{"paper_id":"59961414-4107-440d-a420-3e1a7d0f3f58","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nDEPARTAMENTO DE GENÉTICA \n \n \n \n \n \n \nEXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM TECIDO \nENDOMETRIAL TÓPICO E LESÕES ENDOMETRIÓTICAS \n \n \n \n \n \n \nDaniel Blassioli Dentillo \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2007 \n 1\n\nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nDEPARTAMENTO DE GENÉTICA \n \n \n \n \n \n \n \n \nEXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM TECIDO \nENDOMETRIAL TÓPICO E LESÕES ENDOMETRIÓTICAS \n \n \n \n \n \n \nDaniel Blassioli Dentillo \n \n Tese apresentada à Faculdade de Medicina \nde Ribeirão Preto da Universidade de São \nPaulo para concorrer ao título de Doutor, \npelo curso de Pós-Graduação em \nGenética. \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2007 \n 2\n\nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nDEPARTAMENTO DE GENÉTICA \n \n \n \n \n \n \n \n \nEXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM TECIDO \nENDOMETRIAL TÓPICO E LESÕES ENDOMETRIÓTICAS \n \n \n \n \n \n \nDaniel Blassioli Dentillo \n \n \n \n \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina \nde Ribeirão Preto da Universidade de São \nPaulo para concorrer ao título de Doutor, \npelo curso de Pós-Graduação em \nGenética. \n \nOrientadora: Profa. Dra. Lúcia R. Martelli \n \n \nRibeirão Preto \n2007 \n 3\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n   1. Endometriose, 2. RaSH, 3. Expressão gênica, 4. LOXL1, 5. HTRA1 \n \nOrientadora: Martelli, Lúcia R. \nTese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/ \nUSP – Área de concentração: Genética. \n \n 83 p.: il. ; 30cm \nExpressão gênica diferencial em tecido endometrial e lesões endometrióticas. \nRibeirão Preto, São Paulo, 2007. \nDentillo, Daniel Blassioli \n \n 4\n\nData da Defesa: ____/____/____ \n \n \n \n \nBANCA EXAMINADORA \n \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:________________________ \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:________________________ \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:________________________ \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:________________________ \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:________________________ \n 5\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \nVim pelo caminho difícil, \na linha que nunca termina, \na linha que bate na pedra, \na palavra quebra uma esquina, \nmínima linha vazia, \na linha, uma vida inteira, \npalavra, palavra minha. \n  \n \nPaulo Leminski \n \n \n \n 6\n\nDEDICATÓRIA\nDedico a minha família e meus amigos \nque sempre me participaram de todas as  \ndecisões de minha vida. \n 7\n\nAGRADECIMENTOS \n \nA Deus... \n \nÀ Profa. Dra. Lúcia Regina Martelli, agradeço pela orientação e apoio... \n \nAo Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani e Dr. Júlio César Rosa e Silva, agradeço a atenção e \namostras cedidas... \n \nAo Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, agradeço ao suporte técnico... \n \nAo Prof. Dr. Luiz Gonzaga Tone, agradeço ao suporte técnico \n \nÀ Profa. Dra. Silvana Giulia tti e o mestrando Renato Puga , do Grupo de Bioinformática \n(GBI), agradeço pelo suporte estatístico... \n \nAos Profs. Dr. Raysildo Lôbo e Dra. Ester Silveira Ramos, agradeço pelo convívio \nagradável... \n \nAo Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP- USP). \n \nAo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. \n \nAos técnicos do Laboratório de Genética do Bloco C, em especial Sílvio A. Santos, Marli A. \nV. Galerani e Reginaldo A Vila. \n \nAo meu grupo de pesquisa Ana Carolina Laus , Fábio R Pablos, Fern ando H Biase, Gismar \nVieira, Juliana Cuzzi, Juliana Meola, Lucian a C. Veiga, Maria Silvina J. de Vozzi e \nReginaldo Justino Ferreira. \n \nAos amigos Adriane, Alejandro, Álvaro, Andrea,  Dante, Fernanda, Flávia, Francielle, Hélida, \nJair, Jaqueline, Jéferson, Kéllen, Lisandra, Ma rcelo, Marcus Vinícius , Maurício, Murilo, \nPatrícia, Bloco C do Departamento de Genética (FMRP). \n 8\n\n \nÀ equipe do Laboratório de Genética Molecu lar e Bioinformática (LGMB), em especial \nLidiane C. Melato, Fernanda G. Barbuzano, An emari Ramos Dinarte dos Santos e Daniel G. \nPinheiro. \n \nÀ equipe do Laboratório de Oncologia Pediátri ca, em especial Profa. Dra. Agda Karina \nBrodoloni Eterovic, Prof. Dr. Carl os Alberto Scrideli, Profa. Dra. Rosane de Paula Gómes \nQueiroz e aos doutorandos Fábio Motta, Vanessa Andrade, Maria Angélica Abdalla de Freitas \nCortez. \n \nÀ minha Família... \nÀ minha namorada... \n \nAo Programa de Excelência Acadêmica da Coor denação de Aperfeiçoamento de Pessoal de \nNível Superior (PROEX/CAP ES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e \nTecnológico (CNPq), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX/CNPq) e \nFundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência (FAEPA) pelo apoio financeiro. \n 9\n\nRESUMO \nDENTILLO, D.B. Expressão gênica diferencial em te cido endometrial tópico e lesões \nendometrióticas. 2007. 83 p. Tese de Doutorado - Faculd ade de Medicina de  Ribeirão Preto \n– Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. \n \nPerdas gestacionais podem ser determinadas  por vários fatore s, dentre eles a \nendometriose, doença ginecológica comum caract erizada pela presença e crescimento de \nglândulas e estroma endometrial fo ra da cavidade uterina. Os principais sintomas da doença \nenvolvem, além de problemas de fertilidade, di smenorréia, dispaneuria, dor pélvica crônica e \nirregularidades menstruais. Os  locais mais freqüentes das lesões endometrióticas são o \nperitônio e os órgãos pélvicos, principalmente ovários. A incidência da endometriose é difícil \nde ser determinada devido à grande variabi lidade de sintomas e à dificuldade para \nconfirmação diagnóstica, que requer método cirúrgico. Estima-se que 15% da população \nfeminina em idade reprodutiva seja afetada pela doença, sendo sua patogênese pouco \nconhecida. A hipótese mais aceita é a da me nstruação retrógrada, onde os fragmentos \nendometriais descamados durante a fase menstr ual seriam transportados através das tubas \nuterinas até a cavidade peritoni al com implantação, crescimento e invasão local e de órgãos \nadjacentes. No entanto, apenas o refluxo não é suficiente para o esta belecimento da doença, \nsendo necessário que as células endometriais possuam certas características moleculares que \nfavoreçam o aparecimento e a progressão da implantação ectópica. Vários estudos na \nliteratura evidenciam que as principais dive rgências moleculares entre portadoras e não \nportadoras de endometriose estão relacionadas a processos envolvidos na apoptose, adesão \ncelular, angiogênese, biosíntese de estrógeno, si stema imune, além de fatores de crescimento \ne metaloproteinases. Sendo assim, as pesqui sas buscam a investigação de genes que se \nexpressem diferencialmente (maior ou me nor expressão) nas células de lesões \nendometrióticas por meio de várias técnicas . A hibridação subtrativa é uma metodologia de \n 10\n\nscreening gênico que compara dois grupos celulares distintos, permitindo isolar moléculas de \ncDNA representantes do genoma de somente um  dos dois grupos, pois remove as seqüências \ncomuns entre eles. A técnica de hibridação subtrativa rápida (RaSH ) simplifica e torna mais \neficiente esse processo de  subtração, identificando gra nde quantidade de seqüências \ndiferencialmente expressas. Com objetivo de determinar possíveis marcadores moleculares \npara diagnóstico e tratamento da  doença, aplicamos a técnica de RaSH para identificação de \ngenes com expressão diferencial em 11 amostras de lesões endometrióticas (cinco de origem \novariana e seis de origem peritonial)  e em 11 amostras de tecido e ndometrial tópico de \nmulheres sem a doença.  Após análise dos dados referentes a 166 sequências de referência, os \ngenes HTRA1, LOXL1, SPARC e SSAT foram selecionados para validação por meio da técnica \nde RT-PCR quantitativa em tempo real, send o que apenas os dois primeiros mostraram \ndiferença significativa entre os dois grupos estudados. Os genes HTRA1  e LOXL1 \napresentaram expressão aumentada em lesões endometrióticas de pa cientes afetadas, quando \ncomparada aos níveis de expressão no tecido  endometrial de mulheres não afetadas.  Os \nresultados obtidos sugerem que os genes HTRA1 e LOXL1 podem ser considerados candidatos \na marcadores moleculares para o diagnóstico. \n 11\n\nABSTRACT \nDENTILLO, D.B. Genes differentially expresse d in topic endometrium and \nendometriotic lesions. 2007. 83 p. Tese de Doutorado - Facu ldade de Medicina de Ribeirão \nPreto – Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. \n \nGestational losses can be determined by a number of factors incl uding endometriosis, \na common gynecological disease characterized by endometrial tissue found outside the uterine \ncavity. The main symptoms of the disease invo lve dysmenorrhea, dyspaneuria, chronic pelvic \npain and menstrual irregularities, besides fer tility problems. Endometriotic lesions are more \nfrequently found in the peritoneum and in pe lvic organs, mainly ovaries. Endometriosis \nincidence is difficult to be determined due to the wide variability of the symptoms and the \ndifficult diagnostic confirmation, which requires a surgical method. Ne vertheless, it is \nbelieved that around 15% of the female popula tion in reproductive age is affected by the \ndisease, although its pathogenesis remains uncl ear. The most accepted hypothesis is the \nretrograde menstruation, wher e endometrial fragments from  the menstrual phase are \ntransported through the uterine tubes to the peritoneal cavity,  where they undergo \nimplantation, growth, and adjacent tissues invasion. However, only reflux is not enough for \nthe disease establishment, and it is necessa ry that endometrial cells present molecular \ncharacteristics favoring rise and progression of ectopic implant ation. In the literature, a \nnumber of studies highlight th at the main molecular divergences between women with and \nwithout endometriosis are relate d to processes involved in apoptosis, cellular adhesion, \nangiogenesis, estrogen biosynthesis, i mmunological system, gr owth factors and \nmetalloproteinases. In doing so, a number of researches seek for the investigation of genes \ndifferently expressed (up or dow n regulated) in endometriotic lesions cells using a variety of \nmethodologies. The subtractive hybridization is a gene screening methodology that compares \ntwo distinct cellular groups, allowing the isol ation of cDNA molecule s representative from \n 12\n\nthe genome of only one of the two groups, because it removes common sequences among \nthem. The rapid subtractiv e hybridization methodology ( RaSH) makes the process of \nsubtraction easier and more efficient, identi fying a large amount of differently expressed \nsequences. In this study, RaSH was used to identify differently expressed genes in 11 samples \nof endometriotic lesions (five fr om ovarian origin and six from peritoneum origin), and in 11 \nsamples from topic endometrial tissue from women without the disease to determine possible \nmolecular markers for diagnosis and treatment.  After data anal ysis related to 166 reference \nsequences, genes HTRA1, LOXL1, SPARC and SSAT  were selected for validation using real \ntime quantitative RT-PCR.  Only HTRA1 and LOXL1 presented significant difference \nbetween the two stud ied groups. Genes HTRA1 and LOXL1 were up regulated in \nendometriotic lesions from affected patients when compared with  the expression levels in the \nendometrial tissue of non-affected wome n. Our results suggest that the genes HTRA1 and \nLOXL1 can be considered candidate molecular markers for the diagnosis of endometriosis. \n 13\n\nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1: A) Amostras de cDNAs obtidos a partir dos  tecidos analisados transcrição reverva, \nrestrição enzimática com DpnII e ligação dos adaptadores; B) PCR com primers XDPN-18 e \nrestrição enzimática somente da amostra tester, representada pela lesão endometriótica; C) \nMistura das amostras tester e driver, seguida de reação de hibridação ; D) Representação dos \nhíbridos gerados, ligação do híbrido tester-tester ao plamídeo tratado com a enzima de \nrestrição XhoI, transformação bacteriana, pl aqueamento e seqüenciamento dos insertos \nclonados. \n \nFigura 2: Curva de calibração do gene LOXL1. Foi plotada a fluorescência da amplificação \nversus o número de ciclos da PCR \n \nFigura 3: Curva-padrão do gene LOXL1 obtida a partir da curva de calibração. \n \nFigura 4: Diagrama de pontos interativos ( interactive dot) para o gene HTRA1 obtido a partir \ndo software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os \npontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres \nsem endometriose (representados no eixo hor izontal como “Normal=0”) e nas amostras do \ngrupo de mulheres com a doença (representados  no eixo horizontal como “Normal=1”). A \nbarra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos grupos. \n \nFigura 5: Diagrama de pontos interativos ( interactive dot) para o gene LOXL1 obtido a partir \ndo software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os \npontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres \nsem endometriose (representados no eixo hor izontal como “Normal=0”) e nas amostras do \ngrupo de mulheres com a doença (representados  no eixo horizontal como “Normal=1”). A \nbarra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos dois grupos. \n \n \n 14\n\nLISTA DE TABELAS \n \nTabela I: Seqüências de referência obtidas pela RaSH nas bibliotecas RHENDI e RHENDW. \n \nTabela II: Valores de RQ, médias e desvios-padr ão dos grupos de tecido normal e lesão \nendometriótica para o gene SPARC. \n \nTabela III: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão \nendometriótica para o gene SSAT. \n \nTabela IV : Valores de RQ, médias e desvios-padr ão dos grupos de tecido normal e lesão \nendometriótica para o gene HTRA1. \n \nTabela V : Valores de RQ, médias e desvios-padr ão dos grupos de t ecido normal e lesão \nendometriótica para o gene LOXL1. \n \n 15\n\nLISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS \n \n11β-HSD2 - Hydroxysteroid (11-beta) Dehydrogenase 2 \nAGDE - Ambulatório de Dor Pélvica e Endoscopia \nASRM - American Society for Reproductive Medicine \nB61 – aliase do gene EFNA1 (epherin A1) \nBcl-2 - B-cell CLL/lymphoma 2 \nBLAST – Basic Local Alignment Search Tool \nBSEP – Bile Salt Export Pump \nC4BP - Complement Component 4 Binding Protein \nCA 19-9 - Carbohydrate Antigen 19-9 \nCA-125 - Carbohydrate Antigen 125 \ncDNA – complementary Deoxyribonucleic Acid \nCEP - Comitê de Ética em Pesquisa \nc-Myc - cellular Myelocytomatosis oncogene \nCYP1A1 - cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 \nDC21- aliase do gene SSAT (Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase) \nDEPC - Dietil Pirocarbonato \nDLX5 - Distal-Less Homeobox 5 \nDNA - Deoxyribonucleic Acid \nEGF - Epidermal Growth Factor \nEST - Expressed Sequence Tag \nFBLN1 - Fibulin 1 \nFGF - Fibroblast Growth Factor \nFMRP-USP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo \nGALT - Galactose-1-Phosphate Uridylyltransferase \nGAPDH – Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase \nGeap - Generic EST Annotation Pipeline \nGlcNAc6ST - N-acetylglucosamine 6-O-sulfotransferase \nGMST1 - Macrophage Stimulating 1 \nGnRH - Gonadotropin-Releasing Hormone \nH2O2 - Peróxido de Hidrogênio \nHCl – Cloreto de Hidrogênio \n 16\n\nHLA – Major Histocompatibility Complex \nHTRA1 - High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase 1 \nICAM-1 - Intercellular Adhesion Molecule-1 \nIGFBP5– Insulin-Like Growth Factor Binding-Protein 5 \nIL-1 - Interleukin 1 \nIL-15 - Interleukin 15 \nIL2RG - Interleukin 2 Receptor, Gamma \nIL-6 – Interleukin 6 \nIL-8 – Interleukin 8 \nKFSD - keratosis Follicularis Spinulosa Decalvans (aliase do gene Spermidine/Spermine \nN(1)-Acetyltransferase) \nKH2PO4 - Fosfato de Potássio Monobásico \nL56 - aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase 1) \nLB- Lysogeny Broth \nLIF - Leukemia Inhibitory Factor \nLOL – aliase do gene LOXL1 (Lysyl Oxidase-Like 1) \nLoTE – Low Tris-EDTA \nLOXL1 - Lysyl Oxidase-Like 1 \nMEC - Matriz Extracelular \nMMP11 - Matrix Metalloproteinase 11 \nMMP12 - Matrix Metalloproteinase 12 \nMMP-2 - Matrix Metalloproteinase 2 \nMMP3 - Matrix Metalloproteinase 3 \nNa2HPO4.12H2O - Fosfato de Sódio Monobásico Dodecahidratado \nNaCl - Cloreto de Sódio \nNAT2 - N-Acetyltransferase 2 \nNCBI - National Center for Biotechnology Information \nNLM - National Library of Medicine \nOMIM - Online Mendelian Inheritance in Man \nON – aliase do gene SPARC (Secreted Protein, Acidic, Cysteine-rich (Osteonectin)) \nORF480 - aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine \npeptidase 1) \np53 – aliase do gene TP 53 (Tumor Protein p53) \nPBS - Phosphate-Buffered Saline \n 17\n\nPCR - Polymerase Chain Reaction \nPRSS11- aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase \n1) \nPSAP – Prosaposin \nPTEN – Phosphatase and Tensin Homolog \nRaSH – Rapid Subtraction Hybridization \nRefSeq – Reference Sequences \nRHENDI – biblioteca de cDNAs do grupo de mulheres com endometriose (tester) \nRHENDW - biblioteca de cDNAs do grupo de mulheres não afetadas pela endometriose \n(tester) \nRhoE - Ras Homolog Gene Family, Member E \nRNA- Ribonucleic Acid \nROC - Receiver-Operating Characteristic \nRQ - Relative Quantification \nRT-PCR – Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction \nSAT – aliase do gene SSAT (Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase) \nSPARC - Secreted Protein, Acidic, Cysteine-rich (Osteonectin) \nSSAT - Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase \nTGF-α – Transforming Growth Factor Alfa \nTGF-β – Transforming Growth Factor Beta \nTIMP-3 – Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 3 \nTNF-α – Tumor Necrosis Factor Alfa \nTP53 - Tumor Protein p53 \nUniGene – link do site www.ncbi.nlm.nih.gov que contém informações a respeito de \nconjuntos de seqüências (gene ou pseudogene) que aparentemente são transcritos no mesmo \nlocus. \nVEGF - Vascular Endothelial Growth Factor \n \n 18\n\nLISTA DE SÍMBOLOS \n \n% - porcentagem \n°C – graus Celsius \nµg – microgramas \nµL – microlitros \ng – gramas \nL – litros \nM – molar \nmg – miligramas \nmL – mililitros \nmM - milimolar \nRPM – rotações por minuto \nU – unidades \n 19\n\nSUMÁRIO \nRESUMO \nABSTRACT \nI. INTRODUÇÃO           0 1  \n I.1.  ENDOMETRIOSE         0 2  \n  I.1.1.  CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS       0 2  \n  I.1.2.  ASPECTOS GENÉTICOS DA ENDOMETRIOSE     0 7  \n  I.1.3.  ASPECTOS MOLECULARES E PATOGÊNESE     0 8  \n I.2.  METODOLOGIA DE INVESTIGAÇÃO MOLECULAR      1 1  \nI.3. JUSTIFICATIVA         1 4  \nII. OBJETIVOS           1 5  \nIII. MATERIAL E MÉTODOS         1 6  \n III.1.  AMOSTRAS          1 6  \n III.2.  METODOLOGIA         1 7  \n  III.2.1  ISOLAMENTO DO RNA TOTAL      1 7  \n  III.2.2.  RAPID SUBTRACTION HYBRIDIZATION (RAS H )      18 \n   III.2.2.1.  SÍNTESE DE CD N A       2 1  \n   III.2.2.2.  DIGESTÃO ENZIMÁTICA E LIGAÇÃO DOS ADAPTADORES  21 \n   III.2.2.3.  PCR E PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS    2 1  \n   III.2.2.4.  DIGESTÃO DO TESTER E HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA   22 \nIII.2.2.5. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA E GERAÇÃO DAS BIBLIOTECAS                            \nDE CD N A         2 2  \nIII.2.2.6. ANÁLISE DAS COLÔNIAS E OBTENÇÃO DOS DADOS   23 \n  III.2.3.  VALIDAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS GENES SELECIONADOS   26 \n   III.2.3.1.  SÍNTESE DE CD N A       2 6  \n   III.2.3.2.  EFICIÊNCIA DA REAÇÃO      2 6  \n   III.2.3.3.  QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA    2 8  \n  III.2.4.  ANÁLISE ESTATÍSTICA       2 8  \nIV. RESULTADOS           3 0  \n IV.1.  OBTIDOS PELA TÉCNICA DE RASH       3 0  \n 20\n\n IV.2.  GENES SELECIONADOS        4 7  \n IV.3.  RT-PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL      4 8  \n IV.4.  ANÁLISE ESTATÍSTICA        5 0  \nV. DISCUSSÃO           5 3  \n V.1. HTRA1 – Htra (High Temperature Requirement Factor A1) Serine Peptidase 1  54 \n V.2. LOXL1 – lysyl oxidase – like 1       57 \n V. 3. SPARC – secreted protein, acidic, cystein – rich (osteonectin)    60 \n V.4. SSAT – spermidine/spermine N1 – acetyltranferase     62 \nVI. CONCLUSÕES           6 5  \nVII. REFERÊNCIAS          6 6  \nANEXOS            8 4  \n \n 21\n\nI. INTRODUÇÃO \n \nInfertilidade é definida como a incapacidade do  casal em obter gravidez após um ano de \nrelacionamento sexual, sem uso de métodos anticoncepcionais (Healy et al., 1994; Gnoth et \nal., 2005). Cerca de 10 a 15% dos casais são inférteis e aproxi madamente 70% das gestações \nnão chegam a termo, sendo que 50 a 60% das perdas fetais ocorrem no primeiro mês e 1% dos \ncasais apresentam perdas recorrentes (Bulletti et al., 1996; Mercorio et al., 2006). Estima-se \nque 48% dos casos de infertilidade sejam causados por fatores femininos e que 28% não \ntenham etiologia estabelecida (Jose-Miller et al. , 2007). Diversos fatores podem ser \nresponsáveis por perdas gestacionais, dentre  eles: anormalidades uterinas, alterações \ngenéticas; disfunções endócrinas e imunológicas; ag entes infecciosos; poluentes ambientais e \nendometriose. Embora em muitos casos seja po ssível reconhecer a causa, mais de 50% das \nperdas gestacionais recorrentes permanecem sem explicação após investigação ginecológica, \nhormonal e citogenética (Lissalde-Lavigne et al. , 2005). Pressupõe-se que os casos de \ninfertilidade sem causa aparente sejam conse qüência da baixa receptividade endometrial, \nconsiderando o endométrio como fator prevalece nte na determinação da fertilidade da mulher \n(Strowitzki et al. , 2006). Corroborando essa hipótese, Bernabeu e colaboradores (2005) \nrelataram que, em reprodução assistida, o maior fator limitante para o sucesso da fertilização \nin vitro era a implantação embrionária. \nNas últimas décadas, muitas pesquisas vê m sendo desenvolvidas com o objetivo de \nidentificar genes e proteínas expressos pelo endométrio e que possam estar relacionados à sua \nreceptividade. Embora no processo implantacional  a função individual dessas moléculas não \nseja totalmente conhecida, os dados result antes desses estudos forneceram informações \ncomplementares, revelando uma complexa via de  regulação gênica para  que o endométrio \n 22\n\natinja o estado receptivo (Horcajadas et al., 2004; Strowitzki et al., 2006; Horcajadas et al., \n2007). \nDentre os genes estudados estão, por exemplo, os que codificam receptores de \nprogesterona e estrógeno, o fator inibidor da leucemia (LIF), molécu las adesivas, como a \nintegrina αvβ3; TGF-β (transforming growth factor- β), interleucinas, como as IL-1 e IL-6 e \nmetaloproteinases, como as MMP11 e MMP12 (Puri et al., 2000; Popovici et al., 2006).  \nA expressão diferencial desses genes parece determinar tanto a condição uterina saudável, \npropícia para a gestação, qua nto condições patológicas que variam desde a baixa \nreceptividade endometrial até o desenvolvimento da endometriose. \n \nI. 1. ENDOMETRIOSE \n \nI. 1. 1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS \n \nEndometriose é uma doença ginecológica co mum, crônica, benigna, porém agressiva, \ncaracterizada pela presença e crescimento de glândulas e estroma endometrial fora da \ncavidade uterina, onde é denominado t ecido ectópico (Giudice & Kao, 2004; Yang et al. , \n2004; Sharpe-Timms, 2001). \nOs principais sinais clínicos  e sintomas da endometriose são dismenorréia (dor pélvica \ndurante a menstruação), dispaneuria (dor durante o ato sexual), dor pélvica crônica, \nirregularidades menstruais e infertilidade (Poliness et al., 2004; Arya & Shaw, 2005; Wu et \nal., 2005). Outros sintomas podem estar relaciona dos à doença, como dor durante a ovulação \ne fadiga crônica (Kenedy et al. , 2005). Em aproximadamente 4% dos casos há queixa de \ndisúria, causada pelo envolvimento da bexiga (Hassa et al. , 2005), sendo que 3 a 34% das \n 23\n\nmulheres afetadas apresentam sintomas relaci onados ao trato gastrointestinal (Gustofson et \nal., 2006). Entretanto, muitas pacientes podem ser assintomáticas (Nap et al., 2004). \nO tecido ectópico responde a hormônios e drogas de maneira similar ao endométrio \nsituado no local original, denominado de teci do eutópico. Desta forma, está sujeito às \nalterações que se manifestam no decurso do ci clo sexual feminino e o sangramento das lesões \nendometrióticas parece contribuir para de sencadeamento de r eação imunológica local, \ninflamação e formação de adesões fibróticas, que podem ser responsáveis pela sintomatologia \ndas pacientes (Arya & Shaw, 2005). \nA incidência exata da endometriose é desconhe cida e difícil de ser determinada, devido à \nvariabilidade dos sintomas e à definição diagnóstica, que requer abordagem cirúrgica (Prowse \net al. , 2005). Entretanto, acredita-se que aproxi madamente 15% da população feminina em \nidade reprodutiva seja afetad a pela doença, sendo que 30 a 40% das mulheres inférteis \napresentam endometriose. Tem sido também identificada como causa de dor pélvica e \nabdominal em 15 a 32% dos casos submetidos a diagnóstico laparosc ópico. Nas pacientes \ncom endometriose que apresentam dor pélvica, infertilidade ou ambas, a freqüência é de 35-\n50% (Hassa et al., 2005; Giudice & Kao, 2004). \nOs locais mais freqüentes de lesões endometri óticas são o peritônio e os órgãos pélvicos, \nprincipalmente ovários, seguidos pelo sept o reto-vaginal. Menos de 12% das lesões \nlocalizam-se em regiões extra pélvicas, loca lizadas com maior freqüência nos tratos \ngastrointestinal (sigmóide, reto, área ileo cecal e apêndice) e urinário. Raramente pode \nacometer outras partes do corpo, como pulmões, tórax, pericárdio e cére bro. Sua distribuição \né variável, desde poucas regiões afetadas e lesões pequenas até implantes difusos e profundos \nenvolvendo extensas áreas e órgãos pélvicos, além da formação de cistos endometrióticos \n(endometriomas) e de aderências, as quais caus am distorção da anatomia pélvica (Kennedy et \nal., 2005; Barlow & Kennedy, 2005). \n 24\n\nSegundo a American Society for Reproductive Medicine  (ASRM, 1997), a endometriose \npode ser classificada em quatro estágios (de I a IV), em fo rma mínima, leve, moderada e \nsevera, conforme a extensão ou tamanho das lesõ es encontradas. Este método ajuda a avaliar \na severidade da doença e quantificar o volume da s lesões, além de auxiliar na avaliação da \nresposta das pacientes ao tratamento (Arya & Shaw, 2005; Kennedy et al., 2005). \nAdicionalmente, as lesões endometrióticas do peritônio, ovário e septo reto-vaginal \npodem ser subdivididas em três ti pos distintos, de aco rdo com a fase de desenvolvimento da \ndoença. As lesões vermelhas são caracterizadas por atividade celular intensa e ampla \nvascularização, correspondendo aos estágios iniciais da endometriose, quando ocorre \nimplantação ectópica do tecido endometrial. O sangramento deste tecido, seguido de novo \ncrescimento tecidual, desencadeia resposta in flamatória ao redor da lesão, formando uma \nescara de aparência escura, passando então a se r classificada como lesão negra. A seguir, a \nfibrose resultante do processo inflamatório e a conseqüente redução de vasos sanguíneos no \nfoco endometriótico deixam-na opaca, com asp ecto cicatricial, sendo denominada de lesão \nbranca. Acredita-se que nesta última fase as  lesões possam permanecer em estado latente \n(Nisolle & Donnez, 1997). \nA endometriose possui ainda características celulares comuns a neoplasias, como por \nexemplo proliferação clonal, tendência a me tástase e invasão tecidual. Transformações \nmalignas parecem estar associadas a 0,7-1,0% dos casos, sendo 70% deles adenocarcinomas \nendometrióides. Vários estudos demonstram que as pacientes têm risco aumentado de \ndesenvolver certos tipos de câncer, predominantemente o ova riano, que abrange 76% das \nocorrências (Barlow & Kennedy, 2005; Kitajima et al., 2005; Judson et al. , 2000; Swiersz, \n2001). Contudo, esse risco parece ser extremamente  baixo para paciente s jovens, tornando-se \nmaior em períodos próximos à menopausa, torn ando, dessa forma, importante o diagnóstico \nprecoce das lesões endometrióticas. Outros sí tios de implantação relacionados a processos \n 25\n\nmalignos são o intestino, bexiga, parede peritonial, vagina e tubas uterinas (Zanetta et al. , \n2000; Bergqvist et al., 2004). \nApesar de ser uma das doenças humanas mais  freqüentes e ser bem caracterizada, sua \npatogênese permanece pouco conhecida (Redwin, 2002; Bischoff & Simpson, 2004). Segundo \nrevisão de Knapp (1999) com dados históricos sobre a doença, a primeira descrição pelo \nmédico alemão Daniel Shroen data de 1690, já sugerindo ser esta uma doença comum que \nacometia mulheres sexualmente maduras. Poré m, somente em 1927, Sampson caracterizou a \nendometriose como é conhecida atualmente, ela borando a hipótese etiológica mais aceita. A \nhipótese, denominada metastáti ca, é de que por meio da menstruação retrógrada fragmentos \nendometriais, descamados durante a fase menstrual, contendo células viáveis, são \ntransportados através das tubas uterinas até a cavidade peritonial onde se implantam, crescem \ne invadem tecidos de órgãos adjacentes (Ary a & Shaw, 2005). Algumas evidências sustentam \ntal hipótese, como a presença de células endomet riais viáveis no efluente menstrual e fluido \nperitonial, o endométrio ser capaz de se implantar e crescer dent ro da cavidade peritonial e \ncerca de 70 a 90% das mulheres apresentarem menstruação retrógrada (Guo et al. , 2004; \nKyama et al., 2003). Dessa maneira, algumas característi cas têm sido consideradas fatores de \nrisco para o desenvolvimento da endometriose, como: ciclos menstruais de curta duração; \nmaior duração da menstruação e menarca precoce, pois aumentam o tempo de exposição às \ncélulas endometriais (Mounsey et al., 2006).  \nNo entanto, apenas o refluxo não é suficiente para estabelecer a doença, sendo necessárias \noutras condições que permitam que as células endometriais permaneçam funcionais no local \nda lesão. Apesar do tecido ectópico ser hist ogicamente e morfologicamente similar ao \neutópico (endométrio situado no local original, ou seja, revestindo a cavidade uterina), eles \napresentam diferenças qualitativas ou quantitativas em vários aspectos, como expressão de \ndistintas de moléculas (Gaetje et al. , 1995; Sharpe-Timms, 2001). Acredita-se que \n 26\n\ndeterminadas características moleculares favoreçam o aparecimento e a progressão da \nimplantação ectópica, e podem explicar o moti vo pelo qual somente algumas mulheres \ndesenvolvem a doença (Viganò et al., 2006). \nEstabelecer o diagnóstico da endometriose so mente com base na sintomatologia é uma \ntarefa bastante difícil devido a sua variabilid ade, além do que a gravidade da doença nem \nsempre está relacionada ao quadro clínico. Ass im, pode haver um intervalo de anos entre o \naparecimento de sintomas e o diagnóstico definitivo (Kennedy et al. , 2005). Apesar das \nimagens de ultra-sonografia e ressonância magnética serem utilizadas como testes \ndiagnósticos, elas são úteis somente para de tecção de endometriomas ovarianos e implantes \nendometrióticos extrapélvicos, respectivamente  (Spaczynski & Duleba , 2003; Arya & Shaw, \n2005). O procedimento padrão para determinação da localização, estadio, extensão e tipo das \nlesões é a laparoscopia, mesmo que algumas  lesões não sejam reconhecidas devido ao \npequeno tamanho ou por estarem atrás de estruturas de adesão (Brosens et al., 2004). Mesmo \nsendo considerado invasivo, oneroso e com determin ado risco para as pacientes, atualmente \nnão existe diagnóstico confiável que não utilize esse método cirúrgico (Spaczynski & Duleba, \n2003; Barlow & Kennedy, 2005).  \nConsiderando a dificuldade diagnóstica, muito s estudos têm sido elaborados na tentativa \nde identificar marcadores sérico s para a endometriose (Brosens et al., 2003). Nesse contexto, \nmuitos autores estudaram a correlação entre a doença e os antígenos tumorais CA-125 e CA \n19-9, os quais são detectados em maiores quantid ades no soro de portadoras, principalmente \nem estágios mais avançados (Harada et al. , 2002). No entanto, apesar destes marcadores \nterem alta especificidade, ambos possuem baixa sensibilidade, e têm sido utilizados de forma \neficaz apenas no monitoramento de pacientes em  tratamento (Harada, 2002; de Sá Rosa e \nSilva, 2006). O tratamento para a doença tamb ém é um desafio. Em geral tem com objetivo \n 27\n\neliminar e prevenir o reaparecimento dos im plantes endometrióticos, cujos sintomas estão \nprincipalmente relacionados a dor e subfertilidade (O’Callaghan, 2006).  \nAtualmente, o tratamento consiste de drogas como análgésicos, pílulas contraceptivas \norais e análogos de GnRH, cirurgia ou ambos (Mounsey et al. , 2006). Embora nenhuma \nterapia tenha se demonstrado eficaz, as lesões são erradicadas co m sucesso através de \nprocedimentos cirúrgicos, como eletrocauterização e destruição a laser. Em 47% dos casos há \nrecorrência das lesões (Esfandiari et al. , 2007; Marcoux et al. , 1997). Em pacientes com \nendometriose mínima ou média associada a probl emas de fertilidade, tanto a retirada das \nlesões e lise de adesões quanto a inseminação  intra-uterina são métodos que aumentam a \nprobabilidade de gravidez (Kennedy et al., 2005; Tummon et al., 1997). Condutas radicais, \ncomo a histerectomia, podem ser indicadas para  casos mais severos, sendo que a taxa de \nrecorrência nessas pacientes é de 5 a 10% (Arya & Shaw, 2005). \n \nI. 1. 2. ASPECTOS GENÉTICOS DA ENDOMETRIOSE \n \nA origem genética da endometriose foi bas eada em estudos familiais, que evidenciaram \nmaior incidência da doença em parentes de primeiro grau de mulheres afetadas, de 4,3 a 6,9%, \nem relação a parentes de mulheres não afetadas, de 0,6 a 2,0% (Simpson & Bischoff, 2002). \nNo entanto, a grande quantidade de alterações  moleculares e celulares detectadas sugere \norigem poligênica da doença (Hu et al. , 2005). Sendo assim, o fenótipo resultante pode \ndecorrer das interações entre produtos da expressão de determinados alelos de genes \nespecíficos envolvidos (Barlow & Kennedy, 2005) . É verossímil também a idéia de que o \nambiente peritonial de mulheres susceptíveis  à enfermidade possa favorecer modificações na \nintegridade genômica das células endometriais que provêm do efluente menstrual e, assim, \nocasionar o surgimento das lesões (Guo et al., 2004). \n 28\n\nJá a associação entre endometriose e câncer está baseada principalmente no conhecimento \nadquirido por estudos cromossômicos. Regiões com ganho de material possivelmente abrigam \noncogenes, enquanto que os genes supressores tu morais encontram-se em regiões de perda \ncromossômica. As alterações observadas fora m descritas em regiões onde há perdas de \nseqüências de DNA, como nas regiões 1p, 5p, 6q e 22q (Gogusev et al., 2000). Entre os genes \ncom possível desencadeamento de malignidade, estão os supressores tumorais PTEN e TP53 e \nos proto-oncongenes Bcl-2 e c-myc (Viganó et al., 2006). \n \nI. 1. 3. ASPECTOS MOLECULARES E PATOGÊNESE \n \nConsiderando a alta incidência da doença na população feminina, as conseqüências do \nprocesso e também a ausência de diagnóstico e tratamento efetivos, grande esforço científico \ntem sido direcionado para pesquisas sobre a doença. Vários estudos na l iteratura evidenciam \nque as principais divergências moleculares en tre portadoras e não portadoras de endometriose \nestão relacionadas a processos envolvidos na apoptose (Braun et al. , 2002), adesão celular \n(Béliard et al., 1997), angiogênese (Healy et al., 1998), biosíntese de estrógeno (Zeitoun & \nBulun, 1999), sistema imune, além de fatores de crescimento (Braun & Dmowski, 1998) e \nmetaloproteinases (Martelli et al., 1993). \nDessa forma, uma sequência determinada de eventos faz-se necessária para o \nestabelecimento das lesões. Primeiramente,  as células endometriais devem ter maior \ncapacidade para estabelecer interações célula-cé lula e entre células e matriz extracelular nos \nlocais onde se implantam. O fato de que o tecido endometriótico é capaz de expressar \ndiferentes integrinas pode explic ar a habilidade desse  tecido em aderir ao peritônio, uma vez \nque essas moléculas servem como receptoras de laminina, fibronectina, colágeno tipo I e IV e \nvibronectina. (Regidor et al., 1998). A expressão aumentada de  moléculas de adesão, como \n 29\n\nICAM-1, em mulheres acometidas pela endome triose também auxilia na elucidação desse \nfenômeno (Matalliotakis et al., 2001). \nApós a fixação, as células que formam a lesão têm que ser hábeis para invadir o tecido ao \nqual se ligaram. Logo, o aumento da expressã o de metaloproteinase s, como MMP-2, e a \nexpressão reduzida de seus inibidores, como TIMP-3, sugerem maior atividade proteolítica e \nconseqüentemente maior potencial invasivo de células endo metriais em pacientes com \nendometriose (Chung et al., 2002; Cox et al., 2001). \nPara sustentação das lesões endometrióticas, a neovascularização é um processo \nimportante e comumente observado ao redor delas. Atividade e quantidade aumentadas de \nfatores angiogênicos no fluido peritonial de p acientes têm sido descrita s na literatura, sendo \nVEGF, a principal molécula envolvida, expres sa nos implantes endometrióticos (Donnez et \nal., 1998; Viganó et al., 2004). \nComo a endometriose é uma doença estrógeno dependente,  a síntese desse hormônio \nauxilia a manutenção dos implantes ectópico s. Em 1999, Zeitoun e Bulun observaram alta \nsíntese de aromatase em cist os endometrióticos e implante s endometriais extra-ovarianos. \nConsiderando que a aromatase cataliza a biosín tese de estrógeno, os autores sugeriram que \nessa expressão aberrante está relacionada à patogênese da doença. \nO desenvolvimento da doença também depende da  proliferação da lesão estabelecida, a \nqual é mais alta nas células ep iteliais, estromais e endoteliais  do endométrio de mulheres \nportadoras (Wingfield et al. , 1995). Exemplos de fatores que intensificam o crescimento \ncelular incluem FGF, EGF, TGF-α, TGF-β e TNF- α (Hammond et al., 1993). \nOutro fenômeno que ajuda a explicar a persistê ncia das lesões endometrióticas fora da \ncavidade uterina é a resistência à apoptose, devido à desregulação entre moléculas pró-\napoptóticas menos expressas, como por exem plo a p53, e moléculas anti-apoptóticas, como \nBcl-2, mais expressas (Braun et al., 2007; Jones et al., 1998). \n 30\n\nEm relação à imunologia da endometriose, fo i sugerido que as células dos implantes \nectópicos apresentam mecanismos de escape, que r seja pela modificação da expressão de \nantígenos, como HLA classe I, que impedem o reconhecimento imunológico, ou pela secreção \nde TGF- β e prostaglandina E2, que inibem a função linfocitária, quer seja pelo \ncomprometimento da atividade das células natural killer, levando à redução da vigilância \nimunológica. Além disso, foi descrito um aumento no número de macrófagos ativos no fluido \nperitonial das pacientes, os quais secretam citocinas, como IL-8 e TNF- α, promovendo \nproliferação celular, adesão e angiogênese (Semino et al., 1995; Oosterlynck et al., 1991). \nAdicionalmente, as alterações secundárias ou conseqüentes à endometriose também têm \nsido estudadas em nível molecular. Quanto à in fertilidade, considera-se que a causa principal \nde baixas taxas de gravidez em paciente s afetadas pela doença está relacionada a \nanormalidades na expressão de moléculas endomet riais, resultando em falhas na implantação \nembrionária (Kao et al. , 2003). Essa consideração apóia-se  no fato de que a expressão da \nintegrina αVβ3, importante durante o período de receptividade uterina ao embrião, está \nausente no endométrio tópico das mulheres afetadas pela patologia (Vernet-Tomás et al. , \n2006), além do que os altos níveis de óxido ní trico endotelial encontrados nessas mulheres \npodem ser responsáveis por efeitos citotóxico s, que tornam o útero menos receptivo ao \nembrião (Khorram & Lessey, 2002). Outras investigações revelaram que o fluido peritonial de \nmulheres com endometriose pode ser tóxico ao s espermatozóides e exibe efeito adverso à \nsobrevivência embrionária, pois quando inocula do em coelhos, ratos e hamsters, reduzia as \ntaxas de implantação embrioná ria nesses animais (Giudice et al. , 2002). Além disso, os \nprodutos secretados pelo endométrio ect ópico e/ou por células imunológicas contêm \nsubstâncias com efeito prejudicial à fertilidad e (como citocinas, fatores de crescimento, \nprostaglandinas, espécies reativas de oxigênio e auto-anticor pos) que interferem na ovulação, \nfunção endócrina, transporte de gametas e do embrião, fertilização e desenvolvimento \n 31\n\nembrionário, aumentando assim a possibilidade de falhas de implantação do embrião \n(Dmowski et al., 2002). \n \nI. 2. METODOLOGIA DE INVESTIGAÇÃO MOLECULAR \n \nNa última década, muitos estudos foram reali zados na área de genética molecular com \nobjetivo de explorar o genoma dessas pacientes, visando a identificação de genes candidatos a \nmarcadores da endometriose (Taylor et al. , 2002). Alguns autores tentaram associar a doença \na polimorfismos genéticos, relacionados, por exemplo, com os genes GALT, CYP1A1, NAT2 e \nGMST1. Esses estudos, no entanto, apresentaram resultados controversos (Bischoff & \nSimpson, 2004). \nAtualmente, as pesquisas buscam a inve stigação de genes que se expressem \ndiferencialmente (maior ou menor expressã o) nas células que correspondem às lesões \nendometrióticas. Para isso, várias metodologias foram aplicadas para screening desses genes, \ndentre elas as principais são microarrays, hibridação genômica comparativa e biblioteca \nsubtrativa (Gogusev et al., 1999; Gogusev et al., 2000; Kao et al., 2003; Guo et al., 2004; Hu \net al., 2005; Flores et al., 2006). Alguns autores buscaram escl arecer se existe diferença de \nexpressão gênica entre os te cidos eutópico e ectópico das mesmas pacientes. Com isso, \npuderam avaliar quais genes influenciavam modi ficações nas células endometriais do útero, \ntornando-as capazes de se implantar em locais e órgãos distintos. \n A hibridação subtrativa é uma metodol ogia que compara dois grupos celulares \ndistintos denominados tester e driver, permitindo isolar genes mais expressos em somente um \ndos dois grupos, pois remove seqüências comuns entre eles (Cho & Park, 1998; Taylor  et al., \n2002). Segundo Jiang e colaboradores em 2000, a t écnica de hibridação subtrativa rápida \n(RaSH) simplifica e torna mais eficiente o pro cesso de subtração, identificando grande \n 32\n\nquantidade de seqüências diferencialmente expre ssas, o que inclui genes conhecidos, além de \nseqüências ainda não descritas nos  bancos de dados atuais. Re sumidamente, o protocolo de \nRaSH é baseado na digestão enzimática dos c DNAs das amostras dos dois grupos a serem \ntestados e os fragmentos gerados são ligados a adaptadores e amplificados por PCR. Após \nesses passos, somente as amostras de um dos grupos ( tester) são digeridos novamente, com a \nenzima de restrição XhoI. Posteriormente as seqüências de  ambos os grupos são incubadas \njuntamente para que ocorra hibridação. Ne sta etapa, as amostras do grupo denominado driver \nsão colocadas em excesso na reação, o que garante a subtração. O resultado do processo são \nmoléculas representadas por 3 tipos de cDNA fita dupla: driver-driver, driver-tester e tester-\ntester. Somente a população de moléculas tester-tester é selecionada após ligação a \nplasmídeos previamente tratados com a enzima XhoI . Então os plasmídeos recombinantes são \ninseridos por transformação bacteriana, e as bactérias plaqueadas em meio de cultura. \nFinalmente os insertos são retirados das colônias e seqüenciados. \nEm 2002, Eyster e colaboradores em pregaram a tecnologia de cDNA microarrays \ncomparando os níveis de expressão gênica em  três pacientes, numa plataforma com 4133 \ngenes. Oito deles foram considerados super-expressos nos implantes ectópicos, alguns \nresponsáveis por componentes do citoesqueleto (como vimentina) e os demais com funções \nrelacionadas ao sistema imune. Com o mesmo intuito, Hu, Tay & Zhao, em 2005, utilizaram \nhibridação subtrativa de cDNA em 15 pacientes com a doença.  Neste trabalho obtiveram 78 \ncDNAS diferentes, entre os quais  14 genes foram classificados  como possíveis candidatos a \nmarcadores da doença. Entre os genes mais expressos nas lesões estavam o IGFBP5, \nrelacionado ao crescimento das lesões e PSAP  e FBLN1 , associados a câncer ovariano e de \nmama. Entre os menos expressos, estavam os genes RhoE, ligado a adesão celular, DLX5, que \nauxilia na persistência do estado proliferativo das células endometrióticas e 11 β-HSD2, \n 33\n\nresponsável por estimular atividade da aromatase, atuando assim como mantenedor das lesões \nem local ectópico. \nApós terem evidenciado que o endométrio eutópico das pacien tes com endometriose \npossuía propriedades intrínsecas que provocavam seu desenvolvimento em lesões \nendometrióticas (Gagné et al. , 2003), pesquisadores procuraram  estudar a expressão gênica \ndiferencial do endométrio de mulheres portadora s e não portadoras de endometriose, para \nidentificar possíveis genes de susceptibilidade à doença. Flores e colaboradores, em 2006, \naplicaram amostras de cDNA, obtidas a partir de RNA de linfócitos de sangue periférico dos \ndois grupos estudados, em arrays contendo 14185 seqüências de genes conhecidos. Os \nresultados incluíram genes envolvidos no metabolismo de colágeno, promoção da proliferação \ncelular e tumorigênese, mas diferenças de ex pressão mais significativ as foram relacionadas \naos genes IL2RG e LOXL1 , ligados ao sistema imunológico e supressão tumoral, \nrespectivamente. Também em 2006, Kyama e colaboradores aplicaram a técnica de PCR em \ntempo real para avaliar a expressão de mRNA s de citocinas, metaloproteases, fatores de \ncrescimento e de adesão em biópsias endomet riais e peritônio de mulheres com e sem a \ndoença. Foi detectado aumento da expressão de moléculas de  mRNA referentes aos genes \nTNF-α, IL-8 e MMP-3 , principalmente na fase menstrual do ciclo sexual feminino. Esse \nresultado significa maior capacidade do tecido endo metrial das pacientes em proliferar, aderir \ne formar vasos sanguíneos, promovendo o implante  ectópico e o desenvolvimento das lesões \nendometrióticas. Os autores sugeriram que  a progressão da doença, bem como seu \nestadiamento, podiam ser preditas de acordo co m o nível de expressão gênica de citocinas \npró-inflamatórias e MMPs. \nEm 2003, Kao e colaboradores usaram microarrays para pesquisa de genes associados a \nfalhas de implantação embrionária e infertilidade, utilizando amostra de tecido endometrial de \noito afetadas e 12 mulheres sem a doença. Os resultados sugeriram que a maior expressão dos \n 34\n\ngenes B61 e semaforina E, participantes do processo de neovascularização, determinaria o \nestabelecimento das lesões. Além disso, foi pos tulado que a desregulaç ão de outros genes, \ncomo BSEP, C4BP, glicodelina, IL-15 e pentaxina II, provocaria  respostas inflamatórias, \ndisfunção do sistema imune, toxicidade embri onária e apoptose, produzindo ambiente uterino \ninóspito para o início da gravidez. Simultaneamente, a alteração da expressão de GlcNAc6ST \npoderia bloquear mecanismos de adesão endometrial, resultando em falha implantacional. \nApesar da extensa investigação molecular descrita por diferentes grupos de pesquisa, \nainda não há consenso sobre qua is genes e seus produtos são re sponsáveis pelo surgimento e \nprogressão da endometriose, assim como quais moléculas podem ser consideradas marcadoras \npara diagnóstico e terapêutica. \n \nI. 3. JUSTIFICATIVA  \n  \n Apesar da extensa literatura sobre a dete rminação da origem da endometriose, sua \netiologia permanece desconhecida. Devido à alta freqüência da doença em mulheres em idade \nreprodutiva, principalmente em pacientes inférteis, e aos mét odos invasivos utilizados para \nseu diagnóstico, torna-se importante a busca de  novas metodologias de investigação. Este \nprojeto busca identificar genes envolvidos na fisiopatologia da endometriose, com objetivo de \ndeterminar possíveis marcadores moleculares para diagnóstico e tratamento da doença. \n \n 35\n\nII. OBJETIVOS \n \nO objetivo principal do trabalho foi id entificar por meio da técnica de RaSH (Rapid \nSubtraction Hybridization), genes com expressão diferencial em lesões endometrióticas e em \ntecido endometrial de mulheres não afetadas. \n \nOs objetivos intermediários foram: \n(1) identificar genes co m maior ou menor expressão em lesõ es endometrióticas de pacientes \ncom diagnóstico firmado de endometriose; \n(2) identificar genes com maior ou menor expressão em endométrio de mulheres não afetadas \npela doença, para análise comparativa; \n(3) correlacionar os genes expressos diferencialmente com os processos fisiopatológicos \nrelacionados à endometriose. \n \n \n \n 36\n\nIII. MATERIAL E MÉTODOS \n \n Este projeto foi desenvolvi do no Laboratório de Genéti ca Molecular e Citogenética \nMolecular Humana do bloco C do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto (FMRP-USP), com apoio de e quipe multidisciplinar da área de Genética \nReprodutiva, em colaboração com o serviço de Reprodução Humana do Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da FMRP-USP, do Laboratório  de Genética Molecular e \nBioinformática da Fundação Hemocentro da mesma instituição e do Laboratório de Oncologia \nPediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura da FMRP-USP. O projeto foi \naprovado pelo Comitê de Ética em Pesqui sa (CEP) do HCFMRP-USP, processo HCRP n o \n11736/2004. Todas as pacientes participantes da pesquisa assinaram o termo de \nconsentimento livre e esclarecido.  \n \n \n III. 1. AMOSTRAS \n \n Para realização deste projeto, foram coletadas 22 amostras de tecido endometrial de \npacientes atendidas em ambulatórios especi alizados do HCFMRP-USP, divididas em dois \ngrupos.  \n O grupo I compreende 11 biópsias de lesões  endometrióticas, sendo cinco de origem \novariana e seis de origem peritonial, de pacientes encaminhadas aos Ambulatórios de Dor \nPélvica e Endoscopia (AGDE) e de Infertilid ade Conjugal do HCFMRP-USP, diagnosticadas \ncom endometriose por meio de exame laparoscópico, confirmado por análise histológica.  \n O grupo II (grupo controle) compreende 11 am ostras de endométrio tópico, sendo as \nbiópsias obtidas utilizando cureta de Novak, de  pacientes sem diagnóstico de endometriose, \n 37\n\napós serem submetidas à laparoscopia, enca minhadas pelo Ambulatório de Planejamento \nFamiliar para laqueadura tubária. \n As amostras foram coletadas no centro cirúrgico do HCFMRP-USP e armazenadas em \nfreezer -800C após tratamento com criopreservador Tissue-Teck® O.C.T. Compound  (Sakura \nFinetek USA. Inc., Torrance, CA). \n O estadio da doença foi determinado de acordo com a classificação da American Society \nfor Reproductive Medicine  (Revised American Societ y for Reproductive Medicine \nclassification of endometriosis: 1996). Os critérios de inclusão  foram amostras de pacientes \ncom idade entre 18 e 40 anos, apresentando cicl os menstruais regulares  de 25 a 35 dias, que \nestivessem na fase proliferativa do ciclo mens trual e sem uso de anticoncepcional oral ou \nqualquer outra forma de tratamento hormonal no período de três meses anterior à coleta.  \n \n \nIII. 2. METODOLOGIA \n \nIII. 2. 1. ISOLAMENTO DO RNA TOTAL \n \nAnteriormente à extração de RNA, eliminamos  o criopreservador la vando os tecidos com \n1mL de PBS (NaCl 8,50g/L; Na 2HPO4 1,11g/L; Na 2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH 2PO4 0,20g/L \npH7,0) por três vezes. \nAs amostras foram maceradas completamente com nitrogênio líquido e para cada 50mg de \ntecido adicionamos 1mL de TRIZOL ® Reagent ( Invitrogen Life Technologies, USA – \nMolecular Research Center, Inc. ) até atingir consistência lí quida. O RNA total de cada \namostra de tecido foi isolado adicionando 200μL de clorofórmio, seguido de centrifugação, de \nacordo com as recomendações do fabricante. A fa se aquosa foi transferida para um novo tubo \n 38\n\ne o RNA foi então precipitado com 500μ L de álcool isopropílico. O pellet foi lavado com \n1mL de etanol 75% e, após secagem, diluído em 12μL de água tratada com DEPC. \nA integridade do RNA foi analisada em gel de agarose 1%, marcado com brometo de \netídeo e visualizada com luz ultra-violeta. A verificação de bandas de RNAs ribossômicos de \n28S e 18S intactos foram usadas como critério  para certificação de que os RNAs não estavam \ndegradados. As concentrações das soluções de RNA foram medidas em espectofotômetro \n(Eppendorf) a DO 260 , depois de diluídas individualmente em 10 μL de água livre de RNAse. \nO RNA permaneceu armazenado à -800C até o momento do uso. \n \n III. 2. 2. RAPID SUBTRACTION HYBRIDIZATION (RaSH) \n \nNo presente trabalho, ap licamos o protocolo de RaSH (Jiang et al. , 2000) com \nmodificações, utilizando RNA extraído de lesões endometrióticas e de endométrio tópico de \nmulheres não afetadas pela endometriose. O protocolo foi executado duas vezes, sendo que \nambos os grupos serviram uma vez como tester e outra como driver. \n 39\n\nEsquema ilustrativo da técnica de Rash: \nTecido de Endométrio \nNormal \nTecido Ectópico \n(Lesão endometriótica) \nRNAm RNAm \nRT RT \ncDNA cDNA\nGATC   \n CTAG  \nGATC   \n CTAG  \nGATC  \n CTAG \nGATC  \n CTAG \nT4 ligase – adição dos adaptadores T4 ligase – adição dos adaptadores \nPCR (primer XDPN-18) PCR (primer XDPN-18) \nGATC    \n  CTAG  \nGATC    \n  CTAG  \nXXhhoo  II – restrição enzimática \nMMbbooII – restrição enzimática MMbbooII – restrição enzimática\nGATC    \n  CTAG  \nGATC    \n  CTAG  \nHibridação tester e driver \nA \nB \nC \nTester Driver \n \n 40\n\n \nGATC    \n  CTAG  \ntester\ntester\nGATC    \n  CTAG  \ntester\ndriver\nGATC    \n  CTAG  \ndriver\ndriver\nSeqüenciamento \nXhoI \nD \n \n \nFigura 1: A) Amostras de cDNAs obtidos a partir dos tecidos analisados, transcrição reverva, \nrestrição enzimática com MboI e li gação dos adaptadores; B) PCR com primers XDPN-18 e \nrestrição enzimática somente da amostra tester, representada, na figura, pela lesão \nendometriótica; C) Mistura das amostras tester e driver, seguida de reação de hibridação; D) \nRepresentação dos híbridos ge rados, ligação do híbrido tester-tester ao plamídeo tratado com \na enzima de restrição XhoI, transformação b acteriana, plaqueamento e seqüenciamento dos \ninsertos clonados. \n 41\n\nIII.2.2.1. SÍNTESE DE cDNA \nPara síntese de cDNA, foram escolhidas alea toriamente seis amostras do grupo controle e \nseis amostras de mulheres com endometriose. As amostras foram separadas de acordo com o \ngrupo ao qual pertenciam e mistur adas, gerando dois conjuntos ou pools com 25 μg de RNA \ntotal. Cada amostra contribuiu com a mesma quantidade de RNA (4,17μg). \nObtivemos os cDNAs fita dupla utilizando 200U da enzima SuperScriptTM II Reverse \nTranscriptase (Invitrogen) e 0,50 μg de oligo(dT)  12-18 , para síntese da primeira fita, além de \n10U de E. coli DNA ligase (Invitrogen) e 40U de E. coli DNA Polymerase I (Invitrogen), para \nsíntese da segunda fita. Logo após, a qualidade da síntese do cDNA foi avaliada pela técnica \nde PCR, usando primers para β–actina. \n \nIII.2.2.2. DIGESTÃO ENZIMÁTICA E LIGAÇÃO DOS ADAPTADORES \n Os cDNAs foram incubados com 20U da enzima de restrição MboI por 1 hora a 37 0C para \ndigestão. Os fragmentos produzidos foram extr aídos com fenol/clorofórmio e precipitados \ncom etanol. Os sítios gerados nas extremidades dos fragmentos foram ligados aos adaptadores \nXDPN-12 (GATCTCTCGAGT) e XDPN-14 (CTGATCACTCGAGA), usando 8,0 μL de \ntampão ligase 5X. Acrescentamos 9U de T4 ligase ( Invitrogen) e em seguida incubamos a \n140C overnight, para efetuar a reação de ligação. \n \n III.2.2.3. PCR E PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS \n As amostras obtidas da reação anterior foram diluídas com LoTE ( Invitrogen), em volume \nfinal de 100 μL e amplificadas por PCR, contendo 6,00 μL do primer XDPN-18 \n(CTGATCACTCGAGAGATC), complementar aos adaptadores. Após a PCR, os produtos \nforam misturados de acordo com o grupo ao  qual pertenciam (grupo I e grupo II). Foi \n 42\n\nrealizada extração por fenol/clorofórmio e precipitação com etanol para obtenção dos \nprodutos da amplificação. \n \n III.2.2.4. DIGESTÃO DO TESTER E HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA \n Dez microgramas da amostra tester foram digeridos com 20U da enzima de restrição XhoI \n(Gibco BRL). Os fragmentos obtidos foram então diluídos em 30 μL de LoTE. Cem \nnanogramas do produto da digestão foram misturados a 5 μg da amostra driver. A reação de \nhibridação foi realizada adicionando à mistura 16,60 μl de tampão de ligação (0,5M de NaCl; \n50mM de Tris/HCl; SDS 0,2%; formam ida 40%) e após denaturação a 100 0C durante 5 \nminutos, a solução foi incubada a 420C por 48 horas. \n Então foram aplicados 3 μl do produto da hibridação à solução contendo 0,50 μl do \nplasmídeo pZErO ®-1 (1 μg/μL) pré-digerido com a enzima de  restrição XhoI. A mistura foi \nincubada a 160C durante 3 horas para ligação do híbrido tester-tester com o plasmídeo. \n \n III.2.2.5. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA E GERAÇÃO DAS BIBLIOTECAS DE \ncDNA \nDois microlitros do plasmídeo \nrecombinante foram adicionados a 50μ l de \nsolução contendo bactérias competentes, \nseguido de eletroporação (2,5 V, 25 μFD, \n200 OHMS) ( GenePulser, BioRad). \nAcrescentamos 500μl de meio líquido SOC à \nmistura, a qual foi mantida em shaker à \nrotação de 200 RPM, por 1 hora, a 37 0C. \n 43\n\nApós incubação, adicionamos mais 500 μl de \nmeio SOC e semeamos a solução em placas \nde Petri contendo 40mL de meio ágar LB \nLow Salt com 20 μl do antibiótico zeocina \n(100mg/mL). Seguiu-se incubação em estufa \na 370C, overnight. \n \n \n III.2.2.6. ANÁLISE DAS COLÔNIAS E OBTENÇÃO DOS DADOS \nAs colônias foram palitadas e semeadas em \nmicroplacas de 96 poços. Cada poço \ncontinha 150μl do meio líquido 2XYT com \nzeocina (50mg/mL). Após incubação a 37 0C \novernight, uma alíquota de 1 μl de cada poço \nfoi usada para PCR, com primers  M13, \ncomplementares a seqüências internas do \nplasmídeo, flanqueado aos insertos de \ncDNA tester-tester. Os produtos das reações \nforam visualizados em gel de agarose 1,5% e \nseqüenciados em seqüenciador automático \nMegaBace\nTM 1000 ( Amesham Biosciences, \nPiscataway, NJ, USA ) utilizando DYEnamic \nET Dye Terminator  Sequencing Kit  ( Amesham \n 44\n\nBiosciences, Piscataway, NJ, USA ), segundo as \nnormas do fornecedor. \nAs seqüências obtidas foram analisadas e \narmazenadas no banco de dados do \nLaboratório de Genética Molecular e \nBioInformática da Fundação Hemocentro \ndo HCFMRP-USP para posterior análise \ncom o programa Generic EST Annotation \nPipeline ( Geap), desenvolvido no mesmo \nlaboratório, o qual utiliza os seguintes \nvalores padrões: phred cutoff de 0,09, valor de \nqualidade 100pb, minmatch  10, minscore  20 e \nBLAST (1e\n-30). \nForam selecionadas para composição do \nbanco de dados, as seqüências que tiveram, \nno mínimo, 90% de homologia com as \ndepositadas no banco de dados GenBank® do \nNational Institute of Health  \n(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). \nApós a geração desses dados, procedeu-se a leitura de inform ações sobre os genes, aos \nquais as seqüências obtidas pela RaSH se referem, através de buscas nos sites de acesso \npúblico Gene Ontology  ( http://fatigo.bioinfo.cnio.es) e, principalmente, no National Center \nfor Biotechnology Information  - NCBI  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Os textos analisados \npelo site da NCBI são encontrados através dos links: \n 45\n\n- GENE: banco de dados para pesquisa de inform ações de genes específicos. O conteúdo é \natualizado constantemente, envolvendo nomencl atura, localização cromossômica, produtos \ngênicos, fenótipos associados e links para citações, seqüências homólogas, expressão, \ndomínios protéicos e bancos de dados externos; \n- OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man): banco de dados que abrange genes humanos \ne doenças genéticas. As informações fornecidas por vários sites de armazenamento de dados \nenvolvem textos e referências bibliográficas; \n- PubMed: banco de dados desenvolvido na National Library of Medicine (NLM) que fornece \nmais de 14 milhões de artigos científicos pub licados em mais de 4800 jornais e revistas \nespecializadas em diversas áreas, principalmente a biomédica. \nPara facilitar a seleção dos genes de inte resse, o grupo de Bioinf ormática do bloco G do \nDepto. de Genética da FMRP-USP elaborou um programa capaz de cruzar palavras dos textos \ncom as principais palavras-chave de evento s biológicos, fisiológicos e/ou patológicos que \npoderiam estar envolvidos nas principais causas do estabele cimento e desenvolvimento da \nendometriose. Após revisão da literatura, foi elaborada uma lista dos principais termos \nprovavelmente associados à patogênese da doença. As palavras utilizadas foram: “blood \nsupply”; “cell;cycle”; “celldeath”; “pr ogrammed cell death”; adherence; adhesion; \nadhesions; angiogenesis; angiogenetic; antiangi ogenic; antiapoptosis; apoptosis; attach; \nattached; attaches; attachment; autoimmune; c ancer; cancers; carcinogenesis; carcinoma; \nchemoattractant; chemokin; chemokines; chem otactic; cyst; cysts; cytokine; cytokines; \ndifferentiate; differentiates; differentiation; dissemination;  endometrioma; endometriomas; \nendometriosis; endometriotic; endo thelial; endothelium; estrogen; female; fertile; fertility; \nfertilization; gonad; gonadal; gonads; grow; growth; gynecol ogic; gynecology; hyperplasia; \nhyperplasic; immune; immunologic; immunological; immunology; immunosuppression; \nimmunosuppressive; implant; implantation; impl ants; infertile ; infertility;  inflammation; \n 46\n\ninflammatory; interleukin; invade; invading; invasion; lesion; lymphocyte; lymphocytes; \nlymphoma; malignancies; malignancy; malignant; menstrual; menstruation; metaplasia; \nmetaplastic; metastasis; mitogen; mitogenic; mitosis; neoangiogenesis; neoplasia; neoplasm; \nneoplastic; oestrogen; oncogenesi s; oncogenic; ovarian; ovaries;  ovary; ovulation; pelvic; \npelvis; peritonial; peritoneum; pregnancy; pregnant; proapoptotic; proinflammatory; \nproliferate; proliferates; pr oliferation; proliferative; prostaglandins; reproduction; \nreproductive; scatter; spread; spreading; spreads; steroid; steroids; survival; survive; tumor; \ntumoral; tumorigenesis; tumors; tumour; tum ours; uterine; uterus; vasculature; woman; \nwomen. \nDepois de executado o programa, as seqüências obtidas pela RaSH foram classificadas \nem:  \n• Candidatas – seqüências referentes  a genes que participavam de \nprocessos que poderiam estar relacionados à endometriose; \n• Não-candidatas - seqüências referent es a genes que participavam de \nprocessos que não estavam relacionados à endometriose; \n• Com informações insuficientes - seqüências referentes a genes cujas \ninformações da literatura eram escassa s e portanto sem relação direta com a \nendometriose; \n• Com dados controversos na literatura  - seqüências referentes a genes \ncuja ação ou função ainda não estão bem estabelecidas. \n \n \n \n \n \n 47\n\n \n \nIII. 2. 3. VALIDAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS GENES SELECIONADOS POR  \nRT-PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL \n \nIII.2.3.1. SÍNTESE DE cDNA \n \nPara obtenção do cDNA, usamos o High Capacity cDNA Reversion Transcription  Kit \n(Applied Biosystems), segundo instruções do fabricante. Um micrograma de cada a amostra de \nRNA total foi adicionado a tampão 10X, dNTP 100mM, random primer 10X, 1,25μ L da \nenzima multiscribe e 2,5U de RNaseOUTTM (Invitrogen) em volume final de 25μL. A solução \nfoi submetida a 25 0C por 10 minutos, seguido de 37 0C por 2 horas e 85 0C por 5 segundos. \nEntão cada amostra foi diluída em água DEPC  na proporção 1 para 50. Os produtos das \nreações foram armazenados em freezer -20 0C até a realização da técnica de RT-PCR \nquantitativo em tempo real. \n \nIII.2.3.2. EFICIÊNCIA DA REAÇÃO \n \nPara todos os genes de interesse (SPARC , SSAT, HTRA1 e LOXL1 ) e controle endógeno \n(GAPDH) foram construídas curvas de amplificação  a partir da utilização de diluições \nseriadas (não diluído, 10 -1, 10 -2 e 10 -3) em triplicata do cDNA da amostra calibradora. \nUtilizamos como calibrador uma amostra de  cDNA obtida a partir de RNA do tecido \nendometrial normal de uma paciente sem endometriose. Para construção da curva-padrão, \nforam usados pelo menos três pontos a partir  da curva de amplificação. Consideramos as \ncurvas com slope entre -3,55 e -3,1, o que reflete eficiê ncia de amplificação de, no mínimo, \n 48\n\n90,5%. As figuras 2 e 3 mostram, respectivamente, a curva de amplificação e curva-padrão \nconstruídas para o gene LOXL1. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 2: Curva de amplificação do gene LOXL1. Foi plotada a fluorescência  da \namplificação versus o número de ciclos da PCR. \nFonte: ABI PRISMTM 7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems) \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n 49\n\nFigura 3: Curva-padrão do gene LOXL1 obtida a partir da curva de amplificação. \nFonte: ABI PRISMTM 7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems) \nIII.2.3.3. QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA \n \nA quantificação da expressão gênica foi realizada por meio da RT-PCR quantitativa em \ntempo real no aparelho ABI PRISM TM 7500 Sequence Detection Systems  (Applied \nBiosystems) do Laboratório de Oncologia Pediátrica do Departamento de Puericultura e \nPediatria do HCFMRP-USP. As reações fo ram executadas utilizando o sistema TaqMan ® \n(Applied Biosystems),  de acordo com as instruções do fa bricante. Cada reação continha \nUniversal PCR Master Mix 2X, Gene Expression Assay Mix  20X e 9µL de cDNA em volume \nfinal de 20µL. As condições da reação fora m 95ºC por 10 minutos, seguidos de 95ºC por 15 \nsegundos e 60ºC por 1 minuto, durante 40 ciclos.  \nAs expressões dos genes de interesse foram calculadas de acordo com a fórmula 2-ΔΔCT, de \nacordo com o trabalho de Livak & Schmittgen (2001), fornecendo os valores de RQ ( Relative \nQuantification), os quais foram utilizados na análise estatística. \n \nIII. 2. 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA \n \nA comparação dos dados de expressão gênica foi realizada pelo o teste não-paramétrico de \nsoma de postos de Wilcoxon, para duas amostras  independentes com nível de confiança de \n95%, utilizando o programa STATDISK 9.1 (Triola, 2005). \nPara os genes com diferença significativa no  teste anterior, os valores dos níveis de \nexpressão gênica também foram avaliados a partir da análise da curva ROC ( Receiver-\nOperating Characteristic ), através do software MedCalc ( http://www.medcalc.be). A curva \nrefere-se a valores de verdadeiros positivos (sensibilidade, verdadeiro s-positivos / falsos-\n 50\n\nnegativos + verdadeiros-positivos) em função dos falsos positivos (especificidade, \nverdadeiros-negativos / falsos-positivos + verdad eiros-negativos). A área abaixo da curva é a \nmedida de quanto é acurada a distinção entr e os grupos analisados (Metz, 1978; Zweig & \nCampbell, 1993). Adicionalmente, a partir da curva ROC foi gerado, pelo mesmo programa, o \ndiagrama de pontos interativos ( interactive dot ) para estudo da prec isão da separação dos \ngrupos desse estudo. O diagrama indica o valor de RQ que permite melhor separação (mínimo \nde falsos-positivos e de falsos-negativos) entre os grupos.  \n 51\n\nIV. RESULTADOS \n \nIV.1. OBTIDOS PELA TÉCNICA DE RaSH \nOs dados referentes às seqüências que segui ram os critérios de seleção permaneceram \ndisponíveis aos pesquisadores deste trabalho no site http://guarani.fmrp.usp.br/geap.  \nAs seqüências analisadas das bibliotecas de cDNA foram dividi das em 8 categorias : \nmitocondrial; levedura; RefSeq (seqüências de referência) ; UniGene; outros; ribossômica; \nESTs e bactéria. \nA tabela I sumariza os resultados referentes às seqüências de referência: a coluna RHENDI \napresenta os dados obtidos quando o conj unto de cDNAs do grupo de mulheres com \nendometriose foi utilizado como tester e a coluna RHENDW é referente aos resultados \nobtidos quando esse mesmo conjunto de cDNAs foi usado como driver. Os números à direita \ncorrespondem à quantidade de colônias contendo os insertos referentes às seqüências anotadas \nà esquerda. As demais categorias de seqüências estão relacionadas nos anexos A e B. \n \nTabela I: Seqüências de referência obtidas pela RaSH nas bibliotecas RHENDI e RHENDW \nRefSeq RHENDI RHENDW \nNM_013349 \nHomo sapiens SCIRP10-related protein \n(SCIRP10), mRNA \n 1 \nNM_001001894 \nHomo sapiens tetrat ricopeptide repeat \ndomain 3 (TTC3), transcript variant 2, \nmRNA \n 4 \nNM_001008897 \nHomo sapiens t-complex 1 (TCP1), \ntranscript variant 2, mRNA \n 1 \n   continua \n \ncontinuação \n \n  \n 52\n\nNM_000291 \nHomo sapiens phosphoglycerate kinase \n1 (PGK1), mRNA \n 1 \nNM_153000 \nHomo sapiens adenomatosis polyposis \ncoli down-regulated 1 (APCDD1), \nmRNA \n 1 \nNM_002668 \nHomo sapiens proteolipid protein 2 \n(colonic epithelium-enriched) (PLP2), \nmRNA \n 1 \nNM_006732 \nHomo sapiens FBJ murine \nosteosarcoma viral oncogene homolog \nB (FOSB), mRNA \n 3 \nNM_000518 \nHomo sapiens hemoglobin, beta (HBB), \nmRNA \n 3 \nNM_001961 \nHomo sapiens eukaryotic translation \nelongation factor 2 (EEF2), mRNA \n 2 \nNM_003118 \nHomo sapiens secreted protein, acidic, \ncysteine-rich (osteonectin) (SPARC), \nmRNA \n 7 \nNM_004530 \nHomo sapiens matrix metalloproteinase \n2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase, \n72kDa type IV colla genase) (MMP2), \nmRNA \n 2 \nNM_001780 \nHomo sapiens CD63 antigen \n(melanoma 1 antigen) (CD63), mRNA \n 12 \n \n \ncontinuação \n \n \ncontinua \n \n \n 53\n\nXM_929146 \nPREDICTED: Homo sapiens \nhypothetical protein LOC646190 \n(LOC646190), mRNA \n1  \n \nNM_002568 \nHomo sapiens poly(A)  binding protein, \ncytoplasmic 1 (PABPC1), mRNA \n 1 \nXM_496985 \nPREDICTED: Homo sapiens similar to \ntranscription el ongation factor B \npolypeptide 3 binding protein 1 \n(LOC441363), mRNA \n1  \nNM_000918 \nHomo sapiens procollagen-proline, 2-\noxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4-\nhydroxylase), beta polypeptide (protein \ndisulfide isomerase-associated 1) \n(P4HB), mRNA \n 1 \nNM_207521 \nHomo sapiens reticulon 4 (RTN4), \ntranscript variant 5, mRNA \n 3 \nNM_013974 \nHomo sapiens dimethylarginine \ndimethylaminohydrolase 2 (DDAH2), \nmRNA \n 5 \nNM_198976 \nHomo sapiens TH1-like (Drosophila) \n(TH1L), transcript variant 1, mRNA \n 1 \nNM_014300 \nHomo sapiens SEC11-like 1 (S. \ncerevisiae) (SEC11L1), mRNA \n 1 \n   continua\ncontinuação    \n 54\n\nNM_001013702 \nHomo sapiens similar to p40 \n(LOC440258), mRNA \n12 1 \nNM_006367 \nHomo sapiens CAP, adenylate cyclase-\nassociated protein 1 (yeast) (CAP1), \nmRNA \n 1 \nNM_017733 \nHomo sapiens GPI7 protein (GPI7), \nmRNA \n 1 \nNM_004109 \nHomo sapiens ferredoxin 1 (FDX1), \nnuclear gene encoding mitochondrial \nprotein, mRNA \n 1 \nNM_024293 \nHomo sapiens chromosome 2 open \nreading frame 17 (C2orf17), mRNA \n 1 \nNM_004786 \nHomo sapiens thioredoxin-like 1 \n(TXNL1), mRNA \n 1 \nNM_145702 \nHomo sapiens tigger transposable \nelement derived 1 (TIGD1), mRNA \n1  \nNM_203392 \nHomo sapiens family with sequence \nsimilarity 27-like (FAM27L), mRNA \n1  \nNM_002775 \nHomo sapiens protease, serine, 11 (IGF \nbinding) (PRSS11), mRNA \n 1 \nNM_052996 \nHomo sapiens PR domain containing 7 \n(PRDM7), mRNA \n1  \ncontinua\ncontinuação    \n 55\n\nNM_003017 \nHomo sapiens splicing factor, \narginine/serine-rich 3 (SFRS3), mRNA \n 1 \nNM_021141 \nHomo sapiens X-ray repair \ncomplementing defective repair in \nChinese hamster cells 5 (double-strand-\nbreak rejoining; Ku autoantigen, \n80kDa) (XRCC5), mRNA \n 2 \nXM_926493 \nPREDICTED: Homo sapiens \nhypothetical protein LOC643121 \n(LOC643121), mRNA \n1  \nNM_005575 \nHomo sapiens leucyl/cystinyl \naminopeptidase (LNPEP), transcript \nvariant 1, mRNA \n2  \nNM_005016 \nHomo sapiens poly(rC) binding protein \n2 (PCBP2), transcript variant 1, mRNA \n 3 \nNM_003155 \nHomo sapiens stanni ocalcin 1 (STC1), \nmRNA \n 1 \nNM_016015 \nHomo sapiens leucine carboxyl \nmethyltransferase 1 (LCMT1), mRNA \n 1 \nNM_006476 \nHomo sapiens ATP synthase, H+ \ntransporting, mitochondrial F0 complex, \nsubunit g (ATP5L), nuclear gene \nencoding mitochondrial protein, mRNA \n 2 \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 56\n\nNM_015917 \nHomo sapiens glutathione S-transferase \nkappa 1 (GSTK1), mRNA \n 1 \nNM_003079 \nHomo sapiens SWI/SNF related, matrix \nassociated, actin dependent regulator of \nchromatin, subfamily e, member 1 \n(SMARCE1), mRNA \n 1 \nNM_005801 \nHomo sapiens putative translation \ninitiation factor (SUI1), mRNA \n 2 \nNM_001001522 \nHomo sapiens transgelin (TAGLN), \ntranscript variant 1, mRNA \n 1 \nXM_938374 \nPREDICTED: Homo sapiens \nhypothetical protein LOC648101, \ntranscript variant 1 (LOC648102), \nmRNA \n1  \nNM_032376 \nHomo sapiens hypothetical protein \nMGC4251 (MGC4251), mRNA \n 2 \nNM_000801 \nHomo sapiens FK 506 binding protein \n1A, 12kDa (FKBP1A), transcript \nvariant 12B, mRNA \n 1 \nXM_498789 \nPREDICTED: Homo sapiens \nLOC440645 (LOC440645), mRNA \n4  \n \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 57\n\nNM_006098 \nHomo sapiens guanine nucleotide \nbinding protein (G protein), beta \npolypeptide 2-like 1 (GNB2L1), mRNA \n 11 \nNM_000198 \nHomo sapiens hydrox y-delta-5-steroid \ndehydrogenase, 3 beta- and steroid \ndelta-isomerase 2 (HSD3B2), mRNA \n1  \nNM_014380 \nHomo sapiens nerve growth factor \nreceptor (TNFRSF16) associated \nprotein 1 (NGFRAP1), transcript \nvariant 3, mRNA \n 1 \nNM_201428 \nHomo sapiens reticulon 3 (RTN3), \ntranscript variant 2, mRNA \n 1 \nNM_005097 \nHomo sapiens leucine-rich, glioma \ninactivated 1 (LGI1), mRNA \n1  \nNM_017794 \nHomo sapiens KIAA1797 (KIAA1797), \nmRNA \n1  \nNM_198252 \nHomo sapiens gelsolin (amyloidosis, \nFinnish type) (GSN), transcript variant \n2, mRNA \n 1 \nNM_006472 \nHomo sapiens thioredoxin interacting \nprotein (TXNIP), mRNA \n 1 \n \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 58\n\nNM_002778 \nHomo sapiens prosaposin (variant \nGaucher disease and variant \nmetachromatic leukodystrophy) \n(PSAP), mRNA \n 1 \nNM_001418 \nHomo sapiens eukaryotic translation \ninitiation factor 4 gamma, 2 (EIF4G2), \nmRNA \n 1 \nNM_001014795 \nHomo sapiens integrin-linked kinase \n(ILK), transcript variant 3, mRNA \n 1 \nNM_005780 \nHomo sapiens lipoma HMGIC fusion \npartner (LHFP), mRNA \n1  \nNM_003825 \nHomo sapiens synaptosomal-associated \nprotein, 23kDa (SNAP23), transcript \nvariant 1, mRNA \n1  \nNM_002211 \nHomo sapiens integrin, beta 1 \n(fibronectin receptor, beta polypeptide, \nantigen CD29 includes MDF2, MSK12) \n(ITGB1), transcript variant 1A, mRNA \n 1 \nNM_006435 \nHomo sapiens interferon induced \ntransmembrane protein 2 (1-8D) \n(IFITM2), mRNA \n 2 \nNM_003590 Homo sapiens cullin 3 (CUL3), mRNA  1 \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 59\n\nNM_000884 \nHomo sapiens IMP (inosine \nmonophosphate) dehydrogenase 2 \n(IMPDH2), mRNA \n 1 \nNM_138793 \nHomo sapiens calcium activated \nnucleotidase 1 (CANT1), mRNA \n 1 \nXM_929760 \nPREDICTED: Homo sapiens \nhypothetical protein LOC646803 \n(LOC646803), mRNA \n2  \nNM_014719 \nHomo sapiens KIAA0738 gene product \n(KIAA0738), mRNA \n1  \nNM_003295 \nHomo sapiens tumor protein, \ntranslationally-controlled 1 (TPT1), \nmRNA \n 17 \nNM_030789 \nHomo sapiens histocompatibility \n(minor) 13 (HM13), transcript variant 1, \nmRNA \n 2 \nNM_006196 \nHomo sapiens poly(rC) binding protein \n1 (PCBP1), mRNA \n 1 \nNM_001878 \nHomo sapiens cellular retinoic acid \nbinding protein 2 (CRABP2), mRNA \n 1 \nNM_001101 \nHomo sapiens actin, beta (ACTB), \nmRNA \n 6 \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 60\n\nNM_001749 \nHomo sapiens calpain, small subunit 1 \n(CAPNS1), transcript variant 1, mRNA \n 7 \nNM_014320 \nHomo sapiens heme binding protein 2 \n(HEBP2), mRNA \n 2 \nNM_014799 \nHomo sapiens hephaestin (HEPH), \ntranscript variant 2, mRNA \n2  \nNM_021103 \nHomo sapiens thymosin, beta 10 \n(TMSB10), mRNA \n 4 \nNM_001540 \nHomo sapiens heat shock 27kDa protein \n1 (HSPB1), mRNA \n 1 \nXM_498786 \nPREDICTED: Homo sapiens \nLOC440642 (LOC440642), mRNA \n3  \nNM_018382 \nHomo sapiens hypothetical protein \nFLJ11292 (FLJ11292), mRNA \n1  \nNM_181353 \nHomo sapiens inhibitor of DNA binding \n1, dominant negative helix-loop-helix \nprotein (ID1), transcript variant 2, \nmRNA \n 11 \nNM_021109 \nHomo sapiens thymosin, beta 4, X-\nlinked (TMSB4X), mRNA \n 61 \nNM_000942 \nHomo sapiens pepti dylprolyl isomerase \nB (cyclophilin B) (PPIB), mRNA \n 15 \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 61\n\nNM_006769 \nHomo sapiens LIM domain only 4 \n(LMO4), mRNA \n 1 \nXM_943152 \nPREDICTED: Homo sapiens \nKIAA1245, transcript variant 12 \n(KIAA1245), mRNA \n1  \nNM_203380 \nHomo sapiens acyl-CoA synthetase \nlong-chain family member 5 (ACSL5), \ntranscript variant 3, mRNA \n 1 \nXM_292160 \nPREDICTED: Homo sapiens similar to \nSerine/threonine-protein kinase Nek1 \n(NimA-related prot ein kinase 1) \n(MGC75495), mRNA \n1  \nNM_198334 \nHomo sapiens glucosidase, alpha; \nneutral AB (GANAB), mRNA \n 1 \nNM_001280 \nHomo sapiens cold inducible RNA \nbinding protein (CIRBP), mRNA \n 1 \nNM_018155 \nHomo sapiens hypothetical protein \nFLJ10618 (FLJ10618), mRNA \n 1 \nNM_001681 \nHomo sapiens ATPase, Ca++ \ntransporting, cardiac muscle, slow \ntwitch 2 (ATP2A2), transcript variant 2, \nmRNA \n 1 \nNM_003746 \nHomo sapiens dynein, cytoplasmic, \nlight polypeptide 1 (DNCL1), mRNA \n 1 \n \ncontinuação \n \n continua \n 62\n\nNM_005347 \nHomo sapiens heat shock 70kDa protein \n5 (glucose-regulated protein, 78kDa) \n(HSPA5), mRNA \n 2 \nNM_002423 \nHomo sapiens matrix metalloproteinase \n7 (matrilysin, uterine) (MMP7), mRNA \n 2 \nNM_000516 \nHomo sapiens GNAS complex locus \n(GNAS), transcript variant 1, mRNA \n 3 \nNM_147184 \nHomo sapiens tumor protein p53 \ninducible protein 3 (TP53I3), transcript \nvariant 2, mRNA \n 1 \nNM_001256 \nHomo sapiens cell division cycle 27 \n(CDC27), mRNA \n4  \nNM_002817 \nHomo sapiens proteasome (prosome, \nmacropain) 26S subunit, non-ATPase, \n13 (PSMD13), transcript variant 1, \nmRNA \n 1 \nNM_012287 \nHomo sapiens centaurin, beta 2 \n(CENTB2), mRNA \n 1 \nNM_148923 \nHomo sapiens cytochrome b-5 (CYB5), \ntranscript variant 1, mRNA \n 1 \nNM_175744 \nHomo sapiens ras homolog gene family, \nmember C (RHOC), mRNA \n 3 \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 63\n\nNM_138473 \nHomo sapiens Sp1 transcription factor \n(SP1), mRNA \n 2 \nNR_002836 \nHomo sapiens phosphoglucomutase 5 \npseudogene 2 (PGM5P2) on \nchromosome 9 \n2  \nNM_022454 \nHomo sapiens SRY (sex determining \nregion Y)-box 17 (SOX17), mRNA \n 1 \nNM_001001937 \nHomo sapiens ATP synthase, H+ \ntransporting, mitochondrial F1 complex, \nalpha subunit, isoform 1, cardiac muscle \n(ATP5A1), nuclear gene encoding \nmitochondrial protein, transcript variant \n1, mRNA \n 2 \nNM_002970 \nHomo sapiens spermidine/spermine N1-\nacetyltransferase (SAT), mRNA \n 7 \nNM_015937 \nHomo sapiens phosphatidylinositol \nglycan, class T (PIGT), mRNA \n 1 \nNM_005566 \nHomo sapiens lactate dehydrogenase A \n(LDHA), mRNA \n 2 \nNM_004425 \nHomo sapiens extracellular matrix \nprotein 1 (ECM1), transcript variant 1, \nmRNA \n 2 \nNM_007273 \nHomo sapiens prohibitin 2 (PHB2), \nmRNA \n 1 \n \ncontinuação \n \n continua \n 64\n\nNM_005507 \nHomo sapiens cofilin 1 (non-muscle) \n(CFL1), mRNA \n 1 \nXM_928061 \nPREDICTED: Homo sapiens similar to \nRho-associated protein kinase 1 (Rho-\nassociated, coiled-coil containing \nprotein kinase 1) (p160 ROCK-1) \n(p160ROCK) (LOC653559), mRNA \n5  \nNM_021034 \nHomo sapiens interferon induced \ntransmembrane protein 3 (1-8U) \n(IFITM3), mRNA \n 3 \nNM_014402 \nHomo sapiens low molecular mass \nubiquinone-binding protein (9.5kD) \n(QP-C), nuclear gene encoding \nmitochondrial protein, mRNA \n 1 \nNM_001743 \nHomo sapiens calmodulin 2 \n(phosphorylase kinase, delta) \n(CALM2), mRNA \n 1 \nNM_080594 \nHomo sapiens RNA binding protein S1, \nserine-rich domain (RNPS1), transcript \nvariant 2, mRNA \n 1 \nNM_020378 \nHomo sapiens K562 cell-derived \nleucine-zipper-like protein 1 (KLP1), \nmRNA \n 1 \n \ncontinuação \n \n continua \n 65\n\nNM_153280 \nHomo sapiens ubiquitin-activating \nenzyme E1 (A1S9T and BN75 \ntemperature sensitivity complementing) \n(UBE1), transcript variant 2, mRNA \n 1 \nNM_033161 Homo sapiens surfeit 4 (SURF4), \nmRNA \n 1 \nNM_198335 Homo sapiens glucosidase, alpha; \nneutral AB (GANAB), mRNA \n 2 \nNM_006801 \nHomo sapiens KDEL (Lys-Asp-Glu-\nLeu) endoplasmic reticulum protein \nretention receptor 1 (KDELR1), mRNA \n 1 \nNM_001349 \nHomo sapiens aspartyl-tRNA \nsynthetase (DARS), mRNA \n 1 \nNM_002567 \nHomo sapiens prosta tic binding protein \n(PBP), mRNA \n 4 \nNM_004356 \nHomo sapiens CD81 antigen (target of \nantiproliferative antibody 1) (CD81), \nmRNA \n 2 \nNM_005576 \nHomo sapiens lysyl oxidase-like 1 \n(LOXL1), mRNA \n 1 \nNM_019111 \nHomo sapiens major histocompatibility \ncomplex, class II, DR alpha (HLA-\nDRA), mRNA \n 1 \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 66\n\nNM_080546 \nHomo sapiens CDW92 antigen \n(CDW92), mRNA \n 1 \nNM_000733 \nHomo sapiens CD3E antigen, epsilon \npolypeptide (TiT3 complex) (CD3E), \nmRNA \n 1 \nXM_932180 \nPREDICTED: Homo sapiens \nhypothetical protein LOC644424 \n(LOC644424), mRNA \n1  \nNM_031157 \nHomo sapiens heterogeneous nuclear \nribonucleoprotein A1 (HNRPA1), \ntranscript variant 2, mRNA \n1  \nXM_498569 \nPREDICTED: Homo sapiens \nhypothetical gene supported by \nAY338954 (LOC440155), mRNA \n1  \nNM_001009570 \nHomo sapiens chaperonin containing \nTCP1, subunit 7 (eta) (CCT7), \ntranscript variant 2, mRNA \n 1 \nNM_001428 \nHomo sapiens enolase 1, (alpha) \n(ENO1), mRNA \n 1 \nNM_020320 \nHomo sapiens arginyl-tRNA \nsynthetase-like (RARSL), mRNA \n 1 \nNM_001614 \nHomo sapiens actin, gamma 1 \n(ACTG1), mRNA \n 1 \n \ncontinuação \n \n continua \n 67\n\nNM_003164 \nHomo sapiens syntaxin 5A (STX5A), \nmRNA \n 1 \nXM_935538 \nPREDICTED: Homo sapiens similar to \npostmeiotic segregation increased 2-like \n2 (LOC442573), mRNA \n1  \nNM_013234 \nHomo sapiens eukaryotic translation \ninitiation factor 3, subunit 12 \n(EIF3S12), mRNA \n 1 \nNM_005762 \nHomo sapiens tripartite motif-\ncontaining 28 (TRIM28), mRNA \n 3 \nNM_014042 \nHomo sapiens DKFZP564M082 protein \n(DKFZP564M082), mRNA \n 1 \nXM_928302 \nPREDICTED: Homo sapiens \nhypothetical protein LOC643817 \n(LOC643817), mRNA \n2  \nXM_496061 \nPREDICTED: Homo sapiens similar to \nFLJ44796 protein (LOC440264), \nmRNA \n7 1 \nNM_004568 \nHomo sapiens serine (or cysteine) \nproteinase inhibitor, clade B \n(ovalbumin), member 6 (SERPINB6), \nmRNA \n 1 \n \n \ncontinuação \n \n continua \n 68\n\nNM_002166 \nHomo sapiens inhibitor of DNA binding \n2, dominant negative helix-loop-helix \nprotein (ID2), mRNA \n 2 \nNM_021129 \nHomo sapiens pyrophosphatase \n(inorganic) (PP), mRNA \n 1 \nNM_003064 \nHomo sapiens secretory leukocyte \nprotease inhibitor (antileukoproteinase) \n(SLPI), mRNA \n 8 \nNM_021005 \nHomo sapiens nuclear receptor \nsubfamily 2, group F, member 2 \n(NR2F2), mRNA \n 2 \nNM_006585 \nHomo sapiens chaperonin containing \nTCP1, subunit 8 (theta) (CCT8), mRNA \n 1 \nTotal de seqüências de referência 65 317 \nTOTAL DE COLÔNIAS ANALISADAS 524 537 \n 69\n\n \n \nEntre as seqüências RefSeq, referentes a genes bem caracterizados na literatura, \nobtivemos um total de 31 seqüências diferentes na biblioteca RHENDI e 135 na RHENDW. \nAs classes levedura, bactéria e outros (v ide ANEXO A) foram consideradas como \ncontaminantes das reações. Já as classes m itocondrial, ribossômica, ESTs e Unigene não \nforam analisadas neste estudo (ANEXO B). \n \nIV. 2. GENES SELECIONADOS \n \nOs genes selecionados para validação dos dados de expressão gênica foram: SPARC \n(secreted protein, acidic, cysteine-rich ); SSAT ( spermidine/spermine N1-acetyltransferase ); \nHTRA1 [(high temperature requirement factor A1 ) serine peptidase 1 ] e LOXL1  ( lysyl \noxidase-like 1). \n \nIV. 3. RT-PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL \n \nAs tabelas II, III, IV e V mostram os valores de RQ ( Relative Quantification), referentes \nàs expressões dos genes selecionados, em cada amostra, obtidos pela RT-PCR quantitativa em \ntempo real. \n \nTabela II: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão \nendometriótica para o gene SPARC \nSPARC \n \nENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA \n \n 70\n\nAMOSTRA RQ AMOSTRA RQ \n11 0,63 O11 0,65 \n3.2 0,85 O3 0,98 \n6 0,88 P6 1,10 \n2 0,92 O10.2 1,32 \n5 1,24 O9 1,32 \n12 1,31 P10 () 1,41 \n4 1,39 O6 1,83 \n9 1,97 P1 2,32 \n8 2,08 P3 3,02 \n1 2,25 P8 4,01 \n7 3,95 P7 6,21 \n \nMédia 1,59 Média 2,20 \nDesvio padrão 0,95 Desvio padrão 1,66 \n \n \n \n \n \n \n \nTabela III: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão \nendometriótica para o gene SSAT \nSSAT \n \nENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA \n \nAMOSTRA RQ AMOSTRA RQ \n4 0,44 O10.2 0,18 \n1 0,64 O3 0,30 \n2 0,65 O9 0,37 \n7 0,65 O11 0,56 \n3.2 0,96 O6 0,79 \n9 1,17 P6 0,99 \n5 1,44 P10() 1,12 \n12 2,38 P1 1,16 \n6 2,45 P3 1,38 \n8 4,50 P8 1,50 \n11 8,44 P7 2,11 \n \nMédia 2,16 Média 0,95 \nDesvio padrão 2,40 Desvio padrão 0,59 \n \n \n 71\n\nTabela IV: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão \nendometriótica para o gene HTRA1 \nGene HTRA1 \n \nENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA \n \nAMOSTRA RQ AMOSTRA RQ \n11 0,55 O11 0,79 \n2 0,98 P6() 0,87 \n3.2 1,55 P10(2) 1,68 \n6 2,02 P3 4,77 \n5 2,33 P1 5,87 \n4 2,69 P8 6,09 \n9 3,06 P7 6,52 \n1 4,23 O3 10,96 \n7 4,42 O10.2 11,66 \n12 5,40 O9 12,59 \n8 5,50 O6 15,70 \n \nMédia 2,97 Média 7,04 \nDesvio padrão 1,71 Desvio padrão 5,06 \n \nTabela V: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e \nlesão endometriótica para o gene LOXL1 \nGene LOXL1 \n \nENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA \n \nAMOSTRA RQ AMOSTRA RQ \n1 1,12 O11 1,58 \n11 2,18 P1() 5,097 \n6 2,36 O3 5,62 \n4 2,59 P6()  6,87 \n2 2,62 P3 7,47 \n5 2,63 P10() 9,05 \n3.2 3,11 P7() 9,35 \n9 3,38 O10.2 10,96 \n12 3,93 O9 11,03 \n8 4,98 O6 12,84 \n7 11,51 P8() 36,76 \n \nMédia 3,67 Média 10,60 \nDesvio padrão 2,78 Desvio padrão 9,24 \n \nIV. 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA \n 72\n\n \nO teste da soma de postos de Wilcoxon mostrou que os genes SSAT e SPARC  não \napresentaram diferença signifi cativa de expressão entre os grupos de mulheres com e sem \nendometriose, enquanto que os genes HTRA1 e LOXL1  apresentaram diferença quanto a sua \nexpressão nos dois grupos. \nPara o gene HTRA1, foi obtida área abaixo da curva ROC de 0,75, mostrando \nsensibilidade de 63,6% e especificidade de 100% para separação entre os grupos de mulheres \ncom e sem endometriose. Para o gene LOXL1, a área abaixo da curva ROC foi de 0,85, \ndeterminando sensibilidade e especificidade de 90,9% para distinçã o entre os grupos. O \ndiagrama de pontos interativos mostra valor de corte de RQ do gene HTRA1 de 5,5 e de 5,0 \npara o gene LOXL1. As figuras 4 e 5 representam o diag rama de pontos interativos para os \ngenes HTRA1 e LOXL1, respectivamente. \n \n \nFigura 4: Diagrama de pontos interativos ( interactive dot) para o gene HTRA1 obtido a partir \ndo software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os \npontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres \nsem endometriose (representados no eixo hor izontal como “Normal=0”) e nas amostras do \n 73\n\ngrupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Endometriose=1”). \nA barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos grupos. \n \n 74\n\n \n \nFigura 5: Diagrama de pontos interativos ( interactive dot) para o gene LOXL1 obtido a partir \ndo software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os \npontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres \nsem endometriose (representados no eixo hor izontal como “Normal=0”) e nas amostras do \ngrupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Endometriose=1”). \nA barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos dois grupos. \n \n \n 75\n\nV. DISCUSSÃO \n \nA confecção de biblioteca subtrativa é aplicad a com sucesso para clonar seqüências de \nRNA mensageiro mais abundantes em uma dete rminada amostra, quand o comparada à outra \n(Cho & Park, 1998). A técnica de hibridação subtrativa rápida ( RaSH) identifica genes \ndiferencialmente expressos, incluindo seqüênc ias descritas e não descritas nos bancos de \ndados disponíveis (Jiang et al., 2000). Uma das vantagens da RaSH sobre as demais técnicas é \nque ela elimina vários passos de subtraçã o e amplificação, fazendo com que a metodologia \ntenha menor complexidade e seja mais rápi da e econômica. Além disso, é efetiva para \nobtenção da fração tester-tester da reação e para reduzir os backgrounds, gerando resultados \nconfiáveis (Jiang et al., 2000; Boukerche et al., 2004). \n No entanto, os métodos baseados em hibridação subtrativa possuem certas limitações, \npois nem sempre todas as seqüê ncias de cDNA comuns entre os grupos são completamente \nremovidas, levando a alguns resultados falso-positivos (Hu et al., 2006). O sucesso da técnica \nrequer remoção efetiva dos híbridos tester-driver para assegurar boa eficiência da reação, a \nqual pode ser influenciada por vários fatores,  como concentrações de DNA e sal, além da \nquantidade de tester-driver gerada (Cho & Park, 1998). Dessa maneira, deve-se estabelecer \numa boa metodologia para validação dos result ados. A RT-PCR quantitativa em tempo real é \nconsiderada a metodologia padrão para quantif icação da expressão gênica, pois consegue \nmedir desde grandes até quantidades muito pequenas de transcritos, mostrando alta \nsensibilidade além de alta especificidade quando comparadas a outras técnicas, como, por \nexemplo, Northern blot (Goodsaid et al., 2003). \nEm nosso trabalho, as bibl iotecas RHENDI e RHENDW fo ram geradas a partir da \nsubtração de moléculas de c DNA entre os grupos de mulheres com e sem endometriose. \nConsideramos que o conjunto de cDNAs presente s em uma biblioteca são referentes a genes \n 76\n\nsuperexpressos no grupo tester em relação ao grupo driver, onde esses genes foram menos \nexpressos. \nAs seqüências selecionadas como candidatas para validação por RT-PCR quantitativa em \ntempo real foram referentes aos genes HTRA1, LOXL1, SPARC e SSAT , os quais \napresentaram baixa expressão no grupo de mulheres com endometriose. \n \nV. 1. HTRA1 - HtrA (high temperature requirement factor A1) serine peptidase 1 \n \nO gene HTRA1, conhecido também como L56, HtrA, ORF480 e PRSS11, codifica uma \nenzima secretada pertencente à família das serino-proteases, altamente conservada em várias \nespécies (GeneID 5654; OMIM 602194). A alta expressão desta proteína inibe a proliferação \ncelular in vivo e in vitro . Além disso, o locus 10q26, onde se encontra o gene, está sujeito à \nperda de heterozigosidade e in ativação epigenética, sugeri ndo assim função de supressor \ntumoral para o mesmo (Baldi et al., 2002; Chien et al., 2004). Alguns trabalhos confirmaram \nessa hipótese, mostrando que sua baixa expressã o está relacionada a certos tipos de câncer, \ncomo o endometrial, além de estar fortemente  associado à transformação maligna e metástase \nde câncer ovariano e melanoma maligno (Bowden et al. , 2006; Tsuchiya et al. , 2005). A \nobservação de que ocorre regulação hepática da transcrição de HTRA1 entre a fase fetal e pós-\nnatal propõe que o gene participa do contro le do crescimento celular não apenas em \nneoplasias, como também de proc essos fisiológicos normais (Nagata et al., 2003). Outro fato \nimportante é que a proteína HTRA1 é produzida em quantidade proeminente pelo endométrio \nna fase proliferativa do ciclo menstrual e, por  isso, sugere-se que sua expressão possa ser \nimportante na preparação endometrial para a implantação embrionária (Bowden et al., 2006; \nDe Luca et al., 2003). \n 77\n\nSelecionamos este gene para validação considerando que estava menos expresso no grupo \nde mulheres com endometriose, segundo dados obtidos pela RaSH, sendo que sua baixa \nexpressão tem sido relacionada a neoplasias co mumente associadas à doença, como câncer \novariano e endometrial. Adicionalmente, a pr oteína codificada por ele, quando altamente \nexpressa, provoca inibição do crescimento celular  e, dessa forma, a baixa expressão geraria \nambiente propício para que as células endomet riais se proliferassem, produzindo lesões. \nPonderamos também o fato de que a baixa expressão desse gene na fase proliferativa do ciclo \nmenstrual poderia causar alteração da rece ptividade endometrial durante a fase de \nimplantação do embrião, prejudicando, assim, a função reprodutiva de pacientes com \nendometriose. \nTodavia, quando executamos a RT-PCR quantita tiva em tempo real, a média de RQ deste \ngene para mulheres com endometriose foi de 7,04, enquanto que para as mulheres sem \nendometriose foi de 2,97, contrariando os dados  obtidos pela RaSH. Tendo em vista que a \nRT-PCR quantitativa em tempo r eal é a técnica padrão para determinação dos  níveis de \nexpressão gênica, consideramos esse resultado como verdadeiro. \nA proteína HTRA1 também interage com al guns fatores reguladores  da proliferação \ncelular, como IGFs e TGF- β1 (Zumbrunn & Trueb, 1996; Tocharus et al. , 2004). As IGFs \n(Insuline Growth Factors) atuam em diversos tecidos, estimulando divisão e diferenciação \ncelulares. Sua atividade é modulada por molécula s inibidoras, as IGFBPs, que se ligam às \nIGFs e controlam a disponibilidade desses fa tores de crescimento (Clemmons, 1998). No \nentanto, existem enzimas, como HTRA1, que podem clivar essas IGFBPs e dessa maneira \naumentar os níveis de IGFs bioa tivas (Zumbrunn & Trueb, 1996; Ferry et al., 1999; Hou et \nal., 2005). Uma vez livres para agirem, as IGFs  promoveriam crescime nto celular, efeito \ncompatível com os achados científicos em lesões endometrióticas. \n 78\n\nJá TGF-β1 é um regulador negativo da proliferação celular, cuja expressão está reduzida \nem células de endométrio tópico de paciente s com endometriose, sugerindo que a diminuição \ndesse fator possa favorecer a proliferação dessas células (Johnson et al. 2005). Foi proposto \nque HTRA1 se liga a TGF- β1, inibindo as vias de sinaliza ção dessa molécula (Kresse & \nSchönherr, 2001; Oka et al., 2004). Desse modo a maior expre ssão de HTRA1 neutralizaria a \nação de maior quantidade de moléculas TGF- β1, propiciando maior multiplicação de células \nendometriais ectópicas. \nAlém disso, as mulheres apresentam normalm ente alta expressão de HTRA1 na fase \nproliferativa do ciclo reprodutivo (De Luca et al., 2003). Visto que estudamos mulheres com e \nsem endometriose na mesma fase do ciclo, podemos sugerir que o aumento ainda maior da \nexpressão do gene HTRA1 em mulheres com a enfermidade causaria conseqüências \nreprodutivas graves para elas, como falhas de implantação. \nQuanto à análise da curva ROC, HTRA1 mostrou especificida de alta, porém sua \nsensibilidade, de 63,6%, foi ba ixa para discriminar mulheres  com daquelas sem a doença. \nProvavelmente os níveis de expressão de HTRA1, muito discrepantes entre as pacientes, \nprovocou grande aumento do desvio-padrão, contribuindo para esse resultado. \nAnalisando o gráfico de pontos interativos, podemos observar que para valores de RQ \nabaixo de 5,5, foi possível separar mulheres se m endometriose daquelas com endometriose, \napesar de duas amostras do grupo de mulheres  não afetadas pela doença apresentarem RQs \nmuito próximas a esse ponto de corte. Já no gr upo de mulheres afetadas, existe uma diferença \nmuito variável entre RQs. Quatro pacien tes desse grupo possuem RQs abaixo de 5,5, \napresentando, portanto,  expressão do gene HTRA1 igual à das mulheres não afetadas pela \nendometriose. Dessa forma, podemos afirmar que no grupo amostral estudado, pela análise da \nexpressão de HTRA1, não foi possível diferenciar todas as pacientes com endometriose. Como \na proteína HTRA1 interage com moléculas re guladoras do crescimento celular, estimulando-\n 79\n\no, podemos supor que, nessas quatro pacientes, a baixa expressão do gene que a codifica \ntenha conferido um potencial de crescimento menor que o das demais pacientes. Podemos \npresumir também que as 2 mulheres não afet adas pela endometriose com RQs de 5,40 e 5,50, \npor apresentarem expressão gênica de HTRA1  muito próximas ao padrão de expressão das \nafetadas, apresentavam células endometriais co m atividade proliferativa maior que as outras \nmulheres do seu grupo. Provavelmente isso acarretaria predisposição  dessas células em \ncrescer em locais ectópicos, como ovário e/ou peritônio e, assim, desenvolverem \nendometriose. Porém, somente o acompanhamento clínico a longo prazo dessas mulheres com \nconcomitante quantificação da expressão de HTRA1 poderia corroborar para a hipótese. \n \nV. 2. LOXL1 - lysyl oxidase-like 1 \n \nO gene LOXL1, também denominado LOL e LOXL, codifica uma amino oxidase essencial \nna biogênese de tecido conjuntivo por catalisar, na matriz extrac elular, o primeiro passo para \nformação de ligações covalentes cruzadas de fibras de colágeno e de elastina, necessárias para \nhomeostase de diversos tecido s, incluindo órgãos pélvicos femininos, principalmente durante \na gestação e parto (GeneID 4016; OMIM 153456; Kagan & Li, 2003; Liu et al., 2004). Wu et \nal., em 2007, descreveram genes hipermetilados, isto é, silenciados, em células cancerosas de \nbexiga humana, dentre os quais LOXL1  estava presente. Além disso, foi encontrada baixa \nexpressão do gene em câncer de próstata e carcinomas de células escamosas de cabeça e \npescoço, sugerindo ação supressora tumoral para ele (Ren et al., 1998; Rost et al. , 2003). Em \n2006, Flores e colaboradores, usaram microarrays, identificando baixa quantidade de \ntranscritos de LOXL1 a partir de RNAs mensageiros isolados de linfócitos de sangue \nperiférico de pacientes com endometriose quando comparadas a pacientes sem a doença, \nsugerindo ser esse gene candidato a marcador sanguíneo para a doença. \n 80\n\nO gene LOXL1 foi selecionado para validação uma vez que foi menos expresso no grupo \nde mulheres com endometriose, segundo dados obtidos pela RaSH, o que é coerente com o \nresultado do trabalho que analisou linfócitos de sangue periférico de mulheres afetadas pela \ndoença. Também consideramos o fato de que se trata de um gene candidato a supressor \ntumoral e, assim, sua baixa expressão poderi a aumentar a taxa de multiplicação celular, \npermitindo estabelecimento da doença. Entretan to, analisando os resultados de expressão \nobtidos pela RT-PCR quantitativa em tempo real, observamos maior média dos níveis de \nexpressão de LOXL1 em mulheres com a doença (10,60) em comparação com mulheres não \nafetadas (3,67), contrapondo o dado obtido pela RaSH. \nQuanto à função do gene, sugerimos que um aumento da expressão poderia aumentar a \nbiogênese de tecido conjuntivo, levando ao aparecimento de lesões endometrióticas. Assim, a \nalta expressão de LOXL1 poderia contribuir para o estabelecimento das células endometriais \nfora da cavidade uterina por permitir que elas mantenham-se ligadas, em contato, com outros \ntecidos. \nEm relação ao valor diagnóstico, consideramos que os dados obtidos em nosso trabalho \nforam mais fidedignos que os descritos por Fl ores e colaboradores (2006), que pesquisaram \nalterações de expressão gêni ca no sangue periférico de paci entes com e sem endometriose. \nApesar de se tratar de uma doença de caráter inflamatório e as células decorrentes desse \nprocesso poderem circular no sangue, a met odologia executada envolve u pesquisa de genes \nnão específicos do tecido endometriótico. Logo, a investigação da expressão de genes sem \numa pesquisa prévia referente ao  local da lesão não permite a obtenção de dados consistentes \npara afirmar que LOXL1 tem baixa expressão em portadoras da doença \nLevando em conta que a endometriose possui características similares a processos \nneoplásicos, outro fato interessante é que no câncer de mama metastático, LOXL1 encontra-se \n 81\n\naltamente expresso, o que está de acordo com nossos resultados obtidos pela RT-PCR \nquantitativa em tempo real para as mulheres com endometriose (Wu et al., 2007). \nEm relação à análise da curva ROC, LOXL1 apresentou especificidade e sensibilidade \naltas (90,9%), o que pode ser co nsiderado bom parâmetro para distinção entre mulheres \nafetadas e não afetadas pela endometriose , permitindo-nos sugerir que o gene pode ser \ncandidato a marcador da doença. \nExaminando o gráfico de pontos interativos, observamos que o valor de corte de RQ de \n5,0 pode ser considerado eficiente para separação entre as mulheres com e sem endometriose. \nNo entanto, no grupo afetado, uma paciente mostrou RQ abaixo de 5,0, em conformidade com \nas RQs da maioria das mulheres sem a doença, e no grupo não afetado, uma mulher teve valor \nde RQ acima do ponto de corte, considerad o como pertencente à maioria do grupo das \nmulheres com endometriose analisadas nest e estudo. Além disso, no grupo I, uma paciente \napresentou valor de 5,09 e no grupo II, uma mulher  apresentou valor de  4,98, valores muito \npróximos ao de corte. Esses dados demonstrar am que 9,09% das mulheres (2 em 22) não \nforam discriminadas com sucesso entre os dois grupos e a mesma porcentagem incluiu \nmulheres com RQs próximas ao limite de separação entre os dois grupos.  \nParalelamente, houve maior dispersão de RQ no grupo de mulheres com endometriose em \nrelação aos valores das RQs de mulheres sem a doença, sendo que um dos dados obtidos foi \nmuito alto em relação à média (RQ = 36,76). A alta expressão de LOXL1 pode significar que \nessa paciente possa ser mais resistente ao desenvolvimento da doença em relação às outras \npacientes estudadas, uma vez que nela seria nece ssária expressão muito alta do gene para que \nas lesões se estabelecessem. \nTorna-se necessário aumentar o número de mulheres em estudos posteriores, visando \navaliar se os níveis de  expressão de LOXL1 podem ser eficazes para a separação de mulheres \nafetadas das não afetadas pela doença. \n 82\n\nSe os resultados de nosso estudo estiverem em  concordância com a distribuição real das \nRQs de LOXL1 da população de mulheres com e sem endometriose, para a amostra 7 do \ngrupo não afetado (RQ = 11,50) em que o gene LOXL1 está se expressando igual  ao grupo de \nmulheres afetadas pela endometriose, podemos especular que essa mulher pode não ter focos \nendometrióticos visíveis, mas é portadora da  doença. Também podemos hipotetizar que a \npaciente com expressão de LOXL1 igual à média das mulheres sem endometriose, apesar de \nser afetada, possui células endom etriais cujo estabelecimento em  locais ectópicos seja mais \nfácil de ocorrer, já que nesta bastaria baixa expressão do gene em questão para \ndesenvolvimento da doença. \n \nV. 3. SPARC - secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin) \n \nO gene SPARC, ou ON, codifica uma glicoproteína secretada multifuncional que está \nassociada à matriz extracelular (MEC) onde se liga a um grande número de moléculas e \nexerce ação antiadesiva, o que inclui ha bilidade em desfazer adesões locais (Hudson et al., \n2005). Além disso, SPARC atua estimulando alterações no formato celular, inibindo a \nprogressão do ciclo celular, influenciando a síntese de elementos da MEC e modulando \ninterações célula-matriz (GeneID 6678; OMIM 182120). Também foi demonstrado que \nSPARC reforça o sistema de sinalização de TGF- β, citocina responsável, dentre outras \nfunções, pela ativação da síntese de component es da MEC, como colágeno, pela supressão da \nexpressão de metaloproteinases de matriz e indução de expressão de inibidores teciduais \ndessas enzimas (Schiemann et al., 2003; Poncelet et al., 1998). \nEm relação ao câncer, em células de carcinoma ovariano humano foi encontrada baixa \nexpressão de SPARC e nessas células a expressão dessa molécula induz apoptose (Mok et al., \n1996; Yiu et al. , 2001). Esses resultados fo ram corroborados pelo fato  de que, em ratos, na \n 83\n\nausência da expressão desse gene ocorria a formação de ambiente permissivo para o \ncrescimento e invasão tumorais de células ovarianas (Said & Motamed, 2005). Além do mais, \nem ratos com mutação nula para SPARC e inoculados com células de câncer pancreático ou \npulmonar, foram encontradas alterações na pr odução e organização de componentes da MEC \nno interior e na cápsula dos implantes tumorais , gerando menor restriçã o para a progressão \ntumoral e metástase (Brekken et al., 2003). \nOutra informação interessante é o fato de que  SPARC possui ação antiangiogênica por se \nligar diretamente a VEGF, inibindo a prolifera ção celular endotelial e por bloquear o efeito \nmitogênico de bFGF, um potente estimulador da angiogênese (Chlenski et al., 2006). \nDevido ao fato de SPARC ter sido menos expresso no grupo das pacientes com \nendometriose, a partir dos dados obtidos pela RaSH, selecionamos esse gene para validação, \numa vez que a redução de sua expressão pode gerar proliferação celular, angiogênese e \nredução de apoptose, processos importantes para estabelecimento de lesões endometrióticas. \nOutrossim, colabora para o desenvolvimento da doença, processos semelhantes aos que \nocorrem durante o aparecimento e desenvol vimento de tumores, tais como adesão, \ncrescimento e invasão. Além diss o, quanto menor a expressão de SPARC, menor interação \ncom TGF-β, regulador negativo da proliferação celular, o que favorece a formação de lesões. \nOutra conseqüência dessa baixa interação é o aumento da produção de enzimas proteolíticas \nda MEC, o que facilita a inva são tecidual e, conseqüentemente  permite estabelecimento das \ncélulas endometriais em local ectópico. Em  nossa amostra, não detectamos diferença \nsignificativa nos níveis de expressão de SPARC entre os grupos de mulheres com e sem \nendometriose, por meio da RT-PCR quantitativa  em tempo real. Esse resultado sugere que \nprovavelmente esse gene não represente a cla sse de moléculas com expressão alterada que \natuam no desenvolvimento da endometriose. A ssim, acreditamos que devam existir outros \nelementos que desempenhem funções semelhantes a SPARC nos processos dos quais essa \n 84\n\nmolécula participa, tais como adesão, invasã o, angiogênese e resistência à apoptose, e que \npossivelmente estejam relacionados ao estabelecimento da doença. \n \n \nV. 4. SSAT - spermidine/spermine N1-acetyltransferase \n \nO gene SSAT, cujas aliases são SAT, DC21 e KFSD, codifica a enzima \nspermidina/spermina N1-acetiltransferase, que  promove N(1)-acetilaçã o de spermidina e \nspermina na via catabólica de poliaminas, que são moléculas requeridas para o crescimento e \ndiferenciação normais da célula (GeneID 6303; OMIM 313020; Huang et al. , 2005). Em \nEscherichia coli , a indução de SSAT converte rapidamente espermidina em N1-\nacetilespermidina, resultando em redução da  taxa de crescime nto celular (Parry et al., 1995). \nEm 2005, Pledgie e colaboradores ob servaram efeito antiproliferativo de células de câncer de \nmama quando a expressão de SSAT foi induzida. Além disso, nesse mesmo trabalho foi \nelaborada a hipótese de que outro produto decorrente da catálise de poliaminas, o peróxido de \nhidrogênio (H 2O2), espécie reativa conhecida por pr ovocar danos no DNA, teria efeito \ninibitório no crescimento celular. Dessa maneir a, pode-se concluir que a baixa expressão de \nSSAT promoveria redução da catálise de poliaminas, e conseqüente diminuição da produção \nde peróxido de hidrogênio, aumentando, assim, a taxa de proliferação celular. \nOs dados acima concordam com os obtidos em nosso trabalho por meio da RaSH, já que a \nbaixa expressão de SSAT em mulheres com endometriose poderia aumentar a quantidade de \npoliaminas ativas no interior de células endometrióticas, levando-as a uma maior proliferação. \nAdicionalmente, nesse caso, a quantidade de H 2O2 estaria reduzida, o que impediria que a \nmultiplicação dessas células fosse prejudicada. Por esses motivos selecionamos também SSAT \npara validação. \n 85\n\nNão foi observada, por RT-PCR quantitativa em tempo real , diferença significativa na \nexpressão de SSAT  entre os grupos de afetadas e não af etadas pela endometriose, sugerindo \nque essa molécula não participe do processo re sponsável pelo início e manutenção da doença. \nAssim, acreditamos que outras moléculas particip am de vias relacionadas à proliferação \ncelular nos mecanismos que levam ao desencadeamento da endometriose. \n \n \nA partir da análise das seqüê ncias diferencialmente expressas entre as mulheres com e \nsem endometriose, podemos dizer que a grande ma ioria das seqüências de referência obtidas \nfoi identificada neste estudo pela primeira vez e que nossos resulta dos não confirmaram \nalguns dados publicados anteriormente sobre a expressão de genes específicos na doença. \nA biblioteca RHENDW identificou seqüências referentes aos genes das metaloproteinases \nMMP2 e MMP7, ambos descritos em publicações anteriores. As metaloproteinases são \nenzimas proteolíticas que atuam em conjunto co m seus inibidores, denominados TIMPs, para \nremodelamento e renovação da matriz extracelular (Yang et al. , 2004). A expressão \ndesregulada de qualquer uma dessas moléculas tem sido associada a doenças que envolvem \nfenômenos invasivos, como processos tumo rais e endometriose (Roughley & Lee, 1994; \nSillem et al., 1998). \nEm discordância com nossos dados, alguns trab alhos evidenciaram aumento de expressão \nde MMP2 tanto em tecido ectópico quanto t ópico de mulheres com diagnóstico de \nendometriose, quando comparada a mulheres não afetadas (Wenzl & Heinzl, 1998; Chung  et \nal., 2002). Entretanto, Sharpe-Timms (1997) descreveram altos níveis de expressão de MMP7 \nno endométrio tópico, mas expressão constitutiva desta metaloproteínase em lesões \nendometrióticas, durante o ciclo menstrual. \n 86\n\nDesta maneira, apesar de termos obtido result ados discordantes da literatura, acreditamos \nque a RaSH foi eficiente na identificação de transcri tos diferencialmente expressos entre as \namostras analisadas.  \nProva disso é a observação de que entre os dois grupos estudados, houve diferença \nsignificativa na expressão dos genes HTRA1 e LOXL1 , após validação por RT-PCR \nquantitativa em tempo real. Investigações fu turas envolvendo maior número de amostras \npodem confirmar nossos resultados em re lação ao aumento de expressão de HTRA1 e LOXL1 \nem pacientes com endometriose, quando comparadas a mulheres sem a doença, estabelecendo \nvalores de corte mais confiáveis para sepa ração desses dois grupos. Sugerimos que esses dois \ngenes possam estar envolvidos nos processo s biológicos de desenvolvimento da doença, \npodendo ser selecionados como marcadores moleculares para diagnóstico de endometriose. \n \n \n \n \n 87\n\nVI. CONCLUSÕES \n \n1) A técnica de RaSH foi eficaz na identificação de genes diferencialmente expressos \nno tecido endometrial de mulheres sem endome triose, em comparação a genes expressos em \nlesões endometrióticas de pacientes analisadas neste trabalho; \n \n2) Os genes HTRA1 e LOXL1 mostraram diferença sign ificativa entre o tecido \nendometrial tópico e ectópico, sugerindo possível envolvimento entre expressão aumentada \ndesses genes e desenvolvimento da endometriose; \n \n3) Os genes HTRA1 e LOXL1  podem ser considerados candidatos a marcadores \nmoleculares para o diagnóstico não invasivo de endometriose. \n \n4) Apesar de ter sido possí vel a identificação dos genes SSAT e SPARC , \ndiferencialmente expressos pela técnica de RaSH, os resultados obtidos  pela técnica de PCR \nem tempo real não confirmaram diferença de expressão desses genes nos dois grupos \nanalisados; \n \n \n \n \n 88\n\nVII. REFERÊNCIAS  \n \nArya, P & Shaw, R.  Endometriosis: Current thinking. 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Clinical Chemistry , v. 39(4), p. 561-77. \nErratum in: Clinical Chemistry, v. 39(8), p. 1589, 1993. \n \n \n \n 107\n\nANEXO A \nSeqüências consideradas contaminantes obtidas das bibliotecas RHENDI e RHENDW \n \n \nBactérias RHENDI RHENDW\nU00096 Escherichia coli K-12 MG1655 complete \ngenome 37 5 \nTotal 37 5 \nLeveduras RHENDI RHENDW\nT38386 T38386 EST103859 Saccharomyces cerevisiae \ncDNA 3' end. 1/95 \n 4 \nTotal 0 4 \n \nOutros RHENDI RHENDW\nZP_00377153 TonB-dependent receptor [Erythrobacter \nlitoralis HTCC2594] \n1  \nZP_00302656 \nCOG0346: Lactoylglutathione lyase and related \nlyases [Novosphingobium aromaticivorans \nDSM 12444] \n1  \nZP_00304057 \nCOG1506: Dipeptidyl \naminopeptidases/acylaminoacyl-peptidases \n[Novosphingobium aromaticivorans DSM \n12444] \n1  \nAAA36590 ORF1; putative 1  \nTotal 4 0 \nTotal de contaminantes 41 9 \n 108\n\nANEXO B \nSeqüências de RNA das categorias: mitocondrial, ribossômica, ESTs e Unigene \n \nMitocondrial RHENDI RHENDW\nJ01415 Human mitochondrion, complete genome 368 19 \nTotal 368 19 \n \nRibossômica RHENDI RHENDW\nU09953 gp|U09953|1323733|E3F957CA13F7BFEF \nribosomal protein L9 [Homo sapiens]  22 \nAB007158 gp|AB007158|3088342|E6A62203E15257C1 \nribosomal protein S23 [Homo sapiens] \n 1 \nM90054 gp|M90054|337580|E9F238D9F8CA0D67 \nribosomal protein L3 [Homo sapiens] \n 5 \nBC000802 tn|BC000802|AAH00802|E9CE3CBD59524F81 \nSimilar to ribosomal protein S9.[Homo sapiens] \n 2 \nBC000523 \ntn|BC000523|AAH00523|E0764D60A6DD576E \nSimilar to ribosomal protein S24.[Homo \nsapiens] \n 1 \nU14966 gp|U14966|550013|25F3BC2C6F674442 \nribosomal protein L5 [Homo sapiens] \n 1 \nAF348700 \ntn|AF348700|AAK31162|2FE469F736571002 \n(UBA52)Ubiquitin A-52 residue ribosomal \nprotein fusion product 1 (Fragment).[Homo \nsapiens] \n 5 \nX69391 gp|X69391|36138|3E209D02DFF365D9 \nribosomal protein L6 [Homo sapiens] \n 14 \nXM_371853 PREDICTED: Homo sapi ens similar to 60S \nribosomal protein L27a (LOC389435), mRNA  16 \nNM_000979 Homo sapiens ribosomal protein L18 (RPL18), \nmRNA \n 2 \nNM_001002 Homo sapiens ribosomal protein, large, P0 \n(RPLP0), transcript variant 1, mRNA \n 4 \nNM_001012 Homo sapiens ribosomal  protein S8 (RPS8), \nmRNA  2 \nNM_000661 Homo sapiens ribosomal protein L9 (RPL9), \nmRNA \n 3 \nNM_002952 Homo sapiens ribosomal  protein S2 (RPS2), \nmRNA  1 \nNM_000992 Homo sapiens ribosomal protein L29 (RPL29), \nmRNA \n 5 \nNM_006013 Homo sapiens ribosomal protein L10 (RPL10), \nmRNA \n 3 \nNM_022551 Homo sapiens ribosomal protein S18 (RPS18), \nmRNA \n 2 \ncontinua \n \n 109\n\ncontinuação    \nNM_000998 Homo sapiens ribosomal protein L37a \n(RPL37A), mRNA  4 \nNM_007104 Homo sapiens ribosomal protein L10a \n(RPL10A), mRNA \n 1 \nNM_000970 Homo sapiens ribosomal protein L6 (RPL6), \nmRNA \n 4 \nNM_000991 Homo sapiens ribosomal protein L28 (RPL28), \nmRNA \n 2 \nNM_033022 Homo sapiens ribosomal protein S24 (RPS24), \ntranscript variant 1, mRNA \n 1 \nNM_001009 Homo sapiens ribosomal  protein S5 (RPS5), \nmRNA  13 \nNM_001007074 Homo sapiens ribosomal protein L32 (RPL32), \ntranscript variant 3, mRNA \n 1 \nNM_000981 Homo sapiens ribosomal protein L19 (RPL19), \nmRNA \n 6 \nNM_001021 Homo sapiens ribosomal protein S17 (RPS17), \nmRNA \n 47 \nNM_001015 Homo sapiens ribosomal protein S11 (RPS11), \nmRNA \n 11 \nTotal 0 179 \n \nESTs RHENDI RHENDW\nBE078764 QV2-BT0619-160400-144-f07_1 BT0619 \nHomo sapiens cDNA, mRNA sequence \n 1 \nCN288604 17000583181938 GRN_PRENEU Homo \nsapiens cDNA 5', mRNA sequence \n1  \nAW063430 \nTN0915 KRIBB Human TN intrathymic T-cell \ncDNA library Homo sapiens cDNA 3', mRNA \nsequence \n2  \nAW023412 \ndf54e06.y1 Morton Fetal Cochlea Homo \nsapiens cDNA clone IMAGE:2487251 5', \nmRNA sequence \n1  \nAW166933 \nxg68e10.x1 NCI_CGAP_Ut4 Homo sapiens \ncDNA clone IMAGE:2633514 3' similar to \nTR:P97365 P97365 ZINC FINGER PROTEIN \n64 ;, mRNA sequence \n1  \nDA513180 DA513180 FEBRA2 Homo sapiens cDNA \nclone FEBRA2000391 5', mRNA sequence \n1  \nBF979590 \n602288061F1 NIH_MGC_97 Homo sapiens \ncDNA clone IMAGE:4373847 5', mRNA \nsequence \n1  \nAU120065 AU120065 HEMBA1 Homo sapiens cDNA \nclone HEMBA1007256 5', mRNA sequence \n1  \n \n \n continua \n 110\n\n \ncontinuação \nCF597202 \nAGENCOURT_15657637 NICHD_Hs_Ov1 \nHomo sapiens cDNA clone IMAGE:30705289 \n5', mRNA sequence \n5  \nBX402096 \nBX402096 Homo sapiens \nNEUROBLASTOMA COT 25-NORMALIZED \nHomo sapiens cDNA clone CS0DC012YB18 3-\nPRIME, mRNA sequence \n2  \nCB999662 \nAGENCOURT_13652348 NIH_MGC_186 \nHomo sapiens cDNA clone IMAGE:30323605 \n5', mRNA sequence \n1  \nAA253227 \nzr76b03.s1 Soares_NhHMPu_S1 Homo sapiens \ncDNA clone IMAGE:669293 3', mRNA \nsequence \n 1 \nCR737055 \nCR737055 Soares_pregnant_uterus_NbHPU \nHomo sapiens cDNA clone \nIMAGp998B211198 ; IMAGE:502196 5', \nmRNA sequence \n 1 \nAA586724 \nnn67c06.s1 NCI_CGAP_Lar1 Homo sapiens \ncDNA clone IMAGE:1088938 3' similar to \ncontains Alu repetitive element;contains \nMER27.b2 MER27 repetitive element ;, mRNA \nsequence \n1  \nAI906423 RC-BT108-140399-075 BT108 Homo sapiens \ncDNA, mRNA sequence \n1  \nCN284794 17000531650825 GRN_ES Homo sapiens \ncDNA 5', mRNA sequence \n1  \nBU570422 \nAGENCOURT_10401461 NIH_MGC_82 \nHomo sapiens cDNA clone IMAGE:6618678 5', \nmRNA sequence \n1  \nAA174078 \nzp18g12.s1 Stratagene fetal retina 937202 \nHomo sapiens cDNA clone IMAGE:609862 3', \nmRNA sequence \n1  \nAA176858 \nzp10c01.r1 Stratagene fetal retina 937202 \nHomo sapiens cDNA clone IMAGE:609024 5' \nsimilar to contains Alu repetitive \nelement;contains element THR repetitive \nelement ;, mRNA sequence \n1  \nBE439881 HTM1-470F HTM1 Homo sapiens cDNA, \nmRNA sequence \n3  \nCV572711 \nod27h01.y1 Human keratoconus cornea, \nunamplified, (od/oe) Homo sapiens cDNA clone \nod27h01 5', mRNA sequence \n 1 \nDA160554 DA160554 BRAMY2 Homo sapiens cDNA \nclone BRAMY2020574 5', mRNA sequence 1  \n \n  continua\n \n 111\n\n \ncontinuação \nCV571660 \noe15f10.y1 Human keratoconus cornea, \nunamplified, (od/oe) Homo sapiens cDNA clone \noe15f10 5', mRNA sequence \n 2 \nBI463414 \n603204458F1 NIH_MGC_97 Homo sapiens \ncDNA clone IMAGE:5269982 5', mRNA \nsequence \n1  \nCX783776 \nHESC3_25_H02.g1_A036 NIH_MGC_260 \nHomo sapiens cDNA clone IMAGE:7478237 5', \nmRNA sequence \n 1 \nCV427484 RC6-FN0082-271000-021-E10 FN0082 Homo \nsapiens cDNA, mRNA sequence \n 1 \nDA627771 DA627771 KIDNE2 Homo sapiens cDNA \nclone KIDNE2008378 5', mRNA sequence \n1  \nTotal 28 8 \n \nUnigene RHENDI RHENDW\nAK131511 \ntgnl|UG|Hs#S19862974 Homo sapiens cDNA \nFLJ16729 fis, clone UTERU3017176 \n/cds=p(3512,3913) /gb=AK131511 \n/gi=47077535 /ug=Hs.544147 /len=3913 \n4  \nAK125512 \ntgnl|UG|Hs#S16887192 Homo sapiens cDNA \nFLJ43524 fis, clone PLACE5000297 \n/gb=AK125512 /gi=34531632 /ug=Hs.369042 \n/len=3591 \n2  \nDB275414 \ntgnl|UG|Hs#S29666869 DB275414 UTERU3 \nHomo sapiens cDNA clone UTERU3000431 5', \nmRNA sequence /clone=UTERU3000431 \n/clone_end=5' /gb=DB275414 /gi=83216722 \n/ug=Hs.586927 /len=570 \n1  \nAK024881 \ntgnl|UG|Hs#S2652760 Homo sapiens cDNA: \nFLJ21228 fis, clone COL00739, mRNA \nsequence /gb=AK024881 /gi=10437293 \n/ug=Hs.306716 /len=1869 \n1  \nBG818416 \ntgnl|UG|Hs#S3604358 602779974F2 \nNCI_CGAP_Brn67 Homo sapiens cDNA clone \nIMAGE:4915530 5', mRNA sequence \n/clone=IMAGE:4915530 /clone_end=5' \n/gb=BG818416 /gi=14166003 /ug=Hs.434023 \n/len=744 \n 1 \nAF370457 \ntgnl|UG|Hs#S15632048 Homo  sapiens ovarian \nepithelial carcinoma-related protein mRNA, \ncomplete cds /cds=p(3715,4461) /gb=AF370457 \n/gi=30314934 /ug=Hs.131226 /len=4737 \n1  \n \n \n \n \n \n \n continua\n 112\n\n \ncontinuação    \nCA313852 \ntgnl|UG|Hs#S6103412 UI-C F-FN0-afo-g-20-0-\nUI.s1 UI-CF-FN0 Homo sapiens cDNA clone \nUI-CF-FN0-afo-g-20-0-UI 3', mRNA sequence \n/clone=UI-CF-FN0-afo-g-20-0-UI \n/clone_end=3' /gb=CA313852 /gi=24531950 \n/ti=159720155 /ug=Hs.574529 /len=760 \n1  \nAK022877 \ntgnl|UG|Hs#S2650933 Homo  sapiens cDNA \nFLJ12815 fis, clone NT2RP2002546, mRNA \nsequence /gb=AK022877 /gi=10434526 \n/ug=Hs.49476 /len=2267 \n 1 \nBQ924623 \ntgnl|UG|Hs#S4693338 AGENCOURT_8821514 \nLupski_sciatic_nerve Homo sapiens cDNA \nclone IMAGE:6203471 5', mRNA sequence \n/clone=IMAGE:6203471 /clone_end=5' \n/gb=BQ924623 /gi=22339654 /ti=141988287 \n/ug=Hs.573780 /len=963 \n2  \nXM_496387 \ntgnl|UG|Hs#S21591497 PR EDICTED: Homo \nsapiens similar to tripartite motif-containing 43 \n(LOC440610), mRNA /cds=p(1,1701) \n/gb=XM_496387 /gi=51459269 /ug=Hs.497543 \n/len=1774 \n2  \nNM_014643 \ntgnl|UG|Hs#S2140692 KIAA0222 gene product \n[Homo sapiens], mRNA sequence \n/cds=(318,3809) /gb=NM_014643 /gi=7662009 \n/ug=Hs.48450 /len=6033 \n 1 \nNM_017737 \ntgnl|UG|Hs#S2293714 hypot hetical protein \nFLJ20275 [Homo sapiens], mRNA sequence \n/cds=(54,1046) /gb=NM_017737 /gi=8923248 \n/ug=Hs.239681 /len=3320 \n 1 \nN23897 \ntgnl|UG|Hs#S321444 yw 46h10.s1 Weizmann \nOlfactory Epithelium Homo sapiens cDNA \nclone IMAGE:255331 3', mRNA sequence \n/clone=IMAGE:255331 /clone_end=3' \n/gb=N23897 /gi=1138047 /ug=Hs.144186 \n/len=454 \n 1 \nBX641141 \ntgnl|UG|Hs#S16819731 Homo  sapiens mRNA; \ncDNA DKFZp686N19169 (from clone \nDKFZp686N19169) /gb=BX641141 \n/gi=34365471 /ug=Hs.449601 /len=3129 \n1  \ncontinua\n 113\n\ncontinuação \nBM141654 \ntgnl|UG|Hs#S3994991 if24c05.x1 Melton \nNormalized Human Islet 4 N4-HIS 1 Homo \nsapiens cDNA clone IMAGE:5677424 3', \nmRNA sequence /clone=IMAGE:5677424 \n/clone_end=3' /gb=BM141654 /gi=17151719 \n/ug=Hs.571918 /len=543 \n3  \nAL833386 \ntgnl|UG|Hs#S4622005 Homo sapiens mRNA; \ncDNA DKFZp667N0414 (from clone \nDKFZp667N0414), mRNA sequence \n/gb=AL833386 /gi=21734021 /ug=Hs.376868 \n/len=3219 \n1  \nXM_498786 PREDICTED: Homo sapiens LOC440642 \n(LOC440642), mRNA \n2  \nBG941030 \ntgnl|UG|Hs#S3751839 ax08h09.y1 Proliferating \nHuman Erythroid Cells (LCB:ax library) Homo \nsapiens cDNA clone ax08h09 random, mRNA \nsequence /clone=ax08h09 /gb=BG941030 \n/gi=14340402 /ug=Hs.574458 /len=272 \n1  \nTotal 22 5 \n \n \n \n \n \n \n 114","source_license":"CC0","license_restricted":false}