Determinação do perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de pacientes com endometriose e controles submetidas à estimulação ovariana e fertilização in vitro

KOOPMAN, L. O. Determination of the eicosanoid profile in the serum and follicular fluid of patients with endometriosis and controls undergoing ovarian stimulation and in vitro fertilization. 2023. Dissertation (Master's in Sciences - Graduate Program in Gynecology and Obstetrics, Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, São Paulo, 2023). Endometriosis is a highly prevalent disease among women of reproductive age and is often associated with infertility. However, the mechanisms involved in the pathogenesis of endometriosis-related infertility have not been fully elucidated. It is believed t hat oocyte quality plays an important role in the impairment of natural fertility in affected individuals, with systemic inflammation and oxidative stress being possible mediators of oocyte damage. In this regard, there is evidence of alterations in system ic and follicular inflammatory and oxidative stress markers in infertile women with the disease. Among the main mediators of the inflammatory response are eicosanoids, bioactive lipid molecules that regulate various pathophysiological processes, including folliculogenesis, oocyte maturation, and ovulation, and are produced in response to an inflammatory stimulus or exposure to reactive oxygen species. We questioned whether systemic inflammation and oxidative stress could modify the serum eicosanoid profile in these patients, which could be reflected in the lipid profile of the follicular microenvironment and impair oocyte quality. Therefore, the primary objective of this study is to compare the eicosanoid profile in the serum and follicular fluid of infertil e women with endometriosis and those with tubal and/or male factor infertility undergoing controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization . To achieve this, blood and follicular fluid samples from 18 infertile patients with endometriosis and 20 patients with tubal and/or male factor infertility were collected on the day of oocyte retrieval, stored at -80°C, and analyzed for eicosanoid profiles using electrospray ionization mass spectrometry (ESI -MS). When comparing the endometriosis and control groups, we did not observe a significant difference in the serum concentrations of the 5 detected eicosanoids, but we found higher follicular concentrations of Eicosapentaenoic Acid (EPA) in the endometriosis group. Upon subdividing the endometriosis group, we observed an increase in 5 -HETE in the serum of women with endometriosis without endometrioma compared to those with endometriosis with endometrioma, and an increase in EPA in the follicular fluid of women with endometriosis with endometrioma compared to controls. Correlation analysis showed a moderate positive association between serum 5 -HETE and follicular fluid 5 -HETE in the control group. Only weak correlations were observed between serum and follicular concentrations of eicosanoids and the outcomes of ART in both endometriosis and non -endometriosis groups. These findings contribute to the understanding of the mechanisms involved in endometriosis-related infertility and highlight the importance of eicosanoids in oocyte quality.

endometriosis, female infertility, eicosanoids, oocyte quality. LISTA DE FIGURAS Figura 1: metabolismo do ácido araquidônico (AA), gerando diferentes espécies de eicosanoides pelas vias enzimáticas COX, LOX e CYP, e pela via de oxidação não-enzimática (por ROS). Figura 2: metabolismo dos ácidos graxos poli -insaturados EPA e DHA, gerando diferen tes espécies de eicosanoides pela via enzimáticas da COX e LOX. Figura 3: fluxograma do estudo com o número de pacientes elegíveis, incluídas, excluídas e amostras coletadas e analisadas divididas em controle e endometriose. Figura 4: gráfico da concentração do eicosanoide 5-HETE nas amostras de soro dos grupos controle, endometriose sem OMA e endometriose com OMA. Figura 5: gráfico da concentração do eicosanoide EPA nas amostras de FF dos grupos controle, endometriose sem OMA e endometriose com OMA. LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Características clínicas: idade, IMC, tempo de infertilidade e FSH basal em pacientes controle e com endometriose. Tabela 2 – Resultados de TRA no grupo controle e endometriose: número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de embriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3. Tabela 3 – Resultados de TRA no grupo controle e endometriose: taxa de fertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, taxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos. Tabela 4 – Características clínicas: idade, IMC, tempo de infertilidade e FSH basal em pacientes controle, com endometriose sem endometrioma, e com endometriose com endometrioma. Tabela 5 – Resultados de TRA nos grupos controle, endometriose sem endometrioma e endometriose com endometrioma: número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de embriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3, número de embriões transferidos a fresco, número de sacos gestacionais, número de embriões com batimento cardíaco e número de nascidos vivos. Tabela 6 – Resultados de TRA nos grupos controle, endometriose sem endometrioma e endometriose com endometrioma: taxa de fertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, taxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos. Tabela 7 - Concentração de eicosanoides no soro. Concentração em picograma por mililitro (pg/mL) dos eicosanoides 5 -HETE, 11 -HETE, 15 -oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no soro de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Tabela 8 - Concentração de eicosanoides no soro de mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma, com endometriose com endometrioma, e controles inférteis. Tabela 9 - Concentração de eicosanoides no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Tabela 10 - Concentração de eicosanoides no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e controles inférteis. Tabela 11 - Valores do coeficiente de correlação de Spearman ent re as concentrações dos eicosanoides 5 -HETE, 11 -HETE, 15 -oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no soro com as concentrações de 5 -HETE, 11 -HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Tabela 12 - Valores do coeficiente de correlação de Spearman entre as concentrações dos eicosanoides 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15-HETE no soro de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Tabela 13 - Valores do coeficiente de correlação de S pearman entre as concentrações dos eicosanoides 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA, 15-HETE e PGE-2 no FF de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. LISTA DE ABREVIATURAS 5-HETE - ácido 5-hidroxieicosatetraenoico 11-HETE - ácido 11-hidroxieicosatetraenoico 15-HETE - ácido 11-hidroxieicosatetraenoico 15-oxo-ETE – ácido 15-oxoicosatetraenoico AA - Ácido araquidônico AG – Ácido graxo ASRM – Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva CC – Células dos cumulus Ceqil - Centro de Excelência em Quantificação e Identificação de Lipídios COC – Complexo oophorus-cumulus COX-1 – Ciclo-oxigenase-1 COX-2- Ciclo-oxigenase-2 CTEP - Contagem total de espermatozoides progressivos CYP – Citocromo P450 D1 - Primeiro dia do desenvolvimento embrionário D2 – Segundo dia do desenvolvimento embrionário D3 – Terceiro dia do desenvolvimento embrionário DGO - Departamento de Ginecologia e Obstetrícia DHA - Ácido docosahexaenóico DHET - Ácido di-hidroeicosatetraenóico EET - Ácido epoxieicosatrienoico EO – Estresse Oxidativo EOC - Estimulação ovariana controlada ESI - Ionização por Eletrospray EPA -Ácido eicosapentaenoico FCFRP - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto FF – Fluido folicular FIV - Fertilização in vitro FSH - Hormônio folículo estimulante FMRP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto GnRH - Hormônio liberador de gonadotrofinas hCG - Gonadotrofina coriônica humana HCRP - Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto HDHA - Ácido hidroxidocosahexaenóico HEPE - Ácido hidroxieicosapentaenóico HETE - Ácido hidroxieicosatetraenoico ICSI - Injeção intracitoplasmática de espermatozoides IMC - Índice de massa corpórea LA – Ácido linoleico LC - Cromatografia líquida LOX – Lipoxigenase LT – Leucotrieno LX - Lipoxina MI – Oócitos imaturos em metáfase I MII – Oócitos em metáfase II (maduros) MeOH - Metanol MRM -Monitoramento de Reações Múltiplas MS - Espectrometria de massas PD - Protectina PG – Prostaglandina PGE2 – Prostaglandina E2 PLA2 – Fosfolipase A2 PUFA – Ácido graxos poli-insaturado Q1 - Primeiro quadrupolo Q2 - Segundo quadrupolo Q3 - Terceiro quadrupolo ROS - Espécies reativas de oxigênio RvD – Resolvina D RvE – Resolvina E SOP - Síndrome dos ovários policísticos SPE - Solid phase extraction TAG - Triacilglicerídeo TCLE - Termo de consentimento livre e esclarecido TOF - Time of flight TRA – Técnicas de Reprodução Assistida TX - Tromboxano USTV - Ultrassom Transvaginal VG – Oócitos imaturos em vesícula germinativa SUMÁRIO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................................. 16 1.1. ENDOMETRIOSE................................ ................................ ................................ ............................. 16 1.2. ENDOMETRIOSE E INFERTILIDADE ................................ ................................ ................................ . 17 1.3. PROCESSO INFLAMATÓRIO E ESTRESSE OXIDATIVO ................................ ................................ ............ 19 1.4. LIPÍDIOS ................................ ................................ ................................ ................................ ....... 21 1.5. METABOLISMO DE ÁCIDOS GRAXOS E EICOSANOIDES ................................ ................................ ......... 23 1.6. ESPECTROMETRIA DE MASSAS ................................ ................................ ................................ ......... 26 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................................................. 28 OBJETIVOS ................................................................................................................................................... 29 3.1. OBJETIVO PRIMÁRIO ................................ ................................ ................................ ........................... 29 3.2. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS ................................ ................................ ................................ ................... 29 METODOLOGIA ............................................................................................................................................ 30 4.1. MODELO DE ESTUDO E LOCAL DE REALIZAÇÃO ................................ ................................ .................... 30 4.2. PARTICIPANTES E CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE ................................ ................................ .................. 30 4.3. PROTOCOLO DE ESTIMULAÇÃO OVARIANA E SUPLEMENTAÇÃO DE FASE LÚTEA ................................ ... 31 4.4. CAPTAÇÃO OOCITÁRIA ................................ ................................ ................................ ....................... 32 4.5. COLETA E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS ................................ ................................ ...................... 33 4.6. ICSI E A AVALIAÇÃO DA QUALIDADE EMBRIONÁRIA ................................ ................................ ............ 34 4.7. DEMAIS VARIÁVEIS ANALISADAS ................................ ................................ ................................ ........ 34 4.8. EXTRAÇÃO LIPÍDICA ................................ ................................ ................................ ........................... 35 4.9. LC-MS/MS ................................ ................................ ................................ ................................ ........ 35 4.10. TAMANHO DO ESTUDO ................................ ................................ ................................ ...................... 37 4.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................ ................................ ................................ ...................... 37 RESULTADOS ................................................................................................................................................ 39 5.1. FLUXOGRAMA ................................ ................................ ................................ ................................ .... 39 5.2. CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS ................................ ................................ ................................ .......... 41 5.3. CONCENTRAÇÃO DE EICOSANOIDES ................................ ................................ ................................ ..... 45 5.4. CORRELAÇÃO ENTRE EICOSANOIDES NO SORO E NO FF ................................ ................................ ......... 50 5.5. CORRELAÇÃO ENTRE EICOSANOIDES NO SORO E RESULTADOS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA .................... 51 5.6. CORRELAÇÃO ENTRE EICOSANOIDES NO FF E RESULTADOS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA ........................ 52 DISCUSSÃO .................................................................................................................................................. 54 CONCLUSÕES ............................................................................................................................................... 60 REFERÊNCIAS ............................................................................................................................................... 62 APÊNDICE .................................................................................................................................................... 73 9.1. CONDIÇÕES PARA LC-MS/MS ................................ ................................ ................................ .................. 73 9.2. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO GRUPO ENDOMETRIOSE ................................ ......... 75 9.3. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO GRUPO CONTROLE ................................ ................ 80 16 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1. Endometriose A endometriose é uma condição ginecológica inflamatória crônica, benigna, estrogênio-dependente (ESKENAZI; WARNER, 1997) , caracterizada pela presença e crescimento de implantes endometriais compostos por glândula e ̸ ou estroma fora da cavidade uterina, principal mente no peritônio, ovários e septo retrovaginal (GUPTA; GOLDBERG; AZIZ; GOLDBERG et al. , 2008) . Os sintomas da endometriose incluem dor pélvica, dispareunia, dismenorreia e infertilidade, podendo ser , entretanto, assintomática (BURNEY; GIUDICE, 2012). Possui uma elevada prevalência, afetando de 6 a 10% das mulheres em idade reprodutiva (BURNEY; GIUDICE, 2012) . Por se tratar de uma doença muitas vezes acompanhada de dor pélvica crônica e formação de aderências (GIUDICE; KAO, 2004) , acaba por repercutir na qualidade de vida das portadoras, tanto por impacto na saúde física e psicológica, quanto pelo impacto socioeconômico, visto os custos de diagnóstico e tratamento. Diante disso, a endometriose tem sido considerada um problema de saúde pública (SIGNORILE; BALDI, 2010). Apesar da nítida importância e de extensivos estudos a respeito, a etiopatogenia da endometriose ainda não é bem esclarecida (BURNEY; GIUDICE, 2012). A fim de se padronizar o diagnóstico de endometriose, bem como definir diferentes estadios, a Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) propôs, em 1997, um sistema de classificação da doença baseado nas características morfológicas do implante endometriótico, levando-se em consideração a dimensão e profundidade das lesões, e se há presença de aderências pélvicas. No estágio I ou endometriose mínima, as lesõe s de endometriose são isoladas e não há presença de aderências. No estágio II ou endometriose leve, há presença de lesões ectópicas superficiais de menos de 5 cm e aderências pouco significativas, que não provocam alterações anatômicas. No estágio III ou e ndometriose moderada, há múltiplos implantes endometrióticos, com aderências peritubárias e periovarianas evidentes. E no estágio IV ou endometriose grave, os focos endometrióticos são múltiplos, com implantes superficiais e profundos, endometriomas ovaria nos e aderências densas que levam a alterações anatômicas (ASRM, 1997). 17 1.2. Endometriose e infertilidade A endometriose é frequentemente associada à infertilidade (ASRM, 2012). Sabe-se que a taxa de fecundidade mensal em casais normais em idad e reprodutiva é de 15 a 20%, enquanto que em mulheres inférteis com endometriose essa taxa varia entre 2 e 10% (HUGHES; FEDORKOW; COLLINS, 1993). A endometriose está presente em 25 a 50% das mulheres inférteis (BULLETTI; COCCIA; BATTISTONI; BORINI, 2 010), sendo que 30 a 50% das portadoras de endometriose têm dificuldade em ter filhos (BULLETTI; COCCIA; BATTISTONI; BORINI, 2010; MACER; TAYLOR, 2012). Apesar dos estudos apoiarem as evidências de redução da fecundidade em portadoras da doença, os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade associada à endometriose ainda não foram integralmente elucidados, especialmente nos estadios iniciais da doença, em que não são observadas alterações anatômicas do trato reprodutivo (HOLOCH; LESSEY, 2010). As mulheres infér teis portadoras dos graus moderado e grave de endometriose (estágios III, e IV, respectivamente), podem ter sua infertilidade justificada pelas alterações anatômicas ocasionadas pelas adesões pélvicas e peritubárias características desse estágio da doença. Tais alterações podem originar obstrução tubária, o que prejudica a comunicação entre ovários e ambiente uterino, e dificulta a liberação, captação e transporte do oócito (BULLETTI; COCCIA; BATTISTONI; BORINI, 2010) . Endometriomas são pseudocistos produzidos pelo acúmulo de detritos menstruais e sangramento de lesões endometrióticas no ovário (HUGHESDON, 1957), e podem estar presentes no caso de endometriose moderada e grave, sendo que de 30 a 40% das mulheres com endometriose apresentam endometrioma (VERCELLINI; CHAPRON; DE GIORGI; CONSONNI et al., 2003). Sua presença também parece influenciar negativamente na fertilidade, já que pode gerar um microambiente folicular citotóxico, prejudicando o desenvolvimento oocitário (PAFFONI; BOLIS; FERRARI; BENAGLIA et al. , 2019) , além de diminuir o número de folículos no córtex ovariano (KITAJIMA; DEFRÈRE; DOLMANS; COLETTE et al., 2011). Entretanto, as mulheres com endometriose mínima e leve (estágios I e II, respectivamente), nas quais o acometimento da doença não causa as alterações anatômicas observadas nos graus mais severos, também apresentam infertilidade (HOLOCH; LESSEY, 2010). Um estudo de D'Hooghe apontou que a prevalência de endometriose para mulheres férteis foi de 4% em comparação com 33% na pop ulação infértil. Daquelas com a doença, 68% tinham doença mínima ou leve e 32% tinham endometriose moderada ou grave. Também 18 foi mostrado que mulheres com endometriose mínima e leve tiveram uma taxa de fecundidade mensal de 3,6% em comparação com mulheres com infertilidade por fator masculino grave, que tiveram a taxa de fecundidade mensal de 12%, ambos os grupos recebendo sêmen de doador (D'HOOGHE; DEBROCK; HILL; MEULEMAN, 2003). Nesse sentido, pode -se pensar que a etiologia da infertilidade em mulheres com endometriose vai além de alterações anatômicas. Diversos estudos têm sido conduzidos a fim de elucidar essa questão. Ao se comparar a morfologia de embriões de mulheres com endometriose a embriões de mulheres sem a patologia, foi notado que os embriões do grupo de estudo tiveram a lterações morfológicas no dia 1 (D1) e dia 2 (D2) do desenvolvimento embrionário, sendo que tais alterações estão relacionadas negativamente com as taxas em implantação e gestação (BRIZEK; SCHLAFF; PELLEGRINI; FRANK et al., 1995). Estudos dos efeitos do fluido peritoneal (MORCOS; GIBBONS; FINDLEY, 1985) e do soro (DAMEWOOD; HESLA; SCHLAFF; HUBBARD et al. , 1990) obtidos de mulheres com endometriose demonstram a toxicidade desses fluidos em embriões de camundongos em cultura, implicando essencialmente em um efeito sistêmico da doença in vivo. A capacidade do oócito de completar a maturação, estando em fase de metáfase II (MII), e de passar por uma fertilização bem -sucedida, reflete uma boa qualidade oocitária. Logo, o número de oócitos MII recuperados e a taxa de fertilização observada nos resultados de FIV/ICSI podem ser adotados como marcadores clínicos de competência oocitária (SANCHEZ; VANNI; BARTIROMO; PAPALEO et al., 2017). Evidências parecem sugerir que uma redução no número de oócitos maduros recuperados está consistentemente associada à endometriose, em comparação com outras causas de infertilidade (BARBOSA; TEIXEIRA; NAVARRO; FERRIANI et al. , 2014; SHEBL; SIFFERLINGER; HABELSBERGER; OPPELT et al. , 2017) , bem como uma redução nas taxas de fertilização (BARNHART; DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002) . Esse conjunto de observações apoiam a hipótese de que a infertilidade de pacientes com endometriose está relacionada à diminuição da qualidade do oócito. Alguns autores também consideram o pape l do endométrio eutópico na infertilidade relacionada à endometriose, de modo que alterações na receptividade endometrial podem comprometer a implantação do embrião em mulheres com a doença, principalmente por expressão anormal de moléculas durante a janel a de implantação (BULLETTI; COCCIA; BATTISTONI; BORINI, 2010; GIUDICE; KAO, 2004; WEI; ST CLAIR; FU; STRATTON 19 et al., 2009). Em contrapartida, estudos mais recentes mostraram que a expressão simultânea de genes cruciais para a receptividade endometrial não parece sofrer alterações significativas em mulheres inférteis com endometriose durante a janela de implantação (DA BROI; ROCHA; CARVALHO; MARTINS et al. , 2017; GARCIA -VELASCO; FASSBENDER; RUIZ-ALONSO; BLESA et al., 2015). Estudos em programas de ovodoação reforçam um papel prioritário da qualidade oocitária na etiopatogênese da infertilidade associada à endometriose: pacientes com endometriose têm as mesmas chances de implantação e gravidez que outras receptoras quando os oócitos são provenientes de doadoras saudáveis (SIMÓN; GUTIÉRREZ; VIDAL; DE LOS SANTOS et al., 1994; SUNG; MUKHERJEE; TAKESHIGE; BUSTILLO et al., 1997). Em contraste, as pacientes que receberam embriões derivados de oócitos de mulheres com endometriose mostraram uma taxa de implantação significativamente reduzida (PELLICER; OLIVEIRA; GUTIERREZ, 1994) . Esses estudos apoiam a ideia de que a infertilidade de pacientes com endometriose pode não estar relacionada ao fator endometrial, mas sim à diminuição da qualidade do oócito (SANCHEZ; VANNI; BARTIROMO; PAPALEO et al., 2017). 1.3. Processo inflamatório e estresse oxidativo Evidências crescentes apoiam a conceituação da endometriose como uma condição inflamatória pélvica (BURNEY; GIUDICE, 2012). Em mulheres com endometriose, o líquido peritoneal apresenta um número aumentado de macrófagos ativados e diferenças importantes no perfil de citocinas e quimocinas (RANA; BRAUN; HOUSE; GEBEL et al. , 1996) . O microambiente peritoneal no cenário da endometriose é notavelmen te rico em prostaglandinas, e esses mediadores inflamatórios provavelmente desempenham um papel central na fisiopatologia da doença, bem como nas sequelas clínicas de dor e infertilidade (BURNEY; GIUDICE, 2012) . Macrófagos peritoneais de mulheres com endometriose expressam níveis mais elevados de ciclo -oxigenase-2 (COX -2) e liberam quantidades significativamente maiores de prostaglandinas do que macrófagos de mulheres saudáveis (WU; SUN; LIN; HSIAO et al., 2002). Em relação às causas de infertilidade associada à endometriose, mediadores inflamatórios encontrados nos fluidos peritoneal e folicular podem atuar na proliferação, diferenciação celular e invasão de blastocistos (MALVEZZI; HERNANDES; PICCINATO; 20 PODGAEC, 2019) . Entre os efeitos nocivos descritos estão a diminuição da qualidade do oócito (BARCELOS; VIEIRA; FERREIRA; MARTINS et al., 2009; DA BROI; NAVARRO, 2016; FERREIRA; GIORGI; RODRIGUES; DE ANDRADE et al. , 2019; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI et al., 2016; MALVEZZI; DA BROI; J; ROSA -E-SILVA et al., 2018), distúrbios de interação espermatozóide/oócito (HSU; TOWNSEND; OEHNINGER; CASTORA, 2015) , e prejuízo na qualidade do embrião, em sua implantação e desenvolvimento (STILLEY; BIRT; SHARPE -TIMMS, 2012). Qualquer um desses efeitos leva a uma condição reprodutiva alterada (HAYDARDEDEOGLU; ZEYNELOGLU, 2015). Os sintomas de dor também são agravados pela resposta inflamatória local secundária à ativação das respostas imunes (ARNOLD; VERCELLINO; CHIANTERA; SCHNEIDER et al., 2013). A inflamação está associada à ativação do sistema de coagulação, aumento da perfusão e da permeabilidade vascular, bem como à produção de mediadores inflamatórios, incluindo os derivados do ácido araquidônico ( AA) e do ácido linoleico (LA). Uma inflamação sistêmica pode interferir no curso normal dos ciclos menstruais, nos processos de foliculogênese, ovulação e implantação do embrião (SZCZUKO; KIKUT; KOMORN IAK; BILICKI et al., 2020). As prostaglandinas (PGs) são mediadores lipídico s do tipo eicosanoide s e são importantes reguladoras da ruptura folicular e liberação do oócito, e estão envolvidas na regulação da esteroidogênese, remodelação tecidual e neovascularização de folículos luteinizantes (DU; GAO; SHI; SUN et al. , 2013) . Estudos demonstraram que oócitos de macacos e camundongos expressam receptores funcionais de prostaglandinas E 2 (PGE2), e que podem atuar diretamente em oócitos de mamíferos para retardar a maturação nuclear (MARTORIATI; LALMANACH; GOUDET; GÉRARD, 2002). Um estudo de Yan-Bo Du e colaboradores mostrou que o fluido folicular de mulheres com endometri ose apresentou elevados níveis de PGE2, sendo que as mesmas mulheres tiveram uma diminuição do número de oócitos maduros e maus resultados nos tratamentos de reprodução assistida (DU; GAO; SHI; SUN et al., 2013). Tais resultados sugerem que concentrações alteradas de PGE2 podem perturbar o desenvolvimento de folículos e oócitos. Vários autores têm associado a endometriose ao estresse oxidativo (EO) (DA BROI; DE ALBUQUERQUE; DE ANDRADE; CARDOSO et al. , 2016; DA BROI; JORDÃO; FERRIANI; NAVARRO, 2018; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI et al., 2016; GUPTA; 21 AGARWAL; KRAJCIR; ALVAREZ, 2006; GUPTA; GOLDBERG; AZIZ; GOLDBERG et al., 2008) de modo que os implantes endometriais ectópicos promoveri am uma resposta inflamatória (MURPHY; SANTANAM; PARTHASARATHY, 19 98) com recrutamento e ativação de macrófagos, liberação de citocinas e aumento de espécies reativas (AGARWAL; SALEH; BEDAIWY, 2003; RUDER; HARTMAN; BLUMBERG; GOLDMAN, 2008). Uma tendência a maior produção de agentes pró -oxidantes associada a uma potencial alteração da sua capacidade antioxidante poderia promover a perda do equilíbrio redox do trato reprodutivo e induzir à ocorrência de EO nessas pacientes (AGARWAL; SALEH; BEDAIWY, 2003; GUPTA; AGARWAL; KRAJCIR; ALVAREZ, 2006; RUDER; HARTMAN; BLUMBERG; GOLDMAN, 2008) , o que, por sua vez, poderia estar envolvido no comprometimento da fertilidade (AGARWAL; APONTE -MELLADO; PREMKUMAR; SHAMAN et al. , 2012; DA BROI; JORDÃO; FERRIANI; NAVARRO, 2018; DA BROI; MALVEZZI; PAZ; FERRIANI et al., 2014; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI et al., 2016). Reforçando essa hipótese, estudos têm evidenciado alterações em marcadores inflamatórios e oxidativos no fluido peritoneal de mulheres com a doença (FAN; CHEN; CHEN; LIU et al. , 2018; POLAK; WERTEL; BARCZYŃSKI; KWAŚNIEWSKI et al. , 2013). Além disso, o estresse oxidativo parece não se restringir apenas ao local das lesões, de modo que há evidências de sua ocorrência também a nível sistêmico (ANDRADE; RODRIGUES; DIB; ROMÃO et al. , 2010; DA BROI; DE ALBUQUERQUE; DE ANDRADE; CARDOSO et al., 2016; LIU; HE; LIU; SHI et al., 2013; PRIETO; QUESADA; CAMBERO; PACHECO et al., 2012) e folicular (CHOI; CHO; SEO; PARK et al., 2015; DA BROI; JORDÃO; FERRIANI; NAVARRO, 2018; DA BROI; MALVEZZI; PAZ; FERRIANI et al. , 2014; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI et al. , 2016; SINGH; CHATTOPADHYAY; CHAKRAVARTY; CHAUDHURY, 2013) . Como EO pode comprometer a qualidade oocitária (LIU; TRIMARCHI; NAVARRO; BLASCO et al., 2003; NAVARRO; LIU; FERRIANI; KEEFE, 2006; N AVARRO; LIU; KEEFE, 2004) , as alterações identificadas em marcadores de EO no soro e no fluido folicular (FF) dessas mulheres poderiam sugerir consequente impacto no desenvolvimento oocitário, comprometendo a qualidade gamética dessas pacientes. 1.4. Lipídios Os lipídios são importantes alvos do EO (AGARWAL; SALEH; BEDAIWY, 2003). A produção de agentes pró-oxidantes pode promover a peroxidação lipídica, de seus produtos 22 de degradação e dos produtos formados pela sua interação com as lipoproteínas de baixa densidade e outras proteínas (AUGOULEA; MASTORAKOS; LAMBRINOUDAKI; CHRISTODOULAKOS et al., 2009). Sabe-se que os lipídios são os principais constituintes das membranas celulares, são responsáveis por estocar energia dentro da célula e atuam como precursores de mensageiros secundários (MOK; SHIN; LEE; LEE et al. , 2016) . No microambiente folicular, os lipídios têm um importante papel no desenvolvimento de competência e na maturação oocitária (MOK; SHIN; LEE; LEE et al., 2016). Como os oócitos não sintetizam lipídios, eles obtêm essas moléculas das células foliculares que o circundam e do FF, acumulando -os durante a maturação oocitária (AARDEMA; VOS; LOLICATO; ROELEN et al. , 2011; DA BROI; GIORGI; WANG; KEEFE et al., 2018). Ácidos graxos (AG) são estocados, sob a forma de triglicerídeos (TAG), dentro das gotículas lipídicas existentes nas células do cumulus (CC) e no oócito, e são oxidados pela mitocôndria para gerar energia para a síntese proteica durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário inicial (DUNNING; ANASTASI; ZHANG; RUSSELL et al., 2014). Os fosfolipídios e o colesterol são essenciais para a formação das membranas celulares e são componentes extremamente importantes para a divi são celular após a fertilização (DUNNING; ANASTASI; ZHANG; RUSSELL et al. , 2014) . Lipoproteínas, TAG e AG insaturados, como o oleico e linoleico e saturados, como o palmítico e o esteárico, são os principais componentes encontrados no FF humano (DUNNING; ANASTASI; ZHANG; RUSSELL et al., 2014) e seu perfil reflete, em menores níveis, o perfil encontrado no soro (LEROY; VANHOLDER; DELANGHE; OPSOMER et al., 2004; VALCKX; DE PAUW; DE NEUBOURG; INION et al., 2012). O impacto do conteúdo lipídico folicular sobre o potencial reprodutivo tem sido alvo de diversos estudos. Alguns autores têm associado altos níveis dos AG palmítico e esteárico no FF de mulheres submetidas a tratamentos de Reprodução Assistida a efeitos deletérios na maturação oocitária, nas taxas de fertilização, implantação e no desenvolvimento embrionário (MIRABI; CHAICHI; ESMAEILZADEH; ALI JORSARAEI et al. , 2017) . Além disso, a presença de altas concentrações desses ácidos graxos no FF tem sido associada a efeitos inibidores na quantidade de lipídios estocados dentro das gotículas lipídicas das células do cumulus e do oócito (SHAAKER; RAHIMIPOUR; NOURI; KHANAKI et al. , 2012) e, também, à pobre morfologia do complexo cumulus-oócito (COC) (JUNGHEIM; MACONES; ODEM; PATTERSON et al., 2011). 23 Curiosamente, embriões humanos com falha de desenvolvimen to (HAGGARTY; WOOD; FERGUSON; HOAD et al., 2006) apresentam a mesma composição de AG que oócitos com falha de fertilização (MATORRAS; RUIZ; MEND OZA; RUIZ et al., 1998) , apresentando um predomínio de AG palmítico e esteárico. Além do mais, qualquer modificação na estrutura dos fosfolipídios presentes nas membranas celulares das células foliculares e do oócito altera sua fluidez e sua permeabilidade (MOK; SHIN; LEE; LEE et al., 2016). Mok et al. (2016) evidenciaram a redução de várias s ubclasses de fosfolipídios em oócitos de camundongos que sofreram estresse oxidativo, indicando que a integridade dos fosfolipídios presentes na membrana plasmática do oócito pode ser afetada nessas condições, tornando-os alvos do possível EO que ocorre em portadoras da doença (MOK; SHIN; LEE; LEE et al., 2016). No contexto da endometriose, há e vidências de aumento dos níveis de peróxidos lipídicos no fluido peritoneal (LIU; LUO; ZHAO, 2001) e fluido folicular (FF) de suas portadoras (DE LIMA; CORDEIRO; CAMARGO; ZYLBERSZTEJN et al., 2017; NASIRI; MOINI; EFTEKHARI-YAZDI; KARIMIAN et al., 2017; PETEAN; FERRIANI; DOS REIS; DE MOURA et al. , 2008; SINGH; CHATTOPADHYAY; CHAKRAVARTY; CHAUDHURY, 2013) . Além disso, análise lipidômic a do FF de mulheres inférteis com endometriose encontrou duas subclasses lipídicas hiperrepresentadas (fosfatidilcolina e esfingomielina) (CORDEIRO; CATALDI; PERKEL; DA COSTA et al. , 2015) , ambas componentes da membrana celular e fortemente relaciona das à apoptose (VOUK; HEVIR; RIBIĆ-PUCELJ; HAARPAINTNER et al., 2012). Sabe-se que o microambiente folicular pode ser impactado pelo conteúdo sanguíneo, uma vez que o FF é formado, em parte, pelo transudato proveniente do plasma (EDWARDS, 1974; PRIETO; QUESADA; CAMBERO; PACHECO et al., 2012). Nesse contexto, o perfil lipídico do FF pode refletir o encontrado no soro (LEROY; VANHOLDER; DELANG HE; OPSOMER et al., 2004; VALCKX; DE PAUW; DE NEUBOURG; INION et al., 2012). 1.5. Metabolismo de ácidos graxos e eicosanoides Os metabólitos dos ácidos graxos poli -insaturados (PUFAs) são moléculas bioativas envolvidas em eventos fisiopatológicos que afetam a maioria das células e tecidos humanos, como regulação do sistema imune, produção de citocinas, formação de anticorpos, diferenciação, proliferação e migração celular (HARIZI; CORCUFF; GUALDE, 2008). Esses 24 mediadores lipídicos derivados de PUFAs podem ser produzidos por meio de reações iniciadas por espécies reativas de oxigênio (ROS), ou por reações de oxigenação mediada por enzimas, sendo elas a ciclo -oxigenase (COX), a lipoxigenase (LOX) e o citocromo P450 (CYP) (MASSEY; NICOLAOU, 2011). O ácido araquidônico (AA) é um PUFA liberado de fosfolipídios de membrana pela ação das enzimas fosfolipases A2 (PLA2) em resposta a estímulos inflamatórios (HARIZI; CORCUFF; GUALDE, 2008). É do AA e de outros PUFAs, como o ácido eicosapentaenoico (EPA) e o ácido docosahexaenóico (DHA), que se derivam os mediadores lipídicos, entre eles os eicosanoides (MASSEY; NICOLAOU, 2013) , lipídios bioativos de grande importância fisiopatológica, por terem papel fundamental na inflamação, sendo os derivados de AA considerados predominantemente pró -inflamatórios, e os derivados de EPA e DHA predominantemente anti -inflamatórios (CALDER, 2006) . Embora a maioria dos tipos de células seja capaz de sintetizar eicosanoides, eles são produzidos principalmente por basófilos, eosinófilos, macrófagos, mastócitos, monócitos e neutrófilos (FUNK, 2001). Quando metabolizados pelas isoformas da COX (COX -1 constitutiva ou COX -2 induzível), os AAs e EPAs geram prostaglandinas , prostaciclina e tromboxanos (TXs). (HELLIWELL; ADAMS; MITCHELL, 2004). Quando submetidos à oxigenação por ação da LOX, os PUFAs podem gerar uma série de eicosanoides: por exemplo, AA produz ácidos hidroxieicosatetraenoicos (HETEs), leucotrienos (LTs) e lipoxinas (LXs); EPA gera ácido s hidroxieicosapentaenóicos (HEPEs) e resolvinas da série E (RvE's); e o DHA produz docosanóides, ácidos hidroxidocosahexaenóicos (HDHAs), maresinas, resolvinas da série D (RvD's) e protectinas (PDs) (KÜHN; O'DONNELL, 2006) . Ao usar AA como substrato, o CYP pode formar HETE e ácido epoxieicosatrienoico (EET) que são posteriormente metabolizados em ácidos di-hidroeicosatetraenóicos (DHET) (KONKEL; SCHUNCK, 2011). Finalmente, em relação às reações mediadas por ROS, destacando -se as reações de peroxidação l ipídica de PUFAs, que podem formar uma variedade de pequenas moléculas lipídicas com estruturas e funções que se assemelham as dos eicosanoides, sendo eles os isoprostanos, levuglandinas e isolevuglandinas (CATALÁ, 2010). 25 Figura 1: metabolismo do ácido araquidônico (AA), gerando diferentes espécies de eicosanoides pelas vias enzimáticas COX, LOX e CYP, e pela via de oxidação não - enzimática (por ROS). Figura 2: metabolismo dos ácidos graxos poli -insaturados EPA e DHA, gerando diferentes espécies de eicosanoides pela via enzimáticas da COX e LOX. 26 Sendo assim, considerando que há evidências de inflamação peritoneal e estresse oxidativo sistêmico em mulheres infér teis com endometriose, com consequente potencial impacto folicular, e sendo os lipídios importantes alvos de espécies reativas, incluindo os eicosanoides, que também são mediadores da resposta inflamatória, questionamos a existência de alterações no perfil de eicosanoides que poderiam alterar o microambiente folicular e prejudicar o recrutamento folicular, a maturação oocitária, a ovulação, a fertilização e /ou o desenvolvimento do futuro embrião (LEROY; VANHOLDER; MATEUSEN; CHRISTOPHE et al., 2005). Exemplo direto disso são os estudos que apontam as alterações na prostaglandina E2, um tipo de eicosanoide (DU; GAO; SHI; SUN et al., 2013), ou na via de produção da PGE2 (DA LUZ; DA BROI; DONABELA; PARO et al. , 2017) nas mulheres com endometriose e seu respectivo efeito na qualidade oocitária. Até o momento, nenhum estudo avaliou o perfil de metabólitos de ácidos graxos poli - insaturados no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e controles e os correlacionou com os resultados dos procedimentos de Reprodução Assistida, o que traria importantes dados acerca dos mecanismos inerentes à infertilidade associada a essa patologia. 1.6. Espectrometria de massas A lipidômica se baseia na identificação e quantificação de lipídios em um determinado sistema biológico, a fim de se elucidar como o metabolismo e funções lipídicas podem ser afetados por determinadas espécies moleculares (BLANKSBY; MITCHELL, 2010) . Novas tecnologias para melhor compreensão da composição lipídica vêm sendo definidas, dentre elas a espectrometria de massas (MS) (FERREIRA; SOUZA; RICCIO; CATHARINO et al., 2009; FERREIRA; SARAIVA; CATHARINO; GARCIA et al., 2010), que consiste em uma técnica analítica rápida, versátil e sensível, permit indo a detecção e determinação de biomoléculas, assim como sua quantificação. A abordagem lipidômica, através da MS, contribui para o estudo dos papéis biológicos dos lipídios na sinalização, no metabolismo e na estrutura da membrana celular (FERREIRA; SARAIVA; CATHARINO; GARCIA et al., 2010). A análise de mediadores lipídicos, entre eles os eicosanoides, por espectrometria de massas é particularmente desafiadora, pois esses estão presentes em concentrações extremamente baixas, são temporariamente formados por demanda das células e frequentemente têm meia -vida limitada. Para dificultar mais a situação, podem ser geradas 27 espécies isoméricas desses lipídios, as quais possuem função metabólica distinta e especí fica (MASSEY; NICOLAOU, 2011). Nesse sentido, a cromatografia líquida com espectrometria de massas em tandem (LC- MS/MS) vem se mostrando um excelente método na identificação e quantificação de lipídios com baixa concentração em amostras biológicas (TAM, 2013). Em particular, o advento da ionização por electrospray (ESI) transformou completamente a forma como esses mediadores são identificados e quantificados, resultando em grandes melhorias na seletividade e sensibilidade (FENN; MANN; MENG; WONG et al. , 1989; MURPHY; BARKLEY; ZEMSKI BERRY; HANKIN et al., 2005). Além disso, o monitoramento de reação múltipla (MRM) permite a rápida separação e identificação de espécies de lipídios, minimizando os requisitos de preparação de amostras e evitando reações de derivatização (DOMINIC M. DESIDERIO, 2021). Deste modo, para o propósito do nosso estudo, a MS é uma poderosa e confiável ferramenta para identificação de eicosanoides no soro e no fluido folicular, o que poderia se refletir no microambiente folicul ar e afetar a qualidade oocitária, contribuindo para o entendimento adequado da infertilidade em mulheres portadoras de endometriose. 28 JUSTIFICATIVA A endometriose, doença de elevada prevalência populacional, tem sido frequentemente associada à infertilidade, havendo forte embasamento na literatura acerca da sua relação com a redução da fecundidade em ciclos naturais. Todavia, os mecanismos relacionados à redução da fertilidade natural em pacientes inférteis com endometriose, especialmente na doença inicial, ainda não são claramente conhecidos. Nesse sentido, evidências recentes sugerem que o comprometimento da qualidade oocitária possa ser um fator prioritário envolvido na patogênese da infertilidade relacionada à doença. A endometriose tem sido associada à inflamação peritoneal e ao estresse oxidativo sistêmico e folicular, o que poderia impactar a competência oocitária em portadoras da doença. Processos inflamatórios e EO pode m modificar o perfil de metabólitos lipídicos do folículo ovariano dessas pacientes e, consequentemente, comprometer o desenvolvimento oocitário. Sabe-se que o microambiente folicular pode ser impactado pelo conteúdo sanguíneo, uma vez que o FF é formado, em parte, pelo transudato proveniente do plasma. Nesse sentido, o perfil lipídico do FF reflete o encontrado no soro. Considerando que há evidências de inflamação e estresse oxidativo sistêmicos em mulheres inférteis com endometriose, com consequente pote ncial impacto folicular, e sendo os metabólitos lipídicos importantes mediadores de resposta inflamatória, bem como os ácidos graxos e fosfolipídios alvos de espécies reativas, questionamos a existência de alterações no perfil lipídico sérico que poderiam alterar o microambiente folicular e prejudicar a qualidade oocitária. Até o momento, nenhum estudo avaliou o perfil de eicosanoides no soro e no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e controles e o correlacionou com os resultados dos procedimentos de Reprodução Assistida, o que traria importantes dados acerca desta enigmática patologia. Dessa forma, torna -se essencial uma análise completa do perfil de eicosanoides do soro e do fluido folicular de mulheres inférteis com e sem a doença e su a correlação com os resultados de Reprodução Assistida para um melhor entendimento da etiopatogenia da infertilidade associada à endometriose. 29 OBJETIVOS 3.1. Objetivo Primário Comparar o perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e com infertilidade por fator tubário e/ou masculino submetidas a EOC para realização de fertilização in vitro. 3.2. Objetivos Secundários Correlacionar o perfil de eicosanoides observado no soro com o observado no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e controles. Correlacionar o perfil de eicosanoides sérico e do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e co ntroles com seus respectivos resultados das técnicas de Reprodução Assistida (número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de oócitos fertilizados, taxa de fertilização, número de embriões clivados, taxa de clivagem, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3, taxa de implantação, taxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos). Comparar o perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e com infertilidade por fator tubário e/ou masculino submetidas a EOC para realização de fertilização in vitro. Correlacionar o perfil de eicosanoides observado no soro com o observado no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e com infertilidade por fator tubário e/ou masculino. Correlacionar o perfil de eicosanoides sérico e do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e com infertilidade por fator tubário e/ou masculina com seus respectivos resultados das técnicas de Reprodução Assistida. 30 METODOLOGIA 4.1. Modelo de estudo e local de realização Trata-se de um estudo observacional caso-controle não multicêntrico, aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (parecer nº 3.349.839), desenvolvido junto ao Setor de Reprodução Humana, no DGO do Hospit al das Clínicas (HC) FMRP/USP. A coleta e o preparo do material foram realizados no laboratório de Ginecologia e Obstetrícia – HCFMRP/USP. Os procedimentos de extração lipídica das amostras e a análise do perfil de eicosanoides, por espectrometria de massa s, de extratos lipídicos extraídos de amostras de soro e fluido folicular foram realizados na Facility do Centro de Excelência em Quantificação e Identificação de Lipídios (Ceqil) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP). 4.2. Participantes e Critérios de elegibilidade Pacientes do Setor de Reprodução Humana, do DGO do HCFMRP/USP que preencheram os critérios de elegibilidade no período de setembro de 2019 a outubro de 2021, foram convidadas a participar do estudo. As pacientes que concordaram em conceder as amostras de sangue periférico e de fluido folicular assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) previamente à inclusão no estudo. Como rotina d o serviço de Reprodução Humana, todas as pacientes foram clinicamente examinadas para se determinar o fator de infertilidade e somente foram incluídas pacientes submetidas aos protocolos de estimulação ovariana controlada (EOC) definidos no estudo. Para es te estudo, as pacientes foram divididas no grupo endometriose e grupo controle infértil (fator tubário e/ou masculino de infertilidade). Foram consideradas elegíveis as pacientes com idade inferior a 38 anos, IMC entre 18,5 kg ̸m2 e 30 kg ̸m2, sem quaisqu er outras condições patológicas associadas como dislipidemia, doenças autoimunes, hormonais ( síndrome de ovários policísticos - SOP, tireoidopatias e outras), neoplasias malignas, insuficiência ovariana precoce, anovulação crônica, hidrossalpinge, doença c ardiovascular, doenças reumatológicas, doenças renais, 31 hepatopatias, doenças crônicas como diabetes melittus e outras endocrinopatias, infecção pelo vírus HIV, hipertensão, qualquer infecção ativa, tabagismo, assim como usuárias crônicas de medicações antidislipidêmica, hormonais, de anti-inflamatórios hormonais e não hormonais e de medicamentos como tiazídicos, betabloqueadores, corticóides e hormônio de crescimento nos seis meses anteriores à inclusão no estudo. No grupo endometriose foram selecionadas pa cientes com infertilidade associada exclusivamente à endometriose, em todos os estadiamentos da doença (grau I a IV), diagnosticada e classificada por videolaparoscopia (segundo os critérios da ASRM, 1997) (Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996, 1997), ou então diagnosticas por USTV, com a presença de endometrioma. No grupo controle, foram incluídas pacientes que apresentaram infertilidade por fator tubário (sem hidrossalpinge ou salpingite e doença inflama tória pélvica) e ̸ ou masculino , mas com espermatozóides obtidos do ejaculado. Como fator masculino foi considerada a presença de contagem total de espermatozoides móveis (CTEP) menor que 10 milhões. A CTEP foi obtida pela multiplicação do volume da ejaculação em mililitros pela concentração de espermatozóides e a proporção de espermatozóides com motilidade progressiva dividida por 100% (AYALA; STEINBERGER; SMITH, 1996; HAMILTON; CISSEN; BRANDES; SMEENK et al. , 2015). Foram excluídas as pacientes que, após o recrutamento, foram submetidas a protocolos de estimulação ovariana distintos dos propostos para o estudo, que utilizaram a medicação incorretamente ou que tiveram o ciclo cancelado e não realizaram captação oocitária. 4.3. Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea Com o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de EOC foi utilizada a programação da menstruação, que consiste em se administrar anticoncepcionais orais combinados diariamente, iniciados no p eríodo menstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto para o início da estimulação ovariana. A estimulação ovariana controlada foi iniciada cinco dias após a interrupção dos contraceptivos orais combinados usados para a programação do ciclo. Todas as mulheres foram monitorizadas apenas por ultrassonografia transvaginal (UStv) (MARTINS; VIEIRA; 32 TEIXEIRA; BARBOSA et al., 2014) e submetidas ao protocolo flexível com antagonista do GnRH (Cetrotid®, Merck Serono, Rio de Janeiro, Brasil ou Orgalutran®, Merck & Co, New Jersey, EUA ), iniciado quando identificado um folículo com diâmetro médio ≥ 14 mm e mantido até o dia da administraçã o da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Ovidrel®, Serono, Brasil). A EOC foi realizada com menotropina (Menopur©, Ferring, Aalst, Belgium, na dose de 150 a 300 UI por dia ) ou alfacorifolitropina (Elonva®, Schering-Plough, Brasil; na dose de 100 mcg para pacientes com até 60kg e 150 mcg para pacientes com mais de 60kg). Seis dias após a administração d e uma das gonadotrofinas, foi realizada a primeira UStv para monitorização do ciclo. Quando pelo menos dois folículos atingiram 17 mm de diâmetro médio, foi administrado 250 µg de hCG recombinante neste dia ou no dia seguinte. A captação dos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante. A suplementação da fase l útea foi realizada com progesterona natural micronizada (Utrogestan®, Besins Healthcare, Brasil) por via vaginal na dose de 200mg, três vezes ao dia, a partir do dia da captação oocitária e mantida até a décima segunda semana da gestação, nas pacientes que engravidaram. 4.4. Captação oocitária Para a captação dos oócitos, as pacientes foram submetidas a anestesia geral venosa com propofol (Diprivan®, Zeneca-Astra, Brasil), além de fentanil (Fentanil®, Jansen -Cilag, Brasil). Os folículos ovarianos foram aspirados por via endovaginal, guiada por um transdutor de ultrassom transvaginal. Uma agulha padrão de lúmen único (Wallace, Smiths Medical, Mexico) foi usada, com pressão aspirativa artificial constante de 100mmHg obtida com uma bomba de sucção controlada e letronicamente (Craft® Bomba de sucção, Rocket Medical, Ingalterra). Os folículos de ambos os ovários foram aspirados em pool. O conteúdo aspirado foi analisado em estereomicroscópio e, após a identificação, os COCs foram lavados para remoção de sangue e debris e as CCs foram parcialmente removidas mecanicamente por microdissecção com a utilização de duas agulhas de insulina, em HTF - 33 SSS. Os COCs foram colocados em placas de cultura HTF -HEPES suplementado com 10% de soro substituto sintético (SSS, Irvine Sci entific) até o final da captação. Após, eles foram transferidos para placas de cultura de células (One well dish, Corning, EUA) contendo o meio de cultura CSCM (Continuous Single Culture Médium, Irvine Scientific) e incubados a 37°C em 5% de CO2 e 95% de humidade durante 2 a 5 horas. Após este período, os COCs destinados à ICSI foram desnudados e os oócitos classificados em maduros [metáfase II (MII) – presença de 1 corpúsculo polar (CP) extruso] e imaturos [vesícula germinativa (VG) – ausência do CP extruso e presença de VG, e metáfase I (MI) – ausência do CP e da VG], sob visualização ao microscópio de luz. 4.5. Coleta e armazenamento das amostras O sangue foi coletado em tubo BD Vacutainer ® SST ® II Advance® (com ativador de coágulo e partículas de sílica na parede), no momento da punção venosa para administração da anestesia geral e realização da captação oocitária. As amostras de sangue foram deixadas em temperatura ambiente por 30 minutos para efetuar a coagulação, e foram centrifuga das a 700 x g por 10 minutos a 4 °C para a separação do soro. Removeu-se o sobrenadante e centrifugou-se novamente, nas mesmas condições. Em seguida, o soro foi transferido para microtubos individuais de 1,5ml DNAse e RNAse (Axygen, Corning Inc, NY, EUA), e foi dado um jato de gás de nitrogênio encima das amostras, a fim de se retirar o oxigênio de dentro do microtubo e minimizar a oxidação das amostras. O armazenamento foi feito a -80°C para posterior extração de lipídios e análise. O fluido folicular foi obtido após o procedimento de captação oocitária, depois de se inspecionar e retirar os oócitos do aspirado folicular. Foi centrifugado a 1000 x g por 10 minutos a 4 °C para separação da fase líquida e dos componentes celulares. Em seguida, foi transferido para microtubos individuais de 1,5ml DNAse e RNAse (Axygen, Corning Inc, NY, EUA), e foi dado um jato de gás de nitrogênio em cima das amostras, a fim de se retirar o oxigênio de dentro do microtubo e minimizar a oxidação das amostras. O armazenamento foi feito a -80°C para posterior extração de lipídios e análise. 34 4.6. ICSI e a avaliação da qualidade embrionária Os oócitos maduros foram submetidos à ICSI 3 a 4 horas após a captação de oócitos e, depois de injetados, cultivados em gotas separadas. A ferti lização foi avaliada aproximadamente 16-18 horas após a ICSI, caracterizada pela presença de dois pronúcleos e dois corpúsculos polares. A taxa de fertilização foi calculada com base no número de oócitos fertilizados divididos pelo número de oócitos injeta dos x 100. Cerca de 43 a 45 horas após a ICSI (segundo dia de desenvolvimento-D2), foi avaliada a taxa de clivagem (que corresponde ao número de embriões clivados divididos pelo número total de oócitos fertilizados x 100) e a qualidade embrionária, baseada no número e na simetria dos blastômeros, percentual de fragmentação e presença ou ausência de multinucleação. Foram considerados como embriões de boa qualidade em D2 os que apresentarem 4 blastômeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação (ALPHA; ESHRE, 2011). Nos casos em que a transferência embrionária não foi realizada em D2, a qualidade embrionária foi novamente analisada aproximadamente 67-69 horas após a ICSI (D3). Foram considerados de boa qualidade no D3 os embriões com 8 blastômeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação. A transferência embrionária foi realizada em D2 ou D3 de acordo com as considerações individualizadas para cada caso. 4.7. Demais variáveis analisadas Quatorze dias após a transferência embrionária foi realizada a análise do β -hCG sanguíneo, sendo considerada como gravidez química a pr esença de β-hCG positivo (maior ou igual a 25 UI/ml). A taxa de gravidez química foi calculada dividindo -se o número de pacientes com β -hCG positivo após 14 dias da transferência embrionária pelo número de ciclos com transferência, multiplicado por 100. Fo i avaliada também a taxa de implantação, caracterizada pelo número de sacos gestacionais divididos pelo número de embriões transferidos x 100 e a taxa de gravidez clínica por ciclo transferido, caracterizada pelo número de pacientes com embrião com batimen to cardíaco visualizado ao USTV realizado 6 a 7 semanas após a transferência embrionária dividido pelo número de ciclos com transferência embrionária x 100. A taxa de nascidos vivos por ciclo de transferência embrionária foi definida como o número de ciclos com nascimento vivo dividido pelo número de ciclos com transferência de embrião x 100. Foram também avaliados o número total de oócitos captados, maduros, fertilizados, de embriões clivados e produzidos, e de sacos gestacionais. 35 4.8. Extração lipídica A extração lipídica foi realizada após a coleta de todas as amostras biológicas, previamente à análise, respeitando um tempo de armazenamento dos extratos lipídicos de seis meses, para evitar degradação das mesmas. As amostras de soro e fluido folicular for am descongeladas à temperatura ambiente por 5 minutos. Os eicosanoides foram extraídos das amostras de soro e fluido folicular pelo método solid phase extraction (SPE) (SORGI; PETI; PETTA; MEIRELLES et al., 2018). Segundo o protocolo, as amostras de soro e fluido folicular, aliquotadas em volume de 200 μ L em microtubos de 1,5 mL, tiveram as proteínas desnaturadas com 800 μL de metanol (Merck, Kenilworth, NJ, EUA), seguido da adição de 10 uL de padrão interno de eicosanoides (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI, EUA). As proteínas desnaturadas foram removida s por centrifugação a 12000 rpm, por 20 minutos, a 4 º C, e os sobrenadantes resultantes foram diluídos em água Milli -Q (Merck-Millipore, Kenilworth, NJ, EUA), a fim de se obter uma concentração de metanol de 10%. A purificação das amostras foi então realizada usando colunas C18 SPE (Hypersep C18-500 mg, 3mL, Thermo Scientific-Bellefonte, PA, EUA). Foram previamente preparadas as soluções de H 2O + ácido acético (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, EUA) diluído a 0,1% (solução 1), e de MeOH + ácido acético di luído a 0,1% (solução 2). O condicionamento da coluna foi feito com 4mL de MeOH e 4 mL da solução 1. Em seguida, a coluna é carregada com o volume total da amostra diluída e lavada com 4 mL da solução 1 para remoção de impurezas hidrofílicas. Por fim, se dá a eluição da amostra com 1 mL da solução 2. Os extratos purificados foram armazenados a -80 ° C para prevenir a degradação do metabólito. Antes das análises, o solvente deve ser evaporado à vácuo (Concentrator Plus, Eppendorf, Alemanha) em temperatura ambiente, e os extratos ressuspendidos em solução de MeOH+ H 2O (7 : 3 ; v/v) e armazenados a -80 º C para análise LC-MS/MS. 4.9. LC-MS/MS A análise do soro e do FF foi realizada por cromatografia líquida com espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Ao longo das análises, a coluna foi mantida a 25 °C e as amostras foram mantidas a 4 °C. Uma alíquota de 10 μL de cada amostra foi injetada na 36 coluna. O pH da fase móvel foi otim izado para alcançar a melhor sensibilidade e separação cromatográfica dos metabólitos lipídicos. As condições utilizadas para a cromatografia estão descritas no apêndice 2 (PETTA; MORAES; FACCIOLI, 2015; SORGI; PETI; PETTA; MEIRELLES et al., 2018). O sistema de cromatografia líquida de ultra alta performance (UHPLC) foi interfaceado com um Espectrômetro de Massa TripleTOF5600+ (Sciex -Foster, CA, EUA) equipado com um Turbo-V IonSpray. Uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo de íon negativo foi utilizada para varredura MRM HR. A faixa de massa dos experimentos de product ion foi de m/z 50 a 700, o tempo de permanência foi de 10 ms e uma resolução de massa de 35.000 foi alcançada em m/z 400. As aquisições de dados foram realizadas usando o Analyst Software (Sciex-Foster, CA, EUA). Os eicosanoides analisados foram: LTB4, 6-trans-LTB4, 20-OH-LTB4, LTC4, LTD4, 11-trans-LTD4, LTE4, LXA4, RvD1, RvD2, TXB2, PGB2, PGE2, PGD2, 15-keto-PGE2, 20- OH-PGE2, PGD2, PGJ2,15 -deoxi-PGJ2, 6 -keto-PGF1α, PGF2α, 19 -OH-PGB2, PGG2, maresina, 5-HETE, AA, 5-oxo-ETE, 20-HETE, 5,6-DIHETE, 12-HETE, 8-HETE, 11-HETE, 12-oxo-ETE, 12 -oxo-LTB4, 15-oxo-ETE, 11,12 -DIHETRE, 14,15 -DIHETRE, EPA, DHA, 15-HETE, 5,6-DIHETRE. A identificação das espécies lipídicas obtidas na análise de LC -MS foi realizada usando o PeakView 2.1 (Sciex -Foster, CA, EUA). Resum idamente, este software combina informações em três dimensões para fornecer uma representação do tempo de retenção, intensidade do sinal e valor m/z para cada analito. O processamento de dados passou por várias etapas, incluindo filtragem, detecção de recursos, alinhamento e normalização. Para análise quantitativa, usamos o MultiQuant. Este software usa algoritmos de integração robustos, como MQ4 e SignalFinder avançado, e é capaz de gerar resultados de integração confiáveis mais rapidamente com menos intervenção do usuário para maximizar a produtividade. O uso de padrões de referência para cada uma das espécies ou classes lipídicas alvo foi importante na quantificação dos lipídios sob investigação. Nesse campo, é prática comum normalizar as intensidades de pico de íons moleculares individuais usando um padrão interno para cada classe de lipíd ios. A proporção calculada de analito para padrão interno é então multiplicada pela concentração do referido padrão interno de modo a obter a concentração de um determinado analito presente na amostra. Para quantificar os mediadores 37 lipídicos em nosso trabalho, canais MRM HR foram criados durante o processamento de dados computacionais. Estes foram instruídos a selecionar íons de produto de maior intensidade e seletividade, a fim de obter maior sensibilidade analítica e evitar identificação cruzada. A concentração final de eicosanoides em amostras biológicas foi normalizada pelo volume, peso do fluido ou concentração de proteína/DNA. 4.10. Tamanho do estudo Considerando os restritivos critérios de elegibilidade e as dificuldades impostas pela pandemia pela Covid-19, foram incluídas todas as mulheres elegíveis que aceitaram participar do estudo no período de coleta de 25 meses. 4.11. Análise Estatística A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SAS® 9.3. Foi realizada uma análise exploratória de dados através de medidas de posição central e de dispersão e gráficos de box-plot. Para a comparação da concentração de eicosanoides entre os gru pos endometriose e controle foi utilizado o teste t de student, e quando se realizou a comparação entre os grupos endometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e grupo controle, usou - se o Teste variância ANOVA e pós-teste de Tukey. Para a comparação das características clínicas e resultados de TRA entr e os grupos endometriose e controle, as variáveis com distribuição normal (idade, FSH basal, IMC, tempo de infertilidade) foram analisadas usando o teste t de stud ent. Já as variáveis que não apresentaram distribuição normal (número de oócitos captados, nú mero de oócitos maduros, número de embriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3) foram analisadas com o teste de teste de Mann-Whitney. Para a comparação das características clínicas e resultados de TRA entre os grupos endometriose com endometrioma, endometriose sem endometrioma e controle, as variáveis com distribuição 38 normal (idade, FSH basal, IMC, tempo de infertilidade) foram analisadas usando o teste de variância (ANOVA) seguido do pós -teste de Turkey . Já as variáveis que não apresentaram distribuição normal (número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de embriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3) foram analisadas com o teste de teste de Kruskal -Wallis seguido do pós- teste de Turkey. As variáveis: taxa de fertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, taxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos foram comparadas entre os mesmos grupos com o teste do Qui-quadrado. O perfil lipídico e os resultados de TRA foram correlacionados utilizando -se a correlação de Spearmann, assim como os níveis de eicosanoides no soro e no FF. O nível de significância adotado foi de 5%. 39 RESULTADOS 5.1. Fluxograma No período de setembro de 2019 a outubro de 2021 foram analisados 999 prontuários de mulheres admitidas por infertilidade conjugal no Serviço de Reprodução Assistida do Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Desses, 14 5 pertenciam a pacientes que preenchiam os critérios de elegibilidade. Das 14 5 mulheres elegíveis, 40 tiveram alta do serviço e 109 iniciaram o ciclo de estimulação ovariana e foram convidadas a participar da pesquisa, sendo que 11 mulheres não aceitaram participar do estudo e 9 4 assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Destas, 50 foram excluídas porque tiveram o ciclo cancelado por apresentarem má resposta ovariana ou outros fatores, como suspensão do tratamento devido à pandemia de COVID -19. Assim, foram coletadas am ostras de 4 4 pacientes. Destas, 21 foram destinadas ao grupo endometriose e 23 ao grupo controle. Após a coleta, 6 foram excluídas por diversos motivos (não tiveram folículo puncionado, amostra insuficiente de FF, dificuldade na coleta do sangue periférico , sangue hemolisado, entre outros), sendo três do grupo endometriose e três do grupo controle. Assim, o número amostral foi de 20 pacientes para o grupo controle e 18 para o grupo endometriose. As pacientes do grupo endometriose foram subdivididas no grupo endometriose sem endometrioma e endometriose com endometrioma, sendo constituídos por 10 e 8 pacientes, respectivamente. O fluxograma do estudo está representado na figura 3. 40 Figura 3: fluxograma do estudo com o número de pacientes elegíveis, incluídas, excluídas e amostras coletadas e analisadas divididas em controle e endometriose. 41 5.2. Caracterização dos grupos A comparação das variáveis clínicas: idade, IMC, FSH basal e tempo de infertilidade entre o grupo endometriose e grupo controle não demonstraram diferença estatística significativa, evidenciando a homogeneidade entre os grupos. Os resultados estão expresso s na tabela 1. Tabela 1 – Características clínicas: idade, IMC, tempo de infertilidade e FSH basal em pacientes controle e com endometriose. Variável Controle Endometriose Valor de p Idade (anos) 35,6 (±4,02) 36 (±3,51) 0,71 IMC (kg/m²) 24,4 (±3,26) 23,4 (±2,71) 0,32 FSH basal (mUI/mL) 5,2 (±1,48) 6,5 (±2,21) 0,06 Tempo de infertilidade (meses) 75,6 (±50,37) 77,7 (±47,08) 0,89 Nota: Dados expressos em média e desvio -padrão. Teste t de student. Nível de significância de 5% Dentre as pacientes do grupo controle, apenas três apresentavam exclusivamente fator tubário de infertilidade, enquanto as demais 17 pacientes foram diagnosticadas com fator masculino de infertilidade. Dentre as pacientes com endometriose, duas apresentaram fator masculino associado a endometriose. A respeito da gonadotrofina utilizada na EOC de cada grupo, no grupo controle tivemos 15 pacientes utilizando Menopur®, e 5 utilizando alfacorifolitropina. No grupo endometriose, as 18 paciente fizeram a EOC utilizando Menopur®. Em relação aos resultados de TRA, para os grupos controle e endometriose, observou- se maior número de oócitos maduros, oócitos fertilizados, número de embriões clivados, e número de embriões formados em D2 no grupo controle comparado ao en dometriose. As demais variáveis, incluindo as taxas de fertilização, clivagem, implantação, gestação química, gestação clínica e nascidos vivos, não apresentaram diferença estatística significativa (tabelas 2 e 3). 42 Tabela 2 – Resultados de TRA no grupo controle e endometriose: número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de embriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3. Variável Controle Endometriose Valor de p Nº de oócitos captados 9,7 (6; 13) 6,2 (3; 8,5) 0,06 Nº de oócitos maduros 8 (5; 11) 4,6 (2,5; 6,5) 0,02* Nº de oócitos fertilizados 5,8 (3; 7,5) 3,3 (1,5; 5,5) 0,04* Nº de embriões clivados 5,7 (3; 7) 3,2 (1,5; 5) 0,02* Nº de embriões formados em D2 5,7 (3; 7) 3,2 (1,5; 5) 0,02* Nº de embriões de boa qualidade em D2 2,9 (0,5; 4) 1,3 (0; 3) 0,07 Nº de embriões formados em D3 5,4 (3; 6,5) 3 (1,5; 4,5) 0,14 Nº de embriões de boa qualidade em D3 2,6 (1; 3) 1,4 (0,5; 3) 0,15 Nº de embriões transferidos a fresco 2 (2; 2) 1,5 (1; 2) 0,18 Nº de sacos gestacionais 0,7 (0; 1) 0,2 (0; 0,5) 0,15 Nº de embriões com batimento cardíaco 0,5 (0; 1) 0,25 (0; 0,5) 0,68 Nº de nascidos vivos 0,5 (0; 1) 0,25 (0; 0,5) 0,68 Nota: Dados expressos como mediana (intervalo interquartil). Teste de Mann Whitney. Nível de significância: 5% 43 Tabela 3 – Resultados de TRA no grupo controle e endometriose: taxa de fertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, taxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos. Variável Controle Endometriose Valor de p Taxa de fertilização 66,7% 70,5% 0.56 Taxa de clivagem 92,9% 96,6% 0.97 Taxa de implantação 41,7% 22,9% 0.51 Taxa de gestação química 50,0% 37,5% 0.70 Taxa de gestação clínica 50,0% 25,0% 0.68 Taxa de nascidos vivos 50,0% 25,0% 0.68 Nota: Dados expressos em porcentagem. Teste do qui-quadrado. Nível de significância: 5% Ao separarmos o grupo endometriose nos subgrupos com endometrioma, e sem endometrioma, o resultado permaneceu o mesmo, não havendo diferença estatística para todas as variáveis analisadas (tabela 4). Tabela 4 – Características clínicas: idade, IMC, tempo de infertilidade e FSH basal em pacientes controle, com endometriose sem endometrioma, e com endometriose com endometrioma. Variável Controle Endometriose sem OMA Endometriose com OMA Valor de p Idade (anos) 35,6 (±4,02) 36,1 (±3,38) 36,7 (±3,73) 0,76 IMC (kg/m²) 24,4 (±3,26) 23,6 (±3,42) 23,6 (±3,42) 0,79 FSH basal (mUI/mL) 5,2 (±1,48) 6,9 (±2,23) 6,0 (±1,87) 0,06 Tempo de infertilidade (meses) 75,6 (±50,37) 88,5 (±46,12) 47,88 (±45,23) 0,89 Nota: Dados expressos em média (desvio -padrão). Teste de variância (ANOVA) e pós -teste de Tukey. Nível de significância de 5%. Valores do pós teste de Tukey para a variável CTEP: controle 44 x endometriose sem endometrioma (p = 0,008); controle x endometriose com e ndometrioma (p = 0,002); endometriose sem endometrioma x endometriose com endometrioma (p = 0,36). Em relação aos resultados de TRA , a análise com a subdivisão do grupo endometriose em endometriose com OMA e endometriose sem OMA, e grupo controle, não evi denciou diferença estatística entre as variáveis analisadas (tabelas 5 e 6). Tabela 5 – Resultados de TRA nos grupos controle, endometriose sem endometrioma e endometriose com endometrioma: número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de embriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3, número de embriões transferidos a fresco, número de sacos gestacionais, número de embriões com batimento cardíaco e número de nascidos vivos. Variável Controle Endometriose sem OMA Endometriose com OMA Valor de p Nº de oócitos captados 9,7 (6; 13) 5,7 (3; 8) 5,4 (1,5; 7,5) 0,06 Nº de oócitos maduros 8 (5; 11) 4,8 (3; 6) 4,3 (2; 7) 0,06 Nº de oócitos fertilizados 5,8 (3; 7,5) 3,1 (2; 5) 3,5 (1; 6) 0,13 Nº de embriões clivados 5,7 (3; 7) 2,9 (2; 4) 4 (2; 6) 0,14 Nº de embriões formados em D2 5,7 (3; 7) 2,9 (2; 4) 4 (2; 6) 0,09 Nº de embriões de boa qualidade em D2 2,9 (0,5; 4) 1,1 (0; 2) 1,6 (0; 3) 0,11 Nº de embriões formados em D3 5,4 (3; 6,5) 3,3 (2; 4,5) 4 (2; 6) 0,21 Nº de embriões de boa qualidade em D3 2,6 (1; 3) 1,5 (0,5; 3) 1,3 (0,5; 2) 0,19 Nº de embriões transferidos a fresco 2 (2; 2) 1,4 (1; 2) 1,67 (1; 2) 0,42 Nº de sacos gestacionais 0,7 (0; 1) 0,4 (0; 1) 0,3 (0; 1) 0,73 Nº de embriões com batimento cardíaco 0,5 (0; 1) 0,4 (0; 1) 0 0,56 45 Nº de nascidos vivos 0,5 (0; 1) 0,4 (0; 1) 0 0,56 Nota: Dados expressos como mediana e intervalo interquartil. Teste de Kruskal-Wallis. Nível de significância: 5% Tabela 6 – Resultados de TRA nos grupos controle, endometriose sem endometrioma e endometriose com endometrioma: taxa de fertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, taxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos. Variável Controle Endometriose sem OMA Endometriose com OMA Valor de p Taxa de fertilização 67% 74% 64% 0,68 Taxa de clivagem 93% 96% 98% 0,85 Taxa de implantação 42% 27% 17% 0,70 Taxa de gestação química 50% 40% 33% 0,90 Taxa de gestação clínica 50% 40% 0% 0,56 Taxa de nascidos vivos 50% 40% 0% 0,56 Nota: Dados expressos em porcentagem. Teste do qui-quadrado. Nível de significância: 5% 5.3. Concentração de eicosanoides Na análise do perfil dos eicosanoides, foram avaliados um total de 41 analitos tanto no soro quanto no fluido folicular, conforme previsto a metodologia utilizada no estudo. Dos 41 eicosanoides analisados, cinco foram detectados nas amostras de soro, inclu indo o ácido 5 - hidroxieicosatetraenóico (5-HETE), o ácido 11-hidroxieicosatetraenóico (11-HETE), o ácido 15-oxoicosatetraenóico (15 -oxo-ETE), o ácido eicosapentaenóico (EPA) e o ácido 15 - hidroxieicosatetraenóico (15-HETE). Os mesmos cinco estavam presentes nas amostras de fluido folicular, com a adição da prostaglandina E2 (PGE-2). 46 Ao comparar os grupos de mulheres com endometriose e o grupo controle, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na concentração de cada eicosanoide no soro. A tabela 7 descreve a concentração em picograma por mililitro dos cinco eicosanoides presentes no soro nos grupos controle e endometriose. Tabela 7: Concentração de eicosanoides no soro. Concentração em picograma por mililitro (pg/mL) dos eicosanoides 5 -HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no soro de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Eicosanoide Controle Endometriose Valor de p 5-HETE 82,11 (±61,75) 87,67 (±83,04) 0,81 11-HETE 101,74 (±74,33) 88,76 (±74,94) 0,6 15-oxo-ETE 68,67 (±67,46) 34,27 (±60,29) 0,12 EPA 8197,14 (±7959,79) 8629,82 (±5555,29) 0,85 15-HETE 82,71 (±76,00) 112,47 (±112,91) 0,35 Nota: Dados expressos em média (desvio -padrão). Teste t de student. Nível de significância de 5% A fim de se entender se a presença de endometrioma estaria relacionada a alguma potencial mudança nos níveis de eicosanoides séricos, o grupo endometriose foi classificado nos subgrupos com endometrioma e sem endometrioma. Tal subdivisão evidenciou uma diferença estatisticamente significante nas concentrações de 5-HETE, sendo maior no grupo endometriose sem OMA (120,45 pg/mL) comparado ao grupo endometriose com OMA (38,47 pg/mL; p = 0,01). Os demais eicosanoides não apresentaram diferenças de concentração entre os grupos. A Tabela 8 demostra a média de concentração de cada eicosanoide nos grupos de estudo. As diferenças de concentração de 5-HETE nas amostras de soro também podem ser observadas no gráfico apresentado na figura 4. Tabela 8: Concentração de eicosanoides no soro de mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma, com endometriose com endometrioma, e controles inférteis. 47 Eicosanoide Controle Endometriose sem OMA Endometriose com OMA Valor de p 5-HETE 82,11 (±61,75) 120,45 (±88,20) 38,47 (±30,56) 0,04* 11-HETE 101,74 (±73,33) 89,85 (±47,47) 93,91 (±97,90) 0,91 15-oxo-ETE 68,67 (±67,46) 45,33 (±73,93) 44,01 (±67,47) 0,57 EPA 8197,14 (±7959,79) 8149,58 (±3948,42) 10294,82 (±7798,17) 0,75 15-HETE 82,71 (±76,00) 124,54 (±102,57) 102,10 (±123,27) 0,51 Nota: Dados expressos em média (desvio -padrão), concentração em picograma por mililitro (pg/mL). Teste variância ANOVA e pós -teste de Tukey. Nível de significância de 5%. V alores do pós-teste de Tukey para a variável concentração de 5 -HETE: controle x endometriose sem endometrioma (p = 0,13); controle x endometriose com endometrioma (p = 0,11); endometriose sem endometrioma x endometriose com endometrioma (p = 0,01) Figura 4: gráfico da concentração do eicosanoide 5-HETE nas amostras de soro dos grupos controle, endometriose sem OMA e endometriose com OMA. * concentração superior no grupo endometriose sem OMA comparado ao grupo com OMA. 48 Agora, em relação à concentração de cada eicosanoide no fluido folicular, houve diferença estat isticamente relevante nas concentrações de EPA, sendo maior no grupo endometriose (4038,52 pg/mL), comparado ao grupo controle (1159,83 pg/mL , p=0,03). Os demais eicosanoides não apresentaram diferenças relevantes de concent ração entre os dois grupos. A Tabela 9 demostra a média de concentração de cada eicosanoide para os grupos controle e endometriose. Tabela 9: Concentração de eicosanoides no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Eicosanoides Controle Endometriose Valor de p 5-HETE 60,61 (±65,10) 91,60 (±236,86) 0,57 11-HETE 114,59 (±80,38) 136,99 (±111,2) 0,33 15-oxo-ETE 23,34 (±33,66) 11,16 (±18,66) 0,2 EPA 1159,83 (±1432,62) 4038,52 (±45637,61) 0,03* 15-HETE 97,43 (±105,95) 150,83 (±200,82) 0,19 PGE-2 18,19 (±64,42) 2,91 (±1,31) 0,31 Nota: Dados expressos em média (desvio-padrão); concentração em picograma por mililitro (pg/mL). Teste t de student. Nível de significância de 5%. Ao se realizar a divisão do grupo endometriose nos subgrupos endometriose com endometrioma e endometriose sem endometrioma, pode -se observar uma diferença estatisticamente significativa para o mesmo eicosanoide EPA, sendo maior no FF do grupo endometriose com OMA (5811,50 pg/mL), comparado ao grupo controle (1159,83 pg/mL, p = 0,005). Os demais eicosanoides não apresentaram diferenças relevantes de concentração entre os grupos. A Tabela 10 demostra a média de concentração de cada eicosanoide no grupo controle e subgrupos endometriose . As diferenças de concentração de EPA nas amostras de FF também podem ser observadas no gráfico apresentado na figura 5. 49 Tabela 10: Concentração de eicosanoides no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e controles inférteis. Eicosanoides Controle Endometriose sem OMA Endometriose com OMA Valor de p 5-HETE 60,61 (±65,10) 45,19 (±90,84) 134,05 (±325,10) 0,46 11-HETE 114,59 (±80,38) 156,10 (±133,43) 92,36 (±53,69) 0,33 15-oxo-ETE 23,34 (±33,66) 7,6 (±12,09) 21,81 (±30,69) 0,36 EPA 1159,83 (±1432,62) 2618,23 (±4802,12) 5811,50 (±5908,08) 0,01* 15-HETE 97,43 (±105,95) 91,84 (±77,70) 205,88 (±270,60) 0,19 PGE-2 18,19 (±64,42) 75,59 (±127,29) 0,0 (±0,0) 0,10 Nota: Dados expressos em média (desvio-padrão). Teste de variância ANOVA e pós-teste de Tukey. Nível de significância de 5%. Valores do pós -teste de Tukey para a variável concentração de EPA: controle x endometriose sem endometrioma (p = 0,32); controle x endom etriose com endometrioma (p = 0,005); endometriose sem endometrioma x endometriose com endometrioma (p = 0,08). Figura 5: gráfico da concentração do eicosanoide EPA nas amostras de FF dos grupos controle, endometriose sem OMA e endometriose com OMA. * concentração superior no grupo endometriose com OMA comparado ao controle. 50 5.4. Correlação entre eicosanoides no soro e no FF As correlações entre a concentração dos eicosanoides do soro com os eicosanoides do fluido folicular demonstraram que existe uma correlação moderada positiva entre o 5 -HETE no soro com o 5-HETE no fluido folicular de pacientes controle, e que existe uma correlação fraca positiva entre 11 -HETE e 15 -oxo-HETE do soro com 5 -HETE do fluido folicular em pacientes do grupo controle. Observou -se também que, nas pacientes com endometriose, há correlação fraca positiva entre o 11 -HETE e 15-HETE do soro com o 15-oxo-ETE do fluido folicular. Os valores do coeficiente de correlação estão na tabela 11. Tabela 11: Valores do coeficiente de correlação de Spearman entre as concentrações dos eicosanoides 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15-HETE no soro com as concentrações de 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Grupo 5-HETE soro 11-HETE soro 15-oxo-ETE soro EPA soro 15-HETE soro 5-HETE FF Controle 0,630* (p = 0,002) 0,481* (p = 0,03) 0,482* (p = 0,03) 0,182 0,109 Endometriose 0,078 0,031 -0,107 -0,005 0,009 11-HETE FF Controle 0,392 0,351 0,233 0,246 0,413 Endometriose 0,100 0,001 -0,285 0,269 -0,188 15-oxo-ETE FF Controle -0,006 0,127 -0,001 -0,041 0,353 Endometriose -0,023 0,547* (p = 0,01) 0,160 0,151 0,496* (p = 0,03) EPA FF Controle 0,107 0,185 0,109 -0,008 -0,188 Endometriose 0,208 -0,077 -0,332 0,364 -0,088 15-HETE FF Controle 0,001 -0,278 0,039 -0,286 0,324 Endometriose 0,036 0,048 -0,193 0,452 -0,121 PGE-2 FF Controle 0,298 -0,048 0,235 0,263 -0,026 Endometriose 0,316 0,058 -0,142 0,004 0,019 51 5.5. Correlação entre eicosanoides no soro e resultados de reprodução assistida Todas as correlações encontradas entre os eicosanoides do soro e os resultados de RA foram fracas. No grupo controle, foi evidenciada uma correlação negativa entre os níveis de 11-HETE e a taxa de clivagem. No grupo endometriose, encontrou-se uma correlação positiva entre 15-oxo-ETE e a taxa de fertilização , correlações negativas entre 15 -HETE e o número de embriões clivados, o número de embriões em D2 e o número de embriões em D3, assim como uma correlação negativa entre o 11-HETE e o número de embriões em D3. Tabela 12: Valores do coeficiente de correlação de Spearman entre as concentrações dos eicosanoides 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no soro de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Grupo 5-HETE 11-HETE 15-oxo-ETE EPA 15-HETE Nº de oócitos captados Controle 0,353 0,322 0,038 0,329 0,403 Endometriose -0,134 -0,313 -0,582* (p = 0,01) -0,317 -0,151 Nº de oócitos maduros Controle 0,237 0,237 -0,131 0,275 0,250 Endometriose -0,137 -0,349 -0,374 -0,017 -0,211 Nº de oócitos fertilizados Controle 0,345 0,249 -0,099 0,314 0,443 Endometriose -0,331 -0,352 -0,130 -0,058 -0,319 Taxa de fertilização Controle 0,166 -0,075 0,224 0,061 0,372 Endometriose -0,260 -0,022 0,558 * ( p = 0,02) -0,043 -0,066 Nº de embriões clivados Controle 0,325 0,209 -0,080 0,285 0,462 Endometriose -0,348 -0,461 -0,231 -0,078 -0,583 * (p = 0,02) Taxa de clivagem Controle -0,061 -0,516 * (p = 0,03) -0,065 0,065 0,214 Endometriose -0,018 0,175 0,070 0,338 0,012 Nº de embriões em D2 Controle 0,299 0,363 -0,004 0,213 0,469 Endometriose -0,348 -0,461 -0,231 -0,078 -0,583* (p = 0,02) Nº de embriões de boa qualidade em D2 Controle -0,060 -0,111 -0,425 0,397 -0,166 Endometriose -0,255 -0,121 -0,181 0,082 -0,472 Nº de embriões de D3 Controle 0,177 0,347 0,044 0,157 0,469 Endometriose -0,351 -0,608 * (p = 0,03) -0,280 -0,060 -0,584 * (p = 0,04) 52 Nº de embriões de boa qualidade em D3 Controle -0,339 -0,146 -0,486 0,400 -0,067 Endometriose 0,007 -0,119 -0,424 0,446 -0,465 Taxa de implantação Controle 0,339 -0,308 0,370 0,246 -0,277 Endometriose -0,139 0,000 -0,562 -0,109 -0,163 Taxa de gestação química Controle 0,097 -0,487 0,292 0,097 -0,292 Endometriose -0,288 -0,056 -0,580 -0,169 -0,281 Taxa de gestação clínica Controle 0,540 -0,101 0,371 0,371 -0,338 Endometriose 0,000 0,377 -0,433 0,125 0,125 Taxa de nascidos vivos Controle 0,540 -0,101 0,371 0,371 -0,338 Endometriose 0,000 0,377 -0,433 0,125 0,125 5.6. Correlação entre eicosanoides no FF e resultados de reprodução assistida Assim como no soro, no FF todas as correlações encontradas entre os eicosanoides e os resultados de RA foram fracas. No grupo controle, foi evidenciada uma correlação positiva entre os níveis de PGE-2 e o número de oócitos captados, o número de oócitos fertilizados, o número de embriões clivados e o número de embriões em D2 . Também se evidenciou uma correlação positiva entre a concentração de 15-oxo-ETE e o número de oócitos maduros, e uma correlação negativa entre o s níveis de EPA e a taxa de fertilização . No grupo endometriose, encontrou-se correlação negativa entre 15-oxo-ETE e o número de embriões clivados e o número de embriões de boa qualidade em D2. Tabela 13: Valores do coeficiente de correlação de Spearman entre as concentrações dos eicosanoides 5-HETE, 11 -HETE, 15 -oxo-ETE, EPA, 15 -HETE e PGE -2 no FF de mulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. Grupo 5-HETE 11-HETE 15-oxo-ETE EPA 15-HETE PGE-2 Nº de oócitos captados Controle -0,003 0,245 0,323 -0,158 0,244 0,558 * (p = 0,01) Endometriose -0,086 -0,123 -0,287 -0,308 -0,171 0,142 Nº de oócitos maduros Controle -0,044 0,023 0,547 * (p = 0,01) 0,057 0,217 0,432 Endometriose 0,091 -0,334 -0,181 -0,276 -0,165 0,246 53 Nº de oócitos fertilizados Controle 0,000 0,136 0,313 -0,139 0,101 0,530 * (p = 0,02) Endometriose 0,100 -0,224 -0,361 -0,409 -0,248 0,131 Taxa de fertilização Controle -0,071 0,195 -0,200 -0,488 * (p= 0,04) -0,080 0,451 Endometriose 0,000 -0,089 -0,260 -0,394 -0,377 -0,084 Nº de embriões clivados Controle -0,019 0,138 0,324 -0,152 0,115 0,532 * (p = 0,02) Endometriose -0,013 -0,107 -0,572 * (p = 0,02) -0,359 -0,071 -0,001 Taxa de clivagem Controle -0,179 0,179 -0,008 -0,426 0,140 0,199 Endometriose 0,003 0,410 -0,101 0,196 0,371 -0,392 Nº de embriões em D2 Controle -0,022 0,110 0,425 0,014 0,173 0,531 * (p = 0,03) Endometriose -0,013 -0,107 -0,572* (p = 0,02) -0,359 -0,071 -0,001 Nº de embriões de boa qualidade em D2 Controle -0,349 -0,102 -0,009 0,213 0,083 0,434 Endometriose -0,057 -0,024 -0,567 * (p = 0,02) -0,348 -0,215 -0,066 Nº de embriões de D3 Controle -0,137 0,044 0,450 -0,039 0,133 0,507 Endometriose 0,055 -0,263 -0,547 -0,197 -0,149 -0,200 Nº de embriões de boa qualidade em D3 Controle -0,495 0,047 0,073 0,011 -0,005 0,217 Endometriose 0,137 0,141 -0,436 0,103 0,042 -0,097 Taxa de implantação Controle -0,092 -0,185 0,032 -0,018 -0,339 0,237 Endometriose 0,062 -0,163 -0,093 0,027 -0,681 0,000 Taxa de gestação química Controle -0,292 -0,292 -0,103 -0,115 -0,097 0,115 Endometriose 0,064 -0,056 -0,193 -0,057 -0,619 0,000 Taxa de gestação clínica Controle 0,338 0,033 0,071 0,020 -0,676 0,220 Endometriose -0,433 0,377 0,000 -0,258 -0,251 0,000 Taxa de nascidos vivos Controle 0,338 0,033 0,071 0,020 -0,676 0,220 Endometriose -0,433 0,377 0,000 -0,258 -0,251 0,000 54 DISCUSSÃO A endometriose é uma doença com alta prevalência em mulheres em idade fértil e é frequentemente associada à infertilidade (BURNEY; GIUDICE, 2012) . Apesar disso, ainda não se sabe completamente quais mecanismos estão envolvidos na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. Suspeita-se que a piora da qualidade dos oócitos seja um fator chave na redução da fertilidade natural nessas pacientes (SANCHEZ; VANNI; BARTIROMO; PAPALEO et al., 2017), sendo a inflamação e o estresse oxidativo possíveis mediadores desse dano oocitário (BARCELOS; VIEIRA; FERREIRA; MARTINS et al. , 2009; DA BROI; NAVARRO, 2016; FERREIRA; GIORGI; RODRIGUES; DE ANDRADE et al., 2019; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI et al., 2016; MALVEZZI; DA BROI; J; ROSA-E-SILVA et al. , 2018) . Hipotetizamos que o processo inflamatório e o estresse oxidativo relacionados à endometriose podem afetar a produção sistêmica e folicular de eicosanoides, moléculas bioativas de origem lipídica que regulam diversos processos fisiopatológicos, inclusive a foliculogênese, maturação oocitária e ovulação (LEROY; VANHOLDER; MATEUSEN; CHRISTOPHE et al., 2005). Não se observou diferença significativa na concentração sérica de eicosanoides entre os grupos controle e endometriose. Entretanto, quando se subdividiu o grupo endometriose, observou-se que o 5 -HETE apresentou aumento significativo no grupo endometriose sem OMA em relação ao grupo endometriose com OMA. Considerando que a endometriose peritoneal é caracterizada pela presenç a de lesões espalhadas pela cavidade abdominal (AGARWAL; SUBRAMANIAN, 2010), enquanto o endometrioma é uma lesão localizada, restrita aos ovários e encapsu lada (HUGHESDON, 1957; PAFFONI; BOLIS; FERRARI; BENAGLIA et al. , 2019) ; esse achado s ugere que existe uma repercussão inflamatória sistêmica mais evidente nos casos de endometriose peritoneal e/ou pélvica . As lesões da endometriose perito neal pode m levar à liberação de células e moléculas inflamatórias na corrente sanguínea, resultando em uma resposta inflamatória sistêmica. Acredita -se que essa inflamação crônica induzida pela endometriose, possa estar envolvida na patogênese de vários distúrbios sistêmicos (AHN; MONSANTO; MILLER; SINGH et al., 2015). Portanto, parece importante considerar a natureza e extensão das lesões de endometriose ao se avaliar seu impacto no sistema reprodutivo e na saúde geral da paciente. A literatura médica destaca que a produção excessiva de 5-HETE está associada a uma série de condições patológicas, incluindo inflamação crônica, dor e doenças cardiovasculares 55 (KIKUT; KOMORNIAK; ZIĘTEK; PALMA et al., 2020; LEUTI; FAZIO; FAVA; PICCOLI et al., 2020). Visto isso, é possível elaborar algumas hipóteses sobre como o aumento do 5 - HETE pode estar envolvido na infertilidade associada à endometriose. Primeiramente, sabe - se que a endometriose pode causar alterações no ambiente peritoneal, levando a um estado inflamatório crônico e oxidativo, o que pode afetar a função ovariana e a qualidade dos óvulos e embriões (BARCELOS; VIEIRA; FERREIRA; MARTINS et al. , 2009; DA BROI; NAVARRO, 2016; FERREIRA; GIORGI; RODRIGUES; DE ANDRADE et al. , 2019; MALVEZZI; HERNANDES; PICCINATO; PODGAEC, 2019) . O 5 -HETE é um potente quimiotático para neutrófilos e eosinófilos e pode estar envolvido na atração dessas células para o tecido endometrial ectópico, contribuindo para a inflamação local e sistêmica (BITTLEMAN; CASALE, 1995). Além disso, estudos mostram que o 5-HETE pode afetar a angiogênese, a proliferação celular e a apoptose em diferentes tipos de células, incluindo as células do ovário (MILLER; GHOSH; MYERS; MACDONALD, 20 00; ZENG; YELLATURU; NEELI; RAO, 2002) . Considerando que os folículos ovarianos podem ser impactados pelas alterações séricas, especialmente nos estágios finais de maturação oocitária (EDWARDS, 1974 ; LEROY; VANHOLDER; DELANGHE; OPSOMER et al. , 2004; PRIETO; QUESADA; CAMBERO; PACHECO et al. , 2012; VALCKX; DE PAUW; DE NEUBOURG; INION et al., 2012), as alterações pró -inflamatórias encontradas no presente estudo podem indicar possível impacto folicular nessas pacientes. Assim, o aumento da produção de 5-HETE pode estar envolvido na patogênese da endometriose e sua associação com a infertilidade. A análise da concentração dos eicosanoides no FF demonstrou um aumento na concentração de EPA no grupo endometriose comparado ao control e. Esses resultados sugerem que a endometriose pode estar associada a um desequilíbrio de eicosanoides no FF. O resultado fica ainda mais interessante ao se subdividir o grupo endometriose, evidenciando que existe um aumento de concentração de EPA no FF de mulheres com endometrioma comparado às do grupo controle e endometriose sem endometrioma. Mais uma vez, esse dado reflete um comportamento distinto da doença a depender do tipo de lesão encontrada. Sendo o endometrioma uma lesão ovariana encapsulada (HUGHESDON, 1957; PAFFONI; BOLIS; FERRARI; BENAGLIA et al. , 2019) , a alteração observada no FF reflete diretamente a condição do microambiente folicular e pode ter implicações clínicas na fertilidade dessas mulheres. Esses achados são importantes e sugerem que o microambiente folicular em mulheres com endometriose é modulado de forma diferente dependendo da presença ou 56 ausência de endometrioma, e que isso pode ter implicações importantes para a fisiologia reprodutiva dessas pacientes. O EPA é conhecido por suas propriedades anti -inflamatórias, incluindo a inibição da síntese de prostaglandinas pró -inflamatórias e leucotrienos, e a redução da expressão de moléculas de adesão celular, diminuindo a adesão dos leucócitos aos vasos sanguíneo s (CALDER, 2010; SERHAN, 2005). Seu aumento no FF de mulheres com endometrioma pode estar relacionado a um efeito de proteção do organismo contra a inflamação crônica que ocorre nesse tipo de lesão (YLAND; CARVALHO; BESTE; BAILEY et al., 2020). Tal inflamação pode levar a um estresse oxidativo, com aumento da produção de espécies reativas de oxigênio, o que pode resultar em danos às células e tecidos (NAKAGAWA; HISANO; SUGIYAMA; YAMAGUCHI, 2016). Nesse sentido, o aumento de EPA no FF pode ser uma resposta compensatória a fim de reduzir esse estresse oxidativo e proteger as células ovarianas e foliculares da inflamação crônica presente no endometrioma. Há poucos estudos avaliando diretamente a associação do EPA com a infertilidade em pacientes com endometriose. Um estudo do nosso grupo evidenciou que a adição de EPA em meio de cultura de maturação oocitária preveniu os danos meióticos provocados pelo FF de mulheres com endometriose em todos os estágios (GIORGI; NAVARRO, 2018). Além disso, há evidências que a suplementação de EPA reduziu a dor pélvica relacionada à endometriose (NETSU; KONNO; ODAGIRI; SOMA et al., 2008) e não impactou negativamente na reserva ovariana de pacientes com endometrioma. No entanto, mais est udos são necessários para entender a relação entre o EPA e a infertilidade em pacientes com endometriose e endometrioma. A comparação das variáveis clínicas entre os grupos controle e endometriose evidenciou uma homogeneidade, mesmo quando subdividida a en dometriose em com e sem endometrioma. Todavia, observou -se uma redução significativa no número de oócitos coletados, número de oócitos maduros, número de oócitos fertilizados, número de embriões clivados e número de embriões formados em D2 no grupo endometriose em comparação com o grupo controle, corroborando achados de outros estudos (HAMDAN; DUNSELMAN; LI; CHEONG, 2015; QU; DU; YU; WANG et al., 2022). A endometriose pode ter um impacto direto sobre o número de folículos recrutados e a qualidade dos oócitos, explicando essas diferenças observadas. É interessante destacar que, apesar dessas reduções, não foram encontradas diferenças significativas nas taxas de fertilização, clivagem, gestações e nascidos 57 vivos. Nesse sentido, questionamos se o aumento do EPA no FF dessas pacientes poderia ter um efeito protetor, reduzindo o impacto das alterações inflamatórias e oxidativas sobre o potencial de desenvolvimento embrionário , o que precisa ser explorado em estudos futuros . Ao analisar os subgrupos do grupo endometriose, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas variáveis analisadas. No entanto, é importante pontuar que a redução no tamanho da amostra pode ter influenciado essa falta de diferenças estatísticas, uma vez que foi possível observar tendências de diminuição nas variáveis número de oócitos coletados, número de oócitos maduros, número de oócitos fertilizados e número de embriões clivados. É necessário ter cautela ao interpretar esses resultados, pois, apesar da ausência de diferenças estatísticas, essas tendências podem sugerir uma possível influência da endometriose e do endometrioma na qualidade dos gametas e embriões , o que precisa ser avaliado com casuística adequada. A literatura médica nos mostra que a endometriose é uma condição que pode ter um impacto significativo no TRA, afetando várias etapas do processo e influenciando os resultados. A presença de endometriose pode levar a desafios específicos, como a redução do número de oócitos coletados, a diminuição da qualidade oocitária, a redução da taxa de fertilização e a diminuição da taxa de implantação embrionári a (HAMDAN; OMAR; G; CHEONG, 2015; INVERNICI; RESCHINI; BENAGLIA; SOMIGLIANA et al., 2022). As análises de correlações desempenham um papel crucial na determinação da relação de uma variável com a outra. Neste estudo, avaliamos correlações entre as concentrações de eicosanoides no soro e no fluido folicular, bem como correlações entre as concentrações de eicosanoides no soro e no FF e os resultados do tratamento de RA em mulheres inférteis com e sem endometriose. Ao examinar a co rrelação entre as concentrações de eicosanoides no soro e no FF, observamos uma correlação moderada positiva entre o 5 -HETE no soro e no fluido folicular de pacientes do grupo controle , sugerindo que a composição deste eicosanoide no soro pode refletir a do ambiente folicular em situações fisiológicas. Todavia, no grupo endometriose, não observamos nenhuma correlação forte ou moderada entre as concentrações séricas e as foliculares de eicosanoides. Isto pode ser decorrente de mecanismos foliculares de defesa anti- inflamatórios na tentativa de preservar a qualidade gamética. Essas descobertas ressaltam a importância de entender as interações entre os eicosanoides no soro e no FF e seu impacto na fertilidade das pacientes com endometriose. 58 Apesar das correlações entre as concentrações de eicosanoides no soro e os resultados de RA serem fracas, alguns dados interessantes podem ser discutidos. Nas pacientes do grupo controle, nota-se uma correlação negativa entre 11-HETE e taxa de clivagem, sugerindo que um aumento na concentração sérica de 11-HETE pode ter um impacto negativo nessas taxas. Curiosamente, a concentração de 11-HETE se correlacionou positivamente com o 5-HETE no fluido folicular, o qual já se mostrou alterado no soro de mulheres com endometriose. Além disso, encontrou -se, no grupo endometriose, uma associação negativa entre 15 -HETE e o número de embriões clivados, o número de embriões em D2 e o número de embriões em D3, assim como uma correlação negativa entre o 11-HETE e o número de embriões em D3. Isso sugere que os eicosanoides do grupo HETE, potencialmente pró -inflamatórios, podem prejudicar o início do desenvolvimento embrionário, e que seu aumento em doenças inflamatórias, como a endometriose, pode justificar uma qualidade embrionária inferior. Assim como no soro, as correlações entre as concentrações de eicosanoides no FF e os resultados de RA se mostraram fracas. No grupo controle, foi evidenciada uma correlação positiva entre as concentrações de PGE-2 e o número de oócitos captados, o número de oócitos fertilizados, o número de embriões clivados e o número de embriões em D2. A relação entre a PGE-2 e os processos chaves na gametogênese, ovulação e desenvolvimento embrionário é bem estabelecida na literatura. Embora a concentração de várias prostaglandinas aumente paralelamente durante a ovulação, a PGE -2 é considerada o principal mediador (KIM; DUFFY, 2016; VERNUNFT; LAPP; VIERGUTZ; WEITZEL, 2022). A PGE-2 orquestra os processos de ovulação, incluindo expansão do cúmulo, a liberação d o oócito, a ruptura folicular e a angiogênese (KIM; DUFFY, 2016). Verificou-se que a PGE-2 está envolvida não apenas na expansão do cúmulo, mas também na maturação meiótica, sendo que o seu aumento favorece as condições moleculares para a conclusão da meiose (NIRINGIYUMUKIZA; CAI; XIANG, 2018). Também está envolvida na regulação do processo de fertilização, atuando na degradação da matriz extracelular do COC, o que permite a chegada do espermatozoide ao óvulo (NIRINGIYUMUKIZA; CAI; XIANG, 2018) . Em embriões, níveis gradualmente crescentes de PGE2 de um embrião de 2 células para um blastocisto foram identificados (TAN; LIU; DIAO; YANG, 2005) . A PGE -2 é considerada um fator mitogênico, anti- apoptótico e angiogênico para proliferação celular e sobrevivência em outras células (SALES; KATZ; DAVIS; HINZ et al. , 2001) , o que sugere que a PGE -2 exerce esses efeitos no desenvolvimento do embrião, aumentando assim a proliferação de células embrionárias . Logo, uma alteração nos níveis fisiológicos de PGE-2 pode alterar toda essa precisa regulação, 59 alterando potencialm ente a fertilidade. No grupo controle, t ambém se evidenciou uma correlação positiva entre a concentração de 15-oxo-ETE e o número de oócitos maduros, e uma correlação negativa entre os níveis de EPA e a taxa de fertilização . Nesses casos, a problemática se estabelece quando os mediadores inflamatórios se exacerbam e sobrecarregam as defesas naturais anti-inflamatórias. Assim, a correlação negativa entre EPA e fertilização sugere que a descompensação pode impactar, mesmo com aumento de defesa anti-inflamatória. Já, no grupo endometriose, observou-se uma correlação negativa entre 15- oxo-ETE e o número de embriões clivados e o número de embriões de boa qualidade em D2. Uma vez que esse eicosanoide é um metabólito do 15 -HETE, com ação predominantemente pró-inflamatória (WEI; ZHU; SHAH; BLAIR, 2009), uma elevação de 15-oxo-HETE poderia implicar em baixa qualidade embrionária. 60 CONCLUSÕES Não se observou diferença na concentração sérica de eicosan oides entre mulheres inférteis controles e com endometriose. Todavia, ao subdividirmos o grupo endometriose, demonstramos maiores concentrações séricas de 5 -HETE em mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma quando comparadas às com endometrioma e cont roles, sugerindo que a doença peritoneal favorece a elevação sistêmica deste eisosan oide pró - inflamatório, o que pode favorecer tanto a etiopatogênese da endometriose, como da infertilidade relacionada a mesma. Por outro lado, o bservou-se maiores concentrações foliculares de EPA em mulheres inférteis com endometriose quando comparadas às controles, especificamente naquelas com endometrioma , o que pode estar relacionado a um efeito de proteção do microambiente folicular contra a inflamação crônica que ocorre nesse tipo de lesão, na tentativa de prevenir o dano oocitário. Ao avaliarmos a correlação entre as concentrações de eicosanoides no soro e no FF, observamos uma correlação moderada positiva apenas entre o 5 -HETE no soro e no fluido folicular de pacientes do grupo controle , sugerindo que a composição de ste eicosanoide no soro pode refletir a do ambiente folicular em situações fisiológicas. No grupo endometriose, não observamos qualquer correlação forte ou moderada entre as concentrações séricas e as foliculares de eicosanoides, o que pode ser decorrente de mecanismos foliculares de defesa anti-inflamatória na tentativa de preservar a qualidade gamética. Observou-se apenas fracas correlações entre as concentrações séricas e foliculares de eicosanoides e os resultados dos tratamentos de RA nos grupos com e sem endometriose. No soro, alguns eicosanoides do grupo HETE se mostraram correlacionados negativamente com parâmetros iniciais do desenvolvimento embrionário, o que sugere que eicosanoides com esse perfil pró-inflamatório podem prejudicar os primeiros dias do desenvolvimento embrionário. No FF, uma correlação positiva do PGE -2 com parâmetros do recrutamento folicular e desenvolvimento embrionário inicial em pacientes controle sugerem a importância dessa molécula em eventos fisiológicos que permeiam a capacidade reprodutiva. Em conjunto, estes achados são importantes para avançarmos no entendimento dos mecanismos subjacentes à infertilidade relacionada à endometriose. Compreender o papel dos eicosanoides na fisiopatologia da endometriose e na qualidade oocitária pode favorecer o estudo e descoberta de abordagens terapêuticas inovadoras, visando melhorar tanto a 61 fertilidade natural, como os resultados dos tratamentos de reprodução assistida nas mulheres inférteis com endometriose que apresentam má qualidade gamética e embrionária. 62 REFERÊNCIAS AARDEMA, H.; VOS, P.; LOLICATO, F.; ROELEN, B. et al. Oleic acid prevents detrimental effects of saturated fatty acids on bovine oocyte developmental competence. Biology of reproduction, 85, n. 1, 2011 Jul 2011. AGARWAL, A.; APONTE-MELLADO, A.; PREMKUMAR, B.; SHAMAN, A. et al. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review. Reproductive biology and endocrinology : RB&E , 10, 06/29/2012 2012. AGARWAL, A.; SALEH, R.; BEDAIWY, M. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertility and sterility, 79, n. 4, 2003 Apr 2003. AGARWAL, N.; SUBRAMANIAN, A. 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Para a separação cromato gráfica dos mediadores lipídicos foi utilizada uma coluna HPLC C18 (Supelco, Ascentis Express) com dimensões de 100 × 3,0 mm, 2,7 µm. A eluição foi conduzida com um gradiente binário, onde a fase A consistia em água/acetonitrila/ácido acético (69,98 : 30 : 0,02, v/v/v ) e a fase B era acetonitrila/isopropanol (70:30, v/v). O gradiente linear começou com 0% B e foi aumentado para 15% B em 2 min, 20% B em 5 min, 35% B em 8 min, 40% B em 11 min, 100% B em 15 min, 100% B aos 18 min, 0% de B aos 19 min e mantido até 30 min com uma vazão de 0,6 ml min -1 . A fonte de ionização por eletrospray (ESI) operou no modo de íon negativo usando os modos MRM, íon precursor e varredura de íon produto. Para otimização das condições de MRM e MS de íon precursor, padrões puros a 100 ng.ml −1 preparados em MeOH/H 2 O/AcNH 4 (70 : 29,9 : 0,1, v/v/v ) foram infundidos no espectrômetro a um fluxo taxa de 10 μL.min −1 e fragmentado via CID com argônio para obter espectros de íons de produto para cada eicosanoide individual. Após a seleção das transições MRM, as energias de cone e colisão foram otimizadas por meio da infusão dos padrões para obter a sensibilidade ótima. Para análise LC-MS/MS usando a varredura de íons de produto de m/z 115, os íons selecionados fo ram fragmentados com energia de colisão de 20 eV e energia de cone de 40 V. Os espectros foram adquiridos na faixa de varredura de massa de m/ z200 a 700 Da com um tempo de varredura de 0,3 s. Parâmetros analíticos adicionais foram os seguintes: capilar, 2 ,00 V; temperatura da fonte, 150 °C; temperatura de dessolvatação, 350°C; fluxo de gás cônico, 150 lh -1 ; fluxo de gás de dessolvatação, 500 lh - 1 ; fluxo de gás de colisão, 0,15 ml −1 ; fluxo de gás do nebulizador, 7,00 bar; e tempo de permanência, 0,003 s. Os dados foram processados usando o programa Masslynx 4.1 (Waters Corp., Milford, MA, EUA). O sistema de cromatografia líquida de ultra alta performance (UHPLC) (Nexera X 2 , Shimadzu-Kyoto, HO, Japão) foi equipado com um sistema de bomba binária, um amostrador automático SIL-30AC, um desgaseificador DGU-20A e um controlador CBM-20ª. Para isso, 74 foi utilizada uma coluna Ascentis Express C18 (Supelco - St. Louis, MO, EUA) com diâmetro interno de 100 × 4,6 mm e tamanho de partícula de 2,7 μm. A eluição f oi conduzida sob um sistema de gradiente binário que consistia em Fase A, H 2 O/ACN/ácido acético (69,98:30:0,02, v/v/v ) a pH 5,8 (ajustado com NH4 OH) e Fase B, um ACN/isopropanol (70:30, v/v ). A eluição em gradiente foi realizada por 25 min a uma vazão de 0,6 mL.min −1. As condições de gradiente foram as seguintes: 0 a 2,0 min, 0% B; 2,0 a 5,0 min, 15% B; 5,0 a 8,0 min, 20% B; 8,0 a 11,0 min, 35% B; 11,0 a 15,0 min, 70% B; e 15,0 a 19 min, 100% B. Aos 19,0 min, o gradiente voltou à condição inicial de 0% B, e a coluna foi reequilibrada até 25,0 min. Ao longo das análises, a coluna foi mantida a 25 °C e as amostras foram mantidas a 4 °C no amostrador automático. Uma alíquota de 10 μL de cada amostra foi injetada na coluna. O pH da fase móvel A foi otimizado para alcançar a melhor sensibilidade e separação cromatográfica dos metabólitos lipídicos. Assim, os valores de pH da fase A ao longo do experimento foram 3,8, 5,8 e 6,4. O sistema UHPLC foi interfaceado com um Espectrômetro de Massa TripleTOF5600 + (Sciex-Foster, CA, EUA) equipado com um Turbo -V IonSpray. Uma sonda de Ionização Química de Pressão Atmosférica (APCI) foi usada para calibrações externas do Sistema de Distribuição de Calibrantes (CDS). A calibração automática de massa (<2 ppm) foi realizada usando APCI Negative Calibration Solution (Sciex -Foster, CA, EUA) injetada por infusão direta a uma taxa de fluxo de 300 μL.min −1; isso foi feito periodicamente após cada uma das cinco injeções de amostra. Uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo de íon negativo foi utilizada para varredura MRM HR. Para otimização d o MRM, valores de CE e DP foram determinados para cada analito por meio de infusão direta de soluções de MWS e IS a uma taxa de fluxo de 10 μL.min −1 . Os compostos foram fragmentados via CAD usando nitrogênio como gás de colisão. Parâmetros instrumentais adicionais foram os seguintes: gás nebulizador (GS1), 50 psi; turbo -gás (GS2), 50 psi; gás de cortina (CUR), 25 psi; tensão de eletrospray (ISVF), −4,0 kV; e temperatura da fonte de pulverização de íon turbo, 550°C. A faixa de massa dos experimentos de íons de produto foi de m/z 50 a 700, o tempo de permanência foi de 10 ms e uma resolução de massa de 35.000 foi alcançada em m/z 400. As aquisições de dados foram realizadas usando o Analyst Software (Sciex-Foster, CA, EUA). 75 9.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido grupo endometriose 76 77 78 79 80 9.3. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido grupo controle 81 82 83 84