Cinética celular na endometriose profunda infiltrativa de reto-sigmoide: estudo anátomo-clínico

Bassi MA. Cell kinetics in deep infiltrati ng endometriosis of rect osigmoid: an anatomoclinical study [thesis]. São Paulo: Medicine School, University of São Paulo; 2011.

Endometriosis, a benign disease, has invasive features with its proliferative potential. Development of lesions may occur due to stromal and/or glandular cell growth and to alterations in cellular kinetics. Cellular kinetics involves a balance between the regulation of cell death, or apoptosis, and cell growth, that can be eva luated by the expression of growth factors, suc h as topoisomerase 2 - alpha (TOP2A). Oncoproteins, such as p53 and c -erB2, known to affect apoptosis resulting in oncog enesis, also influence cellular kinetics. OBJECTIVES: The main

of this study was to compare the cellular kinetics in deep endometriosis i n- volving the recto -sigmoid to eutopic endometrium from patients without endo metri- osis. Apoptosis and TOP2A expression were primarily evaluated, as well as p53 and c-erB2 expression . METHODS: Study samples were obtained from endometriosis lesions involving the recto-sigmoid in 60 women, and control samples were obtained from eutopic endometrium from 20 women without endometriosis. The expression of TOP-2A, p53 and c -erB2 proteins were quantified using immuno -histochemistry. TUNEL method was used in the analysis of apoptosis patterns , and the apoptosis index (AI) was derived. The proliferation index (PI) was derived from the level of ex- pression of TOP-2A. Cellular renew index (CRI) was calculated from the ratio of the PI and AI. Immunohistochemi cal analyses were performed in two ways: on the ti s- sue collectively, and on the stromal and glandular components separately. Spear- man’s correlation coefficient was used to identify the correlation between clinical, morphological (size, number and level of invasion of lesions) and the study v a- riables. RESULTS: When looked at collectively, there was no difference in the AI between study and control groups ( p = 0.389). PI, however, was noted to be signif i- cantly higher in the control samples (p < 0.001). When evaluating the stromal cells separately from the glandular components, the PI and CRI were both significantly xiv higher in the control group compared to the study group (Study stromal PI vs control stromal PI; p = 0.006; Study glandular PI vs study glandular PI; p = 0.001; Study stromal CRI vs control stromal CRI; p = 0.032; study glandular CRI vs control gla n- dular CRI; p = 0.007). In patients with endometriosis, a correlation was found b e- tween glandular PI, CRI and number of lesions (p = 0.003). The same result was observed in the analysis of stromal CRI and lesion size (p = 0.006). There was no difference in expression of p53 and c-erB2 between groups. CONCLUSIONS: Cellular kinetics is altered in endometriosis of the recto-sigmoid, as shown by the decrease in the levels and frequency of TOP2A expression, and lower PI and CRI; however, apoptosis and p53 and c -erB2 expression were un af- fected.

1.Endometriosis 2.Bowel 3.DNA topoisomerase t ype II 4.Apoptos is 5.Genes p53 6.Protein c-erbB-2 xv SUMÁRIO Lista de abreviaturas …....................................................................................... vi Lista de tabelas ................................................................................................... vii Lista de figuras .................................................................................................... ix Resumo ............................................................................................................... xi

............................................................................................................... xiii 1. Introdução ...................................................................................................... 1 1.1 Endometriose ........................................................................................... 1 1.2 Cinética celular e endometriose ............................................................... 5 1.2.1 Apoptose ........................................................................................ 5 1.2.2 Topoisomerase II-alfa ..................................................................... 9 1.3 Mecanismos de controle da cinética celular ............................................. 12 1.3.1 Oncoproteína p53 ........................................................................... 14 1.3.2 Oncoproteína c-erb2 ...................................................................... 16 1.4 Endometriose e câncer ............................................................................ 17 2. Proposição ..................................................................................................... 22 3. Métodos ......................................................................................................... 23 3.1 Local do estudo ........................................................................................ 23 3.2 Pacientes .................................................................................................. 23 3.2.1 Critérios de inclusão ....................................................................... 24 3.3 Métodos .................................................................................................... 25 3.3.1 Dinâmica do estudo ........................................................................ 25 3.3.2 Quadro clínico ................................................................................ 28 3.3.3 Videolaparoscopia com ressecção de segmento de reto-sigmoide 28 3.3.4 Videolaparoscopia para realização de laqueadura ........................ 31 3.3.5 Estadiamento da endometriose ...................................................... 31 3.3.6 Características das lesões de endometriose do reto-sigmoide .... 33 3.3.7 Confirmação diagnóstica e classificação histológica ..................... 33 3.3.8 Detecção de apoptose ................................................................... 35 3.3.9 Reação imuno-histoquímica para pesquisa de p53, c-erB2 e to- poisomerase II-alfa .................................................................................. 38 3.4 Mensuração dos resultados ..................................................................... 41 3.5 Análise estatística .................................................................................... 43 4. Resultados ..................................................................................................... 45 5. Discussão ...................................................................................................... 59 6. Conclusões .................................................................................................... 68 7. Anexos ........................................................................................................... 69 8. Referências .................................................................................................... 83 Introdução 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 ENDOMETRIOSE Descrita pela primeira vez por von Rokitansky em 1860 (von Rokitansky, 1861), a endometriose corresponde à presença de glândula e/ou estroma endometriais em sítios ectópicos à cavidade do útero (Metzger e Haney, 1989). A endometriose acomete 10% a 15% das mulheres durante a menacma (Eskenazi e Warner, 1997; Abrão et al., 2000; Bia nchi et al., 2007) e está presente em 40% a 60% das pacientes com dor pélvica, ressaltando - se que 2% a 22% das pacientes são assintomáticas (Farquhar, 2000). Em 5,3% a 12% dos casos a endometriose pode se instalar na parede intestinal, ocasião em que o reto-sigmoide é responsável por 55% a 80% de todas as lesões observadas nesse sítio (Abrão et al., 2003a; Darai et al., 2005; Chapron et al., 2006; 2009). Estima -se, ainda, que alguns casos de endometriose esteja m relacionados com câncer (Marchevsky e Kaneko, 1978; La Grenade e Silverberg, 1988; Bassi et al., 2009). Uma das primeiras hipóteses da etiopatogenia da endometriose foi proposta por Meyer em 1919, conhecida como a teoria da metaplasia cel ô- mica que defende a transformação de mesotélio em tecido endometrial. Em 1927, Sampson apresentou a teoria da menstruação retrógrada, que ainda é a hipótese mais conhecida, segundo a qual haveria implante de Introdução 2 células endometriais provenientes do refluxo do sangue menstrual pelas t u- bas uterinas para a cavid ade abdominal. A ocorrência desse implante seria influenciada por ambiente hormonal favorável e por fatores imunológicos que não eliminariam essas células desse l ocal impróprio (Weed e Arguembourg, 1980; Siristatidis et al., 2006). Essas duas teorias propostas já há quase um século ainda constituem as duas correntes principais para o entendimento da patogênese da endome- triose. Ao longo dos anos, diversas outras hipóteses foram sugeridas, dentre as quais a teoria da disseminação linfática (Halban, 1925); a hipótese de dissemi- nação hematogênica (Sampson, 1927); a teoria iatrogênica (Greenhill, 1942); a teoria composta (Javert, 1949); a teoria hormonal (Meigs, 1953); a teoria da an- giogênese (Klagsbrun e D'Amore, 1991); e a te oria da inibição das matriz - metaloproteinases (Sharpe-Timms et al., 1995). A teoria imu nológica (Weed e Arguembourg, 1980) foi precursora de estudos sobre o papel etiopatogênico das interleucinas (Morgan et al., 1992), da apoptose (Kerr et al., 1994) e da catepsina D (Bergqvist et al., 1996). Ne- nhuma dessas teorias, porém, conseguiu elucidar de modo absolutamente seguro a etiopatogenia da endometriose. Os diversos aspectos dessa afecção levaram Nisolle e Donnez (1997) a introduzir conceito segundo o qual a endometriose seria dividida em três d o- enças distintas: a doença peritoneal, a ovariana e a do septo retovaginal . A doença peritoneal é caracterizada pela presença de implantes superficiais no peritônio; a doença ovariana engloba os implantes superficiais de ovário e os endometriomas, que são os cistos típicos dessa afecção; e a doença de sep- Introdução 3 to retovaginal acomete as regiões retrocervical e paracervical, o septo r eto- vaginal, o reto-sigmoide, os ureteres e a bexiga de forma infiltrativa, com l e- sões de profundidade maior do que cinco milímetros. Esta afec ção também é denominada de endometriose infiltrativa profunda (Cornillie et al., 1990). Sinais e sintomas que caracterizam o quadro clínico da endometriose referem-se a queixas como dismenorreia em graus variáveis, dor pélvica acíclica, dispareunia de prof undidade, infertilidade e alterações intestinais e urinárias cíclicas como puxo, tenesmo, proctorragia, diarreia e/ou constipação durante o período menstrual (Abrão et al., 2003a). Nos casos de endometriose intestinal, sintomas mais específicos dependem do grau de comprometimento da parede do intestin o e incluem dor retal irradiada ao períneo ao defecar (52%), constipação intestinal ou diarreia (25% a 40%) e alternância entre constipação e diarreia (14%) (Av erbach et al., 2005). Alguns casos apresentam sintomas típicos de suboclusão intestinal , e casos mais graves, oclusão intestinal (Assenza et al., 2004). A dor pélvica acíclica geralmente é mais intensa na endometriose intestinal, provavelmente devido a perda de fibras nervosas simpáticas nas camadas muco sa e muscular adjacentes às lesões de endometriose na parede intestinal e à hiperinervação observada na lesão em si (Wang et al., 2009; Ferrero et al., 2010). O diagnóstico definitivo da doença ainda é eminentemente histológico, o que implica na utilizaçã o de métodos invasivos que possibilitem visualizar as lesões sugestivas de endometriose e permitam a obtenção de amostra tecidual (Abrão et al., 2000). De toda forma, exames de imagem são Introdução 4 recursos que auxiliam a investigação diagnóstica. O enema opaco tamb ém pode ser utilizado no diagnóstico de endometriose intestinal, com sensibilidade regular e baixa especificidade, com resultados que se associam aos da ultrassonografia transvaginal, porém com concordância moderada (Ribeiro et al., 2008). A ressonância ma gnética se mos tra eficiente auxiliar diagnóstico (Douglas e Rotimi, 2004), porém a ultrassonografia transvaginal com preparo i ntestinal representa o exame de imagem com melhor relação custo -benefício nos casos de endometriose profunda e ovariana (Gonçalves et al., 2009; Abrão et al., 2009). A classificação histológica das lesões endometrióticas permite a distinção entre a endometriose estromal (caracterizada pela presença de estroma morfologicamente similar ao do endométrio eutópico em qualquer fase do cic lo) e a endometriose glandular (caracterizada pela presença de epitélio superficial ou constituindo espaços glandulares ou císticos, associado a tecido com sinais de hemorragia prévia). Conforme a similaridade com o epitélio endometrial ativo, o padrão gla ndular é subclassificado em bem diferenciado, quando a morfologia das células epiteliais não se distingue do endométrio eutópico nas diferentes fases do ciclo; indiferenciado, quando o epitélio é aplainado ou cuboidal baixo, sem correspondente endometrial eutópico, assemelhando -se ao mesotélio do revestimento peritoneal, ou quando o epitélio é do tipo mulleriano e distinto do endometrial; e com diferenciação mista, quando há presença dos padrões anteriores na mesma localização (Abrão et al., 2003a). Introdução 5 1.2 CINÉTICA CELULAR E ENDOMETRIOSE A homeostasia de tecidos normais requer equilíbrio adequado entre proliferação e morte celular, o que depende das propriedades e da atividade das células ou do conjunto de reações físic o-químicas que ocorrem no microambiente celular, denominado cinética celular (Harada et al., 2004) . Essa atividade tem expressão morfológica que pode ser avaliada por meio da análise da apoptose, ou morte celular programada, cuja expressão determina o Índice de Apoptose (IA), e da topoisomerase II-alfa (TOP2A), que faz parte do grupo de enzimas intimamente envolvidas em vários estágios da proliferação celular, cuja expressão determina o Índice de P roliferação Celular (IP) (Deweese et al., 2008; Singh e Bhardwaj, 2008). 1.2.1 Apoptose A apoptose é evento importante para diversos processos fisiológicos e patológicos (Kerr et al., 1994), caracterizado pela fragmentação nuclear, formação de co rpos apoptóticos contendo organelas e encolhimento celular (Kerr et al., 1994). Nesse fenômeno, o proto -oncogene bcl-2 (B-cell lympho- ma/leukaemia 2 gene) previne a apoptose promovendo a sobrevivência celu- lar ao bloquear o curso apoptótico final que resulta na morte celular (Jones et al., 1998). Há evidências de que a apoptose está diretamente envolvida na reg u- lação do ciclo menstrual, sendo responsável pela eliminação das células s e- Introdução 6 nescentes da camada funcional do endométrio eutópico durante as fases f i- nais do período menstrual (Harada et al., 2004). Diversos autores estudaram a expressão de bcl -2 no endométrio normal como um indicador indireto da apoptose. No epitélio glandular, a expre ssão de bcl-2 variou de acordo com a fase do ciclo menstrual: atingiu um pico na fase proliferativa e se mostrou ausente na fase secretória (Gompel et al., 1994; Otsuki et al., 1 994; Koh et al., 1995). No epitélio estromal houve expressão de bcl-2 apenas nas células linfóides do endométrio na fase secretória final (McLaren et al., 1997). Esses achados suportam a hipótese de que a expressão de bcl -2 seria regulada pelos hormônios esteroides que controlam as alterações endometriais duran- te o ciclo menstrual (Otsuki et al., 1995; Koh et al., 1995). De modo geral, os padrões apoptóticos parecem não diferir em endomé- trio eutópico e ectópico em mulheres com e sem endometriose (Hassa et al., 2009), mas há controvérsias na literatura a esse respeito. Já foi evidenc iado que o índice de apoptose está significativamente reduzido no epitélio glandu- lar das células do endométrio eutópico de mulheres com endometriose (Gebel et al., 1998; Dmowski et al., 2001; Braun et al., 2007), as quais parecem per- der a variabilidade cíclica fisiológica da apoptose (Harada et al., 2004). Wata- nabe et al. (1997) observaram que as células glandulares do tecido endom e- triótico eutópico apresentam padrão apoptótico cíclico, o que não foi evidenci- ado no endométrio ectópico de mulheres com endometriose. Parece que alterações encontradas no endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose se referem à regulação da apoptose (G ebel et al., 1998; Jones et al., 1998; Watanabe et al., 1997; Dmowski et al., 2001). Introdução 7 Jones et al. (1998) reportaram expressão aumentada de bcl-2 refletindo ausência de apoptose nas células estromais de tecido ectópico. Ilad et al. (2004) também observaram decréscimo importante de apoptose d etectada por expressão aument ada de ubiquitina no componente estromal de tecido de endométrio ectópico, o que os levou a sugerir que as células estromais teriam papel diferenciado no desenvolv imento da endometriose. Dmowski et al. (2001), no entanto, não e ncontraram diferença significativa no índice a- poptótico de células estromais de tecido endometriótico ectópico quando compararam mulheres com e sem endometriose. É pertin ente propor que diminuição nos índices de morte celular por apoptose viabilizaria o c rescimento do tecido endometrial ectópico e, assim, seria esperada correlação inversa entre o nível de apoptose e a gravidade da doença (Harada et al., 2004). De fato, Dmowski et al. (2001) observaram tendência acentuada, mas não significativa, de índices reduzidos de apopto- se estarem associados a estadios mais avançados da endometriose no tec i- do ectópico. Há autores que não encontraram diferenças nos índices de apoptose em tecidos eutópicos e ectópicos de mulheres sem e com endometriose, mas evidenciaram proliferação celular significativamente aumentada nos c a- sos de endometriose, principalmente nos implantes peritoneais (Aguiar, 2007), nos quais a redução da apoptose é geralmente mais drástica (Dufour- net et al., 2001). Os índices de proliferação celular ma is altos foram detect a- dos no componente estromal do endométrio eutópico ou no componente glandular do implante ectópico (Aguiar, 2007). Introdução 8 Parece que a característica invasiva da lesão endometriótica decorre da redução da morte celular associada com aumento da proliferação celular (Johnson et al., 2005; Braun et al., 2007); essa assertiva se mostra plausível, uma vez que já foi evidenciado que a indução de redução da proliferação ce- lular e de aumento de apoptose diminuiu o desenvolvimento inicial da doe n- ça em modelo animal de endometriose (González-Ramos et al., 2008). Também em modelo experimental, Rosa e Silva et al. (20 10) investiga- ram a caracterização do padrão homeostático de tecido endometrial eutópico e ectópico de coelhas submetidas à indução de lesões endometrióticas. Ob- servaram maior índice de proliferação celular tanto no componente glandular quanto no estromal do tecido e ctópico nas análises realizadas quatro e oito semanas após a indução das lesões. Não houve diferença no índice de a- poptose nos tecidos eutópicos e ectópicos na análise realizada após quatro semanas; todavia, após oito semanas, ficou evidente a redução significativa de apoptose no tecido ectópico em relação ao eutópico. Por fim, ao calcul a- rem o índice de renovação celular (ou seja, o índice de proliferação celular dividido pelo índice de apoptose), observaram tendência acentuada de maior proliferação celular nas lesões ectópicas induzidas, revelando o favorec i- mento do hospedeiro ao desenvolvimento da doença. Experimentos com substância s como a melatonina e a sinvastatina para o tratamento da endometriose fundamentado no princípio de que o aumento de apoptose poderia resultar na regressão da lesão de endometriose têm revelado resultados promissores no epitélio glandular e no estromal, ra tificando, assim, o papel da redução da apoptose na perpetuação da endometriose (Paul et al. 2010; Sokalska et al., 2010). Introdução 9 Por fim, Agic et al. (2009) acreditam que as evidências atualmente disponíveis sugerem que existam diferenças fundamentais nas célula s do endométrio de mulheres com e sem endometriose. Admitem que a apoptose desempenha papel importante na fisiopatologia da endometriose, uma vez que a prolife ração celular exacerbada e a capacidade aumentada para implantação e sobrevivência em sítios ectó picos são características marcantes das células endometriais de mulheres com endometriose. Para os autores, falta apenas esclarecer se as alterações apoptóticas no endométrio eutópico de mulheres com endometriose seriam decorrentes de um processo primário ou se seriam secundárias ao desenvolvimento e estabelecimento de endometriose pélvica. 1.2.2 Topoisomerase II-alfa A topoisomerase II é uma enzima nuclear que altera a topologia do DNA e é essencial para diversos processos nucleares como a condensação cromossômica, a separação da cromatina e o alívio do estresse torsional que ocorre durante a dupl icação e a transcrição do DNA (Champoux, 2001). Uma das duas isoformas dessa enzima é denominada topoisomerase II -alfa (TOP2A), que é codificada pelo gene TOP2A e faz parte do grupo de enzimas intimamente envolvidas em vários estágios da multiplicação celular , estando, por isso, envolvidas na propagação de células neoplásicas (Deweese et al., 2008; Singh e Bhardwaj, 2008). Introdução 10 Para melhor compreensão da ação dessa en zima na célula é necessário relembrar brevemente o ciclo celular, processo em que a célula eucarionte produz células -filhas para o sustento da homeostasia ou do crescimento tecidual, e que ocorre em quatro fases: G1 ( Gap 1), S (fase de síntese de DNA), G2 (Gap 2) e M (fase de mitose), além de haver uma fase de quiescência denominada G0. Nas fases G1 e G2 a célula tem determinado tempo para crescer e para retificar erros imprevi stos na síntese de DNA. Esse ciclo é principalmente controlado pelas ciclinas (A e H), pelas quinases dependentes de ciclinas (CDKs), pelas proteínas inibidoras de quinases (CDK-i) e por produtos de genes supressores de tumores (p53 e Rb). A atividade das CDKs é regulada por mecanismos que incluem a fosforilação e a desfosforilação da subunidade quinase, a ativação por ciclinas, e a inibição por proteínas inibid oras que são elementos importantes na supressão de tumores (Solomon, 1993; Sherr, 1994; Reed et al., 1994; Morgan, 1995; Sherr e Roberts, 1995). Para o estudo morfológico do cicl o celular utiliza -se, entre outros possíveis métodos, a reação imuno-histoquímica para detecção de proteínas nucleares associadas a esse ciclo, como a enzima TOP2A (Woessner et al., 1991). Assim, a TOP2A não é detectada nas células G0, mas sua atividade aumenta drasticamente durante a fase S, atingindo um pico na fase G2 -M, voltando, então, a declinar (Hellemans et al., 1995). Mondal e Parvin (2001) demonstraram que a transcrição sobre os moldes de cromatina resulta no acúmulo de tensão na hélice do DNA tornando a atividade de relaxamento da topoisomerase II essencial para a síntese de RNA. Introdução 11 Uma vez que a TOP2A gera quebras na cadeia de DNA para completar o seu ciclo catalítico, tem o potencial de fragmentar o genoma toda vez em que funciona. Desse modo, emb ora essa enzima seja essencial para a sobrevivência das células proliferativas, ao mesmo tempo apresenta efeitos genotóxicos significativos, característica que a faz ser cada vez mais explorada para o desenvolvimento de diferentes drogas anticâncer (McClendon e Osheroff, 2007). Por outro lado, já há evidências de que essa enzima esteja associada a translocações cromossômicas em leucemias específicas (Deweese et al., 2008). Chen et al. (2009) relataram que a expressão aumentada de TOP2A é fator preditivo ind ependente de prognóstico ruim nos casos de leucemia mieloide aguda, razão pela qual pode servir como marcador biológico para a estratificação de pacientes leucêmicos. Também já está evidenciado que a expressão aumentada de TOP2A está significativamente ass ociada com alterações na proliferação e na diferenciação celular em tumores colorretais, de estômago, endométrio e de mama (Brustmann, 2005; Tsiambas et al., 2006; Coss et al., 2009). Sheen-Chen et al. (2010) analisaram a expressão de TOP2A em amostras de 94 pacientes com câncer de mama primário. Observaram diferentes graus de expressão da TOP2A, mas não encontraram valor prognóstico dessa expressão no câncer de mama. Apesar da associação entre expressão aumentada da TOP2A e tumores mamários, estudos recentes têm discutido o caráter ainda inconclusivo dessa associação (Oakman et al., 2009; Nielsen et al., 2010). A expressão aumentada da TOP2A tem sido associada com as Introdução 12 neoplasias mais agressivas e altamente proliferativas (Hellemans et al., 1995; Deweese et al., 2008). Além disso, está integralmente envolvida com o mecanismo de ação das antraciclinas (Pritchard et al., 2008), razão pela qual é considerada importante alvo celular para as drogas quimioter ápicas (Li e Liu, 2001). Diversos estudos sobre os mecanismos que regulam a expressão do gene TOP2A têm demonstrado como e sse gene pode ser sub -regulado na resistência a essas drogas, aumentando o entendimento das funções biológicas da TOP2A (Isola et al., 2000; Mirski et al., 2000). Recentemente, Faggad et a l. (2009) sugeriram que a expressão aumentada de TOP2A estaria envolvida também na progressão do câncer de ovário, o que a torna alvo de futuras investigações que determinem o seu papel prognóstico e preditivo na evolução desse tipo de tumor. 1.3 MECANISMOS DE CONTROLE DA CINÉTICA CELULAR Os mecanismos que regulam a cinética celular envolvida na endom e- triose não estão completamente elucidados. Entretanto, alguns estudos ev i- denciaram por técnicas de hibridização in situ fluorescente (fluorescence in situ hybridization – FISH) (Shin et al., 1997; Kosugi et al., 1999; Bischoff et al., 2002), perda de heterozigose (loss of heterozygosity – LOH) (Gomenou et al., 2000; Obata e Hoshiai, 2000; Thomas e Campbell, 2000) e hibridiz a- ção genômica comparativa ( comparative genomic hybridization – CGH) (Go- gusev et al., 2000) que as alterações genéticas encontradas envolvem reg i- ões cromossômicas que contêm protoncogenes e/ou g enes supressores de Introdução 13 tumor conhecidos ou putativos, previamente relacionados com câncer de ovário, como, por exemplo, nas regiões 1q21, 9p21 e 17p13.1. Estudo experimental recentemente publicado por Pelch et al. (2010) e- videnciou que os genes 479 e 114 (associados com a matriz extracelular, adesões celulares, resposta imunológica, crescimento celular e angiogêne- se) se mostraram notadamente alterados em lesões de endometriose ind u- zidas em ratas em relação às amostras de endométrio eutópico. Prowse et al. (2006) investigaram 15 casos de endometriose ovariana, após microdissecção a laser, utilizando 12 m arcadores de microssatélites mapeados próximos ou ligados a genes previamente associados com o d e- senvolvimento da endometriose (por exemplo, TP16, TP53, APOA2 e PTEN). Os autores não detectaram perda de heterozigose na maioria das lesões e somente uma amostra apresentou essa perda no microssatélite cor- respondente à região cromossômica 8p22 . Outros estudos que pesquisaram perda de heterozigose por análise de microssatélites (Jiang et al., 1996) e por sequenciamento automático de DNA (Jimbo et al., 1997) demo nstraram a natureza monoclonal do tecido endometriótico. Para a finalidade deste estudo, propusemo -nos conhecer o papel de duas oncoproteínas específicas, p53 e c-erB2, cuja expressão está bem e s- tabelecida em uma série de processos neoplásicos (Ross et al. , 2003; N a- kamura et al., 2004; Tomasini et al.; 2008), de modo a investigar a sua forma de apresentação na endometriose profunda. Introdução 14 1.3.1 Oncoproteína p53 O gene TP53 é um dos mais importantes genes supressores tumorais frequentemente mutado em cânceres humanos, o qual codifica uma fosf o- proteína nuclear de 53 KDa multifuncional , com atuação na regulação do ci- clo celular, integridade do DNA e apoptose. A função primária dessa prote í- na p53 na supressão tumoral é atribuída às propriedades de fator transcr i- cional e regulador da expressão de diferentes genes celulares (Ad imoolam e Ford, 2003). Um importante papel da p53 na proteção do genoma celular está ass o- ciado à remoção e reparo de lesões potencialmente mutagênicas ao DNA via reparo por ex cisão de nucleotí deos (Sengupta e Harris, 2005). Em re s- posta a estímulos genotóxicos, a proteína p53 é ativada por uma série de modificações estruturais e, com o a uxílio de um complexo de coativadores, liga-se a regiões promotoras específicas, ac ionando a transcrição de ge nes importantes como o XPC, responsável pelo reconhecimento de erros no DNA. A proteína XPC se liga diretamente no local do dano ou, dependendo do tipo de erro, requer uma interação preliminar de coativadores proteicos específicos no sítio da lesão, os qua is posteriormente sofrem imediata d e- gradação proteossômica (Sengupta e Harris, 2005). Nakamura et al. (2004) sugeriram que a perda ou a inativação dos dois alelos de TP53 e XPC por mutações e/ou deleções pode promover instabilidade genômica e predispor as células à transformação tumoral. Introdução 15 Segundo Tomasini et al. (2008) há evidências suficientes na literatura de que membros da família TP53 sejam os principais genes reguladores na relação entre instabilidade cromossômica e câncer, pois são responsáveis pela transcrição de proteínas supressoras de tumores e desempenham p a- pel importante no controle da ploidia celular. A expressão da proteína p53 no núcleo da célula é considerada ma r- cador prognóstico de vários carcinomas, como os de mama, estômago, c ó- lon e endométrio. Nesses casos, amostras positivas para p53 seriam indic a- doras de menor sobrevida do paciente e menor tempo livre da doença (Sung et al., 1996). Coronado Martín et al. (2007) puderam estabelecer forte associação entre expressão aumentada de p53 e fa tores prognósticos em carcinomas de ovário, incluindo estadio avançado da doença, tipo e grau histológico. Interessante chamar a atenção para o fato de que Jiang et al. (1996) e Nakayama et al. (2001) não encontraram mutações do gene TP53 em teci- dos de e ndometriose. Por outro lado, Saínz de La Cuesta et al. (2004) e n- contraram expressão aumentada de p53 em 82% dos tumores de ovário as- sociados com endometriose, em 100% dos casos de endometriose com ati- pia celular e apenas 11% na endometriose sem atipia celular. Neste sentido, Zubor et al. (2009) relataram que o aumento da transcrição dos genes pró - apoptóticos p53 e bcl -x em amostras de endométrio eutópico se mostrou significativamente associado com a presença de endometriose. Introdução 16 1.3.2 Oncoproteína c-erB2 A proteína c-erbB2 codificada pelo oncogene ERBB2 é membro da f a- mília de receptores transmembrânicos do tipo tirosina-quinase (HER-1, HER- 2, HER-3, HER-4) e apresenta elevada afinidade com substratos estimulado- res de crescimento (Ross et al., 2003). A famí lia ERBB participa das vias de transdução de sinais de proliferação, diferenciação, motilidade e adesão em uma variedade de linhagens celulares (Baselga e Albanell, 2001). A interação destes receptores tirosina -quinase com fatores de crescimento promove a formação de dímeros entre as diferentes proteínas c -erB2 e, consequent e- mente, a ativação da divisão celular. A expressão elevada de c -erB2 resulta na formação de homodímeros permanentes que se mantêm constitutivamente ativos e estão associados com vantagens proliferativas (Pupa et al., 2005). Níveis aumentados de expressão do gene ERBB2 são descritos em vá- rios tipos de tumores sólidos e, particularmente, no câncer de mama, quando mostra associação a prognósticos agressivos (Ross et al., 2003). Estudos de investigação da eventual associação entre câncer de mama e expressão de c-erB2 (Ross et al., 2003) demonstraram pior prognóstico re- lativo à sobrevida global para os tumores positivos para essa oncoproteína. Essa observação, porém, não se aplica ao prognóstico relativo ao tempo livre da doença, o que tem sido interpretado como deterioração da resposta ao tratamento nos casos de recidiva. Antunes et al. (2004), todavia, não obse r- varam qualquer vantagem na determinação da expressão de c -erB2 como fator prognóstico para recidiva e sobrevida ao examinarem 66 peças histol ó- gicas de tumores primários de mama. Introdução 17 Nos tumores endometriais, a expressão de c -erB2 e bcl -2 parece ter papel limitado para a identificação de tumores de risco maior, enquanto fenó- tipos malignos m ais agressivos parecem estar fortemente associados com expressão aumentada de p53 e Ki-67 (Pilka et al., 2008). Resultados de estudo conduzido por Nasu et al. (1995) sugeriram não haver envolvimento de c -erB2 na patogênese da endometriose ; porém, não há outros estudos relativos a esse tema publicados recentemente. 1.4 ENDOMETRIOSE E CÂNCER Evidências em literatura indicam que neoplasias são fenômenos mon o- clonais (McDonnel, 1993; Mommers et al., 1999). Postula-se que t umores malignos se desenvolvem em de corrência de estados hiperproliferativos do epitélio; porém, mais recentemente se defende que a transformação neopl á- sica pode ocorrer em células que perdem a capacidade de entrar em apo p- tose, e que qualquer alteração no equilíbrio entre proliferação celular e apop- tose pode ter papel crucial no desenvolvimento de neoplasias (Braun et al., 2007; González-Ramos et al., 2008). Índices de proliferação celular e de apoptose são mais altos em tecidos carcinomatosos do que em epitélios normais (Allan et al., 1992). Também já foi relatada expressão aumentada de bcl -2 em uma variedade de tumores, especialmente os mamários, nos quais é inversamente proporcional à e x- pressão de p53 (Zhang et al., 1997), embora ainda não tenha sido estabel e- cida relação genética consistent e entre esses marcadores (Sjönströn e Be r- gh, 2001; Pilka et al., 2008). Introdução 18 Ainda que o desenvolvimento de processos neoplásicos seja pouco frequente em casos de endometriose, que se configura como uma doença benigna, apesar da constante evolução do quadro, Mascaretti et al. (2007) relataram haver associação eventual entre endometriose e câncer de ovário. Sampson (1927) foi o primeiro a relatar que a endometriose poderia f a- vorecer o desenvolvimento de neoplasias. Posteriormente, a doença foi a s- sociada clinicam ente com subtipos de neoplasias ovarianas, em particular com o carcinoma de endométrio e o de células claras de ovário (Swiersz, 2002). Na literatura médica, vários tipos de carcinoma e sarcoma foram correlacionados com focos de endometriose (Benoit et al ., 2006). Bruson et al. (1988) relataram que aproximadamente 90% desses casos apresentam carcinomas de endométrio e apenas 5% são tumores de células claras. Há cerca de 45 casos de tumores intestinais associados à endometriose relatados até o presente (Sla vin et al., 2000; Jones et al., 2002; Kim et al., 2009). Desse total, 18 casos são adenocarcin omas primários localizados no reto-sigmoide, e os demais incluem sarcoma de células fusiformes, carcinoma de células escamosas, adenoacantoma, carcinossarcomas, carcinoma adenoescamoso, tumor misto de células germinativas, carcinoma de células claras, adenofibroma, adenossarcomas, hiperplasias atípicas, adenocarcinomas in situ de endométrio e sarcomas do estroma endometrial. Kim et al. (2009) relataram achado de en dometriose intestinal após cirurgia de intento curativo em cinco pacientes assim tratadas p or apresentarem carcinomas de cólon ou reto, e sugeriram que a endometriose Introdução 19 intestinal deva ser também investigada em mulheres em idade reprodutiva que apresentem sintomas gastrointestinais associados com massa intestinal de origem desconhecida. Mais recentemente, Rafailidis et al. (2010) publicaram o caso de paciente de 45 anos com queixa de sangramento retal recorrente, cuja colonoscopia revelou presença de massa po lipoide retal. Exame histológico após a realização de retossigmoidectomia evidenciou presença de endometriose intestinal com envolvimento de nódulo linfático. Estudos demonstram que o tecido de endometriose carrega potencial proliferativo e de monoclonalid ade (Nilbert et al., 1995). As teorias etiopatogênicas da endometriose envolvem fatores de crescimento e citocinas associados com a regulação da multiplicação celular e a neoangiogênese que podem atuar na carcinogênese (Brinton et al., 1997). Podgaec et al . (2007) demonstraram que a endometriose, enquanto doença inflamatória, apresenta alterações no componente Th2, representadas por aumento relativo das citocinas representativas desse padrão de resposta imunológica. Parece, também, que os níveis de fator de crescimento endotelial vascular apresentam variações cíclicas no fluido peritoneal em pacientes com endometriose (Pupo-Nogueira et al., 2007). Formas de câncer ovariano podem estar associadas a essa afecção (Erzen e Kovacic, 1998; Stern et al., 2001). Há evidências de que a endometriose é fator de risco independente para câncer de ovário (Van Gorp et al., 2004), e esse risco aumenta proporcionalmente com o tempo de duração da endometriose (Melin et al., 2006). Introdução 20 Alterações do gene PTEN foram identificadas em 21% dos endometrio- mas de ovário (Hitti et al., 1990). Estudos histoquímicos também evidenciaram que alterações em bcl-2 e p53 podem estar associadas com a maligniz ação de cistos endometrióticos (Nezhat et al., 2002). Até 2002, havia nove relatos de malign ização de endometriose intestinal (Mourra et al., 2001; Cho et al., 2002; Jones et al., 2002), e casos isolados vêm sendo descritos nos últimos anos (Ulrich et al., 2003; Hoang et al., 2005; Leng et al., 2006). Trata -se geralmente de carcinomas endometrioides, e alguns se referem à transformação sarcomat osa de baixo grau. A possibilidade de malignização da endometriose intestinal torna importante a realização de estudos específicos das características morfofuncionais do tecido endometrial ectópico que o aproximam do fenótipo neoplásico (Falco et al., 2007). A despeito dessa possibilidade, pode-se dizer que endometriose é uma lesão benigna com caráter invasivo, e que, como demonstrado, diversos e s- tudos já descreveram associação com neoplasias em razão do seu potencial proliferativo e de sua monoclonalidade. Modificações na cinética celular do tecido endometrial como um todo e nos compartimentos estromal e glandular isoladamente podem se relacionar com o desenvolvimento da endometriose, assim como alterações na participação de oncoproteínas essenciais para o controle do ciclo celular. Uma vez que a literatura médica carece de estudos tanto sobre a cin é- tica celular quanto sobre a expressão de p53 e c-erB2 em tecido de endome- Introdução 21 triose intestinal, a presente investiga ção foi desenhada com o intuito de co n- tribuir com informações que possam elucidar o caráter proliferativo e benigno da endometriose intestinal. Proposição 22 2. PROPOSIÇÃO 1. Objetivo primário: 1.1 Estudar a cinética celular por meio da análise d o índice de prolif e- ração celular ( expressão de topoisomerase II -alfa), do índice de apoptose e do índice de renova ção celular (índice de proliferação celular dividido pelo índice de apoptose) na endometriose infiltrativa de reto-sigmoide. 2. Objetivos secundários: 2.1 Relacionar os resultados d a análise da cinética celular (índices de proliferação, apoptose e renovação celular) na endometriose infiltrativa de reto-sigmoide com: a) as características clínicas das pacientes; b) as características morfológicas das lesões; c) a classificação histológica das lesões. 2.2 Avaliar a expressão das oncoproteínas p53 e c -erB2 na endometri- ose infiltrativa do reto-sigmoide. Métodos 23 3. MÉTODOS 3.1 LOCAL DO ESTUDO Este estudo transversal retrospectivo foi realizado no Setor de End o- metriose da C línica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP), com a aprovação do Comitê de Ética e m Pesquisa do HCFMUSP, datada de 14 de março de 2007, conforme Protocolo 1328/06 (Anexo 1), adequado e novamente apro- vado em agosto de 2010, e com a aprovação do Comitê de Ética em Pesqui- sa do Hospital Heliópolis (Protocolo 761). 3.2 PACIENTES A aplicação da metodologia de Cochran (1986) para o cálculo amostral adequado indicou “n” de 60 pacientes, considerando adoção da distribuição normal para as variáveis paramétricas; fixação da margem de erro aceitável em 17,5%; e representatividade de 50% para a variável-núcleo do estudo. Pe- la mesma metodologia e considerando margem de erro aceitável de 20%, de- terminou-se amostra mínima composta de 20 elementos para a construção do grupo-controle. Desse modo, de um grupo de 100 pacientes com diagnóstico de e n- dometriose do reto-sigmoide que, entre 2002 e 2009, foram submetidas à vi- Métodos 24 deolaparoscopia cirúrgica para exerese das le sões, selecionaram-se 60 pa- cientes que atendiam rigorosamente aos critérios de inclusão adotados para o estudo. O grupo-controle, por sua vez, foi formado por 20 pacientes submetidas à laqueadura videolaparoscópica e a coleta de endométrio eutópico foi reali- zada durante o ato cirúrgico. Todas as pacientes leram e assinaram o Termo de Consentimento L i- vre e Esclarecido (Anexos 2 e 3). 3.2.1 Critérios de inclusão Foram adotados os seguintes critérios de inclusão para a seleção das pacientes com endometriose infiltrativa de reto -sigmoide que compuseram o grupo experimental: (1) idade entre 18 e 45 anos; (2) diagnóstico histológico de lesão de endometriose profunda infiltrativa de reto, conforme visualização pré -operatória em um ou mais exames dia g- nósticos de imagem (ressonância magnética, ultrassonografia e/ou ecoendos- copia baixa); (3) sem história conhecida de câncer; (4) sem uso de qualquer medicação hormonal por pelo menos seis m e- ses antes da cirurgia. Para a composição do grupo-controle, foram utilizados os mesmos cri- térios de inclusão , exceto pela h istória clínica, exame clínico e exames de Métodos 25 imagem não serem sugestivos de endometriose e pela confirmação de a u- sência de endometriose durante vídeolaparoscopia para laqueadura. 3.3 MÉTODOS 3.3.1 Dinâmica do estudo Todas as pacientes com endometriose infiltrativa de reto -sigmoide fo- ram avaliadas pela história clínica, exame físico e exames complementares (CA125, u ltrassonografia pélvica e/ou transvaginal com preparo intestinal, ecoendoscopia baixa e ressonância magnética, quando indicada), conforme indicação clínica para definição da suspeita de endometriose. Todas as p a- cientes foram submetidas à colonoscopia com a finalidade de excluir outras doenças colônicas concomitantes. Após a identificação de sintomas da doença, principalmente dor crônica refratária aos tratamentos clínicos prévios, aliada a sintomas e alterações in- testinais, e a confirmação por exames de imagem de sinais de endometriose comprometendo o reto-sigmoide, com profundidade maior q ue a camada muscular int erna, indicou -se a videolaparoscopia com ressecção desse segmento intestinal. A videolaparoscopia com ressecção de segmento do reto-sigmoide contendo a lesão e com anastomose primária por duplo grampeamento foi realizada conforme a rotina habitual do servi ço, sempre com a mesma técni- ca e pela mesma equipe cirúrgica em pacientes sintomáticas, com lesões Métodos 26 comprometendo o reto e o sigmoide, com dois ou mais centímetros de e x- tensão, ou multifocais, infiltrando a parede intestinal além da camada muscu- lar interna. Os blocos de endometriose fixados em formalina e incluídos em paraf i- na foram recuperados dos arquivos do laboratório de Anatomia Patológica e revistos para a escolha de tecido representativo da lesão. As amostras as- sim obtidas e sel ecionadas foram corada s com Hematoxilina -Eosina (HE) e analisadas por dois patologistas em microscópio óptico convencional. Com relação ao grupo-controle, as pacientes encaminhadas pelo Pr o- grama de Controle Familiar do Estado de São Paulo, após completa avali a- ção clínica e labo ratorial, para realização de laqueadura foram interrogadas quanto à prese nça de sintomas de endometriose. Realizaram dosagem de CA125, BHcG e ultrass onografia pélvica, além de completo exame físico e ginecológico. Durante o proc edimento videolaparoscópico para laqueadura, completo inventário da cavidade abdominal e pélvica descartou a presença de focos de doença endometriótica, inclusive nas pacientes assintomáticas. Na Figura 1 se encontra a representação esquemática da dinâmica do estudo. Métodos 27 GRUPO EXPERIMENTAL GRUPO-CONTROLE Quadro clínico Exames de imagem Colonoscopia Indicação cirúrgica Indicação de laqueadura 100 pacientes Critérios de inclusão Critérios de inclusão 60 pacientes 20 pacientes Blocos de parafina com lesão do reto-sigmoide Blocos de parafina com endométrio eutópico TOP2A Apoptose P53 c-erB2 Figura 1. Representação esquemática da dinâmica de estudo. Métodos 28 3.3.2 Quadro clínico Todas as pacientes foram q uestionadas quanto à presença de cinco sintomas associados à endometriose, a saber: 1) dismenorreia: dor em cólica no período menstrual que, para inclusão da paciente no grupo com doença , devia se apresentar severa (quando a paciente referia que a dor não melhorava completamente com analg ésicos, embora não a impedisse de exercer suas atividades habituais) ou incapac i- tante (quando a paciente referia que a dor a impedia de exercer suas ativ i- dades habituais) (Laufer e Goldstein, 1998); 2) dispareunia de profundidade: dor pélvica durante a relação sexual; 3) dor pélvica acíclica: dor pélvica sem relação com o ciclo menstrual por pelo menos seis meses, sem melhora com a utilização de analgésicos; 4) alterações intestinais cíclicas: sintomas intestinais durante o período menstrual, incluindo aceleração ou diminuição do trânsito intestinal, dor à evacuação, puxo, tenesmo e/ou sangramento nas fezes; 5) alterações urinárias cíclicas: sintomas urinários durante o período menstrual, incluindo disúria, hematúria, polaciúria e/ou urgência miccional. 3.3.3 Videolaparoscopia com ressecção de segmento de reto-sigmoide Com a paciente em decúbito dorsal horizontal e posição semiginecol ó- gica, sob anestesia geral, agulha de Veres era introduzida em incisão umbil i- cal, confeccionando-se pneumoperitônio com 2,5 litros de CO 2, procedimen- Métodos 29 to seguido p ela colocação de trocáter de 11 mm para a introdução de ótica de 0 (zero) grau. Mais dois trocáteres de 5 mm eram colocados na medi ana, um entre a crista ilí aca e o hipocôndrio direito, em linha hemiclavicular, e o outro contralateral na mesma posição. Um último trocáter de 12 mm era, e n- tão, colocado em FID baixa mais mediana, lateralmente aos vasos epigástr i- cos. Em seguida, as lesões e o grau de comprometimento da pelve eram iden- tificados. Procedia-se à manipulação uterina com manipulador previamente in- troduzido. Liberava-se, primeiro, o cólon sigmoideo pela face medial do mesentério e, então, a goteira parietocólica esquerda, seguindo-se a identificação de ure- ter e vasos, além da emergência do plexo sacro e nervo hipogástrico com sua preservação. Realizava-se a ligadura de vasos do reto e/ou do sigmoide, conforme a altura da lesão. Procedia-se à dissecção até abaixo da reflexão peritoneal ou da lesão identificada, com margem de pelo me nos 2 cm de reto livre de d o- ença, efetuando-se a sua secção com grampeador linear 45 mm (Ethicon®, Johnson & Johnson do Brasil). Outras lesões associadas em outros sítios de doença na pelve e fora dela eram tratadas quando necessário. Realizava-se abertura de incisão Pfannenstiel com 3 a 4 cm de largura para a retirada de peça do reto (Figura 2 ) e a introdução de ogiva de gra m- peador circular 33 mm (Ethicon®, Johnson & Johnson do Brasil) para ana s- tomose término-terminal, que ocorria após a reintrodução do i ntestino na ca- vidade e o seu fechamento. Métodos 30 Figura 2. Peça cirúrgica com lesões de endometriose em parede intestinal no momento de sua retirada (à esquerda) e e com a pinça se aproximando de uma das lesões (à direita). A anastomose era realizada com grampeador circular, e realizavam-se as provas de segurança. Para tanto, era introduzida seringa de 60 cc com ar em reto e, com a pelve cheia de soro, avaliava -se a presença ou não de e x- travasamento de ar pela anastomose; em seguida, injetava-se soro com azul de metileno também com seringa de 60 cc pelo reto, para novamente avaliar extravasamento pela linha de sutura. Por fim, realizava -se drenagem da ca- vidade com dreno a vácuo, retirada de pneumoperitô nio e dos trocáteres e fechamento da pele. Métodos 31 3.3.4 Videolaparoscopia para a realização de laqueadura Com a paciente sob anestesia geral, posicionada em decúbito dorsal horizontal e em posição semiginecológica, colocava-se o espéculo vaginal, pinçava-se o colo uterino e introduzia -se o dispositivo plástico PIPELLE® (Cooper Surgical) para obtenção de biópsia de endométrio eutópico por suc- ção, colocando -se, em seguida, o manipulador uterino. A agulha de Veres era, então, introduzida em incisão umbilical, confeccionando-se pneumoperi- tônio com 2,5 litros de CO 2, procedimento que era seguido pela colocação de trocáter de 11 mm para a introdução de ótica de zero (0) grau. Mais dois trocáteres de 5 mm eram colocados nas fossas ilíacas direita e esquerda baixas, mais medianas, lateralmente aos vasos epigástricos. Na sequência, era realizado inventário de toda a cavidade abdominal e pélvica, momento em que era excluída a presença de qualquer lesão, inclu- indo-se endometriose. Apreendia-se, então, a tuba uterina e procedia -se à cauterização do seu terço médio e à sua secçã o. Por fim, procedia-se à revisão de hemosta- sia e terminava-se o procedimento com o fechamento da pele. 3.3.5 Estadiamento da endometriose De acordo com os critérios estabelecidos em 1985 e revistos em 1996 pela American Society for Reprodutive Medicin e (ASRM, 1997), a endom e- triose foi classificada, durante o procedimento cirúrgico, em estadios I a IV, conforme a Figura 3. Métodos 32 Estadio I (mínima): 1-5 Estadio II (leve): 6-15 Estadio III (moderada): 16-40 Estadio IV (severa): > 40 ENDOMETRIOSE 3 cm PERITÔNIO Superficial 1 2 4 Profunda 2 4 6 OVÁRIO D Superficial 1 2 4 D Profunda 4 16 20 E Superficial 1 2 4 E Profunda 4 16 20 OBLITERAÇÃO DO FUNDO DE SACO POSTERIOR Parcial Completa 4 40 ADERÊNCIAS 2/3 envolvidos OVÁRIO D Velamentosa 1 2 4 D Densa 4 8 16 E Velamentosa 1 2 4 E Densa 4 8 16 TROMPA D Velamentosa 1 2 4 D Densa 4* 8* 16 E Velamentosa 1 2 4 E Densa 4* 8* 16 (*) Se as fímbrias tubárias estiverem totalmente envolvidas por aderências, mude o escore para 16. Porcentagem de implantes: Lesões vermelhas (claras, vermelhas, rosadas, em chama, vesíc u- las): % Lesões brancas (brancas, amareladas, marrons, defeito s de peri- tônio): % Lesões pretas (pretas, depósitos de hemossiderina, azuis): % Endometriose adicional: Patologias associadas: Figura 3. Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive Medicine (1996). Métodos 33 3.3.6 Características das lesões de endometriose do reto-sigmoide A análise anátomo-patológica de cada segmento de reto-sigmoide res- secado permitiu ao patologista determinar o número de lesões presentes (por contagem), o tamanho dessas lesões (com uso de régua milimétrica), expresso em milímetros, e a camada da parede intestinal acometida. 3.3.7 Confirmação diagnóstica e classificação histológica As amostras de endometriose FFEP (fixadas em formalina e em blocos de parafina) foram coradas com Hematoxi lina-Eosina (HE) e analisadas em microscópio óptico convencional para a confirmação diagnóstica da doença endometriótica. As Figuras 4 e 5 ilustram amostra corada com HE evidenc i- ando ilha de endometriose cercada de tecido da camada muscular própria do intestino. Figura 4. Amostra corada com H e- matoxilina-Eosina (aumento de 100x), evidenciando ilha de end o- metriose cercada de tecido da c a- mada muscular própria do intestino, sem evidências de fibrose. Obse r- vam-se focos isolados de lesão. Métodos 34 Figura 5. A mesma amostra, eviden- ciando células epiteliais (de formato cilíndrico) e células estromais (as células menores) (aumento de 350x). A análise histológica dos tecidos ressecados seguiu os padrões da classificação proposta por Abrão et al. (200 3b), que divide a doença em: a) padrão estromal: presença de estroma morfologicamente similar ao do e n- dométrio eutópico em qualquer fase do ciclo (Figura 6a); b) padrão glandular bem diferenciado: presença de epitélio superficial ou constituindo espaços glandulares ou císticos, composto por células epiteliais com morfologia indis- tinguível dos endométrios tópicos na diferentes fases do ciclo menstrual (F i- gura 6b); c) padrão glandular indiferenciado: presença de epit élio superficial ou constituindo espaços glandulares ou císticos, sem as características mo r- fológicas vistas no epitélio endometrial eutópico (Figura 6c); d) padrão gla n- dular misto de diferenciação: presença, na mesma localização, de epitélios com padrão bem diferenciado e indiferen ciado (Figura 6 d). Para efeitos do estudo, foram agrupadas as lesões indiferenciadas e mistas (com indifere n- ciação) e as lesões bem diferenciadas e estromais (sem indiferenciação). Métodos 35 Figura 6. (A) Foco de endometriose estromal em meio à f ibrose (HE, 100x); (B) Foco de endometriose com padrões estromal e glandular bem diferenc iado (HE, 400x); (C) Foco de endometriose de padrões estromal e glandular indiferenciado (HE, 400x); (D) Foco de endometriose de padrões estromal e glandular misto de diferenciação (HE, 100x). 3.3.8 Detecção de apoptose Apoptose foi detectada por meio da marcação de pontos de quebra de DNA por DUPT -biotina mediada por deoxinucleotidil terminal -transferase (TUNEL) realizada com o emprego do kit Apop -Tag Plus Peroxidase ( Inter- gen Company, Burlington, MA, USA) por técnica previamente descrita e m o- dificada (Gavrieli et al., 1992; Ansari et al., 1993). Cortes histológicos de tecido endometrial (5 μ) fixados em formol a 10% e emblocados em parafina foram montados em lâminas previamente s i- lanizadas (3-aminopropiltrietoxisilano, Sigma do Brasil). Depois de despar a- Métodos 36 finizados e re-hidratados, as lâminas foram l avadas com PBS com pH = 7,2, e os cortes foram submetidos à digestão em solução de tripsina (Si gma do Brasil) a 0,25mg% em estufa a 37ºC por dois minutos e lavados em água deionizada. O bloqueio da peroxidase endógena foi alcançado lavando -se as l â- minas com água oxigenada a 3%. Depois da aplicação de tampão de equil í- brio fornecido pelo fabricante, as lâminas foram incubadas com solução co n- tendo a enzima deoxinucleotidil terminal -transferase (TdT) e nucleotídeos conjugados à digoxigenina por uma hora a 37ºC . Interrompeu-se a reação pela incubação das lâminas em tampão de interrupção fornecido pelo fabr i- cante por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois da lavagem das lâm i- nas, foram identificados os nucleotídeos incorporados. Para tanto, os co rtes foram incubados com anticorpo antidigosigenina conjugado à perox idase, e a reação foi revelada com diaminobenzidina (DAB). A contracoloração foi fei- ta com hematoxilina de Harris. Utilizou -se tecido endometrial como contr ole positivo. O controle negativo foi obtido p ela substituição da so lução de enzi- ma TdT e nucleotídeos conjugados à digoxigenina por tampão fosfa to. As Figuras 7 a 9 ilustram positividade para apoptose respectivamente em ad e- nocarcinoma endometrial, em carcinoma in situ de colo de útero e e m endo- metriose. A detecção de apoptose em material colhido a fresco das pacie n- tes do grupo-controle foi realizada com os mesmos métodos empregados para o grupo experimental. Métodos 37 Figura 7. Controle positivo para apoptose em aden o- carcinoma endometrial (aumento de 1.000x). Figura 8. Controle positivo para apoptose em carc i- noma in situ de colo uteri- no (aumento de 1.000x). Figura 9. Controle positivo para apoptose em endome- triose (aumento de 1.000x). Métodos 38 3.3.9 Reação imuno-histoquímica para pesquisa de p53, c-erB2 e topoisomerase II-alfa A reação imuno-histoquímica para pesquisa de proteína p53, c -erbB2 e topoisomerase II -alfa (TOP2A) foi realizada utilizando -se anticorpos da marca DAKO (Glostrup, Dinamarca), por técn ica descrita previamente, com pequenas modificações (Gorczyca et al., 1995). Brevemente, os cortes histo- lógicos de tecido intestinal (5 m) fixado em formol a 10% em blocos de paraf i- na foram montados em lâm inas previamente silanizadas (3 -aminopropiltrie- toxisilano, marca Sigma). Após desparafinização e re -hidratação, foram imu- nocorados utilizando-se o método do complexo stre ptavidina-biotina-peroxi- dase (kit LSAB+, DAKO, Glostrup, Dinamarca). O bloqueio da peroxidase endógena foi alcançado lavando-se as lâminas com água oxigenada a 3%, e a recuperação antigênica por calor úmido em ta mpão citrato 10 mM, pH 6,0 (quatro minutos marcados após atingir -se o ponto de fervura), util izando-se panela de pressão convencional. Os anticorpos primários utilizados foram antirreceptor de proteína p53 (clone DO7, monoclonal, DAKO, Glostrup, D i- namarca) diluído a 1/300, antioncoproteína c -erbB2 (policlonal, DAKO, Glos- trup, Dinamarca) diluído a 1/200 e antitopoisomerase II -alfa (clone Ki -S1, monoclonal, DAKO, Glostrup, Dinamarca) diluído a 1/50. Cortes histológicos de amígdalas palatinas serviram de controles posi- tivos para TOP2A. Carcinomas mamários com positividade conhecida para proteína p53 e oncoproteína c -erbB2 foram utilizados como controles posit i- vos para essas reações. Os controles negativos foram obtidos substituindo - Métodos 39 se o anticorpo primário por soluçã o salina tamponada. As Figuras 10 e 11 i- lustram amostras positivas para TOP2A e para expressão da proteína p53. As Figuras 12 e 13 ilustram amostras negativas para a expressão da proteí- na p53 e para a expressão do produto de oncongene c-erbB2. Figura 10. Corte marcado com anticorpo antit opoi- somerase II -alfa. Os n ú- cleos das células epiteliais marcados na cor marrom revelam positividade para topoisomerase II -alfa (au- mento de 200x). Figura 1 1. Controle posit i- vo para a expressão da proteína p53 em câncer de mama (aumento de 200x). Métodos 40 Figura 12. Amostra nega- tiva para a expressão da proteína p53 (aumento de 350x). Figura 13. Amostra negat i- va para a expressão da oncoproteína c -erbB2 (au - mento de 350x). A reação imuno-histoquímica para pesquisa de proteína p53, c -erbB2 e TOP2A em material das pacientes do grupo-controle foi realizada com os mesmos métodos empregados para o grupo experimental. Métodos 41 3.4 MENSURAÇÃO DOS RESULTADOS A análise dos resultados para detecção de apoptose, TOP2A, p53 e c- erB2 foi realizada por quantificação direta. Brevemente, utilizou -se microscó- pio marca Nikon modelo Labophot com ocular de 26,5 mm (10x) e diâmetro de campo de 0,53 mm em aumento de 40x (campo de 0,22 mm 2) para co n- tagem de células. Foram consideradas áreas com maior número de n úcleos marcados pela reação imuno-histoquímica (coloração acastanhada). Uma reação foi considerada positiva para a proteína p53 quando pelo menos 30% dos núcleos das células epiteliais se apresentavam fortemente corados no tecido. A avaliação dos resultados para a oncoproteína c-erbB2 seguiu um sistema de pontuações (escores). Assim: 0: nenhuma célula positiva ou positividade em menos de 10% das c é- lulas; (1+): imunorreatividade de membrana, fraca e irregular em pelo m e- nos 10% das células; (2+): imunorreatividade de membrana, de intensidade fraca a mod e- rada, porém regular em mais de 10% das células; (3+): imunorreatividade de membrana, com forte intensidade, em pelo menos 10% das células. Foram considerados positivos casos com pontuação 2+ e 3+. Os d e- mais foram considerados negativos. Métodos 42 Para avaliação da apoptose, foram considerados elementos apoptót i- cos aqueles que se enquadravam nos critérios morfológicos descritos como corpos apoptóticos, a saber: células com diminuição do volume citoplasmát i- co, marginação da cromatina, vitrificação, condensação e fragmentação c i- toplasmática presentes no interior de macrófagos , células epiteliais ou livres pelo estroma. De acordo com os critérios histológicos previamente padronizados e adotados pelo patologista, pelo menos 500 células de cada corte foram con- tadas para a avaliação do índice de apoptose, e 1.000 células para avaliação da expressão da TOP2A. Os resultados foram expressos como índices de positividade (quoc i- ente entre o número de núcleos marcados e o número total de núcleos co n- tados) e individualizados para o componente epitelial e para o componente estromal do teci do endometriótico. O índice de positividade para TOP2A foi denominado índice de proliferação celular (IP), e se considerou evidência de TOP2A mediante IP >1. O índice de positividade para células apoptóticas foi denominado índice de apoptose (IA), e se con siderou evidência de apoptose mediante IA >1. O quociente IP/IA também foi calculado, resultando em índice de renovação celular (IRC). Esses índices são representados por números a- leatórios de zero (fenômeno ausente) ao infinito. Métodos 43 3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados coletados foram tabulados em planilha Excel (Microsoft®) pa- ra aplicação dos cálculos pertinentes por meio do programa SSPS para Windows™, versão 17.0. Aplicou-se a Prova do Qui -quadrado para a comparação das frequê n- cias observadas nos grupos de estudo no que concerne à raça e ao quadro clínico das pacientes e à evidência de apoptose e de TOP2A. Pelo mesmo teste, compararam-se as frequências relativas ao IA e ao IP encontrados em estroma e em glândula tanto no grupo experimental quanto no grupo - controle. O Teste t de Student foi aplicado para a comparação de dados expre s- sos em médias + desvios-padrão, como a idade das pacientes (comparação entre os grupos de estudo) , o IP, o IA e o IRC (comparação entre os ach a- dos em estroma e em glândula). O grau de relacionamento entre o IP, o IA e o IRC em estroma e glâ n- dula e as variáveis de interesse (idade, quadro clínico, estadiamento da do- ença [ASRM, 1996], número de lesões, tamanho da lesão, camada acomet i- da da camada intestinal e classificação histológica ) foi determinado com a aplicação da Análise de Correlação de Spearman , que gera um coeficiente de correlação que varia de -1 a +1. Quanto mais distante de zero e mais próximo das extremidades, maior a correlação entre as variáveis. Coeficie n- tes positivos (entre 0 e +1) indicam que as variáveis se correlacionam no mesmo sentido, enquanto coeficientes negativos (entre -1 e 0) indicam que Métodos 44 as variáveis se correlacionam em sentido oposto. Essas correlações podem ser classificadas em perfeitas (=1), fortes (>0,7 5), médias (>0,50), fracas (<0,50) e inexistentes (=0), e sofrem grande influência do tamanho e da var i- abilidade das amostras, razão pela qual se deve buscar o valor de p que de- termina a significância do coeficiente de correlação encontrado. Foi adotado o nível de significância de 5% (p < 0,050) para a avaliação dos resultados da aplicação dos testes estatísticos. Resultados 45 4. RESULTADOS Os dados clínicos individuais das 60 pacientes com endometriose do re- to-sigmoide do grupo experimental e das 20 pacientes sem en dometriose do grupo-controle se encontram nos Anexos 4 e 5 , respectivamente. As médias de idade dos grupos experimental e co ntrole foram similares (p = 0,5 28), as- sim como não houve diferença na distribuição das frequências relativas à raça (p = 0,229) das pacientes na comparação entre os grupos (Tabela 1). Tabela 1. Dados clínicos de 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide (grupo experimental) e de 20 pacientes sem endometriose (grupo-controle). Dados clínicos Grupos p Experimental Controle Idade Menor 22 26 Maior 45 40 Média + Desvio-padrão 33,8 + 5,9 32,9 + 4,3 0,528 Raça Branca 50 (83,3%) 16 (80,0%) Negra 6 (10,0%) 4 (20,0%) Amarela 4 (6,7%) 0 (-) 0,229 A distribuição das frequências relativas aos sintomas clínicos referid os pelas pacientes com endometriose do reto-sigmoide e sem endometriose es- tá na Tabela 2 e, como esperado, as poucas ocorrências de sintomatol ogia no grupo-controle foram significativamente menos frequentes do que no gr u- po experimental. A frequência de alterações urinárias cíclicas encontrada no Resultados 46 grupo experimental (15,0%) não foi significativa em relação ao gr upo- controle, embora nenhumas das pacientes desse último grupo tenha relat a- do esse sintoma. Tabela 2. Distribuição das frequências dos sintomas de 60 pacientes com endometri- ose do reto-sigmoide (grupo experimental) e de 20 pacientes sem endometriose (gru- po-controle). Sintomas Grupos p Experimental (n = 60) Controle (n = 20) n % n % Dismenorreia 60 100,0% 3 15,0% < 0,001* Alterações intestinais cíclicas 50 83,3% 1 5,0% < 0,001* Dor pélvica crônica 49 81,7% 0 0 < 0,001* Dispareunia de profundidade 49 81,7% 2 10,0% < 0,001* Alterações urinárias cíclicas 9 15,0% 0 0 0,367 A caracterização das lesões de endometriose do reto-sigmoide nas pa- cientes do grupo experimental, em relação ao número e tamanho, está apre- sentada na Tabela 3, e as camadas intestinais acometidas pela doença estão indicadas na Tabela 4. Tabela 3. Valores relativos ao número e tamanho (em milímetros) de lesões observadas em 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide. Características Valores da lesão Mínimo Máximo Média Desvio-padrão Número 1,0 4,0 1,3 0,6 Tamanho (mm) 8,0 65,0 26,9 12,3 Resultados 47 Tabela 4. Distribuição das frequências relativas às camadas intes- tinais mais profundas acometidas em 60 pacientes com endome- triose do reto-sigmoide. Camadas Frequências acometidas n % Mucosa 3 5,0% Submucosa 17 28,3% Muscular interna 39 65,0% Muscular externa 1 1,7% Total 60 100,0% Todas as pacientes com endometriose do reto-sigmoide do grupo experi- mental se encontravam no estadio III ou IV da classificação da ASRM (1996). Histologicamente, todas as lesões ex ibiam padrão glandular, sendo 56 (93,3%) do tipo indiferenciado e as demais quatro (6,7 %) do tipo sem indif e- renciação. Neste grupo de pacientes com endometriose do reto-sigmoide não foram encontradas lesões de padrão estromal puro. Inicialmente, foram comparadas as frequências em que os diferentes IA e IP foram encontrados em estroma e glândula da lesão intestinal (n o grupo experimental) e do endométrio eutópico (no grupo-controle). No grupo de pacientes com endometriose do reto-sigmoide, foram e n- contradas evidências de apoptose em estroma e glândula em, respectivamen- te, 50,0% e 55,0% dos casos (Figura 14). Expressão de TOP2A em estroma e glândula foi evidenciada em 76 ,7% e 70,0% das amostras, re spectivamente (Figura 15). Não houve diferença significativa entre os índices de proliferação celular do estroma e da glândula (p = 0,54), nem entre os índices de apoptose nesses compartimentos (p = 0,67 ), indicando que o tecido de endometriose cresce homogeneamente. Resultados 48 50,0 45,0 26,7 26,7 6,7 5,0 23,315,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Estroma Glândula Índice de Apoptose (IA) Frequências percentuais 0 1 2 3 5 Figura 1 4. Representação gráfica das frequências percentuais dos Índices de Apoptose (IA) encontrados em estroma e glândula (p = 0,65) de lesões de 60 pa- cientes com endometriose do reto-sigmoide. [Os índices de 0 a 5 se referem aos índices mínimo e máximo encontrados nesta amostra ; neste grupo, não foi e n- contrado o índice 4.] 23,3 30,0 43,3 35,0 6,7 6,7 26,7 25,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Estroma Glândula Índice de Proliferação (IP) Frequências percentuais 0 1 2 3 4 6 Figura 15. Representação gráfica das frequências percentuais dos Índices de Proliferação (IP) encontrados em estroma e glândula (p = 0, 54) de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide. [Os índices de 0 a 6 se r e- ferem aos índices mínimo e máximo encontrados nesta amostra; neste grupo não foi encontrado o índice 5.] Resultados 49 No grupo-controle, foram encontradas evidências de apoptose em e s- troma e glândula em 60,0% e 55,0% das amostras, respectivamente (F igura 16). A expressão de TOP2A foi encontrada tanto em estroma quanto em glândula em 100,0% casos (Figura 17). Não houve diferença estatística entre os índices de proliferação celular do estroma e da glândula (p = 0,65), assim como entre os índices de apoptose nesses compartimentos (p = 0,64). 40,0 45,0 30,0 25,0 10,0 10,0 5,0 5,0 5,0 15,0 10,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Estroma Glândula Índice de Apoptose (IA) Frequências percentuais 0 1 2 3 4 8 Figura 16. Representação gráfica das frequências percentuais dos Índices de Apoptse (IA) encontrados em estroma e glândula (p = 0,64) de endométrio de 20 pacientes sem endometriose. [Os índices de 0 a 8 se referem aos índices mínimo e máximo enco n- trados nesta amostra; neste grupo não foram encontrados os índices 5, 6 e 7.] Resultados 50 20,0 5,0 20,0 35,0 10,0 15,0 5,0 10,0 5,0 5,0 30,0 40,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Estroma Glândula Índice de Proliferação celular (IP) Frequências percentuais 1 2 3 4 5 8 Figura 17. Representação gráfica das frequências percentuais dos Índices de Prolifer a- ção (IP) encontrados em estroma e glândula (p = 0,65) em endométrio de 20 pacientes sem endometriose. [Os índices de 0 a 8 se referem aos índices mínimo e máximo encon- trados nesta amostra; neste grupo não foram encontrados os índices 6 e 7.] Foram, então, comparadas as frequências relativas às evidências de TOP2A e de apo ptose entre os grupos , bem como as médias e desvios - padrão dos IP e IA. Evidências de TOP2A tanto em estroma (p = 0,006) quanto em glându- la (p = 0,001) foram significativamente mais frequentes nas amostras de e n- dométrio de pacientes sem endometriose , quan do comparadas com as a- mostras de lesões de endometriose do reto -sigmoide. Essa diferença não foi observada em relação às evidências de apoptose (Tabela 5). As médias do IP em estroma (2,8 + 1,6) e glândula (3,2 + 1,6) no gru- po-controle foram significativamente maiores (p < 0,001) do que essas m é- dias observadas nas lesões de end ometriose (respectivamente, 1,2 + 0,9 e Resultados 51 1,2 + 1,2). Já as médias do IA em estroma (1,1 + 1,2) e glândula (1,4 + 1,9) no grupo-controle foram estatisticamente similares (p = 0,389) às observa- das nas lesões com endometriose (respectivamente, 0,8 + 1,1 e 0,9 + 0,9). Tabela 5. Distribuição das frequências relativas à evidência de apoptose e topoisome- rase II-alfa em 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide (grupo experimental) e em 20 pacientes sem endometriose (grupo-controle). Evidências Grupo experimental Grupo-controle p (n = 60) (n = 20) n % n % Apoptose Estroma 30 50,0% 12 60,0% 0,303 Glândula 33 55,0% 11 55,0% 0,806 Topoisomerase II-alfa Estroma 46 76,7% 20 100,0% 0,006* Glândula 42 70,0% 20 100,0% 0,001* A título de ilustração, a distribuição das frequências percentuais relat i- vas aos índices de apoptose e de proliferação celular em estroma e glândula das 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide e das 20 mulheres sem endometriose encontra-se representada na Figura 18. Resultados 52 IA Estroma Glândula 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 8 Frequências percentuais 0 10 20 30 40 50 0 1 2 3 4 5 8 Frequências percentuais IP Estroma Glândula 0 10 20 30 40 50 60 70 0 1 2 3 4 6 8 Frequências percentuais 0 10 20 30 40 50 60 70 0 1 2 3 4 6 8 Frequências percentuais Grupo experimental Grupo-controle Figura 18. Representação gráfica das frequências dos Índices de Apoptose (IA) e de Proliferação (IP) encontrados em estroma e glândula de tecido de endometriose de 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide e de endométrio de 20 pacientes sem endometriose. [Os índices de 0 a 8 se referem aos índices mínimo e máximo enco n- trados nesta amostra.] Resultados 53 Na sequência, foram estabelecidas e comparadas as médias e os des- vios-padrão do IRC (produto do índice de proliferação dividido pelo índice de apoptose) em estroma e glândula de ambos os grupos. Não foi observada diferença significativa nas médias do IRC, quando comparados estroma e glândula tanto nas pacientes com endometriose do reto-sigmoide (p = 0,992) quanto nas pacientes sem endometriose (p = 0,744) (Tabela 6 ). Por outro lado, os IRC médios foram significativamente mais baixos entre as mulheres com endometriose do reto-sigmoide, compa- radas às mulheres do grupo-controle, tanto em estroma (p = 0,032) quanto em glândula (p = 0,007), conforme Figura 19. Tabela 6. Médias dos Índices de Renovação Celular (IRC) em estroma e glândula de tecido de 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide (grupo experimental) e em tecido de endométrio de 20 pacientes sem en- dometriose (grupo-controle). Grupo experimental Grupo-controle Estroma Glândula Estroma Glândula 0,9 + 0,9 0,9 + 1,2 2,4 + 2,1 2,2 + 1,6 p = 0,922 p = 0,744 Resultados 54 0,9 2,4 0,9 2,2 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Índices de Renovação Celular (IRC) Estroma Glândula Grupo experimental Grupo-controle Figura 19. Médias e desvios-padrão dos Índices de Renovação Celular (IRC) em e s- troma e glândula de tecido de 60 pacientes com endometriose do reto-sigmoide (gru- po experimental) e em tecido de endométrio de 20 pacientes sem endometriose (gru- po-controle). A seguir, buscou-se determinar eventuais correlações do IP, do IA e do IRC com os dados clínicos das pacientes, com as características da l esão e com o estadiamento da doença. De modo geral, no grupo de pacientes com endometriose do reto- sigmoide não foi evidenciado grau significativo de relacionamento dos sinto- mas clínicos com o IP nem com o IA (Tabela 7 ). Ressalte-se que, uma vez que todas as pacientes com endometriose do reto-sigmoide (100%) relata- ram dismenorreia, essa análise não foi possível com esse sintoma clínico. p = 0,007 p = 0,032 Resultados 55 Tabela 7. Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística (p) na análise do grau de relacionamento entre variáveis clínicas e os IP (índice de proliferação) e IA (índice de apoptose) em glândula e estroma de lesões de 60 pacientes com endome- triose do reto-sigmoide. Variáveis clínicas IP IA Estroma Glândula Estroma Glândula CC p CC p CC p CC p Idade 0,05 0,969 -0,03 0,820 0,08 0,513 0,05 0,654 Alterações intestinais cíclicas -0,02 0,897 0,11 0,407 0,22 0,079 0,08 0,508 Dor pélvica crônica -0,11 0,411 -0,17 0,188 0,13 0,311 0,03 0,802 Dispareunia de profundidade 0,09 0,489 0,126 0,337 0,09 0,489 0,01 0,921 Alterações urinárias cíclicas -0,29 0,064 -0,20 0,091 -0,07 0,611 -0,04 0,732 Por outro lado, quando analisadas as características das lesões, o IP em glândula mostrou-se positivamente correlacionado com o número de l e- sões, ou seja, quanto maior o número de lesões, maior o índice de positiv i- dade para TOP2A (Tabela 8). Não houve grau de relacionamento significat i- vo entre os IP e IA e as demais características da lesão. Tabela 8. Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística ( p) na análise do grau de relacionamento entre características da lesão e os IP (índice de proliferação) e IA (índice de apoptose) em estroma e glândula de lesões de 60 pacientes com endome- triose do reto-sigmoide. Características da lesão IP IA Estroma Glândula Estroma Glândula CC p CC p CC p CC p Número de lesões 0,07 0,568 0,35 0,006 -0,16 0,909 0,14 0,272 Tamanho das lesões 0,19 0,143 0,20 0,150 -0,19 0,150 0,06 0,670 Camadas acometidas -0,14 0,293 -0,03 0,825 -0,06 0,654 -0,05 0,727 Classificação histológica 0,03 0,849 -0,05 0,704 -0,09 0,513 0,03 0,802 Resultados 56 Não foi observada correlação significativa entre os IP e IA e o estadiamen- to da doença (Tabela 9). Tabela 9. Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística ( p) na análise do grau de relacionamento entre o estadimaneto da doença e os IP (índice de proliferação) e IA (índice de apoptose) em estroma e glândula d e lesões de 60 pacientes com endo- metriose do reto-sigmoide. IP IA Estroma Glândula Estroma Glândula CC p CC p CC p CC p Estadiamento da doença -0,13 0,329 0,07 0,611 -0,04 0,784 -0,11 0,381 Quando a análise dos dados visou à verificação do grau de relacionamen- to entre variáveis clínicas e IRC (Tabela 10), não foi estabelecido grau de rela- cionamento significativo. Tabela 10. Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística (p) na análise do grau de relacionamento entre variáveis clínicas e o IRC (índice de renovação celular) em glândula e estroma de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto- sigmoide. Variáveis clínicas IRC Estroma Glândula CC p CC p Idade 0,12 0,510 0,13 0,477 Alterações intestinais cíclicas -0,03 0,874 0,02 0,912 Dor pélvica crônica -0,19 0,299 0,04 0,825 Dispareunia de profundidade 0,09 0,320 0,10 0,579 Alterações urinárias cíclicas -0,27 0,126 -0,15 0,354 Resultados 57 Já na verificação do grau de relacionamento entre características da lesão de endometriose do reto-sigmoide e o IRC (Tabela 11), foi evidenciada correla- ção positiva significativa entre o tamanho das lesões e o IRC no estroma (p = 0,006), bem como ente o número de lesões e o IRC em glândula (p = 0,003). Tabela 11. Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística (p) na análise do grau de relacionamento entre características da lesão e o IRC (índice de renovação celular) em glândula e estroma de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto- sigmoide. Características da lesão IRC Estroma Glândula CC p CC p Número de lesões -0,01 0,478 0,49 0,003* Tamanho das lesões 0,47 0,006* 0,30 0,089 Camadas acometidas -0,04 0,823 0,19 0,289 Classificação histológica -0,08 0,647 -0,20 0,264 Não foi observada correlação significativa entre o IRC e o estadiamento da doença (Tabela 12). Tabela 12. Coeficientes de correlação (CC) e significância estatística (p) na análise do grau de relacionamento entre o estadiamento da doença e o IRC (índice de renovação celular) em glândula e estroma de lesões de 60 pacientes com endometriose do reto- sigmoide. IRC Estroma Glândula CC p CC p Estadiamento da doença -0,18 0,329 0,13 0,470 Resultados 58 Por fim, n os estudos imuno -histoquímicos, não foi observada positiv i- dade para a proteína p53 nem para a oncoproteína c-erB2 nas pacientes dos dois grupos de estudo. Discussão 59 5. DISCUSSÃO Nossos estudos sobre os conhecimentos diagnósticos, clínicos e terapêuticos dos implantes intestinais de tecido endometriótico e sobre a sua relação com processos neoplásicos evidenciar am a necessidade de maior compreensão do caráter benigno dessa doença e do seu eventual potencial para malignidade (Bassi et al., 2009). Sabe-se que a endometriose é uma lesão de natureza benigna, mas com caráter invasivo. Diferentes estudos já relataram a sua correlação com fenômenos neoplásicos devido ao seu potencial proliferativo e à sua monoclonalidade (Sampson, 1927; Nilbert et al., 1995; Erzen e Kovacic, 1998; Stern et al., 2001; Van Gorp et al., 2004; Melin et al., 2006). É necessário, contudo, esc larecer qual a influência de condições da cinética desse tecido e de seus compartimentos histológicos sobre a difusão da doença nos tecidos distantes de seu sítio primário uterino, assim como qual a influência de oncoproteínas-chave para o controle do ciclo celular. Foi nesse sentido que o presente trabalho visou realizar estudo anátomo-clínico da endometriose profunda e correlacionar os achados com dados histológicos e moleculares na tentativa de contribuir para a compreensão da influência de aspectos do ciclo celular no tecido ectópico no que se refere à cinética de renovação celular. Na amostra composta de 60 pacientes com endometriose do reto- sigmoide pudemos observar que a maioria delas apresentava os s inais e Discussão 60 sintomas que classicamente caracterizam o quadro clínico da endometriose (Abrão et al., 1999), especialmente representados por dismenorreia (100,0%), alterações intestinais cíclicas (83,3%), dor pélvica crônica (81,7%), dispareunia de profundidade (81,7%) e alterações urinárias cíclicas ( 15,0%). Alguns desses sintomas (dismenorreia, alterações intestinais cíclicas e dispareunia de profundidade) também foram relatados por algumas das pacientes sem endometriose, mas com frequência significativamente menor. Na maioria dos caso s de endometriose do reto-sigmoide (65,0%), as lesões infiltravam até a camada muscular interna; 20 lesões acometiam ain- da a su bmucosa (28,3%) ou a mucosa (5,0%). Em média, essas pacientes apresentavam 1,3 + 0,6 lesões medindo 26,9 + 12,3 mm. Embora tenhamos adotado critério que considera como endometriose profunda infiltrativa de reto -sigmoide com indicação para ressecção de se g- mento intestinal a lesão infiltrando até pelo menos a camada muscular inte r- na da p arede intestinal (Cornillie et al., 1990), em um caso (1,7%) o exame histológico evidenciou que a lesão estava comprometendo a camada muscu- lar externa, o que poderia evitar a ressecção segmentar, apesar de a im a- gem ultrassonográfica ter sugerido co mprometimento da camada muscular interna. Os exames ultrassonográficos, portanto, foram p recisos em 98,3%, corroborando o papel adjuvante imprescindível desse exame na avaliação diagnóstica das lesões endometrióticas implantadas no intestino (Abrão et al., 2003a; Abrão et al., 2004; Gonçalves et al., 2009). Com relação ao estudo do tecido da endometriose propriamente dito, é importante lembrar que a identificação de células morfologicamente alter a- Discussão 61 das constituem o método -padrão para o estudo quantitativo da apoptose, mesmo quando essas alterações morfológicas são identificadas com o aux í- lio de métodos para a detecção de corpos apoptóticos com corantes fluore s- centes e para a detecção de DNA fragmentado pela marcação das extrem i- dades dos segmentos da molécula (Gavrieli et al., 1992; Parton et al., 2001; Holubec et al., 2005). O equilíbrio entre proliferação celular (aqui determinado pela expressão de TOP2A) e apoptose tem papel fundamental na homeostasia tecidual. A l- terações não fisiológicas nesse equilíbrio, geralmente secundárias a alter a- ções nos genes envolvidos na regulação do ciclo celular, te ndem a resultar em acúmulo de células no tecido, queira por aumento no número de células em proliferação, queira por diminuição no número de células que entram em apoptose possibilitando o crescimento do tecido. Ao acessarmos as características biológicas da lesão de endometriose no que se refere à cinética celular, podemos chamar a atenção para os seguintes achados: a) Não houve diferenças entre o índice de apoptose, o índice de prolife- ração e o índice de renovação celular, quando comparamos o componente glandular e o componente estromal da lesão endometriótica, caracterizando crescimento homogêneo desse tecido. b) Houve correlação significativa positiva entre o número de lesões e IP e IRC em glândula, e entre o tamanho das lesões e IRC em estroma, o que representa achado ainda não observado anteriormente em endometriose do reto-sigmoide. Discussão 62 Com relação ao IP e IRC em glândula ter em sido positivamente corr e- lacionados com o número de lesões, não encontramos na literatura pertinen- te informações sobre a possibil idade de haver mais de uma lesão de end o- metriose em um mesmo segmento do intestino. Pode-se, contudo, especular que facilitadores dessas múltiplas lesões ectópicas de endometriose devem incluir aspectos imunológicos e humorais das pacientes, bem como a pr o- pensão de determinados sítios orgânicos a favorecer a instalação e a man u- tenção da doença. O achado de correlação positiva significativa entre os IRC estromais e o tamaho da lesão parece ratificar que lesões maiores seriam mais infiltrat i- vas, preferencialmente pela via estroma l (Jones et al., 1998) , especialmente se considerarmos que essa correlação não foi encontrada nos IRC glandul a- res. Encontramos frequência de evidências de proliferação celular menor em estroma e glândula de lesões de endometriose do reto-sigmoide em re- lação às amostras de endométrio de pacientes sem endometriose . De toda forma, considerando apenas o grupo experimental, esses índices foram bas- tante altos. Os índices de renovação celular também se mostraram signific a- tivamente mais baixos nas pacientes com endometriose do que no grupo- controle. Pudemos observar evidências de apoptose em 50% das amostras e s- tromais e em 5 5% das amostras glandulares nas lesões de endometriose que não foram diferentes dos achados do grupo-controle (respectivamente, 60,0% e 55,0%). Discussão 63 Diferentes autores relataram redução significativa de apoptose no componente glandular (Watanabe et al., 1997; Gebel et al., 1998; Dmowski et al., 2001; Harada et al., 2004) ou no estroma (Jones et al., 1998; Ilad et al., 2004) de te cido endometriótico ectópico. Jones et al. (1998) reportaram, inclusive, a ausência de apoptose nas células estromais de tecido ectópico. Alguns trabalhos sugerem que, nas células glandulares de tecido endometr i- ótico ectópico há perda da variabilidade cícl ica característica da apoptose encontrada no tecido eutópico (Watanabe et al., 1997; Dmowski et al., 2001). Ilad et al. (2004) sugeriram que irregular idades no processo apoptótico das células estromais teriam papel crucial no desenvolvimento da endometriose. Há autores que defendem que não há diferenças na apoptose de end o- métrio eutópico ou ectópico em pacientes com ou sem endometriose, e que o tema ainda carece de evidências que o esclareçam (Aguiar, 2007; Hassa et al., 2009). Nossos achados parecem ratificar essa assertiva, pelo menos no que tange à comparação entre lesões de endometriose e tecido de endom é- trio de mulheres sem a doença. Em 2007, Aguiar demonstrou índices de proliferação celular significat i- vamente aumentados nos casos de endometriose, principalmente no compo- nente estromal do endométrio eutópico ou no componente glandular do i m- plante ectópico. Também já foi observada tendência acentuada de maior proli- feração celular em lesões ectópicas induzidas em modelos animais (Rosa e Silva et al., 2010). Estudos defendem que a característica invasiva do endométrio em sítio ectópico resulta da associação entre a morte celular reduzida e proliferação Discussão 64 celular aumentada (Johnson et al., 2005; Braun et al., 2007). Na tentativa de confirmação dessa hipótese, Gonzáles-Ramos et al. (2008) induziram a r e- dução da proliferação celular e o aumento de apoptose em modelo animal de endometriose, e observaram que o desenvolvimento inicial da doença se mostrou significativamente diminuído. Os nossos resultados sugerem que o tecido com endometriose cresce de forma homogênea, o que é ratificado pe- lo fato de o IP e o IRC terem sido correlacionados positivamente com tam a- nho e número de lesões. Diferentes autores vêm associando os graus de expressão da TOP2A com diferentes tumores (Faggad et al., 2009; Sheen-Chen et al., 2010), espe- cialmente com aqueles mais agressivos e altamente proliferativos (Hell e- mans et al., 1995; Deweese et al., 2008), e nosso estudo ratificou que o ca- ráter proliferativo da endometriose pode ser decorrente de alterações na pro- liferação celular, mas não de defeito na morte celular programada. É fato que tanto a redução de apoptose quanto o aumento da prolifer a- ção celular alteram o equilíbrio da cinética celular, e que essa alteração d e- sempenha papel sabid amente crucial no desenvolvimento de neoplasias (McDonnel, 1993; Mommers et al., 1999). Talvez esteja aí uma das razões que explicam o fenótipo neoplásico da endometriose e a possibilidade de malignização de endometriose intestinal (Falco et al., 2007). Embora já tenha sido relatada correl ação inversa entre apoptose red u- zida e a gravidade da endometriose (Dmowski et al., 2001; Harada et al., 2004), nossos dados não permitiram relacionar o IA com qualquer outra vari- ável clínica. Discussão 65 Encontramos correlação positiva entre o tamanho da lesão e o IRC em estroma. Esses achados permitem inferir, a exemplo de Ilad et al. (2004), que o componente estromal desempenha papel predominante no crescimento do tecido endometriótico. A diferença é que Ilad et al. (2004) atribuíram o desen- volvimento da endometriose às irregularidades no processo apoptótico nas células estromais, o que, na interpretação de Harada et al. (2004), estaria d i- retamente relacionado com o aumento no número de receptores de estróg e- nos expressos no estroma ectópico. Nossos dados, por outro lado, o atribuem a alterações no índice de renovação celular no estroma, por razões a serem esclarecidas. Neste estudo não foi observada positividade para p53 nem para c-erB2 nas lesões analisadas, sugerindo que a atividade dos oncogenes que codif i- cam essas proteínas não está alterada. Assim, no nosso material, p odemos concluir que tais oncoproteínas não influenciaram a cinética celular do tecido endometriótico implantado na parede intestinal. Schneider et al. (1998) não e ncontraram expressão de p53 em 16 a- mostras de tecido endometriótico. Prefumo et al. (2003), por sua vez, e ncon- traram expressão aumentada tanto de p53 quanto de c-erB2 em 13 casos de adenocarcinoma endometrioide ovariano associado com endometriose. Embora tenham encontrado positividade focal para proteína p53 no componente glandular do tecido de endometriose, Nakayama et al. (2001) não encontraram mutações gênicas. Segundo esses autores, essa ausência de mutações gênicas em lesões com endometriose não é ach ado inespera- do, principalmente se considerarmos que, mesmo em carcinomas de ov á- Discussão 66 rios, essas mutações não são part icularmente frequentes, e, quando estão presentes, ocorrem tardiamente no processo de carcinogênese ovariana. Em estudo envolvendo 410 casos de câncer epitelial de ovários e 521 casos de endometriose (Saínz de La Cuesta et al., 2004), foram destacados grupos compostos de 17 casos (4,1%) de câncer associado com endometr i- ose; seis c asos de endometriose atípica; 17 casos de endometriose; e sete casos de endométrio saudável para análise imuno -histoquímica para avali a- ção da expressão de oncoproteínas. Expressão aumentada de p53 foi detec- tada em 82,4% dos casos de câncer associado com endometriose e em t o- dos os casos de endometriose atípica. Em apenas d ois casos (11,8%) de endometriose e em nenhuma amostra de tecido endometrial normal foi o b- servado p53 mutante. Não houve diferenças entre os grupos na expressão de c -erB2. Esses achados sugerem que a expressão aumentada de p53 possa ser forte fator predito r de endometriose com pote ncial pré-maligno, o que não significa dizer que toda lesão endometriótica tenha esse potencial. Coronado Martín et al. (2007) realizaram análise imuno-histoquímica de 124 amostras de tecido de câncer epitelial de ovário e de 30 amostras de te- cido ovariano normal. Não foi identificada expressão aumentada de p53 nem de c -erB2 em nenhuma das amostras de tecido normal. Expressão de c - erB2 foi detectada em 24,2% dos casos de câncer ovariano, e foi significat i- vamente correlacionada com estadio avançado da doença e com menores taxas de sobrevida, tanto geral quanto livre da doença. Em resumo, pudemos constatar que o índice de proliferação celular em glândula de tecido de endometriose no reto-sigmoide se correlaciona positi- Discussão 67 vamente com o número de lesões nesse segmento intestinal , o que pod eria nos reportar às teorias propostas por Meyer (1919) e Sampson (1927) sobre implantes continuados do endométrio em cavidade abdominal, associados com algum tipo de favorecimento do microambiente relac ionado ao hosp e- deiro, que exerceria papel importante nesse controle e no aparecimento de múltiplas lesões, abrindo novas perspectivas de estudo em relação a e sses fatores. A mesma correlação positiva foi evidenciada entre o índice de renov a- ção celular e o número de lesões (em glândula) e o tamanho da lesão (em estroma). Por fim, n ossos achados sugerem que os fatores que regulam o cre s- cimento da endometriose que compromete a parede do reto-sigmoide prova- velmente não sofram influências das oncoproteínas p53 e c-erbB-2, corrobo- rando com os conhecimentos que se têm até os dias de hoje sobre o caráter benigno da endometriose, embora mantendo o desafio de conhecer a ra zão por que uma doença benigna apresenta, tal qual uma neoplasia maligna, comportamento agress ivo e invasivo aos diversos órgãos, principalmente quando afeta o segmento intestinal. Conclusões 68 CONCLUSÕES Este estudo permitiu as seguintes conclusões: - Foi evidenciada positividade para apoptose e topoisomerase II -alfa tanto em lesões de endometriose do reto-sigmoide quanto em tecido de e n- dométrio eutópico de mulheres sem endometriose. - Evidências de proliferação celular foram menos frequentes e índices de proliferação e de renovação celular foram mais baixos em amostras de lesões de endometriose do reto-sigmoide em relação às amostras de end o- métrio de mulheres sem endometriose. - Não houve correlação entre índices positivos para apoptose, prolif e- ração celular e renovação celular e os sintomas clínicos referidos pelas p a- cientes com endometriose do reto-sigmoide. - O número de lesões apresentou correlação positiva com os índices de proliferação e de renovação celular na glândula. - O tamanho das lesões apresentou correlação positiva com os índices de renovação celular no estroma. - A classificação histológ ica das lesões não foi correlacionada com os índices de apoptose, proliferação ou renovação celular. - Não houve expressão das oncoproteínas p53 e c -erB2 na endometri- ose infiltrativa do reto-sigmoide. Anexos 69 ANEXOS ANEXO 1. APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA. Anexos 70 ANEXO 2. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ASSINADO PELAS PACIENTES COM ENDOMETRIOSE DO RETO-SIGMOIDE. HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO CAIXA POSTAL, 8091 – SÃO PAULO - BRASIL TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (Instruções para preenchimento no verso) I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME DO PACIENTE .:............................................................................. ........................................... DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ........................................ SEXO : M F DATA NASCIMENTO: ......../......../...... ENDEREÇO ............................................................................................ Nº .................... APTO: ............ BAIRRO: ...................................................................... CIDADE ............................................................ CEP:......................................... TELEFONE: DDD (............) ................................................................... 2. RESPONSÁVEL LEGAL ....................................................................................................................... NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) ............................................................................... DOCUMENTO DE IDENTIDADE :.................................... SEXO: M F DATA NASCIMENTO.: ....../......./...... ENDEREÇO: .......................................................................................... Nº ............ APTO: ..................... BAIRRO: .................................................................... CIDADE: ............................................................... CEP: ............................................ TELEFONE: DDD (............) ................................................................ II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: Pesquisa de ploidia de DNA, apoptose, p53, c-erBB 2 e topoisomerase II alfa em lesão de endometriose infiltrativa de intestino. 2. PESQUISADOR: Dr. Marco AntonioBassi 3. CARGO/FUNÇÃO: Pós-Graduando do Departamento da Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 69.806 4. UNIDADE DO HCFMUSP: Disciplina de Ginecologia HCFMUSP 5. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: SEM RISCO X RISCO MÍNIMO — RISCO MÉDIO — RISCO BAIXO — RISCO MAIOR — (probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como consequência imediata ou tardia do estudo) 6. DURAÇÃO DA PESQUISA : 05 anos III - REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA CONSIGNANDO: Anexos 71 1. Justificativa e os objetivos da pesquisa : A senhora está sendo admitida nesta pesquisa, por ter sido submetida a tratamento cirúrgico para endometriose profunda infiltrativa, com retirada de um p e- queno segmento intestinal, e (ou) de fragmentos de outros órgãos e tecidos. Nesta doença, o endomé- trio, que é a parte do útero que se desprende e sangra durante a menstruação, pode crescer fora do útero, em outros lugares, como os ovários, o tecido que reveste o abdome internamente (chamado de peritônio) e outras localizações como o intestino, bexiga e outros órgãos. Para o tratamento da sua doença, a senhora foi submetida a uma cirurgia e durante o ato cirúrgico fragmentos de tecido foram retirados por apresentarem endometriose. Estes fragmentos foram e nviados para exame anátomo - patológico (no qual se utiliza um microscópio para avaliar cortes muito finos dos tecidos que foram reti- rados da senhora). Para obter um maior conhecimento clínico e científico das doenças, o corpo clínico deste hospital (médicos e pesquisadores) desenvolvem pesquisa clínica e científica. Por esta pesquisa é possível conhecer melhor os mecanismos da doença e, portanto, oferecer novas possibilidades de diagnóstico e tratamento. O objetivo desta pesquisa é analisar pequenos fragmentos do tecido doente retirados na cirurgia, sem comprometer o diagnóstico da doença para que sejam utilizados em estudos para se conhecer melhor as causas da doença e novas possibilidades de diagnóstico e tratamento. 2. Procedimentos que serão utilizados e propósitos, incluindo a identificação dos procedimen- tos que são experimentais: A senhora foi submetida a uma videolaparoscopia, que é um tipo de c i- rurgia na qual são realizados 3 ou 4 pequenos cortes na barriga e os médicos realizaram a cirurgia observando o interior da barriga em uma televisão. Durante a cirurgia, o seu médico removeu o tecido doente. Este tecido foi enviado para a análise final do diagnóstico, por um médico patologista. O diag- nóstico foi confirmado pela análise destes matérias e os mesmos estão arquivados no laboratório de patologia clínica . Agora precisamos utilizar uma diminuta fração de todo este material que já foi anali- zado, e, que agora esta arquivado no laboratório de patologia, para podermos realizar a pesquisa que estamos propondo 3. Desconfortos e riscos esperados: Não haverá nenhum desconforto ou risco para a relização des- ta pesquisa, uma vez que serão utilizados diminutos fragmentos de material já coletados durante a ci- rurgia que a sra. realizou, e que estão guardados no laboratório de patologia clínica, 4. Benefícios que poderão ser obtidos: com esta pesquisa da qual a senhora está participando, ten- tamos descobrir se os achados encontrados poderão ajudar futuras pacientes no que tange ao seu tratamento. Concordando com o uso deste material, do modo descrito, é necessário esc larecer que você não terá quaisquer benefícios ou direitos financeiros sobre os eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em doar o fragmento da peça para pesquisa, sua decisão não in- fluenciará, de modo algum, o seu tratamento. Salientamos que você tem a liberdade de retirar o co n- sentimento em qualquer fase da pesquisa sem prejuízos a seu cuidado e que você terá direito de a- cesso sobre os eventuais resultados desta pesquisa e toda assistência necessária caso assim o dese- jar. Os pesquisadores estarão à sua disposição para quaisquer esclarecimentos e no endereço abaixo especificado 5. Custos: a senhora não terá custos ao participar do estudo. 6. Tratamento alternativo: não existem diferenças nos tratamentos realizados em virtude de sua par- ticipação ou não neste estudo. IV - ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNANDO: Sua participação no presente estudo é voluntária. A senhora pode optar por não participar ou interromper sua participação no estudo a qualquer momento, sem sanção nem perda de benefícios aos quais pudesse ter direito. Se decidir interromper antes de terminar o estudo, será solicitado a vol- tar ao consultório/hospital para uma visita final. Havendo interesse subsequente da paci ente os pesquisadores se comprometem a descartar as amostra colhidas imediatamente após notificacao oficial da paciente ou de seus representantes le- gais. O pesquisador assegura TOTAL sigilo e privacidade quanto aos dodos armazenados e obtidos com este estudo. O Dr. Marco Antonio Bassi pode retirar a senhora do estudo sem o seu consentimento por qualquer uma das seguintes razões: a) com base em critérios para melhorar seu atendimento médico; Anexos 72 b) se a senhora deixar de seguir o esquema do estudo; c) desenvolvi mento de efeitos adversos gr a- ves. V. INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS. O Dr. Marco Antonio Bassi estará à sua disposição, a qualquer momento, para discutir as dúvi- das que a senhora possa ter a respeito de sua endometriose, este estudo e sua participação. O co n- sultório do Dr. Marco Anoónio Bassi fica na Rua Albuquerque Lins, 537 cj. 112 e o número do telefone de seu consultório é (11) 3825-2262, durante o horário comercial ou pelo pager (11) 4196-7060, códi- go BASSI após este horário e durante os finais de semana ou feriados. O contato com o Dr. Marco Antonio Bassi ou um de seus auxiliares em caso de emergência pode ser feito através deste número. Se o desenho do estudo ou o uso da informação forem alterados ou se surgir alguma descoberta significativa durante o estudo que possam afetar seu desejo em parti- cipar, a senhora será informada e será obtido novamente o seu consentimento. Se tiver quaisquer dúvidas sobre seus direitos como indivíduo de pesquisa ou queixas referen- tes a este estudo de pesquisa, a senhora deverá telefonar para: Dr. Marco Antonio Bassi End.: Rua Albuquerque Lins, 537 – cj. 112 – São Paulo – Capital Tel. 11- 3825-2262 – cep. 05088-000 VI. OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES: __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ VII - CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO Ao assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, reconheço que li e compreendi a informação precedente descrevendo este estudo. Minhas dúvidas foram satisfatoriamente esclarec i- das e estou assinando este termo de consentimento livre e esclarecido indicando meu desejo de parti- cipar. Compreendo que receberei uma cópia assinada deste termo. Ao assinar este termo de consentimento livre e esclarecido, não abdiquei de nenhum de meus direitos legais aos quais eu pudesse fazer jus como participante de um estudo de pesquisa. São Paulo, de de . assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal assinatura do pesquisador (crimbo ou nome Legível) Anexos 73 ANEXO 3. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ASSINADO PELAS PACIENTES SEM ENDOMETRIOSE DO RETO-SIGMOIDE (GRUPO-CONTROLE). É necessário que a senhora leia atentamente e entenda o estudo antes de assinar este documento. Por isso, se não entender qualque r palavra ou informação, por favor, peça todas as explicações necessárias para a sua compreensão. A senhora não deve aceitar a participação sem entender totalmente os objetivos e a sua importância no estudo. Caso tenha dificuldade para a leitura deste documento, a senhora pode pedir para que o pesquisador leia em voz alta na frente de testemunhas , e depois a senhora dirá se entendeu e se quer participar da pesquisa. Se não puder assinar o documento, será necessário que as testemunhas assinem pela senhora. NATUREZA E OBJETIVO DO ESTUDO O endométrio é o tecido que reveste a parte interna do útero e é, também, a parte do útero que sangra durante a menstruação. Em algumas mulheres, o tecido endometrial pode crescer fora do útero, em outros lugares, como os ovários, o intestino, a bexiga, o peritônio - tecido que reveste a parte interna do abdômen. A essa doença se dá o nome de endometriose, que pode causar dor às vezes bastante intensa, sangramentos, alterações intestinais e urinárias desconfortáveis e dificuldade para engravidar ou infertilidade. O nosso objetivo nesta pesquisa composta de diferentes estudos relativos à endometriose é obter maior conhecimento científico da doença endometriose. Para entender por que e como ocorre a endometrio se, necessitamos comparar amostras de tecidos de pacientes com endometriose com amostras de endométrio de pacientes saudáveis sem endometriose. Por isso, estamos convidando a senhora para participar, se quiser, desta pesquisa que deverá permitir que possamos conhecer um pouco melhor os mecanismos da doença e, assim, oferecer novas possibilidades de diagnóstico mais rápido e tratamento mais eficaz para as pacientes com endometriose. Ressaltamos que o material colhido será utilizado nos diferentes estudos que compõem a pesquisa maior intitulada “ENDOMETRIOSE: BASES MOLECULARES DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA”. PROCEDIMENTO DO ESTUDO Para que a senhora possa decidir se quer ou não quer aceitar este nosso convite para participar da pesquisa, esclarecemos, desde já, que, qualquer que seja a sua decisão, o procedimento cirúrgico de laqueadura para o qual a senhora está sendo admitida neste hospital será realizado exatamente da forma como aprovada e combinada com a senhora, sem nenhuma modificação e sem qualquer interferência de sua resposta ao nosso convite. Por isso, a senhora tem toda a liberdade de recusar ao convite. Esclarecemos, também, que o estudo consiste de três procedimentos: (1) coleta de 5 ml de fluido peritoneal (um líquido que normalmente existe no interior de sua cavidade abdominal); (2) coleta de sangue na quantidade aproximada de 20 ml, que é uma quantia considerada pequena e sem riscos para sua saúde; e (3) retirada de um pequeno fragmento de endométrio do seu útero. Esses procedimentos só serão realiza dos quando a senhora já estiver devidamente preparada para a sua cirurgia, inclusive sob anestesia, de modo que a senhora não sentirá qualquer desconforto. A obtenção desses materiais não causará nenhum risco adicional para a sua cirurgia nem acarretará aumento no tempo da operação. Estes materiais coletados serão identificados por códigos formados por números e letras e, portanto, sua privacidade e identidade não serão reveladas. RISCOS ESPERADOS A senhora já deve ter sido informada de que o procedimento cirúrgico ao qual a senhora será submetida poderá trazer alguns desconfortos, e asseguramos que os procedimentos do estudo para o qual a senhora está sendo convidada não apresentará nenhum risco adicional. Para a coleta do fluido peritoneal, um pequeno instrumento que permite a aspiração do liquido será usado na mesma incisão que será feita para a cirurgia de laqueadura. Para a coleta do fragmento de endométrio (o tecido que reveste a parede interna do útero), será utilizado um instrumento chamado cureta de pipele, que é um instrumento plástico estéril e flexível, parecido com um canudinho plástico, que permite que se aspire uma pequena parte da parede interna do útero, sem a necessidade de qualquer outra incisão (corte). Durante a coleta de fluido peritone al e durante a coleta de fragmento do endométrio, os riscos de ocorrer algum evento adverso são mínimos. Depois da cirurgia, esses procedimentos de estudo Anexos 74 podem ocasionar, em número pequeno de pacientes, algum corrimento escuro ou pequeno sangramento, como ocorre no final da uma menstruação. Em poucos casos, também pode ocorrer um desconforto doloroso de pequena intensidade e, em raríssimos casos, pode haver risco de perfuração uterina, porém essa complicação nunca foi de scrita com a utilização desse método . Essas ocorrências, porém, geralmente desaparecem em no máximo até um dia após o procedimento. Quanto à coleta de sangue, no local da punção da veia para a coleta, podem ocorrer sangramentos que causem hematomas, que podem causar dor, mas não trarão nenhu m prejuízo futuro, e que geralmente desaparecem em alguns dias. BENEFÍCIOS - Os resultados da pesquisa sobre a qual a senhora está sendo esclarecida e para a qual a senhora está sendo convidada a participar não trar ão para a senhora nenhum benefício dire to nem qualquer direito financeiro. Por outro lado, esses resultados ajudarão a compreender melhor a doença endometriose e permitirão que desenvolvamos tratamentos mais eficientes para as mulheres que possuem essa doença. - Sua participação é voluntária e você terá tempo suficiente para decidir se quer ou não participar dele. Caso tenha dúvidas sobre algum risco relacionado à sua participação, a senhora deve perguntar quantas vezes forem necessárias até sentir -se confortável para decidir. Se decidir partic ipar, poderá retirar a sua autorização a qualquer momento se assim desejar, sem nenhum prejuízo pa ra o seu acompanhamento clínico. - O profissional poderá retirá -la do estudo a qualquer momento, caso julgue que é a melhor opção para a senhora. - Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética do Hospital Heliópolis. Qualquer dúvida sobre os seus direitos de participante na pesquisa poderão ser esclarecidos diretamente com o dr. Odilon Victor Porto Denardin, no endereço Rua Cônego Xavier, 276 m 10º andar, Sacomã, São Paulo, SP, ou pelo telefone (11) 2215-1100. - Caso a senhora apresente algum problema decorrente da sua participação direta no estudo, a senhora deve procurar o dr. Maurício Simões Abrão, em qualquer período, no telefone (11) 5180-3344. CONFIDENCIALIDADE DOS REGISTROS Nesse estudo somente suas iniciais e um número especial do estudo identificarão a senhora. Caso os resultados do estudo sejam publicados ou apresentados em congressos médicos ou reuniões científicas, sua identidade não será revelada em hipótese alguma. TERMO DE PARTICIPAÇÃO E ASSINATURA Aceito participar da pesquisa “ENDOMETRIOSE: BASES MOLECULARES DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA”, e declaro que li e não tenho nenhuma dúvida sobre os termos de esclarecimento acima. Autorizo, também, o uso das informações obtidas na pesquisa em publicações em revistas médicas e apresentações em congressos, desde que meus dados pessoais sejam mantidos em sigilo. Nome completo do Paciente ________________________________________ Data:________________________ Assinatura do Paciente Nome completo do Médico responsável __________________________________________ Data:______________________ Assinatura e carimbo de Médico responsável Nome completo da Testemunha __________________________________________ Data:______________________ Assinatura da Testemunha Anexos 75 ANEXO 4. DADOS CLÍNICOS DE 60 PACIENTES COM ENDOMETRIOSE DO RETO-SIGMOIDE. INICIAIS IDADE RAÇA DISME- DOR DISPAREUNIA ALTERAÇÕES ALTERAÇÕES NORREIA PÉLVICA DE URINÁRIAS INTESTINAIS CRÔNICA PROFUNDIDADE CÍCLICAS CÍCLICAS AAG 32 BRANCA s s s n s ACDSG 27 BRANCA s s s n s ACH 45 BRANCA s s s n s ADST 33 BRANCA s s n n s APDC 22 BRANCA s s s s s APNDLP 29 BRANCA s s s n s CDF 32 BRANCA s s s n s CFRE 26 BRANCA s s n n s CGIM 35 BRANCA s s s n n CMMC 32 BRANCA s s n n s CMSM 40 BRANCA s n s s s CSFL 30 BRANCA s s s n s ECR 41 BRANCA s n n n s EMM 44 BRANCA s s s n s FDSDNEN 26 BRANCA s s s n s FGAF 25 BRANCA s n s n n FNA 33 AMARELA s s s n s FOSDO 31 BRANCA s n s s s FRB 38 BRANCA s s s n s FSMC 34 BRANCA s s s n s GASR 39 NEGRA s s s n s GNB 34 BRANCA s s s n s GRB 31 BRANCA s s s n s ICB 37 BRANCA s s s n s IGPF 43 BRANCA s s s s s JABB 34 BRANCA s s s n n JYHN 34 AMARELA s n s n s KRM 27 BRANCA s s s n n LFML 22 BRANCA s s s n s LGODSS 38 BRANCA s s s n s LSBDM 37 NEGRA s s n n s MAFR 29 BRANCA s s n n s MAMC 40 BRANCA s n n n n MARP 34 BRANCA s s n n s MBL 40 NEGRA s s s n s MCAF 44 BRANCA s s s s s MCDPLM 30 BRANCA s s s s s MDLAS 40 BRANCA s s s n s MFM 30 NEGRA s s s n s MGRM 27 BRANCA s s s n S MHFG 45 BRANCA s s s n n MIAS 39 NEGRA s n s n s Anexos 76 INICIAIS IDADE RAÇA DISME- DOR DISPAREUNIA ALTERAÇÕES ALTERAÇÕES NORREIA PÉLVICA DE URINÁRIAS INTESTINAIS CRÔNICA PROFUNDIDADE CÍCLICAS CÍCLICAS MN 34 AMARELA s s s n s MZLB 42 BRANCA s n n n n NOKF 32 AMARELA s s s n s NSDN 30 BRANCA s s s n s PRR 30 BRANCA s n n n n RASMM 34 BRANCA s s s n s RCSPS 38 NEGRA s s s s s RDSS 31 BRANCA s s s n s RMF 31 BRANCA s n s n n SAAS 40 BRANCA s s s n s SAP 32 BRANCA s s s n s SDMNB 29 BRANCA s s n s s SFHT 41 BRANCA s n s n s SHBS 33 BRANCA s s s n s SRNO 43 BRANCA s s s n s TCCML 29 BRANCA s s s n s TDP 22 BRANCA s s s s s VMDS 29 BRANCA s s s n n Anexos 77 ANEXO 5. DADOS CLÍNICOS DE 20 PACIENTES SEM ENDOMETRIOSE. INICIAIS IDADE RAÇA DISME- DOR DISPAREUNIA ALTERAÇÕES ALTERAÇÕES NORREIA PÉLVICA DE URINÁRIAS INTESTINAIS CRÔNICA PROFUNDIDADE CÍCLICAS CÍCLICAS ALF 29 BRANCA n n n n n AMA 34 NEGRA n n n n n APS 29 BRANCA n n n n n DBS 35 BRANCA n n n n n ECPN 33 BRANCA s n n n n EOGN 34 BRANCA n n n n n ES 33 BRANCA n n n n n FTO 28 BRANCA n n n n n IS 26 NEGRA n n n n n LSSL 27 BRANCA n n s n n MAM 38 NEGRA n n n n n MDSM 27 BRANCA n n n n n MFFS 33 NEGRA n n n n n MIS 35 BRANCA n n n n n MJS 35 BRANCA s n s n s MLA 40 BRANCA n n n n n MSA 37 BRANCA n n n n n RABB 30 BRANCA s n n n n RJSL 35 BRANCA n n n n n STAN 40 BRANCA n n n n n Anexos 78 ANEXO 6. CARACTERÍSTICAS DAS LESÕES EM 60 PACIENTES COM ENDOMETRIOSE DO RETO-SIGMOIDE. INICIAIS ESTADIA- NÚMERO TAMANHO CAMADA TIPO MENTO DE DAS INTESTINAL HISTOLÓGICO LESÕES LESÕES ACOMETIDA AAG 4 2 15 e 20 MUSCULAR INTERNA S / INDIFERENCIAÇÃO ACDSG 4 1 35 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO ACH 4 1 16 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO ADST 4 1 15 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO APDC 4 1 22 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO APNDLP 4 1 30 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO CDF 4 1 8 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO CFRE 4 1 35 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO CGIM 4 1 28 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO CMMC 4 2 25 e 20 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO CMSM 4 1 30 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO CSFL 4 1 25 MUCOSA INDIFERENCIADO ECR 4 2 20 e 22 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO EMM 4 2 43 e 32 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO FDSDNEN 3 1 17 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO FGAF 4 1 29 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO FNA 3 1 15 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO FOSDO 4 1 25 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO FRB 4 1 18 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO FSMC 3 1 35 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO GASR 4 4 10 14 16 e 28 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO GNB 4 1 65 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO GRB 4 1 9 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO ICB 4 2 40 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO IGPF 4 1 20 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO JABB 4 1 15 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO JYHN 3 1 32 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO KRM 4 1 20 MUCOSA INDIFERENCIADO LFML 4 1 18 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO LGODSS 4 1 15 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO LSBDM 4 1 45 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO MAFR 4 3 40 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO MAMC 4 1 60 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO MARP 4 1 25 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO MBL 4 3 20 22 e 27 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO MCAF 4 1 32 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO MCDPLM 3 1 19 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO MDLAS 4 1 34 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO Anexos 79 INICIAIS ESTADIA- NÚMERO TAMANHO CAMADA TIPO MENTO DE DAS INTESTINAL HISTOLÓGICO LESÕES LESÕES ACOMETIDA MFM 4 1 35 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO MGRM 4 1 20 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO MHFG 4 1 34 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO MIAS 4 1 32 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO MN 4 1 30 MUSCULAR INDIFERENCIADO MZLB 4 2 20 e 25 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO NOKF 4 2 10 e 15 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO NSDN 4 1 35 SUBMUCOSA S / INDIFERENCIAÇÃO PRR 4 1 34 MUSCULAR INTERNA S / INDIFERENCIAÇÃO RASMM 3 2 35 e 25 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO RCSPS 4 1 12 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO RMF 3 1 27 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO RDSS 4 1 28 SUBMUCOSA S / INDIFERENCIAÇÃO SAAS 4 1 25 MUCOSA INDIFERENCIADO SAP 4 1 19 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO SDMNB 4 2 60 e 30 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO SFHT 4 1 30 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO SHBS 4 1 29 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO SRNO 3 1 55 SUBMUCOSA INDIFERENCIADO TCCML 4 1 60 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO TDP 4 1 20 MUSCULAR INTERNA INDIFERENCIADO VMDS 4 1 15 MUSCULAR EXTERNA INDIFERENCIADO Anexos 80 ANEXO 7 ACHADOS IMUNO-HISTOLÓGICOS EM 60 PACIENTES COM ENDOMETRIOSE DO RETO-SIGMOIDE. INICIAIS Pesquisa para p53 Pesquisa para c-erB2 Índice de Proliferação (Topoisomerase II-alfa em mil células contadas) Índice de Apoptose (em 500 células contadas) Índice de Renovação ESTROMA GLÂNDULA ESTROMA GLÂNDULA ESTROMA GLÂNDULA AAG Negativo Negativo 1 1 0 2 NA 0,5 ACDSG Negativo Negativo 2 0 2 0 1,0 NA ACH Negativo Negativo 1 2 0 1 NA 2,0 ADST Negativo Negativo 1 0 3 0 0,33 NA APDC Negativo Negativo 2 1 0 0 NA NA APNDLP Negativo Negativo 1 1 3 1 0,33 1,0 CDF Negativo Negativo 0 0 1 1 0 0 CFRE Negativo Negativo 0 1 0 0 NA NA CGIM Negativo Negativo 1 0 0 0 NA NA CMMC Negativo Negativo 1 2 0 1 NA 2,0 CMSM Negativo Negativo 0 2 2 1 0 2,0 CSFL Negativo Negativo 1 0 2 1 0,5 0 ECR Negativo Negativo 1 0 2 0 0,5 NA EMM Negativo Negativo 1 2 0 0 NA NA FDSDNEN Negativo Negativo 2 2 1 0 2,0 NA FGAF Negativo Negativo 2 4 0 0 NA NA FNA Negativo Negativo 2 0 2 0 1,0 NA FOSDO Negativo Negativo 0 2 0 0 NA NA FRB Negativo Negativo 2 1 3 2 0,67 0,5 FSMC Negativo Negativo 2 0 0 2 NA 0 GASR Negativo Negativo 2 6 0 1 NA 6,0 GNB Negativo Negativo 3 2 1 1 3,0 2,0 GRB Negativo Negativo 1 1 0 0 NA NA ICB Negativo Negativo 2 1 3 1 0,67 1,0 IGPF Negativo Negativo 1 0 2 1 0,5 0 JABB Negativo Negativo 0 2 1 1 0 2,0 JYHN Negativo Negativo 3 3 1 0 3,0 NA KRM Negativo Negativo 2 1 0 2 NA 0,5 LFML Negativo Negativo 2 2 0 1 NA 2,0 LGODSS Negativo Negativo 0 1 5 0 0 NA LSBDM Negativo Negativo 1 3 0 3 NA 1,0 MAFR Negativo Negativo 0 1 1 2 0 0,5 MAMC Negativo Negativo 1 0 0 0 NA NA MARP Negativo Negativo 2 1 0 2 NA 0,5 MBL Negativo Negativo 3 2 2 2 1,5 1,0 MCAF Negativo Negativo 1 0 0 0 NA NA MCDPLM Negativo Negativo 1 1 0 2 NA 0,5 MDLAS Negativo Negativo 1 1 1 0 1,0 NA MFM Negativo Negativo 1 0 0 2 NA 0 MGRM Negativo Negativo 1 2 1 0 1,0 NA MHFG Negativo Negativo 0 1 0 0 NA NA MIAS Negativo Negativo 1 1 0 2 NA 0,5 MN Negativo Negativo 0 1 1 0 0 NA MZLB Negativo Negativo 2 2 1 0 1,0 NA Anexos 81 INICIAIS Pesquisa para p53 Pesquisa para c-erB2 Índice de Proliferação (Topoisomerase II-alfa em mil células contadas) Índice de Apoptose (em 500 células contadas) Índice de Renovação ESTROMA GLÂNDULA ESTROMA GLÂNDULA ESTROMA GLÂNDULA NOKF Negativo Negativo 0 1 0 3 NA 0,33 NSDN Negativo Negativo 1 3 0 0 NA NA PRR Negativo Negativo 2 0 0 1 NA 0 RASMM Negativo Negativo 1 1 1 0 1,0 NA RCSPS Negativo Negativo 0 0 0 2 NA 0 RDSS Negativo Negativo 1 0 2 1 0,5 0 RMF Negativo Negativo 1 3 0 3 NA 1,0 SAAS Negativo Negativo 1 1 1 0 1,0 NA SAP Negativo Negativo 0 1 1 0 0 NA SDMNB Negativo Negativo 0 0 0 1 NA 0 SFHT Negativo Negativo 2 1 0 2 NA 0,5 SHBS Negativo Negativo 3 2 1 2 3,0 1,0 SRNO Negativo Negativo 2 0 1 2 1,0 0 TCCML Negativo Negativo 1 2 0 1 NA 2,0 TDP Negativo Negativo 0 0 2 0 0 NA VMDS Negativo Negativo 1 2 1 0 1,0 NA Anexos 82 ANEXO 8 ACHADOS IMUNO-HISTOLÓGICOS EM 20 PACIENTES SEM ENDOMETRIOSE. INICIAIS Pesquisa para p53 Pesquisa para c-erB2 Índice de Proliferação (Topoisomerase II-alfa em mil células contadas) Índice de Apoptose (em 500 células contadas) Índice de Renovação ESTROMA GLÂNDULA ESTROMA GLÂNDULA ESTROMA GLÂNDULA ALF Negativo Negativo 3 8 1 2 3 4 AMA Negativo Negativo 3 3 0 1 NA 3 APS Negativo Negativo 4 3 3 4 1,33 0,75 DBS Negativo Negativo 3 2 3 0 1 NA ECPN Negativo Negativo 3 3 0 0 NA NA EOGN Negativo Negativo 8 4 1 0 8 NA ES Negativo Negativo 3 4 0 0 NA NA FTO Negativo Negativo 3 2 2 3 1,5 0,67 IS Negativo Negativo 1 4 0 0 NA NA LSSL Negativo Negativo 2 5 1 1 2 5 MAM Negativo Negativo 5 3 1 2 5 1,5 MDSM Negativo Negativo 1 2 0 0 NA NA MFFS Negativo Negativo 3 1 4 0 0,75 NA MIS Negativo Negativo 2 3 0 1 NA 3 MJS Negativo Negativo 2 2 0 0 NA NA MLA Negativo Negativo 3 2 2 8 1,5 0,25 MSA Negativo Negativo 4 3 2 1 2 3 RABB Negativo Negativo 2 2 1 3 2 0,67 RJSL Negativo Negativo 1 2 1 1 1 2 STAN Negativo Negativo 1 5 0 0 NA NA Referências 83 8. 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