Expressão gênica diferencial em tecido endometrial tópico e lesões endometrióticas

DENTILLO, D.B. Genes differentially expresse d in topic endometrium and endometriotic lesions. 2007. 83 p. Tese de Doutorado - Facu ldade de Medicina de Ribeirão Preto – Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Gestational losses can be determined by a number of factors incl uding endometriosis, a common gynecological disease characterized by endometrial tissue found outside the uterine cavity. The main symptoms of the disease invo lve dysmenorrhea, dyspaneuria, chronic pelvic pain and menstrual irregularities, besides fer tility problems. Endometriotic lesions are more frequently found in the peritoneum and in pe lvic organs, mainly ovaries. Endometriosis incidence is difficult to be determined due to the wide variability of the symptoms and the difficult diagnostic confirmation, which requires a surgical method. Ne vertheless, it is believed that around 15% of the female popula tion in reproductive age is affected by the disease, although its pathogenesis remains uncl ear. The most accepted hypothesis is the retrograde menstruation, wher e endometrial fragments from the menstrual phase are transported through the uterine tubes to the peritoneal cavity, where they undergo implantation, growth, and adjacent tissues invasion. However, only reflux is not enough for the disease establishment, and it is necessa ry that endometrial cells present molecular characteristics favoring rise and progression of ectopic implant ation. In the literature, a number of studies highlight th at the main molecular divergences between women with and without endometriosis are relate d to processes involved in apoptosis, cellular adhesion, angiogenesis, estrogen biosynthesis, i mmunological system, gr owth factors and metalloproteinases. In doing so, a number of researches seek for the investigation of genes differently expressed (up or dow n regulated) in endometriotic lesions cells using a variety of methodologies. The subtractive hybridization is a gene screening methodology that compares two distinct cellular groups, allowing the isol ation of cDNA molecule s representative from 12 the genome of only one of the two groups, because it removes common sequences among them. The rapid subtractiv e hybridization methodology ( RaSH) makes the process of subtraction easier and more efficient, identi fying a large amount of differently expressed sequences. In this study, RaSH was used to identify differently expressed genes in 11 samples of endometriotic lesions (five fr om ovarian origin and six from peritoneum origin), and in 11 samples from topic endometrial tissue from women without the disease to determine possible molecular markers for diagnosis and treatment. After data anal ysis related to 166 reference sequences, genes HTRA1, LOXL1, SPARC and SSAT were selected for validation using real time quantitative RT-PCR. Only HTRA1 and LOXL1 presented significant difference between the two stud ied groups. Genes HTRA1 and LOXL1 were up regulated in endometriotic lesions from affected patients when compared with the expression levels in the endometrial tissue of non-affected wome n. Our results suggest that the genes HTRA1 and LOXL1 can be considered candidate molecular markers for the diagnosis of endometriosis. 13 LISTA DE FIGURAS Figura 1: A) Amostras de cDNAs obtidos a partir dos tecidos analisados transcrição reverva, restrição enzimática com DpnII e ligação dos adaptadores; B) PCR com primers XDPN-18 e restrição enzimática somente da amostra tester, representada pela lesão endometriótica; C) Mistura das amostras tester e driver, seguida de reação de hibridação ; D) Representação dos híbridos gerados, ligação do híbrido tester-tester ao plamídeo tratado com a enzima de restrição XhoI, transformação bacteriana, pl aqueamento e seqüenciamento dos insertos clonados. Figura 2: Curva de calibração do gene LOXL1. Foi plotada a fluorescência da amplificação versus o número de ciclos da PCR Figura 3: Curva-padrão do gene LOXL1 obtida a partir da curva de calibração. Figura 4: Diagrama de pontos interativos ( interactive dot) para o gene HTRA1 obtido a partir do software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os pontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres sem endometriose (representados no eixo hor izontal como “Normal=0”) e nas amostras do grupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Normal=1”). A barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos grupos. Figura 5: Diagrama de pontos interativos ( interactive dot) para o gene LOXL1 obtido a partir do software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os pontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres sem endometriose (representados no eixo hor izontal como “Normal=0”) e nas amostras do grupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Normal=1”). A barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos dois grupos. 14 LISTA DE TABELAS Tabela I: Seqüências de referência obtidas pela RaSH nas bibliotecas RHENDI e RHENDW. Tabela II: Valores de RQ, médias e desvios-padr ão dos grupos de tecido normal e lesão endometriótica para o gene SPARC. Tabela III: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão endometriótica para o gene SSAT. Tabela IV : Valores de RQ, médias e desvios-padr ão dos grupos de tecido normal e lesão endometriótica para o gene HTRA1. Tabela V : Valores de RQ, médias e desvios-padr ão dos grupos de t ecido normal e lesão endometriótica para o gene LOXL1. 15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 11β-HSD2 - Hydroxysteroid (11-beta) Dehydrogenase 2 AGDE - Ambulatório de Dor Pélvica e Endoscopia ASRM - American Society for Reproductive Medicine B61 – aliase do gene EFNA1 (epherin A1) Bcl-2 - B-cell CLL/lymphoma 2 BLAST – Basic Local Alignment Search Tool BSEP – Bile Salt Export Pump C4BP - Complement Component 4 Binding Protein CA 19-9 - Carbohydrate Antigen 19-9 CA-125 - Carbohydrate Antigen 125 cDNA – complementary Deoxyribonucleic Acid CEP - Comitê de Ética em Pesquisa c-Myc - cellular Myelocytomatosis oncogene CYP1A1 - cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 DC21- aliase do gene SSAT (Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase) DEPC - Dietil Pirocarbonato DLX5 - Distal-Less Homeobox 5 DNA - Deoxyribonucleic Acid EGF - Epidermal Growth Factor EST - Expressed Sequence Tag FBLN1 - Fibulin 1 FGF - Fibroblast Growth Factor FMRP-USP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo GALT - Galactose-1-Phosphate Uridylyltransferase GAPDH – Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase Geap - Generic EST Annotation Pipeline GlcNAc6ST - N-acetylglucosamine 6-O-sulfotransferase GMST1 - Macrophage Stimulating 1 GnRH - Gonadotropin-Releasing Hormone H2O2 - Peróxido de Hidrogênio HCl – Cloreto de Hidrogênio 16 HLA – Major Histocompatibility Complex HTRA1 - High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase 1 ICAM-1 - Intercellular Adhesion Molecule-1 IGFBP5– Insulin-Like Growth Factor Binding-Protein 5 IL-1 - Interleukin 1 IL-15 - Interleukin 15 IL2RG - Interleukin 2 Receptor, Gamma IL-6 – Interleukin 6 IL-8 – Interleukin 8 KFSD - keratosis Follicularis Spinulosa Decalvans (aliase do gene Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase) KH2PO4 - Fosfato de Potássio Monobásico L56 - aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase 1) LB- Lysogeny Broth LIF - Leukemia Inhibitory Factor LOL – aliase do gene LOXL1 (Lysyl Oxidase-Like 1) LoTE – Low Tris-EDTA LOXL1 - Lysyl Oxidase-Like 1 MEC - Matriz Extracelular MMP11 - Matrix Metalloproteinase 11 MMP12 - Matrix Metalloproteinase 12 MMP-2 - Matrix Metalloproteinase 2 MMP3 - Matrix Metalloproteinase 3 Na2HPO4.12H2O - Fosfato de Sódio Monobásico Dodecahidratado NaCl - Cloreto de Sódio NAT2 - N-Acetyltransferase 2 NCBI - National Center for Biotechnology Information NLM - National Library of Medicine OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man ON – aliase do gene SPARC (Secreted Protein, Acidic, Cysteine-rich (Osteonectin)) ORF480 - aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase 1) p53 – aliase do gene TP 53 (Tumor Protein p53) PBS - Phosphate-Buffered Saline 17 PCR - Polymerase Chain Reaction PRSS11- aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase 1) PSAP – Prosaposin PTEN – Phosphatase and Tensin Homolog RaSH – Rapid Subtraction Hybridization RefSeq – Reference Sequences RHENDI – biblioteca de cDNAs do grupo de mulheres com endometriose (tester) RHENDW - biblioteca de cDNAs do grupo de mulheres não afetadas pela endometriose (tester) RhoE - Ras Homolog Gene Family, Member E RNA- Ribonucleic Acid ROC - Receiver-Operating Characteristic RQ - Relative Quantification RT-PCR – Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction SAT – aliase do gene SSAT (Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase) SPARC - Secreted Protein, Acidic, Cysteine-rich (Osteonectin) SSAT - Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase TGF-α – Transforming Growth Factor Alfa TGF-β – Transforming Growth Factor Beta TIMP-3 – Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 3 TNF-α – Tumor Necrosis Factor Alfa TP53 - Tumor Protein p53 UniGene – link do site www.ncbi.nlm.nih.gov que contém informações a respeito de conjuntos de seqüências (gene ou pseudogene) que aparentemente são transcritos no mesmo locus. VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor 18 LISTA DE SÍMBOLOS % - porcentagem °C – graus Celsius µg – microgramas µL – microlitros g – gramas L – litros M – molar mg – miligramas mL – mililitros mM - milimolar RPM – rotações por minuto U – unidades 19 SUMÁRIO RESUMO

I. INTRODUÇÃO 0 1 I.1. ENDOMETRIOSE 0 2 I.1.1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS 0 2 I.1.2. ASPECTOS GENÉTICOS DA ENDOMETRIOSE 0 7 I.1.3. ASPECTOS MOLECULARES E PATOGÊNESE 0 8 I.2. METODOLOGIA DE INVESTIGAÇÃO MOLECULAR 1 1 I.3. JUSTIFICATIVA 1 4 II. OBJETIVOS 1 5 III. MATERIAL E MÉTODOS 1 6 III.1. AMOSTRAS 1 6 III.2. METODOLOGIA 1 7 III.2.1 ISOLAMENTO DO RNA TOTAL 1 7 III.2.2. RAPID SUBTRACTION HYBRIDIZATION (RAS H ) 18 III.2.2.1. SÍNTESE DE CD N A 2 1 III.2.2.2. DIGESTÃO ENZIMÁTICA E LIGAÇÃO DOS ADAPTADORES 21 III.2.2.3. PCR E PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS 2 1 III.2.2.4. DIGESTÃO DO TESTER E HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA 22 III.2.2.5. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA E GERAÇÃO DAS BIBLIOTECAS DE CD N A 2 2 III.2.2.6. ANÁLISE DAS COLÔNIAS E OBTENÇÃO DOS DADOS 23 III.2.3. VALIDAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS GENES SELECIONADOS 26 III.2.3.1. SÍNTESE DE CD N A 2 6 III.2.3.2. EFICIÊNCIA DA REAÇÃO 2 6 III.2.3.3. QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA 2 8 III.2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 2 8 IV. RESULTADOS 3 0 IV.1. OBTIDOS PELA TÉCNICA DE RASH 3 0 20 IV.2. GENES SELECIONADOS 4 7 IV.3. RT-PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL 4 8 IV.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 5 0 V. DISCUSSÃO 5 3 V.1. HTRA1 – Htra (High Temperature Requirement Factor A1) Serine Peptidase 1 54 V.2. LOXL1 – lysyl oxidase – like 1 57 V. 3. SPARC – secreted protein, acidic, cystein – rich (osteonectin) 60 V.4. SSAT – spermidine/spermine N1 – acetyltranferase 62 VI. CONCLUSÕES 6 5 VII. REFERÊNCIAS 6 6 ANEXOS 8 4 21 I. INTRODUÇÃO Infertilidade é definida como a incapacidade do casal em obter gravidez após um ano de relacionamento sexual, sem uso de métodos anticoncepcionais (Healy et al., 1994; Gnoth et al., 2005). Cerca de 10 a 15% dos casais são inférteis e aproxi madamente 70% das gestações não chegam a termo, sendo que 50 a 60% das perdas fetais ocorrem no primeiro mês e 1% dos casais apresentam perdas recorrentes (Bulletti et al., 1996; Mercorio et al., 2006). Estima-se que 48% dos casos de infertilidade sejam causados por fatores femininos e que 28% não tenham etiologia estabelecida (Jose-Miller et al. , 2007). Diversos fatores podem ser responsáveis por perdas gestacionais, dentre eles: anormalidades uterinas, alterações genéticas; disfunções endócrinas e imunológicas; ag entes infecciosos; poluentes ambientais e endometriose. Embora em muitos casos seja po ssível reconhecer a causa, mais de 50% das perdas gestacionais recorrentes permanecem sem explicação após investigação ginecológica, hormonal e citogenética (Lissalde-Lavigne et al. , 2005). Pressupõe-se que os casos de infertilidade sem causa aparente sejam conse qüência da baixa receptividade endometrial, considerando o endométrio como fator prevalece nte na determinação da fertilidade da mulher (Strowitzki et al. , 2006). Corroborando essa hipótese, Bernabeu e colaboradores (2005) relataram que, em reprodução assistida, o maior fator limitante para o sucesso da fertilização in vitro era a implantação embrionária. Nas últimas décadas, muitas pesquisas vê m sendo desenvolvidas com o objetivo de identificar genes e proteínas expressos pelo endométrio e que possam estar relacionados à sua receptividade. Embora no processo implantacional a função individual dessas moléculas não seja totalmente conhecida, os dados result antes desses estudos forneceram informações complementares, revelando uma complexa via de regulação gênica para que o endométrio 22 atinja o estado receptivo (Horcajadas et al., 2004; Strowitzki et al., 2006; Horcajadas et al., 2007). Dentre os genes estudados estão, por exemplo, os que codificam receptores de progesterona e estrógeno, o fator inibidor da leucemia (LIF), molécu las adesivas, como a integrina αvβ3; TGF-β (transforming growth factor- β), interleucinas, como as IL-1 e IL-6 e metaloproteinases, como as MMP11 e MMP12 (Puri et al., 2000; Popovici et al., 2006). A expressão diferencial desses genes parece determinar tanto a condição uterina saudável, propícia para a gestação, qua nto condições patológicas que variam desde a baixa receptividade endometrial até o desenvolvimento da endometriose. I. 1. ENDOMETRIOSE I. 1. 1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Endometriose é uma doença ginecológica co mum, crônica, benigna, porém agressiva, caracterizada pela presença e crescimento de glândulas e estroma endometrial fora da cavidade uterina, onde é denominado t ecido ectópico (Giudice & Kao, 2004; Yang et al. , 2004; Sharpe-Timms, 2001). Os principais sinais clínicos e sintomas da endometriose são dismenorréia (dor pélvica durante a menstruação), dispaneuria (dor durante o ato sexual), dor pélvica crônica, irregularidades menstruais e infertilidade (Poliness et al., 2004; Arya & Shaw, 2005; Wu et al., 2005). Outros sintomas podem estar relaciona dos à doença, como dor durante a ovulação e fadiga crônica (Kenedy et al. , 2005). Em aproximadamente 4% dos casos há queixa de disúria, causada pelo envolvimento da bexiga (Hassa et al. , 2005), sendo que 3 a 34% das 23 mulheres afetadas apresentam sintomas relaci onados ao trato gastrointestinal (Gustofson et al., 2006). Entretanto, muitas pacientes podem ser assintomáticas (Nap et al., 2004). O tecido ectópico responde a hormônios e drogas de maneira similar ao endométrio situado no local original, denominado de teci do eutópico. Desta forma, está sujeito às alterações que se manifestam no decurso do ci clo sexual feminino e o sangramento das lesões endometrióticas parece contribuir para de sencadeamento de r eação imunológica local, inflamação e formação de adesões fibróticas, que podem ser responsáveis pela sintomatologia das pacientes (Arya & Shaw, 2005). A incidência exata da endometriose é desconhe cida e difícil de ser determinada, devido à variabilidade dos sintomas e à definição diagnóstica, que requer abordagem cirúrgica (Prowse et al. , 2005). Entretanto, acredita-se que aproxi madamente 15% da população feminina em idade reprodutiva seja afetad a pela doença, sendo que 30 a 40% das mulheres inférteis apresentam endometriose. Tem sido também identificada como causa de dor pélvica e abdominal em 15 a 32% dos casos submetidos a diagnóstico laparosc ópico. Nas pacientes com endometriose que apresentam dor pélvica, infertilidade ou ambas, a freqüência é de 35- 50% (Hassa et al., 2005; Giudice & Kao, 2004). Os locais mais freqüentes de lesões endometri óticas são o peritônio e os órgãos pélvicos, principalmente ovários, seguidos pelo sept o reto-vaginal. Menos de 12% das lesões localizam-se em regiões extra pélvicas, loca lizadas com maior freqüência nos tratos gastrointestinal (sigmóide, reto, área ileo cecal e apêndice) e urinário. Raramente pode acometer outras partes do corpo, como pulmões, tórax, pericárdio e cére bro. Sua distribuição é variável, desde poucas regiões afetadas e lesões pequenas até implantes difusos e profundos envolvendo extensas áreas e órgãos pélvicos, além da formação de cistos endometrióticos (endometriomas) e de aderências, as quais caus am distorção da anatomia pélvica (Kennedy et al., 2005; Barlow & Kennedy, 2005). 24 Segundo a American Society for Reproductive Medicine (ASRM, 1997), a endometriose pode ser classificada em quatro estágios (de I a IV), em fo rma mínima, leve, moderada e severa, conforme a extensão ou tamanho das lesõ es encontradas. Este método ajuda a avaliar a severidade da doença e quantificar o volume da s lesões, além de auxiliar na avaliação da resposta das pacientes ao tratamento (Arya & Shaw, 2005; Kennedy et al., 2005). Adicionalmente, as lesões endometrióticas do peritônio, ovário e septo reto-vaginal podem ser subdivididas em três ti pos distintos, de aco rdo com a fase de desenvolvimento da doença. As lesões vermelhas são caracterizadas por atividade celular intensa e ampla vascularização, correspondendo aos estágios iniciais da endometriose, quando ocorre implantação ectópica do tecido endometrial. O sangramento deste tecido, seguido de novo crescimento tecidual, desencadeia resposta in flamatória ao redor da lesão, formando uma escara de aparência escura, passando então a se r classificada como lesão negra. A seguir, a fibrose resultante do processo inflamatório e a conseqüente redução de vasos sanguíneos no foco endometriótico deixam-na opaca, com asp ecto cicatricial, sendo denominada de lesão branca. Acredita-se que nesta última fase as lesões possam permanecer em estado latente (Nisolle & Donnez, 1997). A endometriose possui ainda características celulares comuns a neoplasias, como por exemplo proliferação clonal, tendência a me tástase e invasão tecidual. Transformações malignas parecem estar associadas a 0,7-1,0% dos casos, sendo 70% deles adenocarcinomas endometrióides. Vários estudos demonstram que as pacientes têm risco aumentado de desenvolver certos tipos de câncer, predominantemente o ova riano, que abrange 76% das ocorrências (Barlow & Kennedy, 2005; Kitajima et al., 2005; Judson et al. , 2000; Swiersz, 2001). Contudo, esse risco parece ser extremamente baixo para paciente s jovens, tornando-se maior em períodos próximos à menopausa, torn ando, dessa forma, importante o diagnóstico precoce das lesões endometrióticas. Outros sí tios de implantação relacionados a processos 25 malignos são o intestino, bexiga, parede peritonial, vagina e tubas uterinas (Zanetta et al. , 2000; Bergqvist et al., 2004). Apesar de ser uma das doenças humanas mais freqüentes e ser bem caracterizada, sua patogênese permanece pouco conhecida (Redwin, 2002; Bischoff & Simpson, 2004). Segundo revisão de Knapp (1999) com dados históricos sobre a doença, a primeira descrição pelo médico alemão Daniel Shroen data de 1690, já sugerindo ser esta uma doença comum que acometia mulheres sexualmente maduras. Poré m, somente em 1927, Sampson caracterizou a endometriose como é conhecida atualmente, ela borando a hipótese etiológica mais aceita. A hipótese, denominada metastáti ca, é de que por meio da menstruação retrógrada fragmentos endometriais, descamados durante a fase menstrual, contendo células viáveis, são transportados através das tubas uterinas até a cavidade peritonial onde se implantam, crescem e invadem tecidos de órgãos adjacentes (Ary a & Shaw, 2005). Algumas evidências sustentam tal hipótese, como a presença de células endomet riais viáveis no efluente menstrual e fluido peritonial, o endométrio ser capaz de se implantar e crescer dent ro da cavidade peritonial e cerca de 70 a 90% das mulheres apresentarem menstruação retrógrada (Guo et al. , 2004; Kyama et al., 2003). Dessa maneira, algumas característi cas têm sido consideradas fatores de risco para o desenvolvimento da endometriose, como: ciclos menstruais de curta duração; maior duração da menstruação e menarca precoce, pois aumentam o tempo de exposição às células endometriais (Mounsey et al., 2006). No entanto, apenas o refluxo não é suficiente para estabelecer a doença, sendo necessárias outras condições que permitam que as células endometriais permaneçam funcionais no local da lesão. Apesar do tecido ectópico ser hist ogicamente e morfologicamente similar ao eutópico (endométrio situado no local original, ou seja, revestindo a cavidade uterina), eles apresentam diferenças qualitativas ou quantitativas em vários aspectos, como expressão de distintas de moléculas (Gaetje et al. , 1995; Sharpe-Timms, 2001). Acredita-se que 26 determinadas características moleculares favoreçam o aparecimento e a progressão da implantação ectópica, e podem explicar o moti vo pelo qual somente algumas mulheres desenvolvem a doença (Viganò et al., 2006). Estabelecer o diagnóstico da endometriose so mente com base na sintomatologia é uma tarefa bastante difícil devido a sua variabilid ade, além do que a gravidade da doença nem sempre está relacionada ao quadro clínico. Ass im, pode haver um intervalo de anos entre o aparecimento de sintomas e o diagnóstico definitivo (Kennedy et al. , 2005). Apesar das imagens de ultra-sonografia e ressonância magnética serem utilizadas como testes diagnósticos, elas são úteis somente para de tecção de endometriomas ovarianos e implantes endometrióticos extrapélvicos, respectivamente (Spaczynski & Duleba , 2003; Arya & Shaw, 2005). O procedimento padrão para determinação da localização, estadio, extensão e tipo das lesões é a laparoscopia, mesmo que algumas lesões não sejam reconhecidas devido ao pequeno tamanho ou por estarem atrás de estruturas de adesão (Brosens et al., 2004). Mesmo sendo considerado invasivo, oneroso e com determin ado risco para as pacientes, atualmente não existe diagnóstico confiável que não utilize esse método cirúrgico (Spaczynski & Duleba, 2003; Barlow & Kennedy, 2005). Considerando a dificuldade diagnóstica, muito s estudos têm sido elaborados na tentativa de identificar marcadores sérico s para a endometriose (Brosens et al., 2003). Nesse contexto, muitos autores estudaram a correlação entre a doença e os antígenos tumorais CA-125 e CA 19-9, os quais são detectados em maiores quantid ades no soro de portadoras, principalmente em estágios mais avançados (Harada et al. , 2002). No entanto, apesar destes marcadores terem alta especificidade, ambos possuem baixa sensibilidade, e têm sido utilizados de forma eficaz apenas no monitoramento de pacientes em tratamento (Harada, 2002; de Sá Rosa e Silva, 2006). O tratamento para a doença tamb ém é um desafio. Em geral tem com objetivo 27 eliminar e prevenir o reaparecimento dos im plantes endometrióticos, cujos sintomas estão principalmente relacionados a dor e subfertilidade (O’Callaghan, 2006). Atualmente, o tratamento consiste de drogas como análgésicos, pílulas contraceptivas orais e análogos de GnRH, cirurgia ou ambos (Mounsey et al. , 2006). Embora nenhuma terapia tenha se demonstrado eficaz, as lesões são erradicadas co m sucesso através de procedimentos cirúrgicos, como eletrocauterização e destruição a laser. Em 47% dos casos há recorrência das lesões (Esfandiari et al. , 2007; Marcoux et al. , 1997). Em pacientes com endometriose mínima ou média associada a probl emas de fertilidade, tanto a retirada das lesões e lise de adesões quanto a inseminação intra-uterina são métodos que aumentam a probabilidade de gravidez (Kennedy et al., 2005; Tummon et al., 1997). Condutas radicais, como a histerectomia, podem ser indicadas para casos mais severos, sendo que a taxa de recorrência nessas pacientes é de 5 a 10% (Arya & Shaw, 2005). I. 1. 2. ASPECTOS GENÉTICOS DA ENDOMETRIOSE A origem genética da endometriose foi bas eada em estudos familiais, que evidenciaram maior incidência da doença em parentes de primeiro grau de mulheres afetadas, de 4,3 a 6,9%, em relação a parentes de mulheres não afetadas, de 0,6 a 2,0% (Simpson & Bischoff, 2002). No entanto, a grande quantidade de alterações moleculares e celulares detectadas sugere origem poligênica da doença (Hu et al. , 2005). Sendo assim, o fenótipo resultante pode decorrer das interações entre produtos da expressão de determinados alelos de genes específicos envolvidos (Barlow & Kennedy, 2005) . É verossímil também a idéia de que o ambiente peritonial de mulheres susceptíveis à enfermidade possa favorecer modificações na integridade genômica das células endometriais que provêm do efluente menstrual e, assim, ocasionar o surgimento das lesões (Guo et al., 2004). 28 Já a associação entre endometriose e câncer está baseada principalmente no conhecimento adquirido por estudos cromossômicos. Regiões com ganho de material possivelmente abrigam oncogenes, enquanto que os genes supressores tu morais encontram-se em regiões de perda cromossômica. As alterações observadas fora m descritas em regiões onde há perdas de seqüências de DNA, como nas regiões 1p, 5p, 6q e 22q (Gogusev et al., 2000). Entre os genes com possível desencadeamento de malignidade, estão os supressores tumorais PTEN e TP53 e os proto-oncongenes Bcl-2 e c-myc (Viganó et al., 2006). I. 1. 3. ASPECTOS MOLECULARES E PATOGÊNESE Considerando a alta incidência da doença na população feminina, as conseqüências do processo e também a ausência de diagnóstico e tratamento efetivos, grande esforço científico tem sido direcionado para pesquisas sobre a doença. Vários estudos na l iteratura evidenciam que as principais divergências moleculares en tre portadoras e não portadoras de endometriose estão relacionadas a processos envolvidos na apoptose (Braun et al. , 2002), adesão celular (Béliard et al., 1997), angiogênese (Healy et al., 1998), biosíntese de estrógeno (Zeitoun & Bulun, 1999), sistema imune, além de fatores de crescimento (Braun & Dmowski, 1998) e metaloproteinases (Martelli et al., 1993). Dessa forma, uma sequência determinada de eventos faz-se necessária para o estabelecimento das lesões. Primeiramente, as células endometriais devem ter maior capacidade para estabelecer interações célula-cé lula e entre células e matriz extracelular nos locais onde se implantam. O fato de que o tecido endometriótico é capaz de expressar diferentes integrinas pode explic ar a habilidade desse tecido em aderir ao peritônio, uma vez que essas moléculas servem como receptoras de laminina, fibronectina, colágeno tipo I e IV e vibronectina. (Regidor et al., 1998). A expressão aumentada de moléculas de adesão, como 29 ICAM-1, em mulheres acometidas pela endome triose também auxilia na elucidação desse fenômeno (Matalliotakis et al., 2001). Após a fixação, as células que formam a lesão têm que ser hábeis para invadir o tecido ao qual se ligaram. Logo, o aumento da expressã o de metaloproteinase s, como MMP-2, e a expressão reduzida de seus inibidores, como TIMP-3, sugerem maior atividade proteolítica e conseqüentemente maior potencial invasivo de células endo metriais em pacientes com endometriose (Chung et al., 2002; Cox et al., 2001). Para sustentação das lesões endometrióticas, a neovascularização é um processo importante e comumente observado ao redor delas. Atividade e quantidade aumentadas de fatores angiogênicos no fluido peritonial de p acientes têm sido descrita s na literatura, sendo VEGF, a principal molécula envolvida, expres sa nos implantes endometrióticos (Donnez et al., 1998; Viganó et al., 2004). Como a endometriose é uma doença estrógeno dependente, a síntese desse hormônio auxilia a manutenção dos implantes ectópico s. Em 1999, Zeitoun e Bulun observaram alta síntese de aromatase em cist os endometrióticos e implante s endometriais extra-ovarianos. Considerando que a aromatase cataliza a biosín tese de estrógeno, os autores sugeriram que essa expressão aberrante está relacionada à patogênese da doença. O desenvolvimento da doença também depende da proliferação da lesão estabelecida, a qual é mais alta nas células ep iteliais, estromais e endoteliais do endométrio de mulheres portadoras (Wingfield et al. , 1995). Exemplos de fatores que intensificam o crescimento celular incluem FGF, EGF, TGF-α, TGF-β e TNF- α (Hammond et al., 1993). Outro fenômeno que ajuda a explicar a persistê ncia das lesões endometrióticas fora da cavidade uterina é a resistência à apoptose, devido à desregulação entre moléculas pró- apoptóticas menos expressas, como por exem plo a p53, e moléculas anti-apoptóticas, como Bcl-2, mais expressas (Braun et al., 2007; Jones et al., 1998). 30 Em relação à imunologia da endometriose, fo i sugerido que as células dos implantes ectópicos apresentam mecanismos de escape, que r seja pela modificação da expressão de antígenos, como HLA classe I, que impedem o reconhecimento imunológico, ou pela secreção de TGF- β e prostaglandina E2, que inibem a função linfocitária, quer seja pelo comprometimento da atividade das células natural killer, levando à redução da vigilância imunológica. Além disso, foi descrito um aumento no número de macrófagos ativos no fluido peritonial das pacientes, os quais secretam citocinas, como IL-8 e TNF- α, promovendo proliferação celular, adesão e angiogênese (Semino et al., 1995; Oosterlynck et al., 1991). Adicionalmente, as alterações secundárias ou conseqüentes à endometriose também têm sido estudadas em nível molecular. Quanto à in fertilidade, considera-se que a causa principal de baixas taxas de gravidez em paciente s afetadas pela doença está relacionada a anormalidades na expressão de moléculas endomet riais, resultando em falhas na implantação embrionária (Kao et al. , 2003). Essa consideração apóia-se no fato de que a expressão da integrina αVβ3, importante durante o período de receptividade uterina ao embrião, está ausente no endométrio tópico das mulheres afetadas pela patologia (Vernet-Tomás et al. , 2006), além do que os altos níveis de óxido ní trico endotelial encontrados nessas mulheres podem ser responsáveis por efeitos citotóxico s, que tornam o útero menos receptivo ao embrião (Khorram & Lessey, 2002). Outras investigações revelaram que o fluido peritonial de mulheres com endometriose pode ser tóxico ao s espermatozóides e exibe efeito adverso à sobrevivência embrionária, pois quando inocula do em coelhos, ratos e hamsters, reduzia as taxas de implantação embrioná ria nesses animais (Giudice et al. , 2002). Além disso, os produtos secretados pelo endométrio ect ópico e/ou por células imunológicas contêm substâncias com efeito prejudicial à fertilidad e (como citocinas, fatores de crescimento, prostaglandinas, espécies reativas de oxigênio e auto-anticor pos) que interferem na ovulação, função endócrina, transporte de gametas e do embrião, fertilização e desenvolvimento 31 embrionário, aumentando assim a possibilidade de falhas de implantação do embrião (Dmowski et al., 2002). I. 2. METODOLOGIA DE INVESTIGAÇÃO MOLECULAR Na última década, muitos estudos foram reali zados na área de genética molecular com objetivo de explorar o genoma dessas pacientes, visando a identificação de genes candidatos a marcadores da endometriose (Taylor et al. , 2002). Alguns autores tentaram associar a doença a polimorfismos genéticos, relacionados, por exemplo, com os genes GALT, CYP1A1, NAT2 e GMST1. Esses estudos, no entanto, apresentaram resultados controversos (Bischoff & Simpson, 2004). Atualmente, as pesquisas buscam a inve stigação de genes que se expressem diferencialmente (maior ou menor expressã o) nas células que correspondem às lesões endometrióticas. Para isso, várias metodologias foram aplicadas para screening desses genes, dentre elas as principais são microarrays, hibridação genômica comparativa e biblioteca subtrativa (Gogusev et al., 1999; Gogusev et al., 2000; Kao et al., 2003; Guo et al., 2004; Hu et al., 2005; Flores et al., 2006). Alguns autores buscaram escl arecer se existe diferença de expressão gênica entre os te cidos eutópico e ectópico das mesmas pacientes. Com isso, puderam avaliar quais genes influenciavam modi ficações nas células endometriais do útero, tornando-as capazes de se implantar em locais e órgãos distintos. A hibridação subtrativa é uma metodol ogia que compara dois grupos celulares distintos denominados tester e driver, permitindo isolar genes mais expressos em somente um dos dois grupos, pois remove seqüências comuns entre eles (Cho & Park, 1998; Taylor et al., 2002). Segundo Jiang e colaboradores em 2000, a t écnica de hibridação subtrativa rápida (RaSH) simplifica e torna mais eficiente o pro cesso de subtração, identificando grande 32 quantidade de seqüências diferencialmente expre ssas, o que inclui genes conhecidos, além de seqüências ainda não descritas nos bancos de dados atuais. Re sumidamente, o protocolo de RaSH é baseado na digestão enzimática dos c DNAs das amostras dos dois grupos a serem testados e os fragmentos gerados são ligados a adaptadores e amplificados por PCR. Após esses passos, somente as amostras de um dos grupos ( tester) são digeridos novamente, com a enzima de restrição XhoI. Posteriormente as seqüências de ambos os grupos são incubadas juntamente para que ocorra hibridação. Ne sta etapa, as amostras do grupo denominado driver são colocadas em excesso na reação, o que garante a subtração. O resultado do processo são moléculas representadas por 3 tipos de cDNA fita dupla: driver-driver, driver-tester e tester- tester. Somente a população de moléculas tester-tester é selecionada após ligação a plasmídeos previamente tratados com a enzima XhoI . Então os plasmídeos recombinantes são inseridos por transformação bacteriana, e as bactérias plaqueadas em meio de cultura. Finalmente os insertos são retirados das colônias e seqüenciados. Em 2002, Eyster e colaboradores em pregaram a tecnologia de cDNA microarrays comparando os níveis de expressão gênica em três pacientes, numa plataforma com 4133 genes. Oito deles foram considerados super-expressos nos implantes ectópicos, alguns responsáveis por componentes do citoesqueleto (como vimentina) e os demais com funções relacionadas ao sistema imune. Com o mesmo intuito, Hu, Tay & Zhao, em 2005, utilizaram hibridação subtrativa de cDNA em 15 pacientes com a doença. Neste trabalho obtiveram 78 cDNAS diferentes, entre os quais 14 genes foram classificados como possíveis candidatos a marcadores da doença. Entre os genes mais expressos nas lesões estavam o IGFBP5, relacionado ao crescimento das lesões e PSAP e FBLN1 , associados a câncer ovariano e de mama. Entre os menos expressos, estavam os genes RhoE, ligado a adesão celular, DLX5, que auxilia na persistência do estado proliferativo das células endometrióticas e 11 β-HSD2, 33 responsável por estimular atividade da aromatase, atuando assim como mantenedor das lesões em local ectópico. Após terem evidenciado que o endométrio eutópico das pacien tes com endometriose possuía propriedades intrínsecas que provocavam seu desenvolvimento em lesões endometrióticas (Gagné et al. , 2003), pesquisadores procuraram estudar a expressão gênica diferencial do endométrio de mulheres portadora s e não portadoras de endometriose, para identificar possíveis genes de susceptibilidade à doença. Flores e colaboradores, em 2006, aplicaram amostras de cDNA, obtidas a partir de RNA de linfócitos de sangue periférico dos dois grupos estudados, em arrays contendo 14185 seqüências de genes conhecidos. Os resultados incluíram genes envolvidos no metabolismo de colágeno, promoção da proliferação celular e tumorigênese, mas diferenças de ex pressão mais significativ as foram relacionadas aos genes IL2RG e LOXL1 , ligados ao sistema imunológico e supressão tumoral, respectivamente. Também em 2006, Kyama e colaboradores aplicaram a técnica de PCR em tempo real para avaliar a expressão de mRNA s de citocinas, metaloproteases, fatores de crescimento e de adesão em biópsias endomet riais e peritônio de mulheres com e sem a doença. Foi detectado aumento da expressão de moléculas de mRNA referentes aos genes TNF-α, IL-8 e MMP-3 , principalmente na fase menstrual do ciclo sexual feminino. Esse resultado significa maior capacidade do tecido endo metrial das pacientes em proliferar, aderir e formar vasos sanguíneos, promovendo o implante ectópico e o desenvolvimento das lesões endometrióticas. Os autores sugeriram que a progressão da doença, bem como seu estadiamento, podiam ser preditas de acordo co m o nível de expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias e MMPs. Em 2003, Kao e colaboradores usaram microarrays para pesquisa de genes associados a falhas de implantação embrionária e infertilidade, utilizando amostra de tecido endometrial de oito afetadas e 12 mulheres sem a doença. Os resultados sugeriram que a maior expressão dos 34 genes B61 e semaforina E, participantes do processo de neovascularização, determinaria o estabelecimento das lesões. Além disso, foi pos tulado que a desregulaç ão de outros genes, como BSEP, C4BP, glicodelina, IL-15 e pentaxina II, provocaria respostas inflamatórias, disfunção do sistema imune, toxicidade embri onária e apoptose, produzindo ambiente uterino inóspito para o início da gravidez. Simultaneamente, a alteração da expressão de GlcNAc6ST poderia bloquear mecanismos de adesão endometrial, resultando em falha implantacional. Apesar da extensa investigação molecular descrita por diferentes grupos de pesquisa, ainda não há consenso sobre qua is genes e seus produtos são re sponsáveis pelo surgimento e progressão da endometriose, assim como quais moléculas podem ser consideradas marcadoras para diagnóstico e terapêutica. I. 3. JUSTIFICATIVA Apesar da extensa literatura sobre a dete rminação da origem da endometriose, sua etiologia permanece desconhecida. Devido à alta freqüência da doença em mulheres em idade reprodutiva, principalmente em pacientes inférteis, e aos mét odos invasivos utilizados para seu diagnóstico, torna-se importante a busca de novas metodologias de investigação. Este projeto busca identificar genes envolvidos na fisiopatologia da endometriose, com objetivo de determinar possíveis marcadores moleculares para diagnóstico e tratamento da doença. 35 II. OBJETIVOS O objetivo principal do trabalho foi id entificar por meio da técnica de RaSH (Rapid Subtraction Hybridization), genes com expressão diferencial em lesões endometrióticas e em tecido endometrial de mulheres não afetadas. Os objetivos intermediários foram: (1) identificar genes co m maior ou menor expressão em lesõ es endometrióticas de pacientes com diagnóstico firmado de endometriose; (2) identificar genes com maior ou menor expressão em endométrio de mulheres não afetadas pela doença, para análise comparativa; (3) correlacionar os genes expressos diferencialmente com os processos fisiopatológicos relacionados à endometriose. 36 III. MATERIAL E MÉTODOS Este projeto foi desenvolvi do no Laboratório de Genéti ca Molecular e Citogenética Molecular Humana do bloco C do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP), com apoio de e quipe multidisciplinar da área de Genética Reprodutiva, em colaboração com o serviço de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP, do Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática da Fundação Hemocentro da mesma instituição e do Laboratório de Oncologia Pediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura da FMRP-USP. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesqui sa (CEP) do HCFMRP-USP, processo HCRP n o 11736/2004. Todas as pacientes participantes da pesquisa assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. III. 1. AMOSTRAS Para realização deste projeto, foram coletadas 22 amostras de tecido endometrial de pacientes atendidas em ambulatórios especi alizados do HCFMRP-USP, divididas em dois grupos. O grupo I compreende 11 biópsias de lesões endometrióticas, sendo cinco de origem ovariana e seis de origem peritonial, de pacientes encaminhadas aos Ambulatórios de Dor Pélvica e Endoscopia (AGDE) e de Infertilid ade Conjugal do HCFMRP-USP, diagnosticadas com endometriose por meio de exame laparoscópico, confirmado por análise histológica. O grupo II (grupo controle) compreende 11 am ostras de endométrio tópico, sendo as biópsias obtidas utilizando cureta de Novak, de pacientes sem diagnóstico de endometriose, 37 após serem submetidas à laparoscopia, enca minhadas pelo Ambulatório de Planejamento Familiar para laqueadura tubária. As amostras foram coletadas no centro cirúrgico do HCFMRP-USP e armazenadas em freezer -800C após tratamento com criopreservador Tissue-Teck® O.C.T. Compound (Sakura Finetek USA. Inc., Torrance, CA). O estadio da doença foi determinado de acordo com a classificação da American Society for Reproductive Medicine (Revised American Societ y for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996). Os critérios de inclusão foram amostras de pacientes com idade entre 18 e 40 anos, apresentando cicl os menstruais regulares de 25 a 35 dias, que estivessem na fase proliferativa do ciclo mens trual e sem uso de anticoncepcional oral ou qualquer outra forma de tratamento hormonal no período de três meses anterior à coleta. III. 2. METODOLOGIA III. 2. 1. ISOLAMENTO DO RNA TOTAL Anteriormente à extração de RNA, eliminamos o criopreservador la vando os tecidos com 1mL de PBS (NaCl 8,50g/L; Na 2HPO4 1,11g/L; Na 2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH 2PO4 0,20g/L pH7,0) por três vezes. As amostras foram maceradas completamente com nitrogênio líquido e para cada 50mg de tecido adicionamos 1mL de TRIZOL ® Reagent ( Invitrogen Life Technologies, USA – Molecular Research Center, Inc. ) até atingir consistência lí quida. O RNA total de cada amostra de tecido foi isolado adicionando 200μL de clorofórmio, seguido de centrifugação, de acordo com as recomendações do fabricante. A fa se aquosa foi transferida para um novo tubo 38 e o RNA foi então precipitado com 500μ L de álcool isopropílico. O pellet foi lavado com 1mL de etanol 75% e, após secagem, diluído em 12μL de água tratada com DEPC. A integridade do RNA foi analisada em gel de agarose 1%, marcado com brometo de etídeo e visualizada com luz ultra-violeta. A verificação de bandas de RNAs ribossômicos de 28S e 18S intactos foram usadas como critério para certificação de que os RNAs não estavam degradados. As concentrações das soluções de RNA foram medidas em espectofotômetro (Eppendorf) a DO 260 , depois de diluídas individualmente em 10 μL de água livre de RNAse. O RNA permaneceu armazenado à -800C até o momento do uso. III. 2. 2. RAPID SUBTRACTION HYBRIDIZATION (RaSH) No presente trabalho, ap licamos o protocolo de RaSH (Jiang et al. , 2000) com modificações, utilizando RNA extraído de lesões endometrióticas e de endométrio tópico de mulheres não afetadas pela endometriose. O protocolo foi executado duas vezes, sendo que ambos os grupos serviram uma vez como tester e outra como driver. 39 Esquema ilustrativo da técnica de Rash: Tecido de Endométrio Normal Tecido Ectópico (Lesão endometriótica) RNAm RNAm RT RT cDNA cDNA GATC CTAG GATC CTAG GATC CTAG GATC CTAG T4 ligase – adição dos adaptadores T4 ligase – adição dos adaptadores PCR (primer XDPN-18) PCR (primer XDPN-18) GATC CTAG GATC CTAG XXhhoo II – restrição enzimática MMbbooII – restrição enzimática MMbbooII – restrição enzimática GATC CTAG GATC CTAG Hibridação tester e driver A B C Tester Driver 40 GATC CTAG tester tester GATC CTAG tester driver GATC CTAG driver driver Seqüenciamento XhoI D Figura 1: A) Amostras de cDNAs obtidos a partir dos tecidos analisados, transcrição reverva, restrição enzimática com MboI e li gação dos adaptadores; B) PCR com primers XDPN-18 e restrição enzimática somente da amostra tester, representada, na figura, pela lesão endometriótica; C) Mistura das amostras tester e driver, seguida de reação de hibridação; D) Representação dos híbridos ge rados, ligação do híbrido tester-tester ao plamídeo tratado com a enzima de restrição XhoI, transformação b acteriana, plaqueamento e seqüenciamento dos insertos clonados. 41 III.2.2.1. SÍNTESE DE cDNA Para síntese de cDNA, foram escolhidas alea toriamente seis amostras do grupo controle e seis amostras de mulheres com endometriose. As amostras foram separadas de acordo com o grupo ao qual pertenciam e mistur adas, gerando dois conjuntos ou pools com 25 μg de RNA total. Cada amostra contribuiu com a mesma quantidade de RNA (4,17μg). Obtivemos os cDNAs fita dupla utilizando 200U da enzima SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen) e 0,50 μg de oligo(dT) 12-18 , para síntese da primeira fita, além de 10U de E. coli DNA ligase (Invitrogen) e 40U de E. coli DNA Polymerase I (Invitrogen), para síntese da segunda fita. Logo após, a qualidade da síntese do cDNA foi avaliada pela técnica de PCR, usando primers para β–actina. III.2.2.2. DIGESTÃO ENZIMÁTICA E LIGAÇÃO DOS ADAPTADORES Os cDNAs foram incubados com 20U da enzima de restrição MboI por 1 hora a 37 0C para digestão. Os fragmentos produzidos foram extr aídos com fenol/clorofórmio e precipitados com etanol. Os sítios gerados nas extremidades dos fragmentos foram ligados aos adaptadores XDPN-12 (GATCTCTCGAGT) e XDPN-14 (CTGATCACTCGAGA), usando 8,0 μL de tampão ligase 5X. Acrescentamos 9U de T4 ligase ( Invitrogen) e em seguida incubamos a 140C overnight, para efetuar a reação de ligação. III.2.2.3. PCR E PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS As amostras obtidas da reação anterior foram diluídas com LoTE ( Invitrogen), em volume final de 100 μL e amplificadas por PCR, contendo 6,00 μL do primer XDPN-18 (CTGATCACTCGAGAGATC), complementar aos adaptadores. Após a PCR, os produtos foram misturados de acordo com o grupo ao qual pertenciam (grupo I e grupo II). Foi 42 realizada extração por fenol/clorofórmio e precipitação com etanol para obtenção dos produtos da amplificação. III.2.2.4. DIGESTÃO DO TESTER E HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA Dez microgramas da amostra tester foram digeridos com 20U da enzima de restrição XhoI (Gibco BRL). Os fragmentos obtidos foram então diluídos em 30 μL de LoTE. Cem nanogramas do produto da digestão foram misturados a 5 μg da amostra driver. A reação de hibridação foi realizada adicionando à mistura 16,60 μl de tampão de ligação (0,5M de NaCl; 50mM de Tris/HCl; SDS 0,2%; formam ida 40%) e após denaturação a 100 0C durante 5 minutos, a solução foi incubada a 420C por 48 horas. Então foram aplicados 3 μl do produto da hibridação à solução contendo 0,50 μl do plasmídeo pZErO ®-1 (1 μg/μL) pré-digerido com a enzima de restrição XhoI. A mistura foi incubada a 160C durante 3 horas para ligação do híbrido tester-tester com o plasmídeo. III.2.2.5. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA E GERAÇÃO DAS BIBLIOTECAS DE cDNA Dois microlitros do plasmídeo recombinante foram adicionados a 50μ l de solução contendo bactérias competentes, seguido de eletroporação (2,5 V, 25 μFD, 200 OHMS) ( GenePulser, BioRad). Acrescentamos 500μl de meio líquido SOC à mistura, a qual foi mantida em shaker à rotação de 200 RPM, por 1 hora, a 37 0C. 43 Após incubação, adicionamos mais 500 μl de meio SOC e semeamos a solução em placas de Petri contendo 40mL de meio ágar LB Low Salt com 20 μl do antibiótico zeocina (100mg/mL). Seguiu-se incubação em estufa a 370C, overnight. III.2.2.6. ANÁLISE DAS COLÔNIAS E OBTENÇÃO DOS DADOS As colônias foram palitadas e semeadas em microplacas de 96 poços. Cada poço continha 150μl do meio líquido 2XYT com zeocina (50mg/mL). Após incubação a 37 0C overnight, uma alíquota de 1 μl de cada poço foi usada para PCR, com primers M13, complementares a seqüências internas do plasmídeo, flanqueado aos insertos de cDNA tester-tester. Os produtos das reações foram visualizados em gel de agarose 1,5% e seqüenciados em seqüenciador automático MegaBace TM 1000 ( Amesham Biosciences, Piscataway, NJ, USA ) utilizando DYEnamic ET Dye Terminator Sequencing Kit ( Amesham 44 Biosciences, Piscataway, NJ, USA ), segundo as normas do fornecedor. As seqüências obtidas foram analisadas e armazenadas no banco de dados do Laboratório de Genética Molecular e BioInformática da Fundação Hemocentro do HCFMRP-USP para posterior análise com o programa Generic EST Annotation Pipeline ( Geap), desenvolvido no mesmo laboratório, o qual utiliza os seguintes valores padrões: phred cutoff de 0,09, valor de qualidade 100pb, minmatch 10, minscore 20 e BLAST (1e -30). Foram selecionadas para composição do banco de dados, as seqüências que tiveram, no mínimo, 90% de homologia com as depositadas no banco de dados GenBank® do National Institute of Health (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). Após a geração desses dados, procedeu-se a leitura de inform ações sobre os genes, aos quais as seqüências obtidas pela RaSH se referem, através de buscas nos sites de acesso público Gene Ontology ( http://fatigo.bioinfo.cnio.es) e, principalmente, no National Center for Biotechnology Information - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Os textos analisados pelo site da NCBI são encontrados através dos links: 45 - GENE: banco de dados para pesquisa de inform ações de genes específicos. O conteúdo é atualizado constantemente, envolvendo nomencl atura, localização cromossômica, produtos gênicos, fenótipos associados e links para citações, seqüências homólogas, expressão, domínios protéicos e bancos de dados externos; - OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man): banco de dados que abrange genes humanos e doenças genéticas. As informações fornecidas por vários sites de armazenamento de dados envolvem textos e referências bibliográficas; - PubMed: banco de dados desenvolvido na National Library of Medicine (NLM) que fornece mais de 14 milhões de artigos científicos pub licados em mais de 4800 jornais e revistas especializadas em diversas áreas, principalmente a biomédica. Para facilitar a seleção dos genes de inte resse, o grupo de Bioinf ormática do bloco G do Depto. de Genética da FMRP-USP elaborou um programa capaz de cruzar palavras dos textos com as principais palavras-chave de evento s biológicos, fisiológicos e/ou patológicos que poderiam estar envolvidos nas principais causas do estabele cimento e desenvolvimento da endometriose. Após revisão da literatura, foi elaborada uma lista dos principais termos provavelmente associados à patogênese da doença. As palavras utilizadas foram: “blood supply”; “cell;cycle”; “celldeath”; “pr ogrammed cell death”; adherence; adhesion; adhesions; angiogenesis; angiogenetic; antiangi ogenic; antiapoptosis; apoptosis; attach; attached; attaches; attachment; autoimmune; c ancer; cancers; carcinogenesis; carcinoma; chemoattractant; chemokin; chemokines; chem otactic; cyst; cysts; cytokine; cytokines; differentiate; differentiates; differentiation; dissemination; endometrioma; endometriomas; endometriosis; endometriotic; endo thelial; endothelium; estrogen; female; fertile; fertility; fertilization; gonad; gonadal; gonads; grow; growth; gynecol ogic; gynecology; hyperplasia; hyperplasic; immune; immunologic; immunological; immunology; immunosuppression; immunosuppressive; implant; implantation; impl ants; infertile ; infertility; inflammation; 46 inflammatory; interleukin; invade; invading; invasion; lesion; lymphocyte; lymphocytes; lymphoma; malignancies; malignancy; malignant; menstrual; menstruation; metaplasia; metaplastic; metastasis; mitogen; mitogenic; mitosis; neoangiogenesis; neoplasia; neoplasm; neoplastic; oestrogen; oncogenesi s; oncogenic; ovarian; ovaries; ovary; ovulation; pelvic; pelvis; peritonial; peritoneum; pregnancy; pregnant; proapoptotic; proinflammatory; proliferate; proliferates; pr oliferation; proliferative; prostaglandins; reproduction; reproductive; scatter; spread; spreading; spreads; steroid; steroids; survival; survive; tumor; tumoral; tumorigenesis; tumors; tumour; tum ours; uterine; uterus; vasculature; woman; women. Depois de executado o programa, as seqüências obtidas pela RaSH foram classificadas em: • Candidatas – seqüências referentes a genes que participavam de processos que poderiam estar relacionados à endometriose; • Não-candidatas - seqüências referent es a genes que participavam de processos que não estavam relacionados à endometriose; • Com informações insuficientes - seqüências referentes a genes cujas informações da literatura eram escassa s e portanto sem relação direta com a endometriose; • Com dados controversos na literatura - seqüências referentes a genes cuja ação ou função ainda não estão bem estabelecidas. 47 III. 2. 3. VALIDAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS GENES SELECIONADOS POR RT-PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL III.2.3.1. SÍNTESE DE cDNA Para obtenção do cDNA, usamos o High Capacity cDNA Reversion Transcription Kit (Applied Biosystems), segundo instruções do fabricante. Um micrograma de cada a amostra de RNA total foi adicionado a tampão 10X, dNTP 100mM, random primer 10X, 1,25μ L da enzima multiscribe e 2,5U de RNaseOUTTM (Invitrogen) em volume final de 25μL. A solução foi submetida a 25 0C por 10 minutos, seguido de 37 0C por 2 horas e 85 0C por 5 segundos. Então cada amostra foi diluída em água DEPC na proporção 1 para 50. Os produtos das reações foram armazenados em freezer -20 0C até a realização da técnica de RT-PCR quantitativo em tempo real. III.2.3.2. EFICIÊNCIA DA REAÇÃO Para todos os genes de interesse (SPARC , SSAT, HTRA1 e LOXL1 ) e controle endógeno (GAPDH) foram construídas curvas de amplificação a partir da utilização de diluições seriadas (não diluído, 10 -1, 10 -2 e 10 -3) em triplicata do cDNA da amostra calibradora. Utilizamos como calibrador uma amostra de cDNA obtida a partir de RNA do tecido endometrial normal de uma paciente sem endometriose. Para construção da curva-padrão, foram usados pelo menos três pontos a partir da curva de amplificação. Consideramos as curvas com slope entre -3,55 e -3,1, o que reflete eficiê ncia de amplificação de, no mínimo, 48 90,5%. As figuras 2 e 3 mostram, respectivamente, a curva de amplificação e curva-padrão construídas para o gene LOXL1. Figura 2: Curva de amplificação do gene LOXL1. Foi plotada a fluorescência da amplificação versus o número de ciclos da PCR. Fonte: ABI PRISMTM 7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems) 49 Figura 3: Curva-padrão do gene LOXL1 obtida a partir da curva de amplificação. Fonte: ABI PRISMTM 7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems) III.2.3.3. QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA A quantificação da expressão gênica foi realizada por meio da RT-PCR quantitativa em tempo real no aparelho ABI PRISM TM 7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems) do Laboratório de Oncologia Pediátrica do Departamento de Puericultura e Pediatria do HCFMRP-USP. As reações fo ram executadas utilizando o sistema TaqMan ® (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fa bricante. Cada reação continha Universal PCR Master Mix 2X, Gene Expression Assay Mix 20X e 9µL de cDNA em volume final de 20µL. As condições da reação fora m 95ºC por 10 minutos, seguidos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto, durante 40 ciclos. As expressões dos genes de interesse foram calculadas de acordo com a fórmula 2-ΔΔCT, de acordo com o trabalho de Livak & Schmittgen (2001), fornecendo os valores de RQ ( Relative Quantification), os quais foram utilizados na análise estatística. III. 2. 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA A comparação dos dados de expressão gênica foi realizada pelo o teste não-paramétrico de soma de postos de Wilcoxon, para duas amostras independentes com nível de confiança de 95%, utilizando o programa STATDISK 9.1 (Triola, 2005). Para os genes com diferença significativa no teste anterior, os valores dos níveis de expressão gênica também foram avaliados a partir da análise da curva ROC ( Receiver- Operating Characteristic ), através do software MedCalc ( http://www.medcalc.be). A curva refere-se a valores de verdadeiros positivos (sensibilidade, verdadeiro s-positivos / falsos- 50 negativos + verdadeiros-positivos) em função dos falsos positivos (especificidade, verdadeiros-negativos / falsos-positivos + verdad eiros-negativos). A área abaixo da curva é a medida de quanto é acurada a distinção entr e os grupos analisados (Metz, 1978; Zweig & Campbell, 1993). Adicionalmente, a partir da curva ROC foi gerado, pelo mesmo programa, o diagrama de pontos interativos ( interactive dot ) para estudo da prec isão da separação dos grupos desse estudo. O diagrama indica o valor de RQ que permite melhor separação (mínimo de falsos-positivos e de falsos-negativos) entre os grupos. 51 IV. RESULTADOS IV.1. OBTIDOS PELA TÉCNICA DE RaSH Os dados referentes às seqüências que segui ram os critérios de seleção permaneceram disponíveis aos pesquisadores deste trabalho no site http://guarani.fmrp.usp.br/geap. As seqüências analisadas das bibliotecas de cDNA foram dividi das em 8 categorias : mitocondrial; levedura; RefSeq (seqüências de referência) ; UniGene; outros; ribossômica; ESTs e bactéria. A tabela I sumariza os resultados referentes às seqüências de referência: a coluna RHENDI apresenta os dados obtidos quando o conj unto de cDNAs do grupo de mulheres com endometriose foi utilizado como tester e a coluna RHENDW é referente aos resultados obtidos quando esse mesmo conjunto de cDNAs foi usado como driver. Os números à direita correspondem à quantidade de colônias contendo os insertos referentes às seqüências anotadas à esquerda. As demais categorias de seqüências estão relacionadas nos anexos A e B. Tabela I: Seqüências de referência obtidas pela RaSH nas bibliotecas RHENDI e RHENDW RefSeq RHENDI RHENDW NM_013349 Homo sapiens SCIRP10-related protein (SCIRP10), mRNA 1 NM_001001894 Homo sapiens tetrat ricopeptide repeat domain 3 (TTC3), transcript variant 2, mRNA 4 NM_001008897 Homo sapiens t-complex 1 (TCP1), transcript variant 2, mRNA 1 continua continuação 52 NM_000291 Homo sapiens phosphoglycerate kinase 1 (PGK1), mRNA 1 NM_153000 Homo sapiens adenomatosis polyposis coli down-regulated 1 (APCDD1), mRNA 1 NM_002668 Homo sapiens proteolipid protein 2 (colonic epithelium-enriched) (PLP2), mRNA 1 NM_006732 Homo sapiens FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B (FOSB), mRNA 3 NM_000518 Homo sapiens hemoglobin, beta (HBB), mRNA 3 NM_001961 Homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 2 (EEF2), mRNA 2 NM_003118 Homo sapiens secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin) (SPARC), mRNA 7 NM_004530 Homo sapiens matrix metalloproteinase 2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV colla genase) (MMP2), mRNA 2 NM_001780 Homo sapiens CD63 antigen (melanoma 1 antigen) (CD63), mRNA 12 continuação continua 53 XM_929146 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC646190 (LOC646190), mRNA 1 NM_002568 Homo sapiens poly(A) binding protein, cytoplasmic 1 (PABPC1), mRNA 1 XM_496985 PREDICTED: Homo sapiens similar to transcription el ongation factor B polypeptide 3 binding protein 1 (LOC441363), mRNA 1 NM_000918 Homo sapiens procollagen-proline, 2- oxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4- hydroxylase), beta polypeptide (protein disulfide isomerase-associated 1) (P4HB), mRNA 1 NM_207521 Homo sapiens reticulon 4 (RTN4), transcript variant 5, mRNA 3 NM_013974 Homo sapiens dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 (DDAH2), mRNA 5 NM_198976 Homo sapiens TH1-like (Drosophila) (TH1L), transcript variant 1, mRNA 1 NM_014300 Homo sapiens SEC11-like 1 (S. cerevisiae) (SEC11L1), mRNA 1 continua continuação 54 NM_001013702 Homo sapiens similar to p40 (LOC440258), mRNA 12 1 NM_006367 Homo sapiens CAP, adenylate cyclase- associated protein 1 (yeast) (CAP1), mRNA 1 NM_017733 Homo sapiens GPI7 protein (GPI7), mRNA 1 NM_004109 Homo sapiens ferredoxin 1 (FDX1), nuclear gene encoding mitochondrial protein, mRNA 1 NM_024293 Homo sapiens chromosome 2 open reading frame 17 (C2orf17), mRNA 1 NM_004786 Homo sapiens thioredoxin-like 1 (TXNL1), mRNA 1 NM_145702 Homo sapiens tigger transposable element derived 1 (TIGD1), mRNA 1 NM_203392 Homo sapiens family with sequence similarity 27-like (FAM27L), mRNA 1 NM_002775 Homo sapiens protease, serine, 11 (IGF binding) (PRSS11), mRNA 1 NM_052996 Homo sapiens PR domain containing 7 (PRDM7), mRNA 1 continua continuação 55 NM_003017 Homo sapiens splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SFRS3), mRNA 1 NM_021141 Homo sapiens X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 (double-strand- break rejoining; Ku autoantigen, 80kDa) (XRCC5), mRNA 2 XM_926493 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC643121 (LOC643121), mRNA 1 NM_005575 Homo sapiens leucyl/cystinyl aminopeptidase (LNPEP), transcript variant 1, mRNA 2 NM_005016 Homo sapiens poly(rC) binding protein 2 (PCBP2), transcript variant 1, mRNA 3 NM_003155 Homo sapiens stanni ocalcin 1 (STC1), mRNA 1 NM_016015 Homo sapiens leucine carboxyl methyltransferase 1 (LCMT1), mRNA 1 NM_006476 Homo sapiens ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit g (ATP5L), nuclear gene encoding mitochondrial protein, mRNA 2 continuação continua 56 NM_015917 Homo sapiens glutathione S-transferase kappa 1 (GSTK1), mRNA 1 NM_003079 Homo sapiens SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1 (SMARCE1), mRNA 1 NM_005801 Homo sapiens putative translation initiation factor (SUI1), mRNA 2 NM_001001522 Homo sapiens transgelin (TAGLN), transcript variant 1, mRNA 1 XM_938374 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC648101, transcript variant 1 (LOC648102), mRNA 1 NM_032376 Homo sapiens hypothetical protein MGC4251 (MGC4251), mRNA 2 NM_000801 Homo sapiens FK 506 binding protein 1A, 12kDa (FKBP1A), transcript variant 12B, mRNA 1 XM_498789 PREDICTED: Homo sapiens LOC440645 (LOC440645), mRNA 4 continuação continua 57 NM_006098 Homo sapiens guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1 (GNB2L1), mRNA 11 NM_000198 Homo sapiens hydrox y-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and steroid delta-isomerase 2 (HSD3B2), mRNA 1 NM_014380 Homo sapiens nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein 1 (NGFRAP1), transcript variant 3, mRNA 1 NM_201428 Homo sapiens reticulon 3 (RTN3), transcript variant 2, mRNA 1 NM_005097 Homo sapiens leucine-rich, glioma inactivated 1 (LGI1), mRNA 1 NM_017794 Homo sapiens KIAA1797 (KIAA1797), mRNA 1 NM_198252 Homo sapiens gelsolin (amyloidosis, Finnish type) (GSN), transcript variant 2, mRNA 1 NM_006472 Homo sapiens thioredoxin interacting protein (TXNIP), mRNA 1 continuação continua 58 NM_002778 Homo sapiens prosaposin (variant Gaucher disease and variant metachromatic leukodystrophy) (PSAP), mRNA 1 NM_001418 Homo sapiens eukaryotic translation initiation factor 4 gamma, 2 (EIF4G2), mRNA 1 NM_001014795 Homo sapiens integrin-linked kinase (ILK), transcript variant 3, mRNA 1 NM_005780 Homo sapiens lipoma HMGIC fusion partner (LHFP), mRNA 1 NM_003825 Homo sapiens synaptosomal-associated protein, 23kDa (SNAP23), transcript variant 1, mRNA 1 NM_002211 Homo sapiens integrin, beta 1 (fibronectin receptor, beta polypeptide, antigen CD29 includes MDF2, MSK12) (ITGB1), transcript variant 1A, mRNA 1 NM_006435 Homo sapiens interferon induced transmembrane protein 2 (1-8D) (IFITM2), mRNA 2 NM_003590 Homo sapiens cullin 3 (CUL3), mRNA 1 continuação continua 59 NM_000884 Homo sapiens IMP (inosine monophosphate) dehydrogenase 2 (IMPDH2), mRNA 1 NM_138793 Homo sapiens calcium activated nucleotidase 1 (CANT1), mRNA 1 XM_929760 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC646803 (LOC646803), mRNA 2 NM_014719 Homo sapiens KIAA0738 gene product (KIAA0738), mRNA 1 NM_003295 Homo sapiens tumor protein, translationally-controlled 1 (TPT1), mRNA 17 NM_030789 Homo sapiens histocompatibility (minor) 13 (HM13), transcript variant 1, mRNA 2 NM_006196 Homo sapiens poly(rC) binding protein 1 (PCBP1), mRNA 1 NM_001878 Homo sapiens cellular retinoic acid binding protein 2 (CRABP2), mRNA 1 NM_001101 Homo sapiens actin, beta (ACTB), mRNA 6 continuação continua 60 NM_001749 Homo sapiens calpain, small subunit 1 (CAPNS1), transcript variant 1, mRNA 7 NM_014320 Homo sapiens heme binding protein 2 (HEBP2), mRNA 2 NM_014799 Homo sapiens hephaestin (HEPH), transcript variant 2, mRNA 2 NM_021103 Homo sapiens thymosin, beta 10 (TMSB10), mRNA 4 NM_001540 Homo sapiens heat shock 27kDa protein 1 (HSPB1), mRNA 1 XM_498786 PREDICTED: Homo sapiens LOC440642 (LOC440642), mRNA 3 NM_018382 Homo sapiens hypothetical protein FLJ11292 (FLJ11292), mRNA 1 NM_181353 Homo sapiens inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein (ID1), transcript variant 2, mRNA 11 NM_021109 Homo sapiens thymosin, beta 4, X- linked (TMSB4X), mRNA 61 NM_000942 Homo sapiens pepti dylprolyl isomerase B (cyclophilin B) (PPIB), mRNA 15 continuação continua 61 NM_006769 Homo sapiens LIM domain only 4 (LMO4), mRNA 1 XM_943152 PREDICTED: Homo sapiens KIAA1245, transcript variant 12 (KIAA1245), mRNA 1 NM_203380 Homo sapiens acyl-CoA synthetase long-chain family member 5 (ACSL5), transcript variant 3, mRNA 1 XM_292160 PREDICTED: Homo sapiens similar to Serine/threonine-protein kinase Nek1 (NimA-related prot ein kinase 1) (MGC75495), mRNA 1 NM_198334 Homo sapiens glucosidase, alpha; neutral AB (GANAB), mRNA 1 NM_001280 Homo sapiens cold inducible RNA binding protein (CIRBP), mRNA 1 NM_018155 Homo sapiens hypothetical protein FLJ10618 (FLJ10618), mRNA 1 NM_001681 Homo sapiens ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, slow twitch 2 (ATP2A2), transcript variant 2, mRNA 1 NM_003746 Homo sapiens dynein, cytoplasmic, light polypeptide 1 (DNCL1), mRNA 1 continuação continua 62 NM_005347 Homo sapiens heat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated protein, 78kDa) (HSPA5), mRNA 2 NM_002423 Homo sapiens matrix metalloproteinase 7 (matrilysin, uterine) (MMP7), mRNA 2 NM_000516 Homo sapiens GNAS complex locus (GNAS), transcript variant 1, mRNA 3 NM_147184 Homo sapiens tumor protein p53 inducible protein 3 (TP53I3), transcript variant 2, mRNA 1 NM_001256 Homo sapiens cell division cycle 27 (CDC27), mRNA 4 NM_002817 Homo sapiens proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 13 (PSMD13), transcript variant 1, mRNA 1 NM_012287 Homo sapiens centaurin, beta 2 (CENTB2), mRNA 1 NM_148923 Homo sapiens cytochrome b-5 (CYB5), transcript variant 1, mRNA 1 NM_175744 Homo sapiens ras homolog gene family, member C (RHOC), mRNA 3 continuação continua 63 NM_138473 Homo sapiens Sp1 transcription factor (SP1), mRNA 2 NR_002836 Homo sapiens phosphoglucomutase 5 pseudogene 2 (PGM5P2) on chromosome 9 2 NM_022454 Homo sapiens SRY (sex determining region Y)-box 17 (SOX17), mRNA 1 NM_001001937 Homo sapiens ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit, isoform 1, cardiac muscle (ATP5A1), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA 2 NM_002970 Homo sapiens spermidine/spermine N1- acetyltransferase (SAT), mRNA 7 NM_015937 Homo sapiens phosphatidylinositol glycan, class T (PIGT), mRNA 1 NM_005566 Homo sapiens lactate dehydrogenase A (LDHA), mRNA 2 NM_004425 Homo sapiens extracellular matrix protein 1 (ECM1), transcript variant 1, mRNA 2 NM_007273 Homo sapiens prohibitin 2 (PHB2), mRNA 1 continuação continua 64 NM_005507 Homo sapiens cofilin 1 (non-muscle) (CFL1), mRNA 1 XM_928061 PREDICTED: Homo sapiens similar to Rho-associated protein kinase 1 (Rho- associated, coiled-coil containing protein kinase 1) (p160 ROCK-1) (p160ROCK) (LOC653559), mRNA 5 NM_021034 Homo sapiens interferon induced transmembrane protein 3 (1-8U) (IFITM3), mRNA 3 NM_014402 Homo sapiens low molecular mass ubiquinone-binding protein (9.5kD) (QP-C), nuclear gene encoding mitochondrial protein, mRNA 1 NM_001743 Homo sapiens calmodulin 2 (phosphorylase kinase, delta) (CALM2), mRNA 1 NM_080594 Homo sapiens RNA binding protein S1, serine-rich domain (RNPS1), transcript variant 2, mRNA 1 NM_020378 Homo sapiens K562 cell-derived leucine-zipper-like protein 1 (KLP1), mRNA 1 continuação continua 65 NM_153280 Homo sapiens ubiquitin-activating enzyme E1 (A1S9T and BN75 temperature sensitivity complementing) (UBE1), transcript variant 2, mRNA 1 NM_033161 Homo sapiens surfeit 4 (SURF4), mRNA 1 NM_198335 Homo sapiens glucosidase, alpha; neutral AB (GANAB), mRNA 2 NM_006801 Homo sapiens KDEL (Lys-Asp-Glu- Leu) endoplasmic reticulum protein retention receptor 1 (KDELR1), mRNA 1 NM_001349 Homo sapiens aspartyl-tRNA synthetase (DARS), mRNA 1 NM_002567 Homo sapiens prosta tic binding protein (PBP), mRNA 4 NM_004356 Homo sapiens CD81 antigen (target of antiproliferative antibody 1) (CD81), mRNA 2 NM_005576 Homo sapiens lysyl oxidase-like 1 (LOXL1), mRNA 1 NM_019111 Homo sapiens major histocompatibility complex, class II, DR alpha (HLA- DRA), mRNA 1 continuação continua 66 NM_080546 Homo sapiens CDW92 antigen (CDW92), mRNA 1 NM_000733 Homo sapiens CD3E antigen, epsilon polypeptide (TiT3 complex) (CD3E), mRNA 1 XM_932180 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC644424 (LOC644424), mRNA 1 NM_031157 Homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRPA1), transcript variant 2, mRNA 1 XM_498569 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical gene supported by AY338954 (LOC440155), mRNA 1 NM_001009570 Homo sapiens chaperonin containing TCP1, subunit 7 (eta) (CCT7), transcript variant 2, mRNA 1 NM_001428 Homo sapiens enolase 1, (alpha) (ENO1), mRNA 1 NM_020320 Homo sapiens arginyl-tRNA synthetase-like (RARSL), mRNA 1 NM_001614 Homo sapiens actin, gamma 1 (ACTG1), mRNA 1 continuação continua 67 NM_003164 Homo sapiens syntaxin 5A (STX5A), mRNA 1 XM_935538 PREDICTED: Homo sapiens similar to postmeiotic segregation increased 2-like 2 (LOC442573), mRNA 1 NM_013234 Homo sapiens eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 12 (EIF3S12), mRNA 1 NM_005762 Homo sapiens tripartite motif- containing 28 (TRIM28), mRNA 3 NM_014042 Homo sapiens DKFZP564M082 protein (DKFZP564M082), mRNA 1 XM_928302 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC643817 (LOC643817), mRNA 2 XM_496061 PREDICTED: Homo sapiens similar to FLJ44796 protein (LOC440264), mRNA 7 1 NM_004568 Homo sapiens serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 6 (SERPINB6), mRNA 1 continuação continua 68 NM_002166 Homo sapiens inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein (ID2), mRNA 2 NM_021129 Homo sapiens pyrophosphatase (inorganic) (PP), mRNA 1 NM_003064 Homo sapiens secretory leukocyte protease inhibitor (antileukoproteinase) (SLPI), mRNA 8 NM_021005 Homo sapiens nuclear receptor subfamily 2, group F, member 2 (NR2F2), mRNA 2 NM_006585 Homo sapiens chaperonin containing TCP1, subunit 8 (theta) (CCT8), mRNA 1 Total de seqüências de referência 65 317 TOTAL DE COLÔNIAS ANALISADAS 524 537 69 Entre as seqüências RefSeq, referentes a genes bem caracterizados na literatura, obtivemos um total de 31 seqüências diferentes na biblioteca RHENDI e 135 na RHENDW. As classes levedura, bactéria e outros (v ide ANEXO A) foram consideradas como contaminantes das reações. Já as classes m itocondrial, ribossômica, ESTs e Unigene não foram analisadas neste estudo (ANEXO B). IV. 2. GENES SELECIONADOS Os genes selecionados para validação dos dados de expressão gênica foram: SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich ); SSAT ( spermidine/spermine N1-acetyltransferase ); HTRA1 [(high temperature requirement factor A1 ) serine peptidase 1 ] e LOXL1 ( lysyl oxidase-like 1). IV. 3. RT-PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL As tabelas II, III, IV e V mostram os valores de RQ ( Relative Quantification), referentes às expressões dos genes selecionados, em cada amostra, obtidos pela RT-PCR quantitativa em tempo real. Tabela II: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão endometriótica para o gene SPARC SPARC ENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA 70 AMOSTRA RQ AMOSTRA RQ 11 0,63 O11 0,65 3.2 0,85 O3 0,98 6 0,88 P6 1,10 2 0,92 O10.2 1,32 5 1,24 O9 1,32 12 1,31 P10 () 1,41 4 1,39 O6 1,83 9 1,97 P1 2,32 8 2,08 P3 3,02 1 2,25 P8 4,01 7 3,95 P7 6,21 Média 1,59 Média 2,20 Desvio padrão 0,95 Desvio padrão 1,66 Tabela III: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão endometriótica para o gene SSAT SSAT ENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA AMOSTRA RQ AMOSTRA RQ 4 0,44 O10.2 0,18 1 0,64 O3 0,30 2 0,65 O9 0,37 7 0,65 O11 0,56 3.2 0,96 O6 0,79 9 1,17 P6 0,99 5 1,44 P10() 1,12 12 2,38 P1 1,16 6 2,45 P3 1,38 8 4,50 P8 1,50 11 8,44 P7 2,11 Média 2,16 Média 0,95 Desvio padrão 2,40 Desvio padrão 0,59 71 Tabela IV: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão endometriótica para o gene HTRA1 Gene HTRA1 ENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA AMOSTRA RQ AMOSTRA RQ 11 0,55 O11 0,79 2 0,98 P6() 0,87 3.2 1,55 P10(2) 1,68 6 2,02 P3 4,77 5 2,33 P1 5,87 4 2,69 P8 6,09 9 3,06 P7 6,52 1 4,23 O3 10,96 7 4,42 O10.2 11,66 12 5,40 O9 12,59 8 5,50 O6 15,70 Média 2,97 Média 7,04 Desvio padrão 1,71 Desvio padrão 5,06 Tabela V: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão endometriótica para o gene LOXL1 Gene LOXL1 ENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA AMOSTRA RQ AMOSTRA RQ 1 1,12 O11 1,58 11 2,18 P1() 5,097 6 2,36 O3 5,62 4 2,59 P6() 6,87 2 2,62 P3 7,47 5 2,63 P10() 9,05 3.2 3,11 P7() 9,35 9 3,38 O10.2 10,96 12 3,93 O9 11,03 8 4,98 O6 12,84 7 11,51 P8() 36,76 Média 3,67 Média 10,60 Desvio padrão 2,78 Desvio padrão 9,24 IV. 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 72 O teste da soma de postos de Wilcoxon mostrou que os genes SSAT e SPARC não apresentaram diferença signifi cativa de expressão entre os grupos de mulheres com e sem endometriose, enquanto que os genes HTRA1 e LOXL1 apresentaram diferença quanto a sua expressão nos dois grupos. Para o gene HTRA1, foi obtida área abaixo da curva ROC de 0,75, mostrando sensibilidade de 63,6% e especificidade de 100% para separação entre os grupos de mulheres com e sem endometriose. Para o gene LOXL1, a área abaixo da curva ROC foi de 0,85, determinando sensibilidade e especificidade de 90,9% para distinçã o entre os grupos. O diagrama de pontos interativos mostra valor de corte de RQ do gene HTRA1 de 5,5 e de 5,0 para o gene LOXL1. As figuras 4 e 5 representam o diag rama de pontos interativos para os genes HTRA1 e LOXL1, respectivamente. Figura 4: Diagrama de pontos interativos ( interactive dot) para o gene HTRA1 obtido a partir do software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os pontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres sem endometriose (representados no eixo hor izontal como “Normal=0”) e nas amostras do 73 grupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Endometriose=1”). A barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos grupos. 74 Figura 5: Diagrama de pontos interativos ( interactive dot) para o gene LOXL1 obtido a partir do software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os pontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres sem endometriose (representados no eixo hor izontal como “Normal=0”) e nas amostras do grupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Endometriose=1”). A barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos dois grupos. 75 V. DISCUSSÃO A confecção de biblioteca subtrativa é aplicad a com sucesso para clonar seqüências de RNA mensageiro mais abundantes em uma dete rminada amostra, quand o comparada à outra (Cho & Park, 1998). A técnica de hibridação subtrativa rápida ( RaSH) identifica genes diferencialmente expressos, incluindo seqüênc ias descritas e não descritas nos bancos de dados disponíveis (Jiang et al., 2000). Uma das vantagens da RaSH sobre as demais técnicas é que ela elimina vários passos de subtraçã o e amplificação, fazendo com que a metodologia tenha menor complexidade e seja mais rápi da e econômica. Além disso, é efetiva para obtenção da fração tester-tester da reação e para reduzir os backgrounds, gerando resultados confiáveis (Jiang et al., 2000; Boukerche et al., 2004). No entanto, os métodos baseados em hibridação subtrativa possuem certas limitações, pois nem sempre todas as seqüê ncias de cDNA comuns entre os grupos são completamente removidas, levando a alguns resultados falso-positivos (Hu et al., 2006). O sucesso da técnica requer remoção efetiva dos híbridos tester-driver para assegurar boa eficiência da reação, a qual pode ser influenciada por vários fatores, como concentrações de DNA e sal, além da quantidade de tester-driver gerada (Cho & Park, 1998). Dessa maneira, deve-se estabelecer uma boa metodologia para validação dos result ados. A RT-PCR quantitativa em tempo real é considerada a metodologia padrão para quantif icação da expressão gênica, pois consegue medir desde grandes até quantidades muito pequenas de transcritos, mostrando alta sensibilidade além de alta especificidade quando comparadas a outras técnicas, como, por exemplo, Northern blot (Goodsaid et al., 2003). Em nosso trabalho, as bibl iotecas RHENDI e RHENDW fo ram geradas a partir da subtração de moléculas de c DNA entre os grupos de mulheres com e sem endometriose. Consideramos que o conjunto de cDNAs presente s em uma biblioteca são referentes a genes 76 superexpressos no grupo tester em relação ao grupo driver, onde esses genes foram menos expressos. As seqüências selecionadas como candidatas para validação por RT-PCR quantitativa em tempo real foram referentes aos genes HTRA1, LOXL1, SPARC e SSAT , os quais apresentaram baixa expressão no grupo de mulheres com endometriose. V. 1. HTRA1 - HtrA (high temperature requirement factor A1) serine peptidase 1 O gene HTRA1, conhecido também como L56, HtrA, ORF480 e PRSS11, codifica uma enzima secretada pertencente à família das serino-proteases, altamente conservada em várias espécies (GeneID 5654; OMIM 602194). A alta expressão desta proteína inibe a proliferação celular in vivo e in vitro . Além disso, o locus 10q26, onde se encontra o gene, está sujeito à perda de heterozigosidade e in ativação epigenética, sugeri ndo assim função de supressor tumoral para o mesmo (Baldi et al., 2002; Chien et al., 2004). Alguns trabalhos confirmaram essa hipótese, mostrando que sua baixa expressã o está relacionada a certos tipos de câncer, como o endometrial, além de estar fortemente associado à transformação maligna e metástase de câncer ovariano e melanoma maligno (Bowden et al. , 2006; Tsuchiya et al. , 2005). A observação de que ocorre regulação hepática da transcrição de HTRA1 entre a fase fetal e pós- natal propõe que o gene participa do contro le do crescimento celular não apenas em neoplasias, como também de proc essos fisiológicos normais (Nagata et al., 2003). Outro fato importante é que a proteína HTRA1 é produzida em quantidade proeminente pelo endométrio na fase proliferativa do ciclo menstrual e, por isso, sugere-se que sua expressão possa ser importante na preparação endometrial para a implantação embrionária (Bowden et al., 2006; De Luca et al., 2003). 77 Selecionamos este gene para validação considerando que estava menos expresso no grupo de mulheres com endometriose, segundo dados obtidos pela RaSH, sendo que sua baixa expressão tem sido relacionada a neoplasias co mumente associadas à doença, como câncer ovariano e endometrial. Adicionalmente, a pr oteína codificada por ele, quando altamente expressa, provoca inibição do crescimento celular e, dessa forma, a baixa expressão geraria ambiente propício para que as células endomet riais se proliferassem, produzindo lesões. Ponderamos também o fato de que a baixa expressão desse gene na fase proliferativa do ciclo menstrual poderia causar alteração da rece ptividade endometrial durante a fase de implantação do embrião, prejudicando, assim, a função reprodutiva de pacientes com endometriose. Todavia, quando executamos a RT-PCR quantita tiva em tempo real, a média de RQ deste gene para mulheres com endometriose foi de 7,04, enquanto que para as mulheres sem endometriose foi de 2,97, contrariando os dados obtidos pela RaSH. Tendo em vista que a RT-PCR quantitativa em tempo r eal é a técnica padrão para determinação dos níveis de expressão gênica, consideramos esse resultado como verdadeiro. A proteína HTRA1 também interage com al guns fatores reguladores da proliferação celular, como IGFs e TGF- β1 (Zumbrunn & Trueb, 1996; Tocharus et al. , 2004). As IGFs (Insuline Growth Factors) atuam em diversos tecidos, estimulando divisão e diferenciação celulares. Sua atividade é modulada por molécula s inibidoras, as IGFBPs, que se ligam às IGFs e controlam a disponibilidade desses fa tores de crescimento (Clemmons, 1998). No entanto, existem enzimas, como HTRA1, que podem clivar essas IGFBPs e dessa maneira aumentar os níveis de IGFs bioa tivas (Zumbrunn & Trueb, 1996; Ferry et al., 1999; Hou et al., 2005). Uma vez livres para agirem, as IGFs promoveriam crescime nto celular, efeito compatível com os achados científicos em lesões endometrióticas. 78 Já TGF-β1 é um regulador negativo da proliferação celular, cuja expressão está reduzida em células de endométrio tópico de paciente s com endometriose, sugerindo que a diminuição desse fator possa favorecer a proliferação dessas células (Johnson et al. 2005). Foi proposto que HTRA1 se liga a TGF- β1, inibindo as vias de sinaliza ção dessa molécula (Kresse & Schönherr, 2001; Oka et al., 2004). Desse modo a maior expre ssão de HTRA1 neutralizaria a ação de maior quantidade de moléculas TGF- β1, propiciando maior multiplicação de células endometriais ectópicas. Além disso, as mulheres apresentam normalm ente alta expressão de HTRA1 na fase proliferativa do ciclo reprodutivo (De Luca et al., 2003). Visto que estudamos mulheres com e sem endometriose na mesma fase do ciclo, podemos sugerir que o aumento ainda maior da expressão do gene HTRA1 em mulheres com a enfermidade causaria conseqüências reprodutivas graves para elas, como falhas de implantação. Quanto à análise da curva ROC, HTRA1 mostrou especificida de alta, porém sua sensibilidade, de 63,6%, foi ba ixa para discriminar mulheres com daquelas sem a doença. Provavelmente os níveis de expressão de HTRA1, muito discrepantes entre as pacientes, provocou grande aumento do desvio-padrão, contribuindo para esse resultado. Analisando o gráfico de pontos interativos, podemos observar que para valores de RQ abaixo de 5,5, foi possível separar mulheres se m endometriose daquelas com endometriose, apesar de duas amostras do grupo de mulheres não afetadas pela doença apresentarem RQs muito próximas a esse ponto de corte. Já no gr upo de mulheres afetadas, existe uma diferença muito variável entre RQs. Quatro pacien tes desse grupo possuem RQs abaixo de 5,5, apresentando, portanto, expressão do gene HTRA1 igual à das mulheres não afetadas pela endometriose. Dessa forma, podemos afirmar que no grupo amostral estudado, pela análise da expressão de HTRA1, não foi possível diferenciar todas as pacientes com endometriose. Como a proteína HTRA1 interage com moléculas re guladoras do crescimento celular, estimulando- 79 o, podemos supor que, nessas quatro pacientes, a baixa expressão do gene que a codifica tenha conferido um potencial de crescimento menor que o das demais pacientes. Podemos presumir também que as 2 mulheres não afet adas pela endometriose com RQs de 5,40 e 5,50, por apresentarem expressão gênica de HTRA1 muito próximas ao padrão de expressão das afetadas, apresentavam células endometriais co m atividade proliferativa maior que as outras mulheres do seu grupo. Provavelmente isso acarretaria predisposição dessas células em crescer em locais ectópicos, como ovário e/ou peritônio e, assim, desenvolverem endometriose. Porém, somente o acompanhamento clínico a longo prazo dessas mulheres com concomitante quantificação da expressão de HTRA1 poderia corroborar para a hipótese. V. 2. LOXL1 - lysyl oxidase-like 1 O gene LOXL1, também denominado LOL e LOXL, codifica uma amino oxidase essencial na biogênese de tecido conjuntivo por catalisar, na matriz extrac elular, o primeiro passo para formação de ligações covalentes cruzadas de fibras de colágeno e de elastina, necessárias para homeostase de diversos tecido s, incluindo órgãos pélvicos femininos, principalmente durante a gestação e parto (GeneID 4016; OMIM 153456; Kagan & Li, 2003; Liu et al., 2004). Wu et al., em 2007, descreveram genes hipermetilados, isto é, silenciados, em células cancerosas de bexiga humana, dentre os quais LOXL1 estava presente. Além disso, foi encontrada baixa expressão do gene em câncer de próstata e carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, sugerindo ação supressora tumoral para ele (Ren et al., 1998; Rost et al. , 2003). Em 2006, Flores e colaboradores, usaram microarrays, identificando baixa quantidade de transcritos de LOXL1 a partir de RNAs mensageiros isolados de linfócitos de sangue periférico de pacientes com endometriose quando comparadas a pacientes sem a doença, sugerindo ser esse gene candidato a marcador sanguíneo para a doença. 80 O gene LOXL1 foi selecionado para validação uma vez que foi menos expresso no grupo de mulheres com endometriose, segundo dados obtidos pela RaSH, o que é coerente com o resultado do trabalho que analisou linfócitos de sangue periférico de mulheres afetadas pela doença. Também consideramos o fato de que se trata de um gene candidato a supressor tumoral e, assim, sua baixa expressão poderi a aumentar a taxa de multiplicação celular, permitindo estabelecimento da doença. Entretan to, analisando os resultados de expressão obtidos pela RT-PCR quantitativa em tempo real, observamos maior média dos níveis de expressão de LOXL1 em mulheres com a doença (10,60) em comparação com mulheres não afetadas (3,67), contrapondo o dado obtido pela RaSH. Quanto à função do gene, sugerimos que um aumento da expressão poderia aumentar a biogênese de tecido conjuntivo, levando ao aparecimento de lesões endometrióticas. Assim, a alta expressão de LOXL1 poderia contribuir para o estabelecimento das células endometriais fora da cavidade uterina por permitir que elas mantenham-se ligadas, em contato, com outros tecidos. Em relação ao valor diagnóstico, consideramos que os dados obtidos em nosso trabalho foram mais fidedignos que os descritos por Fl ores e colaboradores (2006), que pesquisaram alterações de expressão gêni ca no sangue periférico de paci entes com e sem endometriose. Apesar de se tratar de uma doença de caráter inflamatório e as células decorrentes desse processo poderem circular no sangue, a met odologia executada envolve u pesquisa de genes não específicos do tecido endometriótico. Logo, a investigação da expressão de genes sem uma pesquisa prévia referente ao local da lesão não permite a obtenção de dados consistentes para afirmar que LOXL1 tem baixa expressão em portadoras da doença Levando em conta que a endometriose possui características similares a processos neoplásicos, outro fato interessante é que no câncer de mama metastático, LOXL1 encontra-se 81 altamente expresso, o que está de acordo com nossos resultados obtidos pela RT-PCR quantitativa em tempo real para as mulheres com endometriose (Wu et al., 2007). Em relação à análise da curva ROC, LOXL1 apresentou especificidade e sensibilidade altas (90,9%), o que pode ser co nsiderado bom parâmetro para distinção entre mulheres afetadas e não afetadas pela endometriose , permitindo-nos sugerir que o gene pode ser candidato a marcador da doença. Examinando o gráfico de pontos interativos, observamos que o valor de corte de RQ de 5,0 pode ser considerado eficiente para separação entre as mulheres com e sem endometriose. No entanto, no grupo afetado, uma paciente mostrou RQ abaixo de 5,0, em conformidade com as RQs da maioria das mulheres sem a doença, e no grupo não afetado, uma mulher teve valor de RQ acima do ponto de corte, considerad o como pertencente à maioria do grupo das mulheres com endometriose analisadas nest e estudo. Além disso, no grupo I, uma paciente apresentou valor de 5,09 e no grupo II, uma mulher apresentou valor de 4,98, valores muito próximos ao de corte. Esses dados demonstrar am que 9,09% das mulheres (2 em 22) não foram discriminadas com sucesso entre os dois grupos e a mesma porcentagem incluiu mulheres com RQs próximas ao limite de separação entre os dois grupos. Paralelamente, houve maior dispersão de RQ no grupo de mulheres com endometriose em relação aos valores das RQs de mulheres sem a doença, sendo que um dos dados obtidos foi muito alto em relação à média (RQ = 36,76). A alta expressão de LOXL1 pode significar que essa paciente possa ser mais resistente ao desenvolvimento da doença em relação às outras pacientes estudadas, uma vez que nela seria nece ssária expressão muito alta do gene para que as lesões se estabelecessem. Torna-se necessário aumentar o número de mulheres em estudos posteriores, visando avaliar se os níveis de expressão de LOXL1 podem ser eficazes para a separação de mulheres afetadas das não afetadas pela doença. 82 Se os resultados de nosso estudo estiverem em concordância com a distribuição real das RQs de LOXL1 da população de mulheres com e sem endometriose, para a amostra 7 do grupo não afetado (RQ = 11,50) em que o gene LOXL1 está se expressando igual ao grupo de mulheres afetadas pela endometriose, podemos especular que essa mulher pode não ter focos endometrióticos visíveis, mas é portadora da doença. Também podemos hipotetizar que a paciente com expressão de LOXL1 igual à média das mulheres sem endometriose, apesar de ser afetada, possui células endom etriais cujo estabelecimento em locais ectópicos seja mais fácil de ocorrer, já que nesta bastaria baixa expressão do gene em questão para desenvolvimento da doença. V. 3. SPARC - secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin) O gene SPARC, ou ON, codifica uma glicoproteína secretada multifuncional que está associada à matriz extracelular (MEC) onde se liga a um grande número de moléculas e exerce ação antiadesiva, o que inclui ha bilidade em desfazer adesões locais (Hudson et al., 2005). Além disso, SPARC atua estimulando alterações no formato celular, inibindo a progressão do ciclo celular, influenciando a síntese de elementos da MEC e modulando interações célula-matriz (GeneID 6678; OMIM 182120). Também foi demonstrado que SPARC reforça o sistema de sinalização de TGF- β, citocina responsável, dentre outras funções, pela ativação da síntese de component es da MEC, como colágeno, pela supressão da expressão de metaloproteinases de matriz e indução de expressão de inibidores teciduais dessas enzimas (Schiemann et al., 2003; Poncelet et al., 1998). Em relação ao câncer, em células de carcinoma ovariano humano foi encontrada baixa expressão de SPARC e nessas células a expressão dessa molécula induz apoptose (Mok et al., 1996; Yiu et al. , 2001). Esses resultados fo ram corroborados pelo fato de que, em ratos, na 83 ausência da expressão desse gene ocorria a formação de ambiente permissivo para o crescimento e invasão tumorais de células ovarianas (Said & Motamed, 2005). Além do mais, em ratos com mutação nula para SPARC e inoculados com células de câncer pancreático ou pulmonar, foram encontradas alterações na pr odução e organização de componentes da MEC no interior e na cápsula dos implantes tumorais , gerando menor restriçã o para a progressão tumoral e metástase (Brekken et al., 2003). Outra informação interessante é o fato de que SPARC possui ação antiangiogênica por se ligar diretamente a VEGF, inibindo a prolifera ção celular endotelial e por bloquear o efeito mitogênico de bFGF, um potente estimulador da angiogênese (Chlenski et al., 2006). Devido ao fato de SPARC ter sido menos expresso no grupo das pacientes com endometriose, a partir dos dados obtidos pela RaSH, selecionamos esse gene para validação, uma vez que a redução de sua expressão pode gerar proliferação celular, angiogênese e redução de apoptose, processos importantes para estabelecimento de lesões endometrióticas. Outrossim, colabora para o desenvolvimento da doença, processos semelhantes aos que ocorrem durante o aparecimento e desenvol vimento de tumores, tais como adesão, crescimento e invasão. Além diss o, quanto menor a expressão de SPARC, menor interação com TGF-β, regulador negativo da proliferação celular, o que favorece a formação de lesões. Outra conseqüência dessa baixa interação é o aumento da produção de enzimas proteolíticas da MEC, o que facilita a inva são tecidual e, conseqüentemente permite estabelecimento das células endometriais em local ectópico. Em nossa amostra, não detectamos diferença significativa nos níveis de expressão de SPARC entre os grupos de mulheres com e sem endometriose, por meio da RT-PCR quantitativa em tempo real. Esse resultado sugere que provavelmente esse gene não represente a cla sse de moléculas com expressão alterada que atuam no desenvolvimento da endometriose. A ssim, acreditamos que devam existir outros elementos que desempenhem funções semelhantes a SPARC nos processos dos quais essa 84 molécula participa, tais como adesão, invasã o, angiogênese e resistência à apoptose, e que possivelmente estejam relacionados ao estabelecimento da doença. V. 4. SSAT - spermidine/spermine N1-acetyltransferase O gene SSAT, cujas aliases são SAT, DC21 e KFSD, codifica a enzima spermidina/spermina N1-acetiltransferase, que promove N(1)-acetilaçã o de spermidina e spermina na via catabólica de poliaminas, que são moléculas requeridas para o crescimento e diferenciação normais da célula (GeneID 6303; OMIM 313020; Huang et al. , 2005). Em Escherichia coli , a indução de SSAT converte rapidamente espermidina em N1- acetilespermidina, resultando em redução da taxa de crescime nto celular (Parry et al., 1995). Em 2005, Pledgie e colaboradores ob servaram efeito antiproliferativo de células de câncer de mama quando a expressão de SSAT foi induzida. Além disso, nesse mesmo trabalho foi elaborada a hipótese de que outro produto decorrente da catálise de poliaminas, o peróxido de hidrogênio (H 2O2), espécie reativa conhecida por pr ovocar danos no DNA, teria efeito inibitório no crescimento celular. Dessa maneir a, pode-se concluir que a baixa expressão de SSAT promoveria redução da catálise de poliaminas, e conseqüente diminuição da produção de peróxido de hidrogênio, aumentando, assim, a taxa de proliferação celular. Os dados acima concordam com os obtidos em nosso trabalho por meio da RaSH, já que a baixa expressão de SSAT em mulheres com endometriose poderia aumentar a quantidade de poliaminas ativas no interior de células endometrióticas, levando-as a uma maior proliferação. Adicionalmente, nesse caso, a quantidade de H 2O2 estaria reduzida, o que impediria que a multiplicação dessas células fosse prejudicada. Por esses motivos selecionamos também SSAT para validação. 85 Não foi observada, por RT-PCR quantitativa em tempo real , diferença significativa na expressão de SSAT entre os grupos de afetadas e não af etadas pela endometriose, sugerindo que essa molécula não participe do processo re sponsável pelo início e manutenção da doença. Assim, acreditamos que outras moléculas particip am de vias relacionadas à proliferação celular nos mecanismos que levam ao desencadeamento da endometriose. A partir da análise das seqüê ncias diferencialmente expressas entre as mulheres com e sem endometriose, podemos dizer que a grande ma ioria das seqüências de referência obtidas foi identificada neste estudo pela primeira vez e que nossos resulta dos não confirmaram alguns dados publicados anteriormente sobre a expressão de genes específicos na doença. A biblioteca RHENDW identificou seqüências referentes aos genes das metaloproteinases MMP2 e MMP7, ambos descritos em publicações anteriores. As metaloproteinases são enzimas proteolíticas que atuam em conjunto co m seus inibidores, denominados TIMPs, para remodelamento e renovação da matriz extracelular (Yang et al. , 2004). A expressão desregulada de qualquer uma dessas moléculas tem sido associada a doenças que envolvem fenômenos invasivos, como processos tumo rais e endometriose (Roughley & Lee, 1994; Sillem et al., 1998). Em discordância com nossos dados, alguns trab alhos evidenciaram aumento de expressão de MMP2 tanto em tecido ectópico quanto t ópico de mulheres com diagnóstico de endometriose, quando comparada a mulheres não afetadas (Wenzl & Heinzl, 1998; Chung et al., 2002). Entretanto, Sharpe-Timms (1997) descreveram altos níveis de expressão de MMP7 no endométrio tópico, mas expressão constitutiva desta metaloproteínase em lesões endometrióticas, durante o ciclo menstrual. 86 Desta maneira, apesar de termos obtido result ados discordantes da literatura, acreditamos que a RaSH foi eficiente na identificação de transcri tos diferencialmente expressos entre as amostras analisadas. Prova disso é a observação de que entre os dois grupos estudados, houve diferença significativa na expressão dos genes HTRA1 e LOXL1 , após validação por RT-PCR quantitativa em tempo real. Investigações fu turas envolvendo maior número de amostras podem confirmar nossos resultados em re lação ao aumento de expressão de HTRA1 e LOXL1 em pacientes com endometriose, quando comparadas a mulheres sem a doença, estabelecendo valores de corte mais confiáveis para sepa ração desses dois grupos. Sugerimos que esses dois genes possam estar envolvidos nos processo s biológicos de desenvolvimento da doença, podendo ser selecionados como marcadores moleculares para diagnóstico de endometriose. 87 VI. CONCLUSÕES 1) A técnica de RaSH foi eficaz na identificação de genes diferencialmente expressos no tecido endometrial de mulheres sem endome triose, em comparação a genes expressos em lesões endometrióticas de pacientes analisadas neste trabalho; 2) Os genes HTRA1 e LOXL1 mostraram diferença sign ificativa entre o tecido endometrial tópico e ectópico, sugerindo possível envolvimento entre expressão aumentada desses genes e desenvolvimento da endometriose; 3) Os genes HTRA1 e LOXL1 podem ser considerados candidatos a marcadores moleculares para o diagnóstico não invasivo de endometriose. 4) Apesar de ter sido possí vel a identificação dos genes SSAT e SPARC , diferencialmente expressos pela técnica de RaSH, os resultados obtidos pela técnica de PCR em tempo real não confirmaram diferença de expressão desses genes nos dois grupos analisados; 88 VII. REFERÊNCIAS Arya, P & Shaw, R. Endometriosis: Current thinking. Current Obstetrics & Gynaecology, v. 15, p. 191–8, 2005. 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Erratum in: Clinical Chemistry, v. 39(8), p. 1589, 1993. 107 ANEXO A Seqüências consideradas contaminantes obtidas das bibliotecas RHENDI e RHENDW Bactérias RHENDI RHENDW U00096 Escherichia coli K-12 MG1655 complete genome 37 5 Total 37 5 Leveduras RHENDI RHENDW T38386 T38386 EST103859 Saccharomyces cerevisiae cDNA 3' end. 1/95 4 Total 0 4 Outros RHENDI RHENDW ZP_00377153 TonB-dependent receptor [Erythrobacter litoralis HTCC2594] 1 ZP_00302656 COG0346: Lactoylglutathione lyase and related lyases [Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444] 1 ZP_00304057 COG1506: Dipeptidyl aminopeptidases/acylaminoacyl-peptidases [Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444] 1 AAA36590 ORF1; putative 1 Total 4 0 Total de contaminantes 41 9 108 ANEXO B Seqüências de RNA das categorias: mitocondrial, ribossômica, ESTs e Unigene Mitocondrial RHENDI RHENDW J01415 Human mitochondrion, complete genome 368 19 Total 368 19 Ribossômica RHENDI RHENDW U09953 gp|U09953|1323733|E3F957CA13F7BFEF ribosomal protein L9 [Homo sapiens] 22 AB007158 gp|AB007158|3088342|E6A62203E15257C1 ribosomal protein S23 [Homo sapiens] 1 M90054 gp|M90054|337580|E9F238D9F8CA0D67 ribosomal protein L3 [Homo sapiens] 5 BC000802 tn|BC000802|AAH00802|E9CE3CBD59524F81 Similar to ribosomal protein S9.[Homo sapiens] 2 BC000523 tn|BC000523|AAH00523|E0764D60A6DD576E Similar to ribosomal protein S24.[Homo sapiens] 1 U14966 gp|U14966|550013|25F3BC2C6F674442 ribosomal protein L5 [Homo sapiens] 1 AF348700 tn|AF348700|AAK31162|2FE469F736571002 (UBA52)Ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1 (Fragment).[Homo sapiens] 5 X69391 gp|X69391|36138|3E209D02DFF365D9 ribosomal protein L6 [Homo sapiens] 14 XM_371853 PREDICTED: Homo sapi ens similar to 60S ribosomal protein L27a (LOC389435), mRNA 16 NM_000979 Homo sapiens ribosomal protein L18 (RPL18), mRNA 2 NM_001002 Homo sapiens ribosomal protein, large, P0 (RPLP0), transcript variant 1, mRNA 4 NM_001012 Homo sapiens ribosomal protein S8 (RPS8), mRNA 2 NM_000661 Homo sapiens ribosomal protein L9 (RPL9), mRNA 3 NM_002952 Homo sapiens ribosomal protein S2 (RPS2), mRNA 1 NM_000992 Homo sapiens ribosomal protein L29 (RPL29), mRNA 5 NM_006013 Homo sapiens ribosomal protein L10 (RPL10), mRNA 3 NM_022551 Homo sapiens ribosomal protein S18 (RPS18), mRNA 2 continua 109 continuação NM_000998 Homo sapiens ribosomal protein L37a (RPL37A), mRNA 4 NM_007104 Homo sapiens ribosomal protein L10a (RPL10A), mRNA 1 NM_000970 Homo sapiens ribosomal protein L6 (RPL6), mRNA 4 NM_000991 Homo sapiens ribosomal protein L28 (RPL28), mRNA 2 NM_033022 Homo sapiens ribosomal protein S24 (RPS24), transcript variant 1, mRNA 1 NM_001009 Homo sapiens ribosomal protein S5 (RPS5), mRNA 13 NM_001007074 Homo sapiens ribosomal protein L32 (RPL32), transcript variant 3, mRNA 1 NM_000981 Homo sapiens ribosomal protein L19 (RPL19), mRNA 6 NM_001021 Homo sapiens ribosomal protein S17 (RPS17), mRNA 47 NM_001015 Homo sapiens ribosomal protein S11 (RPS11), mRNA 11 Total 0 179 ESTs RHENDI RHENDW BE078764 QV2-BT0619-160400-144-f07_1 BT0619 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 1 CN288604 17000583181938 GRN_PRENEU Homo sapiens cDNA 5', mRNA sequence 1 AW063430 TN0915 KRIBB Human TN intrathymic T-cell cDNA library Homo sapiens cDNA 3', mRNA sequence 2 AW023412 df54e06.y1 Morton Fetal Cochlea Homo sapiens cDNA clone IMAGE:2487251 5', mRNA sequence 1 AW166933 xg68e10.x1 NCI_CGAP_Ut4 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:2633514 3' similar to TR:P97365 P97365 ZINC FINGER PROTEIN 64 ;, mRNA sequence 1 DA513180 DA513180 FEBRA2 Homo sapiens cDNA clone FEBRA2000391 5', mRNA sequence 1 BF979590 602288061F1 NIH_MGC_97 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:4373847 5', mRNA sequence 1 AU120065 AU120065 HEMBA1 Homo sapiens cDNA clone HEMBA1007256 5', mRNA sequence 1 continua 110 continuação CF597202 AGENCOURT_15657637 NICHD_Hs_Ov1 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:30705289 5', mRNA sequence 5 BX402096 BX402096 Homo sapiens NEUROBLASTOMA COT 25-NORMALIZED Homo sapiens cDNA clone CS0DC012YB18 3- PRIME, mRNA sequence 2 CB999662 AGENCOURT_13652348 NIH_MGC_186 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:30323605 5', mRNA sequence 1 AA253227 zr76b03.s1 Soares_NhHMPu_S1 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:669293 3', mRNA sequence 1 CR737055 CR737055 Soares_pregnant_uterus_NbHPU Homo sapiens cDNA clone IMAGp998B211198 ; IMAGE:502196 5', mRNA sequence 1 AA586724 nn67c06.s1 NCI_CGAP_Lar1 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:1088938 3' similar to contains Alu repetitive element;contains MER27.b2 MER27 repetitive element ;, mRNA sequence 1 AI906423 RC-BT108-140399-075 BT108 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 1 CN284794 17000531650825 GRN_ES Homo sapiens cDNA 5', mRNA sequence 1 BU570422 AGENCOURT_10401461 NIH_MGC_82 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:6618678 5', mRNA sequence 1 AA174078 zp18g12.s1 Stratagene fetal retina 937202 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:609862 3', mRNA sequence 1 AA176858 zp10c01.r1 Stratagene fetal retina 937202 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:609024 5' similar to contains Alu repetitive element;contains element THR repetitive element ;, mRNA sequence 1 BE439881 HTM1-470F HTM1 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 3 CV572711 od27h01.y1 Human keratoconus cornea, unamplified, (od/oe) Homo sapiens cDNA clone od27h01 5', mRNA sequence 1 DA160554 DA160554 BRAMY2 Homo sapiens cDNA clone BRAMY2020574 5', mRNA sequence 1 continua 111 continuação CV571660 oe15f10.y1 Human keratoconus cornea, unamplified, (od/oe) Homo sapiens cDNA clone oe15f10 5', mRNA sequence 2 BI463414 603204458F1 NIH_MGC_97 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:5269982 5', mRNA sequence 1 CX783776 HESC3_25_H02.g1_A036 NIH_MGC_260 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:7478237 5', mRNA sequence 1 CV427484 RC6-FN0082-271000-021-E10 FN0082 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 1 DA627771 DA627771 KIDNE2 Homo sapiens cDNA clone KIDNE2008378 5', mRNA sequence 1 Total 28 8 Unigene RHENDI RHENDW AK131511 tgnl|UG|Hs#S19862974 Homo sapiens cDNA FLJ16729 fis, clone UTERU3017176 /cds=p(3512,3913) /gb=AK131511 /gi=47077535 /ug=Hs.544147 /len=3913 4 AK125512 tgnl|UG|Hs#S16887192 Homo sapiens cDNA FLJ43524 fis, clone PLACE5000297 /gb=AK125512 /gi=34531632 /ug=Hs.369042 /len=3591 2 DB275414 tgnl|UG|Hs#S29666869 DB275414 UTERU3 Homo sapiens cDNA clone UTERU3000431 5', mRNA sequence /clone=UTERU3000431 /clone_end=5' /gb=DB275414 /gi=83216722 /ug=Hs.586927 /len=570 1 AK024881 tgnl|UG|Hs#S2652760 Homo sapiens cDNA: FLJ21228 fis, clone COL00739, mRNA sequence /gb=AK024881 /gi=10437293 /ug=Hs.306716 /len=1869 1 BG818416 tgnl|UG|Hs#S3604358 602779974F2 NCI_CGAP_Brn67 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:4915530 5', mRNA sequence /clone=IMAGE:4915530 /clone_end=5' /gb=BG818416 /gi=14166003 /ug=Hs.434023 /len=744 1 AF370457 tgnl|UG|Hs#S15632048 Homo sapiens ovarian epithelial carcinoma-related protein mRNA, complete cds /cds=p(3715,4461) /gb=AF370457 /gi=30314934 /ug=Hs.131226 /len=4737 1 continua 112 continuação CA313852 tgnl|UG|Hs#S6103412 UI-C F-FN0-afo-g-20-0- UI.s1 UI-CF-FN0 Homo sapiens cDNA clone UI-CF-FN0-afo-g-20-0-UI 3', mRNA sequence /clone=UI-CF-FN0-afo-g-20-0-UI /clone_end=3' /gb=CA313852 /gi=24531950 /ti=159720155 /ug=Hs.574529 /len=760 1 AK022877 tgnl|UG|Hs#S2650933 Homo sapiens cDNA FLJ12815 fis, clone NT2RP2002546, mRNA sequence /gb=AK022877 /gi=10434526 /ug=Hs.49476 /len=2267 1 BQ924623 tgnl|UG|Hs#S4693338 AGENCOURT_8821514 Lupski_sciatic_nerve Homo sapiens cDNA clone IMAGE:6203471 5', mRNA sequence /clone=IMAGE:6203471 /clone_end=5' /gb=BQ924623 /gi=22339654 /ti=141988287 /ug=Hs.573780 /len=963 2 XM_496387 tgnl|UG|Hs#S21591497 PR EDICTED: Homo sapiens similar to tripartite motif-containing 43 (LOC440610), mRNA /cds=p(1,1701) /gb=XM_496387 /gi=51459269 /ug=Hs.497543 /len=1774 2 NM_014643 tgnl|UG|Hs#S2140692 KIAA0222 gene product [Homo sapiens], mRNA sequence /cds=(318,3809) /gb=NM_014643 /gi=7662009 /ug=Hs.48450 /len=6033 1 NM_017737 tgnl|UG|Hs#S2293714 hypot hetical protein FLJ20275 [Homo sapiens], mRNA sequence /cds=(54,1046) /gb=NM_017737 /gi=8923248 /ug=Hs.239681 /len=3320 1 N23897 tgnl|UG|Hs#S321444 yw 46h10.s1 Weizmann Olfactory Epithelium Homo sapiens cDNA clone IMAGE:255331 3', mRNA sequence /clone=IMAGE:255331 /clone_end=3' /gb=N23897 /gi=1138047 /ug=Hs.144186 /len=454 1 BX641141 tgnl|UG|Hs#S16819731 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp686N19169 (from clone DKFZp686N19169) /gb=BX641141 /gi=34365471 /ug=Hs.449601 /len=3129 1 continua 113 continuação BM141654 tgnl|UG|Hs#S3994991 if24c05.x1 Melton Normalized Human Islet 4 N4-HIS 1 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:5677424 3', mRNA sequence /clone=IMAGE:5677424 /clone_end=3' /gb=BM141654 /gi=17151719 /ug=Hs.571918 /len=543 3 AL833386 tgnl|UG|Hs#S4622005 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp667N0414 (from clone DKFZp667N0414), mRNA sequence /gb=AL833386 /gi=21734021 /ug=Hs.376868 /len=3219 1 XM_498786 PREDICTED: Homo sapiens LOC440642 (LOC440642), mRNA 2 BG941030 tgnl|UG|Hs#S3751839 ax08h09.y1 Proliferating Human Erythroid Cells (LCB:ax library) Homo sapiens cDNA clone ax08h09 random, mRNA sequence /clone=ax08h09 /gb=BG941030 /gi=14340402 /ug=Hs.574458 /len=272 1 Total 22 5 114