Perfil diferencial de microRNAs em células do Cummulus oophorus de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana

SILVA, LFI. Differential profile of microRNAs in Cumulus oophorus cells from infertile women with and without endometriosis submitted to ovarian stimulation. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. It is questioned a possible deleterious role of endometriosis on oocyte quality (OQ), which is largely conditioned by the function of cumulus cells. The role of these cells involve the expression of several molecules encoded by specific genes, regulated at transcription level, post-transcription and translation. The m icroRNAs act as transcriptional regulators of gene expression, thus any alteration in this mechanism can lead to abnormalities in oocyte development. In this way, we proposed an unpublished study of the microRNAs analysis in cumulus cells (CC) of infertile women with and without endometriosis, aiming to evidence the biological processes and pathways of action correlated with the presence of endometriosis in infertility and its possible impact on the acquisition of oocyte competence. Fifteen infertile patients (5 controls with tubal factor and/or male, 5 with stage I/II of endometriosis and 5 with stages III/ IV of endometriosis) submitted to the controlled ovarian stimulation ( EOC) for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) were included in the study. Immediately after oocyte uptake, CCs were isolated and stored for miRNA extrac tion. The 754 miRNAs profile was analyzed using the TaqMan®Arr ay Human MicroRNA Cards technique. Significant values were considered when p <0.05. The hsa-miR-218, hsa-miR-301 and hsa-miR-629-5p miRNAs were identified as less expressed in the patients with endometriosis I/II compared to controls. The miRNAs hsa -miR-1291, hsa -miR-187-3p, hsa -miR-30b, hsa -miR-532-3p and hsa -miR- 629-5p were identified as less expressed in patients with endometriosis III /IV compared to controls. Comparing the groups with endometriosis I/II and endometriosis III/IV, hsa-miR-187- 3p and hsa -miR-532-3p miRNAs were less expressed and hsa -let-7f-1# and hsa-miR-362-3p more expressed in patients with endometriosis III/IV. The enrichment analysis identified the genes regulated by the miRNAs and the respective metabolic pathways in which they are involved, suggesting apoptosis increase, decreased cell proliferation, alterations in the cell cycle control and energetic metabolism of the CCs of women with initial and advanced disease. The data point to changes in post -transcriptional regulation in CCs of infertile women with early and advanced endometriosis, which may affect processes and pathways essential for acquiring oocyte competence and resulting in infertility associated with the disease. This study contributes to the understanding of the etiopatho genesis of infertility related to endometriosis by identifying post-transcriptional mechanisms related to the deterioration of quality of gametes in these women.

Endometriosis; infertility; microRNAs, cumulus cells; gene expression profile. Lista de figuras Figura 1. MicroRNAs analisados no experimento TaqMan®Array Human MicroRNA Cards A... .................................................................................................................................. 35 Figura 2. MicroRNAs analisados no experimento de TaqMan®Array Human MicroRNA Cards B.. ................................................................................................................................... 36 Figura 3. Fluxograma do Estudo. ............................................................................................. 41 Lista de tabelas Tabela 1. Caracterização clínica, resposta à estimulação ovariana controlada e resultados de ICSI de pacientes inférteis controles, com endometriose pélvica I/II e endometriose III/IV ................................................................................................................................................. 42 Tabela 2: Perfil diferencial de microRNAs expressos em CCs de mulheres inférteis com endometriose ............................................................................................................................ 44 Tabela 3: Vias gênicas relacionadas a comparação controle versus endometriose estágios I/II reguladas pelos microRNAs desregulados (hsa-lef-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140-5p, hsa- miR-218 hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p) .............................................................................. 45 Tabela 4: Vias gênicas relacionadas a comparação controle versus endometriose estágios III/IV reguladas pelos microRNAs desregulados (hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa- miR-532-3p e hsa-miR-629-5p) .............................................................................................. 47 Tabela 5: Vias gênicas relacionadas a comparação controle versus endometriose estágios I/II e controle versus endometriose estágios III/IV reguladas pelos microRNAs desregulados (hsa - miR-1291, hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p) ........................................................................... 48 Tabela 6: Vias gênicas dos genes de interesse relacionadas a comparação endometriose estágios I/II versus endometriose estágios III/IV relacionados aos microRNAs (let-7f-1# e hsa-miR-362- 3p) ............................................................................................................................................ 49 Tabela 7: Descricão das vias metabólicas relacionadas aos genes-alvo dos microRNAs (miRNAs) ................................................................................................................................ 50 Lista de siglas ATP: Adenosina trifosfato C: controle CC: Células do cumulus cDNA: DNA complementar DAVID: Database for annotation, visualization and integrated Discovery DNA: Ácido desorirribonucleico EOC: Estimulação ovariana controlada ESHRE: Special Interest GRoup for Endometriosis and Endometrium FF: Fluído folicular FIV: Fertilização in vitro FMRP: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto FSH: Hormônio folículo estimulante GnRH: Hormônio liberador de gonadotrofina hCG: Gonadotrofina coriônica humana HCRP: Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto HIV: Vírus da imuno deficiência humana HTF: meio de cultura Human Tubal Fluid-HEPES IQ: Intervalo interquartil ICSI: Injeção intracitoplasmática de espermatozoides IMC: Índice de massa corporal KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes LUF: Síndrome do folículo não roto LH: Hormônio lteinizante miRNA: MicroRNA QO: Qualidade oocitária RNA: Ácido ribonucleico RNA-Seq: Sequenciamento de nova geração de RNA mensageiro ROS: Espécies reativas de oxigênio TRA: Técnicas de reprodução assistida USTV: Ultrassonografia transvaginal VLPS: Videolaparoscopia OC: oócito cumulus PCR - Reação em cadeia da polimerase cDNA : DNA complementar RA: Reprodução assistida RQ: nível de expressão 2-ΔΔCT (ou 2-Ct): dois - delta delta Ct Sumário 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 19 1.1. Endometriose ............................................................................................................. 19 1.2. Endometriose e infertilidade ...................................................................................... 19 1.3. Qualidade oocitária .................................................................................................... 21 1.4. Células da granulosa/cumulus e endometriose .......................................................... 21 1.5. Células do cumulus e expressão gênica ..................................................................... 23 1.6. MicroRNAs e CCs ..................................................................................................... 24 2. OBJETIVOS...................................................................................................................... 27 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS............................................................................................ 29 3.1. Desenho do estudo, contexto e considerações éticas ................................................. 29 3.2. Pacientes .................................................................................................................... 29 3.3. Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea ....................... 30 3.4. Captação Oocitária ..................................................................................................... 31 3.5. Células do Cummulus oophorus ................................................................................ 32 3.6. ICSI e avaliação da qualidade embrionária ............................................................... 32 3.7. Isolamento RNA total ................................................................................................ 33 3.8. Transcrição Reversa ................................................................................................... 33 3.9. Pré-Amplificação do cDNA ....................................................................................... 33 3.10. PCR em Tempo Real Quantitativo (qPCR) de microRNA .................................... 34 3.11. Análise estatística ................................................................................................... 37 3.12. Análise de enriquecimento ..................................................................................... 38 4. RESULTADOS ............................................................................................................. 40 4.1. Fluxograma do estudo ................................................................................................ 40 4.2. Caracterização dos grupos ......................................................................................... 42 4.2.1. Controle versus endometriose estágios I/II: ....................................................... 44 4.2.2. Controle versus endometriose estágios III/IV .................................................... 46 4.2.3. Micros comuns das comparações controle versus endometriose estágios I/II e controle verus endometriose estágios III/IV ..................................................................... 47 4.2.4. Endometriose estágios I/II versus endometriose estágios III/IV ........................ 48 5. DICUSSÃO ....................................................................................................................... 53 6. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 58 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 60 8. ANEXOS ........................................................................................................................... 71 Introdução 19 1. INTRODUÇÃO 1.1.Endometriose A endometriose é um distúrbio ginecológico dependente de estrogênio que afeta 6-10% das mulheres em idade reprodutiva ( Eskenazi, et al .,1997). Caracteriza -se por implante e crescimento de tecido endometrial (glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina, principalmente no peritôneo pélvico, ovários e septo reto -vaginal. Pode apresentar quadro clínico bastante diversificado, variando desde assintomático, até caracterizado pela presença de dor pélvica crônica, dismenorréia, dispareunia, sangramento uterino anormal e infertilidade (Giudice e Kao, 2004, Bulun, 2009). Tanto por seu impacto na saúde física e psicológica, como pelo impacto sócio -econômico diante dos custos para o seu diagnóstico e tratamento, a endometriose tem sido considerada um problema atual de saúde pública (Signori le e Baldi, 2010). A etiopatog enia da endometriose é ainda não completamente esclarecida, havendo diversas teorias e hipóteses tentando justificar a origem desta enigmática doença. De modo geral, há teorias propondo que os implantes se originam do endométrio uterino e outras sugerindo que os implantes surgem de tecidos extra -uterinos ( Burney e Giudice, 2012) . Intrinsicamente a estas teorias têm sido estudados fatores desencadeadores e potencial susceptibilidade genética, cujos papéis estão começando a ser delineados, apesar de, até o presente, estarem insuficientemente estabelecidos para confirmar uma relação causa -efeito no desenvolvimento da doença. 1.2. Endometriose e infertilidade Um aspecto muito interessante em portadoras de endometriose é a sua enigmática associação com a infertilidade. A doença está presente em 25 a 40% das mu lheres inférteis, sendo que 30 a 50% das portadoras de endometriose têm dificuldade em ter filhos (Holoch e Lessey, 2010). Até o presente momento, pouco é conhecido acerca dos mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade relacionada a esta doen ça, especialmente nos casos de endometriose mínima e leve, em que não se observam alterações significativas da anatomia pélvica. As técnicas de reprodução assistida (TRA) de alta complexidade têm sido cada vez mais aplicadas na abordagem terapêutica da infertilidade relacionada a esta afecção. A introdução da fertilização in vitro (FIV) no tratamento da infertilidade secundária à endometriose tornou -se 20 uma importante ferramenta para o estudo dos efeitos potenciais da endometriose em alguns estágios específ icos do processo reprodutivo, incluindo a foliculogênese, a fertilização, o desenvolvimento embrionário e a implantação. Se por um lado há evidências de associação entre endometriose e infertilidade, por outro, encontramos resultados controversos acerca d os resultados da FIV em pacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos e hipóteses nos últimos anos (García - Velasco e Arici, 1999; Garrido et al., 2000; Barnhart et al., 2002; Al-Fadhli et al., 2006; Opoien et al., 2012; Harb et al.; 2013, Barbosa et al., 2014; Senapati et al., 2016). Resultados conflitantes de alguns estudos têm sugerido a ocorrência de menores taxas de implantação e gestação em portadoras de endometriose, que poderiam ser decorrentes do comprometimento da qualidad e oocitária e, consequentemente, embrionária, de defeitos endometriais e/ou anomalias da interação entre o endométrio e o embrião (Barnhart et al., 2002; Al-Fadhli et al., 2006; Lin et al., 2012). Os achados conflitantes da presença de algumas alterações no endométrio eutópico de pacientes com endometriose, poderiam explicar, pelo menos em parte, distúrbios na interação entre o embrião e o endométrio, gerando anomalias no processo de implantação (García - Velasco e Arici, 1999; Simón, 2000). Contudo, o achado de taxas de implantação semelhantes em mulheres com e sem endometriose que receberam oócitos de doadoras saudáveis, tem reforçado o papel crucial da qualidade embrionária no comprometimento da implantação verificado neste grupo de pacientes (Brizek et al., 1995; Pellicer et al., 1995; Garrido et al., 2000; Pellicer et al., 2001; Katsoff et al., 2006). O comprometimento da qualidade embrionária pode ser induzido tanto por defeitos relacionados à foliculogênese e qualidade oocitária, como por eventos poster iores à fertilização. Neste contexto, alguns autores sugerem alterações na qualidade do oócito como responsáveis pelo comprometimento (Brizek et al. , 1995) ou completo bloqueio do desenvolvimento embrionário (Pellicer et al., 1995) em mulheres com endometriose quando comparadas a controles saudáveis, reforçando o papel da piora da qualidade oocitária nos resultados dos procedimentos de reprodução assistida nestas pacientes. Sabemos que embriões de boa qualidade (aqueles com habilidade para implantar e desenvolver adequadamente), originam-se de oócitos de boa qualidade, que, por sua vez, são provenientes de folículos com um adequado meio ambiente, condicionado tanto pelo conteúdo do fluido folicular, como pela influência das células vizinhas (Canipari et al., 2000; Gilchrist, 2011). 21 1.3. Qualidade oocitária A qualidade oocitária resulta de um complexo e sincronizado processo de desenvolvimento que tem duração de vários meses, desde a fase de folículo primordial até a fase de folículo pré -ovulatório (Pellicer et al .,1998; Garrido et al ., 2002). Os folículos que iniciam esse processo o fazem inicialmente de modo gonadotrofina -independente e, posteriormente, gonadotrofina-dependente. Nessa última fase, oócito, células da granulosa e FSH interagem de forma sinérgi ca e a multiplicação das células da granulosa e o modo como respondem ao FSH e, posteriormente, ao LH para a produção de esteróides intra-foliculares são eventos fundamentais desse processo (Speroff e Fritz, 2005). Sabe -se que existem gap- junctions entre as células da granulosa e entre essas e o oócito (Furger et al., 1996), havendo, assim, interação através de moléculas sinalizadoras como o GDF -9 (fator de diferenciação de crescimento 9) e o BMP -15 (proteína óssea morfogenética -15) (Albertini e Barrett, 20 03; Combelles et al ., 2004; Thomas e Vanderhyden, 2006; Hutt e Albertini, 2007). Existem evidências de que as células do cumulus ( CCs) contribuem para o processo de maturação citoplasmática oocitária (Tanghe et al., 2002) através da rede de gap junctions entre as próprias células do cumulus e entre essas e o oócito (Albertini, 2003; Combelles et al., 2004. Thomas e Vanderhyden, 2006; Hutti e Albertini, 2007). Além disso, a presença das CCs é importante para que ocorra a fertilização (Tanghe et al., 2002) por atraírem espermatozóides selecionados e promoverem sua capacitação e penetração (Eisenbach, 1999). Por outro lado, deve-se enfatizar que as CCs protegem os oócitos de entrarem em apoptose induzida por estresse oxidativo (Tatemoto et al., 2000), que ocorre quando há uma grande quantidade de espécies reativas d e oxigênio (EROs) ou nitrogênio (ERN) em relação aos antioxidantes disponíveis (Halliwell B., 2007). Alguns estudos sugerem que a análise das CCs possa ser utilizada como preditor indireto da qualidade oocitária e dos resultados dos procedimentos de reprodução assistida, o que poderia ter distintas aplicações clínicas (Hamamah et al., 2006; Assou et al., 2006, 2008; Hamel et al., 2008; Tesfaye et al., 2009; Haouzi e Hamamah, 2009). 1.4. Células da granulosa/cumulus e endometriose Alguns estudos evidenciam incidência aumentada de síndrome do folículo luteinizado não roto (LUF) e defeitos de fase lútea em mulheres com endometriose (Cheesman et al., 1983; Holtz et al., 1985; Saracoglu et al., 1985; Kaya e Oral, 1999 ). Alguns dados demonstram um 22 defeito da esteroidogênese das células da granulosa associado à endometriose, representada não apenas pela redução da atividade basal da aromatase, mas també m pela menor produção de progesterona tanto em ciclos estimulados quanto não estimulados (Harlow et al, 1996). Desse modo, a disfunção ovulatória resultante da secreção alterada de esteróides ovarianos ou da função lútea inadequada pode ser importante na p atogênese da infertilidade associada à endometriose. Um defeito funcional do oócito devido à função folicular anormal pode ser resultado dessa disfunção ovulatória (Wardle et al., 1985). A aromatase está presente nas células da granulosa e, de fato, exerc e um papel fundamental para o processo de maturação folicular e estabelecimento da qualidade oocitária (Erickson et al., 1989; Foldesi et al., 1998; Speroff e Fritz, 2005). Estudos in vitro, de cultivo de células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas a ciclos de hiperestimulação ovariana controlada demonstraram que essas apresentam um comprometimento na atividade da aromatase. Harlow e colaboradores (1996) pesquisaram a atividade da aromatase em pacientes com endometriose mínima e leve através de cultura de células da granulosa na qual avaliaram a produção de estrógeno frente à adição de testosterona ao meio de cultura. Estes autores encontraram redução da atividade da aromatase nas pacientes com endometriose em comparação ao controle. Pesquisadores do mesmo grupo (Cahill et al ., 2003) utilizando a mesma técnica, constataram uma menor sensibilidade ao LH nas células da granulosa de mulheres com endometriose. Abreu e colaboradores (2006) encontraram redução na produção de estradiol nas células da granulosa murais luteinizadas in vitro, obtidas de mulheres com endometriose, após 24 horas de cultivo celular. Em outro estudo realizado por Abreu e colaboradores (2009) não se observou diferença na expressão gênica da aromatase ( CYP19A1) em células murais luteinizadas de mulheres com endometriose e controles submetidas a técnica de reprodução assistida. Todavia, segundo Barcelos e colaboradores (2013) dados recentemente obtidos de nosso g rupo, evidenciaram que a expressão do gene CYP19A1, codificante da aromatase, é significativamente menor nas células do Cumulus oophorus de mulheres inférteis com endometriose, quando comparadas a mulheres inférteis sem a doença, submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro . Assim, sugere -se que o comprometimento da esteroidogênese ovariana participe da etiopatogênese da infertilidade relacionada à doença. Todavia, os mecanismos envolvidos na desregulação da esteroidogênese ovariana em portadoras de infertilidade relacionada à endometriose permanecem desconhecidos. 23 Se por um lado há indícios de que o comprometimento da esteroidogênese ovariana possa participar da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, por outro também temos indícios de anomalias na foliculogênese e maturação oocitária relacionadas a esta doença (Barcelos et al., 2008; 2009). Alguns autores apontam para um possível atraso na maturação do oócito (Barcelos et al., 2009), assim como, para a presença de estresse oxidativo no microambiente folicular dessas mulheres (Andrade et al., 2010; Da Broi et al., 2016). Sabe- se que diversas moléculas são responsáveis pela comunicação precisa entre CCs, entre oócito e CCs, assim como, por sua defesa antioxidante, a fim de garantir um adequado desenvolvimento folicular com consequente ovulação de um oócito competente (Albertini et al., 2003; Assou et al., 2006). Estas moléculas são codificadas por genes específicos, cuja expressão deve ser coordenada a fim de promover as funções fisiológicas esperadas neste microambiente. 1.5. Células do cumulus e expressão gênica Apesar de ainda ser pouco explorada, a avaliação da expressão gênica em CC de mulheres inférteis com endometriose tem sido utilizada em estudos que investigam os mecanismos envolvidos na infertilidade associada à doença. Nosso grupo foi pioneiro nesta temática, demonstrando maior expressão do gene SOD1 em CC de pacientes inférteis com endometriose pélvica nos estadios avançados (III/IV), quando comparadas a pacientes inférteis sem endometriose e com endometriose pélvica em estadios iniciais (I/II). Estes re sultados sugerem uma tentativa de prevenção ao dano oxidativo oocitário desencadeado pela doença (Donabela et al ., 2015). Há, também, evidência de menores níveis do gene que codifica a Cicloxigenase-2 ( PTGS2) nas CCs de mulheres inférteis com a doença, o q ue pode estar envolvido no comprometimento da qualidade oocitária em pacientes com endometriose (Da Luz, et al, 2017). Allegra e colaboradores (2014) analisaram o perfil de expressão gênica em CC de mulheres com endometriose severa utilizando a técnica de microarray realizada com apenas um pool de amostras por grupo, controle e endometriose. Essa avaliação evidenciou genes desregulad os e potencialmente associados à doença e à baixa taxa de fertilização de pacientes com endometriose (Allegra et al., 2014). Em estudo recente, ao avaliar as CCs de mulheres com endometriose avançada com e sem endometrioma e controles inférteis através de sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), nosso grupo evidenciou genes diferencialmente expressos entre os grupos, sugerindo fortemente alterações nas CCs dessas pacientes com possível prejuízo para o desenvolvimento oocitário (Da Luz, et al., 2016). 24 1.6. MicroRNAs e CCs O processo de expressão gênica é complexo e altamente controlado e regulado a nível de transcrição e tradução. Recentemente, tornou -se evidente que um grupo de genes não codificantes de proteínas também atuam como reguladores essenciais da estabilidade da expressão gênica (Ambros et al., 2007; Lee et al., 2006). Portanto, a regulação precisa desses genes não codificantes é crucial para a adequada expressão de seus genes-alvo. Os miRNAs representam uma classe de RNAs não -codificantes que possuem de 18 a 24 pares de bases de nucleotídeos. Seu papel na regulação gênica consiste na sua ligação a uma pequena sequência correspondente a região não traduzida 3´(3´UTR) do RNAm alvo especifico, ocasionando um bloqueio na tradução proteic a ou a degradação do RNAm alvo (Ioiro et al., 2005). Uma vez que os miRNAs podem regular mais de um alvo, estimativas indicam que um único miRNA pode regular mais de 30% dos genes codificantes de proteína no genoma humano (Lewis et al., 2005), comprovando sua importância como regulador global da expressão gênica. Apesar de não terem suas funções totalmente esclarec idas, a descoberta dos miRNAs atraiu a comunidade científica pelas evidências sugestivas de que essas moléculas apresentam papel fundamental em diversos processos biológicos. Em mamíferos, esses pequenos RNAs foram associados à regulação da proliferação ce lular, apoptose, diferenciação celular, hematopoiese, entre outras funções (Chen et al., 2005; Brennecke et al., 2003; Esau et al., 2004). Alterações em miRNAs já foram associadas com várias doenças humanas (Singh et al., 2008), incluindo doenças ginecológicas benignas, neoplasias ginecológicas e problemas de fertilidade do trato reprodutivo feminino (Carletti e Christenson, 2009). Nesse sentido, alterações nos mecanismos de regulação gênica dos microRNAs poderiam estar envolvidas na desregulação dos genes previamente identificados com expressão aberrante em CCs de mulheres inférteis com a doença. Considerando o microambiente folicular e as funções das CCs, qualquer alteração nos mecanismos de controle pós -transcricionais poderia levar a anormalidades no desenvolvimento dos oócitos, induzir apoptose e prejudicar a comunicação celular entre as células somáticas, afetando assim, o desen volvimento e recrutamento dos folículos. Como mencionado anteriormente, mulheres com endometriose parecem ter uma fase folicular mais longa (Cahill et al., 1997), uma taxa mais lenta de crescimento folicular (Doody et al., 1998) e uma redução do folículo d ominante (Tummon et 25 al., 1998), quando comparadas com mulheres inférteis sem causa aparente. Portanto, é possível que na endometriose a sequência dos eventos de maturação dos oócitos esteja comprometida pela expressão alterada de moléculas cruciais, o que poderia ser decorrente de uma regulação anormal exercida pelos microRNAs corresppondentes, fato que precisa ser avaliado em estudos com metodologias pertinentes (Teague et al., 2009). Apesar de v ários estudos tentarem buscar um perfil diferencial de expressão de miRNAs em tecidos endometriais eutópico e ectópico de mulheres com a doença através de análises de bioinformática e dados de microarrays, (Ohlsson et al., 2009; Pan et al., 2007) Assim, determinar o perfil di ferencial de miRNAs em células do Cummulus oophorus de pacientes inférteis com endometriose, submetidas à estimulação ovariana para a realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI), pode ajudar a elucidar mecanismos moleculares envolvidos no comprometimento da qualidade oocitária relacionado à doença, assim como identificar biomarcadores d e qualidade gamética e sucesso gestacional nessas pacientes. Objetivos 27 2. OBJETIVOS 1º. Comparar a expressão de 754 microRNAs em células do Cummulus (CCs) entre mulheres inférteis controles (fatores masculino e/ou tubário de infertilidade) , endometriose pélvica estágios I/II e estágios III/IV submetidas à estimulação ovariana para a realizaçã o de Técnicas de Reprodução Assistida de alta complexidade; 2º. Realizar uma análise in silico para enriquecimento das vias dos genes regulados pelos miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos e destacar as vias relacionadas à aquisição de competência oocitária possivelmente alteradas nas pacientes com a doença. Casuística e Métodos 29 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS 3.1. Desenho do estudo, contexto e considerações éticas Realizou-se um estudo caso-controle prospectivo de fevereiro de 2013 a maio de 2014. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo ( USP) -SP processo CAAE nº 10735012.8.0000.5440. Foram incluídas consecutivamente no presente estudo todas as mulheres submetidas à estimulação ovariana para a realização de ICSI, junto ao Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP -USP, que preencheram os critérios de elegibilidade abaixo descritos e manifestaram o desejo de participar do projeto, mediante a assinatura do termo de consentimento pós-informado. O estudo foi realizado junto ao Laboratório de Ginec ologia - Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP e Laboratório de Biologia Molecular do Laboratório Multiusuário, FMRP-USP. 3.2. Pacientes As pacientes tiveram seus prontuários avaliados de acordo com os critérios de elegibilidade e as consideradas elegíveis foram contatadas para a realização do convite e da entrevista inicial. Ao concordarem em participar do estudo, as pacientes foram acompanhadas até a data da captação. Foram consideradas elegíveis as pacientes com i dade menor que 40 anos, FSH do terceiro dia do ciclo menstrual ≤ 10 mUI/mL, índice de massa corporal (IMC) menor ou igual 30 kg/m 2, com ausência de doenças como diabetes mellitus ou quaisquer outras endocrinopatias, doença cardiovascular, dislipidemia, lúpus eritematoso sistêmico e outras doenças reumatológicas, ausência de infecção pelo vírus HIV ou qualquer infecção ativa, ausência de tabagismo ou o uso de medicações hormonais e antiinflamatórios hormonais e não- hormonais nos últimos seis meses, previa mente à programação para o procedimento de reprodução assistida. No grupo controle, foram incluídas as pacientes submetidas à estimulação ovariana para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, indicada pela presença exclusivamente de fa tor masculino e/ou fator tubário (excluindo -se a presença de hidrossalpinge) e ausência de quaisquer doenças pélvicas associadas à infertilidade, quando da realização da laparoscopia diagnóstica, utilizada como parte da propedêutica da investigação 30 de infertilidade. No grupo endometriose I/II e III/IV, foram incluídas as pacientes submetidas à estimulação ovariana para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, indicada pela presença exclusivamente de endometriose, com diagnóstico de endometriose e classificação do estágio da doença por videolaparoscopia realizada no Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, segundo os critérios definidos pela American Society for Reproductive Medicine (1997) e com ausência de qualquer tratamento clínico ou cirúrgico para a endometriose nos últimos seis meses. Para a caracterização clínica das pacientes foram coletados dados como : o tempo de infertilidade; número de oócitos captados, maduros, injetados e fertilizados; taxa de fertilização; número de embriões clivados, embriões formados e embriões transferidos. 3.3. Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea Com o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de estimulação ovariana controlada foi utilizada a programação da menstru ação, que consiste em se administrar anticoncepcionais orais combinados diariamente, iniciados no período menstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto para o início da estimulação ovariana. A hiperestimulação ovariana controlada foi inici ada cinco dias após a interrupção dos contraceptivos orais combinados usados para a programação do ciclo. Todas as mulheres foram monitorizadas apenas por ultrassonografia transvaginal (UStv) (Martins et al., 2014), submetidas ao protocolo flexível com antagonista do GnRH e a estimulação ovariana controlada realizada de acordo com um dos dois protocolos descritos a seguir: - Protocolo flexível com antagonista e alfacorifolitropina (Elonva®, Schering -Plough, Brasil). Cinco dias após a interrupção do contraceptivo oral combinado foi administrada a alfacorifolitropina na dose de 100 mcg para pacientes com até 60kg e 150 mcg para pacientes com mais de 60kg. Seis dias após a administração da alfacorifolitropina foi realizado o primeiro UStv para monitoriz ação do ciclo. O bloqueio hipofisário foi realizado com antagonista do GnRH (Cetrotid ® ou Orgalutran ®), iniciado quando havia um folículo com diâmetro médio maior ou igual a 14 mm e mantido até o dia da administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Ovidrel®, Serono, Brasil). No oitavo dia após a administração da alfacorifolitropina, as pacientes que não apresentaram critério para uso do hCG recombinante, iniciaram o uso diário de gonadotrofinas (150-300 IU/dia), usadas até a véspera do dia de uso do hCG. 31 - Protocolo flexível com antagonista e FSH recombinante (FSHr) (Gonal -F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil) . Cinco dias após a interrupção do contraceptivo oral combinado foi administrado FSHr, 150 a 300 UI por dia, durante os seis primeiros dias da EOC. A partir do sétimo dia EOC, a dose foi ajustada de acordo com o crescimento folicular , monitorado com USTV diariamente ou em dias alternados e mantida até a véspera do dia de uso do hCG . O bloqueio hipofisário foi rea lizado com antagonista do GnRH (Cetrotid ® ou Orgalutran®), iniciado quando havia um folículo com diâmetro médio maior ou igual a 14 mm e mantido até o dia da administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Ovidrel®, Serono, Brasil). Quando pelo menos dois folículos atingiram 17 mm de diâmetro médio, foi administrado 250 µg de hCG recombinante às 22:00. A captação dos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante. A suplementação da fase lútea foi realizada com progesterona natural micronizada (Utrogestan®, Besins Healthcare, Brasil) por via vaginal na dose de 200mg, três vezes ao dia, a partir do dia da captação oocitária e mantida até a décima segunda semana da gestação, nas pacientes que engravidaram. 3.4. Captação Oocitária A captação dos oócitos foi realizada mediante prévia anestesia geral endovenosa com propofol (Diprivan®, Astra-Zeneca, Brasil) associado a citrato de fentanil (Fentanil®, Janssen- Cilag, Brasil). A aspiração dos folículos por via endovaginal guiada por tran sdutor ultrassonográfico transvaginal, foi realizada utilizando-se uma agulha de lúmen simples padrão, com 300 mm de comprimento, 1,1 mm de diâmetro interno, duplo bizel cortante, ranhurado nos dois centímetros terminais para uma maior ecogenicidade (Labor atório CCD, França), com pressão aspirativa artificial constante de 100 mmHg, por meio de bomba de sucção com controle eletrônico (Craft® Suction Pump, Rocket Medical, Inglaterra). Os folículos foram aspirados em pool, ou seja, foi realizada a aspiração do maior número possível de folículos em cada punção, observando -se o esvaziamento completo de cada folículo e puncionando -se o ovário o menor número de vezes possível. A punção foi realizada sob aspiração contínua, tomando-se o cuidado de tirar a pressão durante a entrada e retirada da agulha na parede vaginal, para evitar aspiração de células vaginais. 32 Para a identificação e o isolamento dos complexos oócito-cumulus, o material aspirado foi transferido para placas de Petri com 10 cm de diâmetro, previament e aquecidas em platina térmica a 37°C, não contendo meio de cultivo. Depois de identificados, os complexos oócito cumulus (OC) foram isolados do fluido folicular (FF) e colocados em placa separada. Os complexos OC foram lavados cuidadosamente em meio de cu ltura Human Tubal Fluid-HEPES (HTF, Irvine Scientific), para a remoção de sangue e debris. Todo o manuseio dos oócitos foi realizado em capela de fluxo laminar (Veco Modelo HLFS 12), com a finalidade de manter o meio estéril. 3.5. Células do Cummulus oophorus Imediatamente após a identificação dos OC, os mesmos foram lavados cuidadosamente em meio de cultura Human Tubal Fluid-HEPES (HTF, Irvine Scientific), para a remoção de sangue e debris. As CC foram separadas do ovócito através de microdissecção com a utilização de duas agulhas de insulina, colocadas no criotubo com RNAlaterR Solution (Ambion) e após 24 horas à 4C de imersão nesta solução, as amostras foram armazenadas em nitrogênio líquido até a sua utilização como descrito a seguir. As CCs de todos os OC obtidos de cada paciente eram armazenadas no mesmo criotubo. 3.6. ICSI e avaliação da qualidade embrionária Os oócitos maduros foram submetidos à ICSI 3 a 4 horas após a captação de oócitos e depois de injetados, foram cultivados em gotas separadas. A fertilização foi avaliada aproximadamente 16-18 horas após ICSI, caracterizada pela presença de dois pronúcleos e dois corpúsculos polares. A qualidade embrionária foi analisada aproximadamente 43-45 horas após ICSI (segundo dia de desenvolvimento -D2), baseada no número e na simetria dos blastômeros, percentual de fragmentação e presença ou ausência de multinucleação. Nos casos em que a transferência embrionária não foi realizada em D2, a qualidade embrionária foi novamente analisada aproximadamente 67 -69 horas após ICSI (D3) (Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011) . A transferência embrionária foi realizada em D2 ou D3 de acordo com as considerações individualizadas para cada caso. 33 Metodologias 3.7. Isolamento RNA total O RNA total foi extraído de células do cumulus usando o mirVana™ miRNA Isolation Kit (Ambion/ThermoFisher, USA), seguindo as instruções do fabricante (protocolo em anexo – ANEXO 2). Em seguida, foi realizada a quantificação por fluorimetr ia do RNA total no equipamento Qubit® Fluorometer utilizando o Qubit® RNA HS Assay Kit (Life thecnology/ThermoFisher Scientific, USA). 3.8. Transcrição Reversa Foram realizadas duas sínteses de cDNA da mesma amostra com o conjunto de reagentes TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit e Megaplex™ RT Primers (Applied Biosystems/ThermoFisher Scientific, USA). Na primeira síntese utilizou-se um pool de primers A contendo 377 microRNAs alvos e 4 controles, e na segunda, um pool B contendo outros 377 microRNAs alvos e os mesmos 4 controles. Foi preparada uma reação contendo: 0,8µl Megaplex RT Primers A/B (10x), 0,20 µl dNTPs with dTTP (10mn), 1,50 µl Multi Scribe Reversa (75U), 0,80 µl 10x RT Buffer, 0,90 µl MgCl 2 (25mm), 0,10 µl RNAse Inibitor, 0,20 µl água livre de nucleases e 3 µl da amostra (10 ng de RNA total). Logo em seguida, o mix de reação foi incubado por 5 minutos no gelo e submetido às seguintes condições de ciclagem: 40 ciclos de 16ºC por 2 minutos, 42ºC por 1 minuto e 50º por 1 segundo, 1 ciclo de 85ºC por 5 minutos e 4ºC infinito no termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems/ThermoFisher Scientific, USA). 3.9. Pré-Amplificação do cDNA A reação de pré -amplificação do cDNA foi realizada utilizando -se o conjunto de reagentes TaqMan® PreAmp Master Mix, Megaplex PreAmp Primers Human Pool A e Megaplex PreAmp Primers Human Pool B (Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific, USA). Para o preparo da reação utilizou -se os seguintes reagentes: 12,5 µl TaqMan PreAmp Master Mix (2x), 2,5 µl Megaplex PreAmp Primers A ou B (10x), 2,5 µl de água livre de nucleases e 7,5 µl de cDNA. Após a incubação do mix de reação por 5 minutos em temperatura ambiente, este foi submetido às seguintes condições de ciclagem: 1 ciclo de 95ºC por 10 minutos, 55ºC por 2 minutos, 72ºC por 2 minutos, 12 ciclos de 95º por 15 segundos e 60ºC por 4 minutos, 1 ciclo 99,9ºC por 10 minutos e 4ºC infinito no termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific, USA). 34 3.10. PCR em Tempo Real Quantitativo (qPCR) de microRNA O TaqMan®Array Human MicroRNA Cards A e B abrange um total de 754 alvos específicos para microRNAs do genoma humano baseados no banco de dados do Sanger miRBase v14. Cada card (A ou B) contém 4 controles (3 controles enógenos candidatos - RNU44, RNU48, U6 e 1 controle negativo - ath-mir-159a) e 377 microRNAs alvos. As figuras 1 e 2 apresentam, respectivamente, o desenho dos cards A e B com o nome dos microRNAs analisados. Para as reações de qPCR foram utilizados os seguintes r eagentes: 450 µl de TaqMan® Universal Master Mix II no UNG (Applied Biosystems), 50 µl do produto da Pré – Amplificação A ou B na diluição de 1:4 e 400 µl de água livre de nucleases. Pipetou-se 100 µl deste preparo em cada um dos 8 reservatórios do card, e esta solução foi distribuída homogeneamente em cada poço por centrifugação a 1200 rpm por 1 minuto (3 vezes). A reação de amplificação dos microRNAs ocorreu na seguinte condição de ciclagem: 1 ciclo 95ºC por 10 minutos, 40 ciclos 95ºC por 15 segundo e 60ºC por 1 minuto no equipamento ViiA™ 7 Real- Time PCR System (Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific, USA). Os resultados de amplificação foram analisados no software Thermo Fisher Cloud. Como controle de qualidade do RNA foi utilizad a como parâmetro a amplificação dos microsRNAs RNU44, RNU48, U6 (variações de 12 a 18 Cts). Os microRNAs que apresentaram Cts (ciclo threshould) maiores ou iguais a 36 ciclos foram considerados como não detectados (Vandesompele et al ., 2009) e foram excluídos das análises todos os microRNAs que não amplificaram (não det ectados) em pelo menos 50% das amostras por grupo . A amostra referência (calibrador) deste estudo foi elaborada com a mistura de cDNA pré -amplificado de cada amostra do grupo controle, formando-se, assim, um pool com 5 amostras. Os microRNAs que não amplificaram na amostra de referência também foram excluídos das análises. Como estratégia de normalização dos dados, utilizou -se o método de normalização global recomendado por Vandesompele e cols (2009). Resumidamente, nesta normalizaç ão os alvos expressos em todas as amostras são encontrados e então, usa-se a mediana dos Cts destes alvos como fator de normalização para calcular a quantificação relativa (RQ) baseada no método 2 - Ct (Livak and Schmittgen, 2001). Os microRNAs RNU44, RNU48, U6 não foram utilizados neste cálculo de normalização uma vez que não foram adotados como genes de referencia (Vandesompele et al., 2009). 35 Figura 1. MicroRNAs analisados no experimento TaqMan®Array Human MicroRNA Cards A. 36 Figura 2. MicroRNAs analisados no experimento de TaqMan®Array Human MicroRNA Cards B 37 Casuística Considerando os restritivos critérios de elegibilidade, a dificuldade esperada em obter amostras satisfatórias e por se tratar de estudo inédito, sem dados prévios passíveis de estimar médias e desvios -padrão dos microRNAs avaliados, propusemos um tamanho amostral que permite identificar ou descartar uma grande diferença entre os grupos (Cohen, 1988). Um n amostral de 5 pacientes por grupo (controle, endometrioses I/II e endometrioses III/IV) é suficiente para descartar uma diferença de 2,42 desvios-padrão (large effect size) com um poder de teste de 90% e alfa de 5% ou uma diferença de 2,09 desvios-padrão para um poder de teste de 80% e alfa de 5%. Essa análise de sensibilidade foi realizada no programa G Power considerando o teste de Mann Whitney. 3.11. Análise estatística As variáveis (idade, IMC, tempo de infertilidade, número oócitos captados, número de oócitos maduros, número de oócitos injetados, número de oócitos fertilizados, taxa fertilização, número de embriões clivados, taxa de clivagem, número de embriões formados), foram representadas pela mediana e intervalo interquartil e apresentadas de modo descritivo. A expressão dos microRNAs (valores de RQ) foi representada pela mediana e intervalo interquartil. Foi utilizado o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis para verificar a existência de diferença na expressão (valores de RQ) dos microRNAs analisados nos diferentes grupos (Controle, Endometriose I/ II e endo metriose III/ IV). A hipótese nula testada foi de que as populações de cada grupo provem da m esma distribuição, ou seja, tem a mesma forma e dispersão. Quando a hipótese nula foi rejeitada foi utilizado o pós -teste de Dunn. Foi considerado significativo p<0,05. Estes procedimentos foram implementados no programa R versão 3.2.2. 38 3.12. Análise de enriquecimento A pesquisa de vias em que os genes regulados pelos microRNAs identificados como diferencialmente expressos entre os grupos foi realizada por meio da ferramenta DAVID, com base na Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Resultados 40 4. RESULTADOS 4.1. Fluxograma do estudo No período de fevereiro de 2013 a maio de 2014 foram analisados 651 prontuários de mulheres que participaram do Programa de Reprodução Assistida do Hospital Universitário da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e foram submetidos à estimulação ovariana para ICSI. Destas pacientes 520 não atenderam os critérios de elegibilidade, sendo 30 exclusivamente por apresentarem idade superior a 40 anos e 490 por apresentarem outros fatores ou fatores associados (hipertensão arterial, uso de medicamentos, tabagista, uso de álcool, obesidade, outros fatores de infertilidade, infertilidade sem causa aparente , entre outros). Assim, as 131 elegíveis para participação no estudo foram entrevistadas, 47 pacientes não aceitaram participar da pesquisa e 84 assinaram o TCLE (Anexo 1), sendo 26 pacientes do grupo endometriose I/II, 34 pacientes do grupo endometriose III/IV e 24 pacientes do grupo controle. Das 84 pacientes, 30 não foram submetidas à captação de oócitos, sendo 2 por motivos financeiros (ausência de recursos financeiros para aquisição das medicações usadas para estimulação ovariana), 24 por ausência de resposta a estimulação ovariana, 3 pacientes por uso incorreto da medicação, 1 por exames alterados e outras 14 pacientes não entraram no estudo devido a diferentes protocolos de estimulação ovariana. Desta forma, obtivemos CCS doadas por 40 pacientes, sendo 11 pacientes com endometriose I/II, 16 pacientes com endometriose I/II e 13 pacientes controles. Destas, foram excluídas 25 pacientes sendo, 6 pacientes endometriose I/II, 11 pacientes endometriose III/IV e 8 pacientes controle, devido à baixa quantificação de RNA obtida. Sendo assim, foram analisadas CCs de 5 pacientes com endometriose I/II, 5 pacientes endomet riose III/IV e 5 pacientes controles, que tiveram amostras adequadas para dar seguimento ao estudo (Figura 3). 41 Analisados Avaliadas para Elegibilidade (n = 651) Não elegíveis ( n = 520) - Idade > 40 anos (n = 30) - Outros fatores (n = 490) Hipertensão arterial, uso de medicamentos, tabagista, uso de álcool, obesidade, fatores de infertilidade, ESCA entre outros. Elegíveis (n= 131) Incluídas ( n= 84) Endometriose I/II (n = 26) Endometriose III/IV(n = 34) Controle(n = 24) Endometriose I/II (n = 26) Endometriose III/IV(n = 34) Doadoras CCs (n = 24) Endometriose III/IV(n = 5) Endometriose I/II(n = 5) Controle (n = 5) Excluídas (n=21) - 1 exames alterados - 9 má resposta - 5 pacientes devido ao protocolo de estimulação - 6 amostras com baixa quantificação de RNA Excluídas (n=29) - 3 uso incorreto da medicação - 1 problemas financeiros - 9 má resposta - 5 pacientes devido ao protocolo de estimulação - 11amostras com baixa quantificação de RNA. Excluídas (n=19) - 6 má resposta - 1 problemas financeiros - 4 pacientes devido ao protocolo de estimulação - 8 amostras com baixa quantificação de RNA Recrutamento Incluídas Seguidas Figura 3. Fluxograma do estudo. - 47 não aceitaram participar 42 4.2. Caracterização dos grupos As pacientes do grupo controle foi composto por 5 pacientes sendo 3 pacientes com fator tubário bilateral e 2 pacientes com fator masculino. O grupo endometriose I/II foi composto por 3 pacientes com endomotriose leve e 2 pacientes com endometriose minima associada a fator masculino. O grupo de endometriose III/IV foi composto por 5 pacientes com endometriose sendo 2 pacientes com endometriose avaçanda e 3 pacientes com endometriose severa. Todas as pacientes do grupo endometriose III/IV não apresentavam imagem no US transvaginal sujetiva de endometrioma ovariano no ciclo que foram obtidas as células do cumulus. Os dados clínicos das pacientes controle, endometriose I/II e endometriose III/IV estão representados na Tabela 1. Tabela 1. Caracterização clínica, resposta à estimulação ovariana controlada e resultados de ICSI de pacientes inférteis controles, com endometriose pélvica I/II e endometriose III/IV. Variável Controle Endometriose I/ II Endometriose III/ IV Idade (anos) 29 (28 ;33) 37 (35;38) 34 (28;35) IMC 22,01 (20,98;27,18) 23,73 (22,58;26,89) 24 (23,5;26,33) Tempo de infertilidade (meses) 78 (48;89) 96 (72;188) 54 (48 ;89) Número oócitos captados 11 (10 ; 12) 4 (4;6) 8 (5;8) Número de oócitos maduros 8 (6; 9) 4 (3 ;4) 7 (5;7) Número de oócitos injetados 8 (6;9) 4 (3;4) 7 (5;7) Número de oócitos fertilizados 7 (5;8 ) 4 (3;4) 5 (3; 6) Taxa fertilização 88 (87,50 ; 90) 100 (100;100) 85,71 (71,42;100) Número de embriões clivados 5 (4 ;6) 4 (2 ;4) 4 (3 ; 4) Taxa de clivagem (%) 100 (85,71;100) 100 (89;100) 80 (66,67; 100) Número de embriões formados 2 (2;3) 2 (2;4) 4 (2; 4) Número de embriões transferidos 2 (2;2) 2 (2;2) 2 (0; 2) Nota. Dados apresentados como mediana (intervalo interquartil). 43 1. Resultados referentes ao objetivo 1: Comparar a expressão de 754 microRNAs em células do Cummulus (CCs) entre mulheres inférteis controles (fatores masculino e/ou tubário de infertilidade), endometriose pélvica estágios I/II e estágios III/IV submetidas à estimulação ovariana para a realização de técnicas de Reprodução Assistida (RA) de alta complexidade Dos 754 microRNAs alvos analisados no PCR em tempo real, 350 miRNAs foram excluídos por não amplificarem em 50% das amostras por grupo e 1 microRNA por não apresentar amplificação na amostra de referência. Desta forma, analisamos a quantificação relativa (RQ) de um total de 404 microRNAs (Anexo 3). Após a análise do perfil de expressão dos 404 microRNAs em CCs de pacientes inférteis controles e com endometriose I/II e III/IV por TaqMan Array cards , 09 microRNAs apresentaram uma diferença significativa de expressão (Tabela 2). Ao comparar-se endometriose I/II e controle, os microRNAs hsa-let-7f-1#, hsa-miR- 1291, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-218, hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p foram menos expressos nas pacientes com endometriose I/II em relação as pacientes controles. Ao comparar -se endometriose III/IV e controle, os microRNAs hsa -miR-1291, hsa - miR-187-3p, hsa -miR-30b, hsa -miR-532-3p e hsa -miR-629-5p foram menos expressos nas pacientes com endometriose III/IV em relação as pacientes controles. Os microRNAs, hsa-miR-1291, hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p foram menos expressos tanto no grupo endometriose I/II como no grupo endometriose III/IV quando comparados ao grupo controle. Ao comparar -se os grupos endometriose I/II e endometriose III/IV entre s i, os microRNAs hsa -miR-187-3p e hsa -miR-532-3p foram menos expressos nas pacientes com endometriose III/IV. Por outro lado, os microsRNAs hsa-let-7f-1# e hsa -miR-362-3p foram mais expressos nas pacientes com endometriose III/IV quando comparadas às pacien tes com endometriose I/II. 44 Tabela 2. Perfil diferencial de microRNAs expressos em células do cumulus de mulheres inférteis sem endometriose e com endometriose estágios I/II e III/IV. MicroRNA Controle Mediana (IIQ) Endometriose I/II Mediana (IIQ) Endometriose III/IV Mediana (IIQ) Expressão diferencial (C x EI/II) Expressão diferencial (C x EIII/IV) Expressão diferencial (EI/II x EIII/IV) hsa-let-7f-1# 3.37 (1.51;4.22) 1.08 (0.26 ; 1.18) 4.78 (3.09;-7.94) down ... up hsa-miR-1291 0.91 (0.32 ; 1.19) 0.06 (0.03 ; 0.09) 0.13 (0.09 ;0.23) down down ... hsa-miR-140-5p 1.03 ( 0.88 ; 1.38) 0.61 (0.55 ;0.77) 0.71 (0.61;0.89) down ... ... hsa-miR-187-3p 2.32 (1.02 ; 6.73) 2.59 (1.27 ;3.83) 0.10 (0.05 ; 0.55) ... down down hsa-miR-218 0.25 (0.21 ;0.75) 0.16 (0.14 ;0.16) 0.17 (0.15 ; 0.30) down ... ... hsa-miR-30b 0.56 (0.55;0.82) 0.49 (0.19 ; 0.49) 0.24 (0.18 ; 0.27) down down ... hsa-miR-362-3p 1.97 (1.00 ; 2.31) 0.53 (0.23 ;1.26) 4.06 (2.79 ;6.91) ... ... up hsa-miR-532-3p 1.27 (1.25 ; 1.85) 1.16 (1.14 ; 1.48) 0.11 (0.02 ;0.34) ... down down hsa-miR-629-5p 1.95 (1.56 ; 3.04) 0.79 (0.36 ; 1.12) 0.52 (0.47;1.07) down down ... Nota. C: controle. EI/II: endometriose estágios I/II. EIII/IV: endometriose estágios III/IV. Os valores estão expressos em Mediana (intervalo interquartil - IIQ). Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Utilizado o pós-teste de Dunn. 2. Realizar uma análise in silico para enriquecimento das vias dos genes regulados pelos miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos e destacar as vias relacionadas à aquisição de competência oocitária possivelmente alteradas nas pacientes com a doença 4.2.1. Controle versus endometriose estágios I/II: Os microRNAs hsa-lef-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-218 hsa-miR- 30b e hsa -miR-629-5p regulam um total de 2048 genes validados. Destes, 1558 não se encontram em vias descritas e 490 genes participam de 57 diferentes vias do KEGG. D ez vias foram consideradas de interesse para este estudo por terem possível papel na função das CCs e na aquisição de competência oocitária (Tabela 3). 45 Tabela 3. Vias gênicas relacionadas a comparação controle versus endometriose estágios I/II reguladas pelos microRNAs desregulados (hsa-lef-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140- 5p, hsa-miR-218 hsa-miR-30b e hsa-miR-629-5p). Via Genes envolvidos Via de sinalização p53 ATM,ATR, MDM2, MDM4, PERP, CASP3, CCNB2, CCND1,CCND, CCNE2, CCNG1, CDK6, CDKN1A Via de sinalização Wnt APC, CREBBP, CXXC4, EP300,WNT5A,ROCK2, VANGL2, WNT7B, AXIN1, CSNK1E, CHD8, CCND1, CCND3, DKK2, DVL3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD9, GSK3B, GPC4, LEF1, MAPK8, NFATC3, PPARD, PRICKLE1, PRICKLE1, PRKCA, PPP3CB, RHOA, SOST, SFRP2, TP53, MYC Via de sinalização Ras ABL1, BCL2L1, BRAP, ETS2, GNB1, GNB4, GNG5, GAB1, GAB2, MET, RAP1B, RASGRP3 ,RALA, RASA4, SHC1, ANGPT4, CALM1,CSF1, .EFNA1, EGFR, FGF2, FGF9, IKBKB, IGF1R, IGF1, KSR1, KSR2, MAPK8, NRAS, PAK2, PLCE1, PLCG2, PDGFRA, PDGFRB, PDGFB,PRKCA, PRKCA, RHOA, STK4, SYNGAP1, VEGFA, VEGFC Junções aderentes CREBBP ,EP300, MET,WASL, ACTB, ACTN1, CTNNA1, CTNND1, EGFR, IGF1R, LEF1, PARD3 ,PTPRB, RHOA, SNAI1, SNAI2, TGFBR1, VCL Via de sinalização PI3K-Akt BCL2L1, BCL2L11 ,BCL2, GNB1, GNB4, GNG4, GNG5, JAK1, MDM2, MET, ANGPT4, CREB1, CREB3L1, COL4A1, COL5A1, COL5A1, CSF1, CCND1, CCND3, CCNE2, CDK6, CDKN1A, CDKN1B, EFNA1, EGFR, FGF2, FGF9, FN1, FOXO3, GSK3B, HSP90B1 ,IKBKB, IGF1R, IGF1, ITGA3, ITGAV, ITGB1, ITGB3, IFNAR2, LAMB3, LAMC1, MTOR, NRAS, PDGFRA, PDGFRB, PDGFB, PDGFB, PRLR, PRK CA, PPP2CB, PPP2R5E, PPP2R2A, THBS1, TP53,YWHAB, YWHAQ, YWHAZ, MYC, VEGFA 46 Via Genes envolvidos Via de sinalização Rap1 CRKL,GNAI2,GNAS,MET,RAP1B,RASGRP3,RALA,ACT B,ANGPT4,CALM1,CTNND1,CSF1,EFNA1,EGFR,FGF 2,FGF9,FPR1,IGF1R,IGF1,ITGB1,ITGB3,MAP2K3,NR AS,PARD3,PLCE1,PDGFRA,PDGFRB,PDGFB,PFN2,P RKCA,RHOA,SIPA1L2,SIPA1L2,TLN1,THBS1,VEGFA, VEGFC Via de sinalização FoxO APC, CRKL, GN A12, GNA13 ,ROCK2, WASL ,ABI2, ACTB, ARPC1B, ARPC3, ACTN1, EGFR, FGF2, FGF9, FN1, ITGA3, ITGAV, ITGB1, ITGB3, NRAS, PAK2, RAC1, PIP4K2A, PIP4K2B, PDGFRA, PDGFRB, PDGFB, PFN2, PPP1CC, PPP1R12A, PPP1R12B, RDX, RHOA, SSH1, VAV2, VCL Via de sinalização ErbB ABL1,CRKL,CBL,GAB1,SHC1,CDKN1A,CDKN1B,EGF R,GSK3B,MTOR,MAPK8,MAP2K7,NRAS,PAK2,PLCG2, PRKCA,TGFA, MYC Via de sinalização MAPK PFKFB3, ELAVL1 ,RAB10, STRADB, ACACA, ADIPOR2, ADIPOQ, CREB1, CREB3L1, CCND1, FOXO3, HNF4A, IGF1R, IGF1, MTOR, PPARG, PRKAG1, PPP2CB, PPP2R5E, PPP2R2A, PPP2R1B, SCD5. Metabolismo de ácidos graxos ELOVL5 ,ELOVL6, ACAA2, ACACA, ACADL, EHHADH, FADS1, FADS2, HSD17B12, MECR , SCD5 4.2.2. Controle versus endometriose estágios III/IV Os microsRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa-miR-532-3p e hsa- miR-629-5p regulam um total de 1134 genes validado s e, destes, 989 não foram descritos em nenhuma via, sendo que 145 genes foram enriquecidos em 17 diferentes vias do KEGG. Destas, 5 vias são de interesse para o estudo pelo seu possível papel na função das CCs e na aquisição de competência oocitária. (Tabela 4). 47 Tabela 4: Vias gênicas relacionadas a comparação controle versus endometriose estágios III/IV reguladas pelos microRNAs desregulados (hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa- miR-532-3p e hsa-miR-629-5p). Via Genes envolvidos Apoptose ATM,BCL2,CFLAR,DFFA,TNFRSF10B,TNFRSF10D,XIAP,CAS P3,CYCS,TNF e TP53 Via de sinalização p53 ATM,PERP,CASP3,CCNE2,CDK2,CYCS,IGF1,PPM1D,RRM2,S ERPINE1 e TP53 Via de sinalização Rap1 CRKL,GNAI2,GNAS,RAP1B,RASGRP3,RAPGEF6,ANGPT4,CTN NB1,CTNND1,CSF1,GRIN2B,IGF1,ITGB3,PARD3,PLCE1,PDG FRA,PDGFRB,SIPA1 e TLN1 Via de sinalização Wnt CXXC4,ROCK2,VANGL2,WNT7B,CAMK2G,CSNK1E,CTNNB1, FRAT2,GPC4,MAPK8,PRICKLE1,PPP3CB,PPP3R1,PPP3R2, TP53 Metabolismo de ácidos graxos ELOVL5,ACAA2,ACADL,ACSL6,EHHADH,HSD17B12, SCD5 4.2.3. Micros comuns das comparações controle versus endometriose estágios I/II e controle verus endometriose estágios III/IV Os microsRN As hsa -miR-1291, hsa -miR-30b e hsa -miR-629-5p são comuns nas comparações controle x endometriose I/II e controle x endometriose III/IV, sendo menos expressos tanto na doença inicial como na avançada. Esses microRNAs regulam 934 genes e, destes, 78 genes são enriquecidos em 8 diferentes vias do KEGG, sendo 3 vias focos de interesse deste estudo (Tabela 5). 48 Tabela 5: Vias gênicas relacionadas a comparação controle versus endometriose estágios I/II e controle versus endometriose estágios III/IV reguladas pelos microRNAs desregulados (hsa-miR-1291, hsa-miR- 30b e hsa-miR-629-5p). Via Genes envolvidos Apoptose ATM,BCL2,CFLAR,DFFA,TNFRSF10B,TNFRSF10 D,XIAP,CASP3, TP53 Via de sinalização p53 ATM,PERP,CASP3,CCNE2,IGF1,PPM1D,RRM2,SE RPINE1, TP53 Metabolismo de ácidos graxos ELOVL5,ACAA2,ACADL,EHHADH,HSD17B12,SC D5 4.2.4. Endometriose estágios I/II versus endometriose estágios III/IV Ao comparar -se os grupos endometriose I/II e endometriose III/IV entre si, os microRNAs hsa-let-7f-1# e hsa-miR-362-3p apresentaram-se mais expressos e os microRNAs hsa-miR-187-3p e hsa-miR-532-3p menos expressos na doença avançada. Analisando os genes regulados pelos microRNAs identificados, 18 genes foram comuns a micros mais e menos expressos, de modo que foram excluídos da análise. Os microsRNAs hsa-let-7f-1# e hsa-miR-362-3p, estão mais expressos na endometriose III/IV, regulam 916 genes e, destes, 152 genes foram enriquecidos em 37 diferentes vias do KEGG. Destas, 4 vias são de interesse para o estudo (Tabela 6) por seu possível papel na função das CCs e desenvolvimento oocitário. 49 Tabela 6 . Vias gênicas dos genes de interesse relacionadas a comparação endometriose estágios I/II versus endometriose estágios III/IV relacionados aos microRNAs (let-7f-1# e hsa-miR-362-3p). Via Genes envolvidos Via de sinalização Jak-STAT MPL,CCND1,IFNLR1,IL13,IL5RA,IL6ST,PIK3CG,P IK3R1,PIAS1,STAT2,STAM,SOCS1,SOCS3,SOCS7, MYC Via de sinalização FoxO FASLG,MDM2,SMAD2,ATG12,CCNB2,CCND1,CD KN1A,CDKN1B,IGF1R,IRS1,PIK3CG,PIK3R1,SOD 2, TGFBR1 Via de sinalização Wnt BAMBI,VANGL1,WNT7A,WNT9A,CCND1,DAAM2, DVL3,FZD2,FZD4,FZD5,FZD9,GSK3B,GPC4, MYC Via de sinalização ErbB CRK,CDKN1A,CDKN1B,GSK3B,MAP2K7,PAK6,PI K3CG,PIK3R1,PLCG2,MYC Por outro lado, os microRNAs hsa-miR-187-3pe hsa -miR-532-3p, que estão menos expressos na endometriose III/IV , regulam 203 genes e estes não se encontram descritos em vias. Na tabela 7, encontram-se descritas todas as vias relacionadas aos microRNas que foram significativos para este estudo. 50 Tabela 7. Descricão das vias metabólicas relacionadas aos genes-alvo dos microRNAs (miRNAs) Vias Descrição Via de sinalização p53 A proteína p53 é um ativador transcricional, resultando em parada do ciclo celular, senescência celular ou apoptose. A ativação desta via é induzida por uma série de sinais, incluindo danos ao DNA, estresse oxidativo e ativação de oncogenes Via de sinalização Wnt Esta via está relacionada a processos de desenvolvimento básicos como destino celular, proliferação e controle da divisão celular assimétrica embrionária e consiste em uma cascata de sinalização celular. Existem três vias Wnt diferentes: a via canônica, a via de polaridade celular planar e a via Wnt/Ca2+. A via canônica está associada à estabilização do citoesqueleto e proliferação celular, enquanto a via de polaridade está relacionada à adesão celular, ao controle da migração e da orientação celulares e a via do cálcio está relacionada ao aumento do Ca2+ livre intracelular e ativação de quinases . Via de sinalização Ras As proteínas Ras são GTPases que funcionam como comutadores moleculares para vias de sinalização que regulam a proliferação celular, sobrevivência, crescimento, migração, diferenciação celular. Tem relação com a via PI3K -Akt. Junções aderentes As junções aderentes são importantes para manter a arquitetura do tecido e a polaridade celular e podem limitar o movimento celular e a proliferação. As alterações no estado de fosforilação da beta-catenina afetam a adesão célula-célula, a migração celular e o nível de sinalização da beta-catenina. Possui relação com a via Wnt. Via de sinalização PI3K-Akt É ativada por muitos tipos de estímulos celulares ou insultos tóxicos e regula funções celulares fundamentais tais como transcrição, tradução, proliferação, crescimento e sobrevivência Via de sinalização Rap1 Rap1 é uma pequena GTPase que controla diversos processos, tais como adesão celular, formação de junção célula -célula e polaridade celular. 51 Vias Descrição Via de sinalização FoxO Regula a expressão de genes em eventos fisiológicos celulares incluindo apoptose, controle do ciclo celular, metabolismo da glicose, resistência ao stress oxidativo e longevidade . Via de sinalização ErbB Está relacionada a fatores de crescimento extracelular e a vias de sinalização intracelular que regulam diversas respostas biológicas, incluindo proliferação, diferenciação, motilidade celular e sobrevivência. Via de sinalização MAPK O sistema MAPK atua como um sensor de status de energia celular. Esta cascata de ativação está envolvida em diversas funções celulares, incluindo proliferação, diferenciação e migração celular. Metabolismo de ácidos graxos N/D Apoptose Via de sinalização Jak-STAT É um processo geneticamente programado para a eliminação de células danificadas ou redundantes por ativação de caspases (cisteína-proteases específicas de aspartato). É uma via de ativação de uma cascata transcricional de sinais envolvidos no desenvolvimento e homeostase. Em mamíferos, está via é o principal mecanismo de sinalização para uma ampla gama de citocinas e fatores de crecimento. Relacionada a outras vias como MAPK, P13kK e Ras. Discussão 53 5. DISCUSSÃO A endometriose é uma doença frequentemente associada à infertilidade, sendo altamente prevalente entre mulheres inférteis (D'hooghe et al., 2003; Holoch e Lessey, 2010). Apesar de os mecanismos de causa e efeito dessa relação ainda carecerem de esclarecime ntos, diversos estudos propõem um impacto deletério da endometriose sobre a qualidade oocitária (Brizek et al., 1995; Saito et al., 2002; Allegra et al., 2014; Barcelos et al., 2009, 2015; Da Broi et al., 2014; Donabela et al ., 2015 ; Da Luz et al ., 2017 ). A aquisição da competência oocitária é condicionada pelo conteúdo do fluido folicular e a influência das células da granulosa e do cumulus (Canipari, 2000; Thomas et al., 2005; Thomas e Vanderhyden, 2006; Gilchrist, 2011). Para que ocorra um desenvolvimen to folicular e oocitário adequados, levando à ovulação, é necessário que ocorra uma comunicação precisa entre as células do cumulus e entre elas e o oócito, por meio de várias moléculas codificadas por genes específicos ( Albertini et al., 2003; Assou et al., 2006), cuja expressão é regulada a nível de transcrição e tradução. Os microRNAs atuam como reguladores pós-transcricionais (Ambros et al., 2007; Lee et al., 2006), e alguns estudos evidenciaram que a desregulação de microRNAs pode levar a comprometimento da qualidade gamética (Chen et al., 2017; Machtinger et al., 2017). Desta forma, propusemos um estudo inédito da análise de microRNAs em CCs de mulheres inférteis com e sem endometriose com o objetivo de avaliar se ocorre desregulação de microRNAs env olvidos na regulação de processos biológicos e vias de atuação importantes para a aquisição e manutenção da qualidade oocitária, visando obter mais informações sobre os mecanismos pelos quais a endometriose poderia interferir com a qualidade oocitária. Con siderando o restrito acesso populacional às técnicas de reprodução assistida, mesmo em países desenvolvidos, c ompreender esses mecanismos etiopatogênicos pode ser valioso na concepção de abordagens terapêuticas efetivas para melhorar a fecundidade natural desses pacientes. Ao compararmos os grupos controle e endometriose I/II, encontramos os microRNAs hsa-let-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-218, hsa-miR-30b e hsa -miR-629-5p menos expressos nas pacientes com a doença. Os genes regulados por esses microRNAs estão envolvidos em vias relacionadas, na sua maioria, a processos de controle do ciclo celular, proliferação celular e apoptose (via de sinalização p53, via de sinalização Wnt , via de sinalização Ras, junções aderentes, via de sinalização PI3K -Akt, via de sinalização Rap1, via de sinalização FoxO, via de sinalização ErbB, via de sinalização MAPK e metabolismo de ácidos graxos). Como os miRNAs atuam como silenciadores de expressão (Singh et al., 2008) acreditamos que haja uma maior expressão dessas vias na doença inicial. 54 A via de sinalização p53 está envolvida com processos de reparo de danos ao DNA, regulação do ciclo celular e indução de apoptose. A ativação do p53 é induzida por uma série de sinais como o estresse oxidativo (Pietenpol et al., 2002). A via de sinalização FoxO também está envolvida no controle do ciclo celular, apoptose , resistência ao estresse oxidativo e longevidade (Hagenbuchner et al., 2013). Da mesma forma, a via de sinalização PI3K-Akt está relacionada a processos como controle do ciclo celular e apoptose. A via de sinalização Ras também atua na parada do ciclo celular e apoptose, tendo a função de regular a proliferação e sobrevivência celular (Cox et al., 2003). Uma maior ativação tanto da via p53 como das vias FoxO, PI3K-Akt e Ras pode indicar que as CCs estejam sofrendo um dano oxidativo, com tentativa de reparo ao DNA e indução de apoptose, o que pode comprometer o desenvolvimento folicular e afetar a maturação e a qualidade oocitárias. Esses achados corroboram evidências da literatura de alterações no ciclo celular e maior apoptose em CCs dessas pacientes (Toya et al., 2000 e Díaz et al., 2009). Além disso, a endometriose é uma doença que tem sido associada ao estresse oxidativo (Choi, et al., 2015; Da Broi et., 2016; Huang et al., 2014; Liu et al., 2013; Nasiri et al., 2017; Prieto et al. 2012; Singh et al., 2013 ) com alterações em marcadores tanto a nível peritoneal (Polak et al., 2013; Santulli et al., 2015; Shanti et al., 1999), como sistêmico (Andrade et al., 2010; Da Broi et al., 2016; Liu et al., 2013; Nasiri et al., 2017; Singh et al., 2013 ) e folicular (Choi, et al., 2015; Donabela et al., 2015; Da Broi et al., 2016; Huang et al., 2014; Liu et al ., 2013 ), havendo evidência de dano oxidativo ao DNA no microambiente folicular dessas mulheres (Da Broi et al, 2016). Sabe-se que as CCs atuam na proteção do oócito contra agentes pro -oxidantes ( Devine et al., 2012). No entanto, quando essa capacidade antioxidante é exacerbada, elas podem ser danificadas e os oócitos sofrem os efeitos nocivos do estresse oxidativo (Shaeib et al., 2016). Assim, acreditamos que o estresse oxidativo possa estar envolvido no comprometimento da CCs e, consequ entemente, da qualidade oocitária dessas pacientes, o que poderia estar envolvido na infertilidade apresentada por elas. As vias de sinalização Wnt, junções aderentes, Rap1 e ErbB estão envolvidas no controle da polaridade, adesão e proliferação celular (Saito et al., 2001; Nakanishi et al., 2004; Hattori et al., 2003; Yarden Y, Sliwkowski et al., 2001). A alteração dessas vias em CCs de mulheres inférteis com endometriose sugere uma inibição do processo de proliferação celular, o que, juntamente com a ativação de vias relacionadas à indução da apoptose, indica dano às CCs, com possível comprometimento do desenvolvimento oocitário. Já o sistema MAPK atua como um sensor de status de energia celular. É ativado por aumentos na relação AMP:ATP celular causada por estresses metabólicos que interferem com 55 a produção de ATP ou que aceleram o consumo de ATP. Uma vez ativada, a MAPK conduz a uma inibição concomitante de vias biossintéticas que consomem energia, tais como síntese de proteínas, ácidos graxos e glicogênio e ativação de vias catabólicas produtoras de ATP, tais como oxidação de ácidos graxos e glicólise ( Hardie et al., 2004). A via de metabolismo de ácidos graxos te m relação direta com a via MAPK e está envolvida nos processos de fosforilação oxidativa e cadeia respiratória. Esses processos são extremamente importantes para a célula. A fosforilação oxidativa, tem por função produzir energia na forma de ATP através da oxidação de nutrienetes e liberação de elétrons ( Weber e Senior, 2003; Dumesic et al., 2015 Weber e Senior, 2003; Dumesic et al., 2015). Esse mecanismo molecular de formação de ATP ocorre por meio dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial localizad a na membrana interna da mitocôndria e também contribui para a geração de espécies reativas de oxigênio (Weber e Senior, 2013; Dumesic et al., 2015). Os ácidos graxos são considerados importantes fontes de energia para o oócito (Sanchez-Lazo et al.,2014). As células do cumulus são capazes de incorporar e armazenar os ácidos graxos formando gotículas lipídicas (LDs), protegendo assim o oócito dos níveis elevados de ácidos graxos saturados (Sanchez-Lazo et al., 2014). Assim, a maior expressão dessas vias em CCs pode indicar uma maior necessidade de aporte energético frente ao estresse oxidativo folicular já evidenciado na doença, com consequente aumento da oxidação de ácidos graxos e glicólise, culminando com maior produção de ATP e também maior geração de es pécies reativas, o que pode danificar mais ainda as CCs e comprometer a aquisição de competência oocitária. Nesse sentido, Hsu et al., 2015 evidenciou atividade mitocondrial comprometida em CCs de mulheres inférteis com endometriose, o que pode reforçar nossos achados. Quando comparamos os grupos controle e endometriose III/IV encontramos os microRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa-miR-532-3p e hsa -miR-629- 5p menos expressos nas pacientes com endometriose III/IV em relação às pacientes controles. Os genes regulados por estes microRNAs estão envolvidos em vias semelhantes à comparação endometriose I/II e controle, envolvidas, na sua maioria, em processos de apoptose, regulação do ciclo e proliferação celular (via de apoptose, via de sinalização p53, via de sinalização Rap1, Via de sinalização Wnt e metabolismo de ácidos graxos). Sendo assim, esse grupo de mulheres também apresentaram maior atividade na via de apoptose, cuja ativação pode se dar por danos ao DNA e estresse metabólico. Esses achados sugerem que, na doença, essas vias também estão mais ativas, decorrentes dos danos ao DNA promovidos pelo estre sse oxidativo , com consequente indução de apoptose, redução de prolifera ção, aumento de adesão celular, maior 56 necessidade energética e maior produção de EROs nessas células. Nesse contexto, um estudo que avaliou a expressão de genes codificantes de antioxidantes enzimáticos em CCs de mulheres com endometriose evidenciou maior expressão do gene SOD1 em CC de pa cientes inférteis com endometriose III/IV quando comparadas a pacientes inférteis sem endometriose e com endometirose I/II, sugerindo uma resposta antioxidante compensatória frente ao dano oxidativo oocitáio desencadeado pela doença (Donabela et al., 2015). Ao comparar-se os grupos endometriose I/II e endometriose III/IV, os microRNAs hsa- let-7f-1# e hsa-miR-362-3p estavam mais expressos e os microRNAs hsa -miR-187-3p e hsa- miR-532-3p apresentaram -se menos expressos nas pa cientes com endometriose III/IV . Analisando os genes regulados pelos microRNAs desregulados, 18 genes eram comuns a micros mais e menos expressos, de modo que foram excluídos da análise. Os genes relacionados aos microRNAs mais expressos estão envolvidos com as vias de sinalização JAK -Stat, via de sinalização FoxO, via de sinalização Wnt e via de sinalização ErbB. A via de sinalização do Jak-Stat está envolvida com interação de receptor de citocina, ciclo celular e anti -apoptose. Como descrito anteriormente, a via de sinalização FoxO tem relação com estresse oxidativo, reparo de DNA e apoptose. E as vias de sinalização Wnt e ErbB estão envolvidas no controle da polaridade, adesão e proliferação celular. A menor atividade dessas vias em mulheres inférteis com endometriose avançada indicam menor reparo de dano de DNA, mais apoptose e menos proliferação celular nas CCs dessas pacientes, sugerindo maior dano folicular e, consequentemente, oocitário com a progressão da doença. Os genes regulados pelos micr os menos expressos na endometriose I/II comparada à III/IV não estão envolvidos em vias comuns, sendo necessária a realização de mais estudos a fim de se verificar as funções biológicas em que cada um desses genes está envolvido e, assim, entender melhor seu papel na qualidade oocitária diante da doença inicial. Conclusões 58 6. CONCLUSÕES Os microRNAs hsa-let-7f-1#, hsa-miR-1291, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-218, hsa-miR- 30b e hsa -miR-629-5p apresentam-se menos expressos nas CCs d as pacientes inférteis com endometriose I/II em relação às pacientes controles. Os microRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-30b, hsa-miR-532-3p e hsa- miR-629-5p apresentam-se menos expressos nas CCs d as pacientes com endometriose III/IV em relação às pacientes controles. Os microRNAs hsa-miR-1291, hsa-miR-30b e hsa -miR-629-5p apresentam-se menos expressos nas CCs tanto do grupo endometriose I/II , como do grupo endometriose III/IV , quando comparados ao grupo controle. Os microRNAs hsa -miR-187-3p e hsa -miR-532-3p apresentam-se menos expressos e os microsRNAs hsa -let-7f-1# e hsa -miR-362-3p mais expressos nas CCs d as pacientes com endometriose III/IV em relação às pacientes com endometriose I/II. A análise de enriquecimento das vias reguladas por esses micros sugere alterações em vias de apoptose, dano oxidativo ao DNA e proliferação nas CCs de mulheres inférteis tanto com endometriose inicial como avançada o que poderia estar envolvido na etiopatogênese da infertilidade associada à doença. Dessa forma, nossos achados evidenciam desregulação em microRNAs em células do cumulus de mulheres inférteis com endometriose inicial e avançada passíveis de comprometer vias envolvidas na aquisição da competência oocitária, auxiliando a elucidar mecanismos moleculares envolvidos no comprometimento da qualidade oocitária relacionado à doença. Referências Bibliográficas 60 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abreu LG , Romão GS , Dos Reis RM , Ferriani RA , De Sá MF , De Moura MD . Reduced aromatase activity in granulosa cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques. 2006 Aug;22(8):432-6. Albertini DF, Barrett SL. Oocyte -somatic cell communication. Reproduction. 2003 61:49 -54. 2003. Al-Fadhli R, Kelly SM, Tulandi T, Tanr SL. Effects of different stages of endometriosis on the outcome of in vitro fertilization. J Obstet Gynaecol Can 2006; 28:888-91. ALPHA Scientists In Reproductive Medicine ; ESHRE Special Interest Group Embryology . 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NOME DA PESQUISA: “Perfil diferencial de microRNAs em células do Cummulus oophorus de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana” 2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro e Liliane Fabio Isidoro da Silva Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada“Perfi l diferencial de microRNAs em células do Cummulus oophorus de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana”. A endometriose, doença na qual há endométrio (tecido que em situações normais está presente apenas na parte interna do útero) em atividade fora da cavidade uterina, apresenta elevada prevalência em mulheres em idade reprodutiva. Existe uma forte associação entre a ocorrência de endometriose e infertilidade (não ocorrência de gravidez após 12 meses de atividade sexual regular sem uso de métodos para evitar a gestação). Os mecanismos responsáveis tanto pela redução da fertilidade natural, como pelos piores resultados dos procedimentos de reprodução assistida em portadoras desta doença são pouco conhecidos, sendo questionad o um possível papel prejudicial da endometriose sobre a esteroidogênese ovariana, foliculogênese e qualidade oocitária. Como os oócitos humanos são extremamente raros e a sua utilização em estudos invasivos, que impossibilitam a utilização dos mesmos nos p rocedimentos de reprodução assistida, geralmente não é exequível, a identificação de biomarcadores não invasivos, passíveis HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO-USP DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar - Ribeirão Preto-SP - CEP 14049- 900 Fone (016) 3602-2231 - Fax (016)3633-0946 Setor de Reprodução Humana 72 de predição da qualidade oocitária, é bastante desejável. Neste contexto, as células do Cumulus oophorus podem ser utilizadas como b iomarcadores indiretos de qualidade oocitária e resultados de fertilização in vitro. Pequenas moléculas de RNA (microRNAs) desempenham papel importante na regulação pós -transcricional de genes -alvo, parecem estar envolvidos na regulação esteroidogênese ovariana, foliculogênese e maturação oocitária. Acreditamos que a desregulação dessas pequenas moléculas em células do Cumulus oophorus possa ajudar a entender os processos envolvidos com a infertilidade observada em portadoras desta doença, o que motivou a realização do presente estudo. Propomos avaliar se os níveis dessas pequenas moléculas (microRNAs) nas células do Cumulus oophorus no dia da realização da captação de óvulos. Fui informada de que o procedimento pode ocasionar discreta dor local, podendo ap arecer hematomas no local da punção. Também autorizo a utilização das células da granulosa (células que envolvem o óvulo, representando a parede do folículo ovariano) obtidos, durante o procedimento de captação dos óvulos, após a identificação e separação dos óvulos pela bióloga responsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução. Fui informada de que, após o isolamento dos óvulos, as células da granulosa (que ficam misturadas ao fluido) são desprezadas, uma vez que não apresentam qualquer u tilidade para o procedimento de reprodução ao qual serei submetida. Temos indícios de que a endometriose possa também comprometer a qualidade dos óvulos, levando a redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam procedimentos de reprodução assist ida. Nas mulheres inférteis com endometriose e, questiona -se se um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar, seja a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade e, conseqüentemente, gerar uma gestação menos viável. Contudo, na atualidade, não se realiza a avaliação adequada da qualidade oocitária, devido à ausência de métodos bem estabelecidos capazes de predizer se os óvulos são bons ou não. A identificação da presença de alterações nas células do cumulus de pacientes portadoras de endometriose, não somente ajudaria a elucidar o mecanismo causador da infertilidade, como também abriria perspectivas futuras de tratamento para este grupo de pacientes. Contudo, para podermos dizer se os óvulos destas pacientes com endometriose são ou não são de boa qualidade, precisamos comparar a qualidade dos mesmos com a de óvulos provenientes de um grupo de pacientes tido como grupo controle, ou seja, cuja qualidade dos óvulos seja considerada como padrã o de normalidade. Desta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de paciente do grupo controle, ou seja, cujos óvulos sejam 73 considerados como padrão de normalidade, para fins de comparação com os óvulos das pacientes com endometriose. Também devemos ressaltar que a sua participação no presente estudo não implicará na realização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para tentar engravidar, com exceção da coleta de sangue no dia de início de estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o uso da gonadotrofina coriônica humana e no dia da realização da captação de óvulos, como descrito acima. Sua colaboração, portanto, no fornecimento de amostras de células da granulosa, será imprescindível para um melhor conhecimento da qualidade dos oócitos de pacientes com dificuldade para engravidar devido à Endometriose. Este conhecimento no futuro poderá ser usado no sentido de propiciar um tratamento mais eficaz da infertilidade associada à Endometriose. É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu companheiro. Todo o material obtido será utilizado exclusivamente para a avaliação das células da granulosa. Autorizo, caso haja amostras remanescentes de materiais colhidos (células da granulosa), ao armazenamento das mesmas, sendo que somente poderão ser utilizadas para a realização de pesquisas futuras, caso eu dê a minha autorização expressa, mediante a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido específico da n ova(s) pesquisa(s). No caso de haver amostras remanescentes, eu assinarei um termo de consentimento específico, autorizando a sua estocagem e onde conste os tipos e quantidades de alíquotas armazenadas. 3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todos as dúvidas com relaç ão ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente esclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você tem a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do es tudo, a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes dos integrantes deste estudo, bem como garantimos que será mantido o caráter confidencial de toda informação r elacionada a sua privacidade. Temos o compromisso de que serão prestadas informações atualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa afetar a vossa vontade de continuar dele participando. Asseguramos o compromisso de que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste projeto, bem como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa. 74 Eu, _______________________________ ______________, RG nº:___________ aba ixo assinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e aceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras de células da granulosa.,. Autorizo a pesquisadora abaixo mencionada a utilizá -los para a pesquisa : “Perfil diferencial de microRNAs em células do Cummulus oophorus de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana”,estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu consentimento e de deixar de participar do estud o a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. Ribeirão Preto _______ / _______ / _________ _______________________________ ___________________________ Assinatura- Paciente Assinatura do Pesquisador 4. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP Liliane Fabio Isidoro da Silva – CRBM: 13993 – SP Telefone de contato: 16-3602-2231 Endereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínicas- Setor de Reprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. 75 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (GRUPO ENDOMETRIOSE) 1. NOME DA PESQUISA: “Perfil diferencial de microRNAs em células do Cummulus oophorus de mulheres inférteis c om e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana” 2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro e Liliane Fabio Isidoro da Silva Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada“Perfil diferencial de microRNAs em células do Cummulus oophorus de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana”. A endometriose, doença na qual há endométrio (tec ido que em situações normais está presente apenas na parte interna do útero) em atividade fora da cavidade uterina, apresenta elevada prevalência em mulheres em idade reprodutiva. Existe uma forte associação entre a ocorrência de endometriose e infertilida de (não ocorrência de gravidez após 12 meses de atividade sexual regular sem uso de métodos para evitar a gestação). Os mecanismos responsáveis tanto pela redução da fertilidade natural, como pelos piores resultados dos procedimentos de reprodução assistid a em portadoras desta doença são pouco conhecidos, sendo questionado um possível papel prejudicial da endometriose sobre a esteroidogênese ovariana, foliculogênese e qualidade oocitária. Como os oócitos humanos são extremamente raros e a sua utilização em estudos invasivos, que impossibilitam a utilização dos mesmos nos procedimentos de reprodução assistida, geralmente não é exequível, a identificação de biomarcadores não invasivos, passíveis de predição da qualidade oocitária, é bastante desejável. Neste contexto, as células do Cumulus oophorus podem ser utilizadas como biomarcadores indiretos de qualidade oocitária e resultados de fertilização in vitro. Pequenas moléculas de HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO-USP DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar - Ribeirão Preto-SP - CEP 14049- 900 Fone (016) 3602-2231 - Fax (016)3633-0946 Setor de Reprodução Humana 76 RNA (microRNAs) desempenham papel importante na regulação pós -transcricional de genes- alvo, parecem estar envolvidos na regulação esteroidogênese ovariana, foliculogênese e maturação oocitária. Acreditamos que a desregulação dessas pequenas moléculas em células do Cumulus oophorus possa ajudar a entender os processos envolvidos com a in fertilidade observada em portadoras desta doença, o que motivou a realização do presente estudo. Propomos avaliar se os níveis dessas pequenas moléculas (microRNAs) nas células do Cumulus oophorus no dia da realização da captação de óvulos. Fui informada de que o procedimento pode ocasionar discreta dor local, podendo aparecer hematomas no local da punção. Também autorizo a utilização das células da granulosa (células que envolvem o óvulo, representando a parede do folículo ovariano) obtidos, durante o pro cedimento de captação dos óvulos, após a identificação e separação dos óvulos pela bióloga responsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução. Fui informada de que, após o isolamento dos óvulos, as células da granulosa (que ficam misturada s ao fluido) são desprezadas, uma vez que não apresentam qualquer utilidade para o procedimento de reprodução ao qual serei submetida. Temos indícios de que a endometriose possa também comprometer a qualidade dos óvulos, levando a redução das chances de gr avidez, mesmo quando se realizam procedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometriose e, questiona -se se um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar, seja a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade e, conseqüentemente, gerar uma gestação menos viável. Contudo, na atualidade, não se realiza a avaliação adequada da qualidade oocitária, devido à ausência de métodos bem estabelecidos capazes de predizer se os óvulos são bons ou não. A identificação da presença de alterações nas células do cumulus de pacientes portadoras de endometriose, não somente ajudaria a elucidar o mecanismo causador da infertilidade, como também abriria perspectivas futuras de tratamento p ara este grupo de pacientes. Contudo, para podermos dizer se os óvulos destas pacientes com endometriose são ou não são de boa qualidade, precisamos comparar a qualidade dos mesmos com a de óvulos provenientes de um grupo de pacientes tido como grupo contr ole, ou seja, cuja qualidade dos óvulos seja considerada como padrão de normalidade. Desta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de paciente do grupo controle, ou seja, cujos óvulos sejam considerados como padrão de normalidade, para fins de comparação com os óvulos das pacientes com endometriose. 77 Também devemos ressaltar que a sua participação no presente estudo não implicará na realização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para tentar engravidar, com exceção da coleta de sangue no dia de início de estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o uso da gonadotrofina coriônica humana e no dia da realização da captação de óvulos, como descrito acima. Sua colaboração, portanto, no fornecimen to de amostras de células da granulosa, será imprescindível para um melhor conhecimento da qualidade dos oócitos de pacientes com dificuldade para engravidar devido à Endometriose. Este conhecimento no futuro poderá ser usado no sentido de propiciar um tra tamento mais eficaz da infertilidade associada à Endometriose. É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu companheiro. Todo o material obtido será utilizado exclusivamente para a avaliação das células da granulosa. Autorizo, caso haja amostras remanescentes de materiais colhidos ( células da granulosa), ao armazenamento das mesmas, sendo que somente poderão ser utilizadas para a realização de pesquisas futuras, caso eu dê a minha autorização expressa, mediante a assi natura do termo de consentimento livre e esclarecido específico da nova(s) pesquisa(s). No caso de haver amostras remanescentes, eu assinarei um termo de consentimento específico, autorizando a sua estocagem e onde conste os tipos e quantidades de alíquotas armazenadas. 3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todos as dúvidas com relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente esclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você tem a libe rdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes dos integrantes deste estudo, bem como garantimos que será mantido o caráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso de que serão prestadas informações atualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa afetar a vossa vontade de continuar dele partic ipando. Asseguramos o compromisso de que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste projeto, bem como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa. Eu, __ ___________________________________________, RG nº:___________ abaixo assinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e aceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras de células da 78 granulosa.,. Autorizo a pesquisadora abaixo mencionada a utilizá -los para a pesquisa : “Perfil diferencial de microRNAs em células do Cummulus oophorus de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana”,estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu consentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. Ribeirão Preto _______ / _______ / _________ _______________________________ ___________________________ Assinatura- Paciente Assinatura do Pesquisador 5. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP Liliane Fabio Isidoro da Silva – CRBM: 13993 – SP Telefone de contato: 16-3602-2231 Endereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínicas - Setor de Reprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. 79 8.2. Protocolo de Extração de RNA total (Kit mirVanaTMmiRNA Isolation) As amostras foram centrifugadas ‘a 4.000rpm por 5 minutos a 4 ºC. Em seguida, foi adicionou-se 300µl de “ Cell Disreption Buffer” gelado em cada amostras. As amostras foram homogeneizadas usando Politron e mantidas no gelo. Adicionou -se 300µl de “Denaturing Solution” e homogeneizadas com a pipeta e incubadas por 5 minutos no gelo. Acrescentou -se 600µl do Acid – Phenol Choroform e agitamos durante 60 segundos no vortex. Em seguida, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos em velocidade máxima (> 10.000g) em temperatura ambiente. Apos a centrifuga ção verificou-se a formação de 3 fases. Cuidadosamente, removeu -se a fase superior (fase aquosa) e transferiu -se para um novo microtubo. Adicionou -se 1,25 volume de etanol 100% (o volume retirado da fase aquosa multiplicado por 1,25). Após misturar completamente o mesmo foi transferido para um novo microtubo com filtro. Centrifugou-se por 1 minuto a 10.000g em temperatura ambiente. Descartou -se o que passou pelo filtro e repetimos a pipetagem até que a mistura de fase aquosa + etamol 100% passe toda pelo filtro. Adicionou-se 700µl de “miRNA Wash Solution 1” no filtro e centrifugou -se por 1 minuto a 10.000g em emperatura ambiente. Descartou -se novamente o que passou pelo filtro e reservou-se o tubo coletor e o filtro. Adicionou-se 500µl de “Wash Solution 2/3” no filtro e novamente centrifugou-se a 1 minuto a 10.000g em temperatura ambiente. Descartou -se o que passou pelo filtro e reservou -se o tubo coletor. Novamente, adicionou -se 500µl de “ Wash Solution 2/3” no filtro e centrifugaou-se a 1 minuto a 10.000g em temperatura ambiente. Transferiu-se o “ Filtro Cartridge” para um novo tubo coletor. Pipetou -se no centro do “Filtro Cartridge” 40µl de agua RNase free previamente aquecida a 95ºC no banho maria. Centrifugou-se por 1 minuto a 10.000g em temperatura ambiente. 80 8.3. Expressão dos microRNAs analisados. Micro Grupo N Mean Std Dev Median Lower Quartile Upper Quartile Minimum Maximum P-valor dme-miR-7 Controle 5 0,41 0,59 0,17 0,14 0,23 0,05 1,46 Endo I/II 5 0,04 0,04 0,03 0,03 0,05 0 0,11 0.08943 Endo III/IV 5 0,14 0,18 0,07 0,01 0,18 0,01 0,42 hsa-let-7a# Controle 4 0,86 1,12 0,36 0,23 1,49 0,19 2,52 Endo I/II 5 0,41 0,26 0,48 0,26 0,62 0,04 0,67 0.2878 Endo III/IV 3 1,04 0,61 0,93 0,49 1,69 0,49 1,69 hsa-let-7a Controle 5 0,65 0,3 0,74 0,34 0,9 0,33 0,97 Endo I/II 5 0,41 0,26 0,48 0,26 0,62 0,04 0,67 0.4317 Endo III/IV 5 0,49 0,46 0,33 0,13 0,79 0,05 1,15 hsa-let-7b# Controle 4 0 0 0 0 0,01 0 0,01 Endo I/II 4 0,02 0,03 0,01 0 0,04 0 0,06 0.2259 Endo III/IV 3 0,02 0,01 0,02 0,01 0,03 0,01 0,03 hsa-let-7b Controle 5 0,92 0,12 0,91 0,91 0,92 0,76 1,1 Endo I/II 5 0,71 0,32 0,85 0,64 0,93 0,17 0,95 0.2982 81 Endo III/IV 5 0,64 0,57 0,48 0,39 0,67 0,07 1,59 hsa-let-7c Controle 5 0,85 0,46 0,76 0,63 0,76 0,46 1,65 Endo I/II 5 0,62 0,42 0,54 0,34 1,06 0,12 1,06 0.6766 Endo III/IV 5 0,62 0,55 0,47 0,22 1,01 0,05 1,35 hsa-let-7d Controle 5 2,84 1 2,6 2,4 2,62 2 4,56 Endo I/II 5 1,65 1,08 2,2 0,92 2,4 0,12 2,61 0.4152 Endo III/IV 5 2,31 2,24 1,42 0,69 4,32 0,05 5,06 hsa-let-7e# Controle 5 1,52 0,84 1,22 1,09 1,43 0,87 2,97 Endo I/II 4 0,73 0,76 0,44 0,21 1,24 0,21 1,83 0.2521 Endo III/IV 4 4,02 3,46 4,13 1,17 6,88 0,14 7,7 hsa-let-7e Controle 5 1,56 1,07 1,27 1,04 1,29 0,76 3,44 Endo I/II 5 0,68 0,46 0,96 0,31 0,97 0,06 1,09 0.3296 Endo III/IV 5 1,03 0,7 0,9 0,83 1,49 0,04 1,88 hsa-let-7f Controle 5 0,89 0,69 0,85 0,45 1,01 0,17 1,98 Endo I/II 5 0,49 0,32 0,61 0,27 0,75 0,06 0,77 0.6057 Endo III/IV 4 0,98 0,93 0,74 0,25 1,7 0,24 2,18 hsa-let-7f-1# Controle 5 2,96 1,47 3,37 1,51 4,22 1,32 4,4 82 Endo I/II 5 1,05 0,95 1,08 0,26 1,18 0,2 2,55 0.01914 Endo III/IV 3 5,27 2,46 4,78 3,09 7,94 3,09 7,94 hsa-let-7f-2# Controle 5 6,49 3,66 4,76 4,67 5,6 4,43 12,99 Endo I/II 4 4,83 2,81 3,96 3,14 6,53 2,49 8,92 0.5853 Endo III/IV 5 6,2 6,2 5,79 0,33 10,53 0,16 14,2 hsa-let-7g# Controle 5 0,59 0,5 0,66 0,16 0,81 0,03 1,27 Endo I/II 3 0,69 0,42 0,87 0,2 0,99 0,2 0,99 0.7659 Endo III/IV 3 0,69 0,4 0,67 0,3 1,1 0,3 1,1 hsa-let-7g Controle 5 1,12 0,46 1,19 0,89 1,46 0,47 1,61 Endo I/II 5 0,72 0,53 0,81 0,39 0,95 0,04 1,41 0.4819 Endo III/IV 5 1 0,8 0,73 0,57 1,59 0,07 2,05 hsa-let-7i# Controle 4 1,72 1,76 1,18 0,48 2,96 0,31 4,21 Endo I/II 4 0,77 0,42 0,87 0,44 1,1 0,22 1,11 0.4981 Endo III/IV 3 2,97 3 2,51 0,23 6,18 0,23 6,18 hsa-miR-100# Controle 4 6,54 9,91 1,79 1,35 11,73 1,18 21,39 Endo I/II 4 7,34 7,21 7,03 1,11 13,56 1,02 14,28 0.9738 Endo III/IV 3 4,04 2,8 3,65 1,45 7,02 1,45 7,02 83 hsa-miR-100 Controle 5 1,67 0,9 1,36 0,95 2,3 0,82 2,91 Endo I/II 5 1,45 0,75 1,65 1,24 1,68 0,33 2,37 0.99 Endo III/IV 5 2,39 2,16 1,23 0,81 4,54 0,43 4,93 hsa-miR-101 Controle 5 0,39 0,47 0,27 0,14 0,29 0,02 1,21 Endo I/II 5 0,1 0,06 0,11 0,06 0,14 0,03 0,18 0.3086 Endo III/IV 4 0,45 0,42 0,4 0,1 0,81 0,08 0,94 hsa-miR-103 Controle 5 0,43 0,26 0,34 0,29 0,46 0,2 0,86 Endo I/II 5 0,23 0,11 0,29 0,24 0,3 0,04 0,3 0.6451 Endo III/IV 5 0,79 0,98 0,2 0,1 1,39 0,02 2,24 hsa-miR-106a Controle 5 0,82 0,31 0,85 0,78 1,06 0,33 1,1 Endo I/II 5 0,5 0,22 0,61 0,42 0,64 0,14 0,66 0.1075 Endo III/IV 5 0,44 0,21 0,42 0,34 0,6 0,16 0,68 hsa-miR-106b# Controle 5 1,12 0,92 0,62 0,59 1,32 0,43 2,66 Endo I/II 5 0,54 0,54 0,3 0,28 0,7 0,01 1,41 0.4764 Endo III/IV 4 1,21 1,7 0,53 0,27 2,15 0,04 3,73 hsa-miR-106b Controle 5 0,34 0,33 0,26 0,13 0,28 0,1 0,9 Endo I/II 5 0,13 0,06 0,13 0,08 0,19 0,07 0,19 0.4049 84 Endo III/IV 5 0,26 0,24 0,17 0,08 0,44 0,03 0,59 hsa-miR-107 Controle 5 0,92 0,42 0,8 0,59 1,29 0,49 1,42 Endo I/II 4 0,73 0,45 0,68 0,38 1,08 0,27 1,29 0.742 Endo III/IV 4 1,68 1,61 1,38 0,36 3 0,33 3,62 hsa-miR-10a Controle 5 1,4 0,9 1,05 0,86 1,59 0,6 2,88 Endo I/II 4 21,01 39,99 1,41 0,7 41,33 0,24 80,99 0.8969 Endo III/IV 4 1,89 1,83 1,92 0,31 3,47 0,16 3,56 hsa-miR-10b# Controle 5 0,57 0,67 0,36 0,26 0,4 0,09 1,75 Endo I/II 3 1,62 2,74 0,06 0,01 4,77 0,01 4,77 0.6054 Endo III/IV 4 0,21 0,17 0,15 0,12 0,3 0,09 0,46 hsa-miR-1180 Controle 5 0,61 0,21 0,56 0,45 0,8 0,39 0,86 Endo I/II 5 0,18 0,16 0,13 0,11 0,16 0,04 0,44 0.08458 Endo III/IV 5 0,59 0,61 0,23 0,21 1,15 0,01 1,35 hsa-miR-1183 Controle 5 0,02 0,04 0 0 0 0 0,08 Endo I/II 5 0,3 0,66 0 0 0 0 1,49 0.8758 Endo III/IV 5 0,38 0,53 0 0 0,83 0 1,07 hsa-miR-1201 Controle 5 1,47 0,91 1,6 0,89 2,3 0,23 2,34 85 Endo I/II 5 1,72 1,43 1,38 0,61 2,26 0,41 3,92 0.7634 Endo III/IV 5 5,06 7,16 2,05 0,95 4,33 0,4 17,58 hsa-miR-1208 Controle 5 0,02 0,02 0,02 0,01 0,03 0,01 0,05 Endo I/II 5 0,03 0,02 0,03 0,02 0,03 0,02 0,06 0.8869 Endo III/IV 5 0,05 0,07 0,02 0,02 0,06 0 0,17 hsa-miR-122 Controle 5 0,87 1,1 0,12 0,12 1,6 0,06 2,47 Endo I/II 4 1,49 1,69 0,8 0,54 2,43 0,35 4 0.2051 Endo III/IV 4 0,27 0,24 0,23 0,09 0,45 0,03 0,59 hsa-miR-1225- 3P Controle 5 2,32 1,13 2,04 1,32 3,33 1,23 3,66 Endo I/II 5 2,24 1,11 1,72 1,37 3,26 1,25 3,61 0.2299 Endo III/IV 5 1 0,69 1,34 0,47 1,47 0,08 1,66 hsa-miR-1226# Controle 5 0,74 0,91 0,29 0,2 0,73 0,15 2,32 Endo I/II 4 0,4 0,31 0,41 0,14 0,67 0,11 0,7 0.7086 Endo III/IV 4 0,73 0,79 0,37 0,29 1,17 0,28 1,92 hsa-miR-1227 Controle 5 1,17 0,82 1,24 0,38 1,89 0,29 2,04 Endo I/II 5 0,6 0,58 0,35 0,23 0,75 0,12 1,56 0.3923 Endo III/IV 4 0,58 0,25 0,49 0,41 0,75 0,38 0,95 86 hsa-miR-1233 Controle 4 1163,69 2327,1 0,2 0,11 2327,28 0,04 4654,34 Endo I/II 3 0,61 0,69 0,42 0,02 1,37 0,02 1,37 0.9426 Endo III/IV 3 0,4 0,52 0,13 0,08 1 0,08 1 hsa-miR-1244 Controle 5 0,5 0,09 0,52 0,45 0,55 0,36 0,61 Endo I/II 5 0,47 0,44 0,46 0,09 0,72 0,02 1,07 0.9458 Endo III/IV 4 0,46 0,3 0,44 0,25 0,67 0,11 0,84 hsa-miR-1247 Controle 4 3,94 3,6 3,19 1,04 6,84 0,93 8,46 Endo I/II 4 35,57 67,8 2,29 0,74 70,4 0,44 137,26 0.926 Endo III/IV 4 3,56 2,17 2,86 2,27 4,85 1,8 6,73 hsa-miR-1248 Controle 5 1,01 0,99 0,73 0,4 0,88 0,3 2,73 Endo I/II 4 2,7 2,08 1,95 1,35 4,06 1,19 5,73 0.1789 Endo III/IV 4 1,07 1,27 0,55 0,28 1,86 0,25 2,95 hsa-miR-1249 Controle 5 0,74 0,4 0,73 0,68 0,99 0,12 1,19 Endo I/II 5 0,87 0,74 0,77 0,26 1,42 0,1 1,82 0.9078 Endo III/IV 3 0,86 0,58 0,9 0,26 1,42 0,26 1,42 hsa-miR-1254 Controle 4 0,67 0,79 0,33 0,25 1,1 0,17 1,86 Endo I/II 5 0,47 0,34 0,46 0,17 0,61 0,14 0,97 0.9364 87 Endo III/IV 5 0,39 0,24 0,25 0,22 0,64 0,18 0,65 hsa-miR-1255B Controle 5 2,8 3,47 0,73 0,42 4,46 0,21 8,15 Endo I/II 5 0,76 0,28 0,79 0,59 0,99 0,38 1,07 0.1824 Endo III/IV 4 0,34 0,21 0,37 0,17 0,51 0,09 0,53 hsa-miR-125a- 3p Controle 5 2,7 2,34 1,71 1,39 3,27 0,62 6,52 Endo I/II 5 2,24 0,76 2,34 2,13 2,58 1,06 3,11 0.6126 Endo III/IV 5 1,79 0,36 1,81 1,48 2,08 1,36 2,2 hsa-miR-125a- 5p Controle 5 1,95 0,8 1,94 1,49 2,62 0,88 2,83 Endo I/II 5 3,1 2,51 2,38 1,55 2,82 1,29 7,45 0.2209 Endo III/IV 5 1,25 0,95 0,89 0,59 1,55 0,46 2,77 hsa-miR-125b Controle 5 0,81 0,44 0,79 0,54 0,85 0,36 1,51 Endo I/II 5 1,24 0,97 1,06 0,68 1,46 0,24 2,78 0.9324 Endo III/IV 5 1,66 1,78 0,52 0,4 3,51 0,18 3,69 hsa-miR-125b- 2# Controle 5 1,87 0,69 2,28 1,14 2,29 1,09 2,53 Endo I/II 5 1,33 1,65 1,15 0,11 1,16 0,09 4,12 0.7334 Endo III/IV 5 2,27 2,09 2,86 0,41 2,96 0,01 5,11 hsa-miR-126# Controle 5 2,18 4,03 0,55 0,27 0,62 0,08 9,38 88 Endo I/II 5 0,55 0,82 0,17 0,12 0,47 0 1,99 0.6561 Endo III/IV 4 0,4 0,36 0,35 0,16 0,65 0,02 0,89 hsa-miR-1260 Controle 5 10,62 21,61 1,06 0,73 1,65 0,38 49,27 Endo I/II 5 1,59 1,93 0,73 0,62 1,44 0,22 4,95 0.4449 Endo III/IV 5 0,7 0,67 0,35 0,3 1,13 0,08 1,66 hsa-miR-126 Controle 5 0,41 0,66 0,16 0,07 0,23 0,03 1,59 Endo I/II 5 0,14 0,15 0,12 0,03 0,18 0,02 0,37 0.2982 Endo III/IV 5 0,06 0,04 0,05 0,04 0,06 0,01 0,13 hsa-miR-1262 Controle 5 0,13 0,19 0,05 0,03 0,07 0,01 0,47 Endo I/II 4 0,3 0,31 0,28 0,03 0,56 0,02 0,6 0.6462 Endo III/IV 5 0,17 0,25 0,07 0,07 0,08 0,01 0,62 hsa-miR-1270 Controle 5 1 0,65 1 0,46 1,18 0,39 1,99 Endo I/II 5 0,32 0,21 0,2 0,17 0,48 0,16 0,62 0.1054 Endo III/IV 5 0,63 0,4 0,39 0,37 0,72 0,37 1,29 hsa-miR-127 Controle 5 0,85 0,58 1,02 0,39 1,04 0,17 1,62 Endo I/II 5 0,72 0,41 0,61 0,51 1,08 0,19 1,19 0.9704 Endo III/IV 5 0,81 0,65 0,68 0,43 0,88 0,17 1,87 89 hsa-miR-1271 Controle 5 0,87 0,69 0,86 0,39 1,35 0,03 1,72 Endo I/II 5 1,11 0,6 1,04 0,94 1,14 0,4 2,06 0.6126 Endo III/IV 5 1,34 0,97 1,2 1,11 1,46 0,11 2,81 hsa-miR-1274A Controle 5 0,53 0,49 0,37 0,22 0,64 0,08 1,32 Endo I/II 5 0,67 0,94 0,36 0,12 0,42 0,11 2,34 0.1451 Endo III/IV 5 0,13 0,1 0,11 0,06 0,21 0,03 0,25 hsa-miR-1274B Controle 5 0,85 0,49 0,82 0,7 0,94 0,2 1,57 Endo I/II 5 2,16 3,65 0,53 0,42 0,8 0,36 8,68 0.1479 Endo III/IV 5 0,38 0,27 0,29 0,17 0,49 0,15 0,8 hsa-miR-1275 Controle 5 0,49 0,36 0,54 0,27 0,6 0,05 1 Endo I/II 5 0,47 0,15 0,44 0,37 0,57 0,31 0,68 0.7558 Endo III/IV 5 0,66 0,42 0,47 0,46 0,58 0,4 1,4 hsa-miR-1276 Controle 5 2,22 1,37 2,34 1,18 2,69 0,71 4,2 Endo I/II 5 1,33 0,47 1,49 0,94 1,7 0,73 1,79 0.6126 Endo III/IV 5 1,77 1,69 1,68 0,41 1,87 0,36 4,51 hsa-miR-1285 Controle 5 1,5 1,25 1,1 1,07 1,21 0,43 3,67 Endo I/II 5 0,77 0,45 0,59 0,52 0,95 0,31 1,46 0.2491 90 Endo III/IV 5 0,58 0,43 0,6 0,21 0,77 0,12 1,18 hsa-miR-128a Controle 5 1,13 0,48 1,16 0,76 1,24 0,63 1,87 Endo I/II 5 0,74 0,25 0,83 0,57 0,85 0,42 1,05 0.3055 Endo III/IV 4 1,3 0,77 1,26 0,74 1,87 0,42 2,26 hsa-miR-1290 Controle 4 0,54 0,54 0,34 0,2 0,87 0,15 1,33 Endo I/II 5 0,47 0,43 0,36 0,24 0,41 0,13 1,21 0.7408 Endo III/IV 5 0,29 0,17 0,31 0,22 0,33 0,06 0,52 hsa-miR-129 Controle 5 29,17 36,41 17,06 3,17 33,79 1,77 90,07 Endo I/II 3 73,61 48,03 47,61 44,18 129,04 44,18 129,04 0.1788 Endo III/IV 3 58,4 57,13 37,71 14,49 122,99 14,49 122,99 hsa-miR-1291 Controle 5 0,99 0,87 0,91 0,32 1,19 0,17 2,36 Endo I/II 5 0,13 0,17 0,06 0,03 0,09 0,02 0,43 0.04243 Endo III/IV 5 0,23 0,26 0,13 0,09 0,23 0 0,68 hsa-miR-1296 Controle 5 3,03 1,11 2,51 2,45 4,02 1,8 4,39 Endo I/II 4 0,45 0,18 0,47 0,3 0,61 0,28 0,61 0.05625 Endo III/IV 4 8,51 14 2,17 0,65 16,37 0,28 29,42 hsa-miR-1298 Controle 5 0,82 1,28 0,28 0,16 0,54 0,03 3,07 91 Endo I/II 5 0,5 0,51 0,26 0,15 0,84 0,02 1,22 0.9704 Endo III/IV 5 0,83 1,18 0,42 0,13 0,68 0,04 2,89 hsa-miR-1300 Controle 4 0,4 0,47 0,22 0,13 0,66 0,06 1,09 Endo I/II 4 0,68 0,75 0,43 0,24 1,12 0,08 1,78 0.2727 Endo III/IV 3 0,13 0,05 0,15 0,07 0,16 0,07 0,16 hsa-miR-1303 Controle 5 1,09 0,58 1 0,81 1,64 0,3 1,68 Endo I/II 5 0,27 0,37 0,09 0,05 0,3 0,02 0,89 0.06311 Endo III/IV 4 1,2 1,28 0,82 0,38 2,02 0,13 3,05 hsa-miR-1305 Controle 5 0,43 0,55 0,21 0,19 0,22 0,1 1,41 Endo I/II 5 1,05 0,4 1,01 0,77 1,4 0,57 1,49 0.208 Endo III/IV 5 0,8 0,73 0,64 0,23 1,24 0,05 1,82 hsa-miR-130a Controle 5 0,67 0,26 0,81 0,55 0,84 0,27 0,88 Endo I/II 5 0,54 0,29 0,51 0,47 0,71 0,14 0,9 0.1511 Endo III/IV 5 0,32 0,21 0,29 0,2 0,46 0,06 0,59 hsa-miR-130b# Controle 5 0,82 0,73 0,61 0,26 1,06 0,2 1,98 Endo I/II 4 1,73 1,05 1,53 1,1 2,36 0,68 3,19 0.2285 Endo III/IV 3 1,18 0,35 1,35 0,79 1,42 0,79 1,42 92 hsa-miR-130b Controle 5 1,15 0,41 1,35 1,06 1,44 0,48 1,44 Endo I/II 5 0,98 0,53 1,22 1,13 1,26 0,03 1,26 0.1367 Endo III/IV 5 0,65 0,5 0,82 0,27 0,92 0,01 1,24 hsa-miR-132# Controle 5 1,15 0,81 1,27 0,44 1,52 0,28 2,25 Endo I/II 3 0,69 0,67 0,34 0,26 1,46 0,26 1,46 0.338 Endo III/IV 4 3,29 4,4 1,5 0,61 5,98 0,38 9,79 hsa-miR-132 Controle 5 0,8 0,46 0,77 0,43 1,03 0,32 1,46 Endo I/II 5 0,53 0,34 0,42 0,35 0,48 0,27 1,12 0.5273 Endo III/IV 5 0,59 0,33 0,58 0,57 0,69 0,1 1,01 hsa-miR-133a Controle 5 0,44 0,44 0,24 0,2 0,44 0,14 1,21 Endo I/II 5 1,05 1,62 0,41 0,3 0,46 0,14 3,93 0.68 Endo III/IV 4 0,33 0,08 0,35 0,27 0,38 0,21 0,39 hsa-miR-135a Controle 5 0,84 0,87 0,39 0,24 1,71 0,01 1,84 Endo I/II 5 0,66 0,49 0,67 0,42 0,81 0,03 1,36 0.8781 Endo III/IV 5 0,88 0,58 1,1 0,6 1,14 0,03 1,54 hsa-miR-135b# Controle 5 0,21 0,1 0,16 0,15 0,27 0,12 0,37 Endo I/II 5 0,27 0,2 0,35 0,08 0,41 0,04 0,49 0.06266 93 Endo III/IV 5 0,5 0,23 0,53 0,42 0,53 0,2 0,84 hsa-miR-135b Controle 5 0,96 0,78 0,83 0,48 0,87 0,33 2,3 Endo I/II 5 0,8 0,4 0,65 0,63 0,87 0,41 1,45 0.99 Endo III/IV 5 1,1 1,14 0,7 0,56 1,13 0,08 3,02 hsa-miR-136# Controle 5 1,08 0,74 0,97 0,66 1,32 0,26 2,21 Endo I/II 5 0,38 0,46 0,2 0,1 0,35 0,06 1,18 0.3296 Endo III/IV 5 0,99 1,29 0,47 0,03 1,38 0,01 3,07 hsa-miR-138 Controle 4 1,66 0,2 1,73 1,53 1,78 1,37 1,8 Endo I/II 4 1,04 1,31 0,48 0,26 1,82 0,21 2,99 0.3342 Endo III/IV 4 1,2 0,83 0,87 0,74 1,66 0,62 2,43 hsa-miR-139- 3p Controle 4 0,41 0,4 0,32 0,12 0,7 0,03 0,96 Endo I/II 3 0,23 0,15 0,28 0,07 0,35 0,07 0,35 0.7877 Endo III/IV 4 0,82 1,1 0,41 0,15 1,48 0,01 2,44 hsa-miR-139- 5p Controle 5 0,58 0,41 0,61 0,46 0,62 0,03 1,18 Endo I/II 5 0,52 0,35 0,65 0,34 0,69 0 0,92 0.2982 Endo III/IV 4 0,24 0,11 0,22 0,17 0,31 0,14 0,39 Controle 5 0,94 0,53 0,97 0,42 1,41 0,39 1,51 94 hsa-miR-140- 3p Endo I/II 5 0,47 0,29 0,37 0,28 0,73 0,17 0,82 0.1409 Endo III/IV 5 0,4 0,36 0,19 0,18 0,45 0,16 1,01 hsa-miR-141# Controle 5 1,22 1,55 0,39 0,34 1,18 0,28 3,92 Endo I/II 5 0,62 0,22 0,66 0,48 0,72 0,33 0,91 0.3396 Endo III/IV 5 0,36 0,41 0,11 0,09 0,5 0,07 1,02 hsa-miR-141 Controle 4 0,95 0,47 0,84 0,6 1,3 0,55 1,58 Endo I/II 4 27,77 54,49 0,76 0,37 55,17 0,05 109,51 1 Endo III/IV 4 1,2 1,06 0,84 0,52 1,89 0,39 2,74 hsa-miR-142- 3p Controle 5 0,25 0,46 0,06 0,03 0,07 0,02 1,07 Endo I/II 5 0,03 0,01 0,04 0,03 0,04 0,02 0,05 0.5326 Endo III/IV 5 0,08 0,07 0,06 0,03 0,13 0,01 0,17 hsa-miR-143 Controle 5 0,75 0,47 0,71 0,45 0,86 0,23 1,47 Endo I/II 5 0,92 1,52 0,22 0,08 0,69 0,01 3,6 0.5052 Endo III/IV 4 0,59 0,53 0,51 0,21 0,98 0,05 1,3 hsa-miR-144# Controle 5 0,34 0,7 0,02 0,02 0,05 0 1,59 Endo I/II 5 0,01 0,02 0 0 0 0 0,04 0.3426 Endo III/IV 5 0,1 0,14 0,01 0,01 0,13 0 0,32 95 hsa-miR-145# Controle 5 1,15 1,24 0,67 0,36 1,45 0,1 3,18 Endo I/II 3 0,6 0,25 0,57 0,37 0,87 0,37 0,87 0.8865 Endo III/IV 4 0,82 0,42 0,71 0,52 1,11 0,44 1,4 hsa-miR-145 Controle 5 1,66 2,1 0,57 0,53 1,6 0,31 5,32 Endo I/II 5 2,49 2,81 0,84 0,42 4,31 0,33 6,57 0.2645 Endo III/IV 5 0,6 0,59 0,32 0,26 0,67 0,16 1,6 hsa-miR-146a Controle 5 0,53 0,45 0,5 0,21 0,52 0,13 1,27 Endo I/II 5 0,29 0,14 0,24 0,22 0,25 0,2 0,54 0.1119 Endo III/IV 5 0,14 0,09 0,15 0,09 0,16 0,03 0,26 hsa-miR-146b- 5p Controle 5 1,02 0,13 0,97 0,95 0,99 0,93 1,25 Endo I/II 5 0,79 0,49 0,9 0,37 1,25 0,2 1,25 0.8106 Endo III/IV 5 0,88 0,39 0,94 0,84 1,07 0,26 1,3 hsa-miR-146b- 3p Controle 5 0,85 0,55 0,87 0,68 0,95 0,1 1,64 Endo I/II 4 1,62 0,65 1,71 1,16 2,07 0,75 2,31 0.1062 Endo III/IV 5 2,47 2,02 2,12 1,27 2,14 0,88 5,95 hsa-miR-148a Controle 5 0,56 0,29 0,64 0,58 0,74 0,06 0,77 Endo I/II 5 0,48 0,17 0,42 0,37 0,52 0,34 0,75 0.8869 96 Endo III/IV 5 1,58 2,26 0,33 0,21 1,79 0,15 5,43 hsa-miR-148b# Controle 5 0,45 0,39 0,22 0,19 0,84 0,08 0,9 Endo I/II 4 0,29 0,16 0,27 0,18 0,4 0,12 0,5 0.9362 Endo III/IV 4 0,33 0,19 0,29 0,2 0,45 0,13 0,59 hsa-miR-148b Controle 5 0,72 0,39 0,67 0,66 0,96 0,13 1,17 Endo I/II 5 0,46 0,21 0,48 0,4 0,57 0,15 0,72 0.68 Endo III/IV 4 1,91 2,45 1,12 0,19 3,64 0,04 5,37 hsa-miR-149 Controle 5 1158,68 2588,21 1,36 0,97 2,16 0,31 5788,61 Endo I/II 5 1,95 1,75 1,54 0,82 1,55 0,81 5,01 0.827 Endo III/IV 5 1,22 0,78 1,07 0,86 1,11 0,52 2,56 hsa-miR-150 Controle 5 0,25 0,34 0,12 0,09 0,16 0,03 0,85 Endo I/II 5 0,21 0,2 0,24 0,04 0,27 0,02 0,51 0.7558 Endo III/IV 5 0,11 0,08 0,1 0,09 0,11 0,02 0,24 hsa-miR-151- 3p Controle 5 0,98 0,16 1 0,9 1,08 0,76 1,18 Endo I/II 5 0,51 0,38 0,38 0,27 0,72 0,13 1,07 0.1959 Endo III/IV 5 0,94 0,7 0,82 0,62 1,22 0,09 1,95 Controle 5 1,39 0,7 1,14 1,07 1,92 0,53 2,28 97 hsa-miR-151- 5P Endo I/II 5 0,59 0,9 0,23 0,16 0,32 0,05 2,19 0.3679 Endo III/IV 5 1,27 1,26 1,56 0,1 1,61 0,01 3,06 hsa-miR-152 Controle 5 0,6 0,33 0,66 0,56 0,76 0,06 0,94 Endo I/II 5 0,77 0,62 0,69 0,68 0,75 0,01 1,74 0.9324 Endo III/IV 5 0,64 0,5 0,58 0,31 0,84 0,11 1,39 hsa-miR-154# Controle 5 0,81 0,74 0,45 0,36 0,79 0,35 2,08 Endo I/II 3 0,43 0,41 0,37 0,06 0,87 0,06 0,87 0.1101 Endo III/IV 3 1,79 1,54 0,92 0,9 3,57 0,9 3,57 hsa-miR-155 Controle 5 0,81 0,74 0,45 0,36 0,79 0,35 2,08 Endo I/II 5 0,43 0,22 0,39 0,29 0,54 0,18 0,75 0.5326 Endo III/IV 5 0,52 0,46 0,27 0,18 0,98 0,12 1,05 hsa-miR-15a# Controle 5 0,98 0,64 0,95 0,69 1,34 0,13 1,82 Endo I/II 5 0,26 0,19 0,16 0,12 0,46 0,12 0,48 0.08691 Endo III/IV 4 1,1 1,28 0,64 0,33 1,86 0,13 2,97 hsa-miR-15a Controle 5 0,28 0,23 0,17 0,17 0,34 0,06 0,64 Endo I/II 4 0,16 0,02 0,16 0,15 0,17 0,14 0,19 0.1118 Endo III/IV 4 0,32 0,12 0,3 0,23 0,4 0,19 0,47 98 hsa-miR-15b# Controle 5 0,76 1,03 0,38 0,23 0,42 0,18 2,6 Endo I/II 5 0,18 0,18 0,1 0,05 0,32 0 0,41 0.2915 Endo III/IV 4 0,49 0,53 0,36 0,17 0,82 0 1,24 hsa-miR-15b Controle 5 0,44 0,29 0,39 0,32 0,41 0,17 0,94 Endo I/II 5 0,2 0,07 0,23 0,2 0,24 0,09 0,26 0.3136 Endo III/IV 5 0,3 0,18 0,24 0,2 0,47 0,08 0,51 hsa-miR-16 Controle 5 0,5 0,54 0,3 0,2 0,37 0,17 1,44 Endo I/II 5 0,2 0,11 0,22 0,11 0,27 0,05 0,32 0.2101 Endo III/IV 5 0,17 0,12 0,12 0,11 0,2 0,04 0,37 hsa-miR-16-1# Controle 5 0,92 0,69 0,66 0,47 1,44 0,2 1,83 Endo I/II 5 0,58 0,36 0,43 0,34 0,72 0,25 1,14 0.6761 Endo III/IV 4 1,05 0,85 1,2 0,36 1,74 0 1,78 hsa-miR-17# Controle 5 0,67 0,36 0,6 0,49 0,85 0,23 1,17 Endo I/II 5 0,36 0,15 0,4 0,34 0,4 0,14 0,54 0.2484 Endo III/IV 4 0,94 0,95 0,56 0,37 1,52 0,32 2,35 hsa-miR-17 Controle 5 0,86 0,37 0,88 0,78 1,09 0,29 1,28 Endo I/II 5 0,54 0,26 0,65 0,4 0,71 0,16 0,79 0.1249 99 Endo III/IV 5 0,45 0,25 0,37 0,33 0,65 0,14 0,75 hsa-miR-181a Controle 5 0,7 0,59 0,64 0,49 0,67 0,06 1,66 Endo I/II 5 0,58 0,25 0,51 0,46 0,78 0,28 0,88 1 Endo III/IV 5 1,08 1,06 0,44 0,29 2,23 0,19 2,24 hsa-miR-181a- 2# Controle 5 1 0,94 0,7 0,44 0,99 0,26 2,62 Endo I/II 5 0,6 0,57 0,7 0,12 0,7 0,04 1,46 0.1873 Endo III/IV 4 1,2 0,13 1,21 1,12 1,29 1,03 1,36 hsa-miR-181c Controle 5 3,38 2,49 3,11 2,26 3,59 0,59 7,34 Endo I/II 5 2,8 1,89 2,83 1,65 4,22 0,31 4,99 0.9704 Endo III/IV 5 5,83 6,76 1,58 1,15 11,32 0,26 14,85 hsa-miR-182 Controle 5 1,58 1,16 1,34 0,73 2,43 0,31 3,08 Endo I/II 5 1,14 0,77 0,76 0,63 1,7 0,44 2,21 0.7334 Endo III/IV 5 1,21 1,82 0,77 0,04 0,82 0,01 4,4 hsa-miR-1825 Controle 5 2,33 0,87 2,71 1,7 2,72 1,18 3,33 Endo I/II 5 1,51 0,77 1,64 1,09 1,91 0,45 2,45 0.3362 Endo III/IV 5 2,73 1,95 2,13 1,3 4,16 0,73 5,33 hsa-miR-183# Controle 5 1,79 1,29 1,91 0,55 2,47 0,53 3,53 100 Endo I/II 4 1,21 0,78 1,46 0,69 1,72 0,09 1,83 0.3813 Endo III/IV 4 1,58 0,64 1,89 1,25 1,9 0,62 1,91 hsa-miR-183 Controle 5 1,34 0,63 1,3 1,04 1,41 0,64 2,34 Endo I/II 4 1,1 0,86 0,9 0,44 1,76 0,35 2,24 0.3625 Endo III/IV 3 1,72 0,44 1,64 1,32 2,19 1,32 2,19 hsa-miR-185 Controle 5 0,32 0,5 0,09 0,08 0,16 0,06 1,2 Endo I/II 5 0,04 0,04 0,03 0,01 0,05 0 0,11 0.09177 Endo III/IV 4 0,06 0,04 0,05 0,03 0,09 0,03 0,11 hsa-miR-186 Controle 5 0,84 0,45 0,79 0,42 1,26 0,39 1,35 Endo I/II 5 0,77 0,37 0,93 0,52 0,94 0,26 1,19 0.5655 Endo III/IV 5 0,62 0,4 0,39 0,38 0,68 0,36 1,3 hsa-miR-18a# Controle 5 0,74 0,6 0,55 0,31 1,18 0,11 1,54 Endo I/II 5 0,41 0,17 0,52 0,24 0,53 0,23 0,55 0.744 Endo III/IV 4 0,59 0,52 0,55 0,21 0,96 0,01 1,24 hsa-miR-18a Controle 5 0,83 0,64 0,65 0,27 1,39 0,23 1,61 Endo I/II 5 0,38 0,22 0,29 0,29 0,43 0,16 0,75 0.6771 Endo III/IV 5 0,86 0,89 0,31 0,31 1,8 0,03 1,84 101 hsa-miR-18b Controle 5 2,66 2,47 1,33 0,79 5,16 0,5 5,54 Endo I/II 5 1,08 1,19 0,66 0,56 0,9 0,15 3,16 0.3946 Endo III/IV 5 1,71 1,89 0,72 0,34 3,35 0,01 4,14 hsa-miR-190 Controle 5 0,36 0,67 0,09 0,06 0,1 0,01 1,55 Endo I/II 5 0,04 0,05 0,02 0,02 0,03 0,01 0,14 0.5258 Endo III/IV 4 0,14 0,17 0,08 0,02 0,26 0,02 0,38 hsa-miR-190b Controle 5 0,7 0,73 0,54 0,27 0,62 0,13 1,96 Endo I/II 5 0,44 0,2 0,48 0,34 0,57 0,14 0,65 0.99 Endo III/IV 5 0,43 0,2 0,44 0,33 0,59 0,15 0,63 hsa-miR-191# Controle 5 2,12 1,15 2,13 1,6 3,18 0,47 3,22 Endo I/II 5 1,95 1,01 1,92 1,52 2,04 0,76 3,52 0.744 Endo III/IV 4 1,68 0,81 1,55 1,11 2,26 0,87 2,78 hsa-miR-191 Controle 5 0,61 0,39 0,41 0,34 0,98 0,25 1,07 Endo I/II 5 0,33 0,11 0,33 0,3 0,33 0,18 0,5 0.1791 Endo III/IV 5 0,27 0,11 0,29 0,21 0,32 0,13 0,43 hsa-miR-192# Controle 5 1,06 0,86 0,87 0,35 1,36 0,32 2,39 Endo I/II 3 0,27 0,24 0,28 0,03 0,51 0,03 0,51 0.2878 102 Endo III/IV 4 1,08 0,92 0,94 0,31 1,84 0,26 2,17 hsa-miR-192 Controle 5 0,41 0,5 0,2 0,14 0,39 0,06 1,28 Endo I/II 5 0,19 0,09 0,19 0,18 0,23 0,06 0,31 0.3791 Endo III/IV 5 0,13 0,06 0,12 0,11 0,12 0,07 0,23 hsa-miR-193a- 5p Controle 5 3,47 2,18 3,28 1,91 5,62 0,82 5,7 Endo I/II 5 2,34 1,72 2,39 1,21 2,72 0,44 4,94 0.6561 Endo III/IV 4 2,89 1,51 2,84 1,71 4,07 1,21 4,67 hsa-miR-193b# Controle 5 0,89 0,44 0,78 0,76 0,93 0,4 1,59 Endo I/II 5 0,49 0,24 0,42 0,33 0,7 0,21 0,77 0.2276 Endo III/IV 5 1,08 1,08 0,81 0,65 0,96 0,07 2,9 hsa-miR-193b Controle 5 1,17 0,48 1,2 0,71 1,49 0,68 1,76 Endo I/II 5 1,28 0,66 1,14 1,07 1,9 0,35 1,93 0.5655 Endo III/IV 5 0,95 0,15 0,98 0,9 0,99 0,75 1,15 hsa-miR-194 Controle 5 0,3 0,36 0,17 0,13 0,21 0,08 0,94 Endo I/II 5 0,12 0,09 0,1 0,06 0,14 0,04 0,26 0.3263 Endo III/IV 5 0,11 0,06 0,11 0,06 0,16 0,06 0,19 hsa-miR-195 Controle 5 1,29 0,52 1,37 0,97 1,6 0,61 1,93 103 Endo I/II 5 0,92 0,44 0,88 0,84 1,05 0,31 1,52 0.4025 Endo III/IV 5 0,92 0,53 0,86 0,43 1,4 0,39 1,53 hsa-miR-196b Controle 3 0,96 1,03 0,76 0,05 2,08 0,05 2,08 Endo I/II 3 32,72 56,6 0,07 0,02 98,08 0,02 98,08 0.8452 Endo III/IV 4 0,55 0,57 0,4 0,12 0,99 0,09 1,32 hsa-miR-197 Controle 5 0,66 0,26 0,62 0,51 0,65 0,43 1,11 Endo I/II 5 0,88 0,55 0,66 0,6 0,78 0,51 1,85 0.3314 Endo III/IV 5 0,53 0,12 0,56 0,51 0,6 0,34 0,66 hsa-miR-199a- 3p Controle 5 0,59 0,31 0,52 0,43 0,9 0,21 0,92 Endo I/II 5 2,53 4,55 0,46 0,21 1,38 0 10,62 0.7634 Endo III/IV 5 0,49 0,37 0,41 0,32 0,81 0 0,91 hsa-miR-19a Controle 5 1,15 0,7 0,9 0,79 1,2 0,53 2,33 Endo I/II 5 0,6 0,28 0,62 0,34 0,74 0,31 0,98 0.1409 Endo III/IV 5 0,54 0,3 0,49 0,39 0,6 0,2 1,01 hsa-miR-19b Controle 5 0,84 0,23 0,84 0,72 0,94 0,54 1,15 Endo I/II 5 0,59 0,48 0,37 0,37 0,6 0,22 1,41 0.1466 Endo III/IV 5 0,51 0,16 0,52 0,46 0,54 0,3 0,73 104 hsa-miR-19b- 1# Controle 5 1,05 0,47 0,85 0,81 1,33 0,53 1,71 Endo I/II 5 0,84 0,51 0,92 0,62 1,02 0,13 1,52 0.8106 Endo III/IV 5 1,16 0,84 1,33 0,49 1,57 0,18 2,25 hsa-miR-200a Controle 5 0,43 0,35 0,28 0,18 0,64 0,11 0,95 Endo I/II 5 1,36 2,42 0,21 0,19 0,72 0,03 5,67 0.9788 Endo III/IV 4 0,28 0,06 0,27 0,25 0,32 0,22 0,36 hsa-miR-200b Controle 5 0,95 0,5 0,98 0,66 1,05 0,36 1,71 Endo I/II 4 4,5 8,31 0,52 0,21 8,8 0,02 16,96 0.6057 Endo III/IV 5 0,7 0,62 0,41 0,4 0,64 0,29 1,78 hsa-miR-200c Controle 5 0,86 0,23 0,7 0,7 1,05 0,69 1,17 Endo I/II 5 19,24 41,88 0,62 0,4 0,95 0,07 94,16 0.5434 Endo III/IV 5 0,67 0,55 0,47 0,47 0,7 0,13 1,58 hsa-miR-202# Controle 5 1,6 1,21 1,19 1,18 2,47 0,05 3,13 Endo I/II 5 0,75 1,01 0,37 0,07 0,79 0,06 2,48 0.5326 Endo III/IV 5 0,97 1 0,96 0,13 1,31 0 2,46 hsa-miR-202 Controle 5 1,02 0,35 1,19 0,76 1,27 0,55 1,36 Endo I/II 5 1,1 0,54 1,3 0,86 1,45 0,28 1,62 0.5655 105 Endo III/IV 5 0,82 0,7 0,64 0,33 0,99 0,19 1,94 hsa-miR-203 Controle 5 0,5 0,28 0,43 0,32 0,62 0,22 0,93 Endo I/II 5 0,33 0,18 0,37 0,16 0,45 0,15 0,54 0.5117 Endo III/IV 5 0,45 0,27 0,39 0,26 0,58 0,2 0,85 hsa-miR-204 Controle 5 1 0,38 0,97 0,82 1,02 0,58 1,59 Endo I/II 5 1,28 1,22 0,74 0,62 1,6 0,19 3,26 0.6907 Endo III/IV 5 0,68 0,41 0,68 0,55 1,05 0,07 1,06 hsa-miR-205 Controle 5 0,1 0,15 0,03 0,01 0,09 0,01 0,37 Endo I/II 5 0,42 0,45 0,25 0,05 0,76 0,02 1,04 0.3923 Endo III/IV 4 0,14 0,15 0,09 0,04 0,25 0,02 0,36 hsa-miR-206 Controle 5 0,15 0,08 0,14 0,13 0,14 0,07 0,28 Endo I/II 5 1,78 3,05 0,67 0,17 0,85 0,03 7,2 0.4819 Endo III/IV 5 0,4 0,47 0,23 0,05 0,49 0,05 1,18 hsa-miR-20a# Controle 5 1,19 0,87 1 0,76 1,42 0,23 2,55 Endo I/II 5 0,42 0,42 0,29 0,25 0,43 0 1,13 0.4317 Endo III/IV 5 1,07 1,19 1,11 0,14 1,13 0,01 2,97 hsa-miR-20a Controle 5 0,52 0,46 0,45 0,24 0,61 0,05 1,25 106 Endo I/II 5 0,29 0,13 0,34 0,26 0,38 0,09 0,41 0.7788 Endo III/IV 5 0,34 0,21 0,28 0,27 0,49 0,07 0,59 hsa-miR-20b Controle 5 2,1 1,02 1,55 1,54 2,77 1,1 3,55 Endo I/II 5 1,16 0,75 1,27 0,68 1,78 0,15 1,94 0.08982 Endo III/IV 5 0,8 0,52 0,85 0,49 1,25 0,1 1,33 hsa-miR-21# Controle 5 0,83 0,43 0,55 0,52 1,27 0,48 1,32 Endo I/II 5 0,76 0,56 0,43 0,41 0,84 0,4 1,71 0.2982 Endo III/IV 5 1,52 1,52 0,99 0,74 1,09 0,58 4,22 hsa-miR-21 Controle 5 1,11 0,38 1,06 0,86 1,38 0,67 1,59 Endo I/II 5 0,86 0,3 0,9 0,87 1,05 0,37 1,12 0.7634 Endo III/IV 5 2,18 2,39 0,66 0,53 3,78 0,32 5,6 hsa-miR-210 Controle 5 0,81 0,24 0,76 0,73 0,81 0,54 1,21 Endo I/II 5 0,85 0,48 0,63 0,56 1,36 0,36 1,37 0.99 Endo III/IV 5 0,75 0,45 0,94 0,63 0,94 0,04 1,21 hsa-miR-212 Controle 5 0,49 0,29 0,62 0,28 0,66 0,09 0,79 Endo I/II 5 0,44 0,32 0,51 0,17 0,58 0,09 0,87 0.4431 Endo III/IV 5 0,32 0,18 0,39 0,18 0,42 0,09 0,51 107 hsa-miR-213 Controle 5 2,97 2,23 1,64 1,41 5,15 1 5,63 Endo I/II 4 3,52 4,88 1,54 0,85 6,19 0,22 10,77 0.9364 Endo III/IV 5 4,72 4,45 2,83 1,06 9,43 0,68 9,61 hsa-miR-214# Controle 5 0,95 0,73 0,74 0,47 0,98 0,37 2,19 Endo I/II 4 1,61 2,24 0,74 0,12 3,1 0,1 4,86 0.8287 Endo III/IV 4 0,54 0,39 0,48 0,27 0,82 0,15 1,07 hsa-miR-214 Controle 5 1,11 0,64 1,09 0,89 1,42 0,2 1,94 Endo I/II 5 3,56 6,7 0,38 0,27 1,63 0,04 15,5 0.2299 Endo III/IV 5 0,34 0,3 0,24 0,15 0,43 0,06 0,82 hsa-miR-215 Controle 5 0,86 1,05 0,64 0,24 0,65 0,1 2,68 Endo I/II 5 0,28 0,11 0,28 0,23 0,39 0,13 0,39 0.5945 Endo III/IV 5 0,32 0,12 0,33 0,32 0,35 0,12 0,47 hsa-miR-218 Controle 5 0,45 0,31 0,25 0,21 0,75 0,19 0,81 Endo I/II 5 0,15 0,02 0,16 0,14 0,16 0,13 0,17 0.03801 Endo III/IV 5 0,25 0,18 0,17 0,15 0,3 0,08 0,53 hsa-miR-219-1- 3p Controle 3 2,97 1,48 2,35 1,89 4,66 1,89 4,66 Endo I/II 3 2,29 2,27 1,66 0,39 4,81 0,39 4,81 0.7326 108 Endo III/IV 3 5,29 4,75 3,69 1,54 10,63 1,54 10,63 hsa-miR-22# Controle 5 0,92 0,46 1,03 0,91 1,23 0,15 1,28 Endo I/II 5 0,36 0,55 0,15 0,07 0,22 0,04 1,34 0.5047 Endo III/IV 5 1,13 1,17 1,19 0,1 1,42 0,03 2,91 hsa-miR-22 Controle 5 1,08 0,13 1,13 1,03 1,14 0,88 1,23 Endo I/II 4 1,23 0,99 1,09 0,54 1,92 0,19 2,56 0.5223 Endo III/IV 4 1,64 1,26 1,75 0,87 2,42 0,01 3,07 hsa-miR-221 Controle 5 0,96 0,81 0,48 0,43 1,14 0,43 2,3 Endo I/II 5 1,11 1,54 0,47 0,42 0,82 0 3,81 0.8933 Endo III/IV 4 2,03 2,04 2 0,26 3,79 0,25 3,87 hsa-miR-222# Controle 5 0,81 0,55 0,71 0,44 0,84 0,35 1,72 Endo I/II 5 1,19 0,92 1,07 0,66 1,81 0,04 2,38 0.2491 Endo III/IV 5 3,54 2,82 3,24 1,52 6,24 0,18 6,53 hsa-miR-222 Controle 5 0,67 0,31 0,8 0,49 0,84 0,23 1,01 Endo I/II 5 0,71 0,41 0,6 0,53 0,6 0,41 1,44 0.6188 Endo III/IV 5 0,52 0,44 0,32 0,3 0,6 0,13 1,24 hsa-miR-223# Controle 4 0,63 0,65 0,57 0,08 1,18 0,03 1,35 109 Endo I/II 4 0,3 0,3 0,27 0,05 0,56 0,05 0,63 0.7939 Endo III/IV 4 0,37 0,17 0,4 0,24 0,5 0,16 0,51 hsa-miR-223 Controle 5 0,66 0,46 0,54 0,43 0,95 0,09 1,28 Endo I/II 5 0,37 0,27 0,26 0,24 0,45 0,12 0,8 0.6126 Endo III/IV 5 0,5 0,29 0,53 0,23 0,7 0,19 0,85 hsa-miR-23a# Controle 4 1,87 1,68 1,66 0,84 2,9 0,05 4,12 Endo I/II 4 0,97 1,63 0,23 0,11 1,83 0,02 3,41 0.7086 Endo III/IV 5 1,69 2,05 1,53 0,06 1,76 0,03 5,07 hsa-miR-23b Controle 5 1,07 0,22 1 0,93 1,06 0,91 1,44 Endo I/II 5 1,69 2,38 0,78 0,56 1,16 0,06 5,88 0.6868 Endo III/IV 4 5,8 6,72 4,11 0,54 11,06 0,41 14,57 hsa-miR-24 Controle 5 0,86 0,34 1,09 0,55 1,11 0,42 1,11 Endo I/II 5 0,82 0,31 0,93 0,75 1,05 0,32 1,07 0.5047 Endo III/IV 5 0,81 0,4 1,07 0,55 1,08 0,23 1,11 hsa-miR-24-2# Controle 5 1,4 1,16 0,79 0,6 2,31 0,33 2,96 Endo I/II 4 0,89 0,64 0,85 0,44 1,34 0,15 1,71 0.338 Endo III/IV 3 3,4 3,13 1,64 1,56 7,01 1,56 7,01 110 hsa-miR-25# Controle 5 0,5 0,73 0,19 0,16 0,26 0,1 1,81 Endo I/II 5 0,25 0,18 0,21 0,17 0,22 0,1 0,56 0.2309 Endo III/IV 4 0,77 0,69 0,54 0,35 1,18 0,21 1,77 hsa-miR-25 Controle 5 0,27 0,34 0,12 0,12 0,17 0,06 0,87 Endo I/II 5 0,07 0,04 0,06 0,05 0,1 0,02 0,13 0.3851 Endo III/IV 5 0,13 0,12 0,06 0,06 0,25 0 0,27 hsa-miR-26a Controle 5 0,81 0,47 0,99 0,7 1,01 0,07 1,3 Endo I/II 5 0,54 0,29 0,49 0,43 0,79 0,14 0,85 0.3396 Endo III/IV 5 0,52 0,24 0,54 0,45 0,66 0,16 0,81 hsa-miR-26a-1# Controle 3 1,93 0,79 1,68 1,3 2,82 1,3 2,82 Endo I/II 4 6,3 6,84 3,46 2,49 10,12 1,8 16,49 0.3126 Endo III/IV 4 2,56 1,76 2,9 1,14 3,99 0,37 4,08 hsa-miR-26a-2# Controle 4 1,59 1,44 1,06 0,75 2,43 0,53 3,72 Endo I/II 3 1,1 1,36 0,5 0,15 2,66 0,15 2,66 0.5849 Endo III/IV 3 1,48 0,8 1,91 0,56 1,97 0,56 1,97 hsa-miR-26b# Controle 5 1,44 1,05 1,13 0,87 1,58 0,46 3,18 Endo I/II 5 1,44 1,07 1,27 0,79 1,72 0,32 3,1 0.6907 111 Endo III/IV 5 1,91 1,1 2,21 1,07 2,38 0,57 3,33 hsa-miR-26b Controle 5 0,39 0,5 0,25 0,19 0,25 0,01 1,27 Endo I/II 5 0,12 0,07 0,14 0,07 0,16 0,03 0,19 0.4025 Endo III/IV 5 0,14 0,15 0,09 0,06 0,19 0 0,37 hsa-miR-27a# Controle 5 0,92 0,78 0,55 0,47 0,84 0,46 2,3 Endo I/II 5 2,02 1,08 1,8 1,77 2,76 0,47 3,3 0.09569 Endo III/IV 5 4,12 3,32 3,3 3,24 4,05 0,46 9,54 hsa-miR-27a Controle 5 0,51 0,33 0,42 0,22 0,69 0,22 1 Endo I/II 5 0,52 0,2 0,62 0,44 0,64 0,21 0,7 0.7554 Endo III/IV 5 0,62 0,25 0,51 0,45 0,87 0,37 0,91 hsa-miR-27b# Controle 5 0,68 0,44 0,56 0,32 0,91 0,3 1,33 Endo I/II 5 0,67 0,4 0,78 0,54 0,85 0,06 1,14 0.7788 Endo III/IV 4 0,97 0,56 0,89 0,5 1,44 0,48 1,61 hsa-miR-27b Controle 5 0,47 0,17 0,53 0,3 0,57 0,29 0,66 Endo I/II 5 0,45 0,27 0,37 0,36 0,61 0,11 0,81 0.7558 Endo III/IV 5 0,38 0,24 0,33 0,29 0,56 0,05 0,66 hsa-miR-28 Controle 5 0,46 0,1 0,44 0,4 0,52 0,35 0,59 112 Endo I/II 5 0,27 0,16 0,24 0,18 0,34 0,09 0,5 0.2645 Endo III/IV 5 1,12 1,36 0,2 0,19 2,16 0,06 2,98 hsa-miR-28-3p Controle 5 0,82 0,4 0,83 0,51 0,93 0,42 1,42 Endo I/II 5 0,78 0,38 0,93 0,44 0,94 0,33 1,25 0.827 Endo III/IV 5 0,95 0,33 0,92 0,91 1,14 0,45 1,33 hsa-miR-296 Controle 5 0,6 0,24 0,65 0,61 0,72 0,21 0,84 Endo I/II 5 0,78 0,3 0,91 0,57 0,95 0,38 1,1 0.5945 Endo III/IV 5 0,75 0,5 0,84 0,31 0,98 0,2 1,41 hsa-miR-299- 5p Controle 5 0,7 1,15 0,35 0,05 0,35 0,02 2,74 Endo I/II 5 0,18 0,15 0,18 0,07 0,27 0,02 0,39 0.7408 Endo III/IV 4 0,63 0,87 0,29 0,06 1,2 0,04 1,91 hsa-miR-29a# Controle 5 1,29 0,9 1,17 0,92 1,4 0,26 2,71 Endo I/II 4 0,7 0,25 0,76 0,54 0,87 0,35 0,94 0.387 Endo III/IV 4 1,12 0,99 1,01 0,46 1,78 0,04 2,43 hsa-miR-29a Controle 5 0,87 0,47 0,83 0,57 0,93 0,42 1,62 Endo I/II 5 0,76 0,38 0,88 0,51 0,93 0,25 1,21 0.9704 Endo III/IV 5 0,78 0,29 0,8 0,59 0,92 0,43 1,17 113 hsa-miR-29b Controle 5 0,48 0,26 0,52 0,33 0,72 0,13 0,72 Endo I/II 5 0,39 0,24 0,37 0,23 0,51 0,11 0,72 0.2645 Endo III/IV 5 0,25 0,22 0,13 0,1 0,34 0,08 0,59 hsa-miR-29b- 1# Controle 5 2,07 1,39 1,68 1,32 2,75 0,52 4,09 Endo I/II 4 0,92 1,23 0,44 0,23 1,61 0,07 2,74 0.3198 Endo III/IV 5 1,66 1,15 2,04 1,01 2,13 0,07 3,08 hsa-miR-29c Controle 5 4,76 2,75 5,54 4,98 5,68 0,12 7,47 Endo I/II 5 2,72 2,19 2,19 1,55 3,47 0,33 6,06 0.7334 Endo III/IV 5 3,55 3,38 3,09 0,39 6,56 0,22 7,48 hsa-miR-301 Controle 5 0,47 0,29 0,44 0,24 0,51 0,2 0,93 Endo I/II 5 0,22 0,11 0,26 0,17 0,27 0,07 0,34 0.4025 Endo III/IV 5 0,24 0,2 0,26 0,16 0,27 0 0,54 hsa-miR-301b Controle 4 1,17 0,64 1,12 0,66 1,68 0,51 1,94 Endo I/II 5 1,74 0,53 2,05 1,39 2,06 0,98 2,22 0.2103 Endo III/IV 4 1,14 0,41 1,18 0,79 1,49 0,7 1,5 hsa-miR-302a Controle 5 2,55 2,89 1,81 0,64 2,09 0,61 7,58 Endo I/II 5 13,51 19,09 1,69 0,35 21,93 0,17 43,44 0.9253 114 Endo III/IV 5 21,1 37,81 0,55 0,35 16,9 0,19 87,51 hsa-miR-302d Controle 3 19,87 6,34 17,64 14,94 27,02 14,94 27,02 Endo I/II 3 20,66 23,63 9,04 5,1 47,85 5,1 47,85 0.5455 Endo III/IV 5 19,25 29,37 5,72 3,46 15,86 0,45 70,76 hsa-miR-30a-3p Controle 5 0,82 0,27 0,9 0,82 0,92 0,36 1,09 Endo I/II 5 0,51 0,26 0,41 0,41 0,7 0,2 0,85 0.3362 Endo III/IV 5 0,74 0,93 0,43 0,39 0,47 0,04 2,38 hsa-miR-30a-5p Controle 5 0,49 0,27 0,52 0,52 0,52 0,08 0,84 Endo I/II 5 0,14 0,17 0,07 0,06 0,14 0,02 0,44 0.1367 Endo III/IV 5 0,3 0,47 0,12 0,09 0,15 0,01 1,15 hsa-miR-30b Controle 5 0,62 0,22 0,56 0,55 0,82 0,33 0,86 Endo I/II 5 0,38 0,18 0,49 0,19 0,49 0,18 0,54 0.02086 Endo III/IV 5 0,22 0,09 0,24 0,18 0,27 0,09 0,34 hsa-miR-30c Controle 5 0,37 0,19 0,35 0,33 0,43 0,1 0,63 Endo I/II 5 0,36 0,19 0,39 0,21 0,43 0,16 0,63 0.2753 Endo III/IV 5 0,22 0,09 0,24 0,18 0,27 0,09 0,34 hsa-miR-30d# Controle 5 1,48 0,84 1,08 0,96 2,22 0,61 2,54 115 Endo I/II 5 1,01 0,94 0,51 0,51 1,7 0,06 2,3 0.4764 Endo III/IV 4 1,11 0,85 0,87 0,57 1,65 0,37 2,33 hsa-miR-30d Controle 5 0,63 0,37 0,6 0,58 0,72 0,11 1,14 Endo I/II 5 0,19 0,22 0,1 0,07 0,17 0,04 0,57 0.1367 Endo III/IV 5 0,36 0,48 0,16 0,16 0,25 0,01 1,2 hsa-miR-30e-3p Controle 5 0,88 0,19 0,81 0,79 0,83 0,77 1,22 Endo I/II 5 0,57 0,3 0,61 0,39 0,79 0,16 0,89 0.1998 Endo III/IV 5 0,78 0,77 0,59 0,54 0,61 0,06 2,1 hsa-miR-31# Controle 5 1,43 1,24 1,27 0,51 1,71 0,27 3,38 Endo I/II 5 0,91 0,81 0,56 0,37 1,27 0,18 2,16 0.6907 Endo III/IV 5 1,55 1,34 0,83 0,76 2,64 0,2 3,3 hsa-miR-31 Controle 5 1,37 0,99 1,53 0,59 1,56 0,34 2,84 Endo I/II 5 0,95 0,49 0,98 0,78 1,37 0,2 1,39 0.3791 Endo III/IV 5 1,77 1,23 1,39 1,26 2,09 0,41 3,7 hsa-miR-32 Controle 4 0,8 0,2 0,86 0,65 0,95 0,52 0,95 Endo I/II 3 0,28 0,29 0,18 0,05 0,6 0,05 0,6 0.05852 Endo III/IV 5 0,22 0,21 0,2 0,11 0,24 0,01 0,56 116 hsa-miR-320 Controle 5 1,01 0,6 0,91 0,88 0,95 0,33 1,99 Endo I/II 5 0,73 0,34 0,82 0,51 0,87 0,29 1,18 0.3791 Endo III/IV 5 0,72 0,57 0,64 0,38 0,67 0,22 1,68 hsa-miR-320B Controle 5 0,64 0,18 0,59 0,55 0,74 0,42 0,88 Endo I/II 5 0,34 0,22 0,31 0,21 0,42 0,1 0,66 0.1791 Endo III/IV 5 0,66 0,79 0,42 0,23 0,68 0 2 hsa-miR-323- 3p Controle 5 2,8 4,9 0,84 0,43 1,05 0,12 11,54 Endo I/II 5 0,45 0,35 0,36 0,19 0,69 0,08 0,93 0.5258 Endo III/IV 4 0,65 0,68 0,41 0,25 1,05 0,13 1,66 hsa-miR-324- 3p Controle 5 1,55 0,53 1,7 1,27 1,9 0,77 2,08 Endo I/II 5 1,08 0,74 1,12 0,4 1,38 0,37 2,13 0.3263 Endo III/IV 5 1,01 0,46 1,19 0,98 1,21 0,24 1,44 hsa-miR-324- 5p Controle 5 0,58 0,43 0,42 0,35 0,6 0,24 1,31 Endo I/II 5 0,25 0,13 0,23 0,23 0,26 0,08 0,44 0.3263 Endo III/IV 5 0,73 0,98 0,2 0,19 0,87 0 2,39 hsa-miR-328 Controle 5 0,81 0,43 0,6 0,49 1,14 0,42 1,4 Endo I/II 5 0,86 0,57 0,76 0,52 0,92 0,31 1,8 0.4724 117 Endo III/IV 5 0,56 0,31 0,49 0,32 0,86 0,23 0,91 hsa-miR-329 Controle 5 3,12 2,85 2,1 1,65 2,72 1,02 8,1 Endo I/II 4 1,82 1,06 2,08 1,04 2,61 0,38 2,75 0.617 Endo III/IV 5 2,25 2,28 1,01 0,97 2,17 0,88 6,21 hsa-miR-330 Controle 5 1,38 1,46 0,79 0,7 1,39 0,17 3,87 Endo I/II 5 0,9 0,31 0,94 0,65 0,99 0,57 1,36 0.7027 Endo III/IV 4 1,3 0,88 1,4 0,66 1,94 0,16 2,25 hsa-miR-331 Controle 5 0,78 0,27 0,81 0,53 0,86 0,5 1,17 Endo I/II 5 0,88 0,52 0,65 0,47 1,29 0,42 1,56 0.7634 Endo III/IV 5 0,71 0,41 0,51 0,43 1,12 0,31 1,17 hsa-miR-331- 5p Controle 5 2 1,1 1,79 1,14 3,06 0,78 3,21 Endo I/II 5 1,21 0,89 1,08 0,88 1,52 0,08 2,51 0.2141 Endo III/IV 4 0,93 1,06 0,44 0,35 1,51 0,32 2,52 hsa-miR-335# Controle 5 15,33 13,05 11,04 9,23 13,03 5,25 38,11 Endo I/II 4 14,4 8,75 14,03 6,84 21,95 6,75 22,78 0.9949 Endo III/IV 3 16,99 16,01 9,76 5,87 35,35 5,87 35,35 hsa-miR-335 Controle 5 0,68 0,44 0,72 0,54 0,75 0,08 1,31 118 Endo I/II 5 0,26 0,19 0,26 0,19 0,27 0,03 0,56 0.4208 Endo III/IV 4 1,05 1,29 0,69 0,07 2,03 0,03 2,78 hsa-miR-337- 3p Controle 4 2,5 0,56 2,62 2,07 2,93 1,77 2,99 Endo I/II 4 2,99 1,05 2,81 2,24 3,74 1,95 4,4 0.2727 Endo III/IV 3 4,97 3 3,71 2,8 8,39 2,8 8,39 hsa-miR-337- 5p Controle 5 1,24 0,92 0,89 0,55 1,73 0,43 2,63 Endo I/II 4 2,28 2,4 1,29 0,83 3,72 0,69 5,83 0.4791 Endo III/IV 3 0,76 0,61 0,84 0,12 1,33 0,12 1,33 hsa-miR-338- 5P Controle 5 2,94 5 0,89 0,56 1,13 0,27 11,87 Endo I/II 5 2,23 1,28 1,77 1,57 2,1 1,24 4,45 0.2808 Endo III/IV 5 1,51 1,38 1,02 0,55 2,06 0,26 3,66 hsa-miR-339- 3p Controle 5 1,26 0,37 1,07 1,05 1,44 0,91 1,83 Endo I/II 5 0,89 0,7 0,43 0,41 1,24 0,41 1,98 0.4019 Endo III/IV 5 0,95 0,66 0,84 0,77 0,93 0,22 2,02 hsa-miR-339- 5p Controle 5 0,55 0,14 0,57 0,49 0,58 0,38 0,76 Endo I/II 5 0,54 0,39 0,65 0,25 0,8 0,04 0,98 1 Endo III/IV 5 0,7 0,68 0,39 0,35 1 0,02 1,73 119 hsa-miR-33a# Controle 5 0,99 0,83 0,54 0,54 1,02 0,43 2,42 Endo I/II 4 0,29 0,19 0,3 0,13 0,46 0,12 0,46 0.09253 Endo III/IV 4 1,23 1,13 0,96 0,52 1,95 0,18 2,84 hsa-miR-33a Controle 5 0,69 0,67 0,57 0,19 0,78 0,12 1,78 Endo I/II 5 0,57 0,52 0,35 0,14 1,11 0,11 1,15 0.8731 Endo III/IV 4 0,42 0,32 0,43 0,22 0,63 0,03 0,81 hsa-miR-340# Controle 5 0,86 0,34 0,78 0,7 1,13 0,43 1,29 Endo I/II 4 0,65 0,31 0,66 0,38 0,92 0,35 0,93 0.2521 Endo III/IV 4 1,18 0,59 1,01 0,83 1,53 0,66 2,04 hsa-miR-340 Controle 5 1,31 0,47 1,3 0,99 1,31 0,87 2,08 Endo I/II 5 0,6 0,19 0,55 0,46 0,71 0,4 0,86 0.06522 Endo III/IV 5 0,89 0,72 0,99 0,45 1,02 0,05 1,94 hsa-miR-342- 3p Controle 5 2,16 2,77 1,03 0,78 1,25 0,64 7,1 Endo I/II 5 1,29 0,41 1,21 0,93 1,61 0,9 1,82 0.2101 Endo III/IV 5 0,67 0,5 0,44 0,29 0,93 0,28 1,42 hsa-miR-345 Controle 5 1,17 0,62 1,11 0,61 1,46 0,6 2,06 Endo I/II 5 1,01 0,26 1,06 0,83 1,23 0,66 1,28 0.2299 120 Endo III/IV 5 0,68 0,33 0,78 0,37 0,93 0,3 1,01 hsa-miR-34a# Controle 5 1,58 1,27 0,96 0,73 1,8 0,7 3,7 Endo I/II 5 1,11 0,95 0,94 0,46 1,33 0,19 2,61 0.827 Endo III/IV 5 1,66 1,55 1,04 0,84 2,25 0,11 4,06 hsa-miR-34a Controle 5 0,77 0,64 0,64 0,46 0,65 0,24 1,88 Endo I/II 5 0,97 0,55 1,19 0,39 1,29 0,38 1,59 0.5945 Endo III/IV 5 1,89 1,61 1,33 0,62 3,49 0,29 3,71 hsa-miR-34b- 3p Controle 5 0,72 0,26 0,78 0,66 0,87 0,3 0,98 Endo I/II 5 1,63 1,85 0,83 0,63 1,76 0,16 4,78 0.8946 Endo III/IV 4 0,82 0,36 0,71 0,55 1,09 0,54 1,31 hsa-miR-34b- 5p Controle 5 2,2 2,67 1,47 0,97 1,61 0,1 6,87 Endo I/II 3 3,31 4,57 1,17 0,19 8,56 0,19 8,56 0.9702 Endo III/IV 3 1,34 0,69 1,12 0,78 2,12 0,78 2,12 hsa-miR-34c Controle 5 0,82 0,89 0,59 0,2 0,83 0,16 2,35 Endo I/II 4 0,77 0,09 0,76 0,7 0,83 0,68 0,87 0.8925 Endo III/IV 4 0,82 0,87 0,83 0,08 1,57 0,01 1,64 hsa-miR-361 Controle 5 0,83 0,61 0,89 0,4 0,99 0,16 1,73 121 Endo I/II 5 0,96 0,63 1,01 0,7 1,13 0,11 1,83 0.8869 Endo III/IV 5 0,99 0,73 0,87 0,45 1,33 0,24 2,06 hsa-miR-361- 3p Controle 5 1,59 0,84 1,46 1,38 1,98 0,41 2,7 Endo I/II 4 43,64 84,3 2,12 0,46 86,82 0,26 170,06 0.9549 Endo III/IV 3 4,25 5,2 1,39 1,12 10,26 1,12 10,26 hsa-miR-362 Controle 5 1,05 0,49 1,16 0,67 1,17 0,51 1,74 Endo I/II 5 0,9 0,6 0,92 0,9 1,01 0,01 1,69 0.7334 Endo III/IV 5 0,81 0,51 0,89 0,61 1,14 0,05 1,39 hsa-miR-362- 3p Controle 5 1,9 1,17 1,97 1 2,31 0,63 3,6 Endo I/II 4 0,75 0,69 0,53 0,23 1,26 0,23 1,7 0.02451 Endo III/IV 4 4,85 3,06 4,06 2,79 6,91 2,12 9,16 hsa-miR-363 Controle 4 0,33 0,55 0,08 0,03 0,63 0 1,15 Endo I/II 4 0,03 0,03 0,02 0 0,05 0 0,05 0.3749 Endo III/IV 3 0,21 0,31 0,06 0 0,56 0 0,56 hsa-miR-365 Controle 5 1,15 1,59 0,53 0,33 0,62 0,3 3,98 Endo I/II 5 0,86 0,49 0,84 0,69 1,21 0,15 1,41 0.9324 Endo III/IV 5 0,76 0,69 0,33 0,23 1,5 0,2 1,51 122 hsa-miR-370 Controle 5 0,93 0,3 0,87 0,73 1,08 0,61 1,37 Endo I/II 5 0,51 0,41 0,24 0,22 0,89 0,17 1,02 0.2209 Endo III/IV 5 0,54 0,49 0,37 0,29 0,4 0,22 1,41 hsa-miR-373 Controle 5 1,23 1,65 0,4 0,34 1,11 0,19 4,11 Endo I/II 5 3,43 6,87 0,44 0,22 0,72 0,04 15,71 0.5945 Endo III/IV 5 0,37 0,35 0,3 0,08 0,66 0,02 0,79 hsa-miR-374 Controle 5 0,46 0,46 0,35 0,29 0,37 0,04 1,25 Endo I/II 5 0,14 0,09 0,12 0,1 0,19 0,03 0,26 0.2299 Endo III/IV 5 0,24 0,27 0,16 0,05 0,28 0,04 0,7 hsa-miR-375 Controle 5 0,5 0,4 0,66 0,11 0,77 0,04 0,92 Endo I/II 5 0,32 0,24 0,21 0,13 0,46 0,12 0,67 0.6496 Endo III/IV 4 0,24 0,23 0,21 0,1 0,38 0 0,56 hsa-miR-376a# Controle 4 2,05 1,79 1,79 0,68 3,43 0,28 4,35 Endo I/II 3 0,76 0,21 0,76 0,55 0,97 0,55 0,97 0.1353 Endo III/IV 2 4,48 2,74 4,48 2,55 6,42 2,55 6,42 hsa-miR-376a Controle 5 0,69 0,27 0,59 0,58 0,69 0,43 1,15 Endo I/II 5 0,43 0,32 0,24 0,22 0,74 0,13 0,8 0.3396 123 Endo III/IV 5 0,44 0,18 0,53 0,26 0,54 0,24 0,64 hsa-miR-376c Controle 5 0,77 0,43 0,73 0,65 1,04 0,15 1,28 Endo I/II 5 0,51 0,4 0,32 0,24 0,89 0,1 0,97 0.5117 Endo III/IV 5 0,62 0,44 0,32 0,32 1,01 0,28 1,19 hsa-miR-378a- 5p Controle 5 0,47 0,13 0,39 0,39 0,52 0,37 0,68 Endo I/II 5 0,57 0,32 0,69 0,29 0,83 0,17 0,88 0.8267 Endo III/IV 5 0,54 0,27 0,46 0,41 0,63 0,23 0,96 hsa-miR-378 Controle 5 1,24 0,89 1,08 0,99 1,39 0,15 2,61 Endo I/II 5 1,04 0,26 1,09 1,04 1,18 0,59 1,28 0.7558 Endo III/IV 5 1,56 0,91 1,53 0,92 2,05 0,51 2,8 hsa-miR-380- 5p Controle 5 3,94 1,04 4,05 3,96 4,52 2,22 4,93 Endo I/II 4 3,62 2,84 3,59 1,77 5,47 0,18 7,12 0.4791 Endo III/IV 3 10,4 10,53 8,2 1,14 21,86 1,14 21,86 hsa-miR-381 Controle 5 0,41 0,52 0,21 0,04 0,49 0,01 1,27 Endo I/II 5 0,38 0,46 0,08 0,08 0,71 0,01 1,02 0.9458 Endo III/IV 4 0,36 0,38 0,35 0,03 0,69 0,01 0,74 hsa-miR-382 Controle 5 0,54 0,3 0,52 0,44 0,6 0,15 0,98 124 Endo I/II 5 0,3 0,18 0,27 0,24 0,42 0,04 0,51 0.3621 Endo III/IV 4 0,4 0,28 0,3 0,21 0,59 0,2 0,79 hsa-miR-409- 3p Controle 5 0,21 0,24 0,1 0,09 0,19 0,06 0,63 Endo I/II 5 0,16 0,09 0,14 0,1 0,2 0,08 0,3 0.8845 Endo III/IV 5 0,15 0,12 0,14 0,08 0,14 0,04 0,34 hsa-miR-410 Controle 5 0,64 0,25 0,74 0,4 0,84 0,33 0,88 Endo I/II 5 0,52 0,27 0,56 0,47 0,69 0,08 0,79 0.9311 Endo III/IV 4 0,62 0,35 0,47 0,42 0,83 0,41 1,14 hsa-miR-411# Controle 5 0,75 0,4 0,62 0,59 0,81 0,35 1,41 Endo I/II 4 0,57 0,56 0,41 0,15 0,99 0,12 1,32 0.3007 Endo III/IV 4 1,23 0,67 1,29 0,66 1,81 0,54 1,82 hsa-miR-411 Controle 5 0,55 0,36 0,65 0,28 0,85 0,09 0,9 Endo I/II 5 0,38 0,35 0,21 0,2 0,67 0 0,82 0.6126 Endo III/IV 5 0,41 0,45 0,16 0,14 0,49 0,09 1,16 hsa-miR-422a Controle 4 0,73 0,51 0,68 0,35 1,12 0,18 1,39 Endo I/II 4 0,63 0,48 0,59 0,29 0,96 0,09 1,25 0.5336 Endo III/IV 5 2,36 3,07 0,78 0,66 2,56 0,18 7,6 125 hsa-miR-423- 5p Controle 5 1,08 0,32 1,22 1 1,23 0,56 1,38 Endo I/II 5 0,48 0,4 0,35 0,16 0,74 0,13 1,04 0.2369 Endo III/IV 5 1,9 2,36 0,36 0,3 3,54 0,06 5,25 hsa-miR-424# Controle 5 1,01 0,44 0,89 0,78 1,01 0,63 1,75 Endo I/II 5 0,6 0,84 0,26 0,18 0,4 0,07 2,08 0.2753 Endo III/IV 5 1 0,83 0,92 0,43 1,3 0,12 2,25 hsa-miR-424 Controle 5 0,89 0,56 0,73 0,64 1,41 0,18 1,49 Endo I/II 5 0,67 0,24 0,67 0,62 0,7 0,35 1,03 0.8781 Endo III/IV 5 1,58 1,57 0,49 0,45 3,01 0,37 3,56 hsa-miR-425# Controle 5 1 0,55 0,91 0,88 1,33 0,2 1,67 Endo I/II 5 0,87 0,63 0,73 0,71 1,13 0,04 1,74 0.8353 Endo III/IV 4 0,99 0,57 1,17 0,62 1,35 0,16 1,45 hsa-miR-425- 5p Controle 5 0,44 0,23 0,36 0,32 0,47 0,22 0,83 Endo I/II 5 0,26 0,15 0,2 0,16 0,3 0,13 0,51 0.1409 Endo III/IV 5 0,22 0,22 0,21 0,08 0,22 0 0,58 hsa-miR-431 Controle 4 5,7 5,19 4,65 2,11 9,29 0,66 12,83 Endo I/II 4 0,86 0,58 0,98 0,48 1,24 0,05 1,43 0.115 126 Endo III/IV 3 4,94 4,73 2,53 1,91 10,39 1,91 10,39 hsa-miR-432# Controle 5 4,2 4,03 2,36 1,29 6,07 0,87 10,4 Endo I/II 5 2,82 5,13 0,65 0,28 0,96 0,22 11,98 0.3086 Endo III/IV 4 4,77 4,62 3,54 1,42 8,11 0,82 11,17 hsa-miR-432 Controle 5 0,6 1 0,24 0,12 0,28 0,01 2,38 Endo I/II 5 0,31 0,29 0,17 0,16 0,41 0,05 0,78 0.827 Endo III/IV 5 0,17 0,08 0,19 0,09 0,23 0,08 0,26 hsa-miR-433 Controle 5 1,08 0,99 0,86 0,8 1,01 0,03 2,73 Endo I/II 5 1,13 0,76 1,04 0,97 1,71 0 1,94 0.7334 Endo III/IV 5 0,8 0,63 0,71 0,3 1,36 0,1 1,52 hsa-miR-449b Controle 4 1,86 2,42 0,9 0,38 3,33 0,19 5,43 Endo I/II 4 23,16 44,84 1,07 0,47 45,86 0,11 90,41 0.3423 Endo III/IV 3 3,29 2,58 2,06 1,55 6,25 1,55 6,25 hsa-miR-450a Controle 5 1,93 1,59 1,28 1,25 1,85 0,62 4,66 Endo I/II 5 1,35 0,72 1,64 0,75 1,69 0,46 2,2 0.827 Endo III/IV 5 2,03 1,65 2,86 0,5 3,23 0,01 3,54 Controle 5 0,97 1,24 0,62 0,32 0,67 0,09 3,14 127 hsa-miR-450b- 5p Endo I/II 5 0,68 0,57 0,76 0,16 0,88 0,1 1,48 0.8521 Endo III/IV 5 0,55 0,39 0,48 0,42 0,67 0,06 1,12 hsa-miR-454# Controle 4 1,4 1,02 1,15 0,78 2,03 0,45 2,85 Endo I/II 4 1 0,86 1 0,26 1,74 0,25 1,75 0.7939 Endo III/IV 4 1,58 1,63 1,27 0,31 2,85 0,09 3,7 hsa-miR-454 Controle 5 0,48 0,44 0,33 0,24 0,48 0,12 1,24 Endo I/II 5 0,25 0,08 0,26 0,24 0,29 0,13 0,34 0.1959 Endo III/IV 5 0,17 0,11 0,12 0,09 0,25 0,08 0,32 hsa-miR-455 Controle 5 1,32 0,72 1,44 1,11 1,49 0,29 2,29 Endo I/II 5 0,91 0,56 0,74 0,53 1,47 0,29 1,52 0.6126 Endo III/IV 5 2,01 1,68 2,88 0,33 2,92 0,1 3,83 hsa-miR-455- 3p Controle 5 0,62 0,26 0,76 0,38 0,81 0,3 0,86 Endo I/II 5 0,67 0,84 0,36 0,22 0,44 0,17 2,15 0.4604 Endo III/IV 4 1,86 1,79 1,66 0,42 3,29 0,05 4,04 hsa-miR-483- 3p Controle 5 0,4 0,44 0,32 0,06 0,43 0,04 1,13 Endo I/II 5 0,35 0,26 0,24 0,17 0,62 0,07 0,63 0.8106 Endo III/IV 5 0,25 0,26 0,13 0,11 0,29 0,03 0,68 128 hsa-miR-483- 5p Controle 5 0,39 0,37 0,36 0,15 0,4 0,03 0,99 Endo I/II 5 0,17 0,16 0,1 0,08 0,24 0,04 0,42 0.6188 Endo III/IV 5 0,17 0,13 0,11 0,09 0,18 0,06 0,39 hsa-miR-484 Controle 5 0,53 0,2 0,44 0,44 0,59 0,35 0,85 Endo I/II 5 0,47 0,19 0,48 0,28 0,64 0,27 0,67 0.2645 Endo III/IV 5 0,35 0,27 0,2 0,18 0,41 0,16 0,78 hsa-miR-485- 3p Controle 5 2,58 1,1 2,51 2,42 2,63 1,11 4,22 Endo I/II 5 2,76 2,12 2,99 1,29 3,43 0,3 5,8 0.3396 Endo III/IV 5 1,5 1,59 1,02 0,81 1,42 0,05 4,2 hsa-miR-487a Controle 5 0,4 0,15 0,39 0,3 0,4 0,26 0,65 Endo I/II 4 0,64 0,34 0,52 0,43 0,86 0,4 1,15 0.3757 Endo III/IV 4 0,79 0,75 0,64 0,34 1,24 0,05 1,83 hsa-miR-487b Controle 5 1,65 1,42 1,49 0,62 1,63 0,48 4,02 Endo I/II 5 1,16 0,87 1,02 0,71 1,38 0,2 2,51 0.8781 Endo III/IV 5 1,75 1,87 1,44 0,55 1,89 0,03 4,82 hsa-miR-489 Controle 4 0,34 0,21 0,35 0,17 0,52 0,14 0,53 Endo I/II 5 0,27 0,17 0,23 0,13 0,37 0,11 0,51 0.3157 129 Endo III/IV 5 0,56 0,33 0,66 0,33 0,73 0,13 0,94 hsa-miR-493 Controle 5 2,51 1,6 1,48 1,4 3,44 1,33 4,9 Endo I/II 3 1,35 0,11 1,32 1,26 1,47 1,26 1,47 0.2906 Endo III/IV 4 1,44 1,09 1,28 0,61 2,28 0,36 2,85 hsa-miR-494 Controle 5 1,78 1,26 1,32 1,23 1,55 0,81 3,97 Endo I/II 5 1,26 0,65 1,45 0,61 1,53 0,6 2,11 0.5655 Endo III/IV 5 2 1,16 1,84 1,14 2,24 0,93 3,84 hsa-miR-497 Controle 5 1,51 0,8 1,85 1,77 1,9 0,08 1,93 Endo I/II 5 0,21 0,3 0,08 0,07 0,15 0,01 0,75 0.117 Endo III/IV 4 2,26 2,41 2 0,24 4,27 0,03 5 hsa-miR-500a- 3p Controle 5 2,93 4,89 0,98 0,43 1,19 0,38 11,66 Endo I/II 4 1,4 0,66 1,42 1 1,81 0,58 2,2 0.3336 Endo III/IV 4 2,93 2,16 2,64 1,47 4,38 0,61 5,81 hsa-miR-500a- 5p Controle 5 0,76 0,48 0,57 0,38 1,2 0,32 1,35 Endo I/II 5 0,39 0,38 0,5 0,01 0,57 0,01 0,88 0.4449 Endo III/IV 4 0,29 0,25 0,28 0,09 0,48 0,01 0,58 hsa-miR-502 Controle 4 1,77 1,76 1,66 0,29 3,26 0,07 3,71 130 Endo I/II 4 0,61 0,36 0,73 0,36 0,87 0,11 0,89 0.3284 Endo III/IV 3 1,59 0,39 1,42 1,32 2,03 1,32 2,03 hsa-miR-502- 3p Controle 5 1,57 0,76 1,57 1,45 1,8 0,45 2,58 Endo I/II 5 0,37 0,2 0,32 0,26 0,52 0,14 0,64 0.1429 Endo III/IV 4 1,96 2,36 1,19 0,31 3,61 0,17 5,31 hsa-miR-503 Controle 5 1 0,98 0,72 0,47 0,8 0,3 2,71 Endo I/II 5 0,37 0,2 0,32 0,26 0,52 0,14 0,64 0.09943 Endo III/IV 4 1,16 1,05 0,79 0,56 1,76 0,36 2,71 hsa-miR-505# Controle 5 0,71 0,69 0,46 0,39 0,68 0,15 1,9 Endo I/II 5 0,31 0,23 0,27 0,11 0,51 0,08 0,59 0.3263 Endo III/IV 5 0,32 0,35 0,29 0,08 0,3 0,03 0,91 hsa-miR-505 Controle 5 0,3 0,12 0,29 0,26 0,39 0,12 0,45 Endo I/II 5 0,33 0,25 0,23 0,23 0,29 0,15 0,77 0.6443 Endo III/IV 3 0,9 0,76 1,31 0,02 1,37 0,02 1,37 hsa-miR-506 Controle 5 1,7 1,3 1,69 0,84 1,77 0,44 3,79 Endo I/II 5 1,71 1,78 0,69 0,3 3,28 0,28 3,99 0.7558 Endo III/IV 5 1,12 0,74 0,93 0,73 1,15 0,42 2,36 131 hsa-miR-508 Controle 5 1,54 0,79 1,85 1,08 2,1 0,37 2,28 Endo I/II 5 1 0,88 0,71 0,32 1,38 0,25 2,37 0.2894 Endo III/IV 5 0,68 0,45 0,63 0,51 0,84 0,1 1,32 hsa-miR-508- 5p Controle 5 2,07 2,93 0,52 0,38 1,94 0,32 7,17 Endo I/II 4 1,65 1,85 1,32 0,15 3,16 0,05 3,92 0.6009 Endo III/IV 4 2,13 1,89 1,78 0,61 3,65 0,45 4,5 hsa-miR-509-3- 5p Controle 5 2,45 1,97 2,63 0,71 3,25 0,43 5,23 Endo I/II 4 2,04 2,91 0,98 0,05 4,04 0,01 6,21 0.4046 Endo III/IV 4 1,12 1,26 0,97 0,05 2,19 0,04 2,49 hsa-miR-509- 5p Controle 5 1,42 1,01 1,24 0,56 2,13 0,41 2,76 Endo I/II 5 1,19 1,1 0,76 0,67 1,37 0,16 3,01 0.4538 Endo III/IV 5 0,59 0,29 0,68 0,37 0,7 0,24 0,97 hsa-miR-510 Controle 5 2,35 1,58 3,25 0,74 3,37 0,53 3,84 Endo I/II 5 1,33 1,48 0,49 0,36 2,37 0,03 3,41 0.2808 Endo III/IV 5 1,35 1,01 1,61 0,47 2,1 0,12 2,43 hsa-miR-513B Controle 5 8,24 10,09 5,48 3,26 5,7 0,79 25,94 Endo I/II 3 3,1 3,23 2,2 0,43 6,69 0,43 6,69 0.5325 132 Endo III/IV 4 7,82 5,81 8,27 3,32 12,31 0,65 14,07 hsa-miR-516- 3p Controle 4 0,55 0,6 0,36 0,19 0,91 0,06 1,42 Endo I/II 5 242,99 531,84 1,25 0,41 18,76 0,27 1194,28 0.1954 Endo III/IV 5 0,36 0,3 0,36 0,15 0,39 0,06 0,84 hsa-miR-518d Controle 3 0,47 0,39 0,57 0,03 0,8 0,03 0,8 Endo I/II 5 4,24 8,56 0,28 0,19 1,11 0,09 19,53 0.07382 Endo III/IV 3 27,19 28,53 21,4 2 58,17 2 58,17 hsa-miR-519b- 3p Controle 3 0,28 0,22 0,21 0,11 0,52 0,11 0,52 Endo I/II 3 1,09 0,89 1,16 0,17 1,93 0,17 1,93 0.2636 Endo III/IV 5 1,06 1,21 0,6 0,36 0,95 0,22 3,17 hsa-miR-520D- 3P Controle 5 0,41 0,2 0,38 0,35 0,43 0,17 0,74 Endo I/II 5 0,59 0,25 0,51 0,39 0,82 0,34 0,89 0.3681 Endo III/IV 5 0,44 0,5 0,18 0,15 0,43 0,14 1,31 hsa-miR-520c- 3p Controle 5 0,07 0,04 0,05 0,05 0,09 0,02 0,13 Endo I/II 5 0,17 0,11 0,15 0,14 0,24 0,02 0,3 0.1803 Endo III/IV 5 0,42 0,48 0,18 0,05 0,75 0,03 1,11 Controle 5 1,12 0,95 0,64 0,51 1,77 0,22 2,45 133 hsa-miR-532- 5p Endo I/II 5 0,28 0,23 0,28 0,07 0,51 0,03 0,51 0.06266 Endo III/IV 5 0,58 0,24 0,55 0,49 0,65 0,27 0,92 hsa-miR-532- 3p Controle 5 1,96 1,51 1,27 1,25 1,85 0,86 4,59 Endo I/II 5 1,24 0,24 1,16 1,14 1,48 0,93 1,49 0.01216 Endo III/IV 5 0,21 0,26 0,11 0,02 0,34 0 0,61 hsa-miR-539 Controle 5 1,17 0,52 1,38 0,77 1,55 0,48 1,65 Endo I/II 5 0,84 0,5 1,04 0,68 1,07 0,06 1,36 0.5945 Endo III/IV 5 0,91 0,56 0,81 0,65 1,12 0,25 1,75 hsa-miR-542- 3p Controle 5 0,74 0,5 0,77 0,35 0,9 0,21 1,47 Endo I/II 4 0,51 0,24 0,52 0,31 0,71 0,25 0,76 0.875 Endo III/IV 4 0,98 1,1 0,65 0,18 1,79 0,13 2,51 hsa-miR-542- 5p Controle 5 1,16 0,73 0,94 0,93 1,71 0,18 2,05 Endo I/II 5 0,5 0,39 0,36 0,26 0,79 0,06 1,01 0.3923 Endo III/IV 4 0,86 0,67 0,71 0,45 1,27 0,21 1,81 hsa-miR-543 Controle 5 1,09 0,45 1,23 0,68 1,35 0,59 1,63 Endo I/II 4 0,46 0,21 0,49 0,31 0,61 0,18 0,69 0.1243 Endo III/IV 4 1,35 0,83 1,46 0,84 1,87 0,25 2,25 134 hsa-miR-548a Controle 5 0,87 1,23 0,37 0,22 0,73 0,02 3,02 Endo I/II 5 7,23 13,78 0,81 0,42 2,88 0,21 31,81 0.6188 Endo III/IV 5 13,4 20,33 3,9 0,07 14,95 0,01 48,09 hsa-miR-548b- 5p Controle 5 0,46 0,27 0,49 0,37 0,5 0,09 0,84 Endo I/II 5 0,18 0,16 0,11 0,09 0,15 0,09 0,47 0.1863 Endo III/IV 3 0,16 0,14 0,24 0 0,25 0 0,25 hsa-miR-548c Controle 4 0,43 0,4 0,38 0,15 0,71 0,01 0,95 Endo I/II 5 9,97 19,62 0,73 0,35 3,54 0,27 44,98 0.3007 Endo III/IV 4 25,94 36,67 12,08 2,16 49,71 0,17 79,41 hsa-miR-548c- 5p Controle 5 2,11 2,79 0,86 0,47 2,12 0,18 6,92 Endo I/II 4 0,33 0,31 0,26 0,09 0,57 0,07 0,74 0.255 Endo III/IV 4 1,39 1,53 1,03 0,2 2,57 0,09 3,4 hsa-miR-548d- 5p Controle 5 0,79 0,43 0,66 0,55 1,11 0,29 1,35 Endo I/II 4 0,2 0,19 0,15 0,04 0,35 0,04 0,45 0.07504 Endo III/IV 3 0,48 0,45 0,43 0,06 0,96 0,06 0,96 hsa-miR-550a- 3p Controle 5 1,12 0,92 1,12 0,28 1,71 0,17 2,3 Endo I/II 4 1,77 1,89 1,2 0,46 3,08 0,24 4,44 0.6601 135 Endo III/IV 3 2,76 2,62 1,42 1,09 5,78 1,09 5,78 hsa-miR-550 Controle 5 2,07 2,19 1,2 1,02 1,69 0,53 5,93 Endo I/II 3 1,22 0,32 1,3 0,86 1,49 0,86 1,49 0.5942 Endo III/IV 4 0,87 0,37 0,82 0,57 1,17 0,54 1,3 hsa-miR-564 Controle 5 2,96 1,4 2,58 1,78 4,3 1,59 4,57 Endo I/II 5 4,15 5,58 1,16 1,1 3,6 0,97 13,94 0.6868 Endo III/IV 4 6,43 9,59 2,4 0,5 12,36 0,34 20,59 hsa-miR-566 Controle 5 0,53 0,33 0,52 0,34 0,81 0,09 0,89 Endo I/II 4 0,31 0,37 0,16 0,07 0,55 0,06 0,86 0.3855 Endo III/IV 3 0,28 0,32 0,12 0,07 0,65 0,07 0,65 hsa-miR-571 Controle 4 0,11 0,05 0,1 0,08 0,15 0,07 0,19 Endo I/II 5 0,49 0,66 0,24 0,2 0,35 0,03 1,65 0.3668 Endo III/IV 5 0,76 0,94 0,31 0,1 1,1 0,02 2,27 hsa-miR-572 Controle 5 0,57 0,3 0,67 0,5 0,73 0,08 0,87 Endo I/II 4 1,89 2,71 0,59 0,43 3,34 0,41 5,95 0.08115 Endo III/IV 5 0,29 0,14 0,31 0,18 0,4 0,13 0,44 Controle 5 1,11 0,42 0,96 0,84 1,51 0,64 1,58 136 hsa-miR-574- 3p Endo I/II 5 1,26 0,32 1,26 0,96 1,48 0,93 1,67 0.4449 Endo III/IV 5 0,92 0,44 0,77 0,65 0,97 0,56 1,65 hsa-miR-575 Controle 3 1,08 1,18 0,62 0,2 2,42 0,2 2,42 Endo I/II 4 0,57 0,43 0,45 0,24 0,9 0,23 1,14 0.2314 Endo III/IV 3 0,18 0,09 0,18 0,09 0,27 0,09 0,27 hsa-miR-576- 3p Controle 5 1,41 0,63 1,54 0,81 1,84 0,74 2,15 Endo I/II 4 1,2 0,56 1,02 0,8 1,61 0,77 1,99 0.7086 Endo III/IV 4 1,88 1,41 1,79 0,82 2,95 0,33 3,63 hsa-miR-576- 5p Controle 4 1,2 0,88 1,31 0,57 1,82 0,04 2,12 Endo I/II 4 1,6 0,27 1,54 1,44 1,76 1,34 1,98 0.6951 Endo III/IV 3 2,99 3,29 1,44 0,77 6,76 0,77 6,76 hsa-miR-579 Controle 5 0,69 0,53 0,75 0,24 1,19 0,06 1,22 Endo I/II 5 0,9 0,87 0,65 0,44 1,05 0,04 2,32 0.177 Endo III/IV 3 2,13 1,03 2,22 1,05 3,12 1,05 3,12 hsa-miR-581 Controle 5 12,73 23,5 0,51 0,26 8,41 0,2 54,31 Endo I/II 5 0,7 0,31 0,63 0,59 0,89 0,28 1,1 0.4821 Endo III/IV 3 0,49 0,5 0,21 0,19 1,06 0,19 1,06 137 hsa-miR-582- 3p Controle 4 5,04 4,31 4,36 1,52 8,56 1,15 10,27 Endo I/II 3 1,61 0,2 1,52 1,48 1,84 1,48 1,84 0.6889 Endo III/IV 3 50,98 86,79 1,17 0,58 151,19 0,58 151,19 hsa-miR-584 Controle 3 17,02 11,45 12,96 8,14 29,95 8,14 29,95 Endo I/II 5 10,24 11,57 3,06 2,36 17,12 1,28 27,39 0.3442 Endo III/IV 3 6,7 5,18 6,92 1,42 11,77 1,42 11,77 hsa-miR-586 Controle 3 6,94 6,49 3,65 2,75 14,42 2,75 14,42 Endo I/II 5 15,47 13,72 12,25 5,73 20,32 2,32 36,72 0.3625 Endo III/IV 4 35,66 43,51 17,19 9 62,31 8,28 99,96 hsa-miR-590- 3P Controle 5 1,23 0,72 1,27 1 1,43 0,23 2,23 Endo I/II 5 0,86 0,55 0,88 0,72 0,97 0,11 1,64 0.5434 Endo III/IV 5 1,08 1,04 0,77 0,51 1,26 0,08 2,78 hsa-miR-590- 5p Controle 5 1,25 0,81 1,56 0,83 1,84 0,04 2 Endo I/II 5 0,56 0,31 0,49 0,37 0,79 0,21 0,96 0.357 Endo III/IV 5 0,75 0,58 0,48 0,39 0,99 0,24 1,66 hsa-miR-592 Controle 5 1,01 0,64 0,76 0,47 1,46 0,47 1,88 Endo I/II 4 1,09 0,89 0,82 0,54 1,65 0,35 2,38 0.2341 138 Endo III/IV 4 1,72 0,68 1,79 1,19 2,26 0,9 2,42 hsa-miR-597 Controle 5 0,37 0,26 0,37 0,3 0,45 0,01 0,71 Endo I/II 5 0,31 0,2 0,31 0,19 0,37 0,08 0,6 0.6771 Endo III/IV 5 0,65 0,55 0,46 0,19 1,15 0,12 1,31 hsa-miR-598 Controle 5 1,49 0,63 1,54 0,94 1,66 0,87 2,42 Endo I/II 5 0,72 0,46 0,8 0,51 1 0,06 1,25 0.1142 Endo III/IV 5 0,65 0,55 0,46 0,19 1,15 0,12 1,31 hsa-miR-601 Controle 5 0,56 0,24 0,49 0,44 0,64 0,29 0,92 Endo I/II 5 0,79 0,68 0,61 0,35 0,67 0,34 1,97 0.8106 Endo III/IV 5 1,15 1,04 1,04 0,31 1,61 0,14 2,68 hsa-miR-616 Controle 4 1,35 0,46 1,43 1,06 1,65 0,73 1,82 Endo I/II 4 1,64 0,79 2 1,22 2,06 0,46 2,11 0.4169 Endo III/IV 3 2,54 1,72 1,7 1,41 4,52 1,41 4,52 hsa-miR-618 Controle 4 0,02 0,03 0,01 0 0,04 0 0,06 Endo I/II 4 4,79 9,41 0,14 0 9,59 0 18,9 0.8027 Endo III/IV 5 18,66 41,69 0 0 0,05 0 93,24 hsa-miR-623 Controle 5 2,64 3,07 1,22 0,74 2,96 0,42 7,85 139 Endo I/II 5 19,79 30,3 6,96 2,42 14,94 1,49 73,16 0.1466 Endo III/IV 5 24,68 38,48 11,28 1,45 16,7 1,44 92,51 hsa-miR-625# Controle 5 13067,71 29219,22 0,58 0,27 0,93 0,14 65336,63 Endo I/II 5 0,47 0,31 0,29 0,29 0,57 0,24 0,98 0.1809 Endo III/IV 5 0,22 0,12 0,25 0,18 0,27 0,05 0,37 hsa-miR-625 Controle 5 3,24 1,77 3,78 1,66 4,42 1,12 5,21 Endo I/II 3 0,84 0,32 0,95 0,48 1,1 0,48 1,1 0.07038 Endo III/IV 4 1,58 0,93 1,8 0,87 2,29 0,35 2,38 hsa-miR-628- 3p Controle 5 0,71 0,68 0,25 0,24 1,43 0,17 1,49 Endo I/II 5 0,48 0,23 0,46 0,36 0,56 0,2 0,81 0.8781 Endo III/IV 5 0,62 0,34 0,6 0,36 0,82 0,24 1,08 hsa-miR-628- 5p Controle 5 0,43 0,36 0,35 0,17 0,48 0,14 1,03 Endo I/II 5 0,32 0,19 0,25 0,19 0,44 0,13 0,61 0.8521 Endo III/IV 5 0,76 0,87 0,6 0,15 0,7 0,12 2,24 hsa-miR-629- 3p Controle 5 1,09 0,62 0,88 0,61 1,38 0,57 2,03 Endo I/II 5 1,06 0,93 0,94 0,54 1,24 0,05 2,51 0.7788 Endo III/IV 5 0,71 0,49 0,61 0,57 0,95 0,05 1,38 140 hsa-miR-629- 5p Controle 5 2,22 0,83 1,95 1,56 3,04 1,39 3,18 Endo I/II 4 0,74 0,5 0,79 0,36 1,12 0,11 1,27 0.01723 Endo III/IV 3 0,68 0,34 0,52 0,47 1,07 0,47 1,07 hsa-miR-636 Controle 5 0,95 0,59 0,77 0,54 1,15 0,42 1,87 Endo I/II 5 1,34 1,7 0,43 0,2 1,83 0,13 4,12 0.07609 Endo III/IV 3 0,14 0,09 0,09 0,08 0,25 0,08 0,25 hsa-miR-638 Controle 5 0,46 0,11 0,43 0,42 0,54 0,3 0,59 Endo I/II 5 0,62 0,98 0,25 0,15 0,25 0,1 2,37 0.07609 Endo III/IV 5 0,21 0,16 0,14 0,11 0,25 0,09 0,49 hsa-miR-639 Controle 5 0,27 0,2 0,28 0,11 0,38 0,05 0,55 Endo I/II 3 0,03 0,04 0,02 0 0,08 0 0,08 0.1343 Endo III/IV 4 0,24 0,31 0,11 0,06 0,42 0,05 0,7 hsa-miR-645 Controle 5 6,66 3,71 6,46 4,78 7,49 2,27 12,28 Endo I/II 5 9,41 8,08 7,74 5,62 9,17 1,58 22,94 0.1075 Endo III/IV 5 2,66 3,53 0,97 0,89 1,68 0,8 8,94 hsa-miR-652 Controle 5 0,48 0,62 0,24 0,22 0,26 0,11 1,58 Endo I/II 5 0,15 0,11 0,19 0,04 0,25 0,04 0,26 0.4398 141 Endo III/IV 4 0,98 1,38 0,45 0,07 1,9 0,05 2,98 hsa-miR-654 Controle 4 0,52 0,37 0,44 0,28 0,75 0,17 1,03 Endo I/II 4 0,14 0,12 0,13 0,04 0,24 0,03 0,26 0.2457 Endo III/IV 4 0,44 0,54 0,26 0,09 0,79 0,02 1,21 hsa-miR-654- 3p Controle 5 1,19 1,32 0,7 0,41 1,15 0,23 3,47 Endo I/II 4 1,19 0,72 1,04 0,61 1,78 0,61 2,1 0.2246 Endo III/IV 4 3,02 2,29 2,46 1,29 4,75 1,04 6,1 hsa-miR-655 Controle 5 1,95 0,73 1,84 1,46 2,34 1,13 2,98 Endo I/II 5 1,66 1,27 2,03 0,63 2,14 0,18 3,34 0.4819 Endo III/IV 5 1,14 1,01 0,88 0,39 2,11 0,03 2,27 hsa-miR-656 Controle 5 99832,45 223227,41 2,22 1,4 3,93 0,9 499153,78 Endo I/II 3 6,74 6,33 4,39 1,93 13,91 1,93 13,91 0.3932 Endo III/IV 3 4,21 6,54 0,66 0,21 11,76 0,21 11,76 hsa-miR-659 Controle 5 7,49 7,77 4,88 1,96 8,35 1,72 20,53 Endo I/II 5 6,56 4,53 4,35 3,21 11,07 2,35 11,83 0.357 Endo III/IV 5 4,91 6,53 2,23 1,8 2,24 1,7 16,59 hsa-miR-660 Controle 5 0,46 0,43 0,3 0,24 0,34 0,18 1,22 142 Endo I/II 5 0,21 0,2 0,17 0,05 0,28 0,03 0,51 0.3946 Endo III/IV 5 0,22 0,22 0,2 0,04 0,3 0,01 0,55 hsa-miR-661 Controle 5 0,87 0,37 0,94 0,59 1 0,44 1,37 Endo I/II 5 0,49 0,19 0,49 0,34 0,53 0,31 0,77 0.08046 Endo III/IV 5 0,38 0,23 0,34 0,22 0,58 0,11 0,63 hsa-miR-663B Controle 5 1,3 0,91 1,26 0,68 2,2 0,16 2,23 Endo I/II 5 0,23 0,1 0,23 0,17 0,27 0,1 0,37 0.1142 Endo III/IV 5 0,25 0,15 0,24 0,18 0,26 0,07 0,48 hsa-miR-664 Controle 5 0,7 0,37 0,67 0,59 0,76 0,21 1,25 Endo I/II 5 0,61 0,61 0,38 0,31 0,46 0,22 1,69 0.2299 Endo III/IV 5 0,4 0,48 0,18 0,15 0,43 0,03 1,21 hsa-miR-668 Controle 5 0,44 0,37 0,36 0,15 0,54 0,13 1,03 Endo I/II 5 0,31 0,18 0,23 0,2 0,35 0,19 0,61 0.9788 Endo III/IV 4 1,33 2,21 0,28 0,16 2,5 0,11 4,65 hsa-miR-671- 3p Controle 5 1,27 0,37 1,25 1,24 1,28 0,76 1,8 Endo I/II 5 1,52 1,07 1,51 0,84 2,53 0,13 2,6 0.9608 Endo III/IV 5 1,42 1 1,03 1 2,07 0,24 2,77 143 hsa-miR-675 Controle 5 0,94 0,31 0,89 0,69 1,1 0,63 1,38 Endo I/II 5 0,52 0,55 0,22 0,19 0,57 0,17 1,47 0.4025 Endo III/IV 5 1,1 1,3 0,47 0,2 1,42 0,17 3,25 hsa-miR-7-2# Controle 5 0,89 1,14 0,47 0,15 0,98 0,04 2,81 Endo I/II 3 0,78 0,59 0,46 0,41 1,45 0,41 1,45 0.957 Endo III/IV 5 0,76 0,74 0,88 0,12 0,94 0,01 1,85 hsa-miR-708 Controle 5 0,82 0,54 0,88 0,35 1,06 0,25 1,58 Endo I/II 5 0,81 0,31 0,73 0,66 0,86 0,5 1,33 0.495 Endo III/IV 3 0,46 0,48 0,35 0,05 0,99 0,05 0,99 hsa-miR-720 Controle 5 0,7 0,47 0,54 0,5 1,01 0,12 1,33 Endo I/II 5 3,89 6,12 0,81 0,59 2,96 0,41 14,68 0.6126 Endo III/IV 5 0,74 0,37 0,59 0,54 0,87 0,38 1,33 hsa-miR-744# Controle 5 1,34 0,58 1,15 1,08 1,71 0,64 2,12 Endo I/II 4 0,77 0,42 0,6 0,54 1 0,49 1,39 0.425 Endo III/IV 5 1,34 1,29 1,46 0,02 2,55 0,02 2,65 hsa-miR-744 Controle 5 0,79 0,14 0,85 0,79 0,86 0,55 0,88 Endo I/II 5 0,57 0,23 0,53 0,39 0,58 0,39 0,95 0.1119 144 Endo III/IV 5 0,5 0,18 0,54 0,44 0,59 0,24 0,71 hsa-miR-758 Controle 5 1,14 0,41 1,04 0,97 1,1 0,75 1,83 Endo I/II 5 0,99 0,83 0,58 0,4 1,73 0,21 2,04 0.054 Endo III/IV 3 2,72 1,15 2,25 1,89 4,03 1,89 4,03 hsa-miR-766 Controle 5 0,45 0,28 0,33 0,3 0,48 0,22 0,92 Endo I/II 5 0,52 0,21 0,6 0,39 0,62 0,24 0,77 0.4025 Endo III/IV 5 0,33 0,21 0,3 0,2 0,39 0,12 0,67 hsa-miR-769- 5p Controle 5 1,26 0,31 1,22 1,15 1,23 0,93 1,78 Endo I/II 5 0,75 0,56 0,51 0,47 1,09 0,14 1,55 0.357 Endo III/IV 5 1,17 1,14 1,16 0,39 1,21 0,07 3,01 hsa-miR-770- 5p Controle 3 2,65 3,3 1,1 0,41 6,44 0,41 6,44 Endo I/II 5 1,99 1,98 0,98 0,87 2,18 0,59 5,36 0.804 Endo III/IV 3 3,47 4,23 1,08 0,97 8,35 0,97 8,35 hsa-miR-873 Controle 5 5,03 2,8 5,64 2,47 7,17 1,78 8,07 Endo I/II 4 1,53 2,34 0,4 0,3 2,76 0,29 5,05 0.2361 Endo III/IV 3 9,93 10,93 7,98 0,11 21,71 0,11 21,71 hsa-miR-874 Controle 5 6,78 6,31 3,78 3,13 7,16 2,27 17,58 145 Endo I/II 5 2,02 2,36 0,67 0,67 2,78 0,16 5,84 0.1367 Endo III/IV 5 3,77 2,62 3 2,2 5,73 0,76 7,17 hsa-miR-875- 5p Controle 5 0,87 0,62 0,53 0,5 0,93 0,47 1,93 Endo I/II 5 2,01 1,11 2,52 1,12 2,64 0,59 3,2 0.1054 Endo III/IV 5 1,02 0,31 0,93 0,89 1,3 0,63 1,36 hsa-miR-876- 3p Controle 4 3,81 2,25 4,54 2,22 5,4 0,64 5,54 Endo I/II 3 2,45 0,77 2,31 1,76 3,29 1,76 3,29 0.3284 Endo III/IV 4 5,06 3,43 6,18 3,1 7,03 0,05 7,84 hsa-miR-876- 5p Controle 5 1,86 2,02 1,16 0,24 2,88 0,12 4,9 Endo I/II 4 0,6 0,29 0,67 0,4 0,81 0,2 0,88 0.4525 Endo III/IV 4 1,38 0,97 1,03 0,74 2,02 0,67 2,78 hsa-miR-885- 5p Controle 5 0,76 0,48 0,58 0,39 1,17 0,31 1,36 Endo I/II 4 13,19 20,98 3,93 1,01 25,37 0,45 44,43 0.1728 Endo III/IV 4 0,8 0,8 0,56 0,23 1,38 0,16 1,93 hsa-miR-886- 3p Controle 5 0,65 0,43 0,6 0,34 0,69 0,27 1,36 Endo I/II 5 1,32 1,12 1,29 0,56 1,64 0,12 3,02 0.4025 Endo III/IV 5 0,51 0,3 0,38 0,34 0,51 0,31 1,04 146 hsa-miR-886- 5p Controle 5 1,6 2,34 0,54 0,43 1,18 0,13 5,73 Endo I/II 5 1,18 0,91 1,01 0,82 1,23 0,17 2,65 0.1637 Endo III/IV 5 0,26 0,12 0,24 0,19 0,27 0,15 0,45 hsa-miR-889 Controle 5 3,08 4,07 1,25 0,83 2,5 0,57 10,23 Endo I/II 3 0,63 0,71 0,23 0,2 1,44 0,2 1,44 0.3569 Endo III/IV 3 3,27 4,14 1,62 0,21 7,98 0,21 7,98 hsa-miR-892b Controle 5 12,8 17,71 4,95 4,75 5,42 4,4 44,46 Endo I/II 5 21,37 20,4 10,26 4,83 41,98 4,66 45,11 0.6126 Endo III/IV 5 13,88 19,67 4,82 4,54 9,85 1,53 48,66 hsa-miR-9# Controle 5 1,61 1,19 1,2 1,05 2,19 0,26 3,36 Endo I/II 4 1,31 0,9 1,37 0,7 1,91 0,16 2,34 0.2906 Endo III/IV 3 3,45 2,18 3,14 1,44 5,78 1,44 5,78 hsa-miR-9 Controle 5 0,69 0,35 0,63 0,51 0,89 0,27 1,17 Endo I/II 4 1,91 2,73 0,57 0,5 3,31 0,5 5,99 0.3391 Endo III/IV 4 1,01 0,3 1,01 0,78 1,24 0,67 1,36 hsa-miR-92a Controle 5 0,65 0,39 0,54 0,38 0,99 0,22 1,14 Endo I/II 5 0,39 0,19 0,44 0,23 0,55 0,17 0,58 0.4025 147 Endo III/IV 5 0,32 0,16 0,26 0,24 0,45 0,11 0,51 hsa-miR-92a-1# Controle 5 1,12 0,66 1,16 0,53 1,34 0,49 2,09 Endo I/II 5 0,78 0,64 0,62 0,48 0,72 0,22 1,87 0.1387 Endo III/IV 4 2,3 1,34 2,47 1,4 3,2 0,52 3,74 hsa-miR-93# Controle 5 0,57 0,4 0,33 0,28 0,9 0,24 1,09 Endo I/II 5 0,39 0,12 0,38 0,29 0,38 0,29 0,58 0.5326 Endo III/IV 5 0,38 0,33 0,28 0,26 0,31 0,1 0,94 hsa-miR-939 Controle 5 0,71 0,58 0,39 0,35 1,18 0,17 1,49 Endo I/II 5 2,84 5,92 0,15 0,1 0,44 0,08 13,42 0.6505 Endo III/IV 5 0,8 1,09 0,26 0,18 0,88 0,04 2,66 hsa-miR-942 Controle 5 0,43 0,57 0,17 0,14 0,39 0,03 1,43 Endo I/II 5 0,46 0,33 0,35 0,22 0,57 0,16 0,97 0.68 Endo III/IV 4 0,39 0,29 0,25 0,22 0,55 0,22 0,82 hsa-miR-95 Controle 5 1,81 1,54 1,61 0,59 2,16 0,45 4,26 Endo I/II 5 2,35 0,88 2,27 1,82 2,74 1,31 3,59 0.5655 Endo III/IV 4 3,66 4,32 1,87 1,18 6,14 0,81 10,09 hsa-miR-98 Controle 5 0,76 0,52 0,62 0,56 0,68 0,28 1,65 148 Endo I/II 5 0,51 0,46 0,38 0,22 0,81 0,01 1,15 0.6771 Endo III/IV 5 1,76 1,84 1,1 0,17 3,18 0,13 4,2 hsa-miR-99a# Controle 5 1,15 0,96 0,78 0,73 1,49 0,13 2,64 Endo I/II 5 0,74 1,04 0,38 0,18 0,42 0,13 2,58 0.4677 Endo III/IV 5 1,21 1,33 0,79 0,59 1,14 0,05 3,49 hsa-miR-99a Controle 5 1,52 0,7 1,54 0,87 2,21 0,77 2,22 Endo I/II 5 1,12 0,56 1,18 1,03 1,34 0,25 1,79 0.7558 Endo III/IV 5 2,24 2,01 1,24 0,98 3,69 0,28 5,01 hsa-miR-99b# Controle 5 0,22 0,09 0,19 0,16 0,23 0,16 0,37 Endo I/II 5 0,23 0,11 0,18 0,14 0,33 0,12 0,37 0.6126 Endo III/IV 5 0,46 0,47 0,29 0,19 0,47 0,09 1,25 hsa-miR-99b Controle 5 0,65 0,52 0,48 0,37 0,53 0,32 1,57 Endo I/II 5 0,43 0,19 0,31 0,31 0,58 0,25 0,68 0.5117 Endo III/IV 5 0,41 0,29 0,27 0,23 0,61 0,13 0,81 hsa-miR-129-2- 3p Controle 5 4,1 3,44 3,45 2,49 4,69 0,32 9,56 Endo I/II 5 5,73 5,54 4,68 1,38 7,42 0,77 14,41 0.3263 Endo III/IV 5 10,53 8,89 9,54 5,68 10,2 1,94 25,27 149 hsa-miR-134- 5p Controle 5 3,42 3,88 2,17 1,07 2,87 0,79 10,2 Endo I/II 5 1,76 1,16 1,41 1,09 2,78 0,39 3,13 0.3791 Endo III/IV 5 1,45 1,96 0,82 0,41 0,86 0,24 4,92 hsa-miR-137 Controle 5 0,99 0,61 0,85 0,66 1,17 0,32 1,93 Endo I/II 4 1,57 1,06 1,79 0,83 2,31 0,11 2,57 0.1106 Endo III/IV 2 2,97 0,76 2,97 2,43 3,51 2,43 3,51 hsa-miR-140- 5p Controle 5 1,15 0,34 1,03 0,88 1,38 0,84 1,62 Endo I/II 5 0,64 0,17 0,61 0,55 0,77 0,42 0,86 0.04372 Endo III/IV 5 0,82 0,28 0,71 0,61 0,89 0,61 1,28 hsa-miR-187- 3p Controle 5 3,55 3,23 2,32 1,02 6,73 0,4 7,28 Endo I/II 3 2,56 1,28 2,59 1,27 3,83 1,27 3,83 0.03835 Endo III/IV 4 0,3 0,46 0,1 0,05 0,55 0,01 0,99 hsa-miR-374b- 5p Controle 5 0,88 0,47 1,06 0,68 1,2 0,15 1,29 Endo I/II 5 0,44 0,2 0,43 0,27 0,54 0,24 0,72 0.2209 Endo III/IV 5 0,42 0,2 0,4 0,26 0,61 0,2 0,62 hsa-miR-379- 5p Controle 5 1,08 0,55 1,23 0,67 1,27 0,4 1,82 Endo I/II 5 0,49 0,35 0,46 0,28 0,78 0,03 0,87 0.1604 150 Endo III/IV 5 0,72 0,44 0,96 0,5 1,05 0,04 1,06 hsa-miR-451a Controle 5 0,32 0,57 0,05 0,02 0,19 0,01 1,33 Endo I/II 5 0,02 0,03 0,01 0,01 0,02 0,01 0,07 0.3584 Endo III/IV 5 0,06 0,08 0,01 0 0,08 0 0,19 hsa-miR-491- 5p Controle 5 1,17 0,52 0,99 0,97 1,55 0,52 1,82 Endo I/II 5 0,72 0,38 0,77 0,46 0,82 0,27 1,27 0.3296 Endo III/IV 5 0,88 0,5 0,82 0,8 1 0,21 1,6 hsa-miR-495 Controle 5 1,85 0,48 2,07 1,57 2,18 1,14 2,3 Endo I/II 5 1,56 0,89 1,6 1,47 1,69 0,25 2,77 0.8869 Endo III/IV 5 2,33 1,38 1,6 1,41 3,16 1,12 4,36 hsa-miR-615- 3p Controle 5 13,41 8,98 15,56 8,27 17,46 1,18 24,6 Endo I/II 4 10,35 6,58 10,56 6,28 14,42 2,08 18,19 0.8425 Endo III/IV 4 9,89 6,32 11,54 6,1 13,69 0,87 15,63 hsa-miR-93-5p Controle 5 0,52 0,32 0,43 0,27 0,57 0,27 1,04 Endo I/II 5 0,24 0,11 0,23 0,19 0,31 0,09 0,38 0.06266 Endo III/IV 5 0,21 0,1 0,22 0,22 0,26 0,06 0,32 hsa-miR-96-5p Controle 4 1,71 1,51 1,62 0,43 3 0,28 3,34 151 Endo I/II 4 1,54 1,16 1,72 0,62 2,47 0,1 2,64 0.6677 Endo III/IV 4 0,99 0,83 0,86 0,45 1,53 0,12 2,12 hsa-miR-29a-3p Controle 5 1,13 1,57 0,42 0,3 0,79 0,24 3,92 Endo I/II 4 0,34 0,27 0,25 0,18 0,5 0,11 0,74 0.2934 Endo III/IV 4 0,99 0,83 0,86 0,45 1,53 0,12 2,12 hsa-miR-7-1-3p Controle 5 0,61 0,18 0,61 0,53 0,76 0,35 0,81 Endo I/II 5 0,38 0,25 0,37 0,25 0,38 0,12 0,79 0.357 Endo III/IV 5 0,55 0,48 0,44 0,33 0,53 0,08 1,35