{"paper_id":"fd56ece6-899f-4586-8c89-972349f2baf0","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \nDEPARTAMENTO DE GENÉTICA \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nHIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA EM ENDOMETRIOSE \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLUCIANA CARICATI VEIGA CASTELLI \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO – SP \n2008 \n\nLuciana Caricati Veiga Castelli \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nHIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA EM ENDOMETRIOSE \n \n \nCOMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION IN ENDOMETRIOSIS  \n \n \n \n \n \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto, Universidade de São Paulo – USP \ncomo requisito parcial para obtenção do título de \nDoutor em Ciências, Área de Concentração: \nGenética \n \n \nOrientadora: Profa Dra Lucia Regina Martelli \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO – SP \n2008 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n \n \n \n          Veiga-Castelli, Luciana Caricati \nHibridação genômica comparativa em endometriose. Ribeirão \nPreto, 2008. \n111 p. : il. ; 30cm \n \nTese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto/USP. Área de concentração: Genética. \nOrientador: Martelli, Lucia Regina. \n \n1. Endometriose. 2. Hibridação  Genômica Comparativa. 3. \nCitogenética. 4. Infertilidade.  \n \n \n\nFOLHA DE APROVAÇÃO \n \n \nLuciana Caricati Veiga Castelli \nHibridação genômica comparativa em endometriose  \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto, Universidade de São Paulo – USP \ncomo requisito parcial para obtenção do título de \nDoutor em Ciências, Área de Concentração: \nGenética \nOrientadora: Profa. Dra. Lucia Regina Martelli \n \n \nAprovado em:  \n \n \nBanca Examinadora: \nProf. Dr. ______________________________________________________________________ \nInstituição: ____________________________________ Assinatura: ______________________ \nProf. Dr. ______________________________________________________________________ \nInstituição: ____________________________________ Assinatura: ______________________ \nProf. Dr. ______________________________________________________________________ \nInstituição: ____________________________________ Assinatura: ______________________ \nProf. Dr. ______________________________________________________________________ \nInstituição: ____________________________________ Assinatura: ______________________ \nProf. Dr. ______________________________________________________________________ \nInstituição: ____________________________________ Assinatura: ______________________ \n \n\n \n \n \n \n \n \n \nAo Erick \n \n \n \n \nAos meus pais Marisa e José Alberto \n \n \n \n \nÀ minha avó Flora \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nAGRADECIMENTOS..... \n  \n \n À Profa Dra Lucia Regina Martelli, por me receber em seu laboratório, \npelos ensinamentos, pelas oportunidades,  pela amizade, e pelo estímulo em \ncontinuar estudando Citogenética. \n \nA o  D e p a r t a m e n t o  d e  G e n é t i c a  d a  Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto, USP.  À Susie e Maria Aparecid a, secretárias do Departamento de \nGenética, pela atenção. \n \n Ao Dr Rui Ferriani e Dr Julio César Rosa e Silva, pelas amostras e dados \nclínicos das pacientes. \n \nÀs pacientes, por aceitarem participar deste estudo. \n \nAo Dr Luiz Gonzaga Tone, pela colaboração neste trabalho. \n \nAo Conselho Nacional de Desenvolvime nto Científico e Tecnológico (CNPq) \ne à Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa  e Assistência do Hospital das Clínicas \nda Faculdade de Medicina de Ribeirão  Preto (FAEPA-HCFMRP), pelo auxílio \nfinanceiro. \n \nAo Dr Jeremy Squire, por me receber em seu laboratório no Princess \nMargareth Hospital, University Health Network, Toronto, ON, Canadá, e pela \npreciosa colaboração durante todo este trabalho. \n \nÀ Dra Maisa Yoshimoto, pelas sugestões durante toda a parte \nexperimental deste trabalho, e pelo im enso auxílio durante meu estágio em \nToronto. Agradeço também a toda a equipe do Squire Lab, Princess Margareth \nHospital, Toronto, Canadá. \n \nA todos os professores, funcionários e alunos do Bloco C do Departamento \nde Genética, pelo apoio e pela agradáve l convivência diária. Meu agradecimento \nespecial à querida amiga Juliana Meola, pelo companheirismo sem igual desde o \nprimeiro dia do nosso doutorado. Ag radeço também a amiga Maria Silvina \nJuchniuk de Vozzi, que tantas vezes me auxiliou no laboratório. \n \nAos professores Dr Raysildo Barbosa Lôbo e Dra Ester Silveira Ramos, \npelas sugestões e pelo apoio. \n \n\nAo técnico de laboratório Silvio Avelino dos Santos, por toda sua \ncolaboração e amizade no dia-a-dia deste trabalho. Muito obrigada! \n \nÀs técnicas de laboratório Lucimar Aparecida Laureano e Maria Lucia \nMachado, por estarem sempre dispostas a ajudar na análise citogenética. \n \nÀ querida amiga Dra Elida Paula Benquique Ojopi, pela amizade e sugestões \ndurante meu trabalho. \n \nÀs queridas amigas de Botucatu, que  mesmo à distância acompanharam \ntodo o meu trabalho: Érica Cardoso, Jul iana Simões, Perla Reibsheid, Isabela \nPiza, Mônica Rosolem, Bianca Sansone, Karilla Sansone e Fabiana Sansone.  \n \nAos meus sogros Gilberto e Angela Castelli, por me receberem em Ribeirão \nPreto no início deste trabalho e pelo carinho. \n \nÀ toda minha família, em especial mi nha avó Flora, minha tia Silvia, meu \nirmão Beto e meus padrinhos Toninho e Sônia Simões, pelo estímulo e carinho \nsempre. \n \nA o s  m e u s  p a i s  M a r i s a  e  J o s é  A l b e r t o ,  p o r  s e r e m  m e u s  e x e m p l o s  d e  \ncaráter, integridade, respeito e amor. \n \nAo Erick, por seu apoio, companheir ismo e amor em todos os momentos. \nObrigada por tudo.... \n \nA Deus, por mais esta página da minha vida. \n \n \nMeus sinceros agradecimentos. \n  \n \n \n \n \n \n\nRESUMO \nA endometriose é uma doen ça ginecológica benigna comum, mas agressiva, \ncaracterizada pela presença de tecido endometrial ectópico. A teoria mais aceita para \nexplicá-la é a teoria de Sampson, na qual  o tecido endometrial descamado durante a \nmenstruação sofre refluxo através das tubas uterinas, adere e se prolifera em sítios \nectópicos da cavidade peritoneal. Por outro lado, apenas o refluxo tubário não é capaz \nde estabelecer a doença e vários estudo s sugerem uma etiologi a multidimensional \nincluindo fatores hereditários, hormonais e imunológicos. Várias metodologias têm sido \npropostas com o objetivo de identificar genes candidatos para a endometriose. A \nhibridação genômica comparativa (CGH) é uma técnica que pe rmite que o genoma \ninteiro seja analisado em um só experimento, sem a necessidade de cromossomos \nmetafásicos obtidos por cultura celular. Nossa proposta foi avaliar, por CGH, amostras \nde endometriomas ovarianos e de tecido endometrial eutópico de dez pacientes com \ndiagnóstico firmado de endometriose, para screening do genoma. No grupo eutópico, \n6/10 amostras apresentaram alterações caracterizadas por perdas ou ganhos de regiões \ncromossômicas e no grupo ectópico foram en contradas alterações em 7/10 casos. A \npresença de perdas e ganhos de regiões cromossômicas no endométrio eutópico, \nhistologicamente normal, de mulheres com endometr iose ovariana, pode ser \nconsiderada como alteração primária ao desenvolvimento da doença. A metodologia de \nCGH permitiu a detecção das regiões cr omossômicas 11q12.3-q13.1, 17p11.1-p12 e \n17q25.3-qter como regiões críticas, direcionando investigações futuras para identificação \nde genes associados à endometriose. \nPalavras-chave: endometriose, hibridação  genômica comparativa, citogenética, \ninfertilidade. \n\nABSTRACT \nComparative genomic hybridization in endometriosis \nEndometriosis is a common benign gyn ecological disease, very aggressive, \ncharacterized by the presence of ectopic  endometrial tissue.  The most accepted \ntheory to explain it is Sampson’s impl antation theory, which says that the \nendometrial tissue exfoliated during mens truation undergoes reflux through the \nuterine tubes, adheres and prol iferates in ectopic sites of  the peritoneal cavity. On \nthe other hand, only reflux is not enough to the establishment of the disease and a \nnumber of studies suggest a multidimensi onal etiology including hereditary, \nhormonal and immunological factors. Several methodologies have been proposed for \nthe identification of candid ate genes for endometriosis.  The comparative genomic \nhybridization (CGH) is a versatile techniqu e that allows the entire genome to be \nanalyzed in only one experiment without the necessity of metaphasic chromosomes \nfrom the sample, excluding the cell culture.  We aimed to evaluate, by CGH, ovarian \nendometriomas and eutopic endometrial tissue samples from 10 patients with \nconfirmed diagnosis of endometriosis, for a genomic screening. In the eutopic group, \n6/10 samples presented genomic imbalances  and 7/10 cases showed alterations in \nthe ectopic group. The presence of losses and gains of chromosomic regions in the \nhistologically normal eutopic endometrium from women with ovarian endometriosis \ncan be considered as a primary alteration  in the development of the disease. The \nCGH methodology allowed the detection of chromosomic regi ons 11q12.3-q13.1, \n17p11.1-p12 and 17q25.3-qter as critical region s, leading to future investigations for \nthe identification of genes associated to endometriosis.  \nKeywords: endometriosis, comparative genomic hybridization, cytogenetics, infertility. \n\nSUMÁRIO \n \nINTRODUÇÃO.............................................................................................11  \nENDOMETRIOSE ............................................................................................................................... ................... 12 \nENDOMETRIOMA OVARIANO E TUMORES DE OVÁRIO ............................................................................................ 18 \nENDOMETRIOSE E INFERTILIDADE........................................................................................................................ 22 \nINVESTIGAÇÃO DIAGNÓSTICA .............................................................................................................................. 24 \nHIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA E ENDOMETRIOSE.................................................................................... 26 \nGENES CANDIDATOS EM ENDOMETRIOSE ............................................................................................................. 29 \n \nJUSTIFICATIVA ..........................................................................................35  \n \nOBJETIVOS.................................................................................................37  \n \nMATERIAL E MÉTODOS ..............................................................................39  \nCASUÍSTICA ............................................................................................................................... ......................... 39 \nMATERIAL............................................................................................................................... ............................ 40 \nMÉTODOS............................................................................................................................... ............................ 41 \nPreparação das Células Metafásicas ....................................................................................................... 41 \nExtração de DNA de tecido endometrial ................................................................................................ 42 \nAmplificação e Marcação do DNA por SCOMP....................................................................................... 43 \nHibridação Genômica Comparativa......................................................................................................... 45 \nAnálise de Imagens............................................................................................................................... .... 47 \nAnálise por Bioinformática........................................................................................................................ 48 \n \nRESULTADOS..............................................................................................50  \n \nDISCUSSÃO................................................................................................67  \n \nCONCLUSÕES .............................................................................................77  \n \nREFERÊNCIAS ............................................................................................78  \n \nMANUSCRITO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO.........................................88  \n\n \n \n10\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nIntrodução \n\n \n \n11\nINTRODUÇÃO \nDe acordo com Berne e Levy (1990) o ci clo menstrual apresenta três fases \nfisiologicamente distintas: a fase foli cular, começando no primeiro dia do \nsangramento menstrual, com duração variável; a fase ovulatória, com duração média \nde dois dias e a fase luteínica, com duração de 13 a 14 dias, terminando com o inicio \nde um novo período menstrual. Esse ciclo normalmente varia de 21 a 35 dias, \ndependendo da duração da fase folicular. O ciclo começa com aumento gradativo do \nnível de FSH (hormônio folículo estimulante)  pouco antes do início da menstruação, \nque se mantém durante a primeira metade da fase  folicular. Em seguida observa-se \num aumento do nível de LH (hormônio lute inizante). Durante a segunda metade da \nfase folicular, o nível de FS H diminui rapidamente, porém o LH continua aumentado. \nDevido ao estímulo do FSH, a concentração de estradiol no sangue também aumenta \ngradativamente durante os primeiros 6 a 8 dias do ciclo, aumentando \nprogressivamente e atingindo um pico antes da fase ovulatória. Os níveis elevados \nde estradiol exercem efeito de \nfeedback, diminuindo a concentração de FSH no \nsangue durante a segunda metade da fase folicular. Em seguida, a fase ovulatória é \ncaracterizada por um pico elevado de LH  no sangue, que precede um aumento do \nnível plasmático de progesterona. Após a ovulação, durante a fase luteínica, os níveis \nde LH e FSH diminuem até o final desta fase devido ao feedback negativo dos \nhormônios esteróides produzidos pelo corp o lúteo. Esta fase é caracterizada pelo \nintenso aumento dos níveis plas máticos de progesterona e pelo  aumento do \nestradiol, ambos secretados pelo corpo lúteo. Na ausência de gravidez, o corpo lúteo \né degenerado, levando à queda dos níveis de progesterona e estradiol até seus \n\n \n \n12\nníveis mínimos ao final da fase luteínica.  A secreção de FSH aumenta, dando início a \num novo ciclo menstrual. \nNo início de cada ciclo menstrual, o endométrio apresenta-se fino, com poucas \ne retilíneas glândulas. Ao final da mens truação, a elevação da concentração \nplasmática de estradiol durante a fase fo licular aumenta de três a cinco vezes a \nespessura do endométrio, caracterizando a fase proliferativa. O estradiol altera o \nmuco produzido no colo uterino, tornando -o mais aquoso, elástico e produzido em \nmaior quantidade, o que irá facilitar a entrada dos espermatozóides na cavidade \nuterina. Logo após a ovulação, o aument o acentuado de progesterona altera o \nendométrio, inibindo seu crescimento rápi do e atividade mitó tica e provocando \naumento da secreção das glândulas. Essa s alterações, características da fase \nsecretora, permitem a implantação e nutriç ão do embrião no endométrio. Ao mesmo \ntempo, a progesterona diminui a quantida de de muco cervical, que volta a ser \nespesso e não-elástico. Caso não haja concepção, a queda brusca de progesterona e \nestradiol leva a contrações espasmódicas das artérias espiraladas e esta perda do \nsuprimento sanguíneo prod uz morte celular e conseq üente descamação dessas \ncélulas com o sangue coagulado, constituindo o fluxo menstrual.  \n \nEndometriose \nA endometriose é uma doença ginecológica benigna comum, embora bastante \nagressiva, caracterizada pela presença de tecido endometrial ectópico, i.e., tecido \nendometrial implantado fora da cavidade uterina (Yang  et al. , 2004). \nHistologicamente, o tecido ectópico é idêntico ao normal (eutópico), diferenciando-se \n\n \n \n13\napenas por aspectos funcionais e bioquí micos como receptividade a esteróides e \npotencial invasivo (Gaetje et al., 1995). \nA endometriose é caracterizada por sint omas como dismenorréia, dispaneuria, \ndor pélvica e infertilidade (Poliness  et al. , 2004). No entanto, muitas mulheres são \nassintomáticas (Nap et al., 2004).  \nEmbora a endometriose seja uma da s alterações ginecológicas mais \nestudadas, sua etiologia e origem ainda não foram esclarecidas. A teoria mais aceita \npara explicá-la é a teoria da implantaçã o de Sampson (1927), a qual postula que o \ntecido endometrial liberado durante a me nstruação sofre refluxo através das tubas \nuterinas, adere-se e prolifera em loca is ectópicos da cavidade peritoneal \n(principalmente peritônio, ovários e septo retovaginal). No entanto, as teorias da \nmetaplasia do epitélio celôm ico, da indução, dos restos  embrionários, da imunidade \ncelular alterada e da metástase das lesões, também têm sido consideradas  (Witz, \n1999; Giudice e Kao, 2004).  \nVários estudos epidemiológicos susten tam a teoria de Sampson. Ciclos \nmenstruais curtos e longa duração do fluxo menstrual são considerados  dois fatores \nde risco predominantes para a endometriose. Também se sugere que pacientes \nnulíparas ou com menarca precoce apresent em um maior risco para desenvolver a \ndoença (Darrow et al., 1993; Missmer e Cramer, 2003). Acredita-se que em torno de \n10% da população feminina (Dabrosin  et al. , 2002) e 50% das pacientes com \ninfertilidade e dor pélvica (Cornillie  et al. , 1990) apresentem endometriose. Essa \nincidência aumenta durante a idade reprodut iva, é rara antes da menarca e tende a \ndiminuir após a menopausa (Houston  et al. , 1988). Também foi relatada uma \n\n \n \n14\ntendência poligênica e multifatorial para a endometriose, sendo estimado maior risco \n(5 a 8%) para mulheres com história fam ilial da doença em parentes de primeiro \ngrau (Bischoff e Simpson, 2004), bem co mo uma concordância aumentada entre \nirmãs gêmeas (Hadfield et al., 1997). Ainda, o fluxo menstrual retrógrado foi descrito \nna literatura em 76% das mulheres submet idas à laparoscopia durante o período \nmenstrual (Liu e Hitchcock, 1986) bem como  a viabilidade do endométrio menstrual \nem cultura (Keettel e Stein, 1951) e a capa cidade do endométrio menstrual de se \nfixar e proliferar em locais ectópicos (Ridley e Edwards, 1958). \nPor outro lado, considerando-se a menstruação retrógrada como um \nfenômeno bastante comum, o fato de ap enas parte das mulheres desenvolverem \nendometriose ainda não foi esclarecido. Foi proposto que, em mulheres saudáveis, a \nmaioria das células menstruais sofre mo rte celular programada e não sobrevive \n(Gebel et al. , 1998). Entretanto, a porcentage m de células endometrióticas \nmenstruais que sofre apoptose em mulheres com endometriose é bastante reduzida, \nlevando a um aumento do número de cél ulas que sobrevivem e que poderiam \ncontinuar apresentando atividade fisiológica. Esses autores também  observaram que \no tecido endometrial de mulheres com en dometriose é significativamente menos \nsusceptível à apoptose espontânea do que o tecido endometrial de controles férteis. \nHealy e colaboradores (1998) sugeriram que o endométrio de mulheres com \nendometriose sofre um aumento da prolif eração celular e da capacidade de se \nimplantar e sobreviver em locais ectópicos . Os autores chamaram a atenção para a \nproliferação endotelial aumentada, consid erando-se que a angiogênese é essencial \npara a sobrevivência do endo métrio fora do útero, além  do fato de a angiogênese \n\n \n \n15\nexcessiva não ser encontrada apenas na endometriose, mas também em uma \nvariedade de doenças como tumores sólidos, artrite reumatóide e psoríase.  \nA expressão do VEGF (fator de crescime nto endotelial vascular) em implantes \nendometrióticos evidenciou um mecani smo para a neovascularização, que é \ncomumente observada ao re dor dessas lesões (Donnez  et al. , 1998). Altas \nconcentrações de VEGF-A também foram id entificadas no fluido peritoneal de \nmulheres com endometriose, apresentando níveis mais elevados durante a fase \nproliferativa do ciclo (Mclaren  et al. , 1996). Tan e colaboradores (2002) relataram \numa correlação positiva entre a severidade  da endometriose e a concentração de \nVEGF-A no fluido peritoneal. Em 2006, Fe rrero e colaboradores revisaram vários \nagentes anti-fator de crescimento endotelia l vascular e outras drogas angiostáticas \ncomo TNP470, endostatinas, anginex e anticorpo anti-VEGF humana, que foram \nestudadas em laboratório e em modelos animais de endometriose. Os autores \nconcluíram que esses agentes inibem sign ificativamente a resposta angiogênica e \nreduzem o estabelecimento, manutenção e progressão das lesões endometrióticas . \nPor outro lado, a segurança e eficácia dessa s substâncias antiangiogênicas deveriam \nser avaliadas em um modelo primata não- humano de endometriose, visando futuras \naplicações.      \n Al-Fozan e Tulandi (2003) avaliaram a di stribuição lateral da endometriose e \ndo endometrioma ovariano em mulheres com endometrio se. Os autores observaram \nque a endometriose é mais freqüente na he mi-pelve esquerda (64,3%) em relação à \ndireita, bem como um maior número de im plantes endometrióticos no lado esquerdo \nda pelve. Essa predisposição poderia ser ex plicada pela presença do cólon sigmóide \n\n \n \n16\nno lado esquerdo da cavidade abdomina l. Segundo essa teoria, ele retarda a \npassagem do fluxo menstrual retrógrado, fazendo com que as células \nendometrióticas tenham mais tempo para se  implantar na hemi-pelve esquerda. As \nobservações apóiam a teoria de que a or igem da endometriose está nas células \nendometrióticas que sofreram refluxo. No  entanto, suas implicações clínicas \npermanecem desconhecidas.  \nPor outro lado, apenas o refluxo tubário não é suficiente para o \nestabelecimento da doença e vários estudos sugerem uma etiologia multidimensional \nincluindo fatores hereditários, hormonai s e imunológicos (Olive e Schwartz, 1993; \nBrinton et al. , 1997). Em nível celular, a doença é caracterizada por crescimento \nmonoclonal e pode apresentar aspectos de comportamento maligno como invasão \nlocal e metástase  (Olive e Schwartz, 1993; Jimbo, Hitomi  et al. , 1997; Jimbo, \nYoshikawa et al. , 1997). Estima-se que a patogêne se da endometriose esteja \nassociada à capacidade das células endo metrióticas em reagir a uma resposta \nimunológica local. Vários resultados de estudos in vivo e in vitro mostraram que as \nrespostas imunológicas desencadeadas pela endometriose assemelham-se às \nrespostas de células tumorais que evadir am a imunovigilância (Braun e Dmowski, \n1998). Sugere-se que células natural killer (NK), por exemplo, inibam a implantação \nectópica e o crescimento de células endo metrióticas menstruais retrógradas e, \nconseqüentemente, uma falha nesse sistem a possa contribuir para a iniciação e \nprogressão da endometriose (D'hooghe  et al. , 1995). Outras características \nmoleculares da doença incluem al guns genes superexpressos como c-MYC (v-myc \nmyelocytomatosis viral oncogene homolog [avian]) e ERBB2 (v-erb-b2 erythroblastic \nleukemia viral oncogene homolog 2, neur o/glioblastoma derived oncogene homolog \n\n \n \n17\n[avian]) (Bergqvist  et al. , 1991; Schenken  et al. , 1991) e a desregulação da \nexpressão de fatores de crescimento (Huang e Yeh, 1994). \nDados epidemiológicos, ci rúrgicos e patológicos qu estionam se as lesões \nperitoneais, ovarianas e do septo retovaginal apresentam uma etiologia comum única \nou se representam três entidades com patogêneses diferentes (Vigano  et al., 2004). \nEmbora a teoria do fluxo retrógrado seja a mais aceita, outros autores (Nisolle e \nDonnez, 1997) sugerem uma origem diferente para cada um dos três tipos de \nendometriose. A endometriose peritoneal realmente poderia ser explicada pela teoria \ndo refluxo de células menstruais do endomé trio que sofreriam adesão e proliferação \nna cavidade peritoneal. No entanto,  a metaplasia celômica de inclusões epiteliais \ninvaginadas poderia ser responsável pe lo desenvolvimento da endometriose \novariana, já que o epitélio de revestimen to do ovário aprese nta grande potencial \nmetaplásico. Por fim, o nódulo endometr iótico retovaginal poderia ser mais bem \nexplicado pela metaplasia de remanesc entes mullerianos localizados no septo \nretovaginal. \nA endometriose sofre transformação malig na em uma freqüência que varia de \n0,7% a 1%; no entanto, esta freqüência pode ser considerada maior, uma vez que o \ntumor pode destruir o tecido endometrióti co de origem e eliminar as evidências \nhistopatológicas da endometriose (Nishida  et al. , 2000). Os três critérios definidos \npara a transformação maligna da endometriose são: (a) a presença de endometriose \ne carcinoma no mesmo ovário; (b) o carcinoma deve ter sua origem no tecido \nendometriótico, porém sem invasão endome trial, mantendo limites nítidos entre \n\n \n \n18\nambos e (c) a confirmação histopatológica de uma transição entre a endometriose e \no carcinoma (Sampson, 1925).  \n \nEndometrioma Ovariano e Tumores de Ovário   \nDada a complexidade da doença e as limitações para a determinação de sua \ncausa, três modelos diferentes foram propostos para explicar a origem do \nendometrioma ovariano típico (Vigano  et al. , 2004): invasão do córtex ovariano e \ninvaginação progressiva após o acúmulo de debris menstruais derivados  de \nhemorragia de implantes endometrióticos superficiais; envolvimento de cistos \novarianos funcionais por implantes endome trióticos localizados na superfície do \novário; e metaplasia celômic a, que propõe a transformação metaplásica de células \nmesenquimais submesoteliais em um fenótipo endometriótico.  \nDe modo geral, a endometriose não pa rece estar associada a maior risco para \ncâncer. Por outro lado, evidências têm suge rido a endometriose ovariana como fator \nprecursor de tipos específicos de câncer de  ovário. Esta informação corrobora o fato \nde fatores de risco para endo metriose e malignização ovariana  serem similares e \nincluírem menarca precoce, menstruação regula r, ciclos menstruais curtos e poucas \ngestações. Embora nenhum estudo forneça uma evidência genética conclusiva para \nsustentar uma linhagem celular comum entre a endometriose e o câncer de ovário, a \nendometriose de ovário tem sido rela cionada a alterações genéticas e é \nfreqüentemente encontrada em associação com carcinomas ovarianos endometriais e \nde células claras, sugerindo que  esses dois tipos de carc inoma possam ter surgido \ndiretamente de depósitos endometrióti cos (Feeley e Wells, 2001). McMeekin e \n\n \n \n19\ncolaboradores (1995) descreveram uma sé rie de pacientes com adenocarcinomas \nendometrióticos associados  à endometriose (EAEA) onde 30% dos tumores de \nadenocarcinomas endometrióticos do ová rio (ECO) surgiram em associação à \nendometriose, uma proporção levemente ma ior do que a relatada na maioria das \nséries de pacientes. Este dado pode re fletir um maior reco nhecimento da ligação \nentre endometriose e adenoc arcinoma endometriótico. A associação entre a doença \nno estágio inicial, idade precoce e o EAEA  sustenta a idéia de que o EAEA é um \nsubtipo histológico distinto do ECO, com um comportamento biológico menos \nagressivo em relação ao adenocarcinoma endo metriótico típico.  De acordo com os \nautores, a relação entre os dados histológic os associados e o estadio da doença foi \nmenos clara. Um número substancial de casos de ECO apresentou uma mistura de \nelementos epiteliais em proporções va riadas, juntamente com o componente \nendometriótico.  \nA associação entre endometriose e câ ncer ovariano também foi investigada \nem estudos caso-controle (Ness  et al. , 2000; Ness  et al. , 2002; Modugno  et al. , \n2004).  A maioria desses estudos sugere uma associação entre endometriose e \ncâncer ovariano, embora seja difícil quan tificar o efeito com precisão, devido a \nvariações de risco.  \nValenzuela e colaboradores (2007) apresentaram uma análise retrospectiva de \n22 casos de carcinoma ovariano endometrió ide em uma tentativa de identificar a \nendometriose e sua transformação maligna. A endometriose foi detectada em três \ncasos (3/22 = 14%), sendo que um deles apresentou claramente uma área de \ntransformação benigna-maligna  e em outro, a zona de transição era abrupta e \n\n \n \n20\nestava presente em ambos os ovários. No terceiro caso, foi observada endometriose \novariana com carcinoma endometriótico ap enas focal. Todas as três pacientes \napresentavam um componente de carcinom a ovariano de células claras. A presença \ndesse componente foi significantemente ma ior em pacientes com endometriose do \nque em pacientes sem endometriose. Os  autores sugerem a associação desta \ncondição com os carcinomas endometrióides  e de células claras do ovário e que a \nmesma deve ser considerada sempre qu e haja suspeita de diagnóstico de \nendometriose, independentemente da situação pré- ou pós-menopausa da paciente.  \nA literatura relata o comportamento clínico e os fatores prognósticos em \npacientes com câncer de ovário com ou se m endometriose concomitante. Pacientes \ncom endometriose tendem a ser mais jove ns e a ser diagnosticadas em estágios \nprecoces, com lesões de grau mais baixo e melhor prognóstico (Depriest et al., 1992; \nMcmeekin et al. , 1995; Erzen e Kova cic, 1998; Komiyama et al. , 1999; Erzen et al. , \n2001). Entretanto, ainda não foi totalmente esclarecido se o aumento da sobrevida \nestá relacionado à idade precoce e/ou ao diagnóstico precoce relatado em mulheres \ncom endometriose (Somigliana et al., 2006). \nOutros autores (Komiyama  et al. , 1999) avaliaram retrospectivamente dados \nclinicopatológicos da associação entre carcinoma ovariano de células claras e \nendometriose pélvica em 35 pacientes ja ponesas. Os autores observaram que \npacientes com carcinoma ovariano de células claras e endometriose pélvica exibiram \num melhor prognóstico em relação àque las sem endometriose, especialmente as \npacientes com câncer de grau I. Eles também sugeriram que alguma interação ou via \nmetabólica poderia existir entre o carc inoma ovariano de células claras e a \n\n \n \n21\nendometriose pélvica, ajudando a inibir a proliferação ou disseminação do carcinoma \novariano de células claras para a cavidade  intraperitoneal nos eventos iniciais da \nprogressão do câncer.  \nA hipótese de que andrógenos circ ulantes possam estar envolvidos no \ndesenvolvimento do câncer de ovário já foi relatada  (Risch, 1998). A medicação \nandrogênica, danazol, e a medicação antiandrogênica, leuprolide e nafarelin, são \ncomumente usadas no tratamento da endo metriose (Moghissi, 1999; Olive e Pritts, \n2001). Cottreau e colaboradores (2003)  avaliaram as associações entre o uso desses \nmedicamentos e o câncer de ovário, e co ncluíram que o danazol aumentava o risco \nde câncer ovariano, sustentando a hipóte se de que o excesso de andrógeno possa \nestar associado ao desenvolvimento de câncer ovariano.  \nMulheres com endometriose parecem ap resentar um risco maior para outros  \ntumores malignos da pelve (Blumenfel d, 2004; Van Gorp, 2004). A ocorrência \nsimultânea de endometriose e câncer ovariano e carcinoma de células claras (41%) e \nsubtipos endometrióticos (38%) sugere uma transformação de componentes da \nendometriose em células tumorais. Esta tr ansformação pode ser devida à perda de \nheterozigose e à mutação somática de ge nes supressores tumorais, em especial, \nPTEN/MMAC/TEP1 (Jimbo, Hitomi et al., 1997; Jimbo, Yoshikawa et al., 1997; Obata \net al., 1998; Toki e Nakayama, 2000; Swiersz,  2002). Dados da literatura também \nmostram uma alta freqüência de mu tação do gene supressor tumoral TP53 em \nendometriose atípica e câncer ovariano re lacionado à endometriose (Sainz De La \nCuesta et al. , 2004). Cistos endometrióticos também apresentam perda de \nheterozigose e deleções parciais envolvendo os cromossomos 9p, 11q e 22q (Jiang et \n\n \n \n22\nal., 1996). Clonalidade e altos ní veis de aneuploidia têm sido sugeridos como fatores \nde predisposição para transformação maligna de lesões endometrióticas, \nespecialmente para os subtipos endometr ióide e de células claras (Jimbo, Hitomi  et \nal., 1997; Jimbo, Yoshikawa  et al. , 1997; Tamura  et al. , 1998; Blumenfeld, 2004).  \nEntretanto, também foi re latado que mutações no TP53 não estavam associadas à \nendometriose (Omori et al., 2004), enfatizando a necessidade de novos estudos para \numa avaliação precisa de regiões crític as envolvendo genes candidatos para \nendometriose.   \nDesde que a endometriose foi associada à infertilidade, a associação entre a \ndoença e o câncer deve ser interpretada com cautela, já que um risco aumentado \npode ser devido à nuliparidade e não à endometriose em si (Somigliana et al., 2006). \nEm resumo, a literatura relata várias ev idências indicando que o mesotélio da \nsuperfície ovariana normal desempenha um papel complexo na fisiologia ovariana, \ncom funções reguladoras proteolíticas, de síntese e crescimento, as quais influenciam \nna ovulação e no reparo a danos ovulató rios (Feeley e Wells, 2001). Dessa forma, é \npossível que aberrações dessas funções co ntribuam para o desenvolvimento da \nmalignidade. \n \nEndometriose e Infertilidade \nAs várias questões fisiopatológicas e terapêuticas a respeito da associação \nendometriose-infertilidade permanecem não esclarecidas até o momento. O \n\n \n \n23\nmecanismo dessa associação é complexo,  devido aos polimorfismos clínicos e à \nausência de confirmações bem estabelecidas. \nA literatura relata que 25 a 50% das mulheres inférteis apresentam \nendometriose e que 30% a 50% das mulh eres com endometriose são inférteis  (The \nPractice Committee of the American Soci ety for Reproductive Medicine, 2004). A \nhipótese de que a endometriose cause infe rtilidade ou uma diminuição na fertilidade \npermanece controversa. Vários mecanismos  têm sido propostos no intuito de \nesclarecer a associação entr e endometriose e infertilidade: alterações anatômicas, \nalterações citológicas e bioquímicas do lí quido peritoneal, alterações da resposta \nimune local, alterações funcionais do ovário e do endométrio e redução da qualidade \ndo embrião (Collinet  et al. , 2006). No entanto, deve se r enfatizado que nenhum \ndesses mecanismos diminui confirmadamente a fertilidade feminina.  \nAs classificações da American Societ y for Reproductive Medicine (1997) são \núnicas porque fornecem uma forma padronizad a de registro dos dados patológicos e \navaliam, em escala, o status da doença na tentativa de predizer a probabilidade de \ngravidez após o tratamento. De acordo com os critérios da Sociedade Americana, o \nformulário de classificação da  endometriose inclui o regi stro de informações sobre a \nmorfologia da doença, recomendando foto grafias coloridas para documentação. As \nlesões devem ser categorizadas como verm elhas, brancas e negras. A porcentagem \nde envolvimento da superfície em cada ti po de lesão deve ser documentada. Além \ndisso, para aumentar a precisão do sistema de pontuação, um endometrioma \novariano deve ser confirmado por histologia  ou pela presença de (a) tamanho do \ncisto < 12 cm; (b) adesão à parede lateral pélvica; (c) lesões de endometriose na \nsuperfície ovariana; (d) fluido persistente, espesso, cor de chocolate. De acordo com \n\n \n \n24\nesse sistema de pontuação, a endometriose é classificada em grau I (mínima, de 1 a \n5 pontos), II (leve, de 6 a 15 pontos), III (moderada, de 16 a 40 pontos) ou IV \n(severa, mais de 40 pontos). É provável que os esquemas de classificação para \nendometriose continuem a evoluir e que ou tros fatores associados à endometriose \nque contribuam para a infertilidade sejam in cluídos na classificação, permitindo uma \nprevisão mais precisa de gravidez.  \n \nInvestigação Diagnóstica \nO diagnóstico inicial da endometriose é realizado pela história clínica, variando \ndesde ausência completa de sintomas até dor pélvica incapacitante durante o \nperíodo menstrual e infertilidade. A dosa gem das glicoproteínas séricas CA-125 e \nCA19-9, devido à maior concentração de sses marcadores no endométrio ectópico \ncomparado ao normal, em associação a exames de imagem  como ultra-som \nendovaginal e ressonância magnét ica também são utilizadas como  ferramentas \ndiagnósticas. Entretanto, devido à ba ixa especificidade desses métodos, o \ndiagnóstico da endometriose só pode ser confirmado por laparoscopia, considerada \num método bastante invasivo (Brosens et al., 2004). \nA remoção cirúrgica das lesões melhora significativamente alguns sintomas, \ncomo a dor, porém pode haver recorrência da doença e as pacientes podem rejeitar \nou adiar uma segunda cirurgia, preferindo outro tipo de terapia. No momento, dentre \nos tratamentos disponíveis estão os supr essores da síntese de estrógeno, que \ninduzem a atrofia de implantes ectópicos ou interrompem o cicl o de estimulação. \nContraceptivos orais, agentes androgênicos , progesterona e análogos do hormônio \n\n \n \n25\nliberador de gonadotrofina também têm sido  utilizados com sucesso no tratamento \nda endometriose, porém nenhuma dessas drogas elimina a doença, e em alguns \ncasos, os efeitos colaterais provocados limitam seu uso a longo prazo (Ferrero  et al., \n2006). \nAtualmente, a avaliação histológica do endométrio durante a investigação de \nrotina para infertilidade feminina não tem sido recomendada. O conceito de \nanormalidades endometriais, não refletid o pelas alterações histológicas, tem \nenfatizado as deficiências analíticas não diagnosticadas pela avaliação histológica \nclássica, que podem levar à falha de impl antação embrionária. De fato, a relação \nentre as alterações bioquímicas e a histolog ia normal enfatiza a necessidade de uma \nabordagem molecular do endométrio, além da análise histológica, para testes \ndiagnósticos de fertilidade em mulheres  com endometriose e outras causas de \ninfertilidade (Giudice e Kao, 2004). \nUm dos maiores desafios da  investigação genética da endometriose é a busca \npor métodos de análise  precisos e rápidos que revelem o máximo de informação \nsobre a amostra. As técnicas de citogenética convencional permitem uma informação \ndetalhada sobre cada cromossomo e, portan to são bastante utilizadas com sucesso. \nEntretanto, a necessidade de obtenção de  células metafásicas requer um número \nsignificante de células vivas para cultura,  e dessa forma, a dificuldade de se obter \npreparações cromossômicas metafásicas de  boa qualidade e o tempo de cultura \ncelular prejudicam a aplicação desta metodologia.    \nA técnica de Hibridação Fluorescente in situ  (FISH) é uma boa opção, pois \ncélulas interfásicas podem ser analisadas com sondas específicas para determinadas \n\n \n \n26\nregiões cromossômicas, evitando assim a cu ltura celular e reduzindo o tempo para a \nobtenção dos resultados. Por outro lado , o número de cromossomos que pode ser \navaliado por FISH no mesmo experimento é limitado devido à probabilidade de falha \nna hibridação e sobreposição de sinais  fluorescentes de dois cromossomos. \nHibridações seqüenciais, ou seja, mais de uma hibridação na mesma célula com \nsondas para cromossomos diferentes, também têm sido usadas para aumentar o \nnúmero de cromossomos a serem investig ados. No entanto, a eficiência da \nhibridação diminui consistentemente a cada ciclo de hibridação (Liu et al., 1998). \nA Hibridação Genômica Comparativa (CGH) é um método que permite a \nprodução de um mapa detalhado das diferenças entre cromossomos em diferentes \ncélulas, sem qualquer conhecime nto prévio sobre as regiõe s alteradas. Este método \ndetecta ganhos (amplificações) e perdas (deleções) de segmentos de DNA. A CGH \ntem o potencial de investigar o acúmulo de alterações cromossômicas como uma \nmedida da estabilidade genética, bem como  de monitorar as complexas alterações \ncitogenéticas detectadas em doenças humanas (Squire e Perlikowski, 1998). \n \nHibridação Genômica Comparativa e Endometriose     \nNenhuma alteração cromossômica especí fica foi identificada em tecido \nendometriótico por análise citogenética convencional, provavelmente devido às \nlimitações relacionadas à cultura de tecido (Dangel  et al. , 1994). A técnica de FISH \ntem a vantagem de não exigir cultura de  células endometriais, já que pode ser \nrealizada em tecido fresco ou fixado (Vigano  et al. , 2006). Shin e colaboradores \n(1997) relataram que a freqüência de aneuploidia foi significativamente mais alta em \n\n \n \n27\ntrês de quatro amostras frescas de endome triose provenientes de mulheres afetadas \npela doença em estadio avançado (8,8 e 14,8% respectivamente para monossomia \ndos cromossomos 16 e 17 em um caso; 14,8%  para trissomia do cromossomo 11 no \nsegundo caso e 14,1% para monossomia do cromossomo 16 no terceiro caso) \nquando comparado à freqüência média obse rvada em amostras de tecido normal \n(3,4% para monossomia e 1,2% para tri ssomia). A CGH é uma técnica versátil que \nsupre as deficiências do FISH e da cito genética convencional, permitindo que o \ngenoma inteiro seja analis ado em um só experimento, sem a necessidade de \ncromossomos metafásicos da amostra. (Kallioniemi et al., 1992).  \nResumidamente, na metodologia de CGH, o DNA teste é marcado com um \nfluorocromo verde, misturado em uma ra zão 1:1 com DNA normal marcado com um \nfluorocromo vermelho, e ambos são hibridados em preparações metafásicas \nhumanas normais. O DNA normal e as me táfases são obtidos de um voluntário \nsaudável ou adquiridos comercialmente. Os  fragmentos de DNA marcados em verde \ne vermelho competem pela hibridação em  seus locos de origem na preparação \nmetafásica. A proporção de fluorescência ve rde e vermelha medida ao longo do eixo \ncromossômico representa perda (razão < 1) ou ganho (razão > 1) de material \ngenético na célula da amostra em estudo , naquela região específica. Além do \nmicroscópio de fluorescência, a técnica requer um software para a análise dos \nresultados. A Hibridação Genômica Comparativa (CGH) permite um screening \ncompleto do genoma com o objetivo de  descobrir e mapear perdas e ganhos \ncromossômicos (Squire e Perlikowski, 1998). \n\n \n \n28\nDiversas publicações utilizaram a CG H como ferramenta para detecção de \nalterações genéticas na endometriose. Go gusev e colaboradores (1999) examinaram \n18 lesões endometrióticas obtidas de paci entes em estadio avançado, e alterações \nrecorrentes no número de cópias de genes foram encontradas em 15 de 18 casos \n(83%). Perdas de material genômico no s cromossomos 1p e 22q foram detectadas \nem 50% dos casos. Outras perdas comuns  foram observadas nos cromossomos 5p \n(33%), 6q (27%), 7p (22%),  9q (22%), 16 (22% ), e 17q em um caso. Ganhos de \nseqüências de DNA foram encontrados em 1q, 6q, 7q e 17q em quatro casos. Em um \ntrabalho subseqüente, o mesmo grupo (Gogusev\n et al., 2000) avaliou por CGH uma \nlinhagem celular permanente derivada de endometriose (FbEM-1) e observou que \nganhos cromossômicos eram mais comumente observados do que perdas, sendo que \num aumento significativo do número de cópias de seqüên cias de DNA foi detectado \nem 1q, 5p, 6p e 17q correspondendo a amplificações.  \nA metodologia de CGH também foi utilizada na avaliação de alterações \ngenéticas em casos de carcinomas de ovário com origem na endometriose  (Mhawech \net al. , 2002). Foram observadas alterações  cromossômicas em três casos de \ncarcinoma de ovário sendo ganhos em 1q, 8q e 13q e perda em 10p. No entanto, \nnenhuma alteração cromossômica foi detectada no tecido endometriótico de nenhum \ndos três. Os autores concluíram que essa s regiões alteradas podem conter genes \nsupressores tumorais ou oncogenes respon sáveis pela transformação maligna da \nendometriose. \nMais recentemente, a metodologia de CGH-array, que substitui os \ncromossômicos metafásicos por regiões de DNA genômico, começou a ser utilizada \n\n \n \n29\nem estudos de endometriose (Guo  et al. , 2004) para detecção de perdas e ganhos \ngenômicos. \nApesar de alguns trabalhos terem avaliado a endometriose em relação a \npossíveis alterações crom ossômicas detectadas por  CGH, somente um estudo \ncomparou o tecido endometr iótico ovariano e o endomé trio normal das mesmas \npacientes. Wu e colabora dores (2006) investigaram  tecidos ectópicos e eutópicos, \nporém utilizando a técnica de array-CGH, tanto em endometrioses peritoneais quanto \novarianas.  \n \nGenes Candidatos em Endometriose  \nAproximadamente 50% das lesões en dometrióticas poderiam produzir \nalterações genéticas somáticas em re giões cromossômicas que supostamente \nconteriam genes envolvidos na tumorigê nese ovariana, especialmente do tipo \nendometrióide (Jiang  et al. , 1996). Alterações genéticas comuns foram detectadas \nem casos de endometriose concomitante  com cânceres, apoi ando o modelo de \nprogressão da carcinogênese a partir de um precursor benigno ao tumor de ovário \n(Jiang et al., 1998; Thomas e Campbell, 2000a; b). \nUm número cada vez maior de pesquisa s tem sido realizado na procura por \nassociações entre a endometriose e altera ções/polimorfismos em genes candidatos. \nDentre as associações descritas estão:  \n- Galactose–I-fosfatase uridiltransferase ( GALT): Localizado em 9p13, foi o \nprimeiro gene candidato a ser a ssociado à endometriose (Cramer  et al. , 1996). O \n\n \n \n30\npolimorfismo específico de scrito foi uma transição ad enina-guanina, onde uma \nmutação no códon 314 do éxon 10 levari a a uma substituição de aspartato por \nasparagina. Entretanto, esta associação não foi confirmada por outros autores \n(Morland et al., 1998; Hadfield et al., 1999; Stefansson et al., 2001). \n- Genes de Detoxificação de Fase I (receptor Ah, CYP1A1, NAT2): Enzimas do \nmetabolismo de drogas da fase I, que ag em introduzindo um grupo funcional em \nseus substratos endógenos e exógenos, po dem estar relacionadas à ativação de \ncompostos pro-carcinogênicos. Aproxi madamente 10% da população humana \napresenta “alta” inducibilidade do CYP1A1 como resultado do polimorfismo A2, e \npoderiam apresentar um maior risco pa ra o desenvolvimento de tumor ou, por \nanalogia, de endometriose (Bischoff e Simpson, 2004). \n- Genes de Detoxificação de Fase II ( GSTs, NAT2): os genes GSTs, GSTMI e \nGSTT, cruciais para a detoxificação de prod utos do estresse oxidativo, são de \nrelevância específica já que são produzid os durante o reparo do epitélio ovariano \n(Sarhanis et al., 1996). \n- Genes relacionados a esteróides (receptor de estr ógeno, gene da \naromatase): A relação entre endometriose e o aumento da produção de estrógeno é \numa hipótese largamente difundida e bi ologicamente plausí vel. O receptor de \nestrógeno (ER) e o gene da aromatase (CYP19) são prováveis genes candidatos. Eles \npodem tanto aumentar o acúmulo de estr ógeno quanto produzir um ambiente \nhormonal mais rico do que o convencional (Bulun et al., 2000). \n- Genes de Adesão Intracelular ( ICAM-I), matriz de metaloproteinases e \nfatores angiogênicos: Genes candidatos baseados em estudos imunohistoquímicos in \n\n \n \n31\nvivo e in vitro (Henriet et al., 2002; Lessey, 2002; Osteen et al., 2002). Moléculas de \nadesão celular, principalmente integrinas e caderinas, são os principais mediadores \nde adesão célula-célula e célula-matriz e su a expressão pode ser importante para a \nadesão inicial do tecido esfoliado (Beliard et al., 1997). \n- Citocinas: Lebovic e colaboradores (2002) relataram que o gene de ciclo \ncelular Tob-1 estava menos expresso em amostras de endometriose (48%) quando \ncomparado ao controle (16%), após tratamento com IL1-β. \n- Genes de reparo a DNA mismatch: A metilação alterada nesses genes tais \ncomo hMLHI foi observada em 4/46 casos de endo metriose de grau III/IV (8,6%) \n(Martini et al., 2002). \n- Genes supressores tumorais: Bischo ff e Simpson (2004) sugeriram como \nprincipais genes candidatos os oncogene s e genes supressores tumorais mapeados \nno cromossomo 17, especificamente BRCAI e TP53. Por outro lado, alguns autores \nconcordam que a imunorreatividade da p 53 não é detectável em amostras de \nendometriose não associadas  a carcinomas (Vercellini  et al. , 1994; Schneider  et al. , \n1998; Okuda et al., 2003). Outro gene supressor tumoral estudado em endometriose \né o PTEN, mapeado em 10q23. Mutações no PTEN foram relatadas em tumores \nendometrióticos (Obata et al. , 1998) e em tumores epiteliais ovarianos relacionados \nà endometriose  (Campbell e Thomas, 2001). Mutte r e colaboradores (2000) \nenfatizaram que a perda da função do PTEN seria um evento primário na \ntumorigênese endometriótica. Enquanto nenhuma amostra de endométrio normal \napresentou mutações no PTEN, uma taxa de mutação de 83% foi encontrada em \n\n \n \n32\nadenocarcinomas endometriais endometrióid es e de 55% em lesões intraepiteliais \nendometriais pré-malignas.  \n- Oncogenes: Nezhat e colaborado res (2002) compararam padrões de \ncoloração de bcl-2 em cistos endometrió ticos benignos, tumores ovarianos e áreas \nde endometriose associadas aos tumores,  em uma tentativa de identificar uma \ncorrelação seqüencial e etiológica. Apenas  23% dos cistos endometrióticos foram \ncorados positivamente para bcl-2 enquanto 67% dos tumores endometrióides e 74% \ndos carcinomas ovarianos de células claras  apresentaram resultado positivo. Das 12 \namostras de endometriose de áreas adjace ntes a carcinomas endometrióides e das \n11 amostras de endometriose adjacentes a neoplasias de células claras, 42 e 73% \nrespectivamente expressaram bcl-2.  \nBischoff e Simpson (2004) criaram a hipótese de  que duas ou mais alterações \ngênicas concomitantes são necessárias para o surgimento da endometriose. \nDiferentemente da neoplasia em si, os  genes alterados na endometriose não \nnecessariamente precisam ser oncogenes ou genes supressores tumorais. Os autores \nacreditam que o primeiro passo envolve um gene que aumenta a predisposição para \nadesão e implantação do tecido endometrial menstrual que sofreu refluxo. Esse gene \npode estar envolvido com citoesquel eto (MMPs) ou adesão celular (\nICAMI). O \nsegundo passo deve considerar genes de crescimento endometrial como receptor de \nestrógeno (ER) ou de regulação de esteróides ( CYP19). Eles também sugerem que \nem passos adicionais possa haver a participação de um oncogene, o que então \nlevaria a uma proliferação celular descontrolada.   \n\n \n \n33\nA endometriose realmente apresenta al guns aspectos de malignidade como \ncrescimento e vascularização aumentados e invasão tecidual, mas características \nimportantes do câncer como expansão  monoclonal e alterações genéticas \npermanecem não esclarecidas. A presença de mutações gênicas deve ser investigada \nnão apenas em casos de endometriose co ncomitante ao câncer de ovário ou a \nformas de transição histológica, mas tamb ém em cistos endometrióticos isolados. \nDevido à etiologia complexa e multifatoria l, envolvendo herança familial e múltiplos \ngenes candidatos, a endometriose é considerada  alvo ideal para estudos de \nscreening genômico.  \n\n \n \n34\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nJustificativa \n \n\n \n \n35\nJUSTIFICATIVA \nA endometriose é uma doença gineco lógica benigna comum que afeta em \ntorno de 10% das mulheres em idade repr odutiva. As pacientes podem apresentar \ndesde ausência completa de sintomas até dor pélvica, dismenorréia, dispaneuria e \ninfertilidade.  \nA literatura relata que 50% das pacien tes com dor pélvica e infertilidade \napresentam endometriose, e há 1% de  risco de transformação maligna da \nendometriose.  Devido à dificuldade de estabelecer um diagnóstico preciso, e por ser \nconsiderada um problema de  saúde pública, torna-se  importante identificar \nmarcadores biológicos para triagem de mu lheres com predisposição à endometriose, \nassim como para o diagnóstico precoce e não invasivo  da doença. \nApesar de alguns trabalhos terem avaliado a endometriose em relação a \npossíveis alterações cromossômicas, util izando a metodologia de CGH, nenhum \ndesses comparou o tecido endometriótico ovariano e o endométrio normal das \nmesmas pacientes. Até o mome nto, não existem relatos na literatura de estudos de \nperdas e ganhos genômicos utilizando a metodologia de CGH em amostras brasileiras \nde endometriose ovariana.  \n \n \n \n \n\n \n \n36\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nObjetivos \n \n\n \n \n37\nOBJETIVOS \nO objetivo principal deste trabalho é determinar o diagnóstico citogenético \nmolecular de amostras de endometrio mas ovarianos e de tecido eutópico \n(endométrio) das mesmas pacientes, por me io da técnica de Hibridação Genômica \nComparativa. \n Os objetivos intermediários são: \n(a) Detecção de perdas e/ou ganhos de regiões cromossômicas em \namostras de endometriose;  \n(b) Comparação entre os result ados obtidos nas lesões \nendometrióticas ovarianas e no t ecido endometrial eutópico de \npacientes com diagnóstico de endometriose; \n(c) Identificação das regiões cr omossômicas preferenciais e \nconseqüentemente de genes que possam estar envolvidos no \nprocesso de desenvolvimento da doença.  \n\n \n \n38\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nMaterial e Métodos \n \n\n \n \n39\nMATERIAL E MÉTODOS \nCasuística \nO projeto foi desenvolvido  no Departamento de Ge nética da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto (Laboratório de Citogenética Humana) da Universidade de \nSão Paulo (FMRP-USP) e na Division of Applied Molecular Oncology do Princess \nMargaret Hospital, Ontario Ca ncer Institute, University Health Network, Toronto, \nCanadá, em colaboração com o Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-\nUSP (Serviço de Reprodução Humana do Hospital das Clínicas da FMRP – USP) e com \no Laboratório de Oncologia Pediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura \n(FMRP-USP).  \nO projeto foi submetido e aprovado pelo  Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) \ndo HCFMRP – USP processo no 11736/2004.  \nForam selecionadas dez mulheres, com idade variando en tre 24 a 45 anos, \napresentando ciclos menstruais regulares (de 25 a 35 dias de intervalo), atendidas \nno ambulatório de infertilidade do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto – USP, após \nconfirmação diagnóstica de endometriose.  Os critérios de seleção foram: pacientes \nsem história de uso de anticoncepcion ais orais nos últimos seis meses e sem \nreferência a qualquer outra forma de tratamento hormonal. \nDentre as pacientes, sete foram encami nhadas ao serviço para laparoscopia \npelo Ambulatório de Dor Pélvica e Endoscopia (AGDE) com indicação de dor pélvica e \ntrês foram encaminhadas pelo Ambulatório de Infertilidade Conjugal do HCFMRP-USP \n\n \n \n40\ncom indicação de infertilidade. As inform ações clínicas de cada paciente estão \napresentadas na Tabela 1.   \nTabela 1: Descrição das características clínicas das pacientes participantes no estudo. \nPACIENTE IDADE GRAU\nDIA DO \nCICLO \nINDICAÇÃO GRAVIDEZ\nO1/ON1 42 IV 11 DOR G5P4A1 \nO2/ON2 31 IV 7 INFERTILIDADE G0 \nO3/ON3 45 IV 5 DOR G3P3A0 \nO4/ON4 24 IV 6 DOR G0 \nO5/ON5 42 III 7 DOR G2P2A0 \nO6/ON6 40 III 4 DOR G2P2A0 \nO7/0N7 36 IV 8 DOR G3P3A0 \nO8/ON8 35 III 5 INFERTILIDADE G0 \nO9/ON9 35 IV 7 INFERTILIDADE G2P0A2 \nO10/ON10 42 IV 8 DOR G2P2A0 \n \nTodas as pacientes participantes da  pesquisa assinaram o termo de \nconsentimento livre e esclarecido.  \n \nMaterial \n Foram utilizadas 20 amostras teciduais de endométrio eutópico e ectópico das \n10 pacientes na fase proliferativa do ciclo menstrual (1 ˚ ao 12 ˚ dia). Durante a \nlaparoscopia, exame para diagnóstico da endometriose, foram coletadas biópsias das \ndiferentes lesões endometrióticas, send o 10 amostras de endometrioma ovariano e \n\n \n \n41\n10 amostras de endométrio eutópico das mesmas pacientes utilizando Cureta de \nNovak. Por se tratar de um procedimento rotineiro para diagnóstico, não acarretou \ndesconforto adicional às pacientes.  \nTodos os casos foram histopatologic amente confirmados. A doença foi \nestadiada de acordo com a classificação da American Society for Reproductive \nMedicine (1997). As amostras foram armazenadas em freezer a -80 ˚C após \ntratamento com criopreservador Tissue-T eck® O.C.T. Compound  (Sakura Finetek \nUSA. Inc., Torrance, CA). \n \nMétodos \nPreparação das Células Metafásicas \nAmostras de sangue periférico de indi víduos normais do sexo feminino foram \ncultivadas durante 72 horas a 37 °C segundo a técnica de obtenção de células \nmetafásicas a partir da cultura temporária de linfócitos de sangue periférico \n(Moorhead et al. , 1960) modificada por Ferrari (1968). Em resumo, a cultura de \nsangue periférico foi estimulada com fitohemaglutinina (Difco) por 71 horas a 37 °C. \nAdicionou-se colchicina 0,0016% permanecendo por 1 hora a 37 °C. A hipotonização \nfoi feita com solução de  KCl (0,075M) e interrompida ap ós 20 minutos com fixador \n(metanol/ácido acético 3:1). O procedimento  de fixação do sedimento foi repetido \nduas vezes, sendo que a última repetição foi realizada com fixador na proporção \nmetanol/ácido acético 1:1. Após o gotejamento do material nas lâminas, estas foram \narmazenadas a -20°C até sua utilização. \n\n \n \n42\nExtração de DNA de tecido endometrial \nO DNA foi isolado utilizando o reagente TRIzol LS (Invitrogen) de acordo com \nas normas do fornecedor, para posterior amplificação e marcação por SCOMP.  \nApós a retirada da fase aquosa com RN A, os tubos contendo  a interfase/fase \norgânica com TRIzol foram centrifugad os a 12.000 RPM durante 5 minutos a 4 ˚C. \nQualquer resquício da fase aquosa foi cuidadosamente removido evitando assim a \ncontaminação do DNA com RNA. Foram ad icionados 5 mL de tampão BEB (back \nextraction buffer) para cada 1 mL de TRIz ol utilizado para a extração de RNA em \ncada tubo. Durante pelo menos 3 minutos,  as amostras foram homogeneizadas por \ninversão dos tubos. Os tubos foram centrifugados a 12.000 RPM durante 30 minutos \nem temperatura ambiente. A fase aquosa su perior foi transferida para outro tubo \nonde foram adicionados 0,4 mL de isopropanol para cada 1 mL de TRIzol. A amostra \nfoi misturada por inversão durante 5 minu tos à temperatura ambiente. Em seguida \nas amostras foram centrifugadas a 12.000 RPM durante 15 minutos a 4 ˚C. O \nsobrenadante foi removido e 0,5 mL de etanol 70% para cada 1 mL de TRIzol \nutilizado na extração de RNA foi adiciona do ao DNA precipitado para lavagem. A \namostra foi centrifugada a 12.000 RPM durante 15 minutos a 4 ˚C. O etanol foi \nremovido e o DNA foi ressuspendido em 20µL de água. O DNA foi então armazenado \na -80˚C até sua utilização. \n \n\n \n \n43\nAmplificação e Marcação do DNA por SCOMP \n                       - Single Cell Comparative Genomic Hybridization -  \nO protocolo utilizado para marcação por SCOMP foi proposto em 2002  \n(Stoecklein et al., 2002). Para a ligação de adaptadores, foi utilizado um total de 150 \na 300 ng do DNA purificado.  As reações de clivagem com a endonuclease de \nrestrição MseI, ligação dos adaptadores e a primeira amplificação pela PCR foram \nrealizadas no mesmo tubo para prevenir a perda de fragmentos genômicos.  \nInicialmente, o DNA foi submetido à clivagem com 24 unidades da \nendonuclease de restrição MseI (New England Biolabs ), em tampão universal One-\nphor-All buffer plus (OFA pl us) (10mM de Tris-acetato pH 7,5, 10mM de acetato de \nmagnésio, 50mM de acetato de potássio). Incubou-se a 37°C durante 3 horas e em \nseguida a 65°C, durante 5 minutos, para inativação da enzima. \nEm um tubo separado, os adaptadores foram formados pelo pareamento dos \noligonucleotídeos LIB1 (5’-AGTGGG ATTCCTGCTGTCAGT-3’) e ddMseI (5’-\nTAACTGACAGCdd-3’). O pareamento de base s dos oligonucleotídeos adaptadores foi \nrealizado em tubo separado, submetido a um gradiente de temperatura de 65°C a \n15°C com rampa de 1 min/°C. Em seguida, adicionou-se 1 µL de ATP 10mM \n(Invitrogen) e 1 µL de T4 DNA ligase (Roche) 5U/µL. Esta mistura foi transferida ao \nDNA previamente tratado com a endonuclease MseI  e incubada a 15°C overnight.  \nApós a ligação dos adaptadores, o kit Elongase Amplification System (Roche)  \nfoi utilizado para a amplificação primária. A reação foi realizada em um volume final \nde 50 µL contendo 2,5 mM de cada dNTP, 60 mM de Tris-SO 4 pH 9,1, 10 mM de \n\n \n \n44\n(NH4)SO4, 1,5 mM de MgSO4 e 1 unidade da enzima Expand Long Template (Roche). \nAdicionamos 40 µL desse mix aos 10 µL da reação de ligação. A amplificação foi \nrealizada em um termociclador programá vel PTC-200 (MJ Research) e consistiu de: \n(a) 68°C por 3 minutos, (b) 15 ciclos  de 94°C por 40 segundos, 57°C por 30 \nsegundos e 68°C por 1 minuto e 30 segundos  (com 1 segundo adicional por ciclo \npara a temperatura de extensão), (c) 8 ciclos de 94°C por 40 segundos, 57°C por 30 \nsegundos (com 1 segundo adicional por ciclo) e 68°C por 1 minuto e 45 segundos \n(com 1 segundo adicional por ciclo), (d) 22 ciclos de 94°C por 40 segundos, 65°C por \n30 segundos e 68°C por 1 minuto e 53 segundos (com 1 segundo adicional por ciclo) \ne (e) 1 ciclo de 68°C por 3 minutos e 40 segundos. \nOs produtos de amplificação foram pu rificados utilizando-se o QIAquick PCR \nAmplification Kit (QIAGEN) de acordo com as instruções do fornecedor.  \nPara a amplificação secundária, 2 µL do produto previamente purificado foram \nutilizados como molde em uma segunda reaç ão de amplificação para marcação dos \nfragmentos. A solução de reação foi composta por 60 mM de Tris-SO4 pH 9,1, 10 mM \nde (NH 4)SO4, 1,5 mM de MgSO 4, 2 unidades da enzima Elongase, 1,4 µM do \noligonucleotídeo LIB1, 330 µM de dGTP, dATP e dCTP, 290 µM de dTTP e 40 µM de \ndigoxigenina 11-dUTP (para o DNA de refe rência) ou biotina 16-dUTP (para o DNA \nteste). \nAs condições de amplificação foram de 1 ciclo de 94°C por 1 minuto, 60°C por \n30 segundos, 68°C por 2 minutos; 10 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 \nsegundos e 68°C por 2 minutos com 20 segundos adicionais por ciclo. \n\n \n \n45\nO oligonucleotídeo LIB1 foi removido pelo tratamento com a enzima de \nrestrição TruI (Fermentas) conforme as instruções reco mendadas pelo fornecedor. A \nenzima foi inativada a 65°C por 5 minutos. \nPara a reação de precipitação, 8 µg de DNA teste (marcado com biotina 16-\ndUTP) foram colocados em um tubo  de reação, juntamente com 8 µg de DNA de \nreferência (marcado com digoxigenina 11-dUTP), 10 µL de Human Cot-1 DNA (1 \nmg/mL), 10 µL de DNA de esperma de salmão (10 µg/µL), 10 µL de acetato de sódio \n3 M, 400 µL de etanol absoluto gelado. O tubo foi mantido a -20ºC overnight ou a -\n70ºC durante 1 hora. Centrifugou-se a 14.000 RPM, a 4ºC durante 45 minutos, \nadicionou-se 300 µL de etanol 70%, centrifugou-se novamente e depois o material \npermaneceu secando à temperatura ambien te. O mesmo foi ressuspendido em 6 µL \nde solução 30% dextran sulfato/4xSSC durante 15 minutos a 37 ˚C e em seguida \nforam adicionados 6 µL de formamida 100%.  A sonda foi desnaturada por 6 minutos \na 78ºC e incubada a 37ºC por 1 hora (pré-anelamento). \n \nHibridação Genômica Comparativa \nMetáfases normais do sexo feminino foram tratadas em uma solução 10% \npepsina/0,01M HCl a 37°C durante 2 minutos  para eliminação do citoplasma. Em \nseguida, as lâminas foram incubadas em PBS/MgCl 2 durante 5 minutos em \ntemperatura ambiente, desidratadas em uma série de etanóis (70%, 90% e 100% \npor 2 minutos cada) e deixadas à temperatur a ambiente para secagem.  As lâminas \nforam então incubadas em solução 2xSSC a 72°C durante 30 minutos e depois em \numa nova solução 2xSSC a temperatura am biente durante 5 minutos e em solução \n\n \n \n46\n0,1xSSC a temperatura ambiente dura nte 1 minuto. Em seguida ocorreu a \ndesnaturação das lâminas em solução NaOH à temperatura ambiente durante 45 \nsegundos e a incubação seqüencial das lâ minas em 0,1xSSC a 4°C durante 1 minuto \ne em 2xSSC a 4°C durante 1 minuto. As pr eparações foram então desidratadas em \numa série de etanóis (70%, 90% e 100% por 2 minutos cada). Quando as lâminas \nestavam completamente secas, a sonda foi aplicada às lâminas e coberta com \nlamínula, que foi selada com rubber cement. A hibridação ocorreu em câmara úmida \na 37°C durante 72 horas.  \nApós a hibridação, as lâminas fora m lavadas seqüencialmente em 50% \nformamida / 2xSSC pH 7,0, a 45 ˚C durante 5 minutos por 3 vezes; 0,1% SDS / \n0,1xSSC a 45 ˚C durante 5 minutos por 3 vezes e 2xSSC a 45 ˚C durante 5 minutos \npor 3 vezes. Em seguid a, uma solução de 20 µL de tampão TNB (0,1 M TRIS pH \n7,5/0,15 M NaCl/0,5% blocking reagente – Roche) e 20 µL de tampão block I (3% \nBSA e 4xSSC pH 7,0/0,1% Tween 20) foi apli cada às lâminas e estas foram cobertas \ncom lamínula e incubadas a 37°C em câma ra úmida durante 45 minutos. Após este \nprocedimento, as lamínulas foram reti radas e foi aplicada uma solução de 10 µL de \ntampão block I, 10 µL de tampão TNB, 5 µL de anti-digoxigenina-rodamina e 8 µL de \nFITC-avidina. As lâminas foram cobertas  com lamínulas e incubadas a 37°C em \ncâmara úmida durante 30 minutos. Finalizando, as lamínulas foram retiradas e as \nlâminas foram lavadas em solução 4xSSC/0,1% Tween 20 a 45 ˚C durante 5 minutos \npor 3 vezes e contracoradas com 20 µL de DAPI (VECTOR, CA) para a coloração dos \ncromossomos e núcleos.  \n \n\n \n \n47\nAnálise de Imagens \nEsta técnica utiliza uma estratégia de hibridação no qual o material genético a \nser investigado, geralmente o DNA da amos tra, é usado como uma sonda. Este DNA \né marcado com uma cor (por exemplo, verde, FITC), e uma quantidade igual de DNA \nnormal é marcada com uma cor diferente (c omo o corante vermelho rodamina). As \nduas sondas de DNA são hibridadas simu ltaneamente a uma preparação metafásica \nde cromossomos normais. Quando a amos tra contém cromossomos normais, ambas \nas sondas estarão presentes em quanti dades iguais, e os dois corantes se \ncombinarão para produzir uma terceira cor,  ou serão canceladas uma pela outra, e \nremovidas pelo computador. Quando a am ostra contém um excesso de material \ncromossômico, como cromossomos ou re giões cromossômicas adicionais, ou \namplificações de genes, a cor será verde. Regiões genômicas deletadas na amostra \nresultarão no excesso de sonda de DNA normal, produzindo um sinal vermelho. A \ntaxa de intensidade de cada fluorocromo é medida através do uso de um sistema de \nanálise de imagens digital, associado a um software apropriado (Blancato, 1999). \nAs preparações metafásicas foram examinadas em microscópio de \nepifluorescência Axioskop 2 Plus (Zeiss), ca pturadas e analisadas pelo programa de \nCGH Isis FISH Imaging System V 5.0 (M etasystem Gmbh, Althussheim, Germany). \nPara cada hibridação, de 20 a 30 imagen s foram capturadas, 10 das quais foram \nutilizadas para análise. O \nsoftware permite a comparação da quantidade de DNA \nteste (verde) com a quantidade de DNA cont role (vermelho) hibridados ao longo da \nextensão de cada cromossomo e dete rmina a razão média de fluorescência \nvermelho/verde para cada cromossomo. Em  regiões onde o núme ro de cópias de \nseqüências de DNA teste e referência é idêntico, espera-se que a razão de \n\n \n \n48\nfluorescência seja 1,0; quando o número re lativo de cópias de seqüências de DNA é \nmaior no teste, a razão é maior do que 1,0; e quando o número relativo de cópias de \nseqüências de DNA é menor no teste, a ra zão é menor do que 1,0. Desvios da razão \nabaixo ou acima dos limites de 0,8-1,25 são classificados como representações \nsignificantes de sub- ou sobre-representação do número de cópias das seqüências de \nDNA na amostra teste.  \nComo controle interno, testes de hibr idação utilizando DNA normal masculino \n(verde) versus feminino (vermelho) e depois, DNA normal masculino (vermelho) \nversus feminino (verde) foram utilizados para confirmar a eficiência da hibridação. \nTodos os cariótipos foram analisados por mais de um observador para garantir a \nconfiabilidade do teste. \n \nAnálise por Bioinformática \nAs listas de genes reconhecidos nas re giões de interesse foram obtidas nos \nbancos de dados Ensembl (Sanger Institute, \nhttp://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html). Após  a obtenção dessas listas \nde genes, a ferramenta FatiGO Plus (FatiG O+), do utilitário on-line Babelomics (Al-\nShahrour et al. , 2006), foi utilizada para estratific ar todos os locos existentes nas \nregiões de interesse, de acordo com suas  propriedades biológicas, bioquímicas e \nfuncionais. A ferramenta on-lin e PDQ-Wizard v.0.1 (Grimes  et al., 2006) foi utilizada \npara cruzar a lista dos genes com palavras-chave de interesse.  \n\n \n \n49\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nResultados \n \n\n \n \n50\nRESULTADOS \nVinte amostras de tecido endometrial foram analisadas pe la metodologia de \nCGH. A Figura 1 representa o padrão de hibridação obtido. Estas amostras foram \ndivididas em dois grupos, sendo dez amostr as de tecido endometrial eutópico no \nprimeiro grupo e dez de tecido endometrial ectópico ovariano no segundo grupo.  \nA análise do software Metasystem ap ontou alterações cromossômicas em \nambos os grupos analisados (Tabela 2). No grupo eutópico, 6/10 amostras \napresentaram alterações e no grupo ectóp ico foram encontradas alterações em 7/10 \ncasos. As alterações observadas no grupo eutópico foram perda em 9q (dois casos) e \nganhos em 1p (dois casos), 1q (três caso s), 2q, (um caso), 9q (dois casos), 11q \n(dois casos), 12q (um caso), 13p, (um caso ), 14p (dois casos), 14q (um caso), 15p \n(um caso), 16q (um caso), 17p (dois casos), 17q (dois casos), 19p (quatro casos), \n19q (três casos), 20q (um caso), 21p (um caso), 21q (um caso) e 22q (três casos). O \ngrupo ectópico apresentou perdas em 8p (u m caso), 9p (um caso ), 9q (três casos), \n15q (um caso) e ganhos em 1p (um caso),  1q (três casos), 11q (dois casos), 13p, \n(um caso), 14p (um caso), 15p (um caso),  16q (três casos), 17p (três casos), 18p \n(um caso), 19p (três casos), 19q (dois ca sos), 20q (um caso), 21p (um caso), 22q \n(um caso) e Xq (um caso).  \n \n\n \n \n51\n \nFigura 1: Padrão de hibridação obtido pe la técnica de CGH. No alto, da esquerda \npara a direita, metáfase observada ao mi croscópio de epifluorescência Axioskop 2 \nPlus (Zeiss), no filtro para DAPI, FITC, Rodamina e a sobreposição de cores. Abaixo, \nperfil obtido após a captura das metáfases do caso ON1. \n\n \n \n52\nTabela 2: Alterações cromossômicas de tectadas por CGH nos dois grupos: dez \namostras de tecido endometrial ectópic o e 10 amostras de tecido endometrial \neutópico. \nECTÓPICO EUTÓPICO \nO1 -9q ON1 sem alterações \nO2 -9q ON2 -9q \nO3 -9q ON3 -9q, +19p, +22q \nO4 +1q, -8p, +11q, +13p, \n+14p, +15p, -15q, +16q, \n+17p, +19p, +19q, +21p, \n+Xq \nON4 +1q, +13p, +14p, +15p, \n+16q, +17p, +19p, +19q, \n+21p \nO5 sem alterações ON5 +1q \nO6 sem alterações ON6 sem alterações \nO7 +1p, +1q, -9p, +11q, +16q, \n+17p, +18p, +19p, +19q, \n+20q, +22q \nON7 +1p, +2q, +9q, +11q, \n+12q, +14q, +17q, +19p, \n+19q, +21q, +22q \nO8 sem alterações ON8 sem alterações \nO9 +17p ON9 sem alterações \nO10 +1q, +16q, +19p ON10 +1p, +1q, +9q, +11q, \n+14p, +17p, +17q, +19p, \n+19q, +20q, +22q \n(-) = perda; (+) = ganho; vermelho = perda; verde = ganho. \nO = tecido de endometriose ovariana; ON = tecido de endométrio normal das mesmas \npacientes com endometriose ovariana. \n \nQuando as amostras foram separadas por paciente, foram formados 10 grupos, \ncada um contendo uma amostra de tecido eutópico e ectópico de uma mesma paciente. \nDuas pacientes (O6/ON6 e O8/ON8) não apresentaram nenhuma alteração em ambos \n\n \n \n53\nos tecidos. Duas pacientes (O1/ON1 e O9 /ON9) apresentaram alteração apenas no \ntecido ectópico, sendo perda em 9q na paciente O1 e ganho em 17p na paciente O9. \nUma paciente (O5/ON5) apresentou alteração apenas no tecido eutópico, sendo um \nganho em 1q. Foram observadas alterações cromossômicas em ambos os tecidos em \ncinco pacientes (O2/ON2, O3/ON3, O4/ON4, O7/ON7 e O10/ON10). A paciente O2/ON2 \napresentou a mesma alteração (perda em 9q) tanto no te cido eutópico quanto no \nectópico. A paciente O3/ON3 mostrou perda em 9q como alteração comum nos dois \ntecidos, entretanto, ganhos em 19p e 22q foram encont rados apenas no tecido \neutópico. Na paciente O4/ON4, todas as alterações encontradas no tecido eutópico \n(ganho de 1q, 13p, 14p, 15p, 16q, 17p, 19p, 19q e 21p) também foram encontradas no \nectópico, no qual também se observou perda de 8p e 15q, e ganho de 11q e de Xq. A \npaciente O7/ON7 apresentou ganhos em 1p, 11q, 19p, 19q e 22q nos dois tecidos, mas \nforam encontrados ganhos em 2q, 9q, 12q, 14q, 17q e 21q apenas no tecido eutópico e \nganhos em 1q, 16q, 17p, 18p e 20q, bem como  perdas em 9p apenas no tecido \nectópico. Por fim, a paciente O10/ON10 apresentou ganho de 1q e 19p em ambos os \ntecidos, porém, ganho em 16q foi encontrado no tecido ectópico e ganhos em 1p, 9q, \n11q, 14p, 17p, 17q, 19q, 20q e 22q foram encontrados apenas no tecido eutópico.  \nAs Figuras 2 e 3 ilustram as alteraçõ es encontradas somando-se todas as \nlesões ectópicas e eutópicas, respectivamen te. Os cromossomos 3, 4, 5, 6, 7 e 10 \nnão apresentaram quaisquer alterações. As Figuras 4 a 20 representam as alterações \ncromossômicas para o tecido eutópico e ectópico em cada um dos 10 pares de \namostras. As regiões cromossômicas 1p 33-pter, 11q12-q13.1, 17p11.1-p12, 17q25-\nqter, 19, 20q11.23-qter e 22q11.2-qter apre sentaram alterações significativas, que \nestão descritas nas Figuras 4, 8, 14, 16, 17 e 19.  \n\n \n \n54\n \n \n \n \nFigura 2: Alterações cromossômicas detectadas por CGH no grupo de 10 \namostras de tecido ectópico. Perdas em vermelho e ganhos em verde. \n \n\n \n \n55\n \n \n \nFigura 3: Alterações cromossômicas detectadas por CGH no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico das pacientes com endometriose. Perdas em vermelho e \nganhos em verde. \n \n \n \n\n \n \n56\n \nFigura 4: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 1 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \nFigura 5: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 2 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. A barra \nverde representa ganho. \n\n \n \n57\n \n \nFigura 6: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 8 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. A barra \nvermelha representa perda. \n \n \nFigura 7: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 9 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nvermelhas representam perda e as verdes representam ganho. \n \n\n \n \n58\n \n \nFigura 8: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 11 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \nFigura 9: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 12 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. A barra \nverde representa ganho. \n \n \n\n \n \n59\n \n \n \nFigura 10: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 13 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \nFigura 11: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 14 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \n\n \n \n60\n \n \n \nFigura 12: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 15 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho e a vermelha representa perda. \n \n \nFigura 13: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 16 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \n\n \n \n61\n \n \n \nFigura 14: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 17 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \nFigura 15: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 18 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. A barra \nverde representa ganho. \n \n \n \n\n \n \n62\n \n \n \nFigura 16: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 19 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \n \nFigura 17: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 20 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \n\n \n \n63\n \n \n \nFigura 18: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 21 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \n \nFigura 19: Alterações detectadas por CGH no cromossomo 22 no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \n \n\n \n \n64\n \nFigura 20: Alterações detectadas por CGH no cromossomo X no grupo de 10 \namostras de tecido eutópico e ectópico das pacientes com endometriose. As barras \nverdes representam ganho. \n \nAs alterações cromossômicas significat ivas envolveram os cromossomos 1p, \n11q, 17p, 17q, 19, 20q e 22q. De vido ao fato de alguma s alterações terem sido \npreviamente detectadas em tecidos normais em 1p, 19 e 22, regiões ricas em G-C, já \ndescritas na literatura como resultados falso-positivos por CGH (Mhawech  et al. , \n2002), essas regiões foram excluídas para futuras investigações. As regiões 11q, 17p \ne 17q não envolvem regiões de seqüências repetitivas e apresentaram alterações em \nmais de uma amostra, sendo, portanto selecionadas como re giões cromossômicas \npreferenciais para futura identificaçã o de genes envolvidos no processo de \ndesenvolvimento da doença.  \n\n \n \n65\nAs listas dos genes reconhecidos nessas regiões de interesse (regiões pré-\nselecionadas a partir dos ensaios de CG H) foram obtidas nos bancos de dados \nEnsembl (Sanger Institute, http://www.ense mbl.org/Homo_sapiens/index.html), \nespecificando-se os intervalos de band a G de interesse. Foram obtidas listas de \ngenes, exportadas em formato textual, das regiões: 11q12.3- q13.1, 17p11.1-p12 e \n17q25.3-qter. As listas foram utilizadas para triagens de genes com funções \nrelevantes que poderiam de alguma forma influenciar a ocorrência ou \ncomportamento das lesões endometrióticas. Após a obtenção das listas de genes, a \nferramenta FatiGO Plus (FatiGO+), do utilitário on-line Babelomics (Al-Shahrour  et \nal., 2006), foi utilizada para estratificar todos os locos existentes nas regiões de \ninteresse, de acordo com suas propriedades  biológicas, bioquímicas e funcionais. A \nferramenta on-line PDQ-Wizard v.0.1 (Grimes et al., 2006) foi utilizada para cruzar a \nlista dos genes com palavras-chave de interesse, obtendo-se o número total e a \nidentificação de cada pub licação pré-existente envolve ndo um determinado gene e \ntermos como “endometriose”, “endomé trio” ou “carcinoma de ovário”. A \nsobreposição das duas ferramentas (FatiGo+ e PDQ Wizard) possibilitou a seleção de \nvários genes relevantes nas regiões de interesse, entre eles, os genes VEGFB, BIRC5 \ne TNFRSF13B. \n \n\n \n \n66\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDiscussão \n \n\n \n \n67\nDISCUSSÃO \nA endometriose é uma doença ginecoló gica benigna agressiva, caracterizada \npela presença de tecido endometrial ectópico (Yang  et al. , 2004). Embora muitas \nmulheres possam apresentar focos da doença, mesmo assintomáticas  (Nap et al. , \n2004), ela é caracterizada por sintomas como  dismenorréia, dispaneuria, dor pélvica \ne infertilidade (Poliness  et al. , 2004). Acredita-se que cer ca de 10% da população \nfeminina total seja afetada (Dabrosin  et al. , 2002) e que 50% das pacientes com \ninfertilidade e dor pélvica tenham endometriose (Cornillie et al., 1990).  \nA literatura relata que de 25% a 50% das mulheres inférteis apresentam \nendometriose, e que de 30% a 50% das mu lheres com endometriose são inférteis \n(The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine, 2004). \nNo entanto, várias questões fisiopatológicas  e terapêuticas a respeito da associação \nentre endometriose e infertilidade permanecem não esclarecidas. \nAté o momento, a etiologia da doença permanece desconhecida. A \nendometriose na cicatriz após a cirurgia cesariana representa a única localização de \nimplantes endometrióticos cuja etiologi a é conhecida. Acredita-se que durante o \nprocedimento cirúrgico, quando a cavidade uterina está aberta, haja um alto risco de \ndecidualização da implantação do endométrio (Tarkowski et al., 2001). \nVárias teorias têm sido propostas para explicar a etiologia da endometriose, \nsendo as três principais a) implantação e crescimento de tecido endometrial em \nlocais ectópicos após o refluxo menstr ual retrógrado; b) desenvolvimento de \nmetaplasia; c) desenvolvimento a partir  de remanescentes Müllerianos. Dados \nepidemiológicos, cirúrgicos e patológicos questionam se as lesões peritoneais, \n\n \n \n68\novarianas e do septo retovaginal apresentam uma etiologia comum única ou se \nrepresentam três entidades com etiolo gia e patogênese distintas (Vigano  et al. , \n2004). Embora a teoria do fl uxo retrógrado seja a mais  aceita, diversos autores \nsugerem uma origem diferente para cada um dos três tipos de endometriose (Nisolle \ne Donnez, 1997; Giudice e Kao, 2004; Vigano et al., 2004).  \nDiversos fatores de risco já foram de scritos para endometriose, entre eles, \nciclos menstruais curtos, longa duração do  fluxo menstrual, nuliparidade ou menarca \nprecoce bem como história familial da doen ça em parentes de primeiro grau. No \nentanto, as causas genéticas da endome triose ainda são desc onhecidas, e pouca \ninformação existe acerca de riscos constitutivos individuais, tais como \nhereditariedade e alterações genéticas so máticas que poderiam predispor à doença. \nDiscute-se que a endometriose possua um componente genético, e que alterações \ncromossomo-específicas adquiridas possam estar envolvidas em sua patogênese.  \nDada essa origem genética desc onhecida, estudos que promovam um \nscreening completo das alterações genômicas presentes em amostras de tecido \nendometriótico, bem como de tecido norm al de pacientes com endometriose, podem \nser informativos na busca por um possível marcador genético para a doença, além \nde contribuir para a definição de su a origem. Dessa forma, optamos pela \nmetodologia de CGH, que permite um screening total para perdas e ganhos \ngenômicos de uma amostra determinada. \nNeste estudo avaliamos 20 amostras, sendo 10 de endometriose ovariana \n(tecido ectópico) e 10 de tecido endometr ial normal (tecido eutópico) das mesmas \npacientes. Diversas alterações envolve ndo principalmente ganhos de regiões \n\n \n \n69\ncromossômicas foram observadas em ambos os tecidos, após análise citogenética \nmolecular por CGH.  \nA literatura é bastante controversa em  relação aos aspectos genéticos da \nendometriose e poucos estudos, utilizando a metodologia de CGH, foram realizados. \nUtilizando a técnica de CGH, existem rela tos da total ausência de alterações \ncromossômicas em todas as amostras de endometriose analisadas (Mhawech  et al. , \n2002), bem como a detecção de perdas e ganhos de regiões cromossômicas em \n15/18 amostras (83%), sendo principalm ente perdas em 1p 32-36, 5p, 6q, 7p14-\np22ter e 22q12.3-qter e ganhos em 6q e 17q (Gogusev  et al. , 1999). Em nosso \nestudo, encontramos alterações em 7/ 10 amostras (70%) de endometriomas \novarianos, e diferentemente dos outros auto res, observamos principalmente ganhos \nem 1p, 1q, 11q, 13p, 14p, 15p, 16q, 17p , 18p, 19p, 19q, 20q, 21p, 22q e Xq e \nperdas em 8p, 9p, 9q e 15q (Figura 2).  \nEssa discrepância de resultados pode ser explicada pela diferença no número \namostral utilizado e pela heterogeneidad e da origem da amostra. Mhawech e \ncolaboradores (2002) avaliaram tecido endo metriótico de pacientes com carcinomas \nde ovário provenientes da endometriose e,  apesar do quadro clínico agressivo, \nnenhuma alteração cromossômica foi encont rada no tecido endometriótico. Isto \nsugere que não há uma associação estabel ecida entre alterações genômicas e pior \nprognóstico, embora o estudo tenha sido realizado com apenas três pacientes. Nossa \nanálise também não encontrou nenhuma correlação entre a presença ou ausência de \nalterações cromossômicas e um mau prog nóstico, de acordo com os dados do \nseguimento clínico dessas pacientes. O fato das pacientes O4/ON4, O7/ON7 e \n\n \n \n70\nO10/ON10 apresentarem mais alterações  cromossômicas que as outras não foi \nrelacionado com nenhuma complicação ou agravante da sintomatologia clínica. \nNenhuma das pacientes evoluiu para quadro  de tumor de ovário após seguimento \nclínico de três anos. Não foi observad a nenhuma diferença clínica, tanto nas \npacientes com perfil cromo ssômico normal, quanto na quelas que apresentaram \nvárias alterações. \nO outro estudo (Gogusev  et al. , 1999) analisou tecido endometriótico de \norigens diferentes, sendo 6 implantes pe ritoneais, 2 nódulos endometrióticos \numbilicais e 10 endometriomas ovarianos. Nosso estudo inclui u apenas tecido \nendometriótico ovariano, visando diminuir a heterogeneidade amostral,  já que a \nendometriose nas diferentes localizações pode apresentar alterações genéticas \ndistintas entre si, bem como diferentes origens. \nA investigação do tecido endometrial eutópico  de mulheres com endometriose \né outra questão bastante interessante. Um estudo utilizando a técnica de CGH array \nmostrou que todas as cinco amostras estu dadas apresentaram diversas alterações \nem vários cromossomos, sendo 1p, 3p e 4p  as regiões mais comumente envolvidas \nem alterações genômicas (Guo  et al. , 2004). Além disso, houve uma \nheterogeneidade considerável nas alteraçõ es entre as pacientes, já que nenhuma \nalteração foi comum entre elas, provavelmente um resultado da heterogeneidade em \nrelação à idade do surgimento da doença, estadio e outros fatores desconhecidos. \n Em nosso estudo, dentre as 10 amostras de tecido endometrial eutópico das \npacientes com endometriose, seis aprese ntaram alguma alteração cromossômica, \nenvolvendo perda em 9q e ganhos em 1 p, 1q, 2q, 9q, 11q, 12q, 13p, 14p, 14q, 15p, \n\n \n \n71\n16q, 17p, 17q, 19p, 19q, 20q, 21p, 21q e 22q (Figura 3). Estes resultados confirmam \nque o endométrio histologicamente no rmal de mulheres com endometriose \napresenta alterações genômicas, como prev iamente descrito na literatura (Giudice e \nKao, 2004). A presença de alterações nas am ostras de tecido eutópico de mulheres \nafetadas confirma a predisposição desse en dométrio ao desenvolvimento da doença, \npodendo ser consideradas como alterações primárias para a doença. \nAlém disso, observamos que na maiori a dos nossos casos,  as alterações \nencontradas no tecido eutópico não fo ram as mesmas observadas no tecido \nectópico, com exceção do caso O2/ON2 onde  a alteração no tecido eutópico foi a \nmesma no ectópico (perda de 9q). Em um  caso (O4/ON4), todas as alterações \nencontradas no tecido normal foram observ adas também no tecido endometriótico, \nporém este apresentou algumas outras al ém das que foram encontradas no tecido \neutópico. Em outros três casos (O3/ON3,  O7/ON7 e O10/ON10), ambos os tecidos \ncompartilharam apenas algumas das al terações. Esta aparente falta de \nhomogeneidade poderia ser devido à possib ilidade de múltiplas vias que levam à \nendometriose. A observação de alterações  diferentes nos dois tecidos da mesma \npaciente coloca em dúvida  a aplicabilidade da teoria de Sampson em nossas \namostras. Pela teoria do fluxo reverso,  supõe-se que as mesmas alterações \nencontradas no endométrio normal fossem encontradas no tecido  endometriótico e \nque este pudesse apresentar alterações  extras que seriam responsáveis por \ncaracterísticas favoráveis ao desenvolvi mento da endometriose, como adesão, \nproliferação celular, controle negati vo da apoptose e an giogênese, que o \ndiferenciariam do tecido histologicamente normal.  \n\n \n \n72\n Embora a teoria mais aceita seja a teoria da implantação de Sampson \n(Sampson, 1927), existem linhas de pesq uisa sugerindo que a endometriose \novariana possui uma origem diferente da peritoneal. Postula-se que a origem da \nlesão peritoneal ocorra, de fato, por impl antação de células provenientes do fluxo \nretrógrado, e que a lesão ovariana origina-se por metaplasia do tecido ovariano, isto \né, indiferenciação e rediferenciação da célula ovariana, com mudança de \ncaracterísticas adquirindo um fenótipo endometrial (Nisolle e Donnez, 1997). Ou \nseja, a lesão seria originada de células ovarianas alteradas, e não do endométrio. \n Um dos argumentos que sustenta m essa teoria é a presença de \nendometriomas em pacientes com a síndrome de Rokitansky-Küster-Hauser, que não \npossuem útero e, portanto, não sofrem menstruação retrógrada (Rosenfeld e Lecher, \n1981). Dessa forma, nossos resultados ev idenciando alterações cromossômicas \ndiferentes entre os tecidos ectópico e eu tópico podem corroborar com os dados da \nliteratura, que sugerem origen s diferentes para as lesões  peritoneais e ovarianas. O \nfato não exclui a possibilidade das pa cientes que apresentaram um tecido \nendometrial geneticamente alterado, apresentarem uma maior predisposição para \ndesenvolvimento de endometr iose peritoneal devido ao mecanismo da menstruação \nretrógrada.  \n A metaplasia do epitélio celômico é uma das três teorias que tem sido \npropostas para explicar a patogênese da  endometriose ovariana típica, além da \ninversão e progressiva invaginação do córtex ovariano após o acúmulo de \nfragmentos menstruais derivados do sa ngramento de implantes endometrióticos \nsuperficiais localizados na superfície ov ariana, e do envolvimento secundário de \ncistos ovarianos funcionais por implantes endometriais localizados na superfície \n\n \n \n73\novariana (Vigano  et al. , 2004). A hipótese da metaplasia celômica propõe que a \nmembrana celômica original sofre meta plasia formando glândulas e estroma \nendometriais típicos. Essa teoria é su stentada pela descrição de casos de \nendometriose nas quais não ocorre menstruação retrógrada. \n As alterações cromossômicas significativas nas amostras analisadas \nenvolveram os cromossomos 1p, 11q, 17p, 17q, 19, 20q e 22q. As regiões 1p, 19 e \n22 não foram consideradas para análise, devi do à alta freqüência de polimorfismos e \na região 20q apresentou-se alterada em somente uma amostra. Desta forma, as \nregiões 11q, 17p e 17q foram consideradas regiões alvo, justificando a aplicação de \nferramentas de bioinformática para seu mapeamento.  \n Entre os inúmeros genes contidos nessa s regiões de interesse, identificamos \nvários deles relacionados à angiogênese,  regulação do ciclo celular, resposta \nimunitária e adesão celular. Na região 11q12.3-q13.1, encontram-se diversos genes \nrelevantes, entre eles: \nRELA (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A, \nnuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 3, p65 [avian] ), \nque atua no desenvolvimento tecidual e como regulador negativo da apoptose; CFL1 \n(cofilin 1[non-muscle]), que atua na diferenciação celular e na regulação negativa da \napoptose; SYVN1 ( synovial apoptosis in hibitor 1, synoviolin ), responsável pela \nregulação negativa da apoptose; VEGFB (vascular endothelial growth factor B ), que \natua na regulação positiva da proliferaç ão celular e regulação do ciclo celular; \nMARK2 (MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 ), atuando na morfogênese da \ncélula e nas cascatas de sinalização intracelular; e HTATIP ( HIV-1 Tat interacting \nprotein) responsável pela regulação do crescime nto celular e pela via de sinalização \ndo receptor de andrógeno e hormônios esteróides.  \n\n \n \n74\nA região 17p11.1-p12 também contem genes relevantes, como UBB (ubiquitin \nB), responsável pela morfogênese celular durante a diferenciação, desenvolvimento \ncelular e migração celular; MAP2K3 (mitogen-activated protein kinase 3 ), que atua \nem respostas inflamatórias, processos me tabólicos de citocinas e como regulador \npositivo da transcrição; SREBF1 ( sterol regulatory element binding transcription \nfactor 1), atuando em processos metabólico s de esteróides e do colesterol; TOP3A \n(topoisomerase [DNA] III alpha ), atuando na fase M do ciclo celular meiótico e na \nduplicação do DNA; TNFRSF13B (tumor necrosis factor receptor superfamily, \nmember 13B), que atua na resposta imunitária  como receptor do Fator de Necrose \nTumoral ( TNF); e MAPK7 ( mitogen-activated protein kinase 7 ), responsável pela \nmorfogênese de órgãos e angiogênese.  \nNa região 17q25-qter encontramos os  seguintes genes cujas funções são \nrelevantes: PDE6G (phosphodiesterase 6G, cGMP-specific, Rod, gamma) que atua na \ncascata de sinalização intracel ular e na transdução de si nais ligados a receptores de \nsuperfície celular; BIRC5 (baculoviral IAP repeat-containing 5 [survivin]), responsável \nprincipalmente pela regulação negativa da  apoptose, regulação do ciclo celular e \ncheckpoint do ciclo celular; CARD14 ( caspase recruitment do main family, member \n14), atuando principalmente na regulação da apoptose; SOCS3 ( suppressor of \ncytokine signaling 3), que atua na regulação negativa da apoptose e na regulação do \ncrescimento celular; CBX4 (chromobox homolog 4 [PC class homolog, Drosophila] ) \ntambém atuando na regulação negativa da  apoptose bem como na organização dos \ncromossomos; PSCD1 (pleckstrin homolog, Sec7 and coiled-coil domains 1 [cytohesin \n1]) responsável por adesão celular e tran sdução de sinal da proteína ras; MAFG (v-\nmaf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog G [avian] ), que atua na \n\n \n \n75\nmorfogênese de tecidos e no desenvolvimento epidérmico; e LGALS3BP ( lectin, \ngalactoside-binding, soluble, 3 binding protein ), responsável pela adesão celular e \ncomunicação celular.  \nEstes dados evidenciam que as regi ões alteradas mais significativas \nobservadas neste trabalho contêm gene s candidatos que controlam processos \ncelulares.   \nA metodologia de CGH mostrou-se efic az para a identificação de regiões \ncríticas e genes possivelmente relacionados  à fisiopatologia da endometriose. Em \nestudo piloto realizado, investigamos três genes - VEGFB, BIRC5 e TNFRSF13B – \npresentes nessas regiões críticas, pela técnica de PCR em tempo real. No entanto, os \nresultados preliminares obtidos não foram conclusivos (Meola, 2008; personal \ncommunication).  \nEsta foi a primeira investigação de perdas e ganhos cromossômicos utilizando \na metodologia de CGH em amostras de pacientes brasileiras com endometriose. \nTambém não há na literatura relatos de  um estudo caso-c ontrole autólogo \nenvolvendo amostras de endometriose ova riana e endométrio normal das mesmas \npacientes, investigadas pela técnica de CGH. A detecção de regiões cromossômicas é \netapa fundamental para a identificaçã o futura de genes relacionados ao \ndesenvolvimento da doença e de marcadores moleculares para diagnóstico da \ndoença.  \n\n \n \n76\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nConclusões \n \n\n \n \n77\nCONCLUSÕES \n \n(1) A técnica de CGH permitiu a iden tificação de perdas e ganhos em \ndiferentes regiões cromossômicas, sendo que o cariótipo foi normal em 30% das \namostras de endometriomas ovarianos e em 40% das amostras de endométrio \neutópico das pacientes com diagnóstico de endometriose. \n(2) A presença de perdas e ganhos de regiões cromossômicas no endométrio \neutópico, histologicamente normal, de mu lheres com endometriose ovariana, pode \nser considerada como alteração primária ao desenvolvimento da doença. \n (3) As regiões cromossômicas de alte rações significativas detectadas em \namostras de tecido endometrial eutópi co e ectópico contém diversos genes \nrelacionados à adesão celular, resposta imun itária, proliferação celular e controle da \napoptose. \n (4) A metodologia de CGH permitiu a detecção das regiões cromossômicas \n11q12.3-q13.1, 17p11.1-p12 e 17q25.3-qter como regiões críticas, direcionando \ninvestigações futuras para identificação de genes associados à endometriose. \n \n\n \n \n78\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nReferências \n \n\n \n \n79\nREFERÊNCIAS \nAL-FOZAN, H.; TULANDI, T. 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JAS and MY were supported by the \nNational Cancer Institute of Canada with funds from the Canadian Cancer Society. \nABSTRACT \nObjective: To identify genomic alterations in ectopic and eutopic endometrial \ntissue of women with ovarian endometriosis. \nDesign: The comparison of genomic data detected in each type of tissue. \nSetting: University hospital. \nPatients: Ten patients with confirmed diagnosis of endometriosis. \nInterventions: Comparative Genomic Hybridization (CGH) was performed to \nidentify genomic alteration s in the ectopic and eutopi c tissues from the same \npatients. \nMain Outcome Measures:  Gain and loss of chromosomal regions by \nComparative Genomic Hybridization analysis. \nResults and Conclusions:  In the eutopic group,  6/10 samples presented \nalterations and 7/10 cases show ed alterations in the ecto pic tissue. The presence of \nlosses and gains of chromoso mic regions in the histol ogically normal eutopic \nendometrium from women with ovarian en dometriosis can be considered as a \nprimary alteration in the development of the disease. The CGH methodology allowed \nthe detection of 11q12.3-q13. 1, 17p11.1-p12 and 17q25.3-qt er as critical regions, \nleading to future investigations for the identification of genes associated to \nendometriosis.  \n  \nKEYWORDS: endometriosis, infertility, comp arative genomic hybridization, \ncytogenetics, endometrium. \n\n \n \n91\nINTRODUCTION \nEndometriosis is a common benign gyn ecological disorder, very aggressive, \ncharacterized by the presence of ectopic endometrial tissue. Th e ectopic tissue is \nhistologically identical to the normal (eutopic), differing in functional and biochemical \naspects. It is characterized by dysmenorrea, dyspaneuria, pelvic pain and infertility or \na total absence of symptoms (1, 2).  \nI t  i s  r e p o r t e d  t h a t  a r o u n d  1 0 %  o f  t h e  f e m a l e  p o p u l a t i o n  a n d  5 0 %  o f  t h e  \npatients with infertility and pelvic pain  present endometriosi s. This incidence \nincreases along the reproductive age, it is rare before menarche and tends to \ndecrease after menopause. In addition, a polygenic and multifactorial tendency has \nbeen reported, as well as a higher risk fo r the disease (5-8%) in  women with family \nhistory of the disease in first grade relatives (3, 4). \nAlthough it is one of the most studied gynecological abnormalities, its etiology \nhas not been clarified. The most popula r theory to explain it is Sampson’s \nimplantation theory, which postulates that  the endometrial cells exfoliated during \nmenstruation suffer reflux through the uterine tubes, adhere and proliferate in \nectopic sites, mainly peritoneum, ovary an d retovaginal septum (5). On the other \nhand, considering retrograde menstruation as a nearly universal phenomenon, it is \ndifficult to explain why only a fraction of women develops endometriosis. Gebel et al. \n(6) proposed that the percentage of me nstrual endometriotic cells that suffer \napoptosis in women with endometriosis is lower in comparison to the endometrial \ntissue of fertile controls, increasing the number of cells that  survive and keeping \nphysiological activity. Some studies suggest  a multidimensional etiology including \nhereditary, hormonal and immunological fact ors (7, 8). At cellular level, the disease \n\n \n \n92\nis characterized by monoclon al growth and can present ma lignant features as local \ninvasion and metastasis (9).  \nEndometriosis suffers malignant transformation in a frequency of 0.7% to 1%; \nhowever, this frequency can be even high er once the tumor can destroy the original \nendometriotic tissue and elim inate the histopathological evidences of endometriosis \n(10). Nevertheless, since endometriosis ha s been associated to infertility, the \ncorrelation between the disease and cancer  must be carefully interpreted, as an \nincreased risk might be due to nulliparity and not endometriosis per se (11). \n \nComparative Genomic Hybridization and Endometriosis  \nNo specific chromosomal alteration has be en identified in endometriotic tissue \nby karyotyping analysis, probably due to the limitations regarding the cell culture. \n(12). The comparative genomi c hybridization (CGH) is a versatile technique that \nallows the whole genome to be analyzed  in one single experiment, without the \nnecessity of metaphase chromosomes from the sample, eliminating the cell culture \n(13).  \nThere are some reports on CGH as a tool for the detection of genetic \nalterations in endometriosis.  Gogusev et al. (14) examin ed 18 endometriotic lesions \nfrom patients in advanced stage of the di sease, and recurrent alterations in gene \ncopy number were found in 15 out of  18 cases (83%). Genomic losses in \nchromosomes 1p and 22q were detected in  50% of the cases. Other common losses \nwere observed at 5p, 6q, 7p, 9q, 16 and 17q. Gains were found at 1q, 6q, 7q and \n17q. The same group also evaluated by CGH a permanent cell lineage derived from \nendometriosis (FbEM-1) and observed that gains were more common than losses, as \n\n \n \n93\na significant increase in DNA sequence copy  number was detected at 1q, 5p, 6p and \n17q (15).  \nThis methodology was also applied in th e evaluation of genetic alterations in \novary carcinomas arising within endometr iosis (16). Chromosome  aberrations were \nobserved in the three cases of ovary carcin omas, but no alteration was detected in \nthe endometriotic tissue in neither the ca ses. The authors concluded that these \naltered regions might contain tumor suppre ssor genes or oncogenes responsible for \nthe malignant transformation of endometriosis.  \nThis study aimed to detect  chromosomal imbalance, by CGH, in ectopic tissue \nsamples from ovarian endometriomas and eutopic tissue from the same patients, \nand, consequently, the evaluation of gains and/or losses of chromosomal regions \nwhich might be involved in the developmental process of the disease.   \n\n \n \n94\nMATERIAL AND METHODS \nThis study was developed at the Labo ratory of Molecular Cytogenetics, \nDepartment of Genetics, School of Medicine  of Ribeirão Preto (FMRP-USP), Brazil, in \nassociation with the Department of Gynecology and Obstetrics (Human Reproduction \nDivision) from the same institution, and at the Division of Applied Molecular Oncology \nfrom the Princess Margaret Ho spital, Ontario Cancer Institute, University Health \nNetwork, Toronto, Canada. The project was approved by the Research Ethics \nCommittee (CEP) of the University Hospit al from the FMRP-USP, process number \n11736/2004. Written informed consent was obtained from each patient.  \n \n  Samples \nTwenty samples were collected from 10 patients following the inclusion \ncriteria: women in reproductive age (24 to  45 years), with regu lar menstrual cycles \n(25 to 35 days of interval) and no history of any hormonal therapy during the last six \nmonths before the collection;  the samples were obtained  during the proliferative \nphase of the menstrual cycle (1st to 12th day).  \nThe patients were divided into two groups: the eutopic group (control), \nwhere histological normal endometrial biop sies were collected using a Novak curette \nfrom 10 patients with confirmed diagnosis of endometriosis; and the ectopic group, \ncomposed by 10 ovarian endometriomas samples from the same patients, referred to \nour service by the Endoscopy and Pelvic Pa in Ambulatory (AGDE) and the Infertility \nAmbulatory of the University Hospital of the FMRP-USP due to pelvic pain and/or \ninfertility indication. All the biopsies were collected by laparoscopy and submitted to \nhistopathological analysis. The patients’ characterization concerning the lesion origin \n\n \n \n95\nand staging is observed in Table 1. The endometriosis stage was settled in \nagreement with the American Society for Reproductive Medicine  classification (17).  \nThe samples were stored at -80 0C after cryopreservation treatment with Tissue-\nTeck®  O.C.T. Compound  (Sakura Finetek USA. In c., Torrance, CA) for DNA \nextraction. \nComparative Genomic Hybridization \nThe protocol for DNA amplification and labeling by SCOMP was performed as \npreviously described with some modificati ons (18). Briefly, the probe (eutopic or \nectopic endometrial tissue DNA) and no rmal reference DNA (Promega) were \ndifferentially labeled using,  respectively, biotin-16-dU TP and digoxigenin-11-dUTP. \nEqual amounts (8µg) of labeled endometriotic DNA,  and normal reference DNA were \nco-precipitated with 10 µL of Human Cot-1 DNA (1 mg /mL). The labeled probe DNA \nwas resuspended in 12 µL hybridization mixture comp osed of 100% formamide and \n30% dextran sulfato/4xSSC. After denatura tion, the labeled DN A probes were co-\nhybridized to normal human metaphase sp reads prepared by phytohemagglutinin-\nstimulated peripheral blood lymphocyte cult ure. The hybridization was carried out at \n37˚C for 72h. The slides were  washed three times at 45 ˚C for 5 min each in 50% \nformamide/2xSSC, followed by three washes at 45 ˚C in 0.1% SDS/0.1xSSC and \nthree washes at 45 ˚C in 2xSSC. Biotinylated DNA se quences were visualized by \nfluorescein isothyocyanate (FITC)-conjuga ted avidin whereas digoxigenin-labeled \nsequences were detected using anti -digoxigenin-rhodamine. Chromosome \npreparations were counterstained with 4’-6- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride \n(DAPI). \n \n\n \n \n96\nDigital image analysis \nThe metaphases were examined using a epifluorescence microscope (Zeiss), \ncaptured and analyzed by the Metasystem (version 4.5.0.28) CGH program. For each \nsample, 20-30 images were captured, and the data from 10-12 representations of \neach chromosome were combined. Ga ins and losses of chromosomes or \nchromosomal regions were detected on the basis of the ratio profiles deviating from \nthe green to red balance value of 1.0 within 0.8-1.2 limits. The threshold values were \ndetermined according to previous re ports (14, 16). The centromeric, the \nheterochromatic regions and the short ar m of acrocentric chromosomes were not \nincluded in the interpretati on of gains and lo sses. Chromosome Y was also excluded \nfrom the analysis because the reference and test DNAs were from females.  \n\n \n \n97\nRESULTS \nTwenty endometrial tissue samples, ten eutopic endometrial tissue samples \nand ten ovarian endometriomas, were an alyzed by CGH. We have detected \nchromosomal alterations in both groups, summarized in Table 2. In the control \ngroup, 6/10 samples presented alterations, and in the ectopic group they were found \nin 7/10 cases. The alteration s observed in the control gr oup were loss at 9q (two \ncases) and gains at 1p (two cases), 1q (three cases), 2q, (one case), 9q (two cases), \n11q (two cases), 12q (one case), 13p (one case), 14p (two cases), 14q (one case), \n15p (one case), 17p (two cases), 17q (t wo cases), 19p (four cases), 19q (three \ncases), 20q (one case), 21p (one case), 21q (one case) and 22q (three cases). The \nendometriomas presented losses at 8p (one ca se), 9p (one case), 9q (three cases), \n15q (one case) and gains at 1p (one case ), 1q (three cases), 11q (two cases), 13p \n(one case), 14p (one case), 15p (one ca se), 16q (three cases), 17p (three cases), \n18p (one case), 19p (three cases), 19q (two cases), 20q (one case), 21p (one case), \n22q (one case) and Xq (one case).  \nComparative analysis of eu topic and ectopic tissue fr om each patient showed \ntwo patients (O6/ON6 and O8/ON8) without al terations in both tissues. Two patients \n(O1/ON1 and O9/ON9) presented alteration on ly in the ectopic tissue, as loss at 9q \nin patient O1 and gain at 17p in pati ent O9. One patient (O5/ON5) presented \nalteration only in the euto pic tissue (gain in 1q). Ch romosomal alterations were \nobserved in both tissues in five  patients (O2/ON2, O3/ON3, O4/ON4, O7/ON7 and \nO10/ON10). Patient O2/ON2 presented the same  alteration (loss at 9q) both in the \neutopic and in the ectopic tissue. Patient O3/ON3 show ed loss at 9q as a common \nalteration in both tissues, however, gain s at 19p and 22q were  f o u n d  o n l y  i n  t h e  \n\n \n \n98\neutopic tissue. All the alterations observed  in the eutopic tissue (gain at 1q, 13p, \n14p, 15p, 16q, 17p, 19p, 19q and 21p) from patient O4/ON4 were also found in the \nectopic tissue, in which loss at 8p and 15q, and gain at 11q and Xq were also \nobserved. Patient O7/ON7 presented gain s at 1p, 11q, 19p, 19q and 22q in both \ntissues, but gains were observed at 2q , 9q, 12q, 14q, 17q and 21q only in the \neutopic tissue and gains at 1q, 16q, 17p, 18p and 20q, as well as losses at 9p were \nreported only in the ectopic tissue. At la st, patient O10/ON10 presented gain at 1q \nand 19p in both tissues, however, gain at  16q was found in the ectopic tissue and \ngains at 1p, 9q, 11q, 14p , 17p, 17q, 19q, 20q and 22q were found only in the \neutopic tissue. The increased number of chromosomal alterations in patients \nO4/ON4, O7/ON7 and O10/ON10 did not sh ow any correlation to the symptoms \nseverity or poor prognosis. None of the patients presented ovarian tumor within a \nthree-year-follow up.  \nFigures 1 and 2 illustrate all the altera tions found in the ectopic and eutopic \ngroups respectively. Chromosomes 3, 4, 5, 6, 7 and 10 did not show alteration. \nChromosomal regions 1p33-pter, 11q12- q13.1, 17p11.1-p12,  17q25-qter, 19, \n20q11.23-qter and 22q11.2-qter presented significant alterations. The regions 11q, \n17p and 17q were selected as critical re gions because they in volve non-centromeric \nregions (or any other repetitive sequence re gion) and were detected in more than \none sample.  \nMoreover, some aberrations were previously described in normal tissues at 1p, \n19 and 22, G-C rich regions known to produce false-positive results by CGH (16).   \nThe lists of genes mapped to these regi ons were obtained in the database \nEnsembl (Sanger Institute, http://www.ensem bl.org/Homo_sapiens/index.html), at \n\n \n \n99\nspecific G-banding intervals. The lists we re obtained for regions: 11q12.3-q13.1, \n17p11.1-p12 and 17q25.3-qter. A ll of them were used for the selection of relevant \nfunction genes that could somehow influe nce the occurrence or behavior of the \nendometriotic lesions.  \nT h e  F a t i G O  P l u s  ( F a t i G O + )  t o o l ,  f r o m  Babelomics on-line system (19), was \nu s e d  t o  s t r a t i f y  a l l  l o c i  i n  t h e  r e g i o n s  of interest, according to their biological, \nbiochemical, and functional properties. Th e PDQ-Wizard v.0.1 (20) on-line tool was \nused to cross match the list of genes with specific keywords (“endometriosis”, \n“endometrium” or “ovarian carcinoma”), result ing in the identification of publications \ninvolving each specific gene.  \n\n \n \n100\nDISCUSSION \nMany theories have been proposed to explain the etiology of endometriosis. \nAlthough the retrograde reflux is the mo st popular theory, some authors suggest a \ndifferent theory for each one of the three types of endometriosis (21-23). It has been \ndiscussed that endometriosis has a ge netic component and that acquired \nchromosome-specific aberrati ons could be involved in its pathogenesis. Genetic \nstudies providing a complete screening of  the genomic aberrations present in the \nendometriotic tissue, as well as in normal tissue from the patients, can be extremely \ninformative in the search for a possible genetic marker for the disease.  \nIn this study we evaluated 10 ovarian endometriomas samples (ectopic tissue) \nand 10 normal endometrial samples from the same patients (eutopic tissue) by the \nCGH methodology. Many alterations involvi ng mainly gains of chromosomal regions \nwere observed in both tissu es. As far as we know, ther e are no reports regarding \ngenomic losses and gains by CGH in Brazilian patients, comparing ovarian \nendometriomas and normal endometrium.   \nThe literature is unclear about the genetics of endometriosis and there are few \nstudies using CGH. There are reports of to tal absence of aberra tions detected by \nCGH in all endometriosis samples (16) as well as the detection of gains and losses at \nchromosomic regions in 15 out of 18 endometr iotic  samples (83%), mainly losses at \n1p32-36, 5p, 6q, 7p14-p22ter and 22q12.3-qter and gains at 6q and 17q (14). We \nfound alterations in seven out of 10 ov arian endometriomas samples (70%) and, \ndifferently from others, we observed ma inly gains at 1p, 1q, 11q, 13p, 14p, 15p, \n16q, 17p, 18p, 19p, 19q, 20q, 21p, 22q and Xq and losses at 8p, 9p, 9q and 15q.    \n\n \n \n101\nThis discrepancy can be explained by the difference in the sample number and \nby the heterogeneity of the sample or igin. Mhawech et al. (16) evaluated \nendometriotic tissue from patients wi th ovarian carcinoma arising within \nendometriosis and, despite of the poor pr ognosis, no chromosomal alteration was \nfound in the endometriotic tissue.  This suggests that  there are no established \ncorrelations between genomic alterations an d poor prognosis, although this study \nhas been performed with only three patients. We also did not observe any correlation \nbetween either presence or absence of chro mosomal alterations and clinical follow-\nup.  \nA study using array CGH showed that all the five samples analyzed presented \nmany alterations in different chromosome s but mainly at 1 p, 3p and 4p (24). \nBesides, there was a considerable diversity in the alterations among the patients, as \nthey did not share any common alteration, probab ly due to the samples \nheterogeneity. Among our control group, corresponding to normal endometrium from \nthe patients, 60% (6/10) presented chromosomal alterations involving loss at 9q and \ngains at 1p, 1q, 2q, 9q, 11q, 12q, 13p, 14p, 14q, 15p, 16q, 17p, 17q, 19p, 19q, 20q, \n21p, 21q and 22q.  These results emphasize that the histologically normal \nendometrium from women with endometrio sis present genomic alterations, as \npreviously described (22). Moreover, in the majority of our samples, the alterations \nobserved in the eutopic ti ssue were different from th e ectopic tissue, with the \nexception of case O2/ON2 where loss at 9q was common to both tissues. In one case \n(O4/ON4), all alterations found in the no rmal tissue were also observed in the \nendometriotic tissue. In three other case s (O3/ON3, O7/ON7 and O10/ON10), both \ntissues shared only some alterations. This apparently lack of homogeneity could be a \n\n \n \n102\nreflex of the patients heterogeneity, or the possibility of multip le paths leading to \nendometriosis. The observation of different alterations in both tissues from the same \npatient challenges the applicability or Sa mpson`s theory in ou r samples. By the \nretrograde reflux theory, it is supposed that the same alterations found in the normal \nendometrium were also foun d in the endometriotic tissu e and this should present \nextra alterations responsible for adhesion, cell proliferation and angiogenesis, which \nwould differentiate it from the histologically normal tissue.  \nThe celomic metaplasia is one of the th ree theories that have been proposed \nto explain the pathogenesis of  the typical ovarian endometr iosis, in addition to the \ninversion and progressive invagination of the ovarian cortex af ter the accumulation \nof menstrual debris from bleeding of endo metrial implants, which are located on the \novarian surface, and the s econdary involvement of functional ovarian cysts by \nendometrial implants located on the ovar ian surface (23). The celomic metaplasia \nhypothesis states that the original celomic membrane undergoes metaplasia, forming \ntypical endometrial glands and stroma. This theory is supported by the description of \nendometriosis in Rokitansky-Küster-Hauser syndrome patients, who can not present \nretrograde menstruation (25). \nConsidering that peritoneal, ovarian and rectovaginal septum lesions are \ndistinct, we observed alterations that ca n contribute to the development of the \novarian endometrioma, especially altera tions at 11q12.3-q13. 1, 17p11.1-p12 and \n17q25-qter.   \nSome of these genomic alterations cont ain genes related to angiogenesis, cell \ncycle regulation, immune response and cell adhesion. At region 11q12.3-q13.1 there \nare many relevant genes such as: RELA (v-rel reticuloendothel iosis viral oncogene \n\n \n \n103\nhomolog A, nuclear factor of kappa light po lypeptide gene enhancer in B-cells 3, p65 \n[avian]), responsible for tissue development and in the negative control of apoptosis; \nCFL1 (cofilin 1[non-muscle] ), that plays a role in cell differentiation and in the \nnegative control of apoptosis; SYVN1 ( synovial apoptosis in hibitor 1, synoviolin ), \nresponsible for negative regulation of apoptosis; VEGFB (vascular endothelial growth \nfactor B), that plays a role in the positive regulation of cell proliferation and cell cycle \nregulation; MARK2 ( MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 ) ,  a c t i n g  i n  c e l l  \nmorphogenesis and intracellular signaling pathways; and HTATIP ( HIV-1 Tat \ninteracting protein) responsible for cell growth regulation and signaling pathways of \nthe androgen and steroid hormones receptors.   \nRegion 17p11.1-p12 also contains relevant genes for the endometriosis \nprocess, such as UBB ( ubiquitin B ), responsible for cell morphogenesis during \ndifferentiation and cell migration; MAP2K3 (mitogen-activated protein kinase 3), that \nplays a role in inflamatory responses, cytokines metabolic processes and as a positive \nregulator of transcription; SREBF1 ( sterol regulatory element binding transcription \nfactor 1 ), acting in steroid and chol esterol metabolic processes; TOP3A \n(topoisomerase [DNA] III alpha ), acting in the M phase of  the meiotic cell cycle and \nDNA replication; TNFRSF13B (tumor necrosis factor receptor superfamily, member \n13B), that plays a role in the immune response; and MAPK7 ( mitogen-activated \nprotein kinase 7), responsible for organ morphogenesis and angiogenesis.   \nAt region 17q25-qter we find the foll owing genes, whose functions can be \nrelated to the endometriotic process: PDE6G (phosphodiesterase 6G, cGMP-specific, \nRod, gamma ) that plays a role in the intracellular signaling pathways and signal \ntransduction related to cell surface receptors; BIRC5 (baculoviral IAP repeat-\n\n \n \n104\ncontaining 5 [survivin]), responsible mainly by negative regulation of apoptosis, and \ncell cycle regulation and checkpoint; CARD14 ( caspase recruitment domain family, \nmember 14 ), acting mainly in the apoptosis regulation; SOCS3 ( suppressor of \ncytokine signaling 3) , that plays a role in the negati ve regulation of apoptosis and \ncell growth regulation; CBX4 ( chromobox homolog 4 [PC class homolog, \nDrosophila]) ,  a l s o  a c t i n g  i n  t h e  n e g a t i v e  r e g u l a t i o n  o f  a p o p t o s i s  a s  w e l l  a s  i n  t h e  \nchromosomal organization; PSCD1 (pleckstrin homolog, Sec7 and coiled-coil domains \n1 [cytohesin 1] ) responsible for cell adhesion and ras protein signal transduction;  \nMAFG (v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog G [avian]), which \nacts in the tissue morphogenesis and epidermic development; and LGALS3BP (lectin, \ngalactoside-binding, soluble, 3 binding protein ), responsible for cell adhesion, \nresponse to cell defense and cell communication.   \nThis is the first investigation of ch romosomal losses and gains by the CGH \nmethodology in Brazilian endometriosis samp les. Also, there is no report in the \nliterature of an autologous  case-control study regard ing ovarian endometriosis \nsamples and normal endometrium from the same patients.     \nThe presence of losses and gains of chro mosomic regions in the histologically \nnormal eutopic endometrium from wome n with ovarian endometriosis can be \nconsidered as a primary alteration in the development of the disease. The CGH \nmethodology allowed the detection of chromosomic regions 11q12.3-q13.1, 17p11.1-\np12 and 17q25.3-qter as critical regions, leading to future investigations for the \nidentification of genes associated to endometriosis.  \n\n \n \n105\nREFERENCES  \n1. Yang WC, Chen HW, Au HK, Chang CW, Huang CT, Yen YH, et al. Serum and \nendometrial markers. Best practice & research. 2004 Apr;18(2):305-18. \n2. Nap AW, Groothuis PG, Demir AY, Ever s JL, Dunselman GA. Pathogenesis of \nendometriosis. Best practice & research. 2004 Apr;18(2):233-44. \n3. 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Losses in red and gains in green.  \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n111\n \n \n \n \nFigure 2: Chromosomal aberrations detected by CGH in the group of 10 eutopic \ntissue samples from the endometriosis patients. Losses in red and gains in green.","source_license":"CC0","license_restricted":false}