Hibridação Genômica Comparativa em Endometriose

Comparative genomic hybridization in endometriosis Endometriosis is a common benign gyn ecological disease, very aggressive, characterized by the presence of ectopic endometrial tissue. The most accepted theory to explain it is Sampson’s impl antation theory, which says that the endometrial tissue exfoliated during mens truation undergoes reflux through the uterine tubes, adheres and prol iferates in ectopic sites of the peritoneal cavity. On the other hand, only reflux is not enough to the establishment of the disease and a number of studies suggest a multidimensi onal etiology including hereditary, hormonal and immunological factors. Several methodologies have been proposed for the identification of candid ate genes for endometriosis. The comparative genomic hybridization (CGH) is a versatile techniqu e that allows the entire genome to be analyzed in only one experiment without the necessity of metaphasic chromosomes from the sample, excluding the cell culture. We aimed to evaluate, by CGH, ovarian endometriomas and eutopic endometrial tissue samples from 10 patients with confirmed diagnosis of endometriosis, for a genomic screening. In the eutopic group, 6/10 samples presented genomic imbalances and 7/10 cases showed alterations in the ectopic group. The presence of losses and gains of chromosomic regions in the histologically normal eutopic endometrium from women with ovarian endometriosis can be considered as a primary alteration in the development of the disease. The CGH methodology allowed the detection of chromosomic regi ons 11q12.3-q13.1, 17p11.1-p12 and 17q25.3-qter as critical region s, leading to future investigations for the identification of genes associated to endometriosis.

endometriosis, comparative genomic hybridization, cytogenetics, infertility. SUMÁRIO INTRODUÇÃO.............................................................................................11 ENDOMETRIOSE ............................................................................................................................... ................... 12 ENDOMETRIOMA OVARIANO E TUMORES DE OVÁRIO ............................................................................................ 18 ENDOMETRIOSE E INFERTILIDADE........................................................................................................................ 22 INVESTIGAÇÃO DIAGNÓSTICA .............................................................................................................................. 24 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA E ENDOMETRIOSE.................................................................................... 26 GENES CANDIDATOS EM ENDOMETRIOSE ............................................................................................................. 29 JUSTIFICATIVA ..........................................................................................35 OBJETIVOS.................................................................................................37

E MÉTODOS ..............................................................................39 CASUÍSTICA ............................................................................................................................... ......................... 39 MATERIAL............................................................................................................................... ............................ 40 MÉTODOS............................................................................................................................... ............................ 41 Preparação das Células Metafásicas ....................................................................................................... 41 Extração de DNA de tecido endometrial ................................................................................................ 42 Amplificação e Marcação do DNA por SCOMP....................................................................................... 43 Hibridação Genômica Comparativa......................................................................................................... 45 Análise de Imagens............................................................................................................................... .... 47 Análise por Bioinformática........................................................................................................................ 48 RESULTADOS..............................................................................................50 DISCUSSÃO................................................................................................67 CONCLUSÕES .............................................................................................77 REFERÊNCIAS ............................................................................................78 MANUSCRITO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO.........................................88 10 Introdução 11 INTRODUÇÃO De acordo com Berne e Levy (1990) o ci clo menstrual apresenta três fases fisiologicamente distintas: a fase foli cular, começando no primeiro dia do sangramento menstrual, com duração variável; a fase ovulatória, com duração média de dois dias e a fase luteínica, com duração de 13 a 14 dias, terminando com o inicio de um novo período menstrual. Esse ciclo normalmente varia de 21 a 35 dias, dependendo da duração da fase folicular. O ciclo começa com aumento gradativo do nível de FSH (hormônio folículo estimulante) pouco antes do início da menstruação, que se mantém durante a primeira metade da fase folicular. Em seguida observa-se um aumento do nível de LH (hormônio lute inizante). Durante a segunda metade da fase folicular, o nível de FS H diminui rapidamente, porém o LH continua aumentado. Devido ao estímulo do FSH, a concentração de estradiol no sangue também aumenta gradativamente durante os primeiros 6 a 8 dias do ciclo, aumentando progressivamente e atingindo um pico antes da fase ovulatória. Os níveis elevados de estradiol exercem efeito de feedback, diminuindo a concentração de FSH no sangue durante a segunda metade da fase folicular. Em seguida, a fase ovulatória é caracterizada por um pico elevado de LH no sangue, que precede um aumento do nível plasmático de progesterona. Após a ovulação, durante a fase luteínica, os níveis de LH e FSH diminuem até o final desta fase devido ao feedback negativo dos hormônios esteróides produzidos pelo corp o lúteo. Esta fase é caracterizada pelo intenso aumento dos níveis plas máticos de progesterona e pelo aumento do estradiol, ambos secretados pelo corpo lúteo. Na ausência de gravidez, o corpo lúteo é degenerado, levando à queda dos níveis de progesterona e estradiol até seus 12 níveis mínimos ao final da fase luteínica. A secreção de FSH aumenta, dando início a um novo ciclo menstrual. No início de cada ciclo menstrual, o endométrio apresenta-se fino, com poucas e retilíneas glândulas. Ao final da mens truação, a elevação da concentração plasmática de estradiol durante a fase fo licular aumenta de três a cinco vezes a espessura do endométrio, caracterizando a fase proliferativa. O estradiol altera o muco produzido no colo uterino, tornando -o mais aquoso, elástico e produzido em maior quantidade, o que irá facilitar a entrada dos espermatozóides na cavidade uterina. Logo após a ovulação, o aument o acentuado de progesterona altera o endométrio, inibindo seu crescimento rápi do e atividade mitó tica e provocando aumento da secreção das glândulas. Essa s alterações, características da fase secretora, permitem a implantação e nutriç ão do embrião no endométrio. Ao mesmo tempo, a progesterona diminui a quantida de de muco cervical, que volta a ser espesso e não-elástico. Caso não haja concepção, a queda brusca de progesterona e estradiol leva a contrações espasmódicas das artérias espiraladas e esta perda do suprimento sanguíneo prod uz morte celular e conseq üente descamação dessas células com o sangue coagulado, constituindo o fluxo menstrual. Endometriose A endometriose é uma doença ginecológica benigna comum, embora bastante agressiva, caracterizada pela presença de tecido endometrial ectópico, i.e., tecido endometrial implantado fora da cavidade uterina (Yang et al. , 2004). Histologicamente, o tecido ectópico é idêntico ao normal (eutópico), diferenciando-se 13 apenas por aspectos funcionais e bioquí micos como receptividade a esteróides e potencial invasivo (Gaetje et al., 1995). A endometriose é caracterizada por sint omas como dismenorréia, dispaneuria, dor pélvica e infertilidade (Poliness et al. , 2004). No entanto, muitas mulheres são assintomáticas (Nap et al., 2004). Embora a endometriose seja uma da s alterações ginecológicas mais estudadas, sua etiologia e origem ainda não foram esclarecidas. A teoria mais aceita para explicá-la é a teoria da implantaçã o de Sampson (1927), a qual postula que o tecido endometrial liberado durante a me nstruação sofre refluxo através das tubas uterinas, adere-se e prolifera em loca is ectópicos da cavidade peritoneal (principalmente peritônio, ovários e septo retovaginal). No entanto, as teorias da metaplasia do epitélio celôm ico, da indução, dos restos embrionários, da imunidade celular alterada e da metástase das lesões, também têm sido consideradas (Witz, 1999; Giudice e Kao, 2004). Vários estudos epidemiológicos susten tam a teoria de Sampson. Ciclos menstruais curtos e longa duração do fluxo menstrual são considerados dois fatores de risco predominantes para a endometriose. Também se sugere que pacientes nulíparas ou com menarca precoce apresent em um maior risco para desenvolver a doença (Darrow et al., 1993; Missmer e Cramer, 2003). Acredita-se que em torno de 10% da população feminina (Dabrosin et al. , 2002) e 50% das pacientes com infertilidade e dor pélvica (Cornillie et al. , 1990) apresentem endometriose. Essa incidência aumenta durante a idade reprodut iva, é rara antes da menarca e tende a diminuir após a menopausa (Houston et al. , 1988). Também foi relatada uma 14 tendência poligênica e multifatorial para a endometriose, sendo estimado maior risco (5 a 8%) para mulheres com história fam ilial da doença em parentes de primeiro grau (Bischoff e Simpson, 2004), bem co mo uma concordância aumentada entre irmãs gêmeas (Hadfield et al., 1997). Ainda, o fluxo menstrual retrógrado foi descrito na literatura em 76% das mulheres submet idas à laparoscopia durante o período menstrual (Liu e Hitchcock, 1986) bem como a viabilidade do endométrio menstrual em cultura (Keettel e Stein, 1951) e a capa cidade do endométrio menstrual de se fixar e proliferar em locais ectópicos (Ridley e Edwards, 1958). Por outro lado, considerando-se a menstruação retrógrada como um fenômeno bastante comum, o fato de ap enas parte das mulheres desenvolverem endometriose ainda não foi esclarecido. Foi proposto que, em mulheres saudáveis, a maioria das células menstruais sofre mo rte celular programada e não sobrevive (Gebel et al. , 1998). Entretanto, a porcentage m de células endometrióticas menstruais que sofre apoptose em mulheres com endometriose é bastante reduzida, levando a um aumento do número de cél ulas que sobrevivem e que poderiam continuar apresentando atividade fisiológica. Esses autores também observaram que o tecido endometrial de mulheres com en dometriose é significativamente menos susceptível à apoptose espontânea do que o tecido endometrial de controles férteis. Healy e colaboradores (1998) sugeriram que o endométrio de mulheres com endometriose sofre um aumento da prolif eração celular e da capacidade de se implantar e sobreviver em locais ectópicos . Os autores chamaram a atenção para a proliferação endotelial aumentada, consid erando-se que a angiogênese é essencial para a sobrevivência do endo métrio fora do útero, além do fato de a angiogênese 15 excessiva não ser encontrada apenas na endometriose, mas também em uma variedade de doenças como tumores sólidos, artrite reumatóide e psoríase. A expressão do VEGF (fator de crescime nto endotelial vascular) em implantes endometrióticos evidenciou um mecani smo para a neovascularização, que é comumente observada ao re dor dessas lesões (Donnez et al. , 1998). Altas concentrações de VEGF-A também foram id entificadas no fluido peritoneal de mulheres com endometriose, apresentando níveis mais elevados durante a fase proliferativa do ciclo (Mclaren et al. , 1996). Tan e colaboradores (2002) relataram uma correlação positiva entre a severidade da endometriose e a concentração de VEGF-A no fluido peritoneal. Em 2006, Fe rrero e colaboradores revisaram vários agentes anti-fator de crescimento endotelia l vascular e outras drogas angiostáticas como TNP470, endostatinas, anginex e anticorpo anti-VEGF humana, que foram estudadas em laboratório e em modelos animais de endometriose. Os autores concluíram que esses agentes inibem sign ificativamente a resposta angiogênica e reduzem o estabelecimento, manutenção e progressão das lesões endometrióticas . Por outro lado, a segurança e eficácia dessa s substâncias antiangiogênicas deveriam ser avaliadas em um modelo primata não- humano de endometriose, visando futuras aplicações. Al-Fozan e Tulandi (2003) avaliaram a di stribuição lateral da endometriose e do endometrioma ovariano em mulheres com endometrio se. Os autores observaram que a endometriose é mais freqüente na he mi-pelve esquerda (64,3%) em relação à direita, bem como um maior número de im plantes endometrióticos no lado esquerdo da pelve. Essa predisposição poderia ser ex plicada pela presença do cólon sigmóide 16 no lado esquerdo da cavidade abdomina l. Segundo essa teoria, ele retarda a passagem do fluxo menstrual retrógrado, fazendo com que as células endometrióticas tenham mais tempo para se implantar na hemi-pelve esquerda. As observações apóiam a teoria de que a or igem da endometriose está nas células endometrióticas que sofreram refluxo. No entanto, suas implicações clínicas permanecem desconhecidas. Por outro lado, apenas o refluxo tubário não é suficiente para o estabelecimento da doença e vários estudos sugerem uma etiologia multidimensional incluindo fatores hereditários, hormonai s e imunológicos (Olive e Schwartz, 1993; Brinton et al. , 1997). Em nível celular, a doença é caracterizada por crescimento monoclonal e pode apresentar aspectos de comportamento maligno como invasão local e metástase (Olive e Schwartz, 1993; Jimbo, Hitomi et al. , 1997; Jimbo, Yoshikawa et al. , 1997). Estima-se que a patogêne se da endometriose esteja associada à capacidade das células endo metrióticas em reagir a uma resposta imunológica local. Vários resultados de estudos in vivo e in vitro mostraram que as respostas imunológicas desencadeadas pela endometriose assemelham-se às respostas de células tumorais que evadir am a imunovigilância (Braun e Dmowski, 1998). Sugere-se que células natural killer (NK), por exemplo, inibam a implantação ectópica e o crescimento de células endo metrióticas menstruais retrógradas e, conseqüentemente, uma falha nesse sistem a possa contribuir para a iniciação e progressão da endometriose (D'hooghe et al. , 1995). Outras características moleculares da doença incluem al guns genes superexpressos como c-MYC (v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog [avian]) e ERBB2 (v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neur o/glioblastoma derived oncogene homolog 17 [avian]) (Bergqvist et al. , 1991; Schenken et al. , 1991) e a desregulação da expressão de fatores de crescimento (Huang e Yeh, 1994). Dados epidemiológicos, ci rúrgicos e patológicos qu estionam se as lesões peritoneais, ovarianas e do septo retovaginal apresentam uma etiologia comum única ou se representam três entidades com patogêneses diferentes (Vigano et al., 2004). Embora a teoria do fluxo retrógrado seja a mais aceita, outros autores (Nisolle e Donnez, 1997) sugerem uma origem diferente para cada um dos três tipos de endometriose. A endometriose peritoneal realmente poderia ser explicada pela teoria do refluxo de células menstruais do endomé trio que sofreriam adesão e proliferação na cavidade peritoneal. No entanto, a metaplasia celômica de inclusões epiteliais invaginadas poderia ser responsável pe lo desenvolvimento da endometriose ovariana, já que o epitélio de revestimen to do ovário aprese nta grande potencial metaplásico. Por fim, o nódulo endometr iótico retovaginal poderia ser mais bem explicado pela metaplasia de remanesc entes mullerianos localizados no septo retovaginal. A endometriose sofre transformação malig na em uma freqüência que varia de 0,7% a 1%; no entanto, esta freqüência pode ser considerada maior, uma vez que o tumor pode destruir o tecido endometrióti co de origem e eliminar as evidências histopatológicas da endometriose (Nishida et al. , 2000). Os três critérios definidos para a transformação maligna da endometriose são: (a) a presença de endometriose e carcinoma no mesmo ovário; (b) o carcinoma deve ter sua origem no tecido endometriótico, porém sem invasão endome trial, mantendo limites nítidos entre 18 ambos e (c) a confirmação histopatológica de uma transição entre a endometriose e o carcinoma (Sampson, 1925). Endometrioma Ovariano e Tumores de Ovário Dada a complexidade da doença e as limitações para a determinação de sua causa, três modelos diferentes foram propostos para explicar a origem do endometrioma ovariano típico (Vigano et al. , 2004): invasão do córtex ovariano e invaginação progressiva após o acúmulo de debris menstruais derivados de hemorragia de implantes endometrióticos superficiais; envolvimento de cistos ovarianos funcionais por implantes endome trióticos localizados na superfície do ovário; e metaplasia celômic a, que propõe a transformação metaplásica de células mesenquimais submesoteliais em um fenótipo endometriótico. De modo geral, a endometriose não pa rece estar associada a maior risco para câncer. Por outro lado, evidências têm suge rido a endometriose ovariana como fator precursor de tipos específicos de câncer de ovário. Esta informação corrobora o fato de fatores de risco para endo metriose e malignização ovariana serem similares e incluírem menarca precoce, menstruação regula r, ciclos menstruais curtos e poucas gestações. Embora nenhum estudo forneça uma evidência genética conclusiva para sustentar uma linhagem celular comum entre a endometriose e o câncer de ovário, a endometriose de ovário tem sido rela cionada a alterações genéticas e é freqüentemente encontrada em associação com carcinomas ovarianos endometriais e de células claras, sugerindo que esses dois tipos de carc inoma possam ter surgido diretamente de depósitos endometrióti cos (Feeley e Wells, 2001). McMeekin e 19 colaboradores (1995) descreveram uma sé rie de pacientes com adenocarcinomas endometrióticos associados à endometriose (EAEA) onde 30% dos tumores de adenocarcinomas endometrióticos do ová rio (ECO) surgiram em associação à endometriose, uma proporção levemente ma ior do que a relatada na maioria das séries de pacientes. Este dado pode re fletir um maior reco nhecimento da ligação entre endometriose e adenoc arcinoma endometriótico. A associação entre a doença no estágio inicial, idade precoce e o EAEA sustenta a idéia de que o EAEA é um subtipo histológico distinto do ECO, com um comportamento biológico menos agressivo em relação ao adenocarcinoma endo metriótico típico. De acordo com os autores, a relação entre os dados histológic os associados e o estadio da doença foi menos clara. Um número substancial de casos de ECO apresentou uma mistura de elementos epiteliais em proporções va riadas, juntamente com o componente endometriótico. A associação entre endometriose e câ ncer ovariano também foi investigada em estudos caso-controle (Ness et al. , 2000; Ness et al. , 2002; Modugno et al. , 2004). A maioria desses estudos sugere uma associação entre endometriose e câncer ovariano, embora seja difícil quan tificar o efeito com precisão, devido a variações de risco. Valenzuela e colaboradores (2007) apresentaram uma análise retrospectiva de 22 casos de carcinoma ovariano endometrió ide em uma tentativa de identificar a endometriose e sua transformação maligna. A endometriose foi detectada em três casos (3/22 = 14%), sendo que um deles apresentou claramente uma área de transformação benigna-maligna e em outro, a zona de transição era abrupta e 20 estava presente em ambos os ovários. No terceiro caso, foi observada endometriose ovariana com carcinoma endometriótico ap enas focal. Todas as três pacientes apresentavam um componente de carcinom a ovariano de células claras. A presença desse componente foi significantemente ma ior em pacientes com endometriose do que em pacientes sem endometriose. Os autores sugerem a associação desta condição com os carcinomas endometrióides e de células claras do ovário e que a mesma deve ser considerada sempre qu e haja suspeita de diagnóstico de endometriose, independentemente da situação pré- ou pós-menopausa da paciente. A literatura relata o comportamento clínico e os fatores prognósticos em pacientes com câncer de ovário com ou se m endometriose concomitante. Pacientes com endometriose tendem a ser mais jove ns e a ser diagnosticadas em estágios precoces, com lesões de grau mais baixo e melhor prognóstico (Depriest et al., 1992; Mcmeekin et al. , 1995; Erzen e Kova cic, 1998; Komiyama et al. , 1999; Erzen et al. , 2001). Entretanto, ainda não foi totalmente esclarecido se o aumento da sobrevida está relacionado à idade precoce e/ou ao diagnóstico precoce relatado em mulheres com endometriose (Somigliana et al., 2006). Outros autores (Komiyama et al. , 1999) avaliaram retrospectivamente dados clinicopatológicos da associação entre carcinoma ovariano de células claras e endometriose pélvica em 35 pacientes ja ponesas. Os autores observaram que pacientes com carcinoma ovariano de células claras e endometriose pélvica exibiram um melhor prognóstico em relação àque las sem endometriose, especialmente as pacientes com câncer de grau I. Eles também sugeriram que alguma interação ou via metabólica poderia existir entre o carc inoma ovariano de células claras e a 21 endometriose pélvica, ajudando a inibir a proliferação ou disseminação do carcinoma ovariano de células claras para a cavidade intraperitoneal nos eventos iniciais da progressão do câncer. A hipótese de que andrógenos circ ulantes possam estar envolvidos no desenvolvimento do câncer de ovário já foi relatada (Risch, 1998). A medicação androgênica, danazol, e a medicação antiandrogênica, leuprolide e nafarelin, são comumente usadas no tratamento da endo metriose (Moghissi, 1999; Olive e Pritts, 2001). Cottreau e colaboradores (2003) avaliaram as associações entre o uso desses medicamentos e o câncer de ovário, e co ncluíram que o danazol aumentava o risco de câncer ovariano, sustentando a hipóte se de que o excesso de andrógeno possa estar associado ao desenvolvimento de câncer ovariano. Mulheres com endometriose parecem ap resentar um risco maior para outros tumores malignos da pelve (Blumenfel d, 2004; Van Gorp, 2004). A ocorrência simultânea de endometriose e câncer ovariano e carcinoma de células claras (41%) e subtipos endometrióticos (38%) sugere uma transformação de componentes da endometriose em células tumorais. Esta tr ansformação pode ser devida à perda de heterozigose e à mutação somática de ge nes supressores tumorais, em especial, PTEN/MMAC/TEP1 (Jimbo, Hitomi et al., 1997; Jimbo, Yoshikawa et al., 1997; Obata et al., 1998; Toki e Nakayama, 2000; Swiersz, 2002). Dados da literatura também mostram uma alta freqüência de mu tação do gene supressor tumoral TP53 em endometriose atípica e câncer ovariano re lacionado à endometriose (Sainz De La Cuesta et al. , 2004). Cistos endometrióticos também apresentam perda de heterozigose e deleções parciais envolvendo os cromossomos 9p, 11q e 22q (Jiang et 22 al., 1996). Clonalidade e altos ní veis de aneuploidia têm sido sugeridos como fatores de predisposição para transformação maligna de lesões endometrióticas, especialmente para os subtipos endometr ióide e de células claras (Jimbo, Hitomi et al., 1997; Jimbo, Yoshikawa et al. , 1997; Tamura et al. , 1998; Blumenfeld, 2004). Entretanto, também foi re latado que mutações no TP53 não estavam associadas à endometriose (Omori et al., 2004), enfatizando a necessidade de novos estudos para uma avaliação precisa de regiões crític as envolvendo genes candidatos para endometriose. Desde que a endometriose foi associada à infertilidade, a associação entre a doença e o câncer deve ser interpretada com cautela, já que um risco aumentado pode ser devido à nuliparidade e não à endometriose em si (Somigliana et al., 2006). Em resumo, a literatura relata várias ev idências indicando que o mesotélio da superfície ovariana normal desempenha um papel complexo na fisiologia ovariana, com funções reguladoras proteolíticas, de síntese e crescimento, as quais influenciam na ovulação e no reparo a danos ovulató rios (Feeley e Wells, 2001). Dessa forma, é possível que aberrações dessas funções co ntribuam para o desenvolvimento da malignidade. Endometriose e Infertilidade As várias questões fisiopatológicas e terapêuticas a respeito da associação endometriose-infertilidade permanecem não esclarecidas até o momento. O 23 mecanismo dessa associação é complexo, devido aos polimorfismos clínicos e à ausência de confirmações bem estabelecidas. A literatura relata que 25 a 50% das mulheres inférteis apresentam endometriose e que 30% a 50% das mulh eres com endometriose são inférteis (The Practice Committee of the American Soci ety for Reproductive Medicine, 2004). A hipótese de que a endometriose cause infe rtilidade ou uma diminuição na fertilidade permanece controversa. Vários mecanismos têm sido propostos no intuito de esclarecer a associação entr e endometriose e infertilidade: alterações anatômicas, alterações citológicas e bioquímicas do lí quido peritoneal, alterações da resposta imune local, alterações funcionais do ovário e do endométrio e redução da qualidade do embrião (Collinet et al. , 2006). No entanto, deve se r enfatizado que nenhum desses mecanismos diminui confirmadamente a fertilidade feminina. As classificações da American Societ y for Reproductive Medicine (1997) são únicas porque fornecem uma forma padronizad a de registro dos dados patológicos e avaliam, em escala, o status da doença na tentativa de predizer a probabilidade de gravidez após o tratamento. De acordo com os critérios da Sociedade Americana, o formulário de classificação da endometriose inclui o regi stro de informações sobre a morfologia da doença, recomendando foto grafias coloridas para documentação. As lesões devem ser categorizadas como verm elhas, brancas e negras. A porcentagem de envolvimento da superfície em cada ti po de lesão deve ser documentada. Além disso, para aumentar a precisão do sistema de pontuação, um endometrioma ovariano deve ser confirmado por histologia ou pela presença de (a) tamanho do cisto < 12 cm; (b) adesão à parede lateral pélvica; (c) lesões de endometriose na superfície ovariana; (d) fluido persistente, espesso, cor de chocolate. De acordo com 24 esse sistema de pontuação, a endometriose é classificada em grau I (mínima, de 1 a 5 pontos), II (leve, de 6 a 15 pontos), III (moderada, de 16 a 40 pontos) ou IV (severa, mais de 40 pontos). É provável que os esquemas de classificação para endometriose continuem a evoluir e que ou tros fatores associados à endometriose que contribuam para a infertilidade sejam in cluídos na classificação, permitindo uma previsão mais precisa de gravidez. Investigação Diagnóstica O diagnóstico inicial da endometriose é realizado pela história clínica, variando desde ausência completa de sintomas até dor pélvica incapacitante durante o período menstrual e infertilidade. A dosa gem das glicoproteínas séricas CA-125 e CA19-9, devido à maior concentração de sses marcadores no endométrio ectópico comparado ao normal, em associação a exames de imagem como ultra-som endovaginal e ressonância magnét ica também são utilizadas como ferramentas diagnósticas. Entretanto, devido à ba ixa especificidade desses métodos, o diagnóstico da endometriose só pode ser confirmado por laparoscopia, considerada um método bastante invasivo (Brosens et al., 2004). A remoção cirúrgica das lesões melhora significativamente alguns sintomas, como a dor, porém pode haver recorrência da doença e as pacientes podem rejeitar ou adiar uma segunda cirurgia, preferindo outro tipo de terapia. No momento, dentre os tratamentos disponíveis estão os supr essores da síntese de estrógeno, que induzem a atrofia de implantes ectópicos ou interrompem o cicl o de estimulação. Contraceptivos orais, agentes androgênicos , progesterona e análogos do hormônio 25 liberador de gonadotrofina também têm sido utilizados com sucesso no tratamento da endometriose, porém nenhuma dessas drogas elimina a doença, e em alguns casos, os efeitos colaterais provocados limitam seu uso a longo prazo (Ferrero et al., 2006). Atualmente, a avaliação histológica do endométrio durante a investigação de rotina para infertilidade feminina não tem sido recomendada. O conceito de anormalidades endometriais, não refletid o pelas alterações histológicas, tem enfatizado as deficiências analíticas não diagnosticadas pela avaliação histológica clássica, que podem levar à falha de impl antação embrionária. De fato, a relação entre as alterações bioquímicas e a histolog ia normal enfatiza a necessidade de uma abordagem molecular do endométrio, além da análise histológica, para testes diagnósticos de fertilidade em mulheres com endometriose e outras causas de infertilidade (Giudice e Kao, 2004). Um dos maiores desafios da investigação genética da endometriose é a busca por métodos de análise precisos e rápidos que revelem o máximo de informação sobre a amostra. As técnicas de citogenética convencional permitem uma informação detalhada sobre cada cromossomo e, portan to são bastante utilizadas com sucesso. Entretanto, a necessidade de obtenção de células metafásicas requer um número significante de células vivas para cultura, e dessa forma, a dificuldade de se obter preparações cromossômicas metafásicas de boa qualidade e o tempo de cultura celular prejudicam a aplicação desta metodologia. A técnica de Hibridação Fluorescente in situ (FISH) é uma boa opção, pois células interfásicas podem ser analisadas com sondas específicas para determinadas 26 regiões cromossômicas, evitando assim a cu ltura celular e reduzindo o tempo para a obtenção dos resultados. Por outro lado , o número de cromossomos que pode ser avaliado por FISH no mesmo experimento é limitado devido à probabilidade de falha na hibridação e sobreposição de sinais fluorescentes de dois cromossomos. Hibridações seqüenciais, ou seja, mais de uma hibridação na mesma célula com sondas para cromossomos diferentes, também têm sido usadas para aumentar o número de cromossomos a serem investig ados. No entanto, a eficiência da hibridação diminui consistentemente a cada ciclo de hibridação (Liu et al., 1998). A Hibridação Genômica Comparativa (CGH) é um método que permite a produção de um mapa detalhado das diferenças entre cromossomos em diferentes células, sem qualquer conhecime nto prévio sobre as regiõe s alteradas. Este método detecta ganhos (amplificações) e perdas (deleções) de segmentos de DNA. A CGH tem o potencial de investigar o acúmulo de alterações cromossômicas como uma medida da estabilidade genética, bem como de monitorar as complexas alterações citogenéticas detectadas em doenças humanas (Squire e Perlikowski, 1998). Hibridação Genômica Comparativa e Endometriose Nenhuma alteração cromossômica especí fica foi identificada em tecido endometriótico por análise citogenética convencional, provavelmente devido às limitações relacionadas à cultura de tecido (Dangel et al. , 1994). A técnica de FISH tem a vantagem de não exigir cultura de células endometriais, já que pode ser realizada em tecido fresco ou fixado (Vigano et al. , 2006). Shin e colaboradores (1997) relataram que a freqüência de aneuploidia foi significativamente mais alta em 27 três de quatro amostras frescas de endome triose provenientes de mulheres afetadas pela doença em estadio avançado (8,8 e 14,8% respectivamente para monossomia dos cromossomos 16 e 17 em um caso; 14,8% para trissomia do cromossomo 11 no segundo caso e 14,1% para monossomia do cromossomo 16 no terceiro caso) quando comparado à freqüência média obse rvada em amostras de tecido normal (3,4% para monossomia e 1,2% para tri ssomia). A CGH é uma técnica versátil que supre as deficiências do FISH e da cito genética convencional, permitindo que o genoma inteiro seja analis ado em um só experimento, sem a necessidade de cromossomos metafásicos da amostra. (Kallioniemi et al., 1992). Resumidamente, na metodologia de CGH, o DNA teste é marcado com um fluorocromo verde, misturado em uma ra zão 1:1 com DNA normal marcado com um fluorocromo vermelho, e ambos são hibridados em preparações metafásicas humanas normais. O DNA normal e as me táfases são obtidos de um voluntário saudável ou adquiridos comercialmente. Os fragmentos de DNA marcados em verde e vermelho competem pela hibridação em seus locos de origem na preparação metafásica. A proporção de fluorescência ve rde e vermelha medida ao longo do eixo cromossômico representa perda (razão 1) de material genético na célula da amostra em estudo , naquela região específica. Além do microscópio de fluorescência, a técnica requer um software para a análise dos resultados. A Hibridação Genômica Comparativa (CGH) permite um screening completo do genoma com o objetivo de descobrir e mapear perdas e ganhos cromossômicos (Squire e Perlikowski, 1998). 28 Diversas publicações utilizaram a CG H como ferramenta para detecção de alterações genéticas na endometriose. Go gusev e colaboradores (1999) examinaram 18 lesões endometrióticas obtidas de paci entes em estadio avançado, e alterações recorrentes no número de cópias de genes foram encontradas em 15 de 18 casos (83%). Perdas de material genômico no s cromossomos 1p e 22q foram detectadas em 50% dos casos. Outras perdas comuns foram observadas nos cromossomos 5p (33%), 6q (27%), 7p (22%), 9q (22%), 16 (22% ), e 17q em um caso. Ganhos de seqüências de DNA foram encontrados em 1q, 6q, 7q e 17q em quatro casos. Em um trabalho subseqüente, o mesmo grupo (Gogusev et al., 2000) avaliou por CGH uma linhagem celular permanente derivada de endometriose (FbEM-1) e observou que ganhos cromossômicos eram mais comumente observados do que perdas, sendo que um aumento significativo do número de cópias de seqüên cias de DNA foi detectado em 1q, 5p, 6p e 17q correspondendo a amplificações. A metodologia de CGH também foi utilizada na avaliação de alterações genéticas em casos de carcinomas de ovário com origem na endometriose (Mhawech et al. , 2002). Foram observadas alterações cromossômicas em três casos de carcinoma de ovário sendo ganhos em 1q, 8q e 13q e perda em 10p. No entanto, nenhuma alteração cromossômica foi detectada no tecido endometriótico de nenhum dos três. Os autores concluíram que essa s regiões alteradas podem conter genes supressores tumorais ou oncogenes respon sáveis pela transformação maligna da endometriose. Mais recentemente, a metodologia de CGH-array, que substitui os cromossômicos metafásicos por regiões de DNA genômico, começou a ser utilizada 29 em estudos de endometriose (Guo et al. , 2004) para detecção de perdas e ganhos genômicos. Apesar de alguns trabalhos terem avaliado a endometriose em relação a possíveis alterações crom ossômicas detectadas por CGH, somente um estudo comparou o tecido endometr iótico ovariano e o endomé trio normal das mesmas pacientes. Wu e colabora dores (2006) investigaram tecidos ectópicos e eutópicos, porém utilizando a técnica de array-CGH, tanto em endometrioses peritoneais quanto ovarianas. Genes Candidatos em Endometriose Aproximadamente 50% das lesões en dometrióticas poderiam produzir alterações genéticas somáticas em re giões cromossômicas que supostamente conteriam genes envolvidos na tumorigê nese ovariana, especialmente do tipo endometrióide (Jiang et al. , 1996). Alterações genéticas comuns foram detectadas em casos de endometriose concomitante com cânceres, apoi ando o modelo de progressão da carcinogênese a partir de um precursor benigno ao tumor de ovário (Jiang et al., 1998; Thomas e Campbell, 2000a; b). Um número cada vez maior de pesquisa s tem sido realizado na procura por associações entre a endometriose e altera ções/polimorfismos em genes candidatos. Dentre as associações descritas estão: - Galactose–I-fosfatase uridiltransferase ( GALT): Localizado em 9p13, foi o primeiro gene candidato a ser a ssociado à endometriose (Cramer et al. , 1996). O 30 polimorfismo específico de scrito foi uma transição ad enina-guanina, onde uma mutação no códon 314 do éxon 10 levari a a uma substituição de aspartato por asparagina. Entretanto, esta associação não foi confirmada por outros autores (Morland et al., 1998; Hadfield et al., 1999; Stefansson et al., 2001). - Genes de Detoxificação de Fase I (receptor Ah, CYP1A1, NAT2): Enzimas do metabolismo de drogas da fase I, que ag em introduzindo um grupo funcional em seus substratos endógenos e exógenos, po dem estar relacionadas à ativação de compostos pro-carcinogênicos. Aproxi madamente 10% da população humana apresenta “alta” inducibilidade do CYP1A1 como resultado do polimorfismo A2, e poderiam apresentar um maior risco pa ra o desenvolvimento de tumor ou, por analogia, de endometriose (Bischoff e Simpson, 2004). - Genes de Detoxificação de Fase II ( GSTs, NAT2): os genes GSTs, GSTMI e GSTT, cruciais para a detoxificação de prod utos do estresse oxidativo, são de relevância específica já que são produzid os durante o reparo do epitélio ovariano (Sarhanis et al., 1996). - Genes relacionados a esteróides (receptor de estr ógeno, gene da aromatase): A relação entre endometriose e o aumento da produção de estrógeno é uma hipótese largamente difundida e bi ologicamente plausí vel. O receptor de estrógeno (ER) e o gene da aromatase (CYP19) são prováveis genes candidatos. Eles podem tanto aumentar o acúmulo de estr ógeno quanto produzir um ambiente hormonal mais rico do que o convencional (Bulun et al., 2000). - Genes de Adesão Intracelular ( ICAM-I), matriz de metaloproteinases e fatores angiogênicos: Genes candidatos baseados em estudos imunohistoquímicos in 31 vivo e in vitro (Henriet et al., 2002; Lessey, 2002; Osteen et al., 2002). Moléculas de adesão celular, principalmente integrinas e caderinas, são os principais mediadores de adesão célula-célula e célula-matriz e su a expressão pode ser importante para a adesão inicial do tecido esfoliado (Beliard et al., 1997). - Citocinas: Lebovic e colaboradores (2002) relataram que o gene de ciclo celular Tob-1 estava menos expresso em amostras de endometriose (48%) quando comparado ao controle (16%), após tratamento com IL1-β. - Genes de reparo a DNA mismatch: A metilação alterada nesses genes tais como hMLHI foi observada em 4/46 casos de endo metriose de grau III/IV (8,6%) (Martini et al., 2002). - Genes supressores tumorais: Bischo ff e Simpson (2004) sugeriram como principais genes candidatos os oncogene s e genes supressores tumorais mapeados no cromossomo 17, especificamente BRCAI e TP53. Por outro lado, alguns autores concordam que a imunorreatividade da p 53 não é detectável em amostras de endometriose não associadas a carcinomas (Vercellini et al. , 1994; Schneider et al. , 1998; Okuda et al., 2003). Outro gene supressor tumoral estudado em endometriose é o PTEN, mapeado em 10q23. Mutações no PTEN foram relatadas em tumores endometrióticos (Obata et al. , 1998) e em tumores epiteliais ovarianos relacionados à endometriose (Campbell e Thomas, 2001). Mutte r e colaboradores (2000) enfatizaram que a perda da função do PTEN seria um evento primário na tumorigênese endometriótica. Enquanto nenhuma amostra de endométrio normal apresentou mutações no PTEN, uma taxa de mutação de 83% foi encontrada em 32 adenocarcinomas endometriais endometrióid es e de 55% em lesões intraepiteliais endometriais pré-malignas. - Oncogenes: Nezhat e colaborado res (2002) compararam padrões de coloração de bcl-2 em cistos endometrió ticos benignos, tumores ovarianos e áreas de endometriose associadas aos tumores, em uma tentativa de identificar uma correlação seqüencial e etiológica. Apenas 23% dos cistos endometrióticos foram corados positivamente para bcl-2 enquanto 67% dos tumores endometrióides e 74% dos carcinomas ovarianos de células claras apresentaram resultado positivo. Das 12 amostras de endometriose de áreas adjace ntes a carcinomas endometrióides e das 11 amostras de endometriose adjacentes a neoplasias de células claras, 42 e 73% respectivamente expressaram bcl-2. Bischoff e Simpson (2004) criaram a hipótese de que duas ou mais alterações gênicas concomitantes são necessárias para o surgimento da endometriose. Diferentemente da neoplasia em si, os genes alterados na endometriose não necessariamente precisam ser oncogenes ou genes supressores tumorais. Os autores acreditam que o primeiro passo envolve um gene que aumenta a predisposição para adesão e implantação do tecido endometrial menstrual que sofreu refluxo. Esse gene pode estar envolvido com citoesquel eto (MMPs) ou adesão celular ( ICAMI). O segundo passo deve considerar genes de crescimento endometrial como receptor de estrógeno (ER) ou de regulação de esteróides ( CYP19). Eles também sugerem que em passos adicionais possa haver a participação de um oncogene, o que então levaria a uma proliferação celular descontrolada. 33 A endometriose realmente apresenta al guns aspectos de malignidade como crescimento e vascularização aumentados e invasão tecidual, mas características importantes do câncer como expansão monoclonal e alterações genéticas permanecem não esclarecidas. A presença de mutações gênicas deve ser investigada não apenas em casos de endometriose co ncomitante ao câncer de ovário ou a formas de transição histológica, mas tamb ém em cistos endometrióticos isolados. Devido à etiologia complexa e multifatoria l, envolvendo herança familial e múltiplos genes candidatos, a endometriose é considerada alvo ideal para estudos de screening genômico. 34 Justificativa 35 JUSTIFICATIVA A endometriose é uma doença gineco lógica benigna comum que afeta em torno de 10% das mulheres em idade repr odutiva. As pacientes podem apresentar desde ausência completa de sintomas até dor pélvica, dismenorréia, dispaneuria e infertilidade. A literatura relata que 50% das pacien tes com dor pélvica e infertilidade apresentam endometriose, e há 1% de risco de transformação maligna da endometriose. Devido à dificuldade de estabelecer um diagnóstico preciso, e por ser considerada um problema de saúde pública, torna-se importante identificar marcadores biológicos para triagem de mu lheres com predisposição à endometriose, assim como para o diagnóstico precoce e não invasivo da doença. Apesar de alguns trabalhos terem avaliado a endometriose em relação a possíveis alterações cromossômicas, util izando a metodologia de CGH, nenhum desses comparou o tecido endometriótico ovariano e o endométrio normal das mesmas pacientes. Até o mome nto, não existem relatos na literatura de estudos de perdas e ganhos genômicos utilizando a metodologia de CGH em amostras brasileiras de endometriose ovariana. 36 Objetivos 37 OBJETIVOS O objetivo principal deste trabalho é determinar o diagnóstico citogenético molecular de amostras de endometrio mas ovarianos e de tecido eutópico (endométrio) das mesmas pacientes, por me io da técnica de Hibridação Genômica Comparativa. Os objetivos intermediários são: (a) Detecção de perdas e/ou ganhos de regiões cromossômicas em amostras de endometriose; (b) Comparação entre os result ados obtidos nas lesões endometrióticas ovarianas e no t ecido endometrial eutópico de pacientes com diagnóstico de endometriose; (c) Identificação das regiões cr omossômicas preferenciais e conseqüentemente de genes que possam estar envolvidos no processo de desenvolvimento da doença. 38

e Métodos 39

E MÉTODOS Casuística O projeto foi desenvolvido no Departamento de Ge nética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (Laboratório de Citogenética Humana) da Universidade de São Paulo (FMRP-USP) e na Division of Applied Molecular Oncology do Princess Margaret Hospital, Ontario Ca ncer Institute, University Health Network, Toronto, Canadá, em colaboração com o Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP- USP (Serviço de Reprodução Humana do Hospital das Clínicas da FMRP – USP) e com o Laboratório de Oncologia Pediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura (FMRP-USP). O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HCFMRP – USP processo no 11736/2004. Foram selecionadas dez mulheres, com idade variando en tre 24 a 45 anos, apresentando ciclos menstruais regulares (de 25 a 35 dias de intervalo), atendidas no ambulatório de infertilidade do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto – USP, após confirmação diagnóstica de endometriose. Os critérios de seleção foram: pacientes sem história de uso de anticoncepcion ais orais nos últimos seis meses e sem referência a qualquer outra forma de tratamento hormonal. Dentre as pacientes, sete foram encami nhadas ao serviço para laparoscopia pelo Ambulatório de Dor Pélvica e Endoscopia (AGDE) com indicação de dor pélvica e três foram encaminhadas pelo Ambulatório de Infertilidade Conjugal do HCFMRP-USP 40 com indicação de infertilidade. As inform ações clínicas de cada paciente estão apresentadas na Tabela 1. Tabela 1: Descrição das características clínicas das pacientes participantes no estudo. PACIENTE IDADE GRAU DIA DO CICLO INDICAÇÃO GRAVIDEZ O1/ON1 42 IV 11 DOR G5P4A1 O2/ON2 31 IV 7 INFERTILIDADE G0 O3/ON3 45 IV 5 DOR G3P3A0 O4/ON4 24 IV 6 DOR G0 O5/ON5 42 III 7 DOR G2P2A0 O6/ON6 40 III 4 DOR G2P2A0 O7/0N7 36 IV 8 DOR G3P3A0 O8/ON8 35 III 5 INFERTILIDADE G0 O9/ON9 35 IV 7 INFERTILIDADE G2P0A2 O10/ON10 42 IV 8 DOR G2P2A0 Todas as pacientes participantes da pesquisa assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Foram utilizadas 20 amostras teciduais de endométrio eutópico e ectópico das 10 pacientes na fase proliferativa do ciclo menstrual (1 ˚ ao 12 ˚ dia). Durante a laparoscopia, exame para diagnóstico da endometriose, foram coletadas biópsias das diferentes lesões endometrióticas, send o 10 amostras de endometrioma ovariano e 41 10 amostras de endométrio eutópico das mesmas pacientes utilizando Cureta de Novak. Por se tratar de um procedimento rotineiro para diagnóstico, não acarretou desconforto adicional às pacientes. Todos os casos foram histopatologic amente confirmados. A doença foi estadiada de acordo com a classificação da American Society for Reproductive Medicine (1997). As amostras foram armazenadas em freezer a -80 ˚C após tratamento com criopreservador Tissue-T eck® O.C.T. Compound (Sakura Finetek USA. Inc., Torrance, CA). Métodos Preparação das Células Metafásicas Amostras de sangue periférico de indi víduos normais do sexo feminino foram cultivadas durante 72 horas a 37 °C segundo a técnica de obtenção de células metafásicas a partir da cultura temporária de linfócitos de sangue periférico (Moorhead et al. , 1960) modificada por Ferrari (1968). Em resumo, a cultura de sangue periférico foi estimulada com fitohemaglutinina (Difco) por 71 horas a 37 °C. Adicionou-se colchicina 0,0016% permanecendo por 1 hora a 37 °C. A hipotonização foi feita com solução de KCl (0,075M) e interrompida ap ós 20 minutos com fixador (metanol/ácido acético 3:1). O procedimento de fixação do sedimento foi repetido duas vezes, sendo que a última repetição foi realizada com fixador na proporção metanol/ácido acético 1:1. Após o gotejamento do material nas lâminas, estas foram armazenadas a -20°C até sua utilização. 42 Extração de DNA de tecido endometrial O DNA foi isolado utilizando o reagente TRIzol LS (Invitrogen) de acordo com as normas do fornecedor, para posterior amplificação e marcação por SCOMP. Após a retirada da fase aquosa com RN A, os tubos contendo a interfase/fase orgânica com TRIzol foram centrifugad os a 12.000 RPM durante 5 minutos a 4 ˚C. Qualquer resquício da fase aquosa foi cuidadosamente removido evitando assim a contaminação do DNA com RNA. Foram ad icionados 5 mL de tampão BEB (back extraction buffer) para cada 1 mL de TRIz ol utilizado para a extração de RNA em cada tubo. Durante pelo menos 3 minutos, as amostras foram homogeneizadas por inversão dos tubos. Os tubos foram centrifugados a 12.000 RPM durante 30 minutos em temperatura ambiente. A fase aquosa su perior foi transferida para outro tubo onde foram adicionados 0,4 mL de isopropanol para cada 1 mL de TRIzol. A amostra foi misturada por inversão durante 5 minu tos à temperatura ambiente. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 12.000 RPM durante 15 minutos a 4 ˚C. O sobrenadante foi removido e 0,5 mL de etanol 70% para cada 1 mL de TRIzol utilizado na extração de RNA foi adiciona do ao DNA precipitado para lavagem. A amostra foi centrifugada a 12.000 RPM durante 15 minutos a 4 ˚C. O etanol foi removido e o DNA foi ressuspendido em 20µL de água. O DNA foi então armazenado a -80˚C até sua utilização. 43 Amplificação e Marcação do DNA por SCOMP - Single Cell Comparative Genomic Hybridization - O protocolo utilizado para marcação por SCOMP foi proposto em 2002 (Stoecklein et al., 2002). Para a ligação de adaptadores, foi utilizado um total de 150 a 300 ng do DNA purificado. As reações de clivagem com a endonuclease de restrição MseI, ligação dos adaptadores e a primeira amplificação pela PCR foram realizadas no mesmo tubo para prevenir a perda de fragmentos genômicos. Inicialmente, o DNA foi submetido à clivagem com 24 unidades da endonuclease de restrição MseI (New England Biolabs ), em tampão universal One- phor-All buffer plus (OFA pl us) (10mM de Tris-acetato pH 7,5, 10mM de acetato de magnésio, 50mM de acetato de potássio). Incubou-se a 37°C durante 3 horas e em seguida a 65°C, durante 5 minutos, para inativação da enzima. Em um tubo separado, os adaptadores foram formados pelo pareamento dos oligonucleotídeos LIB1 (5’-AGTGGG ATTCCTGCTGTCAGT-3’) e ddMseI (5’- TAACTGACAGCdd-3’). O pareamento de base s dos oligonucleotídeos adaptadores foi realizado em tubo separado, submetido a um gradiente de temperatura de 65°C a 15°C com rampa de 1 min/°C. Em seguida, adicionou-se 1 µL de ATP 10mM (Invitrogen) e 1 µL de T4 DNA ligase (Roche) 5U/µL. Esta mistura foi transferida ao DNA previamente tratado com a endonuclease MseI e incubada a 15°C overnight. Após a ligação dos adaptadores, o kit Elongase Amplification System (Roche) foi utilizado para a amplificação primária. A reação foi realizada em um volume final de 50 µL contendo 2,5 mM de cada dNTP, 60 mM de Tris-SO 4 pH 9,1, 10 mM de 44 (NH4)SO4, 1,5 mM de MgSO4 e 1 unidade da enzima Expand Long Template (Roche). Adicionamos 40 µL desse mix aos 10 µL da reação de ligação. A amplificação foi realizada em um termociclador programá vel PTC-200 (MJ Research) e consistiu de: (a) 68°C por 3 minutos, (b) 15 ciclos de 94°C por 40 segundos, 57°C por 30 segundos e 68°C por 1 minuto e 30 segundos (com 1 segundo adicional por ciclo para a temperatura de extensão), (c) 8 ciclos de 94°C por 40 segundos, 57°C por 30 segundos (com 1 segundo adicional por ciclo) e 68°C por 1 minuto e 45 segundos (com 1 segundo adicional por ciclo), (d) 22 ciclos de 94°C por 40 segundos, 65°C por 30 segundos e 68°C por 1 minuto e 53 segundos (com 1 segundo adicional por ciclo) e (e) 1 ciclo de 68°C por 3 minutos e 40 segundos. Os produtos de amplificação foram pu rificados utilizando-se o QIAquick PCR Amplification Kit (QIAGEN) de acordo com as instruções do fornecedor. Para a amplificação secundária, 2 µL do produto previamente purificado foram utilizados como molde em uma segunda reaç ão de amplificação para marcação dos fragmentos. A solução de reação foi composta por 60 mM de Tris-SO4 pH 9,1, 10 mM de (NH 4)SO4, 1,5 mM de MgSO 4, 2 unidades da enzima Elongase, 1,4 µM do oligonucleotídeo LIB1, 330 µM de dGTP, dATP e dCTP, 290 µM de dTTP e 40 µM de digoxigenina 11-dUTP (para o DNA de refe rência) ou biotina 16-dUTP (para o DNA teste). As condições de amplificação foram de 1 ciclo de 94°C por 1 minuto, 60°C por 30 segundos, 68°C por 2 minutos; 10 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos e 68°C por 2 minutos com 20 segundos adicionais por ciclo. 45 O oligonucleotídeo LIB1 foi removido pelo tratamento com a enzima de restrição TruI (Fermentas) conforme as instruções reco mendadas pelo fornecedor. A enzima foi inativada a 65°C por 5 minutos. Para a reação de precipitação, 8 µg de DNA teste (marcado com biotina 16- dUTP) foram colocados em um tubo de reação, juntamente com 8 µg de DNA de referência (marcado com digoxigenina 11-dUTP), 10 µL de Human Cot-1 DNA (1 mg/mL), 10 µL de DNA de esperma de salmão (10 µg/µL), 10 µL de acetato de sódio 3 M, 400 µL de etanol absoluto gelado. O tubo foi mantido a -20ºC overnight ou a - 70ºC durante 1 hora. Centrifugou-se a 14.000 RPM, a 4ºC durante 45 minutos, adicionou-se 300 µL de etanol 70%, centrifugou-se novamente e depois o material permaneceu secando à temperatura ambien te. O mesmo foi ressuspendido em 6 µL de solução 30% dextran sulfato/4xSSC durante 15 minutos a 37 ˚C e em seguida foram adicionados 6 µL de formamida 100%. A sonda foi desnaturada por 6 minutos a 78ºC e incubada a 37ºC por 1 hora (pré-anelamento). Hibridação Genômica Comparativa Metáfases normais do sexo feminino foram tratadas em uma solução 10% pepsina/0,01M HCl a 37°C durante 2 minutos para eliminação do citoplasma. Em seguida, as lâminas foram incubadas em PBS/MgCl 2 durante 5 minutos em temperatura ambiente, desidratadas em uma série de etanóis (70%, 90% e 100% por 2 minutos cada) e deixadas à temperatur a ambiente para secagem. As lâminas foram então incubadas em solução 2xSSC a 72°C durante 30 minutos e depois em uma nova solução 2xSSC a temperatura am biente durante 5 minutos e em solução 46 0,1xSSC a temperatura ambiente dura nte 1 minuto. Em seguida ocorreu a desnaturação das lâminas em solução NaOH à temperatura ambiente durante 45 segundos e a incubação seqüencial das lâ minas em 0,1xSSC a 4°C durante 1 minuto e em 2xSSC a 4°C durante 1 minuto. As pr eparações foram então desidratadas em uma série de etanóis (70%, 90% e 100% por 2 minutos cada). Quando as lâminas estavam completamente secas, a sonda foi aplicada às lâminas e coberta com lamínula, que foi selada com rubber cement. A hibridação ocorreu em câmara úmida a 37°C durante 72 horas. Após a hibridação, as lâminas fora m lavadas seqüencialmente em 50% formamida / 2xSSC pH 7,0, a 45 ˚C durante 5 minutos por 3 vezes; 0,1% SDS / 0,1xSSC a 45 ˚C durante 5 minutos por 3 vezes e 2xSSC a 45 ˚C durante 5 minutos por 3 vezes. Em seguid a, uma solução de 20 µL de tampão TNB (0,1 M TRIS pH 7,5/0,15 M NaCl/0,5% blocking reagente – Roche) e 20 µL de tampão block I (3% BSA e 4xSSC pH 7,0/0,1% Tween 20) foi apli cada às lâminas e estas foram cobertas com lamínula e incubadas a 37°C em câma ra úmida durante 45 minutos. Após este procedimento, as lamínulas foram reti radas e foi aplicada uma solução de 10 µL de tampão block I, 10 µL de tampão TNB, 5 µL de anti-digoxigenina-rodamina e 8 µL de FITC-avidina. As lâminas foram cobertas com lamínulas e incubadas a 37°C em câmara úmida durante 30 minutos. Finalizando, as lamínulas foram retiradas e as lâminas foram lavadas em solução 4xSSC/0,1% Tween 20 a 45 ˚C durante 5 minutos por 3 vezes e contracoradas com 20 µL de DAPI (VECTOR, CA) para a coloração dos cromossomos e núcleos. 47 Análise de Imagens Esta técnica utiliza uma estratégia de hibridação no qual o material genético a ser investigado, geralmente o DNA da amos tra, é usado como uma sonda. Este DNA é marcado com uma cor (por exemplo, verde, FITC), e uma quantidade igual de DNA normal é marcada com uma cor diferente (c omo o corante vermelho rodamina). As duas sondas de DNA são hibridadas simu ltaneamente a uma preparação metafásica de cromossomos normais. Quando a amos tra contém cromossomos normais, ambas as sondas estarão presentes em quanti dades iguais, e os dois corantes se combinarão para produzir uma terceira cor, ou serão canceladas uma pela outra, e removidas pelo computador. Quando a am ostra contém um excesso de material cromossômico, como cromossomos ou re giões cromossômicas adicionais, ou amplificações de genes, a cor será verde. Regiões genômicas deletadas na amostra resultarão no excesso de sonda de DNA normal, produzindo um sinal vermelho. A taxa de intensidade de cada fluorocromo é medida através do uso de um sistema de análise de imagens digital, associado a um software apropriado (Blancato, 1999). As preparações metafásicas foram examinadas em microscópio de epifluorescência Axioskop 2 Plus (Zeiss), ca pturadas e analisadas pelo programa de CGH Isis FISH Imaging System V 5.0 (M etasystem Gmbh, Althussheim, Germany). Para cada hibridação, de 20 a 30 imagen s foram capturadas, 10 das quais foram utilizadas para análise. O software permite a comparação da quantidade de DNA teste (verde) com a quantidade de DNA cont role (vermelho) hibridados ao longo da extensão de cada cromossomo e dete rmina a razão média de fluorescência vermelho/verde para cada cromossomo. Em regiões onde o núme ro de cópias de seqüências de DNA teste e referência é idêntico, espera-se que a razão de 48 fluorescência seja 1,0; quando o número re lativo de cópias de seqüências de DNA é maior no teste, a razão é maior do que 1,0; e quando o número relativo de cópias de seqüências de DNA é menor no teste, a ra zão é menor do que 1,0. Desvios da razão abaixo ou acima dos limites de 0,8-1,25 são classificados como representações significantes de sub- ou sobre-representação do número de cópias das seqüências de DNA na amostra teste. Como controle interno, testes de hibr idação utilizando DNA normal masculino (verde) versus feminino (vermelho) e depois, DNA normal masculino (vermelho) versus feminino (verde) foram utilizados para confirmar a eficiência da hibridação. Todos os cariótipos foram analisados por mais de um observador para garantir a confiabilidade do teste. Análise por Bioinformática As listas de genes reconhecidos nas re giões de interesse foram obtidas nos bancos de dados Ensembl (Sanger Institute, http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html). Após a obtenção dessas listas de genes, a ferramenta FatiGO Plus (FatiG O+), do utilitário on-line Babelomics (Al- Shahrour et al. , 2006), foi utilizada para estratific ar todos os locos existentes nas regiões de interesse, de acordo com suas propriedades biológicas, bioquímicas e funcionais. A ferramenta on-lin e PDQ-Wizard v.0.1 (Grimes et al., 2006) foi utilizada para cruzar a lista dos genes com palavras-chave de interesse. 49 Resultados 50 RESULTADOS Vinte amostras de tecido endometrial foram analisadas pe la metodologia de CGH. A Figura 1 representa o padrão de hibridação obtido. Estas amostras foram divididas em dois grupos, sendo dez amostr as de tecido endometrial eutópico no primeiro grupo e dez de tecido endometrial ectópico ovariano no segundo grupo. A análise do software Metasystem ap ontou alterações cromossômicas em ambos os grupos analisados (Tabela 2). No grupo eutópico, 6/10 amostras apresentaram alterações e no grupo ectóp ico foram encontradas alterações em 7/10 casos. As alterações observadas no grupo eutópico foram perda em 9q (dois casos) e ganhos em 1p (dois casos), 1q (três caso s), 2q, (um caso), 9q (dois casos), 11q (dois casos), 12q (um caso), 13p, (um caso ), 14p (dois casos), 14q (um caso), 15p (um caso), 16q (um caso), 17p (dois casos), 17q (dois casos), 19p (quatro casos), 19q (três casos), 20q (um caso), 21p (um caso), 21q (um caso) e 22q (três casos). O grupo ectópico apresentou perdas em 8p (u m caso), 9p (um caso ), 9q (três casos), 15q (um caso) e ganhos em 1p (um caso), 1q (três casos), 11q (dois casos), 13p, (um caso), 14p (um caso), 15p (um caso), 16q (três casos), 17p (três casos), 18p (um caso), 19p (três casos), 19q (dois ca sos), 20q (um caso), 21p (um caso), 22q (um caso) e Xq (um caso). 51 Figura 1: Padrão de hibridação obtido pe la técnica de CGH. No alto, da esquerda para a direita, metáfase observada ao mi croscópio de epifluorescência Axioskop 2 Plus (Zeiss), no filtro para DAPI, FITC, Rodamina e a sobreposição de cores. Abaixo, perfil obtido após a captura das metáfases do caso ON1. 52 Tabela 2: Alterações cromossômicas de tectadas por CGH nos dois grupos: dez amostras de tecido endometrial ectópic o e 10 amostras de tecido endometrial eutópico. ECTÓPICO EUTÓPICO O1 -9q ON1 sem alterações O2 -9q ON2 -9q O3 -9q ON3 -9q, +19p, +22q O4 +1q, -8p, +11q, +13p, +14p, +15p, -15q, +16q, +17p, +19p, +19q, +21p, +Xq ON4 +1q, +13p, +14p, +15p, +16q, +17p, +19p, +19q, +21p O5 sem alterações ON5 +1q O6 sem alterações ON6 sem alterações O7 +1p, +1q, -9p, +11q, +16q, +17p, +18p, +19p, +19q, +20q, +22q ON7 +1p, +2q, +9q, +11q, +12q, +14q, +17q, +19p, +19q, +21q, +22q O8 sem alterações ON8 sem alterações O9 +17p ON9 sem alterações O10 +1q, +16q, +19p ON10 +1p, +1q, +9q, +11q, +14p, +17p, +17q, +19p, +19q, +20q, +22q (-) = perda; (+) = ganho; vermelho = perda; verde = ganho. O = tecido de endometriose ovariana; ON = tecido de endométrio normal das mesmas pacientes com endometriose ovariana. Quando as amostras foram separadas por paciente, foram formados 10 grupos, cada um contendo uma amostra de tecido eutópico e ectópico de uma mesma paciente. Duas pacientes (O6/ON6 e O8/ON8) não apresentaram nenhuma alteração em ambos 53 os tecidos. Duas pacientes (O1/ON1 e O9 /ON9) apresentaram alteração apenas no tecido ectópico, sendo perda em 9q na paciente O1 e ganho em 17p na paciente O9. Uma paciente (O5/ON5) apresentou alteração apenas no tecido eutópico, sendo um ganho em 1q. Foram observadas alterações cromossômicas em ambos os tecidos em cinco pacientes (O2/ON2, O3/ON3, O4/ON4, O7/ON7 e O10/ON10). A paciente O2/ON2 apresentou a mesma alteração (perda em 9q) tanto no te cido eutópico quanto no ectópico. A paciente O3/ON3 mostrou perda em 9q como alteração comum nos dois tecidos, entretanto, ganhos em 19p e 22q foram encont rados apenas no tecido eutópico. Na paciente O4/ON4, todas as alterações encontradas no tecido eutópico (ganho de 1q, 13p, 14p, 15p, 16q, 17p, 19p, 19q e 21p) também foram encontradas no ectópico, no qual também se observou perda de 8p e 15q, e ganho de 11q e de Xq. A paciente O7/ON7 apresentou ganhos em 1p, 11q, 19p, 19q e 22q nos dois tecidos, mas foram encontrados ganhos em 2q, 9q, 12q, 14q, 17q e 21q apenas no tecido eutópico e ganhos em 1q, 16q, 17p, 18p e 20q, bem como perdas em 9p apenas no tecido ectópico. Por fim, a paciente O10/ON10 apresentou ganho de 1q e 19p em ambos os tecidos, porém, ganho em 16q foi encontrado no tecido ectópico e ganhos em 1p, 9q, 11q, 14p, 17p, 17q, 19q, 20q e 22q foram encontrados apenas no tecido eutópico. As Figuras 2 e 3 ilustram as alteraçõ es encontradas somando-se todas as lesões ectópicas e eutópicas, respectivamen te. Os cromossomos 3, 4, 5, 6, 7 e 10 não apresentaram quaisquer alterações. As Figuras 4 a 20 representam as alterações cromossômicas para o tecido eutópico e ectópico em cada um dos 10 pares de amostras. As regiões cromossômicas 1p 33-pter, 11q12-q13.1, 17p11.1-p12, 17q25- qter, 19, 20q11.23-qter e 22q11.2-qter apre sentaram alterações significativas, que estão descritas nas Figuras 4, 8, 14, 16, 17 e 19. 54 Figura 2: Alterações cromossômicas detectadas por CGH no grupo de 10 amostras de tecido ectópico. Perdas em vermelho e ganhos em verde. 55 Figura 3: Alterações cromossômicas detectadas por CGH no grupo de 10 amostras de tecido eutópico das pacientes com endometriose. Perdas em vermelho e ganhos em verde. 56 Figura 4: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 1 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. Figura 5: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 2 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. A barra verde representa ganho. 57 Figura 6: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 8 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. A barra vermelha representa perda. Figura 7: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 9 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras vermelhas representam perda e as verdes representam ganho. 58 Figura 8: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 11 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. Figura 9: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 12 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. A barra verde representa ganho. 59 Figura 10: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 13 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. Figura 11: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 14 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. 60 Figura 12: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 15 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho e a vermelha representa perda. Figura 13: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 16 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. 61 Figura 14: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 17 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. Figura 15: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 18 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. A barra verde representa ganho. 62 Figura 16: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 19 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. Figura 17: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 20 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. 63 Figura 18: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 21 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. Figura 19: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 22 no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. 64 Figura 20: Alterações detectadas por CGH no cromossomo X no grupo de 10 amostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras verdes representam ganho. As alterações cromossômicas significat ivas envolveram os cromossomos 1p, 11q, 17p, 17q, 19, 20q e 22q. De vido ao fato de alguma s alterações terem sido previamente detectadas em tecidos normais em 1p, 19 e 22, regiões ricas em G-C, já descritas na literatura como resultados falso-positivos por CGH (Mhawech et al. , 2002), essas regiões foram excluídas para futuras investigações. As regiões 11q, 17p e 17q não envolvem regiões de seqüências repetitivas e apresentaram alterações em mais de uma amostra, sendo, portanto selecionadas como re giões cromossômicas preferenciais para futura identificaçã o de genes envolvidos no processo de desenvolvimento da doença. 65 As listas dos genes reconhecidos nessas regiões de interesse (regiões pré- selecionadas a partir dos ensaios de CG H) foram obtidas nos bancos de dados Ensembl (Sanger Institute, http://www.ense mbl.org/Homo_sapiens/index.html), especificando-se os intervalos de band a G de interesse. Foram obtidas listas de genes, exportadas em formato textual, das regiões: 11q12.3- q13.1, 17p11.1-p12 e 17q25.3-qter. As listas foram utilizadas para triagens de genes com funções relevantes que poderiam de alguma forma influenciar a ocorrência ou comportamento das lesões endometrióticas. Após a obtenção das listas de genes, a ferramenta FatiGO Plus (FatiGO+), do utilitário on-line Babelomics (Al-Shahrour et al., 2006), foi utilizada para estratificar todos os locos existentes nas regiões de interesse, de acordo com suas propriedades biológicas, bioquímicas e funcionais. A ferramenta on-line PDQ-Wizard v.0.1 (Grimes et al., 2006) foi utilizada para cruzar a lista dos genes com palavras-chave de interesse, obtendo-se o número total e a identificação de cada pub licação pré-existente envolve ndo um determinado gene e termos como “endometriose”, “endomé trio” ou “carcinoma de ovário”. A sobreposição das duas ferramentas (FatiGo+ e PDQ Wizard) possibilitou a seleção de vários genes relevantes nas regiões de interesse, entre eles, os genes VEGFB, BIRC5 e TNFRSF13B. 66 Discussão 67 DISCUSSÃO A endometriose é uma doença ginecoló gica benigna agressiva, caracterizada pela presença de tecido endometrial ectópico (Yang et al. , 2004). Embora muitas mulheres possam apresentar focos da doença, mesmo assintomáticas (Nap et al. , 2004), ela é caracterizada por sintomas como dismenorréia, dispaneuria, dor pélvica e infertilidade (Poliness et al. , 2004). Acredita-se que cer ca de 10% da população feminina total seja afetada (Dabrosin et al. , 2002) e que 50% das pacientes com infertilidade e dor pélvica tenham endometriose (Cornillie et al., 1990). A literatura relata que de 25% a 50% das mulheres inférteis apresentam endometriose, e que de 30% a 50% das mu lheres com endometriose são inférteis (The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine, 2004). No entanto, várias questões fisiopatológicas e terapêuticas a respeito da associação entre endometriose e infertilidade permanecem não esclarecidas. Até o momento, a etiologia da doença permanece desconhecida. A endometriose na cicatriz após a cirurgia cesariana representa a única localização de implantes endometrióticos cuja etiologi a é conhecida. Acredita-se que durante o procedimento cirúrgico, quando a cavidade uterina está aberta, haja um alto risco de decidualização da implantação do endométrio (Tarkowski et al., 2001). Várias teorias têm sido propostas para explicar a etiologia da endometriose, sendo as três principais a) implantação e crescimento de tecido endometrial em locais ectópicos após o refluxo menstr ual retrógrado; b) desenvolvimento de metaplasia; c) desenvolvimento a partir de remanescentes Müllerianos. Dados epidemiológicos, cirúrgicos e patológicos questionam se as lesões peritoneais, 68 ovarianas e do septo retovaginal apresentam uma etiologia comum única ou se representam três entidades com etiolo gia e patogênese distintas (Vigano et al. , 2004). Embora a teoria do fl uxo retrógrado seja a mais aceita, diversos autores sugerem uma origem diferente para cada um dos três tipos de endometriose (Nisolle e Donnez, 1997; Giudice e Kao, 2004; Vigano et al., 2004). Diversos fatores de risco já foram de scritos para endometriose, entre eles, ciclos menstruais curtos, longa duração do fluxo menstrual, nuliparidade ou menarca precoce bem como história familial da doen ça em parentes de primeiro grau. No entanto, as causas genéticas da endome triose ainda são desc onhecidas, e pouca informação existe acerca de riscos constitutivos individuais, tais como hereditariedade e alterações genéticas so máticas que poderiam predispor à doença. Discute-se que a endometriose possua um componente genético, e que alterações cromossomo-específicas adquiridas possam estar envolvidas em sua patogênese. Dada essa origem genética desc onhecida, estudos que promovam um screening completo das alterações genômicas presentes em amostras de tecido endometriótico, bem como de tecido norm al de pacientes com endometriose, podem ser informativos na busca por um possível marcador genético para a doença, além de contribuir para a definição de su a origem. Dessa forma, optamos pela metodologia de CGH, que permite um screening total para perdas e ganhos genômicos de uma amostra determinada. Neste estudo avaliamos 20 amostras, sendo 10 de endometriose ovariana (tecido ectópico) e 10 de tecido endometr ial normal (tecido eutópico) das mesmas pacientes. Diversas alterações envolve ndo principalmente ganhos de regiões 69 cromossômicas foram observadas em ambos os tecidos, após análise citogenética molecular por CGH. A literatura é bastante controversa em relação aos aspectos genéticos da endometriose e poucos estudos, utilizando a metodologia de CGH, foram realizados. Utilizando a técnica de CGH, existem rela tos da total ausência de alterações cromossômicas em todas as amostras de endometriose analisadas (Mhawech et al. , 2002), bem como a detecção de perdas e ganhos de regiões cromossômicas em 15/18 amostras (83%), sendo principalm ente perdas em 1p 32-36, 5p, 6q, 7p14- p22ter e 22q12.3-qter e ganhos em 6q e 17q (Gogusev et al. , 1999). Em nosso estudo, encontramos alterações em 7/ 10 amostras (70%) de endometriomas ovarianos, e diferentemente dos outros auto res, observamos principalmente ganhos em 1p, 1q, 11q, 13p, 14p, 15p, 16q, 17p , 18p, 19p, 19q, 20q, 21p, 22q e Xq e perdas em 8p, 9p, 9q e 15q (Figura 2). Essa discrepância de resultados pode ser explicada pela diferença no número amostral utilizado e pela heterogeneidad e da origem da amostra. Mhawech e colaboradores (2002) avaliaram tecido endo metriótico de pacientes com carcinomas de ovário provenientes da endometriose e, apesar do quadro clínico agressivo, nenhuma alteração cromossômica foi encont rada no tecido endometriótico. Isto sugere que não há uma associação estabel ecida entre alterações genômicas e pior prognóstico, embora o estudo tenha sido realizado com apenas três pacientes. Nossa análise também não encontrou nenhuma correlação entre a presença ou ausência de alterações cromossômicas e um mau prog nóstico, de acordo com os dados do seguimento clínico dessas pacientes. O fato das pacientes O4/ON4, O7/ON7 e 70 O10/ON10 apresentarem mais alterações cromossômicas que as outras não foi relacionado com nenhuma complicação ou agravante da sintomatologia clínica. Nenhuma das pacientes evoluiu para quadro de tumor de ovário após seguimento clínico de três anos. Não foi observad a nenhuma diferença clínica, tanto nas pacientes com perfil cromo ssômico normal, quanto na quelas que apresentaram várias alterações. O outro estudo (Gogusev et al. , 1999) analisou tecido endometriótico de origens diferentes, sendo 6 implantes pe ritoneais, 2 nódulos endometrióticos umbilicais e 10 endometriomas ovarianos. Nosso estudo inclui u apenas tecido endometriótico ovariano, visando diminuir a heterogeneidade amostral, já que a endometriose nas diferentes localizações pode apresentar alterações genéticas distintas entre si, bem como diferentes origens. A investigação do tecido endometrial eutópico de mulheres com endometriose é outra questão bastante interessante. Um estudo utilizando a técnica de CGH array mostrou que todas as cinco amostras estu dadas apresentaram diversas alterações em vários cromossomos, sendo 1p, 3p e 4p as regiões mais comumente envolvidas em alterações genômicas (Guo et al. , 2004). Além disso, houve uma heterogeneidade considerável nas alteraçõ es entre as pacientes, já que nenhuma alteração foi comum entre elas, provavelmente um resultado da heterogeneidade em relação à idade do surgimento da doença, estadio e outros fatores desconhecidos. Em nosso estudo, dentre as 10 amostras de tecido endometrial eutópico das pacientes com endometriose, seis aprese ntaram alguma alteração cromossômica, envolvendo perda em 9q e ganhos em 1 p, 1q, 2q, 9q, 11q, 12q, 13p, 14p, 14q, 15p, 71 16q, 17p, 17q, 19p, 19q, 20q, 21p, 21q e 22q (Figura 3). Estes resultados confirmam que o endométrio histologicamente no rmal de mulheres com endometriose apresenta alterações genômicas, como prev iamente descrito na literatura (Giudice e Kao, 2004). A presença de alterações nas am ostras de tecido eutópico de mulheres afetadas confirma a predisposição desse en dométrio ao desenvolvimento da doença, podendo ser consideradas como alterações primárias para a doença. Além disso, observamos que na maiori a dos nossos casos, as alterações encontradas no tecido eutópico não fo ram as mesmas observadas no tecido ectópico, com exceção do caso O2/ON2 onde a alteração no tecido eutópico foi a mesma no ectópico (perda de 9q). Em um caso (O4/ON4), todas as alterações encontradas no tecido normal foram observ adas também no tecido endometriótico, porém este apresentou algumas outras al ém das que foram encontradas no tecido eutópico. Em outros três casos (O3/ON3, O7/ON7 e O10/ON10), ambos os tecidos compartilharam apenas algumas das al terações. Esta aparente falta de homogeneidade poderia ser devido à possib ilidade de múltiplas vias que levam à endometriose. A observação de alterações diferentes nos dois tecidos da mesma paciente coloca em dúvida a aplicabilidade da teoria de Sampson em nossas amostras. Pela teoria do fluxo reverso, supõe-se que as mesmas alterações encontradas no endométrio normal fossem encontradas no tecido endometriótico e que este pudesse apresentar alterações extras que seriam responsáveis por características favoráveis ao desenvolvi mento da endometriose, como adesão, proliferação celular, controle negati vo da apoptose e an giogênese, que o diferenciariam do tecido histologicamente normal. 72 Embora a teoria mais aceita seja a teoria da implantação de Sampson (Sampson, 1927), existem linhas de pesq uisa sugerindo que a endometriose ovariana possui uma origem diferente da peritoneal. Postula-se que a origem da lesão peritoneal ocorra, de fato, por impl antação de células provenientes do fluxo retrógrado, e que a lesão ovariana origina-se por metaplasia do tecido ovariano, isto é, indiferenciação e rediferenciação da célula ovariana, com mudança de características adquirindo um fenótipo endometrial (Nisolle e Donnez, 1997). Ou seja, a lesão seria originada de células ovarianas alteradas, e não do endométrio. Um dos argumentos que sustenta m essa teoria é a presença de endometriomas em pacientes com a síndrome de Rokitansky-Küster-Hauser, que não possuem útero e, portanto, não sofrem menstruação retrógrada (Rosenfeld e Lecher, 1981). Dessa forma, nossos resultados ev idenciando alterações cromossômicas diferentes entre os tecidos ectópico e eu tópico podem corroborar com os dados da literatura, que sugerem origen s diferentes para as lesões peritoneais e ovarianas. O fato não exclui a possibilidade das pa cientes que apresentaram um tecido endometrial geneticamente alterado, apresentarem uma maior predisposição para desenvolvimento de endometr iose peritoneal devido ao mecanismo da menstruação retrógrada. A metaplasia do epitélio celômico é uma das três teorias que tem sido propostas para explicar a patogênese da endometriose ovariana típica, além da inversão e progressiva invaginação do córtex ovariano após o acúmulo de fragmentos menstruais derivados do sa ngramento de implantes endometrióticos superficiais localizados na superfície ov ariana, e do envolvimento secundário de cistos ovarianos funcionais por implantes endometriais localizados na superfície 73 ovariana (Vigano et al. , 2004). A hipótese da metaplasia celômica propõe que a membrana celômica original sofre meta plasia formando glândulas e estroma endometriais típicos. Essa teoria é su stentada pela descrição de casos de endometriose nas quais não ocorre menstruação retrógrada. As alterações cromossômicas significativas nas amostras analisadas envolveram os cromossomos 1p, 11q, 17p, 17q, 19, 20q e 22q. As regiões 1p, 19 e 22 não foram consideradas para análise, devi do à alta freqüência de polimorfismos e a região 20q apresentou-se alterada em somente uma amostra. Desta forma, as regiões 11q, 17p e 17q foram consideradas regiões alvo, justificando a aplicação de ferramentas de bioinformática para seu mapeamento. Entre os inúmeros genes contidos nessa s regiões de interesse, identificamos vários deles relacionados à angiogênese, regulação do ciclo celular, resposta imunitária e adesão celular. Na região 11q12.3-q13.1, encontram-se diversos genes relevantes, entre eles: RELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 3, p65 [avian] ), que atua no desenvolvimento tecidual e como regulador negativo da apoptose; CFL1 (cofilin 1[non-muscle]), que atua na diferenciação celular e na regulação negativa da apoptose; SYVN1 ( synovial apoptosis in hibitor 1, synoviolin ), responsável pela regulação negativa da apoptose; VEGFB (vascular endothelial growth factor B ), que atua na regulação positiva da proliferaç ão celular e regulação do ciclo celular; MARK2 (MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 ), atuando na morfogênese da célula e nas cascatas de sinalização intracelular; e HTATIP ( HIV-1 Tat interacting protein) responsável pela regulação do crescime nto celular e pela via de sinalização do receptor de andrógeno e hormônios esteróides. 74 A região 17p11.1-p12 também contem genes relevantes, como UBB (ubiquitin B), responsável pela morfogênese celular durante a diferenciação, desenvolvimento celular e migração celular; MAP2K3 (mitogen-activated protein kinase 3 ), que atua em respostas inflamatórias, processos me tabólicos de citocinas e como regulador positivo da transcrição; SREBF1 ( sterol regulatory element binding transcription factor 1), atuando em processos metabólico s de esteróides e do colesterol; TOP3A (topoisomerase [DNA] III alpha ), atuando na fase M do ciclo celular meiótico e na duplicação do DNA; TNFRSF13B (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 13B), que atua na resposta imunitária como receptor do Fator de Necrose Tumoral ( TNF); e MAPK7 ( mitogen-activated protein kinase 7 ), responsável pela morfogênese de órgãos e angiogênese. Na região 17q25-qter encontramos os seguintes genes cujas funções são relevantes: PDE6G (phosphodiesterase 6G, cGMP-specific, Rod, gamma) que atua na cascata de sinalização intracel ular e na transdução de si nais ligados a receptores de superfície celular; BIRC5 (baculoviral IAP repeat-containing 5 [survivin]), responsável principalmente pela regulação negativa da apoptose, regulação do ciclo celular e checkpoint do ciclo celular; CARD14 ( caspase recruitment do main family, member 14), atuando principalmente na regulação da apoptose; SOCS3 ( suppressor of cytokine signaling 3), que atua na regulação negativa da apoptose e na regulação do crescimento celular; CBX4 (chromobox homolog 4 [PC class homolog, Drosophila] ) também atuando na regulação negativa da apoptose bem como na organização dos cromossomos; PSCD1 (pleckstrin homolog, Sec7 and coiled-coil domains 1 [cytohesin 1]) responsável por adesão celular e tran sdução de sinal da proteína ras; MAFG (v- maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog G [avian] ), que atua na 75 morfogênese de tecidos e no desenvolvimento epidérmico; e LGALS3BP ( lectin, galactoside-binding, soluble, 3 binding protein ), responsável pela adesão celular e comunicação celular. Estes dados evidenciam que as regi ões alteradas mais significativas observadas neste trabalho contêm gene s candidatos que controlam processos celulares. A metodologia de CGH mostrou-se efic az para a identificação de regiões críticas e genes possivelmente relacionados à fisiopatologia da endometriose. Em estudo piloto realizado, investigamos três genes - VEGFB, BIRC5 e TNFRSF13B – presentes nessas regiões críticas, pela técnica de PCR em tempo real. No entanto, os resultados preliminares obtidos não foram conclusivos (Meola, 2008; personal communication). Esta foi a primeira investigação de perdas e ganhos cromossômicos utilizando a metodologia de CGH em amostras de pacientes brasileiras com endometriose. Também não há na literatura relatos de um estudo caso-c ontrole autólogo envolvendo amostras de endometriose ova riana e endométrio normal das mesmas pacientes, investigadas pela técnica de CGH. A detecção de regiões cromossômicas é etapa fundamental para a identificaçã o futura de genes relacionados ao desenvolvimento da doença e de marcadores moleculares para diagnóstico da doença. 76 Conclusões 77 CONCLUSÕES (1) A técnica de CGH permitiu a iden tificação de perdas e ganhos em diferentes regiões cromossômicas, sendo que o cariótipo foi normal em 30% das amostras de endometriomas ovarianos e em 40% das amostras de endométrio eutópico das pacientes com diagnóstico de endometriose. (2) A presença de perdas e ganhos de regiões cromossômicas no endométrio eutópico, histologicamente normal, de mu lheres com endometriose ovariana, pode ser considerada como alteração primária ao desenvolvimento da doença. (3) As regiões cromossômicas de alte rações significativas detectadas em amostras de tecido endometrial eutópi co e ectópico contém diversos genes relacionados à adesão celular, resposta imun itária, proliferação celular e controle da apoptose. (4) A metodologia de CGH permitiu a detecção das regiões cromossômicas 11q12.3-q13.1, 17p11.1-p12 e 17q25.3-qter como regiões críticas, direcionando investigações futuras para identificação de genes associados à endometriose. 78 Referências 79 REFERÊNCIAS AL-FOZAN, H.; TULANDI, T. Left latera l predisposition of endometriosis and endometrioma. Obstet Gynecol, v.101, n.1, p.164-6, Jan, 2003. AL-SHAHROUR, F., MINGUEZ, P., TARRA GA, J., MONTANER, D., ALLOZA, E., VAQUERIZAS, J. M., CONDE, L., BLASCHKE , C., VERA, J.; DOPAZO, J. BABELOMICS: a systems biology perspective in the f unctional annotation of genome-scale experiments. Nucleic Acids Res, v.34, n.Web Server issue, p.W472-6, Jul 1, 2006. AMERICAN SOCIETY FOR REPRODUCTIVE ME DICINE. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril, v.67, n.5, p.817-21, May, 1997. BELIARD, A., DONNEZ, J., NI SOLLE, M.; FOIDART, J. M. 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Department affiliations: a Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 14049-900, Brazil. b Department of Gynecology and Obstetrics, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 14049-900, Brazil. c Division of Applied Molecular Oncology from the Princess Margaret Hospital, Ontario Cancer Institute, University Health Network, Toronto, Canada. Financial support: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasília, Distrito Federal, Brazil; and Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência 90 (FAEPA/HCFMRP-USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. JAS and MY were supported by the National Cancer Institute of Canada with funds from the Canadian Cancer Society.

Objective: To identify genomic alterations in ectopic and eutopic endometrial tissue of women with ovarian endometriosis. Design: The comparison of genomic data detected in each type of tissue. Setting: University hospital. Patients: Ten patients with confirmed diagnosis of endometriosis. Interventions: Comparative Genomic Hybridization (CGH) was performed to identify genomic alteration s in the ectopic and eutopi c tissues from the same patients. Main Outcome Measures: Gain and loss of chromosomal regions by Comparative Genomic Hybridization analysis.

and Conclusions: In the eutopic group, 6/10 samples presented alterations and 7/10 cases show ed alterations in the ecto pic tissue. The presence of losses and gains of chromoso mic regions in the histol ogically normal eutopic endometrium from women with ovarian en dometriosis can be considered as a primary alteration in the development of the disease. The CGH methodology allowed the detection of 11q12.3-q13. 1, 17p11.1-p12 and 17q25.3-qt er as critical regions, leading to future investigations for the identification of genes associated to endometriosis.

endometriosis, infertility, comp arative genomic hybridization, cytogenetics, endometrium. 91

Endometriosis is a common benign gyn ecological disorder, very aggressive, characterized by the presence of ectopic endometrial tissue. Th e ectopic tissue is histologically identical to the normal (eutopic), differing in functional and biochemical aspects. It is characterized by dysmenorrea, dyspaneuria, pelvic pain and infertility or a total absence of symptoms (1, 2). I t i s r e p o r t e d t h a t a r o u n d 1 0 % o f t h e f e m a l e p o p u l a t i o n a n d 5 0 % o f t h e patients with infertility and pelvic pain present endometriosi s. This incidence increases along the reproductive age, it is rare before menarche and tends to decrease after menopause. In addition, a polygenic and multifactorial tendency has been reported, as well as a higher risk fo r the disease (5-8%) in women with family history of the disease in first grade relatives (3, 4). Although it is one of the most studied gynecological abnormalities, its etiology has not been clarified. The most popula r theory to explain it is Sampson’s implantation theory, which postulates that the endometrial cells exfoliated during menstruation suffer reflux through the uterine tubes, adhere and proliferate in ectopic sites, mainly peritoneum, ovary an d retovaginal septum (5). On the other hand, considering retrograde menstruation as a nearly universal phenomenon, it is difficult to explain why only a fraction of women develops endometriosis. Gebel et al. (6) proposed that the percentage of me nstrual endometriotic cells that suffer apoptosis in women with endometriosis is lower in comparison to the endometrial tissue of fertile controls, increasing the number of cells that survive and keeping physiological activity. Some studies suggest a multidimensional etiology including hereditary, hormonal and immunological fact ors (7, 8). At cellular level, the disease 92 is characterized by monoclon al growth and can present ma lignant features as local invasion and metastasis (9). Endometriosis suffers malignant transformation in a frequency of 0.7% to 1%; however, this frequency can be even high er once the tumor can destroy the original endometriotic tissue and elim inate the histopathological evidences of endometriosis (10). Nevertheless, since endometriosis ha s been associated to infertility, the correlation between the disease and cancer must be carefully interpreted, as an increased risk might be due to nulliparity and not endometriosis per se (11). Comparative Genomic Hybridization and Endometriosis No specific chromosomal alteration has be en identified in endometriotic tissue by karyotyping analysis, probably due to the limitations regarding the cell culture. (12). The comparative genomi c hybridization (CGH) is a versatile technique that allows the whole genome to be analyzed in one single experiment, without the necessity of metaphase chromosomes from the sample, eliminating the cell culture (13). There are some reports on CGH as a tool for the detection of genetic alterations in endometriosis. Gogusev et al. (14) examin ed 18 endometriotic lesions from patients in advanced stage of the di sease, and recurrent alterations in gene copy number were found in 15 out of 18 cases (83%). Genomic losses in chromosomes 1p and 22q were detected in 50% of the cases. Other common losses were observed at 5p, 6q, 7p, 9q, 16 and 17q. Gains were found at 1q, 6q, 7q and 17q. The same group also evaluated by CGH a permanent cell lineage derived from endometriosis (FbEM-1) and observed that gains were more common than losses, as 93 a significant increase in DNA sequence copy number was detected at 1q, 5p, 6p and 17q (15). This methodology was also applied in th e evaluation of genetic alterations in ovary carcinomas arising within endometr iosis (16). Chromosome aberrations were observed in the three cases of ovary carcin omas, but no alteration was detected in the endometriotic tissue in neither the ca ses. The authors concluded that these altered regions might contain tumor suppre ssor genes or oncogenes responsible for the malignant transformation of endometriosis. This study aimed to detect chromosomal imbalance, by CGH, in ectopic tissue samples from ovarian endometriomas and eutopic tissue from the same patients, and, consequently, the evaluation of gains and/or losses of chromosomal regions which might be involved in the developmental process of the disease. 94

This study was developed at the Labo ratory of Molecular Cytogenetics, Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto (FMRP-USP), Brazil, in association with the Department of Gynecology and Obstetrics (Human Reproduction Division) from the same institution, and at the Division of Applied Molecular Oncology from the Princess Margaret Ho spital, Ontario Cancer Institute, University Health Network, Toronto, Canada. The project was approved by the Research Ethics Committee (CEP) of the University Hospit al from the FMRP-USP, process number 11736/2004. Written informed consent was obtained from each patient. Samples Twenty samples were collected from 10 patients following the inclusion criteria: women in reproductive age (24 to 45 years), with regu lar menstrual cycles (25 to 35 days of interval) and no history of any hormonal therapy during the last six months before the collection; the samples were obtained during the proliferative phase of the menstrual cycle (1st to 12th day). The patients were divided into two groups: the eutopic group (control), where histological normal endometrial biop sies were collected using a Novak curette from 10 patients with confirmed diagnosis of endometriosis; and the ectopic group, composed by 10 ovarian endometriomas samples from the same patients, referred to our service by the Endoscopy and Pelvic Pa in Ambulatory (AGDE) and the Infertility Ambulatory of the University Hospital of the FMRP-USP due to pelvic pain and/or infertility indication. All the biopsies were collected by laparoscopy and submitted to histopathological analysis. The patients’ characterization concerning the lesion origin 95 and staging is observed in Table 1. The endometriosis stage was settled in agreement with the American Society for Reproductive Medicine classification (17). The samples were stored at -80 0C after cryopreservation treatment with Tissue- Teck® O.C.T. Compound (Sakura Finetek USA. In c., Torrance, CA) for DNA extraction. Comparative Genomic Hybridization The protocol for DNA amplification and labeling by SCOMP was performed as previously described with some modificati ons (18). Briefly, the probe (eutopic or ectopic endometrial tissue DNA) and no rmal reference DNA (Promega) were differentially labeled using, respectively, biotin-16-dU TP and digoxigenin-11-dUTP. Equal amounts (8µg) of labeled endometriotic DNA, and normal reference DNA were co-precipitated with 10 µL of Human Cot-1 DNA (1 mg /mL). The labeled probe DNA was resuspended in 12 µL hybridization mixture comp osed of 100% formamide and 30% dextran sulfato/4xSSC. After denatura tion, the labeled DN A probes were co- hybridized to normal human metaphase sp reads prepared by phytohemagglutinin- stimulated peripheral blood lymphocyte cult ure. The hybridization was carried out at 37˚C for 72h. The slides were washed three times at 45 ˚C for 5 min each in 50% formamide/2xSSC, followed by three washes at 45 ˚C in 0.1% SDS/0.1xSSC and three washes at 45 ˚C in 2xSSC. Biotinylated DNA se quences were visualized by fluorescein isothyocyanate (FITC)-conjuga ted avidin whereas digoxigenin-labeled sequences were detected using anti -digoxigenin-rhodamine. Chromosome preparations were counterstained with 4’-6- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 96 Digital image analysis The metaphases were examined using a epifluorescence microscope (Zeiss), captured and analyzed by the Metasystem (version 4.5.0.28) CGH program. For each sample, 20-30 images were captured, and the data from 10-12 representations of each chromosome were combined. Ga ins and losses of chromosomes or chromosomal regions were detected on the basis of the ratio profiles deviating from the green to red balance value of 1.0 within 0.8-1.2 limits. The threshold values were determined according to previous re ports (14, 16). The centromeric, the heterochromatic regions and the short ar m of acrocentric chromosomes were not included in the interpretati on of gains and lo sses. Chromosome Y was also excluded from the analysis because the reference and test DNAs were from females. 97

Twenty endometrial tissue samples, ten eutopic endometrial tissue samples and ten ovarian endometriomas, were an alyzed by CGH. We have detected chromosomal alterations in both groups, summarized in Table 2. In the control group, 6/10 samples presented alterations, and in the ectopic group they were found in 7/10 cases. The alteration s observed in the control gr oup were loss at 9q (two cases) and gains at 1p (two cases), 1q (three cases), 2q, (one case), 9q (two cases), 11q (two cases), 12q (one case), 13p (one case), 14p (two cases), 14q (one case), 15p (one case), 17p (two cases), 17q (t wo cases), 19p (four cases), 19q (three cases), 20q (one case), 21p (one case), 21q (one case) and 22q (three cases). The endometriomas presented losses at 8p (one ca se), 9p (one case), 9q (three cases), 15q (one case) and gains at 1p (one case ), 1q (three cases), 11q (two cases), 13p (one case), 14p (one case), 15p (one ca se), 16q (three cases), 17p (three cases), 18p (one case), 19p (three cases), 19q (two cases), 20q (one case), 21p (one case), 22q (one case) and Xq (one case). Comparative analysis of eu topic and ectopic tissue fr om each patient showed two patients (O6/ON6 and O8/ON8) without al terations in both tissues. Two patients (O1/ON1 and O9/ON9) presented alteration on ly in the ectopic tissue, as loss at 9q in patient O1 and gain at 17p in pati ent O9. One patient (O5/ON5) presented alteration only in the euto pic tissue (gain in 1q). Ch romosomal alterations were observed in both tissues in five patients (O2/ON2, O3/ON3, O4/ON4, O7/ON7 and O10/ON10). Patient O2/ON2 presented the same alteration (loss at 9q) both in the eutopic and in the ectopic tissue. Patient O3/ON3 show ed loss at 9q as a common alteration in both tissues, however, gain s at 19p and 22q were f o u n d o n l y i n t h e 98 eutopic tissue. All the alterations observed in the eutopic tissue (gain at 1q, 13p, 14p, 15p, 16q, 17p, 19p, 19q and 21p) from patient O4/ON4 were also found in the ectopic tissue, in which loss at 8p and 15q, and gain at 11q and Xq were also observed. Patient O7/ON7 presented gain s at 1p, 11q, 19p, 19q and 22q in both tissues, but gains were observed at 2q , 9q, 12q, 14q, 17q and 21q only in the eutopic tissue and gains at 1q, 16q, 17p, 18p and 20q, as well as losses at 9p were reported only in the ectopic tissue. At la st, patient O10/ON10 presented gain at 1q and 19p in both tissues, however, gain at 16q was found in the ectopic tissue and gains at 1p, 9q, 11q, 14p , 17p, 17q, 19q, 20q and 22q were found only in the eutopic tissue. The increased number of chromosomal alterations in patients O4/ON4, O7/ON7 and O10/ON10 did not sh ow any correlation to the symptoms severity or poor prognosis. None of the patients presented ovarian tumor within a three-year-follow up. Figures 1 and 2 illustrate all the altera tions found in the ectopic and eutopic groups respectively. Chromosomes 3, 4, 5, 6, 7 and 10 did not show alteration. Chromosomal regions 1p33-pter, 11q12- q13.1, 17p11.1-p12, 17q25-qter, 19, 20q11.23-qter and 22q11.2-qter presented significant alterations. The regions 11q, 17p and 17q were selected as critical re gions because they in volve non-centromeric regions (or any other repetitive sequence re gion) and were detected in more than one sample. Moreover, some aberrations were previously described in normal tissues at 1p, 19 and 22, G-C rich regions known to produce false-positive results by CGH (16). The lists of genes mapped to these regi ons were obtained in the database Ensembl (Sanger Institute, http://www.ensem bl.org/Homo_sapiens/index.html), at 99 specific G-banding intervals. The lists we re obtained for regions: 11q12.3-q13.1, 17p11.1-p12 and 17q25.3-qter. A ll of them were used for the selection of relevant function genes that could somehow influe nce the occurrence or behavior of the endometriotic lesions. T h e F a t i G O P l u s ( F a t i G O + ) t o o l , f r o m Babelomics on-line system (19), was u s e d t o s t r a t i f y a l l l o c i i n t h e r e g i o n s of interest, according to their biological, biochemical, and functional properties. Th e PDQ-Wizard v.0.1 (20) on-line tool was used to cross match the list of genes with specific keywords (“endometriosis”, “endometrium” or “ovarian carcinoma”), result ing in the identification of publications involving each specific gene. 100

Many theories have been proposed to explain the etiology of endometriosis. Although the retrograde reflux is the mo st popular theory, some authors suggest a different theory for each one of the three types of endometriosis (21-23). It has been discussed that endometriosis has a ge netic component and that acquired chromosome-specific aberrati ons could be involved in its pathogenesis. Genetic studies providing a complete screening of the genomic aberrations present in the endometriotic tissue, as well as in normal tissue from the patients, can be extremely informative in the search for a possible genetic marker for the disease. In this study we evaluated 10 ovarian endometriomas samples (ectopic tissue) and 10 normal endometrial samples from the same patients (eutopic tissue) by the CGH methodology. Many alterations involvi ng mainly gains of chromosomal regions were observed in both tissu es. As far as we know, ther e are no reports regarding genomic losses and gains by CGH in Brazilian patients, comparing ovarian endometriomas and normal endometrium. The literature is unclear about the genetics of endometriosis and there are few studies using CGH. There are reports of to tal absence of aberra tions detected by CGH in all endometriosis samples (16) as well as the detection of gains and losses at chromosomic regions in 15 out of 18 endometr iotic samples (83%), mainly losses at 1p32-36, 5p, 6q, 7p14-p22ter and 22q12.3-qter and gains at 6q and 17q (14). We found alterations in seven out of 10 ov arian endometriomas samples (70%) and, differently from others, we observed ma inly gains at 1p, 1q, 11q, 13p, 14p, 15p, 16q, 17p, 18p, 19p, 19q, 20q, 21p, 22q and Xq and losses at 8p, 9p, 9q and 15q. 101 This discrepancy can be explained by the difference in the sample number and by the heterogeneity of the sample or igin. Mhawech et al. (16) evaluated endometriotic tissue from patients wi th ovarian carcinoma arising within endometriosis and, despite of the poor pr ognosis, no chromosomal alteration was found in the endometriotic tissue. This suggests that there are no established correlations between genomic alterations an d poor prognosis, although this study has been performed with only three patients. We also did not observe any correlation between either presence or absence of chro mosomal alterations and clinical follow- up. A study using array CGH showed that all the five samples analyzed presented many alterations in different chromosome s but mainly at 1 p, 3p and 4p (24). Besides, there was a considerable diversity in the alterations among the patients, as they did not share any common alteration, probab ly due to the samples heterogeneity. Among our control group, corresponding to normal endometrium from the patients, 60% (6/10) presented chromosomal alterations involving loss at 9q and gains at 1p, 1q, 2q, 9q, 11q, 12q, 13p, 14p, 14q, 15p, 16q, 17p, 17q, 19p, 19q, 20q, 21p, 21q and 22q. These results emphasize that the histologically normal endometrium from women with endometrio sis present genomic alterations, as previously described (22). Moreover, in the majority of our samples, the alterations observed in the eutopic ti ssue were different from th e ectopic tissue, with the exception of case O2/ON2 where loss at 9q was common to both tissues. In one case (O4/ON4), all alterations found in the no rmal tissue were also observed in the endometriotic tissue. In three other case s (O3/ON3, O7/ON7 and O10/ON10), both tissues shared only some alterations. This apparently lack of homogeneity could be a 102 reflex of the patients heterogeneity, or the possibility of multip le paths leading to endometriosis. The observation of different alterations in both tissues from the same patient challenges the applicability or Sa mpson`s theory in ou r samples. By the retrograde reflux theory, it is supposed that the same alterations found in the normal endometrium were also foun d in the endometriotic tissu e and this should present extra alterations responsible for adhesion, cell proliferation and angiogenesis, which would differentiate it from the histologically normal tissue. The celomic metaplasia is one of the th ree theories that have been proposed to explain the pathogenesis of the typical ovarian endometr iosis, in addition to the inversion and progressive invagination of the ovarian cortex af ter the accumulation of menstrual debris from bleeding of endo metrial implants, which are located on the ovarian surface, and the s econdary involvement of functional ovarian cysts by endometrial implants located on the ovar ian surface (23). The celomic metaplasia hypothesis states that the original celomic membrane undergoes metaplasia, forming typical endometrial glands and stroma. This theory is supported by the description of endometriosis in Rokitansky-Küster-Hauser syndrome patients, who can not present retrograde menstruation (25). Considering that peritoneal, ovarian and rectovaginal septum lesions are distinct, we observed alterations that ca n contribute to the development of the ovarian endometrioma, especially altera tions at 11q12.3-q13. 1, 17p11.1-p12 and 17q25-qter. Some of these genomic alterations cont ain genes related to angiogenesis, cell cycle regulation, immune response and cell adhesion. At region 11q12.3-q13.1 there are many relevant genes such as: RELA (v-rel reticuloendothel iosis viral oncogene 103 homolog A, nuclear factor of kappa light po lypeptide gene enhancer in B-cells 3, p65 [avian]), responsible for tissue development and in the negative control of apoptosis; CFL1 (cofilin 1[non-muscle] ), that plays a role in cell differentiation and in the negative control of apoptosis; SYVN1 ( synovial apoptosis in hibitor 1, synoviolin ), responsible for negative regulation of apoptosis; VEGFB (vascular endothelial growth factor B), that plays a role in the positive regulation of cell proliferation and cell cycle regulation; MARK2 ( MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 ) , a c t i n g i n c e l l morphogenesis and intracellular signaling pathways; and HTATIP ( HIV-1 Tat interacting protein) responsible for cell growth regulation and signaling pathways of the androgen and steroid hormones receptors. Region 17p11.1-p12 also contains relevant genes for the endometriosis process, such as UBB ( ubiquitin B ), responsible for cell morphogenesis during differentiation and cell migration; MAP2K3 (mitogen-activated protein kinase 3), that plays a role in inflamatory responses, cytokines metabolic processes and as a positive regulator of transcription; SREBF1 ( sterol regulatory element binding transcription factor 1 ), acting in steroid and chol esterol metabolic processes; TOP3A (topoisomerase [DNA] III alpha ), acting in the M phase of the meiotic cell cycle and DNA replication; TNFRSF13B (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 13B), that plays a role in the immune response; and MAPK7 ( mitogen-activated protein kinase 7), responsible for organ morphogenesis and angiogenesis. At region 17q25-qter we find the foll owing genes, whose functions can be related to the endometriotic process: PDE6G (phosphodiesterase 6G, cGMP-specific, Rod, gamma ) that plays a role in the intracellular signaling pathways and signal transduction related to cell surface receptors; BIRC5 (baculoviral IAP repeat- 104 containing 5 [survivin]), responsible mainly by negative regulation of apoptosis, and cell cycle regulation and checkpoint; CARD14 ( caspase recruitment domain family, member 14 ), acting mainly in the apoptosis regulation; SOCS3 ( suppressor of cytokine signaling 3) , that plays a role in the negati ve regulation of apoptosis and cell growth regulation; CBX4 ( chromobox homolog 4 [PC class homolog, Drosophila]) , a l s o a c t i n g i n t h e n e g a t i v e r e g u l a t i o n o f a p o p t o s i s a s w e l l a s i n t h e chromosomal organization; PSCD1 (pleckstrin homolog, Sec7 and coiled-coil domains 1 [cytohesin 1] ) responsible for cell adhesion and ras protein signal transduction; MAFG (v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog G [avian]), which acts in the tissue morphogenesis and epidermic development; and LGALS3BP (lectin, galactoside-binding, soluble, 3 binding protein ), responsible for cell adhesion, response to cell defense and cell communication. This is the first investigation of ch romosomal losses and gains by the CGH methodology in Brazilian endometriosis samp les. Also, there is no report in the literature of an autologous case-control study regard ing ovarian endometriosis samples and normal endometrium from the same patients. The presence of losses and gains of chro mosomic regions in the histologically normal eutopic endometrium from wome n with ovarian endometriosis can be considered as a primary alteration in the development of the disease. The CGH methodology allowed the detection of chromosomic regions 11q12.3-q13.1, 17p11.1- p12 and 17q25.3-qter as critical regions, leading to future investigations for the identification of genes associated to endometriosis. 105

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ECTOPIC EUTOPIC O1 -9q ON1 - O2 -9q ON2 -9q O3 -9q ON3 -9q, +19p, +22q O4 +1q, -8p, +11q, +13p, +14p, +15p, -15q, +16q, +17p, +19p, +19q, +21p, +Xq ON4 +1q, +13p, +14p, +15p, +16q, +17p, +19p, +19q, +21p O5 - ON5 +1q O6 - ON6 - O8 - ON8 - O9 +17p ON9 - O10 +1q, +16q, +19p ON10 +1p, +1q, +9q, +11q, +14p, +17p, +17q, +19p, +19q, +20q, +22q O11 +1p, +1q, -9p, +11q, +16q, +17p, +18p, +19p, +19q, +20q, +22q ON11 +1p, +2q, +9q, +11q, +12q, +14q, +17q, +19p, +19q, +21q, +22q (-): loss; (+): gain, red: loss, green: gain. O = ovarian endometrioma tissue; ON = normal endometrium tissue from the same patients with ovarian endometrioma. 110 Figure 1: Chromosomal aberrations detected by CGH in the group of 10 ectopic tissue samples. Losses in red and gains in green. 111 Figure 2: Chromosomal aberrations detected by CGH in the group of 10 eutopic tissue samples from the endometriosis patients. Losses in red and gains in green.