{"paper_id":"dcb03ba0-5ef1-4764-91c5-f54958c98c64","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA \nDEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA \nSETOR DE REPRODUÇÃO HUMANA \n \n \n \n \n \n \n \nDeterminação do perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de \npacientes com endometriose e controles submetidas à estimulação \novariana e fertilização in vitro. \n \n \n \n \nLarissa de Oliveira Koopman \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2023  \n\n \n \n \nLarissa de Oliveira Koopman \n \n \n \n \nDeterminação do perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de \npacientes com endometriose e controles submetidas à estimulação \novariana e fertilização in vitro. \n \n \n \nDissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação \nem Ginecologia e Obstetrícia  do Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto da Universidade de São Paulo para \nobtenção do título de Mestre em Ciências Médicas \nÁrea de concentração: Ginecologia e Obstetrícia, opção \nBiologia da Reprodução. \n \nOrientadora: Professora Doutora Paula Andrea de \nAlbuquerque Salles Navarro \nCo-orientadora: Doutora Michele Gomes da Broi \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2023  \n\n \n \n \n \nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, desde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n  \n Koopman, Larissa de Oliveira \n \nDeterminação do perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de pacientes \ncom endometriose e controles submetidas à estimulação ovariana e fertilização \nin vitro, 2023. \n85 p.: il; 30cm \nDissertação apresentada ao Programa de Pós -graduação em Gi necologia e \nObstetrícia do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Área de concentração: \nGinecologia e Obstetrícia, opção Biologia da Reprodução \nOrientadora: Professora Doutora Paula Andrea de Albuquerque Salles Navarro \nCo-orientadora: Doutora Michele Gomes da Broi \n1. Endometriose; 2. infertilidade feminina, 3. eicosanoides, 4. qualidade \noocitária. \n \n \n \n\n \n \n \nFOLHA DE APROVAÇÃO \n \nLarissa de Oliveira Koopman \nDeterminação do perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de pacientes com \nendometriose e controles submetidas à estimulação ovariana e fertilização in vitro \n \nDissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação \nem Ginecologia e Obstetrícia  do Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medi cina de \nRibeirão Preto da Universidade de São Paulo para \nobtenção do título de Mestre em Ciências Médicas \nÁrea de concentração: Ginecologia e Obstetrícia, opção \nBiologia da Reprodução. \n \nAprovado em: _____/_____/________ \nBanca examinadora \nPresidente da banca Professor Doutor  \nFaculdade \nAssinatura:____________________________________ \n \nProfessor Doutor \nFaculdade \nAssinatura: ____________________________________ \n \nProfessor Doutor \nFaculdade \nAssinatura: ____________________________________  \n\n \n \n \n \nDEDICATÓRIA \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nÀ minha irmã, Estela \nQue esteve presente durante toda essa \ntrajetória e se construiu como cientista \njunto a mim \nMinha gratidão a sua companhia e \nparceria é imensurável  \n\n \n \n \nAGRADECIMENTOS \n \nPrimeiramente, agradeço a Deus, pois a força para me manter perseverante vem Dele. \nAgradeço por todo conhecimento concedido ao longo dos anos, que me permitiu colaborar \num pouquinho com o conhecimento científico aqui gerado. \nÀ minha mãe, Darli, por todo o amor, carinho e preocupação. Só ela sabe a dor de ter uma \nfilha estudando tão longe de casa. E mesmo com tamanha dor, sempre apoiou meus estudos e \ntorceu pelo meu sucesso. Prometo que tudo isso valerá a pena. \nAo meu pai, Guilherme, que nunca mediu esforços para me ajudar a conquistar todos meus \nsonhos, que sempre me apoiou nos meus estudos, e que agora, junto a mim e minha família, \ncomemora os frutos colhidos dos nossos esforços. Devo tudo que conquistei aos dois, papai e \nmamãe. \nÀ minha irmã, Estela, a quem eu dedico essa dissertação. Minha companhia diária e melhor \namiga, com quem eu compartilho a casa e a vida, os resumos de matéria para prova e as \nmetodologias científicas usadas nas nossas pesquisas, livros (acadêmicos ou não), receitas e \nrefeições diárias, séries e filmes, e muitas risadas, palhaçadas e fofocas. Espero que eu tenha \nte servido de inspiração o mesmo tanto que você me inspira. \nAo meu namorado, Bruno, fonte diária de motivação e acolhimento. Agradeço por ser um \ncompanheiro tão fiel, acreditando sempre que eu sou capaz e me motivando a seguir em frente. \nA vida com você é mais leve e mais feliz.  \nÀ minha orientadora, Professora Doutora Paula Navarro, que me acolheu em seu grupo de \npesquisa e me possibilitou desenvolver este trabalho de pesquisa em um tema que tem todo o \nmeu carinho. Agradeço também pelos constantes aprendizados, tanto em conhecimento \nacadêmico, mas também em sabedorias para a vida. \nÀ minha co-orientadora, Michele, que, com muita paciência, foi me auxiliando em todos os \npassos da minha pesquisa, me mostrando o melhor caminho, fazendo as melhores sugestões e \nme mantendo sempre animada a continuar em frente. \nAo professor Carlos Arterio Sorgi, do departamento de química da Faculdade de Filosofia, \nCiências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP) por contribuir com o enriquecimento deste \ntrabalho. \nÀ querida colega e amiga, Mayra, que compartilhou comigo os momentos de recrutamento de \npaciente e coleta de amostras. Nossa incrível parceria ajudou muito no desenvolvimento \ninicial de todo o trabalho. \nA todos os amigos da pós-gradução, pelos divertidos momentos que tivemos, dentro e fora da \nfaculdade.  \n\n \n \n \nÀ equipe do laboratório de GO, pelo auxílio no recrutamento da s pacientes e aquisição das \namostras. \nÀs mulheres que aceitaram participar deste estudo, doando amostras de soro e fluido folicular. \nAo Centro de Excelência de Quantificação e Identificação de Lipídios – (CEQIL) pela \ncolaboração com as extrações e análises lipídicas. \nÀ Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa l de Nível Sup erior (CAPES) pelo apoio \nfinanceiro por meio do Programa de Excelência Acadêmica (PROEX). \nAo conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio \nfinanceiro através do auxílio a projetos de pesquisa. \nAo programa de Pós-Graduação em Ginecologia e Obstetrícia (PPGGO), ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia (DGO) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da \nUniversidade de São Paulo (FMRP -USP), e ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia \n(INCT) em Hormônios e Saúde da Mulher, pelo suporte financeiro e estrutural. \nAos membros da banca avaliadora pela disponibilidade e valiosas contribuições. \nSou grata a todos \n  \n\n \n \n \nEPÍGRAFE \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Valeu a pena? Tudo vale a pena \nSe a alma não é pequena. \nQuem quer passar além do Bojador \nTem que passar além da dor. \nDeus ao mar o perigo e o abismo deu, \nMas nele é que espelhou o céu.” \n— Fernando Pessoa  \n\n \n \n \nRESUMO \nKOOPMAN, L. O. Determinação do perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de \npacientes com endometriose e controles submetidas à estimulação ovariana e fertilização in \nvitro. 2023. Dissertação (Mestrado em Ciências - Programa de Pós-graduação em Ginecologia \ne Obstetrícia, Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2023). \nA endometriose é uma doença altamente prevalente entre mulheres em idade \nreprodutiva e frequentemente associada à infertilidade. No entanto, os mecanismos envolvidos \nna etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose ainda não foram totalmente \nelucidados. Acredita -se que a qualidade do oócito tenha um papel importante no \ncomprometimento da fertilidade natural de suas portadoras, sendo a inflamação sistêmica e o \nestresse oxidativo possíveis mediadores do dano oocitário. Nesse sentido, há evidência s de \nalterações em marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo sistêmico e folicular em \nmulheres inférteis com a doença. Dentre os principais mediadores da resposta inflamatória \nestão os eicosanoides, moléculas bioativas de origem lipídica que regulam diversos processos \nfisiopatológicos, inclusive a foliculogênese, maturação oocitária e ovulação, e são produzidos \nfrente a um estímulo inflamatório ou à exposição a espécies reativas de oxigênio. \nQuestionamos se a inflamação sistêmica e o estresse oxidativo (EO) poderiam modificar o \nperfil sérico de eicosanoides dessas pacientes, o que poderia se refletir no perfil lipídico do \nmicroambiente folicular e prejudicar a qualidade oocitária. Assim, o objetivo primário deste \nestudo consiste em comparar o perfil d e eicosanoides no soro e fluido folicular de mulheres \ninférteis com endometriose e com infertilidade por fator tubário e/ou masculino submetidas à \nestimulação ovariana controlada para fertilização in vitro. Para tanto, amostras de sangue e \nfluido folicular de 18 pacientes inférteis com endometriose e 20 pacientes com infertilidade \npor fator tubário e/ou masculino foram coletadas no dia da captação oocitária, armazenadas a \n-80ºC e analisadas quanto ao perfil de eicosanoides pela técnica de espectrometria de massas \ncom ionização por eletrospray (ESI-MS). Quando comparamos os grupos endometriose e \ncontrole, não observamos diferença significativa nas concentrações séricas dos 5 eicosanóides \ndetectados, mas evidenciamos maiores concentrações foliculares de Ácido eicosapentaenoico \n(EPA) no grupo endometriose. Ao subdividirmos o grupo endometriose, observamos  um \naumento de 5-HETE no soro de mulheres com endometriose sem endometrioma comparado \nàs mulheres com endometriose com endometrioma e um aumento do EPA no fluido folicular \nde mulheres com endometriose com endometrioma comparado às controle s. A análise de \ncorrelação demonstrou uma associação moderada positiva entre 5-HETE no soro e 5 -HETE \nno fluido folicular  no grupo controle . Observou-se apenas fracas correlações entre as \nconcentrações séricas e foliculares de eicosanoides e os resultados dos tratamentos de RA nos \ngrupos com e sem endometriose. Esses achados contribuem para a compreensão dos \nmecanismos envolvidos na infertilidade relacionada à endometriose e destacam a importância \ndos eicosanoides na qualidade oocitária.  \nPalavras-chave: endometriose, infertilidade feminina, eicosanoides, fluido folicular, soro, \nqualidade oocitária.  \n\n \n \n \nABSTRACT \nKOOPMAN, L. O. Determination of the eicosanoid profile in the serum and follicular fluid \nof patients with endometriosis and controls undergoing ovarian stimulation and in vitro \nfertilization. 2023. Dissertation (Master's in Sciences - Graduate Program in Gynecology and \nObstetrics, Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, \nUniversity of São Paulo, São Paulo, 2023). \nEndometriosis is a highly prevalent disease among women of reproductive age and is often \nassociated with infertility. However, the mechanisms involved in the pathogenesis of \nendometriosis-related infertility have not been fully elucidated. It is believed t hat oocyte \nquality plays an important role in the impairment of natural fertility in affected individuals, \nwith systemic inflammation and oxidative stress being possible mediators of oocyte damage. \nIn this regard, there is evidence of alterations in system ic and follicular inflammatory and \noxidative stress markers in infertile women with the disease. Among the main mediators of \nthe inflammatory response are eicosanoids, bioactive lipid molecules that regulate various \npathophysiological processes, including folliculogenesis, oocyte maturation, and ovulation, \nand are produced in response to an inflammatory stimulus or exposure to reactive oxygen \nspecies. We questioned whether systemic inflammation and oxidative stress could modify the \nserum eicosanoid profile in these patients, which could be reflected in the lipid profile of the \nfollicular microenvironment and impair oocyte quality. Therefore, the primary objective of \nthis study is to compare the eicosanoid profile in the serum and follicular fluid of infertil e \nwomen with endometriosis and those with tubal and/or male factor infertility undergoing \ncontrolled ovarian stimulation for in vitro fertilization . To achieve this, blood and follicular \nfluid samples from 18 infertile patients with endometriosis and 20 patients with tubal and/or \nmale factor infertility were collected on the day of oocyte retrieval, stored at -80°C, and \nanalyzed for eicosanoid profiles using electrospray ionization mass spectrometry (ESI -MS). \nWhen comparing the endometriosis and control groups, we did not observe a significant \ndifference in the serum concentrations of the 5 detected eicosanoids, but we found higher \nfollicular concentrations of Eicosapentaenoic Acid (EPA) in the endometriosis group. Upon \nsubdividing the endometriosis group, we observed an increase in 5 -HETE in the serum of \nwomen with endometriosis without endometrioma compared to those with endometriosis with \nendometrioma, and an increase in EPA in the follicular fluid of women with endometriosis \nwith endometrioma compared to controls. Correlation analysis showed a moderate positive \nassociation between serum 5 -HETE and follicular fluid 5 -HETE in the control group. Only \nweak correlations were observed between serum and follicular concentrations of eicosanoids \nand the outcomes of ART in both endometriosis and non -endometriosis groups. These \nfindings contribute to the understanding of the mechanisms involved in endometriosis-related \ninfertility and highlight the importance of eicosanoids in oocyte quality. \n \nKeywords: endometriosis, female infertility, eicosanoids, oocyte quality. \n \n\n \n \n \nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1:  metabolismo do ácido araquidônico (AA), gerando diferentes espécies de \neicosanoides pelas vias enzimáticas COX, LOX e CYP, e pela via de oxidação não-enzimática \n(por ROS). \nFigura 2: metabolismo dos ácidos graxos poli -insaturados EPA e DHA, gerando diferen tes \nespécies de eicosanoides pela via enzimáticas da COX e LOX. \nFigura 3: fluxograma do estudo com o número de pacientes elegíveis, incluídas, excluídas e \namostras coletadas e analisadas divididas em controle e endometriose.  \nFigura 4: gráfico da concentração do eicosanoide 5-HETE nas amostras de soro dos grupos \ncontrole, endometriose sem OMA e endometriose com OMA.  \nFigura 5: gráfico da concentração do eicosanoide EPA nas amostras de FF dos grupos \ncontrole, endometriose sem OMA e endometriose com OMA.  \n \n \n \n \n \n  \n\n \n \n \nLISTA DE TABELAS \n \nTabela 1  – Características clínicas: idade, IMC, tempo de infertilidade e FSH basal em \npacientes controle e com endometriose.  \nTabela 2  – Resultados de TRA no grupo controle e endometriose: número de oócitos \ncaptados, número de oócitos maduros, número de embriões clivados, número de embriões \nformados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões formados \nem D3, número de embriões de boa qualidade em D3.  \nTabela 3 – Resultados de TRA no grupo controle e endometriose: taxa de fertilização, taxa  \nde clivagem, taxa de implantação, taxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa \nde nascidos vivos.  \nTabela 4  – Características clínicas: idade, IMC, tempo de infertilidade e FSH basal em \npacientes controle, com endometriose sem endometrioma, e  com endometriose com \nendometrioma.  \nTabela 5  – Resultados de TRA nos grupos controle, endometriose sem endometrioma e \nendometriose com endometrioma: número de oócitos captados, número de oócitos maduros, \nnúmero de embriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de \nboa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa \nqualidade em D3, número de embriões transferidos a fresco, número de sacos gestacionais, \nnúmero de embriões com batimento cardíaco e número de nascidos vivos.  \nTabela 6  – Resultados de TRA nos grupos controle, endometriose sem endometrioma e \nendometriose com endometrioma: taxa de fertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, \ntaxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos.  \nTabela 7 - Concentração de eicosanoides no soro. Concentração em picograma por mililitro \n(pg/mL) dos eicosanoides 5 -HETE, 11 -HETE, 15 -oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no soro de \nmulheres inférteis com endometriose e controles inférteis.  \nTabela 8 - Concentração de eicosanoides no soro de mulheres inférteis com endometriose \nsem endometrioma, com endometriose com endometrioma, e controles inférteis.  \nTabela 9  - Concentração de eicosanoides no fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose e controles inférteis.  \nTabela 10  - Concentração de eicosanoides no fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e controles inférteis.  \nTabela 11 - Valores do coeficiente de correlação de Spearman ent re as concentrações dos \neicosanoides 5 -HETE, 11 -HETE, 15 -oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no soro com as \nconcentrações de 5 -HETE, 11 -HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no fluido folicular de \nmulheres inférteis com endometriose e controles inférteis. \n\n \n \n \n \nTabela 12 - Valores do coeficiente de correlação de Spearman entre as concentrações dos \neicosanoides 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15-HETE no soro de mulheres inférteis \ncom endometriose e controles inférteis. \nTabela 13 - Valores do coeficiente de correlação de S pearman entre as concentrações dos \neicosanoides 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA, 15-HETE e PGE-2 no FF de mulheres \ninférteis com endometriose e controles inférteis. \n \n \n \n \n \n  \n\n \n \n \nLISTA DE ABREVIATURAS \n5-HETE - ácido 5-hidroxieicosatetraenoico \n11-HETE - ácido 11-hidroxieicosatetraenoico \n15-HETE - ácido 11-hidroxieicosatetraenoico \n15-oxo-ETE – ácido 15-oxoicosatetraenoico \nAA - Ácido araquidônico \nAG – Ácido graxo \nASRM – Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva \nCC – Células dos cumulus \nCeqil - Centro de Excelência em Quantificação e Identificação de Lipídios \nCOC – Complexo oophorus-cumulus \nCOX-1 – Ciclo-oxigenase-1 \nCOX-2- Ciclo-oxigenase-2 \nCTEP - Contagem total de espermatozoides progressivos \nCYP – Citocromo P450 \nD1 - Primeiro dia do desenvolvimento embrionário \nD2 – Segundo dia do desenvolvimento embrionário \nD3 – Terceiro dia do desenvolvimento embrionário \nDGO - Departamento de Ginecologia e Obstetrícia \nDHA - Ácido docosahexaenóico  \nDHET - Ácido di-hidroeicosatetraenóico   \nEET - Ácido epoxieicosatrienoico \nEO – Estresse Oxidativo \nEOC - Estimulação ovariana controlada \nESI - Ionização por Eletrospray \nEPA -Ácido eicosapentaenoico \nFCFRP - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto \nFF – Fluido folicular \nFIV - Fertilização in vitro \nFSH - Hormônio folículo estimulante \nFMRP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nGnRH - Hormônio liberador de gonadotrofinas \nhCG - Gonadotrofina coriônica humana \nHCRP - Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto \n\n \n \n \nHDHA - Ácido hidroxidocosahexaenóico \nHEPE - Ácido hidroxieicosapentaenóico \nHETE - Ácido hidroxieicosatetraenoico \nICSI - Injeção intracitoplasmática de espermatozoides \nIMC - Índice de massa corpórea \nLA – Ácido linoleico \nLC - Cromatografia líquida \nLOX – Lipoxigenase \nLT – Leucotrieno \nLX - Lipoxina \nMI – Oócitos imaturos em metáfase I \nMII – Oócitos em metáfase II (maduros) \nMeOH - Metanol \nMRM -Monitoramento de Reações Múltiplas \nMS - Espectrometria de massas \nPD - Protectina \nPG – Prostaglandina  \nPGE2 – Prostaglandina E2 \nPLA2 – Fosfolipase A2 \nPUFA – Ácido graxos poli-insaturado \nQ1 - Primeiro quadrupolo \nQ2 - Segundo quadrupolo \nQ3 - Terceiro quadrupolo \nROS - Espécies reativas de oxigênio \nRvD – Resolvina D \nRvE – Resolvina E \nSOP - Síndrome dos ovários policísticos \nSPE - Solid phase extraction \nTAG - Triacilglicerídeo \nTCLE - Termo de consentimento livre e esclarecido \nTOF - Time of flight \nTRA – Técnicas de Reprodução Assistida \nTX - Tromboxano \nUSTV - Ultrassom Transvaginal \nVG – Oócitos imaturos em vesícula germinativa \n\n \n \n \nSUMÁRIO \n \nREVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................................. 16 \n1.1. ENDOMETRIOSE................................ ................................ ................................ .............................  16 \n1.2. ENDOMETRIOSE E INFERTILIDADE  ................................ ................................ ................................ . 17 \n1.3. PROCESSO INFLAMATÓRIO E ESTRESSE OXIDATIVO  ................................ ................................ ............  19 \n1.4. LIPÍDIOS ................................ ................................ ................................ ................................ ....... 21 \n1.5. METABOLISMO DE ÁCIDOS GRAXOS E EICOSANOIDES  ................................ ................................ ......... 23 \n1.6. ESPECTROMETRIA DE MASSAS ................................ ................................ ................................ ......... 26 \nJUSTIFICATIVA ............................................................................................................................................. 28 \nOBJETIVOS ................................................................................................................................................... 29 \n3.1. OBJETIVO PRIMÁRIO ................................ ................................ ................................ ...........................  29 \n3.2. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS ................................ ................................ ................................ ...................  29 \nMETODOLOGIA ............................................................................................................................................ 30 \n4.1. MODELO DE ESTUDO E LOCAL DE REALIZAÇÃO  ................................ ................................ ....................  30 \n4.2. PARTICIPANTES E CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE  ................................ ................................ ..................  30 \n4.3. PROTOCOLO DE ESTIMULAÇÃO OVARIANA E SUPLEMENTAÇÃO DE FASE LÚTEA ................................ ... 31 \n4.4. CAPTAÇÃO OOCITÁRIA ................................ ................................ ................................ .......................  32 \n4.5. COLETA E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS  ................................ ................................ ......................  33 \n4.6. ICSI E A AVALIAÇÃO DA QUALIDADE EMBRIONÁRIA  ................................ ................................ ............  34 \n4.7. DEMAIS VARIÁVEIS ANALISADAS  ................................ ................................ ................................ ........ 34 \n4.8. EXTRAÇÃO LIPÍDICA ................................ ................................ ................................ ...........................  35 \n4.9. LC-MS/MS ................................ ................................ ................................ ................................ ........ 35 \n4.10. TAMANHO DO ESTUDO ................................ ................................ ................................ ......................  37 \n4.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................ ................................ ................................ ......................  37 \nRESULTADOS ................................................................................................................................................ 39 \n5.1. FLUXOGRAMA ................................ ................................ ................................ ................................ .... 39 \n5.2. CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS ................................ ................................ ................................ .......... 41 \n5.3. CONCENTRAÇÃO DE EICOSANOIDES  ................................ ................................ ................................ ..... 45 \n5.4. CORRELAÇÃO ENTRE EICOSANOIDES NO SORO E NO FF ................................ ................................ ......... 50 \n5.5. CORRELAÇÃO ENTRE EICOSANOIDES NO SORO E RESULTADOS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA  ....................  51 \n5.6. CORRELAÇÃO ENTRE EICOSANOIDES NO FF E RESULTADOS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA  ........................  52 \nDISCUSSÃO .................................................................................................................................................. 54 \nCONCLUSÕES ............................................................................................................................................... 60 \nREFERÊNCIAS ............................................................................................................................................... 62 \nAPÊNDICE .................................................................................................................................................... 73 \n9.1. CONDIÇÕES PARA LC-MS/MS ................................ ................................ ................................ ..................  73 \n9.2. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO GRUPO ENDOMETRIOSE  ................................ ......... 75 \n9.3. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO GRUPO CONTROLE  ................................ ................  80 \n \n \n\n\n \n16 \n \nREVISÃO BIBLIOGRÁFICA \n \n1.1. Endometriose \nA endometriose é uma condição ginecológica inflamatória crônica, benigna, \nestrogênio-dependente (ESKENAZI; WARNER, 1997) , caracterizada pela presença e \ncrescimento de implantes endometriais compostos por glândula e ̸ ou estroma fora da cavidade \nuterina, principal mente no peritônio, ovários e septo retrovaginal  (GUPTA; GOLDBERG; \nAZIZ; GOLDBERG  et al. , 2008) . Os sintomas da endometriose incluem dor pélvica, \ndispareunia, dismenorreia e infertilidade, podendo ser , entretanto, assintomática (BURNEY; \nGIUDICE, 2012). Possui uma elevada prevalência, afetando de 6 a 10% das mulheres em \nidade reprodutiva (BURNEY; GIUDICE, 2012) . Por se tratar de uma doença muitas vezes \nacompanhada de dor pélvica crônica e formação de aderências  (GIUDICE; KAO, 2004) , \nacaba por repercutir na qualidade de vida das portadoras, tanto por impacto na saúde física e \npsicológica, quanto pelo impacto socioeconômico, visto os custos de diagnóstico e tratamento. \nDiante disso, a endometriose tem sido considerada um problema de saúde pública \n(SIGNORILE; BALDI,  2010). Apesar da nítida importância e de extensivos estudos a \nrespeito, a etiopatogenia da endometriose ainda não é bem esclarecida (BURNEY; GIUDICE, \n2012). \nA fim de se padronizar o diagnóstico de endometriose, bem como definir diferentes \nestadios, a Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva  (ASRM) propôs, em 1997, um  \nsistema de classificação da doença baseado nas características morfológicas do implante \nendometriótico, levando-se em consideração a dimensão e profundidade das lesões, e se há \npresença de aderências pélvicas. No estágio I ou endometriose mínima, as lesõe s de \nendometriose são isoladas e não há presença de aderências. No estágio II ou endometriose \nleve, há presença de lesões ectópicas superficiais de menos de 5 cm e aderências pouco \nsignificativas, que não provocam alterações anatômicas. No estágio III ou e ndometriose \nmoderada, há múltiplos implantes endometrióticos, com aderências peritubárias e \nperiovarianas evidentes. E no estágio IV ou endometriose grave, os focos endometrióticos são \nmúltiplos, com implantes superficiais e profundos, endometriomas ovaria nos e aderências \ndensas que levam a alterações anatômicas (ASRM, 1997). \n \n\n \n17 \n \n1.2. Endometriose e infertilidade \nA endometriose é frequentemente associada à infertilidade (ASRM, 2012). Sabe-se \nque a taxa de fecundidade mensal em casais normais em idad e reprodutiva é de 15 a 20%, \nenquanto que em mulheres inférteis com endometriose essa taxa varia entre 2 e 10% \n(HUGHES; FEDORKOW; COLLINS, 1993). A endometriose está presente em 25 a 50% das \nmulheres inférteis (BULLETTI; COCCIA; BATTISTONI; BORINI, 2 010), sendo que 30 a \n50% das portadoras de endometriose têm dificuldade em ter filhos  (BULLETTI; COCCIA; \nBATTISTONI; BORINI, 2010; MACER; TAYLOR, 2012). Apesar dos estudos apoiarem as \nevidências de redução da fecundidade em portadoras da doença, os mecanismos envolvidos \nna etiopatogênese da infertilidade associada à endometriose ainda não foram integralmente \nelucidados, especialmente nos estadios iniciais da doença, em que não são observadas \nalterações anatômicas do trato reprodutivo (HOLOCH; LESSEY, 2010).  \nAs mulheres infér teis portadoras dos graus moderado e grave de endometriose \n(estágios III, e IV, respectivamente), podem ter sua infertilidade justificada pelas alterações \nanatômicas ocasionadas pelas adesões pélvicas e peritubárias características desse estágio da \ndoença. Tais alterações podem originar obstrução tubária, o que prejudica a comunicação \nentre ovários e ambiente uterino, e dificulta a liberação, captação e transporte do oócito \n(BULLETTI; COCCIA; BATTISTONI; BORINI, 2010) . Endometriomas são pseudocistos \nproduzidos pelo acúmulo de detritos menstruais e sangramento de lesões endometrióticas no \novário (HUGHESDON, 1957), e podem estar presentes no caso de endometriose moderada e \ngrave, sendo que de 30 a 40% das mulheres com endometriose apresentam endometrioma \n(VERCELLINI; CHAPRON; DE GIORGI; CONSONNI et al., 2003). Sua presença também \nparece influenciar negativamente na fertilidade, já que pode gerar um microambiente folicular \ncitotóxico, prejudicando o desenvolvimento oocitário (PAFFONI; BOLIS; FERRARI;  \nBENAGLIA et al. , 2019) , além de diminuir o número de folículos no córtex ovariano \n(KITAJIMA; DEFRÈRE; DOLMANS; COLETTE et al., 2011). \n Entretanto, as mulheres com endometriose mínima e leve (estágios I e II, \nrespectivamente), nas quais o acometimento da doença não causa as alterações anatômicas \nobservadas nos graus mais severos, também apresentam infertilidade  (HOLOCH; LESSEY, \n2010).  Um estudo de D'Hooghe apontou que a prevalência de endometriose para mulheres \nférteis foi de 4% em comparação com 33% na pop ulação infértil. Daquelas com a doença, \n68% tinham doença mínima ou leve e 32% tinham endometriose moderada ou grave. Também \n\n \n18 \n \nfoi mostrado que mulheres com endometriose mínima e leve tiveram uma taxa de fecundidade \nmensal de 3,6% em comparação com mulheres com infertilidade por fator masculino grave, \nque tiveram a taxa de fecundidade mensal de 12%, ambos os grupos recebendo sêmen de \ndoador (D'HOOGHE; DEBROCK; HILL; MEULEMAN, 2003). \nNesse sentido, pode -se pensar que a etiologia da infertilidade em mulheres com \nendometriose vai além de alterações anatômicas. Diversos estudos têm sido conduzidos a fim \nde elucidar essa questão. Ao se comparar a morfologia de embriões de mulheres com \nendometriose a embriões de mulheres sem a patologia, foi notado que os embriões do grupo \nde estudo tiveram a lterações morfológicas no dia 1 (D1) e dia 2 (D2) do desenvolvimento \nembrionário, sendo que tais alterações estão relacionadas negativamente com as taxas em \nimplantação e gestação (BRIZEK; SCHLAFF; PELLEGRINI; FRANK et al., 1995). Estudos \ndos efeitos do fluido peritoneal  (MORCOS; GIBBONS; FINDLEY, 1985)  e do soro \n(DAMEWOOD; HESLA; SCHLAFF; HUBBARD  et al. , 1990)  obtidos de mulheres com \nendometriose demonstram a toxicidade desses fluidos em embriões de camundongos em \ncultura, implicando essencialmente em um efeito sistêmico da doença in vivo. \nA capacidade do oócito de completar a maturação, estando em fase de metáfase II \n(MII), e de passar por uma fertilização bem -sucedida, reflete uma boa qualidade oocitária. \nLogo, o número de oócitos MII recuperados e a taxa de fertilização observada nos resultados \nde FIV/ICSI podem ser adotados como marcadores clínicos de competência oocitária \n(SANCHEZ; VANNI; BARTIROMO; PAPALEO et al., 2017). Evidências parecem sugerir \nque uma redução no número de oócitos maduros recuperados está consistentemente associada \nà endometriose, em comparação com outras causas de infertilidade (BARBOSA; TEIXEIRA; \nNAVARRO; FERRIANI  et al. , 2014; SHEBL; SIFFERLINGER; HABELSBERGER; \nOPPELT et al. , 2017) , bem como uma redução nas taxas de fertilização  (BARNHART; \nDUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002) . Esse conjunto de observações apoiam a hipótese \nde que a infertilidade de pacientes com endometriose está relacionada à diminuição da \nqualidade do oócito. \nAlguns autores também consideram o pape l do endométrio eutópico na infertilidade \nrelacionada à endometriose, de modo que alterações na receptividade endometrial podem \ncomprometer a implantação do embrião em mulheres com a doença, principalmente por \nexpressão anormal de moléculas durante a janel a de implantação  (BULLETTI; COCCIA; \nBATTISTONI; BORINI, 2010; GIUDICE; KAO, 2004; WEI; ST CLAIR; FU; STRATTON  \n\n \n19 \n \net al., 2009). Em contrapartida, estudos mais recentes mostraram que a expressão simultânea \nde genes cruciais para a receptividade endometrial não parece sofrer alterações significativas \nem mulheres inférteis com endometriose durante a janela de implantação  (DA BROI; \nROCHA; CARVALHO; MARTINS  et al. , 2017; GARCIA -VELASCO; FASSBENDER; \nRUIZ-ALONSO; BLESA et al., 2015). \nEstudos em programas de ovodoação reforçam um papel prioritário da qualidade \noocitária na etiopatogênese da infertilidade associada à endometriose: pacientes com \nendometriose têm as mesmas chances de implantação e gravidez que outras receptoras quando \nos oócitos são provenientes de doadoras saudáveis (SIMÓN; GUTIÉRREZ; VIDAL; DE LOS \nSANTOS et al., 1994; SUNG; MUKHERJEE; TAKESHIGE; BUSTILLO  et al., 1997). Em \ncontraste, as pacientes que receberam embriões derivados de oócitos de mulheres com \nendometriose mostraram uma taxa de implantação significativamente reduzida  (PELLICER; \nOLIVEIRA; GUTIERREZ, 1994) . Esses estudos apoiam a ideia de que a infertilidade de \npacientes com endometriose pode não estar relacionada ao fator endometrial, mas sim  à \ndiminuição da qualidade do oócito (SANCHEZ; VANNI; BARTIROMO; PAPALEO et al., \n2017). \n1.3. Processo inflamatório e estresse oxidativo  \nEvidências crescentes apoiam a conceituação da endometriose como uma condição \ninflamatória pélvica (BURNEY; GIUDICE, 2012). Em mulheres com endometriose, o líquido \nperitoneal apresenta um número aumentado de macrófagos ativados e diferenças importantes \nno perfil de citocinas  e quimocinas (RANA; BRAUN; HOUSE; GEBEL  et al. , 1996) . O \nmicroambiente peritoneal no cenário da endometriose é notavelmen te rico em \nprostaglandinas, e esses mediadores inflamatórios provavelmente desempenham um papel \ncentral na fisiopatologia da doença, bem como nas sequelas clínicas de dor e infertilidade \n(BURNEY; GIUDICE, 2012) . Macrófagos peritoneais de mulheres com endometriose \nexpressam níveis mais elevados de ciclo -oxigenase-2 (COX -2) e liberam quantidades \nsignificativamente maiores de prostaglandinas do que macrófagos de mulheres saudáveis \n(WU; SUN; LIN; HSIAO et al., 2002).  \nEm relação às causas de infertilidade associada à endometriose, mediadores \ninflamatórios encontrados nos fluidos peritoneal e folicular podem atuar na proliferação, \ndiferenciação celular e invasão de blastocistos  (MALVEZZI; HERNANDES; PICCINATO; \n\n \n20 \n \nPODGAEC, 2019) . Entre os efeitos nocivos descritos estão a diminuição da qualidade do \noócito (BARCELOS; VIEIRA; FERREIRA; MARTINS et al., 2009; DA BROI; NAVARRO, \n2016; FERREIRA; GIORGI; RODRIGUES; DE ANDRADE  et al. , 2019; GIORGI; DA \nBROI; PAZ; FERRIANI  et al., 2016; MALVEZZI; DA BROI; J; ROSA -E-SILVA et al., \n2018), distúrbios de interação espermatozóide/oócito  (HSU; TOWNSEND; OEHNINGER; \nCASTORA, 2015) , e prejuízo na  qualidade do embrião, em sua implantação e \ndesenvolvimento (STILLEY; BIRT; SHARPE -TIMMS, 2012). Qualquer um desses efeitos \nleva a uma condição reprodutiva alterada  (HAYDARDEDEOGLU; ZEYNELOGLU, \n2015). Os sintomas de dor também são agravados pela resposta inflamatória local secundária \nà ativação das respostas imunes  (ARNOLD; VERCELLINO; CHIANTERA; SCHNEIDER  \net al., 2013). \nA inflamação está associada à ativação do sistema de coagulação, aumento da perfusão \ne da permeabilidade vascular, bem como à produção de mediadores inflamatórios, incluindo \nos derivados do ácido araquidônico ( AA) e do ácido linoleico (LA).  Uma inflamação \nsistêmica pode interferir no curso normal dos ciclos menstruais, nos processos de \nfoliculogênese, ovulação e implantação do embrião  (SZCZUKO; KIKUT; KOMORN IAK; \nBILICKI et al., 2020).  \nAs prostaglandinas (PGs) são mediadores lipídico s do tipo eicosanoide s e são  \nimportantes reguladoras da ruptura folicular e liberação do oócito, e estão envolvidas na \nregulação da esteroidogênese, remodelação tecidual e neovascularização de folículos \nluteinizantes (DU; GAO; SHI; SUN  et al. , 2013) . Estudos  demonstraram que oócitos de \nmacacos e camundongos expressam receptores funcionais de prostaglandinas E 2 (PGE2), e \nque podem atuar diretamente em oócitos de mamíferos para retardar a maturação nuclear \n(MARTORIATI; LALMANACH; GOUDET; GÉRARD, 2002). Um estudo de Yan-Bo Du e \ncolaboradores mostrou que o fluido folicular de mulheres com endometri ose apresentou \nelevados níveis de PGE2, sendo que as mesmas mulheres tiveram uma diminuição do número \nde oócitos maduros e maus resultados nos tratamentos de reprodução assistida  (DU; GAO; \nSHI; SUN et al., 2013).  Tais resultados sugerem que concentrações alteradas de PGE2 podem \nperturbar o desenvolvimento de folículos e oócitos. \nVários autores têm associado a endometriose ao estresse oxidativo (EO)  (DA BROI; \nDE ALBUQUERQUE; DE ANDRADE; CARDOSO  et al. , 2016; DA BROI; JORDÃO; \nFERRIANI; NAVARRO, 2018; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI et al., 2016; GUPTA; \n\n \n21 \n \nAGARWAL; KRAJCIR; ALVAREZ, 2006; GUPTA; GOLDBERG; AZIZ; GOLDBERG  et \nal., 2008)  de modo que os implantes endometriais ectópicos promoveri am uma resposta \ninflamatória (MURPHY; SANTANAM; PARTHASARATHY, 19 98) com recrutamento e \nativação de macrófagos, liberação de citocinas e aumento de espécies reativas (AGARWAL; \nSALEH; BEDAIWY, 2003; RUDER; HARTMAN; BLUMBERG; GOLDMAN, 2008). Uma \ntendência a maior produção de agentes pró -oxidantes associada a uma potencial alteração da \nsua capacidade antioxidante poderia promover a perda do equilíbrio redox do trato reprodutivo \ne induzir à ocorrência de EO nessas pacientes  (AGARWAL; SALEH; BEDAIWY, 2003; \nGUPTA; AGARWAL; KRAJCIR; ALVAREZ, 2006; RUDER; HARTMAN; BLUMBERG; \nGOLDMAN, 2008) , o que, por sua vez, poderia estar envolvido no comprometimento  da \nfertilidade (AGARWAL; APONTE -MELLADO; PREMKUMAR; SHAMAN  et al. , 2012; \nDA BROI; JORDÃO; FERRIANI; NAVARRO, 2018; DA BROI; MALVEZZI; PAZ; \nFERRIANI et al., 2014; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI et al., 2016). \nReforçando essa hipótese, estudos têm evidenciado alterações em marcadores \ninflamatórios e oxidativos no fluido peritoneal de mulheres com a doença (FAN; CHEN; \nCHEN; LIU  et al. , 2018; POLAK; WERTEL; BARCZYŃSKI; KWAŚNIEWSKI  et al. , \n2013). Além disso, o estresse oxidativo parece não se restringir apenas ao local das lesões, de \nmodo que há evidências de sua ocorrência também a nível sistêmico  (ANDRADE; \nRODRIGUES; DIB; ROMÃO  et al. , 2010; DA BROI; DE ALBUQUERQUE; DE \nANDRADE; CARDOSO et al., 2016; LIU; HE; LIU; SHI et al., 2013; PRIETO; QUESADA; \nCAMBERO; PACHECO et al., 2012) e folicular (CHOI; CHO; SEO; PARK et al., 2015; DA \nBROI; JORDÃO; FERRIANI; NAVARRO, 2018; DA BROI; MALVEZZI; PAZ; \nFERRIANI et al. , 2014; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI  et al. , 2016; SINGH; \nCHATTOPADHYAY; CHAKRAVARTY; CHAUDHURY, 2013) . Como EO pode \ncomprometer a qualidade oocitária (LIU; TRIMARCHI; NAVARRO; BLASCO et al., 2003; \nNAVARRO; LIU; FERRIANI; KEEFE, 2006; N AVARRO; LIU; KEEFE, 2004) , as \nalterações identificadas em marcadores de EO no soro e no fluido folicular (FF) dessas \nmulheres poderiam sugerir consequente impacto no desenvolvimento oocitário, \ncomprometendo a qualidade gamética dessas pacientes. \n1.4. Lipídios \nOs lipídios são importantes alvos do EO  (AGARWAL; SALEH; BEDAIWY, 2003). \nA produção de agentes pró-oxidantes pode promover a peroxidação lipídica, de seus produtos \n\n \n22 \n \nde degradação e dos produtos formados pela sua interação com as lipoproteínas de baixa \ndensidade e outras proteínas  (AUGOULEA; MASTORAKOS; LAMBRINOUDAKI; \nCHRISTODOULAKOS et al., 2009). Sabe-se que os lipídios são os principais constituintes \ndas membranas celulares, são responsáveis por estocar energia dentro da célula e atuam como \nprecursores de mensageiros secundários  (MOK; SHIN;  LEE; LEE  et al. , 2016) . No \nmicroambiente folicular, os lipídios têm um importante papel no desenvolvimento de \ncompetência e na maturação oocitária (MOK; SHIN; LEE; LEE et al., 2016). \nComo os oócitos não sintetizam lipídios, eles obtêm essas moléculas das células \nfoliculares que o circundam e do FF, acumulando -os durante a maturação oocitária \n(AARDEMA; VOS; LOLICATO; ROELEN  et al. , 2011; DA BROI; GIORGI; WANG; \nKEEFE et al., 2018). Ácidos graxos (AG) são estocados, sob a forma de triglicerídeos (TAG), \ndentro das gotículas lipídicas existentes nas células do cumulus (CC) e no oócito, e são \noxidados pela mitocôndria para gerar energia para a síntese proteica durante a maturação \noocitária e o desenvolvimento embrionário inicial  (DUNNING; ANASTASI; ZHANG; \nRUSSELL et al., 2014). Os fosfolipídios e o colesterol são essenciais para a formação das \nmembranas celulares e são componentes extremamente importantes para a divi são celular \napós a fertilização  (DUNNING; ANASTASI; ZHANG; RUSSELL  et al. , 2014) . \nLipoproteínas, TAG e AG insaturados, como o oleico e linoleico e saturados, como o \npalmítico e o esteárico, são os principais componentes encontrados no FF humano \n(DUNNING; ANASTASI; ZHANG; RUSSELL et al., 2014) e seu perfil reflete, em menores \nníveis, o perfil encontrado  no soro (LEROY; VANHOLDER; DELANGHE; OPSOMER  et \nal., 2004; VALCKX; DE PAUW; DE NEUBOURG; INION et al., 2012). \nO impacto do conteúdo lipídico folicular sobre o potencial reprodutivo tem sido alvo \nde diversos estudos. Alguns autores têm associado altos níveis dos AG palmítico e esteárico \nno FF de mulheres submetidas a tratamentos de Reprodução Assistida a efeitos deletérios na \nmaturação oocitária, nas taxas de fertilização, implantação e no desenvolvimento embrionário \n(MIRABI; CHAICHI; ESMAEILZADEH; ALI JORSARAEI  et al. , 2017) . Além disso, a \npresença de altas concentrações desses ácidos graxos no FF tem sido associada a efeitos \ninibidores na quantidade de lipídios estocados dentro das gotículas lipídicas das células do \ncumulus e do oócito  (SHAAKER; RAHIMIPOUR; NOURI; KHANAKI  et al. , 2012)  e, \ntambém, à pobre morfologia do complexo cumulus-oócito (COC) (JUNGHEIM; MACONES; \nODEM; PATTERSON et al., 2011). \n\n \n23 \n \nCuriosamente, embriões humanos com falha de desenvolvimen to (HAGGARTY; \nWOOD; FERGUSON; HOAD  et al., 2006)  apresentam a mesma composição de AG que \noócitos com falha de fertilização  (MATORRAS; RUIZ; MEND OZA; RUIZ et al., 1998) , \napresentando um predomínio de AG palmítico e esteárico. Além do mais, qualquer \nmodificação na estrutura dos fosfolipídios presentes nas membranas celulares das células \nfoliculares e do oócito altera sua fluidez e sua permeabilidade (MOK; SHIN; LEE; LEE et al., \n2016). Mok et al. (2016) evidenciaram a redução de várias s ubclasses de fosfolipídios em \noócitos de camundongos que sofreram estresse oxidativo, indicando que a integridade dos \nfosfolipídios presentes na membrana plasmática do oócito pode ser afetada nessas condições, \ntornando-os alvos do possível EO que ocorre em  portadoras da doença (MOK; SHIN; LEE; \nLEE et al., 2016).  \nNo contexto da endometriose, há e vidências de aumento dos níveis de peróxidos \nlipídicos no fluido peritoneal  (LIU; LUO; ZHAO, 2001)  e fluido folicular (FF) de suas \nportadoras (DE LIMA; CORDEIRO; CAMARGO; ZYLBERSZTEJN et al., 2017; NASIRI; \nMOINI; EFTEKHARI-YAZDI; KARIMIAN et al., 2017; PETEAN; FERRIANI; DOS REIS; \nDE MOURA  et al. , 2008; SINGH; CHATTOPADHYAY; CHAKRAVARTY; \nCHAUDHURY, 2013) . Além disso, análise lipidômic a do FF de mulheres inférteis com \nendometriose encontrou duas subclasses lipídicas hiperrepresentadas (fosfatidilcolina e \nesfingomielina) (CORDEIRO; CATALDI; PERKEL; DA COSTA  et al. , 2015) , ambas \ncomponentes da membrana celular e fortemente relaciona das à apoptose  (VOUK; HEVIR; \nRIBIĆ-PUCELJ; HAARPAINTNER et al., 2012). \nSabe-se que o microambiente folicular pode ser impactado pelo conteúdo sanguíneo, \numa vez que o FF é formado, em parte, pelo transudato proveniente do plasma (EDWARDS, \n1974; PRIETO; QUESADA; CAMBERO; PACHECO et al., 2012). Nesse contexto, o perfil \nlipídico do FF pode refletir o encontrado no soro (LEROY; VANHOLDER; DELANG HE; \nOPSOMER et al., 2004; VALCKX; DE PAUW; DE NEUBOURG; INION et al., 2012). \n1.5. Metabolismo de ácidos graxos e eicosanoides \nOs metabólitos dos ácidos graxos poli -insaturados (PUFAs) são moléculas bioativas \nenvolvidas em eventos fisiopatológicos que afetam a maioria das células e tecidos humanos, \ncomo regulação do sistema imune, produção de citocinas, formação de anticorpos, \ndiferenciação, proliferação e migração celular (HARIZI; CORCUFF; GUALDE, 2008). Esses \n\n \n24 \n \nmediadores lipídicos derivados de PUFAs podem ser produzidos por meio de reações \niniciadas por espécies reativas de oxigênio (ROS), ou por reações de oxigenação mediada por \nenzimas, sendo elas a ciclo -oxigenase (COX), a lipoxigenase (LOX) e o citocromo P450 \n(CYP) (MASSEY; NICOLAOU, 2011). \nO ácido araquidônico (AA) é um PUFA liberado de fosfolipídios de membrana pela \nação das enzimas fosfolipases A2 (PLA2) em resposta a estímulos inflamatórios (HARIZI; \nCORCUFF; GUALDE, 2008). É do AA e de outros PUFAs, como o ácido eicosapentaenoico \n(EPA) e o ácido docosahexaenóico (DHA), que se derivam os mediadores lipídicos, entre eles \nos eicosanoides (MASSEY; NICOLAOU, 2013) , lipídios bioativos de grande importância \nfisiopatológica, por terem papel fundamental na inflamação, sendo  os derivados de AA  \nconsiderados predominantemente pró -inflamatórios, e os derivados de EPA e DHA \npredominantemente anti -inflamatórios (CALDER, 2006) . Embora a maioria dos tipos de \ncélulas seja capaz de sintetizar eicosanoides, eles são produzidos principalmente por basófilos, \neosinófilos, macrófagos, mastócitos, monócitos e neutrófilos (FUNK, 2001). \n Quando metabolizados pelas isoformas da COX (COX -1 constitutiva ou COX -2 \ninduzível), os AAs e EPAs geram prostaglandinas , prostaciclina e tromboxanos (TXs). \n(HELLIWELL; ADAMS; MITCHELL, 2004). Quando submetidos à oxigenação por ação da \nLOX, os PUFAs podem gerar uma série de eicosanoides: por exemplo, AA produz ácidos \nhidroxieicosatetraenoicos (HETEs), leucotrienos (LTs) e lipoxinas (LXs);  EPA gera ácido s \nhidroxieicosapentaenóicos (HEPEs) e resolvinas da série E (RvE's); e  o DHA produz \ndocosanóides, ácidos hidroxidocosahexaenóicos (HDHAs), maresinas, resolvinas da série D \n(RvD's) e protectinas (PDs) (KÜHN; O'DONNELL, 2006) . Ao usar AA como substrato, o \nCYP pode formar HETE e ácido epoxieicosatrienoico (EET) que são posteriormente \nmetabolizados em ácidos di-hidroeicosatetraenóicos (DHET) (KONKEL; SCHUNCK, 2011). \nFinalmente, em relação às reações mediadas por ROS, destacando -se as reações de \nperoxidação l ipídica de PUFAs, que podem formar uma variedade de pequenas moléculas \nlipídicas com estruturas e funções que se assemelham as dos eicosanoides, sendo eles os \nisoprostanos, levuglandinas e isolevuglandinas (CATALÁ, 2010). \n\n \n25 \n \n \nFigura 1:  metabolismo do ácido araquidônico (AA), gerando diferentes espécies de \neicosanoides pelas vias enzimáticas COX, LOX e CYP, e pela via de oxidação não -\nenzimática (por ROS). \n \n \nFigura 2:  metabolismo dos ácidos graxos poli -insaturados EPA e DHA, gerando \ndiferentes espécies de eicosanoides pela via enzimáticas da COX e LOX. \n \n\n\n \n26 \n \nSendo assim, considerando que há evidências de inflamação peritoneal e estresse \noxidativo sistêmico em mulheres infér teis com endometriose, com consequente potencial \nimpacto folicular, e sendo os lipídios importantes alvos de espécies reativas, incluindo os \neicosanoides, que também são mediadores da resposta inflamatória, questionamos a existência \nde alterações no perfil  de eicosanoides que poderiam alterar o microambiente folicular e \nprejudicar o recrutamento folicular, a maturação oocitária, a ovulação, a fertilização e /ou o \ndesenvolvimento do futuro embrião (LEROY; VANHOLDER; MATEUSEN; CHRISTOPHE \net al., 2005). Exemplo direto disso são os estudos que apontam as alterações na prostaglandina \nE2, um tipo de eicosanoide  (DU; GAO; SHI; SUN  et al., 2013), ou na via de produção da \nPGE2 (DA LUZ; DA BROI; DONABELA; PARO  et al. , 2017)  nas mulheres com \nendometriose e seu respectivo efeito na qualidade oocitária.  \nAté o momento, nenhum estudo avaliou o perfil de metabólitos de ácidos graxos poli -\ninsaturados no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose e controles e os \ncorrelacionou com os resultados dos procedimentos de Reprodução Assistida, o que traria \nimportantes dados acerca dos mecanismos inerentes à infertilidade associada a essa patologia. \n1.6. Espectrometria de massas \nA lipidômica se baseia na identificação e quantificação de lipídios em um determinado \nsistema biológico, a fim de se elucidar como o metabolismo e funções lipídicas podem ser \nafetados por determinadas espécies moleculares  (BLANKSBY; MITCHELL, 2010) . Novas \ntecnologias para melhor compreensão da composição lipídica vêm sendo definidas, dentre \nelas a espectrometria de massas (MS) (FERREIRA; SOUZA; RICCIO; CATHARINO et al., \n2009; FERREIRA; SARAIVA; CATHARINO; GARCIA et al., 2010), que consiste em uma \ntécnica analítica rápida, versátil e sensível, permit indo a detecção e determinação de \nbiomoléculas, assim como sua quantificação. A abordagem lipidômica, através da MS, \ncontribui para o estudo dos papéis biológicos dos lipídios na sinalização, no metabolismo e \nna estrutura da membrana celular (FERREIRA; SARAIVA; CATHARINO; GARCIA et al., \n2010).  \nA análise de mediadores lipídicos, entre eles os eicosanoides, por espectrometria de \nmassas é particularmente desafiadora, pois esses estão presentes em concentrações  \nextremamente baixas, são temporariamente formados por demanda das células e \nfrequentemente têm meia -vida limitada. Para dificultar mais a situação, podem ser geradas \n\n \n27 \n \nespécies isoméricas desses lipídios, as quais possuem função metabólica distinta e especí fica \n(MASSEY; NICOLAOU, 2011).  \nNesse sentido, a cromatografia líquida com espectrometria de massas em tandem (LC-\nMS/MS) vem se mostrando um excelente método na identificação e quantificação de lipídios \ncom baixa concentração em amostras biológicas  (TAM, 2013). Em particular, o advento da \nionização por electrospray (ESI) transformou completamente a forma como esses mediadores \nsão identificados e quantificados, resultando em grandes melhorias na seletividade e \nsensibilidade (FENN; MANN; MENG; WONG  et al. , 1989; MURPHY; BARKLEY; \nZEMSKI BERRY; HANKIN et al., 2005). Além disso, o monitoramento de reação múltipla \n(MRM) permite a rápida separação e identificação de espécies de lipídios, minimizando os \nrequisitos de preparação de amostras e evitando reações de derivatização (DOMINIC M. \nDESIDERIO, 2021). \nDeste modo, para o propósito do nosso estudo, a MS é uma poderosa e confiável \nferramenta para identificação de eicosanoides no soro e no fluido folicular, o que poderia se \nrefletir no microambiente folicul ar e afetar a qualidade oocitária, contribuindo para o \nentendimento adequado da infertilidade em mulheres portadoras de endometriose. \n  \n\n \n28 \n \nJUSTIFICATIVA \nA endometriose, doença de elevada prevalência populacional, tem sido frequentemente \nassociada à infertilidade, havendo forte embasamento na literatura acerca da sua relação com \na redução da fecundidade em ciclos naturais. Todavia, os mecanismos relacionados à redução \nda fertilidade  natural em pacientes inférteis com endometriose, especialmente na doença \ninicial, ainda não são claramente conhecidos. Nesse sentido, evidências recentes sugerem que \no comprometimento da qualidade oocitária possa ser um fator prioritário envolvido na \npatogênese da infertilidade relacionada à doença. \nA endometriose tem sido associada à inflamação peritoneal e ao estresse oxidativo \nsistêmico e folicular, o que poderia impactar a competência oocitária em portadoras da doença. \nProcessos inflamatórios e EO pode m modificar o perfil de metabólitos lipídicos do folículo \novariano dessas pacientes e, consequentemente, comprometer o desenvolvimento oocitário.  \nSabe-se que o microambiente folicular pode ser impactado pelo conteúdo sanguíneo, \numa vez que o FF é formado, em parte, pelo transudato proveniente do plasma. Nesse sentido, \no perfil lipídico do FF reflete o encontrado no soro. Considerando que há evidências de \ninflamação e estresse oxidativo sistêmicos em mulheres inférteis com endometriose, com \nconsequente pote ncial impacto folicular, e sendo os metabólitos lipídicos importantes \nmediadores de resposta inflamatória, bem como os ácidos graxos e fosfolipídios alvos de \nespécies reativas, questionamos a existência de alterações no perfil lipídico sérico que \npoderiam alterar o microambiente folicular e prejudicar a qualidade oocitária. Até o momento, \nnenhum estudo avaliou o perfil de eicosanoides no soro e no fluido folicular de mulheres \ninférteis com endometriose e controles e o correlacionou com os resultados dos procedimentos \nde Reprodução Assistida, o que traria importantes dados acerca desta enigmática patologia. \nDessa forma, torna -se essencial uma análise completa do perfil de eicosanoides do \nsoro e do fluido folicular de mulheres inférteis com e sem a doença e su a correlação com os \nresultados de Reprodução Assistida para um melhor entendimento da etiopatogenia da \ninfertilidade associada à endometriose.  \n  \n\n \n29 \n \nOBJETIVOS \n \n3.1. Objetivo Primário \n Comparar o perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose e com infertilidade por fator tubário e/ou masculino submetidas a EOC para \nrealização de fertilização in vitro. \n \n3.2. Objetivos Secundários  \n Correlacionar o perfil de eicosanoides observado no soro com o observado no fluido \nfolicular de mulheres inférteis com endometriose e controles. \nCorrelacionar o perfil de eicosanoides sérico e do fluido folicular de mulheres inférteis \ncom endometriose e co ntroles com seus respectivos resultados das técnicas de Reprodução \nAssistida (número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de oócitos \nfertilizados, taxa de fertilização, número de embriões clivados, taxa de clivagem, número de \nembriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de embriões \nformados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3, taxa de implantação, taxa de \ngestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos). \nComparar o perfil de eicosanoides no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e com infertilidade por \nfator tubário e/ou masculino submetidas a EOC para realização de fertilização in vitro. \nCorrelacionar o perfil de eicosanoides observado no soro com o observado no fluido \nfolicular de mulheres inférteis com endometriose sem endometrioma, endometriose com \nendometrioma e com infertilidade por fator tubário e/ou masculino. \nCorrelacionar o perfil de eicosanoides sérico e do fluido folicular de mulheres inférteis \ncom endometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e com infertilidade \npor fator tubário e/ou masculina com seus respectivos resultados das técnicas de Reprodução \nAssistida. \n\n \n30 \n \nMETODOLOGIA \n \n4.1. Modelo de estudo e local de realização \nTrata-se de um estudo  observacional caso-controle não multicêntrico, aprovado pela \nComissão Nacional de Ética em Pesquisa (parecer nº 3.349.839), desenvolvido junto ao Setor \nde Reprodução Humana, no DGO do Hospit al das Clínicas (HC) FMRP/USP. A coleta e o \npreparo do material foram realizados no laboratório de Ginecologia e Obstetrícia – \nHCFMRP/USP. Os procedimentos de extração lipídica das amostras e a análise do perfil de \neicosanoides, por espectrometria de massa s, de extratos lipídicos extraídos de amostras de \nsoro e fluido folicular foram realizados na Facility do Centro de Excelência em Quantificação \ne Identificação de Lipídios (Ceqil) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto \n(FCFRP-USP). \n \n4.2. Participantes e Critérios de elegibilidade \nPacientes do Setor de Reprodução Humana, do DGO do HCFMRP/USP que \npreencheram os critérios de elegibilidade no período de setembro de 2019 a outubro de 2021, \nforam convidadas a participar do estudo. As pacientes que concordaram em conceder as \namostras de sangue periférico e de fluido folicular assinaram o termo de consentimento livre \ne esclarecido (TCLE) previamente à inclusão no estudo. Como rotina d o serviço de \nReprodução Humana, todas as pacientes foram clinicamente examinadas para se determinar \no fator de infertilidade e somente foram incluídas pacientes submetidas aos protocolos de \nestimulação ovariana controlada (EOC) definidos no estudo. Para es te estudo, as pacientes \nforam divididas no grupo endometriose e grupo controle infértil (fator tubário e/ou masculino \nde infertilidade). \n Foram consideradas elegíveis as pacientes com idade inferior a 38 anos, IMC entre \n18,5 kg  ̸m2 e 30 kg  ̸m2, sem quaisqu er outras condições patológicas associadas como \ndislipidemia, doenças autoimunes, hormonais ( síndrome de ovários policísticos - SOP, \ntireoidopatias e outras), neoplasias malignas, insuficiência ovariana precoce,  anovulação \ncrônica, hidrossalpinge, doença c ardiovascular, doenças reumatológicas, doenças renais, \n\n \n31 \n \nhepatopatias, doenças crônicas como diabetes melittus e outras endocrinopatias, infecção pelo \nvírus HIV, hipertensão, qualquer infecção ativa, tabagismo, assim como usuárias crônicas de \nmedicações antidislipidêmica, hormonais, de anti-inflamatórios hormonais e não hormonais e \nde medicamentos como tiazídicos, betabloqueadores, corticóides e hormônio de crescimento \nnos seis meses anteriores à inclusão no estudo. \nNo grupo endometriose foram selecionadas pa cientes com infertilidade associada \nexclusivamente à endometriose, em todos os estadiamentos da doença (grau I a IV), \ndiagnosticada e classificada por videolaparoscopia (segundo os critérios da ASRM, 1997) \n(Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996, \n1997), ou então diagnosticas por USTV, com a presença de endometrioma. No grupo controle, \nforam incluídas pacientes que apresentaram infertilidade por fator tubário (sem hidrossalpinge \nou salpingite e doença inflama tória pélvica) e  ̸ ou masculino , mas com espermatozóides \nobtidos do ejaculado. Como fator masculino foi considerada a presença de contagem total de \nespermatozoides móveis (CTEP) menor que 10 milhões. A CTEP foi obtida pela \nmultiplicação do volume da ejaculação em mililitros pela concentração de espermatozóides e \na proporção de espermatozóides com motilidade progressiva dividida por 100% (AYALA; \nSTEINBERGER; SMITH, 1996; HAMILTON; CISSEN; BRANDES; SMEENK  et al. , \n2015). \nForam excluídas as pacientes que, após o recrutamento, foram submetidas a protocolos \nde estimulação ovariana distintos dos propostos para o estudo, que utilizaram a medicação \nincorretamente ou que tiveram o ciclo cancelado e não realizaram captação oocitária. \n \n 4.3. Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea \nCom o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de EOC foi utilizada a \nprogramação da menstruação, que consiste em se administrar anticoncepcionais orais \ncombinados diariamente, iniciados no p eríodo menstrual do ciclo precedente até cinco dias \nantes do previsto para o início da estimulação ovariana. \nA estimulação ovariana controlada foi iniciada cinco dias após a interrupção dos \ncontraceptivos orais combinados usados para a programação do ciclo. Todas as mulheres \nforam monitorizadas apenas por ultrassonografia transvaginal (UStv) (MARTINS; VIEIRA; \n\n \n32 \n \nTEIXEIRA; BARBOSA et al., 2014) e submetidas ao protocolo flexível com antagonista do \nGnRH (Cetrotid®, Merck Serono, Rio de Janeiro, Brasil ou Orgalutran®, Merck & Co, New \nJersey, EUA ), iniciado quando identificado um folículo com diâmetro médio ≥ 14 mm e \nmantido até o dia da administraçã o da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Ovidrel®, \nSerono, Brasil).  \nA EOC foi realizada com menotropina (Menopur©, Ferring, Aalst, Belgium, na dose de \n150 a 300 UI por dia ) ou alfacorifolitropina (Elonva®, Schering-Plough, Brasil; na dose de \n100 mcg para pacientes com até 60kg e 150 mcg para pacientes com mais de 60kg). Seis dias \napós a administração d e uma das gonadotrofinas, foi realizada a primeira UStv para \nmonitorização do ciclo.  \nQuando pelo menos dois folículos atingiram 17 mm de diâmetro médio, foi \nadministrado 250 µg de hCG recombinante neste dia ou no dia seguinte. A captação dos \noócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante.  \nA suplementação da fase l útea foi realizada com progesterona natural micronizada \n(Utrogestan®, Besins Healthcare, Brasil) por via vaginal na dose de 200mg, três vezes ao dia, \na partir do dia da captação oocitária e mantida até a décima segunda semana da gestação, nas \npacientes que engravidaram. \n \n4.4. Captação oocitária \nPara a captação dos oócitos, as pacientes foram submetidas a anestesia geral venosa \ncom propofol (Diprivan®, Zeneca-Astra, Brasil), além de fentanil (Fentanil®, Jansen -Cilag, \nBrasil). Os folículos ovarianos foram aspirados por via endovaginal, guiada por um transdutor \nde ultrassom transvaginal. Uma agulha padrão de lúmen único (Wallace, Smiths Medical, \nMexico) foi usada, com pressão aspirativa artificial constante de 100mmHg obtida com uma \nbomba de sucção controlada e letronicamente (Craft® Bomba de sucção, Rocket Medical, \nIngalterra). Os folículos de ambos os ovários foram aspirados em pool. \nO conteúdo aspirado foi analisado em estereomicroscópio e, após a identificação, os \nCOCs foram lavados para remoção de sangue e debris e as CCs foram parcialmente removidas \nmecanicamente por microdissecção com a utilização de duas agulhas de insulina, em HTF -\n\n \n33 \n \nSSS. Os COCs foram colocados em placas de cultura HTF -HEPES suplementado com 10% \nde soro substituto sintético (SSS, Irvine Sci entific) até o final da captação. Após, eles foram \ntransferidos para placas de cultura de células (One well dish, Corning, EUA) contendo o meio \nde cultura CSCM (Continuous Single Culture Médium, Irvine Scientific) e incubados a 37°C \nem 5% de CO2 e 95% de humidade durante 2 a 5 horas. Após este período, os COCs destinados \nà ICSI foram desnudados e os oócitos classificados em maduros [metáfase II (MII) – presença \nde 1 corpúsculo polar (CP) extruso] e imaturos [vesícula germinativa (VG) – ausência do CP \nextruso e presença de VG, e metáfase I (MI) – ausência do CP e da VG], sob visualização ao \nmicroscópio de luz.  \n \n 4.5. Coleta e armazenamento das amostras \nO sangue foi coletado em tubo BD Vacutainer ® SST ® II Advance® (com ativador \nde coágulo e partículas de sílica na parede), no momento da punção venosa para administração \nda anestesia geral e realização da captação oocitária. As amostras de sangue foram deixadas \nem temperatura ambiente por 30 minutos para efetuar a coagulação, e foram centrifuga das a \n700 x g por 10 minutos a 4 °C para a separação do soro. Removeu-se o sobrenadante e \ncentrifugou-se novamente, nas mesmas condições. Em seguida, o soro foi transferido para \nmicrotubos individuais de 1,5ml DNAse e RNAse (Axygen, Corning Inc, NY, EUA), e foi \ndado um jato de gás de nitrogênio encima das amostras, a fim de se retirar o oxigênio de dentro \ndo microtubo e minimizar a oxidação das amostras. O armazenamento foi feito a -80°C para \nposterior extração de lipídios e análise. \nO fluido folicular foi obtido após o procedimento de captação oocitária, depois de se \ninspecionar e retirar os oócitos do aspirado folicular. Foi centrifugado a 1000 x g por 10 \nminutos a 4 °C para separação da fase líquida e dos componentes celulares. Em seguida, foi \ntransferido para microtubos individuais de 1,5ml DNAse e RNAse (Axygen, Corning Inc, NY, \nEUA), e foi dado um jato de gás de nitrogênio em cima das amostras, a fim de se retirar o \noxigênio de dentro do microtubo e minimizar a oxidação das amostras. O armazenamento foi \nfeito a -80°C para posterior extração de lipídios e análise. \n \n\n \n34 \n \n4.6. ICSI e a avaliação da qualidade embrionária \nOs oócitos maduros foram submetidos à ICSI 3 a 4 horas após a captação de oócitos \ne, depois de injetados, cultivados em gotas separadas. A ferti lização foi avaliada \naproximadamente 16-18 horas após a ICSI, caracterizada pela presença de dois pronúcleos e \ndois corpúsculos polares. A taxa de fertilização foi calculada com base no número de oócitos \nfertilizados divididos pelo número de oócitos injeta dos x 100. Cerca de 43 a 45 horas após a \nICSI (segundo dia de desenvolvimento-D2), foi avaliada a taxa de clivagem (que corresponde \nao número de embriões clivados divididos pelo número total de oócitos fertilizados x 100) e \na qualidade embrionária, baseada  no número e na simetria dos blastômeros, percentual de \nfragmentação e presença ou ausência de multinucleação. Foram considerados como embriões \nde boa qualidade em D2 os que apresentarem 4 blastômeros simétricos, sem fragmentação e \nsem multinucleação (ALPHA; ESHRE, 2011). Nos casos em que a transferência embrionária \nnão foi realizada em D2, a qualidade embrionária foi novamente analisada aproximadamente \n67-69 horas após a ICSI (D3). Foram considerados de boa qualidade no D3 os embriões com \n8 blastômeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação. A transferência \nembrionária foi realizada em D2 ou D3 de acordo com as considerações individualizadas para \ncada caso. \n 4.7. Demais variáveis analisadas \nQuatorze dias após a transferência embrionária foi realizada a análise do β -hCG \nsanguíneo, sendo considerada como gravidez química a pr esença de β-hCG positivo (maior \nou igual a 25 UI/ml). A taxa de gravidez química foi calculada dividindo -se o número de \npacientes com β -hCG positivo após 14 dias da transferência embrionária pelo número de \nciclos com transferência, multiplicado por 100. Fo i avaliada também a taxa de implantação, \ncaracterizada pelo número de sacos gestacionais divididos pelo número de embriões \ntransferidos x 100 e a taxa de gravidez clínica por ciclo transferido, caracterizada pelo número \nde pacientes com embrião com batimen to cardíaco visualizado ao USTV realizado 6 a 7 \nsemanas após a transferência embrionária dividido pelo número de ciclos com transferência \nembrionária x 100. A taxa de nascidos vivos por ciclo de transferência embrionária foi \ndefinida como o número de ciclos com nascimento vivo dividido pelo número de ciclos com \ntransferência de embrião x 100. Foram também avaliados o número total de oócitos captados, \nmaduros, fertilizados, de embriões clivados e produzidos, e de sacos gestacionais.  \n\n \n35 \n \n4.8. Extração lipídica \nA extração lipídica foi realizada após a coleta de todas as amostras biológicas, \npreviamente à análise, respeitando um tempo de armazenamento dos extratos lipídicos de seis \nmeses, para evitar degradação das mesmas. As amostras de soro e fluido folicular for am \ndescongeladas à temperatura ambiente por 5 minutos.  \nOs eicosanoides foram extraídos das amostras de soro e fluido folicular pelo método \nsolid phase extraction (SPE) (SORGI; PETI; PETTA; MEIRELLES et al., 2018). Segundo o \nprotocolo, as amostras de soro e fluido folicular, aliquotadas em volume de 200 μ L em \nmicrotubos de 1,5 mL, tiveram as proteínas desnaturadas com 800 μL de metanol (Merck, \nKenilworth, NJ, EUA), seguido da adição de 10 uL de padrão interno de eicosanoides \n(Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI, EUA). As proteínas desnaturadas foram removida s \npor centrifugação a 12000 rpm, por 20 minutos, a 4 º C, e os sobrenadantes resultantes foram \ndiluídos em água Milli -Q (Merck-Millipore, Kenilworth, NJ, EUA), a fim de se obter uma \nconcentração de metanol de 10%.  \nA purificação das amostras foi então realizada usando colunas C18 SPE (Hypersep \nC18-500 mg, 3mL, Thermo Scientific-Bellefonte, PA, EUA). Foram previamente preparadas \nas soluções de H 2O + ácido acético (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, EUA) diluído a 0,1% \n(solução 1), e de MeOH + ácido acético di luído a 0,1% (solução 2). O condicionamento da \ncoluna foi feito com 4mL de MeOH e 4 mL da solução 1. Em seguida, a coluna é carregada \ncom o volume total da amostra diluída e lavada com 4 mL da solução 1 para remoção de \nimpurezas hidrofílicas. Por fim, se dá a eluição da amostra com 1 mL da solução 2. Os extratos \npurificados foram armazenados a -80 ° C para prevenir a degradação do metabólito. Antes das \nanálises, o solvente deve ser evaporado à vácuo (Concentrator Plus, Eppendorf, Alemanha) \nem temperatura ambiente, e os extratos ressuspendidos em solução de MeOH+ H 2O (7 : 3 ; \nv/v) e armazenados a -80 º C para análise LC-MS/MS. \n \n4.9. LC-MS/MS \nA análise do soro e do FF foi realizada por cromatografia líquida com espectrometria \nde massas em tandem (LC-MS/MS). Ao longo das análises, a coluna foi mantida a 25 °C e as \namostras foram mantidas a 4 °C. Uma alíquota de 10 μL de cada amostra foi injetada na \n\n \n36 \n \ncoluna. O pH da fase móvel foi otim izado para alcançar a melhor sensibilidade e separação \ncromatográfica dos metabólitos lipídicos. As condições utilizadas para a cromatografia estão \ndescritas no apêndice 2  (PETTA; MORAES; FACCIOLI, 2015; SORGI; PETI; PETTA; \nMEIRELLES et al., 2018). \nO sistema de cromatografia líquida de ultra alta performance  (UHPLC) foi \ninterfaceado com um Espectrômetro de Massa TripleTOF5600+ (Sciex -Foster, CA, EUA) \nequipado com um Turbo-V IonSpray. Uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo \nde íon negativo foi utilizada para varredura MRM  HR. A faixa de massa dos experimentos de \nproduct ion foi de m/z 50 a 700, o tempo de permanência foi de 10 ms e uma resolução de \nmassa de 35.000 foi alcançada em m/z 400. As aquisições de dados foram realizadas usando \no Analyst Software (Sciex-Foster, CA, EUA).  \nOs eicosanoides analisados foram: LTB4, 6-trans-LTB4, 20-OH-LTB4, LTC4, LTD4, \n11-trans-LTD4, LTE4, LXA4, RvD1, RvD2, TXB2, PGB2, PGE2, PGD2, 15-keto-PGE2, 20-\nOH-PGE2, PGD2, PGJ2,15 -deoxi-PGJ2, 6 -keto-PGF1α, PGF2α, 19 -OH-PGB2, PGG2, \nmaresina, 5-HETE, AA, 5-oxo-ETE, 20-HETE, 5,6-DIHETE, 12-HETE, 8-HETE, 11-HETE, \n12-oxo-ETE, 12 -oxo-LTB4, 15-oxo-ETE, 11,12 -DIHETRE, 14,15 -DIHETRE, EPA, DHA, \n15-HETE, 5,6-DIHETRE. \nA identificação das espécies lipídicas obtidas na análise de LC -MS foi realizada \nusando o PeakView 2.1 (Sciex -Foster, CA, EUA). Resum idamente, este software combina \ninformações em três dimensões para fornecer uma representação do tempo de retenção, \nintensidade do sinal e valor m/z para cada analito. O processamento de dados passou por várias \netapas, incluindo filtragem, detecção de recursos, alinhamento e normalização.  \nPara análise quantitativa, usamos o MultiQuant. Este software usa algoritmos de \nintegração robustos, como MQ4 e SignalFinder avançado, e é capaz de gerar resultados de \nintegração confiáveis mais rapidamente com menos intervenção do usuário para maximizar a \nprodutividade. O uso de padrões de referência para cada uma das espécies ou classes lipídicas \nalvo foi importante na quantificação dos lipídios sob investigação. Nesse campo, é prática \ncomum normalizar as intensidades de pico de íons moleculares individuais usando um padrão \ninterno para cada classe de lipíd ios. A proporção calculada de analito para padrão interno é \nentão multiplicada pela concentração do referido padrão interno de modo a obter a \nconcentração de um determinado analito presente na amostra. Para quantificar os mediadores \n\n \n37 \n \nlipídicos em nosso trabalho, canais MRM HR foram criados durante o processamento de dados \ncomputacionais. Estes foram instruídos a selecionar íons de produto de maior intensidade e \nseletividade, a fim de obter maior sensibilidade analítica e evitar identificação cruzada. A \nconcentração final de eicosanoides em amostras biológicas foi normalizada pelo volume, peso \ndo fluido ou concentração de proteína/DNA. \n \n4.10. Tamanho do estudo  \nConsiderando os restritivos critérios de elegibilidade  e as dificuldades impostas pela \npandemia pela Covid-19, foram incluídas todas as mulheres elegíveis que aceitaram participar \ndo estudo no período de coleta de 25 meses.  \n \n4.11. Análise Estatística \nA análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SAS® 9.3. \n Foi realizada uma análise exploratória de dados através de medidas de posição central \ne de dispersão e gráficos de box-plot.  \nPara a comparação da concentração de eicosanoides entre os gru pos endometriose e \ncontrole foi utilizado o teste t de student, e quando se realizou a comparação entre os grupos \nendometriose sem endometrioma, endometriose com endometrioma e grupo controle, usou -\nse o Teste variância ANOVA e pós-teste de Tukey. \nPara a comparação das características clínicas e resultados de TRA entr e os grupos \nendometriose e controle, as variáveis com distribuição normal (idade, FSH basal, IMC, tempo \nde infertilidade) foram analisadas usando o teste t de stud ent. Já as variáveis que não \napresentaram distribuição normal (número de oócitos captados, nú mero de oócitos maduros, \nnúmero de embriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de \nboa qualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa \nqualidade em D3) foram analisadas com o teste de teste de Mann-Whitney. Para a comparação \ndas características clínicas e resultados de TRA entre os grupos endometriose com \nendometrioma, endometriose sem endometrioma e controle, as variáveis com distribuição \n\n \n38 \n \nnormal (idade, FSH basal, IMC, tempo de infertilidade) foram analisadas usando o teste de \nvariância (ANOVA) seguido do pós -teste de Turkey . Já as variáveis que não apresentaram \ndistribuição normal (número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de \nembriões clivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa \nqualidade em D2, número de embriões formados em D3, número de embriões de boa \nqualidade em D3) foram analisadas com o teste de teste de Kruskal -Wallis seguido do pós-\nteste de Turkey. As variáveis: taxa de fertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, taxa \nde gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos foram comparadas entre \nos mesmos grupos com o teste do Qui-quadrado.  \nO perfil lipídico e os resultados de TRA foram correlacionados utilizando -se a \ncorrelação de Spearmann, assim como os níveis de eicosanoides no soro e no FF. \nO nível de significância adotado foi de 5%.  \n\n \n39 \n \nRESULTADOS  \n \n5.1. Fluxograma \nNo período de setembro de 2019 a outubro de 2021 foram analisados 999 prontuários de \nmulheres admitidas por infertilidade conjugal no Serviço de Reprodução Assistida do \nLaboratório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina \nde Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Desses, 14 5 pertenciam a pacientes que \npreenchiam os critérios de elegibilidade. Das 14 5 mulheres elegíveis, 40 tiveram alta do \nserviço e 109 iniciaram o ciclo de estimulação ovariana e foram convidadas a participar da \npesquisa, sendo que 11 mulheres não aceitaram participar do estudo e 9 4 assinaram o termo \nde consentimento livre e esclarecido (TCLE). Destas, 50 foram excluídas porque tiveram o \nciclo cancelado por apresentarem má resposta ovariana ou outros fatores, como suspensão do \ntratamento devido à pandemia de COVID -19. Assim, foram coletadas am ostras de 4 4 \npacientes. Destas, 21 foram destinadas ao grupo endometriose e 23 ao grupo controle. Após a \ncoleta, 6 foram excluídas por diversos motivos (não tiveram folículo puncionado, amostra \ninsuficiente de FF, dificuldade na coleta do sangue periférico , sangue hemolisado, entre \noutros), sendo três do grupo endometriose e três do grupo controle. Assim, o número amostral \nfoi de 20 pacientes para o grupo controle e 18 para o grupo endometriose. As pacientes do \ngrupo endometriose foram subdivididas no grupo endometriose sem endometrioma e \nendometriose com endometrioma, sendo constituídos por 10 e 8 pacientes, respectivamente. \nO fluxograma do estudo está representado na figura 3. \n \n \n \n\n \n40 \n \n \nFigura 3: fluxograma do estudo com o número de pacientes elegíveis, incluídas, excluídas e amostras \ncoletadas e analisadas divididas em controle e endometriose.  \n \n\n\n \n41 \n \n5.2. Caracterização dos grupos \nA comparação das variáveis clínicas: idade, IMC, FSH basal e tempo de infertilidade \nentre o grupo endometriose e grupo controle não demonstraram diferença estatística \nsignificativa, evidenciando a homogeneidade entre os grupos. Os resultados estão expresso s \nna tabela 1.  \nTabela 1 – Características clínicas: idade, IMC, tempo de infertilidade e FSH basal em \npacientes controle e com endometriose.  \nVariável Controle Endometriose  Valor de p \nIdade (anos) 35,6 (±4,02) 36 (±3,51) 0,71 \nIMC (kg/m²) 24,4 (±3,26) 23,4 (±2,71) 0,32 \nFSH basal (mUI/mL) 5,2 (±1,48) 6,5 (±2,21) 0,06 \nTempo de infertilidade \n(meses) 75,6 (±50,37) 77,7 (±47,08) 0,89 \nNota: Dados expressos em média  e desvio -padrão. Teste t de student. Nível de \nsignificância de 5% \n \nDentre as pacientes do grupo controle, apenas três apresentavam exclusivamente fator \ntubário de infertilidade, enquanto as demais 17 pacientes foram diagnosticadas com fator \nmasculino de infertilidade. Dentre as pacientes com endometriose, duas apresentaram fator \nmasculino associado a endometriose. \nA respeito da gonadotrofina utilizada na EOC de cada grupo, no grupo controle \ntivemos 15 pacientes utilizando Menopur®, e 5 utilizando alfacorifolitropina. No grupo \nendometriose, as 18 paciente fizeram a EOC utilizando Menopur®. \nEm relação aos resultados de TRA, para os grupos controle e endometriose, observou-\nse maior número de oócitos maduros, oócitos fertilizados, número de embriões clivados, e \nnúmero de embriões formados em D2 no grupo controle comparado ao en dometriose. As \ndemais variáveis, incluindo as taxas de fertilização, clivagem, implantação, gestação química, \ngestação clínica e nascidos vivos, não apresentaram diferença estatística significativa (tabelas \n2 e 3). \n\n \n42 \n \nTabela 2 – Resultados de TRA no grupo controle e endometriose: número de oócitos \ncaptados, número de oócitos maduros, número de embriões clivados, número de \nembriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número de \nembriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3.  \nVariável Controle Endometriose Valor de p \nNº de oócitos captados 9,7 (6; 13) 6,2 (3; 8,5) 0,06 \nNº de oócitos maduros 8 (5; 11) 4,6 (2,5; 6,5) 0,02* \nNº de oócitos fertilizados 5,8 (3; 7,5) 3,3 (1,5; 5,5) 0,04* \nNº de embriões clivados 5,7 (3; 7) 3,2 (1,5; 5)  0,02* \nNº de embriões formados em \nD2 5,7 (3; 7) 3,2 (1,5; 5) 0,02* \nNº de embriões de boa \nqualidade em D2 2,9 (0,5; 4) 1,3 (0; 3) 0,07 \nNº de embriões formados em \nD3 5,4 (3; 6,5) 3 (1,5; 4,5) 0,14 \nNº de embriões de boa \nqualidade em D3 2,6 (1; 3) 1,4 (0,5; 3) 0,15 \nNº de embriões transferidos a \nfresco 2 (2; 2) 1,5 (1; 2) 0,18 \nNº de sacos gestacionais 0,7 (0; 1) 0,2 (0; 0,5) 0,15 \nNº de embriões com \nbatimento cardíaco 0,5 (0; 1) 0,25 (0; 0,5) 0,68 \nNº de nascidos vivos 0,5 (0; 1) 0,25 (0; 0,5) 0,68 \nNota: Dados expressos como mediana (intervalo interquartil). Teste de Mann Whitney. Nível \nde significância: 5% \n \n\n \n43 \n \nTabela 3 – Resultados de TRA no grupo controle e endometriose:  taxa de \nfertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, taxa de gestação química, taxa \nde gestação clínica e taxa de nascidos vivos.  \nVariável Controle Endometriose Valor de p \nTaxa de fertilização 66,7% 70,5% 0.56 \nTaxa de clivagem 92,9% 96,6% 0.97 \nTaxa de implantação 41,7%  22,9%  0.51 \nTaxa de gestação química 50,0% 37,5% 0.70 \nTaxa de gestação clínica 50,0% 25,0% 0.68 \nTaxa de nascidos vivos 50,0% 25,0% 0.68 \nNota: Dados expressos em porcentagem. Teste do qui-quadrado. Nível de significância: 5% \nAo separarmos o grupo endometriose nos subgrupos com endometrioma, e sem \nendometrioma, o resultado permaneceu o mesmo, não havendo diferença estatística para todas \nas variáveis analisadas (tabela 4). \nTabela 4 – Características clínicas: idade, IMC, tempo de infertilidade e FSH basal em pacientes \ncontrole, com endometriose sem endometrioma, e com endometriose com endometrioma.  \nVariável Controle Endometriose \nsem OMA \nEndometriose \ncom OMA Valor de p \nIdade (anos) 35,6 (±4,02) 36,1 (±3,38) 36,7 (±3,73) 0,76 \nIMC (kg/m²) 24,4 (±3,26) 23,6 (±3,42) 23,6 (±3,42) 0,79 \nFSH basal (mUI/mL) 5,2 (±1,48) 6,9 (±2,23) 6,0 (±1,87) 0,06 \nTempo de \ninfertilidade (meses) 75,6 (±50,37) 88,5 (±46,12) 47,88 (±45,23) 0,89 \nNota: Dados expressos em média (desvio -padrão). Teste de variância (ANOVA) e pós -teste de \nTukey. Nível de significância de 5%. Valores do pós teste de Tukey para a variável CTEP: controle \n\n \n44 \n \nx endometriose sem endometrioma (p = 0,008); controle x endometriose com e ndometrioma (p = \n0,002); endometriose sem endometrioma x endometriose com endometrioma (p = 0,36). \n \nEm relação aos resultados de TRA , a análise com a subdivisão do grupo endometriose \nem endometriose com OMA e endometriose sem OMA, e grupo controle, não evi denciou \ndiferença estatística entre as variáveis analisadas (tabelas 5 e 6).  \nTabela 5 – Resultados de TRA nos grupos controle, endometriose sem endometrioma e endometriose \ncom endometrioma: número de oócitos captados, número de oócitos maduros, número de embriões \nclivados, número de embriões formados em D2, número de embriões de boa qualidade em D2, número \nde embriões formados em D3, número de embriões de boa qualidade em D3, número de embriões \ntransferidos a fresco, número de sacos gestacionais, número de embriões com batimento cardíaco e \nnúmero de nascidos vivos.  \nVariável Controle \nEndometriose \nsem OMA \nEndometriose \ncom OMA \nValor de p \nNº de oócitos captados 9,7 (6; 13) 5,7 (3; 8) 5,4 (1,5; 7,5) 0,06 \nNº de oócitos maduros 8 (5; 11) 4,8 (3; 6) 4,3 (2; 7) 0,06 \nNº de oócitos fertilizados 5,8 (3; 7,5) 3,1 (2; 5) 3,5 (1; 6) 0,13 \nNº de embriões clivados 5,7 (3; 7) 2,9 (2; 4) 4 (2; 6) 0,14 \nNº de embriões formados em \nD2 \n5,7 (3; 7) 2,9 (2; 4) 4 (2; 6) 0,09 \nNº de embriões de boa \nqualidade em D2 \n2,9 (0,5; 4) 1,1 (0; 2) 1,6 (0; 3) 0,11 \nNº de embriões formados em \nD3 \n5,4 (3; 6,5) 3,3 (2; 4,5) 4 (2; 6) 0,21 \nNº de embriões de boa \nqualidade em D3 \n2,6 (1; 3) 1,5 (0,5; 3) 1,3 (0,5; 2) 0,19 \nNº de embriões transferidos a \nfresco \n2 (2; 2) 1,4 (1; 2) 1,67 (1; 2) 0,42 \nNº de sacos gestacionais 0,7 (0; 1) 0,4 (0; 1) 0,3 (0; 1) 0,73 \nNº de embriões com \nbatimento cardíaco \n0,5 (0; 1) 0,4 (0; 1) 0 0,56 \n\n \n45 \n \nNº de nascidos vivos 0,5 (0; 1) 0,4 (0; 1) 0 0,56 \nNota: Dados expressos como mediana e intervalo interquartil. Teste de Kruskal-Wallis. Nível de \nsignificância: 5% \n \n \nTabela 6 – Resultados de TRA nos grupos controle, endometriose sem endometrioma e \nendometriose com endometrioma: taxa de fertilização, taxa de clivagem, taxa de implantação, \ntaxa de gestação química, taxa de gestação clínica e taxa de nascidos vivos.  \nVariável Controle \nEndometriose \nsem OMA \nEndometriose \ncom OMA \nValor de p \nTaxa de fertilização 67% 74% 64% 0,68 \nTaxa de clivagem 93% 96% 98% 0,85 \nTaxa de implantação 42% 27% 17% 0,70 \nTaxa de gestação química 50% 40% 33% 0,90 \nTaxa de gestação clínica 50% 40% 0% 0,56 \nTaxa de nascidos vivos 50% 40% 0% 0,56 \nNota: Dados expressos em porcentagem. Teste do qui-quadrado. Nível de significância: 5% \n \n5.3. Concentração de eicosanoides \nNa análise do perfil dos eicosanoides, foram avaliados um total de 41 analitos tanto no \nsoro quanto no fluido folicular, conforme previsto a metodologia utilizada no estudo. Dos 41 \neicosanoides analisados, cinco foram detectados nas amostras de soro, inclu indo o ácido 5 -\nhidroxieicosatetraenóico (5-HETE), o ácido 11-hidroxieicosatetraenóico (11-HETE), o ácido \n15-oxoicosatetraenóico (15 -oxo-ETE), o ácido eicosapentaenóico (EPA) e o ácido 15 -\nhidroxieicosatetraenóico (15-HETE). Os mesmos cinco estavam presentes  nas amostras de \nfluido folicular, com a adição da prostaglandina E2 (PGE-2). \n \n\n \n46 \n \nAo comparar os grupos de mulheres com endometriose e o grupo controle, não foram \nobservadas diferenças estatisticamente significativas na concentração de cada eicosanoide no \nsoro. A tabela 7 descreve a concentração em picograma por mililitro dos cinco eicosanoides \npresentes no soro nos grupos controle e endometriose. \nTabela 7: Concentração de eicosanoides no soro. Concentração em picograma por mililitro \n(pg/mL) dos eicosanoides 5 -HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no soro de \nmulheres inférteis com endometriose e controles inférteis.  \n \nEicosanoide Controle Endometriose  Valor de p \n5-HETE 82,11 (±61,75) 87,67 (±83,04) 0,81 \n11-HETE 101,74 (±74,33) 88,76 (±74,94) 0,6 \n15-oxo-ETE 68,67 (±67,46) 34,27 (±60,29) 0,12 \nEPA 8197,14 (±7959,79) 8629,82 (±5555,29) 0,85 \n15-HETE 82,71 (±76,00) 112,47 (±112,91) 0,35 \nNota: Dados expressos em média (desvio -padrão). Teste t de student. Nível de \nsignificância de 5% \n \nA fim de se entender se a presença de endometrioma estaria relacionada a alguma \npotencial mudança nos níveis de eicosanoides séricos, o grupo endometriose foi classificado \nnos subgrupos com endometrioma e sem endometrioma. Tal subdivisão evidenciou uma \ndiferença estatisticamente significante nas concentrações de 5-HETE, sendo maior no grupo \nendometriose sem OMA (120,45 pg/mL) comparado  ao grupo endometriose com OMA \n(38,47 pg/mL; p = 0,01). Os demais eicosanoides não apresentaram diferenças de \nconcentração entre os grupos. A Tabela 8 demostra a média de concentração de cada \neicosanoide nos grupos de estudo. As diferenças de concentração de 5-HETE nas amostras de \nsoro também podem ser observadas no gráfico apresentado na figura 4. \n \nTabela 8: Concentração de eicosanoides no soro de mulheres inférteis com endometriose  sem \nendometrioma, com endometriose com endometrioma, e controles inférteis.  \n\n \n47 \n \nEicosanoide Controle \nEndometriose sem \nOMA \nEndometriose com \nOMA \nValor \nde p \n5-HETE 82,11 (±61,75) 120,45 (±88,20) 38,47 (±30,56) 0,04* \n11-HETE 101,74 (±73,33) 89,85 (±47,47) 93,91 (±97,90) 0,91 \n15-oxo-ETE 68,67 (±67,46) 45,33 (±73,93) 44,01 (±67,47) 0,57 \nEPA 8197,14 (±7959,79) 8149,58 (±3948,42) 10294,82 (±7798,17) 0,75 \n15-HETE 82,71 (±76,00) 124,54 (±102,57) 102,10 (±123,27) 0,51 \nNota: Dados expressos em média (desvio -padrão), concentração em picograma por mililitro \n(pg/mL). Teste variância ANOVA e pós -teste de Tukey. Nível de significância de 5%. V alores do \npós-teste de Tukey para a variável concentração de 5 -HETE: controle x endometriose sem \nendometrioma (p = 0,13); controle x endometriose com endometrioma (p = 0,11); endometriose sem \nendometrioma x endometriose com endometrioma (p = 0,01) \n \n \nFigura 4: gráfico da concentração do eicosanoide 5-HETE nas amostras de soro dos grupos controle, \nendometriose sem OMA e endometriose com OMA. * concentração superior no grupo endometriose sem OMA \ncomparado ao grupo com OMA. \n\n\n \n48 \n \nAgora, em relação à concentração de cada eicosanoide no fluido folicular, houve \ndiferença estat isticamente relevante nas concentrações de EPA, sendo maior no grupo \nendometriose (4038,52 pg/mL), comparado ao grupo controle (1159,83 pg/mL , p=0,03). Os \ndemais eicosanoides não apresentaram diferenças relevantes de concent ração entre os  dois \ngrupos. A Tabela 9 demostra a média de concentração de cada eicosanoide  para os grupos \ncontrole e endometriose.  \n \nTabela 9: Concentração de eicosanoides no fluido folicular de mulheres inférteis \ncom endometriose e controles inférteis.  \nEicosanoides Controle Endometriose  Valor de p \n5-HETE 60,61 (±65,10) 91,60 (±236,86) 0,57 \n11-HETE 114,59 (±80,38) 136,99 (±111,2) 0,33 \n15-oxo-ETE 23,34 (±33,66) 11,16 (±18,66) 0,2 \nEPA 1159,83 (±1432,62) 4038,52 (±45637,61) 0,03* \n15-HETE 97,43 (±105,95) 150,83 (±200,82) 0,19 \nPGE-2 18,19 (±64,42) 2,91 (±1,31) 0,31 \nNota: Dados expressos em média (desvio-padrão); concentração em picograma \npor mililitro (pg/mL). Teste t de student. Nível de significância de 5%.  \n \nAo se realizar a divisão do grupo endometriose nos subgrupos endometriose com \nendometrioma e endometriose sem endometrioma, pode -se observar uma diferença \nestatisticamente significativa para o mesmo eicosanoide EPA, sendo maior no FF do grupo \nendometriose com OMA (5811,50 pg/mL), comparado ao grupo controle (1159,83 pg/mL, p \n= 0,005). Os demais eicosanoides não apresentaram diferenças relevantes de concentração \nentre os grupos. A Tabela 10 demostra a média de concentração de cada eicosanoide no grupo \ncontrole e subgrupos endometriose . As diferenças de concentração de EPA nas amostras de \nFF também podem ser observadas no gráfico apresentado na figura 5. \n\n \n49 \n \nTabela 10: Concentração de eicosanoides no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sem \nendometrioma, endometriose com endometrioma e controles inférteis.  \nEicosanoides Controle \nEndometriose sem \nOMA \nEndometriose com \nOMA \nValor de p \n5-HETE 60,61 (±65,10) 45,19 (±90,84) 134,05 (±325,10) 0,46 \n11-HETE 114,59 (±80,38) 156,10 (±133,43) 92,36 (±53,69) 0,33 \n15-oxo-ETE 23,34 (±33,66) 7,6 (±12,09) 21,81 (±30,69) 0,36 \nEPA 1159,83 (±1432,62) 2618,23 (±4802,12) 5811,50 (±5908,08) 0,01* \n15-HETE 97,43 (±105,95) 91,84 (±77,70) 205,88 (±270,60) 0,19 \nPGE-2 18,19 (±64,42) 75,59 (±127,29) 0,0 (±0,0) 0,10 \nNota: Dados expressos em média (desvio-padrão). Teste de variância ANOVA e pós-teste de Tukey. Nível \nde significância de 5%.  Valores do pós -teste de Tukey para a variável concentração de EPA: controle x \nendometriose sem endometrioma (p = 0,32); controle x endom etriose com endometrioma (p = 0,005); \nendometriose sem endometrioma x endometriose com endometrioma (p = 0,08). \n \nFigura 5: gráfico da concentração do eicosanoide EPA nas amostras de FF dos grupos controle, endometriose \nsem OMA e endometriose com OMA. * concentração superior no grupo endometriose com OMA comparado ao \ncontrole. \n\n\n \n50 \n \n5.4. Correlação entre eicosanoides no soro e no FF \n As correlações entre a concentração dos eicosanoides do soro com os eicosanoides do \nfluido folicular demonstraram que existe uma correlação moderada positiva entre o 5 -HETE \nno soro com o 5-HETE no fluido folicular de pacientes controle, e que existe uma correlação \nfraca positiva entre 11 -HETE e 15 -oxo-HETE do soro com 5 -HETE do fluido folicular em \npacientes do grupo controle. Observou -se também que, nas pacientes com endometriose, há \ncorrelação fraca positiva entre o 11 -HETE e 15-HETE do soro com o 15-oxo-ETE do fluido \nfolicular. Os valores do coeficiente de correlação estão na tabela 11. \nTabela 11: Valores do coeficiente de correlação de Spearman entre as concentrações dos \neicosanoides 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15-HETE no soro com as concentrações \nde 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no fluido folicular de mulheres inférteis \ncom endometriose e controles inférteis. \n Grupo 5-HETE \nsoro \n11-HETE \nsoro \n15-oxo-ETE \nsoro \nEPA \nsoro \n15-HETE \nsoro \n5-HETE FF \nControle 0,630* \n(p = 0,002) \n0,481* \n(p = 0,03) \n0,482* \n(p = 0,03) \n0,182 0,109 \nEndometriose 0,078 0,031 -0,107 -0,005 0,009 \n11-HETE FF \nControle 0,392 0,351 0,233 0,246 0,413 \nEndometriose 0,100 0,001 -0,285 0,269 -0,188 \n15-oxo-ETE FF \nControle -0,006 0,127 -0,001 -0,041 0,353 \nEndometriose -0,023 0,547* \n(p = 0,01) \n0,160 0,151 0,496* \n(p = 0,03) \nEPA FF \nControle 0,107 0,185 0,109 -0,008 -0,188 \nEndometriose 0,208 -0,077 -0,332 0,364 -0,088 \n15-HETE FF \nControle 0,001 -0,278 0,039 -0,286 0,324 \nEndometriose 0,036 0,048 -0,193 0,452 -0,121 \nPGE-2 FF \nControle 0,298 -0,048 0,235 0,263 -0,026 \nEndometriose 0,316 0,058 -0,142 0,004 0,019 \n \n \n \n \n\n \n51 \n \n5.5. Correlação entre eicosanoides no soro e resultados de reprodução assistida \nTodas as correlações encontradas entre os eicosanoides do soro e os resultados de RA \nforam fracas. No grupo controle, foi evidenciada uma correlação negativa entre os níveis de \n11-HETE e a taxa de clivagem. No grupo endometriose, encontrou-se uma correlação positiva \nentre 15-oxo-ETE e a taxa de fertilização , correlações negativas entre 15 -HETE e o número \nde embriões clivados, o número de embriões em D2 e o número de embriões em D3, assim \ncomo uma correlação negativa entre o 11-HETE e o número de embriões em D3.  \nTabela 12: Valores do coeficiente de correlação de Spearman  entre as concentrações dos \neicosanoides 5-HETE, 11-HETE, 15-oxo-ETE, EPA e 15 -HETE no soro de mulheres inférteis \ncom endometriose e controles inférteis. \n Grupo 5-HETE 11-HETE 15-oxo-ETE EPA 15-HETE \nNº de oócitos \ncaptados \nControle 0,353 0,322 0,038 0,329 0,403 \nEndometriose -0,134 -0,313 -0,582* \n(p = 0,01) \n-0,317 -0,151 \nNº de oócitos \nmaduros \nControle 0,237 0,237 -0,131 0,275 0,250 \nEndometriose -0,137 -0,349 -0,374 -0,017 -0,211 \nNº de oócitos \nfertilizados \nControle 0,345 0,249 -0,099 0,314 0,443 \nEndometriose -0,331 -0,352 -0,130 -0,058 -0,319 \nTaxa de \nfertilização \nControle 0,166 -0,075 0,224 0,061 0,372 \nEndometriose -0,260 -0,022 0,558 * \n( p = 0,02) \n-0,043 -0,066 \nNº de embriões \nclivados \nControle 0,325 0,209 -0,080 0,285 0,462 \nEndometriose -0,348 -0,461 -0,231 -0,078 -0,583 * \n(p = 0,02) \nTaxa de \nclivagem \nControle -0,061 -0,516 * \n(p = 0,03) \n-0,065 0,065 0,214 \nEndometriose -0,018 0,175 0,070 0,338 0,012 \nNº de embriões \nem D2 \nControle 0,299 0,363 -0,004 0,213 0,469 \nEndometriose -0,348 -0,461 -0,231 -0,078 -0,583* \n(p = 0,02) \nNº de embriões \nde boa \nqualidade em \nD2 \nControle -0,060 -0,111 -0,425 0,397 -0,166 \nEndometriose -0,255 -0,121 -0,181 0,082 -0,472 \nNº de embriões \nde D3 \nControle 0,177 0,347 0,044 0,157 0,469 \nEndometriose -0,351 -0,608 * \n(p = 0,03) \n-0,280 -0,060 -0,584 * \n(p = 0,04) \n\n \n52 \n \nNº de embriões \nde boa \nqualidade em \nD3 \nControle -0,339 -0,146 -0,486 0,400 -0,067 \nEndometriose 0,007 -0,119 -0,424 0,446 -0,465 \nTaxa de \nimplantação \nControle 0,339 -0,308 0,370 0,246 -0,277 \nEndometriose -0,139 0,000 -0,562 -0,109 -0,163 \nTaxa de \ngestação \nquímica \nControle 0,097 -0,487 0,292 0,097 -0,292 \nEndometriose -0,288 -0,056 -0,580 -0,169 -0,281 \nTaxa de \ngestação clínica \nControle 0,540 -0,101 0,371 0,371 -0,338 \nEndometriose 0,000 0,377 -0,433 0,125 0,125 \nTaxa de \nnascidos vivos \nControle 0,540 -0,101 0,371 0,371 -0,338 \nEndometriose 0,000 0,377 -0,433 0,125 0,125 \n \n5.6. Correlação entre eicosanoides no FF e resultados de reprodução assistida \nAssim como no soro, no FF todas as correlações encontradas entre os eicosanoides e \nos resultados de RA foram fracas. No grupo controle, foi evidenciada uma correlação positiva \nentre os níveis de PGE-2 e o número de oócitos captados, o número de oócitos fertilizados, o \nnúmero de embriões clivados  e o número de embriões em D2 . Também se evidenciou uma \ncorrelação positiva entre a concentração de 15-oxo-ETE e o número de oócitos maduros,  e \numa correlação negativa entre o s níveis de EPA e a taxa de fertilização . No grupo \nendometriose, encontrou-se correlação negativa entre 15-oxo-ETE e o número de embriões \nclivados e o número de embriões de boa qualidade em D2. \nTabela 13: Valores do coeficiente de correlação de Spearman entre as concentrações dos eicosanoides \n5-HETE, 11 -HETE, 15 -oxo-ETE, EPA, 15 -HETE e PGE -2 no FF de mulheres inférteis com \nendometriose e controles inférteis. \n Grupo 5-HETE 11-HETE 15-oxo-ETE EPA 15-HETE PGE-2 \nNº de oócitos \ncaptados \nControle -0,003 0,245 0,323 -0,158 0,244 0,558 * \n(p = 0,01) \nEndometriose -0,086 -0,123 -0,287 -0,308 -0,171 0,142 \nNº de oócitos \nmaduros \nControle -0,044 0,023 0,547 * \n(p = 0,01) \n0,057 0,217 0,432 \nEndometriose 0,091 -0,334 -0,181 -0,276 -0,165 0,246 \n\n \n53 \n \nNº de oócitos \nfertilizados \nControle 0,000 0,136 0,313 -0,139 0,101 0,530 * \n(p = 0,02) \nEndometriose 0,100 -0,224 -0,361 -0,409 -0,248 0,131 \nTaxa de \nfertilização \nControle -0,071 0,195 -0,200 -0,488 * \n(p= 0,04) \n-0,080 0,451 \nEndometriose 0,000 -0,089 -0,260 -0,394 -0,377 -0,084 \nNº de \nembriões \nclivados \nControle -0,019 0,138 0,324 -0,152 0,115 0,532 * \n(p = 0,02) \nEndometriose -0,013 -0,107 -0,572 * \n(p = 0,02) \n-0,359 -0,071 -0,001 \nTaxa de \nclivagem \nControle -0,179 0,179 -0,008 -0,426 0,140 0,199 \nEndometriose 0,003 0,410 -0,101 0,196 0,371 -0,392 \nNº de \nembriões em \nD2 \nControle -0,022 0,110 0,425 0,014 0,173 0,531 * \n(p = 0,03) \nEndometriose -0,013 -0,107 -0,572* \n(p = 0,02) \n-0,359 -0,071 -0,001 \nNº de \nembriões de \nboa qualidade \nem D2 \nControle -0,349 -0,102 -0,009 0,213 0,083 0,434 \nEndometriose -0,057 -0,024 -0,567 * \n(p = 0,02) \n-0,348 -0,215 -0,066 \nNº de \nembriões de \nD3 \nControle -0,137 0,044 0,450 -0,039 0,133 0,507 \nEndometriose 0,055 -0,263 -0,547 -0,197 -0,149 -0,200 \nNº de \nembriões de \nboa qualidade \nem D3 \nControle -0,495 0,047 0,073 0,011 -0,005 0,217 \nEndometriose 0,137 0,141 -0,436 0,103 0,042 -0,097 \nTaxa de \nimplantação \nControle -0,092 -0,185 0,032 -0,018 -0,339 0,237 \nEndometriose 0,062 -0,163 -0,093 0,027 -0,681 0,000 \nTaxa de \ngestação \nquímica \nControle -0,292 -0,292 -0,103 -0,115 -0,097 0,115 \nEndometriose 0,064 -0,056 -0,193 -0,057 -0,619 0,000 \nTaxa de \ngestação \nclínica \nControle 0,338 0,033 0,071 0,020 -0,676 0,220 \nEndometriose -0,433 0,377 0,000 -0,258 -0,251 0,000 \nTaxa de \nnascidos vivos \nControle 0,338 0,033 0,071 0,020 -0,676 0,220 \nEndometriose -0,433 0,377 0,000 -0,258 -0,251 0,000 \n \n\n \n54 \n \nDISCUSSÃO \nA endometriose é uma doença com alta prevalência em mulheres em idade fértil e é \nfrequentemente associada à infertilidade (BURNEY; GIUDICE, 2012) . Apesar disso, ainda \nnão se sabe completamente quais mecanismos estão envolvidos na etiopatogênese da \ninfertilidade relacionada à endometriose. Suspeita-se que a piora da qualidade dos oócitos seja \num fator chave na redução da fertilidade natural nessas pacientes  (SANCHEZ; VANNI; \nBARTIROMO; PAPALEO et al., 2017), sendo a inflamação e o estresse oxidativo possíveis \nmediadores desse dano oocitário  (BARCELOS; VIEIRA; FERREIRA; MARTINS  et al. , \n2009; DA BROI; NAVARRO, 2016; FERREIRA; GIORGI; RODRIGUES; DE ANDRADE \net al., 2019; GIORGI; DA BROI; PAZ; FERRIANI  et al., 2016; MALVEZZI; DA BROI; J; \nROSA-E-SILVA et al. , 2018) . Hipotetizamos que o  processo inflamatório  e o estresse \noxidativo relacionados à endometriose  podem afetar a produção sistêmica e folicular  de \neicosanoides, moléculas bioativas de origem lipídica que regulam diversos processos \nfisiopatológicos, inclusive a foliculogênese, maturação oocitária e ovulação  (LEROY; \nVANHOLDER; MATEUSEN; CHRISTOPHE et al., 2005). \nNão se observou diferença significativa na concentração sérica de eicosanoides entre \nos grupos controle e endometriose. Entretanto, quando se subdividiu o grupo endometriose, \nobservou-se que o 5 -HETE apresentou aumento significativo no grupo endometriose sem \nOMA em relação ao grupo endometriose com OMA. Considerando que a endometriose \nperitoneal é caracterizada pela presenç a de lesões espalhadas pela cavidade abdominal  \n(AGARWAL; SUBRAMANIAN, 2010), enquanto o endometrioma é uma lesão localizada, \nrestrita aos ovários e encapsu lada (HUGHESDON, 1957; PAFFONI; BOLIS; FERRARI; \nBENAGLIA et al. , 2019) ; esse achado s ugere que existe uma repercussão inflamatória \nsistêmica mais evidente nos casos de endometriose peritoneal e/ou pélvica .  As lesões da \nendometriose perito neal pode m levar à liberação de células e moléculas inflamatórias na \ncorrente sanguínea, resultando em uma resposta inflamatória sistêmica. Acredita -se que essa \ninflamação crônica induzida pela endometriose, possa estar envolvida na patogênese de vários \ndistúrbios sistêmicos (AHN; MONSANTO; MILLER; SINGH et al., 2015). Portanto, parece \nimportante considerar a natureza e extensão das lesões de endometriose ao se avaliar seu \nimpacto no sistema reprodutivo e na saúde geral da paciente. \nA literatura médica destaca que a produção excessiva de 5-HETE está associada a uma \nsérie de condições patológicas, incluindo inflamação crônica, dor e doenças cardiovasculares \n\n \n55 \n \n(KIKUT; KOMORNIAK; ZIĘTEK; PALMA et al., 2020; LEUTI; FAZIO; FAVA; PICCOLI \net al., 2020). Visto isso, é possível elaborar algumas hipóteses sobre como o aumento do 5 -\nHETE pode estar envolvido na infertilidade associada à endometriose. Primeiramente, sabe -\nse que a endometriose pode causar alterações no ambiente peritoneal, levando a um estado \ninflamatório crônico e oxidativo, o que pode afetar a função ovariana e a qualidade dos óvulos \ne embriões  (BARCELOS; VIEIRA; FERREIRA; MARTINS  et al. , 2009; DA BROI; \nNAVARRO, 2016; FERREIRA; GIORGI; RODRIGUES; DE ANDRADE  et al. , 2019; \nMALVEZZI; HERNANDES; PICCINATO; PODGAEC, 2019) . O 5 -HETE é um potente \nquimiotático para neutrófilos e eosinófilos e pode estar envolvido na atração dessas células \npara o tecido endometrial ectópico, contribuindo para a inflamação local e sistêmica  \n(BITTLEMAN; CASALE, 1995). Além disso, estudos mostram que o 5-HETE pode afetar a \nangiogênese, a proliferação celular e a apoptose em diferentes tipos de células, incluindo as \ncélulas do ovário  (MILLER; GHOSH; MYERS; MACDONALD, 20 00; ZENG; \nYELLATURU; NEELI; RAO, 2002) . Considerando que os folículos ovarianos podem ser \nimpactados pelas alterações séricas, especialmente nos estágios finais de maturação oocitária  \n(EDWARDS, 1974 ; LEROY; VANHOLDER; DELANGHE; OPSOMER  et al. , 2004; \nPRIETO; QUESADA; CAMBERO; PACHECO  et al. , 2012; VALCKX; DE PAUW; DE \nNEUBOURG; INION et al., 2012), as alterações pró -inflamatórias encontradas no presente \nestudo podem indicar possível impacto folicular nessas pacientes.  Assim, o aumento da \nprodução de 5-HETE pode estar envolvido na patogênese da endometriose e sua associação \ncom a infertilidade.  \nA análise da concentração dos eicosanoides no FF demonstrou um aumento na \nconcentração de EPA no grupo endometriose comparado ao control e. Esses resultados \nsugerem que a endometriose pode estar associada a um desequilíbrio de eicosanoides no FF. \nO resultado fica ainda mais interessante ao se subdividir o grupo endometriose, evidenciando \nque existe um aumento de concentração de EPA no FF de mulheres com endometrioma \ncomparado às do grupo controle e endometriose sem endometrioma.  Mais uma vez, esse dado \nreflete um comportamento distinto da doença a depender do tipo de lesão encontrada. Sendo \no endometrioma uma lesão ovariana encapsulada (HUGHESDON, 1957; PAFFONI; BOLIS; \nFERRARI; BENAGLIA  et al. , 2019) , a alteração observada no FF reflete diretamente a \ncondição do microambiente folicular e pode ter implicações clínicas na fertilidade dessas \nmulheres. Esses achados são  importantes e sugerem que o microambiente folicular em \nmulheres com endometriose é modulado de forma diferente dependendo da presença ou \n\n \n56 \n \nausência de endometrioma, e que isso pode ter implicações importantes para a fisiologia \nreprodutiva dessas pacientes. \nO EPA é conhecido por suas propriedades anti -inflamatórias, incluindo a inibição da \nsíntese de prostaglandinas pró -inflamatórias e leucotrienos, e a redução da expressão de \nmoléculas de adesão celular, diminuindo a adesão dos leucócitos aos vasos sanguíneo s \n(CALDER, 2010; SERHAN, 2005). Seu aumento no FF de mulheres com endometrioma pode \nestar relacionado a um efeito de proteção do organismo contra a inflamação crônica que ocorre \nnesse tipo de lesão (YLAND; CARVALHO; BESTE; BAILEY et al., 2020). Tal inflamação \npode levar a um estresse oxidativo, com aumento da produção de espécies reativas de \noxigênio, o que pode resultar em danos às células e tecidos  (NAKAGAWA; HISANO; \nSUGIYAMA; YAMAGUCHI, 2016). Nesse sentido, o aumento de EPA no FF pode ser uma \nresposta compensatória a fim de reduzir esse estresse oxidativo e proteger as células ovarianas \ne foliculares da inflamação crônica presente no endometrioma. \nHá poucos estudos avaliando diretamente a associação do EPA com a infertilidade em \npacientes com endometriose. Um estudo do nosso grupo evidenciou que a adição de EPA em \nmeio de cultura de maturação oocitária preveniu os danos meióticos provocados pelo FF de \nmulheres com endometriose em todos os estágios (GIORGI; NAVARRO, 2018). Além disso, \nhá evidências que a suplementação de EPA reduziu a dor pélvica relacionada à endometriose \n(NETSU; KONNO; ODAGIRI; SOMA et al., 2008) e não impactou negativamente na reserva \novariana de pacientes com endometrioma. No entanto, mais est udos são necessários para \nentender a relação entre o EPA e a infertilidade em pacientes com endometriose  e \nendometrioma. \nA comparação das variáveis clínicas entre os grupos controle e endometriose \nevidenciou uma homogeneidade, mesmo quando subdividida a en dometriose em com e sem \nendometrioma. Todavia, observou -se uma redução significativa no número de oócitos \ncoletados, número de oócitos maduros, número de oócitos fertilizados, número de embriões \nclivados e número de embriões formados em D2 no grupo endometriose em comparação com \no grupo controle, corroborando achados de outros estudos  (HAMDAN; DUNSELMAN; LI; \nCHEONG, 2015; QU; DU; YU; WANG  et al., 2022). A endometriose pode ter um impacto \ndireto sobre o número de folículos recrutados e a qualidade dos oócitos, explicando essas \ndiferenças observadas. É interessante destacar que, apesar dessas reduções, não foram \nencontradas diferenças significativas nas taxas de fertilização, clivagem, gestações e nascidos \n\n \n57 \n \nvivos. Nesse sentido, questionamos se o aumento do EPA no FF dessas pacientes poderia ter \num efeito protetor, reduzindo o impacto das alterações inflamatórias e oxidativas sobre o \npotencial de desenvolvimento embrionário , o que precisa ser explorado em estudos futuros . \nAo analisar os subgrupos do grupo endometriose, não foram observadas diferenças \nestatisticamente significativas nas variáveis analisadas. No entanto, é importante pontuar que \na redução no tamanho da amostra pode ter influenciado essa falta de diferenças estatísticas, \numa vez que foi possível observar tendências de diminuição nas variáveis número de oócitos \ncoletados, número de oócitos maduros, número de oócitos fertilizados e número de embriões \nclivados. É necessário ter cautela ao interpretar esses resultados, pois, apesar da ausência de \ndiferenças estatísticas, essas tendências podem sugerir  uma possível influência da \nendometriose e do endometrioma na qualidade dos gametas e embriões , o que precisa ser \navaliado com casuística adequada. A literatura médica nos mostra que a endometriose é uma \ncondição que pode ter um impacto significativo no TRA, afetando várias etapas do processo \ne influenciando os resultados. A presença de endometriose pode levar a desafios específicos, \ncomo a redução do número de oócitos coletados, a diminuição da qualidade oocitária, a \nredução da taxa de fertilização e a diminuição da taxa de implantação embrionári a \n(HAMDAN; OMAR; G; CHEONG, 2015; INVERNICI; RESCHINI; BENAGLIA; \nSOMIGLIANA et al., 2022).  \nAs análises de correlações desempenham um papel crucial na determinação da relação \nde uma variável com a outra. Neste estudo, avaliamos correlações entre as concentrações de \neicosanoides no soro e no fluido folicular, bem como correlações entre as concentrações de \neicosanoides no soro e no FF e os resultados do tratamento de RA em mulheres inférteis com \ne sem endometriose. \nAo examinar a co rrelação entre as concentrações de eicosanoides no soro e no FF, \nobservamos uma correlação moderada positiva entre o 5 -HETE no soro e no fluido folicular \nde pacientes do grupo controle , sugerindo que a composição deste eicosanoide no soro pode \nrefletir a do ambiente folicular  em situações fisiológicas. Todavia, no grupo endometriose, \nnão observamos nenhuma correlação forte ou moderada entre as concentrações séricas e as \nfoliculares de eicosanoides. Isto pode ser decorrente de mecanismos foliculares de defesa anti-\ninflamatórios na tentativa de preservar a qualidade gamética.  Essas descobertas ressaltam a \nimportância de entender as interações entre os eicosanoides no soro e no FF e seu impacto na \nfertilidade das pacientes com endometriose.  \n\n \n58 \n \nApesar das correlações entre as concentrações de eicosanoides no soro e os resultados \nde RA serem fracas, alguns dados interessantes podem ser discutidos. Nas pacientes do grupo \ncontrole, nota-se uma correlação negativa entre 11-HETE e taxa de clivagem, sugerindo que \num aumento na concentração sérica de 11-HETE pode ter um impacto negativo nessas taxas. \nCuriosamente, a concentração de 11-HETE se correlacionou positivamente com o 5-HETE no \nfluido folicular, o qual já se mostrou  alterado no soro de mulheres com endometriose. Além \ndisso, encontrou -se, no grupo endometriose, uma associação negativa entre 15 -HETE e o \nnúmero de embriões clivados, o número de embriões em D2 e o número de embriões em D3, \nassim como uma correlação negativa entre o 11-HETE e o número de embriões em D3.  Isso \nsugere que os eicosanoides do grupo HETE, potencialmente pró -inflamatórios, podem \nprejudicar o início do desenvolvimento embrionário, e que seu aumento em doenças \ninflamatórias, como a endometriose, pode justificar uma qualidade embrionária inferior.  \nAssim como no soro, as correlações entre as concentrações de eicosanoides no FF e \nos resultados de RA se mostraram fracas. No grupo controle, foi evidenciada uma correlação \npositiva entre as concentrações de PGE-2 e o número de oócitos captados, o número de oócitos \nfertilizados, o número de embriões clivados e o número de embriões em D2. A relação entre \na PGE-2 e os processos chaves na gametogênese, ovulação e desenvolvimento embrionário é \nbem estabelecida na literatura. Embora a concentração de várias prostaglandinas aumente \nparalelamente durante a ovulação, a PGE -2 é considerada o principal mediador (KIM; \nDUFFY, 2016; VERNUNFT; LAPP; VIERGUTZ; WEITZEL, 2022). A PGE-2 orquestra os \nprocessos de ovulação, incluindo expansão do cúmulo, a liberação d o oócito, a ruptura \nfolicular e a angiogênese (KIM; DUFFY, 2016). Verificou-se que a PGE-2 está envolvida não \napenas na expansão do cúmulo, mas também na maturação meiótica, sendo que o seu aumento \nfavorece as condições moleculares para a conclusão da meiose (NIRINGIYUMUKIZA; CAI; \nXIANG, 2018). Também está envolvida na regulação do processo de fertilização, atuando na \ndegradação da matriz extracelular do COC, o que permite a chegada do espermatozoide ao \nóvulo (NIRINGIYUMUKIZA; CAI; XIANG, 2018) . Em embriões, níveis gradualmente \ncrescentes de PGE2 de um  embrião de 2 células para um blastocisto foram identificados \n(TAN; LIU; DIAO; YANG, 2005) . A PGE -2 é considerada um fator mitogênico,  anti-\napoptótico e angiogênico para proliferação celular e sobrevivência em outras células (SALES; \nKATZ; DAVIS; HINZ  et al. , 2001) , o que sugere que a PGE -2 exerce esses efeitos no \ndesenvolvimento do embrião, aumentando assim a proliferação de células embrionárias . \nLogo, uma alteração nos níveis fisiológicos de PGE-2 pode alterar toda essa precisa regulação, \n\n \n59 \n \nalterando potencialm ente a fertilidade.  No grupo controle, t ambém se evidenciou uma \ncorrelação positiva entre a concentração de 15-oxo-ETE e o número de oócitos  maduros, e \numa correlação negativa entre os níveis de EPA e a taxa de fertilização . Nesses casos, a  \nproblemática se estabelece quando os mediadores inflamatórios se exacerbam e \nsobrecarregam as defesas naturais anti-inflamatórias. Assim, a correlação negativa entre EPA \ne fertilização sugere que a descompensação pode impactar, mesmo com aumento de defesa \nanti-inflamatória. Já, no grupo endometriose, observou-se uma correlação negativa entre 15-\noxo-ETE e o número de embriões clivados e o número de embriões de boa qualidade em D2. \nUma vez que esse eicosanoide é um metabólito do 15 -HETE, com ação predominantemente \npró-inflamatória (WEI; ZHU; SHAH; BLAIR, 2009), uma elevação de 15-oxo-HETE poderia \nimplicar em baixa qualidade embrionária. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n60 \n \nCONCLUSÕES \nNão se observou diferença na concentração sérica de eicosan oides entre mulheres \ninférteis controles e com endometriose. Todavia, ao subdividirmos o grupo endometriose, \ndemonstramos maiores concentrações séricas de 5 -HETE em mulheres inférteis com \nendometriose sem endometrioma quando comparadas às com endometrioma e cont roles, \nsugerindo que  a doença peritoneal favorece a elevação sistêmica deste eisosan oide pró -\ninflamatório, o que pode favorecer tanto a etiopatogênese da endometriose, como da \ninfertilidade relacionada a mesma.  Por outro lado, o bservou-se maiores concentrações \nfoliculares de EPA em mulheres inférteis com endometriose quando comparadas às controles, \nespecificamente naquelas com endometrioma , o que  pode estar relacionado a um efeito de \nproteção do microambiente folicular contra a inflamação crônica que ocorre  nesse tipo de \nlesão, na tentativa de prevenir o dano oocitário.  \nAo avaliarmos a correlação entre as concentrações de eicosanoides no soro e no FF, \nobservamos uma correlação moderada positiva apenas entre o 5 -HETE no soro e no fluido \nfolicular de pacientes do grupo controle , sugerindo que a composição de ste eicosanoide no \nsoro pode refletir a do ambiente folicular em situações fisiológicas. No grupo endometriose, \nnão observamos qualquer correlação forte ou moderada entre as concentrações séricas e as \nfoliculares de eicosanoides, o que pode ser decorrente de mecanismos foliculares de defesa \nanti-inflamatória na tentativa de preservar a qualidade gamética. \nObservou-se apenas fracas correlações entre as concentrações séricas e foliculares de \neicosanoides e os resultados dos tratamentos de RA nos grupos com e sem endometriose. No \nsoro, alguns eicosanoides do grupo HETE se mostraram correlacionados negativamente com \nparâmetros iniciais do desenvolvimento embrionário, o que sugere que eicosanoides com esse \nperfil pró-inflamatório podem prejudicar os primeiros dias do desenvolvimento embrionário. \nNo FF, uma correlação positiva do PGE -2 com parâmetros do recrutamento folicular e \ndesenvolvimento embrionário inicial em pacientes controle sugerem a importância dessa \nmolécula em eventos fisiológicos que permeiam a capacidade reprodutiva.  \nEm conjunto, estes achados são importantes para avançarmos no entendimento dos \nmecanismos subjacentes à infertilidade relacionada à endometriose. Compreender o papel dos \neicosanoides na fisiopatologia da endometriose e na qualidade oocitária pode favorecer o \nestudo e descoberta  de abordagens terapêuticas inovadoras, visando  melhorar tanto a \n\n \n61 \n \nfertilidade natural, como os resultados dos tratamentos de reprodução assistida nas mulheres \ninférteis com endometriose que apresentam má qualidade gamética e embrionária.   \n\n \n62 \n \nREFERÊNCIAS \nAARDEMA, H.; VOS, P.; LOLICATO, F.; ROELEN, B.  et al.  Oleic acid prevents detrimental effects of \nsaturated fatty acids on bovine oocyte developmental competence. Biology of reproduction, 85, n. \n1, 2011 Jul 2011. \n \nAGARWAL, A.; APONTE-MELLADO, A.; PREMKUMAR, B.; SHAMAN, A.  et al. The effects of oxidative \nstress on female reproduction: a review. Reproductive biology and endocrinology : RB&E , 10, \n06/29/2012 2012. \n \nAGARWAL, A.; SALEH, R.; BEDAIWY, M. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of \nhuman reproduction. 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Para a separação cromato gráfica dos mediadores lipídicos foi utilizada uma \ncoluna HPLC C18 (Supelco, Ascentis Express) com dimensões de 100 × 3,0 mm, 2,7 µm. A \neluição foi conduzida com um gradiente binário, onde a fase A consistia em \nágua/acetonitrila/ácido acético (69,98 : 30 : 0,02, v/v/v ) e a fase B era acetonitrila/isopropanol \n(70:30, v/v). O gradiente linear começou com 0% B e foi aumentado para 15% B em 2 min, \n20% B em 5 min, 35% B em 8 min, 40% B em 11 min, 100% B em 15 min, 100% B aos 18 \nmin, 0% de B aos 19 min e mantido até 30 min com uma vazão de 0,6 ml min -1 . A fonte de \nionização por eletrospray (ESI) operou no modo de íon negativo usando os modos MRM, íon \nprecursor e varredura de íon produto. \nPara otimização das condições de MRM e MS de íon precursor, padrões puros a 100 ng.ml −1 \npreparados em MeOH/H 2 O/AcNH 4 (70 : 29,9 : 0,1, v/v/v ) foram infundidos no \nespectrômetro a um fluxo taxa de 10 μL.min −1 e fragmentado via CID com argônio para \nobter espectros de íons de produto para cada eicosanoide individual. Após a seleção das \ntransições MRM, as energias de cone e colisão foram otimizadas por meio da infusão dos \npadrões para obter a sensibilidade ótima. Para análise LC-MS/MS usando a varredura de íons \nde produto de m/z 115, os íons selecionados fo ram fragmentados com energia de colisão de \n20 eV e energia de cone de 40 V. Os espectros foram adquiridos na faixa de varredura de \nmassa de m/ z200 a 700 Da com um tempo de varredura de 0,3 s. Parâmetros analíticos \nadicionais foram os seguintes: capilar, 2 ,00 V; temperatura da fonte, 150 °C; temperatura de \ndessolvatação, 350°C; fluxo de gás cônico, 150 lh -1 ; fluxo de gás de dessolvatação, 500 lh -\n1 ; fluxo de gás de colisão, 0,15 ml −1 ; fluxo de gás do nebulizador, 7,00 bar; e tempo de \npermanência, 0,003 s. Os dados foram processados usando o programa Masslynx 4.1 (Waters \nCorp., Milford, MA, EUA). \nO sistema de cromatografia líquida de ultra alta performance (UHPLC) (Nexera X 2 , \nShimadzu-Kyoto, HO, Japão) foi equipado com um sistema de bomba binária, um amostrador \nautomático SIL-30AC, um desgaseificador DGU-20A e um controlador CBM-20ª. Para isso, \n\n \n74 \n \nfoi utilizada uma coluna Ascentis Express C18 (Supelco - St. Louis, MO, EUA) com diâmetro \ninterno de 100 × 4,6 mm e tamanho de partícula de 2,7 μm. A eluição f oi conduzida sob um \nsistema de gradiente binário que consistia em Fase A, H 2 O/ACN/ácido acético \n(69,98:30:0,02, v/v/v ) a pH 5,8 (ajustado com NH4 OH) e Fase B, um ACN/isopropanol \n(70:30, v/v ). A eluição em gradiente foi realizada por 25 min a uma vazão de 0,6 mL.min −1. \nAs condições de gradiente foram as seguintes: 0 a 2,0 min, 0% B; 2,0 a 5,0 min, 15% B; 5,0 \na 8,0 min, 20% B; 8,0 a 11,0 min, 35% B; 11,0 a 15,0 min, 70% B; e 15,0 a 19 min, 100% B. \nAos 19,0 min, o gradiente voltou à condição inicial de 0% B, e a coluna foi reequilibrada até \n25,0 min. Ao longo das análises, a coluna foi mantida a 25 °C e as amostras foram mantidas \na 4 °C no amostrador automático. Uma alíquota de 10 μL de cada amostra foi injetada na \ncoluna. O pH da fase móvel A foi otimizado para alcançar a melhor sensibilidade e separação \ncromatográfica dos metabólitos lipídicos. Assim, os valores de pH da fase A ao longo do \nexperimento foram 3,8, 5,8 e 6,4. \nO sistema UHPLC foi interfaceado com um Espectrômetro de Massa TripleTOF5600 + \n(Sciex-Foster, CA, EUA) equipado com um Turbo -V IonSpray. Uma sonda de Ionização \nQuímica de Pressão Atmosférica (APCI) foi usada para calibrações externas do Sistema de \nDistribuição de Calibrantes (CDS). A calibração automática de massa (<2 ppm) foi realizada \nusando APCI Negative Calibration Solution (Sciex -Foster, CA, EUA) injetada por infusão \ndireta a uma taxa de fluxo de 300 μL.min −1; isso foi feito periodicamente após cada uma das \ncinco injeções de amostra. Uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo de íon \nnegativo foi utilizada para varredura MRM HR. Para otimização d o MRM, valores de CE e \nDP foram determinados para cada analito por meio de infusão direta de soluções de MWS e \nIS a uma taxa de fluxo de 10 μL.min −1 . Os compostos foram fragmentados via CAD usando \nnitrogênio como gás de colisão. Parâmetros instrumentais adicionais foram os seguintes: gás \nnebulizador (GS1), 50 psi; turbo -gás (GS2), 50 psi; gás de cortina (CUR), 25 psi; tensão de \neletrospray (ISVF), −4,0 kV; e temperatura da fonte de  pulverização de íon turbo, 550°C. A \nfaixa de massa dos experimentos de íons de produto foi de m/z 50 a 700, o tempo de \npermanência foi de 10 ms e uma resolução de massa de 35.000 foi alcançada em m/z 400. As \naquisições de dados foram realizadas usando o Analyst Software (Sciex-Foster, CA, EUA). \n \n \n\n \n75 \n \n9.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido grupo endometriose \n \n \n\n\n \n76 \n \n \n\n\n \n77 \n \n \n\n\n \n78 \n \n \n \n\n\n \n79 \n \n \n \n\n\n \n80 \n \n9.3. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido grupo controle \n \n\n\n \n81 \n \n \n \n\n\n \n82 \n \n \n\n\n \n83 \n \n \n \n\n\n \n84","source_license":"CC0","license_restricted":false}