actina, EDT: grupo endometriose; P: fase proliferativa do ciclo menstrual (1o-14o dia); S: fase secretora do ciclo menstrual (15o- 28o dia); PF: endometriose profunda; PROF+OVA: EDT profunda na presença de EDT ovariana (OVA); NR: não refer ida; I: estádio inicial, mínimo; II: estádio inicial, leve; estádio avançado, moderado, estádio avançado, grave; estádios de acordo com rASRM. 208 Continuação Tabela 1. Valores de Ct e ∆Ct referentes à expressão do gene MICA no endométrio eutópico de mu lheres com endometriose e de controles, e respectivos dados clínicos. B) Grupo controle ID: identificação do paciente; Ct: Threshold cicle (média de triplicata); ΔCt= Ct MICA - Ct β-actina (gene normalizador); P: fase proliferativa do ciclo menstrual (1o-14o dia); S: fase secretora do ciclo menstrual (15o- 28o dia); NR: não referida; 209 ANEXO VIII. Expressão proteica de MICA Tabela 1. Escores individualizados de frequência e intensidade de expressão da proteína MICA em epitélio glandular e estroma, no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e controles, e na lesão de mulheres com endometriose, e dados clínicos. A) Grupo endometriose: escores da lesão e do endométrio eutópico e dados clínicos. ID Tecido Frequencia Intensidade EIR glândula Frequencia Intensidade EIR estroma Fase ciclo Estádio ARSM Idade lesão RS 3 2 6 1 2 2 endométrio 3 2 6 1 2 2 lesão RS 3 1 3 1 1 1 endométrio 3 1 3 1 1 1 lesão RC 0 0 0 0 0 0 endométrio 1 1 1 0 0 0 lesão RS 1 1 1 0 0 0 endométrio 1 1 1 0 0 0 lesão RS 2 1 2 2 1 2 endométrio 1 1 1 0 0 0 lesão RC 1 1 1 0 0 0 endométrio 1 1 1 0 0 0 lesão RS 1 1 1 1 1 1 endométrio 1 1 1 0 0 0 lesão RC 2 1 2 0 0 0 endométrio 4 1 4 2 1 2 lesão RC 3 2 6 0 0 0 endométrio 4 3 12 0 0 0 lesão RC 4 1 4 0 0 0 S endométrio 4 2 8 2 1 2 lesão RC 3 2 6 1 1 1 endométrio 3 2 6 1 1 1 lesão RC 2 1 2 1 1 1 endométrio 4 3 12 2 1 2 lesão RC 3 1 3 1 1 1 endométrio 4 3 12 2 1 2 lesão RC 3 2 6 2 1 2 endométrio 2 1 2 1 1 1 lesão RC 3 2 6 3 1 3 endométrio 3 2 6 3 1 3 lesão RC 4 2 8 3 1 3 endométrio 2 1 2 3 1 3 lesão RS 1 1 1 0 0 0 endométrio 3 1 3 0 0 0 lesão RS 4 2 8 3 1 3 endométrio 2 1 2 0 0 0 lesão RS 0 0 0 0 0 0 endométrio 0 0 0 0 0 0 lesão RC 1 1 1 0 0 0 endométrio 1 1 1 0 0 0 lesão RS 3 1 3 0 0 0 endométrio 3 2 6 0 0 0 lesão RS 1 1 1 0 0 0 endométrio 2 1 2 1 1 1 lesão RC 1 1 1 0 0 0 endométrio 3 2 6 0 0 0 lesão RS 2 1 2 0 0 0 endométrio 4 3 12 0 0 0 lesão RS 1 1 1 1 1 1 endométrio 1 1 1 1 1 1 lesão RS 1 1 1 1 1 1 endométrio 3 1 3 1 1 1 lesão RC 3 2 6 1 1 1 endométrio 2 1 2 1 1 1 lesão RC 1 1 1 0 0 0 endométrio 1 1 1 0 0 0 lesão RS 4 1 4 0 0 0 endométrio 4 2 8 0 0 0 P 108 P 110 P 78 P 79 P 86 P 96 P 97 P 99 Estroma - escore dados clínicos P 185 P 186 P 187 P 188 P 189 Epitélio glandular - escore P 139 P 143 P 144 P 147 P 149 P 158 P 118 P 119 P 121 P 124 P 126 P 128 P 100 P 103 P 104 P 105 P S P P P S S S S S P S S S II III II III S S S P IV IV II IV IV II P S S S P P P P P P II IV III IV IV 27 30 41 32 42 IV III II IV IV IV II II III II II II I I 25 26 42 34 27 38 35 39 44 34 44 35 39 40 35 30 35 38 34 33 46 37 21 32 ID: identificação do paciente; P: f ase proliferativa do ciclo menstrual (1 o-14o dia); S: fase secretora do ciclo menstrual (15 o- 28o dia); I: estádio inicial, mínimo; II: estádio inicial, leve; estádio avançado, moderado, estádio avançado, grave; estádios de acordo com a rASRM; EIR: escore de imunorreatividade (definido pelo escore de intensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão de MICA). 210 Continuação Tabela 1. Escores individualizados de frequência e intensidade de expressão da proteína MICA em epitélio glandular e estroma, no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, e na lesão de mulheres com endometriose, e dados clínicos. B) Grupo controle: escores no endométrio e dados clínicos ID Tecido Frequencia Intensidade EIR glândula Frequencia Intensidade EIR estroma Fase ciclo Idade C 43 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 30 C 44 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 29 C 45 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 25 C 47 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 26 C 48 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 35 C 51 endométrio 2 1 2 2 1 2 S 25 C 57 endométrio 1 1 1 1 1 1 S 29 C 58 endométrio 2 1 2 2 1 2 P 35 C 60 endométrio 2 1 2 2 1 2 P 34 C 61 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 32 C 63 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 36 C 64 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 33 C 68 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 26 C 70 endométrio 4 1 4 0 0 0 P 36 C 71 endométrio 4 2 8 0 0 0 S 34 C 73 endométrio 4 2 8 0 0 0 S 37 C 75 endométrio 4 2 8 0 0 0 S 40 C 79 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 25 C 80 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 30 C 83 endométrio 4 1 4 0 0 0 S 32 C 84 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 38 C 85 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 46 C 86 endométrio 4 1 4 0 0 0 S 36 Epitélio glandular - escore Estroma - escore Dados clínicos ID: identificação do paciente; P: f ase prolifer ativa do ciclo menstrual (1 o-14o dia); S: fase secretora do ciclo menstrual (15 o- 28o dia); EIR: escore de imunorreatividade (definido pelo escore de intensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão de MICA). 211 Tabela 2. Estatística descritiva de EIR para MICA n o endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, e na lesão de mulheres com endometriose (A), EIR de acordo fase do ciclo menstrual (B), estádios da endometriose (C) e localização da le são profunda de endometriose (D). A) Estatística descritiva de EIRs em epitélio glandular e estroma. média (DP) mediana (min-max) p lesão (n=29) 3 (2,4) 2 (0-8) endométrio EDT (n=29) 4,7 (3,8) 3 (0-12) endométrio CTR (n=23) 2,7 (2,3) 2 (1-8) lesão (n=29) 0,8 (1,0) 0 (0-3) endométrio EDT (n=29) 0,8 (1,0) 0 (0-3) endométrio CTR (n=23) 0,9 (0,6) 1 (0-2) EIR glândula (epitélio) EIR estroma 0,1270 0,5623 EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão de MICA; endométrio: endométrio eutópico; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; DP; desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max; valor máximo da mediana; valores de p determinados pelo teste de Kruskal-Wallis B) Estatística descritiva do EIR em epitélio glandular e estroma, de acordo com a fase do ciclo menstrual. Expressão de MICA Fase do ciclo média (DP) mediana (min-max) p lesão (n=29) P 3,5 (2,9) 2,0 (0-8) S 2,6 (2,0) 2,0 (0-6) endométrio eutópico EDT (n=29) P 4,2 (4,0) 2,0 (1-12) S 5,0 (3,8) 4,5 (0-12) endométrio eutópico CTR (n=23) P 1,7 (0,8) 2,0 (1-4) S 5,0 (3,0) 4,0 (1-8) lesão (n=29) P 1,0 (1,3) 0,0 (0-3) S 0,6 (0,7) 0,5 (0-2) endométrio eutópico EDT (n=29) P 0,8 (1,2) 0,0 (0-3) S 0,8 (0,8) 1,0 (0-2) endométrio eutópico CTR (n=23) P 1,1 (0,4) 1,0 (0-2) S 0,4 (0,8) 0,0 (0-2) 0,6185 0,0074 0,6871 EIR glândula (epitélio) EIR estroma 0,4698 0,4627 0,0043 EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; DP; desvi o padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; P: fase proliferativa do ciclo menstrual (1 o– 14o dia); S: fase secretora do ciclo menstrual (15 o – 30o); análise realizada por imunohistoquímica; em negrito: valores significantes (<0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 212 Continuação Tabela 2. Estatística descritiva do EIR para MICA n o endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, e na lesão de mulheres com endometriose (A), EIR de acordo fase do ciclo menstrual (B), estádios da endometriose (C) e localização da lesão profunda de endometriose (D). C) Estatística descritiva do EIR em epitélio glandular e estroma, de acordo com o estádio da endometriose. Expressão MICA média (DP) mediana (min-max) p a p b estádios I / II (n=13) lesão 3,2 (2,9) 3,0 (0-8) endométrio eutópico 4,2 (4,0) 2,0 (1-12) estádios III / IV (n=16) lesão 2,5 (2,1) 2,0 (0-6) endométrio eutópico 4,8 (3,9) 3,5 (0-12) estádios I / II (n=13) lesão 0,9 (1,1) 1,0 (0-3) endométrio eutópico 0,7 (0,9) 0,0 (0-3) estádios III / IV (n=16) lesão 0,7 (0,9) 0,0 (0-3) endométrio eutópico 0,8 (1,0) 0,5 (0-3) 0,3464 0,9294 EIR glândula (epitélio) EIR estroma 0,5060 0,0949 0,6896 0,7548 EIR: escore de imunorreatividade, definid o pelo escore intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; I/II; estádio iniciais da endometriose; III/IV; estádios avançados da endom etriose; estádios de acordo com a rASRM; pa: valores de p determinados pelo teste de Kruskal-Wallis na comparação entre os estádios e tecidos de lesão e endométrio eutópico; pb: valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney na comparação entre a les ão e endométrio eutópico. D) Estatística descritiva do EIR em epitélio glandular e estroma, de acordo com a localização da lesão profunda de endometriose. Expressão MICA média (DP) mediana (min-max) p retossigmóide (n=14) 2,4 (2,2) 1,5 (0-8) retrocervical (n=15) 3,5 (2,6) 3,0 (0-8) retossigmóide (n=14) 0,8 (1,0) 0,5 (0-3) retrocervical (n=15) 0,8 (1,1) 0,0 (0-3) EIR glândula (epitélio) 0,2760 EIR estroma 0,9578 EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max; valor máximo da mediana; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney na comparação entre as lesões de retossigmóide e retrocervical. 213 ANEXO IX. MICA SOLÚVEL (sMICA) L A Q D N I 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 A ) n = 5 0 n = 2 6 s M IC A (p g /m l) p = n s 3 1 ,2 5 S o ro L A Q D N I 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 n = 5 0 n = 2 6 B )s M IC A (p g /m L ) p = n s F lu id o p e rito n e a l 3 1 ,2 5 Figura 1. Distribuição da concentração de sMICA (pg/mL) em mulheres do grupo controle provenientes de laqueadura tubária (LAQ) e doenças não inflamatórias (DNI) . (A) níveis de sMIC A no soro; (B) níveis de sMICA no fluido peritoneal; níveis de sMICA determinados por ELISA; a linha tracejada representa o limite inferior de detecção do teste (31,25 pg/mL); ns: não significante (p≥ 0,05), sMICA: MICA solúvel; as barras horizontais repre sentam a mediana; valores de p determinados pelo Teste Mann–Whitney. Tabela 1. Níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres com endometriose de acordo com estádio da doença e controles. sMICA (pg/mL) n Média (±DP) Mediana (min-max) p Soro CTR 76 <31,25 (± 6,3) <31,25 (<31,25-82) I 24 31,63 (± 5,8) <31,25 (<31,25-56) II 39 40,24 (± 23,6) <31,25 (<31,25-148) 0,0004 III 34 44,24 (± 30,9) <31,25 (<31,25-145) IV 63 42,34 (± 23,8) <31,25 (<31,25-155) FP CTR 76 52,50 (±44,8) <31,25 (<31,25–239,0) I 24 55,92 (±44,8) <31,25 (<31,25–222) II 39 132,00 (±176,4) 64,5 (<31,25-893) <0,0001 III 34 102,60 (±128,4) 57,5 (<31,25-694) IV 63 138,60 (±166,6) 80,0 (<31,25-695) I: endometriose inicial mínima; II, endometriose inicial leve; III: endometriose avançada moderada; IV: endometriose avançada grave; estádios de acordo com a rASRM; FP: fluido peritoneal; DP: desvio padrão; CTR: grupo controle; min; valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; < 31,25pg/mL: valores abaixo do limite de detecção do teste (31,25pg/mL); sMICA: MICA solúvel; níveis de sMICA determinados por ELISA; em negrito: valores de p significantes (<0,05); valores de p determinados pelo teste Kruskal-Wallis. 214 Tabela 2. Concentrações de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal e dados clínicos e demográficos das mulheres com endometriose e de controles. A) Grupo endometriose Id Fase ciclo Estádio (ASRM) Tipo de lesão Idade Id Fase ciclo Estádio (ASRM) Tipo de lesão Idade soro FP soro FP P 01 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 36 P 82 <31,25 86 Secretora I SUP 36 P 02 <31,25 258 Secretora II PF + OVA 47 P 83 <31,25 694 Secretora III PF + OVA 28 P 03 <31,25 399 Secretora IV OVA 45 P 84 44 74 Secretora II PF 41 P 04 <31,25 376 Proliferativa III PF + OVA 27 P 85 53 164 Secretora IV PF + OVA 39 P 05 148 297 Secretora II PF 30 P 86 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 41 P 06 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 45 P 87 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 37 P 07 70 72 Proliferativa II PF 50 P 88 <31,25 80 Secretora IV PF + OVA 33 P 08 <31,25 <31,25 Proliferativa III PF 28 P 89 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF + OVA 49 P 09 32 43 Proliferativa IV PF + OVA 44 P 90 <31,25 507 Secretora IV PF 29 P 10 42 417 Proliferativa II PF 30 P 91 <31,25 240 Secretora II PF 36 P 11 <31,25 85 Secretora III PF 37 P 92 <31,25 89 Proliferativa I PF 39 P 12 86 158 Secretora II PF 39 P 93 <31,25 69 Proliferativa IV PF 25 P 13 121 139 Secretora III PF + OVA 29 P 94 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 30 P 14 <31,25 120 Secretora IV PF + OVA 33 P 95 <31,25 115 Secretora III PF + OVA 33 P 15 64 228 Proliferativa IV PF 35 P 96 <31,25 131 Secretora IV PF + OVA 32 P 16 <31,25 61 Secretora II PF 29 P 97 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 42 P 17 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 32 P 98 35,7 338 Proliferativa IV PF 26 P 18 64 129 Secretora IV PF + OVA 30 P 99 <31,25 <31,25 Secretora II PF 35 P 19 74 893 Proliferativa II PF 35 P 100 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 39 P 20 <31,25 43 Secretora IV PF + OVA 26 P 101 <31,25 <31,25 Secretora I SUP 29 P 21 145 147 Proliferativa III OVA 35 P 102 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 39 P 22 <31,25 56 Secretora III PF 35 P 103 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 44 P 23 <31,25 <31,25 Secretora I PF 34 P 104 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 35 P 24 91 87 Secretora IV PF + OVA 32 P 105 <31,25 59 Secretora III PF 44 P 25 <31,25 54 Proliferativa IV PF + OVA 33 P 106 <31,25 <31,25 Secretora III PF 26 P 26 59 138 Proliferativa IV PF + OVA 29 P 107 <31,25 <31,25 Secretora III PF + OVA 33 P 27 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF 35 P 108 <31,25 <31,25 Secretora II PF 35 P 28 <31,25 <31,25 Secretora IV PF + OVA 33 P 109 <31,25 <31,25 Secretora III PF 32 P 29 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF + OVA 38 P 110 <31,25 <31,25 Secretora III PF + OVA 25 P 30 81 193 Proliferativa III PF + OVA 31 P 111 <31,25 <31,25 Secretora II PF 30 P 31 108 43 Secretora III OVA 34 P 112 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 37 P 32 <31,25 67 Proliferativa II PF 30 P 113 72 148 Secretora IV PF 38 P 33 <31,25 52 Proliferativa I PF 34 P 114 <31,25 131 Secretora IV PF 31 P 34 37 304 Secretora IV PF + OVA 38 P 115 <31,25 189 Proliferativa II PF 32 P 35 43 57 Secretora I PF 45 P 116 <31,25 <31,25 Secretora II PF 28 P 36 155 124 Secretora IV PF 38 P 117 <31,25 87 Secretora I PF 43 P 37 <31,25 <31,25 Secretora IV PF + OVA 32 P 118 85 414 Secretora II PF 26 P 38 <31,25 <31,25 Proliferativa I SUP 43 P 119 <31,25 62 Proliferativa II PF 42 P 39 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 31 P 120 <31,25 <31,25 Secretora III OVA 37 P 40 83 47 Secretora IV PF + OVA 47 P 121 <31,25 32 Secretora III PF 34 P 41 60 695 Secretora IV OVA 36 P 122 <31,25 295 Secretora II PF 35 P 42 <31,25 145 Secretora III OVA 29 P 123 56 222 Proliferativa I SUP 27 P 43 <31,25 <31,25 Proliferativa III PF + OVA 35 P 124 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 27 P 44 42 <31,25 Proliferativa III PF + OVA 35 P 125 <31,25 46 Proliferativa IV PF 45 P 45 33 74 Proliferativa II PF 32 P 126 <31,25 <31,25 Secretora II PF 38 P 46 47 139 Secretora IV PF + OVA 29 P 127 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 43 P 47 47 235 Secretora IV PF 49 P 128 <31,25 55 Proliferativa II PF 34 P 48 <31,25 <31,25 Secretora III PF + OVA 32 P 129 <31,25 <31,25 Secretora I SUP 43 P 49 <31,25 72 Proliferativa III PF 31 P 130 <31,25 <31,25 Secretora III OVA 36 P 50 123 510 Proliferativa IV OVA 31 P 131 40 44 Secretora II PF 38 P 51 <31,25 <31,25 Secretora III OVA 21 P 132 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF 43 P 52 35 60 Secretora II PF 32 P 133 <31,25 <31,25 Proliferativa III OVA 40 P 53 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF + OVA 31 P 134 <31,25 <31,25 Secretora II PF 40 P 54 71 129 Secretora IV PF + OVA 34 P 135 <31,25 101 Proliferativa III PF + OVA 32 P 55 <31,25 114 Secretora IV PF + OVA 31 P 136 <31,25 <31,25 Secretora II PF 42 P 56 <31,25 112 Secretora I PF 36 P 137 36 66 Secretora III PF + OVA 48 P 57 67 143 Secretora III PF 26 P 138 44 172 Secretora III PF 38 P 58 34 87 Secretora II PF 34 P 139 <31,25 198 Secretora IV PF 33 P 59 <31,25 174 Proliferativa IV PF + OVA 38 P 140 <31,25 92 Secretora I SUP 50 P 60 <31,25 87 Proliferativa III PF 38 P 141 <31,25 67 Proliferativa II PF 32 P 61 <31,25 184 Secretora III PF 47 P 142 <31,25 <31,25 Secretora I SUP 35 P 62 <31,25 58 Secretora IV OVA 34 P 143 <31,25 <31,25 Proliferativa III PF 46 P 63 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 33 P 144 35,5 79 Secretora II PF 20 P 64 71 444 Secretora IV PF 35 P 145 <31,25 547 Secretora II PF 28 P 65 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 44 P 146 <31,25 175 Secretora IV PF 25 P 66 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 30 P 147 <31,25 <31,25 Secretora IV PF + OVA 21 P 67 <31,25 33 Proliferativa I SUP 30 P 148 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 22 P 68 110 162 Secretora III PF + OVA 35 P 149 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 21 P 69 <31,25 334 Proliferativa IV PF 32 P 150 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 37 P 70 <31,25 <31,25 Proliferativa III PF 38 P 151 <31,25 <31,25 Proliferativa I SUP 28 P 71 <31,25 92 Secretora I SUP 31 P 152 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF 41 P 72 <31,25 88 Secretora IV PF 33 P 153 <31,25 <31,25 Secretora II SUP 35 P 73 <31,25 109 Secretora II PF 28 P 154 59,5 353 Proliferativa IV PF 38 P 74 <31,25 47 Secretora IV PF + OVA 37 P 155 62,7 220 Proliferativa II SUP 42 P 75 59 554 Proliferativa IV PF + OVA 37 P 156 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 37 P 76 63 129 Proliferativa IV PF 45 P 157 <31,25 <31,25 Secretora II PF 35 P 77 <31,25 <31,25 Proliferativa I SUP 30 P 158 <31,25 80 Proliferativa IV PF 37 P 78 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 27 P 159 <31,25 32 Secretora II PF 38 P 79 37 85 Secretora IV PF 30 P 160 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 33 P 80 <31,25 129 Secretora II PF 36 P 161 54,2 573 Secretora IV PF 38 P 81 <31,25 72 Proliferativa IV PF 34 sMICA(pg/mL) sMICA(pg/mL) Id, identificação do paciente; FP, fluido peritoneal; ASRM, American Society for Reproductive Medicine ; I: endometriose inicial mínima; II, endometriose inicial leve; III: endometriose avançada moderada; IV: endometriose avançada grave; estádios de acordo com a ASRM; SUP: EDT superficial, OVA: EDT ovariana, PROF: EDT profunda, PROF+OVA: EDT profunda na presença de EDT o variana; sMICA: MICA solúvel; níveis de sMICA determinados por ELISA, <31,25 pg/mL: abaixo do limite inferior de detecção do teste. 215 Continuação Tabela 2. Concentrações de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal e dados clínicos e demográficos das mulheres com endometriose e de controles. B) Grupo controle Id: identificação do paciente; FP: fluido peritoneal; endometriose, sMICA: MICA solúvel; níveis de sMICA determinados por ELISA (pg/mL); <31,25 pg/mL: abaixo do limite inferior de detecção do teste. 216 Tabela 3. Concentrações de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com endometriose e controles, em relação às fases do ciclo menstrual, estádio da doença e localização das lesões de endometriose. A) Níveis de sMICA (pg/mL) nos grupos endometriose e controle, de acordo com a fase do ciclo menstrual. Fase do ciclo n média (DP) mediana (min-max) p a n média (DP) mediana (min-max) p a p b Proliferativa 62 39,5 (21,9) <31,25 (<31,25-145) 37 <31,25 (0,3) <31,25 (<31,25-32) 0,0012 Secretora 99 41,2 (25,9) 53 (<31,25-893) 29 <31,25 (3,7) <31,25 (<31,25-47,5) 0,1056 Proliferativa 62 119,7 (160,0) <31,25 (<31,25-155) 37 60,3 (57,0) <31,25 (<31,25-239) 0,0278 Secretora 99 121 (143,2) 66 (<31,25-695) 29 45,0 (30,4) <31,25 (<31,25-166) 0,0003 sMICA- ControlessMICA - Endometriose 0,0389 0,4544 SORO FLUIDO PERITONEAL 0,7472 0,4053 sMICA: MICA solúvel; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; Fase proliferativa: 1 o-14o dia do ciclo menstrual; Fase secretora: 15 o- 28o dia do ciclo menstrual; pa: referem -se às comparações entre a fase proliferativa e secretora, no soro e fluido peritoneal, nos grupos endometriose e controles (teste de Mann-Whitney); pb: refere às comparações entre os grupos endometriose e controles em cada fase do ciclo, no soro e fluido peritoneal (teste de Mann-Whitney); em negrito: valores de p significantes (<0,05); n: número de amostras analisadas em cada grupo (a somatória dos valores de n no grupo controle é inferior ao n Total (n=76), pois foram excluídos da a nálise estatística as pacientes cuja fase do ciclo é desconhecida (n=10); níveis de sMICA determinados por ELISA. B) Níveis de sMICA (pg/mL) no grupo endometriose de acordo com os estádios iniciais e avançados e tipos da doença. n Média (DP) Mediana (min-máx) p Média (DP) Mediana (min-máx) p p e Estádios I/II 63 36,9 (19,1) <31,25 (<31,25-148) 105,6 (146,6) 53,5 (<31,25-893) < 0,0001 Estádios III/IV 97 43,0 (26,3) <31,25 (<31,25-155) 130,3 (151,1) 72,0 (<31,25-695) < 0,0001 SUP 13 34,5 (11,1) <31,25 (<31,25-62,7) 73,5 (70,26) <31,25 (<31,25-222) 0,0547 OVA 11 58,7 (44,47) <31,25 (<31,25-145) 192,5 (233,7) 58,0 (<31,25-695) 0,1273 PROF 99 37,97 (20,9) <31,25 (<31,25-155) 115,1 (146,6) 59,0 (<31,25-893) < 0,0001 PROF + OVA 38 44,11 (24,29) <31,25 (<31,25-121) 129,8 (144,1) 94,0 (<31,25-694) < 0,0001 0,3320d 0,1127b 0,1771a sMICA - Soro sMICA - Fluido peritoneal 0,1654c sMICA: MICA solúvel; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; SUP: endometriose superficial de peritônio; OVA: OVA, endometriose ovariana com ou sem doença peritoneal e sem endometriose profunda; PROF: endometriose profunda com ou sem doença peritoneal e sem ovariana; OVA + PROF: PROF na presença de OVA; estádios I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a rASRM; em negrito: valores de p significantes (<0,05); níveis de sMICA determinados por ELISA. a valor de p: estádios I/II vs III/IV, no soro, teste de Mann-Whitney; b valor de p :estádios I/II vs III/IV, no fluido peritoneal, teste de Mann-Whitney; c valor de p referente à comparação entre os tipos de endometriose, no soro, teste de Kruskal-Wallis; d valor de p referente à comparação entre os tipos de endometriose, no Fluido peritoneal, teste de Kruskal-Wallis; e valores de p referentes à comparação entre grupo endometriose e grupo controles, em estádios e tipos de endometriose, teste de Mann-Whitney. 217 Tabela 4. Pontos de cortes estabelecidos para níveis de sMICA no soro e fluido peritoneal, e possíveis medidas diagnósticas. Variável Ponto de corte sMICA (pg/mL) AUC (IC 95% ) Sensibilidade (% ) Especificidade (% ) EDT total soro 33,5 0,604 (0,59-0,73) 27 93 FP 32,0 0,660 (0,53-0,68) 60 64 EDT I/II soro 33,5 0,578 (0,48-0,68) 23 97 FP 40,5 0,619 (0,52-0,71) 52 67 EDT III/IV soro 34,8 0,623 (0,54-0,71) 31 95 FP 44,5 0,684 (0,61-0,76) 60 67 EDT I soro 45,3 0,498 (0,36-0,63) 4 97 FP 50,0 0,531 (0,53-0,68) 38 29 EDT II soro 37,5 0,627 (0,51-0,74) 23 96 FP 40,5 0,674 (0,57-0,78) 62 67 EDT III soro 40,0 0,595 (0,47-0,72) 24 97 FP 55,0 0,646 (0,53-0,76) 53 74 EDT IV soro 34,8 0,638 (0,54-0,73) 33 95 FP 40,0 0,704 (0,61-0,79) 67 67 AUC: área sob a curva; EDT: grupo endometriose; EDT total: todos os sujeitos de pesquisa estudad os; EDT I/II: estádios iniciais; EDT III/IV: estádios avançados de EDT; estádios de acordo com rASRM; n: número de amostras analisadas em cada grupo; FP: fluido peritoneal; IC: intervalo de confiança; em negrito: valor da AUC considerada discriminatória. ’ Figura 2. Curva ROC para níveis de sMICA no soro e no fluido peritoneal entre mulheres com endometriose estádio IV e controles saudáveis . sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peritoneal; Estádio IV: estádio avançado (grave) da endometriose, de acordo com rASRM; ROC: do inglês, Receiver Operating Curve ; sMICA no soro: valor de corte= 34,8pg/mL, sensibilidade= 33% e especificidade= 95% (5% de falsos positivos), AUC: 0,638 (IC 95: 0,54 -0,73); sMICA no FP: valor de corte= 40pg/mL, sensibilidade= 67% e especifi cidade= 67% (33% de falsos positivos), AUC= 0,704 (IC95%: 0,61 -0,79); a sensibilidade indica a probabilidade de um caso de endometriose ser corretamente diagnosticado (verdadeiro positivo) e a especificidade, indica os verdadeiros negativos. 218 ANEXO X. ATIVIDADE EFETORA DE CÉLULAS NK Tabela 1. Frequência de células K562 com expressão de MICA e sua intensidade de fluorescência, com e sem bloqueio para MICA, e a análise da efetividade do bloqueio, de células utilizadas nos ensaios de moléculas relacionadas à atividade efetora de células NK (CD107a, IFN-y e IL-10). Experimento Células Vivas Células Vivas % expressão (%) MFI % expressão (%) expressão (%) MFI (%) 1 86,7 28,4 2046 87,2 12,5 1616 55,9 21,0 2 94,0 34,0 2377 94,6 22,5 2046 33,8 13,9 3 95,2 43,2 2145 95,4 8,56 1761 80,2 17,9 4 91,2 56,1 2584 93,9 44,9 2184 19,9 15,5 5 87,0 22,4 2778 88,3 7,75 1290 65,4 53,6 6 94,8 42,2 2041 96,0 13,1 1349 68,9 33,9 7 95,1 24,8 1644 95,7 6,43 1169 74,1 28,9 8 91,2 38,2 1841 95,5 13,9 1141 63,6 38,0 9 93,2 49,7 2241 95,1 18,6 1418 62,6 36,7 10 91,3 43,8 1368 93,0 12,3 876 71,9 36,0 11 85,6 48,7 1110 88,6 18,4 733 62,2 34,0 Mediana 91,3 42,2 2046 94,6 13,1 1349 63,6 33,9 (min-max) (85,6-95,2) (22,4-56,1) (1110-2778) (87,2-96,0) (6,4-44,9) (733-2184) (19,9-80,2) (13,9-53,6) Efetividade do bloqueio para MICA MICA MICA K562 K562BLOQ MFI: mediana de intensidade de fluorescência; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína MICA; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; viabilidade celular foi avaliada utilizando-se o marcador LIVE/DEAD™ FixableAqua (descrito no item 3.9.1, Métodos). 219 Tabela 2. Análise da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, entre as subpopulações de células NK, no grupo de mulheres com endometriose e controles, no estado basal de cultura (sem estímulo). A) Grupo endometriose EDT CD107a IL-10 Subpopulações n med min-max p n med min-max p n med min-max p NK totais 21 358 217-449 21 84 36-321 17 127 3-263 CD56dim 21 350 206-426 21 84 37-324 18 119 3-252 CD56brigth 18 469 362-606 18 81 35-304 15 143 74-265 CD56dimCD16+ 20 347 3-454 20 76 35-313 17 90 3-452 CD56dimCD16- 20 303 222-460 20 80 38-339 17 144 119-253 CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 16 462 362-659 16 69 34-297 13 158 125-245 Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) IFN-γ < 0,0001 0,0164ns EDT: grupo endometriose; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade d e fluorescência (intensidade de expressão); ns: valor de p não significante (p ≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Kruskal-Wallis; CD107a: CD56bright > NK totais ( p≤ 0,001), CD56 bright> CD56 dim (p≤ 0,001), CD56 bright > CD56 dimCD16+ (p≤ 0,001), CD56bright > CD56dimCD16- (p≤ 0,0001), CD56 brightCD16- > NK totais (p≤ 0,01), CD56dim >CD56brightCD16- (p≤ 0,001), CD56dimCD16+ > CD56 brightCD16- (p≤ 0,001), CD56 dimCD16- > CD56 brightCD16- (p≤ 0,0001), diferenças entre subpopulações com teste Kruskal-Wallis e pós teste de Dunn. IL-10: CD56bright> NK totais ( p= 0,0358), CD56 bright> CD56 dim (p= 0,0293), CD56 brightCD16- >CD56dimCD16+ > ( p= 0,0329), CD56 brightCD16- >CD56dim > ( p= 0,0104), CD56 dimCD16- > CD56 dim (p= 0,0199), CD56 dimCD16- > CD56dimCD16+ (p= 0,0477), diferenças entre subpopulações com teste Kruskal-Wallis e com pós teste de Mann- Whitney: B) Grupo controle CTR CD107a IL-10 Subpopulações n med min-max p n med min-max p n med min-max p NK totais 20 336 209-411 20 97 6-210 16 49 1-166 CD56dim 20 328 208-413 20 99 3-231 16 37 1-164 CD56brigth 18 452 312-556 18 93 72-215 16 132 70-195 CD56dimCD16+ 19 322 208-404 19 93 3-201 16 3 1-176 CD56dimCD16- 19 340 231-439 19 122 71-254 15 140 123-184 CD56brightCD16+ 9 489 281-530 9 155 76-224 8 83 3-140 CD56brightCD16- 17 438 309-573 15 104 73-214 13 143 92-209 Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) IFN-γ < 0,0001 ns < 0,0001 CTR grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+, MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expres são); ns: valor de p não significante (p ≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste inicial de Kruskal-Wallis; diferenças entre subpopulações com teste Kruskal-Wallis e pós teste de Dunn: CD107a: CD56bright> CD56 dim (p≤ 0,05), CD56 brightCD16+ > CD56 dim (p≤ 0,05), CD56 brightCD16- > CD56 dim (p≤ 0,05), CD56bright >CD56dimCD16+ (p≤ 0,001), CD56bright >CD56dimCD16- (p≤ 0,05), CD56brightCD16+ >CD56dimCD16+ (p≤ 0,05), CD56brightCD16- > CD56 dimCD16+ (p≤ 0,001), CD56 brightCD16+ >CD56dimCD16- (p≤ 0,05), CD56 brightCD16- >CD56dimCD16- (p≤ 0,05) IL-10: CD56bright > CD56 dimCD16+ (p≤ 0,05), CD56 brightCD16- > NK totais ( p≤ 0,01), CD56 brightCD16- > CD56 dim (p≤ 0,01), CD56brightCD16- > CD56dimCD16+ (p≤ 0,001), CD56brightCD16- > CD56brightCD16+ (p≤ 0,05), CD56dimCD16- > NK totais (p≤ 0,05), CD56dimCD16- > CD56dim (p≤ 0,05), CD56dimCD16- > CD56dimCD16+ (p≤ 0,01). 220 Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL-10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. A) NK totais • Grupo endometriose K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 63,6 13,2 17,8 3,6 2,9 -0,1 -0,3 P055 62,6 25,8 23,5 5,5 6,9 -0,7 -0,6 P059 80,2 6,7 9,8 2,6 3,0 NT NT P066 NT 10,0 23,7 11,6 12,1 -0,8 -0,6 P069 19,9 13,2 18,2 -0,5 1,5 1,1 0,6 P071 68,9 26,9 25,9 4,0 3,3 -0,1 0,6 P077 19,9 32,2 26,2 2,4 0,5 0,3 -0,3 P090 65,4 9,6 7,3 -0,7 -0,8 -0,3 -0,6 P091 74,1 3,5 6,4 3,9 2,2 -0,4 -0,4 P118 80,2 17,9 11,6 -10,8 -7,1 0,7 0,2 P128 55,9 18,9 16,8 7,6 7,1 NT NT P132 NT 12,3 14,7 7,5 9,4 0,4 0,4 P137 80,2 5,7 6,2 6,1 -3,0 NT NT P139 62,6 14,5 15,9 4,2 4,5 -0,4 0,1 P140 63,6 23,4 18,9 8,6 9,1 0,7 0,4 P141 62,6 7,5 6,9 2,0 3,1 -0,3 -0,2 P145 19,9 32,7 45,3 2,9 5,9 0,8 0,8 P146 33,8 13,8 5,2 4,6 1,8 3,2 -0,2 P147 62,6 15,9 9,8 2,1 0,9 0,4 0,2 P148 62,6 15,7 17,9 3,2 5,6 -0,3 -0,2 P155 NT 60,4 18,8 0,4 2,1 NT NT mediana 62,6 14,5 16,8 3,6 3,0 -0,1 -0,2 (min-max) (19,9-80,2) (3,5-60,4) (5,2-45,3) (-10,3-11,6) (-7,1-12,1) (-0,8-3,2) (-0,6-0,8) Células NK totais % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo estímulo estímuloEDT K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 38,0 74 71 5 4 -8 -10 P055 36,7 73 90 9 12 22 33 P059 17,9 -13 -15 17 -9 NT NT P066 NT 90 135 13 11 23 19 P069 15,5 10 83 -56 -29 -44 -31 P071 33,9 86 46 14 11 18 -8 P077 15,5 221 208 -66 -69 -85 -98 P090 53,6 50 40 -2 1 -8 -2 P091 28,9 -8 -1 -8 -9 -11 -21 P118 17,9 34 87 -39 -11 19 28 P128 21,0 146 127 18 10 NT NT P132 NT 40 49 13 19 10 16 P137 17,9 54 42 1 -24 NT NT P139 36,7 37 37 13 13 18 0 P140 38,0 90 71 12 12 -2 0 P141 36,7 40 57 -2 1 -13 -16 P145 15,5 89 175 -23 32 -28 12 P146 13,9 134 12 0 -2 10 -14 P147 36,7 49 46 -1 -2 0 0 P148 36,7 75 83 -5 0 0 2 P155 NT -14 24 -17 -3 NT NT mediana 31,4 54,0 57,0 -0,3 0,5 0,0 0,0 (min-max) (13,9-53,6) (-14-221 (-15-208) (-66-18) (-69-32) (-85-23) (-98-33) estímulo estímulo IFN-γ (MFI) Células NK totais % bloqueio para MICA em K562 EDT IL-10 (MFI ) estímulo CD107a (MFI ) EDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+, MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão), min: valor mínimo, max: valor máximo. K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo) K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo) NT: não testado ; valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 221 Continuação Tabela 3. Frequência e intensida de de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. • Grupo controle K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 68,9 17,0 17,8 3,0 2,6 0,1 0,2 C28 74,1 21,2 13,0 7,5 5,3 0,1 NT C30 19,9 -5,1 19,7 1,0 -0,3 0,6 0,6 C32 NT 18,0 NT 6,4 NT 0,9 NT C33 33,8 28,4 25,5 4,1 5,7 0,5 0,3 C35 19,9 34,4 47,0 4,3 5,3 -0,9 -1,0 C38 80,2 18,2 16,2 5,1 11,2 -0,1 -0,1 C39 NT 26,8 15,4 9,4 7,6 -0,3 1,4 C42 68,9 41,1 42,2 14,9 15,5 -0,2 0,1 C43 68,9 26,4 -0,9 4,6 0,4 0,4 0,6 C44 68,9 4,2 4,7 0,1 -0,2 NT NT C66 68,9 15,1 16,1 2,0 3,2 0,0 1,6 C72 74,1 13,2 8,9 4,2 2,1 NT NT C73 62,2 20,3 23,3 3,8 4,5 -0,5 0,0 C76 62,2 16,6 9,8 2,7 0,9 0,9 0,3 C77 74,1 34,8 17,3 3,7 6,3 -0,5 -0,4 C78 71,9 27,3 20,8 10,8 11,2 -0,3 0,2 C79 71,9 -6,4 7,8 1,2 2,2 NT NT C80 62,2 31,9 32,5 7,2 6,9 NT NT C81 62,2 30,2 31,1 10,5 3,5 0,5 1,5 mediana 68,9 20,7 17,3 4,2 4,5 0,0 0,3 (min-max) (19,9 - 74,1) (-6,4 - 41,1) (-0,9 - 47,0) (0,1 - 14,9) (-0,3 - 15,5) (-0,9 - 0,9) (-1,0 - 1,6) CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) estímulo Células NK totais IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo estímulo K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 33,9 85 112 17 -8 31 24 C28 28,9 67 38 11 -2 -18 NT C30 15,5 116 51 -1 18 -5 16 C32 NT 73 NT 12 NT 38 NT C33 13,9 130 117 -10 -3 -17 -9 C35 15,5 122 195 -12 -9 -10 -21 C38 17,9 89 105 30 19 74 80 C39 NT 110 51 19 21 9 37 C42 33,9 141 199 42 56 52 100 C43 33,9 86 -2 -13 24 12 50 C44 33,9 145 17 -34 32 NT NT C66 33,9 47 87 13 16 55 56 C72 28,9 51 -41 -8 -38 NT NT C73 34,0 108 99 32 43 0 0 C76 34,0 53 23 25 18 16 0 C77 28,9 124 170 -2 1 -9 -11 C78 36,0 84 83 72 75 0 0 C79 36,0 22 72 54 125 NT NT C80 34,0 110 112 25 11 NT NT C81 34,0 180 198 37 56 0 56 mediana 33,9 98,5 87,0 14,8 18,0 4,7 19,8 (min-max) (13,9 - 36,0) (22 - 180) (-41,0 - 199) (-34 - 72) (-38-125) (-18-740 (-21-100) Células NK totais CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) estímulo estímulo IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) estímulo CTR: grupo co ntrole com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; valores negativos: valores o nde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 222 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de cél ulas K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. B) CD56dim • Grupo endometriose K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 63,6 12,7 18,6 3,6 3,1 -0,5 -0,3 P055 62,6 29,8 25,3 7,6 9,5 -0,1 -0,1 P059 80,2 8,3 6,1 4,5 -0,2 NT NT P066 NT 12,2 37,4 14,8 15,2 -1,0 0,5 P069 19,9 24,9 37,8 -1,5 2,1 1,8 0,2 P071 68,9 27,3 30,0 4,3 4,8 -0,3 0,3 P077 19,9 26,6 34,8 0,6 0,7 0,4 -0,3 P090 65,4 13,3 13,6 -0,8 -0,5 -0,5 -0,7 P091 74,1 3,1 6,1 4,1 2,2 -0,2 -0,1 P118 80,2 21,3 6,1 -10,8 -6,5 -0,8 -1,3 P128 55,90 17,8 16,7 10,2 8,3 0,5 -0,2 P132 NT 18,9 20,8 8,6 9,0 0,4 0,5 P137 80,2 10,8 8,6 8,9 -3,4 NT NT P139 62,6 13,0 16,8 4,1 4,4 -0,5 0,2 P140 63,6 37,4 20,6 10,9 10,8 0,1 0,2 P141 62,6 8,8 5,3 2,3 3,6 0,5 0,2 P145 19,9 34,1 26,4 2,5 5,3 -0,6 -0,5 P146 33,8 -6,1 -19,6 4,7 1,9 2,9 -0,2 P147 62,6 18,9 12,4 2,0 0,5 0,6 0,1 P148 62,6 16,4 18,5 3,9 6,6 -0,1 -0,2 P155 NT 14,3 20,2 0,8 2,5 NT NT mediana 62,6 16,4 18,5 4,1 3,1 -0,1 -0,1 (min-max) (19,9-80,2) (-6,1-37,4) (-19,6-37,8) (-10,8-14,8) (-6,5-15,2) (-1,0-2,9) (-1,3-0,5) EDT % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) estímulo estímulo estímulo IL-10 (% ) células CD56dim K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 38,0 81 84 5 4 -9 -12 P055 36,7 85 95 14 17 31 47 P059 17,9 -33 -21 11 -12 NT NT P066 NT 97 139 18 15 38 35 P069 15,5 4 98 -58 -26 -51 -31 P071 33,9 98 87 23 17 25 6 P077 15,5 217 226 -57 -68 -70 -86 P090 53,6 41 41 -1 2 -2 3 P091 28,9 10 15 -5 -6 0 -9 P118 17,9 36 94 -38 -8 33 43 P128 21,0 147 143 23 13 18 1 P132 NT 38 48 15 21 10 16 P137 17,9 51 41 1 -22 NT NT P139 36,7 26 36 14 15 3 0 P140 38,0 88 64 13 13 -1 2 P141 36,7 39 69 -1 4 -11 -13 P145 15,5 98 176 -20 29 -26 13 P146 13,9 134 7 0 -2 9 -14 P147 36,7 44 40 0 -2 0 0 P148 36,7 70 84 -4 1 0 0 P155 NT -26 18 -17 -2 NT NT mediana 31,4 51,0 69,0 -0,4 2,1 0,0 0,4 (min-max) (13,9-53,6) (-33-217) (-21-226) (-58-23) (-68-29) (-70-38) (-86-47) estímulo IL-10 (MFI )% bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) IFN-γ (MFI) estímulo estímuloEDT células CD56dim EDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+, MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão), min: valor mínimo, max: valor máximo. K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo) K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo) NT: não testado, valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 223 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individ uais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. • Grupo controle K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 68,9 21,3 30,7 3,4 2,4 0,2 0,3 C28 74,1 -2,4 -13,8 7,4 4,4 -0,4 NT C30 19,9 -6,5 14,4 1,4 -0,2 0,8 0,5 C32 NT 21,3 NT 6,7 NT 0,9 NT C33 33,8 29,9 27,4 4,1 5,7 0,5 0,3 C35 19,9 36,9 53,3 4,2 5,7 -0,8 -0,9 C38 80,2 23,8 14,4 5,7 10,1 0,4 -0,1 C39 NT 33,6 20,0 10,9 5,9 -0,2 1,5 C42 68,9 43,1 45,9 16,3 17,0 -0,1 0,3 C43 68,9 18,4 -2,0 4,9 0,4 0,5 0,6 C44 68,9 -0,6 2,1 0,2 0,0 NT NT C66 68,9 16,3 23,1 2,6 3,9 -0,2 1,1 C72 74,1 13,6 8,9 4,2 2,3 NT NT C73 62,2 22,0 25,0 3,2 4,5 -0,6 -0,1 C76 62,2 15,7 10,9 2,3 0,8 2,1 0,7 C77 74,1 39,5 46,8 4,0 6,7 -0,5 -0,2 C78 71,9 27,5 22,0 11,9 10,7 0,0 0,4 C79 71,9 -3,8 11,6 1,5 3,7 NT NT C80 62,2 28,3 33,1 9,2 8,3 NT NT C81 62,2 32,8 36,7 11,5 3,4 0,4 1,2 mediana 68,9 21,6 22,0 4,2 4,4 0,1 0,3 (min-max) (19,9-80,2) (-6,5-43,1) (-13,8-53,3) (0,2-16,3) (-0,2-17) (-0,8-2,1) (-0,9-1,5) estímulo estímulo estímulo IFN-γ (%) IL-10 (% ) células CD56dim CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 33,9 68 100 17 -7 32 27 C28 28,9 58 39 13 1 -16 NT C30 15,5 123 50 -1 18 -5 15 C32 NT 72 NT 12 NT 39 NT C33 13,9 129 117 -10 -3 -18 -9 C35 15,5 125 214 -13 -8 -11 -20 C38 17,9 82 94 29 24 65 80 C39 NT 107 49 21 22 9 36 C42 33,9 153 199 45 60 56 103 C43 33,9 81 -5 -15 22 23 61 C44 33,9 147 20 -32 34 NT NT C66 33,9 39 85 14 20 80 77 C72 28,9 52 -38 -9 -37 NT NT C73 34,0 113 102 38 50 0 0 C76 34,0 50 24 26 17 3 0 C77 28,9 127 177 -3 2 -12 -13 C78 36,0 86 85 72 67 0 0 C79 36,0 32 87 57 138 NT NT C80 34,0 132 161 28 9 NT NT C81 34,0 188 207 46 64 0 59 mediana 33,9 96,5 87,0 15,6 20,1 1,5 21,2 (min-max) (13,9-36) (32-188) (-38-214) (-32-72) (-37-138) (-18-80) (-20-103) estímulo estímulo estímuloCTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) IFN-γ (MFI) células CD56dim IL-10 (MFI ) CTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máxi mo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo; NT: não testado; valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 224 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio par a MICA, em mulheres com endometriose e controles. C) CD56bright • Grupo endometriose K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 63,6 18,2 10,8 4,7 1,3 2,0 0,6 P055 62,6 17,6 20,1 5,2 7,8 -2,9 -2,4 P059 80,2 NA 12,6 NA -1,0 NT NT P066 NT 4,6 27,8 2,7 6,4 0,4 -1,1 P069 19,9 NA NA NA NA NA NA P071 68,9 29,0 NA 0,7 NA 0,0 NA P077 19,9 34,4 31,3 0,6 -0,7 1,1 0,4 P090 65,4 9,5 12,6 -4,0 -5,1 1,9 -0,6 P091 74,1 NA NA NA NA NA NA P118 80,2 17,6 15,6 4,0 11,0 -5,0 -5,4 P128 55,90 30,2 26,7 4,3 4,3 1,0 0,5 P132 NT 17,7 16,3 8,2 5,0 -0,2 -0,2 P137 80,2 5,2 12,2 8,3 1,8 NT NT P139 62,6 23,5 13,4 10,5 4,8 0,0 -0,1 P140 63,6 12,9 -1,3 -0,2 1,2 0,1 0,1 P141 62,6 NA NA NA NA NA NA P145 19,9 44,1 NA 0,9 NA 1,8 NA P146 33,8 28,4 18,4 4,1 -0,1 4,9 0,3 P147 62,6 22,2 21,3 8,0 7,5 -0,6 0,0 P148 62,6 19,9 21,1 4,4 7,4 -1,5 -1,3 P155 NT 12,7 24,1 1,7 2,4 NT NT mediana 62,6 18,2 17,3 4,1 3,4 0,1 -0,1 (min-max) (19,9-80,2) (4,6-44,1) (-1,3-31,3) (-4,0-10,5) (-5,1-11,0) (-5,0-4,9) (-5,4-0,6) estímulo estímulo estímuloEDT CD107a (% ) IFN-γ (%)% bloqueio para MICA em K562 IL-10 (% ) células CD56bright K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 38 54 33 4 1 7 -4 P055 37 62 98 -1 -4 -14 -22 P059 18 NA 23 NA -68 NT NT P066 NT 40 90 -2 -1 -5 -12 P069 16 NA NA NA NA NT NA P071 34 42 NA -18 NA -21 NA P077 16 170 298 -72 -84 -51 -53 P090 54 34 26 0 0 -10 -10 P091 29 NA NA NA NA NA NA P118 18 23 53 -51 -30 -41 -39 P128 21 161 116 6 4 1 -16 P132 NT 60 65 0 2 9 19 P137 18 57 55 -6 -37 NT NT P139 37 118 99 9 4 -6 -9 P140 38 30 58 2 8 -3 4 P141 37 NA NA NA NA NA NA P145 16 44 NA -28 NA -46 NA P146 14 205 51 10 0 7 -19 P147 37 84 75 2 4 -28 -15 P148 37 112 123 -9 -1 -45 -22 P155 NT -54 22 -20 -7 NT NT mediana 31 57 62 -1 -1 -10 -15 (min-max) (14-54) (-54-205) (22-298) (-72-10) (-84-8) (-51-9) (-53-19) estímulo estímulo estímulo IL-10 (MFI )IFN-γ (MFI)% bloqueio para MICA em K562 EDT CD107a (MFI ) células CD56bright EDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 225 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com end ometriose e controles. • Grupo controle K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 68,9 39,3 39,6 4,3 5,4 0,4 0,4 C28 74,1 NA 28,7 NA 15,8 NT NT C30 19,9 16,0 0,0 -1,5 -1,8 0,6 -0,1 C32 NT 16,3 NT 3,6 NT -0,7 NT C33 33,8 55,4 48,6 6,6 6,6 -0,1 -0,1 C35 19,9 19,7 21,0 -0,5 1,0 -0,6 -1,0 C38 80,2 8,7 18,0 1,9 11,2 -0,8 1,4 C39 NT 6,4 2,5 3,7 5,3 -1,9 -0,7 C42 68,9 48,6 35,2 11,3 21,4 -1,4 -1,4 C43 68,9 58,5 15,5 8,3 0,7 1,0 NT C44 68,9 NA NA NA NA NA NA C66 68,9 23,0 14,4 3,4 5,8 2,1 1,6 C72 74,1 26,4 17,4 11,9 4,2 NT NT C73 62,2 46,8 43,9 4,7 2,7 -6,2 -4,9 C76 62,2 41,0 24,1 9,5 12,0 8,7 -0,5 C77 74,1 20,1 25,6 5,7 9,0 2,1 0,8 C78 71,9 22,2 41,3 11,2 14,3 NA 4,8 C79 71,9 NA NA NA NA NA NA C80 62,2 14,9 5,0 1,3 3,7 NT NT C81 62,2 36,6 38,0 10,3 6,8 -3,2 -2,4 mediana 68,9 23,0 24,1 4,7 5,8 -0,3 -0,1 (min-max) (19,9-80,2) (6,4-58,5) (0-48,6) (-1,5-11,9) (-1,8-21,4) (-6,2-8,7) (-4,9-4,8) estímulo estímulo % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo células CD56bright CTR K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 33,9 224 220 21 -6 3 -17 C28 28,9 NA 62 NA -2 NT NT C30 15,5 117 52 6 6 -17 12 C32 NT 92 NT 11 NT 19 NT C33 13,9 219 186 -5 2 -14 -13 C35 15,5 79 168 -30 -27 -13 -30 C38 17,9 96 143 18 8 23 23 C39 NT 96 75 15 24 0 NT C42 33,9 777 546 46 44 18 22 C43 33,9 240 -3 -8 30 -12 NT C44 33,9 NA NA NA NA NA NA C66 33,9 62 81 7 5 9 8 C72 28,9 103 -33 5 -32 NT NT C73 34,0 214 192 64 64 31 10 C76 34,0 102 39 38 31 5 -4 C77 28,9 83 159 -1 4 -4 -20 C78 36,0 80 30 41 24 NA 22 C79 36,0 NA NA NA NA NA NA C80 34,0 22 -29 17 33 NT NT C81 34,0 193 183 13 25 -1 -1 mediana 33,9 102 81 13 8 2 4 (min-max) (13,9-36,0) 22-777) (-33-546) (-30-64) (-32-64) (-17-31) (-30-23) estímulo estímulo % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) CTR estímulo células CD56bright IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) CTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa, NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+, MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo, max: valor máximo. K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo) K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem e stímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100), valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 226 Continuação Tabela 3. Frequência e in tensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. D) CD56dimCD16+ • Grupo endometriose K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 63,6 32,1 15,8 0,3 -0,2 -0,7 -0,4 P055 62,6 28,0 35,4 3,1 6,6 -0,3 1,3 P059 80,2 20,5 28,7 17,6 -5,4 NT NT P066 NT 9,0 31,4 9,2 8,8 -1,1 -0,3 P069 19,9 -12,0 60,7 1,0 -3,0 1,3 0,0 P071 68,9 38,1 29,4 0,0 -0,4 -0,6 -0,6 P077 19,9 19,6 39,2 0,7 -0,7 1,0 -0,1 P090 65,4 8,3 17,2 0,2 0,3 -1,1 0,3 P091 74,1 NA NA NA NA NA NA P118 80,2 26,9 13,7 -9,4 -10,6 -0,1 0,8 P128 55,9 37,0 34,3 8,6 6,6 1,3 0,8 P132 NT 15,9 16,3 5,8 4,7 0,5 0,7 P137 80,2 9,3 5,8 6,6 -4,7 NT NT P139 62,6 15,6 18,0 3,6 5,8 -0,8 -0,1 P140 63,6 45,7 36,7 5,2 4,2 0,3 0,4 P141 62,6 22,6 34,0 5,9 9,6 -0,5 -0,5 P145 19,9 31,7 58,3 -1,8 -0,4 0,0 0,3 P146 33,8 -5,7 -20,6 3,0 3,3 3,1 0,1 P147 62,6 21,6 18,8 1,9 0,1 0,6 0,0 P148 62,6 20,0 29,3 2,9 3,8 -0,4 -0,7 P155 NT 16,1 27,5 3,3 7,5 NT NT mediana 62,6 20,3 29,0 3,0 1,8 -0,1 0,0 (min-max) (19,9-80,2) (-12-45,7) (-20,6-60,7) (-9,4-17,6) (-10,6-9,6) (-1,1-3,1) (-0,7-1,3) células CD56dimCD16+ estímulo estímuloEDT % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 38,0 68 51 2 2 -14 -9 P055 36,7 58 74 -3 13 0 0 P059 17,9 27 84 -5 -25 NT NT P066 NT 74 112 13 8 24 29 P069 15,5 -27 55 -73 -60 -146 -137 P071 33,9 81 12 11 -15 79 47 P077 15,5 163 167 -74 -88 -245 -255 P090 53,6 12 25 -5 0 -29 -12 P091 28,9 NA NA NA NA NA NA P118 17,9 55 109 -45 -19 42 67 P128 21,0 148 131 19 7 0 0 P132 NT 28 32 9 13 12 16 P137 17,9 47 35 -5 -26 NT NT P139 36,7 0 0 16 17 41 47 P140 38,0 61 45 5 5 -9 3 P141 36,7 149 166 16 12 0 0 P145 15,5 60 164 -38 15 -27 24 P146 13,9 126 0 -4 -4 7 -14 P147 36,7 44 60 -1 -5 0 0 P148 36,7 60 73 -5 -2 0 0 P155 NT -16 41 -17 0 NT NT mediana 31,4 59,0 57,5 -3,3 -0,1 0,0 0,0 (min-max) (13,9-53,6) (-27-163) (0-167) (-74-19) (-88-17) (-245-79) (-255-67) células CD56dimCD16+ estímulo estímulo estímulo % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) EDT EDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensid ade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 227 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. • Grupo controle K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 68,9 29,2 36,7 1,9 0,4 0,4 0,2 C28 74,1 11,4 10,4 9,6 6,1 -0,4 NT C30 19,9 -6,1 -24,9 0,8 0,4 0,6 0,8 C32 NT 25,4 NT 4,4 NT 1,0 NT C33 33,8 -3,3 30,8 3,9 5,5 0,3 0,2 C35 19,9 30,1 45,6 -0,6 -1,0 -1,4 -1,3 C38 80,2 38,3 38,1 18,5 18,5 0,7 0,0 C39 NT 32,5 18,9 7,5 6,5 -0,4 1,4 C42 68,9 39,0 45,0 4,1 7,8 -0,3 1,1 C43 68,9 26,4 -2,5 1,1 0,0 0,7 NT C44 68,9 NT NT NT NT NT NT C66 68,9 28,2 27,2 -2,6 -0,1 0,5 1,0 C72 74,1 12,2 3,7 0,8 -0,5 NT NT C73 62,2 27,9 25,8 1,2 1,6 -0,9 -0,6 C76 62,2 18,8 9,8 3,3 0,0 1,3 -0,9 C77 74,1 33,3 12,7 1,0 3,1 -0,1 0,6 C78 71,9 29,1 36,8 9,7 10,1 0,4 0,5 C79 71,9 NA NA NA NA NA NA C80 62,2 42,7 45,8 13,9 8,4 NT NT C81 62,2 47,3 -14,1 17,6 3,6 0,6 0,5 mediana 68,9 28,6 25,8 3,6 3,1 0,4 0,5 (min-max) (19,9-80,2) (-6,1-47,3) (-24,9-45,8) (-2,6-18,5) (-1,0-18,5) (-1,4-1,3) (-1,3-1,4) células CD56dimCD16+ CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo estímulo estímulo K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 33,9 71 104 18 -10 14 19 C28 28,9 61 79 8 -3 -18 NT C30 15,5 -231 -231 3 14 337 278 C32 NT 62 NT 10 NT 38 NT C33 13,9 141 125 -10 -3 -17 -7 C35 15,5 51 127 -14 -15 -18 -11 C38 17,9 114 139 28 13 0 0 C39 NT 96 42 16 20 9 39 C42 33,9 78 170 23 40 0 0 C43 33,9 76 -4 -21 23 7 NT C44 33,9 NA NT NA NT NA NT C66 33,9 75 77 24 24 0 0 C72 28,9 40 -48 -15 -43 NT NT C73 34,0 112 94 22 35 0 0 C76 34,0 53 26 43 31 0 0 C77 28,9 109 150 -8 -5 -13 -13 C78 36,0 74 75 31 32 0 0 C79 36,0 NA NA NA NA NA NA C80 34,0 178 278 38 22 NT NT C81 34,0 276 239 49 65 0 0 mediana 33,9 75,5 94,0 17,0 20,0 0,0 0,0 (min-max) (13,9-36,0) (-213-276) (-213-278) (-21-49) (-43-65) (-18-337) (-13-278) células CD56dimCD16+ CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) estímulo IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) estímulo estímulo CTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valo r máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 228 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. E) CD56dimCD16- • Grupo endometriose K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 63,6 10,7 26,4 6,3 5,9 0,2 0,3 P055 62,6 29,6 23,0 9,6 10,5 -0,1 -0,1 P059 80,2 -2,3 -5,4 5,1 1,5 NT NT P066 NT 6,4 19,4 18,9 23,3 -1,5 0,5 P069 19,9 22,7 25,6 -0,8 5,7 -0,2 -0,3 P071 68,9 30,7 34,6 8,1 7,5 -1,9 5,1 P077 19,9 26,7 28,7 2,4 2,4 0,1 -0,2 P090 65,4 25,6 24,4 -1,7 0,7 1,3 0,2 P091 74,1 NA NA NA NA NA NA P118 80,2 15,5 -3,9 -17,8 -14,8 -1,4 -2,3 P128 55,9 13,4 14,6 7,5 9,1 -0,5 -0,9 P132 NT 26,2 31,8 25,6 32,3 2,0 1,3 P137 80,2 17,4 22,7 13,7 6,1 NT NT P139 62,6 8,4 4,6 4,5 5,2 0,7 1,0 P140 63,6 19,7 16,7 14,8 20,1 -0,1 0,6 P141 62,6 -3,8 -9,0 1,7 2,4 0,3 0,5 P145 19,9 23,3 31,0 3,6 7,0 -0,9 -0,3 P146 33,8 -4,3 -15,4 9,8 10,2 2,9 -0,7 P147 62,6 19,8 8,0 3,8 1,0 -0,3 -0,5 P148 62,6 16,7 21,6 9,1 11,3 -0,1 -0,7 P155 NT 5,7 10,1 0,0 1,1 NT NT mediana 62,6 17,1 20,5 5,7 6,0 -0,1 -0,1 (min-max) (19,9-80,2) (-4,3-30,7) (-15,4-34,6) (-17,8-25,6) (-14,8-32,3) (-1,9-2,9) (-2,3-5,1) células CD56dimCD16- estímulo estímuloEDT % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 38,0 123 140 7 7 -12 -19 P055 36,7 85 97 12 14 -17 -9 P059 17,9 -12 -18 35 -3 NT NT P066 NT 141 191 22 25 3 -6 P069 15,5 62 183 -110 -72 -35 -18 P071 33,9 115 244 32 52 -23 -29 P077 15,5 388 252 -50 -46 -37 -40 P090 53,6 74 50 -6 3 -13 10 P091 28,9 NA NA NA NA NA NA P118 17,9 26 112 -31 5 -16 -4 P128 21,0 144 154 28 23 24 7 P132 NT 135 205 73 96 -5 0 P137 17,9 111 131 21 -9 NT NT P139 36,7 46 30 7 13 6 0 P140 38,0 138 134 20 24 4 -5 P141 36,7 14 32 -2 8 -3 -3 P145 15,5 147 196 -14 38 -32 3 P146 13,9 183 39 13 12 14 -13 P147 36,7 44 25 2 -4 -20 -27 P148 36,7 95 103 7 13 -9 -8 P155 NT -39 3 -17 0 NT NT mediana 31,4 103,0 121,5 7,0 9,9 -12,0 -6,0 (min-max) (13,9-53,6) (-39-388) (-18-252) (-110-73) (-72-96) (-37-24) (-40-10) células CD56dimCD16- estímulo estímulo estímulo % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) EDT EDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes particip antes de pesquisa ; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingi ram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 229 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de cél ulas NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. • Grupo controle K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 68,9 12,3 18,3 3,3 3,5 -0,3 -0,1 C28 74,1 -16,8 -16,6 5,1 2,3 NT NT C30 19,9 -4,4 12,1 1,7 -0,7 0,7 0,7 C32 NT 25,1 NT 12,2 NT 0,1 NT C33 33,8 16,2 13,7 4,4 7,1 0,4 0,2 C35 19,9 42,4 56,5 6,0 9,0 -0,4 -1,0 C38 80,2 7,5 -6,3 2,0 1,7 -0,2 -0,5 C39 NT 39,0 30,6 29,3 25,2 -0,9 -0,2 C42 68,9 42,0 35,1 30,3 22,0 0,1 0,2 C43 68,9 14,8 -1,7 9,7 0,5 0,8 0,1 C44 68,9 -7,7 -1,0 0,2 0,0 NT NT C66 68,9 4,8 10,4 3,7 3,8 -0,9 0,6 C72 74,1 22,7 13,3 13,6 6,2 NT NT C73 62,2 15,7 27,1 8,4 9,7 -1,6 -0,7 C76 62,2 17,2 13,3 2,4 1,4 3,3 1,6 C77 74,1 32,3 44,6 8,2 12,5 -0,7 -1,0 C78 71,9 25,2 25,1 13,1 14,8 0,4 1,4 C79 71,9 NA NA NA NA NA NA C80 62,2 9,3 14,0 9,7 10,9 NT NT C81 62,2 18,8 20,7 12,6 2,8 1,1 1,7 mediana 68,9 16,2 13,9 8,2 5,0 0,1 0,2 (min-max) (19,9-80,2) (-16,8-42,4) (-16,6-56,5) (0,2-30,3) (-0,7-25,2) (-1,6-3,3) (-1,0-1,7) células CD56dimCD16- CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo estímulo estímulo K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 33,9 70 99 16 -3 -5 -11 C28 28,9 50 12 18 3 NT NT C30 15,5 149 41 -4 10 -9 5 C32 NT 155 NT 21 NT 3 NT C33 13,9 84 81 -17 -8 -18 -14 C35 15,5 330 321 -11 -6 -6 -27 C38 17,9 77 82 6 1 -3 1 C39 NT 276 162 82 59 -21 -12 C42 33,9 488 233 83 72 14 14 C43 33,9 90 1 -14 14 -19 28 C44 33,9 106 -14 -42 45 NT NT C66 33,9 15 84 9 14 -5 6 C72 28,9 106 -7 16 -22 NT NT C73 34,0 120 212 21 45 -21 -37 C76 34,0 37 10 0 1 5 -2 C77 28,9 155 226 6 15 1 -3 C78 36,0 235 440 50 68 -7 15 C79 36,0 NA NA NA NA NA NA C80 34,0 59 27 27 12 NT NT C81 34,0 98 166 14 4 -4 -8 mediana 33,9 106,0 83,0 14,0 11,0 -5,0 -2,5 (min-max) (13,9-36,0) (15-488) (-14-440) (-42-83) (-22-72) (-21-14) (-37-28) células CD56dimCD16- CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) estímulo IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) estímulo estímulo CTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem e stímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 230 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. F) CD56brightCD16+ • Grupo endometriose K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 63,6 NA NA NA NA NA NA P055 62,6 NA NA NA NA NA NA P059 80,2 NA NA NA NA NA NA P066 NT -1,3 36,5 5,9 9,7 1,8 0,4 P069 19,9 NA NA NA NA NA NA P071 68,9 NA NA NA NA NA NA P077 19,9 NA NA NA NA NA NA P090 65,4 NA NA NA NA NA NA P091 74,1 NA NA NA NA NA NA P118 80,2 NA NA NA NA NA NA P128 55,90 NA NA NA NA NA NA P132 NT NA NA NA NA NA NA P137 80,2 NA NA NA NA NA NA P139 62,6 NA NA NA NA NA NA P140 63,6 NA NA NA NA NA NA P141 62,6 NA NA NA NA NA NA P145 19,9 NA NA NA NA NA NA P146 33,8 39,6 3,2 -6,1 -4,1 6,2 0,6 P147 62,6 7,4 0,2 2,2 5,7 -0,7 1,1 P148 62,6 14,8 9,7 2,0 7,0 -2,5 2,7 P155 NT NA NA NA NA NA NA mediana 62,6 11,1 6,4 2,1 6,4 0,6 0,9 (min-max) (19,9-80,2) (-1,3-39,6) (0,2-36,5) (-6,1-5,9) (-4,1-9,7) (-2,5-6,2) (0,4-2,7) estímulo CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo % bloqueio para MICA em K562 EDT células CD56brightCD16+ estímulo K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 38,0 NA NA NA NA NA NA P055 36,7 NA NA NA NA NA NA P059 17,9 NA NA NA NA NA NA P066 NT 74 110 -3 -6 -16 -9 P069 15,5 NA NA NA NA NA NA P071 33,9 NA NA NA NA NA NA P077 15,5 NA NA NA NA NA NA P090 53,6 NA NA NA NA NA NA P091 28,9 NA NA NA NA NA NA P118 17,9 NA NA NA NA NA NA P128 21,0 NA NA NA NA NA NA P132 NT NA NA NA NA NA NA P137 17,9 NA NA NA NA NA NA P139 36,7 NA NA NA NA NA NA P140 38,0 NA NA NA NA NA NA P141 36,7 NA NA NA NA NA NA P145 15,5 NA NA NA NA NA NA P146 13,9 118 -61 8 -5 26 -20 P147 36,7 39 42 -4 -4 0 0 P148 36,7 44 67 -8 -9 -40 -3 P155 NT NA NA NA NA NA NA mediana 31,4 59,0 54,5 -3,4 -5,4 -8,0 -6,0 (min-max) (13,9-53,6) (39-118) (-61-110) (-8-8) (-9 - -4) (-40-26) (-20-0) células CD56brightCD16+ IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) EDT estímulo estímulo estímulo CD107a (MFI )% bloqueio para MICA em K562 EDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o val or basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 231 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. • Grupo controle K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 68,9 37,0 30,3 0,3 -0,4 0,8 0,3 C28 74,1 NA NA NA NA NA NA C30 19,9 8,6 51,0 -1,0 0,9 0,0 3,3 C32 NT 16,9 NT 6,7 NT 16,9 NT C33 33,8 51,2 48,3 2,1 5,6 0,0 0,3 C35 19,9 NA NA NA NA NA NA C38 80,2 NA NA NA NA NA NA C39 NT 6,0 5,1 4,5 6,6 -3,7 -1,5 C42 68,9 32,3 45,5 8,2 27,7 5,3 0,0 C43 68,9 21,2 20,5 -4,5 -5,8 3,4 NT C44 68,9 NA NA NA NA NA NA C66 68,9 NA NA NA NA NA NA C72 74,1 2,2 2,7 -0,8 -0,8 NT NT C73 62,2 NA NA NA NA NA NA C76 62,2 NA NA NA NA NA NA C77 74,1 NA NA NA NA NA NA C78 71,9 NA NA NA NA NA NA C79 71,9 NA NA NA NA NA NA C80 62,2 NA NA NA NA NA NA C81 62,2 NA NA NA NA NA NA mediana 68,9 19,1 30,3 1,2 0,9 0,8 0,3 (min-max) (19,9-80,2) (2,2-51,2) (2,7-51) (-4,5-8,2) (-5,8-27,7) (-3,7-16,9) (-1,5-3,3) estímuloCTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) células CD56brightCD16+ estímulo estímulo K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 33,9 180 155 18 -12 11 4 C28 28,9 NA NA NA NA NA NA C30 15,5 126 434 3 -3 2 16 C32 NT 52 NT 9 NT 41 NT C33 13,9 194 95 -3 6 -23 -9 C35 15,5 NA NA NA NA NA NA C38 17,9 NA NA NA NA NA NA C39 NT 139 99 2 9 23 54 C42 33,9 92 207 55 38 0 0 C43 33,9 82 -9 -27 47 15 NT C44 33,9 NA NA NA NA NA NA C66 33,9 NA NA NA NA NA NA C72 28,9 84 -27 -2 -38 NT NT C73 34,0 NA NA NA NA NA NA C76 34,0 NA NA NA NA NA NA C77 28,9 NA NA NA NA NA NA C78 36,0 NA NA NA NA NA NA C79 36,0 NA NA NA NA NA NA C80 34,0 NA NA NA NA NA NA C81 34,0 NA NA NA NA NA NA mediana 33,9 109,0 99,0 2,5 6,4 11,0 4,0 (min-max) (13,9-36) (52-194) (-27-434) (-27-55) (-38-47) (-23-41) (-9-54) estímulo IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) estímulo células CD56brightCD16+ estímulo CTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a pro teína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 232 Continuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometr iose e controles. G) CD56brightCD16- • Grupo endometriose K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 63,6 26,8 33,7 5,7 3,7 1,3 0,2 P055 62,6 19,4 30,6 16,3 22,7 -7,7 -7,8 P059 80,2 NA NA NA NA NA NA P066 NT 4,4 24,1 0,9 4,1 0,1 -1,4 P069 19,9 NA NA NA NA NA NA P071 68,9 24,9 25,9 6,5 -1,8 0,3 -2,3 P077 19,9 14,6 21,6 -0,4 -4,3 -2,6 -3,5 P090 65,4 18,1 8,4 -0,7 -3,4 1,5 -0,5 P091 74,1 NA NA NA NA NA NA P118 80,2 15,2 7,4 -19,6 -15,4 NT NT P128 55,90 37,2 36,1 3,4 4,5 2,4 0,5 P132 NT 14,3 14,7 7,1 5,1 -0,1 0,3 P137 80,2 10,7 11,1 4,2 -7,5 NT NT P139 62,6 25,8 19,2 9,7 5,0 -0,7 -1,3 P140 63,6 21,3 -4,2 8,4 2,9 -0,6 0,1 P141 62,6 NA NA NA NA NA NA P145 19,9 NA NA NA NA NA NA P146 33,8 37,4 34,3 6,7 1,2 3,5 -0,6 P147 62,6 28,3 28,9 7,9 7,8 -0,5 -0,6 P148 62,6 35,1 27,7 7,5 8,2 -0,8 -1,1 P155 NT 12,6 25,9 -2,2 -1,5 NT NT mediana 62,6 20,3 25,0 6,1 3,3 -0,1 -0,6 (min-max) (19,9-80,2) (4,4-37,4) (-4,2-36,1) (-19,6-16,3) (-15,4-22,7) (-7,7-3,5) (-7,8-0,5) CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo estímulo estímulo células CD56brightCD16- EDT % bloqueio para MICA em K562 K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ P054 38,0 61 52 6 3 13 -2 P055 36,7 121 191 13 27 -14 -28 P059 17,9 NA NA NA NA NA NA P066 NT 31 79 -2 0 -6 -12 P069 15,5 NA NA NA NA NA NA P071 33,9 38 -24 -11 -13 -19 -62 P077 15,5 130 238 -75 -80 -42 -34 P090 53,6 50 28 1 0 3 4 P091 28,9 NA NA NA NA NA NA P118 17,9 26 35 -48 -31 NT NT P128 21,0 130 112 7 5 -19 -19 P132 NT 60 62 2 5 16 25 P137 17,9 53 43 -4 -34 NT NT P139 36,7 149 116 7 8 -15 -14 P140 38,0 21 54 12 10 4 7 P141 36,7 NA NA NA NA NA NA P145 15,5 NA NA NA NA NA NA P146 13,9 231 110 12 2 6 -22 P147 36,7 109 94 2 5 -37 -29 P148 36,7 162 172 -9 2 -22 -5 P155 NT -69 -2 -20 -9 NT NT mediana 31,4 60,5 70,5 1,4 2,0 -14,0 -14,0 (min-max) (13,9-53,6) (-69-231) (-24-238) (-75-13) (-80-27) (-42-16) (-62-25) estímulo estímulo estímuloEDT IL-10 (MFI ) % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) IFN-γ (MFI) células CD56brightCD16- EDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: med iana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 233 Continuação Tab ela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles • Grupo controle K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 68,9 40,4 42,0 4,4 6,8 -0,6 -0,6 C28 74,1 NA NA NA NA NA NA C30 19,9 15,5 2,7 -0,6 -0,9 1,7 1,1 C32 NT 20,0 NT 5,1 NT -1,0 NT C33 33,8 38,0 35,8 8,5 8,3 -0,5 0,2 C35 19,9 38,1 21,9 0,5 2,2 0,5 -0,6 C38 80,2 18,4 23,0 18,8 21,1 -0,8 0,0 C39 NT 5,7 0,5 4,7 5,5 0,5 1,5 C42 68,9 52,6 33,2 11,5 21,1 -1,8 -1,8 C43 68,9 61,1 22,0 12,4 3,3 0,9 NT C44 68,9 NA NA NA NA NA NA C66 68,9 31,3 13,8 2,2 5,5 0,6 2,2 C72 74,1 11,9 5,4 8,5 1,7 NA NA C73 62,2 40,4 54,6 NA NA NA NA C76 62,2 28,4 13,2 8,9 8,4 10,9 0,0 C77 74,1 38,1 51,5 8,2 15,9 0,0 0,0 C78 71,9 28,9 NA NA NA NA NA C79 71,9 NA NA NA NA NA NA C80 62,2 9,0 5,9 1,5 3,1 NT NT C81 62,2 42,0 40,7 18,0 12,8 -3,0 -3,1 mediana 68,9 31,3 22,0 8,2 6,2 0,0 0,0 (min-max) (19,9-80,2) (5,7-61,1) (0,5-54,6) (-0,6-18,8) (-0,9-21,1) (-3-10,9) (-3,1-2,2) CTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% ) estímulo estímulo estímulo células CD56brightCD16- K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ C27 33,9 234 250 21 -5 -9 -30 C28 28,9 NA NA NA NA NA NA C30 15,5 121 34 1 9 -25 4 C32 NT 72 NT 10 NT -4 NT C33 13,9 235 222 -8 1 -10 -12 C35 15,5 127 201 -25 -21 -2 -23 C38 17,9 114 157 19 5 -15 -15 C39 NT 92 75 20 22 0 5 C42 33,9 1125 588 45 50 5 10 C43 33,9 512 33 7 25 -14 NT C44 33,9 NA NA NA NA NA NA C66 33,9 58 65 10 11 14 12 C72 28,9 74 -67 7 -31 NA NA C73 34,0 187 195 NA NA NA NA C76 34,0 115 23 31 11 8 -13 C77 28,9 91 326 -1 7 -14 -14 C78 36,0 100 NA NA NA NA NA C79 36,0 NA NA NA NA NA NA C80 34,0 12 -39 11 33 NT NT C81 34,0 210 164 26 43 15 32 mediana 33,9 115,0 157,0 10,1 9,8 -4,0 -12,0 (min-max) (13,9-36) (12-1125) (-67-588) (-25-45) (-31-50) (-25-15) (-30-32) estímuloCTR % bloqueio para MICA em K562 CD107a (MFI ) estímuloestímulo células CD56brightCD16- IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI ) CTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. 234 Tabela 4. Análise de correlação entre a frequência de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, ou entre a intensidade de sua expressão, em subpopulações de células NK circulantes, com os níveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e de co ntroles, na condição basal de cultura, sem estímulo. A) Grupo endometriose Subpopulações EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0393 0,5 21 ns ns 18 ns ns 18 ns ns CD56bright 18 ns ns 18 ns ns 18 ns ns 18 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0277 0,5 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns Subpopulações EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns 18 ns ns CD56bright 18 ns ns 18 ns ns 18 ns ns 18 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP Sem estímulo (% de células com expressão) IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FPIFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP EDT: grupo endometriose; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; sMICA: MICA solúvel; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número de pares de dados analisados para cada subpopulação ; FP: fluido peritoneal; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) ; em negrito: valores de p significantes (p<0,05) e respectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correlações diferenciais entre o grupo EDT e grupo controle; ns: não significante (p≥ 0,05); as análises foram realizadas a partir de valores da mediana da porcentagem e da MFI de expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, nas diferentes subpopulações de NK; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 235 Continuação Tabela 4. Análise de correlação entre a frequência de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, ou entre a intensidade de sua expressão, em subpopulações de células NK circulantes, com os níveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e de controles, na condição basal de cultura, sem estímulo B) Grupo controle Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 17 0,0316 0,5 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dim 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56bright 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 17 0,0249 0,6 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56brightCD16+ 9 ns ns 9 ns ns 9 ns ns 9 ns ns 8 ns ns 8 ns ns CD56brightCD16- 15 ns ns 15 ns ns 13 ns ns 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dim 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56bright 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56brightCD16+ 9 ns ns 9 ns ns 9 ns ns 9 ns ns 8 ns ns 8 ns ns CD56brightCD16- 15 ns ns 15 ns ns 13 ns ns 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FPCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP Sem estímulo (% de células com expressão) CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; sMICA: MICA solúvel; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número de pares de dados analisados para cada subpopulação ; FP: fluido peritoneal; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) ; em negrito: valores de p significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correlações diferenciais entre o grupo EDT e grupo controle ns: não signif icante (p≥ 0,05); as análises foram realizadas a partir de valores da mediana da porcentagem e da MFI de expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, nas diferentes subpopulações de NK; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo t este de correlação de Spearman. 236 Tabela 5. Análise de correlação entre a frequência de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL -10, e de suas intensidades de expressão, em subpopulações de células NK circulantes, com os ní veis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com endometriose e de controles, na condição com estímulo com células K562. A) Grupo endometriose Subpopulações EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0279 -0,5 17 ns ns 17 ns ns CD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0373 -0,5 18 ns ns 18 ns ns CD56bright 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0468 -0,4 17 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0076 -0,6 17 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 0,0413 -0,5 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns Subpopulações EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0279 -0,5 17 ns ns 17 ns ns CD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0434 -0,4 18 ns ns 18 ns ns CD56bright 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0488 -0,4 17 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0435 -0,5 17 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP Estímulo com K562 (% de células com expressão) CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP B) Grupo controle Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dim 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56bright 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 0,0032 -0,7 13 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 15 0,0190 -0,6 15 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 14 ns ns 14 ns ns CD56brightCD16+ 8 ns ns 8 ns ns 8 ns ns 8 ns ns 7 ns ns 7 ns ns CD56brightCD16- 15 ns ns 15 ns ns 13 ns ns 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dim 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56bright 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 13 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 15 ns ns 15 ns ns CD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 14 ns ns 14 ns ns CD56brightCD16+ 8 ns ns 8 ns ns 8 ns ns 8 ns ns 7 ns ns 7 ns ns CD56brightCD16- 15 ns ns 15 ns ns 13 0,0140 -0,7 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP IL-10 x sMICA FP Estímulo com K562 (% de células com expressão) IFN-γ x sMICA FPCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IL-10 x sMICA soro EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpo pulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+, sMICA: MICA solúvel, MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão), K562: estímulo com células K562 , n: número de pares de dados analisados para cad a subpopulação; FP: fluido peritoneal, NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) , em negrito: valores de p significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r, em negrito e sublinhado: correlações diferenciais entre o grupo EDT e g rupo controle ns: não significante (p≥ 0,05); as análises foram realizadas a partir de valores de mediana da porcentagem de células com expressão e da MFI das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, nas diferentes subpopulações de NK; níveis de sMICA analisados p or ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 237 Tabela 6. Análise de correlação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL -10, e de suas intensidades de expressão, em subp opulações de células NK circulantes, com os níveis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com endometriose e controles, na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. A) Grupo endometriose Subpopulações EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0366 -0,5 21 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 18 0,0427 -0,5 18 ns ns CD56bright 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 20 0,0192 -0,5 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0444 -0,5 17 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns Subpopulações EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns 18 ns ns CD56bright 16 ns ns 16 0,0057 -0,7 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns CD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns CD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA CD56brightCD16- 16 0,0390 -0,5 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FPCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP Estímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) B) Grupo controle Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns CD56dim 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 0,0175 -0,6 13 ns ns CD56bright 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 12 ns ns 12 ns ns CD56dimCD16+ 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 12 0,0455 -0,6 12 ns ns CD56dimCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns CD56brightCD16+ 7 ns ns 7 0,0476 0,8 7 ns ns 7 ns ns 5 ns ns 5 ns ns CD56brightCD16- 13 ns ns 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns 10 ns ns 10 ns ns Subpopulações CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r (n) (n) (n) (n) (n) (n) NK totais 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 0,0105 -0,7 13 ns ns CD56dim 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 0,0152 -0,7 13 ns ns CD56bright 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 12 ns ns 12 ns ns CD56dimCD16+ 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 12 0,0417 -0,6 12 ns ns CD56dimCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 0,0012 -0,7 13 ns ns CD56brightCD16+ 7 ns ns 7 ns ns 7 ns ns 7 ns ns 5 ns ns 5 ns ns CD56brightCD16- 13 ns ns 13 ns ns 12 0,0152 -0,7 12 ns ns 10 ns ns 10 ns ns Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFNγ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP IL-10 x sMICA FP Estímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) CD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IL-10 x sMICA soroIFNγ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP EDT: grup o endometriose; CTR: grupo controle; NK: células Natural Killer ; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; sMICA: MICA solúvel; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número de pares de dados analisados para cada subpopulação ; FP: fluido peritoneal; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) ; em negrito: valores de p significantes (p<0,05) e respectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correlações diferenciais entre o grupo EDT e grupo controle ns: não significante (p≥ 0,05); as análises foram realizadas a partir de valores de mediana da porcentagem de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10 e de suas MFIs, nas diferentes subpopulações de NK; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. 238 Tabela 7. Comparações das frequências de c élulas com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, e de suas intensidades de expressão, nas diferentes subpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose e controles, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, na condição basal de cultura, sem estímulo. A) Grupo endometriose EDT Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 8 9,9 13 7,4 ns 8 1,5 13 1,7 ns 5 0,6 12 0,8 ns CD566dim 8 9,5 13 7,6 ns 8 2,2 13 1,8 ns 6 0,7 12 0,9 ns Cd56bright 6 5,4 12 5,1 ns 6 1,2 12 1,7 ns 5 0,0 11 0,4 ns CD56dimCD16+ 8 8,7 12 10,4 ns 8 3,1 12 2,1 ns 6 0,8 11 0,9 ns CD56dimCD16- 8 13,7 12 11,2 ns 8 1,5 12 1,9 ns 6 0,7 11 1,1 ns CD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 2 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 5,9 11 5,5 ns 5 2,7 11 2,9 ns 4 0,9 9 1,4 ns EDT Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 8 361 13 358 ns 8 96 13 71 ns 5 125 12 127 ns CD56dim 8 350 13 350 ns 8 96 13 71 ns 6 109 12 119 ns Cd56bright 6 455 12 478 ns 6 99 12 69 ns 4 127 11 162 ns CD56dimCD16+ 8 366 12 347 ns 8 100 12 67 ns 6 47 11 121 ns CD56dimCD16- 8 335 12 282 ns 8 87 12 78 ns 6 148 11 143 ns CD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 2 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 434 11 476 ns 5 95 11 68 ns 4 157 9 158 ns Sem estímulo (% células com expressão) p Prolif IFN-γ IL-10CD107a p Secret Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 Secret Prolif Secret p Prolif Prolif Secret p Prolif Secret p Prolif Secret p B) Grupo controle CTR Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 11 9,2 9 7,8 ns 11 0,9 9 1,5 ns 8 0,7 8 0,5 ns CD566dim 11 10,6 9 12 ns 11 1,0 9 1,7 ns 8 0,7 8 0,6 ns Cd56bright 9 4,8 9 6,9 ns 9 0,9 9 1,1 ns 8 0,6 8 0,9 ns CD56dimCD16+ 10 10,8 9 8,1 ns 10 1,3 9 2,1 ns 8 0,6 8 0,6 ns CD56dimCD16- 10 18,1 9 18,3 ns 10 1,1 9 1,5 ns 8 0,7 8 1,1 ns CD56brightCD16+ 5 NA 4 NA NA 5 NA 4 NA NA 5 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 9 5,1 8 6,5 ns 8 0,5 7 0,3 ns 7 0,8 6 0,7 ns CTR Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 11 355 9 310 ns 11 106 9 94 ns 8 17 8 67 ns CD566dim 11 350 9 305 ns 11 106 9 93 ns 8 15 8 57 ns Cd56bright 9 466 9 444 ns 9 113 9 87 ns 8 132 8 135 ns CD56dimCD16+ 10 335 9 305 ns 10 98 9 80 ns 8 3 8 32 ns CD56dimCD16- 10 347 9 331 ns 10 149 9 105 ns 8 139 8 140 ns CD56brightCD16+ 5 NA 4 NA NA 5 NA 4 NA NA 5 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 9 471 8 435 ns 8 118 7 94 ns 7 168 6 141 ns CD107a IL-10 Sem estímulo (% células com expressão) IFN-γ Secret p Prolif Secret p Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 Prolif Secret p Prolif Secret p Prolif Secret p Prolif Secret p Prolif EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Prolif: fase pr oliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Secret: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); med: mediana; ns: valores de p não significantes(p≥ 0,05); n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 239 Tabela 8. Comparações das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, e de suas intensidades de expressão, nas diferentes subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, na condição basal de cultura, sem estímulo. A) CD107a B) IFN-y C) IL-10 Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 9,9 11 9,2 ns 13 7,4 9 7,8 ns CD566dim 8 9,5 11 10,6 ns 13 7,6 9 11,8 ns Cd56bright 6 5,4 9 4,8 ns 12 5,1 9 6,9 ns CD56dimCD16+ 8 8,7 10 10,8 ns 12 10,4 9 8,1 ns CD56dimCD16- 8 13,7 10 18,0 ns 12 11,2 9 18,3 ns CD56brightCD16+ 3 NA 5 NA NA 4 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 5 5,9 9 5,1 ns 11 5,5 8 6,5 ns Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 361 11 355 ns 13 358 9 310 ns CD566dim 8 350 11 350 ns 13 350 9 305 ns Cd56bright 6 455 9 466 ns 12 478 9 444 ns CD56dimCD16+ 8 366 10 335 ns 12 347 9 305 ns CD56dimCD16- 8 335 10 347 ns 12 282 9 331 ns CD56brightCD16+ 3 NA 5 NA NA 4 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 5 434 9 471 ns 11 476 8 435 ns Sem estímulo (% de células com expressão) Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) PROLIFERATIVA CD107a SECRETORA CD107a SECRETORA CD107aPROLIFERATIVA CD107a Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 1,5 11 0,9 ns 13 1,7 9 1,5 ns CD566dim 8 2,2 11 1,0 0,0252 13 1,8 9 1,7 ns Cd56bright 6 1,2 9 0,9 ns 12 1,7 9 1,1 ns CD56dimCD16+ 8 3,1 10 1,3 ns 12 2,1 9 2,1 ns CD56dimCD16- 8 1,9 10 1,1 ns 12 1,9 9 1,5 ns CD56brightCD16+ 3 NA 5 NA NA 4 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 2,7 8 0,5 0,0101 11 2,9 7 0,3 0,0041 Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 96 11 106 ns 13 71 9 94 ns CD566dim 8 95 11 106 ns 13 71 9 93 ns Cd56bright 6 99 9 113 ns 12 69 9 87 ns CD56dimCD16+ 8 100 10 98 ns 12 67 9 80 ns CD56dimCD16- 8 87 10 149 ns 12 78 9 105 ns CD56brightCD16+ 3 NA 5 NA NA 4 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 95 8 118 ns 11 68 7 94 ns Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) Sem estímulo (% de células com expressão) PROLIFERATIVA IFN- γ SECRETORA IFN-γ PROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 5 0,6 8 0,7 ns 12 0,8 8 0,5 ns CD566dim 6 0,7 8 0,7 ns 12 0,9 9 0,6 ns Cd56bright 4 0,4 8 0,6 ns 11 0,4 7 1,5 ns CD56dimCD16+ 6 0,8 8 0,6 ns 11 0,9 8 0,6 ns CD56dimCD16- 6 0,7 8 0,6 ns 11 1,1 8 1,3 ns CD56brightCD16+ 2 NA 5 NA NA 4 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 4 0,9 7 0,9 ns 9 1,3 6 0,7 ns Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 5 125 8 17 ns 12 127 8 67 ns CD566dim 6 109 8 15 ns 12 119 8 57 ns Cd56bright 4 127 8 132 ns 11 162 8 135 ns CD56dimCD16+ 6 47 8 15 ns 11 121 8 32 ns CD56dimCD16- 6 148 8 139 ns 11 143 8 140 ns CD56brightCD16+ 2 NA 5 NA NA 4 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 4 157 7 168 ns 9 158 6 141 ns Sem estímulo (% de células com expressão) PROLIFERATIVA IL-10 Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI) PROLIFERATIVA IL-10 SECRETORA IL-10 SECRETORA IL-10 EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Proliferativa: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Secretora: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); med: mediana, ns: valores de p não significantes (p≥ 0,05); em vermelho: maior valor de mediana na análise entre os grupos; negrito: valor de p significante; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) ; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 240 Tabela 9. Comparações das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, e de suas intensidades de expressão, nas diferentes subpopulações de células NK circulantes de mulheres c om endometriose e controles, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562. A) Grupo endometriose EDT Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 8 14,5 13 14,5 ns 8 2,5 13 3,9 ns 5 0,3 12 -0,11 ns CD566dim 8 17,1 13 13,3 ns 8 3,1 13 4,1 ns 6 0,45 12 -0,4 0,0302 Cd56bright 5 19,9 12 17,9 ns 5 4,3 12 4,1 ns 4 0,4 11 0,1 ns CD56dimCD16+ 8 19,8 12 24,3 ns 8 4,6 12 2,4 ns 6 0,7 11 0,3 ns CD56dimCD16- 8 15,1 12 21,0 ns 8 3,8 12 6,5 ns 6 -0,1 11 0,2 ns CD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 14,6 11 21,3 ns 5 3,4 11 6,5 ns 4 -0,5 9 0,1 ns EDT Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 8 40 13 73 ns 8 -4 13 1 ns 5 -13 12 5 ns CD566dim 8 39 13 81 ns 8 -2 13 13 ns 6 -6 12 1 ns Cd56bright 5 112 12 49 ns 5 -9 12 -1 ns 4 -22,1 11 -10 ns CD56dimCD16+ 8 44 12 59 ns 8 -5 12 -2 ns 6 0 11 0 ns CD56dimCD16- 8 79 12 113 ns 8 3 12 10 ns 6 -7 11 -13 ns CD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 130 11 53 ns 5 -9 11 2 ns 4 -20,5 9 -6 ns Estímulo com K562 (% de células com expressão) Prolif Secret p IFN-γ Prolif Secret p IL-10 Prolif Secret p p Prolif Secret p Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 Prolif Secret p Prolif Secret CD107a B) Grupo controle CTR Subpopulações Prolif Secret (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 11 18,2 9 21,2 ns 11 4,6 9 4,2 ns 8 0,2 8 0,1 ns CD566dim 11 21,3 9 21,9 ns 11 4,9 9 4,2 ns 8 0,5 8 -0,2 ns Cd56bright 9 20,1 8 31,5 ns 9 5,7 8 4,5 ns 7 0,6 7 -0,6 ns CD56dimCD16+ 9 29,1 9 28,2 ns 9 4,1 9 1,9 ns 8 0,7 8 0,0 0,0281 CD56dimCD16- 10 15,9 9 16,2 ns 10 8,9 9 5,9 ns 8 0,3 7 -0,4 ns CD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA 4 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 9 28,4 8 38,0 ns 8 8,5 7 4,7 ns 7 -0,01 6 -0,01 ns CTR Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 11 89 9 108 ns 11 25 9 13 ns 8 14 8 0 ns CD566dim 11 86 9 107 ns 11 26 9 14 ns 8 13 8 0 ns Cd56bright 9 96 8 148 ns 9 17 8 10 ns 7 5 7 0 ns CD56dimCD16+ 9 76 9 75 ns 9 23 9 16 ns 8 0 8 0 ns CD56dimCD16- 10 128 9 98 ns 10 6 9 16 ns 8 -1 7 -6 ns CD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA 4 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 9 114 8 157 ns 8 11 7 10 ns 7 -14 6 -1 ns IL-10IFN-γ Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 p pp Estímulo com K562 (% de células com expressão) CD107a p Prolif Secret pProlif Secret p Prolif Secret Prolif Secret Prolif Secret EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Prolif: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Secret: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo com K562: valores do estímulo com células K562 descontado o valor basal, descontado o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); med: mediana, ns: valor es de p não significantes(p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes (p<0,05); em vermelho: valor de maior mediana na comparação entre os grupos analisados; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: amostras não anali sadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 241 Tabela 10 . Comparações das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, e de suas intensidades de expressão, nas diferentes subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562. A) CD107a B) IFN-y C) IL-10 Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 14,5 11 18,2 ns 13 14,5 9 21,2 ns CD566dim 8 17,1 11 21,3 ns 13 13,3 9 21,9 ns Cd56bright 5 19,9 9 20,1 ns 12 17,9 8 31,5 ns CD56dimCD16+ 8 19,8 9 29,1 ns 12 24,3 9 28,2 ns CD56dimCD16- 8 15,1 10 15,9 ns 12 18,5 9 16,2 ns CD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 14,6 9 28,4 ns 11 21,3 8 38,0 ns Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 40 11 89 ns 13 73 9 108 ns CD566dim 8 39 11 86 ns 13 81 9 107 ns Cd56bright 5 112 9 96 ns 12 49 8 148 0,0032 CD56dimCD16+ 8 44 9 76 ns 12 59 9 75 ns CD56dimCD16- 8 79 10 128 0,195 12 113 9 98 ns CD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 130 9 114 0,974 11 53 8 157 0,0259 Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) Estímulo K562 (% de células com expressão) PROLIFERATIVA CD107a SECRETORA CD107a SECRETORA CD107aPROLIFERATIVA CD107a Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 2,5 11 4,9 ns 13 3,9 9 4,2 ns CD566dim 8 3,1 11 4,9 ns 13 4,1 9 4,2 ns Cd56bright 5 4,3 9 5,7 ns 12 4,0 8 4,5 ns CD56dimCD16+ 8 4,6 9 4,1 ns 12 2,4 9 1,9 ns CD56dimCD16- 8 3,8 10 8,9 ns 12 7,2 9 5,9 ns CD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 3,4 8 8,5 ns 11 6,5 7 4,7 ns Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 -4 11 25 ns 13 1 9 13 ns CD566dim 8 -2 11 26 ns 13 1 9 14 ns Cd56bright 5 -9 9 17 0,019 12 -1 8 10 ns CD56dimCD16+ 8 -5 9 23 ns 12 -2 9 16 ns CD56dimCD16- 8 3 10 6 ns 12 10 9 16 ns CD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 -9 8 11 0,0186 11 2 7 10 ns Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) Estímulo K562 (% de células com expressão) PROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ PROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 5 0,3 8 0,2 ns 12 -0,1 8 0,1 ns CD566dim 6 0,5 8 0,5 ns 12 -0,4 8 -0,2 ns Cd56bright 4 0,4 7 0,56 ns 11 0,11 7 -0,6 ns CD56dimCD16+ 6 0,7 8 0,7 ns 11 -0,3 8 0,0 ns CD56dimCD16- 6 -0,01 8 0,3 ns 11 -0,1 7 -0,4 ns CD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 4 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 4 -0,5 7 0,0 ns 9 R$0,1 6 -0,01 ns Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 5 -13 8 14 0,0295 12 5 8 0 ns CD566dim 6 -6 8 13 ns 12 1 8 0 ns Cd56bright 4 -22 7 5 ns 11 -10 7 0 ns CD56dimCD16+ 6 0 8 0 ns 11 0 8 0 ns CD56dimCD16- 6 -7 8 -1 ns 11 -13 7 -6 ns CD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 4 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 4 -21 7 -14 ns 9 -6 6 -1 ns Estímulo K562 (% de células com expressão) Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) PROLIFERATIVA IL-10 SECRETORA IL-10 PROLIFERATIVA IL-10 SECRETORA IL-10 EDT: grupo endom etriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Proliferativa: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Secretora: fase secretora do ciclo me nstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo com células K562: valores do estímulo descontado o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo ; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); med: mediana, ns: valores de p não significantes ( p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes (p<0,05); em vermelho: valor de maior mediana na comparação entre os grupos analisados; n: número de amostras analisadas para cada subpopula ção de células NK ; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 242 Tabela 11. Comparações das porcentagens de expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL- 10, e de suas intensidad es de expressão, nas diferentes subpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose e controles, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. A) Grupo endometriose EDT Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 8 17,4 13 15,9 ns 8 3,0 13 2,9 ns 5 -0,2 12 -0,3 ns CD566dim 8 19,4 13 16,8 ns 8 3,1 13 3,1 ns 6 -0,1 12 -0,1 ns Cd56bright 6 22,6 11 15,6 ns 6 3,4 11 4,8 ns 4 0,1 10 -0,1 ns CD56dimCD16+ 8 31,7 12 18,4 ns 8 4,3 12 0,2 ns 6 -0,1 11 0,1 ns CD56dimCD16- 8 18,1 12 18,5 ns 8 4,0 12 7,2 ns 6 -0,2 11 -0,1 ns CD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 3 NA NA 2 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 5 25,9 11 24,1 ns 5 4,5 11 2,9 ns 4 -0,4 9 -0,6 ns EDT Subpopulações Prolif Secret p Prolif p Prolif p (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 8 70 13 46 ns 8 -2 13 4 ns 5 -16 12 0 ns CD566dim 8 77 13 64 ns 8 -1 13 4 ns 6 0 12 3 ns Cd56bright 6 91 11 57 ns 6 -4 11 -0,2 ns 4 -19 10 -12 ns CD56dimCD16+ 8 79 12 48 ns 8 -1 12 1 ns 6 0 11 3 ns CD56dimCD16- 8 129 12 122 ns 8 4,0 12 13 ns 6 -6 11 -6 ns CD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 3 NA NA 2 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 5 112 11 54 ns 5 2,2 11 2 ns 4 -12 9 -14 ns Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) Estímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) IFN-γ Prolif Secret p Prolif Secret p Prolif Secret p IL-10 CD107a IFN-γ IL-10 Secret Secret CD107a B) Grupo controle CTR Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 10 16,8 9 17,8 ns 10 4,3 9 4,5 ns 7 0,2 7 0,3 ns CD566dim 10 14,4 9 24,9 ns 10 5,2 9 4,4 ns 7 0,5 7 0,3 ns Cd56bright 8 21,1 9 28,7 ns 8 10,1 9 5,4 ns 6 0,4 7 -0,7 ns CD56dimCD16+ 8 24,8 9 25,8 ns 8 5,5 9 1,6 ns 6 0,5 7 0,2 ns CD56dimCD16- 9 13,3 9 18,3 ns 9 1,7 9 6,2 ns 7 0,4 7 -0,1 0,62 CD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 3 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 7 22,0 6 -0,01 0,0012 7 8,4 7 5,5 ns 5 0,0 6 -0,2 ns CTR Subpopulações (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med NK totais 10 78 9 99 ns 10 22 9 -2 ns 7 16 7 24 ns CD566dim 10 86 9 100 ns 10 23 9 1 ns 7 15 7 27 ns Cd56bright 8 46 9 168 ns 8 27 9 2 ns 6 17 7 -1 ns CD56dimCD16+ 8 107 9 94 ns 8 23 9 -3 ns 6 0 7 0 ns CD56dimCD16- 9 41 9 99 ns 9 14 9 3 ns 7 5 7 -12 0,0070 CD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 3 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 7 34 8 179,5 ns 7 11 7 1 ns 5 -13 6 -4 ns CD107a IFN-γ Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) CD107a IFN-γ IL-10 p IL-10 p Prolif Secret p Prolif Secret p Prolif Secret p Prolif Secret Prolif Secret p Prolif Secret Estímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Prolif: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Se cret: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo com K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA – valores descontado o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior d o que com estímulo ; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); med: mediana; ns: valores de p não significantes ( p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes ( p<0,05); em vermelho: valor de maior mediana na comparação entr e os grupos analisados; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 243 Tabela 12. Comparações das frequênc ias de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, e de suas intensidades de expressão, nas diferentes subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas fases pro liferativa e secretora do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. A) CD107a B) IFN-γ C) IL-10 Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 17,4 10 16,8 ns 13 15,9 9 17,8 ns CD566dim 8 19,4 10 14,4 ns 13 16,8 9 24,9 ns Cd56bright 6 22,6 8 21,1 ns 9 17,0 9 28,7 ns CD56dimCD16+ 8 31,7 8 24,8 ns 12 18,4 9 25,8 ns CD56dimCD16- 8 18,1 9 13,3 ns 12 21,0 9 18,3 ns CD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 25,9 7 22 ns 11 24,1 8 28,8 ns Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 70 10 78 ns 13 46 9 99 ns CD566dim 8 77 10 86 ns 13 64 9 100 ns Cd56bright 6 91 8 46 ns 9 55 9 168 0,0336 CD56dimCD16+ 8 79 8 107 ns 12 48 9 94 ns CD56dimCD16- 8 129 9 41 ns 12 122 9 99 ns CD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 112 7 34 ns 11 54 8 180 ns Estímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) PROLIFERATIVA CD107a SECRETORA CD107a Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) PROLIFERATIVA CD107a SECRETORA CD107a Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 3,1 10 4,3 ns 13 2,9 9 4,5 ns CD566dim 8 3,1 10 5,2 ns 13 3,1 9 4,4 ns Cd56bright 6 3,4 8 10,1 ns 10 3,3 9 5,4 ns CD56dimCD16+ 8 4,3 8 5,5 ns 12 0,2 9 1,6 ns CD56dimCD16- 8 4,0 9 1,7 ns 12 6,5 9 6,2 ns CD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 4,5 7 8,4 ns 11 2,9 7 5,5 ns Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 8 -2 10 22 0,0010 13 4 9 -2 ns CD566dim 8 -1 10 23 0,0021 13 4 9 1 ns Cd56bright 6 -4 8 31 0,0013 10 0 9 2 ns CD56dimCD16+ 8 -1 8 -22 0,0033 12 1 9 -3 ns CD56dimCD16- 8 4 9 14 ns 12 13 9 3 ns CD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 4 NA NA CD56brightCD16- 5 2 7 11 0,0051 11 2 7 1 ns PROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ Estímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) PROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 5 -0,2 7 0,2 ns 12 -0,1 7 0,3 ns CD566dim 6 -0,4 7 0,4 ns 12 -0,1 7 0,3 ns Cd56bright 4 0,1 6 0,4 ns 9 -0,1 7 -0,7 ns CD56dimCD16+ 6 -0,1 6 0,5 ns 11 0,1 7 0,2 ns CD56dimCD16- 6 -0,2 7 0,4 ns 11 0,2 7 -0,1 ns CD56brightCD16+ 2 NA 3 NA NA 3 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 4 -0,4 5 0,0 ns 9 -0,6 6 -0,2 ns Subpopulações EDT CTR EDT CTR (n) med (n) med p (n) med (n) med p NK totais 5 -16 7 16 ns 12 0 7 24 ns CD566dim 6 -7 7 15 ns 12 3 7 27 ns Cd56bright 4 -19 6 17 ns 9 -12 7 -0,6 ns CD56dimCD16+ 6 0 6 0 ns 11 3 7 0 0 CD56dimCD16- 6 -6 7 5 0,0385 11 -6 7 -12 ns CD56brightCD16+ 2 NA 3 NA NA 3 NA 3 NA NA CD56brightCD16- 4 -12 5 -13 ns 9 -14 6 -4 ns Estímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) SECRETORA IL-10PROLIFERATIVA IL-10 Estímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) PROLIFERATIVA IL-10 SECRETORA IL-10 EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+; Proliferativa: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Secretora: fase secretora do ciclo menstrual ( 15º ao 28º dia do ciclo); MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); es timulo com K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA – valores descontado o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo ; med: mediana, ns: valores de p não significantes (p≥ 0,05); em negrito, valores de p significantes (p<0,05); em vermelho: valor de maior mediana na comparação entre os grupos analisados; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. 244 Tabela 13. Frequência e intensidade de expressão de MICA nas células K562 e células K562 bloqueadas para MICA, e a análise da efetividade do bloqueio, utilizadas nos ensaios de citotoxicidade de células NK. Experimento Células Vivas Células Vivas % expressão (%) MFI % expressão (%) MFI expressão (%) MFI (%) 1 84,7 38,8 1914 92,8 25,4 1487 34,5 22,3 2 74,6 67,4 2679 80,2 30,8 1806 54,3 32,6 3 92,7 78,0 2293 91,8 68,2 1559 12,6 32,0 4 91,0 80,2 2181 92,6 75,2 1723 6,2 20,9 5 94,0 51,5 1537 95,7 28,8 1036 44,1 32,6 6 96,2 39,7 964 93,5 22,5 734 43,0 23,9 7 95,4 21,7 406 96,7 13,1 125 39,6 69,2 8 91,7 81,7 2024 92,3 49,2 1114 39,8 44,9 9 85,3 40,1 742 77,9 16,1 265 59,9 64,1 Mediana 91,7 51,5 1914 92,6 28,8 1114 39,8 32,6 (min-max) (84,7-96,2) (21,7-81,7) (742-2679) (77,9-96,7) (13,1-75,2) (125-1806) (6,2-59,9) (22,3-69,2) K562*CFSE K562*CFSEBLOQ MICA MICA Efetividade do bloqueio para MICA MFI: mediana de intensidade de fluorescência; K562*CFSE: células K562 marcadas com o corante fluorescente CFSE; K562*CFSEBLOQ: células K562 marcadas com CFSE e bloqueadas para a molécula MICA; CFSE: do inglês -Carboxyfluorescein succinimidyl ester; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; a viabilidade celular foi avaliada utilizando-se o marcador LIVE/DEAD™ FixableAqua (descrito em Métodos, item 3.9.1). 245 Tabela 14. Citotoxicidade de células NK circulantes de mulheres com endometriose e controles contra células K562 e células K562 bloqueadas para a proteína MICA, e porcentagens de bloqueio de MICA em células K562 usadas, para cada amostra. K562 K562BLOQ C27 44,1 19,0 11,5 C28 43,0 8,2 6,7 C29 NT 7,3 0,5 C30 6,2 11,6 9,6 C32 54,3 9,0 18,0 C33 34,5 11,4 27,9 C35 6,2 10,7 6,9 C38 12,6 2,7 2,0 C39 NT 0,5 13,2 C42 44,1 35,2 12,0 C43 44,1 29,9 13,0 C44 44,1 29,3 14,9 C66 44,1 9,4 9,2 C72 43,0 7,9 12,0 C73 59,9 18,4 12,9 C76 59,9 9,1 3,3 C77 43,0 25,0 27,7 C78 NT 17,6 13,4 C79 NT 15,5 18,0 C80 59,9 17,4 34,9 Mediana 44,1 11,5 12,5 (min-max) (6,2-59,9) (0,5-35,2) (0,5-34,9) % CTX CTR % bloqueio para MICA em K562 K562 K562BLOQ P054 39,6 14,3 10,5 P055 39,8 5,3 5,9 P059 12,6 6,2 5,1 P066 54,3 9,4 8,1 P069 6,2 7,8 2,2 P071 44,1 21,3 12,9 P077 6,2 10,3 3,9 P090 NT -1,6 -1,2 P091 43,0 13,7 12,2 P118 12,6 5,9 3,9 P128 NT 4,8 -4,7 P132 NT 6,3 26,3 P137 12,6 7,0 3,7 P139 40,0 8,2 9,8 P140 39,6 12,7 7,7 P141 39,8 6,0 6,1 P145 6,2 10,3 5,1 P146 34,5 29,1 55,4 P147 39,8 2,8 5,3 P148 39,8 1,8 3,8 P155 54,3 7,7 14,9 Mediana 39,7 7,7 5,9 (min-max) (6,2-55,3) (-1,6-29,1) (-4,7-55,4) % CTX % bloqueio para MICA em K562 EDT CTR: grupo controle com numeração do s diferentes participantes da pesquisa; EDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes da pesquisa; CTX: citotoxicidade; % CTX: porcentagem de citotoxicidade avaliada pela porcentagem de morte de células K562 em ensaio de cocultura; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína MICA; valores de CTX contra K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; NT: não testado; min: valor mínimo; max: valor máximo. 246 0 1 0 2 0 3 0 4 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 % d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2 s M IC A p g /m L (s o ro ) 3 1,25 C T R (n = 1 8 )A ) r= 0 ,0 2 p = 0 ,9 5 1 1 (n s ) 0 1 0 2 0 3 0 4 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 % d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2 s M IC A p g /m L (F P ) 3 1 ,2 5 C T R (n = 1 8 )B ) r= -0 ,2 p = 0 ,3 6 0 9 (n s ) 0 1 0 2 0 3 0 4 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 % d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2 s M IC A p g /m L (s o ro ) 3 1 ,2 5 E D T (n = 2 1 )C ) r= 0 ,0 4 p = 0 ,8 7 6 9 (n s ) 0 1 0 2 0 3 0 4 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 E D T (n = 2 1 ) % d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2 s M IC A p g /m L (F P ) 3 1 ,2 5 D ) r= 0 ,2 p = 0 ,4 8 0 6 (n s ) Figura 1. Análise de correlação entre a citotoxicidade de células NK circulantes de mul heres com endometriose e controles contra células K562 e níveis de MICA solúvel. EDT: grupo controle; CTR: grupo controle; FP: fluido peritoneal; sMICA: MICA solúvel; linha pontilhada: valor limite de corte para a detecção de sMICA; níveis de sMICA determi nados por ELISA; valores de CTX contra K562 descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; linha pontilhada no eixo X: valor zero de % de células mortas; linha pontilhada no eixo Y: valor limite de corte para a detecção de sMICA (31,25pg/mL); níveis de sMICA determinados por ELISA; ns: valor de p não significante ( p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de correção de Spearman. 0 1 0 2 0 3 0 4 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 % d e m o r te d e c é lu la s K 5 6 2 B L O Q s M IC A p g /m L (s o ro ) 3 1 ,2 5 C T R (n = 1 8 )A ) r= 0 ,0 3 p = 0 ,8 8 3 3 (n s ) 0 1 0 2 0 3 0 4 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 % d e m o r te d e c é lu la s K 5 6 2 B L O Q s M IC A p g /m L (F P ) 3 1 ,2 5 C T R (n = 1 8 )B ) r= -0 ,5 p = 0 ,0 5 3 8 (n s ) 0 2 0 4 0 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 % d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2 B L O Q s M IC A p g /m L (s o ro ) 3 1 ,2 5 E D T (n = 2 1 ) r= 0 ,1 p = 0 ,6 8 0 7 (n s ) C ) 0 2 0 4 0 6 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 % d e m o r te d e c é lu la s K 5 6 2 B L O Q s M IC A p g /m L (F P ) 3 1 ,2 5 E D T (n = 2 1 ) r= -0 ,0 2 p = 0 ,9 1 7 0 (n s ) D ) Figura 2. Análise de correlação entre a citotoxicidade de células NK circulantes de mulheres com endometriose e controles, contra células K562 bloqueadas para a proteína MICA, e níveis de MICA solúvel. EDT: grupo controle; CTR: grupo controle; FP: fluido peritoneal; sMICA: MICA solúvel; K562BLOQ: K562 bloqueadas para MI CA; valores de CTX contra K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; linha pontilhada no eixo X: valor zero de % de células mortas; linha pontilhada no eixo Y: valor limite de corte para a detecção de sMICA (31,25pg/mL); níveis de sMICA determinados por ELISA; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de correção de Spearman. 247 Tabela 15. Análise de correlação entre a citotoxicidade de células NK circulantes frente a células K562 e células K562 bloqueadas para MICA e os níveis de MICA solúvel (soro e fluido peritoneal) em mulheres com endometriose, de acordo com o estádio da doença. r p r p r p r p -0,3 0,6670 0,4 0,2712 0,3 0,3561 0,1 0,8857 r p r p r p r p -0,2 0,7778 0,2 0,4599 0,2 0,5515 -0,3 0,4398 CTX K562BLOQ I/II (n=9) III/IV (n=12) sMICA soro sMICA FP sMICA soro sMICA FP CTX K562 I/II (n=9) III/IV (n=12) sMICA soro sMICA FP sMICA soro sMICA FP CTX: citotoxicidade; sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peritoneal; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a rASRM; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; análise baseada nos valores de CTX contra K562 e K562BLOQ desc ontado o valor de morte espontânea de K562; valores de r e p determinados pelo teste de correlação de Spearman. ___________________________________________REFERÊNCIAS 249 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS A B. Separation of blood leukocytes, granulocytes and lymphocytes. Tissue Antigens. 1974;4(3):269 –74. Abrão MS, Podgaec S, Ribeiro S MJ. Tratamento cirúrgico da endometriose: quando e como fazer. In: MS A, editor. Endometriose: uma visão contemporânea. Rio de Janeiro: Revinter; 2000. p. 137–47. Abrao MS, Andres MP, Miller CE, Gingold JA, Rius M, Neto JS, et al. AAGL 2021 Endometriosis Classification: An Anatomy-based Surgical Complexity Score. J Minim Invasive Gynecol [Internet]. 2021;28(11):1941-1950.e1. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jmig.2021.09.709 Abrao MS, Goncalves MO d. C, Dias JA, Podgaec S, Chamie LP, Blasbalg R. Comparison between clinical examination, transvaginal sonography and magnetic resonance imaging for the diagnosis of deep endometriosis. Hum Reprod [Internet]. 2007 Oct 18;22(12):3092–7. Available from: https://academic.oup.com/humrep/article-lookup/doi/10.1093/humrep/dem187 Abrao MS, Neme RM, Carvalho FM, Aldrighi JM, Pinotti JA. Histological classification of endometriosis as a predictor of response to treatment. Int J Gynecol Obstet. 2003;82(1):31–40. Abrão MS, Petraglia F, Falcone T, Keckstein J, Osuga Y, Chapron C. Deep endometriosis infiltrating the recto-sigmoid: Critical factors to consider before management. Hum Reprod Update. 2015;21(3):329–39. Adurthi S, Kumar MM, Vinodkumar HS, Mukherjee G, Krishnamurthy H, Acharya KK, et al. Oestrogen Receptor-α binds the FOXP3 promoter and modulates regulatory T-cell function in human cervical cancer. Sci Rep [Internet]. 2017;7(1):1–15. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/s41598-017- 17102-w Agarwal A, Gupta S, Sekhon L, Shah R. Redox Considerations in Female Reproductive Fun ction and Assisted Reproduction: From Molecular Mechanisms to Health Implications. Antioxid Redox Signal [Internet]. 2008 Aug;10(8):1375–404. Available from: http://www.liebertpub.com/doi/10.1089/ars.2007.1964 Ahn SH, Monsanto SP, Miller C, Singh SS, Thomas R, Tayade C. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. Biomed Res Int. 2015;2015. Akoum A, Lemay A, McColl S, Turcot-Lemay L, Maheux R. Elevated concentration and biologic activity of monocyte chemotactic protein-1 in the peritoneal fluid of patients with endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 1996 Jul;66(1):17–23. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8752605 Aktas E, Kucuksezer UC, Bilgic S, Erten G, Deniz G. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol [Internet]. 2009;254(2):149–54. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.cellimm.2008.08.007 Alter G, Malenfant JM, Altfeld M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 2004;294(1–2):15–22. De Andrade LF, En Tay R, Pan D, Luoma AM, Ito Y, Badrinath S, et al. Antibody -mediated inhibition of MICA and MICB shedding promotes NK cell-driven tumor immunity. Science (80- ). 2018;359(6383):1537–42. Andres MP, Borrelli GM, Abrão MS. Endometriosis classification according to pain symptoms: can the ASRM classification be improved? Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol [Internet]. 2018;51:111 –8. Available from: https://doi.org/10.1016/j.bpobgyn.2018.06.003 Anfossi N, André P, Guia S, Falk CS, Roetynck S, Stewart CA, et al. Human NK cell education by inhibitory receptors for MHC class I. Immunity [Internet]. 2006/08/10. 2006;25(2):331 –42. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16901727 Antsiferova YS, Sotnikova NY, Posiseeva L V., Shor AL. Changes in the T-helper cytokine profile and in lymphocyte activation at the systemic and local levels in women with endometriosis. Fertil Steril. 2005;84(6):1705–11. Aoki M. ENDOMETRIOSIS OF THE PELVIC LYMPH NODES. Pathol Int [Internet]. 1967 May ;17(2):217– 34. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1440-1827.1967.tb03169.x Arreygue-Garcia NA, Daneri-Navarro A, del Toro-Arreola A, Cid-Arregui A, Gonzalez-Ramella O, Jave- Suarez LF, et al. Augmented serum level of major histocompatibility complex class I-related chain A (MICA) protein and reduced NKG2D expression on NK and T cells in patients with cervical cancer and precursor lesions. BMC Cancer. 2008;8:1–10. Arruvito L, Sanz M, Banham AH, Fainboim L. Expansion of CD4 + CD25 + and FOXP3 + Regulatory T Cells during the Follicular Phase of the Menstrual Cycle: Implications for Human Reproduction . J Immunol. 2007;178(4):2572–8. Ashiru O, López-Cobo S, Fernández-Messina L, Pontes-Quero S, Pandolfi R, Reyburn HT, et al. A GPI anchor explains the unique biological features of the common NKG2D-ligand allele MICA*008. Biochem J. 2013;454(2):295–302. Attar E, Bulun SE. Aromatase and other steroidogenic genes in endometriosis: Translational aspects. Hum Reprod Update. 2006;12(1):49–56. 250 Attia GR, Zeitoun K, Edwards D, Johns A, Carr BR, Bulun SE. Progesterone Receptor Isoform A But Not B Is Expressed in Endometriosis1. J Clin Endocrinol Metab [Internet]. 2000 Aug 1;85(8):2897 –902. Available from: https://academic.oup.com/jcem/article/85/8/2897/2853885 Van Audenaerde JRM, De Waele J, Marcq E, Van Loenhout J, Lion E, Van den Bergh JMJ, et al. Interleukin-15 stimulates natural killer cell-mediated killing of both human pancreatic cancer and stellate cells. Oncotarget [Internet]. 2017 Aug 22;8(34):56968–79. Available from: https://www.oncotarget.com/lookup/doi/10.18632/oncotarget.18185 Bahram S. MIC genes: from genetics to biology. Adv Immunol [Internet]. 2000;76:1 –60. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11079097 Banu SK, Lee J, Speights VO, Starzinski-Powitz A, Arosh JA. Cyclooxygenase-2 regulates survival, migration, and invasion of human endometriotic cells through multiple mechanisms. Endocrinology. 2008;149(3):1180–9. Barbieri RL. Stenosis of the external cervical os: An association with endometriosis in women with chronic pelvic pain. Fertil Steril. 1998;70(3):571–3. Bargostavan MH, Eslami G, Esfandiari N SSA. MMP9 PromoterPolymorphism ( -1562 C/T) Does not Affect the Serum Levels of Soluble MICB and MICA in Breast Cancer. Iran J Immunol. 2016;13(1):45–53. Basu S, Pioli PA, Conejo-Garcia J, Wira CR, Sentman CL. Estradiol regulates MICA expression in human endometrial cells. Clin Immunol [Internet]. 2008 Nov;129(2):325–32. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1521661608007146 Bauer S, Groh V, Wu J, Steinle A, Phillips JH, Lanier LL, et al. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress- inducible MICA. Science (80- ). 1999;285(5428):727–9. Becker CM, Laufer MR, Stratton P, Hummelshoj L, Missmer SA, Zondervan KT, et al. World Endometriosis Research Foundation Endometriosis Phenome and Biobanking Harmonisation Project: I. Surgical phenotype data collection in endometriosis research. Fertil Steril [Internet]. 2014 Nov;102(5):1213–22. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0015028214013363 Becker CM, Louis G, Exarhopoulos A, Mechsner S, Ebert AD, Zurakowski D, et al. Matrix metalloproteinases are elevated in the urine of patients with endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 2010;94(6):2343–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2010.02.040 Bellelis P, Frediani Barbeiro D, Gueuvoghlanian-Silva BY, Kalil J, Abrão MS, Podgaec S. Interleukin-15 and Interleukin-7 are the Major Cytokines to Maintain Endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 2019;84(5):435–44. Berbic M, Fraser IS. Immunology of normal and abnormal menstruation. Women ’s Heal. 2013;9(4):387– 95. Berbic M, Hey-Cunningham AJ, Ng C, Tokushige N, Ganewatta S, Markham R, et al. The role of Foxp3+ regulatory T-cells in endometriosis: a potential controlling mechanism for a complex, chronic immunological condition. Hum Reprod [Internet]. 2010 Apr 1;25(4):900–7. Available from: https://academic.oup.com/humrep/article-lookup/doi/10.1093/humrep/deq020 Berbic M, Schulke L, Markham R, Tokushige N, Russell P, Fraser IS. Macrophage expression in endometrium of women with and without endometriosis. Hum Reprod [Internet]. 2009 Feb 1;24(2):325–32. Available from: https://academic.oup.com/humrep/article- lookup/doi/10.1093/humrep/den393 Berkley KJ, Rapkin AJ, Papka RE. The Pains of Endometriosis. Science (80- ) [Internet]. 2005 Jun 10;308(5728):1587–9. Available from: https://www.science.org/doi/10.1126/science.1111445 Borghese B, Zondervan KT, Abrao MS, Chapron C, Vaiman D. Recent insights on the genetics and epigenetics of endometriosis. Clin Genet. 2017;91(2):254–64. Borreli G. Avaliação de fatores associados à invasão, migração celular e transformação maligna em mulheres com endometriose profunda. 2015. Borrelli GM, Abrão MS, Taube ET, Darb-Esfahani S, Köhler C, Kaufmann AM, et al. Immunohistochemical Investigation of Metastasis-Related Chemokines in Deep-Infiltrating Endometriosis and Compromised Pelvic Sentinel Lymph Nodes. Reprod Sci. 2015;22(12):1632–42. Boukouaci W, Al-Daccak R, Dulphy N, Lauden L, Amokrane K, Fortier C, et al. Soluble MICA -NKG2D interaction upregulates IFN-γ production by activated CD3-CD56+ NK cells: Potential impact on chronic graft versus host disease. Hum Immunol [Internet]. 2013;74(12):1536–41. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.humimm.2013.08.281 Bourlev V, Volkov N, Pavlovitch S, Lets N, Larsson A, Olovsson M. The relationship between microvessel density, proliferative activity and expression of vascular endothelial growth factor-A and its receptors in eutopic endometrium and endometriotic lesions. Reproduction. 2006;132(3):501 –9. Brosens I, Brosens JJ, Benagiano G. The eutopic endometrium in endometriosis: Are the c hanges of clinical significance? Reprod Biomed Online [Internet]. 2012;24(5):496–502. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.rbmo.2012.01.022 Brosens J BI. Adenomyosis. In: Cameron I, Fraser I SS, editor. Clinical Disorders of the Menstrual Cycle and Endometrium. New York: Oxford University Press; 1998. p. 297–312. 251 Bruner-Tran KL, Mokshagundam S, Herington JL, Ding T, Osteen KG. Rodent Models of Experimental Endometriosis: Identifying Mechanisms of Disease and Therapeutic Targets. Curr Women s Heal Rev. 2018;14(2):173–88. Bulun SE, Cheng Y, Yin P, Imir G, Utsunomiya H, Attar E, et al. Progesterone resistance in endometriosis : Link to failure to metabolize estradiol. Mol Cell Endocrinol. 2006;248:94–103. Bulun SE, Yang S, Fang Z, Gurates B, Tamura M, Zhou J, et al. Role of aromatase in endometrial disease. J Steroid Biochem Mol Biol. 2001;79(1–5):19–25. Burney RO, Giudice LC. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 2012;98(3):511–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2012.06.029 Burney RO, Talbi S, Hamilton AE, Kim CV, Nyegaard M, Nezhat CR, et al. Gene expression analysis of endometrium reveals progesterone resistance and candidate susceptibility genes in women with endometriosis. Endocrinology. 2007;148(8):3814–26. Butts CL, Shukair SA, Duncan KM, Bowers E, Horn C, Belyavskaya E, et al. Progesterone inhibits mature rat dendritic cells in a receptor-mediated fashion. Int Immunol. 2007;19(3):287–96. CakmakH, Guzeloglu-Kayisli O, Kayisli UA AA. Immune-endocrine interactions inendometriosis. Front Biosci. 2009;1:429–43. Caligiuri MA. Human natural killer cells. Blood. 2008;112(3):461–9. Campbell JJ, Qin S, Unutmaz D, Soler D, Murphy KE, Hodge MR, et al. Unique Subpopulations of CD56 + NK and NK-T Peripheral Blood Lymphocytes Identified by Chemokine Receptor Expression Repertoire . J Immunol. 2001;166(11):6477–82. Canis M, Donnez JG, Guzick DS, Halme JK, Rock JA, Schenken RS, et al. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril. 1997;67(5):817 –21. Cannistra SA. Cancer of the Ovary. N Engl J Med [Internet]. 2004 Dec 9;351(24):2519 –29. Available from: http://www.nejm.org/doi/abs/10.1056/NEJMra041842 Carapito R, Bahram S. Genetics, genomics, and evolutionary biology of NKG2D ligands. Immunol Rev. 2015;267(1):88–116. Chan CJ, Smyth MJ, Martinet L. Molecular mechanisms of natural killer cell activation in response to cellular stress. Cell Death Differ [Internet]. 2014;21(1):5–14. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/cdd.2013.26 Chang K-K, Liu L-B, Jin L-P, Zhang B, Mei J, Li H, et al. IL-27 triggers IL-10 production in Th17 cells via a c-Maf/RORγt/Blimp-1 signal to promote the progression of endometriosis. Nat Publ Gr [Internet]. 2017 [cited 2022 Jan 2];8. Available from: www.nature.com/cddis Chapron C, Dubuisson JB, Fritel X, Fernandez B, Poncelet C, Béguin S, et al. Operative management of deep endometriosis infiltrating the uterosacral ligaments. J Am Assoc Gynecol Laparosc. 1999;6(1):31–7. Chapron C, Fauconnier A, Vieira M, Barakat H, Dousset B, Pansini V, et al. Anatomical distribution of deeply infiltrating endometriosis: Surgical implications and proposition for a classification. Hum Reprod. 2003;18(1):157–61. Chegini N, Roberts M, Ripps B. Differential expression of interleukins (IL)-13 and IL-15 in ectopic and eutopic endometrium of women with endometriosis and normal fertile women. Am J Reprod Immunol. 2003;49(2):75–83. Chuang PC, Wu MH, Shoji Y TS. Downregulation of CD36 results in reduced phagocytic ability of peritoneal macrophages of women with endometriosis. J Pathol. 2009;219(2):232 –41. Clayton A, Mitchell JP, Court J, Linnane S, Mason MD, Tabi Z. Human T umor-Derived Exosomes Down- Modulate NKG2D Expression. J Immunol. 2008;180(11):7249–58. Cooper MA, Fehniger TA, Caligiuri MA. The biology of human natural killer -cell subsets. Trends Immunol. 2001a;22(11):633–40. Cooper MA, Fehniger TA, Turner SC, Chen KS, Ghaheri BA, Ghayur T, et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56bright subset. Blood [Internet]. 2001b May 15;97(10):3146–51. Available from: https://ashpublications.org/blood/article/97/10/3146/89683/Human-natural-killer-cells-a-unique- innate Cornillie FJ, Oosterlynck D, Lauweryns JM, Koninckx PR. Deeply infiltrating pelvic endometriosis: histology and clinical significance. Fertil Steril [Internet]. 1990;53(6):978–83. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2140994 Cox ST, Laza-Briviesca R, Pearson H, Soria B, Gibson D, Gomez S, et al. Umbilical cord blood plasma contains soluble NKG2D ligands that mediate loss of natural killer cell function and cytotoxicity. Eur J Immunol. 2015;45(8):2324–34. Critchley HOD, Kelly RW, Brenner RM, Baird DT. The endocrinology of menstruation - A role for the immune system. Clin Endocrinol (Oxf). 2001;55(6):701–10. Crona Guterstam Y, Strunz B, Ivarsson MA, Zimmer C, Melin AS, Jonasson AF, et al. The cytokine profile of menstrual blood. Acta Obstet Gynecol Scand. 2021;100(2):339–46. Cruz C Dela, Reis FM. The role of TGF β superfamily members in the pathophysiology of endometriosis. Gynecol Endocrinol [Internet]. 2015;31(7):511–5. Available from: 252 http://dx.doi.org/10.3109/09513590.2015.1018166 Cullinan-Bove K, Koos RD. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor expression in the rat uterus: rapid stimulation by estrogen correlates with estrogen-induced increases in uterine capillary permeability and growth. Endocrinology [Internet]. 1993 Aug;133(2):829–37. Available from: https://academic.oup.com/endo/article-lookup/doi/10.1210/endo.133.2.8344219 D’Hooghe TM, Xiao L, Hill JA. Cytokine profiles in autologous peritoneal fluid and peripheral blood of women with deep and superficial endometriosis. Arch Gynecol Obstet. 2001;265(1):40 –4. Deng L, Shipley GL, Loose-Mitchell DS, Stancel GM, Broaddus R, Pickar JH, et al. Coordinate regulation of the production and signaling of retinoic acid by estrogen in the human endometrium. J Clin Endocrinol Metab. 2003;88(5):2157–63. Deniz G, Akdis M, Aktas E, Blaser K, Akdis CA. Human NK1 and NK2 subsets determined by purification of IFN-γ-secreting and IFN-γ-nonsecreting NK cells. Eur J Immunol. 2002;32(3):879–84. Deniz G, Erten G, Kücüksezer UC, Kocacik D, Karagiannidis C, Aktas E, et al. Regulatory NK Cells Suppress Antigen-Specific T Cell Responses. J Immunol. 2008;180(2):850–7. Dias JA, Podgaec S, de Oliveira RM, Carnevale Marin ML, Baracat EC, Abrão MS. Patients With Endometriosis of the Rectosigmoid Have a Higher Percentage of Natural Killer Cells in Peripheral Blood. J Minim Invasive Gynecol. 2012;19(3):317–24. Diefenbach A, Hsia JK, Hsiung MYB, Raulet DH. A novel ligand for the NKG2D receptor activates NK cells and macrophages and induces tumor immunity. Eur J Immunol. 2003;33(2):381 –91. Diefenbach A, Raulet DH. Strategies for target cell recognition by natural killer cells. Immunol Rev. 2001;181(7):170–84. Diefenbach A, Tomasello E, Lucas M, Jamieson AA, Hsia JK, Vivier E, et al. Selective associations with signaling proteins determine stimulatory versus costimulatory activity of NKG2D. Nat Immunol. 2002;3(12):1142–9. Dmowski WP, Braun D GH. Endometriosis: genetic and immunologic aspects. Prog ClinBiol Res. 1990;323:99–122. Dmowski WP, Braun DP. Immunology of endometriosis. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2004;18(2):245–63. Dmowski WP, Ding J, Shen J, Rana N, Fernandez BB, Braun DP. Apoptosis in endometrial glandular and stromal cells in women with and without endometriosis. Hum Reprod. 2001;16(9):1802 –8. Dogra P, Rancan C, Ma W, Toth M, Senda T, Carpenter DJ, et al. Tissue Determinants of Human NK Cell Development, Function, and Residence. Cell [Internet]. 2020;180(4):749-763.e13. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.01.022 Donnez J, Smoes P, Gillerot S, Casanas-Roux F, Nisolle M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis. Hum Reprod. 1998;13(6):1686–90. Dosiou C, Lathi RB, Tulac S, Huang STJ, Giudice LC. Interferon-related and other immune genes are downregulated in peripheral blood leukocytes in the luteal phase of the menstrual cycle. J Cli n Endocrinol Metab. 2004;89(5):2501–4. Dubernard G, Piketty M, Rouzier R, Houry S, Bazot M, Darai E. Quality of life after laparoscopic colorectal resection for endometriosis. Hum Reprod. 2006;21(5):1243–7. Eisermann J, Gast MJ, Pineda J, Odem RR, Collins JL. Tumor necrosis factor in peritoneal fluid of women undergoing laparoscopic surgery. Fertil Steril [Internet]. 1988;50(4):573 –9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0015-0282(16)60185-1 Epling-Burnette PK, Bai F, Painter JS, Rollison DE, Salih HR, Krusch M, et al. Reduced natural killer (NK) function associated with high-risk myelodysplastic syndrome (MDS) and reduced expression of activating NK receptors. Blood. 2007;109(11):4816–24. Estes PA, Suba EJ, Lawler-Heavner J, El-Ashry-Stowers D, Wei LL, Toft DO, et al. Immunologic analysis of human breast cancer progesterone receptors. 1. Immunoaffinity purification of transformed receptors and production of monoclonal antibodies. Biochemistry [Internet]. 1987 Sep 22;26(19):6250–62. Available from: https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi00393a045 Fauriat C, Long EO, Ljunggren HG, Bryceson YT. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 2010;115(11):2167–76. Febbraio M, Hajjar DP, Silverstein RL. CD36: a class B scavenger receptor involved in angiogenesis, atherosclerosis, inflammation, and lipid metabolism. J Clin Invest [Internet]. 2001 Sep 15;108(6):785–91. Available from: http://www.jci.org/articles/view/14006 Fehniger TA, Cooper MA, Nuovo GJ, Cella M, Facchetti F, Colonna M, et al. CD56bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated by T cell-derived IL-2: A potential new link between adaptive and innate immunity. Blood. 2003;101(8):3052–7. Ferlazzo G, Münz C. NK Cell Compartments and Their Activation by Dendritic Cells. J Immunol. 2004;172(3):1333–9. Ferrari de Andrade L, Tay RE, Pan D, Luoma AM, Ito Y, Badrinath S, et al. Antibody -mediated inhibition of MICA and MICB shedding promotes NK cell–driven tumor immunity. Science (80- ) [Internet]. 2018 Mar 30;359(6383):1537–42. Available from: https://www.science.org/doi/10.1126/science.aao0505 253 Fleige S, Pfaffl MW. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med [Internet]. 2006 Apr;27(2–3):126–39. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0098299705000944 Flynn L, Byrne B, Carton J, Kelehan P, O’Herlihy C, O’Farrelly C. Menstrual cycle dependent fluctuations in NK and T-lymphocyte subsets from non-pregnant human endometrium. Am J Reprod Immunol. 2000;43(4):209–17. Fox HS, Bond BL, Parslow TG. Estrogen regulates the IFN-gamma promoter. J Immunol [Internet]. 1991 Jun 15;146(12):4362–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1904081 Freud AG, Caligiuri MA. Human natural killer cell development. Immunol Rev. 2006;214(1):56 –72. Freud AG, Mundy-Bosse BL, Yu J, Caligiuri MA. The Broad Spectrum of Human Natural Killer Cell Diversity. Immunity [Internet]. 2017;47(5):820–33. Available from: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2017.10.008 Fuertes MB, Domaica CI, Zwirner NW. Leveraging NKG2D Ligands in Immuno -Oncology. Front Immunol. 2021;12(July):1–27. Fujiwara T, Oda K, Yokota S, Takatsuki A, Ikehara Y. Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem [Internet]. 1988;263(34):18545–52. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9258(19)81393- 5 Gaide Chevronnay HP, Selvais C, Emonard H, Galant C, Marbaix E, Henriet P. Regulation of matrix metalloproteinases activity studied in human endometrium as a paradigm of cyclic tissue breakdown and regeneration. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics [Internet]. 2012;1824(1):146–56. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbapap.2011.09.003 Gao X, Single RM, Karacki P, Marti D, O’Brien SJ, Carrington M. Diversity of MICA and Linkage Disequilibrium with HLA-B in Two North American Populations. Hum Immunol. 2006;67(3):152–8. Garrity D, Call ME, Feng J, Wucherpfennig KW. The activating NKG2D receptor assembles in the membrane with two signaling dimers into a hexameric structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(21):7641–6. Garzetti GG, Ciavattini A, Provinciali M, Muzzioli M, Stefano G Di, Fabris N. Natural killer activity in stage III and IV endometriosis: Impaired cytotoxicity and retained lymphokine responsiveness of natural killer cells. Gynecol Endocrinol. 1995;9(2):125–30. Gasser S, Orsulic S, Brown EJ, Raulet DH. The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor. Nature. 2005;436(7054):1186–90. Gellersen B, Brosens IA, Brosens JJ. Decidualization of the human endometrium: Mechanisms, functions, and clinical perspectives. Semin Reprod Med. 2007;25(6):445–53. Ghadially H, Brown L, Lloyd C, Lewis L, Lewis A, Dillon J, et al. MHC class i chain -related protein A and B (MICA and MICB) are predominantly expressed intracellularly in tumour and normal tissue. Br J Cancer [Internet]. 2017;116(9):1208–17. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/bjc.2017.79 Gilabert-Estellés J, Estellés A, Gilabert J, Castelló R, España F, Falcó C, et al. Expression of several components of the plasminogen activator and matrix metalloproteinase systems in endometriosis. Hum Reprod. 2003;18(7):1516–22. Giudice LC. Endometriosis. N Engl J Med [Internet]. 2010 Jun 24;362(25):2389–98. Available from: http://www.nejm.org/doi/abs/10.1056/NEJMcp1000274 Giudice LC, Kao LC. Endometriosis. Lancet [Internet]. 2004;364(9447):1789–99. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15541453 Gleicher N, el-Roeiy A, Confino E FJ. Is endometriosis an autoimmune disease? Obs Gynecol. 1987;70:115-22. Gmyrek GB, Sieradzka U, Goluda M, Gabryś M, Sozański R, Jerzak M, et al. Differential flow cytometric detection of intracellular cytokines in peripheral and peritoneal mononuclear cells of women with endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2008;137(1):67–76. González-Foruria I, Santulli P, Chouzenoux S, Carmona F, Batteux F, Chapron C. Soluble l igands for the NKG2D receptor are released during endometriosis and correlate with disease severity. PLoS One [Internet]. 2015/03/16. 2015;10(3):e0119961. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25775242 Groh V, Bahram S, Bauer S, Herman A, Beauchamp M, Spies T. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(22):12445–50. Groh V, Rhinehart R, Randolph-Habecker J, Topp MS, Riddell SR, Spies T. Costimulation of CD8αβ T cell by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat Immunol. 2001;2(3):255–60. Groh V, Smythe K, Dai Z, Spies T. Fas ligand-mediated paracrine T cell regulation by the receptor NKG2D in tumor immunity. Nat Immunol. 2006;7(7):755–62. Groh V, Wu J, Yee C, Spies T. Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T- cell activation. Nature. 2002;419(6908):734–8. Gross E, Sunwoo JB, Bui JD. Cancer immunosurveillance and immunoediting by natural ki ller cells. 254 Cancer J (United States). 2013;19(6):483–9. Guo SW, Du Y, Liu X. Platelet-derived TGF-βI mediates the down-modulation of NKG2D expression and may be responsible for impaired natural killer (NK) cytotoxicity in women with endometriosis. Hum Reprod. 2016;31(7):1462–74. Hafner LM, Cunningham K, Beagley KW. Ovarian steroid hormones: Effects on immune responses and Chlamydia trachomatis infections of the female genital tract. Mucosal Immunol. 2013;6(5):859 –75. Halme J, Becker S, Wing R. Accentuated cyclic activation of peritoneal macrophages in patients with endometriosis. Am J Obstet Gynecol [Internet]. 1984;148(1):85–90. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0002-9378(84)80037-X Harada T, Yoshioka H, Yoshida S, Iwabe T, Onohara Y, Tanikawa M, et al. Increased interleukin-6 levels in peritoneal fluid of infertile patients with active endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1997;176(3):593–7. Hedlund M, Nagaeva O, Kargl D, Baranov V, Mincheva-Nilsson L. Thermal- and oxidative stress causes enhanced release of NKG2D ligand-bearing immunosuppressive exosomes in leukemia/lymphoma T and B cells. PLoS One. 2011;6(2). Heidemann LN, Hartwell D, Heidemann CH, Jochumsen KM. The relation between endometriosis and ovarian cancer - A review. Acta Obstet Gynecol Scand. 2014;93(1):20–31. Herington JL, Bruner-Tran KL, Lucas JA, Osteen KG. Immune interactions in endometriosis. Expert Rev Clin Immunol. 2011;7(5):611–26. Higuma-Myojo S, Sasaki Y, Miyazaki S, Saki M, Siozaki A, Miwa N, et al. Cytokine profile of na tural killer cells in early human pregnancy. Am J Reprod Immunol. 2005;54(1):21–9. Hill JA, Faris HMP, Schiff I, Anderson DJ. Characterization of leukocyte subpopulations in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril. 1988;50(2). Hirata J, Kikuchi Y, Imaizumi E, Tode T, Nagata I. Endometriotic tissues produce immunosuppressive factors. Gynecol Obstet Invest. 1994;37(1):43–7. Ho HN, Chao KH, Chen HF, Wu MY, Yang YS, Lee TY. Peritoneal natural killer cytotoxicity and CD25+CD3+ lymphocyte subpopulation are decreased in women with stage III-IV endometriosis. Hum Reprod. 1995;10(10):2671–5. Hobbs JE, Bortnick AR. Endometriosis of the Lungs. Am J Obstet Gynecol [Internet]. 1940;40(5):832 –43. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0002-9378(15)30807-3 Imamura T, Khan KN, Fujishita A, Kitajima M, Hiraki K, Ishimaru T, et al. Effect of GnRH agonist therapy on the expression of human heat shock protein 70 in eutopic and ectopic endometria of women with endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol [Internet]. 2014;180(1):16–23. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ejogrb.2014.06.002 Isernhagen A, Malzahn D, Bickeböller H, Dressel R. Impact of the MICA-129Met/val dimorphism on NKG2D-mediated biological functions and disease risks. Front Immunol. 2016;7(DEC):1–9. Isernhagen A, Malzahn D, Viktorova E, Elsner L, Monecke S, Bonin F, et al. The MICA ‐129 dimorphism affects NKG2D signaling and outcome of hematopoietic stem cell transplantation. EMBO Mol Med. 2015;7(11):1480–502. Iwasaki, K. I; Makino, T.; Maruyama, T.; Matsubayashi, H.; Nozawa, S.; Yokokura T. Leukocyte subpopulations and natural killer activity in endometriosis. Int J Fertil (1993), 38(4). 1993;38(4):229–34. Jabbour HN, Kelly RW, Fraser HM, Critchley HOD. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 2006;27(1):17–46. Jaeger-Lansky A, Schmidthaler K, Kuessel L, Gstöttner M, Waidhofer-Söllner P, Zlabinger GJ, et al. Local and systemic levels of cytokines and danger signals in endometriosis -affected women. J Reprod Immunol [Internet]. 2018;130(July):7–10. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jri.2018.07.006 Jiang J, Jiang Z, Xue M. Serum and peritoneal fluid levels of interleukin-6 and interleukin-37 as biomarkers for endometriosis. Gynecol Endocrinol [Internet]. 2019;35(7):571–5. Available from: https://doi.org/10.1080/09513590.2018.1554034 Jiang W, Chai NR, Maric D, Bielekova B. Unexpected Role for Granzyme K in CD56 bright NK Cell - Mediated Immunoregulation of Multiple Sclerosis . J Immunol. 2011;187(2): 781–90. Jiang Y, Chen L, Taylor RN, Li C, Zhou X. Physiological and pathological implications of retinoid action in the endometrium. J Endocrinol. 2018;236(3):R169–88. Jinushi M, Takehara T, Tatsumi T, Kanto T, Groh V, Spies T, et al. Autocrine/Paracrine IL-15 That Is Required for Type I IFN-Mediated Dendritic Cell Expression of MHC Class I-Related Chain A and B Is Impaired in Hepatitis C Virus Infection. J Immunol. 2003;171(10):5423–9. Jinushi M, Vanneman M, Munshi NC, Tai YT, Prabhala RH, Ritz J, et al. MHC class I chain-related protein A antibodies and shedding are associated with the progression of multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(4):1285–90. Jones RK, Searle RF, Bulmer JN. Apoptosis and bcl-2 expression in normal human endometrium, endometriosis and adenomyosis. Hum Reprod. 1998;13(12):3496–502. Kamergorodsky G, Ribeiro PAA, Galvão MAL, Abrão MS, Donadio N, de Barros Moreira Lemos NL, et 255 al. Histologic classification of specimens from women affected by superficial endometriosis, deeply infiltrating endometriosis, and ovarian endometriomas. Fertil Steril. 2009;92(6):2074 –7. Kanzaki H, Wang HS, Kariya M, Mori T. Suppression of natural killer cell activity by sera from patients with endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1992;167(1):257–61. Karpuzoglu-Sahin E, Hissong BD, Ansar Ahmed S. Interferon-γ levels are upregulated by 17-β-estradiol and diethylstilbestrol. J Reprod Immunol. 2001;52(1–2):113–27. Kärre K, Ljunggren HG, Piontek G, Kiessling R. Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy. Nature. 1986;319(6055):675–8. Kats R, Collette T, Metz CN, Akoum A. Marked elevation of macrophage migration inhibitory factor in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril. 2002;78(1):69–76. Kayisli OG, Kayisli UA, Luleci G, Arici A. In vivo and in vitro regulation of Akt activation in human endometrial cells is estrogen dependent. Biol Reprod. 2004;71(3):714 –21. Ke J, Ye J, Li M, Zhu Z. The role of matrix metalloproteinases in endometriosis: A potential target. Biomolecules. 2021;11(11):1–16. Kelly RW, King AE, Crithley HOD. Cytokine control in human endometrium. Reproduction. 2001;121(1):3–19. Kimura MY, Nakayama T. Differentiation of NK1 and NK2 cells. Vol. 25, Critical Reviews in Immunology. 2005. King A, Gardner L, Loke YW. Evaluation of oestrogen and progesterone receptor expression in uterine mucosal lymphocytes. Hum Reprod. 1996;11(5):1079–82. Kitawaki J, Kado N, Ishihara H, Koshiba H, Kitaoka Y, Honjo H. Endometriosis: The pathophysiology as an estrogen-dependent disease. J Steroid Biochem Mol Biol. 2002;83(1–5):149–55. Klemmt PAB, Carver JG, Koninckx P, McVeigh EJ, Mardon HJ. Endometrial cells from women with endometriosis have increased adhesion and proliferative capacity in response to extracellular matrix components: Towards a mechanistic model for endometriosis progression. Hum Reprod. 2007;22(12):3139–47. Klinge CM. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 2001;29(14):2905–19. Klöß S, Chambron N, Gardlowski T, Arseniev L, Koch J, Esser R, et al. Increased sMICA and TGF β1 levels in HNSCC patients impair NKG2D-dependent functionality of activated NK cells. Oncoimmunology. 2015;4(11). Koninckx PR, Meuleman C, Demeyere S, Lesaffre E, Cornillie FJ. Suggestive evidence that pelvic endometriosis is a progressive disease, whereas deeply infiltrating endometriosis is associated with pelvic pain. Fertil Steril [Internet]. 1991;55(4):759–65. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0015-0282(16)54244-7 Kovats S. Estrogen receptors regulate innate immune cells and signaling pathways. Cell Immunol. 2015;29(2):63-9. Kumar S, Bandyopadhyay U. Free heme toxicity and its detoxification systems in human. Toxicol Lett [Internet]. 2005 Jul;157(3):175–88. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0378427405000883 Kumar V, Yi Lo PH, Sawai H, Kato N, Takahashi A, Deng Z, et al. Soluble MICA and a MICA Variation as Possible Prognostic Biomarkers for HBV-Induced Hepatocellular Carcinoma. Villa E, editor. PLoS One [Internet]. 2012 Sep 14;7(9):e44743. Available from: https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0044743 Kyama CM, Debrock S, Mwenda JM, Hooghe TMD. Potential involvement of the immune system in the development of endometriosis. Reprod Biol Endocrinol. 2003;9:1–9. Kyama CM, Overbergh L, Mihalyi A, Meuleman C, Mwenda JM, Mathieu C, et al. Endometrial and peritoneal expression of aromatase, cytokines, and adhesion factors in women with endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 2008 Feb;89(2):301–10. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0015028207005250 Lang TJ. Estrogen as an immunomodulator. Clin Immunol. 2004;113(3):224–30. Lanier LL. NK cell receptors. Annu Rev Immunol. 1998;16:359–93. Laškarin G, Tokmadži VS, Štrbo N, Bogovi T, Szekeres-Bartho J, Randi L, et al. Progesterone induced blocking factor (PIBF) mediates progesterone induced suppression of decidual lymphocyte cytotoxicity. Am J Reprod Immunol. 2002;48(4):201–9. Lavini-Ramos C, Silva HM, Soares-Schanoski A, Monteiro SM, Ferreira LRP, Pacanaro AP, et al. MMP9 integrates multiple immunoregulatory pathways that discriminate high suppressive activity of human mesenchymal stem cells. Sci Rep. 2017;7(1):1–15. Lee SK, Kim CJ, Kim D-J, Kang J. Immune Cells in the Female Reproductive Tract. Immune Netw. 2015;15(1):16. Liu DTY, Hitchcock A. Endometriosis: its association with retrograde menstruation, dysmenorrhoea and tubal pathology. BJOG An Int J Obstet Gynaecol. 1986;93(8):859–62. Liu G, Atteridge CL, Wang X, Lundgren AD, Wu JD. Cutting Edge: The Membrane Type Matrix Metalloproteinase MMP14 Mediates Constitutive Shedding of MHC Class I Chain-Related Molecule 256 A Independent of A Disintegrin and Metalloproteinases. J Immunol. 2010;184(7):3346 –50. Liu H, Lang JH. Is abnormal eutopic endometrium the cause of endometriosis? The role of eutopic endometrium in pathogenesis of endometriosis. Med Sci Monit. 2011;17(4):92–9. Liu K, Zhang W, Liu S, Dong B, Liu Y. Hepatic endometriosis: a rare case and review of the literature. Eur J Med Res [Internet]. 2015 Dec 4;20(1):48. Available from: https://eurjmedres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40001-015-0137-1 Liu Q, Ma P, Liu L, Ma G, Ma J, Liu X, et al. Evaluation of PLGA containing anti-CTLA4 inhibited endometriosis progression by regulating CD4 + CD25 + Treg cells in peritoneal fluid of mouse endometriosis model. Eur J Pharm Sci [Internet]. 2017;96:542–50. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ejps.2016.10.031 Ljunggren HG, Kärre K. In search of the “missing self”: MHC molecules and NK cell recognition. Immunol Today [Internet]. 1990;11(7):237–44. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2201309 Lodoen MB, Lanier LL. Natural killer cells as an initial defense against pathogens. Curr Opin Immunol. 2006;18(4):391–8. Lopes B, Ramos IC, Ribeiro G, Correa R, Valbon B; Luz A, Salomão M, Lyra JM AJR. Biostatistics: fundamental concepts and practical applications Bioestatísticas: conceitos fundamentais e aplicações práticas. Rev Bras Oftalmol. 2014;73(1):16–22. Lopez-Vergès S, Milush JM, Pandey S, York VA, Arakawa-Hoyt J, Pircher H, et al. CD57 defines a functionally distinct population of mature NK cells in the human CD56dimCD16+ NK-cell subset. Blood. 2010;116(19):3865–74. Lozzio BB, Lozzio CB. Properties of the K562 cell line derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 1977;19(1):136. Lubis HP, Aldiansyah D, Siregar HS, Rivany R, Hariadi TS. Expression of natural killer cell activity with CD107a on ectopic endometrium in woman with endometriosis compared with non -endometriosis. IOP Conf Ser Earth Environ Sci. 2018;125(1). Luo Q, Luo W, Zhu Q, Huang H, Peng H, Liu R, et al. Tumor-derived soluble MICA obstructs the NKG2D pathway to restrain NK cytotoxicity. Aging Dis. 2020;11(1):118–28. Maeda N, Izumiya C, Yamamoto Y, Oguri H, Kusume T, Fukaya T. Increased killer inhibitory receptor KIR2DL1 expression among natural killer cells in women with pelvic endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 2002;77(2):297–302. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11821086 Manaster I, Mandelboim O. The Unique Properties of Human NK Cells in the Uterine Mucosa. P lacenta. 2008;29(SUPPL.):60–6. Mansour I, Reznikoff-etievant MF, Netter A. No evidence for the expression of the progesterone receptor on peripheral blood iymphocytes during pregnancy. Hum Reprod. 1994;9(8):1546 –9. Marbaix E. [Role of matrix metalloproteinases in the endometrium in normal and pathologic menstruation]. Bull Mem Acad R Med Belg [Internet]. 2005;160(5–6):232–8; discussion 239-40. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16465777 Marbaix E, Kokorine I, Moulin P, Donnez J, Eeckhout Y, Courtoy PJ. Menstrual breakdown of human endometrium can be mimicked in vitro and is selectively and reversibly blocked by inhibitors of matrix metalloproteinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(17):9120–5. Marcenaro S, Gallo F, Martini S, Santoro A, Griffiths GM, Aricó M, et al. Analysis of natural killer-cell function in familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL): Defective CD107a surface expression heralds Munc13-4 defect and discriminates between genetic subtypes of the disease. Blood. 2006;108(7):2316–23. De Maria A, Fogli M, Mazza S, Basso M, Picciotto A, Costa P, et al. Increased natural cytotoxicity receptor expression and relevant IL-10 production in NK cells from chronically infected viremic HCV patients. Eur J Immunol [Internet]. 2007 Feb;37(2):445–55. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.200635989 Marin MLC, Coelho V, Visentainer JEL, Alves HV, Köhler KF, Rached MR, et al. Inhibitory KIR2DL2 Gene: Risk for Deep Endometriosis in Euro-descendants. Reprod Sci. 2021;28(1):291–304. Marin MLC, Savioli CR, Yamamoto JH, Kalil J, Goldberg AC. MICA polymorphism in a sample of the S ão Paulo population, Brazil. Eur J Immunogenet. 2004;31(2):63–71. Maroof A, Beattie L, Zubairi S, Svensson M, Stager S, Kaye PM. Posttranscriptional Regulation of Il10 Gene Expression Allows Natural Killer Cells to Express Immunoregulatory Function. Immunity. 2008;29(2):295–305. Martín-Fontecha A, Thomsen LL, Brett S, Gerard C, Lipp M, Lanzavecchia A, et al. Induced recruitment of NK cells to lymph nodes provides IFN-γ for TH1 priming. Nat Immunol. 2004;5(12):1260–5. Martín-Pagola A, Ortiz L, De Nanclares GP, Vitoria JC, Castaño L, Bilbao JR. Analysis of the Expression of MICA in Small Intestinal Mucosa of Patients with Celiac Disease. J Clin Immunol [Internet]. 2003 Nov;23(6):498–503. Available from: http://link.springer.com/10.1023/B:JOCI.0000010426.16956.cc Matarese G, De Placido G, Nikas Y, Alviggi C. Pathogenesis of endometriosis: Natural immunity dysfunction or autoimmune disease? Trends Mol Med. 2003;9(5):223–8. Mathur S, Garza DE, Smith LF. Endometrial autoantigens eliciting immunoglobulin (Ig)G, IgA, and IgM 257 responses in endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 1990 Jul;54(1):56–63. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2358092 Matsuoka S, Maeda N, Izumiya C, Yamashita C, Nishimori Y, Fukaya T. Expression of inhibitory -motif killer immunoglobulin-like receptor, KIR2DL1, is increased in natural killer cells from women with pelvic endometriosis. Am J Reprod Immunol [Internet]. 2005;53(5):249–54. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15833103 Matusali G, Tchidjou HK, Pontrelli G, Bernardi S, D’Ettorre G, Vullo V, et al. Soluble ligands for the NKG2D receptor are released during HIV-1 infection and impair NKG2D expression and cytotoxicity of NK cells. FASEB J. 2013;27(6):2440–50. Maybin JA, Critchley HOD. Menstrual physiology: Implications for endometrial pathology and beyond. Hum Reprod Update. 2015;21(6):748–61. McKay LI, Cidlowski JA. Molecular control of immune/inflammatory responses: Interactions between nuclear factor-κB and steroid receptor-signaling pathways. Endocr Rev. 1999;20(4):435–59. Middleton D, Curran M, Maxwell L. Natural killer cells and their receptors. Transpl Immunol. 2002;10(2– 3):147–64. Missmer SA, Hankinson SE, Spiegelman D, Barbieri RL, Malspeis S, Willett WC, et al. Reproductive History and Endometriosis Among Premenopausal Women. Obstet Gynecol [Internet]. 2004 Nov;104(5, Part 1):965–74. Available from: http://journals.lww.com/00006250-200411000-00013 Mollenhauer HH, James Morré D, Rowe LD. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. BBA - Rev Biomembr. 1990;1031(2):225–46. Monsanto SP, Edwards AK, Zhou J, Nagarkatti P, Nagarkatti M, Young SL, et al. Surgical removal of endometriotic lesions alters local and systemic proinflammatory cytokines in endometriosis patients. Fertil Steril [Internet]. 2016;105(4):968-977.e5. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.11.047 Monsivais D, Dyson MT, Yin P, Coon JS, Navarro A, Feng G, et al. ERβ- and prostaglandin E2-regulated pathways integrate cell proliferation via Ras-like and estrogen-regulated growth inhibitor in endometriosis. Mol Endocrinol. 2014;28(8):1304–15. Moretta A, Bottino C, Mingari MC, Biassoni R, Moretta L. What is a natural killer cell? Nat Immunol. 2002;3(1):6–8. Morvan MG, Lanier LL. NK cells and cancer: You can teach innate cells new tricks. Nat Rev Cancer [Internet]. 2016;16(1):7–19. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrc.2015.5 Muharam R, Febri RR, Prabowo KA, Bustami A, Mansur IG. Increased Levels of CD107a and Intracellular Cytokines in IL-2 Stimulated PBMCs from Endometriosis Patients. Moshage HJ, editor. Int J Inflam [Internet]. 2021 Sep 27;2021:1–6. Available from: https://www.hindawi.com/journals/iji/2021/5760959/ Nanda A, Thangapandi K, Banerjee P, Dutta M, Wangdi T, Sharma P, et al. Cytokines, angiogenesis, and extracellular matrix degradation are augmented by oxidative stress in endometriosis. Ann Lab Med. 2020;40(5):390–7. Nandakumar S, Miller CW, Kumaraguru U. T regulatory cells: an overview and intervention techniques to modulate allergy outcome. Clin Mol Allergy [Internet]. 2009 Dec 12;7(1):5. Available from: https://clinicalmolecularallergy.biomedcentral.com/articles/10.1186/1476-7961-7-5 Nausch N, Cerwenka A. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 2008;27(45):5944 –58. Nishikiori N, Koyama M, Kikuchi T, Kimura T, Ozaki M, Harada S, et al. Membrane‐Spanning Fcγ Receptor III Isoform Expressed on Human Placental Trophoblasts. Am J Reprod Immunol. 1993;29(1):17–25. Nisolle M, Casanas-Roux F, Anaf V, Mine JM, Donnez J. Morphometric study of the stromal vascularization in peritoneal endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 1993 Mar;59(3):681–4. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8458479 Nisolle M, Donnez J. Peritoneal endometriosis, ovarian endometriosis, and adenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entities. Fertil Steril [Internet]. 1997;68(4):585–96. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9341595 Notas G, Kampa M, Castanas E. G Protein-Coupled Estrogen Receptor in Immune Cells and Its Role in Immune-Related Diseases. Front Endocrinol (Lausanne). 2020;11(October):1–9. Odukoya O, Bansal A, Cooke I. Serum endometrial IgG antibodies and soluble CD23 concentrations in patients with endometriosis. Acta Obstet Gynecol Scand. 1996;75(10):927–31. Oosterlynck DJ, Cornillie FJ, Waer M, Vandeputte M, Koninckx PR. Women with endometriosis show a defect in natural killer activity resulting in a decreased cytotoxicity to autologous endometrium. Fertil Steril [Internet]. 1991;56(1):45–51. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2065804 Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Koninckx PR, Vandeputte M. Immunosuppressive activity of peritoneal fluid in women with endometriosis. Obstet Gynecol [Internet]. 1993 Aug;82(2):206 –12. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8336865 Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Vandeputte M, Koninckx PR. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 1992;58(2):290–5. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1633893 258 Orange JS. Formation and function of the lytic NK-cell immunological synapse. Nat Rev Immunol. 2008;8(9):713–25. Orlichenko LS, Radisky DC. Matrix metalloproteinases stimulate epithelial -mesenchymal transition during tumor development. Clin Exp Metastasis. 2008;25(6):593–600. Osteen KG, Yeaman GR, Bruner-Tran KL. Matrix metalloproteinases and endometriosis. Semin Reprod Med. 2003;21(2):155–63. Osuga Y, Koga K, Hirota Y, Hirata T, Yoshino O, Taketani Y. Lymphocytes in Endometriosis. Am J Reprod Immunol. 2011;65(1):1–10. Ota H, Igarashi S, Hatazawa J, Tanaka T. Distribution of heat shock proteins in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Fertil Steril [Internet]. 1997;68(1):23 –8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0015-0282(97)81470-7 Ota H, Rong H, Igarashi S, Tanaka T. Suppression of natural killer cell activity by splenocyte transplantation in a rat model of endometriosis. Hum Reprod. 2002;17(6):1453 –8. Otoyama Y, Arai J, Goto K, Nozawa H, Nakagawa R, Muroyama R, et al. Retinoids Decrease Soluble MICA Concentration by Inhibiting the Enzymatic Activity of ADAM9 and ADAM10. Anticancer Res [Internet]. 2021 May 5;41(5):2307–20. Available from: http://ar.iiarjournals.org/lookup/doi/10.21873/anticanres.15006 P M Baxendale, M J Reed VHJ. Inability of human endometrium or myometrium to aromatize androstenedione. J Steroid Biochem . 1981;14(3):305-6. Pardoll DM. Stress, NK Receptors, and Immune Surveillance. Science (80- ) [Internet]. 2001 Oct 19;294(5542):534–6. Available from: https://www.science.org/doi/10.1126/science.1066284 Parker MG. Steroid and related receptors. Curr Opin Cell Biol. 1993;5(3):499–504. Passlick B, Flieger D, Ziegler-Heitbrock HW. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood [Internet]. 1989 Nov 15;74(7):2527–34. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2478233 Peraldi M-N, Berrou J, Dulphy N, Seidowsky A, Haas P, Boissel N, et al. Oxidative Stress Mediates a Reduced Expression of the. J Immunol. 2009;182(1):1696–705. Pérez-Rodríguez M, Argüello JR, Fischer G, Corell A, Cox ST, Robinson J, et al. Further polymorphism of the MICA gene. Eur J Immunogenet [Internet]. 2002 Feb;29(1):35–46. Available from: http://doi.wiley.com/10.1046/j.0960-7420.2001.00275.x Perona-Wright G, Mohrs K, Szaba FM, Kummer LW, Madan R, Karp CL, et al. Systemic but Not Local Infections Elicit Immunosuppressive IL-10 Production by Natural Killer Cells. Cell Host Microbe [Internet]. 2009;6(6):503–12. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.chom.2009.11.003 Perussia B, Ravetch J V. FcγRIII (CD16) on human macrophages is a functional product of the FcγRIII‐2 gene. Eur J Immunol. 1991;21(2):425–9. Peters PJ, Borst J, Oorschot V, Fukuda M, Krahenbuhl O, Tschopp J, et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 1991;173(5):1099–109. Petri B, Sanz MJ. Neutrophil chemotaxis. Cell Tissue Res. 2018;371(3):425 –36. Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res [Internet]. 2001 May 1;29(9):45e – 45. Available from: https://academic.oup.com/nar/article- lookup/doi/10.1093/nar/29.9.e45 Pizzo A, Salmeri FM, Ardita F V., Sofo V, Tripepi M, Marsico S. Behaviour of cytokine levels in serum and peritoneal fluid of women with endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 2002;54(2):82 –7. Podgaec S, Abrao MS, Dias JA, Rizzo L V., de Oliveira RM, Baracat EC. Endometriosis: An inflammatory disease with a Th2 immune response component. Hum Reprod. 2007;22(5):1373–9. Podgaec S, Dias Junior JA, Chapron C, Oliveira RM de, Baracat EC, Abrão MS. Th1 and Th2 immune responses related to pelvic endometriosis. Rev Assoc Med Bras. 2010;56(1):92 –8. Podgaec S, Rizzo LV, Fernandes LFC, Baracat EC, Abrao MS. CD4+CD25highFoxp3+ Cells Increased in the Peritoneal Fluid of Patients with Endometriosis. Am J Reprod Immunol. 2012;68(4):301 –8. Poli A, Michel T, Thérésine M, Andrès E, Hentges F, Zimmer J. CD56bright natural killer (NK) cells: An important NK cell subset. Immunology. 2009;126(4):458–65. Prager I, Watzl C. Mechanisms of natural killer cell-mediated cellular cytotoxicity. J Leukoc Biol. 2019;105(6):1319–29. Pratt WB. Interaction of hsp90 with steroid receptors: organizing some diverse observations and presenting the newest concepts. Mol Cell Endocrinol [Internet]. 1990 Nov;74(1):C69 –76. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/030372079090198H Rached MR, Coelho V, Marin MLC, Pincerato K, Fujita A, Kalil JE, et al. HLA-G is upregulated in advanced endometriosis. Eur J Obs Gynecol Reprod Biol [Internet]. 2019/02/06. 2019;235:36 –41. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30784825 Rae MT, Hillier SG. Steroid signalling in the ovarian surface epithelium. Trends Endocrinol Metab. 2005;16(7):327–33. Rahmioglu N, Fassbender A, Vitonis AF, Tworoger SS, Hummelshoj L, D’Hooghe TM, et al. World Endometriosis Research Foundation Endometriosis Phenome and Biobanking Harmonization 259 Project: III. Fluid biospecimen collection, processing, and storage in endometriosis research. Fertil Steril. 2014;102(5):1233–43. Raulet DH. Roles of the NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat Rev Immunol. 2003;3(10) :781–90. Reed BG, Carr BR. The Normal Menstrual Cycle and the Control of Ovulation [Internet]. Endotext. 2000. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25905282 Reiss K, Ludwig A, Saftig P. Breaking up the tie: Disintegrin-like metalloproteinases as regulators of cell migration in inflammation and invasion. Pharmacol Ther. 2006;111(3):985–1006. Ren J, Nie Y, Lv M, Shen S, Tang R, Xu Y, et al. Estrogen upregulates MICA/B expression in human non-small cell lung cancer through the regulation of ADAM17. Cell Mol Immunol. 2015;12(6):768– 76. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Complement: A key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol [Internet]. 2010;11(9):785–97. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/ni.1923 Rodgers WH, Matrisian LM, Giudice LC, Dsupin B, Cannon P, Svitek C, et al. Patterns of matrix metalloproteinase expression in cycling endometrium imply differential functions and regulation by steroid hormones. J Clin Invest [Internet]. 1994 Sep 1;94(3):946–53. Available from: http://www.jci.org/articles/view/117461 Roederer M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry [Internet]. 2001 Nov 1;45(3):194–205. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/1097-0320(20011101)45:3%3C194::AID- CYTO1163%3E3.0.CO;2-C Romee R, Foley B, Lenvik T, Wang Y, Zhang B, Ankarlo D, et al. NK cell CD16 surface expression and function is regulated by a disintegrin and metalloprotease-17 (ADAM17). Blood. 2013;121(18):3599–608. Russel WW. Aberrant portions of the müllerian duct found in an ovary: Ovarian cysts of müllerian origin. Bull John Hopkins Hosp. 1899;10:8–10. Sakaguchi S, Miyara M, Costantino CM, Hafler DA. FOXP3 + regulatory T cells in the human immune system. Nat Rev Immunol [Internet]. 2010;10(7):490–500. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nri2785 Sakaguchi S, Ono M, Setoguchi R, Yagi H, Hori S, Fehervari Z, et al. Foxp3+CD25+CD4+ natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease. Immunol Rev [Internet]. 2006 Aug;212(1):8–27. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.0105- 2896.2006.00427.x Salamanca A, Beltran E. Subendometrial contractility in menstrual phase visualized by transvaginal sonography in patients with endometriosis. Fertil Steril. 1995;64(1):193–5. Salamonsen LA, Lathbury LJ. Endometrial leukocytes and menstruation. Hum Reprod Update. 2000;6(1):16–27. Salamonsen LA, Woolley DE. Menstruation: Induction by matrix metalloproteinases and i nflammatory cells. J Reprod Immunol. 1999;44(1–2):1–27. Salamonsen LA, Zhang J, Brasted M. Leukocyte networks and human endometrial remodelling. J Reprod Immunol. 2002;57(1–2):95–108. Salih HR, Rammensee H-G, Steinle A. Cutting Edge: Down-Regulation of MICA on Human Tumors by Proteolytic Shedding. J Immunol. 2002;169(8):4098–102. Sampson JA. Metastatic or Embolic Endometriosis, due to the Menstrual Dissemination of Endometrial Tissue into the Venous Circulation. Am J Pathol [Internet]. 1927a;3(2):93-110.43. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19969738%0Ahttp://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender. fcgi?artid=PMC1931779 Sampson JA. Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity. Am J Obstet Gynecol [Internet]. 1927b;14(4):422–69. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0002-9378(15)30003-X De Sanctis P, Elmakky A, Farina A, Caramelli E, Seracchioli R, Mabrouk M, et al. Matrix metalloproteinase-3 mRNA: A promising peripheral blood marker for diagnosis of endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 2011;71(2):118–23. Schmiedel D, Mandelboim O. NKG2D ligands-critical targets for cancer immune escape and therapy. Front Immunol. 2018;9(SEP):1–10. Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA. Interferon-γ: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol [Internet]. 2004 Feb;75(2):163–89. Available from: http://doi.wiley.com/10.1189/jlb.0603252 Schulke L, Berbic M, Manconi F, Tokushige N, Markham R, Fraser IS. Dendritic cell p opulations in the eutopic and ectopic endometrium of women with endometriosis. Hum Reprod. 2009;24(7):1695 – 703. Schulke L, Manconi F, Markham R, Fraser IS. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod [Internet]. 2008 Apr 18;23(7):1574–80. Available from: https://academic.oup.com/humrep/article-lookup/doi/10.1093/humrep/den030 260 Schwane V, Huynh-Tran VH, Vollmers S, Yakup VM, Sauter J, Schmidt AH, et al. Distinct Signatures in the Receptor Repertoire Discriminate CD56bright and CD56dim Natural Killer Cells. Front Immunol. 2020;11(December):1–13. Seeger P, Bosisio D, Parolini S, Badolato R, Gismondi A, Santoni A, et al. Activin A as a Mediator of NK – Dendritic Cell Functional Interactions. J Immunol. 2014;192(3):1241–8. Selvaraj P, Carpén O, Hibbs ML, Springer TA. Natural killer cell and granulocyte Fc gamma receptor III (CD16) differ in membrane anchor and signal transduction. J Immunol [Internet]. 1989 Nov 15;143(10):3283–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2553809 Serdar E. Bulun MD. Mechanism of Disease Endometriosis. N Engl J Med. 2009;(360):268–79. Serrano AE, Menares-Castillo E, Garrido-Tapia M, Ribeiro CH, Hernández CJ, Mendoza-Naranjo A, et al. Interleukin 10 decreases MICA expression on melanoma cell surface. Immunol Cell Biol. 2011;89(3):447–57. Seval Y, Cakmak H, Kayisli UA, Arici A. Estrogen-mediated regulation of p38 mitogen-activated protein kinase in human endometrium. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91(6):2349 –57. Shabrish S, Kelkar M, Chavan N, Desai M, Bargir U, Gupta M, et al. Natural killer cell degranulation defect: A cause for impaired NK-cell cytotoxicity and hyperinflammation in Fanconi anemia patients. Front Immunol. 2019;10(MAR):1–10. Sharpe-Timms KL. Endometrial Anomalies in Women with Endometriosis. Ann N Y Acad Sci [Internet]. 2001 Sep;943(1):131–47. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1749- 6632.2001.tb03797.x Sheppard S, Ferry A, Guedes J, Guerra N. The Paradoxical Role of NKG2D in Cancer Immunity. Front Immunol [Internet]. 2018;9:1808. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30150983 Shin-ichi Komiyama, Daisuke Aoki, Mizuka Komiyama SN. Local activation of TGF -beta1 at endometriosis sites. J Reprod Med. 2007;52(4):306–12. Shiraishi K, Mimura K, Kua LF, Koh V, Siang LK, Nakajima S, et al. Inhibition of MMP activity c an restore NKG2D ligand expression in gastric cancer, leading to improved NK cell susceptibility. J Gastroenterol. 2016;51(12):1101–11. Sidell N, Han SW, Parthasarathy S. Regulation and modulation of abnormal immune responses in endometriosis. Ann N Y Acad Sci. 2002;955:159–73. Siemaszko J, Marzec‐przyszlak A, Bogunia‐kubik K. Nkg2d natural killer cell receptor—a short description and potential clinical applications. Cells. 2021;10(6). Silberstein SD, Merriam GR. Physiology of the Menstrual Cycle. Cephalalgia [Internet]. 2000 Apr 17;20(3):148–54. Available from: http://journals.sagepub.com/doi/10.1046/j.1468- 2982.2000.00034.x Skinner JL, Riley SC, Gebbie AE, Glasier AF, Critchley HOD. Regulation of matrix metalloproteinase -9 in endometrium during the menstrual cycle and following administration of intrauterine levonorgestrel. Hum Reprod. 1999;14(3):793–9. Solass W, Horvath P, Struller F, Königsrainer I, Beckert S, Königsrainer A, et al. Functional vascular anatomy of the peritoneum in health and disease. Pleura and Peritoneum. 2016;1(3):145–58. Somigliana E, Viganò P, Gaffuri B, Candiani M, Busacca M, Di Blasio AM, et al. Modulation of NK cell lytic function by endometrial secretory factors: Potential role in endometriosis. Am J Reprod Immunol. 1996;36(5):295–300. Song H, Kim Y, Park G, Kim YS, Kim S, Lee HK, et al. Transforming growth factor-β1 regulates human renal proximal tubular epithelial cell susceptibility to natural killer cells via modulation of the NKG2D ligands. Int J Mol Med [Internet]. 2015 Oct;36(4):1180–8. Available from: https://www.spandidos- publications.com/10.3892/ijmm.2015.2317 Spear P, Wu M-R, Sentman M-L, Sentman CL. NKG2D ligands as therapeutic targets. Cancer Immun [Internet]. 2013;13:8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23833565 Steinle A, Li P, Morris DL, Groh V, Lanier LL, Strong RK, et al. Interactions of human NKG2D with its ligands MICA, MICB, and homologs of the mouse RAE-1 protein family. Immunogenetics. 2001;53(4):279–87. Suen JL, Chang Y, Chiu PR, Hsieh TH, Hsi E, Chen YC, et al. Serum level of IL-10 is increased in patients with endometriosis, and IL-10 promotes the growth of lesions in a murine model. Am J Pathol [Internet]. 2014;184(2):464–71. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ajpath.2013.10.023 Sun D, Wang X, Zhang H, Deng L, Zhang Y. MMP9 mediates MICA shedding in human osteosarcomas. Cell Biol Int. 2011;35(6):569–74. Suryawanshi S, Huang X, Elishaev E, Budiu RA, Zhang L, Kim S, et al. Complement Pathway Is Frequently Altered in Endometriosis and Endometriosis-Associated Ovarian Cancer. Clin Cancer Res [Internet]. 2014 Dec 1;20(23):6163–74. Available from: http://clincancerres.aacrjournals.org/lookup/doi/10.1158/1078-0432.CCR-14-1338 Swiersz LM. Role of endometriosis in cancer and tumor development. Ann N Y Acad Sci. 2002;955:281– 92. Symons LK, Miller JE, Kay VR, Marks RM, Liblik K, Koti M, et al. The Immunopathophysiology of 261 Endometriosis. Trends Mol Med [Internet]. 2018;24(9):748–62. Available from: https://doi.org/10.1016/j.molmed.2018.07.004 Szekeres-Bartho J, Philibert D, Chaouat G. Progesterone Suppression of Pregnancy Lymphocytes Is not Mediated by Glucocorticoid Effect. Am J Reprod Immunol [Internet]. 1990 Jun;23(2):42 –3. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-0897.1990.tb00668.x Szlosarek PW, Grimshaw MJ, Kulbe H, Wilson JL, Wilbanks GD, Burke F, et al. Expression and regulation of tumor necrosis factor α in normal and malignant ovarian epithelium. Mol Cancer Ther. 2006;5(2):382–90. Tanaka E, Sendo F, Kawagoe S, Hiroi M. Decreased natural killer cell activity in women with endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 1992;34(1):27–30. Tape TG. Interpreting diagnostic tests. http://gim.unmc.edu/dxtests/Default.htm. 2015. Tariverdian N, Siedentopf F, Rücke M, Blois SM, Klapp BF, Kentenich H, et al. Intraperitoneal immune cell status in infertile women with and without endometriosis. J Reprod Immunol. 2009;80:80–90. Tariverdian N, Theoharides TC, Blois SM, Arck PC. Neuroendocrine – immune disequilibrium and endometriosis : an interdisciplinary approach. Semin Immunopathol. 2007;193–210. Taylor P V, Maloney MD, Campbell JM, Skerrow SM, Nip MMC, Parmar R, et al. Autoreactivity in women with endometriosis. Br J Obs Gynaecol. 1991;98:680–4. Textor S, Dürst M, Jansen L, Accardi R, Tommasino M, Trunk MJ, et al. Activating NK cell receptor ligands are differentially expressed during progression to cervical cancer. Int J Cancer [Internet]. 2008 Nov 15;123(10):2343–53. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ijc.23733 Teyssier C, Belguise K, Galtier F, Chalbos D. Characterization of the Physical Interaction between Estrogen Receptor α and JUN Proteins. J Biol Chem [Internet]. 2001 Sep;276(39):36361–9. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S002192582086709X Thiruchelvam U, Wingfield M, O’Farrelly C. Natural Killer Cells: Key Players in Endometriosis. Am J Reprod Immunol. 2015;74(4):291–301. Tomassetti C, Johnson NP, Petrozza J, Abrao MS, Einarsson JI, Horne AW, et al. An International Terminology for Endometriosis, 2021. J Minim Invasive Gynecol [Internet]. 2021;28(11):1849 –59. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jmig.2021.08.032 Tosti C, Pinzauti S, Santulli P, Chapron C, Petraglia F. Pathogenetic Mechanisms of Deep Infiltrating Endometriosis. Reprod Sci [Internet]. 2015 Sep 12;22(9):1053–9. Available from: http://journals.sagepub.com/doi/10.1177/1933719115592713 Ulukus M, Cakmak H, Arici A. The Role of Endometrium in Endometriosis. J Soc Gynecol Investig. 2006;13(7):467–76. Vallvé-Juanico J, Houshdaran S, Giudice LC. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Hum Reprod Update. 2019;25(5):565–92. Vercellini P, Viganò P, Somigliana E, Fedele L. Endometriosis : pathogenesis and treatment. Nat Publ Gr [Internet]. 2013;10(5):261–75. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrendo.2013.255 Vigano P, Candiani M, Monno A, Giacomini E, Vercellini P, Somigliana E. Time to redefine endometriosis including its pro-fibrotic nature. Hum Reprod [Internet]. 2018 Mar 1;33(3):347–52. Available from: https://academic.oup.com/humrep/article/33/3/347/4675058 Viganò P, Vercellini P, Di Blasio AM, Colombo A, Candiani GB, Vignali M. Deficient antiendometrium lymphocyte-mediated cytotoxicity in patients with endometriosis. Fertil Steril [Internet]. 1991;56(5):894–9. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1936324 de Villiers WJS, Fraser IP, Gordon S. Cytokine and growth factor regulation of macrophage scavenger receptor expression and function. Immunol Lett. 1994;43(1–2):73–9. Vivier E, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G, et al. Innate Lymphoid Cells: 10 Years On. Cell [Internet]. 2018 Aug;174(5):1054–66. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867418309115 Vivier E, Tomasello E, Baratin M, Walzer T, Ugolini S. Functions of natural killer cells. Nat Immunol [Internet]. 2008 May 18;9(5):503–10. Available from: http://www.nature.com/articles/ni1582 Vivier E, Ugolini S. Regulatory Natural Killer Cells: New Players in the IL-10 Anti-Inflammatory Response. Cell Host Microbe [Internet]. 2009;6(6):493–5. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.chom.2009.12.001 Waldhauer I, Goehlsdorf D, Gieseke F, Weinschenk T, Wittenbrink M, Ludwig A, et al. Tumor -Associated MICA Is Shed by ADAM Proteases. Cancer Res [Internet]. 2008 Aug 1;68(15):6368 –76. Available from: http://cancerres.aacrjournals.org/lookup/doi/10.1158/0008-5472.CAN-07-6768 Wang F, Lau JKC, Yu J. The role of natural killer cell in gastrointestinal cancer: killer or helper. Oncogene [Internet]. 2021;40(4):717–30. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/s41388-020- 01561-z Wang H, Critchley HO, Kelly RW, Shen D, Baird DT. Progesterone receptor subtype B is differentially regulated in human endometrial stroma. Mol Hum Reprod [Internet]. 1998 Apr 1;4(4):407 –12. Available from: https://academic.oup.com/molehr/article-lookup/doi/10.1093/molehr/4.4.407 Ward C, Chilvers ER, Lawson MF, Pryde JG, Fujihara S, Farrow SN, et al. NF-kB Activation Is a Critical Regulator of Human Granulocyte Apoptosis in Vitro. J Biol Chem. 1999;274(7):4309 –18. 262 Watanabe Y, Dvorak HF. Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor Inhibits Anchorage-Disruption-Induced Apoptosis in Microvessel Endothelial Cells by Inducing Scaffold Formation. Exp Cell Res [Internet]. 1997 Jun;233(2):340–9. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0014482797935837 Weed JC, Arquembourg PC. Endometriosis: can it produce an autoimmune response resulting in infertility? Clin Obstet Gynecol [Internet]. 1980 Sep;23(3):885–93. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7418287 West WH, Cannon GB, Kay HD, Bonnard GD, Herberman RB. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol [Internet]. 1977 Jan;118(1):355–61. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/299761 White JM. ADAMs: modulators of cell–cell and cell–matrix interactions. Curr Opin Cell Biol [Internet]. 2003 Oct;15(5):598–606. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0955067403001108 Whiteside TL. Immune modulation of T-cell and NK (natural killer) cell activities by TEXs (tumour-derived exosomes). Biochem Soc Trans [Internet]. 2013 Feb 1;41(1):245–51. Available from: https://portlandpress.com/biochemsoctrans/article/41/1/245/68185/Immune-modulation-of-T-cell- and-NK-natural-killer Wilson TJ, Hertzog PJ, Angus D, Munnery L, Wood EC, Kola I. Decreased natural killer cell activity in endometriosis patients: Relationship to disease pathogenesis. Fertil Steril [Internet]. 1994;62(5):1086–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0015-0282(16)57082-4 Wingfield M, Macpherson A, Healy DL, Rogers PAW. Cell proliferation is increased in the endometrium of women with endometriosis**Presented at the 4th World Congress on Endometriosis, Salvador, Brazil, May 25 to 28, 1994. Fertil Steril [Internet]. 1995 Aug;64(2):340–6. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0015028216577334 Wu M-H, Sun HS, Lin C-C, Hsiao K-Y, Chuang P-C, Pan H-A, et al. Distinct mechanisms regulate cyclooxygenase-1 and -2 in peritoneal macrophages of women with and without endometriosis. Mol Hum Reprod [Internet]. 2002 Dec;8(12):1103–10. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12468643 Wu M, Shoji Y, Wu M. Suppression of Matrix Metalloproteinase-9 by Prostaglandin E 2 in Peritoneal Macrophage Is Associated with Severity of Endometriosis. Am J Pathol [Internet]. 2005;167(4):1061–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0002-9440(10)61195-9 Wu MY, Yang JH, Chao KH, Hwang JL, Yang YS, Ho HN. Increase in the expression of killer cell inhibitory receptors on peritoneal natural killer cells in women with endometriosis. Fertil Steril. 2000;74(6):1187–91. Xu H. Expressions of natural cytotoxicity receptor, NKG2D and NKG2D ligands in endometriosis. J Reprod Immunol [Internet]. 2019;136(February):102615. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jri.2019.102615 Yang FQ, Liu M, Yang FP, Zhang XL, Yang B, Guo CC, et al. Matrix metallopeptidase 2 ( MMP2 ) media la eliminación de MHC class I polypeptide-related sequence A ( MICA ) en el cáncer de células renales. Actas Urológicas Españolas [Internet]. 2014;38(3):172–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.acuro.2013.09.015 Yang Y-M, Yang W-X. Epithelial-to-mesenchymal transition in the development of endometriosis. Oncotarget [Internet]. 2017 Jun 20;8(25):41679–89. Available from: https://www.oncotarget.com/lookup/doi/10.18632/oncotarget.16472 Yeaman GR, Collins JE, Fanger MW, Wira CR. CD8+ T cells in human uterine endometrial lymphoid aggregates: evidence for accumulation of cells by trafficking. Immunology [Internet]. 2001 Apr;102(4):434–40. Available from: http://doi.wiley.com/10.1046/j.1365-2567.2001.01199.x Zeitoun K, Takayama K, Sasano H, Suzuki T, Moghrabi N, Andersson S, et al. Deficient 17 β- Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 2 Expression in Endometriosis: Failure to Metabolize 17β- Estradiol 1. J Clin Endocrinol Metab [Internet]. 1998 Dec;83(12):4474–80. Available from: https://academic.oup.com/jcem/article-lookup/doi/10.1210/jcem.83.12.5301 Zhang C, Zhang J, Tian Z. The regulatory effect of natural killer cells: do “NK-reg cells” exist? Cell Mol Immunol. 2006a;3(4):241–54. Zhang C, Zhang J, Tian Z. The regulatory effect of natural killer cells: do “NK-reg cells” exist? Cell Mol Immunol [Internet]. 2006b Aug;3(4):241–54. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16978532 Zhang J, Chen Z, Smith GN, Croy BA. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth? Cell Mol Immunol [Internet]. 2011 Jan 16;8(1):1–11. Available from: http://www.nature.com/articles/cmi201038 Zhao Y, Chen N, Yu Y, Zhou L, Niu C, Liu Y, et al. Prognostic value of MICA/B in cancers: a systematic review and meta-analysis. Oncotarget [Internet]. 2017 Nov 10;8(56):96384–95. Available from: https://www.oncotarget.com/lookup/doi/10.18632/oncotarget.21466 Zhou H-E, Nothnick WB. The relevancy of the matrix metalloproteinase system to the pathophysiology of endometriosis. Front Biosci [Internet]. 2005 Jan 1;10(1–3):569–75. Available from: 263 https://imrpress.com/journal/FBL/10/1/10.2741/1552 Zingoni A, Vulpis E, Cecere F, Amendola MG, Fuerst D, Saribekyan T, et al. MICA -129 Dimorphism and Soluble MICA Are Associated With the Progression of Multiple Myeloma. Front Immunol [Internet]. 2018 May 1;9. Available from: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2018.00926/full Zingoni A, Vulpis E, Loconte L, Santoni A. NKG2D Ligand Shedding in Response to Stress: Role of ADAM10. Front Immunol. 2020;11(March):1–8. Zondervan KT, Becker CM, Koga K, Missmer SA, Taylor RN, Viganò P. Endometriosis. Nat Rev Dis Prim. 2018;4(1). Zwirner NW, Dole K, Stastny P. Differential surface expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes, and monocytes. Hum Immunol [Internet]. 1999 Apr;60(4):323–30. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0198885998001281 Zwirner NW, Fuertes MB, Girart MV, Domaica CI, Rossi LE. Cytokine-driven regulation of NK cell functions in tumor immunity: Role of the MICA-NKG2D system. Cytokine Growth Factor Rev. 2007;18(1–2):159–70.