{"paper_id":"cd47dbbd-dacc-4f77-9add-2dd207fe5e12","body_text":"‘ \n \nMARIA LUCIA APARECIDA CARNEVALE MARIN \n \n \n \n \n \n \nPapel de MICA na endometriose \n \n \n \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina \nda Universidade de São Paulo \npara obtenção do título de Doutor em Ciências \n \n \n \n \nPrograma de Alergia e Imunopatologia \nOrientadora: Prof. Dra. Verônica Porto Carreiro \n de Vasconcelos Coelho \nCoorientador: Prof. Dr. Maurício Simões Abrão \n \n \n \nVersão corrigida. Resolução CoPGr6018/11, de 13 de outubro de 2011. \nA versão original está disponível na Biblioteca FMUSP. \n \n \nSão Paulo \n2022\n\n \n \nMARIA LUCIA APARECIDA CARNEVALE MARIN \n \n \n \n \n \n \nPapel de MICA na endometriose \n \n \n \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina \nda Universidade de São Paulo \npara obtenção do título de Doutor em Ciências \n \n \n \n \nPrograma de Alergia e Imunopatologia \nOrientadora: Prof. Dra. Verônica Porto Carreiro \n de Vasconcelos Coelho \nCoorientador: Prof. Dr. Maurício Simões Abrão \n \n \n \nVersão corrigida. Resolução CoPGr6018/11, de 13 de outubro de 2011. \nA versão original está disponível na Biblioteca FMUSP. \n \n \nSão Paulo \n2022\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nÀ minha mãe, uma estrela nesse nosso infinito, \nmeu maior exemplo e a minha maior inspiração. \n \nAo meu amado Carlos, pelo seu incansável apoio neste meu sonho, \ne pelo carinho, em todos os momentos da minha vida. \n \nAo meu filho Lucas, todo o meu amor. \nDesta minha caminhada, fica a fruto de que não há conquistas sem esforço, \ne que sempre há tempo para sonhar... \n\nÉ muito bom olhar para trás quando se consegue vislumbrar momentos tão felizes... \nSozinhos construímos muito pouco. Juntos, os frutos têm um sabor muito especial. \nNão é sem valor que as pessoas cruzam os nossos caminhos. Algumas por uns poucos \nmomentos, outras por um pouco mais... O que vale é a intensidade com que esses momentos são \nvividos. \nA todos, com carinho, o meu muito obrigado. \n \n A minha querida orientadora, Dra. Verônica Coelho, por sua toda dedicação ao meu \naprimoramento científico. Sempre pronta a me orientar, discutir e ensinar , sem nunca medir \nesforços. Meu muito obrigada pelo carinho e apoio em todos os momentos desta caminhada. \nSeu incentivo me fez acreditar que sim, era possível! Espero poder retribuir toda essa \nconfiança e ensinamentos adquiridos. Conte sempre comigo! \n \n Ao meu coorientador, Dr. Mauricio Abrão, pelo grande incentivo, apoio e \nconhecimentos recebidos. Foi a partir do grande projeto Temático em endometriose, por ele \nidealizado e coordenado, que eu tive a oportunidade de me juntar a sua equipe e descobrir \numa nova área de conhecimento e desenvolver este trabalho. Obrigada pela confiança! \n \n Ao Prof. Dr. Jorge Kalil, com quem tenho tido a oportunidade de trabalhar por tantos \nanos. Obrigada pelo apoio e conhecimentos recebidos, e por sempre acreditar em mim. \nEspero poder contribuir sempre mais. \n \n À Dra. Luiza Guilherme, Dr. Edécio Cunha -Neto e Dra . Keity Santos pelo in centivo, \namizade e apoio no desenvolvimento deste trabalho. \n \n À querida Marici, pela sua parceria, desde o início deste projeto científico. Obrigada por \ntodo apoio técnico e organização de dados, bem como n o auxílio na obtenção de materi al \nbiológico, essenciais para o desenvolvimento deste estudo. Obrigada pelas discussões \ncientíficas e auxílio incomparável na revisão deste texto e, principalmente, pela sua amizade, \nnunca faltando carinho e atenção. \n \n A amiga Sandra Maria, Sandroca, por toda sua orientação, auxílio nos experimentos e \ndiscussão de citometria, que foram tão essenciais para mim! Obrigada por seu incansável \napoio, por sua amizade e carinho. \n \n A Samar, sempre amiga e acolhedora. Sua amizade tem sido um privilégio para mim. \nObrigada por tudo! Poder contar com pessoas tão especiais faz com que tenhamos força para \nbuscarmos nossos objetivos e enfrentarmos as dificuldades que a vida nos apresenta. \n \n Aos amigos da equipe de endometriose, Doutores Giuliano Borrelli, Marina Andres, \nSergio Podgaec, Patrick Bellelis, Lidia Myung, Luciano Gibran, Luis Flavio Fernandes, e a \n\ntodos os demais que participaram do procedimento cirúrgico, essenciais para a obtenção de \nmaterial biológico, e desenvolvimento deste trabalho. Pela amizade e colaboração! \n \n À equipe da citometria, Janinha, Sandra e Dani, pelo apoio e discussões científicas, tão \nproveitosas, e que contribuíram para o aprimoramento deste trabalho. Obrigada \ncompanheirismo! \n \n As queridas amigas Priscila Ramos, Amanda Cabral e Bianca Natali, pelas orientações \niniciais nos experimentos de células NK e citometria de fluxo, e pelas discussões que tanto me \najudaram. Obrigada pela paciência e carinho! \n \n A querida Dra. Lea Demarchi, por todo auxílio na obtenção das imagens de \nimunohistoquímica. Obrigada pelo apoio e atenção! \n \n A amiga Marta Privato, pela organização e apoio administrativo durante todo o \ndesenvolvimento do Projeto Temático Endometriose, fundamentais para o andamento deste \nestudo. Pela amizade e incentivo! \n \n À Dra. Mari Sogayar pela disponibilização de reagentes/células, e à Dra. Ana Claudia \nCarreira pelo estabelecimento da linhagem celular e discussões científicas. Obrigada pelo \napoio. \n \n À Dra. Karina Carvalho pela disponibilização do protocolo de atividade NK, e à Dra. \nAna Eduarda Carvalho, ambas pela padronização inicial deste protocolo. \n \n A Cadiele Reichert e Debora Levy pelo auxílio na análise estatística da curva ROC. \nMuito obrigada pelo apoio e disponibilidade! \n \n A todos os meus amigos do laboratório de Imunologia, Selminha, Déia, Elaine, \nWashington, Simone, Rafael, Raquel, Edil, Soninha, Jair, à toda equipe do HLA, em especial a \nClodô, Helcio e Carlos Sergio, à toda equipe da Alergia e OXI, ao querido amigo Leo da imuno, \nàs amigas Fê Alegria, Karen e Ruth, à Karlinha, Giu, Luri e a todos os demai s alunos, bem \ncomo a tantos outros amigos que certamente falhei em citar... A todos, o meu muito obrigada \npelo companheirismo, apoio e alegrias que me proporcionam. Cada um, da sua forma, \ncolaborou para o meu crescimento nesta caminhada. \n \n A querida Eleni, secretária da pós -graduação, pela paciência e apoio que nunca \nfaltaram! Obrigada por toda ajuda! \n \n Obrigada, minha pequena grande Raizinha, onde quer que você esteja! Pelo seu \nexemplo de alegria e perseverança. \n \n A todas as mulheres participantes deste e studo, que mesmo em seus momentos mais \ndifíceis e de incerteza, acreditaram que a ciência poderia trazer respostas à compreensão da \nsua doença. Meus sinceros agradecimentos. \n\n A minha família... \n A minha mãe , agradeço a vida e todo amor . Seu exemplo de det erminação e os \nensinamentos que deixou, foram o maior incentivo na busca deste sonho... \n \n Ao meu pai querido, que, dentro de suas dificuldades, nunca mediu esforços para \nminha formação. Obrigada pelo seu carinho e apoio. \n \n Aos meus queridos irmãos, Franci sco Cesar, Rogerio e Ricardo, pelo carinho e \nincentivo, e pelas alegrias que me fortaleceram nesta caminhada. Desculpem pelos momentos \nde ausência...É tão bom ter vocês ao meu lado! \n \n As minhas cunhadas Ana e Rode, pelo apoio e amizade de irmãs, e aos meus \nsobrinhos, Marina, Rafael, Maira e Enzo, pelo carinho e alegrias! \n \n Ao meu sogro, Sr. Danilo, pelo incentivo e carinho de um pai. \n \nAos meus tesouros... \n A você, Cá, meu companheiro de vida , obrigada por todo apoio e carinho que recebi. \nVocê é parte da m inha conquista, pois sei que o meu sonho passou a ser o nosso sonho. \nObrigada por tudo, sempre e sempre! \n \n Ao meu amado filho Lucas, pelo incentivo e carinho nesta etapa de minha vida. Ter \nvocê ao meu lado me fez mais forte. Tenho certeza de que aprendemos muito nesta \ncaminhada.... \n \n A Deus, que guiou meus caminhos e me deu saúde e forças para chegar até aqui. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n“A ciência se compõe de erros que, \npor sua vez, são os passos até \na verdade.” \nJulio Verne \n \n \n \n \n“O tempo muito me ensinou: \nEnsinou a amar a vida, \nNão desistir de lutar, \nRenascer na derrota, \nRenunciar às palavras \ne pensamentos negativos, \nAcreditar nos valores humanos, \ne a ser otimista. \nAprendi que mais vale \ntentar do que recuar... \nAntes acreditar \ndo que duvidar, \nQue o que vale na vida, \nNão é o ponto de partida \ne sim a nossa caminhada.” \n \nCora Coralina \n \n \n \n \n“Se a gente ri, a gente resiste. \nA alegria é a força que se extrai da vida.” \nGermano Coelho \n \n\nSUMÁRIO \n \nLista de siglas, símbolos e abreviaturas \nLista de figuras \nLista de tabelas \n \n1. INTRODUÇÃO……………………………………………………………………....................2 \n1.1 Endometriose…................................................................................................................2 \n1.1.1 Definição e classificação...................................................................................................2 \n1.1.2 Patogênese, fisiologia e progressão da endometriose.....................................................4 \n1.2 Fisiologia do ciclo menstrual e imunobiologia da endometriose.......................................6 \n1.2.1 Fisiologia do ciclo menstrual.............................................................................................6 \n1.2.2 Imunobiologia da endometriose......................................................................................11 \n1.3 Células Natural Killer na endometriose...........................................................................18 \n1.4 MICA - Major Histocompatibility Class I Chain-related A……………………...................29 \n \n2. OBJETIVOS...................................................................................................................35 \n2.1 Objetivo geral ................................ ................................ ................................ .. .............35 \n2.2 Objetivos específicos ................................ ................................ ...................... .............35 \n \n3. MÉTODOS……………………………………………………………………….....................37 \n3.1 Participantes da pesquisa ..............................................................................................37 \n3.2 Casuística....................................................................................................................... 37 \n3.3 Dados clínicos e critérios de seleção..............................................................................38 \n3.4 Material biológico ...........................................................................................................39 \n3.5 Delineamento do estudo.................................................................................................40 \n3.6 PCR quantitativa em tempo real: expressão gênica de MICA........................................41 \n3.6.1 Extração de RNA total.....................................................................................................41 \n3.6.2 Tratamento com DNAse e análise da qualidade do RNA total.......................................42 \n3.6.3 Síntese de cDNA............................................................................................................43 \n3.6.4 Seleção de primers.........................................................................................................43 \n3.6.5 Reações de qRT-PCR....................................................................................................44 \n3.7 Imunohistoquímica: expressão proteica de MICA..........................................................45 \n3.7.1 Avaliação da expressão proteica de MICA.....................................................................46 \n3.8 ELISA para pesquisa de MICA solúvel...........................................................................47 \n3.9 Atividade efetora de células NK......................................................................................48 \n3.9.1 Análise quantitativa das subpopulações de células NK e expressão do receptor \n NKG2D e das citocinas IFN-γ e IL-10, na condição ex vivo ..........................................51 \n3.9.2 Análise da atividade efetora de células NK frente a estímulo com células K562...........54 \n3.9.2.1 Cultivo de células K562 e bloqueio da proteína MICA na superfície celular.............. 55 \n3.9.2.2 Análise da expressão de MICA em células K562 pré e pós o bloqueio de MICA.......56 \n3.9.2.3 Frequência e intensidade de expressão de moléculas CD107a. IFN-γ e IL-10, nas \n subpopulações de células NK......................................................................................57 \n3.10 Avaliação da atividade citotóxica de células NK.............................................................60 \n3.10.1 Marcação das células K562 com CFSE..........................................................................61 \n3.10.2 Cocultura de PBMC:K562 (E:A) e marcação para morte celular....................................62 \n3.11 Análise estatística...........................................................................................................63 \n \n\n4. RESULTADOS ................................ ................................ ............................... .............66 \n4.1 Expressão gênica de MICA ...........................................................................................67 \n4.2 Expressão proteica de MICA..........................................................................................68 \n4.2.1 Expressão proteica de MICA no epitélio glandular e estroma........................................68 \n4.2.2 Expressão proteica de MICA em relação à fase do ciclo menstrual...............................73 \n4.2.3 Expressão proteica de MICA em relação aos estádios da endometriose.......................76 \n4.2.4 Expressão proteica de MICA na profunda de retossigmóide e retrocervical..................76 \n4.3 Pesquisa de MICA solúvel..............................................................................................77 \n4.3.1 Níveis de sMICA no soro e fluido peritoneal em mulheres com endometriose e \n controles.........................................................................................................................78 \n4.3.2 Níveis de sMICA nos diferentes estádios da endometriose...........................................79 \n4.3.3 Níveis de sMICA nas diferentes fases do ciclo menstrual..............................................81 \n4.3.4 Níveis de sMICA em relação aos tipos de endometriose...............................................83 \n4.3.5 Níveis de sMICA e expressão gênica de MICA..............................................................85 \n4.3.6 Análise de correlação entre os níveis de sMICA e a expressão de MICA in situ...........86 \n4.3.7 Pesquisa de nível de sMICA como potencial parâmetro preditivo para a \n endometriose..................................................................................................................87 \n4.4 Células NK e subpopulações: análises quantitativas e funcionais.................................87 \n4.4.1 Análise quantitativa das subpopulações de células NK e expressão de NKG2D, \n IFN-γ e IL10....................................................................................................................88 \n4.4.1.1 Subpopulações NK: na condição ex vivo.....................................................................88 \n4.4.1.2 Expressão de NKG2D em subpopulações NK: na condição ex vivo...........................91 \n4.4.1.3 Expressão de moléculas IFN-γ e IL-10: na condição ex vivo......................................94 \n4.4.2 Expressão de moléculas CD107a, IFN-γ e IL-10 frente a estímulo com células \n K562................................................................................................................................96 \n4.4.2.1 CD107a, IFN-γ e IL-10: na condição estado basal da cultura, sem estímulo..............96 \n4.4.2.2 Moléculas de atividade NK: na condição com estímulo com células K562...............105 \n4.4.2.3 Na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA.....................113 \n4.4.3 Expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e relação \n com níveis de MICA solúvel..........................................................................................120 \n4.4.3.1 Moléculas vs MICA solúvel: na condição basal de cultura.........................................120 \n4.4.3.2 Moléculas vs MICA solúvel: na condição de estímulo com células K562..................121 \n4.4.3.3 Moléculas vs MICA solúvel: na condição de estímulo com células K562 \n bloqueadas para MICA..............................................................................................123 \n4.4.4 Expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e relação \n com estádios da endometriose.....................................................................................127 \n4.4.4.1 Moléculas vs estádios: na condição basal de cultura.................................................127 \n4.4.4.2 Moléculas vs estádios: na condição de estímulo com células K562..........................131 \n4.4.4.3 Expressão de moléculas vs estádios: na condição com estímulo com células \n K562 bloqueadas para MICA.....................................................................................134 \n4.4.5 Expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10 e relação com às fases do \n ciclo menstrual..............................................................................................................141 \n4.4.5.1 Expressão das moléculas e fases do ciclo: condição basal de cultura......................141 \n4.4.5.2 Expressão das moléculas e fases do ciclo: estímulo com células K562....................142 \n4.4.5.3 Expressão das moléculas e fase do ciclo: estímulo com células K562 bloqueadas \n para MICA...................................................................................................................144 \n4.4.6 Citotoxicidade pelas células NK....................................................................................149 \n4.4.6.1 Citotoxicidade contra células K562 sem bloqueio e com bloqueio para MICA...........149 \n4.4.6.2 Citotoxicidade e relação com os estádios da endometriose...................................... 151 \n4.4.6.3 Citotoxicidade e análise de correlação com níveis de MICA solúvel..........................153 \n\n4.4.6.4 Citotoxicidade e relação com as fases do ciclo menstrual..........................................153 \n4.4.6.5 Análise de correlação entre citotoxicidade induzida pelas células NK e a \n expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10...................................................157 \n \n5. DISCUSSÃO.................................................................................................................161 \n6. CONCLUSÕES.............................................................................................................186 \n7. ANEXOS.......................................................................................................................189 \n8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 249 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nLISTA DE SIGLAS, SIMBOLOS E ABREVIATURAS \n \nADAM A Disintegrin and Metalloproteinase, desintegrina e metaloproteinase \nADCC Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, citotoxicidade celular dependente de \n anticorpo \nAR Ácido Retinóico \nASRM American Society for Reproductive Medicine, Sociedade Americana de Medicina \n Reprodutiva \nAUC Area Under Curve, área sob a curva \nAc (s) Anticorpo (s) \nbp base pairs, pares de bases \nCAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa \ncDNA complementary DNA, DNA complementar \nCOX 2 Cyclooxygenase (COX)-2, cicloxigenase 2 \nCt Threshold Cicle, ciclo de limiar \nCTR Grupo Controle \nCFSE Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester, éster succinimidílico da \n carboxifluoresceína \nCCND1 Cyclin D1, ciclina D1 \nDC Dendritic Cells, células dendríticas \nDEPC Dietilpirocarbonato \nDNA Deoxyribonucleic Acid, ácido desoxirribonucleico \nDNI Doença Ginecológica Não Inflamatória \ndNTP deoxynucleoside triphosphate, desoxirribonucleotídeo trifosfatado \nDO Densidade Óptica \nDP Desvio Padrão \nEDT Endometriose \nEf Eficiência de amplificação \nEIR Escore de Imunorreatividade \nELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ensaio de imunoabsorção enzimática \nERP5 Endopasmic Reticulum Protein 5, proteína 5 do retículo endoplasmático \nFAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo \nFc Região do Fragmento cristalizável \nFcγRIIIA Receptor IIIa para a porção Fc da imunoglobulina G, IgG \nFMO Fluorescence Minus One, fluorescência menos um \nFOXP3 Forkhead box P3, fator de transcrição nuclear P3 \nFP Fluido Peritoneal \nFSC Forward Scatter, dispersão frontal de luz \nFSH Follicle-Stimulating Hormone, hormônio folículo estimulante \n\nGPER1 G protein-coupled estrogen receptor 1, receptor 1 de estrogênio acoplado à \n proteína G \nGM-CSF Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor, fator estimulador de \n colônias de granulócitos e macrófagos \nGREB1 Growth Regulating Estrogen Receptor Binding 1, fator de ligação 1 do receptor \n de estrogênio regulador do crescimento \nGnRH Gonadotropin-Releasing Hormone, hormônio liberador de gonadotrofina \nHCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo \nHLA Human Leukocyte Antigen, antígeno leucocitário humano \nIFN-γ Interferon-gama \nIL Interleucina \nKIR Killer Imunoglobulin like Receptor \nLAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1, ou CD107a \nLAQ Mulheres controles provenientes de laparoscopia para laqueadura tubária \nM Molar \nMASP1 Mannose-Associated Serine Protease 1, serina-protease 1associada à manose. \nMCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein 1, proteína quimiotática de monócitos-1 \nmed Mediana \nMFI Median Fluorescence Intensity, mediana de intensidade de fluorescência \nmg Miligrama \nMHC Major Histocompatibility Complex, complexo principal de histocompatibilidade \nMICA Major Histocompatibility Class I Chain-related A \nMIF Macrophage migration Inhibitory Fator, fator inibidor da migração de macrófago \nmin Minuto(s) \nmL Mililitro(s) \nmM Milimolar \nMMP Matrix Metalloproteinase Protein, proteína metaloproteinase de matriz \nmRNA messenger Ribonucleic Acid, ácido ribonucleico (RNA) mensageiro \nNK Natural killer, célula matadora natural \nNF-κB Nuclear Factor-kappa B, fator nuclear kappa B \nNKG2D Natural Killer- group 2, member D, membro D do grupo 2 de receptores de \n células natural killer \nNKreg Célula Natural Killer reguladora \nns não significante \nON Over-nigth, por uma noite \nOVA Endometriose Ovariana \nPASS programa estatístico Power Analysis Sample Size \nPBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell, células mononucleares do sangue periférico \nPBS Phosphate Buffered Saline, tampão fosfato-salino \n\nPCR Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase \npg Picograma (s) \nPROF (Prof.) Endometriose Profunda \nPROL Fase Proliferativa do ciclo menstrual \nqRT-PCR quantitative Real Time PCR, PCR quantitativo em tempo real \nq.s.p. Quantidade suficiente para \nRANTES Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Secreted, regulada sob \n ativação, expressa e secretada por células T normais \nrASRM Revised American Society for Reproductive Medicine, 1996 \nRC Retrocervical \nRE Receptor de Estrogênio \nRIN RNA Integrity Number, pontuação de integridade para o RNA \nRNA Ribonucleic Acid, ácido ribonucleico \nROC Receiver Operating Characteristic Curve \nRP Receptor de Progesterona \nRS Retossigmóide \nR10 Roswell Park Memorial Institute, RPMI, meio de cultura celular adicionado de \n 10% de soro fetal bovino \nSECRET Fase Secretora do ciclo menstrual \nsMICA MICA solúvel \nSSC Side Scatter, dispersão lateral de luz \nSUP Endometriose Superficial \nTA Temperatura Ambiente \nTCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido \nTGF-β Transforming Growth Fator Beta, fator de transformação do crescimento beta \nTh T helper cell, linfócito T auxiliar \nTNF-α Tumor Necrosis Factor Alpha, fator de necrose tumoral alfa \nTRAIL TNF- Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand, ligante indutor \n de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral \nuNK Células NK uterinas \nVEGF-A Vascular Endothelial Growth Factor A, fator de crescimento vascular endotelial A \nVEGFR-2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2, receptor 2 do fator de \n crescimento vascular endotelial \nvs abreviatura de versus, do latim, em comparação com \nºC Grau Celsius \n% porcentagem \n \n \n\n \nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1 Representação esquemática das principais funções das células NK, no \n contexto de células saudáveis e tumorais/estressadas......................................22 \n \nFigura 2 Principais receptores inibidores e ativadores nas células NK, e seus ligantes \n em célula alvo.....................................................................................................23 \n \nFigura 3 Ativação de vias relacionadas ao receptor NKG2D............................................25 \n \nFigura 4 Mecanismos básicos de ação das células NK....................................................26 \n \nFigura 5 Papel duplo de MICA como molécula alvo para imunovigilância por células \n NK e como mediadora do escape imunológico de tumor/células \n estressadas.........................................................................................................30 \n \nFigura 6 Desenho do estudo.............................................................................................41 \n \nFigura 7 Esquema resumido do protocolo para avaliação da atividade efetora de \n células NK, baseado na degranulação da molécula CD107a, expressão \n das citocinas IFN- e IL-10 e na sua atividade citotóxica....................................50 \n \nFigura 8 Estratégia de análise para determinação das subpopulações de células \n NK circulantes e subpopulações NK com expressão de NKG2D, de \n mulheres com endometriose e controles............................................................54 \n \nFigura 9 Estratégia de análise para expressão de MICA em células K562......................57 \n \nFigura 10 Estratégia de análise para determinação das subpopulações de células NK \n circulantes, com expressão de CD107a, IFN-γ e IL-10, em mulheres com \n endometriose e controles....................................................................................60 \n \nFigura 11 Estratégia de análise para determinação da atividade citotóxica de células \n NK contra células K562...................................................................................... 63 \n \nFigura 12 Expressão de mRNA de MICA no endométrio eutópico de mulheres com \n endometriose e de controles...............................................................................67 \n \nFigura 13 Expressão do gene MICA no endométrio eutópico de mulheres com \n endometriose e de controles, nas fases proliferativa e secretora do ciclo \n menstrual.............................................................................................................68 \n \nFigura 14 Escore de imunorreatividade para expressão proteica de MICA em glândula \n (epitélio) e estroma, e representação da expressão em endométrio \n eutópico...............................................................................................................69 \n \nFigure 15 Exemplos representativos de expressão da proteína MICA, por \n imunohistoquímica, em lesão de retossigmóide e em endométrio eutópico \n de mulheres com endometriose e de controles..................................................71 \n \nFigura 16 Comparação dos escores de imunorreatividade (EIR) de expressão de \n MICA na lesão profunda, endométrio eutópico de mulheres dos grupos \n endometriose e controle..................................................................................... 72 \n \nFigura 17 Porcentagem de casos positivos com baixa ou alta expressão proteica de \n MICA no epitélio glandular, de acordo com os escores de imunorreatividade \n (EIR)................................................................................................................... 73 \n\n \nFigura 18 Escores de imunorreatividade de expressão proteica de MICA no epitélio \n glandular e estroma na lesão profunda e endométrio eutópico de mulheres \n do grupo endometriose e no endométrio eutópico de mulheres do \n grupo controle, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual...............74 \n \nFigura 19 Comparação da expressão de MICA entre as fases proliferativa e secretora \n do ciclo menstrual, na lesão de endometriose profunda e nos endométrios \n eutópicos de mulheres com endometriose e de controles................................. 75 \n \nFigura 20 Escore de imunorreatividade para a expressão da proteína MICA na lesão \n profunda e no endométrio eutópico de mulheres com EDT em estádios \n iniciais e avançados da endometriose, e no endométrio eutópico do grupo \n CTR.................................................................................................................... 76 \n \nFigura 21 Escore de imunorreatividade para a expressão da proteína MICA em lesões \n profundas de endometriose retossigmóide e retrocervical..................................77 \n \nFigura 22 Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL) no soro e fluido peritoneal (FP) de \n mulheres com endometriose (EDT) e controles (CTR).......................................78 \n \nFigura 23 Análise de correlação entre os níveis de sMICA no soro e no fluído peritoneal \n (FP), em mulheres com endometriose (EDT) e controles (CTR)........................79 \n \nFigura 24 Distribuição dos níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de \n mulheres com endometriose e de controles.......................................................79 \n \nFigura 25 Comparação dos níveis MICA solúvel entre mulheres em estádios iniciais \n (I/II) e avançados (III/IV) da endometriose e controles, no soro e no fluido \n peritoneal.............................................................................................................80 \n \nFigura 26 Níveis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com \n endometriose em diferentes estádios da endometriose e em controles.............81 \n \nFigura 27 Distribuição dos níveis de MICA solúvel, no soro e fluido peritoneal (FP) de \n mulheres com endometriose e de controles, nas diferentes fases do ciclo \n menstrual.............................................................................................................82 \n \nFigura 28 Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL), no soro e no fluido peritoneal, de \n mulheres com endometriose e de controles saudáveis, nas fases proliferativa \n e secretora do ciclo menstrual............................................................................82 \n \nFigura 29 Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL) no soro e no FP de mulheres \n com endometriose de acordo com o local de acometimento da doença, e \n no grupo controle................................................................................................84 \n \nFigura 30 Análises de correlação entre os valores de 1/∆Ct para mRNA de MICA no \n endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de controles, e os \n níveis de MICA solúvel........................................................................................85 \n \nFigura 31 Análise de correlação entre os níveis de sMICA, no soro e no fluido \n peritoneal, e a expressão proteica in situ de MICA em epitélio glandular..........86 \n \nFigura 32 Porcentagem das subpopulações de células NK circulantes de mulheres com \n endometriose e de controles, na condição ex vivo.............................................89 \n \nFigura 33 Comparação entre a frequência de células NK totais (A) e das \n subpopulações CD56dim (B) e CD56dimCD16+ (C) entre estádios iniciais \n\n (I/II) da endometriose e controles....................................................................... 90 \n \nFigura 34 Porcentagem (%) de células com expressão de NKG2D nas subpopulações \n NK circulantes em mulheres com endometriose e controles saudáveis, \n na condição ex vivo.............................................................................................92 \n \nFigura 35 Análise da frequência de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou \n IL-10, entre as subpopulações de células NK, nos grupos EDT e CTRs, no \n estado basal de cultura (sem estímulo) .............................................................99 \n \nFigura 36 Comparação da frequência de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou \n IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com \n endometriose e controles, na condição basal, sem estímulo............................101 \n \nFigura 37 Análise de correlação entre a porcentagem de células com expressão de \n moléculas de atividade efetora de células NK, na subpopulação CD56dim \n circulante, de mulheres com endometriose, na condição basal de cultura, \n sem estímulo.....................................................................................................104 \n \nFigura 38 Alterações significativas ocorridas após o estímulo com K562 (Est. K562), \n em relação à condição sem estímulo, em mulheres com endometriose \n e controles.........................................................................................................108 \n \nFigura 39 Comparação da intensidade de expressão de moléculas envolvidas na \n atividade efetora de células NK na subpopulação CD56bright circulantes, entre \n mulheres com endometriose e controles, na condição após estímulo com \n células K562..................................................................................................... 109 \n \nFigura 40 Análise de correlação entre as frequências de células positivas, e entre \n as intensidades de expressão de moléculas de atividade efetora de células \n NK, em subpopulações de células NK circulantes, de mulheres do grupo \n controle, na condição após estímulo com K562............................................... 111 \n \nFigura 41 Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas e \n expressão de moléculas de atividade efetora de células NK, em \n subpopulações de células NK circulantes, com níveis de MICA solúvel de \n mulheres com endometriose e controles, na condição basal de cultura, \n sem estímulo.................................................................................................... 121 \n \nFigura 42 Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas para a \n expressão de IFN-y em subpopulações de células NK circulantes, com \n níveis de MICA solúvel no fluido peritoneal de mulheres com endometriose \n e de controles, na condição com estímulo com células K562.......................... 123 \n \nFigura 43 Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas para a \n expressão CD107a em subpopulações de células NK circulantes, com \n níveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e de controles, \n na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA........... 125 \n \nFigura 44 Comparação da porcentagem (%) de expressão das moléculas CD107a, \n IFN-y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre \n mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, \n na condição basal de cultura, sem estímulo.................................................... 129 \n \nFigura 45 Comparação da porcentagem de expressão das moléculas CD107a, \n IFN-y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre \n mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, \n na condição com estímulo com células K562.................................................. 132 \n\n \nFigura 46 Comparação da porcentagem (%) de expressão das moléculas CD107a, \n IFN-y ou IL-10, nas subpopulações de células NK circulantes, entre \n mulheres em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, \n na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para \n molécula MICA..................................................................................................136 \n \nFigura 47 Frequência de expressão (%) de IFN-y em subpopulações de células \n NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas \n diferentes fases do ciclo menstrual, na condição basal de cultura, sem \n estímulo.............................................................................................................142 \n \nFigura 48 Frequência da porcentagem (%) de expressão das moléculas IFN-y e \n IL-10 em subpopulações de células NK circulantes, de mulheres com \n endometriose e de controles, nas diferentes fases do ciclo menstrual, \n na condição de estímulo com células K562..................................................... 143 \n \nFigura 49 Comparação da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y \n ou IL-10 em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres \n com endometriose e controles, nas diferentes fases do ciclo menstrual, \n na condição com estímulo com células K562...................................................144 \n \nFigura 50 Porcentagem (%) de células com expressão de CD107a e IL-10 e \n intensidade de expressão de IL-10, em subpopulações de células NK \n circulantes, em mulheres com endometriose e em controles, em diferentes \n fases do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562 \n bloqueadas para MICA..................................................................................... 145 \n \nFigura 51 Intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 em \n subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose \n e controles, em diferentes fases do ciclo menstrual, na condição com \n estímulo com células K562 bloqueadas para MICA......................................... 147 \n \nFigura 52 Comparações da citotoxicidade (CTX) pelas células NK circulantes entre \n mulheres com endometriose e controles...........................................................150 \n \nFigura 53. Citotoxicidade pelas células NK circulantes de mulheres com endometriose \n e de controles, contra células K562 e K562 bloqueadas para MICA................151 \n \nFigura 54. Citotoxicidade pelas células NK circulantes frente a células K562 e \n células K562 bloqueadas para MICA, nos diferentes estádios da \n endometriose.................................................................................................... 151 \n \nFigura 55. Citotoxicidade pelas células NK circulantes de mulheres em estádios \n iniciais e avançados da endometriose e de controles.......................................152 \n \nFigura 56. Porcentagem (%) de morte de células K562 e células K562 após o bloqueio \n da proteína MICA, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, \n em mulheres com endometriose e controles....................................................154 \n \nFigura 57. Comparações da frequência de morte de células K562 com e sem bloqueio \n da proteína MICA, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, \n entre os grupos de mulheres com endometriose e controles...........................155 \n \nFigura 58. Comparações da frequência de morte de células K562, e de células \n K562BLOQ, entre as diferentes fases do ciclo, no grupo de mulheres com \n endometriose e controles................................................................................. 156 \n \n\n \nLISTA DE TABELAS \n \nTabela 1 Características clínicas e demográficas das mulheres com endometriose \n e controles...........................................................................................................66 \n \nTabela 2 Escore de imunorreatividade para epitélio glandular e estroma da expressão \n da proteína MICA, na lesão profunda de endometriose e no endométrio \n eutópico de mulheres com endometriose e controles........................................ 70 \n \nTabela 3 Níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres com \n endometriose e de controles...............................................................................78 \n \nTabela 4 Distribuição das lesões de endometriose segundo os tipos e estádios da \n endometriose.......................................................................................................83 \n \nTabela 5 Medianas das frequências de subpopulações de células NK circulantes de \n mulheres com endometriose e de controles, na condição ex vivo......................90 \n \nTabela 6 Comparação da frequência de células com expressão do receptor NKG2D, \n e intensidade de expressão, em subpopulações de células NK circulantes, \n entre mulheres com endometriose e controles, na condição ex vivo..................93 \n \nTabela 7 Análise de correlação da frequência, e da intensidade de expressão, de \n NKG2D nas subpopulações de células NK, com os níveis de MICA solúvel, \n no grupo de mulheres com endometriose e controles........................................94 \n \nTabela 8 Porcentagem de células com expressão de IFN-y ou IL-10, e intensidades \n de expressão, em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres \n com endometriose e controles saudáveis, na condição ex vivo.........................95 \n \nTabela 9 Análise da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou \n IL-10, nas subpopulações de células NK, entre grupos EDT e CTRs, na \n condição basal de cultura, sem estímulo..........................................................100 \n \nTabela 10 Análise de correlação entre as frequências de células com expressão \n das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e entre as intensidades de \n expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres \n com endometriose e controles, na condição basal de cultura, sem \n estímulo.............................................................................................................103 \n \nTabela 11 Comparação das frequências de células com expressão das moléculas \n CD107a, IFN-y ou IL-10 e das intensidades de expressão, nas \n subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose \n (A) e controles (B), entre as condições sem estímulo e após estímulo \n com células K562..............................................................................................106 \n \nTabela 12 Comparação entre as frequências de células com expressão das \n moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e entre as intensidades de expressão, \n nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com \n endometriose e controles, na condição após estímulo com células K562....... 110 \n \nTabela 13 Análise de correlação entre as frequências de células com expressão \n das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e entre as intensidades de \n expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres \n com endometriose (A) e controles (B), na condição após estímulo com \n células K562......................................................................................................112 \n \n\nTabela 14 Comparação das frequências de células com expressão das moléculas \n CD107a, IFN-y ou IL-10, e das intensidades de expressão, nas \n subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com \n endometriose (A) e controles (B), entre as condições após estímulo K562, \n e após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA............................. 114 \n \nTabela 15 Comparação entre as frequências de células com expressão das moléculas \n CD107a, IFN-y ou IL-10 e entre as sus intensidades de expressão, nas \n subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com \n endometriose e controles, na condição de estímulo com K562 bloqueadas \n para a proteína MICA........................................................................................117 \n \nTabela 16 Análise de correlação entre as frequências de células com expressão \n das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e entre suas intensidades de \n expressão, nas subpopulações de células NK circulantes de mulheres \n com endometriose (A) e controles (B), na condição após estímulo com \n células K562 bloqueadas para MICA............................................................... 119 \n \nTabela 17 Balanço dos principais resultados da correlação entre a expressão de \n moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e níveis de MICA \n solúvel...............................................................................................................126 \n \nTabela 18 Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y \n ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres \n em estádios iniciais e avançados da endometriose e entre controles, \n na condição basal de cultura, sem estímulo.................................................... 130 \n \nTabela 19 Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y \n ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres \n em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na \n condição estímulo com células K562............................................................... 133 \n \nTabela 20 Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y \n ou IL-10 nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres \n em estádios iniciais e avançados da endometriose e controles, na \n condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA.....................137 \n \nTabela 21 Balanço dos principais resultados da expressão das moléculas envolvidas \n na atividade efetora de células NK e sua relação com estádios de \n endometriose.....................................................................................................138 \n \nTabela 22 Balanço das principais diferenças das frequências de células com \n expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e suas intensidades \n de expressão, entre os grupos endometriose e controles, e relação com a \n fase do ciclo menstrual..................................................................................... 148 \n \nTabela 23 Análise de correlação entre a citotoxicidade contra células K562 e K562 \n bloqueadas para MICA, com a frequência ou intensidade de expressão das \n moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, em mulheres do grupo controle...............158 \n \nTabela 24 Análise de correlação entre a citotoxicidade contra células K562 e K562 \n bloqueadas para MICA, com a frequência ou intensidade de expressão das \n moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, em mulheres com endometriose..............159 \n \n \n \n \n \n\nRESUMO \n \nMarin MLAC. Papel de MICA na endometriose [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, \nUniversidade de São Paulo; 2022. \n \n \nA endometriose (EDT) é uma doença caracterizada pela presença de epitélio semelhante ao \nendométrio e/ou estroma , fora do endométrio e miométrio, com alterações imunológicas que \nincluem a redução da atividade citotóxica de células NK e TCD8+. MICA ( Major \nHistocompatibility Complex class I Chain-related A) é uma molécula, principalmente, induzida \npor estresse biológico, e sua forma solúvel (sMICA) modula, negativamente, a expressão do \nseu receptor NKG2D , em células NK e TCD8+αβT, reduzindo a resposta citotóxica. \nInvestigamos o papel de MICA na fisiopatologia da EDT, analis ando diversos parâmetros \nbiológicos, e considerando seus estádios e sítios de acometimento, assim como a potencial \nparticipação de MIC A solúvel (sMICA) na deficiência da atividade efetora de células NK. A \nexpressão gênica de MICA (qRT-PCR) no endométrio eutópico (EDT, n=29; CTR, n= 23) não \nmostrou diferença entre os grupos ( p >0,05). No entanto, a sua expressão proteica \n(imunohistoquímica) mostrou maior frequência de “alta” expressão no epitélio glandular do \nendométrio eutópico na EDT, em relação ao CTR ( p= 0,0134), sugerindo haver alterações \nimunológicas em células endometriais, envolvendo MICA, previamente à sua migração e \ninstalação ec tópica, sugerindo, assim, seu papel na resposta inflamatória e como fonte de \nsMICA. Os níveis de sMICA (ELISA) foram maiores no grupo EDT (n=161; soro, p= 0,0004; \nFP, p< 0,0001), tanto nos estádios iniciais (soro, p= 0,0114; FP, p= 0,00 52) como nos \navançados da doença (soro, p= 0,0001; FP, p< 0,0001), em relação aos CTRs (n=76), também \nassociados à doença profunda (PROF) (soro, p= 0,003; FP , p= 0,0004) e PROF + ovariana \n(OVA) (soro, p< 0,0001; FP, p< 0,0001), em relação aos CTRs. Esses resultados sugerem o \nenvolvimento de sMICA na fisiopatologia da endometriose, na sua progressão e/ou gravidade. \nA menor frequência da subpopulação citotóxica CD56 dimCD16+ (p= 0,0456) (citometria de \nfluxo), na EDT, pode contribuir para a deficiência de citotoxicidade observada na doença. Por \noutro lado, a maior intensidade de expressão do receptor ativador, NKG2D, em NK (p= 0,0402) \n(citometria de fluxo), na EDT, e particularmente, na subpopulação CD56 brightCD16+ (p= 0,033) \nnos estádios iniciais, indica maior potencial de ativação das células NK na EDT, e nos estádios \niniciais da doença. Observamos deficiência de citotoxicidade pelas células NK, na EDT ( p= \n0,0144) (cocultura e citometria de fluxo) , principalmente em estádios avançados ( p= 0,0115), \nem concordância com a literatura. A citotoxicidade pelas células NK, na presença de estímulo \ncom células alvo bloqueadas para MICA (mimetiz ando o efeito de sMICA), foi menor apenas \nem estádios iniciais, na comparação ao estímulo sem bloqueio ( p= 0,0313), e menor também \nem relação ao grupo CTR (p= 0,0181). Esses dados, juntamente com a correlação negativa \nentre os níveis de sMICA e a expressão de NKG2D nas células NK (CD56 brightCD16+, r= -0,6, \np= 0,0167), sugerem que os altos níveis de sMICA podem inibir a expressão de NKG2D e, \nconsequentemente, a função efetora das células NK, principalmente nos estádios iniciais da \ndoença, quando detectamos maior expressão de NKG2D nas células NK. A maior expressão \nde IFN -γ na EDT (cocultura e citometria de fluxo) , na condição basal, sem estímulo, é \nconcordante com a condição inflamatória da doença, em curso. No entanto, na condição de \nestímulo, houve menor expressão de CD107a (CD56 dim, p= 0,0308), IFN-γ (CD56 bright, p= \n0,001) e IL-10 (CD56 bright, p= 0,0222) (cocultura e citometria de fluxo) , na EDT, indicando \ndeficiência nas respostas efetora e imunorreguladora de células NK, quando desafiadas. O \nbloqueio para MICA , in vitro, não alterou a expressão dessas moléculas, nas células NK, em \nnenhum dos grupos, sugerindo que sMICA não afeta, de forma robusta, a expressão dessas \n\nmoléculas (cocultura e citometria de fluxo) , ao menos no contexto in vitro . No entanto, a \ncorrelação negativa entre os níveis de sMICA e a expressão de CD107a (CD56bright, r= -0,7, p= \n0,0057), observada apenas na EDT, sugere que, in vivo, sMICA tenha um efeito negativo na \nvia de degranulação, possivelmente, em combinação com outros distúrbios imunoló gicos na \ndoença. Em conjunto, os nossos resultados apoiam o envolvimento MICA na fisiopatologia da \nEDT, e de sMICA contribuindo para a deficiência da atividade citotóxica das células NK. MICA \npode exercer papeis tanto pró -inflamatório como imunorregulador, contribuindo para \ngeração/manutenção de um contexto biológico misto, de inflamação descontrolada e \nimunossupressão, prejudicando a eliminação adequada de tecidos endometriais ectópicos e \nno reestabelecimento da homeostase. \n \n \nDescritores: Endometriose; MI CA; NKG2D; Células NK; Citotoxicidade NK; CD107 a; \nInterferon-gama; IL-10. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \nABSTRACT \n \nMarin MLAC. Role of MICA in Endometriosis [thesis]. São Paulo: “Faculty of Medicine, \nUniversity of São Paulo”; 2022 \n \nEndometriosis (EDT ) is a disease characterized by the presence of endometrium -like \nepithelium and/or stroma outside the endometrium and myometrium, usually with an associated \ninflammatory process , presenting immunological alterations including Natural Killer (NK) and \nTCD8+ cell deficient cytotoxic activity. MICA (MHC, Major Histocompatibility Complex class I \nChain-related A) molecule is mainly induced by biological stress, and its soluble form (sMICA) \nnegatively modulates the expression of NKG2D receptor, on NK e TCD8+αβT cells, reducing \ntheir cytotoxic activity. We investigated the role of MICA in the pathophysiology of EDT, \nanalyzing several biological parameters, and considering disease stages and sites of \ninvolvement, as well as the potential participation of sMICA in the deficiency of NK cells effector \nactivity. MICA gene expression (qRT-PCR) in eutopic endometrium (EDT, n=29; CTR, n=23) \nshowed no difference between groups ( p> 0.05). However, MICA protein expression \n(immunohistochemistry) showed a higher frequency of “high” expression in eutopic endometrial \nglandular epithelium in EDT, in relation to CTRs ( p= 0.0134), suggesting immunological \nalterations in endometrial cells, involving MICA, before their ectopic migration and installation. \nThis suggests that MICA’s u pregulation has role in the inflammatory response, as well as a \nsource of sMICA. Soluble MICA levels (ELISA) were higher in EDT (n=161; serum, p= 0.0004; \nFP, p< 0.0001), both in the initial (serum, p= 0.0114; FP, p= 0. 0052) and advanced stages of \nthe disease (serum, p=0.0001; FP, p< 0.0001), in relation to CTRs (n=76), and also associated \nwith deep (DE) (serum, p= 0.003; FP, p= 0.0004) and DE + ovarian disease (OMA), (serum, p< \n0.0001; FP, p< 0.0001), in relation to CTRs. These results point out sMICA’s in volvement in \nendometriosis pathophysiology, disease severity and progression. The lower frequency of the \nCD56dimCD16+ cytotoxic subpopulation (p= 0.0456) (flow cytometry), in EDT, may contribute to \nthe cytotoxicity deficiency observed in the disease. On other hand, the higher expression of the \nactivator receptor, NKG2D, on NK cells in EDT ( p= 0.0402) (flow cytometry) and particularly in \nthe early stages of EDT for the CD56brightCD16+ subset (p= 0.033), indicates a greater potential \nfor NK cell activation in EDT, and in the early stage of the disease. We also observed NK cell \ncytotoxicity deficiency in EDT ( p= 0.0144) (coculture and flow cytometry) , mainly in the \nadvanced stages (p= 0.0115), in agreement with the literature. NK cell cytotoxicity, induced by \nstimulus with target cells blocked for MICA (mimicking the effect of soluble MICA), was lower \nonly in early stages ( p= 0.0313), and also lower in relation to the CTR group (p= 0.0181). \nThese data, together with the negative correlation between sMICA levels and NKG2D \nexpression on NK cells (CD56 brightCD16+, r= -0.6, p= 0.0167), suggest that high levels of \nsMICA may inhibit the expression of NKG2D and, consequently, NK cells’ effector function, \nespecially in the early stages of the disease, when greater expres sion of NKG2D in NK cells is \ndetected. The higher expression of IFN -γ in the basal condition in EDT (coculture and flow \ncytometry), is consistent with the ongoing inflammatory process of the disease. However, when \nstimulated in vitro NK cells in EDT showed lower expression of CD107a (CD56 dim, p= 0.0308), \nIFN-γ (CD56bright, p= 0.001) and IL-10 (CD56bright, p= 0.0222) (coculture and flow cytometry) , \nindicating NK cell functional deficiency in both effector and immunoregulatory responses, upon \nchallenge. Blocking MICA, in vitro, did not alter the expression of these molecules (coculture \n\nand flow cytometry) , in NK cells in any of the groups, suggesting that sMICA has no robust \neffect on the expression of these molecules, at least in vitro . Nevertheless, the negative \ncorrelation between sMICA levels and CD107a expression (CD56 bright, r= -0.7, p= 0.0057), \nobserved only in EDT, suggests that, in vivo , sMICA may have a negative effect on the \ndegranulation pathway, possibly in synergy with other immunological dysfunctions in the \ndisease. Taken together, our results support the involvement of MICA in the pathophysiology of \nEDT, and that sMICA contributes to the impairment of NK cell cytotoxic activity. MICA can play \nboth, pro-inflammatory and immunoregulatory roles, contributing to the generation/maintenance \nof a mixed biological settin g, of uncontrolled inflammation and immunosuppression, impairing \nthe adequate elimination of ectopic endometrial tissues and reestablishment of homeostasis. \n \nKeywords: Endometriosis; MICA; soluble MICA; NKG2D; NK cells; NK cytotoxicity; CD107a, \nInterferon-gamma; IL-10. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n_______________________________________________INTRODUÇÃO \n \n \n \n\n 2 \n \n1. INTRODUÇÃO \n \n \n1.1 Endometriose \n \n1.1.1 Definição e classificação \n \n A endometriose (EDT) é uma doença inflamatória caracterizada pela presença de \nepitélio, e/ou estroma, similar ao endométrio, fora do endométrio e miométrio (Tomassetti et \nal. 2021) sendo, frequentemente, acompanhada de fibrose e aderências (Zondervan et a l., \n2018). \n A prevalência exata da doença não é bem estabelecida, no entanto, estima -se que \nafete de 10 a 15% das mulheres em idade fértil (Giudice, 2010) Tem como sintomas \ncaracterísticos: dor pélvica grave (durante e após o ato sexual - dispareunia de profundidade; \ndismenorreia, e/ou dor acíclica), alterações intestinais (tenesmo, disquezia e hematoquezia) e \nurinárias cíclicas (disúria e hem atúria), além de associação com infertilidade (Berkley et al., \n2005). Assim sendo, a EDT pode, de forma significante, impactar a saúde e a qualidade de \nvida de mulheres afetadas pela doença (Giudice e Kao 2004). \n O diagnóstico da doença é realizado, inicialmente, por meio da sintomatologia e \nhistória clínica da paciente, em associação ao exame físico ginecológico (Borreli, 2015a). \nExames de imagem, como ultrassonografia transvag inal com preparo intestinal, ressonância \nnuclear magnética, ecoendoscopia e ultrassom transretal são considerados exames de \nauxílio ao diagnóstico (Abrao et al., 2007). No entanto, o diagnóstico definitivo é obtido por \nmeio de exame histológico da lesão suspeita (Abrão et al., 2000) obtida, na sua maior parte, \npor meio de cirurgia laparoscópica (Borreli 2015a). \n A EDT já teve várias formas de classificação baseadas em diferentes abordagens e \ncritérios (Chapron et al., 2003; Hassa et al., 2009). Muito recentemente, foi definida uma nova \nclassificação para a EDT, pela Associação Americana de Laparoscopistas Ginecológicos \n(AAGL) (Abrao et al. 2021) , com o objetivo de melhor pontuar os níveis de complexidade \ncirúrgica intra -operatória e examinar sua associaçã o com a dor relatada pela paciente e a \nocorrência de infertilidade. \n No nosso estudo, foi utilizada a classificação proposta pela Sociedade Americana de \nMedicina Reprodutiva e revisada em 1996 (Revised American Society for Reproductive \nMedicine, rASRM, 1996) (Canis et al. 1997) que, até então, vinha sendo a classificação mais \namplamente utilizada. Trata-se de uma classificação cirúrgica que utiliza como base a \nextensão da doença durante o procedimento cirúrgico, baseando-se no tamanho da lesão, \nlocalização dos implantes de tecido endometrial e extensão das adesões. Segundo um \nsistema de pontuação, ela divide a EDT em diferentes estádios: I (1 -5 pontos), II (6 -15 \npontos), III (16 -40 pontos) e IV (> 40 pontos) (Apresentado no Item 7, Anexos; Anexos III e \n\n 3 \n \nIV). Segundo tal classificação, o estádio I é considerado como EDT mínima, estádio II, leve, \nestádio III, moderada e estádio IV, como EDT grave. Desta forma, em relação à gravidade da \ndoença, podemos considerar I e II como os estádios mais leves, e os estádios III e IV, como \nos mais graves da doença. \n É importante salientar que, embora a classificação rASRM seja amplamente utilizada \ne aceita mundialmente, é consenso entr e especialistas que ela apresenta limitações (Andres \net al. 2018) . Tal sistema de classificação não leva em consideração a presença da doença \nprofunda em diferentes locais, como liga mentos uterossacros, bexiga, vagina e o intestino, \nbem como não descreve, adequadamente, os locais de acometimento da doença (Andres et \nal. 2018) , tendo sido , portanto, como acima ci tado, recentemente atualizada (Abrao et al., \n2021). \n Além da classificação cirúrgica da EDT, há também uma classificação segundo a \nlocalização e profundidade das lesões. São definidos 3 fenótipos: EDT: superficial (SUP), \nEDT ovariana ( OVA; endometrioma) e EDT do septo retovaginal, esta, mais recentement e \ncaracterizada como EDT profunda (PROF) (Kamergorodsky et al., 2009). A doença superficial \né caracterizada por lesões peritoneais, geralmente no peritônio pélvico; a ovariana pode \napresentar-se com implantes superficiais no ovário ou cistos com conteúd o achocolatado, \nderivado de repetidas hemorragias do foco endometriótico no cisto, durante a menstruação. A \ndoença PROF representa 20% dos casos de endometriose (Chapron et al. , 1999) e é \nconsiderada a forma mais agressiva da doença (Abrão et al. , 2015), com sintomas mais \ngraves qu ando comparada à EDT superficial, incluindo dismenorreia grave e infertilidade \n(Abrão et al ., 2015). Caracteriza -se por lesões com infiltração com profundidade igual ou \nsuperior a 5mm em estruturas anatômicas ou órgãos como, por exemplo, ligamentos \nuterossacros, ureteres, bexiga, região retrocervical, retossigmóide, íleo terminal e apêndice \ncecal (Cornillie et al., 1990). Porém, dentre os diferentes locais e apresentações da doença \nPROF, o acometimento retovaginal e retossigmóide é considerado dos mais incapacitantes \n(Borreli 2015) , sendo associado à perda da qualidade de vida de mulhe res acometidas \n(Dubernard et al., 2006). É importante salientar que, apesar de descritos 3 fenótipos clínicos \npara a endometriose, em muitos casos, eles podem coexistir em uma mesma paciente, sendo \nconsiderada uma doença multifocal (Eres et al., 2018). \n Além das classificações já apresentadas, a EDT é também classificada, \nhistologicamente, em dois tipos: EDT estromal (presença de estroma morfologicamente \nsimilar ao do endométrio eutópico em qualquer fase do ciclo menstrual) e EDT gl andular \n(presença de epitélio co m sinais de hemorragia prévia com hemossiderófagos e fibrose) \n(Abrao et al., 2003). É importante salientar que recentes avanços na ca racterização da \ndoença têm sugerido uma modificação na atual definição histológica (ainda não \nestabelecida), incluindo a fibrose como um componente da lesão endometrial, de forma a \nreconsiderar a definição histológica, previamente definida, como “uma condição fibrótica na \nqual o estroma e o epitélio endometrial podem ser identificados” (Vigano et al., 2018). \n\n 4 \n \n \n1.1.2 Patogênese, fisiopatologia e progressão da endometriose \n \n Desde os primeiros achados de tecido de implantes do endométrio em ovário (Russel, \n1899), diversas hipóteses têm sido propostas para a patogênese e progressão da EDT. Tais \nhipóteses não são excludentes e podem contribuir de forma complementar, para a \ncompreensão da patogênese e da fisiopatologia da endometriose. \n A hipótese mais aceita para a origem de células endometriais em localização ectópica \né, possivelmente, a frequente ocorrência da menstruação retrógrada (Sampson 1927b). Na \nmenstruação retrógrada, o tecido endometrial reflui pelas tubas de Falópio até a cavidade \nperitoneal, facilitando a sua implantação e desenvolvimento no peritônio e/ou órgãos pélvicos. \nA detecção de detritos mens truais na cavidade peritoneal durante a menstruação, em \ncondição fisiológica, é uma evidência de que tecido endometrial acessa, f isiologicamente, \nsítios fora do útero (Liu e Hitchcock, 1986). Além disso, dados epidemiológicos mostram \nhaver um risco aumentado da doença qu ando há maior \"exposição\" à menstruação, seja por \naumento do sangramento menstrual, ciclo mais curto, duração e maior número de \nmenstruações (Missmer et al., 2004), obstrução d o fluxo uterino (Barbieri 1998) e \nanormalidades fisiológicas na contratilidade uterina (Salamanca e Beltran, 1995), indicando \nserem relevantes também, a quantidade e o tempo de exposição de restos menstruais que \npodem acessar sítios anatômicos fora do útero. \n Assim sendo, além da menstruação retrógrada, existem dados que apontam a \npossibilidade de outros mecanismos envolvidos na origem das células endometriais \nectópicas, como as seguintes condições e hipóteses: 1) metaplasia celômica : células \nmesoteliais do p eritônio se diferenciariam em tecido endometrial, possivelmente, \ninfluenciadas por estímulos hormonais, infecciosos ou ambientais; 2) ativação de restos \nembriogênicos: uma diferenciação aberrante ou migração de dutos Müllerianos poderia levar \nao “espalhame nto” de células durante a organogênese; 3) disseminação metastática \n(hematogênica ou linfática) : células endometriais viáveis sairiam do endométrio pela \ncirculação sanguínea ou linfática, de maneira similar à metástase tumoral, favorecendo a \nocorrência de endometriose longe do útero, onde se implantariam form ando lesões \nendometrióticas (Sampson, 1927a). A disseminação linfática poderia, pelo menos em parte, \nexplicar a presença de tecido endometrial em vasos linfáticos e linfonodos (Aoki, 1967; \nBorrelli et al., 2015), bem como as raras ocorrências de endometriose em pulmões (Hobbs e \nBortnick, 1940) e f ígado (Liu et al., 2015); 4) células tronco : células tronco \nextrauterinas/progenitoras originadas da medula óssea (como linhagens mesenquimais) \npoderiam se diferenciar, ect opicamente, em tecido endometrial . No entanto, essas outras \npossibilidades de origens da ocorrência de tecido endometrial fora do útero, parecem ser \nmenos frequentes. \n\n 5 \n \n Embora a menstruação retrógrada explique o deslocamento físico do tecido \nendometrial para fora do útero, deve -se considerar que esse é um processo fisiológico muito \ncomum, ocorrendo em até 90% das mulheres que menstruam. No entanto, uma vez que a \nprevalência de endometriose varia em torno de 10%, este fator, isoladamente, não explica a \nocorrência de EDT, e outros fatores devem contribuir facilit ando o implante e \ndesenvolvimento do tecido endometrial (lesões) fora da do útero (Burney e Giudice, 2012). \n Após a ocorrência ectópica de células endometriais, vários fatores podem contribuir \npara a formação das lesões endometrióticas. Dentre eles, podemos cita r a fixação e \npenetração na superfície peritoneal (na menstruação retrógrada como origem), proliferação \ncelular, invasão, angiogênese, neurogênese e inflamação, fatores esses, possivelmente, \nenvolvidos no desencadeamento da dor (Zondervan et al., 2018). Variações gênicas, como \npolimorfismos nos genes WNT4 (do inglês, Wnt Famil y Member 4 ) e GREB1(do inglês, \nGrowth Regulating Estrogen Receptor Binding 1 (revisado em Borghese et al., 2017) bem \ncomo variações epigenéticas, como metilação anormal em fatores de transição (GATA6 e \nSF1 -do inglês, Steroidogenic Factor 1) e no gene E RB2 (do inglês, Encoding Estrogen \nReceptor 2 , que codifica o receptor ER β, do inglês, Estrogen Receptor Beta), também \nparecem contribuir para a etiologia da doença (revisado em Borghese et al., 2017). \nDestacamos que a hipometilação no gene ERB2, na EDT, gera uma falha na repressão da \nexpressão do receptor ERβ, que passa a ser superexpresso no endométrio ectópico, em \nrelação ao eutópico, de mulheres com EDT (Monsivais et al., 2014). Ademais, a lterações \nmetabólicas, como o aumento do metabolismo de vitamina A, e consequente diminuição, \nparece s er relevante para a etiologia da endometriose. O ácido retinóico (AR), metabólito \nfisiológico ativo da vitamina A (retinol), controla diversos processos biológicos, como \ndiferenciação, apoptose e sobrevivência celular, via sinalização por receptores nucleares em \ncélulas alvo (RARs, do inglês, retinoic acid receptor) (revisado em Jiang et al., 2018). Sua via \nde ativação está envolvida na proliferação de epitélios e a transformação de células \nestromais endometriais em células deciduais especializadas. Portanto, a sinalização \ndeficiente em ácido retinóico pode impl icar em aumento da proliferação e invasão celular, \nbem como limitar a apoptose celular de células endometriais ectópicas. Além disso, \nestrogênio (via receptor β), descrito como aumentado em tecido endometrial ectópico (Bulun, \n2009), também pode suprimir a catalisação da conversão de retinaldeído em AR, via \nsupressão da enzima ALDH1A1 (do inglês, Aldehyde Dehydrogenases), catalisadora da \nconversão de retinaldeído em AR (Deng et al., 2003). Ademais, e de maneira relevante, \ntambém o microambiente da lesão interage e regula tais fatores biológicos por meio uma \nvariedade de fatores hormonais e celulares (revisado em Zondervan et al., 2018), a serem \ndiscutidos adiante. \n Considerando que o sistema imune é, fisiologicamente, capaz de detectar e eliminar \ntecidos em desenvolvimento em locais “anormais ”, é relevante explorar o seu papel no \ncontexto da endometriose. Nesse sentido, vários estudos indicam que mulheres com EDT \n\n 6 \n \napresentam diversas disfunções imunológicas, contribuindo de forma relevante para a \neliminação ineficiente do endométrio ectópico e favorecendo a sua implantação. Assim, a \ncondição imunológica da mulher com EDT é fundamental no desenvolvimento e na \nprogressão da doença (Giudice e Kao, 2004). \n \n \n1.2 Fisiologia do ciclo menstrual e imunobiologia da endometriose \n \n Durante cada período menstrual, as células somáticas, presentes na região funcional \ndo endométrio, começam a sofrer apoptose, uma resposta biológica que reduz a chance \ndessas células sobreviverem e crescerem ectopicamente, dentro da cavidade peritoneal \n(Herington et al., 2011). Neste contexto, vamos destacar, inicialmente, a fisiologia normal do \nciclo menstrual, de forma a facilitar o entendimento da imunobiologia da endometriose. \n \n \n1.2.1 Fisiologia do ciclo menstrual \n \n Estruturalmente, o endométrio humano é composto pelas camadas basal e funcional, \nesta, eliminada durante a menstruação e regenerada, na ausência de gravidez (revisado em \n(Vallvé-Juanico et al., 2019). É composto ainda de dois compartime ntos teciduais: epitélio e \nestroma. O epitélio endometrial tem a função de promover a implantação do embrião e \ntambém tem papel na defesa contra a infecção (Kelly et al., 2001). O estroma consiste, \nprincipalmente, de fibroblastos, alguns mac rófagos e células T, mas poucas células B e \ncélulas NK (Kelly et al., 2001). As glândulas tubulares, revestidas por epitélio, vão desde a \nsuperfície endometrial até a base do estroma (revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). \n O ciclo menstrual, embora contínuo, inicia -se no primeiro dia de menstruação e \ntermina no último dia, antes da próxima menstruação. Tem duração média de 28 dias, \npodendo variar de 25 a, aproximadamente, 32 dias (Silberstein e Merriam, 2000).O \nfuncionamento ovariano fisiológico envolve atividades coordenadas do hipotálamo, hipófise e \novários. O hipotálamo secreta o hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH , do inglês, \nGonadotropin-Releasing Hormone); a hipófise, secreta o hormônio luteinizante (LH , do inglês, \nLuteinizing Hormone ) e hormônio folículo estimulante (FSH , do inglês, Follicle-stimulating \nHormone); o ovário, secreta estrogênio e progesterona, inibinas, ativinas, e outros \nmoduladores ovarianos. Complementar a esse processo, o endométrio uterino responde aos \nhormônios estrogênio e progesterona, com produção de prostagl andinas (Silberstein e \nMerriam, 2000). A morfologia do endométrio, sua proliferação, diferenciação de seus \ncomponentes celulares bem como a presença de células imunes, variam ao longo do ciclo \nsob a influência, principalmente, de estrogênio e progesterona (revisado em Vallvé-Juanico et \nal., 2019). \n\n 7 \n \n O ciclo menstrual pode ser dividido em duas fases, a fase folicular ou proliferativa, e a \nfase lútea ou secretora. A fase proliferativa inicia -se no primeiro dia da menstruação e segue \naté a ovulação, geralmente no 14º dia. Portanto, consider ando-se um ciclo médio de 28 dias, \ncompreende de 1-14o dia do ciclo. A fase secretora compreende os 14 dias restantes do ciclo \n(15-28o dia) (revisado em Reed e Carr, 2000). \n Durante o ciclo menstrual, os hormônios esteróides ovarianos, estr ogênio e \nprogesterona, regulam a função endometrial e a menstruação (Maybin e Critchley, 2015). O \nendométrio menstrual apresenta características clássicas de inflamação, como edema de \ntecido e influxo de células do sistema imune, sendo considerado um processo fisiológico e \nrigidamente regulado (Critchley et al., 2001). Tanto o ovário como o endométrio apresentam \num processo de inflamação fisiológica repetido, durante a ovulação e a menstruação, \nrespectivamente, ao longo da vida reprodutiva da mulher (Rae e Hillier, 2005). \n Células como m acrófagos, neutrófilos e células NK participam da proteção \nimunológica da mucosa uterina e estão envolvidas no remodelamento endometrial \n(Salamonsen et al., 2002), decidu alização e implantação embrionária e, na ausência de \ngravidez, facilitam o processo de menstruação (Salamonsen e Lathbury, 2000). A maior parte \ndas células imunes, no endométrio, são tecido residentes, mas parte pode migrar da \ncirculação periférica (Lee et al., 2015). Elas estão espalhadas po r todo estroma e também \nentre as células epiteliais, na camada funcional. \n Na fase proliferativa do ciclo, as células T são a maior parte dos leucócitos, seguidas \npor células NK e macrófagos (Lee et al., 2015). Na camada basal do endométrio, são \nformados agregados linfóides compostos por células B e circundadas por células TCD8+ \ncitotóxicas, as quais são também circundadas por macrófagos (Yeaman et a l., 2001). Os \nmacrófagos compreendem, aproximadamente, 1 -2% das células do endométrio e, em torno \nde 10% do total de células imunes endometriais, na fase proliferativa do ciclo (Salamonsen et \nal., 2002). Essa fre quência é alterada durante as fases do ciclo, sugerindo haver uma \nregulação por estrogênio e progesterona (Berbic et al., 2009). As células NK uterinas (uNK) \ncompreendem cerca de 30-40% (Manaster e Mandelboim, 2008) de leucócitos totais, na fase \nproliferativa do ciclo. \n Durante a fase proliferativa, o hormônio FSH estimula o ovário a produzir o estrogênio, \nno entanto, a reparação e regeneração do tecido endometrial, pós menstruação, é \nindependente desse hormôni o ( revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). Entretanto, \nposteriormente, du rante toda a fase proliferativa, o estrogênio induz a mitose de todos os \nconstituintes celulares, incluindo epitélio luminal e gl andular, fibroblastos estromais e \ncomponentes vasculares ( revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). O estrogênio estimula a \nexpressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF, do inglês, Vascular Endothelial \nGrowth Factor ) no endométrio uterino (Cullinan-Bove e Koos, 1993), com consequente \naumento da sua vascularização. C élulas do sistema imune, como células TCD4, TCD8, \nlinfócitos B, células NK, monócitos e DCs (do inglês, Dendritic Cells) plasmocitóides, \n\n 8 \n \napresentam receptores de estrogênio e podem ter suas funções moduladas por esse \nhormônio (Kovats, 2015). \n Foi demonstrado que o estrogênio modula a expressão de citocinas e quimiocinas por \nDCs derivadas de monócitos humanos (revisado em Hafner et al., 2013). Por conseguinte, o \nestrogênio aumenta a produção de interleucina (IL) -12 por DCs, que atua em células Th1, \ndesencadeando a produção de IFN -γ por essas células, caracteriz ando, portanto, o \nenvolvimento do estrogênio na ativação de respostas imunes adaptativas (revisado em \nHafner et al., 2013). Também as células Treg estão aumentadas, no endométrio, na presença \nde estrogênio, durante a fase proliferativa do ciclo, diminuindo durante a fase secretora \n(Arruvito et al., 2007), possivelmente via interação do receptor α de estrogênio (ERα , do \ninglês, Estrogen Receptor α ) e o promotor do fator de transcrição de FOXP3 (do inglês, \nForkhead Box P3) (Adurthi et al., 2017). Este aumento de Treg, antes da ovulação, sugere \nseu envolvimento na preparação adequada do endométrio à implantação de embriões. Atuam \ninibindo a atividade citotóxica de células do sistema imune, bem como a atividade efetora de \noutros tipos de células, por meio da secr eção de citocinas imunossupressoras, como IL-10 e \nTGF-β (do inglês, Transforming Growth Fator Beta) (Arruvito et al., 2007), mantendo um \nambiente com característica, provavelmente, de imunotolerância (Sakaguchi et al., 2010). \n Após a perda da camada funcional do endométrio, na menstruação, no início da fase \nproliferativa do ciclo, níveis crescentes de estrogênio participam do reparo e crescimento do \nendométrio a partir da ca mada basal (Osteen et al., 2003), bem como do aumento da \nexpressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) (do inglês, Matrix Metalloproteinase \nProtein). Alguns estudos indicam que a ativação da transcrição do gene MMP ocorra, \nprincipalmente via ligação do receptor de estrogênio com a proteína ativadora -1 (AP -1, do \ninglês, Activator Protein 1) (Teyssier et al., 2001). \n De forma coordenada com o remodelamento endometrial, numerosas MMPs são \nexpressas em áreas de crescimento ativo do endométrio, durante toda a fase proliferativa \n(Rodgers et al., 1994). MMP-7 é expressa em células epi teliais, enquanto as células do \nestroma expressam mRNAs para MMP-1, MMP-2 e MMP-11, e baixa expressão para MMP-3 \n(Rodgers et al., 1994). A proteína MMP -9, mas não mRNA, foi identificada em células \nepiteliais e em associação com células imunes residentes (Skinner et al., 1999). Também os \nTIMPs (do inglês, Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, inibidores teciduais de \nmetaloproteinases) são geralmente co -expressos com MMPs, modul ando o controle da \nreparação tecidual (Osteen et al., 2003). \n Em recente trabalho (Crona et al., 2021), a análise do perfil de citocinas no plasma de \nsangue menstrual de mulheres saudáveis indicou a presença de altas conce ntrações de IL-6, \nIL-1β e IL-8 (ou CXCL8, C-X-C Motif Chemokine Ligand 8), na comparação com o perfil de \ncitocinas no sangue periférico, pareado, dessas mulheres. No entanto, os níveis de IL -2, IL-\n12p70, XCL1/linfotactina e IFN -γ foram menores do que os ní veis periféricos. Estes dados \nindicam haver um padrão distinto de citocinas no sangue menstrual em relação do sangue \n\n 9 \n \nperiférico. Neste mesmo estudo, também observaram que as citocinas analisadas no plasma \nsanguíneo menstrual não tiveram diferença entre as fases do ciclo menstrual. \n Uma vez atingindo altos níveis de estrogênio, ocorre a inibição da secreção de FSH \npela hipófise. A diminuição do FSH e o aumento do estrogênio estimulam a hipófise a \nsecretar o hormônio LH, que induz a ovulação (Maybin e Critchley, 2015). Após a ovulação, o \ncorpo lúteo passa a secretar altos níveis de progesterona contribuindo na manutenção da \nreceptividade endometrial, em caso de fertilização. Durante a fase secretora (pós -ovulação, e \naté a menstruação), a progesterona atua sobre o endométrio previamente estimulado com \nestrogênio, lev ando à sua decidualização. A decidualização é caracterizada pela \ntransformação das células endometriais estromais em células deciduais secretoras (Gellersen \net al., 2007). Alteração e/ou quebra neste processo de diferenciação do endométrio estão \nassociadas a uma série de distúrb ios como endometriose e adenomiose, sendo também \nimportante causa de infertilidade e distúrbios menstruais (Brosens, 1998). \n As respostas celulares à progesterona são, predominantemente, mediadas pelo \nreceptor de progesterona (RP), um membro da superfamília de fatores de transcrição \ninduzíveis de ligante (Parker, 1993). Na ausência de ligação com progesterona, o RP é \nmantido num complexo inativo contendo proteínas de choque térmico HSP90 (Pratt 1990) e \nHSP70 (Estes et al., 1987). O RP te m, pelo menos, duas isoformas, RPA e RPB, presentes \ndurante a fase proliferativa do ciclo, tanto em glândula, como no estroma endometrial, \nocorrendo um declínio significativo nas c élulas epiteliais gl andulares na fase secretora do \nciclo. Por outro lado, os RP persistem no estroma endometrial da camada funcional ao longo \nda fase secretora, com predomínio da isoforma A (Wang et al., 1998). Assim, as células \nestromais do endométrio permanecem responsivas à progesterona durante toda a fase \nsecretora. \n Em relação a expressão proteica do RP em células do sistema imune, embora a \nprogesterona tenha efeitos funcionais em células como linfócitos, monócitos, macrófagos e \ncélulas dendríticas, o seu mecanismo de ação (ou seja, proteínas alvo) não está claramente \ndefinido, com alguns estudos sugerindo a expressão do receptor (Butts et al., 2007; \nSzekeres-Bartho et al., 1990), e outros não (Mansour et al., 1994). \n Em contraste com a fase proliferativa do ciclo, na fase secretora tardia, as células uNK \n(CD56brightCD16-) estão em maior frequência, compreendendo, aproximadamente 70 -80% do \ntotal de leucócitos. Os macrófagos atingem cerca de 30% e as células T diminuem para \nmenos de 10% (Flynn et al., 2000) dos leucócitos endometriais. \n Células dendríticas imaturas (iDC, CD1a +CD209+HLADRlow) estão descritas em \nnúmero aumentado na camada basal, nas fases secretora e menstrual (Marbaix, 2005). No \nentanto, em relação às DCs maduras (mDC, CD83 high/HLA-DRhigh), há um estudo indicando \nausência de alteração de frequência ao longo do ciclo (Marbaix 2005) e outro com um \naumento na camada basal do endométrio, nas fases secretora e menstrual do ciclo menstrual \n(King et al., 1996). \n\n 10 \n \n O aumento de iDC durante a fase secretora/menstrual sugere um papel dessas \ncélulas na menstruação (Marbaix, 2005). Nesse sentido, as iDCs produzem MMPs que são \nimportantes neste processo (Marbaix, 2005). Além disso, iDCs também produzem citocinas e \nquimiocinas, como IL -6, IL -10, IL -12, TNFα, RANTES (do inglês, Regulated on Activation \nNormal T-cell Expressed e Secreted ) e MCP-1, que poderiam promover a menstruação ou \nfacilitar a nidação do embrião e regular outras populações celulares (Schulke et al., 2008). \n Em relação às ci tocinas na fase secretora do ciclo, embora no estudo em sangue \nmenstrual acima descrito (Crona Guterstam et al., 2021), não tenha sido observada diferença \nnos seus níveis de expressão, entre as diferentes fases do ciclo menstrual, a análise de \nexpressão gênica em sangue per iférico mostrou que a expressão IFN -γ está diminuída na \nfase secretora/lútea, comparada com a fase proliferativa/folicular (Dosiou et al., 2004). \n Ao final da fase secretora, e na ausência de gravidez, o corpo lúteo regride, caus ando \num relevante declínio nos níveis de progesterona circulantes (Maybin e Critchley, 2015). Esse \ncontexto fisiológico gera uma resposta inflamatória local no endométrio, envolvendo \ninfiltração de leucócitos, liberação de citocinas, edema e ativação de metaloproteinases de \nmatriz (Jabbour et al., 2006), resultando na perda da camada funcional do endométrio (cerca \nde dois terços superiores), correspondendo ao período menstrual do ciclo. Várias células do \nsistema imune participam do processo de fisiológico da menstruação, algumas com \nimportante função na eliminação de restos menstruais (“ clearence uterino”) (Berbic e Fraser, \n2013). \n Após a queda da progesterona, há um aumento significativo da população de \nleucócitos endometriais (Salamonsen e Lathbury, 2000), compreendendo de 6 -15% do \nnúmero total de células no endométrio (Salamonsen e Lathbury, 2000). Já volt ando à fase \nproliferativa, no período menstrual, as c élulas dendríticas (imaturas e maduras) e outras \ncélulas apresentadoras de antígenos (APCs , o inglês Antigen-Presenting C ell) estão \nenvolvidas no processo de “limpeza”, particip ando da captura e apresentação antígenos \nendometriais e ativ ando células T, facilit ando a eliminação de restos endometriais (Berbic e \nFraser, 2013). Os neutrófilos, princip ais mediadores da resposta inflamatória, respondem à \ninflamação local, migr ando, rapidamente, para o endométrio “inflamado”, onde podem \nsobreviver por vários dias, devido à diminuição de sua atividade apoptótica, induzida por \nmediadores pró-inflamatórios e hipóxia (Ward et al., 1999). Há um aumento do número de \nmacrófagos dando-se início ao processo de a poptose de células endometriais e à fagocitose \nde restos celulares eliminados durante a menstruação (Berbic et al., 2009). \n Embora a queda da progesterona tenha um importante papel no início da \nmenstruação, a sua diminuição também promove o aumento da expressão de MMPs, por \ncélulas epiteliais estroma is e neutrófilos (Salamonsen e Woolley, 1999). Os neutrófilos \ncontêm altos níveis de MMPs e têm a capacidade de ativar MMPs residentes, contribuindo \npara a ruptura endometrial (Gaide Chevronnay et al., 2012). As MMPs funcionam como \n\n 11 \n \nmediadores da “ruptura” do endométrio , uma vez que degradam os componentes da matriz \nextracelular (Marbaix et al., 1996). \n Durante a menstruação, as células presentes na região funcional do endométrio e as \nque compõem o material de menstruação retrógrada, começam a sofrer apoptose (Herington \net al., 2011). Estes restos celulares, presentes na cavidade peritoneal, sã o, posteriormente, \neliminados por células do sistema imune, como macrófagos, células NK (do inglês, natural \nkiller) e células T citotóxicas, sem que ocorra um processo inflamatório significante e \nduradouro ( Dmowski et al., 2001). Alguns estudos mostram a existência de uma atividade \ncitotóxica fisiológica mediada por células NK contra células endometriais autólogas \n(Oosterlynck et al., 1991; Viganò et al., 1991; Hirata et al., 1994). As células NK agiriam como \num \"sistema de limpeza peritoneal\" ( clearence) envolvido na eliminação eficaz de células \nendometriais ectópicas, evitando assim, sua implantação e crescimento ( revisado em Hafner \net al., 2013). A ação dessas células é finamente regulada, negativamente, favorecendo a \nresposta imune específica contra células refluídas, e não contra o tecido peritoneal normal. \nAlterações nesses processos biológicos da fisiologia da menstruação podem levar a \ndistúrbios ginecológicos e também integram a fisiopatologia da endometriose. \n \n \n1.2.2. Imunobiologia da endometriose \n \n A endometriose é um processo patogênico que envolve múltiplas desregulações \nimunológicas, bem como desregulações de interações imuno-endócrinas. \n Primeiramente podemos citar que o próprio endométrio eutópico de mulheres com \nEDT apresenta características diferentes qu ando comparado ao endométrio de mulheres \nsaudáveis. Tais características englobam diversos aspectos, incluindo disfunções \nimunológicas, endócrinas e bioquímicas, bem como alterações genéticas que, de forma \ncombinada, desempenham um papel importante na patogên ese e fisiopatologia da \nendometriose (revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). \n O endométrio eutópico de mulheres com EDT apresenta um aumento da expressão \ndo gene anti-apoptótico BCL-2 (do inglês, B-celllymphoma 2) (Jones et al., 1998), diminuindo \na capacida de apoptótica de células endometriais deliberadas durante a menstruação, \nindicando um aumento da viabilidade dessas células, facilit ando sua sobrevivência e \nimplantação ectópica (Dmowski et al., 2001). A apoptose espontânea está dim inuída em \nglândulas endometriais de mulheres com EDT, especialmente durante a fase secretora \ntardia/menstrual e na fase proliferativa precoce (Dmowski et al., 2001). De fato, as células \nendometriais de mulheres com EDT apresentam maior capacidade de implantação (Kyama et \nal., 2008), angiogênese (Donnez et al., 1998) e proliferação (Wingfield et al., 1995; Bourlev et \nal., 2006), com diversos fatores envolvidos, e discutidos abaixo. \n\n 12 \n \n As células endometriais, que possuem menor capacidade apoptótica, chegam na \ncavidade abdominal (células endometriais ectópicas) e invadem o tecido local. Como na EDT \nhá maior capacidade de implantação (Kyama et al., 2008) e angiogênese (Donnez et al., \n1998), o crescimento das células endometriais ectópicas leva à formação das lesões \nendometrióticas (revisado em Liu e Lang, 2011). \n A compreensão de como as células endometriais aderem, ectopicamente, aos ovários, \nligamentos e superfícies peritoneais e como, uma vez aderidas, essas células proliferam, \nadquirem suplemento sanguíneo e resultam em endometrio se, continua sendo alvo de \nconstantes pesquisas. Dentre os principais possíveis mecanismos envolvidos no \nestabelecimento e progressão da doença estão a intensa resposta inflamatória em mulheres \ngeneticamente suscetíveis, a transição epitelial -mesenquimal, disfunção imunológica e da \npresença de um ambiente metabólico e endócrino favorável nessas mulheres ( revisado em \nZondervan et al., 2018). \n A EDT é considerada uma doença estrogênio dependente (Bulun, 2009), uma vez que \nesse hormônio contribui para o crescimento celular ( revisado em Zondervan et al.,, 2018). A \nenzima aromatase (que converte androgênio em estrogênio) está ausente no endométrio de \nmulheres sadias (Baxendale e Reed, 1981). Porém, nas mulheres com EDT, há altos níveis \nda enzima aromatase e baixos níveis da enzima 17-beta-hidroxi-esteróide-desidrogenase-22 \n(conversora de estradiol em estrona), tanto no tecido endometrial eutópico como no ectópico. \nComo consequência, há um nível maior de estrogênio nesses locais. Essa alta concentração \nde estrogênio, associada ao aumento de receptores de estrogênio (Bulun, 2009), ativam \ngenes envolvidos na proliferação celular, tais como GREB1 , MYC ( c-myc, família de p roto-\noncogenes que codifica uma fosfoproteína nuclear com papel na progressão do ciclo celular, \napoptose e transformação celular) e CCND1 (do inglês, Cyclin D1; gene que codifica uma \nproteína que funciona na regulação de Cinases Dependentes de Ciclina (CDK)), no ciclo \ncelular. \n A maior presença de estrogênio em tecido endometrial ectópico, além de favorecer a \nproliferação de células endometriais, estimula a produção de prostagl andinas, pela ativação \nda enzima cicloxigenase 2 (COX 2, do inglês, Cyclo-Oxygenase 2), que pode estimular ainda \nmais a aromatase, contribuindo para a manutenção dos implantes endometrióticos e para a \nmanutenção de ambiente inflamatório (Attar e Bulun, 2006). A produção excessiva de \nestrogênio também tem ação na resposta imune, contribuindo para a inibição da fagocitose \npor macrófagos, as principais células responsáveis pela eliminação dos restos celulares na \ncavidade peritoneal (Sidell et al., 2002). O estrogênio age em várias vias de sinalização do \nmacrófago, influenci ando, em particular, naquelas relacionadas à habilidade de manter o \nrecrutamento de células inflamatórias e no remodelamento de tecidos inflamados [ MPAK, do \ninglês, Mitogen-Activated Protein Kinases, proteína quinase ativada por mitógeno (Seval et \nal., 2006), PI3K/AKT, do inglês, Phosphatidylinositol 3-Kinase, fostatidilinositol-3 \nquinase/proteína quinase B ) (Kayisli et al., 2004) e NF-κB (do inglês, Nuclear Factor Kappa -\n\n 13 \n \nlight-chain-enhancer of activated B cells , fator nuclear kappa) (McKay e Cidlowski, 1999)]. Sua \ndesregulação pode ter, como consequência, a sobrevivência de células ectópicas e a \npromoção da vascularização das lesões (revisado em Cakmak et al., 2009). \n As disfunções hormonal e imunológica, na EDT, caminham juntas, uma vez que além \ndos macrófagos, diversas células imunes, como linfócitos T, linfócitos B, eosinófilos e \nneutrófilos também expressam o receptor funcional de estrogênio , GPER1 (do inglês, G \nProtein-coupled Estrogen Receptor 1, receptor 1 de estrogênio acoplado à proteína G) (Notas \net al., 2020). \n Além da produção local de estrogênio, a resistência à progesterona presente nas \nmulheres com endometriose, pode contribuir para a fisiopatologia da doença. Foram \nobservados baixos nívei s de receptores de progesterona e a ausência da sua isoforma B, \ntanto no endométrio eutópico (Burney et al., 2007), como no ectópico (Bulun et al. 2006), \nquando comparados às mulheres saudáveis. A desregulação da expressão dos receptores de \nprogesterona, ou mesmo alterações nas vias de sinalização causam resistência à \nprogesterona em até 30% das mulheres com EDT (Vercellini et al., 2013). Nest e caso, a \ndiminuição da ação de progesterona, que tem impactos anti-inflamatórios (Bulun et al., 2006), \ntambém parece contribuir para a sobrevida/implantação de implantes endometriais e para a \nmanutenção de inflamação local. \n Em resumo, alterações hormonais também podem contribuir no aumento da \ncapacidade de células endometriai s ectópicas proliferarem, no aumento da adesão ao \nmesotélio peritoneal ( revisado em Ahn et al., 2015) e/ou na diminuição da capacidade do \nsistema imune em eliminar essas células da cavidade peritoneal (Sidell et al., 2002). \n A sobrevivência dos implantes endometrióticos na parede peritoneal depende do \nsuprimento sanguíneo para o fornecimento de oxigênio e nutrientes às lesões em \ndesenvolvimento. As lesões endometrióticas são altamente vascularizadas, indic ando que a \nangiogênese e/ou a vasculogênese devem estar envolvidas no sucesso da sua implantação \n(Nisolle et al., 1993). Análoga ao processo de vascularização dos tumores, a EDT pode \nutilizar de mecanismos de angiogênese e vasculogênese, que contribuem no estabelecendo \nde uma rede vascular própria e na sua manutenção (revisado em Ahn et al., 2015). Assim, as \nlesões endometrióticas se estabelecem em microambiente onde os mediadores inflamatórios \nse mantêm presentes. \n Considerando-se que o endométrio humano normal sofre proliferação, diferenciação e \nregeneração a cada ciclo menstrual, há atividade angiogênica inata, sob regulação do \nestrogênio, de forma que juntamente com o crescimento endometrial, ocorre proliferação e \nregeneração também da vasculatura endometrial, a cada ciclo (revisado em Ahn et al., 2015). \nEsse processo fisiológico parece estar desregulado na EDT, uma vez que o end ométrio \neutópico de mulheres com endometriose apresenta maior densidade de microvasos, maior \nexpressão de VEGF-A (fator de crescimento vascular endotelial A) no epitélio glandular e de \nVEGFR-2 ( do inglês, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor -2, receptor do fator de \n\n 14 \n \ncrescimento vascular endotelial 2) nos vasos sanguíneos. Tais fatores corroboram o \nenvolvimento de angiogênese e neovascularização de lesões, contribuindo no \nestabelecimento da doença (Bourlev et al., 2006). Além disso, VEGF atua como um fator de \nsobrevivência, prevenindo a morte apoptótica de células endoteliais microvasculares \n(Watanabe e Dvorak, 1997). \n Ainda outros elementos importantes na fisiopatologia da endometriose envolvem a \nmaior capacidade de adesão dos fragmentos endometriais, descrita na EDT be m como \nconcentrações elevadas de MMP e do ativador do plasminogênio, no endométrio eutópico de \nmulheres com EDT (Klemmt et al., 2007). Em conjunto, esses dados sugerem haver aumento \nda proteólise dos fragmentos endometriais que saem para a cavidade peritoneal, via \nmenstruação retrógrada, facilitando o estabelecimento como lesões endometrióticas \n(Gilabert-Estellés et al., 2003). De fato, níveis de MMP -9, que tam bém tem atividade \nimunorreguladora (Lavini-Ramos et al., 2017) estão elevados em amostras de soro de \nmulheres com EDT (Becker et al., 2010). A MMP-9 degrada o colágeno e a elastina, induz a \nneovascularização, acelera a expansão das células endoteliais vasculares e aumenta o fluxo \nsanguíneo (De Sanctis et al., 2011). \n Ainda no contexto de ação d e MMPs na fisiopatologia da EDT, o mecanismo de \ndesenvolvimento embrionário, transição epitélio -mesênquima, ou transição mesênquima -\nepitélio é reconhecido como mais um componente na fisiopatologia da EDT. Esse tipo de \nalteração tecidual ocorre num contexto de inflamação crônica, onde células epiteliais \nadquirem um fenótipo mesenquimal invasivo (com modificações na expressão de moléculas \nde adesão como perda de E -caderina e ganho de N -caderina), com aumento de fator de \ncrescimento e da expressão de metalopro teinase de matriz, facilitando a proliferação celular \n(revisado em Zondervan et al., 2018). A transição epitélio -mesênquima também é \nconsiderada, dentre os mecanismos ativo sem células tumorais durante a invasão celular e \nmetástase (Orlichenko e Radisky, 2008). No entanto, não há estudos que indiquem, \nexatamente, que tipo de transição epitélio-mesênquima ocorre na EDT (Yang e Yang, 2017). \nFoi observado que estímulos, como hipóxia e estrogênio, podem, por diferentes vias, ativar \nesse processo na doença, envolvendo fatores como TGF -β e a via da sinalização, Wnt, \nestimulando a proliferação e migração celular (Yang e Yang, 2017). \n Outros mecanismos discutidos como importantes no estabelecimento e progressão da \nEDT são relacionados às disfunções do sistema imune dessas mulheres, considerado \nincapaz de reconhecer e/ou montar uma resposta imune efetora adequada e eliminar os \nfragmentos de endométrio na cavidade pélvica. É possível que os próprios fragmentos \nendometriais também adquiram a capacidade de evasão da resposta imune, qu ando na \ncavidade pélvica, havendo, provavelmente, uma combinação de fatores imunológicos e \nendometriais alterados na doença (revisado em Ahn et al., 2015). \n As alterações imunológicas já relatadas nas mulheres com EDT incluem tanto \ndisfunções da imunidade mediada por cél ulas como na imunidade humoral. No contexto \n\n 15 \n \nhumoral, foram observados depósitos de IgG e de Fator 3 do sistema complemento (C3) no \nendométrio eutópico de pacientes com endometriose, com correspondente diminuição dos \nníveis de complemento total no soro (Weed e Arquembourg, 1980), indicando a ocorrência de \nativação da cascata do complemento. Também foi observada maior expressão gênica e \nproteica de vários componentes do sistema complemento em mulheres com EDT, em relação \nao endométrio normal de mulheres controles (CTRs) (Suryawanshi et al., 2014). Dentre eles, \no fator 7 do complemento (C7), considerado altamente expresso, além do fator B, D, H e \nMASP1 (do inglês, mannose-associated serine protease 1, serina -protease associada à \nmanose). A maioria das proteínas do complemento tem expressão em células epiteliais \nglandulares endometrióticas , sugerindo que a ativação do sistema complemento pode ser, \ninicialmente, um processo envolvido na eliminação de células endometrióticas, mas sem \neficácia, e que, possivelmente contribui para o processo de inflamação crônica da EDT, como \njá descrito em outras doenças (revisado em Ricklin et al., 2010). \n Ainda em relação a alterações humorais, foi observada uma maior frequência de \nreconhecimento de antígenos endometriais (extrato tecidual eutópico e ectópico) por \nanticorpos IgG, presentes tanto no soro como no fluido peritoneal (FP), de mulheres com \nEDT, em relação a mulheres saudáveis (Mathur et al., 1990). Há também descritos maiores \nníveis de autoanticorpos contra fosfolipí deos, histonas, polinucleotí deos (Gleicher et al ., \n1987) e músculo liso (Taylor et al., 1991) em relação a mulheres CTRs, sem a doença. Estes \nachados su gerem haver uma maior exposição de autoantígenos no endométrio eutópico e \nectópico de mulheres com EDT desencade ando processos de autoimunidade patológica, \npossivelmente, compondo a fisiopatologia da doença. Assim, o excesso de proteínas \nendometriais em lo calização extrauterina, poderia contribuir para uma resposta autoimune \ninflamatória, na EDT. Apesar desses achados, indicando a ocorrência de resposta imune \nhumoral dirigida a autoantígenos e ativação da cascata do complemento, sugerindo um \ncomponente de a utoimunidade patológica, na EDT, não se sabe, ao certo, o quanto o \nprocesso autoimune é importante na fisiopatologia da EDT. \n Enquanto alguns estudos, como os acima citados, focam no conceito de EDT com \ncaracterísticas de autoimunidade patológica, cada vez mais acumulam -se dados também \nmostrando alterações na função de diversas células do sistema imune. Diversos estudos \nindicam que a vigilância imunológica nas mulheres com EDT está prejudicada e que as \ncélulas do sistema imune, tanto as residentes, como as recrutadas para a cavidade \nabdominal, parecem ser incapazes de responder de forma adequada à permanência de \ncélulas endometriais ectópicas, tanto em relação ao seu reconhecimento, como quanto à sua \neliminação (Dmowski e Braun 2004; Herington et al., 2011). Nesse sentido, destacamos que \nas células da resposta imune inata estão intensamente envolvidas na patofisiologia da \ndoença, incluindo neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células NK (Symons et al., \n2018). \n\n 16 \n \n Os neutrófilos, as células primárias da resposta imune inata a serem recrutadas para \nlocais com inflamação – infecção e/ou dano tecidual (Petri e Sanz, 2018), no contexto da \nEDT, são encontrados numa maior frequência no fluido peritoneal dessas pacientes, em \nrelação às mulheres sem a doença (Tariverdian et al., 2009). Este achado é, possivelmente, \nresultado de concentrações elevadas de citocinas, como a IL-8, com função quimiotática para \nneutrófilos, no plasma e fluido peritoneal de mulheres com EDT quando comparado aos de \nmulheres CTRs, sem a doença (Monsanto et al., 2016). \n Células como macrófagos, DCs e mastócitos contribuem para a resposta inflamatória \ninicial, participando na eliminação das células ectópicas, mesmo que de forma insuficiente, \ndando início à reparação do tecido peritoneal que sofreu injúria (Herington et al., 2011). A \nfagocitose por macrófagos é auxiliada por metaloproteinases de matriz (MMP) e pela \nexpressão do receptor scavenger, CD36, promovendo a degradação (Osteen et al., 2003) e \neliminação de restos celulares (Febbraio et al., 2001), que chegam na cavidade abdominal. \nEmbora o número de macrófagos seja maior no líquido peritoneal (Hill et al., 1988) e no \nendométrio eutópico (Berbic et al., 2009) de mulheres com EDT, em comparação com \nmulheres CTRs, esses macrófagos apresentam uma redução na expressão e atividade da \nMMP-9 (Wu et al., 2005) e redução de expressão do receptor CD36 (de Villiers et al., 1994). \nComo consequência, ocorre uma diminuição da capacidade fagocítica e de degradaçã o de \ndetritos por esses macrófagos (Chuang et al ., 2009; Halme et al., 1984). A presença de \nmacrófagos ativados na cavidade peritoneal, independentemente de sua capacidade \nfagocítica, contribui para as maiores concentrações de c itocinas pró -inflamatórias e \nquimiotáticas, já observadas no fluido peritoneal de mulheres com endometriose, em relação \nàs mulheres CTRs. São descritos níveis maiores de MIF (do inglês, Macrophage migration \nInhibitory Fator) (Kats et al., 2002), TNF-α (do inglês, Tumor necrosis fator alpha) (Eisermann \net al., 1988), Interleucina (IL) 1β, IL -6 (Harada et al., 1997), IFN-γ (do inglês, Interferon \ngamma) (Podgaec et al., 2007; Bellelis et al., 2019), IL-8, RANTES , MCP-1 (do inglês, \nMonocyte Chemoattractant Protein 1) (Akoum et al., 1996), IL-7 e IL-15 (Bellelis et al., 2019). \nEm condições fisiológicas, os macrófagos participam da e liminação de resíduos \ncelulares provenientes da menstruação, bem como da regeneração de tecidos e angiogênese \n(revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). Macrófagos M2, com propriedade anti -inflamatória \nsão predo minantes na condição fisiológica , indicando que o endométrio eutópico em \nmulheres saudáveis apresentam um ambiente anti-inflamatório, que permite a implantação do \nembrião. No entanto, na EDT, a principal população de macrófagos no endométrio eutópico \nsão os M1, com propriedade pró -inflamatória, conferindo, portanto, um microambiente \nendometrial com característica mais infla matória, nessas mulheres (revisado em Vallvé-\nJuanico et al., 2019). Além disso, diferentemente de DCs, os macrófagos não aumentam na \nfase secretora do ciclo, contribuindo para a manutenção de restos endometriais, que podem \nsobreviver e migrar para a cavidade peritoneal, favorecendo sua implantação e \ndesenvolvimento de lesões ectópicas (revisado em Vallvé-Juanico et al., 2019). \n\n 17 \n \n As células dendríticas, DCs, com função relevante na apresentação de antígenos e na \nmodulação da resposta imune dependente de linfócitos T, também apresentam alterações \nfuncionais nas mulheres com EDT. As DCs imaturas (CD1a+) que, em geral, têm predomínio \nde atividade imunorregula dora, estão em maior densidade nas lesões peritoneais, quando \ncomparada à densidade observada no tecido peritoneal, livre de lesão das mesmas \nmulheres, ou ao tecido peritoneal de mulheres sem EDT, no qual estão ausentes (Schulke et \nal., 2009). Essa s mesmas DCs avaliadas no endométrio eutópico das mulheres com EDT, \napresentam-se em maior densidade na camada basal do endométrio durante a fase \nproliferativa do ciclo menstrual, em comparação com as mulheres CTRs, sem a doença, na \nmesma fase do ciclo. As DCs maduras (CD83+), com alta capacidade de apresentação \nantigênica, têm uma significativa menor densidade no endométrio eutópico de mulheres com \nEDT, tanto na camada basal como na funcional, em relação às mulheres saudáveis, em todas \nas fases do ciclo (Schulke et al., 2009). Essas alterações sugerem uma possível alteração \nprimária da função imune já no endométrio eutópico das mulheres com EDT, com uma menor \ncapacidade de apresentação antigênica e ativação da função efetora linfocitária. \n A fisiopatologia da EDT, pode ainda envo lver células T reguladoras (Treg), que têm \nfunções no controle da resposta imune inflamatória. Estas células produzem citocinas \nimunorreguladoras, como IL -10 e TGF -β (do inglês, Transforming Growth Factor Beta) \n(Nandakumar et al., 2009), podendo atuar na inibição da ativação de macrófagos, da \nproliferação de células T e B, na função de DCs e NKs, além da redução da at ividade das \ncélulas T efetoras (Sakaguchi et al., 2006), tendo importante função na manutenção da \ntolerância ao próprio. Foi observado um maior número de células Treg que expressam o fator \nde transcrição FOXP3 (do inglês, forkhead Box P3) no endométrio eutópico \n(imunohistoquímica) nas mulheres com EDT na fase proliferativa precoce e durante toda a \nfase secretora do ciclo menstrual, em comparação às mulheres saudáveis (Berbic et al., \n2010). Esse dado sugere que no microambiente do endométrio eutópico das mulheres \ndoentes haja uma menor capacidade efetora de células T envolvidas no reconhecimento de \nantígenos endometriais que chegam à cavidade perito neal, permitindo sua sobrevivência e \nfacilitando sua implantação em sítios ectópicos. Também há relatos de maiores níveis de IL -\n10 e IL-4 no fluido peritoneal de mulheres com EDT, em relação a mulheres CTRs saudáveis, \nalém de razões de citocinas anti -inflamatórias/pró-inflamatórias (regula/inflama) IL -4/IFN-, \nIL-4/IL-2, IL-10/IFN-, IL-10/IL-2 (Podgaec et al., 2007). Esses dados indicam que, além da \npresença de um perfil inflamatório de resposta imune (Th1), citocinas com perfil, \npredominantemente, imunorregulador (Th2) também participam da fisiopatologia da EDT. \n A presença deste perfil regulador é também corr oborada por outro estudo que \nidentificou a presença de um maior número de células com fenótipo, predominantemente, \nregula, CD4+CD25high, no fluido peritoneal de mulheres com EDT, com maior expressão de \nmRNA de Foxp3 nestas células (Podgaec et al., 2012), em relação às mulheres sem a \ndoença. Além disso, a expressão de mRNA para as citocinas com padrão regulador, IL-4 e IL-\n\n 18 \n \n10 mais elevada em linfócitos, tanto do sa ngue periférico como do tecido endometrial, em \nmulheres com EDT em relação a mulheres CTRs, sem a doença (Antsiferova et al., 2005). \nCorroborando este achado, há relatos de uma predominância de IL -4 e IL -10 no FP de \nmulheres com EDT profunda (Podgaec et al., 2010), refletindo a ativação de mecanismos \nimunorreguladores, provavelmente, de forma descontrolada, gerando uma condição de \nimunossupressão com prejuízo na resposta imune efetora no sítio de acometimento da \ndoença. \n Além das células acima c itadas com possível envolvimento no estabelecimento e \nprogressão da EDT, especial atenção tem sido dirigida à contribuição de células NK na \nresposta imune na EDT e, mais especificamente, ao seu envolvimento no escape imunológico \ndos fragmentos endometriais ectópicos da cavidade peritoneal (Thiruchelvam et al., 2015). \nVários estudos descrevem alterações funcionais e/ou fenotípicas, tanto local (microambiente \nda lesão) (Oosterlynck et al., 1992; Wu et al., 2000; Maeda et al., 2002) como sistêmicas \n(Wilson et al., 1994; Maeda et al., 2002), de células NK, na EDT, porém os mecanismos \nassociados a tais alterações na doença ainda são objeto de investigação. \n \n \n1.3 Células Natural Killer na endometriose \n \n As células NK compreendem, aproximadamente, 10 -15% dos linfócit os circulantes, e \napresentam papel importante na resposta imune inata. São caracterizadas pelo fenótipo \nCD3‐CD56+ (CD3, marcador específico para linfócitos T; CD56; isoforma da molécula de \nadesão neural). Podem ainda ser subdivididas, fenotipicamente, em d uas subpopulações \ndistintas, CD56 bright e CD56 dim, com base na densidade de CD56 (bright, alta expressão, e \ndim, baixa expressão) na superfície celular (Fehniger et al., 2003). A subpopulação CD56 dim \ncompreende cerca de 90% das células NKs circulantes, sendo consideradas maduras e, \npredominantemente, citotóxicas e produtoras de citocinas após estimulação com células -alvo \n(Caligiuri, 2008). A subpopulação CD56 bright é, geralmente, considerada mais proliferativa, e \ncom capacidade para a produção de citocinas após estimulação com IL -12 e IL-18, mas com \numa baixa atividade citotóxica em repouso (Caligiuri, 2008). As células CD56bright (Fehniger et \nal., 2003) podem deixar os vasos sanguíneos e se constituírem como a maioria das células \nNK encontradas dos nódulos linfáticos ou em tecidos deciduais de mulheres grávidas. Nesses \ntecidos deciduais constituem cerca de 70% dos linfócitos da decídua no primeiro trimestre, \ncom papel na promoção da angiogênese na gravidez (Zhang et al., 2011). Alguns estudos \nsugerem que a s células NK CD56 bright sejam derivadas de células precursoras \nhematopoiéticas CD34+ e dêem origem às células CD56 dim, uma vez que são as que \naparecem primeiro após o transplante de células tronco hematopoiéticas e em modelos de \ndiferenciação de NK, in vitro, com estímulo de citocinas (revisado em Freud e Caligiuri, 2006). \n\n 19 \n \nA expressão de CD57, em células CD56dim, está associada à maturação e função das células \nNK, que inclui alta atividade citolítica e produção de citocinas. Ademais, células \nCD56dimCD16+CD57+ produzem IFN -γ e têm atividade ci totóxica mais potente quando \nestimuladas via CD16 (Lopez-Vergès et al., 2010). \n A atribuição clássica de funções para as células CD56 dim, como, predominantemente, \ncitotóxicas e CD56bright, como produtoras de citocinas, tem sido alvo de debate, uma vez que \nhá estudos mostrando respostas citotóxicas aumentadas de células NK CD56 bright após \nestimulação com citocinas, bem como ampla produção de c itocinas por células NK CD56 dim \napós o reconhecimento de ligantes em células alvo ou anticorpos (Freud et al., 2017). Em \nestudo recente (Schwane et al., 2020) confirmou-se, por meio de agrupamento hierárquico \nnão supervisionado, a identificação de 70 moléculas com expressão diferencial no repertório \nde receptores de células NK CD56 bright e CD56 dim, os quais foram associados a várias \nfunções das células NK. \n As células CD3 -CD56+ podem, ou não, apresentar a molécula C D16 (FcγRIIIA, \nreceptor para a porção Fc da imunoglobulina G, IgG) cuja ligação com IgG promove \ncitotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC, do inglês, Antibody-\ndependent cellular cytotoxicity) (Caligiuri, 2008). C élulas NK maduras circulantes \n(CD56dimCD16+) apresentam uma potente função efetora via ADCC (revisado em Morvan e \nLanier, 2016). \n Células CD56 dimCD16+ são as mais citotóxicas e também as mais frequentes no \nsangue periférico (90 -95%) (Campbell et al., 2001; Cooper et al., 2001a). Mediadas por \nquimiocinas, podem seguir para tecidos periféricos durante as respo stas inflamatórias, \nliberando perforina e granzima capazes de induzir, rapidamente, citotoxicidade (Campbell et \nal., 2001). A menor frequên cia de NK no sangue (5 -10%) são das células CD56 brightCD16−. \nElas expressam receptores de endereçamento ( homing) para locais periféricos inflamados, \nque exercem uma baixa citotoxicidade (Campbell et al., 2001; Cooper et al., 2001b). \n Com base na densidade de expressão na superfície celular, d e forma geral, são \ndefinidas cinco subpopulações de células NK no sangue periférico humano: 1) \nCD56brightCD16-(50-70% das célula s CD56 bright), 2) CD56 bright CD16+ (30–50% das células \nCD56bright), 3) CD56+/dimCD16-, 4) CD56dimCD16+ e 5) CD56-CD16+ (Poli et al., 2009). \n As células NK não expressam receptores de antí genos específicos de células T ou B \n(Vivier e Ugolini, 2009). Apresentam distribuição normal restrita, principalmente, ao sangue \nperiférico, medula óssea, baço e fígado e, em condições fisiológicas, com frequência restrita \nem linfonodos ou órgãos linfáticos, migrando para esses locais nas fases iniciais de \nprocessos inflamatórios (Dogra et al., 2020). C onsideradas como membro da recém -\ndescoberta família das células linfóides inatas (ILC , do inglês, Innate Lymphoid Cell ), as \ncélulas NK foram reclassificadas como ILC -1 (Vivier et al., 2018), sendo caracterizadas, \npredominantemente, por sua atividade citotóxica e pela produção da citocina IFN -γ. No \n\n 20 \n \nentanto, diferentemente dos linfócitos TCD8+ citotóxicos, exercem sua função citolítica sem a \nnecessidade de ativação prévia (Moretta et al., 2002). \n Após a firme adesão da célula NK à célula -alvo, ocorre a formação de uma sinapse \nimunológica, onde os grânulos citotóxicos (vesículas lisossomais) são, então, polarizados em \ndireção à sinapse, fundindo-se com a membrana da célula NK (Orange, 2008). O mecanismo \nde indução de morte da célula alvo envolve a degranulação desses grânulos que contêm \nproteínas tóxicas, perforina e granzima, e as proteínas de membrana associadas aos \nlisossomas-1 (LAMP1, do inglês, Lysosomal-Associated Membrane Protein 1, ou CD107a), \nLAMP2 (CD107b) e LAMP3 (CD63) (Peters et al., 1991). As perforinas criam poros na \nmembrana celular da célula alvo e, com a posterior liberação da proteína citotóxica, granzima, \né desencadeada a morte celular por apoptose, por diferentes vias ( revisado em Prager e \nWatzl, 2019). As granzimas induzem a ativação de caspases, disfunção mitocondrial, ou \napoptose independente de caspases. Dentro desses grânulos, as granzimas formam \ncomplexos com o proteoglicano serglicina, mantendo-se inativas em função dos baixos, pH e \nconcentração de cálcio e, desta maneira, protegendo as células NKs (e/ou TCD8+) de danos \npor seus grânulos tóxicos (revisado em Prager e Watzl, 2019). \n Nas células citotóxicas, NK e TCD8+, CD107a (LAMP -1) é considerada a proteína \nmais abundante nessas vesículas intracelulares. Dessa forma, a análise da expressão de \nCD107a é considerada uma medida de degranulação d e vesículas intracelulares por essas \ncélulas (Alter et al., 2004). Algumas doenças são descritas como associadas a um \nmecanismo deficiente de degranulação (Marcenaro et al., 2006; Shabrish et al., 2019). Em \npacientes com anemia de Falconi, foi observada deficiência na expressão de CD 107a por \ncélulas NK estimuladas, em relação à expressão em CTRs saudáveis, que, associada a uma \nmenor citotoxicidade dessas células e a altos níveis de IFN-γ, sugere haver uma relação com \na hiperinflamação descrita na doença (Shabrish et al., 2019). \n Além da degranulação dos grânulos líticos, a morte de células alvo por células NK \ntambém pode ocorrer por meio de receptores de morte, expressos na superfície de células \nNK: FasL (do inglês, Fas Ligand, Fas ligante) e TRAIL (do inglês, TNF- Tumor Necrosis Factor-\nRelated Apoptosis-Inducing Ligand, ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose \ntumoral), que se ligam aos receptores Fas e TRAIL-R1 e/ou -R2, respectivamente, nas células \nalvo. Como resultado dessa ligação, ocorre ativação de caspases, disfunção mitocondrial e \napoptose da célula alvo (revisado em Prager e Watzl, 2019). \n A ação das cél ulas NK é fortemente regulada por ações integradas entre sinais \ninibidores e ativadores, e mediada pela ligação entre esses receptores, presentes em sua \nsuperfície celular, com seus ligantes, presentes na célula alvo (Cooper et al., 2001a) (Figura \n1). \n Os receptores inibidores expressos nas células NK (Figura 2) possuem um \nimunorreceptor baseado em tirosina (ITIM) (do inglês, Immunoreceptor Tyrosine -based \nInhibitory Motif), presente no domínio citoplasmático dessas moléculas . Segundo a teoria do \n\n 21 \n \n“missing-self” (ausência do própr io) (Ljunggren e Kärre, 1990), n a presença de moléculas \nHLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I próprias (HLA-A, B, -C), resíduos de tirosina dos \nmotivos ITIM sofrem fosforilação, frequentemente, por uma quinase da família Src, mantendo \nalta afinidade de ligação de receptores inibidores . A presença de fosfatases “desliga” os \nreceptores ativadores e o desfecho final é a ausência de ativação das células NK (Lanier, \n1998) (Figura 1). Os principais receptore s inibidores envolvidos nesse processo são os \nreceptores inibidores da família KIR ( Killer Imunoglobulin like Receptor ), que é altamente \npolimórfica e também inclui receptores ativadores (Middleton et al., 2002). Além dos \nreceptores KIR, outros receptores inibidores também são expressos em células NK como \nCD94/NKG2A, membro A da família de receptores de lectina tipo C (do inglês, C-type lectin \nreceptor), receptores leucócitos Ig -like (LIRs, do inglês, Leukocyte Ig-like R eceptors,) e os \ntranscritos Ig -like (ILTs) ( Ig-like transcripts ), que reconhecem moléculas HLA classe I não \nclássicas expressas nas células (molécula próprias, self) ( revisado em Morvan e Lanier, \n2016). Além dos receptores KIR inibitórios, o receptor NKG2A, que reconhece a molécula não \nclássica, HLA -E, também está envolvido na educação de células NK, um processo de \nmaturação funcional que permite a inibição de células NK, quando do reconhecimento do \npróprio (self) (Anfossi et al., 2006). \n Na ausência ou diminuição da expressão de moléculas HLA de classe I (células \nidentificadas como “não-próprias”, “missing-self”) para ligação com receptores inibidores KIR, \ncomo ocorre, frequentemente, na infecção viral ou na transformação maligna, as células NK \nsão ativadas, ocorrendo a lise da célula alvo (Kärre et al., 1986) (Figura 1). Uma outra forma \nde ativação de células NK pode correr quando há uma super expressão de ligantes próprios \nem células alvo (“ induced self”), como na condição de estresse biológico (como tumor, \ninfecção). Neste caso, esses ligantes podem ser reconhecidos pelos receptores ativadores \nem células NK, sobrepondo os sinais in ibitórios e induzi ndo a lise das células -alvo. Além \ndisso, anticorpos específicos ligados a antígenos em células alvo, podem ainda se ligar ao \nreceptor CD16, em células NK, induzindo a citotoxicidade celular dependente de anticorpos \n(ADCC) (revisado em Morvan e Lanier, 2016) (Figura 1). \n \n\n 22 \n \n \nFigura 1. Representação esquemática das principais funções das células NK, no contexto de \ncélulas saudáveis e tumorais/estressadas. A) Um equilíbrio de sinais entre os receptores inibidores \ne ativadores regula o reconhecimento de células saudáveis, por células natural killer(NK); B) As células \ntumorais que regulam ne gativamente a expressão das moléculas HLA de classe I são detectadas \ncomo \"ausência do próprio\" (ausência do próprio, “ missing-self”) e são lisadas por células NK; C) As \ncélulas tumorais/estressadas podem superexpressar ligantes induzidos por estresse (lig antes próprios \ninduzidos, “ induced-self”), reconhecidos por receptores ativadores em células NK, que anulam os \nsinais inibitórios e induzem a lise das células -alvo; D) Anticorpos específicos a antígenos tumorais \nligam-se à molécula CD16 e induzem citotoxic idade mediada por células NK dependente de anticorpos \n(ADCC). Adaptada de Morvan e Lanier, 2016. \n \n \n Além dos receptores KIR ativadores, dentre os receptores ativadores expressos em \ncélulas NK, destacamos o receptor NKG2D, membro da família de receptores semelhantes à \nlectina tipo C ( C type lectin family; que inclui CD94/NKG2C, CD94/NKG2E, CD94/NKG2F), a \nfamília dos receptores de citotoxicidade natural (NCR, do inglês, Natural Cytotoxicity \nReceptors), incluindo os receptores NKp30, NKp44 e NKp46, e o receptor para Fc IgG, CD16 \n(revisado em Morvan e Lanier, 2016) (Figura 2). \n \n\n 23 \n \n \nFigura 2. Principais receptores inibidores e ativadores nas células NK, e seus ligantes em célula \nalvo. BAT3, transcrito 3 a ssociado ao antígeno leucocitário humano (HLA) -B; CRTAM, molécula \nassociada às células T restritas à molécula HLA de classe I; HA, hemaglutinina; HLA -E, moléculas de \nhistocompatibilidade HLA de classe I, cadeia alfa E; IgG, imunoglobulina G; LFA -1, antíge no-1 \nassociado à função leucocitária; LLT1, transcrito 1 tipo lectina; TIGIT, imunoglobulina de células T e \ndomínio ITIM. Adaptado de Chan et al., 2014. \n \n \n Há dois tipos de receptores CD16. O CD16 do tipo A (FCγRIII A) é expresso em \ncélulas NK (Selvaraj et al., 1989), monócitos (Passlick et al., 1989), macrófagos (Perussia e \nRavetch, 1991) e trofoblastos placentários (Nishikiori et al., 1993) na forma de uma proteína \ntransmembranária ancorada em polipep tídeo. O CD16 do tipo B (FCγRIII B) é expresso em \nneutrófilos, com domínios extracelulares homólogos ao CD16A, mas diferenciados pela \nligação com glicosilfosfatidilinositol (Romee et al., 2013). Após a ligação da molécula CD16 \ncom a porção Fc dos anticorpos IgG, na superfície da célula alvo, há indução de uma série de \nsinais intracelulares, resultando em atividade efetora citotóxica, por meio de ADCC. \n O receptor de ativação CD16A em células NK (daqui em diante descrito apenas como \nCD16) do sangue periférico é expresso uniformemente, quase que exclusivamente, na \nsubpopulação CD56 dim; as células CD56bright expressam pouco, ou, n ão expressam, CD16 \n(Romee et al., 2013). Após a estimulação por mitógenos, e também em cocultura com células \nalvo tumorais, pode ocorrer regulação negativa da molécula CD16, mediada pela desintegrina \ne metaloprotease ADAM17 (Tumor Necrosis Fator - TNF- converting enzyme, ou TACE), uma \nenzima envolvida na clivagem de L -selectina (Romee et al., 2013). Tal processo pode ser \nimportante para a modulação da expressão de CD16, com possível comprometimento da \nfunção efetora das células NK, via ADCC. \n O receptor tipo lectina ( do inglês, lectin-like) NKG2D (do inglês, natural-killer group 2, \nmember D), expresso em células NKs, TCD8αβ+ e T  (Pardoll, 2001). NKG2D tem como \n\n 24 \n \nligantes as moléculas MICA e B ( Major Histocompatibility Class I Chain-realted A e B, \nmolécula do Complexo Principal de Histocompatibilidade classe I relacionadas ) e ULBP1 e 2 \n(UL16-binding protein, proteína ligadora UL -16), expressas, predominantemente (mas não \nexclusivamente), em células epiteliais ou em células em situação de estresse (“ induced-self”) \n(Diefenbach e Raulet, 2001) (Figura 2). Como acima citado, a sinalização gerada pela ligação \nde NKG2D com esses novos ligantes próprios, mesmo na presença da ligação HLA -próprio-\nreceptor inibidor, suplanta os níveis de inibição, ativando as células NK (Moretta et al., 2002). \nEssa ativação funcionaria como um sistema de reserva, frente à maior dem anda funcional de \ncélulas NK, em caso de estresse celular, tendo o receptor NKG2D um papel essencial na \ncitotoxicidade (Bauer et al., 1999) e na indução de produção de IFN-γ (revisado em Zwirner et \nal., 2007) por células NK (Figura 3). \n Em semelhança a outros receptores da família CD94/NKG2, o receptor NKG2D \napresenta-se na forma de um homodímero (Figura 3), com um curto domínio \nintracitoplasmático sem propriedade de sinalização (Raulet, 2003). Cada homodímero de \nNKG2D se liga a dois homodímeros da proteína ativador a de DNAX, de 10 kDa ( DAP10, do \ninglês, DNAX-activating Protein 10) e, por meio de uma arginina carregada positivamente nesse \ndomínio, NKG2D se liga a um ácido aspártico, carregado negativamente, no domínio \ntransmembranário da molécula DAP10 (Garrity et al., 2005). DAP10 possui um motivo \nbaseado em tirosina YxxM que recruta e ativa a subunidade p85 da fosfatidilinositol 3-quinase \n(PI3-K) e a proteína 2 ligada ao receptor do fator de crescimento (Grb2 , do inglês, Growth \nFactor Receptor-Bound Protein 2). Sugere-se que esta cascata de sinalização seja a principal \nresponsável pela citotoxicidade e/ou sobrevivência das células alvo por células NK (Bauer et \nal., 1999). Uma das hipóteses para a variabilidade de ligantes para esse receptor (NKG2DL), \nexpressos em condição de estresse, é que a diversidade de liga ntes reduziria as chances de \nescape imunológico das células alvo (Diefenbach et al., 2003). Embora a expressão de \nNKG2D esteja, especialmente, associada à atividade citotóxica por células NK, ela também \npode funcionar como uma molécula coestimuladora, em células citotóxicas T CD8+, e não \napenas um mediador direto de citotoxicidade (Diefenbach et al., 2002). \n \n\n 25 \n \n \nFigura 3. Ativação de vias relacionadas ao receptor NKG2D. A ligação de NKG2D com seu ligante, \nna célula alvo, ativa várias vias moleculares em células NK, q ue são mediadas pela molécula de \nsinalização DAP10. A citotoxicidade de células NK podem ser ativada s por meio da fosfolipase C \nGama 2 (PLC2), c -Jun-NH (2) - terminal quinase (JNK) e fosfatidilinositol 3 -hidroxiquinase PI3K. A \nliberação de grânulo é ativad a pelas vias PLC2 e PI3K. A via JAK -STAT5 (Transdutor de Janus \nquinase 2-Sinal e Ativador de A via de transcrição 5) resulta na liberação de citocinas. Adaptado de \nSiemaszko et al., 2021). \n \n \n Além da citotoxicidade direta por meio da liberação de grânulos tóxicos (granzima e \nperforina), receptores de morte (Fa sL e TRAIL) e CD16 (ADCC), as células NK possuem \npapel relevante na regulação da imunidade inata e adaptativa (Zhang et al., 2006a), por meio \nda secreção de citocinas, fatores de crescimento e quimiocinas (Ferlazzo e Münz, 2004) \n(Figura 4). Uma vez ativadas, as células NK produzem citocinas, principalmen te, Interferon \ngama (IFN -γ), e Fator de necrose tumoral alfa (TNF -α), as quais aumentam a sua \ncitotoxicidade e recrutam monócitos/macrófagos, DCs, células T e células B, atu ando como \nagentes promotores de apoptose em células tumorais/infectadas (Seeger et al., 2014; Gross \net al., 2013). \n IFN-γ tem função imunomoduladora na resposta de célula T, promovendo, entre \noutras funções, a polarização TH1 e ativação de célula T CD8 + (Martín-Fontecha et al., \n2004). Atua na ativação de macrófagos e promove o aumento da apresenta ção de antígenos \npor meio da regulação positiva de moléculas de MHC (Complexo Principal de \nHistocompatibilidade - do inglês, Major Histocompatilibity Complex) de classe I e classe II. Em \nconjunto, essas ações contribuem na imunidade contra tumores, antimic robiana e antiviral \n(Schroder et al., 2004) (Figura 4). \n De forma semelhante às células Th1 e Th2 diferenciadas, in vitro, na presença de \ncitocinas IL-12 e IL -4 (Kimura e Nakayama, 2005), subtipos de células NK humanas podem \nter um perfil distinto de citocinas, baseado na produção, ou não, de IFN - γ (Deniz et al., \n2002). As células NK com produção predominante de IFN - (NK1, semelhantemente às Th1) \nquase não produzem IL-4, IL-5 e IL-13 (Deniz et al., 2002). Por outro lado, as células NK não \n\n 26 \n \nsecretoras (ou alguma secreção) de IFN - (NK2, semelhantemente às Th2) produzem IL -4, \nIL-5 e, principalmente, IL-13 (Deniz et al., 2002) (Figura 4). \n \n \n \nFigura 4. Mecanismos básicos de ação das células NK. As células NK podem ter ação na atividade \ncitotóxica inata, bem como modular a imunidade inata e adaptativa. A) como células matadoras \nnaturais, detectam níveis de expressão de ligantes induzidos por estresse (“ induced self”) bem como \nníveis diminuídos, ou ausentes, da expressão de moléculas MHC de classe I (“ missing self” ), em \ncélulas alvo, que podem ser reconh ecidos por receptores ativadores ou inibitórios respectivamente, \ncujo equilíbrio determina a ativação dessas células; B) após a ativação, as células NK podem induzir a \nlise das células alvo por meio da secreção de grânulos citotóxicos, contendo, granzima B e perforina, a \ninteração entre receptores de morte/ ligante e pela citotoxicidade celular dependente de anticorpos \n(ADCC); C) Por outro lado, células NK ativadas podem secretar uma variedade de citocinas e \nquimiocinas que promovem o recrutamento e a matur ação e de células dendríticas (DC), que podem \nmodular ainda mais a resposta de células T, incluindo a ativação, e/ou inibição, de células T CD8 + \ncitotóxica e de células Thelper (Th). Adaptada de Wang et al., 2021. \n \n \n As células NK induzem sinais que promovem a maturação de DCs com produção de \ncitocinas, com aumento da função de células TCD4+ e diferenciação para células Th1 e \nmodulam, positivamente, respostas efetoras de células T, principalmente pela produção de \nIFN-γ. Por outro lado, podem também regular negativamente a atividade efetora de outras \ncélulas do sistema imune (Zhang et al., 2006b). \n Células NK têm a capacidade de “suprimir” processos inflamatórios contra diversos \npatógenos por meio da produção de IL -10 (Perona-Wright et al., 2009). Em modelo \nexperimental de leishmaniose visceral, células NKs secretoras de IL -10, presentes em \ngranuloma de baço e fígado, foram capazes de inibir a proteção contra o parasita, e a \n\n 27 \n \nprodução desta citocina esteve associada a um processo inflamatório crônico durante a \ninfecção com Leishmania donovani (intravenosa) (Maroof et al., 2008). \n Em infecções induzidas por Toxoplasma gondii, Listeria monocytogenes e Yersinia \npestis, a citocina IL -12 secretada por DC induziu a produção de gr andes quantidades de IL -\n10 por células NK que, por sua vez, inibiu a secreção de IL -12 por DC (Perona-Wright et al., \n2009). Ainda neste estudo, foi observado que a produção de IL -10 por células NK pode \ndiminuir os processos inflamatórios. Também observaram que, quando os camundongos são \ndesafiados com patógenos que não levam à infecção disseminada, como o vírus da gripe ou \ncepa atenuada de Yersinia pestis não disseminada, as células NK secretam IFN -γ, mas não \nsecretam IL-10. Esses resultados sugerem que a ''força'' do desafio microbiano é traduzida na \nsecreção de IL-12, que por sua vez modula a resposta das células NK: estimuladora no caso \ndo IFN-γ, e inibitória, no caso de uma maior secreção de IL-10 (Vivier e Ugolini, 2009). \n Em humanos, a produção de IL -10 por células NK foi detectada em pac ientes com \ninfecção por vírus C da hepatite (De Maria et al., 2007), bem como, a produção de IL -10 por \nNK foi associada a um efeito supressor na proliferação de células TCD4+ antígeno específica \n(Deniz et al., 2008). Neste último estudo, foi observado que apenas parte das células NK \nforam capazes de produzir IL-10, ex vivo, sugerindo haver um subgrupo secretor específico \ndessas células. \n O su bgrupo de células NK produtoras de IL -10 foi proposto serem células NK \nreguladoras (NKreg), com importante papel regulador, tanto na imunidade inata quanto na \nadaptativa, sendo caracterizadas, fenotipicamente, como células NK CD56 brightCD16-/+ \n(Zhang et al., 2006b). As células NK CD56 brightCD16- (ou CD16low) são mais abundantes em \ntecidos linfóides secundários (gânglios linfáticos e tonsilas) e são caracterizadas pela b aixa \ncitotoxicidade. Quando estimuladas, estas células produzem altos níveis de citocinas \nexercendo, primariamente, uma função reguladora (Fauriat et al., 2010). Em contraste, a \npopulação CD56 dimCD16+ é caracterizada pela baixa produção citocinas (IFN - e TNF-α) e \nalta capacidade citotóxica (Fauriat et al., 2010). \nAs principais citocinas produzidas por células NKreg CD56 brightCD16- são IFN-γ, TNF- \nα, GM-CSF (do inglês, Granulocyte-macrophage colony-stimulating fator, fator estimulador de \ncolônias de granulócitos e macrófagos) , IL -10 e IL -13, dependendo das condições de \nestímulo (celular ou citocinas) e do microambiente (Fauriat et al., 2010; Poli et al., 2009). O \nefeito imunorregulador das NKregs CD56 brightCD16- foi observado em algumas doenças \nautoimunes, tais como esclerose múltipla, com supressão da resposta T a autoantígenos e \nindução de apoptose de c élulas T ativadas (Jiang et al., 2011). Além disso, células NK do \nsangue periférico CD56 bright e CD56 dim produtoras de IL -10 estão aumentadas no início da \ngravidez comparadas aos números em mulheres com aborto espontâneo (Higuma-Myojo et \nal., 2005). Também foi observado que parte das NKs da decídua também secretam IL -10 \n\n 28 \n \n(Deniz et al., 2008). Em conjunto, esses dados m ostram a existência de células NK com \natividade imunorreguladora. \n No contexto imunossupressor da endometriose, as células NKreg poderiam participar \nda modulação negativa na apresentação antigênica de antígenos endometriais ectópicos e \nprejudicar a ativaçã o de células TCD8+ citotóxicas, contribuindo para a fisiopatologia da \ndoença. Diversos estudos indicam haver uma diminuição da atividade citotóxica de células \nNK em mulheres com EDT, quando comparada àquela de mulheres CTRs, sem a doença \n(Oosterlynck et al., 1991; Oosterlynck et al., 1992; Tanaka et al., 1992; Iwasaki et al., 1993). \nEsta parece ser uma alteração imunológica relevant e na EDT, uma vez que, a lém de \nmacrófagos e neutrófilos que chegam à cavidade peritoneal, u ma das principais células \nimplicadas na eliminação do tecido endometrial ectópico é a célula NK (Oosterlynck et al., \n1991). IL-10 e TGF-β1 estimulam a proliferação e invasão de células endometriais estromais \nin vitro, bem como o crescimento de lesões ectópicas in vivo (Liu et al., 2017). Além disso, IL-\n10 produzida por células Th17 pode cooperar com a citocina IL -17A, promovendo o \ncrescimento, adesão, invasão e implan tação de células endometriais estromais ectópicas, e \nreduzindo a apoptose in vitro e in vivo (Chang et al., 2017). \n A diminuição da atividade citotóxica de células NK na EDT é descrita como mais \npronunciada nas fases moderadas e graves da doença (Oosterlynck et al., 1991; Garzetti et \nal., 1995; Wilson et al., 1994). O número absoluto e/ou a porcentagem de células NK em \nmulheres com EDT estão descritos de forma variável em alguns estudos, como diminuído em \ntecido uterino de m odelo experimental da doença (Ota et al., 2002), aumentado no fluido \nperitoneal de mulheres em estádios iniciais da EDT (Hill et al., 1988) e aumentado no sangue \nperiférico nos casos de doença profunda de retossigmóide (Dias et al., 2012), quando \ncomparados aos de mulheres CTRs sem a doença. Porém, os mecanismos pelos quais a \natividade citotó xica está diminuída, ainda não estão bem compreendidos, podendo haver \ntanto alterações funcionais intrínsecas dessas células, como a presença de fatores solúveis \nimplicados nessa disfunção. \n Considerando que MICA é uma molécula induzida por células em con dição de \nestresse biológico, ela pode ser expressa como antígenos próprios induzidos (“ induced self”) \n(Figura 1) e reconhecida por células NK, via receptor de ativação, NKG2D. Após \nreconhecimento e ativação dessas células, são desencadeadas suas ações por meio de \ncitotoxicidade e produção de citocinas, especialmente IFN -γ. Tais ações, podem envolver \nregulação imunológica com atividades tanto pró, com produção da citocina inflamatória, IFN -\nγ, como anti -inflamatórias, com produção de IL -10. Além disso, MICA n a sua forma solúvel \npode, de alguma forma, modular negativamente na atividade citotóxica dessas células NK. \n \n \n\n 29 \n \n1.4 MICA - Major Histocompatibility Class I Chain-related A \n \nAs moléculas MICA são codificadas pelo gene MICA, localizado no cromossomo 6, na \nregião de classe I do MHC, e são altamente polimórficas (Bahram, 2000). Diferentemente das \nmoléculas HLA classe I clássicas (HLA -A, B e C), as moléculas codificadas pelo gene MICA \nnão p articipam da apresentação de peptí deos e não estão associadas à cadeia 2-\nmicroglobulina (Groh et al., 1996). \n A molécula MICA é descrita como expressa, constitutivamente, em epitélio \ngastrointestinal, células endoteliais e fibroblastos (Zwirner et al., 1999). No entanto, sua \nexpressão também foi observada em células epiteliais de fígado, pâncreas, estômago, \nbrônquios, bexiga, ureter, mama, amígdala e timo, localizada, predominantemente, \nintracelularmente (citoplasma) e com baixa expressão na membrana celular (Ghadially et al., \n2017). \n MICA é uma molécula que pode ser induzida em diferentes tipos celulares em \nsituação de estresse biológico, incluindo transformação mal igna (Gasser et al., 2005), \ninfecção por patógenos (Lodoen e Lanier, 2006), bem como na presença de choque térmico \n(Groh et al., 1996) e estresse oxidativo (Peraldi et al., 2009). Com base nessas \ncaracterísticas, surgiu o conceito de MICA como uma molécula “ induced-sef” (próprio \ninduzido), funcionando como um alerta ao sistema imune, em condições patológicas e de \nestresse (Carapito e Bahram, 2015) (Figura 5). \nMICA tem como ligante, até o momento, o receptor de ativação de lise celular NKG2D, \nexpresso em células NK, TCD8+ e T (Pardoll, 2001), como acima citado. A interação MICA-\nNKG2D induz a lise de células alvo, por células NK, e pode ainda fornecer coestímulo para as \nrespostas de células T CD8+ citotóxicas (Groh et al., 2001). A falha na expressão de MICA, \nna situação de estresse celular, pode levar à falha no estímulo efetor de citotoxicidade, e \nconsequente disseminação de infecção intracelula r ou tumorigênese/metástase (Carapito e \nBahram, 2015). Na condição de transformação maligna, MICA de membrana é sugerida como \num “marcador” inicial de vigilância tumoral ( revisado em Nausch e Cerwenka, 2008). \nCorroborando esta hipótese, um estudo recente de revisão sistemática e meta -análise \nmostrou haver associação entre a alta expressão de MICA de membrana (imunohistoquímica) \ne a boa evolução de câncer do aparelho digestivo (Zhao et al., 2017). \n A molécula MICA pode também ser encontrada na forma solúvel (sMICA). Os \nmecanismos propostos para a produção de MICA solúvel envolvem a clivagem proteolítica \npor metaloproteinases de matriz (MMPs) (Matusali et al., 2013), principalmente, MMP2 (Yang \net al., 2014), MMP9 (Sun et al., 2011) e MMP14 (Liu et al., 2010) e por desintegrina e \nmetaloproteinases (ADAMs, do inglês, A Disintegrin And Metalloproteinase ) (Waldhauer et al., \n2008; Liu et al., 2010) como, ADAM10 (Zingoni et al., 2020) e ADAM17 (Waldhauer et al., \n2008). Além da ação de proteases, MICA também pode ser liberada em exossomas \n(Whiteside 2013) (Figura 5). \n\n 30 \n \n As MMPs estão amplamente implicadas na destruição da matriz extracelular, invasão \nda membrana basal e angiogênese (Reiss et al., 2006). Muitas ADAMs são proteases presas \nà membrana sendo uma das suas principais funções, a clivagem proteolítica de ectodomínios \nde proteínas transmembranárias, incluindo citocinas, fatores de crescimento e moléculas de \nadesão celular, da superfície celular (White 2003) . Muitas ADAMs são frequentemente \nsuperexpressas em tumores e acredita -se que desempenhem papé is importantes em \ndiferentes etapas da tumorigênese (White 2003) . Destacamos que as MMP2 e MMP9, \nenvolvidas na clivagem de MICA, também têm importante função na imunorregulação de \ncélulas tronco mesenquimais (MSC, do inglês, Mesenchymal Stem Cells) humanas derivadas \nde tecido adiposo, e envolvidas na atividade imunossupressora dessas células (Lavini-Ramos \net al., 2017), podendo também ter contribuição na imunossupressão, na EDT. \n \n \n \nFigura 5. Papel duplo de MICA como molécula alvo par a imunovigilância por células NK e como \nmediadora do escape imunológico de tumor/células estressadas . MICA expressa na superfície \ncelular como, por exemplo, de células tumorais/estressadas pode ser reconhecida pelas células NK, \npelo receptor NKG2D, promovendo uma resposta citotóxica que leva à eliminação dessas células \n(imunovigilância). No entanto, MICA pode se associar com a chaperona ERp5 e, por meio de uma \nclivagem proteolítica mediada por ADAM10, ADAM17 e MMP14, gerar sMICA, promovendo uma \nregulação ne gativa de NKG2D e comprometimento das funções efetoras das células NK, facilitando \nassim o escape imunológico do tumor/células estressadas (imunoevasão). Adaptado de Fuertes et al., \n2021 \n. \n \n MICA solúvel interage com seu receptor NKG2D, promovendo a endocitose e \ndegradação do complexo MICA -NKG2D, comprometendo assim, a atividade citolítica de \ncélulas NK e T citotóxicas (Boukouaci et al., 2013; Groh et al., 2002). Esse mecanismo de \nação parece estar envolvido em diversos tumores, como carcinoma hepático (Luo et al., \n2020), mieloma múltiplo (Zingoni et al., 2018) e câncer cervical (Arreygue-Garcia et al., 2008) \ncontribuído para a evasão tumoral. Além disso, essa interação pode resultar na expansão de \ncélulas imunossupressoras TCD4+ NKG2D+, também colaborando para evasão imune do \ntumor (Groh et al., 2006). \n\n 31 \n \nA ligação de MICA de membrana ao receptor de ativação, NKG2D, está diretamente \nrelacionada com a variação dos domínios externos da molécula e à afinidade de interação, \nque pode variar também com polimorfismos genéticos (Isernhagen et al., 2016). Algumas \nvariantes gênicas de MICA codificam proteínas com diferentes afinidades de ligação com seu \nreceptor, afetando o limiar de ativação de células NK e a modulação de células T (Isernhagen \net al., 2016). A afinidade diferencial está associada a uma substituição entre os aminoácidos \nmetionina (Met) ou valina (Val), no resíduo 129 da molécula (Steinle et al., 2001). A variante \nMICA-129Met fornece uma sinalização NKG2D mais forte, lev ando ao aumento da \ndegranulação e produção IFN -γ por células NK, em relação à variante MICA -129Val. No \nentanto, essa ligação mais forte também é capaz de desencadear mais rapidamente a \nregulação negativa de NKG2D da superfície da célula NK (internalização/degradação) e, \nportanto, diminuir ainda mais a atividade citotóxica desse receptor, via MICA (Isernhagen et \nal., 2015). No entanto, a avaliação funcional desse dimorfismo na patogênese de doenças \nrequer uma avaliação cuidadosa. \n Outro polimorfismo funcional do gene MICA envolve a inserção de nucleotí deos logo \nantes da região transmembranária da molécula (grupo de alelos MICA5.1), ocasionando uma \nalteração no quadro de leitura de bases ( frameshit) e a inserção de uma âncora de \nglicosilfostatidilinositol (GPI) (Ashiru et al., 2013). Essa âncora é respons ável pelo \nrecrutamento dessas variantes da proteína MICA para microdomínios de membrana \nresistentes a detergentes ( lipid-rafts) e, portanto, para vesículas extracelulares (exossomas) \n(Ashiru et al., 2013). Esses alelos, cujas moléculas codificadas são ancoradas por GPI, são \nfrequentemente referidos como o grupo de alelos MICA5.1, sendo muito frequentes em várias \npopulações humanas no mundo todo (Pérez-Rodríguez et al., 2002; Gao et al., 2006), sendo \no alelo MICA*008 mais frequente em várias populações, inclusive na brasileira, como relatado \npor nosso grupo (Marin et al., 2004). É impor tante destacar que, assim como MICA solúvel \nderivada da ação de metaloproteinases clivadas da membrana celular, MICA presente em \nexossomas, também pode diminuir a expressão de NKG2D (Clayton et al., 2008), \ncolaborando para a evasão imune de células tumorais e/ou infectadas. \n Níveis elevados de sMICA são encontrados em diversos tipos de cânceres, \nprincipalmente em estádios mais avançados da doença, sugerindo participar dos mecanismos \nde imunossupressão no câncer. Nesse sentido, níveis elevados de sMICA têm sido \nassociados a um pior prognóstico (Salih et al., 2002; Kumar et al., 2012), sendo considerado \num potencial marcador prognóstico em vários tipos de cânceres, segundo estudo de revisão \nsistemática e meta-análise (Zhao et al., 2017). \n Embora a EDT seja, em geral, considerada uma doença benigna, devido à sua \nestrutura histológica preservada (Cannistra, 2004), ela comparti lha características \nfisiopatológicas com o câncer, como ocorrência de invasão celular e crescimento \ndesordenado, além de neovascularização e uma diminuição no número de células em \napoptose (Swiersz, 2002). Como nas doenças malignas, os implantes endometrióticos podem \n\n 32 \n \ndisseminar-se para a cavidade abdominal e, também para locais mais distantes. As células \nendometriais ectópicas se ligam, invadem e penetram nos tecidos e, muitas vezes, se \nmanifestam como lesões profundas infiltrantes. Porém, ao contrário das lesões mali gnas, a \nEDT não resulta em um estado proliferativo ou catabólico incessante e, raramente é fatal \n(Swiersz, 2002). Não obstante, alguns estudos encontraram associações significativas entre a \nprevalência de EDT e câncer de ovário ( revisado em Heidemann et al., 2014). As citocinas \ninflamatórias TNF -α, IL -1β, e IL -6, presentes em níveis maiores no fluido peritoneal nas \nmulheres com EDT (Eisermann et al., 1988; Harada et al., 1997), também são elevadas em \nsobrenadante de cultura de epitélio de câncer ovariano, quando comparados àqueles das \nCTRs saudáveis (Szlosarek et al., 2006). \n A visão dominante na comunidade científica é considerar EDT como uma doença \ninflamatória crônica. Consider ando que MICA é uma molécula induzida em dive rsos tipos \ncelulares em condição de estresse, levantamos a hipótese de que o ambiente inflamatório \nperitoneal poderia contribuir para o estresse local favorecendo, inicialmente, o aumento da \nexpressão de MICA na superfície de células endometrióticas (estádios iniciais da doença), ou \nmesmo no endométrio eutópico alterado nessas mulheres (Brosens et al., 2012), funcionando \ncomo um “sinal de alerta biológico”. Com a evolução da doença (estádios III e IV) e, por ação \nde metaloproteinases, poderia haver liberação de MICA da forma solúvel em níveis elevados. \nNesse sentido, é sabido que lesões endometrióti cas podem produzir TGF -β (Cruz e Reis \n2015), citocina esta que também estimula a expressão de MICA na superfície celular e sua \nposterior liberação na forma solúvel (Klöß et al., 2015). MICA solúvel, por sua vez, pode \nmodular negativamente a expressão de seu receptor, NKG2D, em células NK e T CD8+, \nreduzindo a resposta citotóxica destas células. \n Corroborando esta hipótese, alguns trabalhos sugerem que fatores solúveis presentes \nno soro ou no fluido peritoneal ( microambiente das lesões) interagem com as células NK, \ninibindo a resposta efetora contra as células endometriais ectópicas. Em concordância com \nesta hipótese, o tratamento de células NK com soro de mulheres com endometriose (Kanzaki \net al., 1992; Tanaka et al., 1992), bem como com flu ído peritoneal e folicular (Oosterlynck et \nal., 1993), mostrou uma diminuição da atividade citotóxica quando comparado ao tratamento \ncom mulheres sem EDT. De maneira semelhante, fatores solúveis, ta mbém presentes no \nsobrenadante de cultura de células estromais de endométrio de mulheres com endometriose, \nforam capazes de suprimir a atividade citotóxica de células NK (Somigliana et al., 1996). \nAinda concordante com essa hipótese, foram observados níveis mais elevados de sMICA no \nfluido peritoneal de mulheres com EDT, em relação aos encontrados em mulheres CTRs, \nsem a doença (incluindo outras doenças benignas) (González-Foruria et al., 2015). \n Defeitos na habilidade de células NK e T citotóxic as em reconhecer e eliminar o \nendométrio extrauterino têm sido considerados cruciais na patogênese da endometriose e \nMICA poderia ter um papel na imunopatologia dessa doença \n\n 33 \n \n Considerando que a deficiência funcional de células NK citotóxicas tem sido impli cada \nna fisiopatologia da endometriose, e que a molécula MICA tem sua expressão celular \ninduzida por estresse biológico, levantamos a hipótese do potencial papel de MICA na \nimunopatologia da endometriose. Ademais, uma vez que sua forma solúvel (sMICA) modu la \nnegativamente a expressão de seu receptor, NKG2D, em células NK, sMICA pode ter \nenvolvimento na diminuição da atividade funcional de células NK nessa doença, contribuindo \nde forma relevante na eliminação ineficiente de tecido endometrial ectópico e para o \nestabelecimento/desenvolvimento da doença. Consideramos também que a proteína MICA, \nna sua forma solúvel, tem potencial implicação na evolução/gravidade da doença, podendo \nser modulada positivamente pelos hormônios sexuais envolvidos nas diferentes fases do ciclo \nmenstrual. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n___________________________________________________OBJETIVOS \n \n \n \n\n35 \n \n2. OBJETIVOS \n \n2.1 Objetivo geral \n \n Testar a hipótese do envolvimento de MICA na imunopatologia da endometriose, \ninclusive contribuindo para a deficiência da atividade efetora de células NK. \n \n \n2.2 Objetivos específicos \n \nDeterminar se na endometriose: \n \n 1) há perfil diferencial dos níveis de sMICA, da expressão proteica de MICA, da \nfrequência e de subpopulações de células NK circulantes: \n• em relação às diferentes fases do ciclo menstrual e potenciais efeitos hormonais \n• em relação à gravidade da doença e/ou em relação a tipos morfológicos da doença \n \n 2) há alteração da expressão gênica diferencial de MICA no endométrio eutópico, \nsugerindo a existência de algum desequilíbrio imunobiológico prévio ao deslocamento de \ntecido endometrial. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n_____________________________________________________MÉTODOS \n \n \n \n\n37 \n \n3. MÉTODOS \n \n3.1 Participantes da pesquisa \n \nAs participantes da pesquisa incluídas no estudo foram mulheres diagnosticadas com \nendometriose (grupo endometriose, EDT, n=173) e mulheres sem endometriose (grupo \ncontrole, CTR, n=86), submetidas à cirurgia laparoscópica e análise histopat ológica, \ngarantindo, portanto, a confirmação do diagnóstico da doença ou da ausência da mesma nos \nrespectivos grupos. O grupo CTR foi constituído por mulheres saudáveis submetidas à \nlaqueadura tubária ( LAQ, n=60) ou ao tratamento cirúrgico de outras doença s ginecológicas \nnão inflamatórias (DNI, n=26). \n Salientamos que, sempre que possível, as mesmas pacientes (grupos EDT e CTR) \nforam incluídas em todas as abordagens de análise deste estudo. \n Todas as mulheres incluídas neste estudo foram provenientes do Serviço de \nEndometriose do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São \nPaulo - HCFMUSP (grupo EDT) ou do Setor de Planejamento Familiar do HCFMUSP (grupo \nCTR). Foi concedida autorização prévia, com assinatura dos Termos de Consentimento Livre e \nEsclarecido-TCLE (Anexos I-A e -B), para utilização de informações clínicas, bem como para a \ncoleta do material biológico. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de \nProjetos de Pesquisa (CAPPesq, No 0505/07 e 0386/11) do HCFMUSP (Anexo II, -A, -B e -C). \n \n3.2 Casuística \n \n O número amostral, para cada abordagem experimental do estudo, foi definido com \nbase em cálculo amostral prévio, lev ando-se em conta a variabilidade dos dados (estimativa \nde desvio padrão dentro de cada grupo, em estudos já realizados), a diferença esperada entre \nos grupos, o nível de significância e o poder do teste. Foi estabelecido um nível de \nsignificância de 5% e um poder do teste de 80%. \n Para a variável contínua “concentração de MICA solúvel (pg/mL) bus camos encontrar \numa diferença entre caso e controle de 0,4, com uma variação igual a 1 (n=100). Na ausência \nde dados na literatura científica específicos para expressão gênica e proteica de MICA em \nendometriose, foram utilizados estudos de MICA em câncer. Para as variáveis expressão \ngênica-mRNA e expressão proteica, o “n” amostral estimado foi de 23, busc ando-se encontrar \numa diferença entre caso e controle de 30, com uma variação estimada de 35 (Basu et al., \n2008; Textor et al., 2008). Para a variável “análise funcional de células NK” (medida em \nporcentagem), buscamos encontrar uma diferença entre caso e controle de 10, com uma \nvariação igual a 10,5, com “n” amostral de 19 (González-Foruria et al., 2015; Oosterlynck et al., \n\n38 \n \n1992). Programa estatístico utilizado: Power Analysis Sample Size (PASS). Salientamos que \neste foi o número estimado, mas o número real de sujeitos de pesquisa atingido, para alguns \nestudos, foi maior, conforme apresentado adiante, no Desenho do Estudo (item 3.5, Figura 6). \n \n \n3.3 Dados clínicos e critérios de seleção \n \nEm relação aos dados clínicos das pacientes, as informações referentes aos tipos de \nendometriose foram obtidas a partir dos registros nos relatórios cirúrgicos, feitos em formulário \nespecífico (Anexo III). A avaliação do estádio da doença foi baseada no critério de \nclassificação da rASRM, 1996 (Canis et al., 1997) (Anexo IV). Sempre que possível, biópsias \nde endométrio coletadas durante as cirur gias tiveram a datação determinada por análise \nanatomopatológica (Anatomia Patológica do HCFMUSP), com o objetivo de determinar a fase \ndo ciclo menstrual em que se encontrava a mulher, na data da laparoscopia. Na ausência da \ndatação histológica, a fase do ciclo foi determinada contando-se os dias a partir do primeiro dia \nda data do último período menstrual, informada pela paciente. \n De acordo com o local de acometimento da doença, a endometriose foi classificada \ncomo endometriose peritoneal, endometriose ov ariana ou endometriose profunda infiltrativa \n(Nisolle e Donnez, 1997). Os grupos foram caracterizados como: SUP: lesões na superfície do \nperitônio; OVA: endometriose ovariana, com ou sem doença peritoneal e sem endometriose \nprofunda; PROF: endometriose profunda com ou sem en dometriose peritoneal e sem \nendometriose ovariana; PROF + OVA: profunda na presença de OVA. \nOs critérios adotados para a seleção das participantes da pesquisa foram os abaixo \ndescritos. \n \nCritérios de inclusão: \n• Mulheres dos grupos endometriose e controle, submetidas à cirurgia laparoscópica \n• Endometriose comprovada histologicamente, no caso do grupo EDT \n• mulheres em idade fértil, com períodos menstruais eumenorréicos, com intervalo entre \nos ciclos variando de 26-45 dias. \nCritérios de exclusão \n• Presença de sinais clínicos de doença autoimune e/ou câncer; \n• Doença inflamatória no caso do grupo CTR \n• Presença de sinais clínicos ou laboratoriais de infecção ginecológica; \n• Uso de terapia hormonal (análogos do GnRH mensais, progestágenos e contraceptivos \nhormonais) nos últimos 3 meses antecedentes à coleta da amostra, ou por seis meses com o \nuso de análogos do GnRH de ação trimestral. \n \n \n\n39 \n \n3.4 Material biológico \n Parte das amostras utilizadas neste estudo foram provenientes do “Banco de Tecidos e \nFluidos Corporais de Paci entes com Endometriose” cuja coleta de amostras teve aprovação \npela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq, nº0505/07; Anexo II-\nA) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo \n(HCFMUSP). Outra part e foi obtida de coleta prospectiva, integrante do Projeto Temático \nFAPESP2010/10338-0, “Endometriose: bases moleculares da resposta imunológica”, também \npreviamente aprovado pela comissão de Ética do HCFMUSP (CAPPesq nº 0386/11; Anexo II -\nB e -C), o qual in cluiu parte do presente estudo. A coleta e armazenamento das amostras \nseguiu o protocolo proposto pela The World Endometriosis Research Foundation (WERF) \nEndometriosis Phenome e Biobanking Harmonisation Project (EPHect) (Becker et al., 2014; \nRahmioglu et al., 2014). \n \n• Sangue periférico: \nSoro: Obtido de, aproximadamente, 5 mL de amostra de sangue coletado sem anticoagulante, \nantes da indução anestésica. As amostras de sangue foram centrifugadas a 1300g, por 10 \nminutos (min), para obtenção do soro. As alíquotas de soro foram armazenadas a -80 ºC, até o \nmomento do uso. \nUtilização: pesquisa de MICA solúvel. \nSangue heparinizado: (10-20mL) utilizado para obtenção de células mononucleares do sangue \nperiférico (PBMC, do inglês Peripheral Blood Mononuclear Cells ). As amostras de PBMC \nforam, posteriormente, criopreservadas (nitrogênio líquido) até o momento do uso. \nUtilização: análise da atividade efetora de células NK. \n• Fluido peritoneal (FP): coletado no início da laparoscopia, logo após as punções com \nos trocáteres, por meio de aspiração em seringa estéril (em média de 1 a 5mL). As amostras \nforam centrifugadas a 1300g, por 10min, para sepa ração da fração celular. Os sobrenadantes \nforam armazenados em tubos de congelamento estéreis, em freezer a - 80ºC, até o momento \ndo uso. \nUtilização: pesquisa de MICA solúvel. \n• Tecidos: \nendométrio eutópico - de mulheres dos grupos EDT e CTR \nendométrio ectópico - lesão de endometriose profunda (grupo EDT). \n A coleta de biópsia de endométrio eutópico foi realizada por aspiração, utilizando-se \nPipelle de Cornier (Laboratoire CCD, Paris, França), no início da cirurgia. Parte da lesão (EDT) \n\n40 \n \ne do endométrio eut ópico (EDT e CTR) foi encaminhada à divisão de Anatomia Patológica do \nHCFMUSP para análise histopatológica de rotina. Outra parte dos tecidos (lesão de \nendometriose profunda e endométrio eutópico) foi armazenada em criotubo e, imediatamente, \ncongelada em n itrogênio líquido e, posteriormente, transferida para freezer -80 ºC, onde \npermaneceu até o momento de uso. As amostras das lesões de endometriose profunda foram \nconstituídas de lesão de endometriose intestinal de retossigmóide ou de lesão de \nendometriose retrocervical. \nUtilização: • endométrio eutópico: análise da expressão gênica e proteica de MICA. \n • lesão de endometriose profunda: análise da expressão proteica de MICA. \n \n \n3.5 Delineamento do estudo \n \n Trata-se de um estudo analítico, observacional e t ransversal. As mulheres do grupo \nEDT foram avaliadas clinicamente, pela história, exame físico e de imagem (ultrassonografia \npélvica e/ou transvaginal e, por ressonância magnética, quando indicada) de acordo com a \nindicação clínica, para confirmação da EDT e posterior indicação cirúrgica. Uma vez \nselecionadas, as mulheres foram submetidas à laparoscopia, seguindo a rotina habitual do \nserviço de Endometriose, do HC -FMUSP. As mulheres do grupo CTR foram avaliadas, no ato \noperatório, quanto à presença macroscó pica de EDT e, em caso de suspeita, foi realizada a \ncoleta do tecido para exame histopatológico. Em caso positivo para a doença, a paciente foi \nexcluída do grupo CTR. \n Na Figura 6 apresentamos o desenho do estudo, incluindo as variáveis teóricas e \noperacionais relacionadas a cada abordagem experimental do mesmo. \n \n \n\n41 \n \n \n \nFigura 6. Desenho do estudo. Variáveis teóricas: avaliação de perfil diferencial de expressão gênica \ne proteica de MICA e dos níveis de MICA solúvel (sMICA ), sistemicamente (soro) e no microamb iente \nda lesão (fluido peritoneal), entre mulheres com EDT e controles saudáveis, e avaliação do potencial \nenvolvimento de MICA na função de células NK, na EDT. Variáveis operacionais: expressão proteica \nde MICA por imunohistoquímica; expressão gênica de M ICA por PCR quantitativa em tempo real (qRT -\nPCR), pesquisa de MICA solúvel por ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e avaliação da \natividade efetora de células NK por meio da avaliação de células NK que expressam CD107a, IFN -γ e \nIL-10 e da citotoxicidade contra células K562; EDT: grupo endometriose, CTR: grupo controle, PBMC: \ncélulas mononucleares do sangue periférico; mRNA: ácido rib onucleico mensageiro; K562: linhagem de \ncélulas de leucemia mielóide crônica humana. \n \n \n3.6 PCR quantitativa em tempo real: expressão gênica de MICA \n A análise da expressão de mRNA para o gene MICA foi realizada por qRT -PCR \n(reação de polimerização em cadeia quantitativa em tempo real) após a extração do RNA total \nde tecido de endométrio eutópico (grupo EDT e grupo CTR) e preparo da síntese de DNA \ncomplementar (cDNA). Foi também realizada a seleção dos primers (iniciadores) específicos \npara o gene MICA e primers endógenos, utilizados para o controle da expressão. \n \n \n3.6.1 Extração de RNA total \n \n As amostras de tecido endometrial (aproximadamente 100mg) foram descongeladas \nem gelo, ressuspensas em 1mL de Trizol® (solução monofásica de fenol e isotiocianato de \nguanidina ( Invitrogen, Waltham, EUA) e transferidas para tubos de 2mL (livres de \n\n42 \n \nRNase/DNase), contendo esferas metálicas ( Omni International Inc ., Kennesaw, Georgia, \nEUA) (em gelo). Em seguida, os tubos foram transferidos para o homogeneizador de tecidos \nPrecellys® (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, França). Neste equipamento, foram \nrealizados 3 ciclos de centrifugação/homogeneização a 4700g, por 15 segundos (seg), com \npausa de 20seg a cada ciclo, com temperatura (T°) mantida entre 2-8ºC, para obtenção de um \nhomogenato tecidual. \n A partir do homogenato de tecido em solução de Trizol®, deu -se prosseguimento à \nextração de RNA, segundo o protocolo do fabricante. Foram adicionados ao tubo 200µl de \nclorofórmio, seguindo-se com agitação vigorosa (15s eg) e incubação por 3min, em TA. Após \ncentrifugação por 12.000g, 15min, a 4ºC, houve separação em três fases (aquosa, interface e \norgânica). A fase aquosa, a qual contém o RNA, foi transferida para um novo tubo, onde foram \nadicionados 500µl de álcool isopropílico, seguindo-se de inversão do tubo para precipitação do \nRNA. Após incubação por 10min, TA, os tubos foram centrifugados a 12.000g, por 10min, a \n4ºC. Após o descarte do sobrenadante, foram adicionados 500µl de etanol 75%, seguindo -se \ncom centrifugação a 7500g, por 5min, a 4ºC. \n O sobrenadante foi retirado com auxílio de micropipeta e o tubo foi mantido aberto, por \n5 min, TA, para secagem do RNA, favorecendo, assim, a evaporação dos resíduos de etanol. \nEm seguida, o RNA foi ressuspenso em 10 -30µl de ág ua livre de RNase ( Thermo Fisher \nScientific, Waltham, Massachusetts, EUA). A concentração de RNA total (ng/µl) foi verificada \nutilizando-se o espectrofotômetro NanoDrop®ND-1000 (Thermo Fi sher Scientific , EUA), em \ncomprimento de onda ( ) 260nm. Além da concentração, foram ava liadas a razão das \nabsorbâncias 260/ 280nm, indicativa do grau de contaminação por proteínas (ideal= 1,8 -\n2,0), e a razão 260/230nm para avaliação de possíveis contaminantes químicos (ideal= 2,0-\n2,2). Em seguida, os tubos contendo RNA foram mantidos a -80ºC. \n \n \n3.6.2 Tratamento com DNase e análise da qualidade do RNA total \n \n Para evitar a presença de DNA contaminante, o RNA extraído foi submetido a \ntratamento com DNas e ( deoxirribonuclease; Thermo Fisher Scientific , EUA), conforme \nrecomendação do fabricante. Foram adicionadas 2U de DNase-I (1U/µl), 20U de RNaseOUTTM \n(inibidor de ribonuclease recombinante, 40U/µl) ( Thermo Fisher Scientific , EUA), 2µl de \nsolução tampão 5X Buffer 1 st Strand (Thermo Fisher Scientific , EUA), e água DEPC \n(Dietilpirocarbonato), (Sigma -Aldrich, Alemanha) quantidade suficiente para (q.s.p.) 10µl, \nseguindo-se de incubações a 37ºC, por 10min, e a 75ºC, por 5min. \n A integridade e pureza do RNA tota l foram avaliadas utilizando-se o equipamento 2100 \nBioanalyser (Agilent Technologies , EUA). Esta análise baseia -se no princípio de separação \neletroforética em matriz de gel aplicado nos capilares de um chip que contém uma mistura de \nfluoróforos e marcadore s de peso molecular. A ligação dos fluoróforos aos marcadores e ao \n\n43 \n \nRNA resulta em fluorescência que é então quantificada, permitindo a separação dos RNAs \nribossômicos 18S e 28S e a atribuição de um número de integridade (RIN, do inglês, RNA \nIntegrity Number). O valor de RIN é gerado, automaticamente, pelo programa do equipamento, \nvariando de 1-10. RNAs com valores de RIN ≥ 5 são considerados adequados para a técnica \nde qRT-PCR (Fleige e Pfaffl 2006). Após as avaliações de qualidade d as amostras de RNA \ntotal, as mesmas foram mantidas a -80ºC até o momento da sua utilização para a síntese de \ncDNA. No Anexo V, Figura 1 está um exemplo da representação gráfica da integridade de uma \namostra de RNA gerada pelo programa, bem como os valores de RIN determinados para cada \namostra (Anexo V, Tabela 1). \n \n \n3.6.3 Síntese de cDNA \n \n A síntese de cDNA (DNA complementar) foi realizada a partir de 1µg de RNA total, ao \nqual foram adicionados: 1µl de desoxinucleotí deoos trifosfatados (dNTP, a 10mM) ( Invitrogen, \nEUA), 1µl de primer OligodT18 (500 µg/mL) ( Invitrogen, EUA) e 1µl de água livre de \nDNase/RNase (volume final = 13µl), seguindo -se de incubação a 65ºC por 10min, e posterior \nmanutenção em gelo. Em seguida, foram adicionados: 4µl do tampão da enzima SuperScript® \nIII (Buffer 5x; Invitrogen, EUA), 1µl de Ditiotreitol (0,1M) ( Invitrogen, EUA), 0,5µl de \nRNaseOUTTM a 40U/µl (Invitrogen, EUA), 1µl da enzima transcriptase reversa SuperScript® III, \na 200U µl (Invitrogen, EUA) e 0,5 µl água livre de RNase/DNase (20µl de solução por tubo). \n A reação de síntese de cDNA ocorreu em 3 ciclos de incubação: 25ºC por 10min, 55ºC \npor 2h e 75ºC por 15min, em termociclador Veriti (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, \nEUA). Por fim, foi adicionado 1µl de RNaseH ( Fermentas, Waltham, Massachusetts, EUA ) a \ncada reação, com posterior incubações a 37ºC, por 30min, e a 72 ºC, por 10min. As amostras \nde cDNA foram então diluídas na proporção 1:3, em água livre de DNase/RNase e estocadas \na -20ºC, até o momento do uso para as reações de qRT-PCR. \n \n \n3.6.4 Seleção dos primers \n \n A análise de expressão do gene MICA foi realizada por qRT -PCR utilizando-se primers \n(iniciadores) específicos para o gene MICA (Martín-Pagola et al., 2003), que amplificam parte \nda região gênica que codifica para os domínios extracelulares 1 e 2 da molécula MICA, \nrespectivamente. Como gene normalizador da expressão do gene MICA, foi utilizado o gene \nendógeno, β-actina. O desenho do primer para β-actina foi realizado com o auxílio do \nprograma Primer Express ® Programa v.2.0 ( Applied Biosystems , EUA). A sequência dos \nprimers de β-actina foi extraída do banco de dados genômicos NCBI Reference Sequence , \n\n44 \n \n(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore; acesso NG_007992.1). Os primers selecionados \nrespeitaram as características de 18-25 bases, To de anelamento entre 57-61oC e conteúdo de \nbases CG de 40 -60%. No Anexo V, Tabela 2 estão apresentadas as s equências e \ncaracterísticas físico-químicas dos pares de primers utilizados. \n Após a padronização, a concentração ideal dos primers, tanto para o gene MICA como \npara o gene controle, β-actina, foi definida como 100mM, consider ando-se a menor \nconcentração onde o Ct, e o perfil da curva de amplificação, apresentaram as menores \nvariações em relação às maiores concentrações e com uma menor formação de dímeros de \nprimers. Foram também verificadas as eficiências de amplificação (Ef) desses primers, bem \ncomo foi selecionada a concentração ideal de cDNA a ser utilizada na qRT -PCR. Para o \ncálculo da Ef do produto, foi utilizada a fórmula Ef = 10 -1/a ou Ef (%) = (Ef -1) x 100 (exemplos \nde curvas de amplificação e cálculos das eficiências dos primers estão apresentadas no Anexo \nV, Figura 2). O resultado das Efs foram de 1,86 (86%) para o primer MICA e 1,91 (91%) para o \nprimer β-actina. A diluição de cDNA considerada adequada para a reação foi de 1:30. V alores \nde eficiência entre 1,8 -2,2 indicam reprodutibilidade e exatidão na cinética de amplificação \n(Pfaffl, 2001). \n \n \n3.6.5 Reações de qRT-PCR \n \n As reações de qRT -PCR foram realizadas em triplicata, em placas para leitura óptica \nde 96 poços ( Applied Biosystems, EUA) utiliz ando-se o equipamento Perkin-Elmer ABI Prism \n7500 sequence detection system (Applied Biosystems, EUA), seladas com selo adesivo óptico \n(Applied Biosystems, EUA. O reagente Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, \nEUA), possui dNTPs, enzima DNA polimerase, solução tampão, além dos fluoróforos ROXTM e \nSYBR® Green (SYBR® Green Master Mix, Applied Biosystems, EUA). A cada poço de reação \nforam adicionados 6μL do reagente Fast SYBR® Green Master Mix , 3μL da solução de \nprimers (foward e reverse) e 3 μL da amostra de cDNA diluída 1:30. A reação de amplificação \nocorreu em 40 ciclos de 15seg a 94ºC, seguida de 1min a 60ºC. \n A intensidade de fluorescência na reação foi determinada pelo cálculo do ΔRn (ΔRn = \nRn+ - Rn-), onde Rn + representa a intensidade de emissão do SYBR Green / intensidade de \nemissão do ROX, em um dado momento da reação; Rn - representa a intensidade de emi ssão \ndo SYBR Green / intensidade de emissão do ROX, antes da amplificação. O fluoróforo ROX \nfunciona como controle interno passivo na reação (emissão de fluorescência de intensidade \nconstante durante toda a reação). Durante os ciclos iniciais da reação não há produto de \namplificação, e os valores de ΔRn permanecem na linha de base (fluorescência do ROX \n>SYBR Green ). Durante a fase logarítmica da reação ocorre acúmulo dos produtos de \namplificação, levando o ΔRn a ultrapassar a linha de base. Para a quantific ação relativa foi \nestabelecido um valor de ΔRn, correspondente à linha de corte ( Threshold), ponto da curva \n\n45 \n \nonde se inicia a amplificação exponencial promovida por cada par de primers. O ciclo em que \na ΔRn cruza o ponto de corte corresponde ao “ciclo de co rte” ou Threshold Cicle ( Ct) da \namostra, é relativo à quantidade de mRNA alvo presente na amostra. \n As amostras de endométrios eutópicos (CTR e EDT) foram amplificadas para os genes \nMICA e β-actina. A expressão do gene MICA foi avaliada em relação ao gene endógeno, para \numa mesma amostra. Foi baseada no cálculo do ΔCt, onde os valores de ΔCt representam a \ndiferença de expressão entre o gene alvo (Ct MICA) e o gene endógeno (Ct β -actina). Para \ntanto, foi utilizada a formula ΔCt = Ct MICA – Ct β-actina, onde Ct representa o valor médio de Ct \nda triplicata de amostra. Desta forma, q uanto menor o valor de ΔCt, maior será a quantidade \nde mRNA do gene alvo presente na amostra. Neste estudo, optamos, em alguns resultados, \npor representar o valor do ΔCt por 1/ΔCt, de forma a facilitar a apresentação gráfica e a \ninterpretação dos resultados de expressão gênica. \n \n \n3.7 Imunohistoquímica: expressão proteica de MICA \n \n A pesquisa da proteína MICA em tecidos foi realizada pela técnica de \nimunohistoquímica, utilizando-se método imunoenzimático indireto. A identificação de antígeno \nfoi baseada no método do complexo biotina -avidina-peroxidase, com revelação com o \ncromógeno diaminobenzidina (DAB), associado a peróxido de hidrogênio. \n Nas mulheres do grupo EDT (n=29) foram ana lisadas biópsias de lesão de EDT \nprofunda (endométrio ectópico: lesão de retossigmóide ou retrocervical) e do respectivo \nendométrio eutópico. Nas mulheres do grupo CTR (n=23), foram analisadas as biópsias do \nendométrio eutópico. \n Os tecidos das biópsias ac ima descritos, já previamente fixados em formalina e \nincluídos em parafina para análise histopatológica na Divisão de Anatomia Patológica do \nHCFMUSP, foram cortados em micrótomo (aproximadamente 3μm) e montados em lâminas de \nvidro silanizadas ( Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA). Foram também preparados \ncortes histológicos adicionais para a realização da padronização da titulação dos anticorpos \n(Acs). Como controle positivo da expressão proteica de MICA, foram utilizados cortes de tecido \nde câncer ce rvical (epitelial). Os cortes e montagens das lâminas para a imunohistoquímica \ndeste estudo foram realizados pelo Laboratório de Histologia e Imuno histoquímica, \nDepartamento de Patologia da FMUSP. \n Inicialmente, as lâminas foram desparafinadas em xilol, a quente (estufa a 60-65ºC, por \n5min) e, posteriormente, submetidas a 3 banhos de xilol a frio. Seguiu -se de 2 etapas para \nhidratação, com banhos em etanol 95% e 70%, com lavagens em água corrente e água \ndeionizada a cada banho, seguindo -se de banho em ácido fórmico puro (3min) e novas \nlavagens em água corrente e água deionizada, e finalizada em tampão PBS1x. \n\n46 \n \n A recuperação antigênica foi obtida por alta T o, 125º, por 1min, em panela de pressão \n(S2800-Dakocytomation, Bensalem, Pensilvania, EUA) utilizando-se tampão citrato 10mM, \npH6. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com água oxigenada 3%, por 5min, por \nquatro vezes. Em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente, água destilada e em \nsolução tampão fosfato -salina PBS/Tween® (solução deterg ente tamponante). Após essas \netapas, foi adicionado, sobre cada corte de tecido, o Ac primário anti -MICA biotinilado (goat \nIgG Human MICA Biotinylated Antibody, BAF1300, R&D Systems, Mineápolis, Minesota, EUA), \n1:100, previamente titulado, com posterior in cubação ON, em câmara úmida (4 -8ºC). As \nlâminas foram então lavadas por 3 vezes, em solução tampão fosfato -salina PBS 1x, por 3min \ncada lavagem. Em seguida, foi adicionado o Ac secundário IgG -HRP (anti-goat IgG -HRP, do \ninglês horseradish peroxidase ) (1:10 0) e as lâminas foram incubadas, por 30min a 37ºC, \nseguindo-se de mais 3 lavagens com PBS (por 3min). Em seguida as lâminas foram imersas \nem solução de peróxido de hidrogênio associado ao cromógeno DAB (diaminobenzidina). \n Após cerca de 5min, as lâminas fo ram lavadas em água corrente, por 10min, e contra -\ncoradas com Hematoxilina de Harris, seguido de nova lavagem em água corrente, por 5min e \ndesidratadas em seguidos banhos de etanol (1min em cada): etanol 70%, etanol 95% e 3 \nbanhos de etanol 100%. As lâmina s foram então diafanizadas em 3 banhos de xilol (1min \ncada) e adicionadas as lamínulas sobre os cortes (com resina sintética), para posterior análise \nmicroscópica. Uma vez havendo a presença do antígeno MICA, o complexo resultante (biotina-\nHRP) reage com o peróxido de hidrogênio/DAB, emitindo uma coloração amarronzada. \n Como teste para controle negativo de expressão, o Ac primário foi substituído por \nsolução salina tamponada (PBS). As lâminas de controle positivo foram processadas de \nmaneira semelhante às lâminas de amostras em teste. \n \n \n3.7.1 Avaliação da expressão proteica de MICA \n \n A expressão proteica de MICA foi avaliada base ando-se em escores, de acordo com a \nintensidade de marcação (0=sem marcação; 1=fraca; 2=moderada; 3=forte) e a porcentagem \nde célu las positivas (0= negativo; 1=1 –25%; 2=26 –50%; 3=51 –75%; 4=76 –100%). Esta \nanálise foi realizada tanto para pesquisa da proteína MICA na glândula (epitélio) como no \nestroma, no mesmo tecido. O produto obtido pela multiplicação entre o escore de intensidade \ne o escore da porcentagem de células positivas (que variou entre 0 e 12) definiu o escore de \nimunorreatividade (EIR). Portanto, obtivemos um EIR para glândula e outro para estroma. \nPosteriormente, o EIR do epitélio glandular foi também categorizado como ex pressão alta ou \nbaixa, base ando-se no valor da mediana de expressão do EIR do epitélio glandular no \nendométrio eutópico do grupo CTR (baixa, ≤ mediana; alta, > mediana). A avaliação \nmicroscópica (leitura) das lâminas de imunohistoquímica foi realizada por um médico \npatologista. \n\n47 \n \n3.8 ELISA para pesquisa de MICA solúvel \n A pesquisa de MICA solúvel (sMICA) foi realizada pela técnica de ELISA (Enzyme-\nLinked Immunosorbent Assay), utilizando-se o kit comercial “ Kit Duo Set Human MICA” (R&D \nSystems, EUA), segundo o protocolo do fabricante. A pesquisa de sMICA foi realizada em soro \ne fluido peritoneal (FP), pareados, de mulheres com e sem EDT (grupo CTR). Como parâmetro \nde detecção, foi utilizada uma curva padrão para a proteína MICA ( Human MICA St andard) \nnas concen trações 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,25pg/mL, como sugerido pelo \nfabricante do kit, sendo o limite de detecção do teste considerado 31,25pg/mL. Todos os testes \n(curva padrão e amostras teste) foram realizados em duplicata. \n Para o teste, foram util izadas microplacas de alta ligação com 96 poços e fundo chato \n(Nunc MaxiSorp , Roschester, New York, EUA), que foram previamente sensibilizadas com \nanticorpo (Ac) de captura (anti -MICA humano, 2µg/mL) ( 100µl) overnight (ON), em \ntemperatura ambiente (TA). Após três lavagens (200µl cada) com tampão de lavagem [PBS 1x \n(Phosphate-Buffered Saline -solução salina tamponada; GIBCO- Life Technologies, Carlsbad, \nCalifórnia, EUA ) contendo 0,05% de Tween 20 ( Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) (pH \nfinal=7,2-7,4)], foi rea lizado o bloqueio da placa com 200 µl de tampão de diluição comercial \n(PBS com 1% albumina de soro bovino – BSA, pH=7,2-7,4; R&D Systems, EUA), seguindo-se \nde incubação por 2h, em TA. \n Após três novas lavagens com tampão de lavagem (200 µl cada), foram adic ionados \n100µl dos padrões da proteína MICA nas concentrações acima descritas, previamente diluídas \nem tampão de diluição, de acordo com o desenho de distribuição da placa. Foram também \ndistribuídos 100µl das respectivas amostras de soro e fluido peritoneal (puras, sem diluição). \nApós 2h de incubação (TA) e 3 novas lavagens com tampão de lavagem (200 µl), foram \nadicionados 100 µl do Ac de detecção (anti -MICA humano biotinilado, 400ng/mL) ( R&D \nSystems, EUA), seguindo-se de mais 2h de incubação, TA. Após lavagem , foram adicionados \n100µl de estreptoavidina conjugada com peroxidase (R&D Systems, EUA) (1:200). Após 20min \n(TA) foram realizadas novas lavagens (200 µl de tampão de lavagem) e adição de 100 µl da \nsolução de substrato enzimático [H 2O2 e tetrametilbenzidina (R&D Systems, EUA)] (1:1). Após \nincubação por 20min, em TA, a placa foi bloqueada com 50 µl de ácido sulfúrico 2N. A leitura \ndas densidades ópticas (DOs) foi efetuada a 450nm, em Leitora de ELISA ( Bio-Tek \nInstruments, Inc. - µQuant, Winooski, Vermont, EUA). \n As análises dos dados foram realizadas utilizando-se o programa KC Junior (Bio-Tek \nInstruments, Inc ., Winooski, Vermont, EUA). Para a curva padrão de sMICA foi criada uma \ncurva logística de 4 parâmetros (4 -PL), a partir da qual foram gerados os dados das \nconcentrações das amostras teste. \n Para análise estatística dos dados, valores abaixo do limite de detecção (31,25pg/mL) \nforam considerados como 30pg/mL e apresentados ao longo dos resultados como \n<31,25pg/mL. \n\n48 \n \n3.9 Atividade efetora de células NK \n \nA avaliação da atividade efetora de células NK incluiu 3 abordagens de análises: \ni) Análise quantitativa das subpopulações de células NK, frequência (%) e intensidade de \nexpressão (MFI) do receptor NKG2D, e das citocinas IFN-γ e IL-10, nessas subpopulações, na \ncondição ex vivo. \nii) Análise da atividade citotóxica pelas células NK frente a células alvo K562 (linhagem de \ncélulas de leucemia mieloide crônica humana) (Lozzio e Lozzio 1977) sem bloqueio e com \nbloqueio para a proteína MICA, na superfície celular. \niii) Análise da frequência e intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL -\n10 em subpopulações de células NK, na condição basal - sem estímulo -, na presença de \nestímulo com células alvo K562 e com células K562 bloqueadas para MICA. \nO bloqueio de MICA teve como objetivo representar a presença de MICA solúvel, uma \nvez que sua presença tem sido descrita como envolvida na diminuição/comprometimento da \natividade de células NK (Boukouaci et al., 2013; Groh et al., 2002). \nOs ensaios foram realizados utilizando-se PBMC de mulheres com EDT e de CTRs \nprovenientes de laqueadura tubária (CTRs saudáveis), como fonte de células NK efetoras, \npreviamente congeladas e mantidas em nitrogênio líquido até o momento do uso. \nA Figura 7 apresenta o esquema resumido do protocolo envolvendo as células NK. \n \n• Separação, congelamento e descongelamento de PBMCs \n \n As PBMCs foram isoladas de sangue heparinizado por meio de centrifugação por \ngradiente de densidade Histopaque 1077® (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) \n(Boyum, 1974). Inicialmente, o sangue foi diluído (1:2 a 1:3) em solução fisiológica e, \ncuidadosamente, colocado sobre 4mL de Histopaque, com posterior centrifugação (500g, \n30min). A camada da interface (células mononucleares) foi, cuidadosamente, coletada e \nlavada por 2 vezes (450g, 8min e 100g, 8min), em solução fisiológica. \n Em seguida, as células foram contadas em Câmara de Neubauer e avaliadas quanto à \nviabilidade celular, utilizando-se o corante vital Tripan-blue 0,4% (Invitrogen, EUA), na diluição \n1:2. Alíquotas de, aproximadamente, 2x10 6– 8 x10 6 células/mL foram criopreservadas em \nnitrogênio líquido, em solução contendo 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, Saint \nLouis, Missouri, EUA) e 90% de soro bovino fetal (FBS) ( GIBCO-Thermo Fisher , \nMassachusetts, EUA). \n Para o descongelamento celular, os criotubos foram retirados do nitrogênio líquido e \ncolocados em banho-maria a 37ºC, até o início do descongelamento. A inda com pequena \n“pérola” de gelo, a suspensão celular foi levemente homogeneizada e transferida para um tubo \nde 15mL com fundo cônico (Corning, Tamaulipas, México) contendo 10 mL de meio R10 [meio \nRPMI 1640 ( Roswell Park Memorial Institute Medium, GIBCO-Life Technologies , Carlsbad, \n\n49 \n \nCalifórnia, EUA), contendo 10% soro fetal bovino - FBS (do inglês, Fetal Bovine Serum , \nGIBCO- Life Technologies , EUA), 2 mM de L -glutamina ( GIBCO- Life Technologies , EUA), \n10.000U/mL penicilina -estreptomicina ( GIBCO- Life Technologies , EUA), 10mM Hepes \n(GIBCO- Life Technologies , EUA), 1mM de piruvato de sódio ( GIBCO- Life Technologies , \nCarlsbad, Califórnia, EUA), e 55 M 2 -mercaptoetanol ( GIBCO- Life Technologies , EUA)], \naquecida a 37°C. \n A suspensão celular foi centrifugada a 350g, por 8min, seguindo -se de mais uma \nlavagem (350g, 8min) em 10mL de meio R10. Após esta etapa, foi realizada a contagem de \ncélulas e análise da viabilidade celular ( Tripan-blue 0,4%; Invitrogen, EUA), em Câmara de \nNeubauer, e ajuste de concentração para cada ensaio específico. \n \n \n \n \n \n \n \n \n.\n\n50 \n \n \n \nFigura 7. Esquema resumido do protocolo para avaliação da atividade efetora de células NK, baseado na degranulação da molécul a CD107a, \nexpressão das citocinas IFN - e IL -10 e na sua atividade citotóxica. PBMC: células mononucleares do sangue periférico; ex vivo: condição após \ndescongelamento celular e descanso de 1h, 37 oC, 5% CO2, sem estímulo; E: células efetoras (PBMCs, fonte de célula s NK); A: células alvo, K562; h, hora, \nK562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína MICA; CFSE: corante fluorescente, do inglês -Carboxyfluorescein succinimidyl ester, K562*CFSE: células \nK562 marcadas com o corante fluorescente CFSE, K562*CFSEBLOQ: cé lulas K562 marcadas com CFSE e bloqueadas para a molécula MICA; marcação \nLIVE/DEAD: marcação com corante LIVE/DEAD™ FixableAqua, para avaliação da viabilidade celular. \n\n51 \n \n Parte das PBMCs descongeladas foi utilizada para imunofenotipagem de células NK , \nexpressão de NKG2D, IFN-γ e IL -10 (1-2 x 10 6 células), na condição ex vivo, e parte para o \nensaio de atividade efetora de células NK (5-10 x 106 células). \n As células para imunofenotipagem de células NK e análise de células produtoras de \ncitocinas foram incubadas por 1h, a 37oC, 5%CO2, em 4mL meio R10, em tubo de 15mL, com \ninclinação de ≈45o e tampa afrouxada (considerada condição ex vivo). \n As células para a análise de atividade efetora de células NK foram incubadas por 16 -\n18h, a 37 oC, 5%CO 2, em tubo de 15mL contendo 4mL meio R10 adicionado de 1 g/mL de \nDNase (Sigma Aldrich, EUA), mantendo a tampa afrouxada. \n \n \n3.9.1 Análise quantitativa das subpopulações de células NK e expressão do receptor \nNKG2D e das citocinas IFN-γ e IL-10, na condição ex vivo \n \n Tais análises foram realiza das por citometria de fluxo, em PBMC de mulheres com \nendometriose (n=21) e de mulheres do grupo controle (n=20). \n Após o descongelamento e descanso celular de 1h, foram adicionados 6mL de meio \nRPMI puro (q.s.p 10mL) ao tubo, seguindo -se de centrifugação ( 450g, 5min). O botão celular \nfoi ressuspenso em 1mL de PBS1x, seguido de contagem de células e a avaliação da \nviabilidade celular ( Tripan-blue 0,4%), em Câmara de Neubauer. Somente células com \nviabilidade acima de 85% foram utilizadas no experimento. \n As reações foram realizadas em tubos para citometria de fluxo, onde foram distribuídos \no volume correspondente a 5 x10 5 células, sempre que possível (mínimo de 2 x10 5 para cada \ntubo), por tubo, de acordo com o painel de anticorpos (Acs) a ser utilizado. Poster iormente, foi \nadicionado 1mL de PBS1x, seguindo -se de centrifugação ( 450g, 5min) e descarte do \nsobrenadante. Em seguida, foi realizada a marcação de antígenos de superfície celular (CD3, \nCD56, CD16 e NKG2D) e intracelulares (IFN-γ e IL-10), para cada amostra (EDT ou CTR). \n \n• Marcação de antígenos de superfície celular \n \n Para a marcação de antígenos de superfície celular, nas PBMCs, foi utilizado um painel \nde Acs, previamente titulados, contendo: anti-CD3 APC H-7 (1:30; clone SK7; BD Biosciences, \nEUA), anti -CD16 PE -Cy7 ( 1:40; clone 3G8; BD Biosciences , EUA), anti -CD56 BV421 ( 1:20; \nclone NC AM16.2; BD Biosciences , EUA), anti -NKG2D Percp Cy5.5 ( 1:30; clone1D11;BD \nBiosciences, EUA) e o marcador de vi abilidade celular LIVE/DEAD (AmCyan) (1:100; \nLIVE/DEAD™ Fixable Aqua Stain , Invitrogen, EUA). A mistura de Acs foi preparada em \nPBS1x, para um volume final de 50μl, consider ando-se as diluições de uso de cada Ac, a qual \nfoi distribuída diretamente sobre o botão celular. Como controle negativo de marcação, \n\n52 \n \nutilizamos um tubo com PBMC na ausência de qualquer marc ação com Ac (somente com o \ndiluente, PBS 1x). \n As células (PBMCs) e os Acs foram homogeneizados e incubados por 30min, em TA, \nao abrigo da luz. Após incubação, foram adicionados 500µl de PBS 1x e a suspensão celular \nfoi novamente centrifugada (450g, 5min), seguindo-se para a marcação de proteínas \nintracelulares, conforme delineamento do estudo (mapa). \n \n• Marcação de antígenos intracelulares \n \n Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e foram adicionados 100 µl do \nreagente de fixação celular A (Life Technologies, EUA), seguindo-se de incubação por 15min, \nao abrigo da luz, e posterior adição de 400µl de tampão de lavagem para citometria (PBS -1x + \n2% Soro Fetal Bovino + 0,02% Azida Sódica) e centrifugação (450g, 5min). Em seguida, foram \nadicionados 50μL de uma mistura contendo os Acs anti -IL-10 PE (1:10; clone JES3-19F1; BD \nBiosciences, EUA) e anti-IFN-γ APC ( 1:30; clone 4SW.B3; Biolegend, San Diego, Califórnia, \nEUA), diluídos na solução B de permeabilização ( Life Technologies, EUA) de acordo com o \ntítulo previamente definido em titulação. \n Como controle negativo para as fluorescências dos Acs IL -10 e IFN -, foi utilizada a \nestratégia Fluorescence Minus One (FMO), onde foram colocados todos os Acs monoclonais \ndo painel do experimento, exceto para um desses Acs, conferindo seus respectivos controles \n(Roederer, 2001). \n Após a adição da mistura de Acs intracelulares, os tubos foram incubados por 40min, \nTA, ao abrigo da luz. Em seguida, foram adicionados 400µl de tampão de lavagem para \ncitometria, seguindo -se de nova centrifugação (450g, 5min). As células foram então \nressuspensas em 400µl de tamp ão de lavagem para citometria e mantidas a 4 oC, até a \naquisição em citômetro de fluxo. \n \n• Aquisição das amostras e análise por citometria de fluxo \n \n A aquisição das amostras foi realizada no citômetro de fluxo BD FACSCanto TMII (BD \nBiosciences, EUA), utilizando-se o programa BD FACSDiva v.6.1.3 (BD Biosciences, EUA). \nInicialmente, foi realizada uma análise das condições eletrônicas e ópticas do equipamento, \nutilizando-se o reagente Cytometer Setup e Tracking (CST, BD Biosciences , EUA). Para a \ncompensação dos lasers, foi utilizada uma mistura de microesferas, negativa (sem capacidade \nde ligação; BD™ CompBead Plus Negative Control -BSA) e de microesferas que se ligam à \ncadeia leve K da imunoglobulina ( CompBeads anti -mouse IgK; BD Biosciences , EUA), as \nquais foram marcadas com os fluorocromos utilizados no ensaio. \n Em seguida, foi definida uma região em linfócitos ( gate), com base nos parâmetros de \ndispersão frontal do laser (FSC, Forward Scatter, correspondente ao tamanho celular) e de \ndispersão lateral do laser (SSC, Sider Scatter, correspondente à complexidade/granulosidade \n\n53 \n \ncelular). As células NK apresentam as mesmas características morfológicas correspondentes à \nFSC e SSC de linfócitos, tendo sido adquiridos, em citômetro de fluxo, um total mínimo de 2 x \n105 eventos (células) nesta região, para posterior análise. \n \n• Estratégia de análise \n \n A análise dos dados foi realizada utilizando-se o programa FlowJo v.10 ( Tree Star , \nAshle, Oregon, EUA). \n Inicialmente, foi selecionada a região de linfócitos, com base nos par âmetros FSC-A \n(Forward Scatter Area ) e de dispersão lateral do laser, SSC-A (Sider Scatter Area ). Em \nseguida, foi selecionada a região com células vivas, identificada com o uso do marcador de \nviabilidade LIVE/DEAD (AmCyan) (Invitrogen, EUA). Na região de c élulas vivas, foram então \nselecionadas células negativas para a marcação com o Ac anti -CD3 (CD3 -). As células de \ninteresse, NK, são caracterizadas fenotipicamente como CD3 -CD56+CD16+/-. A partir das \ncélulas CD3-, as células NK foram identificadas utilizando-se os parâmetros CD16 (eixo X) vs \nCD56 (eixo Y). A partir das células CD56 +, foram discriminadas as subpopulações CD56 bright e \nCD56dim. Dentro destas subpopulações, foram ainda discriminadas as subpopulações \nCD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-. Foram avaliadas também \nas células NK totais, que incluem: subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, \nCD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+. Para todas as subpopulações, foram \navaliadas a frequência (%) de células com expressão, e a me diana de intensidade de \nexpressão (MFI), do receptor NKG2D e das citocinas IFN -γ e IL -10. A estratégia de análise \npara determinação das subpopulações de células NK e do receptor NKG2D, está apresentada \nna Figura 8. A estratégia de análise da % de subpopulações de células NK com expressão, e a \nda intensidade de expressão para as citocinas IFN -γ e IL -10 (marcação intracelular), estão \napresentadas adiante, na Figura 9 (item 3.9.2.2). \n \n\n54 \n \n \n \n \nFigura 8. Estratégia de análise para determinação das subpopulações de células NK circulantes e \nsubpopulações NK com expressão de NKG2D, de mulheres com endometriose e controles . A) \ndispersão frontal (tamanho) (FSC -A, Forward Scatter Area ) e dispersão lateral (granularidade) (SSC -A, \nSider Scatter Area ) para determinação da região de linfócitos; B) determinação de viabilidade celular – \nseleção de células vivas; C) seleção de células CD3 - (exclusão de CD3 +); D) identificação de \nsubpopulações de células NK totais, que incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, \nCD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; E) identificação de subpopulações CD56dim e \nCD56bright; F) identificação de subpopulações CD56 dim e CD56 brigth, na presença ou ausência da \nmolécula CD16 ( CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-); G) expressão de \nNKG2D, a partir das subpopulações identificadas nas regiões apresentadas nos itens E e F. \n \n \n3.9.2 Análise da atividade efetora de células NK frente a estímulo com células K562 \n \n Como parte do ensaio funcional, as moléculas CD107a (represen tando a degranulação \nde vesículas – liberação de granzima e perforina) e das citocinas IFN - e IL-10 (representando \na ativação de células NK ), foram avaliadas quanto à suas frequências (%) e intensidades da \nexpressão (MFI) nas subpopulações de células NK, frente ao estímulo com células K562. \n Essas análises foram realizadas com PBMCs (fonte de células NK) de mulheres do \ngrupo ETD (n= 21) e do grupo CTR (n= 20) nas condições: i) frente a células K562 (estímulo \ncom células K562), ii) frente a células K562 n a presença de bloqueio para a proteína MICA \n\n55 \n \n(estímulo com células K562BLOQ), representando a presença MICA solúvel, iii) na ausência \nde estímulo (sem células K562), apenas PBMCs. \n \n \n3.9.2.1 Cultivo de células K562 e bloqueio da proteína MICA na superfície celular \n \n• Cultivo de células K562 \n \n As células K562 utilizadas neste estudo foram gentilmente cedidas pela Prof. Dra. Mari \nSogayar (Núcleo de Terapia Celular e Molecular – NUCEL, USP). Após o descongelamento \n(mesmo protocolo de descongelamento de PBMCs, item 3.9), as células foram mantidas em \nmeio R10 (garrafas de 250mL; Nunc, Rochester, New York, EUA), por 8-10 dias de cultura, \ncom troca de meio, em média, a cada 2 dias. Em seguida, as células foram recuperadas e \nlavadas por centrifugação (300g, por 8min), em meio R10, e ressuspensas em 2mL de PBS \n1x. Após esta etapa, foi realizada a contagem de células e verificação da viabilidade celular \ncom o corante vital Trypan Blue 0,4%, utilizando-se Câmara de Neubauer. Somen te \nsuspensões celulares com viabilidade acima de 85% foram utilizadas para os experimentos. \n \n• Bloqueio da proteína MICA na superfície celular \n \n Para o bloqueio da proteína MICA na superfície das células K562, foi utilizado o Ac \nanti-MICA não marcado (MAB1 300, mouse anti-human IgG 2B, clone 159227; R&D Systems, \nEUA), na diluição 1:10 (em PBS 1x), previamente titulado (ANEXO VI). Foram bloqueadas, em \nmédia, 1x10 6 células K562, para cada amostra (EDT ou CTR), para a composição dos \nensaios. Consider ando-se o nú mero de amostras a serem analisadas, o volume \ncorrespondente a 0,5 x 10 6 de células K562 foi transferido para 2 poços de uma placa estéril \nde fundo U ( Nunc, EUA). Os poços foram completados com PBS 1x (q.s.p. 200 µl), seguindo -\nse de centrifugação a 450g, p or 5min. Após o completo descarte do sobrenadante (inversão), \nforam adicionados 50µl do Ac anti -MICA 1:10, diretamente ao botão celular, seguindo -se com \nleve homogeneização, com micropipeta. Após incubação por 30min (TA), o volume de cada \npoço foi transferido para um tubo de 15m L estéril, com lavagem de cada poço (PBS 1x), para \nrecuperação celular. \n Após centrifugação (450g, por 5min), as células K562 foram ressuspensas em 1mL de \nmeio R10, seguindo -se de contagem celular e verificação da viabilidade celular (Trypan Blue \n0,4%) em Câmara de Neubauer. \n \n \n \n \n\n56 \n \n3.9.2.2 Análise da expressão de MICA em células K562 pré e pós o bloqueio de MICA \n \n A expressão da proteína MICA foi avaliada, antes e após o bloqueio de MICA, com o \nobjetivo de verificar a eficiência do bl oqueio. A expressão foi avaliada por citometria de fluxo, \nutilizando-se o Ac anti-MICA PE, previamente titulado (1:50, em PBS1x) (Anexo VI) (FAB1300, \nmouse anti-human IgG2, PE-conjugated anti-MICA, clone 159227; R&D Systems, EUA), o qual \nreconhece o mesmo epítopo antigênico do Ac anti-MICA não marcado (mesmo clone, 159227) \nutilizado para o bloqueio de MICA na superfície de células K562. Um total de 2 -5 x105 células \n(com e sem bloqueio) foi transferido para tubos de citometria de fluxo e a marcação da \nproteína MICA foi realizada segundo o protocolo de marcação para antígenos de superfície \ncelular, acima descrito (item 3.9.1). Neste mesmo teste, foi também incluído o marcador de \nviabilidade celular LIVE/DEAD (1:100, em PBX 1x). Como controle negativo de expres são de \nMICA, foi incluído apenas a suspensão celular de K562, com e sem bloqueio, na ausência de \nAc anti-MICA-PE (apenas o diluente, PBS 1x). \n A aquisição das células K562 foi realizada no citômetro de fluxo BD FACSCantoTMII \nutilizando-se o programa BD FACSDiva, v.6.1.3. Inicialmente, foi realizada a análise das \ncondições eletrônicas e ópticas do equipamento, e a compensação dos lasers (conforme item \n3.9.1) utilizando-se a mistura de microesferas BD™ CompBeads (BD Biosciences , EUA) \nmarcadas com os mesmos fluorocromos utilizados neste ensaio. \n Após a compensação dos lasers, foi realizada a aquisição de 2x 105 células K562 com \nbase nos parâmetros FSC -A ( Forward Scatter Area ) e de dispersão lateral do laser, SSC-A \n(Sider Scatter Area) considerando-se o total de células (all cells). \n \n• Estratégia de análise \n \n A análise da expressão de MICA em células K562 foi realizada utilizando-se o \nprograma FlowJo v.10 (Tree Star, EUA). A expressão foi avaliada em células K562, com e sem \nbloqueio para MICA, no conjunto total d e células adquiridas ( all cells ). Inicialmente, foi \nselecionada a região com células vivas, por meio do marcador de viabilidade LIVE/DEAD. As \ncélulas vivas são fracamente marcadas, correspondendo às células descoladas para a \nesquerda do eixo X. Na Figura 9 está apresentada a estratégia de análise da expressão de \nMICA em células K562. \n\n57 \n \n \nFigura 9. Estratégia de análise para expressão de MICA em células K562. A) células K562 totais (all \ncells), de acordo com dispersão frontal (tamanho) (FSC -A, Forward Scatter Area) e dispersão lateral \n(granularidade) (SSC-A, Sider Scatter Area); B) determinação de viabilidade celular – seleção de células \nvivas, por meio do corante LIVE/DEAD; C) região de corte para MICA: controle negativo para expressão \nde MICA; D) expressão positiva para MICA, com base na região de corte do controle negativo. \n \n \n3.9.2.3 Frequência e intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-γ e IL -10, \nnas subpopulações de células NK \n \nA frequência de células que expressam CD107a, IFN-γ e IL-10, e suas intensidades de \nexpressão, foram avaliadas em células efetoras (E): NK totais, subpopulações CD56 bright e \nCD56dim, e nas subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, nas condições: i) sem estímulo, ii) com estímulo de células alvo (A) K562, iii) \ncom estímulo de células alvo (A) K562 bloqueadas para MICA. A proporção de células E:A \npara ensaio de cocultura foi definida em ensaio prévio como 5:1 (Anexo X). \n Após o descongelamento e lavagem (item 3.9), as PBMCs foram ressuspens as em \n4mL de meio R10 com 1g/mL de DNase (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) (tubo de \n15mL) e foram mantidas em repouso por 16 -18h, em posição inclinada 45 o, com tampas \nafrouxadas, a 37°C, em incubadora umidificada e 5% de CO2. \n Após o período de incubação, as suspensões de PBMCs e de células K562, que \nestavam mantidas em cultura, foram centrifugadas (450g, 8min) e ressuspensas em meio R10, \ncontadas e verificadas quanto a sua viabilidade ( Tripan-blue 0,4%), em Câmara de Neubauer. \nParte das células K562 foram bloqueadas para a proteína MICA (K562BLOQ), segundo o item \n\n58 \n \n3.9.2.1. As células K562 tiveram sua concentração e viabilidade celular, novamente, avaliadas \napós o bloqueio para MICA. \n Uma vez avaliadas as concentrações de células vivas de PBMCs, cé lulas K562 e \nK562BLOQ, foi calculado o volume de cada suspensão celular (efetora e alvo) a ser utilizada \nno ensaio, de forma a manter a proporção E:A (PBMC:K562) de 5:1, sendo fixada, sempre que \npossível, a quantidade de 1x10 5 de células alvo. Os volumes f oram transferidos para uma \nplaca de cultura celular de 96 poços, fundo U, de acordo com o mapa do experimento. Como \ncontrole de morte celular para PBMCs e células K562 (com e sem bloqueio) e da expressão \nespontânea de CD107a e de citocinas (controle negativo) em PBMC, tanto células K562 como \nPBMC foram incluídas no ensaio sem qualquer estímulo, apenas com meio R10. Como \ncontrole positivo de morte de células alvo, foi incluído no ensaio um poço com células K562 \nacrescidas de Tween 20 (0,1% final) ( Merck& Co. , EUA). Para cada amostra de PBMC do \nestudo (EDT e CTR), sempre que possível, devido ao número limitante de células, foi incluído \num poço como controle positivo de ativação de células NK, com estímulo de PMA (forbol -12-\nmiristato-13-acetato, 1g/mL) e ionomicina (1g/mL) (Sigma Aldrich, EUA). \n Após a distribuição das células, de acordo com o mapa do experimento, foi adicionado \n1µl do Ac anti -CD107a FITC ( BD Biosciences , EUA). A adição desse Ac, no início da \ncocultura, teve como objetivo garantir que qualquer expressão de CD107, após de granulação \npela célula NK, pudesse ser detectada. A expressão de CD107 na superfície celular é uma \nmedida da degranulação (granzima e perforina) de vesículas intracelulares por linfócitos, \nincluindo células NK (Aktas et al., 2009). O volume final foi ajustado para 200µl, com meio \nR10. Em seguida, as placas foram mantidas a 37ºC, por 1h, em atmosfera de 5% CO2. \n Após este período de incubação, foram adicionados 0,5µl de brefeldina A ( BD \nGolgiPlug; BD Biosciences, EUA) e 0,5µl d e monensina ( Golgi-Stop; BD Biosciences, EUA) \nnos poços correspondentes, seguindo-se de nova incubação por mais 5 h, a 37 oC, em 5% de \nCO2. A adição de monensina tem como objetivo inibir o transporte de proteínas do retículo \ncitoplasmático para o complexo d e Golgi (Mollenhauer et al., 1990). A brefeldina A tem a \nmesma função, porém bloqueia o transporte proteico numa etapa anterior à monoensina \n(Fujiwara et al., 1988). Portanto, ambas permitem o acúmulo intracelular de proteínas, \nfacilitando sua detecção em células produtoras com a utilização de marcação florescente, na \nanálise por citometria de fluxo. \n Após a incubação total de 6h, a placa foi centrifugada (450g, 5min) e o sobrenadante \ndescartado por inversão rápida. As células foram ressuspensas em 200µl de tampão PBS1x e \ntransferidas para tubos de citometria. Após mais uma lavagem com PBS1x (45 0g, 5min), deu-\nse seguimento à marcação de antígenos de superfície e intracelulares com Acs marcados com \nfluorocromos específicos, segundo o protocolo descrito acima (item 3.9.1). \n Para a marcação de antígenos de superfície foi utilizado o mesmo painel de Acs \nutilizado no ensaio na condição ex vivo, exceto o Ac NKG2D : anti-CD3 APC H -7 (1:30), anti-\nCD16 PE-Cy7 (1:40), anti-CD56 BV421 (1:20) e o marcador de viabilidade celular LIVE/DEAD \n\n59 \n \n(1:100; LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Stain, Invitrogen, EUA). Para a marcação de IFN-γ e IL-10 \n(intracelulares) foram utilizados os mesmos Acs, previamente descritos para a condição ex \nvivo (IFN-γ APC e IL -10 PE). A marcação para CD107a ocorrera previamente, com a adição \ndo Ac anti- CD107a FITC na primeira hora de incubação da cocultura. \n Como controle negativo para as fluorescências dos Acs IL -10 e IFN-, e para CD107a \n(como parte da cocultura ), foi utilizada a estratégia Fluorescence Minus One (FMO), onde \nforam colocados todos os Acs monoclonais do painel do experimento, exceto pa ra um desses \nAcs, conferindo seus respectivos controles (Roederer, 2001). \n Após a anál ise das condições eletrônicas e ópticas do equipamento, e da \ncompensação dos lasers (já descritos no item 3.9.1), foi realizada a aquisição das células da \ncocultura (PBMC + K562) (mínimo de 2 x 105 células, em all cells) com base nos parâmetros \nFSC-A e SSC -A. A análise dos dados foi realizada utilizando-se o programa FlowJo v.10. A \nestratégia de análise está apresentada na Figura 10. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n60 \n \n \n \nIFN-γ\n3,44\n \n \nFigura 10. Estratégia de análise para determinação das subpopulações de células NK circulantes, \ncom exp ressão de C D107a, IFN -γ e IL -10, em mulheres com endometriose e controles. A) \ndispersão frontal (tamanho) (FSC -A, Forward Scatter Area ) e dispersão lateral (granularidade) (SSC -A, \nSider Scatter Area ) para determinação da região de linfócitos; B) determinação de viabi lidade celular – \nseleção de células vivas; C) seleção de células CD3 - (exclusão de CD3+); D) identificação de \nsubpopulações de células NK totais, que incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, \nCD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; E) identificação de subpopulações CD56dim e \nCD56bright; F) identificação de subpopulações CD56 dim e CD56 brigth, na presença ou ausência da \nmolécula CD16 ( CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-); G) expressão de \nCD107a, a partir das subpopula ções identificadas nos itens E e F; H) expressão de IFN -γ, a partir das \nsubpopulações identificadas nos itens E e F; I) expressão de IL -10, a partir das subpopulações \nidentificadas nos itens E e F. \n \n \n3.10 Avaliação da atividade citotóxica de células NK \n \n A capacidade citotóxica de células NK de mulheres com EDT (n=21) e de mulheres \nsaudáveis do grupo CTR (n=20) foi avaliada após cocultura de PBMC (fonte de células NK \nefetoras, E) com células alvo (A) K562 e com células K562 bloqueadas para a proteína MICA \n(K562BLOQ). O bloqueio para MICA no ensaio teve como objetivo representar a presença de \n\n61 \n \nMICA solúvel, descrito como com envolvimento na diminuição da atividade citolítica de células \nNK e T citotóxicas (Boukouaci et al., 2013; Groh et al., 2002). A análise foi realizada por \ncitometria de fluxo, avaliando-se a frequência (%) de morte das células alvo, K562. \n Inicialmente, as células K562 foram marcadas com o corante fluorescente éster \nsuccinimidílico da carboxifluoresc eína, CFSE (K562*CFSE), com o objetivo de discriminá -las \ndas PBMCs, na cocultura. Após a marcação com CFSE, parte das células foi também \nbloqueada para a molécula MICA, conforme descrito no item 3.9.2.1 \n \n \n3.10.1 Marcação das células K562 com CFSE \n \n Foram marcadas com CFSE, 2x105 células K562 vivas, para cada ensaio com paciente \n(EDT ou CTR). As células K562 que estavam sendo mantidas em cultura (8 -10 dias) foram \nrecuperadas em tubos plásticos de 15mL e lavadas por centrifugação com meio RPMI sem \nsoro (450g, 8min). Após o descarte total do sobrenadante, as células K562 foram \nressuspensas em 10mL de PBS 1x, e novamente lavadas (450g, 5min) para a eliminação de \nqualquer possível resíduo de soro (proteína) contido no meio de cultura R10 e que pudesse \ngerar ligação inespecífica com CFSE. Em seguida, as células K562 foram ressuspensas em \nPBS 1x, contadas e avaliadas quanto à sua viabilidade ( Tripan-Blue, 04%), em Câmara de \nNeubauer. \n Para a marcação de CFSE, o total de 2x10 5 células K562 vivas foi dividido em 4 tub os \nde 15mL (0,5x10 5 células cada). Os tubos foram completados para 5mL com PBS1x, e \nsubmetidos a nova centrifugação (450g, 8min). O sobrenadante de cada tubo foi \ncuidadosamente descartado, seguindo-se com inversão do tubo sobre papel absorvente, para \ndescarte total do diluente. Em seguida, foram adicionados 500µl de uma solução de CFSE \n0,3µM, diretamente sobre no botão celular, seguindo com incubação, por 10min, a 37 oC, ao \nabrigo da luz, com homogeneização após os primeiros 5min. Após esta incubação, foram \nadicionados 5mL de meio R10 à suspensão celular, com o objetivo de parar a reação. A \nsuspensão celular foi novamente incubada por mais 10min, TA, ao abrigo da luz. Em seguida, \no tubo foi centrifugado (450g, 8min) e as células K562 ressuspensas em meio R10, para \nposterior contagem e avaliação de viabilidade celular com Tripan-blue 0,4% (Câmara de \nNeubauer). Somente suspensões celulares de células K562 com viabilidade acima de 85% \nforam utilizadas no ensaio. \n \n \n \n \n \n \n\n62 \n \n3.10.2 Cocultura de PBMC: K562 (E:A) e marcação para morte celular \n \n As PBMCs de mulheres do grupo EDT e do grupo CTR foram previamente \ndescongeladas e mantidas por 16 -18h, 37oC, 5%CO2, em 4mL de meio R10 (volume final de \n4mL) com 1 g/mL de DNase (Sigma Aldrich, EUA) em tubo de 15mL, com inclinaç ão de ≈45 o \ne tampa afrouxada (obs.: mesmas amostras utilizadas na avaliação de células com expressão \nde CD107a, IFN-γ e IL-10, item 3.9.2.3). Em seguida, as células foram lavadas em meio R10 \n(q.s.p 15mL, 450g, 8min), contadas (Câmara de Neubauer) e avaliad as quanto à sua \nviabilidade celular com Tripan-blue 0,4%. Somente as suspensões de PBMCs com viabilidade \nacima de 85% foram utilizadas no ensaio. \n As células efetoras (E) PBMCs (fonte de células NK) foram então incubadas com \ncélulas alvo (A) K562 marcadas com CFSE e também com células marcadas com CFSE e \nbloqueadas para MICA, na proporção 5:1 (E:A) em placa de cultura estéril de 96 poços, fundo \nU (Nunc, EUA), conforme mapa de distribuição, previamente preparado para o ensaio. As \ncélulas foram cultivadas num volume total de 200μl de meio R10, tendo sido utilizadas 20.000 \ncélulas-alvo. Como control e positivo de morte celular, foram utilizadas células K562 na \npresença de Tween20 0,1% e, como controle de morte espontânea, foram utilizadas as células \nK562 (marcadas com CFSE, com e s em bloqueio para MICA) cultivadas apenas na presença \nde meio R10. Em cada ensaio, foi também incluído um poço contendo apenas PBMC (1x10 5 \ncélulas), de forma a avaliar a viabilidade celular no final do experimento, com a marcação do \nmarcador LIVE/DEAD AmCyan. \n Após cultura de 4h, a 37 oC, 5% de CO 2, a placa foi centrifugada (450g, 5min) e as \nsuspensões celulares (células da cocultura, células K562 e PBMC sozinhas) foram transferidas \npara tubos de citometria de fluxo, previamente identifica dos. Após lavagem com PBS1x \n(400μL) e descarte do sobrenadante, foram adicionados 50μl de uma mistura com marcador \nde viabilidade celular LIVE/DEAD (1:100), em PBS1x, diretamente sobre o botão celular. A \nmarcação seguiu o protocolo para marcação de antígenos de superfície celular (item 3.9.1). As \ncélulas K562 (controles, cultivadas somente com me io R10) foram avaliadas quanto à \nexpressão proteica de MICA, utilizando-se o Ac anti -MICA (FAB 1300, 1:50). O protocolo de \nmarcação, aquisição e análise da expressão de MICA em células K562 está descrito acima, no \nitem 3.9.2.2 \n A marcação de células K562 e K562BLOQ cultivadas sozinhas (sem PBMC) com o \nmarcador de viabilidade LIVE/DEAD indicou a frequência (%) de morte espontânea dessas \ncélulas. Quando presente na cocultura com PBMC (do grupo EDT ou CTR), a frequência (%) \nde morte de células K562 correspondeu à morte específica na amostra. A atividade citotóxica \nde células NK da amostra foi avaliada pela frequência (%) de morte de células K562, calculada \npela fórmula: \n\n63 \n \n \n \n A análise dos dados foi realizada utilizando-se o programa FlowJo v.10 e a estratégia \nde análise para citotoxicidade de células NK contra células K562 (com e sem bloqueio para \nMICA) está apresentada na Figura 11. \n \n \n \nFigura 11. Estratégia de análise pa ra determinação da atividade citotóxica de células NK contra \ncélulas K562. A) gráfico representativo de todas as células E:A adquiridas ( all cells ); B) gráfico \nrepresentativo de células K562 positivas para a marcação CSFE ( corante fluorescente éster \nsuccinimidílico da carboxifluoresceína); C) gráfico representativo de células K562 positivas para CSFE e \npara o marcador de viabilidade celular LIVE/DEAD , indicando células mortas; E: células PBMC efetoras \n(fonte de células NK); A: células alvo K562; PBMC: células mononucleares do sangue periférico. \n \n \n3.11 Análise estatística \n A análise da normalidade de distribuição dos dados foi realizada pelo teste de Shapiro-\nWilk. As comparações de variáveis contínuas e com distribuição normal foram realizadas pelo \nteste para métrico Teste t e apresentadas por média e desvio padrão. As variáveis sem \ndistribuição normal, foram analisadas pelos testes não -paramétricos Mann-Whitney ou \nKruskal-Wallis com pós -teste de comparação múltipla de Dunn ( quando mais de 2 \ncomparações) e fora m apresentadas por medianas com valores de mínimo e máximo. A \nanálise dos dados das variáveis qualitativas (nominais e ordinais) entre os grupos com e sem \nendometriose, foram comparadas pelo teste qui-quadrado ( 2) ou teste exato de Fisher, \nquando aplicável (n≤ 5). Para a análise de correlação entre os dados foi utilizado o teste não \nparamétrico de Spearman. \n Para os níveis de sMICA, no soro e no fluido peritoneal, foram criadas curvas ROC \n(Receiver Operating Characteristic) para gerar um ponto de corte co m melhor sensibilidade e \nespecificidade que pudesse discriminar as mulheres com EDT, em relação às mulheres do \ngrupo CTR. A acurácia/desempenho do teste é representada pela área sob a curva (AUC, \n\n64 \n \nArea Under Curve ), uma vez que a mesma leva em consideração todos os valores de \nsensibilidade e especificidade para cada valor da variável do teste (sMICA). Quanto maior o \npoder do teste em discriminar as mulheres com EDT, das do grupo CTR, mais a curva se \naproxima do canto superior esquerdo, no ponto que represent a a sensibilidade e 1 -\nespecificidade do melhor valor de corte (Lopes et al., 2014). Desta forma, foram considerados \nideais os valores de AUC que se mais se aproximaram de 1, sendo que valores 0,7 ≤ AUC < \n0,8 foram considerados como de discriminação aceitáveis (Tape, 2015). \n Para as análises estatísticas dos dados de sMICA, valores abaixo do limite de detecção \n(31,25pg/mL) foram considerados como 30pg/mL. \n As análises estatísticas foram realizadas no programa estatístico GraphPad Prism 6 \n(GraphPad Programa, Inc ., EUA) , exceto para a curva ROC, realizada utilizando-se o \nprograma SPSS ( Statistical Package for Social Science ), versão 22. Foram considerado s \nsignificantes os valores de p< 0,05. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n___________________________________________RESULTADOS \n \n \n \n\n66 \n \n4. RESULTADOS \n \n Na Tabela 1 estão apresentadas as características clínicas e demográficas das \nmulheres do grupo EDT e mulheres do grupo CTR, participantes do presente estudo. \n \nTabela 1. Características clínicas e demográficas das mulheres com endometriose e controles. \nVariáveis EDT (n=173) CTR (n=86) p\nIdade (mediana, min-max) 35 (21-50) 34 (21-50) ns*\nInfertilidade 87 (50,3) 0 (0,0) <0,0001\nDismenorreia 161 (93,0) 19 (22,0) <0,0001\nDispareunia de profundidade 123 (71,1) 4 (4,7) <0,0001\nDor pélvica crônica 84 (48,6) 8 (9,3) <0,0001\nAlteração intestinal cíclica 146 (84,4) 7 (8,1) <0,0001\nAlteração urinária cíclica 57 (32,9) 0 (0,0) <0,0001\nFase do ciclo\n proliferativa 24 (13,9) 42 (48,8) ns\nsecretora 44 (25,4) 32 (37,2) ns\ndesconhecida 36 (20,8) 12 (13,9)\nEstádio da EDT\nI 24 (13,9) NA\nII 42 (24,3) NA\nIII 33 (19,1) NA\nIV 74 (42,7) NA\nTipo de EDT\nSUP 13 (7,5) NA\nOVA 11 (6,4) NA\nPROF 108 (62,4) NA\nPROF + OVA 41 (23,7) NA\n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle ( laqueadura tubária, n=60 e doenças não inflamatóri as, n=26, que \nincluem: mioma, n=16; mioma na presença de cisto benigno ovariano, n=3; lise de aderências, n=1; laparoscopia \ndiagnóstica sem achado clínico, n=6); EVA: escala visual analógica de dor; estádios da endometriose de acordo \ncom Revised American S ociety for Reproductive Medicine (rASRM, 199 6); I: EDT mínima; II: EDT leve; III: EDT \nmoderada; IV: EDT grave; SUP: lesões na superfície do peritônio ; OVA: endometriose ovariana, com ou sem \ndoença peritoneal e sem endometriose profunda; PROF: endometriose profunda com ou sem endometriose \nperitoneal e sem endometriose ovariana; PROF + OVA: endometriose profunda na presença de OVA; valores \nindicados para os grupos EDT e CTR são representados pelo número em cada grupo, de acordo com a variável e \nporcentagem correspondente, em parênteses – n (%), exceto para a variável idade; NA: não se aplica; valores de p \ndeterminados pelo teste de qui-quadrado ou exato de Fischer, *valor de p determinado pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n \n \n\n67 \n \n4.1 Expressão gênica de MICA \n \n A análise de expressão do gene MICA (mRNA) foi realizada no endométrio eutópico \ndas mulheres com EDT (n=24) e de CTRs saudáveis, sem EDT e que foram submetidas à \nlaqueadura tubária (n=23). A análise foi realizada por qRT - PCR e o cálculo da quantificação \nrelativa p elo método de Pfaffl (Pfaffl, 2001), consider ando-se a eficiência individual de \namplificação de primers para o gene MICA e o gene β-actina, como gene endógeno para \nnormalização do teste. Os valores médios de Cts das triplicatas testadas referentes à \namplificação desses genes, os valores correspondentes de ΔCt e as características clínicas \ndas mulheres com e sem EDT, estão apresentados no Anexo VII, Tabela 1. \n Na Figura 12 estão apresentados os valores de 1/∆Ct nos respectivos endométrios \neutópicos. Tais valores referem -se à diferença entre as médias de Ct da expressão do gene \nMICA e do gene β-actina. A comparação da expressão gênica entre os dois gr upos não \nmostrou diferença significativa (p= 0,3427, teste de Mann-Whitney): EDT, média, 0,094 (±0,01) \ne mediana, 0,09 (0,07 -0,12, min-max); CTR, média, 0,097 (±0,01) e mediana, 0,1 (0,08 -0,13, \nmin-max). \n \n \n0 .0 5\n0 .1 0\n0 .1 5\n1 / C t s\n ( M IC A -  a c t in a )\nC T R (n = 2 3 )E D T (n = 2 4 )\np = n s\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\n \nFigura 12. Expressão de mRNA de MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose \ne de controles. Expressão de mRNA de MICA normalizada pelo gene endógeno β-actina; valores de \n∆Ct representados como 1/∆Ct; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; as barras horizontais \nrepresentam a mediana; valor de p determinado pelo teste de Mann-Whitney; ns: valor de p não \nsignificante (p≥ 0,05); os valores de ∆Ct fo ram representados por 1/∆Ct, de forma a indicarem valores \ncrescentes quanto à expressão gênica. \n \n \n A expressão do gene MICA também foi avaliada nas diferentes fases do ciclo \nmenstrual. Sete mulheres do grupo EDT estavam na fase proliferativa (1 o ao 14o dia do ciclo), \n(7/24, 29,2%), 16 na fase secretora (15 o ao 28 o dia do ciclo) (16/24, 66,7%) e, para 1 (1/24, \n4,1%), não foi possível obter a informação. No grupo CTR, 13 mulheres estavam na fase \nproliferativa (13/23, 56,5%), 7 na fase secretora (7/23, 30,4) e, em 3 casos (3/23, 13%), não foi \npossível obter a informação. Não foram observadas diferenças nos níveis de expressão de \nmRNA de MICA (1/∆C) em endométrio, tanto para o grupo EDT ( p= 0,3456) como para o \n\n68 \n \ngrupo CTR ( p= 0,2377), entre as diferentes fases do ciclo menstrual. A comparação entre os \ngrupos EDT e CTR, tanto na fase proliferativa como na secretora, também não mostrou \ndiferença da expressão do gene MICA (EDT: p= 0,7409; CTR: p= 0,0596) (teste de Mann-\nWhitney) (Figura 13). \n \nP ro lif. S e c re t. P ro lif. S e c re t. \n0 .0 5\n0 .1 0\n0 .1 5\n1 / C t s\n( M IC A -  a c t in a )\ne n d o m é trio e u tó p ic o\nE D T\ne n d o m é trio e u tó p ic o\nC T R\nn = 7 n = 1 6 n = 1 3 n = 7\np = n s\np = n s\np = n s p = n s\n \nFigura 13. Expressão do gene MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de \ncontroles, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual. Prolif: fase proliferativa (1o-14o dia); \nSecret: fase secretora (15o- 28o dia); EDT: grupo endomet riose; CTR: grupo controle; ∆Ct: diferença \nentre a expressão do gene alvo, MICA, e o gene normalizador endógeno, β-Actina; as barras horizontais \nrepresentam a mediana; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste \nde Mann-Whitney. \n \n \n4.2 Expressão proteica de MICA \n \n A análise da expressão da proteína MICA foi realizada por imunohistoquímica em 29 \nmulheres com EDT profunda e em 22 mulheres CTRs saudáveis, provenientes de laqueadura \ntubária, por laparoscopia. No grupo EDT foi realizada pesquisa da proteína MICA em tecido de \nendométrio eutópico e de lesão de EDT profunda (15 casos de lesão de retossigmóide e 14 de \nretrocervical) e, no grupo CTR, no endométrio eutópico. \n As análises foram baseadas na intensidade de expressão e fr equência de positividade \nde marcação (%) para a proteína MICA, avaliadas tanto em epitélio glandular como no \nestroma. Foi calculado um escore de imunorreatividade (EIR) para ambos (epitélio glandular e \nestroma), definido pela multiplicação do escore de int ensidade de expressão de MICA pelo \nescore de frequência da expressão de MICA (descrito em Métodos, item 3.7.1). \n \n \n4.2.1 Expressão proteica de MICA no epitélio glandular e estroma \n \n A expressão de MICA no epitélio glandular e no estroma foi baseada no EIR de MIC A \n(escore da intensidade x escore da frequência) (descrito em Métodos, item 3.7.1). A expressão \nno epitélio glandular foi maior que a expressão no estroma, tanto no endométrio do grupo CTR \n\n69 \n \n[mediana 2 (1 -8, min-max) vs 1 (0-2, min-max); p< 0,0001], como na lesão profunda de EDT \n[mediana 2 (0 -8, min -max) vs 0 (0 -3, min -max); p<0,0001] e no endométrio eutópico de \nmulheres com EDT [mediana 3 (0 -12, min-max) vs 0 (0-3, min-max), p<0,0001] (valores de p \ndeterminados pelo teste de Mann-Whitney) (Figura 14). \n Os va lores de média e mediana dos escores de imunorreatividade em glândula e \nestroma estão apresentados na Tabela 2. Na Figura 15 estão exemplos representativos da \nexpressão da proteína MICA nos tecidos de lesão endometrial e de endométrio eutópico de \nmulheres com EDT e do grupo CTR. Os escores de frequência e intensidade de expressão da \nproteína MICA em epitélio glandular e estroma, individualizados, para o grupo EDT e CTR, e \ndados clínicos estão no Anexo VIII, Tabela 1. \n \n \nL e s ã o p ro fu n d a E D T\n(n = 2 9 )\ng lâ n d u la e s tro m a\n-2\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n1 2\ne s c o re d e im u n o rre a tiv id a d e\n (E IR )\n(ep itélio )\np < 0 ,0 0 0 1\nA )\n \n E n d o m é trio e u tó p ic o E D T\n(n = 2 9 )\ng lâ n d u la e s tro m a\n-2\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n1 2\ne s c o re d e im u n o rre a tiv id a d e\n(E IR )\n(ep itélio )\np < 0 ,0 0 0 1\nB ) \n \nE n d o m é trio e u tó p ic o C T R\n (n = 2 3 )\ng lâ n d u la e s tro m a\n-2\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n1 2\ne s c o re d e im u n o rre a tiv id a d e\n(E IR )\np < 0 ,0 0 0 1\nC )\n(ep itélio )\n \n \nFigura 14. Escore de imunorreatividade para expressão proteica de MICA em glândula (epitélio) e \nestroma, e representação da expressão em endométrio eutópico. A) lesão profunda de EDT ; B) \nendométrio eutópico de mulheres com EDT; C) endométrio eutópico de mulheres CTRs saudáveis; EIR: \nescore de imunorreatividade, definido pela multiplicação do escore de intensidade de expressão de \nMICA pelo escore de frequência da expressão de MICA; as barras horizontais repre sentam a mediana; \nlinha pontilhada: valor zero para EIR; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; reação de \nimunohistoquímica; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n \n \n \n\n70 \n \nTabela 2. Escore de imunorreatividade para epitélio glandular e e stroma da expressão da \nproteína MICA, na lesão profunda de endometriose e no endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose e controles. \n \nP 86 RC 0 0 1 0 C 43 1 1\nP 99 RC 1 0 1 0 C 44 2 1\nP 103 RC 2 0 4 2 C 45 2 1\nP 104 RC 3 0 12 0 C 47 1 1\nP105 RC 4 0 8 2 C 48 1 1\nP 108 RC 6 1 6 1 C 85 1 1\nP 110 RC 2 1 12 2 C 51 2 2\nP 118 RC 3 1 12 2 C 57 1 1\nP 119 RC 6 2 2 1 C 79 1 1\nP 121 RC 6 3 2 1 C 58 2 2\nP 124 RC 8 3 6 3 C 60 2 2\nP 143 RC 1 0 1 0 C 61 1 1\nP 149 RC 0 0 6 0 C 63 2 1\nP 187 RC 6 1 1 0 C 64 2 1\nP 188 RC 1 0 1 0 C 84 2 1\nP 78 RS 6 2 6 2 C 68 1 1\nP 79 RS 3 1 3 1 C 80 2 1\nP 96 RS 1 0 9 0 C 71 8 0\nP 97 RS 2 2 1 0 C 70 4 0\nP 100 RS 1 1 3 0 C 73 8 0\nP 126 RS 0 0 3 0 C 75 8 0\nP 128 RS 8 3 2 3 C 83 4 0\nP 139 RS 0 0 2 0 C 86 4 0\nP 144 RS 3 0 6 0\nP 147 RS 1 0 2 1\nP 158 RS 2 0 12 0\nP 185 RS 1 1 1 1\nP 186 RS 1 1 3 1\nP 189 RS 4 0 8 0\nMédia \n(DP)\nMediana 2 0 3\n(min-máx) (0-8) (0-3) (0-12)\nEndométrio eutópico\n2,70 \n(2,3)\n0,87 \n(0,63)\n2,0 \n(1-8)\n1,0 \n(0-2)\nLesão Endométrio \neutópico\nTecido EIR \nGlândula\nEIR \nEstroma\nEIR \nGlândula\nEIR \nEstroma\nCódigo \nCTR\nEIR \nGlândula\nEIR \nEstroma\n0 \n(0-3)\n4,66 \n(3,85)\n3,00 \n(2,45)\n0,79 \n(1,01)\n0,79 \n(0,98)\nCódigo \nEDT\nENDOMETRIOSE CONTROLES\n \n \nID: identificação das participantes do estudo; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; RC: lesão de \nendometriose retrocervical (n=15); RS: lesão de endometriose retossigmóide (n=14); DP: desvio padrão; min: valor \nmínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; glândula: epitélio glandular; EIR: escore de imunorreatividade \n(definido pelo escore de intensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão de \nMICA). \n \n\n71 \n \n \n \nFigure 15. Exemplos representativos de expressão da proteína MICA, por imunohistoquímica, em \nlesão de retossigmóide e em endométrio eutópico de mulheres com endometriose e de \ncontroles. A) Endométrio eutópico de mulher controle saudável, controle negativo da reação; B) \nEndométrio eutópico de mulher controle saudável com marcação de MICA em epitélio glandular (EP) \n(seta); C) Endométrio eutópico de mulher com endometriose, c ontrole negativo da reação; D) \nEndométrio eutópico de mulher com endometriose com marcação de MICA em epitélio glandular (EP) e \nestroma (ES) (setas); E) Lesão de endometriose profunda de retossigmóide, controle negativo da \nreação; F) Lesão de endometriose profunda de retossigmóide, com marcação de MICA em epitélio \nglandular (EP) e estroma (ES) (setas); Objetiva 20 x. \n\n72 \n \n Na comparação da expressão de MICA entre os diferentes tecidos (EDT e/ou CTR) não \nobservamos diferenças significativas, tanto na glândula com o no estroma (teste de Mann-\nWhitney) (Figura 16): \n \n EIR glandular (epitélio glandular): \n • lesão vs endométrio eutópico EDT, p=0,1029 \n • lesão vs endométrio CTR, p=0,8925 \n • endométrio eutópico EDT vs endométrio eutópico CTR, p=0,0576 \n EIR estromal: \n • lesão vs endométrio eutópico EDT, p=0,9829 \n • lesão vs endométrio CTR, p=0,3182 \n • endométrio eutópico EDT vs endométrio eutópico CTR, p=0,3795. \n \n-1\n0\n1\n2\n3\n4\n6\n8\n1 0\n1 2\nE D T C T R\nE IR p a ra M IC A\nn o e p ité lio g la n d u la r\nn = 2 3n = 2 9\nA )\np = n s\np = 0 ,0 5 7 6 (n s )p = n s\nE p ité lio g la n d u la r\nle s ã o e n d o m é trio\ne u tó p ic o\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\n \n-1\n0\n1\n2\n3\n4\nE D T C T R\nE IR p a ra M IC A\nn o e s tro m a\nn = 2 3n = 2 9\nB )\np = n s\np = n sp = n s\nE s tro m a\nle s ã o e n d o m é trio\ne u tó p ic o\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o \nFigura 16. Comparação dos escores de imunorre atividade (EIR) de expressão de MICA na lesão \nprofunda, endométrio eutópico de mulheres dos grupos endometriose e controle. A) EIR \nglandular (epitélio); B) EIR estromal ; EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore da \nintensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; EDT: \ngrupo endometriose; CTR: grupo controle; end.: endométrio; lesão: lesão profunda de EDT; análise \nrealizada por imunohistoquímica; as barras horizontais representam a mediana; linha pontilh ada: valor \nzero para EIR; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-\nWhitney. \n \n \n Tomando-se o epitélio glandular como base de análise, foi observado que 93,1% \n(27/29) das mulheres com EDT tiveram positividade em lesão (endométrio ectópico) e 96,55% \n(28/29) em endométrio eutópico. Todos os casos positivos para expressão de MICA na lesão \nforam também positivos no endométrio eutópico, pareado. Apesar de EIRs mais baixos (não \nsignificantes), 100% das mulheres do grupo CTR (23/23) apresentaram alguma positividade no \nepitélio glandular do endométrio eutópico. \n Os escores de imunorreatividade em epitélio glandular foram também avaliados em \nrelação ao nível de expressão, “alto” ou “baixo”, tom ando-se como base a mediana de \nexpressão do grupo CTR (mediana= 2,0). Assim, consideramos escores < 2,0, como baixa \nexpressão e, > 2,0, como alta expressão. Do total de 27 casos positivos na EDT para \n\n73 \n \nexpressão de MICA na lesão, 13 (48%) foram considerados como de alta expressão e 14 \n(52%) como de baixa expressão. No endométrio eutópico das mulheres do grupo EDT, do total \nde 28 casos positivos, 17 (61%) tiveram alta expressão e 11 (39%), baixa expressão de MICA. \nNo endométrio eutópico das mulheres do grupo CTR, apesar de todos serem positivos para \nexpressão de MICA (n= 23), somente 6 (26%) tiver am alta expressão. Assim sendo, a \nfrequência de expressão proteica de MICA considerada “alta” no endométrio eutópico de \nmulheres do grupo EDT foi maior do que a frequência de expressão “alta” no endométrio do \ngrupo CTR (p= 0,0134, teste de qui-quadrado). No entanto, não foram observadas diferenças \npara as frequências de “alta” ou “baixa” expressão de MICA entre a lesão e endométrio \neutópico de mulheres com EDT ( p= 0,3495) e endométrio CTR ( p= 0,1092) (teste de qui-\nquadrado) (Figura 17). \n \nle s ã o e n d o m é tr io e n d o m é tr io \n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n P o s itiv id a d e M IC A\ne m ep ité lio g la n d u la r (% )\nb a ix a e x p re s s ã o\na lta e x p re s s ã op = 0 ,0 1 3 4\n5 2 %\n(1 4 /2 7 )\n2 6 %\n(6 /2 3 )\n7 4 %\n(1 7 /2 3 )\n6 1 %\n(1 7 /2 8 )\n3 9 %\n(1 1 /2 8 )\n4 8 %\n(1 3 /2 7 )\ne u tó p ic o\nE D T\ne u tó p ic o\nC T R\n \nFigura 17. Porcentagem de casos positivos com baixa ou alta expressão proteica de MICA no \nepitélio glandular, de acordo com os escores de imunorreatividade (EIR). Reação de \nimunohistoquímica; expressão proteica de MICA baseada na mediana do EIR do grupo controle (baixa, \n< 2; alta, > 2); análise em casos considerados positivos para expressão no epitélio (lesão profunda de \nEDT, n=27; endométrio eutópico de mulheres com EDT, n=28; endométrio eutópico de mulheres CTR, \nn=23); EDT: grupo endometriose; CT R: grupo controle; EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo \nescore da intensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão \nMICA; valor de p determinado pelo teste de qui-quadrado. \n \n \n4.2.2 Expressão proteica de MICA em relação à fase do ciclo menstrual \n \n Do total de 29 mulheres do grupo EDT estudadas para a expressão proteica de MICA, \n13 (45%) estavam na fase proliferativa (estrogênica) do ciclo menstrual e 16 (55%) na fase \nsecretora (progestacional). No grupo CTR, 16/23 (70% ) estavam na fase proliferativa e 7/23 \n(30%) na fase secretora. \n Comparamos a expressão de MICA, tanto no epitélio glandular como no estroma, nos \ndiferentes tecidos dos grupos de estudo (lesão profunda e endométrio eutópico de mulheres \ndo grupo EDT e endom étrio de mulheres do grupo CTR). Não observamos diferença na \nexpressão de MICA tanto no epitélio glandular como no estroma ( p> 0,05, teste de Mann-\n\n74 \n \nWhitney) nem na EDT (lesão vs endométrio eutópico) nem entre EDT e CTRs (lesão ou \nendométrio eutópico de mulh eres com EDT vs endométrio eutópico de mulheres CTRs) \n(Figura 18). A estatística descritiva (média e mediana) dos escores representativos no epitélio \nglandular e estroma dos grupos EDT e CTR, está apresentada no Anexo VIII, Tabela 2A. \n \n \n-1\n0\n1\n2\n3\n4\n6\n8\n1 0\n1 2\nP R O L IF E R A T IV A\n (e p ité lio g la n d u la r )\nE IR p a r a M IC A\nn o e p ité lio g la n d u la r\nA )\nE D T\nn = 1 3\nC T R\nn = 1 6\np = n s p = n s\np = n s\nle s ã o\np ro fu n d a\ne n d o m e trio\ne u tó p ic o\ne n d o m e trio\ne u tó p ic o\n \n-1\n0\n1\n2\n3\n4\n6\n8\n1 0\n1 2\nS E C R E T O R A\n(e p ité lio g la n d u la r )\nE IR p a r a M IC A\nn o e p ité lio g la n d u la r\nB )\nE D T\nn = 1 6\nC T R\nn = 7\np = 0 ,0 5 6 0 (n s ) p = n s\np = 0 ,0 5 2 6 (n s )\nle s ã o\np ro fu n d a\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o \n \n-1\n0\n1\n2\n3\n4\nP R O L IF E R A T IV A\n(e s tr o m a )\nE IR p a r a M IC A\nn o e s tro m a\nC )\nE D T\nn = 1 3\nC T R\nn = 1 6\np = n s p = 0 ,0 5 9 2 (n s )\np = n s\nle s ã o\np ro fu n d a\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\n \n-1\n0\n1\n2\n3\n4\nS E C R E T O R A\n(e s tro m a )\nE IR p a r a M IC A\n n o e s tro m a\nD )\nE D T\nn = 1 6\nC T R\nn = 7\np = n s p = n s\np = n s\nle s ã o\np ro fu n d a\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o \n \nFigura 18. Escores de imunorreatividade de expressão proteica de MICA no epitélio glandular e \nestroma na lesão profunda e endométrio eutópico de mulheres do grupo endometriose e no \nendométrio eutópico de mulheres do grupo controle, nas fases proliferativa e secretora do ciclo \nmenstrual. A) EIR de expressão de MICA no epitélio glandular, na fase proliferativa; B) EIR de \nexpressão de MICA no epitélio glandular, na fase secretora; C) EIR de expressão de MICA no estroma, \nna fase proliferativa; D) EIR de expressão de MICA no estroma, na fase secretora; EDT: grupo \nendometriose; CTR: grupo controle; EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade \nde expressão proteica de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; as barras \nhorizontais representam a mediana; f ase proliferativa: 1o– 14o dia do ciclo; fase secretora: 15 o – 30o dia \ndo ciclo; análise realizada por imunohistoquímica; linha pontilhada: valor de zero para EIR; ns: valor de p \nnão significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n Na comparação da expressão de MICA nos tecidos entre as fases do ciclo, \nconsiderando o epitélio glandular e o estroma, observamos diferenças significantes apenas \npara o grupo CTR (Figura 19). Encontramos maior expressão de MICA no epitélio glandular \n\n75 \n \ndo endométrio eutópico do grupo CTR, na fase secretora do ciclo (p= 0,0043). No entanto, \nno estroma do endométrio eutópico de CTR , observamos maior expressão de MICA na \nfase proliferativa do ciclo (p= 0,0074) (valores de p determinados pelo teste de Mann-\nWhitney). A estatística descritiva dos escores representativos nas fases do ciclo menstrual \nestá apresentada em Anexo VIII, Tabela 2B. \n \nP R O L . S E C R . P R O L . S E C R . P R O L . S E C R .\n0\n2\n4\n8\n1 2\nE IR p a r a M IC A\n n o e p ité lio g la n d u la r\np = 0 ,0 0 4 3\nA )\nle s ã o\nE D T\ne n d o m é tr io\ne u tó p ic o\nE D T\ne n d o m é tr io\ne u tó p ic o\nC T R\nn = 1 3 n = 1 6 n = 7n = 1 6n = 1 6n = 1 3\nE p ité lio g la n d u la r\np = n s\np = n s\n \nP R O L . S E C R . P R O L . S E C R . P R O L . S E C R . \n-1\n0\n1\n2\n3\n4\nE IR p a r a M IC A\n n o e s tro m a\nB )\np = 0 ,0 0 7 4\nle s ã o\nE D T\ne n d o m é tr io\ne u tó p ic o\nE D T\ne n d o m é tr io\ne u tó p ic o\nC T R\nn = 1 3 n = 1 6 n = 7n = 1 6n = 1 6n = 1 3\nE s tro m a\np = n s p = n s\n \n \nFigura 19. Comparação da expressão de MICA entre as fases proliferativa e secretora do ciclo \nmenstrual, na lesão de endometriose profunda e nos endométrios eutópicos de mulheres com \nendometriose e de controles. A ) expressão de MICA no epitélio glandular; B) expressão de MICA no \nestroma; CTR: grupo controle; PROL: fase proliferativa (1o - 14o dia do ciclo); SECR: fase secretora (15 o \n- 30o dia do ciclo); EIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão \nproteica de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão MICA; as barras horizontais \nrepresentam a mediana; linha pontilhada: valor zero para EIR; análise realizada por imunohistoquímica; \nns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n\n76 \n \n4.2.3 Expressão proteica de MICA em relação aos estádios da endometriose \n \n A expressão de MICA na lesão profunda e no endométrio eutópico de mulheres com \nEDT, considerando o epitélio glandular e estroma não mostrou perfil diferencial entre os \nestádios iniciais (I/II) e os avançados da doença (III/IV), e desses, em relação ao grupo CTR \n(p> 0,05, teste Mann-Whitney) (Figura 20). A estatística descritiva total (epitélio glandular e \nestroma) dos escores representativos dos estádios da doença está apresentada no Anexo VIII, \nTabela 2C. \n \nI/II III/IV I/II III/IV C T R\n0\n5\n1 0\n1 5\nE IR p a ra M IC A\n n o e p ité lio g la n d u la r\nle s ã o e n d o m é trio\ne u tó p ic o\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\np = n s\np = n s\np = n s\np = n s\nI/II III/IV I/II III/IV C T R\n0\n1\n2\n3\n4\nE IR p a ra M IC A\n n o e s tro m a\nle s ã o e n d o m é trio\ne u tó p ic o\ne n d o m é trio\ne u tó p ic o\np = n s p = n s\np = n s\np = n s\n \nFigura 20. Escore de imunorreatividade para a expressão da proteína MICA na lesão profunda e \nno endométrio eutópico de mulheres com EDT em estádios iniciais e avançados da \nendometriose, e no endométrio eutópico do grupo CTR. A) EIR para MICA no epitélio glandular; B) \nEIR para MICA no estroma; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle ; I / II: estádios iniciais da \nendometriose; III / IV: estádios avançados da endometrio se de acordo com a rASRM; EIR: escore de \nimunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão proteica de MICA multiplicado pelo \nescore de frequência de expressão MICA; análise realizada por reação de imunohistoquímica; ns: valor \nde p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n4.2.4 Expressão proteica de MICA na lesão profunda de retossigmóide e retrocervical \n A expressão de MICA não teve perfil diferencial entre as lesões profundas de \nretossigmóide (n=15) e retrocervica l (n=14), tanto no epitélio glandular como no estroma, \n(epitélio glandular: EDT retossigmóide vs retrocervical, p= 0,2760; estroma: EDT retossigmóide \nvs retrocervical, p= 0,9578 (Figura 21). A estatística descritiva total (média e mediana) dos \nescores representativos, de acordo com a localização da doença profunda, está apresentada \nno Anexo VIII, Tabela 2D. \n Considerando o todos os dados de expressão proteica de MICA nos grupos EDT e \nCTR, incluindo os parâmetros fase do ciclo menstrual, estádios e tipo de l esão profunda, \npodemos resumir que a expressão proteica de MICA foi maior no epitélio glandular, em ambos \nos grupos, tanto no endométrio eutópico (EDT e CTR) como na lesão profunda de EDT. No \nentanto, as principais diferenças entre os grupos foram: i) maior frequência de alta expressão \nde MICA em epitélio glandular do endométrio eutópico do grupo EDT; ii) maior expressão de \n\n77 \n \nMICA no epitélio glandular do endométrio de mulheres do grupo CTR, na fase secretora do \nciclo menstrual; iii) maior expressão de MICA no estroma do endométrio de mulheres do grupo \nCTR, na fase proliferativa do ciclo menstrual; essas diferenças ( ii e iii) são perdidas no grupo \nEDT. \nr e to s s ig m ó id e r e tr o c e r v ic a l\n-1\n0\n1\n2\n3\n4\n6\n8\nE IR p a ra M IC A\nn o e p ité lio g la n d u la r p = n s\nA )\nE D T\nn = 1 4\nE D T\nn = 1 5\nE p ité lio g la n d u la r\nr e to s s ig m ó id e r e tr o c e r v ic a l\n-1\n0\n1\n2\n3\n4\nE IR p a r a M IC A\n n o e s tro m a\np = n s\nB )\nE D T\nn = 1 4\nE D T\nn = 1 5\nE s tro m a\n \nFigura 21. Escore de imunorreatividade para a expressã o da proteína MICA em lesões profundas \nde endometriose retossigmóide e retrocervical. A) epitélio glandular; B) estroma; EIR: escore de \nimunorreatividade, definido pelo escore de intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de \nfrequência de expre ssão MICA; análise realizada por imunohistoquímica; as barras horizontais \nrepresentam a mediana do EIS; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo \nteste de Mann-Whitney. \n \n \n4.3 Pesquisa de MICA solúvel \n \n A pesquisa de MICA sol úvel (sMICA) foi realizada por ELISA, no soro e no FP, de 161 \nmulheres com EDT (média etária de 34,85 anos ± 6,29) e de 76 mulheres CTRs saudáveis \n(média etária de 35,48 anos ± 6,73). O grupo CTR foi composto de 50 mulheres submetidas à \nlaparoscopia para l aqueadura tubária (LAQ) e por 26 mulheres submetidas à \nvideolaparoscopia, por presença de doença ginecológica não inflamatória (DNI) ou para \nlaparoscopia diagnóstica (descrito no item 3.1), mas sem EDT. Para as análises estatísticas, \nos valores abaixo do l imite de detecção (31,25pg/mL) , foram uniformizados como 30pg/mL e, \ndescritos, ao longo dos resultados, como < 31,25pg/mL. \n Com o objetivo de avaliar a homogeneidade do grupo CTR, foi realizada, inicialmente, \numa análise estatística entre os dois “subgrupo s” de CTRs (LAQ e DNI), não tendo sido \nobservadas diferenças entre os mesmos (soro e FP, p≥ 0,05, Teste de Mann Whitney ), \nconfirmando tratar-se de um grupo CTR homogêneo e válido considerá -lo conjuntamente para \no presente estudo (Anexo IX, Figura 1). \n \n \n \n\n78 \n \n4.3.1 Níveis de sMICA no soro e fluido peritoneal em mulheres com endometriose e \ncontroles \n \n Os ní veis de sMICA identificados nas mulheres com EDT foram maiores no FP \n(mediana 60, 30–893 min-max) em comparação aos níveis séricos (mediana < 31,25; < 31,25-\n55 min-max; p< 0,0001). Esta mesma diferença foi observada no grupo CTR (FP, mediana <3 \n1,25, <3 1,25–239 min-max; soro, mediana < 31,25, < 31,25-82 min-max, p< 0,0001) (valores \nde p determinados pelo teste de Mann-Whitney) (Figura 22 e Tabela 3). \n \nS o r o F P\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 5 0\n5 0 0\n7 5 0\n1 0 0 0\np < 0 ,0 0 0 1\nE D T (n = 1 6 1 )\ns M IC A (p g /m L )\nA )\n3 1 ,2 5\n \nS o r o F P\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n3 0 0\n4 0 0\np < 0 ,0 0 0 1\nC T R (n = 7 6 )\ns M IC A (p g /m L )\nB )\n3 1 ,2 5 \nFigura 22. Distribuição dos níveis de sMICA (pg/m L) no soro e fluido peritoneal (FP) de mulheres \ncom endometriose (EDT) e controles (CTR). A) níveis de sMICA em mulheres com EDT; B) níveis de \nsMICA em mulheres CTR; ensaio realizado por ELISA; a linha tracejada representa o limite inferior de \ndetecção do teste (31,25pg/mL); as barras horizontais representam a mediana; valores de p \ndeterminados pelo teste Mann–Whitney. \n \nTabela 3. Níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres com \nendometriose e de controles. \n \nMediana (min-max) p\nCTR (n=76)\nSoro <31,25 (<31,25-82,0)\nFP <31,25 (<31,25-239,0)\nEDT (n=161)\nSoro <31,25 (<31,25-155,0)\nFP 60 (<31,25-893,0)\n46,56 (±23,86) <0,0001120,50 (±149,40)\nsMICA (pg/mL)\nMédia (±DP)\n<31,25 (±6,36) <0,000152,48 (±44,79)\n \nEDT: grupo endometriose; C TR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peritoneal; DP: desvio padrão; \nmin: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; n: número de amostras analisadas em cada \ngrupo; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n Foi observada correlação positiva entre os níveis de sMICA, no soro e no FP, em \nambos os grupos (EDT, r= 0,5, p< 0,0001; CTR, r= 0,3, p= 0,004; teste de correlação de \nSpearman) (Figura 23). \n \n\n79 \n \n0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0\n0\n2 0 0\n4 0 0\n6 0 0\n8 0 0\n1 0 0 0\nr= 0 ,5\np < 0 ,0 0 0 1\ns M IC A (p g /m L ) n o s o ro\ns M IC A (p g /m L ) n o F P\n3 1 ,2 5\nA ) E D T (n = 1 6 1 )\n \n0 5 0 1 0 0\n0\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\nr= 0 ,3\np = 0 ,0 0 4\ns M IC A (p g /m L ) n o s o ro\ns M IC A (p g /m l) n o F P\n3 1 ,2 5\nC T R (n = 7 6 )B ) \nFigura 23. Análise de correlação entre os níveis de sMICA no soro e no fluído peritoneal (FP), em \nmulheres com endometriose (EDT) e controles (CTR). A) mulheres com EDT; B) mulheres CTRs; \nensaio realizado por ELISA ; o limite mínimo de detecção do teste foi de 31,25pg/mL; valores de r e p \ndeterminados pelo teste de correlação de Spearman. \n \n Os níveis de sMICA foram maiores na EDT do que no grupo CTR, tanto no soro ( p= \n0,0004) como no FP (p< 0,0001) (Teste de Mann-Whitney) (Figura 24). \n \nE D T C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\nS o ro\n n = 1 6 1 n = 7 6\np = 0 ,0 0 0 4\ns M IC A (p g /m L )\n3 1 ,2 5\nA )\n \nE D T C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n2 5 0\n5 0 0\n7 5 0\n1 0 0 0\nF lu id o p e rito n e a l\n n = 1 6 1 n = 7 6\np < 0 ,0 0 0 1\ns M IC A (p g /m L )\n3 1 ,2 5\nB ) \nFigura 24. Distribuição dos níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres \ncom endometriose e de controles. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; sMICA: MICA \nsolúvel; A) níveis de sMICA no soro; B) níveis de sMI CA no fluido peritoneal; ensaio realizado por \nELISA; a linha tracejada representa o limite mínimo de detecção do teste (31,25pg/mL); a s barras \nhorizontais representam a mediana; valores de p determinados pelo teste Mann-Whitney. \n \n \n4.3.2 Níveis de sMICA nos diferentes estádios da endometriose \n \n Os níveis de sMICA, no soro e FP, foram comparados entre mulheres em estádios \niniciais (I/II, n=6 4) e avançados (III/IV, n=97) da EDT, e desses em relação ao grupo CTR \n(n=76). \n Análise geral entre os 3 grupos (CTR, EDT I/ II e EDT III/IV) mostrou diferenças nos \nníveis de sMICA entre eles, tanto no soro ( p= 0,0006) como no FP ( p< 0,0001) (teste de \nKruskal-Wallis). Na análise comparativa entre 2 grupos, não houve diferença nos níveis de \nsMICA entre estádios iniciais e avançados da doença (p≥ 0,05) (Figura 25) (soro e FP). Porém, \n\n80 \n \ntanto mulheres em estádios iniciais como em estádios avançados apresentaram níveis de \nsMICA maiores do que CTRs saudáveis (soro e FP) (EDT inicial vs CTR: soro, p= 0,0114; FP, \np= 0,0052) (EDT avançada vs CTR: soro, p= 0,0001; FP, p< 0,0001) (teste de Mann-Whitney) \n(Figura 25). Valores de média e mediana dos grupos analisados estão apresentados no Anexo \nIX, Tabela 1. \n \nI / II III / IV C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n S o ro\np = 0 ,0 1 1 4\np = 0 ,0 0 0 1\nn = 7 6n = 6 4 n = 9 7\nA )s M IC A (p g /m L )\n3 1 ,2 5\np = n s\n \nI / II III / IV C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n2 5 0\n5 0 0\n7 5 0\n1 0 0 0 p < 0 ,0 0 0 1\np = 0 ,0 0 5 2\ns M IC A (p g /m L )\nB )\n3 1 ,2 5\nn = 7 6n = 6 4 n = 9 7\nF lu id o p e rito n e a l\np = n s \nFigura 25. Comparação dos nívei s MICA solúvel entre mulheres em estádios iniciais (I/II) e \navançados (III/IV) da endometriose e controles, no soro e no fluido peritoneal. A) níveis de sMICA \nno soro; B) níveis de sMICA no FP; ensaio realizado por ELISA ; sMICA: MICA solúvel; CTR: grupo \ncontrole; FP: fluido peritoneal; linha tracejada: limite inferior de detecção do teste (31,25pg/mL); estádios \nde acordo com a rASRM; as barras horizontais representam a mediana; valores de p determinados pelo \nteste de Mann-Whitney; ns: não significante. \n \n \n A comparação dos níveis de sMICA entre os quatro diferentes estádios da EDT (I, \nn=24; II, n=40; III, n=34; IV, n=63) e o grupo CTR também mostrou diferença significativa, tanto \nno soro como no FP ( p = 0,0004 e p < 0,0001, respectivamente; Teste de Kruskal-Wallis). No \nentanto, observamos que mulheres em estádios II, III e IV mostraram níveis mais elevados de \nsMICA (soro e FP), em relação ao grupo CTR ( p< 0,05) (Figura 26) e mulheres em estádio \ninicial mínimo (I) tiveram níveis de sMICA sem diferença estatísti ca em relação àqueles do \ngrupo CTR (soro e FP; p≥ 0,05) (Figura 26) (teste de Mann-Whitney). \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n81 \n \nI II III IV C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\nS o ro\np = 0 ,0 0 0 3\np = 0 ,0 0 6 7\np < 0 ,0 0 0 1\ne s tá d io s E D T\ns M IC A (p g /m l)\nn = 7 6n = 2 4 n = 4 0 n = 3 4 n = 6 3\n A )\n3 1 ,2 5\nF lu id o p e rito n e a l\nI II III IV C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n5 0 0\n1 0 0 0\ne s tá d io s E D T\np = 0 ,0 0 0 4\np < 0 ,0 0 0 1\np = 0 ,0 0 6 7\ns M IC A (p g /m l)\nn = 7 6n = 2 4 n = 4 0 n = 3 4 n = 6 3\n3 1 ,2 5\nB )\n \nFigura 26. Níveis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com endometriose \nem diferentes estádios da endometriose e em controle s. A) níveis de sMICA no soro; B) níveis de \nsMICA no fluido peritoneal; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; I: \nEDT inicial, mínima; II, EDT inicial, leve; III: EDT avançada, moderada; IV: EDT avançada, grave - \nestádios de aco rdo com a rASRM; ensaio realizado por ELISA; linha tracejada: limite inferior de \ndetecção do teste (31,25pg/mL), as barras horizontais representam a mediana; valores de p \ndeterminados pelo teste de Mann–Whitney. \n \n \n4.3.3 Níveis de sMICA nas diferentes fases do ciclo menstrual \n \n No grupo EDT, 62 mulheres estavam na fase proliferativa e 99 na secretora do ciclo \nmenstrual. No grupo CTR, 37 mulheres estavam em fase proliferativa e 29 na secretora; para \n10 mulheres não foi possível obter a informação. \n No grupo CTR, foram observados níveis de sMICA maiores no soro, na fase \nsecretora (progestacional) do ciclo, em relação à fase proliferativa ( p= 0,0389). No FP, não \nforam observadas diferenças entre as diferentes fases do ciclo menstrual ( p= 0,4522) \n(Figura 27). Os valores de p foram determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n No grupo EDT, não foram observadas diferenças nos níveis de sMICA entre as \ndiferentes fases do ciclo menstrual, tanto no soro ( p= 0,7472) como no FP ( p= 0,4053), \nsendo mantidos os maiores níveis no FP (Figura 27). \n Na análise comparativa dos níveis de sMICA entre os grupos, observamos os maiores \nníveis de sMICA no FP do grupo EDT, independentemente da fase do ciclo (Proliferativa: FP, \nEDT vs CTR, p= 0,0278; Secretora: FP, EDT vs CTR, p= 0,0003). No ent anto, no soro, os \nmaiores níveis de sMICA, em relação ao grupo CTR ocorreu na fase proliferativa (estrogênica) \ndo ciclo, (Proliferativa: soro, EDT vs CTR, p= 0,0012; Secretora: Soro, EDT vs CTR, p= \n0,1056, ns) (Figura 28) (teste de Mann-Whitney). \n \n\n82 \n \np ro life ra tiv a s e c re to ra p ro life ra tiv a s e c re to ra\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n5 0 0\n1 0 0 0\nS o ro F P\ns M IC A (p g /m L )\nn = 6 2 n = 6 2n = 9 9 n = 9 9\n3 1 ,2 5\nA ) E D T\np = n s\np = n s\np ro life ra tiv a s e c re to ra p ro life ra tiv a s e c re to ra\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n3 0 0\ns M IC A (p g /m L )\n3 1 ,2 5\nS o ro F P\nn = 3 7 n = 3 7n = 2 9 n = 2 9\nB ) C T R\np = 0 ,0 3 8 9\np = n s\n \nFigura 27. Distribuição dos níveis de MICA solúvel, no soro e fluido peritoneal (FP) de mulheres \ncom endometriose e de controles, nas diferentes fases do ciclo menstrua l. A) níveis de sMICA em \nmulheres com EDT ; B) níveis de sMICA no grupo CTR; fase p roliferativa: 1 o– 14o dia do ciclo; fase \nsecretora: 15o – 30o dia do ciclo; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; análise realizada por \nELISA; a linha tracejada indica o limite inferior de detecção do teste (31,25pg/mL); as barras horizontais \nrepresentam as medianas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05 ); valor de p determinado teste de \nMann–Whitney. \n \nE D T C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\nP ro life ra tiv a : s o ro\ns M IC A (p g /m L )\n3 1 ,2 5\nA )\np = 0 ,0 0 1 2\nn = 6 2 n = 3 7\n \nE D T C T R\n0\n1 0 0\n2 0 0\n4 0 0\n8 0 0\ns M IC A (p g /m L )\n3 1 ,2 5\nB )\np = 0 ,0 2 7 8\nn = 6 2 n = 3 7\nP ro life ra tiv a : F P \nE D T C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n S e c re to ra : s o ro\ns M IC A (p g /m L )\n3 1 ,2 5\nC )\nn = 9 9 n = 2 9\np = n s\n \nE D T C T R\n0\n1 0 0\n2 0 0\n4 0 0\n8 0 0\nS e c re to ra : F P\ns M IC A (p g /m L )\n3 1 ,2 5\nD )\np = 0 ,0 0 0 3\nn = 9 9 n = 2 9 \nFigura 28. Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL), no soro e no fluido peritoneal, de mulheres \ncom endometriose e de controles saudáveis, nas fases proliferativa e secretora do ciclo \nmenstrual. A) e B) níveis de sMICA na fase proliferativa do ciclo, no soro e FP, respectivamente; C) e \nD) níveis de sMICA na fase secretora do ciclo, no soro e FP, respectivamente; fase proliferativa: 1o - 14o \ndia do ciclo; fase secretora: 15 o - 30o dia do ciclo; ensaio realizado por ELISA; sMICA: MICA solúvel, FP, \nfluido peritoneal; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; a linha tracejada indica o limite de \ndetecção do teste (31,25pg/mL); as barras horizontais representam as mediana; ns: valor de p não \nsignificante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann–Whitney. \n \n \n\n83 \n \n4.3.4 Níveis de sMICA em relação aos tipos de endometriose \n \n Os níveis de sMICA ( soro e FP) foram analisados de acordo com os tipos de \nendometriose. Com base nesse parâmetro, as mulheres foram agrupadas em: EDT peritoneal \nsem outros locais de acometimento (SUP, n=13), EDT ovariana, com ou sem doença \nperitoneal e sem EDT profunda (OVA, n=11), EDT profunda, com ou sem doença peritoneal e \nsem doença ovariana (PROF, n=99) e PROF na presença de OVA (PROF + OVA, n=38). \nNa comparação entre o grupo EDT e o grupo CTR, foram observadas diversas \ndiferenças nos níveis de sMICA, tanto no soro como n o FP (Figura 29). Os valores de p foram \ndeterminados pelo teste de Mann–Whitney. \nSoro: maiores níveis em: OVA ( p= 0,0041), PROF ( p= 0,0033) e PROF +OVA ( p< 0,0001), \ncomparativamente ao grupo CTR \nFP: maiores níveis em: OVA ( p= 0,0223), PROF ( p= 0,0004) e PROF +OVA ( p< 0,0001), \ncomparativamente ao grupo CTR \nDestacamos que os níveis mais elevados foram observados na presença de doença \nprofunda (PROF e PROF+OVA). No entanto, devemos considerar que a presença de doença \nprofunda foi mais frequente do que as de mais formas e, a maior parte das mulheres (97/161, \n60,2%) apresentava estádio mais grave da doença (III/IV), onde ocorreu maior frequência de \ndoença profunda, conforme apresentado na Tabela 4. Não foi observada diferença entre os \nníveis de sMICA (soro e FP ) entre mulheres com doença SUP e mulheres do grupo CTR \n(p≥0,05) (Figura 29). \n \n \nTabela 4 . Distribuição das lesões de endometriose segundo os tipos e estádios da \nendometriose \n \n I/II III/IV\nTipos EDT n (%) n (%)\nSUP 13 (8,1) NA\nOVA 0 (0,0) 11 (6,8)\nPROF 50 (31,1) 49 (30,4)\nPROF+OVA 1 (0,6) 37 (23,0)\nTotal 64 (39,8) 97 (60,2)\nEstádios \n \nEDT: endometriose; SUP: lesão superficial; OVA: EDT ovariana, com ou sem doença peritoneal e sem EDT \nprofunda; PROF: EDT profunda com o u sem EDT peritoneal e sem EDT ovariana; OVA+PROF: PROF na \npresença de OVA; NA: não se aplica devido à ausência de casos nesta condição; I/II: estádios iniciais \n(mínimo/leve) da endometriose; III/IV: estádios avançados (moderado/grave) da endometriose, de acordo \ncom a rASRM; n: número de amostras analisadas em cada grupo. \n \n \n\n84 \n \nS U P O V A P R O F P R O F + O V A C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\nn = 1 3 n = 1 1 n = 9 9 n = 3 8\ns M IC A (p g /m L )\nA )\n3 1 ,2 5\nn = 7 6\np = 0 ,0 0 4 1\np = 0 ,0 0 3 3\np < 0 ,0 0 0 1\nS o ro\np = n s\n \n \nS U P O V A P R O F P R O F + O V A C T R\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n5 0 0\n1 0 0 0\nn = 1 3 n = 1 1 n = 9 9 n = 3 8\ns M IC A (p g /m L )\nB )\n3 1 ,2 5\nn = 7 6\np = 0 ,0 2 2 3\np = 0 ,0 0 0 4\np < 0 ,0 0 0 1\nF lu id o p e rito n e a l\np = n s\n \nFigura 29. Distribuição dos níveis de sMICA (pg/mL) no soro e no FP de mulheres com \nendometriose de acordo com o local de acometi mento da doença, e no grupo controle. EDT: \ngrupo endometriose; CTR: grupo controle; SUP: EDT superficial; OVA: EDT ovariana; PROF: EDT \nprofunda; PROF+OVA: EDT profunda na presença de EDT ovariana; e nsaio realizado por ELISA; a \nlinha tracejada indica o limi te inferior de detecção do teste (31,25pg/mL); as barras horizontais \nrepresentam as medianas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05 ); valores de p determinados pelo \nteste de Mann–Whitney. \n \n \nOs valores das concentrações de sMICA (soro e FP) e os dados clínicos \nindividualizados de ambos os grupos estudados estão apresentados no Anexo IX, Tabela 2. \nNo Anexo IX, Tabela 3, estão apresentadas as concentrações (média e mediana) de sMICA no \nsoro e fluido peritoneal, de acordo com a fase do ciclo menstrual (3A), estádio e tipos de \nendometriose (3B). \n \n \n \n \n\n85 \n \n \n4.3.5 Níveis de sMICA e expressão gênica de MICA \n \n Analisamos a ocorrência, ou não, de correlação entre os níveis de sMICA (soro e FP) e \na expressão do gene MICA. No grupo EDT, das 24 mulheres avaliadas para expressão de \nmRNA de MICA (Resultados, Item 4.2), 16 também foram avaliadas para os níveis de sMICA \nNo grupo CTR, 14/23 foram avaliadas tam bém para os níveis de sMICA (soro e FP). No \nentanto, em ambos os grupos não observamos correlação ( p≥ 0,05, teste de correlação de \nSpearman) (Figura 30). A análise da expressão do gene MICA em relação aos estádios da \ndoença não foi realizada, pois a maior parte de mulheres (23/24, 95,8% ) estava em estádio \navançado da doença (III e IV). \n \n0 .0 6 0 .0 8 0 .1 0 0 .1 2 0 .1 4\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 / C t m R N A M IC A\n e n d o m é t r io e u t ó p ic o\ns M IC A s o r o ( p g /m L )\np = n s\nA ) E D T (n = 1 6 )\n \n0 .0 6 0 .0 8 0 .1 0 0 .1 2 0 .1 4\n0\n2 0 0\n4 0 0\n6 0 0\n8 0 0\n1 / C t m R N A M IC A\ne n d o m é t r io e u t ó p ic o\ns M IC A F P ( p g /m L )\np = n s\nB ) E D T (n = 1 6 ) \n0 .0 7 0 .0 8 0 .0 9 0 .1 0 0 .1 1 0 .1 2 0 .1 3\n0\n5\n1 01 0\n2 0\n3 0\n1 / C t m R N A M IC A\ne n d o m é t r io e u t ó p ic o\ns M IC A s o r o ( p g /m L )\np = n s\nC ) C T R (n = 1 4 )\n \n0 .0 7 0 .0 8 0 .0 9 0 .1 0 0 .1 1 0 .1 2 0 .1 3\n0\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\n1 / C t m R N A M IC A\ne n d o m é t r io e u t ó p ic o\ns M IC A F P ( p g /m L )\np = n s\nD ) C T R (n = 1 4 ) \n \nFigura 30. Análises de correlação entre os valores de 1/∆C t para mRNA de MICA no endométrio \neutópico de mulheres com endometriose e de controles, e os níveis de MICA solúvel. A) 1/∆Ct no \nendométrio EDT vs sMICA no soro; B) 1/∆Ct no endométrio EDT vs sMICA no FP; C)1/∆Ct no \nendométrio CTR vs sMICA no soro; D) 1/∆Ct no endométrio CTR vs sMICA no FP; EDT: grupo \nendometriose; CTR: grupo controle; FP: fluido peritoneal; sMICA: MICA solúvel; níveis de sMICA \ndeterminados por ELISA; ∆Ct: diferença entre a expressão do gene alvo, MICA, e o gene normalizador \nendógeno, β-Actina; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de \ncorrelação de Spearman. \n \n\n86 \n \n4.3.6 Análise de correlação entre os níveis de sMICA e a expressão de MICA in situ \n \n A análise de correlação entre a expressão proteica in-situ de MICA (lesão e endométrio \neutópico do grupo EDT, e endométrio eutópico do grupo CTR) e os níveis de sMICA (soro e \nFP) foi realizada em 23 mulheres do grupo EDT e em 17 mulheres do grupo CTR, \nconsiderando-se os EIRs em glândula e estroma. Não foi observada correlação entre os níveis \nde sMICA, tanto do soro, como do FP, e a expressão proteica in-situ de MICA na lesão e no \nendométrio eutópico de mulheres com EDT, tanto em glândula como em estroma. No entanto, \nfoi observada correlação positiva entre os níveis de s MICA no soro de mulheres CTR e a \nexpressão de MICA no epitélio glandular (r= 0,7, p= 0,0063; teste de correlação de Spearman) \n(Figura 31). Não foi observada correlação entre sMICA no FP e expressão de MICA em \nepitélio glandular, nem entre os níveis de sMIC A, tanto do soro, como do FP, e a expressão \nproteica in-situ de MICA no estroma. Na Figura 31 estão apresentados alguns exemplos de \nanálise de correlação (análise de correlação de Spearman). \n \n0 5 1 0 1 5\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nE IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r)\n e n d o m é trio e u tó p ic o\ns M IC A s o ro (p g /m L )\np = n s\nA ) E D T (n = 2 3 )\n0 5 1 0 1 5\n0\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\n4 0 0\n5 0 0\nE IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r)\n e n d o m é trio e u tó p ic o\ns M IC A F P (p g /m L )\np = n s\nB ) E D T (n = 2 3 )\n0 2 4 6 8 1 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nE D T (n = 2 3 )\nE IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r)\nL e s ã o\ns M IC A s o ro (p g /m L )\nC )\np = n s\n \n0 2 4 6 8 1 0\n0\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\n4 0 0\n5 0 0\nE IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r)\nL e s ã o\ns M IC A F P (p g /m L )\nE D T (n = 2 3 )D )\np = n s\n0 2 4 6 8 1 0\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\n5 0\nC T R (n = 1 7 )\nE IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r)\n e n d o m é trio e u tó p ic o\ns M IC A s o ro (p g /m L )\nE )\nr= 0 ,7\np = 0 ,0 0 6 3\n0 2 4 6 8 1 0\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n2 5 0\nE IR M IC A (e p ité lio g la n d u la r)\n e n d o m é trio e u tó p ic o\ns M IC A F P (p g /m L )\nC T R (n = 1 7 )F )\np = n s\n \nFigura 31. Análise de correlação entre os níveis de sMICA, no soro e no fluido peritoneal, e a \nexpressão proteica in situ de MICA em epitélio glandular. A), C) e E) níveis sMICA no soro e EIR \nMICA; B) D) e F) níveis sMICA no fluido peritoneal (FP) e EIS MICA; níveis de sMICA avaliados por \nensaio de ELISA; análise de expressão in situ da proteína MICA realizada por imunohistoquímica; EIR: \nescore de imunorreati vidade, definido pelo escore de intensidade de expressão MICA multiplicado pelo \nescore de frequência de expressão MICA; sMICA: MICA solúvel; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo \ncontrole, valores de r e p determinados pelo teste de correlação de Spearman. \n \n\n87 \n \n4.3.7 Pesquisa de nível de sMICA como potencial parâmetro preditivo para a \nendometriose. \n \n A análise da curva ROC (do inglês, Receiver Operating Characteristic Curve ) foi \nrealizada com objetivo de identificar a sensibilidade e especificidade dos níveis de sMICA, no \nsoro e no fluido peritoneal, de forma a identificar um possível valor de corte para discriminar \nmulheres com EDT e mulheres CTRs, sem a doença (capacidade preditiva). \n De forma geral, os valores da AUC são interpretados como: excelente (> 0,9), bom \n(0,8-0,9), fraco (0,7-0,80), pobre (0,6-0,7) e não discriminatório (0,5-0,6) (Tape, 2015). \n Criamos curvas ROC para níveis de sMICA no soro e FP, para os subgrupos: 1) grupo \ntotal de mulheres com EDT, 2) mulheres com EDT inicial (I/II) e avançada (III/IV), 3) mulheres \ncom EDT em estádios de I a IV. \n No grupo total de mulheres com EDT, não foram encontrados valores que pudessem \ndiscriminar, adequadamente, doentes e não doentes, nem no soro nem FP. No soro, a AUC foi \nde 0,604 (IC 95%, 0,53-0,68) e para o FP de 0,660 (IC 95%, 0,59-0,73). A análise da curva \nROC para estádios iniciais (I/II) e avançados (III/IV) também não indicou valores de AUC \ndiscriminatórios para mulheres com EDT [estádios iniciais, soro: AUC de 0,578 (IC 95%, 0,48-\n0,68); FP: AUC 0,619 (IC 95%, 0,52-0,71); estádios avançados, soro: AUC de 0,623 (IC 95%, \n0,54-0,71); FP: AUC de 0,684 (IC 95%, 0,61-0,76)]. \n Na avaliação da curva ROC para níveis de sMICA no FP, apenas em mulheres com \nEDT em estádio IV, o mais grave da doença, observamos valor discriminatório fraco de nível \nde sMICA. O valor de corte para níveis de sMICA no FP foi de 40pg/mL, com 67% de \nsensibilidade e 67% especificidade (33% de casos falso positivos), e uma AUC de 0,704 (IC \n95%, 0,61 -0,79). Para sMICA no soro, no estádio IV, tivemos: valor de corte= 3 4,8pg/mL, \nsensibilidade= 33% e especificidade= 95% (5% de falsos positivos), AUC: 0,638 (IC 95%: 0,54-\n0,73). Os valores de corte, AUC, sensibilidade e especificidade de todos os subgrupos \nanalisados (total de mulheres com EDT, estádios iniciais e avançados , e estádios I a IV da \nEDT e a representação gráfica das curvas ROC para níveis de sMICA no soro e no FP de \nmulheres com EDT em estádio IV estão apresentados no Anexo IX (Tabela 4 e Figura 2, \nrespectivamente). \n \n \n4.4 Células NK e subpopulações: análises quantitativas e funcionais \n \nCom o objetivo de avaliar a atividade efetora de células NK na EDT, quantificamos as \nsubpopulações de células NK e expressão do receptor NKG2D e das moléculas IFN -γ e IL-10. \nAnalisamos também a expressão de moléculas envolvidas na ativação de células NK, \nCD107a, IFN -y e IL -10, frente ao estímulo com as células K562 e células K562 células \n\n88 \n \nbloqueadas para a proteína MICA (K562BLOQ), em células NK totais e suas subpopulações, \nbem como a capacidade citotóxica de células NK, frente aos mesmos estímulos. \n \n \n4.4.1 Análise quantitativa das subpopulações de células NK e expressão de NKG2D, \nIFN-γ e IL-10 \n \nA quantificação de subpopulações de células NK nos grupos EDT e CTR foi realizada \npor citometria de fluxo, na condição ex vivo e na condição basal de cultura (6h de cultura). \nAvaliamos a porcentagem (%) de diferentes subpopulações de NK com expressão das \nmoléculas NKG2D, IFN -γ e IL -10, assim como a intensidade de expressão (mediana de \nintensidade de fluorescência, MFI) dessas moléculas nas subpopulações de NK. \n \n4.4.1.1 Subpopulações NK: na condição ex vivo \nComo condição ex vivo, consideramos amostras de PBMC apó s o descongelamento \ncelular e descanso por 1-1:30h, a 37oC, 5% CO2, em meio R10 (Métodos, item 3.9.1). \nPara cad a participante da pesquisa foram analisadas as% das subpopulações \nCD56bright e CD56dim, e das subpopulações CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56dimCD16+ \ne CD56dimCD16-. Para as comparações dos grupos foi utilizado o teste de Mann-Whitney. \n \n► Grupo CTR: observamos maior frequência das subpopulações CD56dim (Figura 32): \n • CD56dim vs CD56bright (p< 0,0001) \n • CD56dimCD16+ vs CD56dimCD16- (p< 0,0001) \n • CD56dimCD16+ vs CD56brightCD16+(p< 0,0001) \n • CD56dimCD16+ vs CD56brightCD16- (p< 0,0001) \n • CD56dimCD16- vs CD56brightCD16+ (p< 0,0001) \n \n► Grupo EDT : de forma semelhante ao encontrado no grupo saudável, encontramos \nmaior frequência das subpopulações CD56dim (Figura 32): \n • CD56dim vs CD56bright (p< 0,0001) \n • CD56dimCD16+ vs CD56dimCD16- (p= 0,002) \n • CD56dimCD16+ vs CD56brightCD16+(p< 0,0001) \n • CD56dimCD16+ vs CD56brightCD16- (p< 0,0001) \n • CD56dimCD16- vs CD56brightCD16+ (p< 0,0001) \n Assim, as proporções entre as diferentes subpopulações de NK estão preservadas na \nEDT. \n \n \n\n89 \n \nCD56\ndim (n=21)\nCD56\nbright (n=21)\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nE D T\n% d e c é lu la s p < 0 ,0 0 0 1\nA )\n \nCD56\ndim (n=19)\nCD56\nbright (n= 19)\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nC T R\n% d e c é lu la s p < 0 ,0 0 0 1\nB ) \nCD56\ndim CD16\n+ (n=21)\nCD56\ndim CD16\n- (n=21)\nCD56\nbright CD16\n+ (n=19)\nCD56\nbright CD16\n- (n=21)\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nE D T\n % d e c é lu la s\nC )\np = 0 ,0 0 2\np < 0 ,0 0 0 1\np < 0 ,0 0 0 1\np < 0 ,0 0 0 1\np < 0 ,0 0 0 1\n \nCD56\ndim CD16\n+ (n=19)\nCD56\ndim CD16\n- (n=19)\nCD56\nbright CD16\n+ (n=17)\nCD56\nbright CD16\n- (n=19)\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nC T R\n% d e c é lu la s\nD )\np < 0 ,0 0 0 1\np < 0 ,0 0 0 1\np < 0 ,0 0 0 1\np < 0 ,0 0 0 1\np < 0 ,0 0 0 1 \nFigura 32. Porcentagem das subpopulações de células NK circulantes de mulheres com \nendometriose e de controles, na condição ex vivo. A) e C) grupo endometriose (EDT); B e D) grupo \ncontrole (CTR); Linha pontilhada: indica o valor de zero de % de células; as barras horizontais \nrepresentam as medianas da porcentagem de expressão em cada subpopulação de células NK, valores \nde p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n► Grupo EDT vs grupo CTR : as subpopulações de NK tiveram porcentagens \nsemelhantes entre os grupos, exceto para a subpopulação CD56 dimCD16+, descrita como \ncitotóxica (27,5% vs 21,6%; p= 0,0456, teste T não pareado) que teve menor frequência no \ngrupo EDT (Tabela 5). \n \n \n \n \n \n\n90 \n \nTabela 5. Medianas das frequências de subpopulações de células NK circulantes de mulheres \ncom endometriose e de controles, na condição ex vivo. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; n: número de mulheres analisadas para cada \nsubpopulação; em negrito: valor de p considerado significante; em vermelho: maior valor de mediana entre os \ngrupos analisados; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney; *valores de p determinados pelo \nteste T não pareado. \n \n \n A análise das subpopulações de célula NK de acordo com a estratificação por \nestádios da EDT, indicou que a menor frequência da subpopulação CD56 dimCD16+ \nobservadas na EDT, esteve associada aos estádios iniciais da doença (I/II), na comparação \ncom o grupo CTR saudável (EDT: média 15,9 ± 10,7 vs CTR 29,9 ± 17,2, p= 0,0333, teste T \nnão pareado). Além dessa subpopulação, também foi observado que NK totais (EDT: médi a \n30,3±15,6 vs CTR 46,3±18,4, p= 0,0337, teste T não pareado) e a subpopulação CD56 dim \n(EDT: média 24,6 ± 13,9 vs CTR 38,5 ± 17,1, p= 0,044, teste T não pareado) também tiveram \nmenor expressão na EDT inicial (Figura 33). As demais subpopulações não tiveram diferenças \ntanto em relação à EDT avançada nem em relação ao grupo CTR (p= ns). \n \n \nI/II C T R\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nF re q . e x p re s s ã o (% )\nN K to ta is\np = 0 ,0 3 3 7\nA )\nn = 9 n = 1 9\nI/II C T R \n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nF re q . e x p re s s ã o (% )\nC D 5 6 d im\np = 0 ,0 4 4\nB )\nn = 9 n = 1 9\nI/II C T R \n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nF re q . e x p re s s ã o (% )\nC D 5 6 d im C D 1 6 +\np = 0 ,0 3 3 3\nC )\nn = 9 n = 1 9\n \nFigura 33. Comparação entre a frequência de células NK totais (A) e das subpopulações CD56 dim \n(B) e CD56 dimCD16+ (C) entre estádios iniciais (I/II) da endometriose e controles. I/II: estádios \niniciais da endometriose de acordo com a rASRM; CTR: grupo controle; as barras horizontais \nrepresentam a média dos valores; NK totais: incluem as subpopula ções CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, \nCD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; Freq.; frequência; valores de p determinados pelo teste \nT não pareado. \n \nEDT mediana CTR mediana \n(n) (%) (n) (%)\nNK totais 21 35,6 19 48,9 0,0553*\nCD56dim 21 33,3 19 39,5 0,1061\nCD56bright 21 3,6 19 2,8 0,4813\nCD56dimCD16+ 21 21,6 19 27,5 0,0456*\nCD56dimCD16- 21 9,1 19 7,7 0,4364\nCD56brightCD16+ 19 1,3 16 1,0 0,9025\nCD56brightCD16- 21 1,8 19 1,8 0,9733\nSubpopulações p\n\n91 \n \n4.4.1.2 Expressão de NKG2D em subpopulações NK: na condição ex vivo \n \nTambém avaliamos a expressão do receptor da proteína MICA, NKG2D, em células NK \ne em suas subpopulações . Os valores de p foram determinados pelo teste de Mann-Whitney \n(Figura 34). \n \n► Grupo CTR : maior % de células com expressão de NKG2D na subpopulação \nCD56bright, descrita como mais prod utora de citocina, em relação à subpopulação CD56 dim (p= \n0,0029), descrita com maior propriedade citotóxica. Observamos também (Figura 34, B e D): \n NKG2D (%): • CD56brightCD16+ > CD56dimCD16+ (p= 0,0224) \n • CD56brightCD16- > CD56dimCD16+ (p= 0,0009) \n • CD56brightCD16- > CD56dimCD16- (p= 0,0266) \n \n► Grupo EDT : maior % de células com expressão de NKG2D na subpopulação \nCD56bright em relação à subpopulação CD56 dim (p= 0,0499), de forma semelhante ao grupo \nsaudável Observamos também (Figura 34 A e C): \n NKG2D (%): • CD56brightCD16+ > CD56dimCD16+ (p= 0,0199) \n • CD56brightCD16+ > CD56dimCD16- (p= 0,0026) (não encontrada \n na EDT \n • CD56brightCD16- > CD56dimCD16- (p= 0,0402) \n \n► Grupo EDT vs grupo CTR: Na análise comparativa entre os grupos na condição ex \nvivo não foi observada diferença na % de e xpressão do receptor NKG2D (Tabela 6). No \nentanto, houve uma maior intensidade de expressão (MFI) de NKG2D em NK totais ( p= \n0,0402) e nas subpopulações CD56 dim (p= 0,0334) e CD56 brightCD16+ (p= 0,0221) em \nmulheres com EDT, em relação aos CTRs saudáveis (valores de p determinados pelo teste de \nMann-Whitney). \n Além disso, a análise estratificada por estádio, indicou que a mediana de intensidade \nde fluorescência para NKG2D em células CD56 brightCD16+ foi maior em mulheres em estádio s \niniciais da doença (mediana , 655, min -max, 484 -1395), na comparação com o grupo CTR \n(mediana, 367, min-max, 3-1483; p= 0,033, teste de Mann-Whitney) (Figura 34E). \n \n \n\n92 \n \nCD56\ndim (n= 18)\nCD56\nbright (n= 18)\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nE D T\nE x p re s s ã o\nN K G 2 D (% ) p = 0 ,0 4 9 9\nA )\n \nCD56\ndim (n=18)\nCD56\nbright (n= 18)\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nC T R\nE x p re s s ã o\n N K G 2 D (% )\np = 0 ,0 0 2 9\nB ) \nCD56\ndim CD16\n+ (n=18)\nCD56\ndim CD16\n- (n=18)\nCD56\nbright CD16\n+ (n= 16)\nCD56\nbright CD16\n- (n=18)\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nE D T\nE x p re s s ã o\nN K G 2 D (% ) p = 0 ,0 1 9 9\np = 0 ,0 0 2 6\np = 0 ,0 4 0 2\nC )\n \nCD56\ndim CD16\n+ (n= 18)\nCD56\ndim CD16\n- (n= 18)\nCD56\nbright CD16\n+ (n= 15)\nCD56\nbright CD16\n- (n= 18)\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nC T R\nE x p re s s ã o\nN K G 2 D (% )\nD )\np = 0 ,0 0 0 9\np = 0 ,0 2 6 6\np = 0 ,0 2 2 4 \nI/II III/IV C T R\n0\n5 0 0\n1 0 0 0\n1 5 0 0\n2 0 0 0\nE x p re s s ã o\nN K G 2 D (M F I)\np = 0 ,0 3 3\nC D 5 6 b rig h tC D 1 6 +\ne s tá d io s E D T\nn = 7 n = 9\nE )\n \nFigura 3 4. Porcentagem (%) de células com expressão de NKG2D nas subpopulações NK \ncirculantes em mulheres com endometriose e controles saudáveis, e expressão de acordo com \nestádios da doença, na condição ex vivo . A -D) expressão de NKG2D nas subpopulações NK; E) \nexpressão NKG2D , na subpopulação CD56brightCD16+, entre estádios da E DT e CTR ; EDT: grupo \nendometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; I/II: estádios iniciais \nda EDT; III/IV: estádios avançados da EDT, de acordo com a rASRM; barras horizontais representam as \nmedianas da % de expressão; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n\n93 \n \nTabela 6 . Comparação da frequência de células com expressão do receptor NKG2D, e \nintensidade de expres são, em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com \nendometriose e controles, na condição ex vivo. \n \nEDT CTR p* p ‡\n(n) % MFI (n) % MFI\nNK totais 18 14,4 311,5 18 16,5 185,5 0,6561 0,0402\nCD56dim 18 14,1 312,0 18 15,6 191,0 0,8329 0,0334\nCD56brigth 18 26,8 508,0 18 35,4 503,0 0,3348 0,8945\nCD56dimCD16+ 18 15,3 303,0 18 15,3 3,0 0,4863 0,0599\nCD56dimCD16- 18 10,0 352,5 18 16,4 384,0 0,0986 0,9875\nCD56brightCD16+ 16 34,1 605,0 15 26,3 367,0 0,6187 0,0221\nCD56brightCD16- 18 20,2 466,5 18 35,5 519,0 0,2262 0,7130\nSubpopulações NKG2D NKG2D\n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; %: frequência de expressão, dada em mediana da \nporcentagem; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; n: número de mulheres analisadas para cada \nsubpopulação; *valor de p referente à mediana de porcentagem de expressão entre EDT e CTR ;‡valor de p \nreferente à MFI entre EDT e CTR; em negrito: valores de p significantes ( p<0,05); em vermelho: valor da maior \nmediana significativa entre os grupos; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n Realizamos também a análise de correl ação entre a expressão ( frequência, % e \nintensidade de expressão, MFI) de NKG2D, em células NK, e os níveis de sMICA, no soro e \nFP. Observamos correlações negativas em relação aos níveis de sMICA no soro, e apenas no \ngrupo EDT. A correlação negativa entre a % e níveis de sMICA foram para as subpopulações: \nCD56dimCD16- (r= -0,5, p= 0,0429), CD56bright (r= -0,5, p= 0,0446) e CD56 brightCD16+ (r= -0,6, \np= 0,0167) e CD56 bright CD16- (r= -0,5, p= 0,0429). Entre MFI de NKG2D e sMICA no soro, a \npresença de correlaç ão negativa foi observada para: NK totais (r= -0,5, p= 0,0467) e para as \nsubpopulações CD56dim (r= -0,5, p= 0,0467), CD56bright (r= -0,5, p=0,02), CD56brightCD16+ (r= -\n0,6, p= 0,0167) e CD56brightCD16- (r= -0,5, p= 0,0319) (Correlação de Spearman) (Tabela 7). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n94 \n \nTabela 7. Análise de correlação da frequência, e intensidade de expressão, de NKG2D nas \nsubpopulações de células NK , com os níveis de MICA solúvel, no grupo de mulheres com \nendometriose e controles. \n \n \nEDT EDT \n(n) r p r p (n) r p p\nNK totais 18 -0,4 ns -0,5 0,0467 18 -0,3 ns -0,4 ns\nCD56dim 18 -0,4 ns -0,5 0,0467 18 -0,2 ns -0,4 ns\nCD56brigth 18 -0,5 0,0446 -0,5 0,0200 18 -0,1 ns -0,3 ns\nCD56dimCD16+ 18 -0,3 ns -0,1 ns 16 -0,3 ns -0,3 ns\nCD56dimCD16- 18 -0,5 0,0429 -0,4 ns 18 -0,4 ns -0,4 ns\nCD56brightCD16+ 16 -0,6 0,0167 -0,6 0,0167 18 -0,2 ns -0,4 ns\nCD56brightCD16- 18 -0,5 0,0429 -0,5 0,0319 18 -0,3 ns -0,3 ns\nCTR CTR \n(n) r p r p (n) r p p\nNK totais 15 0,2 ns -0,02 ns 15 0,3 ns 0,2 ns\nCD56dim 15 0,2 ns 0,0 ns 15 0,3 ns 0,2 ns\nCD56brigth 15 0,3 ns 0,2 ns 15 0,1 ns 0,3 ns\nCD56dimCD16+ 15 0,2 ns 0,2 ns 15 0,3 ns 0,4 ns\nCD56dimCD16- 15 0,2 ns 0,2 ns 15 -0,1 ns -0,2 ns\nCD56brightCD16+ 14 0,4 ns 0,1 ns 14 0,5 ns 0,4 ns\nCD56brightCD16- 15 0,2 ns 0,1 ns 15 -0,01 ns 0,1 ns\nSubpopulações \nsMICA FP vs\nSubpopulações \nsMICA FP vssMICA soro vs\nNKG2D (%) NKG2D (MFI) NKG2D (%) NKG2D (MFI)\nsMICA soro vs\nNKG2D (%) NKG2D (MFI) NKG2D (%) NKG2D (MFI)\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; em \nnegrito: valores de p considerados significantes ( p< 0,05) e respectivos valores de r ; n: número de mulheres \nanalisadas para cada subpopulação ; ns: não significante (p≥ 0,05), valores de p e r determinados pelo t este de \ncorrelação de Spearman. \n \n \n4.4.1.3 Expressão das moléculas IFN-γ e IL-10: na condição ex vivo \n Ainda na condição ex vivo, foram analisadas a frequência (%) de células positivas para \nIFN-y e IL -10, e a intensidade de expressão (MFI) dessas moléculas (Tabela 8). Para as \ncomparações entre os grupos, EDT e CTR, e para a determinação dos respectivos valores de \np, foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney. \n \n• IFN-y: observamos maior % de células produtoras de IFN-y em mulheres com EDT, em \nrelação ao grupo CTR, nas subpopulações: \n % de IFN-γ: • CD56dim: EDT > CTR (p= 0,0205) \n • CD56dimCD16+: EDT > CTR (p= 0,0271) \nNão foram observadas diferenças significativas para a intensidade de expressão de \nIFN-y (p≥ 0,05). \n• IL-10: não houve diferença na % de células, entre EDT e CTRs saudáveis. \n\n95 \n \nNo entanto, encontramos maior intensidade de expressão em mulheres com EDT, em \nrelação ao grupo CTR, em todas as populações analisadas: \n MFI de IL-10: • NK totais: EDT > CTR (p= 0,0037) \n • CD56dim: EDT > CTR (p= 0,0066) \n • CD56bright: EDT > CTR (p= 0,0003) \n • CD56dimCD16+: EDT > CTR (p= 0,0105) \n • CD56dimCD16-: EDT > CTR (p= 0,0039) \n • CD56brightCD16+: EDT > CTR (p= 0,0061) \n • CD56brightCD16-: EDT > CTR (p= 0,0025) \n \n \nTabela 8. Porcentagem de células com expressão de IFN-y ou IL -10, e intensidades de \nexpressão, em subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e \ncontroles saudáveis, na condição ex vivo. \n \nSubpopulações\nEDT CTR EDT CTR \n(n) med min-max (n) med min-max p (n) med min-max (n) med min-max p\nNK totais 21 2,2 0,71-13,6 19 1,8 0,2-7,5 0,0818 21 0,4 0,3-1,9 19 0,5 0,2-1,6 0,6534\nCD56dim 21 2,4 1,0-13,5 19 1,8 0,3-6,5 0,0205 21 0,4 0,1-1,9 19 0,5 0,0-1,7 0,3435\nCD56brigth 21 3,3 0,0-8,5 19 1,5 0,3-6,5 0,2055 21 0,4 0,0-1,6 19 0,3 0,4-1,7 0,8775\nCD56dimCD16+ 21 2,5 1,2-13,0 19 1,7 0,2-8,1 0,0271 21 0,5 0,1-2,4 19 0,5 0,2-1,5 0,4646\nCD56dimCD16- 21 2,8 0,4-13,1 19 1,7 0,4-7,5 0,2499 21 0,4 0,0-1,9 19 0,6 0,2-1,4 0,1185\nCD56brightCD16+ 19 3,3 0,0-11,5 16 1,1 0,0-15,8 0,0719 19 0,7 0,0-4,4 16 0,4 0,0-1,8 0,0523\nCD56brightCD16- 21 2,6 0,4-18,6 19 2,4 0,6-11,7 0,7532 21 0,5 0,0-3,6 19 0,3 0,0-2,3 0,8236\nSubpopulações\nEDT CTR EDT CTR \n(n) med min-max (n) med min-max p (n) med min-max (n) med min-max p\nNK totais 21 49 29-200 19 48 3-168 0,7683 21 145 3-286 19 3 3-249 0,0037\nCD56dim 21 49 29-199 19 48 3-168 0,7529 21 147 3-305 19 3 3-351 0,0066\nCD56brigth 21 39 3-207 19 37 3-176 0,5596 21 240 93-429 19 164 56-251 0,0003\nCD56dimCD16+ 21 51 29-210 19 66 3-168 0,7631 21 86 3-613 19 3 3-255 0,0105\nCD56dimCD16- 21 49 23-180 19 50 3-177 0,6928 21 189 132-306 19 162 122-197 0,0039\nCD56brightCD16+ 19 45 3-204 16 49 3-184 0,7630 19 207 3-481 16 33 3-306 0,0061\nCD56brightCD16- 21 37 3-207 19 32 3-169 0,2669 21 241 141-443 19 204 88-236 0,0025\nIFN-γ (% de expressão) IL-10 (% de expressão)\nIFN-γ (intensidade de expressão, MFI) IL-10 (intensidade de expressão, MFI)\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; n: número de mulheres analisadas para cada \nsubpopulação; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; med: mediana; min: valor mínimo da mediana; max: \nvalor máximo da mediana; em negrito: valores de p significantes (p< 0,05); em vermelho: valor da maior mediana \nsignificativa entre os grupos analisados; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n \n \n \n \n\n96 \n \n4.4.2 Expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL -10 frente a estímulo com células \nK562 \n \nA atividade efetora das células NK foi avaliada, tanto em relação à frequência (%) como \nà intensidade (MFI) de expressão, das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, em células NK totais \ne em suas subpopulações. Avaliamos esses parâmetros frente aos estímulos com as células \nK562 (K562) e células K562 previamente bloqueadas para a proteína MICA (K562BLOQ). O \nbloqueio de MICA nas células K562 teve como objetivo representar o potencial efeito da \npresença de MICA solúvel em inibir a interação com a molécula NKG2D, e medir seu imp acto \nna atividade citotóxica de células NK (Boukouaci et al., 2013; Groh et al., 2002). A magnitude \nde expressão de tais moléculas foi também avaliada quanto à sua possível associação com \nestádios da EDT e fases do ciclo menstrual. Como controle de expressão, foi incluída a \ncondição basal de cultura, sem estímulo. \nA % de células K562 com expressão de MICA, e sua intensidade de expressão (MFI), \nforam analisadas em cada experimento de cocultura (PBMC + K562) (Anexo X, Tabela 1). A \nmediana da frequência de células K562 positivas (avaliada em 11/13 ensaios) para a \nexpressão de MICA foi de 42,2% e, MICA em células K562 bloqueadas (K562BLOQ) foi de \n13,1% correspondendo a uma mediana de bloqueio de 63,6%. O bloqueio de MICA afetou \nmenos a sua intensidade de expressão, com mediana de bloqueio de 33,9%. \n \n \n4.4.2.1 CD107a, IFN-y e IL-10: na condição estado basal de cultura, sem estímulo \n \nNo estado basal de cultura (sem estímulo), foram analisadas a frequência e a \nintensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL -10, entre as subpopulações de \ncélulas NK, nos grupos EDT e CTRs. Os resultados referentes à % de expressão estão \napresentados na Figura 35 e, da intensidade de expressão das moléculas, no Anexo X, Tabela \n2. \n \n► Grupo CTR: \n \n• CD107a: para a expressão de CD107a, no grupo CTR, observamos diferenças \nsignificantes, tanto para a % como para a intensidade de expressão, entre várias \nsubpopulações de células NK (p< 0,0001, teste de Kruskal-Wallis). Na comparação entre duas \nsubpopulações celulares (pós teste de Dunn), observamos: \n % de CD107a: • CD56dim>CD56dimCD16+ (p<0,05) \n • CD56dimCD16-> CD56bright (p<0,001) \n • CD56dimCD16-> CD56brightCD16+ (p< 0,0001) \n\n97 \n \n • CD56dimCD16-> CD56brightCD16- (p< 0,001) \n MFI de CD107a: • CD56bright> CD56dim (p< 0,05) \n • CD56brightCD16+ > CD56dim (p< 0,05) \n • CD56brightCD16- > CD56dim (p< 0,05) \n • CD56bright > CD56dimCD16+ (p< 0,001 \n • CD56bright > CD56dimCD16- (p< 0,05) \n • CD56brightCD16+ > CD56dimCD16+ (p< 0,05) \n • CD56brightCD16- > CD56dimCD16+ (p< 0,001 \n • CD56brightCD16+ > CD56dimCD16- (p< 0,05) \n - CD56brightCD16- > CD56dimCD16- (p< 0,05) \nDe forma geral, observamos que a maior frequência para CD107a esteve associada às \ncélulas CD56dim e, de maior intensidade de expressão, às células CD56bright. \n \n• IFN-γ: não observamos diferença, tanto para a % ( p= 0,0746) como para a intensidade \nde expressão de IFN-γ (p= 0,3973 (teste de Kruskal-Wallis), entre as subpopulações NK. \n \n• IL-10: observamos diferença entre as subpopulações de NK, apenas para a \nintensidade de expressão de IL-10 (p< 0,0001, teste de Kruskal-Wallis). Na comparação entre \nduas subpopulações celulares (pós teste de Dunn), observamos: \nMFI de IL10: • CD56bright > CD56dimCD16+ (p< 0,05) \n • CD56brightCD16- > NK totais (p< 0,01) \n • CD56brightCD16- > CD56dim (p< 0,01) \n • CD56brightCD16- > CD56dimCD16+ (p< 0,001) \n • CD56brightCD16- > CD56brightCD16+ (p< 0,05) \n • CD56dimCD16- > NK totais (p< 0,05) \n • CD56dimCD16- > CD56dim (p< 0,05) \n • CD56dimCD16- > CD56dimCD16+ (p< 0,01) \nA maior parte das diferenças estiveram associadas à maior intensidade de expressão \npara células CD56bright. \n \n► Grupo EDT: \n \n• CD107a: observamos diferenças significantes, tanto na % como na intensidade de \nexpressão (MFI), de CD107a, entre várias subpopulações de células NK (p< 0,0001, teste de \nKruskal-Wallis). Na comparação entre duas subpopulações celulares (pós teste de Dunn), \nobservamos: \n % de CD107a: • CD56dimCD16- > CD56bright (p< 0,01) \n\n98 \n \n • CD56dimCD16- > CD56brightCD16- (p< 0,05) \n MFI para CD107a: • CD56bright > NK totais (p< 0,001) (não encontrada no CTR) \n • CD56bright > CD56dim (p< 0,001)) \n • CD56bright > CD56dimCD16+ (p< 0,001) (não encontrada no CTR) \n • CD56bright > CD56dimCD16- (p< 0,0001) (não encontrada no CTR) \n • CD56brightCD16- > NK totais (p< 0,01) (não encontrada no CTR) \n • CD56dim > CD56brightCD16- (p< 0,001) (não encontrada no CTR) \n • CD56dimCD16+ >CD56brightCD16-(p< 0,001)(não encontrada no CTR) \n • CD56dimCD16->CD56brightCD16-(p< 0,0001)(não encontrada no CTR) \n A maior frequência de expressão de CD107a esteve associada à presença de células \nCD56dim+. No entanto, para intensidade de expressão, tanto CD56bright+ como CD56dim+, \ntiveram associação. \n \n• IFN-γ: não observamos diferenças tanto para a % ( p= 0,4093) de IFN -γ como para a \nintensidade de expressão ( p= 0,8755), entre as subpopulações de NK (teste de Kruskal-\nWallis). \n \n• IL-10: não observamos diferença da % de expressão de IL -10 entre as subpopulações \nde NK, mas tivemos diferenças para intensidade de expressão de IL -10 (p= 0,0164, teste de \nKruskal-Wallis). Na comparação entre duas subpopulações celulares, observamos: \nMFI para IL-10: • CD56bright > NK totais (p= 0,0358) (não encontrada no CTR) \n • CD56bright > CD56dim (p= 0,0293) (não encontrada no CTR) \n • CD56brightCD16- > CD56dimCD16+ (p= 0,0329) \n • CD56brightCD16- > CD56dim > (p= 0,0104) \n • CD56dimCD16- > CD56dim (p= 0,0199) \n • CD56dimCD16- > CD56dimCD16+ (p= 0,0477) \nDe forma geral, a maior parte das diferenças para intensidade de fluorescência de IL -\n10, no grupo EDT, estiveram associadas à maior intensidade de expressão da subpopulação \nCD56bright. A subpopulação CD56 brightCD16+ não foi analisada para o grupo EDT devido ao \nbaixo número de amostras que atingiram o valor de corte válido na aquisição no citômetro de \nfluxo (≥ 100). \n \n\n99 \n \nNK totais (n=20)\nCD56\ndim (n=20)\nCD56\nbright (n=18)\nCD56\ndim CD16\n+ (n=19)\nCD56\ndim CD16\n- (n=19)\nCD56\nbright CD16\n+ (n=9)\nCD56\nbright CD16\n- (n=17)\n0\n2\n4\n6\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC T R : C D 1 0 7 a (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\nA )\n*\n**********\nNK totais (n=20)\nCD56\ndim (n=20)\nCD56\nbright (n=18)\nCD56\ndim CD16\n+ (n=19)\nCD56\ndim CD16\n- (n=19)\nCD56\nbright CD16\n+ (n=9)\nCD56\nbright CD16\n- (n=15)\n0\n2\n4\n6\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC T R : IF N -  (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\nB )\nNK totais (n=16)\nCD56\ndim (n=16)\nCD56\nbright (n=16)\nCD56\ndim CD16\n+ (n=16)\nCD56\ndim CD16\n- (n=15)\nCD56\nbright CD16\n+ (n=8)\nCD56\nbright CD16\n- (n=13)\n0\n2\n4\n6\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC T R : IL -1 0 (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\nC )\n \nNK totais (n=21)\nCD56\ndim (n=21)\nCD56\nbright (n=18)\nCD56\ndim CD16\n+ (n=20)\nCD56\ndim CD16\n- (n=20)\nCD56\nbright CD16\n- (n=16)\n0\n2\n4\n6\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nE D T : C D 1 0 7 a (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\nD )\n** *\n \nNK totais (n=21)\nCD56\ndim (n=20)\nCD56\nbright (n=18)\nCD56\ndim CD16\n+ (n=20)\nCD56\ndim CD16\n- (n=20)\nCD56\nbright CD16\n- (n=16)\n0\n2\n4\n6\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nE D T : IF N -  (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\nE ) \nNK totais (n=17)\nCD56\ndim (n=18)\nCD56\nbright (n=15)\nCD56\ndim CD16\n+ (n=17)\nCD56\ndim CD16\n- (n=17)\nCD56\nbright CD16\n+ (n=4)\nCD56\nbright CD16\n- (n=13)\n0\n2\n4\n6\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nE D T : IL -1 0 (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\nD ) \nFigura 35. Análise da frequência de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10, entre as subpopulações de células NK, nos grupos EDT e \nCTRs, no estado basal de cultura (sem estímulo). EDT: grupo endometriose; CTR grupo controle; NK totais: in cluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; as barras horizontais representam as medianas das frequências de expressão de cada grupo; \nlinha pontilhada: indica o valor de zero para porcentagem (%) de célu las com expressão; valores de p determinados pelo teste de Kruskal-Wallis com pós teste \nde Dunn; *p< 0,05, **p< 0,01, *** p< 0,001, *** p< 0,001, **** p< 0,0001. \n\n100 \n \nA % e a intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL -10 nas \nsubpopulações NK for am também comparadas entre os grupos, EDT e CTRs. Para todas as \nanálises, utilizamos o teste não paramétrico de Mann-Whitney (análises de %, Figura 36; \nanálises MFI, Tabela 9). A subpopulação CD56 brightCD16+ não foi analisada no grupo CTR \ndevido ao baixo n úmero de amostras que atingiram o valor de corte válido para aquisição no \ncitômetro de fluxo (≥ 100 eventos). \n \nTabela 9. Análise da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL -10, nas \nsubpopulações de células NK, entre grupos EDT e CTRs, na condição basal de cultura, sem \nestímulo. \n \nEDT CTR EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 21 358,0 20 336,0 ns 21 83,9 20 97,2 ns 17 127,0 16 49,1 0,0281\nCD56dim 21 350,0 20 327,5 ns 21 83,6 20 99,4 ns 18 119,0 16 37,0 0,0428\nCD56bright 18 469,0 18 452,0 ns 18 80,8 18 92,6 ns 15 90,1 14 3,0 ns\nCD56dimCD16+ 20 9,3 19 8,6 ns 20 2,5 19 1,5 ns 17 0,9 16 0,6 ns\nCD56dimCD16- 20 303,0 19 340,0 ns 20 80,1 19 122,1 ns 17 144,0 15 139,0 ns\nCD56brightCD16+ 4 498,0 9 489,0 NA 4 70,2 9 114,0 NA 4 72,7 8 82,8 NA\nCD56brightCD16- 16 462,0 17 438,0 ns 16 69,0 15 104,0 ns 13 158,0 13 143,0 ns\nSem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\nSubpopulações\nCD107a IFNγ IL-10\n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de \nexpressão); med: mediana; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação, na análise entre os gr upos \nEDT e CTR; em negrito: valores de p significantes na análise entre os grupos (<0,05); em vermelho: maior valor de \nmediana entre os grupos analisados; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n101 \n \nC D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n5 0\n1 0 0\nN K T O T A IS\n% d e c é lu la s\nE D T C T R\nn = 2 1 n = 2 1 n = 1 7 n = 2 0 n = 2 0 n = 1 6\np = 0 ,0 1 9 4\nA )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 d im\n% d e c é lu la s\nE D T C T R\nn = 2 1 n = 2 0 n = 1 5 n = 2 0 n = 2 0 n = 1 4\n p = 0 ,0 0 8 3\nB )\n \nC D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n2 5\n5 0\n7 5\n1 0 0\nC D 5 6 b rig h t\n% d e c é lu la s\nE D T C T R\nn = 1 8 n = 1 8 n = 1 5 n = 1 8 n = 1 8 n = 1 4\nC )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 d im C D 1 6 +\n% d e c é lu la s\nE D T C T R\nn = 2 0 n = 2 0 n = 1 7 n = 1 9 n = 1 9 n = 1 6\nD )\n \nC D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 d im C D 1 6 -\n% d e c é lu la s\nE D T C T R\nn = 2 0 n = 2 0 n = 1 7 n = 1 9 n = 1 9 n = 1 7\np = 0 ,0 4 9 2\nE )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0 C D 1 0 7 a IF N -  IL -1 0\n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 b rig h tC D 1 6 -\n% d e c é lu la s\nE D T C T R\n(n = 2 1 ) (n = 2 1 ) (n = 1 7 ) (n = 2 1 ) (n = 2 1 ) (n = 1 7 )\np < 0 ,0 0 0 1\nF )\n \n \nFigura 36. Comparação da frequência de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10, nas \nsubpopulações de células NK circul antes, entre mulheres com endometriose e controles, na \ncondição basal, sem estímulo. EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; valores \nde p determinados pelo teste de Mann-Whitney; n: número de mulheres analisadas para cada molécula, \nem cada grupo; as barras horizontais representam as medianas de porcentagem de expressão de cada \nmolécula. \n \n \n❖ Análise de correlação entre as moléculas envolvidas na atividade efetora de \ncélulas NK, na condição basal, sem estímulo: \n \n Avaliamos se há correlação entre as frequências e/ou intensidades de expressão das \nmoléculas CD107a e IFN -y e IL -10, na condição basal de cultura. As análises, com a \ndeterminação dos valores de p e r, foram realizadas pelo teste de correlação de Spearman. \n \n\n102 \n \n► Grupo CTR: observamos correlações positivas entre: \n \n• CD107a e IL-10 (para a MFI) nas populações celulares abaixo (correlações observadas \napenas no grupo CTR): \n • NK totais (r= 0,6, p=0,0171) \n • CD56dim (r= 0,6, p=0,0244) \n • CD56bright (r= 0,7, p=0,0016) \n • CD56dimCD16+ (r= 0,5, p=0,0395) \n • CD56brightCD16- (r= 0,8, p=0,0014) \n \n► Grupo EDT: foram observadas correlações positivas entre: \n \n• CD107a e IL -10 (para %), em células com fenótipo descrito com maior citotoxicidade, \nCD56dim (r= 0,5, p= 0,0479) (correlação observada apenas no grupo EDT; no grupo CTR a \ncorrelação foi com MFI). \n \n• IFN-y e IL -10 (para %), em células com fenótipo descrito com maior citotoxicidade: \nCD56dim (r= 0,7, p=0,0036) e CD56 dimCD16- (r=0,5, p=0,0465) (correlação observada apenas \nno grupo EDT). \n \n• IFN-y e CD107a (para MFI), em células CD56bright (r= 0,5, p= 0,0326), CD56dimCD16+ (r= \n0,5, p= 0,0452) e CD56 brightCD16- (r= 0,6, p= 0,0257). Destacamos que as sub populações \nCD56bright + são descritas com propriedade imunorreguladora (correlações observadas apenas \nno grupo EDT). \n \nNa Tabela 10 estão apresentados os dados significantes de correlação, nos grupos \nEDT e CTRs saudáveis, tanto para a frequência de células produtoras como para a \nintensidade de produção (MFI), em cada subpopulação de células NK. Na Figura 37 estão \napresentados exemplos de correlações entre as expressões de moléculas de ativação NK, \npara a subpopulação CD56dim. \n A subpopulação CD56 brightCD16+ não foi analisada no grupo EDT, uma vez que não \natingiu o número mínimo de eventos adquiridos no citômetro de fluxo (≥ 100). \n \n \n \n \n \n \n\n103 \n \nTabela 10. Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das \nmoléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações \nde células NK circulantes, em mulheres com endometriose e controles, na condição basal de \ncultura, sem estímulo. \n \nA) Grupo endometriose \n \nSem estímulo (frequência de células com expressão, %) \nEDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 21 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 18 0,0036 0,7 21 ns ns 18 0,0479 0,5\nCD56brigth 15 ns ns 18 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 17 0,0465 0,5 20 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nSem estímulo (intensidade de expressão, MFI) \nEDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 21 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 18 ns ns 21 ns ns 18 ns ns\nCD56brigth 15 ns ns 18 0,0326 0,5 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 20 0,0452 0,5 17 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 13 ns ns 16 0,0257 0,6 13 ns ns\nIFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10\nSubpopulações\nSubpopulações\nIFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10\n \n \nB) Grupo controle \n \nSem estímulo (frequência de células com expressão, %) \nCTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 16 ns ns 20 ns ns 16 ns ns\nCD56dim 16 ns ns 20 ns ns 16 ns ns\nCD56brigth 16 ns ns 18 ns ns 16 ns ns\nCD56dimCD16+ 16 ns ns 19 ns ns 16 ns ns\nCD56dimCD16- 16 ns ns 19 ns ns 16 ns ns\nCD56brightCD16+ 8 ns ns 9 ns ns 8 ns ns\nCD56brightCD16- 13 ns ns 15 ns ns 13 ns ns\nSem estímulo (intensidade de expressão, MFI) \nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 16 ns ns 20 ns ns 16 0,0171 0,6\nCD56dim 16 ns ns 20 ns ns 16 0,0244 0,6\nCD56brigth 16 ns ns 18 ns ns 16 0,0016 0,7\nCD56dimCD16+ 16 ns ns 19 ns ns 16 0,0395 0,5\nCD56dimCD16- 16 ns ns 19 ns ns 16 ns ns\nCD56brightCD16+ 8 ns ns 9 ns ns 8 ns ns\nCD56brightCD16- 13 ns ns 15 ns ns 13 0,0014 0,8\nIFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10\nIFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10\nSubpopulações\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; n: núm ero de pares de dados analisados em cada subpopulação \ncelular; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, \nCD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); em negrito: valores de p \nconsiderados significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correspondem a \ncorrelações diferenciais entre os grupos EDT e CTR; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação ; \nns: não significante (p≥ 0,05), valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. \n\n104 \n \n0 .5 1 .0 1 .5 2 .0\n-5\n0\n5\n1 0\n1 5\n2 0\nIL -1 0 (% )\nIF N -  ( % )\nr= 0 ,7\np = 0 ,0 0 3 6\nC D 5 6 dim (n = 1 8 )A )\n \n0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nIL -1 0 (% )\nC D 1 0 7 a (% ) r= 0 ,5\np = 0 ,0 4 7 9\nC D 5 6 dim (n = 1 8 )B ) \nFigura 37. Análise de correlação entre a porcentagem de células com expressão de moléculas de \natividade efetora de células NK, na subpopulação CD56 dim circulante, de mulheres com \nendometriose, na condição basal de cultura, sem estímulo. A) correlação entre as porcentagens (%) \nde expressão das moléculas IFN -y e IL -10; B) correlação entre as % de expressão das moléculas \nCD107a e IL-10; n= números de pares de dados analisados; valores de p e r determinados pelo teste de \ncorrelação de Spearman. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n105 \n \n4.4.2.2....Moléculas de atividade NK: na condição com estímulo com células K562 \nInicialmente, realizamos uma análise pareada para a e xpressão das moléculas \nCD107a, IFN-y ou IL-10, para as condições sem estímulo e após o estímulo com K562, com o \nobjetivo de avaliar a presença de alteração significativa de expressão, com o estímulo. Foram \nrealizadas análises pareadas das amostras, separad amente, dentro dos grupos EDT e CTR, \nem células NK totais e em suas subpopulações, utilizando-se o teste de Wilcoxon. \n \n► Grupo CTR: o estímulo com células K562 induziu um aumento significativo de CD107a \ne IFN-y, tanto na % de células positivas como na inte nsidade de expressão, em quase todas \nas subpopulações de NK, exceto para IFN-y em células CD56brightCD16+ (p≥ 0,05). Para IL-10, \nhouve um aumento de MFI na presença do estímulo K562 na subpopulação CD56 dimCD16-, \nmas sem modificação na% de células (Tabela 11). \n \n► Grupo EDT : o estímulo com células K562 também induziu um aumento da % de \ncélulas com expressão de CD107a e de IFN -y, em todas as subpopulações de NK, exceto \npara as células CD56 brightCD16+, da mesma forma como observado no grupo CTR. Também \nhouve au mento da intensidade de expressão para CD107a, mas, diferentemente do grupo \nCTR, não para IFN-y, nas mesmas subpopulações, exceto na subpopulação CD56 brightCD16+. \nHouve diminuição de MFI para IL -10 nas subpopulações CD56 bright (p= 0,0173) e \nCD56dimCD16- (p= 0,0359) (no grupo CTR, houve aumento de IL -10 na subpopulação \nCD56dimCD16-). Para % de células, assim como no grupo CTR, não houve modificação na % \nde células produtoras de IL-10 (p> 0,05, teste de Wilcoxon) (Tabela 11). \n \nAs modificações ocorridas após o estímulo com células K562, em relação à condição \nsem estímulo, nos grupos EDT e CTR estão descritas na Tabela 11 . Na Figura 38 \napresentamos algumas modificações significativas ocorridas após o estímulo com K562 \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n106 \n \nTabela 11. Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 e das intensidades de expressão, nas \nsubpopulações de células NK circulantes, em mulheres com endometriose (A) e controles (B), entre as condições sem estímulo e após \nestímulo com células K562. \n \nA) Grupo endometriose \n \nEDT SE K562 EDT SE K562 EDT SE K562\n(n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p\nNK totais 21 7,8 23,2 <0,0001 21 1,7 5,0 0,0009 17 0,7 0,9 ns\nCD56dim 21 8,9 27,5 <0,0001 21 2,1 5,2 0,0009 18 0,7 0,7 ns\nCD56brigth 17 5,1 23,0 <0,0001 17 1,7 5,2 0,0005 15 0,4 0,7 ns\nCD56dimCD16+ 20 9,3 29,1 <0,0001 20 2,5 5,7 0,0020 17 0,9 0,8 ns\nCD56dimCD16- 20 25,7 39,2 <0,0001 20 1,9 8,3 0,0013 17 0,9 0,7 ns\nCD56brightCD16+ 4 5,0 14,6 NA 4 0,6 2,1 NA 4 0,9 1,4 NA\nCD56brightCD16- 16 5,6 31,0 <0,0001 16 2,8 8,2 0,0182 13 1,3 1,4 ns\nEDT SE K562 EDT SE K562 EDT SE K562\n(n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p\nNK totais 21 358,0 422,0 <0,0001 21 84 80,7 ns 17 127,0 115,0 ns\nCD56dim 21 350,0 411,0 <0,0001 21 84 83,2 ns 18 119,0 113,5 ns\nCD56brigth 17 463,0 529,0 0,0003 17 71 69,0 ns 15 143,0 138,0 0,0173\nCD56dimCD16+ 20 347,0 412,5 <0,0001 20 76 78,9 ns 17 90,1 94,2 ns\nCD56dimCD16- 20 303,0 378,0 <0,0001 20 80 91,0 ns 17 144,0 139,0 0,0359\nCD56brightCD16+ 4 498,0 557,0 NA 4 70 66,9 NA 4 72,7 44,5 NA\nCD56brightCD16- 16 462,0 543,5 0,0010 16 69 72,0 ns 13 158,0 142,0 ns\nSE x K562 (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nSE x K562 (frequência de células com expressão, %)\nCD107a IFN-γ IL-10\nSubpopulações\nSubpopulações\n \n \nEDT: grupo endometriose; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); SE: condição basal, sem estímulo; K562: estímulo com células K562; NK \ntotais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+med: mediana; n: número de mulheres analisadas para cada \nsubpopulação; em negrito: valores de p considerados significantes (<0,05, na análise entre SE e K562); em negrito e sublinhado: diferença ausente no grupo CTR; em vermelho: \nvalores de medianas significantes aumentadas em relação à condição SE; em azul: valores de medianas significantes e diminuído s em relação à condição SE; ns: não \nsignificantes (p≥ 0,05); NA: não analisado; valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. \n \n\n107 \n \nContinuação da Tabela 11. Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e das intensidades \nde expressão, nas subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com e ndometriose e controles, entre as condições sem estímulo e \napós estímulo com células K562 \n \nB) Grupo controle \n \nCTR SE K562 CTR SE K562 CTR SE K562\n(n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p\nNK totais 20 8,5 30,6 <0,0001 20 1,1 5,7 <0,0001 16 0,6 0,6 ns\nCD56dim 20 10,9 32,3 <0,0001 20 1,1 5,7 <0,0001 16 0,6 0,6 ns\nCD56brigth 17 6,9 29,9 <0,0001 17 1,1 6,2 0,0001 14 0,9 0,9 ns\nCD56dimCD16+ 18 8,3 38,3 <0,0001 18 1,4 5,1 0,0003 16 0,6 0,7 ns\nCD56dimCD16- 19 18,3 34,7 0,0005 19 1,3 9,2 <0,0001 15 0,7 0,8 ns\nCD56brightCD16+ 8 2,7 19,5 0,0078 8 1,1 2,3 ns 7 0,0 1,0 ns\nCD56brightCD16- 17 5,3 38,1 <0,0001 15 0,3 8,2 0,0002 13 0,8 0,6 ns\nCTR SE K562 CTR SE K562 CTR SE K562\n(n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p\nNK totais 20 336,0 441,5 0,0001 20 97,2 112,5 0,0153 16 49,1 81,8 ns\nCD56dim 20 327,5 433,5 <0,0001 20 99,4 113,5 0,0140 16 37,0 77,6 ns\nCD56brigth 17 444,0 539,0 <0,0001 17 92,7 126,0 0,0079 14 131,5 133,0 ns\nCD56dimCD16+ 18 322,0 391,5 0,0016 18 86,9 94,5 0,0159 16 3,0 13,4 ns\nCD56dimCD16- 19 340,0 455,0 0,0005 19 122,0 143,0 0,0237 15 138,0 140,0 0,0244\nCD56brightCD16+ 8 466,0 533,0 0,0078 8 111,5 123,5 ns 7 84,8 108,0 ns\nCD56brightCD16- 17 438,0 522,0 <0,0001 15 104,0 127,0 0,0151 13 143,0 154,0 ns\nSE x K562 (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nSE x K562 (frequência de células com expressão, %)\nCD107a IFN-γ IL-10\nSubpopulações\nSubpopulações\n \n \nCTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); SE: condição basal, sem estímulo; K562: estímulo com células K562 NK totais: \nincluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; med: mediana; n: número de mulheres analisadas para cada \nsubpopulação; em negrito: valores de p considerados significantes (<0,05, na análise entre SE e K562); em negrito e sublinhado: diferença ausente no grupo EDT; em vermelho: \nvalores de mediana aumentados em relação à condição SE; ns: não significantes (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. \n\n108 \n \nS E E s t. K 5 6 2\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nC T R : C D 5 6 d im (n = 2 0 )\n C D 1 0 7 a (% )\np < 0 ,0 0 0 1\nA )\nS E E s t. K 5 6 2\n0\n5\n1 0\n1 5\n2 0\n3 0\n4 0\nC T R : C D 5 6 d im (n = 2 0 )\nIF N  (% )\np < 0 ,0 0 0 1\nB )\nS E E s t. K 5 6 2\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\nC T R : C D 5 6 d im C D 1 6 - (n = 1 5 )\nIL -1 0 (M F I)\np = 0 ,0 2 4 4\nC )\n \nS E E s t. K 5 6 2\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nE D T : C D 5 6 d im (n = 2 1 )\nC D 1 0 7 a (% )\np < 0 ,0 0 0 1\nD )\nS E E s t. K 5 6 2\n0\n5\n1 0\n1 5\n2 0\n3 0\n4 0\nE D T : C D 5 6 d im (n = 2 1 )\nIF N -  (% ) p = 0 ,0 0 0 9\nE )\nS E E s t. K 5 6 2\n0\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\nE D T : C D 5 6 d im C D 1 6 - (n = 1 7 )\nIL -1 0 (M F I) p = 0 ,0 3 5 9\nF )\n \nFigura 38. Alterações significativas ocorridas após o estímulo com K562 (Est. K562), em relação \nà condição sem estímulo, em mulheres com endometriose e controles. A) frequência de expressão \nde CD107a na subpopulação CD56 dim, em CTR; B) frequência de expressão de IFN-y na subpopulação \nCD56dim, em CTR; C) intensidade de expressão (MFI) de IL -10 na subpopulação CD56 dimCD16-, em \nCTR; D) frequência de expressão de CD107a na subpopulação CD56 dim, na EDT; E) frequência de \nexpressão de IFN-y na subpopulação CD56 dim, na EDT; F) intensidade de expressão (MFI) de IL -10 na \nsubpopulação CD56 dimCD16-, na EDT; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; SE: condição \nbasal, sem estímulo; valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. \n \n \n► Grupo EDT vs grupo CTR: na comparação da expressão (% e MFI) das moléculas de \natividade NK entre os grupos EDT e CTR, frente ao estímulo com células K562, observamos \nalgumas diferenças (Figura 3 9 e Tabela 12) (valores de p determinados pelo teste de Mann-\nWhitney): \n \n• CD107a: apesar de não ter havido diferenças entre os grupos na condição sem \nestímulo, na presença de estímulo, observamos: \n - % de CD107a: EDT < CTR, em células CD56brightCD16-, p= 0,0455 \n - MFI para CD107a: EDT < CTR, em células: \n • NK totais p= 0,0233 \n • CD56dim p= 0,0308 \n • CD56bright p= 0,0097 \n \n• IFN-y: a diferença observada para a maior % de células com expressão de IFN-\ny na EDT, na condição sem estímulo (Figura 36), foi perdida na condição de estímulo \ncom células K562. No entanto, com est ímulo, observamos menor MFI na EDT, em \n\n109 \n \nrelação ao grupo CTR, em quase todas as subpopulações celulares de NK (Figura 37 e \nTabela 12): \n - MFI para IFN-y: EDT < CTR, em células: \n • NK totais p= 0,0233 \n • CD56dim p= 0,0308 \n • CD56dimCD16+ p= 0,0143 \n • CD56bright p= 0,0097 \n • CD56brightCD16- p= 0,0135 \n \n• IL-10: não foi observada diferença para a % de células entre os grupos. Porém, \nobservamos menor intensidade de expressão de IL -10 no grupo EDT em relação ao \ngrupo CTR: \n - MFI para IL-10: EDT < CTR, na subpopulação: CD56bright (p= 0,0222) \n \nNa Figura 39 apresentamos alguns exemplos de diferenças significantes na intensidade \nde expressão de CD107a, IFN -y ou IL -10, entre os grupos EDT e CTR, na subpopulação \nCD56bright. Na Tabela 12 estão os d ados de diferenças significantes para as moléculas \nenvolvidas na atividade efetora de células NK, CD107a, IFN-y ou IL-10, entre os grupos EDT e \nCTR, tanto para a frequência de células com produção, como para a intensidade de produção \n(MFI), nas diferentes subpopulações de células NK. \n \n \nE D T C T R \n-5 0\n0\n5 0\n1 0 0\n2 5 0\n5 0 0\n7 5 0\nC D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 )\nC D 1 0 7 a (M F I)\np = 0 ,0 0 9 7\nA )\nn = 1 7 n = 1 7\nE D T C T R\n-1 0 0\n-5 0\n0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 )\nIF N -  ( M F I)\np = 0 ,0 0 9 7\nB )\nn = 1 7 n = 1 7\nE D T C T R \n-4 0\n-2 0\n0\n2 0\n5 0\n1 0 0\n C D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 )\nIL -1 0 (M F I)\nC )\np = 0 ,0 2 2 2\nn = 1 5 n = 1 4\n \n \nFigura 3 9. Comparação da intensidade de expressão de moléculas envolvidas na atividade \nefetora de células NK na subpopulação CD56 bright circulantes, entre mulheres com endometriose \ne controles, na condição após estímulo com células K562. A) MFI de CD107a; B) MFI de IFN-y; C) \nMFI de IL -10; linha pontilhada: indica o valor de zero para MFI; as barras horizontais representam as \nmedianas de MFI de c ada grupo; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana e \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão); valores de p determinados pelo teste de Mann-\nWhitney. \n \n \n \n \n\n110 \n \nTabela 12 . Comparação entre as frequências de células com expressão d as moléculas \nCD107a, IFN-y ou IL-10 e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações de células \nNK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição após estímulo \ncom células K562. \n \nEDT CTR EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 21 14,5 20 20,7 ns 21 3,6 20 4,2 ns 17 -0,1 16 0,0 ns\nCD56dim 21 16,4 20 21,6 ns 21 4,1 20 4,2 ns 18 -0,1 16 0,1 ns\nCD56bright 17 18,2 17 23,0 ns 17 4,1 17 4,7 ns 15 0,1 14 -0,3 ns\nCD56dimCD16+ 20 20,4 18 28,6 ns 20 3,0 18 3,6 ns 17 -0,1 16 0,4 ns\nCD56dimCD16- 20 17,1 19 16,2 ns 20 5,7 19 8,2 ns 17 -0,1 15 0,1 ns\nCD56brightCD16+ 4 11,1 8 19,1 NA 4 3,2 8 1,2 NA 4 1,1 7 0,8 NA\nCD56brightCD16- 16 20,3 17 31,3 0,0445 16 6,1 15 8,2 ns 13 -0,1 13 0,0 ns\nEDT CTR EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 21 54,0 20 98,5 0,0233 21 -0,3 20 14,8 0,0278 17 0,0 16 4,7 ns\nCD56dim 21 51,0 20 97,0 0,0308 21 -0,4 20 15,6 0,0474 18 0,0 16 1,5 ns\nCD56brigth 17 57,0 17 102,0 0,0097 17 -1,3 17 13,3 0,0010 15 -10,0 14 1,5 0,0222\nCD56dimCD16+ 20 59,0 18 75,5 ns 20 -3,3 18 17,0 0,0143 17 0,0 16 0,0 ns\nCD56dimCD16- 20 103,0 19 106,0 ns 20 7,0 19 14,0 ns 17 -12,0 15 -5,0 ns\nCD56brightCD16+ 4 59,0 8 109,0 NA 4 -3,4 8 2,5 NA 4 -8,0 7 11,0 NA\nCD56brightCD16- 16 60,5 17 115,0 ns 16 1,4 15 10,1 0,0135 13 -14,0 13 -4,0 ns\nSubpopulações\nSubpopulações\nCD107a IFNγ IL-10\nEstímulo com K562 (frequência de células com expressão, %)\nCD107a IFNγ IL-10\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; med: mediana; NK \ntotais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; \nestímulo com K562: descont ando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi \nmaior do que com estímulo; n: número de mulheres analisadas para cada subpopulação; NA: não analisado; em \nnegrito: valores de p considerados significantes (p<0,05); em vermelho: valor da maior mediana significativa entre \nos grupos EDT e CTR; ns: não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \nAnálises de correlação entre as moléculas envolvidas na atividade de células NK, após \no estímulo com células K562: \n \n As análises para avaliar se há presença de correlação entre a expressão das moléculas \nCD107a e IFN -y e IL -10 foram realizadas, tanto para a % como para a intensidade de \nexpressão (MFI). Os valores de p e r foram determinados pelo teste de correlação de \nSpearman (Tabela 13): \n \n► Grupo CTR: correlações positivas entre: \n \n• IFN-y e CD1 07a (para % de expressão), em quase todas as subpopulações \ncelulares: NK totais (r=0,7, p=0,0007), CD56 dim (r=0,6, p=0,0058), CD56 bright (r=0,6, \np=0,0064) e CD56 dimCD16- (r=0,7, p=0,0011) (todas as correlações presentes apenas \nno grupo CTR). \n \n \n\n111 \n \n► Grupo EDT: correlações positivas entre: \n \n• IFN-y e IL -10 (para intensidade de expressão) nas subpopulações: CD56 dim \n(r=0,6, p=0,0048), CD56 bright (r=0,7, p= 0,0024), CD56 dimCD16+ (r=0,5, p= 0,0302) e \nCD56dimCD16- (r=0,6, p= 0,015) \n(Correlações previamente observadas na condição basal, sem estímulo - para a frequência de \nexpressão; todas essas correlações não foram observadas no grupo CTR). \n \nNa Figura 40 estão apresentados alguns exemplos de correlações positivas \nobservadas em ambos os grupos de estudo. Na Tabela 13 est ão apresentados os dados \nsignificantes de correlações observadas nos grupos EDT e CTR, tanto para a frequência como \npara a intensidade de produção, em cada subpopulação de células NK. \n \n \n \n5 1 0 1 5 2 0\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n IF N -  ( % )\nC D 1 0 7 a ( % )\nC T R : C D 5 6 d im (n = 2 0 )\nr= 0 ,6\np = 0 ,0 0 5 8\nA )\n \n-5 0 5 1 0 1 5\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n IF N -  ( % )\nC D 1 0 7 a ( % )\nC T R : C D 5 6 b rig h t (n = 2 0 )\nr= 0 ,6\np = 0 ,0 0 6 4\nB ) \nFigura 40. A nálise de correlação entre as frequências de células positivas, e entre as \nintensidades de expressão de moléculas de atividade efetora de células NK, em subpopulações \nde células NK circulantes, de mulheres do grupo controle, na condição após estímulo com K 562. \nA) correlação entre as frequências de expressão de IFN -y e CD0107, em células CD56dim; B) correlação \nentre as frequências de expressão de IFN -y e CD 107a, em CD56 bright; CTR: grupo controle; n: número \nde pares de dados analisados; valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n112 \n \nTabela 13. Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das \nmoléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e entre as intensidades de expressão, nas subpopulações \nde células NK circula ntes, em mulheres com endometriose (A) e controles (B), na condição \napós estímulo com células K562. \n \nA) Grupo endometriose \n \nEDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 21 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 18 ns ns 21 ns ns 18 ns ns\nCD56brigth 15 ns ns 17 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nEDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 21 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 18 0,0048 0,6 21 ns ns 18 ns ns\nCD56brigth 17 0,0024 0,7 17 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 0,0302 0,5 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 17 0,0150 0,6 20 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nCD107a x IL-10IFN-γ x IL-10\nEstímulo com K562 (frequência de células com expressão, %)\nIFN-γ x CD107a\nIFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10\nSubpopulações\nSubpopulações\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\n \n \nB) Grupo controle \n \nCTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 16 ns ns 20 0,0007 0,7 16 0,0436 -0,5\nCD56dim 16 ns ns 20 0,0058 0,6 16 ns ns\nCD56brigth 15 ns ns 17 0,0064 0,6 14 ns ns\nCD56dimCD16+ 16 ns ns 18 ns ns 16 ns ns\nCD56dimCD16- 15 ns ns 19 0,0011 0,7 15 ns ns\nCD56brightCD16+ 7 ns ns 8 ns ns 7 ns ns\nCD56brightCD16- 13 ns ns 15 ns ns 13 ns ns\nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 16 ns ns 20 ns ns 16 ns ns\nCD56dim 16 ns ns 20 ns ns 16 ns ns\nCD56brigth 15 ns ns 17 ns ns 14 ns ns\nCD56dimCD16+ 16 ns ns 18 ns ns 16 ns ns\nCD56dimCD16- 15 ns ns 19 ns ns 15 ns ns\nCD56brightCD16+ 7 ns ns 8 ns ns 7 ns ns\nCD56brightCD16- 13 ns ns 15 ns ns 13 ns ns\nSubpopulações\nIFN-γ x IL-10\nEstímulo com K562 (frequência de células com expressão, %)\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nIFN-γ x CD107a CD107a x IL-10\nIFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a CD107a x IL-10\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade \nde expre ssão); estímulo com K562: descont ando-se o valor basal (sem estímulo), NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; n: número \nde mulheres analisadas para cada subpopulação; em negrito: valore s de p significantes ( p<0,05) e \nrespectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correspondem a correlações diferenciais entre os grupos \nEDT e CTR; ns: não significante (p≥ 0,05), NA: não analisado; valores de p e r determinados pelo t este de \ncorrelação de Spearman. \n\n113 \n \n \n \n \n \n4.4.2.3 Na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA \n \n O bloqueio de MICA nas células K562 (K562BLOQ), represent ando o potencial efeito \nda presença de sMICA, praticamente não induziu modificações (Tabela 1 4), em relaç ão aos \neventos que ocorreram na condição com o estímulo com K562, sem bloqueio (Tabela 13). \nHouve apenas duas mudanças, estatisticamente significantes, e apenas no grupo EDT: \ndiminuição da porcentagem de células produtoras de IL -10 nas subpopulações CD56 bright (p= \n0,0479) e CD56 brightCD16- (p=0,0105) (Tabela 14 A). Ou seja, com o bloqueio de MICA, \npermaneceram as mesmas modificações induzidas pelo estímulo com K562, na ausência de \nbloqueio (valores de p determinados pelo teste pareado de Wilcoxon). \n \n \n \n \n \n \n\n114 \n \nTabela 14. Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10, e das intensidades de expressão, \nnas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose (A) e controles (B), entre as condições após es tímulo K562, e \napós estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. \n \nA) Grupo endometriose \n \nEDT K562 K562BLOQ EDT K562 K562BLOQ EDT K562 K562BLOQ\n(n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p\nNK totais 21 14,5 16,8 ns 21 3,6 3,0 ns 17 -0,1 -0,2 ns\nCD56dim 21 16,4 18,5 ns 21 4,1 3,1 ns 18 -0,1 -0,1 ns\nCD56brigth 15 17,7 18,4 ns 15 4,3 4,3 ns 13 0,1 -0,1 0,0479\nCD56dimCD16+ 20 20,3 29,0 ns 20 5,9 6,4 ns 17 0,8 0,6 ns\nCD56dimCD16- 20 17,1 20,5 ns 20 5,7 6,0 ns 17 -0,1 -0,1 ns\nCD56brightCD16+ 4 11,1 6,4 NA 4 2,1 6,4 NA 4 5,1 2,3 NA\nCD56brightCD16- 16 20,3 25,0 ns 16 6,1 3,3 ns 13 -0,1 -0,6 0,0105\nEDT K562 K562BLOQ EDT K562 K562BLOQ EDT K562 K562BLOQ\n(n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p\nNK totais 21 54,0 57,0 ns 21 -0,3 0,5 ns 17 -12,0 -15,0 ns\nCD56dim 21 51,0 69,0 ns 21 -0,4 2,1 ns 18 0,0 0,4 ns\nCD56brigth 15 60,0 65,0 ns 15 0,0 -0,3 ns 13 -5,7 -15,0 ns\nCD56dimCD16+ 20 59,0 55,5 ns 20 -3,3 -0,1 ns 17 0,0 0,0 ns\nCD56dimCD16- 20 103,0 121,5 ns 20 7,0 9,9 ns 17 -12,0 -6,0 ns\nCD56brightCD16+ 4 59,0 54,5 NA 4 -3,4 -5,4 NA 4 -8,0 -6,0 NA\nCD56brightCD16- 16 60,5 70,5 ns 16 1,4 2,0 ns 13 -14,0 -14,0 ns\nCD107a IFN-γ IL-10\nK562 x K562BLOQ (frequência de células com expressão, %)\nCD107a IFN-γ IL-10\nSubpopulações\nSubpopulações\nK562 x K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\n \n \nEDT: grupo endometriose; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); K562: estímulo com células K562 descontando-se o valor basal (sem \nestímulo; K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontado do valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do \nque com estímulo; med: mediana; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; n: número de mulheres \nanalisadas para cada subpopulação; em negrito : valores de p significantes (p<0,05); em negrito e sublinhado: diferença ausente no grupo CTR; em azul: valor da mediana \ndiminuída em relação ao estímulo com K562 sem bloqueio; ns: não significante ( p≥ 0,05); NA: não analisado; valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, \nde Wilcoxon. \n \n \n\n115 \n \nContinuação Tabela 14. Comparação das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10, e das intensidades de \nexpressão, nas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose (A) e controles (B), entre as condições após \nestímulo K562, e após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. \n \nB) Grupo controle \nCTR K562 K562BLOQ CTR K562 K562BLOQ CTR K562 K562BLOQ\n(n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p (n) med (%) med (%) p\nNK totais 19 21,2 17,3 ns 19 4,2 4,5 ns 14 0,0 0,3 ns\nCD56dim 19 22,0 22,0 ns 19 4,2 4,4 ns 14 0,1 0,3 ns\nCD56brigth 16 24,7 22,6 ns 16 5,2 5,6 ns 12 -1,8 -1,3 ns\nCD56dimCD16+ 17 29,1 25,8 ns 17 3,3 3,1 ns 13 0,4 0,5 ns\nCD56dimCD16- 18 16,0 13,9 ns 18 12,7 11,3 ns 14 -0,2 0,2 ns\nCD56brightCD16+ 7 21,2 30,3 ns 7 0,3 0,9 ns 5 0,0 0,3 ns\nCD56brightCD16- 15 38,0 22,0 ns 14 8,3 6,2 ns 11 0,0 0,0 ns\nCTR K562 K562BLOQ CTR K562 K562BLOQ CTR K562 K562BLOQ\n(n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p (n) med (MFI) med (MFI) p\nNK totais 19 108,0 87,0 ns 19 17,0 18,0 ns 14 4,7 19,8 ns\nCD56dim 19 107,0 87,0 ns 19 17,0 20,1 ns 14 1,5 21,2 ns\nCD56brigth 16 102,5 112,0 ns 16 14,1 15,8 ns 12 1,5 3,7 ns\nCD56dimCD16+ 17 76,0 94,0 ns 17 18,0 20,0 ns 13 0,0 0,0 ns\nCD56dimCD16- 18 102,0 83,0 ns 18 11,5 11,0 ns 14 -5,5 -2,5 ns\nCD56brightCD16+ 7 126,0 99,0 ns 7 2,0 6,4 ns 5 1,7 4,0 ns\nCD56brightCD16- 15 121,0 157,0 ns 14 10,3 9,8 ns 11 -2,0 -12,0 ns\nK562 x K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nCD107a IFN-γ\nK562 x K562BLOQ (frequência de células com expressão, %)\nIL-10\nSubpopulações\nSubpopulações\n \nCTR: grupo controle; MFI: mediana de intensidade d e fluorescência (intensidade de expressão); K562: estímulo com células K562 descontando-se o valor basal (sem \nestímulo; K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi \nmaior do que com estímulo; med: mediana; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+;n: número \nde mulheres analisadas para cada subpopulação; ns: não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. \n\n116 \n \n Apesar de o bloqueio de MICA, praticamente, não ter modificado o que ocorreu com o \nestímulo com K562, na análise do balanço final entre os grupos EDT e CTRs (teste de Mann-\nWhitney), na condição de bloqueio, observamos algumas diferenças significativas: \n(i) Menor intensidade de expressão de IFN-y no grupo EDT em 5 populações celulares, NK \ntotais ( p= 0,0084), CD56 dim (p= 0,0128), CD56 bright (p= 0,0308), CD56 dimCD16+ (p= \n0,0126) e CD56brightCD16- (p= 0,0308), em comparação com o grupo CTR (valores de p \ndeterminados pelo teste de Mann Whitney ) (Tabela 15). Destacamos que essas \ndiferenças já eram estatisticamente significantes na condição sem bloqueio, para as \nmesmas populações (Tabela 12); \n(ii) Ainda em relação a IFN -y, o bloqueio induziu uma diferença significativa que não havia \nna condição apenas com estímulo K562: menor frequência de células CD56 brightCD16-\nprodutoras de IFN-y no grupo EDT (p= 0,0275, teste de Mann Whitney) (Tabela 15); \n(iii) As outras diferenças encontradas entre os grupos EDT e CTR, após o bloqueio de MICA, \nforam em relação à IL -10: menor porcentagem de células CD56 dim produtoras de IL-10, \nno grupo EDT ( p= 0,0067); e menor intensidade de expressão de IL -10 no grupo EDT, \npara célula s NK totais ( p= 0,0308), em relação ao grupo CTR. Essas diferenças não \nforam significativas na condição após estímulo com K562 sem bloqueio (Tabela 12). \nEncontramos também menor intensidade de expressão de IL-10 na população de células \nCD56bright (p= 0,0329) do grupo EDT, mas essa diferença já era significativa na condição \napós estímulo K562 sem bloqueio (Tabela 12); (valores de p determinados pelo teste de \nMann Whitney ). Esses dados comparativos, entre os grupos EDT e CTR, estão \napresentados na Tabela 15. \n \n Em relação à expressão de CD107a, é interessante destacar que a diferença de menor \n% de células produtoras para CD56 brightCD16- no grupo EDT, em relação ao grupo CTR, \nobservada na condição após estímulo com células K562 ( p= 0,0445, teste de Mann-Whitney; \n(Tabela 12), desapareceu na condição K562 com bloqueio de MICA ( p= ns, teste de Mann-\nWhitney; Tabela 15). O mesmo ocorreu para a intensidade de expressão de CD107a, para NK \ntotais (p= 0,0233) CD56dim (p= 0,0308) e CD56 bright (p= 0,0097) (Tabela 12) na condição após \nestímulo com células K562; desapareceu a diferença de menor intensidade de expressão na \nEDT, em relação ao rupo CTR, na condição K562 com bloqueio de MICA ( p= ns, teste de \nMann-Whitney; Tabela 15). \n Ou seja, com bloqueio de MICA, não observamos diferenças significativas para \nCD107a entre os grupos EDT e CTR (Tabela 15), apesar de terem ocorrido diferenças na \ncondição de estímulo com K562 sem bloqueio (Tabela 12). \n Todos os dados das análises individuais de mulheres dos grupos CTR e EDT, tanto \npara a frequência (%) como para a intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN -y e \n\n117 \n \nIL-10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo com células K562, e com células \nK562 pós bloqueio para MICA, estão apresentados no Anexo X, Tabela 3. \n \n \nTabela 15 . Comparação entre as frequências de células com expressão das moléculas \nCD107a, IFN -y ou IL -10 e entre as sus intensidades de expressão, nas subpopulações de \ncélulas NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, na condição de \nestímulo com K562 bloqueadas para a proteína MICA. \n \nEDT CTR EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 21 16,8 19 17,3 ns 21 3,0 19 4,5 ns 17 -0,2 14 0,3 ns\nCD56dim 21 18,5 19 22,0 ns 21 3,1 19 4,4 ns 18 -0,1 14 0,3 0,0067\nCD56brigth 16 17,3 17 24,1 ns 16 3,4 17 5,8 ns 13 -0,1 13 -0,1 ns\nCD56dimCD16+ 20 29,0 17 25,8 ns 20 1,8 17 3,1 ns 17 0,0 13 0,5 ns\nCD56dimCD16- 20 20,5 18 13,9 ns 20 6,0 18 5,0 ns 17 -0,1 14 0,2 ns\nCD56brightCD16+ 4 14,4 7 30,3 NA 4 6,4 7 0,9 NA 4 1,1 5 0,3 NA\nCD56brightCD16- 16 25,0 15 22,0 ns 16 3,3 14 8,9 0,0275 13 -0,6 11 0,0 ns\nEDT CTR EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 21 57,0 19 87,0 ns 21 0,5 19 18,0 0,0084 17 0,0 14 19,8 0,0308\nCD56dim 21 69,0 19 87,0 ns 21 2,1 19 20,1 0,0128 18 0,4 14 21,2 ns\nCD56brigth 16 61,5 17 81,0 ns 16 -0,7 14 8,0 0,0308 13 -15,0 13 8,0 0,0329\nCD56dimCD16+ 20 55,5 17 94,0 ns 20 -0,1 17 20,0 0,0126 17 0,0 13 0,0 ns\nCD56dimCD16- 20 121,5 18 83,0 ns 20 9,9 18 11,0 ns 17 -6,0 14 -2,5 ns\nCD56brightCD16+ 4 54,5 7 99,0 NA 4 -5,4 7 6,4 NA 4 -6,0 6 9,8 NA\nCD56brightCD16- 16 70,5 15 157,0 ns 16 2,0 14 9,8 0,0308 13 -14,0 11 -12,0 ns\nEstímulo com K562BLOQ (frequência de células com expressão, %)\nCD107a IFNγ IL-10\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFNγ IL-10\nSubpopulações\nSubpopulações\n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência; n: \nnúmero de mulheres analisadas para cada subpopulação; K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para \nMICA, descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que \ncom estímulo; em negrito: valores de p significantes (p<0,05); em vermelho: valor da maior mediana significante \nentre os grupos EDT e CTR; ns: não significante ( p≥ 0,05); NA: não analisado; valores de p determinados pelo \nteste de Mann-Whitney. \n \n \n❖ Análise de correlação entre a expressão das moléculas envolvidas na atividade \nde células NK, após o estímulo com células K562 bloqueadas para MICA: \n \n As análises para avali ação da ocorrência ou não de correlação foram realizadas, tanto \npara a % como para a intensidade de expressão. Os valores de p e r foram determinados pelo \nteste de correlação de Spearman (Tabela 16): \n \n► Grupo CTR: algumas correlações foram mantidas, outras perdidas, e novas surgidas, \nna condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA: \n• IFN-y e CD107a : correlações positivas para % de expressão: mantiveram -se algumas \ncorrelações positivas para as populações celulares previamente encontradas na \ncondição de estímulo com K562 sem bloqueio: NK totais (r=0,5, p= 0,0161), CD56dim \n\n118 \n \n(r= 0,5, p= 0,0169), e CD56 dimCD16- (r= 0,8, p= 0,0001) e surgiu outra, \nCD56brightCD16- (r= 0,7, p= 0,0088). \n \n• IFN-y e IL-10: correlações positivas para intensidade de expressão, nas subpopulações \nCD56bright (r=0,6, p=0,0381) e CD56 brightCD16- (r=0,8, p=0,0027) (correlações \nausentes na condição K562 sem bloqueio). \n \n• CD107a e IL -10: correlação negativa para intensidade de expressão para a \nsubpopulação CD56 dimCD16+ (r= -0,6, p= 0,0485) (correlação ausente na condição \nK562 sem bloqueio). \n \n► Grupo EDT: algumas correlações foram mantidas, outras perdidas, e novas surgidas, \nna condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA: \n \n• IFN-y e IL -10: para % expressão, nas subpopulações: CD56 dim (r=0,5, p=0,0326) \n(correlação positiva ) e CD56 bright (r= -0,7, p= 0,0182) ( correlação negativa ) (não \nobservadas com estímulo com K562 sem bloqueio). Para a intensidade de \nexpressão: correlação positiva em NK totais (r=0,6, p=0,0173) (não observada sem \nbloqueio); CD56 dim (r=0,6, p=0,0068) e CD56 bright (r=0,7, p= 0,0054) (previamente \nobservadas na condição com K562 sem bloqueio); as correlações CD56 dimCD16- e \nCD56dimCD16- observadas na condição sem bloqueio, foram perdidas na condição de \nK562 bloqueada para MICA. \n \n• CD107a e IFN-y: para % de expressão, novas correlações positivas: em NK totais \n(r=0,4, p= 0,0451) e CD56 dim (r=0,5, p= 0,0175). Essas correlações também foram \nobservadas no grupo CTR. \n \nNa Tabela 16 estão apresentados os dados significantes de correlações observadas \nnos grupos EDT e CTR, tanto para a frequência como para a intensidade de produção das \nmoléculas, em cada subpopulação de células NK. \n \n \n \n \n \n \n \n\n119 \n \nTabela 16. Análise de correlação entre as frequências de células com expressão das \nmoléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 e entre suas intensidades de exp ressão, nas \nsubpopulações de células NK circulantes de mulheres com endometriose (A) e controles (B), \nna condição após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. \n \nA) Grupo endometriose \n \nEDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 21 0,0451 0,4 17 ns ns\nCD56dim 18 0,0326 0,5 21 0,0175 0,5 18 ns ns\nCD56brigth 13 0,0182 -0,7 16 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nEDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 17 0,0173 0,6 21 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 18 0,0068 0,6 21 ns ns 18 ns ns\nCD56brigth 13 0,0054 0,7 16 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 13 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nIFN-γ x CD107a CD107a x IL-10IFN-γ x IL-10\nEstímulo com K562BLOQ (frequência de células com expressão, %)\nIFN-γ x CD107a\nSubpopulações\nSubpopulações\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a x IL-10IFN-γ x IL-10\n \n \nB) Grupo controle \n \nCTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 13 ns ns 19 0,0161 0,5 17 ns ns\nCD56dim 14 ns ns 19 0,0169 0,5 14 ns ns\nCD56brigth 13 ns ns 17 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 13 ns ns 17 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16- 14 ns ns 18 0,0001 0,8 14 ns ns\nCD56brightCD16+ 5 ns ns 7 ns ns 5 ns ns\nCD56brightCD16- 11 ns ns 14 0,0088 0,7 13 ns ns\nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n)\nNK totais 14 ns ns 19 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 14 ns ns 19 ns ns 14 ns ns\nCD56brigth 13 0,0381 0,6 17 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 13 ns ns 17 ns ns 13 0,0485 -0,6\nCD56dimCD16- 14 ns ns 18 ns ns 14 ns ns\nCD56brightCD16+ 5 ns ns 7 ns ns 5 ns ns\nCD56brightCD16- 11 0,0027 0,8 14 ns ns 13 ns ns\nSubpopulações\nIFN-γ x IL-10\nIFN-γ x IL-10 IFN-γ x CD107a\nEstímulo com K562BLOQ (frequência de células com expressão, %)\nCD107a x IL-10\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nIFN-γ x CD107a CD107a x IL-10\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência \n(intensidade de expressão); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, descontando-se o \nvalor basal (sem estímulo); n: número de pares de dados analisados para cada subpopulação ; em negrito: valores \nde p significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correspondem a correlações \ndiferenciais entre os grupos EDT e CTR; as análises foram realizadas a partir de valores de mediana da \nporcentagem de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 e de suas MFIs, nas diferentes \nsubpopulações de NK; ns: não significante (p≥ 0,05); NA: não analisado; valores de p e r determinados pelo t este \nde correlação de Spearman. \n\n120 \n \n4.4.3 Expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e relação \naos níveis de MICA solúvel \n Uma vez que MICA solúvel pode diminuir a ativi dade citotóxica de células NK via \nligação e internalização do receptor NKG2D, avaliamos a presença de correlação entre os \nníveis de MICA solúvel (sMICA) no soro (sistêmico) ou no fluido peritoneal (FP; no local da \nlesão) e a expressão das moléculas importa ntes na atividade efetora (CD107a, IFN -y) e \nreguladora de células NK (IL -10) (% e intensidade) no grupo CTR e EDT. Esta análise foi \nrealizada em células NK totais e suas subpopulações: CD56 bright e CD56 dim, com ou sem a \nexpressão da molécula CD16, também e nvolvida na citotoxicidade pelas células NK, mas via \nADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpos). As análises foram realizadas para as \ncondições: basal de cultura (sem estímulo), com estímulo de células K562 e com estímulo de \ncélulas K562 bloqueadas para MICA (K562BLOQ). \n Ressaltamos que não foi realizada a análise para a subpopulação CD56brightCD16+, em \nmulheres com EDT, uma vez que poucas amostras tiveram número de eventos igual ou maior \nou de 100 (valor de corte para análise). \n Todas as anális es de correlação, com determinação de valores de r e p, f oram \nrealizadas pelo teste de correlação de Spearman. \n \n \n \n4.4.3.1 Moléculas vs MICA solúvel: na condição basal de cultura \n► Grupo CTR: \n \n• CD107a e sMICA: observamos duas correlações positivas: \ni) % de células CD107a + e sMICA no fluido peritoneal, em células: NK totais \n(r=0,5, p= 0,0316) e CD56dimCD16- (r=0,6, p= 0,0249) (Figura 41). \n \n• IFN-y e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) \nde IFN-y e níveis de sMICA totais (negativos e positivos, no soro ou FP). \n \n• IL-10 e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) \nde IL-10 e níveis de sMICA totais (soro ou FP). \n \n \n \n \n \n\n121 \n \n► Grupo EDT: \n \n• CD107a e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e \nMFI) de CD107a e níveis de sMICA (soro ou FP). \n \n• IFN-y e sMICA: observamos correlação positiva (Figura 41): \ni) % de células IFN -y + e níveis de sMICA no soro , nas subpopul ações: \nCD56dim (r=0,5, p= 0,0393) e CD56dimCD16+ (r=0,5, p= 0,0277) \n \n• IL-10 e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de \nIL-10 e níveis de sMICA (soro ou FP). \n \n Os dados significantes das análises de correlação entre a frequênci a de células \npositivas ou entre a intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 com \nníveis de sMICA (soro e FP) estão no Anexo X, Tabela 4. \n \n \n0 2 0 4 0 6 0 8 0\n0\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\n C T R : C D 5 6 d im C D 1 6 - (n = 1 7 )\nC D 1 0 7 a (% )\ns M IC A p g /m L (F P )\nA )\nr= 0 ,6\np = 0 ,0 2 4 9\n \n0 5 1 0 1 5 2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nIF N -  (% )\ns M IC A p g /m L ( s o r o )\nB ) E D T : C D 5 6 d im (n = 2 1 )\nr= 0 ,5\np = 0 ,0 3 9 3 \n \nFigura 41. Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas e expressão de \nmoléculas de atividade efetora de células NK, em subpopulações de células NK circulantes, com \nníveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e controles, na condição basal de cultura, \nsem estímulo. A ) correlação entre as frequências de expressão de CD0107 e níveis de sMICA em \nfluido peritoneal, na subpopulação CD56 dimCD16-, no grupo CTR; B) correlação entre as frequências de \nexpressão de IFN-y e níveis de sMICA no soro, na subpopulação CD56 dim, no grupo EDT; EDT: grupo \nendometriose; CTR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peritoneal; n: número de pares de \ndados analisados; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r \ndeterminados pelo teste de correlação de Spearman. \n \n \n4.4.3.2 Moléculas vs MICA solúvel: na condição de estímulo com células K562 \n► Grupo CTR: \n\n122 \n \n• CD107a e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e \nMFI) de CD107a com estímulo com células K562 e níveis de sMICA do grupo total \nde positivos e negativos (soro ou FP). \n• IFN-y e sMICA: observamos duas correlações negativas: \ni) % de células IFN -y + e níveis de sMICA no FP , na subpopulação CD56bright \n(r=-0,7, p= 0,0032) (Figura 42). \nii) intensidade de expressão de IFN -y e níveis de sMICA no soro , na \nsubpopulação CD56brightCD16- (r=-0,7, p= 0,014). \n \n• IL-10 e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e MFI) de \nIL-10 com estímulo com células K562 e níveis de sMICA do grupo total de positivos \ne negativos (soro ou FP). \n Os dados das análises de correlação estão apresentados no Anexo X, Tabela 5A. \n \n► Grupo EDT: \n \n Também na endometriose, observamos diversas correlações negativas, sendo apenas \numa semelhante àquelas observadas no grupo CTR (Figura 42, e Anexo X, Tabela 5B): \n \n• CD107a e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e \nMFI) de CD107a com estímulo com células K562 e níveis de sMICA do grupo total \nde positivos e negativos (soro ou FP). \n \n• IFN-y e sMICA: observamos correlações negativas: \ni) % de células IFN -y+ e níveis de sMICA no soro , na subpopulação \nCD56brightCD16- (r= -0,5, p= 0,0413) (semelhante ao grupo CTR, na mesma \nsubpopulação, mas para MFI) \nii) % de células IFN -y+ e níveis de sMICA no FP , nas populações ( correlações \nnegativas não observadas no grupo CTR): \n • NK totais (r= -0,5, p= 0,0279), \n • CD56dim (r= -0,5, p= 0,0373), \n • CD56dim CD16+ (r= -0,5, p= 0,0468) \n • CD56dim CD16- (r= -0,6, p= 0,0076) \niii) intensidade de expressão de IFN -y e níveis de sMICA no FP , nas \nsubpopulações (correlações negativas não observadas no grupo CTR): \n • CD56dim (r= -0,4, p=0,0434) \n • CD56dimCD16+ (r= -0,5, p=0,0488) \n • CD56dimCD16- (r= -0,5, p=0,0435) \n\n123 \n \n• IL-10 e sMICA: não foram encontradas correlações entre a expressão (% e \nMFI) de IL -10 com estímulo com células K562 e níveis de sMICA do grupo total de \npositivos e negativos (soro ou FP) (p≥ 0,05, correlação de Spearman). \n \n-5 0 5 1 0 1 5\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\n C T R : C D 5 6 b rig h t (n = 1 5 )\nIF N -  (% )\ns M I C A p g / m L ( F P )\nA )\nr= -0 ,7\np = 0 ,0 0 3 2\n \n-1 0 1 0 2 0\n-2 0 0\n2 0 0\n4 0 0\n6 0 0\nE D T : C D 5 6 d im (n = 2 1 )\n IF N -  ( % )\ns M I C A p g / m L ( F P )\nB )\nr= -0 ,5\np = 0 ,0 3 7 3 \n \nFigura 42. Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas para a expressão de \nIFN-y em subpopulações de células NK circulantes, com níve is de MICA solúvel no fluido \nperitoneal de mulheres com endometriose e de controles, na condição com estímulo com células \nK562. A) correlação entre as frequências de expressão de IFN -y e níveis de sMICA em fluido peritoneal \n(FP), na subpopulação CD56 bright, em CTRs; B) correlação entre as frequências de expressão de IFN -y \ne níveis de sMICA no FP, na subpopulação CD56 dim, no grupo EDT; EDT: grupo endometriose; CTR: \ngrupo controle; sMICA: MICA solúvel; n: número de pares de dados analisados; níveis de sMICA \nanalisados por ELISA (Resultados, item 4.3); ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p e r \ndeterminados pelo teste de correlação de Spearman. \n \n \n4.4.3.3 Moléculas vs MICA solúvel: na condição estímulo com células K562 bloqueadas \npara MICA \nObservamos que, após o estímulo com células K562 bloqueadas para MICA \n(K562BLOQ), algumas correlações foram mantidas em relação à condição de estímulo com \nK562 sem bloqueio. Destacamos também, que novas correlações foram detectadas na \npresença de K562BLOQ, que representa a presença de MICA solúvel. \n \n► Grupo CTR: \n Foram observadas tanto correlações positivas como negativas (Figura 4 3 e Anexo X, \nTabela 6): \n \n• CD107a e sMICA: observamos correlação positiva: \ni) % de células CD107a+ e níveis sMICA no FP, na subpopulação \nCD56brightCD16+ (r= 0,8, p= 0,0476) ( correlação positiva não encontrada na \ncondição com estímulo de K562 sem bloqueio para MICA) (Correlação de \nSpearman). \n \n• IFN-y e sMICA: observamos correlação negativa: \n\n124 \n \nii) intensidade de expressão de IFN -y e níveis sMICA no soro, na \nsubpopulação CD56 brightCD16- (r= -0,7, p= 0,0152) ( correlação negativa, \nsemelhante à encontrada na condição com estímulo de K562 sem bloqueio) \n(Correlação de Spearman). \n• IL-10 e sMICA: observamos correlações negativas: \n \niii) de células IL-10+ e níveis de MICA no soro, para as subpopulações: \n • CD56dim (r= -0,6, p= 0,0175) \n • CD56dimCD16+ (r= -0,6, p= 0,0455) (correlação negativa não \n encontrada na condição com estímulo de K562 sem bloqueio para MICA) \n (Correlação de Spearman). \niv) intensidade de expressão de IL -10 e níveis de sM ICA no soro , para as \nsubpopulações ( correlações negativas , ausentes com estímulo de K562 sem \nbloqueio) (Correlação de Spearman): \n • NK totais (r= -0,7, p= 0,0105) \n • CD56dim (r= -0,7, p= 0,0152) \n • CD56dimCD16+ (r= -0,6, p= 0,0417) \n • CD56dimCD16- (r= -0,7, p= 0,0012) \n \n► Grupo EDT: foram observadas apenas correlações negativas (Figura 43 e Anexo X, \nTabela 6) \n \n• CD107a e sMICA: \ni) % de células CD107a+ e níveis de MICA no soro, para a subpopulação \nCD56dimCD16+ (r= -0,5, p= 0,0192) ( correlação negativa não encontrada na \ncondição com estímulo de K562 sem bloqueio para MICA) (Correlação de \nSpearman). \nii) intensidade de expressão de CD107a e níveis de sMICA no soro, em células \nCD56brightCD16- (r= -0,5, p= 0,0390) ( correlação negativa não observada no \nestímulo de K562 sem bloqueio, e não encontrada no grupo CTR ) (Correlação \nde Spearman). \niii) intensidade de expressão de CD107a e níveis de sMICA no FP, em células \nCD56bright (r= -0,7, p= 0,0057) (correlação negativa não observada no estímulo \nde K562 sem bloqueio, e não enc ontrada no grupo CTR ) (Correlação de \nSpearman). \n \n• IFN-y e sMICA: \n\n125 \n \ni) % de células IFN-y+ e níveis de sMICA no soro, em células NK totais (r= -0,5, \np=0,0366) (semelhante àquela encontrada na condição com estímulo com \nK562 sem bloqueio, mas foi para células CD56 brightCD16-; correlação negativa \nnão encontrada no grupo CTR) \nii) % de células IFN -y+ e níveis de sMICA no FP, na subpopulação \nCD56dimCD16- (r= -0,5, p=0,0444) (semelhante ao encontrado na condição com \nestímulo com K562 sem bloqueio, mas com perda de correlaçã o para células \nNK totais, CD56 dim e CD56 dimCD16-; correlação negativa não encontrada no \ngrupo CTR) (Correlação de Spearman). \n \n• IL-10 e sMICA: \niii) % de células IL-10+ e níveis de sMICA no soro, na subpopulação CD56dim (r= \n-0,5, p=0,0427) ( correlação negativa não observada no estímulo de K562 sem \nbloqueio; mas semelhante a encontrada no grupo CTR) \n \n \n0 2 0 4 0 6 0\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n2 5 0\nC D 1 0 7 a (% )\ns M IC A p g /m L (s o ro )\nC T R : C D 5 6 b rig h tC D 1 6 + (n = 7 )A )\nr= 0 ,8\np = 0 ,0 4 7 6\n \n-4 0 -2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\nE D T : C D 5 6 d im C D 1 6 + (n = 2 0 )\nC D 1 0 7 a (% )\ns M IC A p g /m L (s o ro )\nB )\nr= -0 ,5\np = 0 ,0 1 9 2 \n \nFigura 4 3. Análise de correlação entre a frequência (%) de células positivas para a expressão \nCD107a em subpopulações de células NK circulantes, com níveis de MICA solúvel de mulheres \ncom endometriose e de controles, na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para \nMICA. A) correlação entre as frequências de expressão de CD107a e níveis de sMICA no sor o, na \nsubpopulação CD56brightCD16+, em CTRs; B) correlação entre as frequências de expressão de CD107a \ne níveis de sMICA no soro, na subpopulação CD56dimCD16+, no grupo EDT; EDT: grupo endometriose; \nCTR: grupo controle; sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peri toneal; n: número de pares de dados \nanalisados; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados \npelo teste de correlação de Spearman. \n \n \n Na Tabela 17, apresentamos um balanço dos principais resultados da correlaçã o entre \na expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL-10, e os níveis de MICA solúvel, no soro e no \nfluido peritoneal. \n\n126 \n \nTabela 17. Balanço dos principais resultados da correlação entre a expressão de moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e \nníveis de MICA solúvel. \n \n \nNK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; sMICA: MICA solúvel; K562BLOQ: células K562 \nbloqueadas para MICA; FP: fluido peritoneal; em negrito e sublinhado: corr elações diferenciais entre o grupo EDT e CTR; em vermelho: correlações positivas; em azul: \ncorrelações negativas; SC: sem correlação; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman.\n\n127 \n \nResumo do balanço dos principais resultados da correlação entre a expressão de \nmoléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e níveis de MICA solúvel: \n \nNa condição basal, sem estímulo, mulheres do grupo CTR tiveram correlações positivas en tre \na % CD107a e níveis de sMICA no FP e entre a intensidade de expressão de IFN -γ. \nDiferentemente do grupo CTR, apenas na EDT houve correlação positiva entre a % de IFN-γ e \nníveis de sMICA no soro. Na condição de estímulo com células K562, tanto mulheres do grupo \nCTR como do grupo EDT apresentaram correlações negativas para a expressão de IFN-γ (% e \nintensidade) e níveis de sMICA no soro e FP. No entanto, mulheres com EDT apresentaram \ncorrelações negativas em um maior número de subpopulações celulares, algumas ausentes no \ngrupo CTR, e também ausentes na condição sem estímulo. No entanto, a presença do \nbloqueio de células K562 para MICA resultou em novas correlações negativas, tanto entre a % \nde células produtoras de IL -10 como para a intensidade de expressã o, e níveis de sMICA no \nsoro, em ambos os grupos, CTR e EDT. Tais correlações estiveram ausentes na condição de \nestímulo sem bloqueio de MICA (exceto para % de células CD56dimCD16+) e na condição \nbasal de cultura (sem estímulo). \n \n \n4.4.4 Expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e relação \ncom estádios da endometriose \nA expressão de moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10 (frequência e intensidade -MFI) por \ncélulas NK e subpopulações foi analisada em relação aos estádios da EDT, iniciais ( I e II) e \navançados (III e IV) e, destes, em relação ao grupo CTR. A análise foi realizada na condição \nbasal de cultura (sem estímulo), e com estímulo de células K562 com e sem bloqueio, para \ncélulas NK totais e suas subpopulações. Para todas as análises c omparativas entre os grupos \nusamos o teste de Mann-Whitney. \nA subpopulação CD56brightCD16+ de mulheres com EDT não foi analisada, pois poucas \namostras atingiram o valor de corte (≥ 100 eventos na aquisição do citômetro). \n \n4.4.4.1 Moléculas vs estádios: na condição basal de cultura \n• CD107a: não houve diferença na frequência de células produtoras entre EDT inicial e \navançada e nem entre EDT inicial e CTR (Figura 4 4). No entanto, observamos uma menor \nintensidade de expressão na EDT avançada vs EDT inicial (n a subpopulação CD56 dimCD16-, \np= 0,0368) (Tabela 18A). Na comparação entre EDT inicial e CTR, não foi observada diferença \nna % expressão (Figura 4 4), mas houve maior intensidade de expressão na EDT em células \nNK totais (p= 0,0238) e na subpopulação CD56 dimCD16+ (p= 0,0293) (Tabela 18B). Na análise \nentre EDT avançada vs CTR, observamos menor % de expressão de células produtoras de \nCD107a na EDT avançada, para a subpopulação CD56 dimCD16- (p= 0,0445) (Figura 4 4) bem \n\n128 \n \ncomo menor intensidade de expressão nessa mes ma subpopulação celular ( p= 0,0185), \ndescrita como de maior propriedade citotóxica, na EDT avançada (Tabela 18C). \n Em resumo, na EDT avançada há menor expressão de CD107a, na % ou intensidade, \nmesmo na ausência de estímulo in vitro, principalmente, na subpopulação CD56dimCD16-. \n \n• IFN-y: maior frequência de células produtoras na EDT avançada vs EDT inicial \n(CD56dim, p=0,047) (Figura 4 4), mas sem diferença para intensidade de expressão, em \nqualquer subpopulação celular (Tabela 18A). Na comparação entre EDT ini cial e CTR, \nmulheres com EDT inicial apresentaram maior frequência de células produtoras de IFN -y \n(CD56brightCD16-, p=0,0056) (Figura 4 4), mas não apresentaram diferenças para intensidade \nde expressão (Tabela 18B). Para EDT avançada vs CTR, mulheres com ED T avançada \napresentaram maior frequência de células produtoras de IFN -y (NK totais, p=0,0061; CD56dim, \np=0,0008; CD56 dimCD16-, p= 0,0423 e CD56brightCD16-, p=0,0003) (Figura 4 4) e maior \nintensidade de expressão na subpopulação CD56brightCD16- (p= 0,0163) (Tabela 18C). \n Em contraste com CD107a, a expressão de IFN -y nas células NK foi, em geral, maior \nna EDT avançada, ora na sua % ora na sua intensidade de expressão, ou ambas, seja na \ncomparação com o grupo EDT inicial ou grupo CTR. Algumas dessas diferenças foram em \nrelação às células NK totais, às CD56dime às CD56brightCD16-. \n. \n• IL-10: maior frequência de células com expressão na EDT avançada, em comparação à \ninicial (em células NK totais, p=0,0145 e na subpopulação CD56 dimCD16+, p=0,022) (Figura \n44), mas se m diferença para a intensidade de expressão (Tabela 18A). Entre o grupo EDT \ninicial e grupo CTR, não houve diferença na frequência de células produtoras (Figura 4 4), mas \nhouve maior intensidade de expressão na EDT inicial, em várias subpopulações celulares (em \nNK totais, p= 0,0198, CD56 dim, p= 0,0437 e CD56 dimCD16-, p= 0,0238) (Tabela 18B). Essa \nmaior intensidade de marcação para IL -10 em células NK totais e CD56 dim, já havia sido \nobservada na comparação entre o grupo total de mulheres com EDT e CTR, \nindependentemente do estádio da doença (como descrito no item 4.4.2.1). Na comparação \nentre o grupo EDT avançada e grupo CTR, assim como para EDT inicial, não foi observada \nqualquer diferença na frequência de células produtoras de IL -10 (Figura 44). No entanto, \nhouve uma maior intensidade de expressão de IL -10 na EDT avançada, na subpopulação \nCD56dimCD16+ (p= 0,0434) (Tabela 18C). \n A expressão de IL -10 nas células NK, na condição basal de cultura, segue um padrão \nmais semelhante à molécula IFN -y. Ou seja, de modo geral, detectamos maior expressão de \nIL-10 (% ou intensidade de expressão) no estádio avançado da doença, tanto para células NK \ntotais como para algumas subpopulações CD56dim. \n\n129 \n \nI/II\nIII/IV\nCTR I/II\nIII/IV\nCTR I/II\nIII/IV\nCTR\n0\n5\n1 0\n5 0\n1 0 0\nN K to ta is (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\np = 0 ,0 1 4 5\np = 0 ,0 0 6 1\nA )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0\n \n I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\n CTR\n0\n5\n1 0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 d im (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\np = 0 ,0 4 7\np = 0 ,0 0 0 8\nB )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 \n \n I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\nCTR\n0\n1 0\n2 0\n3 0\nC D 5 6 b rig h t (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\nC )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0\n \n I/II\n III/IV\nCTR I/II\nIIII/IV\nCTR I/II\n III/IV\n CTR\n0\n5\n1 0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 d im C D 1 6 + (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\np = 0 ,0 2 2 0\nD )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 \n \n I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\n CTR\n0\n5\n1 0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 d im C D 1 6 - (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s p = 0 ,0 4 4 5\nE )\np = 0 ,0 4 2 3\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0\n \n I/II\n III/IV\nCTR I/II\nIIII/IV\n CTR I/II\n III/IV\n CTR\n0\n5\n1 0\n5 0\n1 0 0\nC D 5 6 b rig C D 1 6 - (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s p = 0 ,0 0 5 6\np = 0 ,0 0 0 3\nF )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 \n \n \nFigura 44. Comparação da porcentagem (%) de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10, \nnas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádi os iniciais e avançados \nda endometriose e controles, na condição basal de cultura, sem estímulo. CTR: grupo controle; I/II: \nestádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a \nrASRM; sem estímulo: condiçã o basal de cultura; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; linha pontilhada: indica o valor de zero \npara a % de células; as barras horizontais representam as medianas de porcentagem de expressão de \ncada molécula; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n130 \n \nTabela 18. Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas \nsubpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da \nendometriose e entre controles, na condição basal de cultura, sem estímulo. \n \nA) EDT inicial vs EDT avançada \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 9 361,0 12 336,0 ns 9 105,0 12 77,6 ns 8 130,5 9 97,4 ns\nCD566dim 9 356,0 12 331,0 ns 9 101,0 12 77,3 ns 9 125,0 9 93,7 ns\nCD56bright 7 475,0 11 463,0 ns 7 155,0 11 70,8 ns 7 168,0 8 133,0 ns\nCD56dimCD16+ 8 349,5 12 341,5 ns 8 109,9 12 76,3 ns 8 8,9 9 123,0 ns\nCD56dimCD16- 8 342,5 12 278,0 0,0368 8 127,0 12 78,7 ns 8 147,5 9 129,0 ns\nCD56brightCD16+ 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 6 480,0 10 454,0 ns 6 122,30 10 69,0 ns 5 169,0 8 144,0 ns\nSem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nI/II III/IV I/II III/IV I/II III/IV\n \n \n \nB) EDT inicial vs CTRs \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 9 361,0 20 336,0 0,0238 9 105,0 20 97,2 ns 8 130,5 16 49,1 0,0198\nCD566dim 9 356,0 20 327,5 ns 9 101,0 20 99,4 ns 9 125,0 16 37,0 0,0437\nCD56bright 7 475,0 18 452,0 ns 7 155,0 18 92,6 ns 7 168,0 16 131,5 ns\nCD56dimCD16+ 8 349,5 19 322,0 0,0293 8 109,9 19 93,3 ns 8 8,9 16 3,0 ns\nCD56dimCD16- 8 342,5 19 340,0 ns 8 127,0 19 122,0 ns 8 147,5 16 139,0 0,0238\nCD56brightCD16+ 1 NA 9 NA NA 1 NA 9 NA NA 1 NA 8 NA NA\nCD56brightCD16- 6 480,0 17 438,0 ns 6 122,3 15 1,0 ns 5 169,0 13 143,0 ns\nCTR\nSem estímulo (intensidade de expressão)\nCD107a IFN-γ IL-10\nI/II CTR I/II CTR I/II\n \n \n \nC) EDT avançada vs CTRs \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 12 336,0 20 336,0 ns 12 77,55 20 97,2 ns 9 97,4 16 49,1 ns\nCD566dim 12 331,0 20 327,5 ns 12 77,3 20 99,4 ns 9 93,7 16 37,0 ns\nCD56bright 11 463,0 18 452,0 ns 11 70,8 18 92,6 ns 8 133,0 16 131,5 ns\nCD56dimCD16+ 12 341,5 19 322,0 ns 12 76,3 19 93,3 ns 9 123,0 16 3,0 0,0434\nCD56dimCD16- 12 278,0 19 340,0 0,0185 12 78,7 19 122,0 ns 9 129,0 16 139,0 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 9 NA NA 3 NA 9 NA NA 3 NA 8 NA NA\nCD56brightCD16- 10 454,0 17 438,0 ns 10 69,0 15 104,0 0,0163 8 144,0 13 143,0 ns\nSem estímulo (intensidade de expressão)\nCD107a IFN-γ IL-10\nIII/IV CTR III/IV CTR III/IV CTR\n \n \nEDT: grupo endometriose: CTR: grupo controle: I/II: estádios iniciais da endomet riose, III/IV: estádios avançados da \nendometriose; estádios de acordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência \n(intensidade de expr essão); med: mediana; ns: valores de p não significantes ( p≥ 0,05);em negrito: valores de p \nsignificantes na comparação entre os grupos; em vermelho: valor da maior mediana significante na comparação \nentre os grupos; n: número de amostras analisadas para c ada subpopulação de células NK ; NA: amostras não \nanalisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n\n131 \n \n4.4.4.2 Moléculas vs estádios: na condição de estímulo com células K562 \n \n• CD107a: o estímulo co m K562 induziu um aumento na % de células produtoras de \nCD107a, em ambos os estádios da EDT (iniciais e avançados). No entanto, houve uma menor \nfrequência de células produtoras de CD107a nos estádios avançados, na comparação com \nestádios iniciais (CD56dimCD16+, p=0,0055) (Figura 45) e menor intensidade de expressão \n(CD56dimCD16+, p=0,0068) (Tabela 19A). \n A análise entre mulheres do grupo EDT inicial e o grupo CTR não mostrou diferenças \nsignificativas, tanto para a frequência como para a intensidade de expre ssão da molécula \nCD107a, nas diferentes subpopulações de células NK avaliadas (Figura 45 e Tabela 19B). Na \ncomparação entre EDT avançada e CTRs, mulheres em estádios avançados apresentaram \nmenor frequência de células produtoras de CD107a (NK totais, p=0,0332 e nas \nsubpopulações CD56dimCD16-, p=0,0116 e CD56brightCD16-p=0,0404) (Figura 45). Além disso, \nmulheres com EDT avançada também apresentaram menor intensidade de expressão em \nrelação ao grupo CTR (NK totais, p=0,0043, CD56 dim, p=0,0065, CD56 bright, p=0,0097 e \nCD56dimCD16+, p=0,0044) (Tabela 19C). \n Em resumo, o estímulo com células K562 não alterou a menor expressão (% e \nintensidade) da molécula CD107a na EDT avançada, tanto em relação à EDT inicial como para \no grupo CTR saudável, mantendo-se semelhante à condição basal, sem estímulo. Essa menor \nexpressão ocorreu, principalmente, em células CD56dim. \n \n• IFN-y: na comparação entre a EDT inicial e avançada , não foi observada nenhuma \ndiferença significativa, tanto para a frequência (%) como para a intensidade de expressão, em \nnenhuma subpopulação celular. No entanto, entre EDT inicial e o grupo CTR , na condição \ncom o estímulo com células K562, observamos uma menor intensidade de expressão na \nEDT inicial, em células NK totais ( p= 0,0308), CD56 bright (p= 0,0019) e CD56brightCD16- (p= \n0,0184) (Tabela 19B). Também, mulheres com EDT avançada apresentaram menor \nintensidade de expressão em relação ao grupo CTR (CD56brigth, p= 0,0203 e \nCD56dimCD16+, p= 0,0420) (Tabela 19C). Ou seja, para as células CD56 bright, a menor \nintensidade de expressão de IFN -y, ocorreu tanto em estádios iniciais quanto aos avançados \nda endometriose, na comparação com CTRs. \n Considerando esses resultados de forma integrada, podemos dizer que, apesar de \nobservamos maior expressão de IFN -y na EDT, pri ncipalmente, na EDT avançada, na \ncondição basal (sem estímulo), quando as células NK são estimuladas in vitro com células \nK562, tanto mulheres com EDT inicial como EDT avançada, apresentam menor expressão do \nque mulheres do grupo CTR, em células CD56bright e CD56dim. \n• IL-10: não foram observadas diferenças (%, Figura 4 5 e MFI, Tabela 19A) entre \nmulheres em EDT inicial e avançada, nem entre EDT avançada e o grupo CTR , nas \n\n132 \n \ndiferentes subpopulações de NK. Porém, após estímulo com células K562, apesar dos baixos \nvalores em ambos os grupos, foi observada uma menor intensidade de expressão em \nestádios iniciais da EDT, na comparação com mulheres CTRs (Tabela 19B) (CD56 bright, \np=0,0042 e CD56brightCD16-, p= 0,0430). \n De forma geral, podemos considerar que a maior exp ressão de IL -10 em células NKs \nna EDT avançada, observada na condição basal de cultura, deixou de existir após o estímulo \ncom células K562, mantendo-se tanto em relação à EDT inicial como aos CTRs saudáveis. \n \nI/II\n III/IV\nCTR I/II\nIII/IV\n CTR I/II\n III/IV\nCTR\n-1 0\n0\n1 0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nN K to ta l (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s\np = 0 ,0 3 3 2\nA )\nC D 1 0 7 a IL -1 0IF N - \n \nI/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\nCTR\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 d im (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s\nB )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 \n \nI/II\n III/IV\nCTR I/II\nIII/IV\nCTR I/II\n III/IV\nCTR\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s\nC )\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0\n \n I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\nCTR\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 d im C D 1 6 + (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s p = 0 ,0 0 5 5\nD )\np = 0 ,0 1 1 6\nC D 1 0 7 a IF N -  IL - 1 0 \n \n I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\n CTR\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 d im C D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s\nF )\nIF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a\n \n I/II\n III/IV\n CTR I/II\nIIII/IV\n CTR I/II\n III/IV\nCTR\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 b rig h t C D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s\nG )\np = 0 ,0 4 0 4\nIF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a \n \nFigura 45. Comparação da porcentagem de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10, nas \nsubpopulações de células NK circulan tes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da \nendometriose e controles, na condição com estímulo com células K562. CTR: grupo controle; I/II: \nestádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a \nrASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, CD56 -CD16+; estímulo K562: estímulo com células K562; linha pontilhada: indica o \nvalor de zero para % de células; as barras horizontais representam as medianas da porcentagem de \nexpressão de cada molécula; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n\n133 \n \nTabela 19. Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas \nsubpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da \nendometriose e controles, na condição de estímulo com células K562. \n \nA) EDT inicial vs EDT avançada \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 9 86,0 12 49,5 ns 9 -5,1 12 -2,9 ns 8 -6,5 9 9,6 ns\nCD566dim 9 88,0 12 42,5 ns 9 -4,2 12 2,9 ns 9 0,0 9 2,8 ns\nCD56bright 7 44,0 10 58,5 ns 7 -18 10 0,1 ns 7 -41,0 8 -5,4 ns\nCD56dimCD16+ 8 71,0 12 36,0 0,0068 8 0,25 12 -3,2 ns 8 0,0 9 0,0 ns\nCD56dimCD16- 8 126,5 12 79,5 ns 8 2,65 12 9,7 ns 8 -12,5 9 -12,0 ns\nCD56brightCD16+ 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 6 84,0 10 60,5 ns 6 -9,85 10 2,0 ns 5 -19,0 8 -1,5 ns\nI/II III/IV\nCD107a IFN-γ\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nIL-10\nI/II III/IV I/II III/IV\n \n \nB) EDT inicial vs CTRs \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 9 86,0 20 98,5 ns 9 -5,1 20 14,8 0,0308 8 -6,5 16 4,7 ns\nCD566dim 9 88,0 20 95,5 ns 9 -4,2 20 15,6 ns 9 0 16 1,51 ns\nCD56bright 7 44,0 17 102,0 ns 7 -18,0 17 13,3 0,0019 7 -41,0 14 1,5 0,0042\nCD56dimCD16+ 8 71,0 18 75,5 ns 8 0,3 18 17,0 ns 8 0,0 16 0,0 ns\nCD56dimCD16- 8 126,5 19 106,0 ns 8 2,7 19 14,0 ns 8 -12,5 15 -5,0 ns\nCD56brightCD16+ 1 NA 8 NA NA 1 NA 8 NA NA 1 NA 7 NA NA\nCD56brightCD16- 6 84,0 17 115,0 ns 6 -9,9 15 10,1 0,0184 5 -19,0 13 -4,0 0,0430\nCTR I/II CTR I/II CTRI/II\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\n \n \nC) EDT avançada vs CTRs \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 12 49,5 20 98,5 0,0043 12 3,0 20 14,8 ns 9 9,6 16 4,7 ns\nCD566dim 12 42,5 20 96,5 0,0065 12 2,9 20 15,6 ns 9 2,8 16 1,5 ns\nCD56bright 10 58,5 17 102,0 0,0097 10 0,1 17 13,3 0,0203 8 -5,4 14 1,5 ns\nCD56dimCD16+ 12 36,0 18 75,5 0,0044 12 -3,3 18 17,0 0,0420 9 0,0 16 0,0 ns\nCD56dimCD16- 12 79,5 19 106,0 ns 12 9,7 19 14,0 ns 9 -12,0 15 -5,0 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 8 NA NA 3 NA 8 NA NA 3 NA 7 NA NA\nCD56brightCD16- 10 60,5 17 115,0 ns 10 2,0 15 10,1 ns 8 -1,5 13 -4,0 ns\nCTRIII/IV CTR III/IV CTR III/IV\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da \nendometriose; estádios de acordo com a rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-\n, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensida de de \nexpressão); K562: estímulo com células K562 descontando-se o valor basal (sem estímulo);valores negativos: valores \nonde o valor basal foi maior do que com estímulo; med: mediana; ns: valores de p não significantes ( p≥ 0,05); em \nnegrito: valores de p significantes na comparação entre os grupos; em vermelho: valor da maior mediana significante \nna comparação entre os grupos; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: \namostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do ci tômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-\nWhitney. \n \n \n\n134 \n \n4.4.4.3 Expressão de moléculas vs estádios: na condição com estímulo com células \nK562 bloqueadas para MICA \n O estímulo na presença de bloqueio de MICA na superfície celular das células K56 2, \nrepresentando a presença de MICA solúvel, de forma geral, não levou a diferenças na % de \ncélulas com expressão de CD107a, IFN -y ou IL -10, nas diferentes subpopulações de células \nNK (Figura 46). Analisando diferenças em relação aos estádios da doença, destacamos: \n \n• CD107a: houve menor intensidade de expressão de CD107a na EDT avançada, em \nrelação à EDT inicial, em células CD56 dimCD16+(p=0,0266) sem nenhuma outra diferença \npara as demais subpopulações (Tabela 20A). \n Na comparação entre EDT inicial e CTRs , o estímulo com células K562 bloqueadas, \nassim como ocorreu no estímulo com K562 sem bloqueio, não mostrou diferenças (% de \ncélulas e MFI) para CD107a (Figura 46 e Tabela 20B). Também não houve diferença entre \nEDT avançada e CTRs , tanto para % de células (Fi gura 4 6) como para intensidade de \nexpressão (Tabela 20C), deix ando de existir as diferenças existentes na condição com \nestímulo de células K562 sem bloqueio (Figura 43 e Tabela 19C). \n Em resumo, com o estímulo de células K562 bloqueadas para MICA na superf ície \ncelular houve perda da diferença de menor % de expressão na EDT avançada, em relação à \nEDT inicial e CTRs, observada com estímulo de célula K562 sem bloqueio. No entanto, \nmesmo na presença de bloqueio, foi mantida a menor intensidade de expressão de C D107a \nna EDT avançada em relação à inicial, mantendo -se semelhante à condição basal e com \nestímulo de células K562 sem bloqueio. \n \n• IFN-y: da mesma forma como observado na condição com estímulo de células K562 \nsem bloqueio (Figura 4 5 e Tabela 19A), na presen ça de bloqueio para MICA na superfície \ncelular, não foram observadas diferenças entre EDT inicial e avançada (frequência, %, \nFigura 46, e MFI, Tabela 20A). Na comparação entre EDT inicial e CTRs, foi observada uma \nmenor % de células produtoras de IFN -y na EDT inicial, em células CD56 brightCD16- (p= \n0,0326) (Figura 46) e, assim como ocorreu com estímulo de K562 sem bloqueio, uma menor \nMFI, em NK totais (p= 0,0491) (Tabela 20B), na EDT inicial. Observamos também que, com o \nbloqueio, houve perda da diferença d a maior intensidade de expressão em células \nCD56bright e CD56brightCD16- nos CTRs com estímulo de K562 em relação à EDT inicial (p= \n0,0019 e p= 0,0184, respectivamente; Tabela 19B, com estímulo sem bloqueio (Tabela 20B). \nNo entanto, a maior MFI observada n o grupo CTR após estímulo com células K562 sem \nbloqueio, em NK totais ( p= 0,0308), foi mantida em relação à EDT inicial, mesmo na \npresença de bloqueio de MICA na superfície celular (p= 0,0491) (Tabela 20B). \n Na comparação entre EDT avançada e CTRs, observa mos menor MFI na EDT \navançada (NK totais, p= 0,0220 e em CD56dim, p= 0,0248) (Tabela 20C), diferenças essas \n\n135 \n \nnão observadas com o estímulo com K562 sem bloqueio (Tabela 20C). Além, disso, as \ndiferenças previamente observadas para MFI, com K562 sem bloqueio (CD56brigth, p= 0,0203, \ne CD56 dimCD16+, p= 0,0420 ), foram mantidas com células K562 bloqueadas para MICA \n(CD56brigth, p= 0,0060 e CD56dimCD16+, p= 0,0349) (Tabela 20C). \n De forma geral, o bloqueio para MICA levou tanto à perda como à manutenção de \nalgumas diferenças para IFN -y (% ou MFI), em relação à condição de estímulo com células \nK562 sem bloqueio. Não houve alteração na ausência de diferenças (% e MFI) entre EDT \ninicial e avançada, mas foi observada uma menor intensidade de expressão de IFN -y na EDT \navançada (em NK totais e em CD56dim) em relação aos CTRs. O bloqueio também levou a \numa menor % de células CD56 brightCD16- produtoras de IFN -y na EDT inicial em relação às \nCTRs saudáveis, não observada sem bloqueio, bem como à perda da diferença da maior \nintensidade de expressão em células CD56 bright e CD56brightCD16- nos CTRs em relação à EDT \ninicial. Algumas dessas diferenças ocorreram, principalmente, em relação às células \nCD56bright, já descritas como maiores produtoras de citocinas. \n \n• IL-10: assim como oc orreu na condição apenas com estímulo de células K562, na \npresença de K562 com bloqueio de MICA, não houve diferença entre EDT inicial e \navançada (%, Figura 4 6, e MFI, Tabela 20A). Também não observamos diferença entre \nEDT avançada e CTRs, tanto para % (Figura 46) como para MFI (Tabela 20C), em nenhuma \nsubpopulação celular. No entanto, na comparação entre EDT inicial e CTRs, apesar da baixa \n% de expressão de IL -10 em CD56 dim, nos dois grupos estudados, o bloqueio de MICA \nmostrou uma menor % de expressão de células produtoras de IL -10, na EDT inicial do que \nnos CTRs, para células CD56 dim (p= 0,01) (Figura 46). Além disso, com estímulo com células \nK562 bloqueadas para MICA, deixou de existir a menor MFI de IL -10 em células \nCD56brightCD16- na EDT inicial , detectada na condição com o estímulo com K562 sem \nbloqueio (p= 0,043, Tabela 19B). No entanto, a maior intensidade de expressão de IL-10 em \nmulheres em EDT inicial em relação aos CTRs, previamente observada em CD56 bright após \nestímulo com células K562 sem bloqu eio ( p=0,0042), foi mantida com K562 com bloqueio \npara MICA (p=0,0264, teste de Mann-Whitney) (Tabela 20). \n Assim como ocorreu para IFN -y, o estímulo com células bloqueadas para MICA levou \ntanto à perda como à manutenção de algumas diferenças (% ou MFI), e m relação à condição \nde estímulo com células K562 sem bloqueio na relação com os estádios da doença. Não \nhouve modificação na ausência de diferenças (% e MFI) entre EDT inicial e avançada, fic eo \nmantidas as maiores % para IL-10 para EDT avançada, apenas na condição sem estímulo. Em \nrelação à condição sem bloqueio, na presença de bloqueio de MICA na superfície celular, \nhouve uma menor % de expressão IL -10, na EDT inicial do que no grupo CTR (em células \nCD56dim), mas deixou de existir a menor MFI de IL -10 em células CD56 brightCD16- na EDT \ninicial, na comparação com o grupo CTR. \n\n136 \n \nNa Tabela 21 ( -A, -B, -C) está apresentado um balanço dos principais resultados da \nexpressão das moléculas envolvidas na atividade efetora e imunorreguladora de células NK e \nsua relação com estádios da endometriose. \n \n I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\nCTR\n-1 0\n0\n1 0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nN K to ta l (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\n% d e c é lu la s\nA )\nIF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a\n \n I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\n CTR\n-2 0\n-1 0\n-5\n0\n5\n1 0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 d im (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\n% d e c é lu la s\np = 0 ,0 1\nB )\nIF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a \n \n I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\n CTR I/II\nIII/IV\nCTR\n-1 0\n0\n1 0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\n% d e c é lu la s\nC )\nIF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a\n \nI/II\n III/IV\n CTR I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\nCTR\n-4 0\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 d im C D 1 6 + (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\n% d e c é lu la s\nD )\nIF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a \n I/II\n III/IV\nCTR I/II\n CTR\n III/IV I/II\n III/IV\nCTR\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\nC D 5 6 d im C D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\n% d e c é lu la s\nE )\nIF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a\n \n I/II\n III/IV\nCTR I/II\n III/IV\nCTR I/II\nIII/IV\nCTR\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n C D 5 6 b rig h tC D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\n% d e c é lu la s\nF )\np = 0 ,0 3 2 6\nIF N -  IL - 1 0C D 1 0 7 a \n \nFigura 46. Comparação da porcentagem (%) de expressã o das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10, \nnas subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados \nda endometriose e controles, na condição após estímulo com células K562 bloqueadas para \nmolécula MICA. CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados \nda endometriose; estádios de acordo com a rASRM; A) células NK totais: incluem as subpopulações \nCD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; B) subpopulação \nCD56dim; C) subpopulação CD56bright; D) subpopulação CD56dimCD16+; E) subpopulação CD56dimCD16-\n; F) subpopulação CD56 brightCD16-; estímulo K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para \nMICA, descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi \nmaior do que com estímulo; linha pontilhada: indica o valor de zero para % de células, as barras \nhorizontais representam as medianas da porcentagem de expressão de cada molécula; valores de p \ndeterminados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n\n137 \n \nTabela 20. Comparação da intensidade expressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 nas \nsubpopulações de células NK circulantes, entre mulheres em estádios iniciais e avançados da \nendometriose e controles, na condição de estímulo com células K 562 bloqueadas para \nMICA. \n \nA) EDT inicial vs EDT avançada \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 9 83,0 12 44,0 ns 9 0,5 12 -0,6 ns 8 -4,0 9 0,0 ns\nCD566dim 9 87,0 12 41,0 ns 9 4,4 12 0,2 ns 9 0,7 9 0,0 ns\nCD56bright 5 116,0 11 55,0 ns 5 -1,0 11 -0,3 ns 5 -22,0 8 -11,0 ns\nCD56dimCD16+ 8 120,0 12 46,0 0,0306 8 1,4 12 -0,1 ns 8 1,5 9 0,0 ns\nCD56dimCD16- 8 144,0 12 73,5 ns 8 18,0 12 4,8 ns 8 -4,5 9 -9,0 ns\nCD56brightCD16+ 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA 1 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 6 83,0 10 70,5 ns 6 -5,4 10 2,2 ns 5 -19,0 8 -13,0 ns\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nI/II III/IV I/II III/IV I/II III/IV\n \n \nB) EDT inicial vs CTRs \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 9 83 19 87,0 ns 9 0,5 19 18,0 0,0491 8 -4,0 14 19,8 ns\nCD566dim 9 87,0 19 87,0 ns 9 4,4 19 20,1 ns 9 0,7 14 21,2 ns\nCD56bright 5 116,0 17 81,0 ns 5 -1,0 17 8,0 ns 5 -22,0 13 8,0 0,0264\nCD56dimCD16+ 8 120,0 17 94,0 ns 8 1,4 17 20,0 ns 8 1,5 13 0,0 ns\nCD56dimCD16- 8 144,0 18 83,0 ns 8 18,0 18 11,0 ns 8 -4,5 14 -2,5 ns\nCD56brightCD16+ 1 NA 7 NA NA 1 NA 7 NA NA 1 NA 5 NA NA\nCD56brightCD16- 6 83,0 15 157,0 ns 6 -5,4 14 9,8 ns 5 -19,0 11 -12,0 ns\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nI/II CTR I/II CTR I/II CTR\n \n \nC) EDT avançada vs CTRs \n \nSubpopulações\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 12 44,0 19 87,0 ns 12 -0,55 19 18,0 0,0220 9 0,0 14 19,8 ns\nCD566dim 12 41,0 19 87,0 ns 12 0,20 19 20,1 0,0248 9 0,0 14 21,2 ns\nCD56bright 11 55,0 17 81,0 ns 11 -0,30 17 8,0 0,0060 9 -11,0 13 8,0 ns\nCD56dimCD16+ 12 46,0 17 94,0 ns 12 -0,10 17 20,0 0,0349 9 0,0 13 0,0 ns\nCD56dimCD16- 12 73,5 18 83,0 ns 12 4,75 18 11,0 ns 9 -9,0 14 -2,5 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 7 NA NA 3 NA 7 NA NA 1 NA 5 NA NA\nCD56brightCD16- 10 70,5 15 157,0 ns 10 2,15 14 9,8 ns 8 -13,0 11 -12,0 ns\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nIII/IV CTR III/IV CTR III/IV CTR\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da \nendometriose; estádios de acordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, \nCD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, \ndescontando--se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores on de o valor basal foi maior do que com \nestímulo; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); med: mediana; ns: valores de p \nnão significantes (p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes na comparação entre os grupos; em vermelho: valor \nda maior mediana significante na comparação entre os grupos; n: número de amostras analisadas para cada \nsubpopulação de células NK ; NA: amostras não analisada s (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p \ndeterminados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n\n138 \n \nTabela 21. Balanço dos principais resultados da expressão das moléculas envolvidas na \natividade efetora de células NK e sua relação com estádios da endometriose \n \nA) Condição basal de cultura, sem estímulo \n \n p Subpopulações grupos p Subpopulações\nns todas I/II > III/IV 0,0368 CD56dimCD16-\nI/II ≈ CTR ns todas I/II > CTR 0,0238 NK totais\nI/II > CTR 0,0293 CD56dimCD16+\n0,0445 CD56dimCD16- III/IV < CTR 0,0185 CD56dimCD16-\np Subpopulações grupos p Subpopulações\n0,0470 CD56dim ns todas\n0,0056 CD56brightCD16- ns todas\n0,0061 NK totais 0,0163 CD56brightCD16-\n0,0008 CD56dim\n0,0423 CD56dimCD16-\n0,0003 CD56brightCD16-\ngrupos p Subpopulações grupos p Subpopulações\n0,0145 NK totais ns todas\n0,0220 CD56dimCD16+\nns todas 0,0198 NK totais\n0,0437 CD56dim\n0,0238 CD56dimCD16-\nns todas 0,0434 CD56dimCD16+\nAnálise para intensidade de expressão\nCondição basal de cultura, sem estímulo\nAnálise para frequência de células produtoras \nCD107a (MFI)\nIFN-γ (%) IFN-γ (MFI)\nIL-10 (MFI)\nI/II < III/IV\nI/II > CTR\nIII/IV > CTR\nIII/IV > CTR\nIII/IV > CTR\nIII/IV > CTR\ngrupos \ngrupos \nI/II ≈ III/IV\nI/II < III/IV\nI/II ≈ CTR\nIII/IV ≈ CTR\nI/II ≈ III/IV\nI/II > CTR\nI/II > CTR\nI/II > CTR\nIII/I > CTR\nIII/IV < CTR\nI/II ≈ III/IV\nI/II ≈ CTR\nIII/IV > CTR\nI/II < III/IV\nCD107a (%)\nIL-10 (%)\n \nCTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da endometriose; estádios de \nacordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); ns: \nvalores de p não significantes (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \nResumo: \nNa condição basal , sem estímulo, mu lheres em estádio avançado da EDT tiveram menor \nintensidade de expressão nas células produtoras de CD107a do que mulheres em estádios \niniciais, apesar de não terem apresentado diferença na frequência dessas células . Além disso, \nmulheres em estádios avançad os apresentaram menor frequência de células produtoras e \nmenor intensidade de expressão CD107a, do que o grupo CTR. Mulheres em estádios iniciais \napresentaram maior intensidade de expressão de CD107a do que CTRs. A frequência de \ncélulas produtoras de IFN-y foi maior na doença, tanto em estádio iniciais quanto avançados, \nem relação aos CTRs. Estádios avançados também tiveram maior frequência células \nprodutoras de IFN-y na comparação com mulheres em estádios iniciais. Quanto à IL-10, \nmulheres em estádios avan çados tiveram maior frequência de células produtoras do que as \nmulheres em estádios iniciais. Para intensidade de expressão de IL -10, tanto estádios iniciais \ncomo avançado, apresentaram maior MFI do que mulheres do grupo CTRs. \n\n139 \n \nContinuação da Tabela 21. Balanço dos principais resultados da expressão das \nmoléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e sua relação com estádios da \nendometriose. \n \nB) Condição de estímulo com células K562 \n \nCD107a (%)\np Subpopulações grupos p Subpopulações\n0,0055 CD56dimCD16+ 0,0068 CD56dimCD16+\nns todas ns todas\n0,0332 NK totais 0,0043 NK totais\n0,0116 CD56dimCD16- 0,0065 CD56dim\n0,0404 CD56brightCD16- 0,0097 CD56bright\n0,0044 CD56dimCD16+\np Subpopulações grupos p Subpopulações\nns todas ns todas\nns todas 0,0308 NK totais\n0,0019 CD56bright\n0,0184 CD56brightCD16-\nns todas 0,0203 CD56bright\n0,0420 CD56dimCD16+\np Subpopulações grupos p Subpopulações\nns todas ns todas\nns todas 0,0042 CD56bright\n0,0430 CD56brightCD16-\nns todas ns todas\nIII/IV < CTR\nIFN-γ (%)\nI/II < CTR\nI/II < CTR\nIII/IV ≈ CTR III/IV ≈ CTR\nIL-10 (MFI)\ngrupos \nI/II ≈ III/IV I/II ≈ III/IV\nI/II < CTR\nI/II < CTR\nIII/IV ≈ CTR III/IV < CTR\nIL-10 (%)\nI/II ≈ CTR\nIFN-γ (MFI)\ngrupos \nI/II ≈ III/IV I/II ≈ III/IV\nI/II ≈ CTR I/II < CTR\nIII/IV < CTR\nIII/IV < CTR\nIII/IV < CTR\nIII/IV < CTR\nIII/IV < CTR\ngrupos \nI/II > III/IVI/II > III/IV\nI/II ≈ CTR\nIII/IV < CTR III/IV < CTR\nEstímulo com células K562 \nAnálise para frequência de células produtoras Análise para intensidade de expressão\nCD107a (MFI)\nI/II ≈ CTR\n \nCTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/ IV: estádios avançados da endometriose; estádios de \nacordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); ns: \nvalores de p não significantes (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \nResumo: \n \nNa condição com estímulo de células K562 , observamos que mulheres em estádios \navançados da EDT tiveram menor frequência de células com produção de CD107a e menor \nintensidade de expressão nas células produtoras, em relação às mulheres em estádios iniciais. \nEssa menor frequência e intensidade de expressão de CD107a em mulheres em estádios \navançados, foi observada em relação a mulheres do grupo CTR. Para IFN-γ, a frequência de \ncélulas produtoras e a intensidade de expressão foram semelhantes entres os estádios, mas \nhouve menor intensidade de expressão na EDT, em ambos os estádios, do que mulheres \nCTRs. Também para IL-10, tanto mulheres em estádios iniciais como avançados, \napresentaram menor intensidade de expressão do que CTRs, mas sem diferença para \nfrequência de células produtoras e intensidade de expressão de IL -10 entre os diferentes \nestádios. \n\n140 \n \nContinuação da Tabela 21. Balanço dos principais resultados da expressão das \nmoléculas envolvidas na atividade efetora de células NK e sua relação com estádios da \nendometriose. \n \nC) Condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA \n \np Subpopulações grupos p Subpopulações\nns todas 0,0306 CD56dimCD16+\nns todas ns todas\nns todas ns todas\np Subpopulações grupos p Subpopulações\nns todas ns todas\n0,0326 CD56brightCD16- 0,0491 CD56brightCD16-\nns todas 0,022 NK totais\n0,0248 CD56dim\n0,0060 CD56bright\n0,0349 CD56dimCD16+\np Subpopulações grupos p Subpopulações\nns todas ns todas\n0,01 CD56dim 0,0264 CD56dimCD16-\nns todas ns todas\nCD107a (%)\nI/II ≈ III/IV I/II ≈ III/IV\nI/II < CTR I/II < CTR\nI/II ≈ CTR\nIII/IV ≈ CTR III/IV ≈ CTR\nIFN-γ (%) IFN-γ (MFI)\nI/II ≈ III/IV\nEstímulo com células K562BLOQ\nAnálise para frequência de células produtoras Análise para intensidade de expressão\nCD107a (MFI)\ngrupos \nI/II > III/IV\nIII/IV ≈ CTR III/IV ≈ CTR\nIII/IV < CTR\nIII/IV < CTR\nIII/IV < CTR\nIL-10 (%) IL-10 (MFI)\nI/II ≈ III/IV\nI/II < CTR I/II < CTR\nIII/IV ≈ CTR III/IV < CTR\nI/II ≈ CTR\ngrupos \nI/II ≈ III/IV\ngrupos \n \n \nCTR: grupo controle; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estád ios avançados da endometriose; estádios de \nacordo com rASRM; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); ns: \nvalores de p não significantes (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \nResumo: \nCom estímulo de células K562 bloqueadas para MICA , as diferenças observadas sem \nbloqueio para frequência de células produtoras de CD107a foram perdidas, mantendo -se \nsemelhantes entre estádios e entre estádios e CTRs. Foi mantida apenas a maior intensidade \nde expressão em mulheres em estádios iniciais em relação aos avançados. \nO bloqueio não alterou a maior intensidade de expressão de IFN-y para estádios iniciais e \navançados, na compar ação com mulheres do grupo CTR. No entanto, o bloqueio resultou \nnuma menor frequência de células produtoras dessa citocina, em mulheres em estádios \niniciais comparadas aos CTRs. Para IL-10, o boqueio de MICA resultou em menor frequência \nde células produtor as e menor intensidade de expressão dessa citocina na EDT inicial em \nrelação aos CTRs, mas foi mantida a semelhança (% e MFI) entre os estádios. \n \n \n\n141 \n \n4.4.5 Expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10 e relação com às fases do ciclo \nmenstrual \n \n A frequência (%) de células produtoras de CD107a, IFN -y ou IL-10 e a intensidade de \nexpressão (MFI) dessas moléculas em células NK e subpopulações, foram analisadas de \nacordo com as fases do ciclo menstrual: proliferativa/estrogênica (1º ao 14º dia do ciclo) e \nsecretora/progestacional (15º ao 28º dia do ciclo). Os dados obtidos em relação às fases do \nciclo em mulheres com EDT foram comparados aos de mulheres CTRs saudáveis. As análises \nforam realizadas para as três condições de estudo: basal de cultura (sem estímulo), com \nestímulo com células K562, e após estímulo com células K562 bloqueadas para MICA, em \ncélulas NK totais e nas subpopulações de NK. A subpopulação CD56 brightCD16+ de mulheres \ncom EDT não foi analisada, pois poucas amostras atingiram o valor de corte (≥ 100 eventos na \naquisição do citômetro). \n \n \n4.4.5.1 Expressão das moléculas e fases do ciclo: condição basal de cultura \n A % de células com expressão de CD107a, IFN -y ou IL -10, e a intensidade de \nexpressão dessas moléculas, não apresentaram diferenças entre as fases proliferativa e \nsecretora, tanto no grupo de mulheres com EDT como no grupo CTR, nas diferentes \nsubpopulações de células NK (p=ns) (Anexo X, Tabela 7). Todas as comparações de variáveis \ncontínuas foram feitas pelo teste estatístico de Mann-Whitney. \n Na comparação das fases entre os grupos EDT e CTR , não observamos diferenças \npara CD107a e IL-10 (% e MFI) nas diferentes subpopulações celulares (p= ns, teste de Mann-\nWhitney) (Anexo X, Tabela 8). No entanto, para IFN -y, observamos que mulheres com EDT \napresentaram maiores % de células CD56 dim produtoras dessa citocina na fase proliferativa do \nciclo (p= 0,0252), do que mulheres do grupo CTR (Figura 47) \n Observamos que c élulas CD56 brightCD16- também apresentaram maiores % de \nexpressão de IFN-y na EDT, em relação ao grupo CTR, mas isto ocorreu independentemente \nda fase do ciclo, uma vez que essa maior frequência ocorreu tanto na fase proliferativa ( p= \n0,0101) como na secretora do ciclo (p= 0,0041) (Figura 47). \n \n \n\n142 \n \nE D T C T R \n0\n2\n4\n6\n8\nC D 5 6 d im\nIF N -  (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s p = 0 ,0 2 5 2\nA )\nP ro life ra tiv a\nn = 8 n = 1 1\nE D T C T R \n0\n2\n4\n6\n8\nC D 5 6 b rig h tC D 1 6 -\n IF N -  (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\nB )\nP ro life ra tiv a\np = 0 ,0 1 0 1\nn = 5 n = 8\nE D T C T R \n0\n2\n4\n6\n8\n1 0\n2 0\n3 0\nC D 5 6 b rig h tC D 1 6 -\nIF N -  (s e m e s tím u lo )\n% d e c é lu la s\np = 0 ,0 0 4\nC )\nS e c re to ra\nn = 1 1 n = 7\n \n \nFigura 47. Frequência de expressão (%) de IFN -y em subpopulações de células NK circulantes, \nentre mulheres com endometriose e contro les, nas diferentes fases do ciclo menstrual, na \ncondição basal de cultura, sem estímulo. A e B) fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do \nciclo); C) fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); EDT: grupo endometriose; CTR: \ngrupo controle; linha pontilhada: indica o valor de zero de % de células; as barras horizontais \nrepresentam as medianas da porcentagem de expressão de IFN -y em cada grupo de estudo, para a \nsubpopulação celular específica; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n \n4.4.5.2 Expressão das moléculas e fases do ciclo: estímulo com células K562 \n Todas as comparações entre os grupos foram feitas pelo teste estatístico de Mann-\nWhitney) (Figura 48 e Anexo X, Tabela 9). \n \n► Grupo CTR: \n• CD107a: não foi observada diferença, tanto para % de células como para \nintensidade de expressão, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo. \n• IFN-y: não foi observada diferença, tanto para % de células como para \nintensidade de expressão, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo. \n• IL-10:% de células CD56 dimCD16: proliferativa > secretora (p= 0,0281). Não \nhouve diferença para a intensidade de expressão. \n \n► Grupo EDT: \n• CD107a: não foi observada diferença, tanto para % de células como para \nintensidade de expressão, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo. \n• -IFN-y: não foi observada diferença, tanto para % de células como para \nintensidade de expressão, entre as fases proliferativa e secretora do ciclo. \n• IL-10:% de células CD56 dim: proliferativa > secretora (p= 0,0302) Não houve \ndiferença para a intensidade de expressão (semelhante ao observado no grupo CTR). \n\n143 \n \np ro life ra tiv a s e c re to ra\n-2 0\n-1 0\n0\n1 0\n2 0\nIF N -  (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s\nn = 8 n = 1 3\nA )\np = n s\nE D T : C D 5 6 d im\np ro life ra tiv a s e c re to ra\n-2\n-1\n0\n1\n2\n4\nIL -1 0 (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s\nn = 6 n = 1 2\np = 0 ,0 3 0 2\nB ) E D T : C D 5 6 d im\np ro life ra tiv a s e c re to ra\n-2\n-1\n0\n1\n2\n IL 1 0 (e s tím u lo K 5 6 2 )\n% d e c é lu la s\nC T R : C D 5 6 d im C D 1 6 +\nC )\nn = 8 n = 8\np = 0 ,0 2 8 1\n \n \nFigura 4 8. Frequência da porcentagem (%) de expressão das moléculas IFN-y e IL -10 em \nsubpopulações de células NK circulantes, de mulheres com endometriose e de controles, nas \ndiferentes fases do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562. EDT: grupo \nendometriose; CTR: grupo contro le; fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); fase \nsecretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo);estímulo com células K562: valores do estímulo \ndescontando-se o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o val or basal foi maior do \nque com estímulo; n: número de amostras avaliadas em cada fase do grupo; linha pontilhada: indica o \nvalor de zero para % de células; as barras horizontais representam as medianas da porcentagem de \nexpressão nas diferentes fases do cic lo menstrual; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p \ndeterminados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n► Grupo EDT vs grupo CTR: \n \n Na análise da % de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL-10 entre grupos, na \ncondição com estímulo de K562, não foram observadas diferenças significativas, n as \ndiferentes fases do ciclo menstrual (Anexo X, Tabela 10). No entanto, para MFI, foram \nobservadas diferenças para as três moléculas (Figura 49) (os valores de p foram determinados \npelo teste de Mann-Whitney). \n \n• CD107a: EDT < CTRs, na fase secretora, nas s ubpopulações CD56bright \n(p=0,0032) e em CD56brightCD16- (p=0,0259) \n• IFN-y: EDT < CTRs , na fase proliferativa, nas subpopulações CD56 bright (p= \n0,019) e CD56brightCD16- (p= 0,0186) \n• IL-10: EDT < CTRs, na fase proliferativa, em células NK totais (p= 0,0295) \n \n \n \n\n144 \n \nE D T C T R \n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n2 5 0\nS e c re to ra : C D 5 6 b rig h t\n(e s tím u lo K 5 6 2 )\nC D 1 0 7 a (M F I) p = 0 ,0 0 3 2\nA )\nn = 1 2 n = 8\nE D T C T R \n-1 0 0\n-5 0\n0\n2 5\n5 0\nP ro life ra tiv a : C D 5 6 b rig h t\n(e s tím u lo K 5 6 2 )\nIF N -  ( M F I)\np = 0 ,0 1 9\nB )\nn = 5 n = 9\nE D T C T R \n-1 0 0\n-5 0\n0\n5 0\n1 0 0\nP ro life ra tiv a : N K to ta is\n(e s tím u lo K 5 6 2 )\nIL -1 0 (M F I)\np = 0 ,0 2 9 5\nC )\nn = 5 n = 8\n \n \nFigura 49. Comparação da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN -y ou IL -10 em \nsubpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e control es, nas \ndiferentes fases do ciclo menstrual, na condição com estímulo com células K562. EDT: grupo \nendometriose; CTR: grupo controle; fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); fase \nsecretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo ); estímulo com células K562: valores do estímulo \ndescontando-se o valor basal(sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do \nque com estímulo; MFI; mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número \nde amostras avaliadas em cada grupo; as barras horizontais representam as medianas de MFI de \nexpressão nas diferentes fases do ciclo menstrual; linha pontilhada: indica o valor de zero de MFI; \nvalores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n4.4.5.3 Expressão das moléculas e fase do ciclo: estímulo com células K562 \nbloqueadas para MICA \n Na presença de bloqueio para a molécula MICA na superfície celular das células K562, \nobservamos poucas mudanças em relação à condição com estímulo apenas com K562, se m \nbloqueio. (Figura 50 e Anexo X, Tabela 11). \n Nas análises da % de células com expressão e intensidade da expressão (MFI), entre \nas fases do ciclo, em cada grupo (EDT e CTR) separadamente, e entre os grupos, \nobservamos: \n \n► Grupo CTR: \n• CD107a: maior % de células CD56 brightCD16- produtoras de CD107a na fase \nproliferativa do ciclo (p= 0,0012). Essa diferença não foi encontrada na condição com \nestímulo com células K562 sem bloqueio. Não foi observada diferença para MFI. \n• IFN-γ: assim como ocorreu na presença de estímulo com K562, não houve \ndiferença na % de células que expressaram essa citocina, nem na intensidade de \nexpressão (MFI). \n• IL-10: detectamos maior MFI em células CD56 dimCD16- (p= 0,007) na fase \nproliferativa do ciclo (mesma diferença já observada na ausência de bloqueio, para % \nde expressão). \n \n \n\n145 \n \n► Grupo EDT: \n• CD107a: não foi encontrada diferença (% e MFI) para a expressão de CD107a \nentre as fases do ciclo \n• IFN-γ: assim como ocorreu na presença de estímulo com K562, não houve \ndiferença na % de células nem na intensidade de expressão (MFI). \n• IL-10: não foi encontrada diferença (% e MFI) para a expressão de IL -10 entre \nas fases do ciclo. Na condição de estímulo sem bloqueio, observamos maior % de IL -\n10 em CD56dim, na fase proliferativa. \n \n A maior % de células CD56dim produtoras de IL-10 na fase proliferativa, na condição de \nestímulo apenas com K562 (p= 0,0302, Figura 4 8), deixou de existir como estímulo com K562 \nbloqueadas para MICA de superfície (p= 0,4936) (Figura 50). \n \n \np ro life ra tiv a s e c re to ra\n-5\n0\n5\n2 0\n4 0\n6 0\n C D 1 0 7 a (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\n% d e c é lu la s\nC T R : C D 5 6 b rig h tC D 1 6 -A )\np = 0 ,0 0 0 1 2\nn = 7 n = 6\np ro life ra tiv a s e c re to ra\n-4 0\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n IL -1 0 (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\nM F I\nB ) C T R : C D 5 6 d im C D 1 6 -\nn = 7 n = 7\np = 0 ,0 0 7\np ro life ra tiv a s e c re to ra\n-1 .5\n-1 .0\n-0 .5\n0 .0\n0 .5\n1 .0\n% d e c é lu la s\nC ) E D T : C D 5 6 d im\n IL -1 0 (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\nn = 6 n = 1 2\np = n s\n \n \nFigura 50. Porcentagem (%) de células com expressão de CD107a e IL -10 e intensidade de \nexpressão de IL -10, em subpopulações de células NK circulantes, em mulheres com \nendometriose e em controles, em diferentes fases do ciclo menstrual, na condição de estí mulo \ncom células K562 bloqueadas para MICA. A e B) grupo controle (CTR), C) grupo endometriose \n(EDT); fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); fase secretora do ciclo menstrual \n(15º ao 28º dia do ciclo); estímulo com células K562BLOQ : K562 bloqueada para a proteína MICA - \nvalores descontando-se o valor basal(sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi \nmaior do que com estímulo ; MFI; mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); \nn: número de amostras avaliadas em cada fase do ciclo; as barras horizontais representam as medianas \nda porcentagem de expressão ou de MFI, nas diferentes fases do ciclo menstrual; linha pontilhada: \nindica o valor de zero para % ou MFI; ns; valor de p não significante ( p≥ 0,05 ), valores de p \ndeterminados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n► Grupo EDT vs grupo CTR: \n \n Na análise comparativa entre os grupos, na condição de bloqueio para MICA, \nobservamos diferenças para as três moléculas envolvidas na atividade efetora e \nimunorreguladora de células NK (Figura 51 e Anexo X, Tabela 12). Para todas as análises \nutilizamos o teste não paramétrico de Mann-Whitney. \n• CD107a: foi mantida a mesma diferença de menor intensidade de \nexpressão de CD107a na EDT em comparação com o grupo CTR, na fase secretora, \n\n146 \n \nna subpopulação CD56 bright (p= 0,0336), previamente observada na condição sem \nbloqueio (p= 0,0032, Figura 49). \n Foi perdida a diferença encontrada na condição sem bloqueio , de menor intensidade \nde expressão de CD107a, na EDT, na fase secreto ra do ciclo, na subpopulação \nCD56brightCD16- (p= 0, 0754). \n \n• IFN-γ: as diferenças ocorreram apenas para MFI, assim como observamos para \na condição sem bloqueio. Observamos menor intensidade de expressão na EDT do \nque no grupo CTR, na fase proliferativa do c iclo em células: NK totais ( p= 0,001), \nCD56dim (p= 0,0021), CD56dimCD16- (p= 0,0033), CD56bright (p= 0,0013), CD56brightCD16-\n(p= 0,0051). \n As diferenças observadas de expressão de IFN-γ para as subpopulações CD56 bright e \nCD56brightCD16-, previamente descri tas com o estímulo com K562 sem bloqueio (Anexo X, \nTabela 10), não foram alteradas na condição de estímulo com bloqueio para MICA. \n \n• IL-10: menor intensidade de expressão em CD56 dimCD16- (p= 0,0385), na \nEDT, na fase proliferativa. \n Ressaltamos que a difere nça, previamente observada de menor intensidade de \nexpressão para IL -10 na EDT, com estímulo sem bloqueio (em NK totais, p= 0,0295), deixou \nde existir na presença de estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA ( p= \n0,0730, teste de Mann-Whitney) (Anexo X, Tabela 12). \n \nO balanço das principais diferenças das frequências de células com expressão das \nmoléculas CD107a, IFN-y ou IL-10, e suas intensidades de expressão, entre os grupos EDT \ne CTR, e relação com as fases do ciclo menstrual, está apresentado na Tabela 22. \n \n \n \n \n \n \n\n147 \n \nE D T C T R \n-4 0\n-2 0\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n2 5 0\nS e c re to ra :\nC D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\nC D 1 0 7 a (M F I) p = 0 ,0 3 3 6\nA )\nn = 9 n = 9\n \nE D T C T R \n-1 0 0\n-5 0\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\n2 0 0\n2 5 0\nS e c re to ra :\nC D 5 6 b rig h tC D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\nC D 1 0 7 a (M F I)\nB )\np = n s\nn = 1 1 n = 8 \n \nE D T C T R \n-1 0 0\n-5 0\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\nP ro life ra tiv a :\nC D 5 6 dim (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\nIF N g (M F I)\np = 0 ,0 0 2 1\nC )\nn = 8 n = 1 0\n \nE D T C T R \n-1 0 0\n-8 0\n-6 0\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\nP ro life ra tiv a :\nC D 5 6 b rig h t (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\nIF N g (M F I)\np = 0 ,0 0 1 3\nD )\nn = 6 n = 8 \n \nE D T C T R \n-6 0\n-4 0\n-2 0\n0\n2 0\n4 0\n P ro life ra tiv a :\n C D 5 6 dim C D 1 6 - (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\nIL -1 0 (M F I)\nE )\np = 0 ,0 3 8 5\nn = 6 n = 7\n \nE D T C T R \n-1 0 0\n-5 0\n0\n5 0\n1 0 0\n1 5 0\nP ro life ra tiv a :\nN K to ta is (e s tím u lo K 5 6 2 B L O Q )\nIL -1 0 (M F I)\nF )\np = 0 ,0 7 3 (n s )\nn = 5 n = 6 \n \nFigura 51. Intensidade de expressão das moléculas CD107a , IFN-y ou IL-10 em subpopulações de \ncélulas NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, em diferentes fases do \nciclo menstrual, na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. EDT: grupo \nendometriose; CTR: grupo controle; fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); fase \nsecretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo K562BLOQ: estímulo com células K562 \nbloqueadas para a proteína MICA – valores descontando-se o valor basal (sem estímulo); valores \nnegativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo ; MFI; mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); n: número de amostras avaliadas em cada grupo; as barras \nhorizontais representam as medianas de MFI nos d iferentes grupos; linha pontilhada: indica o valor de \nzero para MFI; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-\nWhitney. \n \n\n148 \n \nTabela 22. Balanço das principais diferenças das frequências de células com expressão das \nmoléculas CD107a, IFN -y ou IL -10, e suas intensidades de expressão , entre os grupos \nendometriose e controles, e relação com a fase do ciclo menstrual. \n \nProlif. Prolif.\nCD107a EDT ≈ CTR CD107a EDT ≈ CTR\nIFN-γ IFN-γ EDT ≈ CTR\nCD56dim EDT > CTR\nCD56brightCD16- EDT > CTR CD56brightCD16- EDT > CTR\nIL-10 EDT ≈ CTR IL-10 EDT ≈ CTR\nProlif. Prolif.\nCD107a EDT ≈ CTR CD107a EDT ≈ CTR\nCD56bright EDT < CTR\nCD56brightCD16- EDT < CTR\nIFN-γ EDT ≈ CTR IFN-γ EDT ≈ CTR\nCD56bright EDT < CTR\nCD56brightCD16- EDT < CTR\nIL-10 EDT ≈ CTR IL-10 EDT ≈ CTR\nNK totais EDT < CTR\nProlif. Prolif.\nCD107a EDT ≈ CTR CD107a EDT ≈ CTR\nCD56bright EDT < CTR\nIFN-γ EDT ≈ CTR IFN-γ \nCD56dim EDT < CTR\nCD56dimCD16- EDT < CTR\nCD56bright EDT < CTR\nCD56brightCD16- EDT < CTR\nIL-10 EDT ≈ CTR IL-10 \nCD56dimCD16- EDT < CTR\nEDT ≈ CTR\nEDT ≈ CTREDT ≈ CTR\nMFI%\n%\n%\nMFI\nMFI\nEDT ≈ CTR\nEDT ≈ CTR\nSecret.\nSecret.\nEDT ≈ CTR\nEDT ≈ CTR\nSecret.\nEDT ≈ CTR\nEDT ≈ CTR\nSecret.\nEstímulo com K562BLOQ\nEstímulo com K562\nSecret. Secret.\nEDT ≈ CTR\nEDT ≈ CTR\nEDT ≈ CTR\nEDT ≈ CTR\nCondição basal de cultura, sem estímulo\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Prolif: fase proliferativa do ciclo menstrual ( 1º ao \n14º dia do ciclo); Secret: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; em vermelho: valores \ndo grupo considerados ma iores, na comparação entre os grupos analisados; em azul: valores do grupo \nconsiderados menores, na comparação entre os grupos analisados;≈: resultados semelhantes. \n \n \nResumo: \n \nNa condição basal de cultura, sem estímulo, mulheres com EDT apresentaram maior \nfrequência de células produtoras de IFN -γ na fase proliferativa/estrogênica. No entanto, na \npresença de estímulo, com e sem bloqueio de MICA, a frequência de células produtoras de \nIFN-γ tornaram-se semelhantes aos controles saudáveis. Porém, na presença de estímulo com \ncélulas K562, a intensidade de expressão de IFN -γ e IL -10 passaram a ser menores na EDT \ndo que em controles. Essa diferença foi observada em um maior número de subpopulações \nNK, principalmente para IFN-γ, quando na presença de estímulo com células K562 bloqueadas \npara MICA. \n\n149 \n \n4.4.6 Citotoxicidade pelas células NK \n A capacidade citotóxica (CTX) de células NK circulantes, no grupo de mulheres com \nEDT (n=21) e em mulheres controles saudáveis (n=20), foi avaliada pela % de morte de \ncélulas K562 e de células K562 bloqueadas para a molécula MICA, representa ndo a presença \nde MICA solúvel. \nA % de células K562 e de K562 bloqueadas para MICA com expressão de MICA foi \nanalisada em cada data do ensaio CTX, uma vez que nem todas as PBMCs foram testadas \npara a sua capacidade citotóxica no mesmo dia. A mediana da frequência de células K562 \nmarcadas com o corante fluorescente CFSE (K562*CFSE) e positivas para a expressão de \nMICA foi de 51,5% e, em células K562*CFSE e bloqueadas para MICA (K562*CFSEBLOQ) foi \nde 28,8%, correspondendo a uma mediana de bloqueio de MICA de 39,8% (Anexo XI, Tabela \n15). Apesar de ainda considerado como baixo bloqueio, seu o impacto para a intensidade de \nexpressão (MFI) foi considerado equivalente ao da frequência de expressão de MICA, 3 2,6%, \nconsiderando-se a mediana de intensidade de expressão (MFI) pré -bloqueio de 1914 e, pós -\nbloqueio, de 1114 (Anexo X, Tabela 13). \n \n \n4.4.6.1 Citotoxicidade contra células K562 sem bloqueio e com bloqueio para MICA. \nA análise comparativa da CTX entre os grupos (EDT e CTR) foi analisada nas \ncondições de CTX contra as células K562 sem e com bloqueio para MICA (teste de Mann-\nWhitney) (Figura 52). \n \n• CTX contra K562 sem bloqueio: \n► Grupo EDT vs grupo CTR: \n CTX EDT < CTX CTRs (medianas: 7,7% vs 11,5%, p= 0,0144) \n \n• CTX contra K562 bloqueadas para MICA: \n► Grupo EDT vs grupo CTR: \n CTX EDT < CTX CTR (medianas 5,9% vs 12,45%, p= 0,0259) \n \n \n \n\n150 \n \nE D T C T R \n0\n2 0\n4 0\n6 0\n% d e m o rte p = 0 ,0 1 4 4\nn = 2 1 n = 2 0\nA ) a lv o : c é lu la s K 5 6 2\n \nE D T C T R \n0\n2 0\n4 0\n6 0\n a lv o : c é lu la s K 5 6 2 B L O Q\n% d e m o rte\np = 0 ,0 2 5 9\nn = 2 1 n = 2 0\nB ) \n \nFigura 5 2. Comparações da citotoxicidade (CTX) pelas células NK circulantes entre mulheres \ncom endometriose e controles. A) CTX contra células K562 ; B) CTX contra células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA (K562BLOQ); valores de CTX contra K56 2 e K562BLOQ descontado o valor de \nmorte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do \nque com estímulo; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; linha pontilhada: valor zero de % de \ncélulas mortas; as ba rras horizontais representam as medianas nos diferentes grupos; valores de p \ndeterminados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \nCada grupo de estudo, CTR e EDT, foi também analisado de forma pareada, para as \ncondições de CTX contra células K562 sem e com o bloquei o da proteína MICA na \nsuperfície celular (teste de Wilcoxon) (Figura 53). \n \n ► Grupo CTR: não houve diferença na CTX contra células K562, sem e com o\n ‘bloqueio de MICA \nNo grupo CTR, a mediana de % de CTX contra células K562 foi de 11,5 % (0,5% -\n35,2%) e contra células K562BLOQ foi de 12,5% (0,5%- 34,9%) (p= 0,4524) \n \n ► Grupo EDT: não houve diferença na CTX contra células K562, sem e com o \n bloqueio de MICA \nNo grupo EDT, a mediana de frequência de CTX contra K562 foi 7,7% ( -1,6%- 29,1%) \ne contra células K562BLOQ foi de 5,9% (-4,7%- 55,4%) (p= 0,3784) \n \n Ressaltamos que, de forma geral, com o bloqueio da molécula MICA tivemos \nmodificação em relação à condição sem bloqueio. Os resultados da CTX de células K562 e de \nK562BLOQ, frente a cada amostra estudada, e a % de bloqueio de MICA correspondente, \npara cada experimento, estão apresentados no Anexo X, Tabela 14. \n \n \n\n151 \n \nK 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q\n0\n2 0\n4 0\n6 0\nC T R\n% d e m o rte\np = n s\nA )\nn = 2 0\n \nK 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q\n0\n2 0\n4 0\n6 0\nE D T\n% d e m o rte\np = n s\nB )\nn = 2 1 \nFigura 5 3. Citotoxicidade pelas células NK circulantes de mulheres com endometriose e de \ncontroles, contra células K562 e K562 bloqueadas para MICA. A) CTR: grupo controle; B) EDT: \ngrupo endometriose; K562BLOQ células K562 bloqueadas para MICA; valores de CTX contra K562 e \nK562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor \nde morte espontânea foi maior do que com estímulo ; ns: va lor de p não significante (p≥ 0,05 ); linha \npontilhada: valor zero de % de morte; valor de p determinado pelo teste pareado, não paramétrico, de \nWilcoxon. \n \n \n4.4.6.2 Citotoxicidade e relação com os estádios da endometriose \ni) Análise da CTX contra células alvo K562, antes e após o bloqueio para MICA \n O bloqueio levou a uma diminuição significante da porcentagem de CTX nos \nestádios iniciais da doença (med 5,1%, -4,7-12,9, min-max), em relação à CTX contra K562 \nsem bloqueio (med 10,3%, 1,8 - 21,3, min-max) (p= 0,0313, teste de Wilcoxon). No entanto, o \nbloqueio de MICA não induziu diferença na CTX dos estádios avançados da doença (K562: \nmed 7,4%, -1,6-29,1, min-max; K562BLOQ: med 7%, -1,2-55,4, min-max; p= 0,4322, teste de \nWilcoxon) (Figura 54). \n \nK 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q\n0\n1 0\n2 0\n3 0\nE D T in ic ia l (I/II)\nC T X (% )\nA )\np = 0 ,0 3 1 3\nn = 9\n \nK 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\n6 0\nE D T a v a n ç a d a (III/IV )\nC T X (% )\nB )\np = n s\nn = 1 2 \nFigura 5 4. Citotoxicidade pelas células NK circulantes frente a células K562 e células K562 \nbloqueadas para MICA, nos diferentes estádios da endometriose. EDT: grupo endometriose; \nK562BLOQ: células bloqueadas para a proteína MICA; I/II, estádios iniciais da endometriose; III/IV: \nestádios avançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; A) mulheres com EDT em \nestádios iniciais; B) mulheres com EDT em estádios avançado; valores de % de morte de K562 e \nK562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor \nde morte espontânea foi maior do que com estímulo , linha pontilhada: valor zero de % de células \nmortas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05 ); citotoxicidade avaliad a por porcentagem (%) de \nmorte de células K562; valores de p determinados pelo teste pareado, não paramétrico, de Wilcoxon. \n \n\n152 \n \nii) Análise da CTX contra células alvo K562 entre mulheres em estádios iniciais e \navançados da EDT, e o grupo CTR. \n \n A CTX contra célul as K562 não mostrou diferença na comparação entre estádios \niniciais (10,3%, 1,8 - 21,30) e avançados da doença (7,35%, -1,6 - 29,1) (p= 0,6885, teste de \nMann-Whitney). O mesmo foi observado entre mulheres em estádios iniciais em comparação \ncom CTRs saudáve is ( 11,5%, 0,5 –35,2) ( p= 0,1792, teste de Mann-Whitney). No entanto, \nobservamos que mulheres com EDT avançada apresentaram menor CTX (7,35%, -1,6 - 29,1) \nem relação ao grupo CTR saudável (11,5%, 0,5–35,2) (p= 0,0115, teste de Mann-Whitney) \n(Figura 55). \n \niii) Análise da CTX contra células alvo K562 bloqueadas para MICA, entre mulheres \nem estádios iniciais e avançados da EDT, e o grupo CTR \n \n A CTX contra células K562BLOQ também não mostrou diferença na comparação entre \nestádios iniciais (med 5,1%, -4,7-12,9, min-max) e avançados da EDT (med 7,0%, -1,2-55,4, \nmin-max) (p= 0,4322, teste de Mann-Whitney). Mulheres com EDT avançada (med 7,0%, -1,2-\n55,4, min-max) também não apresentaram diferença em relação à CTX de CTRs saudáveis \n(med 12,5%, 0,5 -34,9, min -max) na compa ração com bloqueio ( p= 0,1725, teste de Mann-\nWhitney). Diferentemente da CTX contra células K562 sem bloqueio, a CTX contra células \nK562BLOQ foi menor na EDT inicial (med 5,1%, -4,7-12,9, min-max), em relação aos CTRs \nsaudáveis (med 12,5%,0,5-34,9, min-max) (p= 0,0181, teste de Mann-Whitney (Figura 55). \n \n \nI / II III /IV C T R \n-5\n0\n5\n1 0\n1 5\n2 0\n4 0\n6 0\n% d e m o rte\nc o n tra c é lu la s K 5 6 2 p = 0 ,0 1 1 5\nn = 9 n = 1 2 n = 2 0\nA )\n \nI / II III /IV C T R \n-5\n0\n5\n1 0\n1 5\n2 0\n4 0\n6 0\n% d e m o rte\nc o n tra c é lu la s K 5 6 2 B L O Q\np = 0 ,0 1 8 1\nn = 9 n = 1 2 n = 2 0\nB ) \n \nFigura 5 5. Citotoxicidade pelas células NK circulantes de mulheres em estádios iniciais e \navançados da endometriose e de controles. A) CTX contra células K562; B) CTX contra células K562 \nbloqueadas para MICA; CTX: citotoxicidade; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios \navançados da endometriose; estádios de acordo com rASRM; CTR: grupo controle; K562BLOQ: células \nK562 bloqueadas para MICA; valores de CTX contra células K562 e K562BLOQ descontado o valor de \nmorte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do \nque com estímulo ; linha pontilhada: valor zero de % de células mortas; citotoxicidade avaliada por \nporcentagem (%) de morte de células K562; as barras horizontais representam as medianas nos \ndiferentes grupos; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n\n153 \n \n4.4.6.3 Citotoxicidade e análise de correlação com níveis de MICA solúvel \nA CTX (% de morte) induzida pelas células NK circulantes contra células K562, e \ncélulas K562 com bloqueio para MICA, foi avaliada em relação à variação dos níveis de MICA \nsolúvel (sMICA) (sistêmico, soro, e no microambiente da lesão, fluido peritoneal - FP). \nNão observamos correlação entre a % de morte de células K562 e níveis de sMICA, \ntanto no soro como no FP, em nenhum grupo de estudo (CTR: soro, r=0,02, p= 0,9511 e FP, \nr= -0,2, p= 0,3609; EDT: soro, r= 0,04, p= 0,8769 e FP, r= 0,2, p= 0,4806) (teste de correlação \nde Spearman) (Anexo X, Figura 1). \n De forma semelhante ao encontrado para a condição contra K562 sem bloqueio, a CTX \ncontra células K562 bloqueadas para a proteína MICA também não mostrou correlação com \nníveis de sMICA no soro e no FP, em ambos os grupos (CTR: soro, r=0,03, p= 0,8833 e FP, r= \n-0,02, p= 0,9170; EDT: soro, r=0,1, p= 0,6807 e FP, r= -0,5, p= 0,0538) (teste de correlação de \nSpearman) (Anexo X, Figura 2). \n Uma vez que os níveis de sMICA foram, neste estudo, descritos como maiore s na EDT \navançada (Resultados, item 4.3), avaliamos também se houve correlação entre a \ncitotoxicidade contra as células K562, e contra células K562 bloqueadas para MICA, e os \nníveis de sMICA (soro e FP) em mulheres com EDT, estratificadas para os estádios da \ndoença. Não foram observadas diferenças significativas para a correlação entre a CTX e \nsMICA (soro e FP), tanto nos estádios iniciais como avançados da doença ( p= ns, teste de \ncorrelação de Spearman) (Anexo XI, Tabela 15). \n \n \n4.4.6.4 Citotoxicidade e relação com as fases do ciclo menstrual \ni) Nos grupos EDT e CTR, frente a células K562 com e sem bloqueio de MICA \n \n Tanto na fase proliferativa como na fase secretora, ambos os grupos não apresentaram \ndiferença na CTX (% de morte), antes (K562) e após o bloqu eio de MICA(K562BLOQ). Os \nvalores de p foram determinados pelo teste de Wilcoxon (Figura 56). \n \n• Fase proliferativa: \n ► Grupo CTR: a mediana de % de morte contra células K 562 foi de 16,6% (2,7 -35,2, \nmin-max) e, contra células K562BLOQ foi de 13,2% (2,0-27,7, min-max) (p= 0,1934) \n ► Grupo EDT: a mediana de CTX cont ra K562 foi 6,3% (1,8 -10,3, min-max) e, contra \ncélulas K562BLOQ foi de 4,5% (-4,7-26,3, min-max) (p> 0,9999) \n \n \n \n\n154 \n \n• Fase secretora: \n ► Grupo CTR: a mediana de % de morte de K562 foi de 10,1% (0,5-19,0, min-max) e, \nconta células K562BLOQ, foi de 11,75% (0,5-34,9, min-max) (p= 0,6175) \n ► Grupo EDT: a mediana de CTX contra K562 foi de 9,4% (-1,6-9,4, min-max) e, contra \ncélulas K562BLOQ foi de 7,8% (-1,2-55,4, min-max) (p= 0,2036) \n \nK 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q \n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nC T R : p ro life ra tiv a (n = 1 0 )\n% d e m o rte\nA )\np = n s\n \nK 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q \n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nC T R : s e c re to ra (n = 1 0 )\n% d e m o rte\nB )\np = n s \nK 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q \n0\n1 0\n2 0\n3 0\nE D T : p ro life ra tiv a (n = 8 )\n% d e m o rte\nC )\np = n s\n \nK 5 6 2 K 5 6 2 B L O Q \n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\n6 0\nE D T : s e c re to ra (n = 1 3 )\n% d e m o rte\nD )\np = n s \n \nFigura 56. Porcentagem (%) de morte de células K562 e células K562 após o bloqueio da proteína \nMICA, nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, em mulheres com endometriose e \ncontroles. CTR: grupo controle; EDT: grupo endometriose; K562BLOQ: células K562 boqueadas para \nMICA; valores de CTX contra células K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de \nK562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; linha \npontilhada: valor zero de % de células mortas; citotoxicidade avaliada por porcentagem (%) de morte de \ncélulas K562; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste pareado, \nnão paramétrico, de Wilcoxon. \n \n \nii) Entre grupos, EDT e CTRs, frente a células K562 com e sem bloqueio de MICA \nOs valores de p das análises comparativas entre os grupos foram determinados pelo \nteste de Mann-Whitney. \n \n• Fase proliferativa: \n Mulheres com EDT apresentaram menor % de morte (CTX) contra células K562 (que \nexpressam MICA) (6,3%, 1,8 -10,3) em relação às mulheres CTRs (16,6%, 2,7 -35,2, min-\nmax) (p= 0,0044) (Figura 5 7). No entanto, para CTX contra cé lulas K562BLOQ não houve \ndiferença entre o grupo EDT (4,5%, -4,7-26,3, min-max) e o grupo CTR (13,2%, 2,0-27,7, \nmin-max) (p= 0,1799). \n \n\n155 \n \n• Fase secretora: \n Não houve diferença entre os grupos estudados. Mulheres com EDT apresentaram \nmediana de % de morte, CTX, contra células K562 de 9,4% ( -1,6-29,1, min-max), semelhante \nà de mulheres CTRs, 10,1% (0,5 -19,0, min -max) ( p= 0,6814). Para a CTX contra células \nK562BLOQ, o grupo EDT apresentou mediana de 7,7% (-1,2-55,4, min-max) e, no grupo CTR, \nde 11,75% (0,5-34,9, min-max) (p= 0,2139) (Figura 57). \n \n \nE D T C T R \n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nP ro life ra tiv a\nm o rte K 5 6 2 (% ) p = 0 ,0 0 4 4\nn = 8 n = 1 0\nA )\n \nE D T C T R \n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nP ro life ra tiv a\nm o rte K 5 6 2 B L O Q (% )\np = n s\nn = 8 n = 1 0\nB ) \n \nE D T C T R \n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nS e c re to ra\n m o rte K 5 6 2 (% )\nC )\nn = 1 3 n = 1 0\np = n s\n \nE D T C T R \n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\n6 0\nS e c re to ra\nm o rte K 5 6 2 B L O Q (% )\nD )\np = n s\nn = 1 3 n = 1 0 \n \nFigura 57. Comparações da frequência de morte de células K562 com e sem bloqueio da proteína \nMICA, nas f ases proliferativa e secretora do ciclo menstrual, entre os grupos de mulheres com \nendometriose e controles. A e C) citotoxicidade frente a células K562; B e D) citotoxicidade frente a \ncélulas K562 bloqueadas para MICA; CTR: grupo controle; EDT: grupo endo metriose; CTX: \ncitotoxicidade; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; valores de CTX contra células K562 e \nK562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor \nde morte espontânea foi maior do que com estím ulo; linha pontilhada: valor zero de % de células \nmortas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); as barras horizontais representam as medianas nos \ndiferentes grupos; valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \niii) Citotoxicidade entre as fases do ciclo menstrual, na EDT e CTRs, frente às células \nK562 com e sem bloqueio de MICA \n \n A comparação da CTX entre as diferentes fases do ciclo, tanto o grupo EDT como o \ngrupo CTR, não mostrou diferença frente a células K562 e frente a células K562 bloqueada s \npara MICA. Os valores de p foram determinados pelo teste de Mann-Whitney (Figura 58). \n \n\n156 \n \n• CTX contra células K562: \n ► Grupo CTR: a mediana de % de morte na fase proliferativa foi de 16,6% (2,7 -35,2, \nmin-max) e, na fase secretora, de 10,1% (0,5-19,0, min-max) (p=0,1230) \n ► Grupo EDT: a mediana da % de morte na fase proliferativa foi de 6,3%, (1,8 -10,3, \nmin-max) e, na fase secretora, de 9,4% (-1,6-29,1, min-max) (p=0,1688) \n \n• CTX contra células K562BLOQ: \n ► Grupo CTR: mediana de % de morte na fase proliferativa foi de 13,2 % (2,0 -27,7, \nmin-max) e, na fase secretora, de 10,5% (0,5-19,0, min-max) (p=0,4224) \n ► Grupo EDT: a mediana de % morte na fase proliferativa foi de 4,5 % ( -4,7-26,3, min-\nmax) e, na fase secretora, de 7,7% (-1,2-55,4, min-max) (p=0,3638) \n \n \np ro life ra tiv a s e c re to ra\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nC T R\n% d e m o rte K 5 6 2 p = n s\nn = 1 0 n = 1 0\nA )\n \np ro life ra tiv a s e c re to ra\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nC T R\n% d e m o rte K 5 6 2 B L O Q\np = n s\nB )\nn = 1 0 n = 1 0 \n \np ro life ra tiv a s e c re to ra\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\nE D T\n% d e m o rte K 5 6 2\nC )\nn = 8 n = 1 3\np = n s\n \np ro life ra tiv a s e c re to ra\n0\n1 0\n2 0\n3 0\n4 0\n6 0\nE D T\n% d e m o rte K 5 6 2 B L O Q\nD )\np = n s\nn = 8 n = 1 3 \n \nFigura 58. Comparações da frequência de morte de células K562, e de células K562BLOQ, entre \nas diferentes fases do ciclo, no grupo de mulheres com endometriose e controles. A e C) \ncitotoxicidade frente a células K562 ; B e D) citotoxicidade frente a células K56 2 bloqueadas para MICA; \nCTR: grupo controle; EDT: grupo endometriose; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para MICA; \nvalores de CTX contra células K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; \nvalores negativos: valores onde o valor de mort e espontânea foi maior do que com estímulo ; linha \npontilhada: valor zero de % de células mortas; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05 ); as barras \nhorizontais representam as medianas nos diferentes grupos; valores de p determinados pelo teste de \nMann-Whitney. \n \n\n157 \n \n4.4.6.5 Análise de correlação entre citotoxicidade induzida pelas células NK e a \nexpressão das moléculas CD107a, IFN-y ou IL-10 \n A análise de correlação de CTX de células NK foi feita em relação à frequência de \ncélulas com expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, em células NK e \nsubpopulações, e suas intensidades de expressão (MFI), frente a células K562 e a frente \ncélulas K562 bloqueadas para MICA. Os valores de r e p foram determinados pelo teste de \ncorrelação de Spearman. \n \n• CTX contra células K562 vs CD107a, IFN-y ou IL-10 \n \n As únicas correlações observadas foram em relação à molécula CD107a, em ambos os \ngrupos, EDT e CTR: \n ► Grupo CTR: tivemos correlações positivas entre CTX e a % de células CD56 bright (r= \n0,5, p= 0,0397) e CD56 brightCD16- (r= 0,8, p= 0,001) e entre CTX e intensidade de expressão \nde CD107a em células CD56dim (r= 0,5, p= 0,0405) (Tabela 23A): \n ► Grupo EDT: somente observamos correlação positiva de CTX com intensidade de \nexpressão de CD107a na subpopulação CD56dimCD16- (r= 0,5, p= 0,0474) Tabela 24A): \n Chama a atenção que a correlação da CTX com % de CD107a para o grupo CTR foi \napenas para células com p resença da molécula CD56 bright. Para MFI, em ambos os grupos, a \ncorrelação foi para células com baixa expressão da molécula CD56dim. \n \n• CTX contra células K562 bloqueadas para MICA vs CD107a, IFN-y ou IL-10 \n \n No ensaio de CTX tendo como célula alvo K562 bloqueadas para MICA, houve perda \nde todas as correlações para CD107a (frequência e MFI), tanto na EDT como em CTRs \n(Tabela 23B). \n Para IFN-γ e IL -10, no grupo CTR, foram mantidas as ausências de correlações com \nCTX. No entanto, na EDT, diferentemente do estímulo de células NK com K562 sem bloqueio, \nno ensaio de CTX com células K562 bloqueadas para MICA surgiram correlações positivas \nda CTX com intensidade de expressão de IFN -γ (r= 0,5, p= 0,0478) e com a % de \nexpressão de IL-10 (r= 0,6, p= 0,0135), ambas para células CD56dimCD16- (Tabela 24B). \n \n \n \n \n \n \n \n\n158 \n \nTabela 23. Análise de correlação entre a citotoxicidade contra células K562 e K562 \nbloqueadas para MICA, com a frequência ou intensidade de expressão das moléculas \nCD107a, IFN-y ou IL-10, em mulheres do grupo controle. \n \nA) CTX contra células K562 no grupo controle \n \nCTR\n(n) p r (n) p r (n) p r\nNK totais 19 ns ns 19 ns ns 15 ns ns\nCD566dim 19 ns ns 19 ns ns 15 ns ns\nCd56bright 16 0,0397 0,5 16 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16- 18 ns ns 18 ns ns 14 ns ns\nCD56brightCD16+ 8 ns ns 8 ns ns 7 ns ns\nCD56brightCD16- 16 0,0010 0,8 14 ns ns 12 ns ns\nCTR\n(n) p r (n) p r (n) p r\nNK totais 19 ns ns 19 ns ns 15 ns ns\nCD566dim 19 0,0405 0,5 19 ns ns 13 ns ns\nCd56bright 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16- 18 ns ns 18 ns ns 14 ns ns\nCD56brightCD16+ 8 ns ns 8 ns ns 7 ns ns\nCD56brightCD16- 16 ns ns 14 ns ns 12 ns ns\nSubpopulações\nSubpopulações\n Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\n CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX\nEstímulo com K562 (frequência de expressão, % )\n CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX\n \n \n \nB) CTX contra células K562BLOQ no grupo controle \n \nCTR\n(n) p r (n) p r (n) p r\nNK totais 18 ns ns 18 ns ns 13 ns ns\nCD566dim 18 ns ns 18 ns ns 13 ns ns\nCd56bright 16 ns ns 16 ns ns 12 ns ns\nCD56dimCD16+ 16 ns ns 16 ns ns 12 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 13 ns ns\nCD56brightCD16+ 7 ns ns 7 ns ns 5 ns ns\nCD56brightCD16- 14 ns ns 13 ns ns 10 ns ns\nCTR\n(n) p r (n) p r (n) p r\nNK totais 18 ns ns 18 ns ns 13 ns ns\nCD566dim 18 ns ns 18 ns ns 13 ns ns\nCd56bright 16 ns ns 16 ns ns 12 ns ns\nCD56dimCD16+ 16 ns ns 16 ns ns 12 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 13 ns ns\nCD56brightCD16+ 7 ns ns 7 ns ns 5 ns ns\nCD56brightCD16- 14 ns ns 13 ns ns 10 ns ns\nSubpopulações\nSubpopulações\nIL-10 x CTX CD107a x CTX IFN-γ x CTX\nEstímulo com K562BLOQ (frequência de expressão, % )\n CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\n \n \nCTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de inten sidade de fluorescência (intensidade de expressão); \nK562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína MICA; n: número de pares de dados analisados para cada \nsubpopulação; as análises foram realizadas a partir de valores da mediana de porcentagem de células com \nexpressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10 e de suas MFIs, nas diferentes subpopulações de NK; ns: não \nsignificante (p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes (p<0,05) e respectivos valores de r; valores de p e r \ndeterminados pelo teste de correlação de Spearman. \n\n159 \n \nTabela 24. Análise de correlação entre a citotoxicidade contra células K562 e K562 \nbloqueadas para MICA , com a frequência ou intensidade de expressão das moléculas \nCD107a, IFN-y ou IL-10, em mulheres com endometriose. \n \nA) CTX contra células K562 no grupo endometriose \n \nEDT\n(n) p r (n) p r (n) p r\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns\nCD566dim 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns\nCd56bright 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 ns ns 4 ns ns 4 ns ns\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nEDT\n(n) p r (n) p r (n) p r\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns\nCD566dim 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns\nCd56bright 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 0,0474 0,5 20 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 ns ns 4 ns ns 4 ns ns\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nSubpopulações\nSubpopulações\n CD107a x CTX IFN-γ x CTX\n CD107a x CTX IFN-γ x CTX\n Estímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nIL-10 x CTX\n Estímulo com K562 (frequência de expressão, % )\nIL-10 x CTX\n \n \n \nB) CTX contra células K562BLOQ no grupo endometriose \n \nEDT\n(n) p r (n) p r (n) p r\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns\nCD566dim 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns\nCd56bright 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 17 0,0135 0,6\nCD56brightCD16+ 4 ns ns 4 ns ns 4 ns ns\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nEDT\n(n) p r (n) p r (n) p r\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns\nCD566dim 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns\nCd56bright 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 0,0478 0,5 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 ns ns 4 ns ns 4 ns ns\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns\nSubpopulações\nSubpopulações\nEstímulo com K562BLOQ (frequência de expressão, % )\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\n CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX\n CD107a x CTX IFN-γ x CTX IL-10 x CTX\n \n \nEDT: grupo endometriose; NK totais : incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); \nK562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína MICA; n: número de pares de dado s analisados para cada \nsubpopulação; em negrito: valores de p significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r; as análises foram \nrealizadas a partir de valores da mediana de porcentagem de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y \nou IL -10 e de s uas MFIs, nas diferentes subpopulações de NK; ns: não significante (p≥ 0,05 ; valores de p e r \ndeterminados pelo teste de correlação de Spearman. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n____________________________________________________DISCUSSÃO \n \n \n \n\n161 \n \n5. DISCUSSÃO \n \n Os resultados deste estudo corroboram nossa hipótese do papel da molécula MICA na \nfisiopatologia da endometriose e que MICA solúvel pode contribuir para a deficiência da \natividade citotóxica de células NK, na doença. Como balanço geral, nossos dados mostraram \nque o endométrio eutópico de mulheres com EDT apresentam u ma maior frequência de alta \nexpressão da proteína MICA em contraste ao endométrio saudável, indicando já haver \nalterações imunológicas de células endometriais, com envolvimento de MICA, mesmo antes da \nsua migração e instalação ectópica. Observamos maiores níveis de MICA solúvel, sistêmicos e \nno microambiente peritoneal, na EDT. Esses níveis foram associados a estádios avançados e \na sítios de maior gravidade da doença, sugerindo a participação de MICA solúvel na sua \ngravidade e, possivelmente, na progressão da doença. \n Além disso, mulheres com EDT apresentaram menor citotoxicidade pelas células NK, \ndeficiência essa também associada a estádios avançados da doença, em concordância com \ndados da literatura e indicando a maior deficiência da atividade funcional d e NK, \nprovavelmente, também na progressão da EDT. A menor frequência da subpopulação com \npropriedade citotóxica, CD56 dimCD16+, soma -se ao achado de menor citotoxicidade na \ndoença. Ademais, a maior expressão do receptor NKG2D nas células NK, apenas nos estádios \niniciais da EDT, pode implicar em maior estímulo de ativação das nessas células, em fases \nmais precoces da doença. Testamos o potencial efeito de MICA solúvel na atividade efetora de \ncélulas NK, por meio do experimento de bloqueio de MICA, in vitro . O bloqueio de MICA \nimpactou numa menor citotoxicidade comparada ao estímulo sem bloqueio, apenas em \nmulheres em estádios iniciais da doença, em relação às mulheres saudáveis, sugerindo o \nenvolvimento de MICA solúvel na deficiência da atividade citotóxica de células NK, nos \nestádios iniciais da doença. \n No estado basal de cultura, mulhe res com EDT apresentaram maior expressão da \ncitocina inflamatória IFN -γ e da citocina imunorreguladora IL -10, nas células NK, refletindo o \nestado inflamatório da doença, com impacto nas células NK. A menor de expressão de \nCD107a, IFN-γ e IL-10 nas células NK e sua menor citotoxicidade, na condição de estímulo, \nindica haver deficiência na ativação dessas células, na EDT, quando desafiadas com estímulo. \nA condição de bloqueio para MICA, mimetiz ando o efeito de MICA solúvel, não alterou a \nexpressão das moléculas CD107a, IFN-γ e IL-10, nas células NK, indicando pouco impacto na \nexpressão dessas moléculas, por células NK, nem na EDT nem em mulheres saudáveis, pelo \nmenos in vitro. No entanto, a correlação negativa entre níveis de MICA solúvel ( in vivo) e a \nexpressão de CD107a, apenas na condição de bloqueio de MICA, na EDT, sugere que, in vivo, \nMICA solúvel pode contribuir para a inibição da degranulação das células NK na doença, \nprejudicando sua atividade citotóxica. \n Agora, discutiremos nossos dados de forma mais aprofundada, procurando estabelecer \ninterconexões entre eles, visando melhor interpretação biológica, assim como com a literatura. \n\n162 \n \n Com o objetivo de avaliar a potencial participação de MICA na fisiopatologia da EDT, \nanalisamos, incialmente, sua expressão gênica no endométrio eutópico de mulheres com EDT \ne comparamos com o grupo CTR saudável. Nossos resultados indicaram não haver diferença \nna expressão gênica de MICA entre os grupos de estudo. Este dado sugere que a expressão \ngênica de MICA em mulheres com EDT se mantém semelhante à condição fisiológica, a \ndespeito do endométrio dessas mulheres apresentarem diversas alterações, como funções \nimunológicas e endócrinas, num contexto inflamatório, em relação a mulheres sem doença \n(Sharpe-Timms, 2001; Ulukus et al., 2006). Mesmo considerando a escassez de estudos \nanalisando a expressão gêni ca e proteica de MICA no endométrio eutópico, na EDT, \nidentificamos um estudo (Xu, 2019) que foi concordante com a ausência de diferença de \nexpressão de mRNA de MICA, aqui observada. A expressão gênica de MICA, nesse estudo, \ntambém não indicou diferença em relação ao endométrio ectópico. Nesse sentido, destacamos \nque, embora consideremos relevante a análise pareada da lesão endometrial para o estudo de \nexpressão gênica de MICA, optamos por não realizar esta análise, devido à dificuldade técnica \npara a obtenção de tecid o endometrial puro da lesão, não sendo, portanto, uma amostra \nrepresentativa. \n Não obstante, quando realizamos uma análise mais refinada, considerando a \nexpressão proteica de MICA no epitélio (simultaneamente, frequência e intensidade de \nexpressão, que denominamos de escore de imunorreatividade - EIR), encontramos uma maior \nfrequência de alta expressão de MICA no epitélio do endométrio eutópico de mulheres com \nEDT, em relação ao endométrio de mulheres saudáveis. Esse dado sugere que a ocorrência \nde estímulo prévio nesse endométrio tenha promovido o aumento de expressão da proteína \nMICA, antes mesmo de seu deslocamento e desenvolvimento ectópico. \n Tal estímulo pode estar relacionado ao próprio microambiente do endométrio eutópico \ndas mulheres doentes, como já descrito antes, ter maior expressão de VEGF -A, presença de \nestresse oxidativo, resistência à progesterona, entre outros fatores, caracterizando um \nmicroambiente inflamatório (revisado em Brosens et al., 2012). No entanto, permanece em \naberto o que desencadeia o processo inflamatório e onde ele se inicia. Assim, em \nconcordância com outras alterações relatadas para o endométrio eutópico de mulheres com \nEDT, como disfunções imunológicas e endócrinas (Sharpe-Timms, 2001; Ulukus et al., 2006), \nnossos dados de maior escore de imunorreatividade de MICA, na EDT, também convergem \npara a interpretação da quebra da homeostase do microambiente uterino. \n Destacamos que a indução e/ou aumen to da expressão das moléculas MICA, em \nsituação de estresse biológico, pode estar relacionada com a presença de um segmento do \npromotor gênico semelhante aos do gene da proteína 70 de choque térmico (HSP70), tendo \nsua expressão regulada por tais elementos (Groh et al., 1996). No contexto da EDT, também é \ndescrito que a proteína HSP70 está mais expressa no endométrio eutópico dessas mulheres, \nem comparação ao endométrio eutópico de mulheres CTR, sem a doença (Ota et al., 1997; \nImamura et al., 2014), e também em relação às lesões ectópicas (Ota et al., 1997). Esses \n\n163 \n \ndados colocam a HSP70 como uma p ossível molécula importante na modulação positiva da \nexpressão de MICA, no contexto de estresse celular e da perturbação da homeostase nesse \nmicroambiente, na doença. Além disso, a inflamação do endométrio eutópico na EDT está \ntambém associada à produção d e radicais livres e a sinais de estresse oxidativo (Agarwal et \nal., 2008), que também estão associados ao aumento de expressão de MICA, e na sua \nliberação na forma de exossomas (Hedlund et al., 2011), apoiando nossa interpretação. \n Ademais, é possível que os maiores escores de imunorreatividade (EIR) para a \nexpressão de MICA no epitélio glandular, em ambos os grupos de estudo, possam também \nestar relacionados à intensa atividade funcional a ele associado, assim como por uma possível \nação autócrina de TGF -β produzido por esse epitélio, e que poderia também contribuir p ara a \nindução de maior de expressão de MICA (Song et al., 2015). Em alguns estudos sugerem-se o \npotencial envolv imento de TGF -β na patogênese da EDT, participando na sobrevivência de \nendométrio ectópico, aument ando a proliferação celular, podendo facilitar a capacidade \ninvasiva do endométrio (Shin-ichi Komiyama et al., 2007) \n Ainda no que diz respeito à expressão proteica de MICA, esperávamos encontrar maior \nexpressão no endométrio ectópico da lesão, em relação ao eutópico, na EDT. No entanto, \napesar de não termos observado essa diferença, não podemos descartar que, em algum \nmomento da evolução da doença, tenha havido uma maior expressão de MICA e, no contexto \nde intenso processo inflamatório, tenha ocorrido maior liberação na sua forma solúvel, seja por \nclivagem via MMPs e ADAMs, detectadas em maior expressão na EDT (revisado em Ke et al., \n2021), ou via exossomas (Whiteside, 2013). \n Um estudo da literatura sobre a expressão proteica de MICA na EDT (Xu 2019) \nindicou, diferentemente do nosso resultado de expressão proteica, ausência de diferença na \nexpressão de MICA entre o endométrio eutópico de mulheres com EDT e o do grupo CTR. \nDestacamos que essa diferença pode ser devido às diferentes abordagens técnicas utilizadas \nnos estudos. Ademais, salientamos que, diferentemente dos nossos grupos de estudo (EDT e \nCTR), a análise de expressão gênica e proteica desse estudo (Xu 2019) foi realizada em \nendométrios eutópicos de mulheres apenas com EDT ovariana e, no grupo CTR, em \nendométrio eutópico de mulheres com presença de doença benigna (cisto ovariano), não \nhavendo o parâmetro do endométrio saudável. \n As mulheres com EDT também tiveram níveis maiores de MICA solúvel (sMICA), tanto \nsistemicamente (no soro) como no microambiente da lesão (fluido peritoneal), do que mulheres \ndo grupo CTR, indicando haver desregulação da imunobiologia de MICA, na doença. De \nmaneira complementar, analisamos os níveis de sMICA em relação aos estádios e tipos de \ndoença. \n No entanto, inicialmente, gostaríamos de apontar a vigente discussão, na comunidade \ncientífica, sobre quais parâmetros são adequados para avaliar a progressão da doença em \nmulheres com EDT. Embora haja limitações nos modelos animais disponíveis para EDT, \ndevido à etiopatogenia multifatorial da doença, alguns modelos indicam a ocorrência de \n\n164 \n \nprogressão da doença (revisado em Bruner-Tran et al., 2018). Após a implantação ectópica de \ncélulas endometriais, há progressão da lesão, no entanto, não encontramos dados sobre a \natividade imunológica nesses modelos . Ademais, dados em mulheres com EDT também \nsustentam a interpretação de haver progressão da doença . Em estudo avaliando-se a \ncitotoxicidade pré e pós a remoção total, ou parcial, das lesões de EDT avançada (Garzetti et \nal., 1995), mostrou-se haver manutenção da deficiência de citotoxicidade na EDT, em relação \nao grupo controle. A deficiência de citotoxicidade permaneceu onde houv e remoção \nmacroscópica total da lesão, indicando permanência da disfunção imunológica. Salientamos \nque a avaliação imunológica foi realizada com 4 -8 semanas pós-cirurgia, não sendo possível, \nportanto, saber se a homeostase imunológica poderia ser resgatada posteriormente. Ademais, \ndestacamos que a avaliação da lesão é macroscópica, não sendo possível excluir a \npermanência de lesão residual microscópica (Garzetti et al., 1995). Com base nesses dados, \ninterpretamos que a EDT pode cursar com progressão e maior gravidade. \n Nossos resultados mostraram maiores níveis d e sMICA a partir do estádio II (leve) da \ndoença, sendo mantido nos estádios mais avançados da doença, III (moderado) e IV (grave), \ntanto no soro, como no FP, em relação ao grupo CTR. Em contraste, não foram observadas \ndiferenças entre os níveis de sMICA de mulheres com EDT que estavam no estádio inicial I \n(endometriose mínima) e mulheres CTR, sugerindo que os níveis de sMICA, nesse estádio, \nsejam insuficientes para inibir a atividade citotóxica de células NK, descrita ser pouco \ncomprometida neste estádio da doença (Wilson et al., 1994). Na análise estratificada por \nestádio, identificamos diferenças, tanto sistemicamente (no soro) como no microambiente \nperitoneal (FP), entre os estádios I e II, e I e IV. De forma geral, esses resultados indicam uma \nassociação de maiores níveis de sMICA com estádios mais avançados da doença e sugerem \nque o excesso de sMICA pode contribuir para a progressão da doença. \n Salientamos que o excesso de sMICA pode contribuir para a internalização/degradação \ndo receptor NKG2D (Groh et al., 2002), via ligação sMICA -NKG2D, e contribuir para a menor \natividade efetora de células NK e, consequentemente, para o maior comprometimento na \neliminação de células endometriais ectópicas. Ademais, esses dados, especi almente, em \nrelação ao microambiente da lesão (FP), com maiores níveis de sMICA, sustentam a nossa \nhipótese do potencial envolvimento de MICA, também na forma solúvel, na fisiopatologia da \ndoença e, especialmente em seus estádios avançados. \n É possível que os maiores níveis de sMICA no FP de mulheres com EDT sejam reflexo \ndo microambiente inflamatório do peritônio dessas mulheres, como relatado ter presença \naumentada de células do sistema imune, como macrófagos, células TCD4+, TCD8+ e células \nNK (Osuga et al., 2011; revisto em Ulukus et al., 2006) e de diversas citocinas inflamatórias \n(Podgaec et al., 2007; Bellelis et al., 2019). De forma não excludente, d evemos considerar \nque, ao menos em parte, os maiores níveis de sMICA sejam induzidos pelas citocinas TGF-β e \nIL-15, bem como por espécies reativas de oxigênio (ROS) e pela ação conjunta de MMPs. \nVale destacar que a citocina TGF -β é descrita com maior expressão proteica no epitélio \n\n165 \n \nglandular de cistos endometrióticos de mulheres com EDT, em relação a endométrios normais \n(Komiyama et al., 2007) e que seus níveis, tanto no soro como no FP, foram associados, de \nforma progressiva, a estádios mais avançados da doença (Pizzo et al., 2002). Além disso, \nsalientamos que TGF -β tem a capacidade de estimular a expressão proteica de MICA, bem \ncomo sua liberação na forma solúvel (SONG et al., 2015). Ademais, também a citocina IL-15 é \nexpressa em maiores níveis (mRNA e proteína) no endométrio ectópico (Chegini et al., 2003) e \né capaz de induzir a expressão de MICA (Van Audenaerde et al., 2017; Jinushi et al., 2003). \nAlém disso, a IL -15 é o bservada em níveis elevados no FP de mulheres com EDT, quando \ncomparados aos de mulheres CTRs (Chegini et al., 2003; Bellelis et al., 2019). \n Em relação ao microambiente peritoneal de mulheres com EDT, o aumento de sMICA \npode ter ocorrido poster iormente a uma expressão inicial aumentada de MICA de membrana, \ndentro de um contexto inflamatório continuado (estresse biológico), com liberação sincronizada \nna sua forma solúvel e, portanto, não mais detectável, como aumentada, nas células \nendometriais. Também vale a pena apontar que o ferro, proveniente de refluxo menstrual, \npotencializa a toxicidade de oxigênio e nitrogênio, pela liberação de radicais livres, induzindo \ndano celular e proliferação (Kumar e Beyopadhyay, 2005). A liberação dos produtos pró -\ninflamatórios e os sinais de estresse oxidativo gerados por espécies reativas de oxigênio \n(ROS) podem estimular a expressão de moléculas MICA (Peraldi et al., 2009), amplificando o \nmicroambiente inflamatório. \n As células endometriais aderida s ao peritônio, ou a outras superfícies de órgãos \nperitoneais, uma vez express ando MICA, poderiam sofrer a ação de MMPs, lev ando à \nliberação de MICA na forma solúvel, no FP (revisado em Kyama et al., 2003). Depois da \nligação ao peritônio, as células endometriais invadem a matriz extracelular, num processo, \nprincipalmente, mediado por metaloproteinases. As MMPs são prod uzidas por tecido \nendometrial eutópico e ectópico e parecem participar de forma ativa no estabelecimento e \nprogressão da doença (revisado em Zhou e Nothnick, 2005). Neste sentido, foi observado que \nimplantes endometrióticos têm alta expressão de diversas MMPs, incluindo MMP2 e MMP9 \n(revisado em Zhou e Nothnick, 2005), as quais são mediadoras da clivagem de MICA para a \nforma solúvel (Yang et al., 2014). Ademais, as MMP2/9 têm função imunorreguladora (Lavini-\nRamos et al., 2017) e poderiam contribuir para o estado de imunossupressão que ocorre na \nEDT, especialmente na EDT avançada (Rached et al., 2019). \n Além do fluido peritoneal, também encontramos maiores níveis de MICA solúvel no \nsoro, na EDT, indicando haver uma repercussão sistêmica da desregulação envolvendo MICA \nsolúvel, concordante com a interconexão entre circulação e microambiente peritoneal (Solass \net al., 2016). Isto é, o peritônio consiste em uma camada de células mesoteliais, em uma base \nde tecido conjuntivo, perfundida com vasos sanguíneos e linfáticos (Solass et al., 2016), de \nforma que sMICA presente nesse microambiente pode seguir, via circulação sanguínea e ser \ndetectada sistemicamente (no soro). Além disso, o aumento da angiogênese/vascularização, \nque ocorre nos locais de implante de tecido endometrial (Tariverdian et al., 2007), também \n\n166 \n \npode favorecer a circulação sistêmica dessa proteína. A correlação positiva que encontramos \nentre os níveis de sMICA no soro e FP, em ambos os grupos de estudo, é concordante com \nessa interpretação. \n Destacamos já ter sido relatado, na literatura, que o tratamento de células NK com soro \nde mulheres com EDT, com altos níveis de sMICA observado no presente estudo , diminui a \natividade citotóxica dessas células, de maneira dose dependente, compar ando-se ao \ntratamento com soro de mulheres sadias (Kanzaki et al., 1992; Tanaka et al., 1992). De forma \nsemelhante, fatores solúveis presentes no sobrenadante de cultura de células estromais de \nendométrio de mulheres com EDT são capazes de suprimir a ativ idade citotóxica de células \nNK (Somigliana et al., 1996). Estes achados apoiam o envolvimento de fatores solúveis na \ndeficiência da atividade citotóxica de células NK e reforçam a nossa hipótese do potencial \nenvolvimento de MICA solúvel na fisiopatologia da EDT. \n De forma semelhante ao g rupo EDT, mas em níveis menores, os níveis de sMICA no \nmicroambiente peritoneal (FP) de mulheres CTRs (laqueadura e doença benigna) também foi \nmaior do que os níveis encontrados, sistemicamente, nessas mulheres. Nesse sentido, \npodemos sugerir que sMICA ten ha papel fisiológico na manutenção da homeostase, inclusive \nno ambiente peritoneal. Nossos achados de níveis de sMICA, no grupo CTR, estão em \nconcordância com outros estudos que identificaram sMICA no soro mulheres saudáveis \n(Bargostavan et al., 2016; Arreygue-Garcia et al., 2008). Ademais, a presença de sMICA no FP \nde mulheres CTR com presença de doença benigna, mas, sem EDT, também foi relatada \n(González-Foruria et al., 2015). Como acima citado, nosso grupo de mulheres CTRs foi \nconstituído por mulheres saudáveis, provenientes de laqueadura tubária, e de mulheres com \ndoença benigna, mas sem diferença na expressão de sMICA (no soro e FP) entre esses dois \ngrupos, sendo considerado um grupo CTR adequado para o estudo. \n Outra importante questão analisada neste estudo foi a relação entre os níveis de \nsMICA e os tipos doença, su perficial, ovariana e doença profunda. A ausência de perfil \ndiferencial dos níveis de sMICA entre os diferentes sítios da doença, sugere que o ambiente \ninflamatório parece se manter semelhante quanto aos estímulos à expressão de MICA, nos \ndiferentes tipos de doença. Ou seja, nossos resultados nos levam a pensar que a expressão \nconstitutiva de MICA na superfície de células endometrióticas, independentemente do local de \nacometimento da doença, poderia funcionar como uma fonte contínua de MICA solúvel que, \nligando-se ao seu receptor NKG2D, favoreceria a sua internalização e subsequente \ndegradação lisosssomal. Porém, é relevante apontar que, quando comparamos os níveis de \nsMICA de mulheres com diferentes tipos/sítios de localização da doença, em relação ao grupo \nCTR, observamos níveis progressivamente maiores, de acordo com os tipos descritos como \nmais graves da doença (Koninckx et al., 1991; Tosti et al., 2015), a saber: ovariana, doença \nprofunda e doença profunda na presença de doe nça ovariana. Os maiores níveis de sMICA \nforam ainda identificados no microambiente inflamatório da lesão (fluido peritoneal) em \nmulheres com acometimento ovariano e profundo. Frente a esse resultado , podemos \n\n167 \n \ninterpretar que MICA pode estar envolvida na fisiopatologia da doença e associada a contextos \ninflamatórios progressivos, de acordo com o tipo/localização da doença \n É interessante apontar que, na doença SUP, considerada a mais leve (Cornillie et al., \n1990), não obser vamos níveis diferenciais de sMICA em relação aos CTRs, sugerindo um \nmenor potencial de comprometimento da atividade citotóxica de células NK, mediado, ao \nmenos em parte, pela interação sMICA -NKG2D. Implantes superficiais são considerados \nestádios iniciais da doença (Cornillie et al., 1990), corroborando nossos resultados de ausência \nde diferença dos níveis de sMICA (no soro e FP), entre EDT superficial e CTRs. Ressaltamos \nque, dos 13 casos de doença SUP, em nosso estudo, 1 1 (85%) estavam em estádio I. \nConsiderando esses desfechos, é possível interpretar que os níveis equivalentes de sMICA \nentre a doença SUP e CTRs levariam a um menor comprometimento na eliminação de células \nendometrióticas viáveis na cavidade peritoneal, vi a citotoxicidade de células NK e TCD8+. \nNossos resultados de maiores níveis de sMICA, especialmente nas doenças consideradas \nmais graves, reforçam a interpretação da participação de sMICA na fisiopatologia da EDT, e \napoiam os dados da literatura de maior c omprometimento da atividade de células NK nas \nformas mais graves da doença (Oosterlynck et al., 1992; Tanaka et al., 1992; Wilson et al., \n1994; Garzetti et al., 1995). \n Em concordância com nossos resultados, em outro estudo, também foram observados \nmaiores níveis de sMICA no FP de mulheres com EDT, em relação ao grupo CTR , sem a \ndoença (González-Foruria et al., 2015). Neste estudo também observaram que os maiores \nníveis de sMICA, no FP, estiveram associados à doença profunda, em relação ao grupo CTR . \nNo entanto, diferentemente dos nossos achados, neste estudo, não foi observada diferença \nem relação à doença OVA. Não obstante, foi concordante quanto aos níveis semelhantes de \nsMICA entre a doença SUP e CTRs. É importante salientar que, neste estudo, 40% das \nmulheres, tanto do grupo EDT e como do CTR, estavam em uso de hormônio, o que poderia, \npor si, gerar um estímulo à expressão de MICA (Basu et al., 2008). Além disso, para a análise \ndos dados, os autores (González-Foruria et al., 2015) excluíram os níveis de sMICA \nconsiderados indete ctáveis, gerando um viés aos resultados encontrados . Salientamos que \nnesse estudo não foram avaliados os níveis sistêmicos de sMICA (soro). Ademais, \ndiferentemente de nossos achados, em outro estudo (Guo et al., 2016) não se observou \ndiferença na expressão de sMICA no FP de mulheres com EDT profunda e ovariana, em \nrelação às mulheres com doença benigna, tampouco em relação aos estádios da doença. É \npossível, que neste estudo, os níveis de sMICA observados no grupo CTR, composto apenas \npor mulheres com doença benigna, não tenha sido possível discriminar uma possível diferença \nentre os estádios da doença. Salientamos que, apesar de nosso grupo de estudo para \navaliação de níveis de sMICA ter sido composto por mulheres sadias provenientes de \nlaqueadura tubária e também de mulheres com doença benigna, não houve diferença \nsignificante dos níveis de sMICA entre esses grupos, sendo, portanto, consideramos um grupo \ncontrole adequado para este estudo. \n\n168 \n \n A despeito das limitações para se avaliar a progressão da endometriose na história \nnatural da doença, frente aos nossos achados, consideramos ser válida a interpretação de que \na molécula MICA solúvel possa estar envolvida no processo de progressão/gravidade da EDT. \nConsideramos que os dados de MICA solúvel, apresentados em nosso estudo, fortalecem a \ninterpretação dessa molécula ter potencial de modular, negativamente, a atividade funcional de \ncélulas NK, possivelmente, promovendo a diminuição da expressão do receptor NKG2D. Esse \nmecanismo pode contribuir na ineficiência da eliminação de células endometriais do \nmicroambiente peritoneal, por m eio de células NK, facilitando o estabelecimento e \ndesenvolvimento da endometriose \n Para avaliar se havia uma deficiência quantitativa de células NK, ou de suas \nsubpopulações, contribuindo para a menor da atividade NK descrita na EDT (Oosterlynck et \nal., 1992; Tanaka et al., 1992), analisamos as porcentagens de tais células circ ulantes, na \ncondição ex vivo . Observamos diferença apenas para a subpopulação CD56 dimCD16+, com \nmenor frequência em mulheres com EDT. Considerando que esta subpopulação é descrita ter \nmaior capacidade citotóxica em relação às células CD56bright e, por expressar o receptor de Fc \n(FcγRIIIA - CD16), que pode também mediar citotoxicidade dependente de complemento \n(ADCC) (Cooper et al., 2001b; Vivier et al., 2008), interpretamos que sua menor frequência no \nsangue periférico possa também contribuir, ao menos em parte, para a deficiência de \ncitotoxicidade pelas células NKs, descrita na doença (Oosterlynck et al., 1992; Wilson et al., \n1994). Salientamos que a subpopulação CD56 dimCD16+ compreende, aproximadamente, 90 -\n95% do total de células NK circulantes, enquanto a subpopulação CD56brightCD16- NK, com \nmaior propriedade de produção de citocinas, compreende, aproximadamente, 5 –10% do total \nde células NK circulantes (Vivier et al., 2008). Vale destacar que, a deficiência quantitativa não \né global e sim de uma subpopulação de células NK. \n Além dos dados apresentados, ressaltamos que quando a frequência das \nsubpopulações foi estratificada por estádio, observamos uma menor frequência de células NK \ntotais e, mais u ma vez, das subpopulações CD56 dim e CD56 dim com expressão de CD16 \n(CD56dimCD16+) em estádios iniciais doença (I e II). Esses resultados sugerem que, além do \nenvolvimento na menor atividade funcional dessas células na EDT, a menor frequência dessas \ncélulas, com propriedade citotóxica, pode ter envolvimento na progressão da doença. Uma \nmenor frequência em estádios menos graves, poderia somar na disfunção de células NK, \ndificultando a eliminação de células endometriais ectópicas e facilitando sua implantação e \nestabelecimento da doença. No entanto, surge a pergunta sobre por que não observamos tal \ndiferença também em estádios avançados? \n É possível que, com a progressão da doença e maior declínio da capacidade efetora de \ncélulas NK, como relatado, mesmo sem haver deficiência quantitativa das células NK na EDT \navançada, a sua alteração funcional, aliada a outras disfunções imunológicas, componham um \ncenário desfavorável ao controle do processo inflamatório. \n\n169 \n \n Quando comparamos com a literatura, encontramos dados discordantes sobre a \nfrequência de células NK no sangue periférico. Foram observadas tanto porcentagens maiores \nde células NK (fenótipo CD3 -CD56+CD16+) no sangue periférico de mulheres com EDT \nprofunda de retossigmóide e em estádios avançados (II/IV), em relação a estádios iniciais e ao \ngrupo CTRs, sem EDT (Dias et al., 2012), como também ausência de diferença quantitativa \n(Ho et al., 1995; Matsuoka et al., 2005) dessas células, na comparação com C TRs, sem a \ndoença. Também para a frequência de células NK, no fluido peritoneal, não há uma \nhomogeneidade de resultados, havendo relatos de maiores porcentagens em estádios iniciais \nda EDT (Hill et al., 1988) e também ausência d e diferença (Ho et al., 1995), em relação ao \ngrupo CTR, sem a doença. No entanto, a variação quantitativa de células observada entre \nesses estudos, pode, possivelmente, ser devida a diferenças técnicas na caracterização \ndessas células, bem como diferentes grupos de estudo. \n Na análise da expressão do receptor de ativação, NKG2D, observamos um perfil \ndiferencial de maior expressão na EDT, que também f oi associado a estádios iniciais da \ndoença (I/II, gravidade mínima e leve), na subpopulação CD56 brightCD16+, em relação às \nmulheres CTRs saudáveis. A maior expressão de NKG2D em estádios iniciais, pode ser \ninterpretada como um possível mecanismo que envolv a uma maior ativação de células NK e \nsua maior mobilização, especialmente no início da doença, possivelmente devida a uma \nresposta imune mais competente dessas mulheres, por células NK, ao menos, via esse \nreceptor. Em acordo com esta hipótese, sugere -se que mulheres com EDT inicial podem ser \nimunologicamente mais ativas do que as que estão em estádios mais avançados da doença \n(Odukoya et al., 1996). \n Considerando nossos dados, a maior expressão de NKG2D, somada à maior \nfrequência de alta expressão de MICA no en dométrio eutópico de mulheres com EDT, sugere \num contexto que favorece a ativação continuada das células NK. A maior ativação de células \nNK, e mesmo de células TCD8+, que também expressam NKG2D (Pardoll, 2001), pode \nfavorecer a resposta imune inata e adaptativa, via a produção de citocinas inflamatórias e \nquimiocinas, que medeiam a migração de macrófagos, apresentação antigênica por DCs e \nativação de células T, contribuin do para a amplificação do processo inflamatório da doença, \nmesmo que sem capacidade resolutiva. Em concordância com esta interpretação, em um \nestudo com modelo experimental de carcinoma hepatocelular em camundongos deficientes \npara o receptor NKG2D, comparado com camundongos não deficientes (wild type), sugere que \na expressão desse receptor pode levar a uma alta produção de citocinas inflamatórias (IFN -γ, \nIL-6 e IL-12) e acúmulo de células NK, células T natural killer (NKT) e macrófagos (Sheppard \net al., 2018). \n Além disso, uma vez que a ligação MICA solúvel (sMICA) -NKG2D pode resultar na \nmodulação negativa (internalização) de NKG2D, avaliamos também a existência, ou não, de \ncorrelação entre os níveis de sMICA, in vivo , e a expressão de NKG2D em células NK. \nObservamos correlações negativas sistemicamente (soro) apenas nas mulheres com \n\n170 \n \nendometriose, tanto para frequência como para a intensidade de expressão (MFI) de NKG2D . \nEsta correlação negativa pode indicar que, mesmo com maior expressão desse receptor na \ndoença, a ativação celular pode não ser eficiente, frente aos maiores níveis de MICA na forma \nsolúvel, provavelmente, impact ando negativamente na sua menor expressão, no decorrer da \nevolução da doença. A variação quantitativa inversa dessas moléculas sugere que a presença \nde maiores níveis de MICA solúvel, apenas na EDT, pode regular negativamente este \nreceptor, via sua internalização. Este resultado pode compreender um mecanismo de evasão \nimune na doença, por células NK e também de TCD8+, via receptor NKG2D, contribuindo para \na dimi nuição da capacidade de eliminação de células endometriais ectópicas. Além disso, \nesses dados são concordantes com os dados da literatura mostrando diminuição da expressão \nde NKG2D associada ao aumento de MICA solúvel, no contexto tumoral (Groh et al., 2002; \nJinushi et al., 2008). Salientamos que não encontramos outros relatos na literatura sobre \nqualquer correlação entre a expressão de NKG2D e MICA na forma solúvel, na EDT. \n Uma questão central na hipótese testada em nosso estudo é como as diferentes \nmoléculas, relevantes na atividade das células NK, se relacionam com sua atividade citotóxica, \ne como MICA poderia participar da disfunção imunológica, na EDT. Nesse sentido, analisamos \na citotoxicidade pelas células NK, busc ando as diferentes potenciais relações com essas \nmoléculas. Esta análise foi realizada na condição de estímulo com as células K562 e na \npresença de células K56 2 bloqueadas para MICA (K562BLOQ) na superfície celular, com o \nobjetivo de mimetizar a presença de MICA solúvel, in vitro. Relembramos que as células K562 \nsão caracterizadas pela ausência, ou baixa expressão, de moléculas HLA classe I, torn ando-\nas susceptí veis à ação de receptores ativadores de NK (West et al., 1977). Além disso, as \ncélulas tumorais K562 expressam moléculas MICA (Epling-Burnette et al., 2007) que se ligam \nao receptor ativador NKG2D, funcionando como alvo de citotoxicidade por células NK. \n Nossos resultados indicaram que mulheres com EDT apresentam uma menor \ncitotoxicidade, especialmente em estádios avançados da doença, em relação às mulheres \nCTRs saudáveis. Esses achados confirmam os d ados da literatura indicando diminuição da \natividade citotóxica de células NK na EDT e, mais pronunciada, nas fases moderadas e graves \nda doença ( estádios avançados da doença, III e IV) (Oosterlynck et al., 1992; Wilson et al., \n1994; Garzetti et al., 1995). \n Ademais, com o objetivo de avaliar o potencial envolvimento de sMICA na \ncitotoxicidade de células NK, na EDT, analisa mos também a citotoxicidade por células NK \nfrente ao estímulo com bloqueio para MICA, nas células alvo. O bloqueio não alterou a \ncitotoxicidade previamente observada, na condição sem bloqueio, mantendo -se menor na \nEDT, na comparação com CTRs. No entanto, quando comparamos, tanto os estádios iniciais \ncomo avançados da EDT, nas condições antes e após o bloqueio de MICA (mimetiz ando a \npresença de MICA solúvel), observamos que o bloqueio diminuiu ainda mais a citotoxicidade, \napenas nos estádios iniciais da doen ça. Além disso, também na condição com bloqueio, \napenas mulheres em estádios iniciais tiveram diminuição adicional da citotoxicidade na \n\n171 \n \ncomparação com o grupo CTR. Salientamos que essa diferença de menor citotoxicidade em \nestádios iniciais da EDT, não foi observada na presença de estímulo sem bloqueio. Frente a \nesses achados, podemos interpretar que mulheres em estádios iniciais da EDT (I/II), as quais \napresentam níveis de sMICA, in vivo, menores do que mulheres em estádios avançados da \ndoença (III/IV), apr esentam uma maior sensibilidade ao bloqueio, com impacto negativo na \ncitotoxicidade, ao menos na condição in vitro. Destacamos, como acima descrito, que a maior \nexpressão do receptor de ativação NKG2D em células NK, na EDT, esteve associada a seus \nestádios iniciais. É possível que os maiores níveis de MICA solúvel in vivo, tanto sistêmicos \ncomo no microambiente peritoneal, em mulheres em estádios avançados da EDT, identificados \nneste estudo, possam ter provocado uma saturação de ligações com NKG2D e, talvez , até \nlevado à exaustão das células NK, não permitindo, assim, a detecção de alterações da \ncitotoxicidade, pós bloqueio da proteína MICA, in vitro. Além disso, também p odemos levantar \ncomo hipótese que, in vivo, com a progressão da doença e a exposição crô nica e continuada \ndas células NK a níveis altos de MICA solúvel, na EDT, possa haver alteração da sensibilidade \nao bloqueio, in vitro, ou mesmo envolver outros distúrbios imunológicos. De fato, embora não \ntenhamos observado uma correlação inversa entre os níveis de sMICA (soro e FP) e \ncitotoxicidade por células NK, a menor citotoxicidade identificada em estádios avançados da \ndoença, em relação ao grupo CTR, apoia essa interpretação. \nAdemais, embora não tenhamos observado menor citotoxicidade nos estádios i niciais \nda doença, em relação às mulheres CTRs saudáveis, podemos considerar que as \nsubpopulações CD56dim e CD56dimCD16+, caracterizadas por uma maior atividade citotóxica \n(Cooper et al., 2001a) em relação às células CD56bright+, e observadas em menor frequência \nem estádios iniciais da EDT, em re lação aos CTRs saudáveis, podem ter relevância no \ncontexto geral de menor atividade citolítica na doença, aqui observada e confirmada em outros \nestudos (Tanaka et al., 1992; Garzetti et al., 1995). \n De forma complementar à avaliação do potencial papel de sMICA na citotoxicidade por \ncélulas NK de mulheres com EDT, em experimentos in vitro, analisamos também se havia \ncorrelação entre a citotoxicidade e os níveis, in vivo, de sMICA. A ausência de uma correlação, \npositiva ou negativa, entre citotoxicidade e níveis de sMICA, tanto sistemicamente como no \nmicroambiente peritoneal da lesão (grupo EDT), e também no microambiente peritoneal \nfisiológico (grupo CTR), corroboram nossos achados de pouco, ou nenhum impacto de sMICA \nna citotoxicidade de células NK, tanto na EDT, e até mesmo na saúde. \n Na ausência de estudos funcionais com esse enfoque de análise, na EDT, podemos \ndestacar que, em diversos tipos de cânceres (Klöß et al., 2015; Luo et al., 2020), há relatos de \ncitotoxicidade por células NK comprometi da, na presença de sMICA, e mediada pela ligação \nsMICA-receptor NKG2D e posterior internalização desse receptor (Groh et al., 2002). No \nentanto, salientamos que não encontramos correlação entre a citoto xicidade e a expressão do \nreceptor de ativação NKG2D em células NK, sugerindo que, mesmo com a maior expressão \n\n172 \n \nde NKG2D e menor citotoxicidade, na EDT, a frequência desse receptor parece não impactar \nno balanço final da citotoxicidade de células NK. \n Com o objetivo de explorar diferentes vias moleculares da atividade efetora de células \nNK, avaliamos as expressões das moléculas CD 107a, IFN -y e também da citocina \nimunorreguladora, IL -10, em células NK totais e suas subpopulações, frente aos mesmos \ndesafios de estímulos utilizados no estudo de atividade citotóxica (K562 e K562BLOQ). Além \nda condição com estímulo, a expressão dessas moléculas foi também avaliada na condição \nsem estímulo, que corresponde à condição basal, provavelmente refletindo o que ocorre in \nvivo, seja no contexto fisiológico (CTR), seja na EDT. A expressão das moléculas CD107 a e \nIFN-γ nos traz, de maneira complementar à citotoxicidade, informação sobre a capacidade de \ndegranulação e ativação de células NK, respetivamente, e, a citocina reguladora, IL -10, sobre \no potencial papel de células NKreg na imunorregulação da EDT. \n Primeiramente, a análise na condição basal, na ausência de estímulo, mostrou que a \nexpressão de CD107a por células NK, e em suas subpopulações, não teve diferença entre os \ngrupos EDT e CTR. Estes dados indicam que a expressão da molécula CD107a não impacta \nem diferença no potencial na degranulação de células NK, na condição basal, na doença, em \nrelação à condição fisiológica. Esse dado pode ser interpretado como a existência de algum \ngrau de deficiência no processo de degranulação, na EDT, uma vez que na doenç a há um \nprocesso inflamatório em curso, de forma que esperávamos um grau de ativação maior e, no \nentanto, o nível de degranulação está semelhante ao encontrado na condição fisiológica. \nPorém, em um estudo observou -se menor expressão da proteína CD107a em t ecido \nendometrial ectópico de mulheres com EDT, em relação ao tecido endometrial eutópico de \nmulheres CTRs, sem a doença (Lubis et al., 2018). A diferença encontrada entre o nosso \nestudo (análise por citometria de fluxo), e o estudo da literatura citado (análise por \nimunohistoquímica), pode estar relacionada às diferentes abordagens empregadas - \nexpressão sistêmica e local, respectivamente - para avaliação da molécula envolvida na \ndegranulação, CD107a. \n Ainda em relação à condição basal, sem estímulo, observamos maior expressão de \nIFN-γ e de IL -10, em células NK de mulheres com EDT, do que no grupo CTR saudável. A \nmaior expressão de IFN -γ, nessa condição, indica a existência de ativação, em curso, de \ncélulas NK, corrobor ando a existência de uma condição inflamatória basal, na ED T. No \ncontexto desse processo imunopatológico, a maior expressão de IFN -γ, na doença, pode \ntambém indicar a presença de uma regulação positiva, benéfica, ao processamento e \napresentação de antígenos endometriais ectópicos por DCs e também recrutamento e \nativação de macrófagos. Macrófagos ativados são capazes de produzir mais citocinas \ninflamatórias, como TNF -α, IL-1, IL-6, IL-8, e IL -12 (Gmyrek et al., 2008) que podem recrutar \nainda mais macrófagos, e também células T, para o microambiente peritoneal. \n No entanto, apesar do intenso estímulo inflamatório, é relatado que esses macrófagos \napresentam uma reduzida capacidade de fagocitose, na doença (Chuang et al ., 2009; \n\n173 \n \nDmowski et al. , 1990), com deficiência na eliminação de células endometriais ectópicas, \nfavorecendo a manutenção de um ambiente inflamatório basal descontrolado. Ainda no \ncontexto inflamatório, desencadeado pela maior expressão de IFN-γ pelas células NK, também \né relatado que, na EDT, os macrófagos do microambiente peritoneal expressam níveis maiores \nde ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e de prostaglandinas derivada de COX-2 (PGE2), em relação às \nmulheres saudáveis (Wu et al., 2002). COX2/PGE2 favorecem a implantação e crescimento de \ncélulas endometriais ectópicas, bem como contribuem para a angiogênese (Banu et al., 2008) \ne sintomas clín icos, como de dor e infertilidade na doença (Burney e Giudice, 2012). \nDesatacamos que tal condição inflamatória envolve não apenas o microambiente peritoneal da \nlesão, mas também, como mencionamos, o endométrio eutópico dessas mulheres com \ndiversas disfunções, como a resistência à progesterona, expressão de aromatas e, maiores \nníveis de IL-6 (revisado em Burney e Giudice, 2012). \n Ainda na condição basal, sem estímulo, numa análise mais refinada, observamos uma \nmaior frequência de células com expressão de IFN -γ nos estádios avançados, em relação aos \nestádios iniciais da doença, e também uma maior expressão de IFN -γ em ambos os es tádios, \nem relação ao grupo CTR. Esses achados reforçam nossa interpretação de uma maior \ncondição inflamatória na doença, mais pronunciada, em seus estádios avançados. Embora \npossamos considerar a ocorrência de ativação de células NK, evidenciada pela maio r \nexpressão de IFN-γ, em relação aos CTRs, devemos destacar a menor capacidade citotóxica \nobservada nessas mulheres, também em nosso estudo. Essas informações se complementam \ne indicam que, a despeito da ativação de células NK, no balanço geral, ocorre um prejuízo na \ncapacidade de eliminação de células endometriais ectópicas. \n Em relação à citocina imunorreguladora, IL -10, sua maior expressão em células NK de \nmulheres com EDT, em relação ao grupo CTR, na condição basal, sem estímulo, ocorreu \nindependentemente do estádio da doença. Além disso, destacamos que a maior frequência de \nexpressão de IL -10, tanto na EDT como em CTR, ocorreu na subpopulação CD56 bright, que \ninclui as células NKs com propriedade imunorreguladora (Zhang et al., 2006a). No entanto, na \ncomparação entre os grupos, EDT e CTR, a maior expressão de IL -10 foi observada em \ncélulas CD56 dim, na EDT. Talvez, a maior expressão de IL -10, na doença, justamente na \nsubpopulação de células NKs com maior propriedade citotóxica, em relação à subpopulação \nCD56bright, possa também contribuir para a deficiência da atividade efetora das células NK. O \nprocesso patológico, na EDT, poderia promover um maior estímulo à produção dess a citocina \nreguladora. Ainda que a expressão de IL -10, por células NK, tenha sido considerada muito \nbaixa, podemos interpretar que as células NK produtoras dessa citocina possam estar \nimplicadas, em algum grau, na regulação negativa da condição inflamatóri a basal da doença. \nNesse contexto, e na qualidade de citocina imunorreguladora, a IL -10, na EDT, pode modular, \nnegativamente, a apresentação antigênica de peptí deos antigênicos oriundos de células \nendometriais ectópicas, por células DCs, a ativação de célu las T, bem como a migração de \nmacrófagos, para o microambiente peritoneal da lesão. Essas interpretações, em conjunto, \n\n174 \n \ncontribuiriam para o menor clearence de tecido endometrial ectópico , por células NK, na \ndoença. \n Quando comparamos esses dados com os da literatura envolvendo IL -10, na EDT, \nalguns estudos indicam ausência de diferença em níveis de IL10 solúvel, tanto no soro como \nno FP (D’Hooghe et al., 2001; Jiang et al., 2019) de mulheres com EDT, na comparação com \nCTRs. No entanto, concordantes com a maior expressão de IL-10 por células NK, na condição \nbasal, neste nosso estudo, outros estudos observaram maiores níveis de IL -10 no soro de \nmulheres com EDT, na comparação com mulheres CTR saudáveis e/ou CTR com outras \ndoenças ginecológicas (Suen et al., 2014; Nea et al., 2020), bem como no FP de mulheres \ncom EDT (Podgaec et al., 2007; Jaeger-Lansky et al., 2018). No entanto, destacamos que , \nnesses estudos , a análise foi de I L-10 solúvel e não nas células NK. Ademais, em alguns \nestudos em EDT, relata -se que a secreção de IL -10 estimula a proliferação e invasão de \ncélulas endometriais es tromais in vitro, bem como o crescimento de lesões ectópicas in vivo \n(Liu et al., 2017). Também foi observado que IL -10 coopera com a citocina IL -17A, \npromovendo o crescimento, adesão, invasão e implantação de células endometriais estromais \nectópicas, e reduzindo a apoptose in vitro e in vivo (Chang et al., 2017). Esses dados apoiam \nnossos resultados e a interpretação do envolvimento da IL -10 no estabelecimento e evolução \nda doença, contribuindo para um perfil regulador das células NK, também associado a um \nperfil inflamatório, devido, à maior expressão da citocina inflamatória, IFN -γ, na mesma \ncondição de análise. \n Na busca de uma conexão entre a expressão de IL -10 e moléculas MICA, ainda que \nnão seja um estudo em EDT, vale mencionar que, na presença de IL -10, células tumorais de \nmelanoma apresentaram uma diminuição da expressão de MICA (mRNA e na superfície \ncelular) (Serrano et al., 2011), sugerindo mais um mecanismo de regulação negativa da \nativação de células NK, via NKG2D, favorecendo o escape da vigilância imunológica. \n Ainda na condição basal, sem estímulo in vitro, também observamos uma correlação \npositiva entre as citocinas IL -10 e IFN -γ, apenas na EDT. Considerando o que a condição \nbasal, na doença, provavelmente, reflete o processo fisiopatológico em curso, in vivo, embora \nIL-10 possa regular negativamente a expressão de IFN -γ, podemos interpretar que a variação \nconjunta dessas moléculas, que têm atividades funcionais antagônicas, compreende algum \ngrau de controle do processo inflamatório da doença. \n Após a análise da expressão das moléculas CD107, IFN -γ e IL -10 por células NKs na \ncondição basal de cul tura, sem estímulo, discutiremos agora nossos resultados da expressão \ndessas moléculas por células NK, frente às células K562. \n Para interpretar os resultados dos ensaios realizados in vitro, estimulando as células \nNK das mulheres com EDT, comparativamente às saudáveis, precisamos apontar algumas \nquestões para facilitar as interpretações. Primeiramente, as mulheres com EDT têm diferenças \nquantitativas em relação às populações de células NK, com menor frequência da \nsubpopulação CD56dimCD16+, apresentadas em nosso trabalho. Além disso, essas mulheres \n\n175 \n \ntambém têm uma condição basal diferencial, provavelmente, refletindo a condição inflamatória \nin vivo. Seu organismo está submetido a estímulos inflamatórios de forma crônica, devido ao \nprocesso patológico em curso há algum tempo, enquanto as mulheres CTRs saudáveis, não. \nDesta forma, quando analisamos os resultados dos diferentes parâmetros imunológicos \nrelacionados às células NK, na condição basal, sem estímulo, in vitro, essas questões dever \nser consideradas. Por outro lado, quando analisamos os resultados dos diferentes parâmetros \nde células NK frente a um estímulo in vitro – no caso com células K562 - estamos adicionando \numa sobrecarga de dem anda funcional às células NK, vis ando verificar a sua capacidade de \nresposta frente a mais desafios. No contexto da EDT, poderíamos ponderar sobre se as \ncélulas NKs, que já estão sob constante estímulo in vivo , pelo processo fisiopatológico em \ncurso, teriam ainda mais capacidade funcional efetora, para responder a novas dem andas. \nAmbos os grupos responderam ao estímulo, com aumento da expressão das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10, exceto para IL -10, no grupo EDT, onde houve diminuição da \nexpressão, mas observamos algumas diferenças importantes. Em relação à molécula CD107a, \nobservamos que todas as subpopulações de células NK tiveram aumento de sua expressão , \nem ambos os grupos de estudo (exceto na subpopulação CD56 brightCD16+). Esse aumento de \nCD107a pós estímulo, em relação ao estado basal, sem estímulo, teve uma correlação positiva \ncom a atividade citotóxica, tanto na EDT como no grupo CTR, indicando haver preservação da \nação sincrônica nessa via de ativação de células NK em ambos os grupos. No entanto, na \ncomparação entre os grupos (EDT e CTR), encontramos uma menor expressão de CD107a, \nna EDT, nas mesmas subpopulações de células NK. Ademais, essa menor expressão de \nCD107a, frente ao desafio de estímulo, foi menor em mulheres com EDT em estádio avançado \nda doença (moderado e grave), tanto na comparação aos estádios iniciais (m ínimo e leve) da \nEDT como ao grupo CTR saudável. Considerando o envolvimento de CD107a na atividade \nefetora de células NK e seu potencial envolvimento na deficiência da citotoxicidade dessas \ncélulas, esses dados indicam haver deficiência na degranulação do s grânulos tóxicos, \ngranzima e perforina, por células NK de mulheres com EDT, especialmente em estádios \navançados, e com provável contribuição na deficiência na eliminação de células endometriais \nectópicas. Portanto, embora as células NK de mulheres com ED T tenham capacidade de \ndegranulação, frente a um estímulo adicional, ela ocorre em menor magnitude do que a \nencontrada em mulheres CTRs saudáveis. \n Assim como observamos para CD107a, todas as subpopulações de células NK (exceto \nCD56brightCD16+) tiveram aumento de expressão IFN-γ, frente ao estímulo, em ambos os \ngrupos de estudo, em relação à condição sem estímulo. No entanto, mais uma vez, na \ncomparação entre os grupos, houve uma menor de expressão de IFN-γ, na EDT, em relação \nao grupo CTR, nas mesmas sub populações de células NK. Ademais, essa menor expressão \nde IFN -γ frente ao desafio do estímulo ocorreu tanto em mulheres em estádios avançados \ncomo em estádios iniciais da EDT, em relação ao grupo CTR, saudável. Portanto, a menor \nexpressão de IFN -γ por cél ulas NK, independentemente dos estádios da doença, indica uma \n\n176 \n \nmenor ativação dessas células, com possível impacto negativo na resposta imune efetora no \nmicroambiente da lesão. \n Além disso, a menor expressão de IFN -γ, associada à menor expressão de CD107a, \nnessa mesma condição, indica haver uma resposta efetora deficiente de NK, frente ao \nestímulo, e destacando uma dupla deficiência da atividade de células NK na EDT: deficiência \nde atividade via IFN-γ e de degranulação. Também é interessante apontar que, ap esar da \nexpressão de IFN -γ em células NK ser mais alta, na condição basal, do que em mulheres \nsaudáveis, frente ao desafio com células K562, a resposta a resposta de IFN-γ das células NK, \nna EDT, não atinge a magnitude da resposta observada na saúde. Ademais, destacamos que \nno desafio do estímulo in vitro , tanto mulheres em estádios avançados como em estádios \niniciais tiveram menor expressão de IFN -γ, do que mulheres do grupo CTR, saudáveis. \nPortanto, a menor expressão de IFN -γ por células NK, independentem ente dos estádios da \ndoença, confere uma menor ativação dessas células e comprometimento da resposta imune \nefetora no microambiente da lesão. Destacamos que em um estudo semelhante ao nosso \n(Muharam et al., 2021) houve resultado discordante a este, com ausência de diferença de \nexpressão de CD107a e IFN -γ por células NK, frente às células K562, entre mulheres com \nEDT e mulheres CTRs saudáveis. No entanto, é possível que essa diferença de re sultados \npossa estar associada ao tamanho amostral analisado naquele estudo, considerado pouco \nrepresentativo (EDT, n=9; CTR, n=7). \n Somando-se a estes resultados e, diferentemente do grupo de mulheres CTRs \nsaudáveis, não encontramos correlação positiva e ntre a expressão de CD10 7a e IFN -γ, na \nEDT. Essa ausência de sincronia na cinética de expressão dessas moléculas envolvidas na \natividade efetora de células NK, e apenas na EDT, pode impactar no mecanismo de \ndegranulação e na ativação de células NK, acrescentando novo elemento dis funcional das \ncélulas NK na doença. Podemos também acrescentar que, considerando que as mulheres com \nEDT vivem um estímulo inflamatório continuado de células endometriais ectópicas no \nmicroambiente peritoneal, é possível que tenha ocorrido uma perda na capacidade de resposta \nsincronizada das células NK frente aos desafios, talvez por exaustão, ou por outros distúrbios \nda homeostase celular, ainda não conhecidos. Estes dados contrastam com a correlação \npositiva dessas moléculas, quando células NK de mulheres saudáveis são desafiadas com \nestímulo, indicando haver mobilização molecular de forma sincronizada, provavelmente, \nrelevante na ativação fisiológica de células NK. \n Ainda na condição de estímulo, analisamos a expressão na citocina reguladora IL -10. \nNo entanto, diferentemente da condição basal, frente ao desafio do estímulo, a expressão de \nIL-10 por células NK teve respostas opostas nos grupos EDT e CTR. O aumento de IL -10, \nobservado no grupo CTR, sugere que, mesmo frente à ativação de células NK, indicado pelo \naumento de IFN -γ e CD107a, nesta condição, a expressão da citocina reguladora também \naumenta, com provável relevância na manutenção de homeostase. Em contraste, na EDT, \nfrente ao desafio imune, ocorreu diminuição da expressão de IL -10 nas células NK, \n\n177 \n \ncorroborando a existência de desregulação das células NK, na EDT, também envolvendo a IL -\n10, e com possível contribuição para o descontrole da condição inflamatória. Embora essa \ndiminuição da expressão de IL -10 em células NK, pós estímulo, possa sugerir um a \nmanutenção de atividade efetora de células NK, na EDT, devido à ocorrência de aumento de \nIFN-γ e CD107a observado pós estímulo, devemos salientar que, no balanço comparativo final \nentre os grupos, a menor expressão de IL -10, IFN-γ e CD107a na doença, frente ao desafio \nimune, indica um prejuízo na atividade efetora e re guladora de células NK. Destacamos que \nessa menor expressão de IL -10, frente ao estímulo com células K562, foi mais acentuada nos \nestádios iniciais da doença, em comparação com CTRs saudáveis. Esse achado pode indicar \na existência de mecanismos imunológico s reguladores diferenciais no início da doença, onde \nocorre maior expressão do receptor NKG2D e menor comprometimento da atividade citotóxica \nde células NK. \n Nossos achados de expressão de IL-10, IFN -γ e CD107a sustentam a hipótese de \nocorrência de algum grau de excesso de atividade imunorreguladora nas células NK, na EDT, \npromovendo um contexto, simultaneamente, com inflamação descontrolada e \nimunossupressão. Em seguida, analisamos se há re lação entre a variação da expressão da \ncitocina IL -10, em relação à expressão das moléculas envolvidas na atividade efetora \ninflamatória de células NK, IFN -γ e CD107a. Frente ao desafio do estímulo, assim como \nobservado na condição basal, sem estímulo, obs ervamos uma correlação positiva entre \nexpressão da citocina IL -10 e IFN -γ, apenas em mulheres com EDT, sustent ando a nossa \ninterpretação de que, in vivo , esteja ocorrendo algum grau de regulação ao estímulo \ncontinuado da inflamação crônica na doença. \n Reforçando a hipótese do potencial impacto de sMICA na deficiência da atividade de \ncélulas NK na EDT, avaliamos se há correlação entre a expressão das moléculas CD107a, \nIFN-γ e IL -10 por células NK, e suas subpopulações, e os níveis in vivo de sMICA (soro e \nfluido peritoneal), frente ao desafio do estímulo. Embora ambos os grupos (EDT e CTR) \ntenham apresentado aumento de expressão de CD107a pós estímulo com células K562 e que, \nno balanço final entre os grupos, houve menor expressão de CD107a, na EDT, não \nobservamos correlação entre a expressão de CD107a e níveis de sMICA em ambos os \ngrupos, no soro e FP. Salientamos que, nesta análise, buscamos avaliar se a exposição prévia \na níveis diferenciais de sMICA, in vivo , tem impacto na capacidade das células NK \nresponderem a um estímulo, in vitro . Neste caso, devemos ponderar que as células NK \nhabitaram (in vivo) um ambiente biológico com diferentes níveis de sMICA (EDT e saúde), e \npoderiam impactar em respostas funcionais distintas, dependo do contexto biológico de \nmaiores ou menores níveis de sMICA. \n Desta forma, a ausência de correlação entre CD107a e sMICA, observada na EDT, \ntanto sistemicamente como no ambiente da lesão, sugere que, mesmo com os maiores níveis \nde sMICA observados no contexto biológico da doença, n ão há impacto significativo na \nresposta de degranulação. No entanto, relembramos que a despeito da capacidade de \n\n178 \n \nresponder ao estímulo, com aumento de expressão de CD107a, na EDT, a sua expressão final \nainda foi significativamente menor do que na saúde (CT Rs). Quando analisamos a correlação \nentre a expressão de IFN -γ por células NK e os níveis, in vivo, de sMICA, observamos que \nambos os grupos de estudo tiveram correlação negativa. Este dado sugere que maiores níveis \nde sMICA induzam menor capacidade de ativação das c élulas NK, via IFN-γ, ou vice e versa, \ntanto na saúde e como na doença. Como essa correlação foi encontrada também na condição \nde saúde (CTR), podemos interpretar que, in vivo , sMICA tenha papel na regulação da \nativação da produção de IFN -γ nas células NK. Ademais, como os níveis de sMICA são \nsignificativamente maiores na EDT, é provável que esse seja um mecanismo de regulação \nnegativa de ativação de células NK, in vivo, provavelmente mais acentuado, na doença. \n Em relação à expressão de IL -10 por células N K e níveis de sMICA in vivo, na EDT, \nnão encontramos correlação entre essas moléculas. Este dado sugere que, na doença, a \nexpressão de IL-10 nas células NK não seja regulada pelos níveis de sMICA. Por outro lado, \nna saúde, observamos uma correlação negativ a entre a expressão de IL -10 nas células NK e \nníveis de sMICA sistêmicos, sugerindo que quando células NK são desafiadas com estímulo, \nsMICA regule negativamente, também, a expressão de IL-10 na saúde. \n Além da análise da expressão das moléculas CD107a, IFN-γ e IL-10 frente ao estímulo, \nforam realizadas análises de expressão dessas moléculas também frente ao estímulo com \ncélulas alvo bloqueadas para MICA, visando explorar o potencial efeito de sMICA na atividade \ndas células NK. No que diz respeito à validad e interna desses nossos experimentos, \nmimetizando o efeito de MICA solúvel, destacamos que o bloqueio da proteína MICA na \nsuperfície de células K562 não foi 100% e nem ocorreu de forma homogênea em todos os \nexperimentos. Mas, não houve variação no padrão de estímulo de células NK que pudesse ser \nexplicada por essa variável experimental, em relação à intensidade de bloqueio. \n De forma geral, os resultados com bloqueio não mostraram modificações expressivas \nna atividade dessas células, na comparação ao estímu lo sem bloqueio, independentemente \ndos estádios da doença. No entanto, devemos considerar que nossos experimentos \nmimetizam a ação sMICA, in vitro, e que não podemos descartar que, in vivo, sMICA possa, \nsim, ter um papel na atividade efetora de células NK. Ou seja, in vivo, MICA solúvel poderia \natuar em combinação com outros fatores que têm efeito deletério na atividade efetora das \ncélulas NK. Essa interpretação faz sentido, uma vez que os processos biológicos na saúde e \nna doença são, na sua gr ande maioria, complexos, e envolvem a ação coordenada, e mesmo \nsinérgica, e/ou antagônica, de diversas moléculas e tipos celulares. Nesse sentido, \ndestacamos que a molécula imunorreguladora HLA de classe I não clássica, HLA -G, também \nna sua forma solúvel, foi observad a em níveis maiores no soro de mulheres em estádios \navançados da doença (Rached et al., 2019), em relação a mulheres saudáveis, possivelmente \ncontribuindo para o comprometimento da atividade efetora de células NK, na EDT. Ademais, \noutras moléculas, podem somar a este contexto mais imunorregulador, que pode culminar em \nalgum grau de imunossupressão. A maior frequência do gene KIR2DL2, que codifica para o \n\n179 \n \nreceptor inibitório KIR2DL2, em células NK, em mulheres euro -descendentes com doença \nprofunda (Marin et al., 2021), bem como do gene KIR2DL1 (Matsuoka et al., 2005), também \napoiam o envolvimento de outras moléculas no contexto de menor ativação de células NK, na \nEDT. \n Não obstante, a diferença de menor expressão de CD107a, na EDT, na condição sem \nbloqueio, deixou de existir, pós bloqueio. Is so ocorreu pois, embora sem diferença \nestatisticamente significante, houve uma diminuição na expressão de CD107a por células NK \nno grupo CTR, tornando os grupos sem diferença de expressão de CD107a. Com base nesse \nachado, podemos interpretar que o grupo CT R saudável, que apresenta níveis fisiológicos de \nsMICA, e menores do que o grupo EDT, apresenta uma maior sensibilidade ao bloqueio no \nimpacto negativo na expressão de CD107a, ao menos na condição in vitro. Concordante com \nnossos achados de CD107a no grupo CTR, a presença de sMICA em sangue de cordão \numbilical humano sadio, também foi descrita como envolvida em menor expressão da CD107a \ne na atividade citotóxica de células NK contra células K562, sugerindo um mecanismo \nadicional de tolerância na gravidez (Cox et al., 2015). Podemos levantar como hipótese que, in \nvivo, a exposição continuada das células NK a níveis altos de MICA solú vel, na EDT, pode \nalterar a sensibilidade ao bloqueio, in vitro. \n Em relação às citocinas IFN -γ e IL -10, também não houve alteração nas suas \nexpressões por células NK, na presença de bloqueio. No entanto, a menor expressão de IFN -\nγ, observada na EDT, tanto na condição de estímulo quanto na condição de estímulo com \nbloqueio, é ainda mais relevante quando se considera a maior expressão dessa citocina, nas \ncélulas NK, na condição inflamatória basal, e também na condição ex -vivo, na EDT, na \ncomparação com mulheres saudáveis. Ademais, a manutenção da menor expressão de IFN-γ \ne IL -10, na EDT, com ambos os estímulos (com e sem bloqueio para MICA), sugere a \nmanutenção da menor ativação de células NK e da regulação negativa, por essas moléculas, \nrespectivamente. Esses dados podem indicar que MICA solúvel, representada pelo b loqueio \nde MICA, em nosso experimento, não tem papel expressivo na variação/sincronia na \nexpressão dessas moléculas. Destacamos que n ão encontramos outros relatos na literatura \nsobre a relação de sMICA e a citocina IL-10. \n Reforçando a potencial relação de sMICA na deficiência da atividade de células NK, na \nEDT, avaliamos se há correlação entre os níveis, in vivo, de sMICA (no soro e fluido \nperitoneal) e a expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL -10 por células NK, frente ao \nestímulo com células bloqueadas para MICA, in vitro. Consideramos que relacionar os níveis, \nin vivo, de sMICA com a expressão dessas moléculas, na condição de bloqueio, oferece maior \nsensibilidade para a avaliação do potencial efeito de MICA solúvel na atividade de células NK, \numa vez que permite considerar também o efeito do convívio, in vivo, das células NK com um \nambiente de maiores ou menores níveis de sMICA. \n Observamos uma correlação positiva no grupo CTR entre os n íveis de sMICA, in vivo, \nno peritônio (pg/mL) e a expressão de CD107a, por células NK, frente ao estímulo com \n\n180 \n \nbloqueio. É possível que, na condição de saúde em ambiente biológico com níveis fisiológicos \nmenores de sMICA, ocorra variação sincronizada, possi velmente, um mecanismo de mútua \nregulação entre essas duas moléculas (sMICA-CD107a). No entanto, isso não ocorreu de uma \nforma global, em todas as subpopulações NK. Detectamos a correlação positiva apenas na \nsubpopulação CD56 brightCD16+, descrita com maior capacidade de produção de citocinas, \nindicando haver sensibilidade diferencial de diferentes subpopulações de células NK, ao \npotencial efeito de MICA solúvel. No entanto, vale apontar que o nosso tamanho amostral é \nlimitado, por isso essas interpretações devem ser consideradas com cautela. De forma \nimportante e em contraste com a correlação positiva em saudáveis, na EDT, observamos uma \ncorrelação negativa entre MICA solúvel ( in vivo) e a expressão de CD107a na condição com \nbloqueio de MICA. Esse dado suger e que, na EDT, a presença de maiores níveis de MICA \nsolúvel poderia contribuir para uma menor degranulação e comprometimento na atividade \ncitotóxica de células NK, como observamos na condição de estímulo. \n Ademais, em relação à expressão de IL -10 e níveis de sMICA, in vivo , na EDT, na \ncondição de estímulo com células bloqueadas, foi observada uma correlação negativa, não \nexistente na condição sem bloqueio, mas previamente observada, apenas sem bloqueio, em \nCTRs. Podemos interpretar que, na doença, a presenç a do bloqueio, represent ando a oferta \nde mais MICA solúvel, associada à condição de células previamente já expostas a maiores \nníveis de MICA solúvel, in vivo, gerou uma sincronia inversa da IL-10 e sMICA, diferentemente \ndo observado na condição de estímulo . Uma vez que essa correlação negativa foi observada \nem ambos os grupos de estudo, mas modificada com o bloqueio, apenas no grupo EDT, \npodemos interpretar que os níveis , in vivo , mais elevados de sMICA, na doença, possam \nregular negativamente, de forma mai s efetiva, a expressão da citocina IL -10 na doença, \ncontribuindo para uma menor regulação da homeostase pelas células NK, e para a \nmanutenção do processo inflamatório envolvido na imunopatologia da EDT. \n De forma global, os experimentos com células K562 b loqueadas para MICA, \nmimetizando a presença de MICA solúvel, indicam que, ao menos in vitro, sMICA tem baixo \nimpacto na expressão das moléculas CD107a, IFN -γ e IL -10, por células NK, na EDT. As \nmodificações observadas na expressão dessas moléculas, em rela ção à condição de estímulo \nsem bloqueio ocorreram, de forma geral, no grupo CTR, onde as células NK estiveram em \nambientes biológicos com níveis menores de sMICA. É possível que que, in vivo, a exposição \ncontinuada das células NK, a níveis altos de MICA so lúvel, como ocorre na EDT, possa alterar \na sensibilidade dessas células frente ao bloqueio, in vitro. Destacamos que a correlação \nnegativa entre MICA solúvel ( in vivo) e a expressão de CD107a, na presença de bloqueio de \nMICA, na EDT, indica que MICA solúve l pode impactar, de forma relevante, em menor \ndegranulação por células NK na doença. Ademais, também a correlação negativa entre a \nexpressão de IL10 por células NK, na condição de bloqueio, e níveis de sMICA in vivo, sugere \nque os maiores níveis de sMICA, na EDT, impactam em menor expressão da citocina \nimunorreguladora IL-10, por células NK, contribuindo para a menor resposta imune reguladora \n\n181 \n \ndas células NK, na doença, e manutenção do processo inflamatório imunopatológico nela \nenvolvido. \n Avaliamos nossos r esultados, também, em relação às fases do ciclo menstrual, na \ndoença e, consequentemente, possíveis influências hormonais. No entanto, devemos \nconsiderar que há diferenças imunológicas e hormonais importantes, em relação aos \ndiferentes momentos de ambas as fases do ciclo menstrual, introduzindo vieses importantes \nem relação às interpretações biológicas. Assim, embora sendo um dos objetivos dos nosso \nestudo, devido a essas questões e à uma limitação de tamanho amostral, não consideramos \nconsistente usar os n ossos resultados para a elaboração de uma conclusão em relação às \nfases do ciclo menstrual. Não obstante, discutimos potenciais efeitos hormonais em relação \naos nossos resultados de MICA, MICA solúvel e atividade NK, considerando a fase \nproliferativa com p redomínio de estrogênio, e a fase secretora com predomínio de \nprogesterona. Porém, essa discussão deve ser considerada com reservas. \n Em relação aos níveis de sMICA, a ausência de diferença entre as fases proliferativa e \nsecretora do ciclo menstrual, na E DT (no soro e FP) sugere haver pouco impacto de ação \nhormonal na regulação dos níveis de sMICA, na doença. Nossos achados foram diferentes de \num estudo utilizando linhagem celular de câncer pulmonar, onde foi observado que estrogênio \nmodulou positivamente a ação de ADAM17, resultando em aumento de sMICA (Ren et al., \n2015). Na análise comparativa dos níveis de sMICA entre os grupos (EDT vs CTR), os maiores \nníveis de sMICA, no soro, apenas na fase proliferativa, pode ter relação com os maiores níveis \nde estrogênio presentes nesta fase do ciclo menstrual (revisado em Hafner et al., 2013). É \npossível que esse hormônio possa ter promovido um aumento de expressão de MICA e, \nposteriormente, ocorrido sua clivagem na forma de proteína solúvel. Algun s autores já \nmostraram que estrogênio aumentou a expressão de mRNA e da proteína MICA, na superfície \nde células de uma linhagem epitelial uterina e no endométrio uterino de mulheres com \ndoenças ginecológicas, mediada por receptor de estrogênio (Basu et al., 2008). Um possível \nmecanismo para esse aumento pode estar relacionado ao fato do promotor do gene MICA \n(posição-46, relativo ao sítio de início de tra nscrição) possuir uma sequência consensus do \nElemento de Resposta ao Estrogênio (ERE), em humanos (Basu et al., 2008). O receptor de \nestrogênio, uma vez ligado com alta afinidade à essa sequência, ativaria, também, a \nexpressão gênica de MICA, em resposta ao estrogênio (Klinge, 2001). Ademais, tanto o tecido \nendometrial eutópico, como o ectópico, das mulheres com EDT, expressam altos níveis de \naromatase (conversora de androgênio em estrogênio), ausente no endométrio de mulheres \nsaudáveis (Kitawaki et al., 2002; Bulun et al., 2001), e baixos níveis da enzima 17 beta-hidroxi-\nesteróide-desidrogenase-22 (conversora de estradiol em estrona, sua forma menos ativa) \n(Zeitoun et al., 1998). Também já foi observado que tanto a expressão de mRNA como níveis \nde MICA/B solúveis de linhagem de adenocarcinoma têm aumento na presença de estrogênio \n(Ren et al., 2015). Além disso, o estrogênio foi capaz de aumentar a expressão da \nmetaloproteinase ADAM17, que foi associada à secreção de MICA/B, e levou à diminuição do \n\n182 \n \nreceptor NKG2D na superfície de células NK92, comprometendo a a tividade citotóxica dessas \ncélulas (Ren et al., 2015), apoiando a hipótese de possível clivagem de MICA gerando a forma \nsolúvel. No entanto, não encontramos uma explicação adequada para a ausência de maiores \nníveis de sMICA também no ambiente peritoneal (FP), na mesma fase estrogênica do ciclo \n Procurando relacionar o contexto diferencial dos hormônios sexuais na atividade \nefetora de células NK, observamos que a menor atividade citotóxica na EDT, acima descrita, \nocorreu na fase proliferativa do ciclo, possivelmente, relacionada aos maiores níveis de \nestrogênio associados à doença (Bulun, 2009). Apoiando nossa interpretação, o aumento de \nníveis séricos de estrogênio é descrito ter correlação inversa com a atividade de células NK \n(Garzetti et al., 1995). Essa menor citotoxicidade por células NK, provavelmente, impacta \ndiretamente no aumento da sobrevivência e implantação de teci do endometrial ectópico. \nAdemais, esse resultado pode ter relação com os maiores níveis de MICA solúvel observados \nnessa mesma fase do ciclo, como observado neste estudo. \n Também analisamos a expressão das moléculas de atividade efetora NK, CD107a, \nIFN-γ e IL-10, nas condições sem estímulo e com os estímulos com e sem bloqueio para \nMICA, nas diferentes fases do ciclo. Essa análise teve como objetivo avaliar o potencial \nenvolvimento dos hormônios sexuais na expressão dessas moléculas, associado ao possível \nimpacto de MICA solúvel, representado pelo bloqueio de MICA, na atividade funcional de \ncélulas NK, na EDT. \n Identificamos que a maior expressão de IFN -γ, previamente observada na condição \nbasal, sem estímulo, esteve associada à fase proliferativa da doença, podendo estar \nassociada ao aumento de estrogênio nesta fase do ciclo, bem como com a condição \ninflamatória associada a esta fase do ciclo menstrual, especialmente na inicial e tardia. De \nfato, estrogênio regula o promotor gênico de IFN -γ (Fox et al., 1991) aumentando os níveis \ndessa citocina (Karpuzoglu-Sahin et al., 2001; Fox et al., 1991). Ademais, a fase proliferativa \n(após menstruação) de mulheres com EDT é caracterizada por números aumentados de várias \ncélulas do sistema imune, incluindo macrófagos, cé lulas NK uterinas e DCs imaturas \n(Matarese et al., 2003). O estímulo inflamatório continuado, devido à presença de células \nendometriais na cavidade uterina (Berbic e Fraser, 2013), pode estimular a expressão e/ou \nprodução da citocina inflamatória, IFN-γ, por essas células, contribuindo para a manutenção da \ncondição inflamatória basal da doença. \n Quando analisamos o envolvimento dos hormônios sexuais na expressão das \nmoléculas envolvidas na atividade efetora de células NK, agora na condição de estímu lo com \ncélulas K562, observamos uma resposta diferente da observada na condição basal. A despeito \ndos maiores níveis de estrogênio nesta fase do ciclo, no desafio do estímulo, mulheres com \nEDT tiveram menor expressão de IFN-γ, nas células NK, do que mulher es saudáveis. Este \nachado nos leva a interpretar que o estrogênio mantém a maior expressão dessa citocina na \nsaúde, com ativação celular adequada, o que é perdida na doença, na condição de estímulo, \nna EDT. A presença dos maiores níveis de estrogênio na fa se proliferativa do ciclo também \n\n183 \n \nparece ter papel na expressão da citocina imunorreguladora, IL -10, na EDT. Observamos, \napenas nesta fase do ciclo, que a expressão de IL-10, por células NK, foi menor na doença do \nque na saúde ( CTR). Este resultado sugere q ue estrogênio tenha um papel na regulação \nnegativa da expressão de IL-10 nas células NK, na EDT, contribuindo para a perda e/ou \ndiminuição da homeostase na doença, frente ao estímulo. Salientamos que o estrogênio é \ndescrito na literatura com efeitos difere ntes, aumentando ou mesmo diminuindo a expressão \nde IL -10, dependendo do tipo celular envolvido (Lang, 2004). As m odificações de menor \nexpressão de IFN -γ e IL -10, observadas na fase proliferativa, na presença de estímulo, em \nrelação à condição basal, na EDT, não foram alteradas na condição de bloqueio para MICA \nem células K562, sugerindo que sMICA tenha pouco impacto na expressão dessas citocinas, \nnesta mesma fase do ciclo. \n Na fase secretora, quando os níveis de progesterona estão aumentados, não houve \ndiferença na expressão das moléculas envolvidas na ativação de células NK, entre os grupos \nde estudo, na condição basal, sem estímulo. No entanto, frente ao estímulo, observamos uma \nmenor expressão de CD107a, na EDT, na comparação com CTRs saudáveis, nessa fase do \nciclo. Esse dado sugere um impacto negativo da progesterona na degranulação de células NK \nna doença. A menor expressão de CD107a, na fase secretora, do grupo EDT, pode estar \nassociada à resistência à progesterona já descrita nessas mulheres (Bulun et al., 2006). \nLesões endometrióticas apresentam, de forma geral, redução na e xpressão de receptores de \nprogesterona, e ausência do receptor -β, quando comparada à expressão do endométrio \neutópico (Attia et al., 2000). De forma indireta, mas concordante com nossos achados, \nlinfócitos da decídua uterina apresentam menor porcentagem de células com expressão de \nperforina, na presença de progesterona, a qual é liberada de vesículas lisossomais, com \nexposição da molécula CD107a (Laškarin et al., 2002), indicando efeito negativo da \nprogesterona na citotoxicidade. A menor expressão de CD107a, na EDT, na fase secretora do \nciclo foi mantida na condição de bloqueio para MICA, sugerindo que sMICA tenha pouco \nimpacto na expressão dessa molécula, e, possivelmente, na degranulação por células NK, \nnesta fase do ciclo. \n Dentro de uma perspectiva de tradução clíni ca dos nossos resultados, destacamos \nque, atualmente, diversas estratégias terapêuticas têm sido desenvolvidas com o objetivo de \nmodular a resposta citotóxica de células NK, especialmente contra tumores. (Spear et al., \n2013; Schmiedel e Meelboim, 2018; Ferrari de Andrade et al., 2018). Tomando como base tais \nestudos, e traduzindo para o contexto da EDT, uma das possíveis estratégias, seria a \nreparação e/ou indução de ligantes para o rece ptor de ativação NKG2D, especialmente MICA, \nfavorecendo a ativação, tanto de células NK como TCD8 citotóxicas e, dificult ando, ao menos \nem parte, a evasão imune na eliminação de células endometriais fora do útero. Além disso, \nainda na perspectiva terapêuti ca, o bloqueio da liberação de MICA na forma solúvel, ou \nprevenção dela, por meio de anticorpos ( Ferrari de Andrade et al., 2018) e/ou inibidores de \nMMPs (Shiraishi et al., 2016) e ADAMs (Otoyama et al., 2021), poderia contribuir para inibir, ou \n\n184 \n \nmesmo restaurar, a expressão de NKG2D, em caso de sua internalização após ligação com \nsMICA. Consideramos que uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e \nmoleculares envolvidos no contexto da deficiência de células NK, e também de células TCD8+, \nbem como daqueles que regulam a expressão tanto de ligantes como do próprio receptor \nNKG2D, na endometriose, deve contribuir para estudos de maneira a potencializar a resposta \nimune na doença. \n Em resumo, consideramos que a principal contribuição do nosso trabalho é destacar o \npapel da molécula MICA na fisiopatologia da endometriose, exercendo, atividades pró -\ninflamatória e imunorreguladora. Os achados d e maior frequência de alta expressão da \nproteína MICA no endométrio eutópico de mulheres com endometriose, associados aos altos \nníveis de MICA na forma solúvel, especialmente na doença avançada e em sítios de maior \ngravidade, nos permitem concluir que MICA tem um papel relevante na fisiopatologia da \ndoença, bem como possível envolvimento na sua progressão e gravidade. A deficiência da \natividade citotóxica somada a alterações da expressão de moléculas envolvidas na atividade \nefetora - CD107a e IFN-γ - e imunorreguladora - IL-10- de células NK, sugere a existência de \ndisfunções, tanto na capacidade efetora como imunorreguladora dessas células. Em \nconclusão, nosso trabalho contribui para a melhor compreensão da disfunção imunológica na \nendometriose, coloc ando a molécula MICA com potencial envolvimento na disfunção das \ncélulas NK, integrando a fisiopatologia da doença. \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n________________________________________________CONCLUSÕES \n \n \n \n\n186 \n \n6. CONCLUSÕES \n \n1. A maior frequência de alta expressão proteica de MICA no endométrio eutópico, \nna endometriose, indica a ocorrência de alterações imunológicas precoces, envolvendo MICA, \nnas células endometriais, antes mesmo da sua migração e instalação ectópica. \n \n2. Os maiores níveis de MICA solúvel, tanto sistêmi cos como no microambiente \nperitoneal da lesão, na endometriose, sugerem sua participação na fisiopatologia da doença, \nassim como a prévia ocorrência de alta expressão de MICA de membrana, provavelmente, \ngerando também repercussão sistêmica. \n \n3. A maior expre ssão do receptor NKG2D nas células NK, apenas nos estádios \niniciais da endometriose, sugere a ocorrência, in vivo , de maior estímulo de ativação das \ncélulas NK, em fases mais precoces da doença, quando ainda há menor prejuízo da atividade \ncitotóxica. \n \n4. A correlação negativa entre a expressão de NKG2D e níveis de MICA solúvel, \nna endometriose, sugere que os altos níveis de MICA solúvel podem inibir a expressão de \nNKG2D e, consequentemente, a função efetora das células NK. \n \n5. A maior expressão da citocina inflamatória, IFN-γ, e da imunorreguladora, IL-10, \nnas células NK, na endometriose , apenas na condição basal, indica a ocorrência de ativação, \nin vivo , de células NK com perfis INFLAMA e REGULA. A correlação positiva entre a \nexpressão de IL-10 e IFN-γ, que têm atividades funcionais opostas, apenas na endometriose , \nsugere desregulação da atividade das células NK, com prejuízo da sua atividade citotóxica. \n \n6. A menor expressão de CD107a, IFN-γ e IL-10, em células NK, na \nendometriose, quando desafiadas com o estímulo, indica a existência de disfunção das células \nNK, na sua capacidade de resposta efetora, envolvendo a degranulação, a produção de IFN-γ, \ne também a resposta imunorreguladora, com produção de IL10. \n \n7. Observamos menor expressão de CD107a, nas células NK e stimuladas, aliada \nà sua menor capacidade citotóxica e os maiores níveis de MICA solúvel, tanto sistêmicos \ncomo no microambiente peritoneal, principalmente na endometriose avançada e em sítios de \nmaior gravidade da doença. Esses dados sugerem que com a mai or gravidade e progressão \nda doença ocorre maior comprometimento da atividade efetora das células NK, inclusive com \ndeficiência de degranulação e participação de MICA solúvel. \n \n\n187 \n \n8. A menor citotoxicidade induzida pelo bloqueio de MICA em células alvo, apenas \nem estádios iniciais da endometriose, juntamente com a ocorrência de correlação negativa \nentre os níveis de MICA solúvel e a expressão de NKG2D nas células NK, sugerem que os \naltos níveis de MICA solúvel podem inibir a expressão de NKG2D e, consequentement e, a \nfunção efetora das células NK, principalmente nos estádios iniciais da doença, quando \ndetectamos maior expressão de NKG2D nas células NK. \n \n9. A condição de bloqueio para MICA, in vitro, não alterou a expressão das \nmoléculas CD107a, IFN -γ e IL -10, nas células NK, nem na endometriose nem na condição \nsaudável, sugerindo que MICA, na sua forma solúvel, tenha pouco ou nenhum impacto na \nexpressão dessas moléculas, nas células NK, ao menos in vitro. \n \n10. A correlação negativa entre níveis de MICA solúvel ( in vivo) e a expressão de \nCD107a, nas células NK, apenas na endometriose, e apenas na condição experimental com \nbloqueio de MICA, sugere que, in vivo, MICA solúvel, talvez em ação sinérgica com ou tras \nmoléculas, desempenhe um papel na inibição da degranulação das células NK. \n \n11. A menor frequência de células NK com o fenótipo CD56 dimCD16+, na \nendometriose, sugere que a deficiência quantitativa de células NK com o fenótipo de maior \natividade citotóxica, também compõe o conjunto de distúrbios imunológicos na doença. \n \n12. Em conjunto, nossos resultados apoiam a hipótese de que MICA tem \nparticipação relevante na imunopatologia da endometriose, podendo exercer papeis, pró -\ninflamatório e imunorregulador. MICA p ode contribuir para geração/manutenção de um estado \nbiológico misto, de inflamação descontrolada e imunossupressão, ineficaz na eliminação \nadequada de tecidos endometriais ectópicos e no reestabelecimento da homeostase. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n_________________________ANEXOS \n \n \n \n\n189 \n \n7. ANEXOS \n \nANEXO I - Termos de Consentimento Livre e Esclarecido-TCLE \n \nA) Termo de Consentimento aplicado a pacientes com endometriose. \n \n \n \n \n \n \n\n190 \n \nContinuação – Termo de Consentimento aplicado a pacientes com endometriose. \n \n \n \n \n\n191 \n \n \nContinuação - Termo de Consentimento aplicado a pacientes com endometriose. \n \n \n \n\n192 \n \nContinuação - Termo de Consentimento aplicado às mulheres com endometriose. \n \n \n \n\n193 \n \nB) Termo de Consentimento aplicado a mulheres do grupo controle \n \n \n \n \n \n \n\n194 \n \n \nContinuação - Termo de Consentimento aplicado a pacientes controles \n \n \n \n \n\n195 \n \nContinuação - Termo de Consentimento aplicado a pacientes controles \n \n \n \n \n \n\n196 \n \nContinuação - Termo de Consentimento aplicado a pacientes controles \n \n \n \n\n197 \n \nANEXO II: Aprovações do Comitê de Ética referentes ao presente estudo. \n \nA) “Banco de Tecidos e Fluidos Corporais de pacientes com endometriose” \n \n \n \n \n \n\n198 \n \nB) Projeto Temático “Endometriose: Bases moleculares da Resposta \nImunológica”. \n \n \n \n \n \n \n \n\n199 \n \nC) Emenda ao Projeto Temático para o presente projeto de Doutorado. \n \n \n \n \n \n\n200 \n \nANEXO III - Relatório Cirúrgico. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n201 \n \nContinuação- Relatório Cirúrgico. \n \n \n \n \n \n \n\n202 \n \nANEXO IV- Formulário de estadiamento da ASRM. \n \n \n \n \n\n203 \n \nANEXO V. Análise da qualidade das amostras de RNA e primers utilizados na \nreação de PCR em tempo real \n \n \n \nFigura 1. Representação gráfica da integridade de RNA gerada pelo software do equipamento \n2100 Bioanalyzer. A. Gráfico indicativo dos picos 18S e 28S do RNA; B. Gel virtual com as b eas \nrepresentativas de 28S e 18S; RIN (RNA integrity number); P98: identificação da paciente. \n \n \nTabela 1. Análise da qualidade e integridade das amostras de RNA de mulheres com \nendometriose e controles. \n \nID ID\nEDT Razão \n260/280nm RIN CTR Razão \n260/280nm RIN\nP 57 1,9 6,1 C 30 2,0 5,9\nP 63 1,9 6,5 C 31 2,0 6,4\nP 66 1,9 5,0 C 37 2,0 7,1\nP 72 1,9 7,4 C 38 2,0 6,0\nP 78 1,9 6,9 C 42 2,0 6,9\nP 81 1,9 6,0 C 43 1,8 6,8\nP 88 1,9 7,2 C 44 2,0 7,5\nP 90 2,0 7,2 C 47 2,0 5,5\nP 93 2,0 7,2 C 48 1,8 6,4\nP 97 2,0 6,9 C 50 2,0 7,3\nP 98 1,9 7,3 C 53 1,9 6,4\nP 107 2,0 6,7 C 54 2,0 6,3\nP 112 1,5 5,5 C 57 2,0 5,0\nP 113 1,7 6,5 C 58 2,0 5,1\nP 159 1,5 7,5 C 70 1,9 5,0\nP 161 1,9 5,4 C 75 1,7 7,0\nP 177 2,0 7,2 C 77 1,8 6,5\nP 178 1,8 5,0 C 78 1,6 6,6\nP 179 1,8 5,0 C 79 2,0 6,2\nP 180 1,7 5,1 C 80 2,0 6,3\nP 181 2,0 5,4 C 81 1,7 5,1\nP 182 2,0 5,8 C 82 1,8 6,9\nP 183 1,8 5,2 C 83 1,9 8,1\nP 184 1,8 5,4\nEndométrio \nENDOMETRIOSE CONTROLES\nEndométrio \n \nID: identificação; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; RIN: do inglês, RNA \nTintegrity number – valores gerados pelo software do equipamento 2100 Bioanalyzer. \n \n \n\n204 \n \nTabela 2. Sequências e características físico-químicas dos pares de primers MICA e β -actina, \ne produto de amplificação do gene MICA. \n \n \nBp; pares de bases; NG; número do gene na base de dados NCBI; 5'→3': sentido de elongação do \nácido nucleico - da extremidade fosfatada 5' para a extrem idade 3' hidroxilada; foward: primer iniciador \nda fita senso (5'→3') do ácido nucléico; reverse: primer iniciador da fita anti-senso (3'→5') do ácido \nnucleico; Tm: do inglês melting point; CG: percentual de bases Citosina e Guanina. \n \n \n \n \nA) Primer alvo: gene MICA \nMICA\ndiluição \ncDNA\ndiluição \ncDNA log da diluição média \nCts Eficiência\n1/30 0,0333333 -1,4771213 30,71 1,86028\n1/60 0,0166667 -1,7781513 31,59\n1/120 0,0083333 -2,0791812 32,72\n1/240 0,0041667 -2,3802112 33,47\n1/280 0,0020833 -2,6812482 34,91\n \n \nB) Primer utilizado para o gene normalizador, β-actina \n \ndiluição \ncDNA\ndiluição \ncDNA log da diluição média Cts Eficiência\n1/30 0,0333333 -1,4771213 19,97 1,91471\n1/60 0,0166667 -1,7781513 21,14\n1/120 0,0083333 -2,0791812 22,13\n1/240 0,0041667 -2,3802112 23,05\n1/280 0,0020833 -2,6812482 24,35\nβ-ACTINA\n \nFigura 2. Representação gráfica do cálculo da eficiência dos primers para os genes MICA e β-\nactina. A regressão linear dos valores de Cts em função do logaritmo da respectiva diluição de cDNA \nforneceu o coeficiente angular da reta (a, em y=ax+b), que foi utilizado para o cálculo da eficiência de \namplificação (Ef) do produto, segundo a fórmula: Ef = 10 -1/a ou Ef (%) = (Ef -1) x 100. \n \n\n205 \n \nANEXO VI. Titulação do Ac anti -MICA PE e anti -MICA não marcad o, e avaliação \nda proporção células efetoras: alvo (E:A). \n \n• Titulação do Ac anti -MICA PE (FAB1300, mouse anti -human IgG 2, PE -conjugated \nanti-MICA, clone 159227; R&D, Minneapolis, EUA): para a titulação foram utilizadas as \ndiluições 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100, realizadas em tampão de lavagem citometria de fluxo ((PBS-\n1x + 2% Soro Fetal Bovino + 0,02% Azida Sódica). O teste foi realizado com células K562 \n(linhagem de células de leucemia mieloide crônica humana) e células Hela (câncer cervical \nhumano) (ambas do adas pela Dra. Mar i Sogayar, NUCEL, Núcleo de Terapia Celular e \nMolecular, FMUSP ) com 8 -10 dias de cultivo celular. 2 x 10 5 células (K562 e Hela) foram \nressuspensas em tampão de lavagem e distribuídas em tubos FACs (BD Bioscience, San \nJose, Califórnia, EUA) e foram incubadas com o Ac nas diluições específicas, por 30min, ao \nabrigo da luz. Em seguida, foram adicionados 500µl do tampão de lavagem e os tubos foram \ncentrifugados a 450g, por 5min. Após mais 2 lavagens, as células foram ressuspensas em 400 \nµl de tampão de lavagem para aquisição no citômetro de fluxo BD FACs Canto II (BD \nBioscience, EUA). A melhor diluição deu -se para a menor diluição que gerou a melhor \ndefinição de positividade da molécula MICA na população ´em estudo, e com menor presença \nde ligação inespecífica, definida como 1:50. \n \n• Titulação do Ac anti-MICA não marcado (MAB1300, mouse anti-human IgG2B, clone \n159227; R&D Systems, USA), utilizado para bloqueio de MICA na superfície celular: para a \ntitulação do foram utilizadas as diluições 1:2, 1:5, 1:10 e o Ac puro. O ensaio foi realizado com \n2 x 10 5 células (K562 e Hela) em tampão de lavagem, distribuídas em tubos FACs. Após \ncentrifugação e retirada do sobrenadante, foi adicionado o 1 o Ac, anti-MICA não marcado, nas \ndiluições específicas, seguido de incubação, por 30min, ao abrigo da luz. Em seguida, foram \nadicionados 500µl de tampão de lavagem e os tubos foram centrifugados a 300g, por 5min. \nEsta etapa foi realizada por 2 vezes. Após a retirada do sobrenadante, foi adicionado o \nconjugado (Ac secundário), rabbit anti-mouse Alexa Fluor 633 (clone A21063, Invitrogen, EUA) \nna diluição 1:200, seguindo-se com incubação por mais 30min, ao abrigo da luz. Em seguida, \nforam adicionados 500µl de tampão de lavagem, seguindo -se com nova lavagem dos tubos \n(300g, 5min). Após mais 2 lavagens, as células foram ressuspensas em 400 µl de tampão de \nlavagem para aquisição no citômetro de fluxo. A melhor diluição deu-se para a menor diluição \nque gerou a melhor definição de positividade da molécula MICA na população ´em estudo, e \ncom menor presença de ligação inespecífica, definida como 1:10. \n \n• Avaliação da proporção células efetoras – alvo (E:A): a linhagem celular K562 foi \nmantida por 8 -10 dias em cultura (meio R10) e utilizada como células alvo (A) e as PBMCs \nisoladas de mulheres CTR e EDT, como células efetoras (E). As PBMCs foram descongeladas \n\n206 \n \n(Métodos, item 3.7), lavadas em meio R10, a 400g, por 8 min. Após avaliação da concentração \ne viabilidade celular, as PBMCs foram ressuspensas em 4 mL de R10 com 1g/mL de DNAse \n(Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) e mantidas em repouso por 16 -18, em posição \ninclinada a 45o, com tampas soltas, em incubadora de CO2 umidificada, a 37° C. \n O ensaio seguiu o protocolo descrito em Métodos, item 3.9.2, para a identificação da \nexpressão de IFN-γ e CD107a. Foram avaliadas as proporções E:A: 10:1, 5:1 e 2:1, de forma a \npadronizar a melhor condição para o ensaio, base ando-se na produção de CD107a e IFN -. A \nmelhor proporção E:A foi a que gerou a maior expressão de ambas as moléculas em células \nNK, em ao menos 3 amostras de PBMC de mulheres com endometriose e mulheres controles \nsaudáveis, definida como 1:5. \n As aquisições foram realizadas no citômetro de fluxo BD FACs Canto II (BD Bioscience, \nUSA) (Métodos, item 3.9.1). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n207 \n \nANEXO VII. Expressão gênica de MICA \n \nTabela 1. Valores de Ct e ∆Ct referentes à expressão do gene MICA no endométrio eutópico \nde mulheres com endometriose e de controles, e respectivos dados clínicos. \n \nA) Grupo endometriose \n \nID\nEDT Ct MICA Ct β-Actina ΔCt Fase \nciclo\nEstádio \n(ASRM)\nLocalização \nEDT Idade\nP 57 30,321 21,290 9,031 S III PF 26\nP 63 29,623 19,028 10,595 S IV PF 33\nP 66 31,601 18,762 11,407 S IV PF 30\nP 72 31,598 19,593 12,005 S IV PF 33\nP 78 31,835 18,417 13,418 S IV PF 27\nP 81 29,913 18,716 11,196 P IV PF 34\nP 88 30,331 19,411 10,920 S IV PF + OVA 33\nP 90 32,429 21,472 10,957 S IV PF 29\nP 93 29,247 20,553 8,694 P IV PF 25\nP 97 30,148 20,190 9,958 S IV PF 42\nP 98 30,276 19,317 10,958 P IV PF 26\nP 107 32,451 21,318 11,133 S III PF + OVA 33\nP 112 31,357 21,759 9,598 S IV PF 37\nP 113 31,381 20,548 10,833 S IV PF 38\nP 159 33,282 22,012 11,270 S II PF 37\nP 161 32,436 21,563 10,873 S IV PF 38\nP 177 30,125 19,715 10,410 P IV PF + OVA 40\nP 178 33,005 23,340 9,665 NR IV PF 37\nP 179 31,741 20,564 11,177 S IV PF 36\nP 180 32,230 21,935 10,295 P IV PF + OVA 43\nP 181 31,316 19,592 11,724 S IV PF 30\nP 182 29,335 20,659 8,676 S IV PF 35\nP 183 29,791 19,705 10,086 P IV PF 29\nP 184 35,676 22,164 13,511 P IV PF 32\nMédia (DP) 31,310 (1,5) 20,484 (1,3) 10,776 (1,2) 33,5 (4,9)\nEndométrio Dados clínicos e cirúrgicos\n \n \nID: identificação do paciente; Ct: Threshold cicle (média de triplicata); ΔCt = Ct MICA - Ct β-actina, EDT: grupo \nendometriose; P: fase proliferativa do ciclo menstrual (1o-14o dia); S: fase secretora do ciclo menstrual (15o- 28o dia); \nPF: endometriose profunda; PROF+OVA: EDT profunda na presença de EDT ovariana (OVA); NR: não refer ida; I: \nestádio inicial, mínimo; II: estádio inicial, leve; estádio avançado, moderado, estádio avançado, grave; estádios de \nacordo com rASRM. \n \n \n \n \n \n \n \n\n208 \n \nContinuação Tabela 1. Valores de Ct e ∆Ct referentes à expressão do gene MICA no \nendométrio eutópico de mu lheres com endometriose e de controles, e respectivos dados \nclínicos. \n \nB) Grupo controle \n \n \nID: identificação do paciente; Ct: Threshold cicle (média de triplicata); ΔCt= Ct MICA - Ct β-actina (gene \nnormalizador); P: fase proliferativa do ciclo menstrual (1o-14o dia); S: fase secretora do ciclo menstrual (15o- 28o dia); \nNR: não referida; \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n209 \n \nANEXO VIII. Expressão proteica de MICA \n \nTabela 1. Escores individualizados de frequência e intensidade de expressão da proteína \nMICA em epitélio glandular e estroma, no endométrio eutópico de mulheres com endometriose \ne controles, e na lesão de mulheres com endometriose, e dados clínicos. \n \nA) Grupo endometriose: escores da lesão e do endométrio eutópico e dados clínicos. \nID Tecido Frequencia Intensidade EIR \nglândula Frequencia Intensidade EIR \nestroma \nFase \nciclo\nEstádio \nARSM Idade\nlesão RS 3 2 6 1 2 2\nendométrio 3 2 6 1 2 2\nlesão RS 3 1 3 1 1 1\nendométrio 3 1 3 1 1 1\nlesão RC 0 0 0 0 0 0\nendométrio 1 1 1 0 0 0\nlesão RS 1 1 1 0 0 0\nendométrio 1 1 1 0 0 0\nlesão RS 2 1 2 2 1 2\nendométrio 1 1 1 0 0 0\nlesão RC 1 1 1 0 0 0\nendométrio 1 1 1 0 0 0\nlesão RS 1 1 1 1 1 1\nendométrio 1 1 1 0 0 0\nlesão RC 2 1 2 0 0 0\nendométrio 4 1 4 2 1 2\nlesão RC 3 2 6 0 0 0\nendométrio 4 3 12 0 0 0\nlesão RC 4 1 4 0 0 0 S\nendométrio 4 2 8 2 1 2\nlesão RC 3 2 6 1 1 1\nendométrio 3 2 6 1 1 1\nlesão RC 2 1 2 1 1 1\nendométrio 4 3 12 2 1 2\nlesão RC 3 1 3 1 1 1\nendométrio 4 3 12 2 1 2\nlesão RC 3 2 6 2 1 2\nendométrio 2 1 2 1 1 1\nlesão RC 3 2 6 3 1 3\nendométrio 3 2 6 3 1 3\nlesão RC 4 2 8 3 1 3\nendométrio 2 1 2 3 1 3\nlesão RS 1 1 1 0 0 0\nendométrio 3 1 3 0 0 0\nlesão RS 4 2 8 3 1 3\nendométrio 2 1 2 0 0 0\nlesão RS 0 0 0 0 0 0\nendométrio 0 0 0 0 0 0\nlesão RC 1 1 1 0 0 0\nendométrio 1 1 1 0 0 0\nlesão RS 3 1 3 0 0 0\nendométrio 3 2 6 0 0 0\nlesão RS 1 1 1 0 0 0\nendométrio 2 1 2 1 1 1\nlesão RC 1 1 1 0 0 0\nendométrio 3 2 6 0 0 0\nlesão RS 2 1 2 0 0 0\nendométrio 4 3 12 0 0 0\nlesão RS 1 1 1 1 1 1\nendométrio 1 1 1 1 1 1\nlesão RS 1 1 1 1 1 1\nendométrio 3 1 3 1 1 1\nlesão RC 3 2 6 1 1 1\nendométrio 2 1 2 1 1 1\nlesão RC 1 1 1 0 0 0\nendométrio 1 1 1 0 0 0\nlesão RS 4 1 4 0 0 0\nendométrio 4 2 8 0 0 0\nP 108\nP 110\nP 78\nP 79\nP 86\nP 96\nP 97\nP 99\nEstroma - escore dados clínicos\nP 185\nP 186\nP 187\nP 188\nP 189\nEpitélio glandular - escore\nP 139\nP 143\nP 144\nP 147\nP 149\nP 158\nP 118\nP 119\nP 121\nP 124\nP 126\nP 128\nP 100\nP 103\nP 104\nP 105\nP\nS\nP\nP\nP\nS\nS\nS\nS\nS\nP\nS\nS\nS\nII\nIII\nII\nIII\nS\nS\nS\nP\nIV\nIV\nII\nIV\nIV\nII\nP\nS\nS\nS\nP\nP\nP\nP\nP\nP\nII\nIV\nIII\nIV\nIV\n27\n30\n41\n32\n42\nIV\nIII\nII\nIV\nIV\nIV\nII\nII\nIII\nII\nII\nII\nI\nI\n25\n26\n42\n34\n27\n38\n35\n39\n44\n34\n44\n35\n39\n40\n35\n30\n35\n38\n34\n33\n46\n37\n21\n32\n \nID: identificação do paciente; P: f ase proliferativa do ciclo menstrual (1 o-14o dia); S: fase secretora do ciclo \nmenstrual (15 o- 28o dia); I: estádio inicial, mínimo; II: estádio inicial, leve; estádio avançado, moderado, estádio \navançado, grave; estádios de acordo com a rASRM; EIR: escore de imunorreatividade (definido pelo escore de \nintensidade de expressão de MICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão de MICA). \n\n210 \n \nContinuação Tabela 1. Escores individualizados de frequência e intensidade de expressão da \nproteína MICA em epitélio glandular e estroma, no endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose e de controles, e na lesão de mulheres com endometriose, e dados clínicos. \nB) Grupo controle: escores no endométrio e dados clínicos \n \nID Tecido Frequencia Intensidade EIR \nglândula Frequencia Intensidade EIR \nestroma \nFase \nciclo Idade\nC 43 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 30\nC 44 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 29\nC 45 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 25\nC 47 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 26\nC 48 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 35\nC 51 endométrio 2 1 2 2 1 2 S 25\nC 57 endométrio 1 1 1 1 1 1 S 29\nC 58 endométrio 2 1 2 2 1 2 P 35\nC 60 endométrio 2 1 2 2 1 2 P 34\nC 61 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 32\nC 63 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 36\nC 64 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 33\nC 68 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 26\nC 70 endométrio 4 1 4 0 0 0 P 36\nC 71 endométrio 4 2 8 0 0 0 S 34\nC 73 endométrio 4 2 8 0 0 0 S 37\nC 75 endométrio 4 2 8 0 0 0 S 40\nC 79 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 25\nC 80 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 30\nC 83 endométrio 4 1 4 0 0 0 S 32\nC 84 endométrio 2 1 2 1 1 1 P 38\nC 85 endométrio 1 1 1 1 1 1 P 46\nC 86 endométrio 4 1 4 0 0 0 S 36\nEpitélio glandular - escore Estroma - escore Dados clínicos\n \nID: identificação do paciente; P: f ase prolifer ativa do ciclo menstrual (1 o-14o dia); S: fase secretora do ciclo \nmenstrual (15 o- 28o dia); EIR: escore de imunorreatividade (definido pelo escore de intensidade de expressão de \nMICA multiplicado pelo escore de frequência de expressão de MICA). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n211 \n \nTabela 2. Estatística descritiva de EIR para MICA n o endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose e de controles, e na lesão de mulheres com endometriose (A), EIR de acordo \nfase do ciclo menstrual (B), estádios da endometriose (C) e localização da le são profunda de \nendometriose (D). \n \n \nA) Estatística descritiva de EIRs em epitélio glandular e estroma. \nmédia (DP) mediana (min-max) p\nlesão (n=29) 3 (2,4) 2 (0-8)\nendométrio EDT (n=29) 4,7 (3,8) 3 (0-12)\nendométrio CTR (n=23) 2,7 (2,3) 2 (1-8)\nlesão (n=29) 0,8 (1,0) 0 (0-3)\nendométrio EDT (n=29) 0,8 (1,0) 0 (0-3)\nendométrio CTR (n=23) 0,9 (0,6) 1 (0-2)\nEIR glândula (epitélio)\nEIR estroma\n0,1270\n0,5623\n \nEIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão MICA multiplicado \npelo escore de frequência de expressão de MICA; endométrio: endométrio eutópico; EDT: grupo \nendometriose; CTR: grupo controle; DP; desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max; valor \nmáximo da mediana; valores de p determinados pelo teste de Kruskal-Wallis \n \n \nB) Estatística descritiva do EIR em epitélio glandular e estroma, de acordo com a fase do \nciclo menstrual. \n \nExpressão de MICA Fase do ciclo média (DP) mediana (min-max) p\nlesão (n=29) P 3,5 (2,9) 2,0 (0-8)\nS 2,6 (2,0) 2,0 (0-6)\nendométrio eutópico EDT (n=29) P 4,2 (4,0) 2,0 (1-12)\nS 5,0 (3,8) 4,5 (0-12)\nendométrio eutópico CTR (n=23) P 1,7 (0,8) 2,0 (1-4)\nS 5,0 (3,0) 4,0 (1-8)\nlesão (n=29) P 1,0 (1,3) 0,0 (0-3)\nS 0,6 (0,7) 0,5 (0-2)\nendométrio eutópico EDT (n=29) P 0,8 (1,2) 0,0 (0-3)\nS 0,8 (0,8) 1,0 (0-2)\nendométrio eutópico CTR (n=23) P 1,1 (0,4) 1,0 (0-2)\nS 0,4 (0,8) 0,0 (0-2)\n0,6185\n0,0074\n0,6871\nEIR glândula (epitélio)\nEIR estroma\n0,4698\n0,4627\n0,0043\n \nEIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de \nfrequência de expressão MICA; EDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; DP; desvi o padrão; min: valor \nmínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; P: fase proliferativa do ciclo menstrual (1 o– 14o dia); S: fase \nsecretora do ciclo menstrual (15 o – 30o); análise realizada por imunohistoquímica; em negrito: valores significantes \n(<0,05); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n \n\n212 \n \nContinuação Tabela 2. Estatística descritiva do EIR para MICA n o endométrio eutópico de \nmulheres com endometriose e de controles, e na lesão de mulheres com endometriose (A), \nEIR de acordo fase do ciclo menstrual (B), estádios da endometriose (C) e localização da \nlesão profunda de endometriose (D). \n \n \nC) Estatística descritiva do EIR em epitélio glandular e estroma, de acordo com o estádio \nda endometriose. \n \nExpressão MICA média (DP) mediana (min-max) p a p b\nestádios I / II (n=13)\nlesão 3,2 (2,9) 3,0 (0-8)\nendométrio eutópico 4,2 (4,0) 2,0 (1-12)\nestádios III / IV (n=16)\nlesão 2,5 (2,1) 2,0 (0-6)\nendométrio eutópico 4,8 (3,9) 3,5 (0-12)\nestádios I / II (n=13)\nlesão 0,9 (1,1) 1,0 (0-3)\nendométrio eutópico 0,7 (0,9) 0,0 (0-3)\nestádios III / IV (n=16)\nlesão 0,7 (0,9) 0,0 (0-3)\nendométrio eutópico 0,8 (1,0) 0,5 (0-3)\n0,3464\n0,9294\nEIR glândula (epitélio)\nEIR estroma\n0,5060\n0,0949\n0,6896\n0,7548\n \nEIR: escore de imunorreatividade, definid o pelo escore intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de \nfrequência de expressão MICA; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; \nI/II; estádio iniciais da endometriose; III/IV; estádios avançados da endom etriose; estádios de acordo com a rASRM; \npa: valores de p determinados pelo teste de Kruskal-Wallis na comparação entre os estádios e tecidos de lesão e \nendométrio eutópico; pb: valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney na comparação entre a les ão e \nendométrio eutópico. \n \n \n \nD) Estatística descritiva do EIR em epitélio glandular e estroma, de acordo com a \nlocalização da lesão profunda de endometriose. \n \nExpressão MICA média (DP) mediana (min-max) p\nretossigmóide (n=14) 2,4 (2,2) 1,5 (0-8)\nretrocervical (n=15) 3,5 (2,6) 3,0 (0-8)\nretossigmóide (n=14) 0,8 (1,0) 0,5 (0-3)\nretrocervical (n=15) 0,8 (1,1) 0,0 (0-3)\nEIR glândula (epitélio)\n0,2760\nEIR estroma\n0,9578\n \nEIR: escore de imunorreatividade, definido pelo escore intensidade de expressão MICA multiplicado pelo escore de \nfrequência de expressão MICA; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max; valor máximo da mediana; \nvalores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney na comparação entre as lesões de retossigmóide e \nretrocervical. \n \n \n\n213 \n \nANEXO IX. MICA SOLÚVEL (sMICA) \n \nL A Q D N I\n0\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\nA )\nn = 5 0 n = 2 6\ns M IC A (p g /m l)\np = n s\n3 1 ,2 5\nS o ro\nL A Q D N I\n0\n1 0 0\n2 0 0\n3 0 0\nn = 5 0 n = 2 6\nB )s M IC A (p g /m L ) p = n s\nF lu id o p e rito n e a l\n3 1 ,2 5\n \nFigura 1. Distribuição da concentração de sMICA (pg/mL) em mulheres do grupo controle \nprovenientes de laqueadura tubária (LAQ) e doenças não inflamatórias (DNI) . (A) níveis de sMIC A \nno soro; (B) níveis de sMICA no fluido peritoneal; níveis de sMICA determinados por ELISA; a linha \ntracejada representa o limite inferior de detecção do teste (31,25 pg/mL); ns: não significante (p≥ 0,05), \nsMICA: MICA solúvel; as barras horizontais repre sentam a mediana; valores de p determinados pelo \nTeste Mann–Whitney. \n \n \nTabela 1. Níveis de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal de mulheres com \nendometriose de acordo com estádio da doença e controles. \n \n sMICA (pg/mL) \n n Média (±DP) Mediana (min-max) p \nSoro \nCTR 76 <31,25 (± 6,3) <31,25 (<31,25-82) \nI 24 31,63 (± 5,8) <31,25 (<31,25-56) \nII 39 40,24 (± 23,6) <31,25 (<31,25-148) 0,0004 \nIII 34 44,24 (± 30,9) <31,25 (<31,25-145) \nIV 63 42,34 (± 23,8) <31,25 (<31,25-155) \nFP \nCTR 76 52,50 (±44,8) <31,25 (<31,25–239,0) \nI 24 55,92 (±44,8) <31,25 (<31,25–222) \nII 39 132,00 (±176,4) 64,5 (<31,25-893) <0,0001 \nIII 34 102,60 (±128,4) 57,5 (<31,25-694) \nIV 63 138,60 (±166,6) 80,0 (<31,25-695) \n \nI: endometriose inicial mínima; II, endometriose inicial leve; III: endometriose avançada moderada; IV: endometriose \navançada grave; estádios de acordo com a rASRM; FP: fluido peritoneal; DP: desvio padrão; CTR: grupo controle; \nmin; valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; < 31,25pg/mL: valores abaixo do limite de detecção \ndo teste (31,25pg/mL); sMICA: MICA solúvel; níveis de sMICA determinados por ELISA; em negrito: valores de p \nsignificantes (<0,05); valores de p determinados pelo teste Kruskal-Wallis. \n \n \n \n\n214 \n \nTabela 2. Concentrações de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal e dados clínicos e \ndemográficos das mulheres com endometriose e de controles. \n \nA) Grupo endometriose \nId Fase \nciclo\nEstádio \n(ASRM)\nTipo de \nlesão Idade Id Fase \nciclo\nEstádio \n(ASRM)\nTipo de \nlesão Idade\nsoro FP soro FP\nP 01 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 36 P 82 <31,25 86 Secretora I SUP 36\nP 02 <31,25 258 Secretora II PF + OVA 47 P 83 <31,25 694 Secretora III PF + OVA 28\nP 03 <31,25 399 Secretora IV OVA 45 P 84 44 74 Secretora II PF 41\nP 04 <31,25 376 Proliferativa III PF + OVA 27 P 85 53 164 Secretora IV PF + OVA 39\nP 05 148 297 Secretora II PF 30 P 86 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 41\nP 06 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 45 P 87 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 37\nP 07 70 72 Proliferativa II PF 50 P 88 <31,25 80 Secretora IV PF + OVA 33\nP 08 <31,25 <31,25 Proliferativa III PF 28 P 89 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF + OVA 49\nP 09 32 43 Proliferativa IV PF + OVA 44 P 90 <31,25 507 Secretora IV PF 29\nP 10 42 417 Proliferativa II PF 30 P 91 <31,25 240 Secretora II PF 36\nP 11 <31,25 85 Secretora III PF 37 P 92 <31,25 89 Proliferativa I PF 39\nP 12 86 158 Secretora II PF 39 P 93 <31,25 69 Proliferativa IV PF 25\nP 13 121 139 Secretora III PF + OVA 29 P 94 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 30\nP 14 <31,25 120 Secretora IV PF + OVA 33 P 95 <31,25 115 Secretora III PF + OVA 33\nP 15 64 228 Proliferativa IV PF 35 P 96 <31,25 131 Secretora IV PF + OVA 32\nP 16 <31,25 61 Secretora II PF 29 P 97 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 42\nP 17 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 32 P 98 35,7 338 Proliferativa IV PF 26\nP 18 64 129 Secretora IV PF + OVA 30 P 99 <31,25 <31,25 Secretora II PF 35\nP 19 74 893 Proliferativa II PF 35 P 100 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 39\nP 20 <31,25 43 Secretora IV PF + OVA 26 P 101 <31,25 <31,25 Secretora I SUP 29\nP 21 145 147 Proliferativa III OVA 35 P 102 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 39\nP 22 <31,25 56 Secretora III PF 35 P 103 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 44\nP 23 <31,25 <31,25 Secretora I PF 34 P 104 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 35\nP 24 91 87 Secretora IV PF + OVA 32 P 105 <31,25 59 Secretora III PF 44\nP 25 <31,25 54 Proliferativa IV PF + OVA 33 P 106 <31,25 <31,25 Secretora III PF 26\nP 26 59 138 Proliferativa IV PF + OVA 29 P 107 <31,25 <31,25 Secretora III PF + OVA 33\nP 27 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF 35 P 108 <31,25 <31,25 Secretora II PF 35\nP 28 <31,25 <31,25 Secretora IV PF + OVA 33 P 109 <31,25 <31,25 Secretora III PF 32\nP 29 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF + OVA 38 P 110 <31,25 <31,25 Secretora III PF + OVA 25\nP 30 81 193 Proliferativa III PF + OVA 31 P 111 <31,25 <31,25 Secretora II PF 30\nP 31 108 43 Secretora III OVA 34 P 112 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 37\nP 32 <31,25 67 Proliferativa II PF 30 P 113 72 148 Secretora IV PF 38\nP 33 <31,25 52 Proliferativa I PF 34 P 114 <31,25 131 Secretora IV PF 31\nP 34 37 304 Secretora IV PF + OVA 38 P 115 <31,25 189 Proliferativa II PF 32\nP 35 43 57 Secretora I PF 45 P 116 <31,25 <31,25 Secretora II PF 28\nP 36 155 124 Secretora IV PF 38 P 117 <31,25 87 Secretora I PF 43\nP 37 <31,25 <31,25 Secretora IV PF + OVA 32 P 118 85 414 Secretora II PF 26\nP 38 <31,25 <31,25 Proliferativa I SUP 43 P 119 <31,25 62 Proliferativa II PF 42\nP 39 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 31 P 120 <31,25 <31,25 Secretora III OVA 37\nP 40 83 47 Secretora IV PF + OVA 47 P 121 <31,25 32 Secretora III PF 34\nP 41 60 695 Secretora IV OVA 36 P 122 <31,25 295 Secretora II PF 35\nP 42 <31,25 145 Secretora III OVA 29 P 123 56 222 Proliferativa I SUP 27\nP 43 <31,25 <31,25 Proliferativa III PF + OVA 35 P 124 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 27\nP 44 42 <31,25 Proliferativa III PF + OVA 35 P 125 <31,25 46 Proliferativa IV PF 45\nP 45 33 74 Proliferativa II PF 32 P 126 <31,25 <31,25 Secretora II PF 38\nP 46 47 139 Secretora IV PF + OVA 29 P 127 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 43\nP 47 47 235 Secretora IV PF 49 P 128 <31,25 55 Proliferativa II PF 34\nP 48 <31,25 <31,25 Secretora III PF + OVA 32 P 129 <31,25 <31,25 Secretora I SUP 43\nP 49 <31,25 72 Proliferativa III PF 31 P 130 <31,25 <31,25 Secretora III OVA 36\nP 50 123 510 Proliferativa IV OVA 31 P 131 40 44 Secretora II PF 38\nP 51 <31,25 <31,25 Secretora III OVA 21 P 132 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF 43\nP 52 35 60 Secretora II PF 32 P 133 <31,25 <31,25 Proliferativa III OVA 40\nP 53 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF + OVA 31 P 134 <31,25 <31,25 Secretora II PF 40\nP 54 71 129 Secretora IV PF + OVA 34 P 135 <31,25 101 Proliferativa III PF + OVA 32\nP 55 <31,25 114 Secretora IV PF + OVA 31 P 136 <31,25 <31,25 Secretora II PF 42\nP 56 <31,25 112 Secretora I PF 36 P 137 36 66 Secretora III PF + OVA 48\nP 57 67 143 Secretora III PF 26 P 138 44 172 Secretora III PF 38\nP 58 34 87 Secretora II PF 34 P 139 <31,25 198 Secretora IV PF 33\nP 59 <31,25 174 Proliferativa IV PF + OVA 38 P 140 <31,25 92 Secretora I SUP 50\nP 60 <31,25 87 Proliferativa III PF 38 P 141 <31,25 67 Proliferativa II PF 32\nP 61 <31,25 184 Secretora III PF 47 P 142 <31,25 <31,25 Secretora I SUP 35\nP 62 <31,25 58 Secretora IV OVA 34 P 143 <31,25 <31,25 Proliferativa III PF 46\nP 63 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 33 P 144 35,5 79 Secretora II PF 20\nP 64 71 444 Secretora IV PF 35 P 145 <31,25 547 Secretora II PF 28\nP 65 <31,25 <31,25 Proliferativa I PF 44 P 146 <31,25 175 Secretora IV PF 25\nP 66 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 30 P 147 <31,25 <31,25 Secretora IV PF + OVA 21\nP 67 <31,25 33 Proliferativa I SUP 30 P 148 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 22\nP 68 110 162 Secretora III PF + OVA 35 P 149 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 21\nP 69 <31,25 334 Proliferativa IV PF 32 P 150 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 37\nP 70 <31,25 <31,25 Proliferativa III PF 38 P 151 <31,25 <31,25 Proliferativa I SUP 28\nP 71 <31,25 92 Secretora I SUP 31 P 152 <31,25 <31,25 Proliferativa IV PF 41\nP 72 <31,25 88 Secretora IV PF 33 P 153 <31,25 <31,25 Secretora II SUP 35\nP 73 <31,25 109 Secretora II PF 28 P 154 59,5 353 Proliferativa IV PF 38\nP 74 <31,25 47 Secretora IV PF + OVA 37 P 155 62,7 220 Proliferativa II SUP 42\nP 75 59 554 Proliferativa IV PF + OVA 37 P 156 <31,25 <31,25 Proliferativa II PF 37\nP 76 63 129 Proliferativa IV PF 45 P 157 <31,25 <31,25 Secretora II PF 35\nP 77 <31,25 <31,25 Proliferativa I SUP 30 P 158 <31,25 80 Proliferativa IV PF 37\nP 78 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 27 P 159 <31,25 32 Secretora II PF 38\nP 79 37 85 Secretora IV PF 30 P 160 <31,25 <31,25 Secretora IV PF 33\nP 80 <31,25 129 Secretora II PF 36 P 161 54,2 573 Secretora IV PF 38\nP 81 <31,25 72 Proliferativa IV PF 34\nsMICA(pg/mL) sMICA(pg/mL)\n \nId, identificação do paciente; FP, fluido peritoneal; ASRM, American Society for Reproductive Medicine ; I: \nendometriose inicial mínima; II, endometriose inicial leve; III: endometriose avançada moderada; IV: endometriose \navançada grave; estádios de acordo com a ASRM; SUP: EDT superficial, OVA: EDT ovariana, PROF: EDT \nprofunda, PROF+OVA: EDT profunda na presença de EDT o variana; sMICA: MICA solúvel; níveis de sMICA \ndeterminados por ELISA, <31,25 pg/mL: abaixo do limite inferior de detecção do teste. \n\n215 \n \nContinuação Tabela 2. Concentrações de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal e dados \nclínicos e demográficos das mulheres com endometriose e de controles. \n \nB) Grupo controle \n \n \nId: identificação do paciente; FP: fluido peritoneal; endometriose, sMICA: MICA solúvel; níveis de sMICA \ndeterminados por ELISA (pg/mL); <31,25 pg/mL: abaixo do limite inferior de detecção do teste. \n \n \n \n \n\n216 \n \nTabela 3. Concentrações de MICA solúvel no soro e no fluido peritoneal, de mulheres com \nendometriose e controles, em relação às fases do ciclo menstrual, estádio da doença e \nlocalização das lesões de endometriose. \n \nA) Níveis de sMICA (pg/mL) nos grupos endometriose e controle, de acordo com a fase do \nciclo menstrual. \n \nFase do \nciclo n média (DP) mediana (min-max) p a n média (DP) mediana (min-max) p a p b\nProliferativa 62 39,5 (21,9) <31,25 (<31,25-145) 37 <31,25 (0,3) <31,25 (<31,25-32) 0,0012\nSecretora 99 41,2 (25,9) 53 (<31,25-893) 29 <31,25 (3,7) <31,25 (<31,25-47,5) 0,1056\nProliferativa 62 119,7 (160,0) <31,25 (<31,25-155) 37 60,3 (57,0) <31,25 (<31,25-239) 0,0278\nSecretora 99 121 (143,2) 66 (<31,25-695) 29 45,0 (30,4) <31,25 (<31,25-166) 0,0003\nsMICA- ControlessMICA - Endometriose\n0,0389\n0,4544\nSORO\nFLUIDO \nPERITONEAL\n0,7472\n0,4053\n \nsMICA: MICA solúvel; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; Fase \nproliferativa: 1 o-14o dia do ciclo menstrual; Fase secretora: 15 o- 28o dia do ciclo menstrual; pa: referem -se às \ncomparações entre a fase proliferativa e secretora, no soro e fluido peritoneal, nos grupos endometriose e controles \n(teste de Mann-Whitney); pb: refere às comparações entre os grupos endometriose e controles em cada fase do \nciclo, no soro e fluido peritoneal (teste de Mann-Whitney); em negrito: valores de p significantes (<0,05); n: número \nde amostras analisadas em cada grupo (a somatória dos valores de n no grupo controle é inferior ao n Total (n=76), \npois foram excluídos da a nálise estatística as pacientes cuja fase do ciclo é desconhecida (n=10); níveis de sMICA \ndeterminados por ELISA. \n \n \n \nB) Níveis de sMICA (pg/mL) no grupo endometriose de acordo com os estádios iniciais e \navançados e tipos da doença. \n \nn Média (DP) Mediana (min-máx) p Média (DP) Mediana (min-máx) p p e\nEstádios I/II 63 36,9 (19,1) <31,25 (<31,25-148) 105,6 (146,6) 53,5 (<31,25-893) < 0,0001\nEstádios III/IV 97 43,0 (26,3) <31,25 (<31,25-155) 130,3 (151,1) 72,0 (<31,25-695) < 0,0001\nSUP 13 34,5 (11,1) <31,25 (<31,25-62,7) 73,5 (70,26) <31,25 (<31,25-222) 0,0547\nOVA 11 58,7 (44,47) <31,25 (<31,25-145) 192,5 (233,7) 58,0 (<31,25-695) 0,1273\nPROF 99 37,97 (20,9) <31,25 (<31,25-155) 115,1 (146,6) 59,0 (<31,25-893) < 0,0001\nPROF + OVA 38 44,11 (24,29) <31,25 (<31,25-121) 129,8 (144,1) 94,0 (<31,25-694) < 0,0001\n0,3320d\n0,1127b\n0,1771a\nsMICA - Soro sMICA - Fluido peritoneal\n0,1654c\n \nsMICA: MICA solúvel; DP: desvio padrão; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; SUP: \nendometriose superficial de peritônio; OVA: OVA, endometriose ovariana com ou sem doença peritoneal e sem \nendometriose profunda; PROF: endometriose profunda com ou sem doença peritoneal e sem ovariana; OVA + \nPROF: PROF na presença de OVA; estádios I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: estádios avançados da \nendometriose; estádios de acordo com a rASRM; em negrito: valores de p significantes (<0,05); níveis de sMICA \ndeterminados por ELISA. \na valor de p: estádios I/II vs III/IV, no soro, teste de Mann-Whitney; \nb valor de p :estádios I/II vs III/IV, no fluido peritoneal, teste de Mann-Whitney; \nc valor de p referente à comparação entre os tipos de endometriose, no soro, teste de Kruskal-Wallis; \nd valor de p referente à comparação entre os tipos de endometriose, no Fluido peritoneal, teste de Kruskal-Wallis; \ne valores de p referentes à comparação entre grupo endometriose e grupo controles, em estádios e tipos de \nendometriose, teste de Mann-Whitney. \n \n \n \n \n\n217 \n \nTabela 4. Pontos de cortes estabelecidos para níveis de sMICA no soro e fluido peritoneal, e \npossíveis medidas diagnósticas. \n \nVariável Ponto de corte \nsMICA (pg/mL)\nAUC \n(IC 95% )\nSensibilidade \n(% )\nEspecificidade \n(% )\nEDT total\nsoro 33,5 0,604 (0,59-0,73) 27 93\nFP 32,0 0,660 (0,53-0,68) 60 64\nEDT I/II\nsoro 33,5 0,578 (0,48-0,68) 23 97\nFP 40,5 0,619 (0,52-0,71) 52 67\nEDT III/IV\nsoro 34,8 0,623 (0,54-0,71) 31 95\nFP 44,5 0,684 (0,61-0,76) 60 67\nEDT I\nsoro 45,3 0,498 (0,36-0,63) 4 97\nFP 50,0 0,531 (0,53-0,68) 38 29\nEDT II\nsoro 37,5 0,627 (0,51-0,74) 23 96\nFP 40,5 0,674 (0,57-0,78) 62 67\nEDT III\nsoro 40,0 0,595 (0,47-0,72) 24 97\nFP 55,0 0,646 (0,53-0,76) 53 74\nEDT IV\nsoro 34,8 0,638 (0,54-0,73) 33 95\nFP 40,0 0,704 (0,61-0,79) 67 67\n \nAUC: área sob a curva; EDT: grupo endometriose; EDT total: todos os sujeitos de pesquisa estudad os; EDT \nI/II: estádios iniciais; EDT III/IV: estádios avançados de EDT; estádios de acordo com rASRM; n: número de \namostras analisadas em cada grupo; FP: fluido peritoneal; IC: intervalo de confiança; em negrito: valor da AUC \nconsiderada discriminatória. \n \n \n \n’ \n \nFigura 2. Curva ROC para níveis de sMICA no soro e no fluido peritoneal entre mulheres com \nendometriose estádio IV e controles saudáveis . sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peritoneal; \nEstádio IV: estádio avançado (grave) da endometriose, de acordo com rASRM; ROC: do inglês, \nReceiver Operating Curve ; sMICA no soro: valor de corte= 34,8pg/mL, sensibilidade= 33% e \nespecificidade= 95% (5% de falsos positivos), AUC: 0,638 (IC 95: 0,54 -0,73); sMICA no FP: valor \nde corte= 40pg/mL, sensibilidade= 67% e especifi cidade= 67% (33% de falsos positivos), AUC= \n0,704 (IC95%: 0,61 -0,79); a sensibilidade indica a probabilidade de um caso de endometriose ser \ncorretamente diagnosticado (verdadeiro positivo) e a especificidade, indica os verdadeiros \nnegativos. \n \n\n218 \n \nANEXO X. ATIVIDADE EFETORA DE CÉLULAS NK \n \nTabela 1. Frequência de células K562 com expressão de MICA e sua intensidade de \nfluorescência, com e sem bloqueio para MICA, e a análise da efetividade do bloqueio, de \ncélulas utilizadas nos ensaios de moléculas relacionadas à atividade efetora de células NK \n(CD107a, IFN-y e IL-10). \n \n \nExperimento Células \nVivas \nCélulas \nVivas \n% expressão \n(%)\nMFI % expressão \n(%)\nexpressão \n(%)\nMFI \n(%) \n1 86,7 28,4 2046 87,2 12,5 1616 55,9 21,0\n2 94,0 34,0 2377 94,6 22,5 2046 33,8 13,9\n3 95,2 43,2 2145 95,4 8,56 1761 80,2 17,9\n4 91,2 56,1 2584 93,9 44,9 2184 19,9 15,5\n5 87,0 22,4 2778 88,3 7,75 1290 65,4 53,6\n6 94,8 42,2 2041 96,0 13,1 1349 68,9 33,9\n7 95,1 24,8 1644 95,7 6,43 1169 74,1 28,9\n8 91,2 38,2 1841 95,5 13,9 1141 63,6 38,0\n9 93,2 49,7 2241 95,1 18,6 1418 62,6 36,7\n10 91,3 43,8 1368 93,0 12,3 876 71,9 36,0\n11 85,6 48,7 1110 88,6 18,4 733 62,2 34,0\nMediana 91,3 42,2 2046 94,6 13,1 1349 63,6 33,9\n(min-max) (85,6-95,2) (22,4-56,1) (1110-2778) (87,2-96,0) (6,4-44,9) (733-2184) (19,9-80,2) (13,9-53,6)\nEfetividade do \nbloqueio para MICA\n MICA MICA\n K562 K562BLOQ\n \nMFI: mediana de intensidade de fluorescência; K562BLOQ: células K562 bloqueadas para a proteína \nMICA; min: valor mínimo da mediana; max: valor máximo da mediana; viabilidade celular foi avaliada \nutilizando-se o marcador LIVE/DEAD™ FixableAqua (descrito no item 3.9.1, Métodos). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n219 \n \nTabela 2. Análise da intensidade de expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, entre as \nsubpopulações de células NK, no grupo de mulheres com endometriose e controles, no estado \nbasal de cultura (sem estímulo). \n \nA) Grupo endometriose \n \nEDT CD107a IL-10\nSubpopulações n med min-max p n med min-max p n med min-max p\nNK totais 21 358 217-449 21 84 36-321 17 127 3-263\nCD56dim 21 350 206-426 21 84 37-324 18 119 3-252\nCD56brigth 18 469 362-606 18 81 35-304 15 143 74-265\nCD56dimCD16+ 20 347 3-454 20 76 35-313 17 90 3-452\nCD56dimCD16- 20 303 222-460 20 80 38-339 17 144 119-253\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 16 462 362-659 16 69 34-297 13 158 125-245\nSem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\nIFN-γ\n< 0,0001 0,0164ns\n \n \nEDT: grupo endometriose; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de intensidade d e fluorescência (intensidade de expressão); ns: valor \nde p não significante (p ≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste de Kruskal-Wallis; \n \nCD107a: CD56bright > NK totais ( p≤ 0,001), CD56 bright> CD56 dim (p≤ 0,001), CD56 bright > CD56 dimCD16+ (p≤ 0,001), \nCD56bright > CD56dimCD16- (p≤ 0,0001), CD56 brightCD16- > NK totais (p≤ 0,01), CD56dim >CD56brightCD16- (p≤ 0,001), \nCD56dimCD16+ > CD56 brightCD16- (p≤ 0,001), CD56 dimCD16- > CD56 brightCD16- (p≤ 0,0001), diferenças entre \nsubpopulações com teste Kruskal-Wallis e pós teste de Dunn. \n \nIL-10: CD56bright> NK totais ( p= 0,0358), CD56 bright> CD56 dim (p= 0,0293), CD56 brightCD16- >CD56dimCD16+ > ( p= \n0,0329), CD56 brightCD16- >CD56dim > ( p= 0,0104), CD56 dimCD16- > CD56 dim (p= 0,0199), CD56 dimCD16- > \nCD56dimCD16+ (p= 0,0477), diferenças entre subpopulações com teste Kruskal-Wallis e com pós teste de Mann-\nWhitney: \n \n \n \nB) Grupo controle \n \nCTR CD107a IL-10\nSubpopulações n med min-max p n med min-max p n med min-max p\nNK totais 20 336 209-411 20 97 6-210 16 49 1-166\nCD56dim 20 328 208-413 20 99 3-231 16 37 1-164\nCD56brigth 18 452 312-556 18 93 72-215 16 132 70-195\nCD56dimCD16+ 19 322 208-404 19 93 3-201 16 3 1-176\nCD56dimCD16- 19 340 231-439 19 122 71-254 15 140 123-184\nCD56brightCD16+ 9 489 281-530 9 155 76-224 8 83 3-140\nCD56brightCD16- 17 438 309-573 15 104 73-214 13 143 92-209\nSem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\nIFN-γ\n< 0,0001 ns < 0,0001\n \nCTR grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, \nCD56brightCD16-, CD56-CD16+, MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expres são); ns: valor de \np não significante (p ≥ 0,05); valores de p determinados pelo teste inicial de Kruskal-Wallis; diferenças entre \nsubpopulações com teste Kruskal-Wallis e pós teste de Dunn: \n \nCD107a: CD56bright> CD56 dim (p≤ 0,05), CD56 brightCD16+ > CD56 dim (p≤ 0,05), CD56 brightCD16- > CD56 dim (p≤ 0,05), \nCD56bright >CD56dimCD16+ (p≤ 0,001), CD56bright >CD56dimCD16- (p≤ 0,05), CD56brightCD16+ >CD56dimCD16+ (p≤ 0,05), \nCD56brightCD16- > CD56 dimCD16+ (p≤ 0,001), CD56 brightCD16+ >CD56dimCD16- (p≤ 0,05), CD56 brightCD16- \n>CD56dimCD16- (p≤ 0,05) \n \nIL-10: CD56bright > CD56 dimCD16+ (p≤ 0,05), CD56 brightCD16- > NK totais ( p≤ 0,01), CD56 brightCD16- > CD56 dim (p≤ \n0,01), CD56brightCD16- > CD56dimCD16+ (p≤ 0,001), CD56brightCD16- > CD56brightCD16+ (p≤ 0,05), CD56dimCD16- > NK \ntotais (p≤ 0,05), CD56dimCD16- > CD56dim (p≤ 0,05), CD56dimCD16- > CD56dimCD16+ (p≤ 0,01). \n \n \n \n \n\n220 \n \nTabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas CD107a, IFN-γ e \nIL-10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e estímulo de células \nK562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles. \nA) NK totais \n \n• Grupo endometriose \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 63,6 13,2 17,8 3,6 2,9 -0,1 -0,3\nP055 62,6 25,8 23,5 5,5 6,9 -0,7 -0,6\nP059 80,2 6,7 9,8 2,6 3,0 NT NT\nP066 NT 10,0 23,7 11,6 12,1 -0,8 -0,6\nP069 19,9 13,2 18,2 -0,5 1,5 1,1 0,6\nP071 68,9 26,9 25,9 4,0 3,3 -0,1 0,6\nP077 19,9 32,2 26,2 2,4 0,5 0,3 -0,3\nP090 65,4 9,6 7,3 -0,7 -0,8 -0,3 -0,6\nP091 74,1 3,5 6,4 3,9 2,2 -0,4 -0,4\nP118 80,2 17,9 11,6 -10,8 -7,1 0,7 0,2\nP128 55,9 18,9 16,8 7,6 7,1 NT NT\nP132 NT 12,3 14,7 7,5 9,4 0,4 0,4\nP137 80,2 5,7 6,2 6,1 -3,0 NT NT\nP139 62,6 14,5 15,9 4,2 4,5 -0,4 0,1\nP140 63,6 23,4 18,9 8,6 9,1 0,7 0,4\nP141 62,6 7,5 6,9 2,0 3,1 -0,3 -0,2\nP145 19,9 32,7 45,3 2,9 5,9 0,8 0,8\nP146 33,8 13,8 5,2 4,6 1,8 3,2 -0,2\nP147 62,6 15,9 9,8 2,1 0,9 0,4 0,2\nP148 62,6 15,7 17,9 3,2 5,6 -0,3 -0,2\nP155 NT 60,4 18,8 0,4 2,1 NT NT\nmediana 62,6 14,5 16,8 3,6 3,0 -0,1 -0,2\n(min-max) (19,9-80,2) (3,5-60,4) (5,2-45,3) (-10,3-11,6) (-7,1-12,1) (-0,8-3,2) (-0,6-0,8)\nCélulas NK totais\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo estímulo estímuloEDT\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 38,0 74 71 5 4 -8 -10\nP055 36,7 73 90 9 12 22 33\nP059 17,9 -13 -15 17 -9 NT NT\nP066 NT 90 135 13 11 23 19\nP069 15,5 10 83 -56 -29 -44 -31\nP071 33,9 86 46 14 11 18 -8\nP077 15,5 221 208 -66 -69 -85 -98\nP090 53,6 50 40 -2 1 -8 -2\nP091 28,9 -8 -1 -8 -9 -11 -21\nP118 17,9 34 87 -39 -11 19 28\nP128 21,0 146 127 18 10 NT NT\nP132 NT 40 49 13 19 10 16\nP137 17,9 54 42 1 -24 NT NT\nP139 36,7 37 37 13 13 18 0\nP140 38,0 90 71 12 12 -2 0\nP141 36,7 40 57 -2 1 -13 -16\nP145 15,5 89 175 -23 32 -28 12\nP146 13,9 134 12 0 -2 10 -14\nP147 36,7 49 46 -1 -2 0 0\nP148 36,7 75 83 -5 0 0 2\nP155 NT -14 24 -17 -3 NT NT\nmediana 31,4 54,0 57,0 -0,3 0,5 0,0 0,0\n(min-max) (13,9-53,6) (-14-221 (-15-208) (-66-18) (-69-32) (-85-23) (-98-33)\nestímulo estímulo\nIFN-γ (MFI)\nCélulas NK totais\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nEDT\nIL-10 (MFI )\nestímulo\nCD107a (MFI )\n \nEDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+, MFI: mediana de \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão), min: valor mínimo, max: valor máximo. K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo) K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo) NT: não testado ; valores negativos: valores onde \no valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n \n\n221 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensida de de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \n \n• Grupo controle \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 68,9 17,0 17,8 3,0 2,6 0,1 0,2\nC28 74,1 21,2 13,0 7,5 5,3 0,1 NT\nC30 19,9 -5,1 19,7 1,0 -0,3 0,6 0,6\nC32 NT 18,0 NT 6,4 NT 0,9 NT\nC33 33,8 28,4 25,5 4,1 5,7 0,5 0,3\nC35 19,9 34,4 47,0 4,3 5,3 -0,9 -1,0\nC38 80,2 18,2 16,2 5,1 11,2 -0,1 -0,1\nC39 NT 26,8 15,4 9,4 7,6 -0,3 1,4\nC42 68,9 41,1 42,2 14,9 15,5 -0,2 0,1\nC43 68,9 26,4 -0,9 4,6 0,4 0,4 0,6\nC44 68,9 4,2 4,7 0,1 -0,2 NT NT\nC66 68,9 15,1 16,1 2,0 3,2 0,0 1,6\nC72 74,1 13,2 8,9 4,2 2,1 NT NT\nC73 62,2 20,3 23,3 3,8 4,5 -0,5 0,0\nC76 62,2 16,6 9,8 2,7 0,9 0,9 0,3\nC77 74,1 34,8 17,3 3,7 6,3 -0,5 -0,4\nC78 71,9 27,3 20,8 10,8 11,2 -0,3 0,2\nC79 71,9 -6,4 7,8 1,2 2,2 NT NT\nC80 62,2 31,9 32,5 7,2 6,9 NT NT\nC81 62,2 30,2 31,1 10,5 3,5 0,5 1,5\nmediana 68,9 20,7 17,3 4,2 4,5 0,0 0,3\n(min-max) (19,9 - 74,1) (-6,4 - 41,1) (-0,9 - 47,0) (0,1 - 14,9) (-0,3 - 15,5) (-0,9 - 0,9) (-1,0 - 1,6)\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% )\nestímulo\nCélulas NK totais\nIFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo estímulo\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 33,9 85 112 17 -8 31 24\nC28 28,9 67 38 11 -2 -18 NT\nC30 15,5 116 51 -1 18 -5 16\nC32 NT 73 NT 12 NT 38 NT\nC33 13,9 130 117 -10 -3 -17 -9\nC35 15,5 122 195 -12 -9 -10 -21\nC38 17,9 89 105 30 19 74 80\nC39 NT 110 51 19 21 9 37\nC42 33,9 141 199 42 56 52 100\nC43 33,9 86 -2 -13 24 12 50\nC44 33,9 145 17 -34 32 NT NT\nC66 33,9 47 87 13 16 55 56\nC72 28,9 51 -41 -8 -38 NT NT\nC73 34,0 108 99 32 43 0 0\nC76 34,0 53 23 25 18 16 0\nC77 28,9 124 170 -2 1 -9 -11\nC78 36,0 84 83 72 75 0 0\nC79 36,0 22 72 54 125 NT NT\nC80 34,0 110 112 25 11 NT NT\nC81 34,0 180 198 37 56 0 56\nmediana 33,9 98,5 87,0 14,8 18,0 4,7 19,8\n(min-max) (13,9 - 36,0) (22 - 180) (-41,0 - 199) (-34 - 72) (-38-125) (-18-740 (-21-100)\nCélulas NK totais\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI )\nestímulo estímulo\nIFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\nestímulo\n \nCTR: grupo co ntrole com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; valores negativos: valores o nde \no valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n \n\n222 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de cél ulas K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \nB) CD56dim \n• Grupo endometriose \n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 63,6 12,7 18,6 3,6 3,1 -0,5 -0,3\nP055 62,6 29,8 25,3 7,6 9,5 -0,1 -0,1\nP059 80,2 8,3 6,1 4,5 -0,2 NT NT\nP066 NT 12,2 37,4 14,8 15,2 -1,0 0,5\nP069 19,9 24,9 37,8 -1,5 2,1 1,8 0,2\nP071 68,9 27,3 30,0 4,3 4,8 -0,3 0,3\nP077 19,9 26,6 34,8 0,6 0,7 0,4 -0,3\nP090 65,4 13,3 13,6 -0,8 -0,5 -0,5 -0,7\nP091 74,1 3,1 6,1 4,1 2,2 -0,2 -0,1\nP118 80,2 21,3 6,1 -10,8 -6,5 -0,8 -1,3\nP128 55,90 17,8 16,7 10,2 8,3 0,5 -0,2\nP132 NT 18,9 20,8 8,6 9,0 0,4 0,5\nP137 80,2 10,8 8,6 8,9 -3,4 NT NT\nP139 62,6 13,0 16,8 4,1 4,4 -0,5 0,2\nP140 63,6 37,4 20,6 10,9 10,8 0,1 0,2\nP141 62,6 8,8 5,3 2,3 3,6 0,5 0,2\nP145 19,9 34,1 26,4 2,5 5,3 -0,6 -0,5\nP146 33,8 -6,1 -19,6 4,7 1,9 2,9 -0,2\nP147 62,6 18,9 12,4 2,0 0,5 0,6 0,1\nP148 62,6 16,4 18,5 3,9 6,6 -0,1 -0,2\nP155 NT 14,3 20,2 0,8 2,5 NT NT\nmediana 62,6 16,4 18,5 4,1 3,1 -0,1 -0,1\n(min-max) (19,9-80,2) (-6,1-37,4) (-19,6-37,8) (-10,8-14,8) (-6,5-15,2) (-1,0-2,9) (-1,3-0,5)\nEDT\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%)\nestímulo estímulo estímulo\nIL-10 (% )\ncélulas CD56dim\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 38,0 81 84 5 4 -9 -12\nP055 36,7 85 95 14 17 31 47\nP059 17,9 -33 -21 11 -12 NT NT\nP066 NT 97 139 18 15 38 35\nP069 15,5 4 98 -58 -26 -51 -31\nP071 33,9 98 87 23 17 25 6\nP077 15,5 217 226 -57 -68 -70 -86\nP090 53,6 41 41 -1 2 -2 3\nP091 28,9 10 15 -5 -6 0 -9\nP118 17,9 36 94 -38 -8 33 43\nP128 21,0 147 143 23 13 18 1\nP132 NT 38 48 15 21 10 16\nP137 17,9 51 41 1 -22 NT NT\nP139 36,7 26 36 14 15 3 0\nP140 38,0 88 64 13 13 -1 2\nP141 36,7 39 69 -1 4 -11 -13\nP145 15,5 98 176 -20 29 -26 13\nP146 13,9 134 7 0 -2 9 -14\nP147 36,7 44 40 0 -2 0 0\nP148 36,7 70 84 -4 1 0 0\nP155 NT -26 18 -17 -2 NT NT\nmediana 31,4 51,0 69,0 -0,4 2,1 0,0 0,4\n(min-max) (13,9-53,6) (-33-217) (-21-226) (-58-23) (-68-29) (-70-38) (-86-47)\nestímulo\nIL-10 (MFI )% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI ) IFN-γ (MFI)\nestímulo estímuloEDT\ncélulas CD56dim\n \nEDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+, MFI: mediana de \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão), min: valor mínimo, max: valor máximo. K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo) K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo) NT: não testado, valores negativos: valores onde \no valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n \n\n223 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individ uais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \n \n• Grupo controle \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 68,9 21,3 30,7 3,4 2,4 0,2 0,3\nC28 74,1 -2,4 -13,8 7,4 4,4 -0,4 NT\nC30 19,9 -6,5 14,4 1,4 -0,2 0,8 0,5\nC32 NT 21,3 NT 6,7 NT 0,9 NT\nC33 33,8 29,9 27,4 4,1 5,7 0,5 0,3\nC35 19,9 36,9 53,3 4,2 5,7 -0,8 -0,9\nC38 80,2 23,8 14,4 5,7 10,1 0,4 -0,1\nC39 NT 33,6 20,0 10,9 5,9 -0,2 1,5\nC42 68,9 43,1 45,9 16,3 17,0 -0,1 0,3\nC43 68,9 18,4 -2,0 4,9 0,4 0,5 0,6\nC44 68,9 -0,6 2,1 0,2 0,0 NT NT\nC66 68,9 16,3 23,1 2,6 3,9 -0,2 1,1\nC72 74,1 13,6 8,9 4,2 2,3 NT NT\nC73 62,2 22,0 25,0 3,2 4,5 -0,6 -0,1\nC76 62,2 15,7 10,9 2,3 0,8 2,1 0,7\nC77 74,1 39,5 46,8 4,0 6,7 -0,5 -0,2\nC78 71,9 27,5 22,0 11,9 10,7 0,0 0,4\nC79 71,9 -3,8 11,6 1,5 3,7 NT NT\nC80 62,2 28,3 33,1 9,2 8,3 NT NT\nC81 62,2 32,8 36,7 11,5 3,4 0,4 1,2\nmediana 68,9 21,6 22,0 4,2 4,4 0,1 0,3\n(min-max) (19,9-80,2) (-6,5-43,1) (-13,8-53,3) (0,2-16,3) (-0,2-17) (-0,8-2,1) (-0,9-1,5)\nestímulo estímulo estímulo\nIFN-γ (%) IL-10 (% )\ncélulas CD56dim\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% )\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 33,9 68 100 17 -7 32 27\nC28 28,9 58 39 13 1 -16 NT\nC30 15,5 123 50 -1 18 -5 15\nC32 NT 72 NT 12 NT 39 NT\nC33 13,9 129 117 -10 -3 -18 -9\nC35 15,5 125 214 -13 -8 -11 -20\nC38 17,9 82 94 29 24 65 80\nC39 NT 107 49 21 22 9 36\nC42 33,9 153 199 45 60 56 103\nC43 33,9 81 -5 -15 22 23 61\nC44 33,9 147 20 -32 34 NT NT\nC66 33,9 39 85 14 20 80 77\nC72 28,9 52 -38 -9 -37 NT NT\nC73 34,0 113 102 38 50 0 0\nC76 34,0 50 24 26 17 3 0\nC77 28,9 127 177 -3 2 -12 -13\nC78 36,0 86 85 72 67 0 0\nC79 36,0 32 87 57 138 NT NT\nC80 34,0 132 161 28 9 NT NT\nC81 34,0 188 207 46 64 0 59\nmediana 33,9 96,5 87,0 15,6 20,1 1,5 21,2\n(min-max) (13,9-36) (32-188) (-38-214) (-32-72) (-37-138) (-18-80) (-20-103)\nestímulo estímulo estímuloCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI ) IFN-γ (MFI)\ncélulas CD56dim\nIL-10 (MFI )\n \nCTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máxi mo; K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo; NT: não testado; valores negativos: valores onde \no valor basal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n\n224 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio par a MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \nC) CD56bright \n \n• Grupo endometriose \n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 63,6 18,2 10,8 4,7 1,3 2,0 0,6\nP055 62,6 17,6 20,1 5,2 7,8 -2,9 -2,4\nP059 80,2 NA 12,6 NA -1,0 NT NT\nP066 NT 4,6 27,8 2,7 6,4 0,4 -1,1\nP069 19,9 NA NA NA NA NA NA\nP071 68,9 29,0 NA 0,7 NA 0,0 NA\nP077 19,9 34,4 31,3 0,6 -0,7 1,1 0,4\nP090 65,4 9,5 12,6 -4,0 -5,1 1,9 -0,6\nP091 74,1 NA NA NA NA NA NA\nP118 80,2 17,6 15,6 4,0 11,0 -5,0 -5,4\nP128 55,90 30,2 26,7 4,3 4,3 1,0 0,5\nP132 NT 17,7 16,3 8,2 5,0 -0,2 -0,2\nP137 80,2 5,2 12,2 8,3 1,8 NT NT\nP139 62,6 23,5 13,4 10,5 4,8 0,0 -0,1\nP140 63,6 12,9 -1,3 -0,2 1,2 0,1 0,1\nP141 62,6 NA NA NA NA NA NA\nP145 19,9 44,1 NA 0,9 NA 1,8 NA\nP146 33,8 28,4 18,4 4,1 -0,1 4,9 0,3\nP147 62,6 22,2 21,3 8,0 7,5 -0,6 0,0\nP148 62,6 19,9 21,1 4,4 7,4 -1,5 -1,3\nP155 NT 12,7 24,1 1,7 2,4 NT NT\nmediana 62,6 18,2 17,3 4,1 3,4 0,1 -0,1\n(min-max) (19,9-80,2) (4,6-44,1) (-1,3-31,3) (-4,0-10,5) (-5,1-11,0) (-5,0-4,9) (-5,4-0,6)\nestímulo estímulo estímuloEDT\nCD107a (% ) IFN-γ (%)% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nIL-10 (% )\ncélulas CD56bright\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 38 54 33 4 1 7 -4\nP055 37 62 98 -1 -4 -14 -22\nP059 18 NA 23 NA -68 NT NT\nP066 NT 40 90 -2 -1 -5 -12\nP069 16 NA NA NA NA NT NA\nP071 34 42 NA -18 NA -21 NA\nP077 16 170 298 -72 -84 -51 -53\nP090 54 34 26 0 0 -10 -10\nP091 29 NA NA NA NA NA NA\nP118 18 23 53 -51 -30 -41 -39\nP128 21 161 116 6 4 1 -16\nP132 NT 60 65 0 2 9 19\nP137 18 57 55 -6 -37 NT NT\nP139 37 118 99 9 4 -6 -9\nP140 38 30 58 2 8 -3 4\nP141 37 NA NA NA NA NA NA\nP145 16 44 NA -28 NA -46 NA\nP146 14 205 51 10 0 7 -19\nP147 37 84 75 2 4 -28 -15\nP148 37 112 123 -9 -1 -45 -22\nP155 NT -54 22 -20 -7 NT NT\nmediana 31 57 62 -1 -1 -10 -15\n(min-max) (14-54) (-54-205) (22-298) (-72-10) (-84-8) (-51-9) (-53-19)\nestímulo estímulo estímulo\nIL-10 (MFI )IFN-γ (MFI)% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nEDT\nCD107a (MFI )\ncélulas CD56bright\n \nEDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de \neventos adquiridos no citômetro não atingiram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor \nbasal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n\n225 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com end ometriose e \ncontroles. \n \n• Grupo controle \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 68,9 39,3 39,6 4,3 5,4 0,4 0,4\nC28 74,1 NA 28,7 NA 15,8 NT NT\nC30 19,9 16,0 0,0 -1,5 -1,8 0,6 -0,1\nC32 NT 16,3 NT 3,6 NT -0,7 NT\nC33 33,8 55,4 48,6 6,6 6,6 -0,1 -0,1\nC35 19,9 19,7 21,0 -0,5 1,0 -0,6 -1,0\nC38 80,2 8,7 18,0 1,9 11,2 -0,8 1,4\nC39 NT 6,4 2,5 3,7 5,3 -1,9 -0,7\nC42 68,9 48,6 35,2 11,3 21,4 -1,4 -1,4\nC43 68,9 58,5 15,5 8,3 0,7 1,0 NT\nC44 68,9 NA NA NA NA NA NA\nC66 68,9 23,0 14,4 3,4 5,8 2,1 1,6\nC72 74,1 26,4 17,4 11,9 4,2 NT NT\nC73 62,2 46,8 43,9 4,7 2,7 -6,2 -4,9\nC76 62,2 41,0 24,1 9,5 12,0 8,7 -0,5\nC77 74,1 20,1 25,6 5,7 9,0 2,1 0,8\nC78 71,9 22,2 41,3 11,2 14,3 NA 4,8\nC79 71,9 NA NA NA NA NA NA\nC80 62,2 14,9 5,0 1,3 3,7 NT NT\nC81 62,2 36,6 38,0 10,3 6,8 -3,2 -2,4\nmediana 68,9 23,0 24,1 4,7 5,8 -0,3 -0,1\n(min-max) (19,9-80,2) (6,4-58,5) (0-48,6) (-1,5-11,9) (-1,8-21,4) (-6,2-8,7) (-4,9-4,8)\nestímulo estímulo\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo\ncélulas CD56bright\nCTR\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 33,9 224 220 21 -6 3 -17\nC28 28,9 NA 62 NA -2 NT NT\nC30 15,5 117 52 6 6 -17 12\nC32 NT 92 NT 11 NT 19 NT\nC33 13,9 219 186 -5 2 -14 -13\nC35 15,5 79 168 -30 -27 -13 -30\nC38 17,9 96 143 18 8 23 23\nC39 NT 96 75 15 24 0 NT\nC42 33,9 777 546 46 44 18 22\nC43 33,9 240 -3 -8 30 -12 NT\nC44 33,9 NA NA NA NA NA NA\nC66 33,9 62 81 7 5 9 8\nC72 28,9 103 -33 5 -32 NT NT\nC73 34,0 214 192 64 64 31 10\nC76 34,0 102 39 38 31 5 -4\nC77 28,9 83 159 -1 4 -4 -20\nC78 36,0 80 30 41 24 NA 22\nC79 36,0 NA NA NA NA NA NA\nC80 34,0 22 -29 17 33 NT NT\nC81 34,0 193 183 13 25 -1 -1\nmediana 33,9 102 81 13 8 2 4\n(min-max) (13,9-36,0) 22-777) (-33-546) (-30-64) (-32-64) (-17-31) (-30-23)\nestímulo estímulo\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI )\nCTR estímulo\ncélulas CD56bright\nIFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\n \nCTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa, NK totais: incluem as subpopulações \nCD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+, MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo, max: valor máximo. K562: estímulo com células K562 \ndescontado o valor basal (sem estímulo) K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA, \ndescontado o valor basal (sem e stímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos adquiridos no \ncitômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100), valores negativos: valores onde o valor basal, sem estímulo, foi maior \ndo que com estímulo. \n\n226 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e in tensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \nD) CD56dimCD16+ \n \n• Grupo endometriose \n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 63,6 32,1 15,8 0,3 -0,2 -0,7 -0,4\nP055 62,6 28,0 35,4 3,1 6,6 -0,3 1,3\nP059 80,2 20,5 28,7 17,6 -5,4 NT NT\nP066 NT 9,0 31,4 9,2 8,8 -1,1 -0,3\nP069 19,9 -12,0 60,7 1,0 -3,0 1,3 0,0\nP071 68,9 38,1 29,4 0,0 -0,4 -0,6 -0,6\nP077 19,9 19,6 39,2 0,7 -0,7 1,0 -0,1\nP090 65,4 8,3 17,2 0,2 0,3 -1,1 0,3\nP091 74,1 NA NA NA NA NA NA\nP118 80,2 26,9 13,7 -9,4 -10,6 -0,1 0,8\nP128 55,9 37,0 34,3 8,6 6,6 1,3 0,8\nP132 NT 15,9 16,3 5,8 4,7 0,5 0,7\nP137 80,2 9,3 5,8 6,6 -4,7 NT NT\nP139 62,6 15,6 18,0 3,6 5,8 -0,8 -0,1\nP140 63,6 45,7 36,7 5,2 4,2 0,3 0,4\nP141 62,6 22,6 34,0 5,9 9,6 -0,5 -0,5\nP145 19,9 31,7 58,3 -1,8 -0,4 0,0 0,3\nP146 33,8 -5,7 -20,6 3,0 3,3 3,1 0,1\nP147 62,6 21,6 18,8 1,9 0,1 0,6 0,0\nP148 62,6 20,0 29,3 2,9 3,8 -0,4 -0,7\nP155 NT 16,1 27,5 3,3 7,5 NT NT\nmediana 62,6 20,3 29,0 3,0 1,8 -0,1 0,0\n(min-max) (19,9-80,2) (-12-45,7) (-20,6-60,7) (-9,4-17,6) (-10,6-9,6) (-1,1-3,1) (-0,7-1,3)\ncélulas CD56dimCD16+\nestímulo estímuloEDT\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 38,0 68 51 2 2 -14 -9\nP055 36,7 58 74 -3 13 0 0\nP059 17,9 27 84 -5 -25 NT NT\nP066 NT 74 112 13 8 24 29\nP069 15,5 -27 55 -73 -60 -146 -137\nP071 33,9 81 12 11 -15 79 47\nP077 15,5 163 167 -74 -88 -245 -255\nP090 53,6 12 25 -5 0 -29 -12\nP091 28,9 NA NA NA NA NA NA\nP118 17,9 55 109 -45 -19 42 67\nP128 21,0 148 131 19 7 0 0\nP132 NT 28 32 9 13 12 16\nP137 17,9 47 35 -5 -26 NT NT\nP139 36,7 0 0 16 17 41 47\nP140 38,0 61 45 5 5 -9 3\nP141 36,7 149 166 16 12 0 0\nP145 15,5 60 164 -38 15 -27 24\nP146 13,9 126 0 -4 -4 7 -14\nP147 36,7 44 60 -1 -5 0 0\nP148 36,7 60 73 -5 -2 0 0\nP155 NT -16 41 -17 0 NT NT\nmediana 31,4 59,0 57,5 -3,3 -0,1 0,0 0,0\n(min-max) (13,9-53,6) (-27-163) (0-167) (-74-19) (-88-17) (-245-79) (-255-67)\ncélulas CD56dimCD16+\nestímulo estímulo estímulo\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI ) IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\nEDT\n \nEDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de \nintensidade de fluorescência (intensid ade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de \neventos adquiridos no citômetro não atingiram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor \nbasal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n\n227 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \n• Grupo controle \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 68,9 29,2 36,7 1,9 0,4 0,4 0,2\nC28 74,1 11,4 10,4 9,6 6,1 -0,4 NT\nC30 19,9 -6,1 -24,9 0,8 0,4 0,6 0,8\nC32 NT 25,4 NT 4,4 NT 1,0 NT\nC33 33,8 -3,3 30,8 3,9 5,5 0,3 0,2\nC35 19,9 30,1 45,6 -0,6 -1,0 -1,4 -1,3\nC38 80,2 38,3 38,1 18,5 18,5 0,7 0,0\nC39 NT 32,5 18,9 7,5 6,5 -0,4 1,4\nC42 68,9 39,0 45,0 4,1 7,8 -0,3 1,1\nC43 68,9 26,4 -2,5 1,1 0,0 0,7 NT\nC44 68,9 NT NT NT NT NT NT\nC66 68,9 28,2 27,2 -2,6 -0,1 0,5 1,0\nC72 74,1 12,2 3,7 0,8 -0,5 NT NT\nC73 62,2 27,9 25,8 1,2 1,6 -0,9 -0,6\nC76 62,2 18,8 9,8 3,3 0,0 1,3 -0,9\nC77 74,1 33,3 12,7 1,0 3,1 -0,1 0,6\nC78 71,9 29,1 36,8 9,7 10,1 0,4 0,5\nC79 71,9 NA NA NA NA NA NA\nC80 62,2 42,7 45,8 13,9 8,4 NT NT\nC81 62,2 47,3 -14,1 17,6 3,6 0,6 0,5\nmediana 68,9 28,6 25,8 3,6 3,1 0,4 0,5\n(min-max) (19,9-80,2) (-6,1-47,3) (-24,9-45,8) (-2,6-18,5) (-1,0-18,5) (-1,4-1,3) (-1,3-1,4)\ncélulas CD56dimCD16+\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo estímulo estímulo\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 33,9 71 104 18 -10 14 19\nC28 28,9 61 79 8 -3 -18 NT\nC30 15,5 -231 -231 3 14 337 278\nC32 NT 62 NT 10 NT 38 NT\nC33 13,9 141 125 -10 -3 -17 -7\nC35 15,5 51 127 -14 -15 -18 -11\nC38 17,9 114 139 28 13 0 0\nC39 NT 96 42 16 20 9 39\nC42 33,9 78 170 23 40 0 0\nC43 33,9 76 -4 -21 23 7 NT\nC44 33,9 NA NT NA NT NA NT\nC66 33,9 75 77 24 24 0 0\nC72 28,9 40 -48 -15 -43 NT NT\nC73 34,0 112 94 22 35 0 0\nC76 34,0 53 26 43 31 0 0\nC77 28,9 109 150 -8 -5 -13 -13\nC78 36,0 74 75 31 32 0 0\nC79 36,0 NA NA NA NA NA NA\nC80 34,0 178 278 38 22 NT NT\nC81 34,0 276 239 49 65 0 0\nmediana 33,9 75,5 94,0 17,0 20,0 0,0 0,0\n(min-max) (13,9-36,0) (-213-276) (-213-278) (-21-49) (-43-65) (-18-337) (-13-278)\ncélulas CD56dimCD16+\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI )\nestímulo\nIFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\nestímulo estímulo\n \nCTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações \nCD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valo r máximo; K562: estímulo com células K562 \ndescontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína \nMICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos \nadquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem \nestímulo, foi maior do que com estímulo. \n \n\n228 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \nE) CD56dimCD16- \n \n• Grupo endometriose \n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 63,6 10,7 26,4 6,3 5,9 0,2 0,3\nP055 62,6 29,6 23,0 9,6 10,5 -0,1 -0,1\nP059 80,2 -2,3 -5,4 5,1 1,5 NT NT\nP066 NT 6,4 19,4 18,9 23,3 -1,5 0,5\nP069 19,9 22,7 25,6 -0,8 5,7 -0,2 -0,3\nP071 68,9 30,7 34,6 8,1 7,5 -1,9 5,1\nP077 19,9 26,7 28,7 2,4 2,4 0,1 -0,2\nP090 65,4 25,6 24,4 -1,7 0,7 1,3 0,2\nP091 74,1 NA NA NA NA NA NA\nP118 80,2 15,5 -3,9 -17,8 -14,8 -1,4 -2,3\nP128 55,9 13,4 14,6 7,5 9,1 -0,5 -0,9\nP132 NT 26,2 31,8 25,6 32,3 2,0 1,3\nP137 80,2 17,4 22,7 13,7 6,1 NT NT\nP139 62,6 8,4 4,6 4,5 5,2 0,7 1,0\nP140 63,6 19,7 16,7 14,8 20,1 -0,1 0,6\nP141 62,6 -3,8 -9,0 1,7 2,4 0,3 0,5\nP145 19,9 23,3 31,0 3,6 7,0 -0,9 -0,3\nP146 33,8 -4,3 -15,4 9,8 10,2 2,9 -0,7\nP147 62,6 19,8 8,0 3,8 1,0 -0,3 -0,5\nP148 62,6 16,7 21,6 9,1 11,3 -0,1 -0,7\nP155 NT 5,7 10,1 0,0 1,1 NT NT\nmediana 62,6 17,1 20,5 5,7 6,0 -0,1 -0,1\n(min-max) (19,9-80,2) (-4,3-30,7) (-15,4-34,6) (-17,8-25,6) (-14,8-32,3) (-1,9-2,9) (-2,3-5,1)\ncélulas CD56dimCD16-\nestímulo estímuloEDT % bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo\n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 38,0 123 140 7 7 -12 -19\nP055 36,7 85 97 12 14 -17 -9\nP059 17,9 -12 -18 35 -3 NT NT\nP066 NT 141 191 22 25 3 -6\nP069 15,5 62 183 -110 -72 -35 -18\nP071 33,9 115 244 32 52 -23 -29\nP077 15,5 388 252 -50 -46 -37 -40\nP090 53,6 74 50 -6 3 -13 10\nP091 28,9 NA NA NA NA NA NA\nP118 17,9 26 112 -31 5 -16 -4\nP128 21,0 144 154 28 23 24 7\nP132 NT 135 205 73 96 -5 0\nP137 17,9 111 131 21 -9 NT NT\nP139 36,7 46 30 7 13 6 0\nP140 38,0 138 134 20 24 4 -5\nP141 36,7 14 32 -2 8 -3 -3\nP145 15,5 147 196 -14 38 -32 3\nP146 13,9 183 39 13 12 14 -13\nP147 36,7 44 25 2 -4 -20 -27\nP148 36,7 95 103 7 13 -9 -8\nP155 NT -39 3 -17 0 NT NT\nmediana 31,4 103,0 121,5 7,0 9,9 -12,0 -6,0\n(min-max) (13,9-53,6) (-39-388) (-18-252) (-110-73) (-72-96) (-37-24) (-40-10)\ncélulas CD56dimCD16-\nestímulo estímulo estímulo\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI ) IFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\nEDT\n \nEDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes particip antes de pesquisa ; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de \neventos adquiridos no citômetro não atingi ram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor \nbasal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n\n229 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de cél ulas NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \n• Grupo controle \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 68,9 12,3 18,3 3,3 3,5 -0,3 -0,1\nC28 74,1 -16,8 -16,6 5,1 2,3 NT NT\nC30 19,9 -4,4 12,1 1,7 -0,7 0,7 0,7\nC32 NT 25,1 NT 12,2 NT 0,1 NT\nC33 33,8 16,2 13,7 4,4 7,1 0,4 0,2\nC35 19,9 42,4 56,5 6,0 9,0 -0,4 -1,0\nC38 80,2 7,5 -6,3 2,0 1,7 -0,2 -0,5\nC39 NT 39,0 30,6 29,3 25,2 -0,9 -0,2\nC42 68,9 42,0 35,1 30,3 22,0 0,1 0,2\nC43 68,9 14,8 -1,7 9,7 0,5 0,8 0,1\nC44 68,9 -7,7 -1,0 0,2 0,0 NT NT\nC66 68,9 4,8 10,4 3,7 3,8 -0,9 0,6\nC72 74,1 22,7 13,3 13,6 6,2 NT NT\nC73 62,2 15,7 27,1 8,4 9,7 -1,6 -0,7\nC76 62,2 17,2 13,3 2,4 1,4 3,3 1,6\nC77 74,1 32,3 44,6 8,2 12,5 -0,7 -1,0\nC78 71,9 25,2 25,1 13,1 14,8 0,4 1,4\nC79 71,9 NA NA NA NA NA NA\nC80 62,2 9,3 14,0 9,7 10,9 NT NT\nC81 62,2 18,8 20,7 12,6 2,8 1,1 1,7\nmediana 68,9 16,2 13,9 8,2 5,0 0,1 0,2\n(min-max) (19,9-80,2) (-16,8-42,4) (-16,6-56,5) (0,2-30,3) (-0,7-25,2) (-1,6-3,3) (-1,0-1,7)\ncélulas CD56dimCD16-\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo estímulo estímulo\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 33,9 70 99 16 -3 -5 -11\nC28 28,9 50 12 18 3 NT NT\nC30 15,5 149 41 -4 10 -9 5\nC32 NT 155 NT 21 NT 3 NT\nC33 13,9 84 81 -17 -8 -18 -14\nC35 15,5 330 321 -11 -6 -6 -27\nC38 17,9 77 82 6 1 -3 1\nC39 NT 276 162 82 59 -21 -12\nC42 33,9 488 233 83 72 14 14\nC43 33,9 90 1 -14 14 -19 28\nC44 33,9 106 -14 -42 45 NT NT\nC66 33,9 15 84 9 14 -5 6\nC72 28,9 106 -7 16 -22 NT NT\nC73 34,0 120 212 21 45 -21 -37\nC76 34,0 37 10 0 1 5 -2\nC77 28,9 155 226 6 15 1 -3\nC78 36,0 235 440 50 68 -7 15\nC79 36,0 NA NA NA NA NA NA\nC80 34,0 59 27 27 12 NT NT\nC81 34,0 98 166 14 4 -4 -8\nmediana 33,9 106,0 83,0 14,0 11,0 -5,0 -2,5\n(min-max) (13,9-36,0) (15-488) (-14-440) (-42-83) (-22-72) (-21-14) (-37-28)\ncélulas CD56dimCD16-\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI )\nestímulo\nIFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\nestímulo estímulo\n \nCTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações \nCD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 \ndescontado o valor basal (sem e stímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína \nMICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos \nadquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem \nestímulo, foi maior do que com estímulo. \n \n\n230 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \nF) CD56brightCD16+ \n \n• Grupo endometriose \n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 63,6 NA NA NA NA NA NA\nP055 62,6 NA NA NA NA NA NA\nP059 80,2 NA NA NA NA NA NA\nP066 NT -1,3 36,5 5,9 9,7 1,8 0,4\nP069 19,9 NA NA NA NA NA NA\nP071 68,9 NA NA NA NA NA NA\nP077 19,9 NA NA NA NA NA NA\nP090 65,4 NA NA NA NA NA NA\nP091 74,1 NA NA NA NA NA NA\nP118 80,2 NA NA NA NA NA NA\nP128 55,90 NA NA NA NA NA NA\nP132 NT NA NA NA NA NA NA\nP137 80,2 NA NA NA NA NA NA\nP139 62,6 NA NA NA NA NA NA\nP140 63,6 NA NA NA NA NA NA\nP141 62,6 NA NA NA NA NA NA\nP145 19,9 NA NA NA NA NA NA\nP146 33,8 39,6 3,2 -6,1 -4,1 6,2 0,6\nP147 62,6 7,4 0,2 2,2 5,7 -0,7 1,1\nP148 62,6 14,8 9,7 2,0 7,0 -2,5 2,7\nP155 NT NA NA NA NA NA NA\nmediana 62,6 11,1 6,4 2,1 6,4 0,6 0,9\n(min-max) (19,9-80,2) (-1,3-39,6) (0,2-36,5) (-6,1-5,9) (-4,1-9,7) (-2,5-6,2) (0,4-2,7)\nestímulo\nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nEDT\ncélulas CD56brightCD16+\nestímulo\n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 38,0 NA NA NA NA NA NA\nP055 36,7 NA NA NA NA NA NA\nP059 17,9 NA NA NA NA NA NA\nP066 NT 74 110 -3 -6 -16 -9\nP069 15,5 NA NA NA NA NA NA\nP071 33,9 NA NA NA NA NA NA\nP077 15,5 NA NA NA NA NA NA\nP090 53,6 NA NA NA NA NA NA\nP091 28,9 NA NA NA NA NA NA\nP118 17,9 NA NA NA NA NA NA\nP128 21,0 NA NA NA NA NA NA\nP132 NT NA NA NA NA NA NA\nP137 17,9 NA NA NA NA NA NA\nP139 36,7 NA NA NA NA NA NA\nP140 38,0 NA NA NA NA NA NA\nP141 36,7 NA NA NA NA NA NA\nP145 15,5 NA NA NA NA NA NA\nP146 13,9 118 -61 8 -5 26 -20\nP147 36,7 39 42 -4 -4 0 0\nP148 36,7 44 67 -8 -9 -40 -3\nP155 NT NA NA NA NA NA NA\nmediana 31,4 59,0 54,5 -3,4 -5,4 -8,0 -6,0\n(min-max) (13,9-53,6) (39-118) (-61-110) (-8-8) (-9 - -4) (-40-26) (-20-0)\ncélulas CD56brightCD16+\nIFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\nEDT estímulo estímulo estímulo\nCD107a (MFI )% bloqueio \npara MICA em \nK562 \n \nEDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: mediana de \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de \neventos adquiridos no citômetro não atingiram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o val or \nbasal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n\n231 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e \ncontroles. \n• Grupo controle \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 68,9 37,0 30,3 0,3 -0,4 0,8 0,3\nC28 74,1 NA NA NA NA NA NA\nC30 19,9 8,6 51,0 -1,0 0,9 0,0 3,3\nC32 NT 16,9 NT 6,7 NT 16,9 NT\nC33 33,8 51,2 48,3 2,1 5,6 0,0 0,3\nC35 19,9 NA NA NA NA NA NA\nC38 80,2 NA NA NA NA NA NA\nC39 NT 6,0 5,1 4,5 6,6 -3,7 -1,5\nC42 68,9 32,3 45,5 8,2 27,7 5,3 0,0\nC43 68,9 21,2 20,5 -4,5 -5,8 3,4 NT\nC44 68,9 NA NA NA NA NA NA\nC66 68,9 NA NA NA NA NA NA\nC72 74,1 2,2 2,7 -0,8 -0,8 NT NT\nC73 62,2 NA NA NA NA NA NA\nC76 62,2 NA NA NA NA NA NA\nC77 74,1 NA NA NA NA NA NA\nC78 71,9 NA NA NA NA NA NA\nC79 71,9 NA NA NA NA NA NA\nC80 62,2 NA NA NA NA NA NA\nC81 62,2 NA NA NA NA NA NA\nmediana 68,9 19,1 30,3 1,2 0,9 0,8 0,3\n(min-max) (19,9-80,2) (2,2-51,2) (2,7-51) (-4,5-8,2) (-5,8-27,7) (-3,7-16,9) (-1,5-3,3)\nestímuloCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\ncélulas CD56brightCD16+\nestímulo estímulo\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 33,9 180 155 18 -12 11 4\nC28 28,9 NA NA NA NA NA NA\nC30 15,5 126 434 3 -3 2 16\nC32 NT 52 NT 9 NT 41 NT\nC33 13,9 194 95 -3 6 -23 -9\nC35 15,5 NA NA NA NA NA NA\nC38 17,9 NA NA NA NA NA NA\nC39 NT 139 99 2 9 23 54\nC42 33,9 92 207 55 38 0 0\nC43 33,9 82 -9 -27 47 15 NT\nC44 33,9 NA NA NA NA NA NA\nC66 33,9 NA NA NA NA NA NA\nC72 28,9 84 -27 -2 -38 NT NT\nC73 34,0 NA NA NA NA NA NA\nC76 34,0 NA NA NA NA NA NA\nC77 28,9 NA NA NA NA NA NA\nC78 36,0 NA NA NA NA NA NA\nC79 36,0 NA NA NA NA NA NA\nC80 34,0 NA NA NA NA NA NA\nC81 34,0 NA NA NA NA NA NA\nmediana 33,9 109,0 99,0 2,5 6,4 11,0 4,0\n(min-max) (13,9-36) (52-194) (-27-434) (-27-55) (-38-47) (-23-41) (-9-54)\nestímulo\nIFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (MFI )\nestímulo\ncélulas CD56brightCD16+\nestímulo\n \nCTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações \nCD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 \ndescontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a pro teína \nMICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos \nadquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem \nestímulo, foi maior do que com estímulo. \n \n\n232 \n \nContinuação Tabela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometr iose e \ncontroles. \nG) CD56brightCD16- \n \n• Grupo endometriose \n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 63,6 26,8 33,7 5,7 3,7 1,3 0,2\nP055 62,6 19,4 30,6 16,3 22,7 -7,7 -7,8\nP059 80,2 NA NA NA NA NA NA\nP066 NT 4,4 24,1 0,9 4,1 0,1 -1,4\nP069 19,9 NA NA NA NA NA NA\nP071 68,9 24,9 25,9 6,5 -1,8 0,3 -2,3\nP077 19,9 14,6 21,6 -0,4 -4,3 -2,6 -3,5\nP090 65,4 18,1 8,4 -0,7 -3,4 1,5 -0,5\nP091 74,1 NA NA NA NA NA NA\nP118 80,2 15,2 7,4 -19,6 -15,4 NT NT\nP128 55,90 37,2 36,1 3,4 4,5 2,4 0,5\nP132 NT 14,3 14,7 7,1 5,1 -0,1 0,3\nP137 80,2 10,7 11,1 4,2 -7,5 NT NT\nP139 62,6 25,8 19,2 9,7 5,0 -0,7 -1,3\nP140 63,6 21,3 -4,2 8,4 2,9 -0,6 0,1\nP141 62,6 NA NA NA NA NA NA\nP145 19,9 NA NA NA NA NA NA\nP146 33,8 37,4 34,3 6,7 1,2 3,5 -0,6\nP147 62,6 28,3 28,9 7,9 7,8 -0,5 -0,6\nP148 62,6 35,1 27,7 7,5 8,2 -0,8 -1,1\nP155 NT 12,6 25,9 -2,2 -1,5 NT NT\nmediana 62,6 20,3 25,0 6,1 3,3 -0,1 -0,6\n(min-max) (19,9-80,2) (4,4-37,4) (-4,2-36,1) (-19,6-16,3) (-15,4-22,7) (-7,7-3,5) (-7,8-0,5)\nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo estímulo estímulo\ncélulas CD56brightCD16-\nEDT\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nP054 38,0 61 52 6 3 13 -2\nP055 36,7 121 191 13 27 -14 -28\nP059 17,9 NA NA NA NA NA NA\nP066 NT 31 79 -2 0 -6 -12\nP069 15,5 NA NA NA NA NA NA\nP071 33,9 38 -24 -11 -13 -19 -62\nP077 15,5 130 238 -75 -80 -42 -34\nP090 53,6 50 28 1 0 3 4\nP091 28,9 NA NA NA NA NA NA\nP118 17,9 26 35 -48 -31 NT NT\nP128 21,0 130 112 7 5 -19 -19\nP132 NT 60 62 2 5 16 25\nP137 17,9 53 43 -4 -34 NT NT\nP139 36,7 149 116 7 8 -15 -14\nP140 38,0 21 54 12 10 4 7\nP141 36,7 NA NA NA NA NA NA\nP145 15,5 NA NA NA NA NA NA\nP146 13,9 231 110 12 2 6 -22\nP147 36,7 109 94 2 5 -37 -29\nP148 36,7 162 172 -9 2 -22 -5\nP155 NT -69 -2 -20 -9 NT NT\nmediana 31,4 60,5 70,5 1,4 2,0 -14,0 -14,0\n(min-max) (13,9-53,6) (-69-231) (-24-238) (-75-13) (-80-27) (-42-16) (-62-25)\nestímulo estímulo estímuloEDT\nIL-10 (MFI )\n% bloqueio para \nMICA em K562 \nCD107a (MFI ) IFN-γ (MFI)\ncélulas CD56brightCD16-\n \nEDT: grupo endometriose com numeração dos diferentes participantes de pesquisa ; NK totais: incluem as \nsubpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56-CD16+; MFI: med iana de \nintensidade de fluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo \ncom células K562 descontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de \neventos adquiridos no citômetro não atingiram o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor \nbasal, sem estímulo, foi maior do que com estímulo. \n\n233 \n \nContinuação Tab ela 3. Frequência e intensidade de expressão, individuais, das moléculas \nCD107a, IFN-γ e IL -10 nas subpopulações de células NK, com o estímulo de células K562 e \nestímulo de células K562 pós bloqueio para MICA, em mulheres com endometriose e controles \n \n• Grupo controle \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 68,9 40,4 42,0 4,4 6,8 -0,6 -0,6\nC28 74,1 NA NA NA NA NA NA\nC30 19,9 15,5 2,7 -0,6 -0,9 1,7 1,1\nC32 NT 20,0 NT 5,1 NT -1,0 NT\nC33 33,8 38,0 35,8 8,5 8,3 -0,5 0,2\nC35 19,9 38,1 21,9 0,5 2,2 0,5 -0,6\nC38 80,2 18,4 23,0 18,8 21,1 -0,8 0,0\nC39 NT 5,7 0,5 4,7 5,5 0,5 1,5\nC42 68,9 52,6 33,2 11,5 21,1 -1,8 -1,8\nC43 68,9 61,1 22,0 12,4 3,3 0,9 NT\nC44 68,9 NA NA NA NA NA NA\nC66 68,9 31,3 13,8 2,2 5,5 0,6 2,2\nC72 74,1 11,9 5,4 8,5 1,7 NA NA\nC73 62,2 40,4 54,6 NA NA NA NA\nC76 62,2 28,4 13,2 8,9 8,4 10,9 0,0\nC77 74,1 38,1 51,5 8,2 15,9 0,0 0,0\nC78 71,9 28,9 NA NA NA NA NA\nC79 71,9 NA NA NA NA NA NA\nC80 62,2 9,0 5,9 1,5 3,1 NT NT\nC81 62,2 42,0 40,7 18,0 12,8 -3,0 -3,1\nmediana 68,9 31,3 22,0 8,2 6,2 0,0 0,0\n(min-max) (19,9-80,2) (5,7-61,1) (0,5-54,6) (-0,6-18,8) (-0,9-21,1) (-3-10,9) (-3,1-2,2)\nCTR\n% bloqueio \npara MICA em \nK562 \nCD107a (% ) IFN-γ (%) IL-10 (% )\nestímulo estímulo estímulo\ncélulas CD56brightCD16-\n \n K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ K562 K562BLOQ\nC27 33,9 234 250 21 -5 -9 -30\nC28 28,9 NA NA NA NA NA NA\nC30 15,5 121 34 1 9 -25 4\nC32 NT 72 NT 10 NT -4 NT\nC33 13,9 235 222 -8 1 -10 -12\nC35 15,5 127 201 -25 -21 -2 -23\nC38 17,9 114 157 19 5 -15 -15\nC39 NT 92 75 20 22 0 5\nC42 33,9 1125 588 45 50 5 10\nC43 33,9 512 33 7 25 -14 NT\nC44 33,9 NA NA NA NA NA NA\nC66 33,9 58 65 10 11 14 12\nC72 28,9 74 -67 7 -31 NA NA\nC73 34,0 187 195 NA NA NA NA\nC76 34,0 115 23 31 11 8 -13\nC77 28,9 91 326 -1 7 -14 -14\nC78 36,0 100 NA NA NA NA NA\nC79 36,0 NA NA NA NA NA NA\nC80 34,0 12 -39 11 33 NT NT\nC81 34,0 210 164 26 43 15 32\nmediana 33,9 115,0 157,0 10,1 9,8 -4,0 -12,0\n(min-max) (13,9-36) (12-1125) (-67-588) (-25-45) (-31-50) (-25-15) (-30-32)\nestímuloCTR % bloqueio para \nMICA em K562 \nCD107a (MFI )\nestímuloestímulo\ncélulas CD56brightCD16-\nIFN-γ (MFI) IL-10 (MFI )\n \nCTR: grupo controle com numeração dos diferentes participantes de pesquisa; NK totais: incluem as subpopulações \nCD56dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); min: valor mínimo; max: valor máximo; K562: estímulo com células K562 \ndescontado o valor basal (sem estímulo); K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína \nMICA, descontado o valor basal (sem estímulo); NT: não testado; NA: não analisado - número de eventos \nadquiridos no citômetro não atingiu o valor de corte (≥ 100); valores negativos: valores onde o valor basal, sem \nestímulo, foi maior do que com estímulo. \n\n234 \n \nTabela 4. Análise de correlação entre a frequência de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, ou entre a intensidade de \nsua expressão, em subpopulações de células NK circulantes, com os níveis de MICA solúvel de mulheres com endometriose e de co ntroles, na \ncondição basal de cultura, sem estímulo. \n \nA) Grupo endometriose \nSubpopulações\nEDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0393 0,5 21 ns ns 18 ns ns 18 ns ns\nCD56bright 18 ns ns 18 ns ns 18 ns ns 18 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0277 0,5 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nSubpopulações\nEDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns 18 ns ns\nCD56bright 18 ns ns 18 ns ns 18 ns ns 18 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nSem estímulo (intensidade de expressão, MFI) \nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP\nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP\nSem estímulo (% de células com expressão) \nIL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FPIFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP\n \n \nEDT: grupo endometriose; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; sMICA: MICA \nsolúvel; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número de pares de dados analisados para cada subpopulação ; FP: fluido \nperitoneal; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) ; em negrito: valores de p significantes (p<0,05) e respectivos valores de r; em \nnegrito e sublinhado: correlações diferenciais entre o grupo EDT e grupo controle; ns: não significante (p≥ 0,05); as análises foram realizadas a partir de valores da \nmediana da porcentagem e da MFI de expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, nas diferentes subpopulações de NK; níveis de sMICA analisados por \nELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. \n \n\n235 \n \nContinuação Tabela 4. Análise de correlação entre a frequência de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, ou \nentre a intensidade de sua expressão, em subpopulações de células NK circulantes, com os níveis de MICA solúvel de mulheres com \nendometriose e de controles, na condição basal de cultura, sem estímulo \n \nB) Grupo controle \nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 17 0,0316 0,5 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dim 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56bright 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 17 0,0249 0,6 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56brightCD16+ 9 ns ns 9 ns ns 9 ns ns 9 ns ns 8 ns ns 8 ns ns\nCD56brightCD16- 15 ns ns 15 ns ns 13 ns ns 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns\nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dim 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56bright 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56brightCD16+ 9 ns ns 9 ns ns 9 ns ns 9 ns ns 8 ns ns 8 ns ns\nCD56brightCD16- 15 ns ns 15 ns ns 13 ns ns 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns\nSem estímulo (intensidade de expressão, MFI) \nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP\nIL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FPCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP\nSem estímulo (% de células com expressão) \n \n \nCTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; sMICA: MICA \nsolúvel; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: número de pares de dados analisados para cada subpopulação ; \nFP: fluido peritoneal; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) ; em negrito: valores de p significantes ( p<0,05) e \nrespectivos valores de r; em negrito e sublinhado: correlações diferenciais entre o grupo EDT e grupo controle ns: não signif icante (p≥ 0,05); as análises \nforam realizadas a partir de valores da mediana da porcentagem e da MFI de expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, nas diferentes \nsubpopulações de NK; níveis de sMICA analisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo t este de correlação de \nSpearman. \n\n236 \n \nTabela 5. Análise de correlação entre a frequência de células com expressão das moléculas \nCD107a, IFN-y e IL -10, e de suas intensidades de expressão, em subpopulações de células \nNK circulantes, com os ní veis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal, de mulheres \ncom endometriose e de controles, na condição com estímulo com células K562. \n \nA) Grupo endometriose \nSubpopulações\nEDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0279 -0,5 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0373 -0,5 18 ns ns 18 ns ns\nCD56bright 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0468 -0,4 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0076 -0,6 17 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 0,0413 -0,5 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nSubpopulações\nEDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0279 -0,5 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0434 -0,4 18 ns ns 18 ns ns\nCD56bright 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0488 -0,4 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0435 -0,5 17 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nIL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP\nIFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) \nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP\nEstímulo com K562 (% de células com expressão)\nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP\n \n \nB) Grupo controle \nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dim 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56bright 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 0,0032 -0,7 13 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 15 0,0190 -0,6 15 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 14 ns ns 14 ns ns\nCD56brightCD16+ 8 ns ns 8 ns ns 8 ns ns 8 ns ns 7 ns ns 7 ns ns\nCD56brightCD16- 15 ns ns 15 ns ns 13 ns ns 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns\nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dim 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56bright 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 15 ns ns 15 ns ns\nCD56dimCD16- 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 17 ns ns 14 ns ns 14 ns ns\nCD56brightCD16+ 8 ns ns 8 ns ns 8 ns ns 8 ns ns 7 ns ns 7 ns ns\nCD56brightCD16- 15 ns ns 15 ns ns 13 0,0140 -0,7 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI) \nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP\nIL-10 x sMICA FP\nEstímulo com K562 (% de células com expressão)\nIFN-γ x sMICA FPCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IL-10 x sMICA soro\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpo pulações CD56dimCD16+, CD56dimCD16-, \nCD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+, sMICA: MICA solúvel, MFI: mediana de intensidade de fluorescência \n(intensidade de expressão), K562: estímulo com células K562 , n: número de pares de dados analisados para cad a \nsubpopulação; FP: fluido peritoneal, NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) , em \nnegrito: valores de p significantes ( p<0,05) e respectivos valores de r, em negrito e sublinhado: correlações \ndiferenciais entre o grupo EDT e g rupo controle ns: não significante (p≥ 0,05); as análises foram realizadas a partir \nde valores de mediana da porcentagem de células com expressão e da MFI das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, \nnas diferentes subpopulações de NK; níveis de sMICA analisados p or ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r \ndeterminados pelo teste de correlação de Spearman. \n\n237 \n \nTabela 6. Análise de correlação das frequências de células com expressão das moléculas \nCD107a, IFN-y e IL -10, e de suas intensidades de expressão, em subp opulações de células \nNK circulantes, com os níveis de MICA solúvel, no soro e no fluido peritoneal, de mulheres \ncom endometriose e controles, na condição com estímulo com células K562 bloqueadas para \nMICA. \n \nA) Grupo endometriose \nSubpopulações\nEDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 0,0366 -0,5 21 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 18 0,0427 -0,5 18 ns ns\nCD56bright 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 0,0192 -0,5 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 0,0444 -0,5 17 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nSubpopulações\nEDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r EDT p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dim 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 21 ns ns 18 ns ns 18 ns ns\nCD56bright 16 ns ns 16 0,0057 -0,7 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nCD56dimCD16+ 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56dimCD16- 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 20 ns ns 17 ns ns 17 ns ns\nCD56brightCD16+ 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 16 0,0390 -0,5 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) \nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP\nIL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FPCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFN-γ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP\nEstímulo com K562BLOQ (% de células com expressão)\n \n \nB) Grupo controle \nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nCD56dim 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 0,0175 -0,6 13 ns ns\nCD56bright 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 12 ns ns 12 ns ns\nCD56dimCD16+ 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 12 0,0455 -0,6 12 ns ns\nCD56dimCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 ns ns 13 ns ns\nCD56brightCD16+ 7 ns ns 7 0,0476 0,8 7 ns ns 7 ns ns 5 ns ns 5 ns ns\nCD56brightCD16- 13 ns ns 13 ns ns 12 ns ns 12 ns ns 10 ns ns 10 ns ns\nSubpopulações\nCTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r CTR p r\n (n) (n) (n) (n) (n) (n)\nNK totais 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 0,0105 -0,7 13 ns ns\nCD56dim 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 0,0152 -0,7 13 ns ns\nCD56bright 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 12 ns ns 12 ns ns\nCD56dimCD16+ 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 15 ns ns 12 0,0417 -0,6 12 ns ns\nCD56dimCD16- 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 16 ns ns 13 0,0012 -0,7 13 ns ns\nCD56brightCD16+ 7 ns ns 7 ns ns 7 ns ns 7 ns ns 5 ns ns 5 ns ns\nCD56brightCD16- 13 ns ns 13 ns ns 12 0,0152 -0,7 12 ns ns 10 ns ns 10 ns ns\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI) \nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IFNγ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP IL-10 x sMICA soro IL-10 x sMICA FP\nIL-10 x sMICA FP\nEstímulo com K562BLOQ (% de células com expressão)\nCD107a x sMICA soro CD107a x sMICA FP IL-10 x sMICA soroIFNγ x sMICA soro IFN-γ x sMICA FP\n \n \nEDT: grup o endometriose; CTR: grupo controle; NK: células Natural Killer ; NK totais: incluem as subpopulações \nCD56dimCD16+, CD56dimCD16-, CD56brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56-CD16+; sMICA: MICA solúvel; K562BLOQ: \ncélulas K562 bloqueadas para MICA; MFI: mediana de intensidade de fluorescência (intensidade de expressão); n: \nnúmero de pares de dados analisados para cada subpopulação ; FP: fluido peritoneal; NA: amostras não analisadas \n(< 100 eventos na aquisição do citômetro) ; em negrito: valores de p significantes (p<0,05) e respectivos valores de \nr; em negrito e sublinhado: correlações diferenciais entre o grupo EDT e grupo controle ns: não significante (p≥ \n0,05); as análises foram realizadas a partir de valores de mediana da porcentagem de células com expressão das \nmoléculas CD107a, IFN -y e IL -10 e de suas MFIs, nas diferentes subpopulações de NK; níveis de sMICA \nanalisados por ELISA (Resultados, item 4.3); valores de p e r determinados pelo teste de correlação de Spearman. \n \n\n238 \n \nTabela 7. Comparações das frequências de c élulas com expressão das moléculas CD107a, \nIFN-y e IL-10, e de suas intensidades de expressão, nas diferentes subpopulações de células \nNK circulantes de mulheres com endometriose e controles, entre as fases proliferativa e \nsecretora do ciclo menstrual, na condição basal de cultura, sem estímulo. \n \nA) Grupo endometriose \n \nEDT\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 8 9,9 13 7,4 ns 8 1,5 13 1,7 ns 5 0,6 12 0,8 ns\nCD566dim 8 9,5 13 7,6 ns 8 2,2 13 1,8 ns 6 0,7 12 0,9 ns\nCd56bright 6 5,4 12 5,1 ns 6 1,2 12 1,7 ns 5 0,0 11 0,4 ns\nCD56dimCD16+ 8 8,7 12 10,4 ns 8 3,1 12 2,1 ns 6 0,8 11 0,9 ns\nCD56dimCD16- 8 13,7 12 11,2 ns 8 1,5 12 1,9 ns 6 0,7 11 1,1 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 2 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 5,9 11 5,5 ns 5 2,7 11 2,9 ns 4 0,9 9 1,4 ns\nEDT\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 8 361 13 358 ns 8 96 13 71 ns 5 125 12 127 ns\nCD56dim 8 350 13 350 ns 8 96 13 71 ns 6 109 12 119 ns\nCd56bright 6 455 12 478 ns 6 99 12 69 ns 4 127 11 162 ns\nCD56dimCD16+ 8 366 12 347 ns 8 100 12 67 ns 6 47 11 121 ns\nCD56dimCD16- 8 335 12 282 ns 8 87 12 78 ns 6 148 11 143 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 2 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 434 11 476 ns 5 95 11 68 ns 4 157 9 158 ns\n Sem estímulo (% células com expressão) \np\nProlif \nIFN-γ IL-10CD107a\np\nSecret\n Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nSecret Prolif Secret\np\nProlif \nProlif Secret\np\nProlif Secret\np\nProlif Secret\np\n \n \nB) Grupo controle \n \nCTR\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 11 9,2 9 7,8 ns 11 0,9 9 1,5 ns 8 0,7 8 0,5 ns\nCD566dim 11 10,6 9 12 ns 11 1,0 9 1,7 ns 8 0,7 8 0,6 ns\nCd56bright 9 4,8 9 6,9 ns 9 0,9 9 1,1 ns 8 0,6 8 0,9 ns\nCD56dimCD16+ 10 10,8 9 8,1 ns 10 1,3 9 2,1 ns 8 0,6 8 0,6 ns\nCD56dimCD16- 10 18,1 9 18,3 ns 10 1,1 9 1,5 ns 8 0,7 8 1,1 ns\nCD56brightCD16+ 5 NA 4 NA NA 5 NA 4 NA NA 5 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 9 5,1 8 6,5 ns 8 0,5 7 0,3 ns 7 0,8 6 0,7 ns\nCTR\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 11 355 9 310 ns 11 106 9 94 ns 8 17 8 67 ns\nCD566dim 11 350 9 305 ns 11 106 9 93 ns 8 15 8 57 ns\nCd56bright 9 466 9 444 ns 9 113 9 87 ns 8 132 8 135 ns\nCD56dimCD16+ 10 335 9 305 ns 10 98 9 80 ns 8 3 8 32 ns\nCD56dimCD16- 10 347 9 331 ns 10 149 9 105 ns 8 139 8 140 ns\nCD56brightCD16+ 5 NA 4 NA NA 5 NA 4 NA NA 5 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 9 471 8 435 ns 8 118 7 94 ns 7 168 6 141 ns\nCD107a IL-10\n Sem estímulo (% células com expressão) \nIFN-γ\nSecret p Prolif Secret p\n Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nProlif Secret p Prolif Secret p Prolif Secret p\nProlif Secret p Prolif \n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Prolif: fase pr oliferativa do ciclo menstrual (1º ao \n14º dia do ciclo); Secret: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); med: mediana; ns: valores de p não significantes(p≥ 0,05); n: número de \namostras analisadas para cada subpopulação de células NK; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na \naquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n\n239 \n \nTabela 8. Comparações das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-10, e de suas intensidades de expressão, \nnas diferentes subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas fases proliferativa e secretora do \nciclo menstrual, na condição basal de cultura, sem estímulo. \n \nA) CD107a B) IFN-y C) IL-10 \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 9,9 11 9,2 ns 13 7,4 9 7,8 ns\nCD566dim 8 9,5 11 10,6 ns 13 7,6 9 11,8 ns\nCd56bright 6 5,4 9 4,8 ns 12 5,1 9 6,9 ns\nCD56dimCD16+ 8 8,7 10 10,8 ns 12 10,4 9 8,1 ns\nCD56dimCD16- 8 13,7 10 18,0 ns 12 11,2 9 18,3 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 5 NA NA 4 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 5 5,9 9 5,1 ns 11 5,5 8 6,5 ns\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 361 11 355 ns 13 358 9 310 ns\nCD566dim 8 350 11 350 ns 13 350 9 305 ns\nCd56bright 6 455 9 466 ns 12 478 9 444 ns\nCD56dimCD16+ 8 366 10 335 ns 12 347 9 305 ns\nCD56dimCD16- 8 335 10 347 ns 12 282 9 331 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 5 NA NA 4 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 5 434 9 471 ns 11 476 8 435 ns\n Sem estímulo (% de células com expressão) \n Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\nPROLIFERATIVA CD107a SECRETORA CD107a\nSECRETORA CD107aPROLIFERATIVA CD107a\n \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 1,5 11 0,9 ns 13 1,7 9 1,5 ns\nCD566dim 8 2,2 11 1,0 0,0252 13 1,8 9 1,7 ns\nCd56bright 6 1,2 9 0,9 ns 12 1,7 9 1,1 ns\nCD56dimCD16+ 8 3,1 10 1,3 ns 12 2,1 9 2,1 ns\nCD56dimCD16- 8 1,9 10 1,1 ns 12 1,9 9 1,5 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 5 NA NA 4 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 2,7 8 0,5 0,0101 11 2,9 7 0,3 0,0041\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 96 11 106 ns 13 71 9 94 ns\nCD566dim 8 95 11 106 ns 13 71 9 93 ns\nCd56bright 6 99 9 113 ns 12 69 9 87 ns\nCD56dimCD16+ 8 100 10 98 ns 12 67 9 80 ns\nCD56dimCD16- 8 87 10 149 ns 12 78 9 105 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 5 NA NA 4 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 95 8 118 ns 11 68 7 94 ns\n Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\n Sem estímulo (% de células com expressão) \nPROLIFERATIVA IFN- γ SECRETORA IFN-γ\nPROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 5 0,6 8 0,7 ns 12 0,8 8 0,5 ns\nCD566dim 6 0,7 8 0,7 ns 12 0,9 9 0,6 ns\nCd56bright 4 0,4 8 0,6 ns 11 0,4 7 1,5 ns\nCD56dimCD16+ 6 0,8 8 0,6 ns 11 0,9 8 0,6 ns\nCD56dimCD16- 6 0,7 8 0,6 ns 11 1,1 8 1,3 ns\nCD56brightCD16+ 2 NA 5 NA NA 4 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 4 0,9 7 0,9 ns 9 1,3 6 0,7 ns\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 5 125 8 17 ns 12 127 8 67 ns\nCD566dim 6 109 8 15 ns 12 119 8 57 ns\nCd56bright 4 127 8 132 ns 11 162 8 135 ns\nCD56dimCD16+ 6 47 8 15 ns 11 121 8 32 ns\nCD56dimCD16- 6 148 8 139 ns 11 143 8 140 ns\nCD56brightCD16+ 2 NA 5 NA NA 4 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 4 157 7 168 ns 9 158 6 141 ns\n Sem estímulo (% de células com expressão) \nPROLIFERATIVA IL-10\n Sem estímulo (intensidade de expressão, MFI)\nPROLIFERATIVA IL-10 SECRETORA IL-10\nSECRETORA IL-10 \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; \nProliferativa: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Secretora: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); med: mediana, ns: valores de p não significantes (p≥ 0,05); em vermelho: maior valor de mediana na análise entre os grupos; negrito: \nvalor de p significante; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro) ; \nvalores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n \n\n240 \n \nTabela 9. Comparações das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, \nIFN-y e IL-10, e de suas intensidades de expressão, nas diferentes subpopulações de células \nNK circulantes de mulheres c om endometriose e controles, entre as fases proliferativa e \nsecretora do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562. \n \nA) Grupo endometriose \n \nEDT\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 8 14,5 13 14,5 ns 8 2,5 13 3,9 ns 5 0,3 12 -0,11 ns\nCD566dim 8 17,1 13 13,3 ns 8 3,1 13 4,1 ns 6 0,45 12 -0,4 0,0302\nCd56bright 5 19,9 12 17,9 ns 5 4,3 12 4,1 ns 4 0,4 11 0,1 ns\nCD56dimCD16+ 8 19,8 12 24,3 ns 8 4,6 12 2,4 ns 6 0,7 11 0,3 ns\nCD56dimCD16- 8 15,1 12 21,0 ns 8 3,8 12 6,5 ns 6 -0,1 11 0,2 ns\nCD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 14,6 11 21,3 ns 5 3,4 11 6,5 ns 4 -0,5 9 0,1 ns\nEDT\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 8 40 13 73 ns 8 -4 13 1 ns 5 -13 12 5 ns\nCD566dim 8 39 13 81 ns 8 -2 13 13 ns 6 -6 12 1 ns\nCd56bright 5 112 12 49 ns 5 -9 12 -1 ns 4 -22,1 11 -10 ns\nCD56dimCD16+ 8 44 12 59 ns 8 -5 12 -2 ns 6 0 11 0 ns\nCD56dimCD16- 8 79 12 113 ns 8 3 12 10 ns 6 -7 11 -13 ns\nCD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 130 11 53 ns 5 -9 11 2 ns 4 -20,5 9 -6 ns\nEstímulo com K562 (% de células com expressão) \nProlif Secret\np\nIFN-γ\nProlif Secret\np\nIL-10\nProlif Secret\np\np\nProlif Secret\np\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\nProlif Secret\np\nProlif Secret\nCD107a\n \n \nB) Grupo controle \n \nCTR\nSubpopulações Prolif Secret\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 11 18,2 9 21,2 ns 11 4,6 9 4,2 ns 8 0,2 8 0,1 ns\nCD566dim 11 21,3 9 21,9 ns 11 4,9 9 4,2 ns 8 0,5 8 -0,2 ns\nCd56bright 9 20,1 8 31,5 ns 9 5,7 8 4,5 ns 7 0,6 7 -0,6 ns\nCD56dimCD16+ 9 29,1 9 28,2 ns 9 4,1 9 1,9 ns 8 0,7 8 0,0 0,0281\nCD56dimCD16- 10 15,9 9 16,2 ns 10 8,9 9 5,9 ns 8 0,3 7 -0,4 ns\nCD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA 4 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 9 28,4 8 38,0 ns 8 8,5 7 4,7 ns 7 -0,01 6 -0,01 ns\nCTR\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 11 89 9 108 ns 11 25 9 13 ns 8 14 8 0 ns\nCD566dim 11 86 9 107 ns 11 26 9 14 ns 8 13 8 0 ns\nCd56bright 9 96 8 148 ns 9 17 8 10 ns 7 5 7 0 ns\nCD56dimCD16+ 9 76 9 75 ns 9 23 9 16 ns 8 0 8 0 ns\nCD56dimCD16- 10 128 9 98 ns 10 6 9 16 ns 8 -1 7 -6 ns\nCD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA 4 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 9 114 8 157 ns 8 11 7 10 ns 7 -14 6 -1 ns\nIL-10IFN-γ\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\np pp\nEstímulo com K562 (% de células com expressão) \nCD107a\np Prolif Secret pProlif Secret p Prolif Secret\nProlif Secret Prolif Secret\n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Prolif: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao \n14º dia do ciclo); Secret: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo com K562: valores do \nestímulo com células K562 descontado o valor basal, descontado o valor basal (sem estímulo); valores negativos: \nvalores onde o valor basal foi maior do que com estímulo; MFI: mediana de intensidade de fluorescência \n(intensidade de expressão); med: mediana, ns: valor es de p não significantes(p≥ 0,05); em negrito: valores de p \nsignificantes (p<0,05); em vermelho: valor de maior mediana na comparação entre os grupos analisados; n: número \nde amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: amostras não anali sadas (< 100 eventos na \naquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n\n241 \n \nTabela 10 . Comparações das frequências de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, e de suas intensidades de \nexpressão, nas diferentes subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas fases proliferativa e \nsecretora do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562. \n \n A) CD107a B) IFN-y C) IL-10 \n \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 14,5 11 18,2 ns 13 14,5 9 21,2 ns\nCD566dim 8 17,1 11 21,3 ns 13 13,3 9 21,9 ns\nCd56bright 5 19,9 9 20,1 ns 12 17,9 8 31,5 ns\nCD56dimCD16+ 8 19,8 9 29,1 ns 12 24,3 9 28,2 ns\nCD56dimCD16- 8 15,1 10 15,9 ns 12 18,5 9 16,2 ns\nCD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 14,6 9 28,4 ns 11 21,3 8 38,0 ns\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 40 11 89 ns 13 73 9 108 ns\nCD566dim 8 39 11 86 ns 13 81 9 107 ns\nCd56bright 5 112 9 96 ns 12 49 8 148 0,0032\nCD56dimCD16+ 8 44 9 76 ns 12 59 9 75 ns\nCD56dimCD16- 8 79 10 128 0,195 12 113 9 98 ns\nCD56brightCD16+ 4 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 130 9 114 0,974 11 53 8 157 0,0259\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nEstímulo K562 (% de células com expressão) \nPROLIFERATIVA CD107a SECRETORA CD107a\nSECRETORA CD107aPROLIFERATIVA CD107a \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 2,5 11 4,9 ns 13 3,9 9 4,2 ns\nCD566dim 8 3,1 11 4,9 ns 13 4,1 9 4,2 ns\nCd56bright 5 4,3 9 5,7 ns 12 4,0 8 4,5 ns\nCD56dimCD16+ 8 4,6 9 4,1 ns 12 2,4 9 1,9 ns\nCD56dimCD16- 8 3,8 10 8,9 ns 12 7,2 9 5,9 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 3,4 8 8,5 ns 11 6,5 7 4,7 ns\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 -4 11 25 ns 13 1 9 13 ns\nCD566dim 8 -2 11 26 ns 13 1 9 14 ns\nCd56bright 5 -9 9 17 0,019 12 -1 8 10 ns\nCD56dimCD16+ 8 -5 9 23 ns 12 -2 9 16 ns\nCD56dimCD16- 8 3 10 6 ns 12 10 9 16 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 4 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 -9 8 11 0,0186 11 2 7 10 ns\nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nEstímulo K562 (% de células com expressão) \nPROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ\nPROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 5 0,3 8 0,2 ns 12 -0,1 8 0,1 ns\nCD566dim 6 0,5 8 0,5 ns 12 -0,4 8 -0,2 ns\nCd56bright 4 0,4 7 0,56 ns 11 0,11 7 -0,6 ns\nCD56dimCD16+ 6 0,7 8 0,7 ns 11 -0,3 8 0,0 ns\nCD56dimCD16- 6 -0,01 8 0,3 ns 11 -0,1 7 -0,4 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 4 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 4 -0,5 7 0,0 ns 9 R$0,1 6 -0,01 ns\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 5 -13 8 14 0,0295 12 5 8 0 ns\nCD566dim 6 -6 8 13 ns 12 1 8 0 ns\nCd56bright 4 -22 7 5 ns 11 -10 7 0 ns\nCD56dimCD16+ 6 0 8 0 ns 11 0 8 0 ns\nCD56dimCD16- 6 -7 8 -1 ns 11 -13 7 -6 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 4 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 4 -21 7 -14 ns 9 -6 6 -1 ns\nEstímulo K562 (% de células com expressão) \nEstímulo com K562 (intensidade de expressão, MFI)\nPROLIFERATIVA IL-10 SECRETORA IL-10\nPROLIFERATIVA IL-10 SECRETORA IL-10 \n \nEDT: grupo endom etriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; \nProliferativa: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Secretora: fase secretora do ciclo me nstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo com células K562: \nvalores do estímulo descontado o valor basal (sem estímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo ; MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); med: mediana, ns: valores de p não significantes ( p≥ 0,05); em negrito: valores de p significantes (p<0,05); em vermelho: valor de \nmaior mediana na comparação entre os grupos analisados; n: número de amostras analisadas para cada subpopula ção de células NK ; NA: amostras não analisadas (< 100 \neventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n \n\n242 \n \nTabela 11. Comparações das porcentagens de expressão das moléculas CD107a, IFN-y e IL-\n10, e de suas intensidad es de expressão, nas diferentes subpopulações de células NK \ncirculantes de mulheres com endometriose e controles, entre as fases proliferativa e secretora \ndo ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. \n \nA) Grupo endometriose \n \nEDT\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 8 17,4 13 15,9 ns 8 3,0 13 2,9 ns 5 -0,2 12 -0,3 ns\nCD566dim 8 19,4 13 16,8 ns 8 3,1 13 3,1 ns 6 -0,1 12 -0,1 ns\nCd56bright 6 22,6 11 15,6 ns 6 3,4 11 4,8 ns 4 0,1 10 -0,1 ns\nCD56dimCD16+ 8 31,7 12 18,4 ns 8 4,3 12 0,2 ns 6 -0,1 11 0,1 ns\nCD56dimCD16- 8 18,1 12 18,5 ns 8 4,0 12 7,2 ns 6 -0,2 11 -0,1 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 3 NA NA 2 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 5 25,9 11 24,1 ns 5 4,5 11 2,9 ns 4 -0,4 9 -0,6 ns\nEDT\nSubpopulações Prolif Secret p Prolif p Prolif p\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 8 70 13 46 ns 8 -2 13 4 ns 5 -16 12 0 ns\nCD566dim 8 77 13 64 ns 8 -1 13 4 ns 6 0 12 3 ns\nCd56bright 6 91 11 57 ns 6 -4 11 -0,2 ns 4 -19 10 -12 ns\nCD56dimCD16+ 8 79 12 48 ns 8 -1 12 1 ns 6 0 11 3 ns\nCD56dimCD16- 8 129 12 122 ns 8 4,0 12 13 ns 6 -6 11 -6 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 3 NA NA 2 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 5 112 11 54 ns 5 2,2 11 2 ns 4 -12 9 -14 ns\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nEstímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) \nIFN-γ\nProlif Secret\np\nProlif Secret \np\nProlif Secret \np\nIL-10\nCD107a IFN-γ IL-10\nSecret Secret \nCD107a\n \n \nB) Grupo controle \n \nCTR\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 10 16,8 9 17,8 ns 10 4,3 9 4,5 ns 7 0,2 7 0,3 ns\nCD566dim 10 14,4 9 24,9 ns 10 5,2 9 4,4 ns 7 0,5 7 0,3 ns\nCd56bright 8 21,1 9 28,7 ns 8 10,1 9 5,4 ns 6 0,4 7 -0,7 ns\nCD56dimCD16+ 8 24,8 9 25,8 ns 8 5,5 9 1,6 ns 6 0,5 7 0,2 ns\nCD56dimCD16- 9 13,3 9 18,3 ns 9 1,7 9 6,2 ns 7 0,4 7 -0,1 0,62\nCD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 3 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 7 22,0 6 -0,01 0,0012 7 8,4 7 5,5 ns 5 0,0 6 -0,2 ns\nCTR\nSubpopulações\n(n) med (n) med (n) med (n) med (n) med (n) med\nNK totais 10 78 9 99 ns 10 22 9 -2 ns 7 16 7 24 ns\nCD566dim 10 86 9 100 ns 10 23 9 1 ns 7 15 7 27 ns\nCd56bright 8 46 9 168 ns 8 27 9 2 ns 6 17 7 -1 ns\nCD56dimCD16+ 8 107 9 94 ns 8 23 9 -3 ns 6 0 7 0 ns\nCD56dimCD16- 9 41 9 99 ns 9 14 9 3 ns 7 5 7 -12 0,0070\nCD56brightCD16+ 3 NA 4 NA NA 3 NA 4 NA NA 3 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 7 34 8 179,5 ns 7 11 7 1 ns 5 -13 6 -4 ns\nCD107a IFN-γ\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nCD107a IFN-γ IL-10\np\nIL-10\np Prolif Secret p\nProlif Secret\np\nProlif Secret\np\nProlif Secret\nProlif Secret p Prolif Secret\nEstímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) \n \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, \nCD56dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56 brightCD16-, CD56 -CD16+; Prolif: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao \n14º dia do ciclo); Se cret: fase secretora do ciclo menstrual (15º ao 28º dia do ciclo); estímulo com K562BLOQ: \nestímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA – valores descontado o valor basal (sem estímulo); \nvalores negativos: valores onde o valor basal foi maior d o que com estímulo ; MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); med: mediana; ns: valores de p não significantes ( p≥ 0,05); em negrito: \nvalores de p significantes ( p<0,05); em vermelho: valor de maior mediana na comparação entr e os grupos \nanalisados; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células NK ; NA: amostras não \nanalisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n\n243 \n \nTabela 12. Comparações das frequênc ias de células com expressão das moléculas CD107a, IFN -y e IL -10, e de suas intensidades de \nexpressão, nas diferentes subpopulações de células NK circulantes, entre mulheres com endometriose e controles, nas fases pro liferativa e \nsecretora do ciclo menstrual, na condição de estímulo com células K562 bloqueadas para MICA. \n \nA) CD107a B) IFN-γ C) IL-10 \n \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 17,4 10 16,8 ns 13 15,9 9 17,8 ns\nCD566dim 8 19,4 10 14,4 ns 13 16,8 9 24,9 ns\nCd56bright 6 22,6 8 21,1 ns 9 17,0 9 28,7 ns\nCD56dimCD16+ 8 31,7 8 24,8 ns 12 18,4 9 25,8 ns\nCD56dimCD16- 8 18,1 9 13,3 ns 12 21,0 9 18,3 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 25,9 7 22 ns 11 24,1 8 28,8 ns\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 70 10 78 ns 13 46 9 99 ns\nCD566dim 8 77 10 86 ns 13 64 9 100 ns\nCd56bright 6 91 8 46 ns 9 55 9 168 0,0336\nCD56dimCD16+ 8 79 8 107 ns 12 48 9 94 ns\nCD56dimCD16- 8 129 9 41 ns 12 122 9 99 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 112 7 34 ns 11 54 8 180 ns\nEstímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) \nPROLIFERATIVA CD107a SECRETORA CD107a\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nPROLIFERATIVA CD107a SECRETORA CD107a\n \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 3,1 10 4,3 ns 13 2,9 9 4,5 ns\nCD566dim 8 3,1 10 5,2 ns 13 3,1 9 4,4 ns\nCd56bright 6 3,4 8 10,1 ns 10 3,3 9 5,4 ns\nCD56dimCD16+ 8 4,3 8 5,5 ns 12 0,2 9 1,6 ns\nCD56dimCD16- 8 4,0 9 1,7 ns 12 6,5 9 6,2 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 4,5 7 8,4 ns 11 2,9 7 5,5 ns\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 8 -2 10 22 0,0010 13 4 9 -2 ns\nCD566dim 8 -1 10 23 0,0021 13 4 9 1 ns\nCd56bright 6 -4 8 31 0,0013 10 0 9 2 ns\nCD56dimCD16+ 8 -1 8 -22 0,0033 12 1 9 -3 ns\nCD56dimCD16- 8 4 9 14 ns 12 13 9 3 ns\nCD56brightCD16+ 3 NA 3 NA NA 3 NA 4 NA NA\nCD56brightCD16- 5 2 7 11 0,0051 11 2 7 1 ns\nPROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ\nEstímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) \nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nPROLIFERATIVA IFN-γ SECRETORA IFN-γ \nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 5 -0,2 7 0,2 ns 12 -0,1 7 0,3 ns\nCD566dim 6 -0,4 7 0,4 ns 12 -0,1 7 0,3 ns\nCd56bright 4 0,1 6 0,4 ns 9 -0,1 7 -0,7 ns\nCD56dimCD16+ 6 -0,1 6 0,5 ns 11 0,1 7 0,2 ns\nCD56dimCD16- 6 -0,2 7 0,4 ns 11 0,2 7 -0,1 ns\nCD56brightCD16+ 2 NA 3 NA NA 3 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 4 -0,4 5 0,0 ns 9 -0,6 6 -0,2 ns\nSubpopulações EDT CTR EDT CTR\n(n) med (n) med p (n) med (n) med p\nNK totais 5 -16 7 16 ns 12 0 7 24 ns\nCD566dim 6 -7 7 15 ns 12 3 7 27 ns\nCd56bright 4 -19 6 17 ns 9 -12 7 -0,6 ns\nCD56dimCD16+ 6 0 6 0 ns 11 3 7 0 0\nCD56dimCD16- 6 -6 7 5 0,0385 11 -6 7 -12 ns\nCD56brightCD16+ 2 NA 3 NA NA 3 NA 3 NA NA\nCD56brightCD16- 4 -12 5 -13 ns 9 -14 6 -4 ns\nEstímulo com K562BLOQ (intensidade de expressão, MFI)\nSECRETORA IL-10PROLIFERATIVA IL-10\nEstímulo com K562BLOQ (% de células com expressão) \nPROLIFERATIVA IL-10 SECRETORA IL-10 \n \nEDT: grupo endometriose; CTR: grupo controle; NK totais: incluem as subpopulações CD56 dimCD16+, CD56 dimCD16-, CD56 brightCD16+, CD56brightCD16-, CD56 -CD16+; \nProliferativa: fase proliferativa do ciclo menstrual (1º ao 14º dia do ciclo); Secretora: fase secretora do ciclo menstrual ( 15º ao 28º dia do ciclo); MFI: mediana de intensidade de \nfluorescência (intensidade de expressão); es timulo com K562BLOQ: estímulo com células K562 bloqueadas para a proteína MICA – valores descontado o valor basal (sem \nestímulo); valores negativos: valores onde o valor basal foi maior do que com estímulo ; med: mediana, ns: valores de p não significantes (p≥ 0,05); em negrito, valores de p \nsignificantes (p<0,05); em vermelho: valor de maior mediana na comparação entre os grupos analisados; n: número de amostras analisadas para cada subpopulação de células \nNK; NA: amostras não analisadas (< 100 eventos na aquisição do citômetro); valores de p determinados pelo teste de Mann-Whitney. \n\n244 \n \nTabela 13. Frequência e intensidade de expressão de MICA nas células K562 e células K562 \nbloqueadas para MICA, e a análise da efetividade do bloqueio, utilizadas nos ensaios de \ncitotoxicidade de células NK. \n \n \n \nExperimento Células \nVivas \nCélulas \nVivas \n% expressão \n(%)\nMFI % expressão \n(%)\nMFI expressão \n(%)\nMFI \n(%)\n1 84,7 38,8 1914 92,8 25,4 1487 34,5 22,3\n2 74,6 67,4 2679 80,2 30,8 1806 54,3 32,6\n3 92,7 78,0 2293 91,8 68,2 1559 12,6 32,0\n4 91,0 80,2 2181 92,6 75,2 1723 6,2 20,9\n5 94,0 51,5 1537 95,7 28,8 1036 44,1 32,6\n6 96,2 39,7 964 93,5 22,5 734 43,0 23,9\n7 95,4 21,7 406 96,7 13,1 125 39,6 69,2\n8 91,7 81,7 2024 92,3 49,2 1114 39,8 44,9\n9 85,3 40,1 742 77,9 16,1 265 59,9 64,1\nMediana 91,7 51,5 1914 92,6 28,8 1114 39,8 32,6\n(min-max) (84,7-96,2) (21,7-81,7) (742-2679) (77,9-96,7) (13,1-75,2) (125-1806) (6,2-59,9) (22,3-69,2)\n K562*CFSE K562*CFSEBLOQ\n MICA MICA\nEfetividade do bloqueio \npara MICA\n \nMFI: mediana de intensidade de fluorescência; K562*CFSE: células K562 marcadas com o corante \nfluorescente CFSE; K562*CFSEBLOQ: células K562 marcadas com CFSE e bloqueadas para a molécula \nMICA; CFSE: do inglês -Carboxyfluorescein succinimidyl ester; min: valor mínimo da mediana; max: valor \nmáximo da mediana; a viabilidade celular foi avaliada utilizando-se o marcador LIVE/DEAD™ FixableAqua \n(descrito em Métodos, item 3.9.1). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n245 \n \nTabela 14. Citotoxicidade de células NK circulantes de mulheres com endometriose e \ncontroles contra células K562 e células K562 bloqueadas para a proteína MICA, e \nporcentagens de bloqueio de MICA em células K562 usadas, para cada amostra. \n \nK562 K562BLOQ\nC27 44,1 19,0 11,5\nC28 43,0 8,2 6,7\nC29 NT 7,3 0,5\nC30 6,2 11,6 9,6\nC32 54,3 9,0 18,0\nC33 34,5 11,4 27,9\nC35 6,2 10,7 6,9\nC38 12,6 2,7 2,0\nC39 NT 0,5 13,2\nC42 44,1 35,2 12,0\nC43 44,1 29,9 13,0\nC44 44,1 29,3 14,9\nC66 44,1 9,4 9,2\nC72 43,0 7,9 12,0\nC73 59,9 18,4 12,9\nC76 59,9 9,1 3,3\nC77 43,0 25,0 27,7\nC78 NT 17,6 13,4\nC79 NT 15,5 18,0\nC80 59,9 17,4 34,9\nMediana 44,1 11,5 12,5\n(min-max) (6,2-59,9) (0,5-35,2) (0,5-34,9)\n% CTX \nCTR\n% bloqueio \npara MICA \nem K562 \n \nK562 K562BLOQ\nP054 39,6 14,3 10,5\nP055 39,8 5,3 5,9\nP059 12,6 6,2 5,1\nP066 54,3 9,4 8,1\nP069 6,2 7,8 2,2\nP071 44,1 21,3 12,9\nP077 6,2 10,3 3,9\nP090 NT -1,6 -1,2\nP091 43,0 13,7 12,2\nP118 12,6 5,9 3,9\nP128 NT 4,8 -4,7\nP132 NT 6,3 26,3\nP137 12,6 7,0 3,7\nP139 40,0 8,2 9,8\nP140 39,6 12,7 7,7\nP141 39,8 6,0 6,1\nP145 6,2 10,3 5,1\nP146 34,5 29,1 55,4\nP147 39,8 2,8 5,3\nP148 39,8 1,8 3,8\nP155 54,3 7,7 14,9\nMediana 39,7 7,7 5,9\n(min-max) (6,2-55,3) (-1,6-29,1) (-4,7-55,4)\n% CTX % bloqueio \npara MICA \nem K562 \nEDT \nCTR: grupo controle com numeração do s diferentes participantes da pesquisa; EDT: grupo endometriose com \nnumeração dos diferentes participantes da pesquisa; CTX: citotoxicidade; % CTX: porcentagem de citotoxicidade \navaliada pela porcentagem de morte de células K562 em ensaio de cocultura; K562BLOQ: células K562 bloqueadas \npara a proteína MICA; valores de CTX contra K562 e K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; \nvalores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; NT: não testado; min: \nvalor mínimo; max: valor máximo. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n246 \n \n0 1 0 2 0 3 0 4 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n% d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2\ns M IC A p g /m L (s o ro )\n3 1,25\nC T R (n = 1 8 )A )\nr= 0 ,0 2\np = 0 ,9 5 1 1 (n s )\n \n0 1 0 2 0 3 0 4 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n2 0 0\n4 0 0\n6 0 0\n% d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2\ns M IC A p g /m L (F P )\n 3 1 ,2 5\nC T R (n = 1 8 )B )\nr= -0 ,2\np = 0 ,3 6 0 9 (n s ) \n0 1 0 2 0 3 0 4 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n% d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2\ns M IC A p g /m L (s o ro )\n3 1 ,2 5\nE D T (n = 2 1 )C )\nr= 0 ,0 4\np = 0 ,8 7 6 9 (n s )\n \n0 1 0 2 0 3 0 4 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n2 0 0\n4 0 0\n6 0 0\nE D T (n = 2 1 )\n% d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2\ns M IC A p g /m L (F P )\n 3 1 ,2 5\nD )\nr= 0 ,2\np = 0 ,4 8 0 6 (n s ) \n \nFigura 1. Análise de correlação entre a citotoxicidade de células NK circulantes de mul heres com \nendometriose e controles contra células K562 e níveis de MICA solúvel. EDT: grupo controle; CTR: grupo \ncontrole; FP: fluido peritoneal; sMICA: MICA solúvel; linha pontilhada: valor limite de corte para a detecção de \nsMICA; níveis de sMICA determi nados por ELISA; valores de CTX contra K562 descontado o valor de morte \nespontânea de K562; valores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; \nlinha pontilhada no eixo X: valor zero de % de células mortas; linha pontilhada no eixo Y: valor limite de corte para a \ndetecção de sMICA (31,25pg/mL); níveis de sMICA determinados por ELISA; ns: valor de p não significante ( p≥ \n0,05); valores de p determinados pelo teste de correção de Spearman. \n \n \n0 1 0 2 0 3 0 4 0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n% d e m o r te d e c é lu la s K 5 6 2 B L O Q\ns M IC A p g /m L (s o ro )\n3 1 ,2 5\nC T R (n = 1 8 )A )\nr= 0 ,0 3\np = 0 ,8 8 3 3 (n s )\n \n0 1 0 2 0 3 0 4 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n2 0 0\n4 0 0\n6 0 0\n% d e m o r te d e c é lu la s K 5 6 2 B L O Q\ns M IC A p g /m L (F P )\n3 1 ,2 5\nC T R (n = 1 8 )B )\nr= -0 ,5\np = 0 ,0 5 3 8 (n s ) \n0 2 0 4 0 6 0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n% d e m o rte d e c é lu la s K 5 6 2 B L O Q\ns M IC A p g /m L (s o ro )\n3 1 ,2 5\nE D T (n = 2 1 )\nr= 0 ,1\np = 0 ,6 8 0 7 (n s )\nC )\n \n0 2 0 4 0 6 0\n0\n2 0\n4 0\n6 0\n8 0\n1 0 0\n2 0 0\n4 0 0\n6 0 0\n% d e m o r te d e c é lu la s K 5 6 2 B L O Q\ns M IC A p g /m L (F P )\n3 1 ,2 5\nE D T (n = 2 1 )\nr= -0 ,0 2\np = 0 ,9 1 7 0 (n s )\nD ) \n \nFigura 2. Análise de correlação entre a citotoxicidade de células NK circulantes de mulheres com \nendometriose e controles, contra células K562 bloqueadas para a proteína MICA, e níveis de MICA solúvel. \nEDT: grupo controle; CTR: grupo controle; FP: fluido peritoneal; sMICA: MICA solúvel; K562BLOQ: K562 \nbloqueadas para MI CA; valores de CTX contra K562BLOQ descontado o valor de morte espontânea de K562; \nvalores negativos: valores onde o valor de morte espontânea foi maior do que com estímulo ; linha pontilhada no \neixo X: valor zero de % de células mortas; linha pontilhada no eixo Y: valor limite de corte para a detecção de \nsMICA (31,25pg/mL); níveis de sMICA determinados por ELISA; ns: valor de p não significante (p≥ 0,05); valores \nde p determinados pelo teste de correção de Spearman. \n\n247 \n \nTabela 15. Análise de correlação entre a citotoxicidade de células NK circulantes frente a \ncélulas K562 e células K562 bloqueadas para MICA e os níveis de MICA solúvel (soro e fluido \nperitoneal) em mulheres com endometriose, de acordo com o estádio da doença. \n \nr p r p r p r p\n-0,3 0,6670 0,4 0,2712 0,3 0,3561 0,1 0,8857\nr p r p r p r p\n-0,2 0,7778 0,2 0,4599 0,2 0,5515 -0,3 0,4398\nCTX K562BLOQ\nI/II (n=9) III/IV (n=12)\nsMICA soro sMICA FP sMICA soro sMICA FP\nCTX K562\nI/II (n=9) III/IV (n=12)\nsMICA soro sMICA FP sMICA soro sMICA FP\n \n \nCTX: citotoxicidade; sMICA: MICA solúvel; FP: fluido peritoneal; I/II: estádios iniciais da endometriose; III/IV: \nestádios avançados da endometriose; estádios de acordo com a rASRM; K562BLOQ: células K562 bloqueadas \npara MICA; análise baseada nos valores de CTX contra K562 e K562BLOQ desc ontado o valor de morte \nespontânea de K562; valores de r e p determinados pelo teste de correlação de Spearman. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n___________________________________________REFERÊNCIAS \n \n \n \n\n249 \n \n7. 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