Die Wirkung von hCG auf die Dezidualisierung ektoper endometrialer Läsionen als therapeutischer Ansatz zur Behandlung der Endometriose

und Methoden 14 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien Agarose NEEO Ultra-Qualität Roth, Karlsruhe Ammoniumperoxodisulfat Merck, Darmstadt Benzylbenzoat Sigma-Aldrich, Taufkirchen ß-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen Borsäure Roth, Karlsruhe Bromphenolblau Merck, Darmstadt BSA Roth, Karlsruhe DAB Liquid Substrat-Chromogen-System Dako, Hambur g Deoxycholat Sigma-Aldrich, Taufkirchen DEPC Roth, Karlsruhe Desoxynucleotidmix (je 10 mM) Genecraft, Köln D-Glucose Monohydrat Serva, Heidelberg DMEM Invitrogen, Karlsruhe DMSO Roth, Karlsruhe DTT 0,1 M Invitrogen, Karlsruhe EDTA > 99% Roth, Karlsruhe Eosin Roth, Karlsruhe Essigsäure 100% Roth, Karlsruhe Ethanol absolut Sigma-Aldrich, Taufkirchen Ethidiumbromid [10 mg/ml] Serva, Heidelberg Formaldehyd 37% Roth, Karlsruhe Forskolin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Glycerin Riedel-de Haën, Seelze Glycin Roth, Karlsruhe Hämatoxylin Thermo-Scientific, Pittsburgh, PA, USA Ham’s F-12 Biochrom, Berlin HPLC-H 2O Merck, Darmstadt Isopropanol J.T. Baker, Deventer, NL

und Methoden 15 Isotone NaCL-Lösung (0,9%) Braun, Melsungen Kaliumchlorid Riedel-de Haen, Seelze Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt Ketamin Ceva, Düsseldorf Methanol zur Analyse Sigma-Aldrich, Taufkirchen Medroxyprogesteronacetat Sigma-Aldrich, Taufkir chen Milchpulver fettfrei TSI, Zeven Natriumchlorid Roth, Karlsruhe Natriumcitrat Merck, Darmstadt Natriumdeoxycholat Sigma-Aldrich, Taufkirchen Natriumhydrogencarbonat Roth, Karlsruhe Natriumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt Natriumdodecylsulfat ultra pure > 99% Roth, Karls ruhe Nonidet P40 Lonza, Basel, Schweiz Oligo(dT) 20 -Starteroligonucleotide Invitrogen, Karlsruhe Ovogest® (humanes Choriongonadotropin) Intervet, Boxmeer, Niederlande Paraplast Tissue Embedding Medium (Paraffin) Mc Cor mick Scientific, St. Louis, MO, USA PBS Dulbecco Biochrom, Berlin Penicillin (10 U/ml)/Streptomycin (10 µg/ml)-Lösung Invitrogen, Karlsruhe Ponceau S Sigma-Aldrich, Taufkirchen Progesteron Sigma-Aldrich, Taufkirchen Protease/Phosphatase-Inhibitor Tablette Roche, Ma nnheim Rizinusöl Apotheke, Universitätsklinikum Essen Rotiphorese NF-Acrylamid/Bis-Lösung 40%(19:1) Roth, Karlsruhe Roti-Quant zur Proteinbestimmung Roth, Karlsruhe Salzsäure rauchend Roth, Karlsruhe Salzsäure 37% Roth, Karlsruhe Shandon Xylene Substitute Thermo-Scientific, Pittsb urgh, USA Shandon Xylene Substitute Mountant Thermo-Scientifi c, Pittsburgh, USA Suprapur Wasserstoffperoxid (30%) Merck, Darmstadt

und Methoden 16 TEMED Serva, Heidelberg Tris Roth, Karlsruhe Tween®20 Sigma-Aldrich, Taufkirchen Xylazin Ceva, Düsseldorf Zitronensäure-Monohydrat Merck, Darmstadt 2.1.2 Verbrauchsmaterialien Einkanal-Pipetten Eppendorf, Hamburg Einmalskalpelle HMD Healthcare Ltd.; Hereford, UK Einmalspritzen (1 ml) Terumo Europe N. V., Leuven, Belgien Küvetten Sarstedt, Nümbrecht Injektionskanülen (20G, 23G und 27G) Becton Dickins on, Bedford, MA, USA Mikrotiterplatten (ABI Prism) Applied Biosystems, Weiterstadt Nahtmaterial (Vicryl 6/0, 5/0) Ethicon, Norderstedt Nitrozellulosemembran Hybond-C Extra Amersham Bios ciences, Freiburg Objektträger Engelbrecht, Edermünde Petrischalen Sarstedt, Nümbrecht Pipettenspitzen (10 – 100 µl, 100 – 1000 µl) Sarst edt, Nümbrecht Pipettenspitzen (0,5 – 10 µl) Biozym Scientific, He ssisch Oldendorf PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml Roth, Karlsruhe Polypropylen-Reaktionsgefäße (12 ml, 15 ml, 50 ml) Greiner Bio-One, Frickenhausen Reaktionsgefäße (1,5 ml) Sarstedt, Nümbrecht Reaktionsgefäße (2 ml) Eppendorf, Hamburg Röntgenfilme Super RX Fuji Medical Fujifilm, Düss eldorf

und Methoden 17 Serologische Pipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml) Greiner Bio-One, Frickenhausen UV-Küvetten Eppendorf, Hamburg Whatman 3MM-Papier Biometra, Göttingen 2.1.3 Laborgeräte Agarose-Gelelektrophoresekammer Selbstbau Medizinte chnik Universitätsklinikum Essen Analysenwaage Precisa 4000c Söntgen, Bottrop-Kirchh ellen Axiophot Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Oberkochen Blockthermostat BT 1301 HLC Bio Tech, Bovenden Brutschrank Hera Cell 240i Thermo Fisher Scientific , Langenselbold Feinwaage ALJ 220-4NM Kern, Balingen Geldokumentationssystem Herolab SU-1 Herolab Laborg eräte, Wiesloch Homogenisator Polytron PT3100 Kinematica, Littau-Lu cerne, Schweiz Kühlzentrifuge Biofuge 28RS Heraeus, Hanau Laborwippe 3013 GFL, Burgwedel Magnetrührer IKAMAG® IKA®-Werke, Staufen Paraffinausgießstation PA/3,3 Chirurgie & Elektrome chanik, Ludwigslust PCR-Maschine T3 Thermocycler Biometra, Göttingen pH-Meter HI 9025 Hanna Instruments, Kehl am Rhein Photometer BioPhotometer plus Eppendorf, Hamburg Pipettierhilfe pipetus® Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Proteintransferkammer Bio-Rad, München RealTime PCR-Maschine ABI Prism 7300 Applied Biosys tems, Weiterstadt Mikrotom 2050 Supercut Reichert-Jung Leica, Wetzlar

und Methoden 18 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresekammer Bio-Rad, München Spannungsgerät PHERO-stab. 500 Biotec-Fischer, Reis kirchen Spannungsgerät Bio-Rad, München Stereomikroskop Stemi DV4 Zeiss, Oberkochen Sterilbank Class II Nuaire, Plymouth, USA Taumelschüttler Rotamax 120 Heidolph, Schwabach Ultraschallprozessor (GE 50) Thomas Scientific, Sw edesboro, NJ, USA Vortexer L46 GLW, Würzburg Wasserbad GFL, Burgwedel Zentrifuge 5415D Eppendorf, Hamburg Zentrifuge Rotina 38R Hettich, Tuttlingen Alle verwendeten Geräte und Materialien bzw. Chemik alien entsprachen dem allgemeinen Laborstandard und wurden in Analysequalität von den oben aufgeführten Firmen bezogen. 2.1.4 Enzyme DNase I [1 U/µl] u. Puffer (Molekularbiologie) Inv itrogen, Karlsruhe M-MLV Reverse Transkriptase [200 U/µl] u. Puffer In vitrogen, Karlsruhe Taq-DNA-Polymerase BioTherm™ [5 U/µl] u. Puffer Ge necraft, Köln 2.1.5 Molekularbiologische und proteinbiochemische Kits E.Z.N.A. GelExtraction Kit (V-spin) Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA E.Z.N.A. Total RNA Midi Kit Omega Bio-Tek, Norcross , GA, USA Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems, Weiterstadt Supersignal West Dura Extended Duration-Substrat Th ermo-Scientific, Pittsburgh, PA, USA

und Methoden 19 2.1.6 Kulturmedien, Puffer und Lösungen Soweit nicht anders beschrieben, wurden alle Lösungen mit A. bidest angesetzt. ×10 SDS-Laufpuffer 25 mM Tris/HCl pH 8.8; 95 mM Glyc in, 0.1% SDS (w/v) ×10 Transferpuffer 25 mM Tris/HCl pH 8-10.5; 192 mM Glycin ×10 TBS-Puffer 20 mM Tris, 137 mM NaCl pH 7.6 TBS-T ×1 TBS-Puffer, 0.15% 10%-iges Tween Blotting-Puffer 10% (v/v) Methanol, 10% (v/v) ×10 Transferpuffer SDS-Trenngelpuffer 1,5 M Tris pH 8.8, 0.4% SDS SDS-Sammelgelpuffer 0,5 M Tris pH 6.8, 0.4% SDS Moscona 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 0.4 mM NaH 2PO 4×H2O, 0,2 mM KH 2PO 4, 12 mM NaHCO 3, 9 mM D-Glucose ×H2O, pH 7.4 PBS/BSA 0.5-1 % (w/v) BSA (Fraktion V) in ×1 PBS gelöst, pH 7.5 RIPA-Puffer 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.2, 0.1% SD S, 1% Triton X- 100, 1% Deoxycholate, 5 mM EDTA, 1 Cocktailtablette (EDTA free Complete Proteinase Inhibitoren) Ponceau-Lösung 0.5% (w/v) Ponceau S, 1% (v/v) Essig säure Stripping-Puffer 62,5 mM Tris/HCL pH 6,7, 100 mM ß- Mercaptoethanol, 2% SDS ×10 DNA-Ladepuffer 50% (v/v) Glycerin, 0,25% (w/v) Bromphenolblau, 75 mM EDTA 4× SDS-Probenpuffer 20% (v/v) 1 M Tris/HCl, 27,7 µM S DS, 0,6 µM Bromphenolblau, 40% (v/v) Glycerin, 20% (v/v) β- Mercaptoethanol, 20% (v/v) A. bidest TBE-Puffer 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2 mM EDTA Endometrium-Nährmedium 49,5% (v/v) DMEM, 49.5% (v/v ) Ham’s F12, 1% (v/v) Pen/Strep Xylazin-Ketamin-Lösung 80% (v/v) 0,9%-ige NaCL-Lösu ng, 16% (v/v) 10%-ige Ketaminlösung, 4% (v/v) Xylazin Citratpuffer 1,8 mM Zitronensäure, 8,2 mM Natriumci trat

und Methoden 20 1000 900 800 700 500 400 300 600 200 100 PageRuler™ Prestained Protein Ladder 100 bp DNA - Leiter 2.1.7 bp-Längenstandards/Molekulargewichtsstandards 2.1.8 Oligonukleotide Alle Oligonukleotide wurden mit dem Programm Primer Selection Tools entworfen. Die Überprüfung der Spezifität der ausgewählten Sequenz en erfolgte mit Hilfe des Sequenzvergleichprogramms BLAST (Basic Local Alignm ent Search Tool) in der EMBL (European Molecular Biology Laboratory)-Datenbank. Die Synthese wurde anschließend bei der Firma Invitrogen in Auftrag gegeben und die erhaltenen Oligonukleotide mit HPLC-H 2O auf eine Konzentration von 100 pmol/µl eingestellt. Primer- bezeichnung Accession number Sequenz (5` /barb2right/barb2right /barb2right/barb2right 3`) Position Fragmentgröße (bp) FOXO1-F GACAGCCCTGGATCACAGTT 1241-1260 FOXO1-R NM002015.3 AGATGGCGGGTACACCATAG 1419-1438 198 IGFBP1-F CTATGATGGCTCGAAGGCTC 764-783 IGFBP1-R NM000596.2 TTCTTGTTGCAGTTTGGCAG 900-919 156 GJA1-F TGGATTCAGCTTGAGTGCTG 781-800 GJA1-R NM000165.3 GATATTCAAGGCCAGGGACA 906-925 145 dPRL-F CATCAACAGCTGCCACACTT 437-456 dPRL-R NM000948.4 CGTTTGGTTTGCTCCTCAAT 630-649 213 ACTB-F AGCACAGAGCCTGGCCTTTGCC 27-48 ACTB-R NM001101.3 CACATGCCGGAGCCGTTGTCGA 113-134 108 Bezeichnung Fragmentgrößen 100 bp DNA-Leiter (Genecraft, Köln) 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 bp PageRuler™ Prestained Protein-Leiter (Fermentas, St.Leon-Rot) 10 , 17, 26, 43, 43, 55, 72 , 95, 130, 170 kDa

und Methoden 21 2.1.9 Antikörper Primäre Antikörper Klonalität Verdünnung Applikation Hersteller Kaninchen anti humanes Connexin43 polyklonal 1:2000; WB; IHC Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA Maus anti humanes GAPDH monoklonal 1:1000 WB Millipore, Billerica, MA, USA Kaninchen anti humanes FOXO1 polyklonal 1:50 IHC Cell Signaling, Danvers, MA, USA Maus anti humanes KAI-1 monoklonal 1:50 IHC Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Maus anti humanes CD82 monoklonal 1:5000 WB Diaclone, Besançon, Frankreich Kaninchen anti-humanes Caspase 3 (cleaved) polyklonal 1:200 IHC Zytomed, Carlsbad, CA, USA Maus anti humanes Prolaktin monoklonal 1:25 IHC Zytomed, Carlsbad, CA, USA Maus anti humanes Ki-67 monoklonal 1:400 IHC Dako, Hamburg Sekundäre Antikörper Klonalität Verdünnung Applikation Hersteller Ziege anti Kaninchen IgG- HRP polyklonal 1:10.000 WB Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg Ziege anti Maus IgG-HRP polyklonal 1:10.000 WB Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg Esel anti Maus IgG (biotinyliert) polyklonal 1:100 IHC Dako, Hamburg Esel anti Kaninchen IgG (biotinyliert) polyklonal 1:200 IHC Dako, Hamburg 2.1.10 Software und Datenbanken ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Weiterstadt) SPSS Software, Version 16.0 TINA 2.09g (raytest Isotopenmessgeräte GmbH, Straubenhardt) NIS-Elements BR (Basic Research) Imaging Software Version 2.30 (Nikon) GraphPad Prism 4 BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST Primer Selection Tools http://biotools.umassmed.e du

und Methoden 22 2.2 Methoden 2.2.1 Humanes Endometriumgewebe Für die vorliegende Arbeit wurde endometriales Gewe be von 16 prämenopausalen Patientinnen im Alter zwischen 30 und 50 Jahren ver wendet, welches im Rahmen von Hysteroskopien in der gynäkologischen Abteilung des Universitätsklinikums Essen (Leitung: Prof. Dr. Kimmig) gewonnen wurde. Die Hys teroskopien und diagnostischen Kürettagen wurden aufgrund benigner Indikationen wi e z.B. Uterus myomatosus oder zur Abklärung von Subfertilität durchgeführt. Die Geweb eentnahme sowie die anschließende Verwendung zu Forschungszwecken erfolgten mit Einve rständnis der Patientinnen. Informationen zur allgemeinen Anamnese und vorherig en Behandlungen wurden den Patientenakten entnommen. Ein Auschlusskriterium fü r die Verwendung des endometrialen Gewebes war die Einnahme hormoneller Präparate in den letzten 3 Monaten vor Gewebeentnahme. Zusätzlich zur Anamnese wurde h istologisch nach den Kriterien von Noyes (1950) eine Zyklusbestimmung durchgeführt . Deziduagewebe aus reifen Plazenten wurde ebenfalls von der gynäkologischen K linik des Universitätsklinikums Essen zur Verfügung gestellt. Unmitttelbar nach der Entnahme wurde das endometria le Gewebe in 4°C kalte Mosconalösung überführt. Das Gewebe wurde im Labor des Institutes für Molekularbiologie an Sterilbänken mit laminarem Luf tstrom in 1,5 mm große Fragmente geschnitten. 1-2 Fragmente wurden jeweils zur späte ren RNA- und Proteinextraktion in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C g elagert. Zur histologischen Analyse wurde zusätzlich 1 Fragment in 4% Formalin fixiert. Die übrigen Fragmente wurden bis zur Transplantation in Endometrium-Nährmedium bei 3 7°C unter 5% CO 2 Partialdruck in einer wassergesättigten Atmosphäre inkubiert. Die T ransplantation der endometrialen Gewebestücke in immundefiziente Mäuse erfolgte spät estens 3 Stunden nach Gewebeentnahme.

und Methoden 23 2.2.2 Tierexperimentelle Arbeiten 2.2.2.1 Versuchstiere Für die Versuche wurden weibliche zyklische NOD-SCI D-Mäuse aus der Zucht des Zentralen Tierlabors des Universitätsklinikums Esse n (Leitung: Priv.-Doz. Dr. Hilken) eingesetzt. Die Mäuse wurden unter kontrollierten B edingungen (Temperatur, Luftfeuchtigkeit) in einer pathogenfreien Umgebung mit reguliertem Licht/Dunkel Zyklus (12h/12h) gehalten und hatten unbegrenzten Zugang z u Nahrung und Wasser. Es fanden ausschließlich den Richtlinien entsprechende autokl avierte Käfige mit Filterhauben Verwendung. Bei Versuchsbeginn hatten die Tiere ein Alter von 2 bis 6 Monaten, wobei alle Tiere eines Versuchsansatzes in etwa das gleic he Alter aufwiesen (+/- 2 Wochen). Die Tierversuche wurden nach § 15 des Tierschutzgesetze s genehmigt (LANUV AZ 50.05- 230-83/04 und AZ 87-51.04.2010.A034). 2.2.2.2 Transplantation des endometrialen Gewebes Die vorbereiteten Endometriumfragmente wurden mitte ls Laparatomie in die immundefizienten Mäuse transplantiert, welche zuvor durch intraperitoneale Injektion von 160 µl einer Mischung aus NaCL, Xylazin und Ketamin (20:1:4) betäubt wurden. Pro Maus wurden vier Fragmente in einer Schlinge aus Na htmaterial (Vicryl, 6/0) am parietalen Peritoneum der Bauchwand angenäht ohne u nnötige Reizungen und Verletzungen zu verursachen. Die Bauchwand und die Haut wurden mit Einzelknopfnähten (Vicryl, 5/0) wieder verschlossen . Zusätzlich wurde die Wunde mit Aluminiumklammern zusammengehalten und täglich kontrolliert. Da das Endometriumgewebe unterschiedlicher Patienti nnen eine hohe interindividuelle Schwankung in der Reaktion auf Hormonbehandlungen z eigen kann, wurde für jeden Versuchsansatz das Gewebe derselben Patientin in ve rschiedene Mäuse transplantiert. Je nach Versuchsansatz handelte es sich dabei um 2 bis 4 Mäuse.

und Methoden 24 2.2.2.3 Substanzapplikationen Als Gestagene wurden Progesteron und Medroxyprogest eronacetat (MPA) verwendet, welche in Benylbenzoat gelöst und in einer Konzentr ation von 50 µg subkutan (s.c.) in einem Volumen von 100 µl Benzylbenzoat:Rizinusöl (1 :4) appliziert wurden. Um den intrazellulären cAMP-Spiegel zu erhöhen, wurden zwe i verschiedene Substanzen eingesetzt: Zum einen das Diterpenoid Forskolin, ei n Adenylatzyklaseaktivator, und zum anderen humanes Choriongonadotropin (hCG), welches hauptsächlich über den cAMP/Proteinkinase A (PKA)-Signalweg wirkt (Tang un d Gurpide, 1993; Maruyama und Yoshimura, 2008). Forskolin wurde in DMSO gelöst un d jeweils 100 µg intraperitoneal (i.p.) in einem Volumen von 100 µl DMSO:NaCl (1:4) appliziert. Humanes CG wurde in einer Konzentration von 7,5 IU gelöst in 100 µl NaC l i.p. injiziert. Pro Versuchsreihe diente eine Maus als Vehikelkontrolle, welcher nur das jeweilige Lösungsmittel appliziert wurde. Am Ende der jeweiligen Versuchsreihen wurden die endometrialen Gewebefragmente entnommen und wie unter 2.2.2.4 beschrieben aufgearbeitet. 2.2.2.4 Entnahme der transplantierten Fragmente Nach Beendigung der jeweiligen Versuchsansätze wurd en die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet und gewogen. Das Fell im Bereic h des Bauchraums wurde mit 70%- igem Ethanol sterilisiert und mit einer Schere ange schnitten. Das Fell wurde rostrokaudal abgezogen. Nach Lokalisation der transplantierten F ragmente anhand der Fixierungsnähte wurde die Bauchhöhle beginnend in der Bauchmitte er öffnet. Unter einem Stereomikroskop wurden die Fragmente zunächst verme ssen und anschließend aus dem murinen Gewebe präpariert. Das Gewicht der Fragment e wurde mit einer Feinwaage ermittelt. Zur RNA- und Proteinextraktion wurden je weils 3 Fragmente pro Maus getrennt in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Aufarbeitung bei -80°C gelagert. Je 1 Fragment wurde zur histologischen An alyse über Nacht in 4% Formalin fixiert. Zur Überprüfung der Auswirkungen der Substanzapplik ation auf den Organismus der Maus wurde zusätzlich der Uterus präpariert. Der Ut erus wurde möglichst nahe am Übergang zum Eileiter gehalten und mit einer Schere vom Mesometrium getrennt. Der freigelegte Uterus wurde an den beiden Eileitern un d am unteren Ende des Cervix uteri

und Methoden 25 abgetrennt. Das Uterusgewicht wurde bestimmt und al s prozentualer Anteil des Körpergewichtes dargestellt. 2.2.3 Molekularbiologische Methoden 2.2.3.1 RNA-Isolierung aus Gewebe Die endometrialen Fragmente wurden jeweils in 50 ml Reaktionsgefäße, in denen 2 ml Lysispuffer und 40 µl β-Mercaptoethanol vorgelegt wurden, überführt und mi t einem Homogenisator bei 16.000 - 17.000 UpM aufgeschlosse n. Der Homogenisatorstab wurde zuvor für 10 min mit 0,1 M NaOH behandelt und ansch ließend gründlich mit DEPC-H 2O gewaschen. Diethylpyrocarbonat (DEPC) modifiziert H istidinreste in Proteinen zu N- Carbethoxyhistidin und führt dadurch u.a. zur Hemmu ng von Enzymen wie RNasen. Zwischen der Aufarbeitung der verschiedenen Fragmen tproben wurde der Homogenisatorstab ebenfalls mit DEPC-H 2O gewaschen. Die Isolierung von RNA aus dem homogenisierten Gewebe wurde mit dem „E.Z.N.A. Total RNA Midi Kit“ der Firma Omega Bio-Tek nach Herstellerangaben durchgeführt. Dabei wurde über eine Säule die RNA aufgereinigt und schließlich in 150 µl DE PC-H2O eluiert. Vor der Lagerung bei -80°C wurde die Konzentration der RNA bestimmt (siehe 2.2.3.2). 2.2.3.2 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren Die Konzentration und die Reinheit von Nukleinsäure lösungen können mit Hilfe eines Photometers anhand der Absorption von UV-Licht best immt werden. Das Absorptionsmaximum der heterozyklischen Nukleinsäur en liegt bei 260 nm und das der aromatischen Aminosäurereste bei 280 nm. Daher wurd e die Absorption bei diesen beiden Wellenlängen gemessen. Als Leerwert diente das jewe ils eingesetzte Lösungsmittel. Ein Absorptionswert von 1,0 bei 260 nm entspricht einer Konzentration von 50 µg/ml bei doppelsträngiger DNA und 40 µg/ml bei einzelsträngi ger DNA oder RNA. Um den Reinheitsgrad der Nukleinsäurelösung zu bestimmen, wird der Quotient aus der Absorption bei 260 nm und 280 nm gebildet. Bei DNA- Lösungen zeigt ein Koeffizient zwischen 1,8 und 2,0 eine reine Probe an, bei RNA-Lösungen ein Koeffizient zwischen 1,9

und Methoden 26 und 2,2. Geringere Werte weisen auf eine Verunreini gung mit UV-absorbierenden Stoffen wie z.B. Proteinen hin. Alle verwendeten Proben entsprachen diesen Reinheitskriterien. 2.2.3.3 Reverse Transkription (RT) Vor der Reversen Transkription wurde zunächst ein D Nase-Verdau durchgeführt, um eventuell noch in den Proben enthaltene DNA abzubauen. Hierfür wurden 2 µg RNA mit 2 µl 10 × DNase-Puffer und 1 µl DNase I (Invitrogen) versetz t, mit DEPC-H 2O auf 20 µl aufgefüllt und für 15 min bei RT inkubiert. Um die DNase zu inaktivieren, wurden die RNA-Proben im vorgeheizten Thermocycler für 10 min bei 65°C inkubiert. Danach wurden die Proben auf 8°C gekühlt. Nach diesem erst en Schritt erfolgte die Reverse Transkription mit dem M-MLV-RT-System der Firma Inv itrogen. Dazu wurden auf die Proben 30 µl eines vorher angefertigten Reagenzieng emisches gegeben, bestehend aus 10 µl 5 × Puffer, 2,5 µl dNTPs [10 mM], 4 µl DTT, 1µl oligo( dT) 20 -Primer, 1 µl M-MLV RT [200 U/µl] und 11,5 µl DEPC-H 2O. Die Oligo(dT) 20 -Primer, die sich an den Poly-A- Schwanz der mRNAs anlagern, dienten dabei als Start punkt für die Reverse Transkriptase. Die Umschreibung in die cDNA erfolgte für 1 h bei 3 7°C. Der Ansatz wurde anschließend für 5 min auf 95°C erhitzt, um die Reverse Transkri ptase zu inaktivieren und die Proben daraufhin auf 8°C gekühlt. Die Lagerung der cDNA er folgte bei - 20°C. Die cDNA konnte nun als Ausgangsmaterial für die folgenden PCR-Reaktionen dienen. 2.2.3.4 Polymerasekettenreaktion (PCR) Die PCR-Methode wurde eingesetzt, um die Funktional ität der Primer zu überprüfen und mögliche Kreuzreaktionen der Oligonukleotide mit murinen Sequenzen auszuschließen. Zu diesem Zweck wurden die Primer an cDNA aus murinem Uterus-, humanem Endometrium- und humanem Deziduagewebe getestet. Zu sätzlich wurden semiquantitive PCRs zur Amplifikation spezifischer cDNA-Sequenzen in RT-Ansätzen zur Herstellung von Standardreihen für die quantitative Echtzeit-PC R durchgeführt. Der durch die reverse Transkription synthetisierte cDNA-Strang (s. 2.2.3. 3) dient dabei als Matrize für die Amplifikation eines spezifischen cDNA-Abschnittes. Dazu wurden 4 µl des reversen Transkriptionsansatzes (s. 2.2.3.3) mit genspezifischen Primern in der PCR eingesetzt.

und Methoden 27 PCR-Ansatz: 4 µl RT-Ansatz 5 µl 10 ×-Puffer 1 µl dNTPs 1 µl Primer -F, -R [25 pmol/µl] 0,5 µl Taq-Polymerase [5U/µl] ad 50 µl H 20 Die PCR wurde unter folgenden Bedingungen im Thermocycler durchgeführt: Temperatur (°C) Zeit Zyklen 94 2 min 1 94 45 sec 60 45 sec 72 2 min 35 72 5 min 1 2.2.3.5 Agarosegelelektrophorese Nach Beendigung der PCR wurde die Größe des amplifi zierten Produkts in einer Gelelektrophorese kontrolliert. Für eine optimale F ragment-Auftrennung wird die Agarosekonzentration des Gels auf die Länge der zu trennenden Nukleinsäuren abgestimmt. Aufgrund der Größe der zu erwartenden D NA-Fragmente wurden 2%-ige Agarosegele verwendet. Die entsprechende Menge Agar ose wurde mit 1 ×TBE-Puffer versetzt und durch Aufkochen in der Mikrowelle gelö st, mit Ethidiumbromid (Endkonzentration 0,5 mg/ml) zum Anfärben der DNA v ersetzt und in einen Gelträger mit einem entsprechend gewählten Kamm gegossen. Das erh ärtete Gel wurde in die Elektrophoresekammer gelegt, mit 1 × TBE-Puffer überschichtet und der Gelkamm entfernt. Die Proben wurden mit 10 × DNA-Ladepuffer versetzt und anschließend in die Taschen des Agarosegels geladen. Als Größenstandard wurden 10 µl einer 100 bp DNA- Standard-Leiter aufgetragen, um später die Größe de r DNA-Fragmente bestimmen zu können. Die elektrophoretische Trennung der DNA-Fra gmente erfolgte für ca. 1 h bei 120 V. Eine Auswertung und Dokumentation der Ergebnisse wurde unter UV-Licht (312 nm) an dem Geldokumentationssystem Herolab SU-1 vorgenommen.

und Methoden 28 2.2.3.6 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Zur Aufreinigung der DNA aus Agarosegelen wurde das „E.Z.N.A. GelExtraction Kit“ der Firma Omega Bio-Tek verwendet. Die gewünschte Bande wurde unter UV-Licht mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten, in ei n 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und in Bindepuffer gelöst. Anschließend wurde die DNA/A garose-Lösung auf eine HiBind® Spinsäule aufgetragen und die cDNA nach drei Waschs chritten mit 40 µl Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) eluiert. Die Konzentration und Reinheit der cDNA-Lö sung wurde gemessen (siehe 2.2.3.2) und zur Herstellung von Standardreihen für die quantitative Echtzeit-PCR verwendet. 2.2.3.7 Quantitative Echtzeit-PCR Mit der Echtzeit-PCR ist es möglich, mRNA aus Zelle n oder Geweben indirekt zu quantifizieren. Dafür wurde die mRNA durch eine Rev erse Transkription in cDNA umgeschrieben (s. 2.2.3.3) und mit dieser eine Echt zeit-PCR (ABI Prism 7300 Sequence Detection System) durchgeführt. Zur quantitativen B estimmung der Expressionswerte wurden Standardkurven der spezifischen Produkte und des Haushaltsgens ACTB in einer Echtzeit-PCR erstellt. Dazu wurden die cDNA-Lösunge n aus der Aufreinigung aus Agarosegelen (s. 2.2.3.6) auf eine Konzentration vo n 1 ng/µl eingestellt und jeweils eine Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen 100 pg/µl, 10 pg/µl, 1 pg/µl, 100 fg/µl, 10 fg/µl, 1 fg/µl, 0,1 fg/µl angesetzt. Diese Standard reihen wurden zunächst in einer Echtzeit- PCR getestet. Zur Durchführung der quantitativen Ec htzeit-PCR wurde ein Gemisch aus allen benötigten Komponenten mit Ausnahme der cDNA angesetzt und jeweils 19 µl in die Vertiefungen einer 96er-Lochplatte pipettiert. Ansc hließend wurde 1 µl der cDNA (s. 2.2.3.3) der zu untersuchenden Proben zu den vorgel egten 19 µl gegeben. Jede Probe wurde in einem dreifachen Ansatz amplifiziert. Echtzeit-PCR-Ansatz: 10 µl Power SYBR® Green I PCR Master Mix 0,15 µl Primer -F, -R [25 pmol/µl] 1 µl RT-Ansatz 8,7 µl H 2O

und Methoden 29 Dem Reaktionsansatz ist der Fluoreszenzfarbstoff SY BR® Green I zugesetzt, der mit doppelsträngiger DNA einen charakteristisch fluores zierenden Komplex bildet. Bei jedem Zyklus der PCR lässt sich daher die Fluoreszenz als Maß für die Produktentstehung verfolgen. Die Bedingungen zur Durchführung der PCR sind in der unten stehenden Tabelle dargestellt und werden im Text näher erläutert. Temperatur (°C) Zeit Zyklen 50 2 min 1 95 10 min 1 95 15 sec 60 1 min 45 95 15 sec 1 60 30 sec 1 95 15 sec 1 Nach zweiminütiger Erhitzung der Proben bei 50°C fo lgte die Aktivierung der AmphTaqGold® DNA-Polymerase für 10 Minuten bei 95°C. Eine Erhitzung für 15 sec bei 95°C und eine 1minütige Inkubation bei 60°C wurden 45 × wiederholt. Abschließend wurden für die Ermittlung der Dissoziationskurve di e Proben in 0,1°C Schritten von 60°C auf 95°C erhitzt. Durch das Aufschmelzen der DNA-St ränge wurden die interkalierten SYBR® Green I-Moleküle freigesetzt und die Abnahme der Fluoreszenz gemessen. Unspezifisch entstandene Produkte lassen sich damit detektieren. Zusätzlich wurde die Spezifität bei einer anschließenden Auftrennung der Echtzeit-PCR-Proben in einem 2% Agarosegel überprüft. Die Daten über den Anstieg de r Fluoreszenz bei der PCR-Reaktion geben anhand der jeweils gleichzeitig ermittelten S tandardkurven Aufschluss über die Ausgangsmenge der amplifizierten Sequenz. Die Anzah l der Temperaturzyklen (C t-Wert) wurde bestimmt, ab der die Fluoreszenz einen fixen Wert innerhalb der exponentiellen Phase der Reaktion erreichte. Je höher der C t-Wert ist, also je mehr Zyklen notwendig sind, um den einer bestimmten Produktmenge entsprechenden Fluoreszenzwert zu erreichen, desto geringer war die Ausgangsmenge der amplifizie rten DNA. Die unterschiedliche Syntheserate bei der Reversen Transkription wurde d urch einen externen Standard normalisiert. Als Standard wurde das Haushaltsgen ACTB gewählt. Aufgrund der großen interindividuellen Unterschiede des Ausgangsgewebes wurde die relative Expression der untersuchten Gene im Vehikeltier gleich 1 gesetzt u nd die x-fache Expression im Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt, um auf dies e Weise den Effekt der verwendeten

und Methoden 30 Substanzen bestimmen zu können. Die Auswertung wurde mit dem Programm Excel durchgeführt. 2.2.4 Proteinbiochemische Methoden 2.2.4.1 Proteinextraktion aus Gewebe Zur Proteinexktraktion wurden die Gewebefragmente i n 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt, in denen 200 µl RIPA-Puffer vorgelegt wurde. Eine P roteaseinhibitortablette wurde immer frisch zu dem RIPA-Puffer zugegeben. Mittels eines Ultraschallstabes (2 × 30 sec, mittlere Stufe) wurden die Zellen weitgehend aufgeschlossen. Die Proben wurden während der Ultraschallbehandlung auf Eis gekühlt, um ein stark es Erhitzen zu verhindern. Um die Zellen vollständig aufzuschließen, wurde das Lysat anschließend mehrfach mit einer Injektionskanüle (20G) aufgezogen. Die homogene Sus pension wurde für 30 min auf Eis gestellt und anschließend für 10 min bei 4°C und 13 .000 UpM zentrifugiert. Der proteinhaltige Überstand wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und ein Aliquot zur Bestimmung der Proteinkonzentration eingesetzt. 2.2.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte na ch der Methode von Bradford (1976) mit der den Farbstoff CBBG250 („Coomassie Brilliant blau-G250“) enthaltenden Roti- Quant-Lösung. Dazu wurden 2 µl der Proteinlösung zu 798 µl A. bidest pipettiert. Die Lösung wurde gemischt, mit 200 µl Roti-Quant-Lösung versetzt (1:500 Verdünnung), mit dem Vortexer gemischt und für 10 min im Dunkeln ink ubiert. Für den Leerwert wurden 800 µl A. bidest mit 200 µl Roti-Quant-Lösung gemis cht und ebenfalls für 10 min im Dunkeln inkubiert. Zuvor wurde unter Verwendung von BSA-Lösungen bekannter Konzentration eine Eichkurve erstellt. Die optische Dichte der Proteinlösungen wurde mit einem Photometer bei 595 nm gemessen und anhand der vorher ermittelten Eichkurve die jeweilige Proteinkonzentration der Proben bestimmt. Dieser Schritt ermöglichte die Auftragung gleicher Mengen an Protein in der nachfo lgenden SDS-PAGE, um ein vergleichbares Ergebnis zu erhalten.

und Methoden 31 2.2.4.3 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Zur Auftrennung von Proteinen in Abhängigkeit ihres Molekulargewichts wurde die denaturierende diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach der Methode von Laemmli (1970) durchgeführt. Es wurden 12%-ige Trenngele und 4%-ige Sammelgele v erwendet. Die Gele wurden mit dem BioRad Gelgießsystem nach den unten angegebenen Zusammensetzungen gegossen. Reagenzien Trenngel 12% Sammelgel 4% H20 2,2 ml 1,625 ml SDS-Trenngelpuffer 1,25 ml - SDS-Sammelgelpuffer - 0,625 ml Acrylamid/Bis-Lösung 1,5 ml 0,267 ml 10 % APS 50 µl 7,5 µl TEMED 1,25 µl 2,5 µl Von jeder Probe wurden 10 µg Protein im Verhältnis 1:4 mit reduzierendem 4 × SDS- Probenpuffer für 5 min bei 95°C aufgekocht, auf Eis abgekühlt und danach in die Taschen der Gele gefüllt. Zusätzlich wurde eine Tasche mit 6 µl des Größenstandards beladen. Eine Ausnahme bildete die Detektion von CD82. Um diese mit dem angegebenen Antikörper zu ermöglichen, wurde die SDS-PAGE mit 30 µg Protein u nter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die Elektrophorese erfolgte im Sammelgel zur Fokuss ierung der Proteine bei einer Spannung von 70 V. Erreichte die Lauffront das Tren ngel, wurde die Stromspannung erst auf 120 V, dann auf 150 V erhöht. Die Elektrophores e erfolgte bis zum Auslaufen der Bromphenolblaufront (ca. 1,5 h - 2 h). 2.2.4.4 Western Blot In dieser Arbeit erfolgte der elektrophoretische Tr ansfer der zuvor in der SDS-PAGE separierten Proteine auf eine proteinbindende Träge rmembran aus Nitrozellulose mit dem Nass-Blot-System von BioRad. Zunächst wurden zwei L agen Vlies, vier zurechtgeschnitte Whatman-Papiere und die Nitrozellulose-Membran in 1 ×Blotting-Puffer getränkt. Die

und Methoden 32 Blotkammer wurde wie folgt - ausgehend von der Kath ode - luftblasenfrei zusammengebaut: Auf ein Vlies wurden zwei Lagen Wha tman-Papier, das SDS-Trenngel, die Nitrozellulose-Membran, erneut zwei Lagen Whatm an-Papier und ein weiteres Vlies übereinander geschichtet. Der komplette Sandwich-Au fbau wurde zwischen zwei Gitter gepresst, verriegelt und in die dafür vorgesehenen Halteschienen eingeführt. In die Nass- Blot-Apparatur wurde ein Kühlaggregat eingesetzt un d ein Rührfisch wurde hinzugefügt. Nachdem der vorgekühlte Blotting-Puffer in die Kamm er eingefüllt wurde, erfolgte das Blotten für zwei Stunden bei RT bei einer Stromstär ke von 70 mA von der Kathode zur Anode. Um eine gleichmäßige Wärmeverteilung zu gara ntieren, wurde während des Blottens langsam gerührt. Nach dem Blotten wurde da s Sandwich demontiert und der Blot mit der Proteinseite nach oben kurz in TBS-T gewaschen. 2.2.4.5 Proteinfärbung auf der Nitrozellulosemembran Um den erfolgreichen Proteintransfer zu überprüfen, erfolgte ein erster reversibler visueller Nachweis der Proteinbanden auf der Nitrozelluloseme mbran mit einer Ponceau-Rot- Färbung. Die Proteinnachweisgrenze dieser Färbemeth ode liegt bei 100 ng Protein pro Bande. Diese Färbemethode zeigt, ob das Protein gle ichmäßig in die unterschiedlichen Taschen des SDS-Gels geladen wurde. Hierzu wurde di e Membran solange in der Färbelösung inkubiert, bis rote Banden sichtbar wur den. Der überschüssige Farbstoff wurde mit H 2O von der Membran gewaschen und die Membranen zur D okumentation eingescannt. Durch Zugabe von TBS-T kann die Membran wieder entfärbt werden. 2.2.4.6 Immundetektion von Proteinen auf der Nitrozellulosemembran Auf der Membran lassen sich die transferierten Prot eine mit geeigneten Antikörpern nachweisen. Die hier verwendeten Antikörper sind unter 2.1.9 au fgeführt. Vor der Antikörperreaktion wurden die restlichen freien Pro teinbindungsstellen der Nitrozellulosemembran für 1 h bei RT mit einer Lösu ng aus 10% (w/v) Magermilchpulver in TBS-T blockiert. Die anschließende Inkubation mi t dem in 2% (w/v) Magermilchpulver oder 5% BSA (w/v) (CD82) in TBS-T verdünnten Primär antikörper erfolgte üN bei 4°C. Vor der Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde n die ungebundenen restlichen

und Methoden 33 Primärantikörper durch dreimaliges Waschen mit TBS- T entfernt (2 ×5 min, 1 ×15 min). Es folgte eine 60minütige Inkubation bei RT mit ein em HRP-gekoppelten Sekundärantikörper. Durch diesen sekundären Antikörper kann der Komplex aus primärem Antikörper und Protein wie unter 2.2.4.7 beschriebe n sichtbar gemacht werden. Die Membran wurde daraufhin zweimal für 10 min gewasche n, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und konnte anschließend zum Chemilumi neszenz-Nachweis eingesetzt werden. 2.2.4.7 Chemilumineszenz-Nachweis (ECL-Reaktion) Der Nachweis der Chemilumineszenzreaktion erfolgte nach Towbin und Gordon (1984) unter Verwendung des ECL-Systems der Firma Thermo-S cientific gemäß Herstellerangaben. Durch Auflegen eines Röntgenfilm s auf den mit der ECL-Lösung behandelten Blot kommt es nach Entwicklung des Rönt genfilms zu einer Schwärzung des Films an den belichteten Stellen. Der Film wurde je nach Antikörper unterschiedlich lange belichtet. Die Intensität der so entstandenen Banden gibt Aufs chluss über die relative Menge des Proteins. Die jeweilige spezifische Prote inexpression wurde durch die GAPDH-Expression normalisiert. Die Höhe der Banden wurde mit einem in der SDS- PAGE mitgeführten Standard verglichen, der eine Aus sage über das Molekulargewicht der Bande auf dem Röntgenfilm erlaubt. Nach Scannen des entwickelten, belichteten Röntgenfilms konnten relative Veränderungen zwische n untersuchten Proben quantitativ erfasst werden. Die densitometrischen Analysen der Proteinbanden erfolgten durch das Programm TINA 2.09g. 2.2.5 Morphologische Methoden 2.2.5.1 Histologische Analyse Zur morphologischen Untersuchung wurden die endomet rialen Fragmente in Paraffin eingebettet. Dazu wurde als erstes das präparierte Endometriumgewebe zunächst üN in 4% Formalin fixiert. Nach der Fixierung wurde das Fixi erungsmittel ausgewaschen und das Gewebe durch eine aufsteigende Alkoholreihe entwäss ert. Über das Intermediärmedium Xylol wurde das Gewebe in 60°C flüssiges Paraffin e ingebracht und nach Durchdringung

und Methoden 34 in Paraffin eingebettet und abgekühlt. Das Gewebe i m Paraffinblock wurde auf einem Mikrotom in eine Schichtdicke von 7 µm geschnitten und jeweils 3 Schnitte auf einen Objektträger gebracht. Bei jedem fünften Objektträg er wurden die Gewebeschnitte mittels Hämatoxylin-Eosin (s. 2.2.5.2) angefärbt, um den en dometrialen Charakter der makroskopisch erkannten Läsionen zu bestätigen (Noc i et al., 1995), die durchschnittliche dezidualisierte Arealgröße zu bestimmen und geeigne te Schnitte für die immunhistochemischen Färbungen herauszusuchen. Die Auswertung und morphologischen Analysen der HE- und immunhistochem isch gefärbten Gewebeschnitte erfolgte am Axiophot Mikroskop mit Hilfe der NIS-Elements BR Software. 2.2.5.2 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung Als Vorbereitung auf die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurden die Schnitte in Xylol entparaffiniert und dann über eine absteigende Alko holreihe schrittweise wieder hydriert. Nach Spülen in Leitungswasser und A. bidest wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gefärbt. Hämatoxylin ist ein natürlicher Farbstoff, der in Form des basischen Hämalaun alle sauren Gewebebestandteile wie Nukleinsäuren in tensiv blau färbt. Ungebundenes Hämatoxylin wurde mit warmem Leitungswasser abgewaschen. Als nächster Schritt wurde mit Eosin gefärbt. Bei Eosin handelt es sich um ein en sauren synthetischen Farbstoff, der basische Zellstrukturen rot anfärbt. Dazu gehören v or allem die Proteine des Zytoplasmas. Auch hier wurde ungebundener Farbstoff abgewaschen. Nach den Färbungen wurden die Schnitte wieder durch eine aufsteigende Alkoholreih e entwässert und daraufhin mit einem Xylen-Substitut behandelt. Nun konnten die Schnitte mit Shandon Xylene Substitute Mountant eingedeckt werden. 2.2.5.3 Immunhistochemische Analyse Die immunhistochemische Analyse ermöglicht den Nach weis eines Proteins mit Hilfe von Antikörpern an Gewebeschnitten. Zu diesem Zweck wur den die Schnitte in Xylol entparaffiniert, über eine absteigende Alkoholreihe rehydriert und für 5 min mit PBS gewaschen. Zur Antigendemaskierung wurden die Schni tte anschließend für 20 min in 10 mM Natriumcitratpuffer (pH 6) gekocht. Nach ca. 10m inütigem Abkühlen der Schnitte

und Methoden 35 wurden diese erneut für 20 min in PBS gewaschen. Je der Schnitt wurde mit einem hydrophoben Markierungstift (Dako, Hamburg) umkreis t und im Weiteren ein Volumen von 20 µl aller verwendeten Lösungen direkt auf die Schnitte aufgetragen. Um eine endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren, wurden die Schnitte für 10 min in einer Wasserstoffperoxid-Lösung (1:40 in Methanol verdünnt) unter Lichtschutz inkubiert. Freie Bindungsstellen wurden danach für 20 min mit 0,5%-i gem BSA in PBS abgesättigt. Der primäre und sekundäre Antikörper wurde - wie unter 2.1.9 angegeben - in PBS/BSA verdünnt. Die Inkubation des primären Antikörpers e rfolgte üN bei 4°C. Die ungebundenen Antikörper wurden anschließend durch W aschen mit PBS entfernt. Daraufhin wurden die Schnitte mit einem entsprechen den sekundären Biotin-gekoppelten Antikörper (siehe 2.1.9) für 60 min inkubiert. Auch hier wurden nach der Inkubationszeit die ungebundenen Antikörper durch Waschen mit PBS e ntfernt. Anschließend wurden die Schnitte für 30 min mit einem Strept.A/B-Komplex/HR P inkubiert, mit PBS gewaschen und mit dem chromogenen Substrat für die Peroxidase (DAB) solange inkubiert bis eine Farbreaktion erkennbar wurde, jedoch höchstens 25 m in. Die Reaktion wurde daraufhin mit A. bidest abgestoppt. Zusätzlich wurde eine Geg enfärbung mit Hämatoxylin durchgeführt. Nach erneutem Waschen mit A. bidest w urden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert, mit einem Xy len-Substitut behandelt und mit Xylene Substitute Mountant eingedeckt. Die Auswertung erfolgte an einem Zeiss Axiophot Mikroskop. Als Positivkontrolle diente Deziduageweb e aus reifer humaner Plazenta und als Negativkontrolle Schnitte, die mit PBS/BSA ohne Primärantikörper inkubiert wurden. Die Auswertung der Färbungen erfolgte über semiquan titative Bestimmung des Prozentsatzes angefärbten Gewebes am Gesamtgewebe e ines repräsentativen Schnittes, dabei wurde die Intensität der Färbung in neun vers chiedene Klassen (0 = keine Färbung bis 8 = sehr starke Färbung) eingeteilt. Die Immunhistochemie für Prolaktin, aktivierte Casp ase 3 als Apoptosemarker und dem Proliferationsmarker Ki-67 wurde im histologischen Labor des Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums Essen (Leitung: Prof. Dr. Sch mid) durchgeführt. Zur Bestimmung der Proliferationsrate der endometrialen Drüsenepit helzellen wurden nach der Ki-67- Färbung von einem repräsentativen Schnitt pro Fragm ent alle Drüsenepithelzellen ausgezählt und der prozentuale Anteil der Ki-67-pos itiven Zellen an der Gesamtzellzahl der Drüsenepithelzellen bestimmt. Zur Ermittlung des prozentualen Anteils Ki-67-positiver Stromazellen wurden bei einer 40fachen Vergrößerung alle gefärbten und ungefärbten Stromazellen eines Gesichtsfeldes (entspricht ca. 30-50% eines Schnittes) ausgezählt.

und Methoden 36 2.2.6 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Expressionsanalysen erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS 16.0. Für die Auswertung der RNA- und Proteine xpression wurden jeweils drei unabhängige Messungen mit mindestens drei verschied enen Fragmenten pro Behandlungsansatz durchgeführt. Bei der histologisc hen Auswertung der Fragmente wurden von jedem Behandlungsansatz mindestens drei verschiedene Fragmente analysiert. Zur Überprüfung der Signifikanzen wurde ein nicht p arametrischer Mann-Whitney-Test für den Vergleich zweier unabhängiger Gruppen einge setzt. Die Signifikanz wurde anhand des Quantils der zu überprüfenden Unwahrscheinlichk eit festgelegt. Das Quantil, welches mit P angegeben wird, wurde auf einen Wert von P = 0,05 festgelegt, wobei dieser Wert eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% angibt. Unterschiede mit P ≤ 0,05 wurden somit als statistisch signifikant angesehen. Ergebnisse 37 3 Ergebnisse 3.1 Validierung der Oligonukleotid-Primer Das humane ektope Endometriumgewebe, das in die Per itonealhöhle immundefizienter Mäuse transplantiert wurde, verwächst dort mit muri nem Gewebe. Bei der Präparation der humanen ektopen Läsionen nach Versuchsende konnte d aher humanes und murines Gewebe nicht vollständig voneinander getrennt werde n. Alle in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden daher vorab an humanem Endom etrium und murinem Uterusgewebe auf ihre Speziesspezifität überprüft u m mögliche Kreuzreaktionen mit murinen Sequenzen auszuschließen und somit Veränder ungen in der Genexpression spezifisch in den humanen endometrialen Zellen nachweisen zu können. Abb. 1: Nachweis der Speziesspezifität der verwendeten Oligonukleotide Agarosegelelektrophoresen der mit den jeweiligen Ol igonukleotiden in einer PCR amplifizierten Produkte. Für die semiquantitativen PCRs wurde cDNA aus humanem Endometrium (hEM) sowie murinem Uterusgewebe (mU) verwendet. Bei Verwendung der humanspezifischen Oligonukleotid e zeigte sich eine Bande für das jeweilige amplifizierte Produkt nur bei humanem end ometrialem Gewebe, wodurch Kreuzreaktionen mit murinen Sequenzen ausgeschlossen wurden (Abb. 1). 3.2 Effekt von Progesteron in Kombination mit cAMP-stei gernden Substanzen auf die Dezidualisierung Es ist bekannt, dass die Dezidualisierung von human em Endometrium durch Progesteron initiiert und aufrechterhalten wird (Ramathal et al ., 2010) und dass humane Endometriumzellen in vitro bei Zugabe von Progesteron dezidualisieren (Geller sen und PRL IGFBP1 FOXO1 GJA1 ACTB mU hEM Ergebnisse 38 Brosens, 2003). Es konnte zudem gezeigt werden, das s dass Ausmaß der Dezidualisierung humaner Endometriumzellen durch eine kombinierte Behandlung mit Gestagen und cAMP signifikant verstärkt wird (Gellersen und Brosens, 2003). Um zu überprüfen, ob die Dezidualisierung von ektopem Endometriumgewebe in vivo durch Progesteron alleine oder in Kombination mit Substanzen, die den cAMP-Signalw eg aktivieren, induziert werden kann, wurde nach Transplantation endometrialer Frag mente in NOD-SCID-Mäuse eine Behandlung dieser Mäuse mit Progesteron alleine ode r in Kombination mit Forskolin, einem Adenylatzyklaseaktivator oder mit hCG, welche s hauptsächlich über den cAMP- Signalweg wirkt, durchgeführt. Für jeden Versuchsan satz wurde das Gewebe derselben Patientin parallel in 4 NOD-SCID-Mäuse transplantie rt. Die Mäuse erhielten folgende Behandlungen: 1. Progesteron (50 µg/d, s.c.), 2. Pr ogesteron (50 µg/d, s.c.) + Forskolin (100 µg/d, i.p.), 3. Progesteron (50 µg/d, s.c.) + hCG (7,5 IU/d, i.p.), 4. Vehikelkontrolle. Die Substanzapplikation erfolgte täglich über einen Zeitraum von 7 Tagen. 24 Stunden nach der letzten Applikation wurden die endometrialen Gewebefragmente entnommen, wie unter 2.2.2.4 beschrieben aufgearbeitet und im Hinblick auf Größe, Gewicht, Morphologie, Proliferationsrate und Expression verschiedener Dezidualisierungsmarker analysiert. 3.2.1 Effekt auf das Uterusgewicht der Maus Um eine mögliche Wirkung der verwendeten Substanzen auf das Endometrium der Mäuse zu untersuchen, wurde der Uterus jeder Maus am Ende der Versuchsreihe entnommen und das Naßgewicht bestimmt. Das Gewicht wurde auf das Körpergewicht der Maus bezogen und prozentual dargestellt. Die Uterusgewichte ware n in den behandelten Mäusen tendenziell reduziert, zeigten jedoch keine signifi kanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen (Abb. 2). Ergebnisse 39 Abb. 2: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach 7tägiger Behandlung Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler der Uterusgewichte als prozentualer Anteil am Körpergewicht (KG). V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.2.2 Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen 3.2.2.1 Größe und Gewicht der ektopen humanen endometrialen Läsionen Nach 7tägiger Kultur in NOD-SCID-Mäusen wurde die G röße der ektopen endometrialen Fragmente in situ gemessen. Anschließend wurden die endometrialen Ge webefragmente entnommen und deren Gewicht bestimmt. V P P + F P + hCG 0 1 2 3 4 5Größe [mm 2] V P P + F P + hCG 0 1 2 3 4Gewicht [mg] A B Abb. 3: Wachstumsverhalten der ektopen Läsionen Größe ( A) und Gewicht ( B) der humanen endometrialen Fragmente nach 7tägiger Kultur und Behandlung in der NOD-SCID Maus. Pro Behandlungsgru ppe wurden 16 Fragmente analysiert. Gewicht und Größe sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. Es zeigte sich eine Korrelation der Größe und des G ewichtes der ektopen Fragmente. Sowohl die Fragmentgröße als auch das -gewicht ware n nach Behandlung mit Progesteron alleine tendenziell erhöht (Abb. 3). Die kombiniert e Behandlung von Progesteron mit Forskolin bzw. hCG führte zu einer leichten Gewicht sabnahme der Fragmente im V P P + F P + hCG 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Uterusgewicht/KG [%] Ergebnisse 40 Vergleich zur Vehikelkontrolle (Abb. 3B). Bei keine r Behandlung wurde jedoch ein signifikanter Unterschied in Größe oder Gewicht der ektopen endometrialen Läsionen im Vergleich zur Kontrolle festgestellt. 3.2.2.2 Morphologie der ektopen humanen endometrialen Läsionen Die Auswertung der Paraffin-Serienschnitte zeigte e ine gut erhaltene Morphologie der humanen endometrialen Fragmente nach 7tägiger Kulti vierungsdauer in den NOD-SCID Mäusen. Es ließen sich charakteristische endometria le Histomorphologien mit Drüsen und umgebendem Stroma erkennen (Abb. 4A-D). Dezidualisi erte Zellen sind leicht anhand ihres epitheloiden Erscheinungsbildes zu definieren . Mit steigender Dezidualisierung sind die Zellgrenzen weniger deutlich zu erkennen, wahrs cheinlich aufgrund der verstärkten Bildung extrazellulärer Matrix (Frank et al., 1994) . Areale mit dezidualisierten Zellen wurden in allen Läsionen gefunden. In Kontrollfragm enten (Abb. 4A) und nach Behandlung mit Progesteron alleine (Abb. 4B) waren jedoch nur wenige kleine Areale dezidualisierter Zellen zu erkennen. Nach Behandlun g mit Forskolin in Kombination mit Progesteron (Abb. 4C) fand eine Zunahme dezidualisi erter stromaler Zellen statt. Nach kombinierter Behandlung von Progesteron und hCG war en große dezidualisierte Areale zu beobachten (Abb. 4D). Die dezidualiserten Areale wu rden morphometrisch quantifiziert (Abb. 4E). In ektopem humanem endometrialem Gewebe, welches mit einer Kombination von Progesteron und Forskolin behandelt wurde, war die Gesamtfläche dezidualisierten Stromas im Vergleich zur Kontrolle und zu den Läsio nen, die mit Progesteron alleine behandelt wurden, erhöht. Nach 7tägiger kombinierte r Behandlung von Progesteron und hCG wurde die stärkste Zunahme dezidualisierter Areale festgestellt. Ergebnisse 41 V P P + F P + hCG 0 2 4 6 rel. dezidualisierte Fläche A B C D E DE S S S S DE DE Abb. 4: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen Histomorphologie humaner endometrialer Fragmente na ch 7tägiger Kultur in unbehandelten ( A) sowie behandelten (B-D) NOD-SCID Mäusen. ( B) Progesteron; ( C) Progesteron kombiniert mit Forskolin; ( D) Progesteron kombiniert mit hCG. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und zeigen charakteristische Strukturen end ometrialen Gewebes. Bereiche mit dezidualisierten stromalen Zellen sind umrandet. DE = Drüsenepithel; S = Stroma. Balken = 50 µm. ( E) Morphometrische Quantifizierung dezidualisierter Areale. Pro Behandlungsgruppe wurden vier Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mitt elwert ± Standardfehler. Der prozentuale Anteil der dezidualisierten Fläche an der Gesamtfläche des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x-fache Fläche im Substanz behandelten Tier ent sprechend bestimmt. V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.2.2.3 Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ekto pen humanen endometrialen Läsionen Der Grad der Dezidualisierung wurde in ektopen endometrialen Fragmenten nach Kultur in unterschiedlich behandelten NOD-SCID Mäusen mit Hil fe verschiedener Dezidualisierungsmarker analysiert. Deziduales PRL und IGFBP-1 Die Quantifizierung der klassischen Dezidualisierun gsmarker dPRL und IGFBP-1 in den ektopen endometrialen Läsionen erfolgte auf Transkr iptionsebene durch eine quantitative PCR (Abb. 5AB). Während eine alleinige Substitution mit Progesteron keinen Effekt zeigte, war eine leichte Erhöhung der Transkription der Dezidualisierungsmarker dPRL und IGFBP-1 nach Behandlung mit Progesteron und Forskolin und ein signifikanter Ergebnisse 42 Anstieg der dPRL - und IGFBP1 -Expression in den ektopen endometrialen Fragmenten nach 7tägiger Kultur in NOD-SCID-Mäusen, die mit ei ner Kombination von Progesteron und hCG behandelt wurden, im Vergleich zum Vehikel und den anderen Behandlungen zu verzeichnen. Die Expression von dPRL und IGFBP1 in den ektopen endometrialen Fragmenten konnte somit durch cAMP-steigernde Subst anzen erhöht werden, wobei die Applikation von hCG zu einer signifikant höheren St eigung von IGFBP1 führte als Forskolin. A B V P P + F P + hCG 0 2 4 6 8 10 * * IGFBP1 * rel. Genexpression V P P + F P + hCG 0 10 20 30 40 * dPRL * rel. Genexpression Abb. 5: Expression von dPRL und IGFBP1 Relative Genexpression von dPRL ( A) und IGFBP1 ( B) in ektopen humanen endometrialen Fragmenten nach 7tägiger Kultur in NOD-SCID Mäusen. Dargestellt ist der jeweilige Mittelwert ± Standardfehler der Expression dreier Patientinnen. Es wurde gegen das entsprechende ACTB - Signal abgeglichen. Die relative Expression des Veh ikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x-fache Expression im Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. Die dPRL - und IGFBP1 - Expression ist nach kombinierter Behandlung von Pro gesteron und hCG signifikant hochreguliert (* p ≤ 0,05). V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. Da dPRL- und IGFBP1-Proteine sezerniert werden, kom men sie nur in geringen Mengen in den sezernierenden Zellen vor. Aus diesem Grund war es nicht möglich, Prolaktin und IGFBP1 in Western Blots mit Proteinproben aus den i solierten ektopen Läsionen zu detektieren. Diese Beobachtung stimmt mit denen and erer Gruppen überein (Birgit Gellersen, persönliche Mitteilung). Um die dezidual isierten Areale näher zu analysieren, wurde daher in den in unbehandelten und behandelten Mäusen kultivierten ektopen endometrialen Läsionen das Hormon dPRL immunhistoch emisch untersucht. Als Positivkontrolle wurde dezidualisiertes Gewebe eine r reifen Plazenta verwendet. Wie in Abb. 6A zu erkennen ist, wurden auch im Kontrollgew ebe nicht alle dezidualisierten Zellen angefärbt, da das deziduale Prolaktin sezern iert wird und daher nicht zu jedem Zeitpunkt in ausreichender Menge in allen Zellen vo rhanden ist um detektiert werden zu Ergebnisse 43 können. Eine ähnliche Färbung wurde in dezidualisie rten Arealen humaner ektoper endometrialer Fragmente nach Behandlung mit Progest eron und hCG beobachtet (Abb. 6B). Nur die kombinierte Behandlung mit Progesteron und hCG induzierte eine ausreichende Menge an Prolaktinprotein, so dass die ses immunhistochemisch nachgewiesen werden konnte, während in allen andere n Versuchsgruppen keine immunhistochemische Färbung beobachtet werden konnt e (Abb. 6C-E). Somit korrelierte die in der quantitativen PCR beobachtete Expression ssteigerung mit einem Anstieg der Proteinexpression in mit Progesteron und hCG behand eltem ektopen endometrialen Gewebe. dPRL V P P + F P + hCG 0 10 20 30 40 gefärbte Schnitte [%] A B C D E K P + hCG V P P + F F Abb. 6: Immunhistochemischer Nachweis der dPRL-Expression (A-F) Immunhistochemischer Nachweis von dPRL. ( A) Färbung humaner Dezidua für dPRL (braun). ( B) Ektopes endometriales Fragment nach 7tägiger komb inierter Behandlung von Progesteron und hCG. Es ist eine deutliche stromale Färbung zu erkennen. ( C) unbehandelte Kontrolle; ( D) Progesteron; ( E) Progesteron kombiniert mit Forskolin. Balken A, B = 30 µm, Balken C-E = 50 µm. ( F) Quantitative Auswertung de immunhistochemischen F ärbung für dPRL. K = Positivkontrolle; V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. Ergebnisse 44 FOXO1 und GJA1 Die Expression der Dezidualisierungsmarker FOXO1 (Abb. 7A) und GJA1 (Abb. 7B) wurde sowohl durch die Behandlung mit Progesteron u nd Forskolin als auch durch Progesteron und hCG signifikant in den ektopen endometrialen Fragmenten hochreguliert. V P P + F P + hCG 0 2 4 6 8 FOXO1 ** rel. Genexpression V P P + F P + hCG 0 1 2 3 4 GJA1 ** rel. Genexpression A B Abb. 7: Expression von FOXO1 und GJA1 Relative Genexpression von FOXO1 ( A) und GJA1 ( B) in ektopen humanen endometrialen Fragmenten nach 7tägiger Kultur in NOD-SCID-Mäusen. Dargestellt ist der jeweilige Mittelwert ± Standardfehler dreier Patientinnen. Es wurde gegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. Die relative Expression des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x-fache Expression im Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. * p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikelkontrolle. V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. Es stellte sich heraus, dass selbst von dezidualisi ertem Gewebe einer reifen Plazenta 100 µg Gesamtprotein benötigt wurden, um die FOXO1-Expr ession mittels Western Blot detektieren zu können. Diese Menge an Gesamtprotein konnte aus den kleinen endometrialen Fragmenten nicht in ausreichendem Maß e isoliert werden. Daher wurde die FOXO1-Expression auf Proteinebene immunhistochemisc h analysiert und quantifiziert. Die immunhistochemischen Färbungen zeigten nur nach kombinierter Behandlung mit Progesteron und hCG eine großflächige Expression vo n FOXO1 in den endometrialen Stromazellen (Abb. 8D). Im Vehikelfragment und nach Behandlung mit Progesteron alleine oder in Kombination mit Forskolin waren - w enn überhaupt - nur kleine Areale angefärbter Zellen zu beobachten (Abb. 8A-C). Die s emiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbungen zeigte 7 Tage nach d er Transplantation nur in den ektopen Fragmenten, die in mit Progesteron und hCG behandelten Mäusen kultiviert wurden, eine signifikante Erhöhung der FOXO1-Expression im Vergleich zur Kontrolle. Ergebnisse 45 A B C D E F V P P + F P + hCG 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 * relative Intensität / Vehikelkontrolle D K P + F V P + hCG P Abb. 8: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression FOXO1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron ( B), Progesteron und Forskolin ( C), Progesteron und hCG ( D) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 7 Tagen Kultur. (E) Färbung humaner Dezidua für FOXO1 als Positivkont rolle. Balken = 50 µm. ( F) Semiquantitative Auswertung der FOXO1-Färbung. Pro Behandlungsgruppe wurden vier Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwer t ± Standardfehler. Die relative Intensität des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt. * p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikelkontrolle. K = Positivkontrolle; V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. Zur Lokalisation der GJA1-Expression wurde eine imm unhistochemische Färbung durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde dezidualis iertes Gewebe einer reifen Plazenta verwendet (Abb. 9E). Es war eine starke Färbung der Membran dezidualisierter Zellen zu erkennen. In den Kontrollfragmenten (Abb. 9A) und d en mit Progesteron und Forskolin (Abb. 9C) behandelten Fragmenten waren vereinzelt Z ellen zu sehen, die eine Expression von GJA1 zeigten. Nach Behandlung mit Progesteron a lleine (Abb. 9B) und nach kombinierter Behandlung von Progesteron und hCG (Ab b. 9D) war jedoch der Ergebnisse 46 überwiegende Teil der Stromazellen der jeweiligen F ragmente angefärbt. Endometriale Drüsenepithelzellen zeigten keine Expression von GJA1. A B D C E T D V P P + F KP + hCG Abb. 9: Immunhistochemischer Nachweis der GJA1-Expression GJA1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron ( B), Progesteron und Forskolin ( C) und Progesteron und hCG ( D) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 7 Tagen Kultur. ( E) Dezidualisiertes Gewebe einer reifen Plazenta als Positivkontrolle. K = Positivkontrolle; V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin; T = Tropoblast; D = Dezidua. Balken = 40 µm. Das Gap Junction-Protein GJA1 ist ein membranständi ges Protein und konnte im Gegensatz zu den sezernierten Proteinen Prolaktin u nd IGFBP1 gut im Western Blot nachgewiesen werden. Das GJA1-Protein liegt in der Zelle unterschiedlich stark phosphoryliert vor. Diese Phosphorylierungsstadien sind im Western Blot anhand drei unterschiedlicher Banden zu erkennen (Abb. 10B). De nsitometrisch ausgewertet wurde GJA1-Gesamtprotein unabhängig vom Phosphorylierungs status (Abb. 10A). Korrespondierend zu der quantitativen PCR stieg die GJA1-Proteinexpression nach kombinierter Behandlung mit Progesteron und hCG im Vergleich zum Vehikel und den anderen Behandlungen am stärksten an, jedoch war di eser Anstieg nicht signifikant. Das Ergebnis der Western Blot-Analyse korrelierte somit zu der immunhistochemischen Ausprägung der GJA1-Expression. Ergebnisse 47 V P P + F P + hCG 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 rel. Expression A B GJA1 GAPDH V P P+F P+hCG P0 P1 P2 Abb. 10: Expressionsanalyse von GJA1 (A) Densitometrische Auswertung der Western Blots für GJA1 (n = 3). Angegeben sind die Mittelwerte und die Standardfehler, die gegen das e ntsprechende GAPDH-Signal abgeglichen wurden. ( B) Repräsentativer Western Blot. Bei P0-P2 handelt e s sich um unterschiedliche Phosphorylierungsstadien von GJA1 (P0 = 41 kDa, P1 = 44 kDa, P2 = 46 kDa). V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. CD82 Das CD82 ( cluster of differentiation 82 )-Protein, ein Zelloberflächenprotein der Tetraspaninfamilie, ist in den Prozess der dezidual en Umbildung endometrialer Stromazellen involviert und wird während der Dezidu alisierung heraufreguliert (Gellersen et al., 2007). Da das Expressionslevel des Dezidual isierungsmarkers CD82 bekanntermaßen posttranskriptionell reguliert wird (Gellersen et al., 2007), wurde das CD82-Expressionslevel nur auf Proteinebene untersucht. Im Western Blot zeigte sich, dass die CD82-Expression nach kombinierter Behandlung mi t Progesteron und Forskolin leicht anstieg. Diese Tendenz war nach kombinierter Behand lung mit Progesteron und hCG noch etwas stärker (Abb. 11). Der beobachtete Anstieg na ch Behandlung mit Forskolin oder hCG war jedoch nicht signifikant. Abb. 11: Expressionsanalyse von CD82 (A) Densitometrische Auswertung der Western Blots für CD82. Angegeben sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen der verschiedenen Messungen (n = 3), die gegen das entsprechende GAPDH-Signal abgeglichen wurden. ( B) Repräsentativer Western Blot. V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. V P P + F P + hCG 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 rel. Expression A B CD82 GAPDH V P P+F P+hCG Ergebnisse 48 Auch für den immunhistochemischen Nachweis von CD82 wurde als Positivkontrolle dezidualisiertes Gewebe einer reifen Plazenta verwe ndet. In Abb. 12E ist eine spezifische Färbung des membrandurchspannenden Glykoproteins in der Membran dezidualisierter Zellen zu erkennen. Die ektopen endometrialen Geweb efragmente aus den Kontrolltieren (Abb. 12A) sowie aus den nur mit Progesteron behand elten Tieren (Abb. 12B) zeigten keine Färbung für CD82. Nach Behandlung mit Progest eron und Forskolin waren größere Zellareale zu beobachten, in denen die Zellmembrane n angefärbt waren (Abb. 12C). Nach kombinierter Behandlung von Progesteron und hCG war fast das ganze Fragment spezifisch gefärbt (Abb. 12D). Die immunhistochemis che Färbung spiegelte somit das Ergebnis der Western Blot-Analyse zur CD82-Expression wider. A B D C E T D V P P + F KP + hCG Abb. 12: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression CD82-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron ( B), Progesteron und Forskolin ( C) und Progesteron und hCG ( D) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 7 Tagen Kultur. ( E) Dezidualisiertes Gewebe einer reifen Plazenta als Positivkontrolle. K = Positivkontrolle; V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin; T = Tropoblast; D = Dezidua. Balken A-E = 50 µm. 3.2.2.4 Proliferation der ektopen humanen endometrialen Läsionen Es konnte in den vorhergehenden Kapiteln gezeigt we rden, dass humanes ektopes endometriales Gewebe in vivo durch eine Kombination von Progesteron und einer c AMP- steigernden Substanz dezidualisiert werden kann. Da her wurde als nächstes untersucht, ob Ergebnisse 49 mit dieser kombinierten Behandlung auch ein Prolife rationsstopp in den ektopen endometrialen Läsionen hervorgerufen wird. Der Prol iferationsmarker Ki-67 wurde dazu immunhistochemisch analysiert, um einen Effekt der unterschiedlichen Behandlungen auf die Proliferation der in NOD-SCID-Mäusen kultiviert en endometrialen Fragmente zu untersuchen. Die mit Ki-67 gefärbten Zellkerne im Drüsenepithel sowie im Stroma wurden im Verhältnis zur Gesamtzahl der Epithel- bzw. Stro mazellen ausgezählt und als prozentuale Proliferationsrate angegeben. V P P + F P + hCG 0 5 10 15 20 25 Stromazellen Proliferationsrate [%] V P P + F P + hCG 0 10 20 30 40 50 Drüsenepithelzellen Proliferationsrate [%] A B C D E F V P P + F P + hCG Abb. 13: Proliferation der ektopen Läsionen Nachweis der Proliferation in humanen endometrialen Fragmenten nach Kultivierung in der NOD- SCID Maus über 7 Tage unter Behandlung verschiedene r Substanzen. (A-D) Immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper ge gen den Proliferationsmarker Ki-67. Die Zellkerne proliferierender Zellen sind braun gefärbt. Es wurde eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin durchgeführt. ( A) Vehikel; ( B) Progesteron; ( C) Progesteron + Forskolin; ( D) Progesteron + hCG. Balken: = 50 µm. (E,F) Quantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbung der Stromazellen (E) sowie Drüsenepithelzellen ( F). Pro Behandlungsgruppe wurden vier Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standa rdfehler. V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. Ergebnisse 50 Die quantitative Auswertung der immunhistochemische n Färbungen ergab für das Stroma sowie das Drüsenepithel der mit Progesteron alleine und für das Stroma der mit Progesteron und Forskolin behandelten endometrialen Fragmente eine tendenziell erhöhte Proliferationsrate im Vergleich zur Vehikelkontroll e (Abb. 13EF), während die Proliferationsrate im Drüsenepithel nach 7tägiger k ombinierter Behandlung mit Progesteron und hCG reduziert war (Abb. 13F). Im St roma der ektopen endometrialen Fragmente war die Proliferationsrate nach kombinier ter Behandlung mit Progesteron und hCG niedriger im Vergleich zur Behandlung mit Proge steron alleine oder in Kombination mit Forskolin, es war jedoch kein Unterschied im Ve rgleich zur Kontrolle zu beobachten (Abb. 13E). 3.3 Vergleich des Effektes der Kombination von hCG mit Progesteron bzw. Medroxyprogesteronacetat (MPA) auf die Dezidualisierung Medroxyprogesteronacetat (MPA) ist ein synthetische s Gestagen, welches zusätzlich zu den Progesteronrezeptoren auch an die Glucocorticoi drezeptoren bindet und diese aktiviert (Moghissi und Boyce, 1976; Bruner-Tran et al., 2006 ). In vitro erzielt die kombinierte Gabe von MPA und cAMP einen stärkeren Effekt auf di e Dezidualisierung humaner endometrialer Stromazellen als die Gabe von Progest eron und cAMP, während MPA alleine nur einen schwachen Effekt auf die Dezidual isierung auslöst (Gellersen und Brosens, 2003). In der vorliegenden Arbeit wurde da her untersucht, ob MPA in Kombination mit hCG auch auf die Dezidualisierung v on ektopem humanem Endometriumgewebe in vivo besser wirkt als Progesteron und hCG. Hierzu wurde pro Versuchsansatz Gewebe einer Patientin parallel in d rei NOD-SCID-Mäuse transplantiert. Die Mäuse erhielten folgende Behandlungen: 1. Proge steron (50 µg/d) + hCG (7,5 IU/d), 2. MPA (50 µg/d) + hCG (7,5 IU/d), 3. Vehikelkontro lle. Zudem wurde die Dauer der Behandlung von 7 auf 10 Tage erhöht um zu untersuch en, ob der Effekt auf die Dezidualisierung durch eine längere Behandlung gest eigert werden kann. 24 Stunden nach der letzten Applikation wurden die endometrialen Ge webefragmente entnommen und aufgearbeitet. Ergebnisse 51 3.3.1 Effekt auf das Uterusgewicht der Maus Nach Beendigung des Versuches wurde den NOD-SCID-Mä usen der Uterus entnommen und das Naßgewicht bestimmt. Das Organgewicht wurde auf das Körpergewicht der Maus bezogen und prozentual dargestellt. Die Uterusgewic hte zeigten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen (Abb. 14). Abb. 14: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach 10tägiger Behandlung Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler der Uterusgewichte als prozentualer Anteil am Körpergewicht (KG) nach 10tägiger Behandlung der NO D-SCID Mäuse. Es zeigt sich kein Unterschied zwischen den Versuchsgruppen (n = 5). V = Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.3.2 Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen 3.3.2.1 Größe und Gewicht der ektopen humanen endometrialen Läsionen Nach 10 Tagen Kultur wurden den unterschiedlich beh andelten NOD-SCID-Mäusen die endometrialen Gewebefragmente entnommen und deren Größe und Gewicht bestimmt. Die kombinierte Behandlung mit MPA und hCG hatte ebenso wie die Behandlung mit Progesteron und hCG keinen Einfluss auf die Größe d er endometrialen Gewebefragmente (Abb. 15A). Tendenziell zeigte sich eine Zunahme de s Gewichtes der endometrialen Läsionen nach Behandlung mit Progesteron bzw. MPA u nd hCG im Vergleich zur Kontrolle, jedoch zeigte sich kein signifikanter Un terschied zwischen den Versuchsgruppen (Abb. 15B). V P + hCG MPA + hCG 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Uterusgewicht/KG [%] Ergebnisse 52 V P + hCG MPA + hCG 0 1 2 3 4 5Größe [mm 2] V P + hCG MPA + hCG 0 1 2 3 4Gewicht [mg] A B Abb. 15: Wachstumsverhalten der ektopen Läsionen Größe ( A) und Gewicht ( B) der humanen endometrialen Fragmente nach 10tägiger Kultur in NOD- SCID Mäusen. Pro Behandlungsgruppe wurden 20 Fragme nte analysiert. Gewicht und Größe sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. V = Ve hikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.3.2.2 Morphologie der ektopen humanen endometrialen Läsionen Nach 10tägiger Kultur und Behandlung in der NOD-SCI D-Maus wurde die Morphologie der ektopen humanen endometrialen Läsionen untersuc ht. In den Kontrollfragmenten (Abb. 16A) waren - wie zuvor nach 7tägiger Behandlu ng (vgl. Abb. 4A) - nur kleine Areale dezidualisierter Zellen zu erkennen. Nach Behandlung mit hCG in Kombination mit Progesteron (Abb. 16B) bzw. mit MPA (Abb. 16C) ware n große dezidualisierte Areale zu beobachten. Die morphometrische Quantifizierung erg ab eine signifikante Zunahme dezidualisierter Areale nach 10tägiger kombinierter Behandlung mit hCG und Progesteron bzw. MPA (Abb. 16D), jedoch waren die interindividu ellen Schwankungen nach Behandlung mit MPA und hCG sehr hoch. Schon bei der morphologischen Betrachtung der ektopen Läsionen fiel auf, dass das Gewebe manc her Patientinnen nur schwach auf MPA ansprach, wohingegen in dem Gewebe anderer Pati entinnen eine extrem starke Dezidualisierungsreaktion ausgelöst wurde. Es zeigt e sich jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den Behandlungen mit den beiden verschiedenen Gestagenen. Ergebnisse 53 V P + hCG MPA + hCG 0 1.0 ×× ××10 6 2.0 ×× ××10 6 3.0 ×× ××10 6 * * rel. dezidualisierte Fläche C D A B V P + hCG MPA + hCG Abb. 16: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen Histomorphologie humaner endometrialer Fragmente na ch 10tägiger Kultur in unbehandelten ( A) sowie mit Progesteron und hCG ( B) und MPA und hCG ( C) behandelten NOD-SCID Mäusen. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt u nd zeigen charakteristische Strukturen endometrialen Gewebes. Bereiche mit dezidualisierte n stromalen Zellen sind umrandet. Balken = 50 µm. ( D) Morphometrische Quantifizierung dezidualisierter Areale. Pro Behandlungsgruppe wurden fünf Fragmente analysiert. Dargestellt ist d er Mittelwert ± Standardfehler. Der prozentuale Anteil der dezidualisierten Fläche an der Gesamtflä che des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x-fache Fläche im Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. * p ≤ 0,05 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. V = Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.3.2.3 Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ekto pen humanen endometrialen Läsionen Der Grad der Dezidualisierung in den ektopen endome trialen Fragementen wurde nach 10tägiger Behandlung und Kultur in NOD-SCID-Mäusen mit Hilfe verschiedener Dezidualisierungsmarker analysiert. Im Folgenden wu rde nur noch deziduales PRL als einer der beiden Hauptsekretionsprodukte dezidualis ierter Zellen als spezifischer Marker untersucht. Ergebnisse 54 dPRL V P + hCG MPA + hCG 0 200 400 600 800 *** rel. Genexpression FOXO1 V P + hCG MPA + hCG 0 20 40 60 rel. Genexpression A B FOXO1 Abb. 17: Expression verschiedener Dezidualisierungsmarker auf Transkriptionsebene Relative Genexpression von dPRL ( A) und FOXO1 ( B) in ektopen humanen endometrialen Fragmenten nach 10tägiger Kultur in NOD-SCID Mäusen . Dargestellt ist der jeweilige Mittelwert ± Standardfehler ektoper Fragmente fünf verschieden er Patientinnen. Es wurde gegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. Die relative Expression des Ve hikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x-fache Expression im Subs tanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. Die dPRL -Expression ist nach kombinierter Behandlung von Pr ogesteron und hCG im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle signifikant hochreguliert (*** ≤ 0,005). V = Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. In Abb. 17A sind die Ergebnisse der quantitativen P CR für die dPRL -Expression in den ektopen humanen endometrialen Fragmente dargestellt . Hierbei zeigte sich nach kombinierter Behandlung mit Progesteron und hCG ein e stark signifikante Erhöhung der dPRL -Expression (p = 0,005) im Vergleich zur Vehikelkon trolle. Somit ruft eine 10tägige Behandlung offensichtlich einen deutlicheren Effekt hervor als eine 7tägige Behandlung (vgl. Abb. 5). Die kombinierte Behandlung von MPA u nd hCG führte zwar ebenfalls zu einer erhöhten dPRL -Expression, diese war jedoch nicht signifikant, obwohl der Mittelwert einer 350fachen Expressionserhöhung im Vergleich zu m Vehikel entspach, da das Endometriumgewebe mancher Patientinnen auf diese Behandlung kaum mit einem Anstieg der dPRL -Expression reagierte. Im Hinblick auf die Transkription von FOXO1 zeigte sich nach täglicher Applikation von hCG in Kombination mit Progesteron bzw. MPA über ei nen Zeitraum von 10 Tagen ein tendenzieller Anstieg der FOXO1 -Expression in den ektopen endometrialen Fragmenten im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 17B). Auch bei die ser Expressionsanalyse bestätigte sich, dass nach einer kombinierten Behandlung von M PA und hCG die interindividuellen Schwankungen deutlich höher waren als nach kombinie rter Behandlung von Progesteron und hCG, was zu einem deutlich höheren Standardfehler führte. Ergebnisse 55 Zur Untersuchung der FOXO1-Expression auf Proteineb ene in den ektopen humanen endometrialen Fragmenten nach 10tägiger Behandlung und Kultur in NOD-SCID-Mäusen wurde ein immunhistochemischer Nachweis durchgeführ t (Abb. 18A-C). Vehikelfragmente zeigten keine Expression von FOXO1 (Abb. 18A). Nach Behandlung mit hCG in Kombination mit Progesteron bzw. MPA war eine großflächige nukleäre Expression von FOXO1 in den dezidualisierten Stomaz ellen zu erkennen (Abb. 18BC). Die semiquantitative Auswertung der immunhistochemi schen Färbungen zeigte eine signifikante Erhöhung der FOXO1-Expression im Vergl eich zur Vehikelkontrolle in den ektopen Fragmenten, welche mit Progesteron bzw. MPA und hCG behandelt wurden (Abb. 18). Hierbei zeigte sich kein signifikanter Untersc hied zwischen den beiden verschiedenen Gestagenen. V P + hCG MPA + hCG 0 2 4 6 8 10 * * relative Intensität / Vehikelkontrolle A B C D V P + hCG MPA + hCG Abb. 18: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression FOXO1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron und hCG ( B) und mit MPA und hCG ( C) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 10 Tagen Kultur. Balken = 50 µm. ( D) Semiquantitative Auswertung der FOXO1-Färbung. Pro Behandlungsgruppe wurden fünf Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwer t ± Standardfehler. Die relative Intensität des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt. * p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikelkontrolle. V = Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesterona cetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. Im Hinblick auf die Expression von GJA1 zeigte sich nach 10tägiger kombinierter Behandlung von hCG mit Progesteron bzw. MPA keine S teigerung der Transkription im Ergebnisse 56 Vergleich zur Kontrolle (Abb. 19A). Es zeigte sich jedoch eine gesteigerte GJA1- Proteinexpression in den unterschiedlich behandelte n ektopen humanen endometrialen Läsionen, die aber nicht signifikant war (Abb. 19BC ). Die immunhistochemische Analyse der GJA1-Expression zeigte in den Kontrollfragmente n vereinzelt Zellen, die an der Membran eine Expression von GJA1 aufwiesen (Abb. 19 D). Nach kombinierter Behandlung mit hCG und Progesteron (Abb. 19E) bzw. MPA (Abb. 19F) waren die Membranen fast aller Stromazellen der jeweiligen Fr agmente angefärbt. Durch diesen immunhistochemischen Nachweis der GJA1-Expression k onnte gezeigt werden, dass der im Western Blot gezeigte Anstieg der Proteinexpress ion auf einer gesteigerten Expression von GJA1 im Stroma beruht. C GJA 1 GAPDH V P + hCG MPA + hCG V P + hCG MPA + hCG 0 2 4 6 8rel. Proteinexpression BA FED P0 P1 P2 V P + hCG MPA + hCG V P + hCG MPA + hCG 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 rel. Genexpression Abb. 19: Expressionsanalyse von GJA1 Expression von GJA1 in ektopen humanen endometriale n Fragmenten fünf verschiedener Patientinnen nach 10tägiger Kultur in NOD-SCID Mäus en. ( A) Dargestellt ist der jeweilige Mittelwert ± Standardfehler der Ergebnisse der quan titativen Echtzeit-PCR zur GJA1 -Expression. Es wurde gegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. Die relative Prolaktinexpression des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x- fache Expression im Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. ( B) Densitometrische Auswertung von Western Blots zur GJA1- Expression. Angegeben sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen der verschiedenen Messungen, die gegen das entsprechende GAPDH-Signal abgeglichen worden sind. ( C) Repräsentativer Western Blot. P0-P2 = unterschiedliche Phosphorylierungsstadien von GJA1 (P0 = 41 kDa, P1 = 44 kDa, P2 = 46 kDa). (D-F) Immunhistochemischer Nachweis der GJA1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( D), mit Progesteron und hCG ( E) und MPA und hCG ( F) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 10 Tagen Kultur. B alken = 50 µm. V = Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. Die CD82-Expression wurde auf Proteinebene immunhis tochemisch analysiert und quantifiziert. Die ektopen endometrialen Gewebefrag mente aus den Kontrolltieren wiesen Ergebnisse 57 keine Membranfärbung für CD82 auf (Abb. 20A). Nach Behandlung mit hCG in Kombination mit Progesteron bzw. MPA war eine Expre ssion von CD82 an den Zellmembranen der Stromazellen zu beobachten (Abb. 20BC). Die semiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbungen ergab eine tendenzielle Erhöhung der CD82-Expression im Vergleich zur Vehikelkontrolle nach Behandlung mit hCG in Kombination mit beiden Gestagenen (Abb. 20D). V P + hCG MPA + hCG 0 2 4 6 relative Intensität / Vehikelkontrolle A B C D MPA +hCG V P + hCG Abb. 20: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression CD82-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron und hCG ( B) und mit MPA und hCG ( C) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 10 Tagen Kultur. Balken = 50 µm. ( D) Semiquantitative Auswertung der CD82-Färbung. Pro B ehandlungsgruppe wurden fünf Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standa rdfehler. Die relative Intensität des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt. V = Vehik el; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.3.2.4 Proliferation der ektopen humanen endometrialen Läsionen Die quantitative Auswertung der immunhistochemische n Färbungen des Proliferationsmarkers Ki-67 zeigte eine tendenziell reduzierte Proliferationsrate des Stromas der für 10 Tage mit Progesteron und hCG beh andelten endometrialen Fragmente sowie eine abgesenkte Proliferationsrate der Drüsen epithelzellen bei der Kombination von Ergebnisse 58 hCG mit beiden Gestagenen im Vergleich zur Vehikelk ontrolle (Abb. 21). Diese Unterschiede waren aber nicht signifikant. V P + hCG MPA + hCG 0 5 10 15 Stromazellen Proliferationsrate [%] V P + hCG MPA + hCG 0 20 40 60 Drüsenepithelzellen Proliferationsrate [%] CBA V P + hCG MPA + hCG ED Abb. 21: Proliferation der ektopen Läsionen Nachweis der Proliferation humaner endometrialer Fragmente nach Kultivierung in der NOD-SCID Maus über 10 Tage unter Behandlung verschiedener Su bstanzen. ( A-C) Immunhistochemie mit einem Antikörper gegen den Proliferationsmarker Ki-67. Die Zellkerne proliferierender Zellen sind braun gefärbt. Es wurde eine Gegenfärbung mit Hämat oxylin durchgeführt. ( A) Vehikel; ( B) Progesteron und hCG; ( C) MPA und hCG. Balken: = 40 µm. Quantitative Auswer tung der immunhistochemischen Färbung der Stromazellen ( D) sowie Drüsenepithelzellen ( E). Pro Behandlungsgruppe wurden vier Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler. V = Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.4 Entzug von Dezidualisierungsinduktoren Wie zuvor beschrieben wird diskutiert, dass Endomet rioseherde während einer Schwangerschaft dezidualisieren und nach der Geburt apoptotisch werden können (Moen und Muus, 1991). Für Letzteres könnte der Entzug von Progesteron ver antwortlich sein (Healy und Hodgen, 1983). Aus diesem Grund wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, bei der nach 10 Tagen die Behandlung zur Induktion der Dezidualisierung der in NOD-SCID- Mäuse transplantierten humanen endometrialen Fragme nte beendet und die Kultur für weitere 7 Tage ohne Behandlung fortgesetzt wurde. N ach diesem Zeitraum wurden die Ergebnisse 59 Fragmente analysiert. Da sich in den vorangegangene n Versuchen gezeigt hatte, dass die stärkste Induktion der Dezidualisierung mit Progest eron in Kombination mit hCG erreicht werden konnte, wurde diese Behandlung für die folge nden Versuche eingesetzt. Für jeden Versuch wurde das Gewebe derselben Patientin parall el in zwei NOD-SCID-Mäuse transplantiert. Einer dieser Mäuse wurde Progestero n (50 µg/d) + hCG (7,5 IU/d) appliziert. Die zweite Maus diente als Vehikelkontr olle. Die Substanzapplikation erfolgte über einen Zeitraum von 10 Tagen. Nach einem Zeitra um von 17 Tagen wurden die endometrialen Gewebefragmente entnommen und aufgearbeitet. 3.4.1 Effekt auf das Uterusgewicht der Maus Um die Wirkung der applizierten Substanzen auf den Uterus als Zielorgan zu überprüfen, wurden auch bei dieser Versuchsreihe die Uterusgewichte der Mäuse nach Beendigung des Versuches ermittelt (Abb. 22). Zwar zeigte sich ein erhöhtes Uterusgewicht nach der Behandlung mit Progesteron und hCG, jedoch war dies nicht signifikant. Abb. 22: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach Behandlung Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler der Uterusgewichte als prozentualer Anteil am Körpergewicht (KG) nach Kultivierung und Behandlung in NOD-SCID Mäusen. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.4.2 Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen 3.4.2.1 Größe und Gewicht der ektopen humanen endometrialen Läsionen Nach 17 Tagen wurden den Mäusen die endometrialen G ewebefragmente entnommen und deren Gewicht und Größe bestimmt. Während sich nach 10tägiger Behandlung eine leichte Erhöhung des Gewichtes gezeigt hatte (vgl. Abb. 15) , war nach weiteren 7 Tagen ohne Behandlung kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle zu beobachten (Abb. 23). V P + hCG 0.0 0.5 1.0 1.5 Uterusgewicht/KG [%] Ergebnisse 60 V P + hCG 0 1 2 3 4Größe [mm 2] V P + hCG 0 1 2 3 4Gewicht [mg] A B Abb. 23: Wachstumsverhalten der ektopen Läsionen Größe ( A) und Gewicht ( B) der humanen endometrialen Fragmente dreier versch iedener Patientinnen nach 10tägiger Kultur und Behandlung i n NOD-SCID Mäusen und weiterer 7tägiger Kultur ohne Behandlung. Pro Behandlungsgruppe wurde n 12 Fragmente analysiert. Gewicht und Größe sind als Mittelwert ± Standardfehler dargeste llt. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.4.2.2 Morphologie der ektopen humanen endometrialen Läsionen Nach einer 10tägigen Behandlung mit Progesteron und hCG gefolgt von 7 Tagen ohne Behandlung wurden die ektopen humanen endometrialen Läsionen histomorphologisch untersucht. Während in den Kontrollfragmenten nur k leine Areale dezidualisierter Zellen zu erkennen waren (Abb. 24A), zeigten sich in den b ehandelten Läsionen deutlich größere dezidualisierte Areale (Abb. 24B). Die morphometris che Auswertung dieser Areale zeigte, dass die Gesamtfläche dezidualisierten Stromas im V ergleich zur Kontrolle erhöht war (Abb. 24C). Im Gegensatz zu den unter 3.3.2.2 besch riebenen Versuchen, bei denen nach einer 10tägigen Behandlung mit Progesteron und hCG ein signifikanter Anstieg der dezidualisierten Fläche beobachtet wurde (vgl. Abb. 16), war dieser Anstieg nach weiteren 7 Tagen Kultur ohne Behandlung nicht mehr signifikant. Ergebnisse 61 V P + hCG 0 2 4 6 8rel. dezidualisierte Fläche A B C V P + hCG Abb. 24: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen Histomorphologie humaner endometrialer Fragmente na ch 10tägiger Kultur in NOD-SCID Mäusen, die mit Progesteron und hCG bzw. dem Vehike l behandelt wurden und weiterer 7tägiger Kultur ohne Behandlung. ( A) Vehikelkontrolle, ( B) Behandlung mit Progesteron und hCG. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt u nd zeigen charakteristische Strukturen endometrialen Gewebes. Balken = 50 µm. ( C) Morphometrische Quantifizierung dezidualisierter Areale. Pro Behandlungsgruppe wurden drei Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler. Der prozentuale Anteil der dezidual isierten Fläche an der Gesamtfläche des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x- fache Fläche im Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.4.2.3 Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ekto pen humanen endometrialen Läsionen Der Grad der Dezidualisierung in den ektopen endome trialen Fragmenten wurde nach 17tägiger Kultur in NOD-SCID-Mäusen wie in den vorh ergehenden Versuchsreihen mit Hilfe verschiedener Dezidualisierungsmarker analysiert. In Abb. 25 sind die Ergebnisse der quantitativen PC R für dPRL und FOXO1 in den ektopen humanen endometrialen Fragmenten von drei v erschiedenen Patientinnen nach 10tägiger Behandlung und weiterer 7tägiger Kultur o hne Behandlung in NOD-SCID- Mäusen dargestellt. Die signifikante Erhöhung der dPRL -Expression, die bereits in der vorhergehenden Versuchsreihe nach 10tägiger kombini erter Behandlung mit Progesteron Ergebnisse 62 und hCG gezeigt wurde (vgl. Abb. 17A), stieg nach 1 0tägiger Behandlung mit Progesteron und hCG und anschließender 7tägiger Kultur ohne Beh andlung in den ektopen endometrialen Fragmenten nochmals deutlich an (Abb. 25A). Im Gegensatz hierzu zeigte sich im Hinblick auf die die Expression des Dezidua lisierungsmarkers FOXO1 kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle (Abb. 25B). FOXO1 V P + hCG 0 2 4 6 8 10 rel. Genexpression A B dPRL V P + hCG 0 100 200 300 400 500 15000 35000 * rel. Genexpression Abb. 25: Relative Expression von dPRL und FOXO1 auf Transkriptionsebene Relative Genexpression von dPRL ( A) und FOXO1 ( B) in ektopen humanen endometrialen Fragmenten nach 10tägiger bzw. 17tägiger Kultur in NOD-SCID Mäusen. Dargestellt sind die Ergebnisse der quantitativen Echtzeit-PCR ektoper F ragmente dreier Patientinnen als Mittelwert ± Standardfehler. Es wurde gegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. Die dPRL - Expression ist nach kombinierter Behandlung mit Pro gesteron und hCG signifikant hochreguliert (* ≤ 0,05). V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. Auf Proteinebene zeigten die Kontrollen nach 17tägi ger Kultur in NOD-SCID-Mäusen eine schwache Expression von FOXO1 in der immunhist ochemischen Untersuchung (Abb. 26A). Eine solche Expression war in den vorhergehen den Versuchsreihen nach kürzerer Kulturdauer in den endometrialen Kontrollfragmenten nicht zu beobachten (vgl. Abb. 8A und Abb. 18A). Nach 10tägiger Behandlung mit Proges teron und hCG und anschließender 7tägiger Kultur ohne Behandlung in der NOD-SCID-Mau s wiesen größere Bereiche der ektopen Fragmente eine Expression von FOXO1 in den endometrialen Stromazellen auf (Abb. 26B). Die semiquantitative Auswertung der imm unhistochemischen Färbungen ergab jedoch keine signifikanten Unterschiede zwisc hen unbehandelten und behandelten Fragmenten (Abb. 26C). Ergebnisse 63 V P + hCG 0 1 2 3 4 5relative Intensität A C V P + hCG B relative Intensität / Vehikelkontrolle Abb. 26: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression FOXO1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A) und mit Progesteron und hCG behandelten ( B) NOD-SCID-Mäusen nach 17 Tagen Kultur. Balken = 40 µm. ( D) Semiquantitative Auswertung der FOXO1-Färbung. Pro Behandlungsgruppe wurden drei Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. Die Transkription von GJA1 unterschied sich nach 10tägiger kombinierter Behan dlung mit Progesteron und hCG und nachfolgender 7tägiger Kult ur ohne Behandlung nicht signifikant von der Kontrolle (Abb. 27). Abb. 27: Relative Expression von GJA1 auf Transkriptionsebene Relative Genexpression von GJA1 in ektopen humanen endometrialen Fragmenten drei verschiedener Patientinnen nach 17tägiger Kultur in NOD-SCID Mäusen. Dargestellt ist der jeweilige Mittelwert ± Standardfehler der Ergebniss e der quantitativen Echtzeit-PCR. Es wurde gegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. GJA1 V P + hCG 0 1 2 3 4 5 rel. Genexpression Ergebnisse 64 Eine leichte Erhöhung der GJA1-Proteinexpression, w ie sie in der Western Blot-Analyse nach 10tägiger Behandlung mit Progesteron und hCG i n den ektopen humanen endometrialen Läsionen gezeigt wurde (vgl. Abb. 19B ), blieb auch nach weiteren 7 Tagen Kultur ohne Behandlung erhalten, war jedoch nicht s ignifikant (Abb. 28A). Eine stärkere GJA1-Proteinexpression zeigte sich auch in den beha ndelten ektopen Fragmenten nach 17tägiger Kultur im Vergleich zur Kontrolle in der immunhistochemischen Analyse (Abb. 28C). V P + hCG 0 1 2 3 4 rel. Genexpression GJA1 GAPDH V P + hCG P0 P1 P2 A C V P + hCG B D Abb. 28: Expressionsanalyse von GJA1 auf Proteinebene Expression von GJA1 in ektopen humanen endometriale n Fragmenten drei verschiedener Patientinnen nach 17tägiger Kultur in NOD-SCID Mäus en. ( A) Densitometrische Auswertung von Western Blots zur GJA1-Expression. Angegeben sind d ie Mittelwerte und die Standardabweichungen der verschiedenen Messungen, d ie gegen das entsprechende GAPDH- Signal abgeglichen worden sind. ( B) Repräsentativer Western Blot. P0-P2 = unterschied liche Phosphorylierungsstadien von GJA1 (P0 = 41 kDa, P1 = 44 kDa, P2 = 46 kDa). (CD) Immunhistochemischer Nachweis der GJA1-Expression n ach Kultivierung in unbehandelten ( C) und Progesteron und hCG behandelten ( D) NOD-SCID-Mäusen nach 17 Tagen Kultur. Balken = 40 µm. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. Die immunhistochemische Analyse der CD82-Expression zeigte in den Kontrollfragmenten nur wenige Zellen, die an der Me mbran eine Expression von CD82 aufwiesen (Abb. 29A). Nach kombinierter Behandlung von Progesteron und hCG waren die Membranen fast aller Stromazellen in den ektope n endometrialen Fragmenten angefärbt (Abb. 29B). Die semiquantitative Auswertu ng der immunhistochemischen Ergebnisse 65 Färbungen ergab einen signifikanten Unterschied zwischen unbehandelten und behandelten Fragmenten (Abb. 29C). V P + hCG 0 2 4 6 * relative Intensität / Vehikelkontrolle A B C V P + hCG Abb. 29: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression CD82-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A) und für 10 Tage mit Progesteron und hCG behandelten ( B) NOD-SCID-Mäusen nach 17 Tagen Kultur. Balken = 50 µm. ( C) Semiquantitative Auswertung der CD82-Färbung. Pro B ehandlungsgruppe wurden drei Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standa rdfehler. Die relative Intensität des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt. * p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikelkontrolle. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.4.2.4 Proliferation der ektopen humanen endometrialen Läsionen Die quantitative Auswertung der immunhistochemische n Färbungen für Ki-67 (Abb. 30) ergab für das Stroma sowie das Drüsenepithel der fü r 10 Tage mit Progesteron und hCG behandelten und für weitere 7 Tage ohne Behandlung in NOD-SCID-Mäusen kultivierten ektopen endometrialen Fragmente eine im Vergleich z ur Vehikelkontrolle signifikant reduzierte Proliferationsrate des endometrialen Str omas (Abb. 30C), während die Proliferation der Drüsenepithelzellen nur leicht reduziert war (Abb. 30D). Ergebnisse 66 V P + hCG 0 5 10 15 20 Stromazellen * Proliferationsrate [%] V P + hCG 0 10 20 30 40 50 Drüsenepithelzellen Proliferationsrate [%] A B V P + hCG C D Abb. 30: Proliferation der ektopen Läsionen Nachweis der Proliferation humaner endometrialer Fr agmente nach 10tägiger Behandlung Progesteron und hCG gefolgt von einer 7tägigen Kultivierung ohne Behandlung in der NOD-SCID Maus. (AB) Immunhistochemien mit einem Antikörper g egen den Proliferationsmarker Ki-67. Die Zellkerne proliferierender Zellen sind braun gefärbt. Es wurde eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin durchgeführt. ( A) Vehikel; ( B) Progesteron + hCG. Balken: = 50 µm. Quantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbung der Stromazellen ( C) sowie Drüsenepithelzellen ( D). Pro Behandlungsgruppe wurden Fragmente von vier verschi edenen Patientinnen analysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler. Die Proliferat ionsrate der Stromazellen ist nach 10tägiger kombinierter Behandlung von Progesteron und hCG und weiterer 7tägiger Kultur im Vergleich zur Vehikelkontrolle signifikant reduziert (* ≤ 0,05). V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. 3.5 Einfluss der verschiedenen Behandlungen auf die Apo ptoserate von ektopen endometrialen Läsionen In den vorhergehenden Kapiteln konnte gezeigt werde n, dass es möglich ist, die Dezidualisierung ektopen endometrialen Gewebes in vivo zu induzieren. Die nächste zu untersuchende Frage wäre, ob diese dezidualisierten Stromazellen mit der Zeit apoptotisch werden und somit ein Persistieren der ektopen endom etrialen Fragmente in vivo verhindert werden kann. Daher wurden zur Untersuchung von Apop toseparametern Paraffinschnitte Ergebnisse 67 der humanen Endometriumfragmente aller Versuchsreihen mit einem Antikörper gegen die aktivierte Caspase 3, ein Mitglied in der Apoptosesignalkaskade, inkubiert. V P + hCG MPA + hCG 0 10 20 30 40 50 gefärbte Schnitte [%] A B C D MPA +hCG V P + hCG Abb. 31: Nachweis aktivierter Caspase 3 Immunhistochemischer Nachweis der aktivierten Caspa se 3 in unbehandelten ( A), mit P und hCG (B) und mit MPA und hCG ( C) behandelten humanen ektopen endometrialen Läsione n nach 10 Tagen Kultur in NOD-SCID-Mäusen. Apoptotische Zellkerne sind braun gefärbt. Balken = 10 µm. (D) Quantitative Darstellung des immunhistochemischen Nachweises von aktivierter Caspase 3. V = Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogestero nacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. Nach 7tägiger Behandlung mit Progesteron alleine od er in Kombination mit Forskolin bzw. hCG konnte keine spezifische Färbung der Zellk erne für aktivierte Caspase 3 festgestellt werden. Ebenso konnte nach 10tägiger B ehandlungsdauer mit Progesteron und hCG (Abb. 31B) sowie nach Entzug dieser Dezidualisi erungsinduktoren, d.h. nach 10tägiger Behandlung und anschließender Kultivierun g der ektopen Fragmente für einen Zeitraum von sieben Tagen, keine Apoptose in den ek topen endometrialen Läsionen ausgelöst werden. In den unbehandelten Fragmenten a ller Versuchsreihen wurde keine spezifische Färbung der Zellkerne für aktivierte Ca spase 3 gefunden (Abb. 31A). Interessanterweise waren nach 10tägiger Behandlung mit MPA und hCG in den ektopen endometrialen Fragmenten große Areale zu beobachten , in denen die Zellkerne der dezidualisierten Stromazellen, nicht aber der Drüse nepithelzellen, eine Färbung für Ergebnisse 68 aktivierte Caspase 3 aufwiesen (Abb. 31CD). Jedoch war eine Expression von aktivierter Caspase 3 nur in den mit MPA und hCG behandelten Ge webefragmenten aus Patientinnen zu erkennen, die auch schon in den vorhergehenden Analysen der Dezidualisierungsmarker die stärkste Reaktion auf die Induktion der Dezidualisierung zeigten. Diskussion 69 4 Diskussion 4.1 Induktion der Dezidualisierung ektopen Endometriums in vivo Es wird davon ausgegangen, dass die stromale Kompon ente des Endometriums eine wesentliche Rolle bei der Etablierung und Persisten z der Endometriose spielt (Nisolle et al., 2000a). Ein möglicher therapeutischer Ansatz z ur Behandlung der Endometriose könnte daher darin liegen, durch eine Induktion der Dezidualisierung der endometriotischen Stromazellen diese Zellen termina l zu differenzieren und damit die Überlebensdauer zu terminieren. Normalerweise sind die meisten menstruellen Zellen terminal differenziert und zeigen daher eine reduzi erte Kapazität zu ektoper Invasion und Östrogen-vermitteltem Wachstum (Bruner-Tran et al., 2006). Scott und Te Linde (1954) konnten im Tiermodell zeigen, dass die Transplantat ion von operativ entnommenem humanem Endometrium aus der Proliferationsphase des Menstruationszyklus sich am erfolgreichsten darstellt. Endometriales Gewebe aus der Sekretions- und prämenstruellen Phase ist weniger erfolgreich zu transplantieren und die Transplantationsfähigkeit reduziert sich weiterhin bei dezidualisiertem Gewebe mit der Dauer einer Schwangerschaft, so dass das stark dezidualisierte Gewebe am Ende der Schwan gerschaft kaum mehr zu transplantieren ist (Scott and Te Linde, 1954). Die Theorie einer nichtadäquaten Differenzierung des eutopen Endometriums bei erkrankten Frauen wird durch die Tatsache unterstützt, dass Endometriose in fast 60% der Pati entinnen mit Infertilität verbunden ist (Grummer et al., 2001; Ledger, 1999). Ein Abbau des endometrialen Stromas könnte die für das Wachstum der endometriotischen Läsionen not wendige Interaktion zwischen dem stromalen und epithelialen Kompartiment beeinflussen (Cunha et al., 1980, 1985; Osteen et al., 1994; Nisolle et al., 2000b). Nisolle et al. ( 2000) und Grümmer et al. (2001) konnten zeigen, dass epitheliale Zellen ihre ursprüngliche Morphologie nur in Bereichen beibehalten, in denen das Stroma stark entwickelt i st. Ohne endometriales Stroma, welches die Drüsen umgibt, atrophiert auch das Drüsenepithe l (Bergqvist et al., 1985a). Diese Beobachtung bildet u.a. die Grundlage der therapeut ischen Verwendung kontinuierlich eingesetzter hochdosierter Progestine (Kistner, 195 8; Metzger und Haney, 1988). In 77% der endometriotischen Läsionen schwangerer Frauen w urde bei einer Studie eine Dezidualisierung gefunden (Moen und Muus, 1991). In experimentellen Studien mit operativ induzierter Endometriose in Affen konnte e ine vollständige oder deutliche Regression der Implante nach der Geburt demonstrier t werden (Schenken et al., 1987). Diskussion 70 Jedoch wurde schon 1965 beschrieben, dass eine hist ologische Regression endometriotischer Läsionen nicht durchweg in der Sc hwangerschaft beobachtet wurde (McArthur und Ulfelder, 1965). Da aus zahlreichen in vitro -Studien bekannt ist, dass die Gabe von Progestinen in Kombination mit cAMP zu einer verstärkten Dezidualisierung von humanen endometrialen Stromazellen im Vergleich zu der Behandlung mit Pro gestinen alleine führt (Kim et al., 1998; Gellersen und Brosens, 2003; Tsuno et al., 20 09), wurde in der vorliegenden Arbeit erstmalig versucht, die Dezidualisierung auch in humanen ektopen endometrialen Läsionen in vivo durch die zusätzliche Aktivierung des cAMP/PKA-Sig nalweges hervorzurufen bzw. zu verstärken. Als Substanzen, die den intraze llulären cAMP-Spiegel erhöhen, wurde zum einen Forskolin appliziert, das eine direkte Ak tivierung der Adenylatzyklase bewirkt, zum anderen das heterodimere Glykoproteinhormon hCG, das den cAMP-Anstieg über die Bindung an G-Protein-gekoppelte LH/hCG (Luteinisier endes Hormon /Choriongonadotropin)-Rezeptoren und nachfolgend in einem Rezeptor-abhängigen Prozess die Aktivierung der α-Untereinheit des trimeren G-Proteins hervorruft, w elches dann die katalytische Aktivität der Adenylatzyklase auslöst (Weedon-Fekjaer und Tasken, 2012). Als Maß für die Dezidualisierung wurden die morphologischen und biochemischen Änderungen des endometrialen Stromas herangezogen. Die stromalen Fibroblasten differenzieren zu runden, großen epitheloiden sezer nierenden Deziduazellen. Spezifische biochemische Marker dieser Transformation endometri aler Stromazellen sind PRL und IGFBP-1 (Tseng et al., 1992; Gellersen und Brosens, 2003). Anhand dieser Parameter konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, d ass die Dezidualisierung ektopen endometrialen Gewebes signifikant durch die Applika tion von Progesteron und hCG induziert werden kann, während die Behandlung mit P rogesteron alleine keinen und die Kombination von Progesteron und Forskolin einen deu tlich schwächeren Effekt zeigte. Dieser signifikante Effekt einer kombinierten Behan dlung mit Progesteron und hCG verstärkte sich mit der Behandlungsdauer. Während n ach 7tägiger Behandlung ein 20fach erhöhtes Expressionslevel von dPRL erreicht wurde, war das Transkriptlevel von dPRL im Vergleich zur Kontrolle nach 10 tägiger kombinierte r Behandlung mit Progesteron und hCG nun beinahe 100fach erhöht. Es konnte zuvor schon gezeigt werden, dass Progesteron nur ein schwacher Induktor der Dezidualisierung ist und zudem eine längere Dauer der Progesteronwirkung nötig ist. So wird auch die dezi duale Umformung der eutopen stromalen Zellen beim Menschen erst ungefähr zehn T age nach dem postovulatorischen Anstieg des ovariellen Progesteronlevels zunächst um die Spiralarterien herum sichtbar (de Diskussion 71 Ziegler et al., 1998). In in vitro -Studien wurde festgestellt, dass eine 2wöchige Behandlung humaner endometrialer Stromazellen notwendig ist, u m die Dezidualisierung durch die alleinige Gabe von Progesteron zu induzieren (Mizun o et al., 1998). Die Ergebnisse der oben aufgeführten Studien deuten darauf hin, dass d ie Expression der Dezidua- spezifischen Gene wahrscheinlich nicht unter der di rekten transkriptionellen Kontrolle des aktivierten Progesteronrezeptors liegt, sondern die Interaktion des nukleären Progesteronrezeptors mit anderen Transkriptionsfakt oren den Progesteroneffekt im differenzierenden endometrialen Stroma vermittelt ( Tseng et al., 1992; Gellersen und Brosens, 2003). Dafür spricht auch die Tatsache, da ss viele Dezidua-spezifischen Gene, darunter das deziduale Prolaktingen, keine palindro mischen Progesteron-responsiven Elemente in ihren Promotoren besitzen (Gellersen un d Brosens, 2003). Der genaue molekulare Mechanismus, über den Progesteron die Di fferenzierung reguliert, ist noch nicht wirklich verstanden. Es ist bekannt, dass die Dezidualisierung des Endometriums zusätzlich zum Progesteron über weitere Faktoren be einflußt und gesteuert wird. So kann auch die Stimulierung des cAMP/PKA-Signalweges eine n starken Einfluß auf die Dezidualisierung haben (Tseng et al., 1992; Frank e t al., 1994; Gellersen und Brosens, 2003). In den letzten Jahren wurde herausgefunden, dass der cAMP/PKA-Signalweg mit dem Progesteronsignalweg interagiert, diesen reguli ert und modifiziert (Maruyama und Yoshimura, 2008). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung der ektopen Fragmente mit Progesteron und cAMP-stei gernden Substanzen zu einer vestärkten Dezidualisierung im Vergleich zur allein igen Behandlung mit Progesteron führte, wobei hCG ein signifikant besserer Induktor der Dezidualisierung ektopen endometrialen Gewebes war als Forskolin. Es ist bek annt, dass cAMP die trankriptionelle Aktivität des Prolaktinrezeptors verstärkt, obwohl dieser Mechanismus noch nicht ganz verstanden ist (Gellersen und Brosens, 2003). Der B eginn des Dezidualisierungsprozesses benötigt wahrscheinlich einen erhöhten intrazellulä ren cAMP-Level und eine kontinuierliche Aktivierung des Proteinkinase A (PK A)-Signalweges (Gellersen und Brosens, 2003). Nachdem zwar gezeigt wurde, dass di e Zugabe von cAMP oder Forskolin zum Kulturmedium die Dezidualisierung endometrialer Stromazellen in vitro induzieren kann (Sugino et al., 2002; Gellersen und Brosens, 2003), konnte in der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass die kombinierte Gabe von Progestinen und cAMP- Induktoren auch in vivo den Dezidualisierungsprozess der Stromazellen ekto pen endometrialen Gewebes verstärken kann. Interessant ist hier vor allen Dingen der von hCG ausgelöste starke Effekt auf die Dezidualisierung. Humanes Choriongonadotropin wird Diskussion 72 während der Schwangerschaft vom Trophoblasten gebildet und sezerniert und spielt, neben seiner klassischen endokrinen Funktion zur Aufrecht erhaltung der Progesteronproduktion durch den Gelbkörper, eine wichtige Rolle bei der V orbereitung des Endometriums auf eine Implantation (Tang und Gurpide et al., 1993; Kajihara et al., 2011). Das Endometrium besitzt im Gegensatz zu anderen Geweben, die nicht zum Reproduktionssystem gehören, eine große Menge an LH/hCG-Rezeptoren (Reshef et al ., 1990; Han et al, 1997; Gellersen und Brosens, 2003; Prast et al., 2008) und ist währ end der Schwangerschaft einem hohen Level an hCG ausgesetzt (Maruyama und Yoshimura, 20 08). Das Dezidualisierungspotential von hCG zeigt in zahlrei chen in vitro -Studien widersprüchliche Ergebnisse. Tang und Gurpide (1993) konnten zeigen, dass die Differenzierung primärer endometrialer Stromazellen in Deziduazellen in vitro durch urinäres hCG verstärkt wird. Es wurde auch beschrieben, dass hCG die Produktion von dPRL in humanem Deziduagewebe in vitro stimuliert (Rosenberg und Bhatnagar, 1984). Demgeg enüber steht eine Studie, bei der die morphologische und biochem ische Differenzierung primärer humaner endometrialer Stromazellen durch die alleinige Gabe von hCG nicht induziert und der durch Progesteron hervorgerufene Effekt auf die Dezidualisierung durch die zusätzliche Gabe von hCG nicht verstärkt werden konnte, wobei in dieser Veröffentlichung nicht ersichtlich war, welche hCG-Präparation verwe ndet wurde (Kasahara et al., 2001). Eine kürzlich erschienene Studie berichtet, dass be i Verwendung einer rekombinanten hCG-Präparation die Expression des Dezidualisierung smarkers dPRL in einer immortalisierten endometrialen Stromazelllinie heru nterreguliert werden kann, jedoch die Verwendung von urinärem hCG die Expression steigert (Kajihara et al., 2011). Somit könnten für die widersprüchlichen Ergebnisse der St udien die unterschiedlich verwendeten hCG-Präparationen, rekombinantes versus urinäres hC G, verantwortlich sein. Humanes Choriongonadotropin setzt sich aus zwei Untereinhei ten zusammen: Der α-Untereinheit, welche ebenfalls an dem Aufbau der Glykoproteinhorm one FSH, LH und TSH (Thyreoidea-stimulierendes Hormon) beteiligt ist, u nd der β-Untereinheit, die dem hCG- Molekül seine biologische Spezifität verleiht (Yarr am et al., 2004). In den meisten rekombinanten hCG-Präparationen ist auschließlich β-hCG enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine natürlich vorkommende Mischung au s hCG-Molekülen mit ihren charakteristischen Glykolisierungseigenschaften und freien α- und β-Untereinheiten verwendet, die aus humanem weiblichem Urin extrahie rt wurde. In den verschiedenen urinären hCG-Präparationen kann das Level funktione ll intakter hCG-Moleküle und anderer enthaltener hCG-Formen schwanken (Yarram et al., 2004). Es wurde zudem Diskussion 73 diskutiert, dass urinäre Präparationen nicht verwen det werden sollten, da diese mit EGF (epidermal growth factor ) kontaminiert sein könnten und EGF ungewollte zell uläre Reaktionen auslösen kann, auf der anderen Seite bie ten urinäre hCG-Präparationen den Vorteil, dass das Hormon in diesen Präparaten über unterschiedliche Modifikationen, wie z.B. Glykosylierungen, verfügt, welche für die biol ogische Funktion von hCG erforderlich und daher besser für die Untersuchung von in vivo -Effekten des Hormons geeignet sind (Saleh et al., 2007). Ein hoher Glykolysierungsgrad von hCG trägt zudem zur Stabilität des Moleküls bei und verlängert somit seine Halbwertszeit (Tsampalas et al., 2010). In der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich zu den spezifischen Dezidualisierungsmarkern PRL und IGFBP-1 auch die Expression von FOXO-1, GJA 1 und CD82 als weitere an der Dezidualisierung beteiligte Faktoren analysiert. De r Transkriptionsfaktor FOXO-1 ist ein früherer Indikator für eine beginnende Dezidualisie rungsreaktion, da FOXO1 zusammen mit dem Transkriptionsfaktor C/EBP β (CCAAT/enhancer-binding-Protein β) den dPRL - Promotor aktiviert (Gellersen und Brosens, 2003) un d eine erhöhte Expression von FOXO1 notwendig ist, damit die Prolaktinproduktion in den Zellen induziert werden kann. GJA1 spielt eine wichtige Rolle bei der interzellul ären Kommunikation, da es in Form von Gap Junction-Kanälen die zytoplasmatischen Komparti mente zweier benachbarter Zellen miteinander verbindet. Es wird bereits sehr früh wä hrend der Dezidualisierung heraufreguliert, und es wurde gezeigt, dass humanes dezidualisiertes Gewebe ausgedehnte Gap Junctions besitzt (Tsuno et al., 2009; Yu et al ., 2011). GJA1 sowie funktionelle Gap Junction-Kanäle werden für die morphologischen und biochemischen Veränderungen während der Differenzierung endometrialer Stromazel len benötigt (Laws et al., 2008; Yu et al., 2011). CD82, welches während der Dezidualis ierung heraufreguliert wird, spielt ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Differenzieru ng der endometrialen Stromazellen (Gellersen et al., 2007). Obwohl eine signifikante Induktion der Dezidualisierung des ektopen Endometriums anhand morphologischer Paramet er sowie der Expression der spezifischen Dezidualisierungsmarker PRL und IGFBP1 nur nach kombinierter Behandlung mit Progesteron und hCG auftrat, zeigte sich in der vorliegenden Arbeit interessanterweise sowohl bei der kombinierten Behandlung mit Progesteron und Forskolin als auch hCG eine signifikante Steigerung der Trans kription von FOXO-1 und GJA1 in dem ektopen endometrialen Gewebe im Vergleich zur K ontrolle. Es ist bekannt, dass das FOXO1-Protein in vivo im Nukleus dezidualisierter stromaler Zellen akkum uliert (Gellersen und Brosens, 2003). Dies war auch in der vorliegenden Studie gut im Diskussion 74 immunhistochemischen Nachweis zu erkennen, wobei di e FOXO1-Expession nach 7tägiger Behandlung mit Progesteron und hCG z.T. au ch im Zytoplasma nachweisbar war. Dieser Anstieg der Expression von FOXO1 und GJA1 ze igte sich nach Behandlung mit Progesteron und Forskolin jedoch nur auf Transkript -, nicht aber auf Proteinebene, während für beide Behandlungen, Progesteron und For skolin sowie Progesteron und hCG, tendenziell ein Anstieg der CD82-Proteinexpression zu beobachten war. Somit aktiviert offensichtlich auch die Behandlung mit Progesteron und Forskolin die Signalkaskade der Dezidualisierung in ektopem endometrialem Gewebe in vivo . Möglicherweise benötigt dieser Weg in vivo jedoch einen längeren Applikationszeitraum. Dass d ie Applikation von Progesteron in Kombination mit hCG zu einer deutlic h stärkeren Dezidualisierungsreaktion führt als in Kombination mit Forskolin, könnte an den unterschiedlichen Signalwegen dieser beiden cAMP-In duktoren liegen. Die Spezifität und zeitliche Regulation des cAMP/PKA-Signalweges, der durch die Bindung von hCG an LH/hCG-Rezeptoren ausgelöst wird, wird durch die Ge nerierung lokal begrenzter cAMP- Ansammlungen in der Zelle gewährleistet (Weedon-Fek jaer und Tasken, 2012). Phosphodiesterasen und die diskrete räumliche und z eitliche Aktivierung einer spezifischen Isoform der PKA sowie Proteinkinase A- Ankerproteine regulieren und organisieren diesen Prozess (Weedon-Fekjaer und Tas ken, 2012). Forskolin stimuliert jedoch nichtselektiv fast alle Isoformen der Adenyl atzyklase und greift auf diese Weise zentral in die Signaltransduktionswege vieler G-Pro tein-gekoppelter Rezeptoren ein. Eine Erhöhung des cAMP-Spiegels in der Zelle durch Forsk olin hat daher zahlreiche biologische Reaktionen zur Folge. Dies könnte den geringeren Effekt von Forskolin auf die Dezidualisierung erklären, da das durch Forskolin e ntstandene cAMP in der Zelle nicht ausschließlich mit dem Dezidualisierungssignalweg verknüpft ist. Nach 10tägiger Behandlung der ektopen endometrialen Fragmente in NOD-SCID-Mäusen mit Progesteron und hCG zeigte sich auf Transkriptebene nach Untersuchung d es frühen Dezidualisierungsmarkers FOXO1 zwar ein Anstieg der Expression im Vergleich zur Kontrolle, jedoch ergaben sich keine Signifikanzen mehr. Dies könnte darin begründet sein, dass die Dezidualisierung zu diesem Zeitpunkt auch im Kontrollfragment beginnt. Die in dieser Arbeit verwendeten Mäuse wurden vor V ersuchsbeginn nicht ovariektomiert, so dass das endogene Progesteron nach 10 Tagen in d en Kontrollfragmenten eine schwache Dezidualisierungsreaktion auslösen könnte. Auf Proteinebene zeigte sich jedoch nach 10tägiger Behandlung mit Progesteron und hCG e ine stark signifikant erhöhte Expression des Transkriptionsfaktors FOXO1 im Vergl eich zur Kontrolle. In den Diskussion 75 Kontrollfragmenten wurde demnach zunächst nur die FOXO1 -mRNA, jedoch noch kein FOXO1-Protein synthetisiert und somit auch noch kei n PRL. Auch für GJA1, einem noch früheren Marker als FOXO1, zeigte sich in den Kontr ollen zu diesem Zeitpunkt ein zu den beiden Behandlungen gesteigertes GJA1 -Transkriptlevel, jedoch keine erhöhte Proteinexpression. Die induzierte Dezidualisierungsreaktion hatte im u ntersuchten Zeitraum von bis zu 10 Tagen keinen Effekt auf die Größe und das Gewicht d er transplantierten Endometriumfragmente. Dies ist erklärbar, da es sic h bei der Dezidualisierung zunächst um eine morphologische und biochemische Umbildung d er endometrialen Stromazellen handelt (Tsuno et al., 2009). Im Hinblick auf die Proliferation des ektopen endom etrialen Gewebes zeigte das glanduläre Epithel der Kontrollfragmente eine durch schnittliche Proliferationsrate von ca. 30 % und bestätigt die Ergebnisse der Studie von Gr ümmer et al. (2001). Der durchschnittliche prozentuale Anteil Ki-67 positive r Zellen des Stromas betrug ca. 10 %. Somit proliferierten hauptsächlich die Drüsenepithe lzellen in den ektopen humanen endometrialen Fragmenten. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung der ektopen Läsionen mit Progesteron und hCG, die eine starke D ezidualisierungsreaktion induzierte, tendenziell zu einer Reduktion der Proliferationsra te der Drüsenepithelzellen führte. Obwohl Progesteron einen antiproliferativen Effekt auf das Endometrium hat (Moyer und Felix, 1998), konnte in der vorliegenden Arbeit nac h alleiniger Progesteronbehandlung sowie nach Behandlung mit Progesteron und Forskolin keine Hemmung der Proliferation im Vergleich zur Kontrolle beobachtet werden. Dies könnte an dem in der Literatur beschriebenen verzögerten Effekt von Progesteron li egen (de Ziegler et al., 1998; Mizuno et al., 1998). Es konnte hier somit gezeigt werden, dass durch ein e Behandlung mit Progesteron in Kombination mit hCG erfolgreich eine Dezidualisieru ng des endometrialen Stromas in humanen ekopen endometrialen Läsionen induziert werden kann. In der tierexperimentellen Forschung stellen Veränd erungen des Uterusgewichtes generell einen gängigen Indikator für Östrogen- sowie Proges teronwirkung dar und werden daher stets zusätzlich analysiert. Im Hinblick auf das Ge wicht des Uterus konnte in der vorliegenden Arbeit kein auffälliger Effekt im Mausorganismus festgestellt werden. Jedoch Diskussion 76 weist die Maus eine andere Dezidualisierungskaskade auf als der Mensch. Somit kann hierdurch keine Aussage darüber getroffen werden, o b die in den hier durchgeführten Experimenten verwendeten Dosierungen der unterschie dlichen Progestine und cAMP- steigernden Substanzen im eutopen Endometrium des M enschen zu signifikanten Veränderungen führen. 4.2 Vergleich des Effektes von Progesteron und MPA auf die Dezidualisierung Zusätzlich zum Progesteron wurde in der vorliegende n Arbeit vergleichend der Effekt von MPA in Kombination mit hCG auf die Dezidualisierung ektopen endometrialen Gewebes untersucht. Das synthetische steroidale Progestin M PA wird schon lange zur medikamentösen Behandlung der Endometriose eingeset zt (Valle, 2002; Bruner-Tran et al., 2006). Es konnte gezeigt werden, dass die tägl iche Einnahme von 30 mg MPA über einen Zeitraum von 90 Tagen in manchen Frauen zu ei ner deutlichen Atrophie des glandulären Epithels und zu einer dezidualen Reakti on des endometrialen Stromas führt (Moghissi und Boyce, 1976). Obwohl MPA mit einigem Erfolg zur Endometriose- Behandlung eingesetzt wird, werden durch die Einnah me unerwünschte Nebenwirkungen durch die Aktivierung von Zellsignalwegen nach Inte raktion mit anderen nahe verwandten Steroidrezeptoren hervorgerufen (Moghissi und Boyce , 1976; Bruner-Tran et al., 2006). In Kombination mit hCG zeigte MPA den gleichen Effekt auf die Dezidualisierung des ektopen endometrialen Gewebes wie Progesteron. Es k am zu einer signifikanten Zunahme der dezidualisierten Stromabereiche in den ektopen Läsionen und parallel zu einer gesteigerten Expression von Dezidualisierungsmarker n. Im Gegensatz zu der Behandlung mit Progesteron und hCG zeigte sich jedoch nach App likation von MPA und hCG eine deutlich höhere interindividuelle Varianz des Geweb es verschiedener Patientinnen in der Reaktion auf die Behandlung. Zum einen reagierte na ch Behandlung mit MPA und hCG ein geringerer Prozentsatz der Gewebe mit einer Dez idualisierungsreaktion als nach Behandlung mit Progesteron und hCG, zum anderen fie l die Reaktion bei den Geweben, die auf die Behandlung ansprachen, aber stärker aus , so dass große Varianzen in den untersuchten Parametern resultierten. Interessanterweise zeigte sich in den ektopen endometrialen Läsionen, in denen eine starke Dezidu alisierungsreaktion durch die Behandlung mit MPA und hCG ausgelöst wurde, eine st arke Expression aktivierter Diskussion 77 Caspase 3, einem Apoptosemarker, im dezidualisierten Stroma. Die Caspase 3 zählt zu den Effektorcysteinproteasen, die einerseits sekundäre Zielproteine wie DNAsen oder weitere Caspasen aktivieren, andererseits zelleigene Protei ne wie Aktin und Lamin spalten und daher aktiv am Abbau des Zytoskeletts und der Kerns truktur beteiligt sind (Pop und Salvesen, 2009). Die Ergebnisse der vorliegenden Un tersuchung zeigen, dass es möglich ist ektope endometriale Stromazellen in vivo terminal zu differenzieren und somit Apoptose in diesen Zellen auszulösen. Dies bietet e inen interessanten Ansatz zur Entwicklung einer neuer therapeutischen Behandlung der Endometriose. Die Varianz zwischen den unterschiedlichen Patientinnen und deren Ursache soll in Folgeexperimenten mit größeren Fallzahlen untersucht werden. 4.3 Entzug von Dezidualisierungsinduktoren Um zu überprüfen, ob ein Hormonabfall nach der Indu ktion der Dezidualisierung zu einer Regression der ektopen endometriotischen Läsionen f ührt, wie es Healy und Hodgen (1983) für die Regression endometriotischer Läsion nach der Geburt postuliert hatten, wurde in einer weiteren Versuchsreihe der Effekt ei nes Entzugs der Dezidualisierungsinduktoren nach einer vorrangegang enen 10tägigen Behandlung auf die Morphologie und Physiologie der ektopen endometrial en Fragmente untersucht. Da die Applikation von Progesteron und hCG in den vorangeg angenen Versuchen die verläßlichste Induktion einer Dezidualisierungsreak tion im Endometrium verschiedener Patientinnen aufwies, wurde dieser Versuchsansatz m it dieser hormonellen Behandlung durchgeführt, indem die transplantierten Mäuse zunä chst für 10 Tage mit Progesteron und hCG behandelt wurden und die Kultur des ektopen hum anen Gewebes anschließend für weitere 7 Tage ohne Behandlung fortgesetzt wurde. D ie Auswertung der ektopen Fragmente am Ende dieser Versuchsreihe zeige in der histomorphologische Analyse eine größere Fläche dezidualisierten Gewebes im Vergleic h zur Kontrolle, die jedoch nun nicht mehr - wie unmittelbar nach der 10tägigen Behandlun g mit Progesteron und hCG - signifikant war. Es zeigte sich jedoch weiterhin ei n signifikant gesteigertes dPRL - Transkriptlevel als Marker für die physiologische F unktion der dezidualisierten Zellen. Im Gegensatz dazu zeigte sich in den ektopen Fragmente n für die Transkriptmenge der frühen Dezidualisierungsmarker FOXO-1 und GJA1 eine Abnahme nach Entzug der Dezidualisierungsinduktoren im Vergleich zu den 10t ägig behandelten Fragmenten. Diskussion 78 Parallel ergab die Untersuchung auf Proteinebene zw ar immer noch einen deutlichen Anstieg der FOXO-1-Expression im Vergleich zur Kontrolle, jedoch war dieser nicht mehr signifikant, wie dies zuvor bei 10tägiger Behandlun g beobachtet wurde. Auch war die Expression von FOXO-1 nun wieder fast ausschließlic h im Zytoplasma der ektopen endometrialen Stromazellen lokalisiert. Diese Befun de weisen darauf hin, die Behandlungsdauer zur terminalen Differenzierung des ektopen endometrialen Gewebes möglicherweise nicht ausgereicht hat. Es wurde zuvor in in vitro -Studien gezeigt, dass eine dauerhafte Gabe von Progesteron und cAMP notwendig ist um den dezidualen Phänotyp endometrialer Stromazellen aufrechtzuerhalten (Tana ka et al., 1993; Telgmann und Gellersen, 1998) und dass diese nach Entzug des cAM P-Stimulus in vitro ihren undifferenzierten Phänotyp wiedererhalten und die E xpression der Differenzierungsmarker dPRL und IGFBP-1 einstellen (Gellersen und Brosens, 2003). Andererseits konnte 7 Tage nach Entzug der Dezidualisierungsinduktoren eine te ndenzielle Größenabnahme der ektopen Fragmente und eine signifikante Reduktion d er Proliferationsrate in den endometrialen Stromazellen der ektopen Fragmente ge zeigt werden. Somit könnte dieser Proliferationsstopp und als Folge eine Reduktion de r Größe der ektopen Läsionen möglicherweise durch eine längere vorausgehende Phase der Behandlung verstärkt werden. In weiterführenden Experimenten soll geklärt werden , ob eher durch eine dauerhafte Behandlung mit Progestinen und hCG oder zusätzlich durch einen nachfolgenden Entzug der Dezidualisierungsinduktoren ein therapeutischer Effekt auf die Persistenz der ektopen endometrialen Läsionen erreicht werden kann. 4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass es möglich ist durch die Behandlung mit Progestinen in Kombination mit hCG die Dezidual isierung ektoper humaner endometrialer Läsionen in vivo zu induzieren, somit einen Proliferationsstopp hervorzurufen und letztendlich in diesen terminal d ifferenzierten Stromazellen Apoptose auszulösen. Zuvor konnte bereits gezeigt werden, da ss die Dezidualisierung endometrialen Gewebes einen hemmenden Einfluss auf die Persistenz endometriotischer Läsionen haben kann und dass eine Progestintherapie sowie die hohe Serumprogesteronkonzentration während der Schwangerschaft in manchen Frauen einen therapeutischen Einfluss auf die Erkrankung besitzt, da durch die Dezidualisierung d er endometrialen Stromazellen Diskussion 79 letztendlich eine Atrophie des ektopen Gewebes indu ziert wird (Novak und Hoge, 1958; Andrews et al., 1959; Olive und Haney, 1986; Metzge r und Haney, 1988; Mahmood und Templeton, 1990; Tabanelli et al., 1992; Bruner-Tra n et al., 2002; 2006). Moen und Muus (1991) konnten jedoch in 23% der schwangeren Frauen keine Dezidualisierung der endometriotischen Läsionen als Reaktion auf die Sch wangerschaft finden. Dies steht in Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass endometri otische Läsionen in manchen Fällen weder auf normale zyklische Variationen noch auf eine exogene hormonale Therapie reagieren (Bergqvist et al., 1984; Brosens et al., 1987; Metzger et al., 1988; Moen und Muus, 1991). Klemmt et al. (2006) konnten zeige n, dass endometriotische Läsionen und eutopes Endometrium einiger erkrankter Frauen ü ber eine reduzierte Kapazität zur Dezidualisierung verfügen. Eine nichtadäquate Differenzierung des eutopen Endometriums bei Endometriose-Patientinnen könnte ein Grund für das Auftreten der Erkrankung sowie für die hohe Rezidivrate sein, da diese reduzierte Differenzierungskapazität der endometrialen Stromazellen mit einer erhöhten Überlebens- und Proliferationsfähigkeit der stromalen Zellen in der ektopen Umgebung assoziiert sein könnte. Dieses reduzierte Potential zur Dezidualisierung ist vermutlich durch die nachgewiesene Progesteronresistenz des Endometriums von an Endometriose erkrankten Frauen begründet (Attia et al., 2000; Bruner-Tran et al., 2006). Die Menge der Progesteronrezeptoren in endometriotischem Gewebe ist variabel und stellt daher eine Erklärungsmöglichkeit für die unterschiedliche Effektivität von Progesteron als t herapeutischen Wirkstoff in erkrankten Frauen dar (Bergqvist et al., 1981; Janne et al., 1 981; Bruner-Tran et al., 2006). Somit ist die alleinige Therapie mit Progesteron nicht immer erfolgreich. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die gleichzeitige Verabreichung von Progesteron und hCG die Dezidualisierungsreaktion der endometrialen Stromazellen deutlich verstärkt werden kann. Hierin könnte ein neuartiger Therapieansatz für die zukünftige Endometriose-Behandlung liegen, den es gilt, in weiterführenden Analysen zu optimieren. Hierzu müssen die optimalen Dosen für das Progestin und hCG ausgestes tet werden. Durch die starke Wirkung von hCG könnte möglicherweise eine erfolgre iche Therapie auch in erkrankten Frauen mit endometrialer Progesteronresistenz durch geführt werden. Zudem bleibt zu analysieren, inwieweit dieser Effekt durch die Verw endung von Progestinen, die nicht ausschließlich an den Progesteronrezeptor binden (w ie MPA) verstärkt werden kann. Neben dem Effekt auf die ektopen endometrialen Läsi onen könnte eine solche Behandlung zudem eine adäquate Dezidualisierung des eutopen En dometriums auslösen. Hierdurch Diskussion 80 könnte das Invasions- und Wachstumspotential der du rch die retrograde Menstruation in die Peritonealhöhle gelangten Zellen und damit die Neuenstehung von endometriotischen Läsionen reduziert oder verhindert werden. So konnt e bereits in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass die Verabreichung von Progesti nen nicht nur die Dezidualisierung endometriotischer Läsionen, sondern auch die Dezidu alisierung des eutopen Endometriums induziert (Cornillie et al., 1987; Del igdisch, 2000; Phillips et al., 2003), so dass eine Kombination von Progestinen und hCG vermu tlich auch die Dezidualisierung des eutopen Endometriums verstärken würde. Eine Beh andlung mit hCG stellt zudem eine natürliche und spezifische Möglichkeit dar, auf das ektope Fragment zu wirken ohne andere Organe außerhalb des Reproduktionssystems zu beeinflussen. Somit könnte die Behandlung mit hCG in Kombination mit Progestinen e ine Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapieansätze in der Endometriosebehandlung darstellen. Zusammenfassung 81 5 Zusammenfassung Trotz jahrzehntelanger Forschung ist die Pathogenes e der Endometriose heutzutage immer noch nicht ausreichend verstanden und die vorhanden en Therapiemöglichkeiten sind begrenzt. Die aktuelle medikamentöse Behandlung der Endometriose basiert auf der hormonellen Unterdrückung des Menstruationszyklus. Da diese Therapie mit unerwünschten Nebenwirkungen und hohen Rezidivraten verbunden ist, besteht eine Notwendigkeit spezifischere therapeutische Strategi en zu entwickeln. In der Literatur wurde beschrieben, dass die Schwere der Erkrankung entscheidend dadurch beeinflusst wird, ob die endometrialen Zellen an den ektopen St ellen proliferieren oder differenzieren. Ziel dieser Arbeit war es daher mit Hilfe des human isierten Endometriose-Mausmodells die Wirkung von Progestinen kombiniert mit zyklisch en Adenosinmonophosphat (cAMP)- steigernden Substanzen auf die Induktion der termin alen Differenzierung (Dezidualisierung) humanen ektopen endometrialen Ge webes in vivo zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Dezidualisierung ektopen endometrialen Gewebes signifikant durch die Applika tion von Progesteron und humanem Choriongonadotropin (hCG) induziert werden kann, wä hrend die Behandlung mit Progesteron alleine keinen und die Kombination von Progesteron und Forskolin einen deutlich schwächeren Effekt zeigte. Durch Induktion der terminalen Differenzierung der ektopen endometrialen Stromazellen konnte die Proli ferationsrate im Vergleich zum Kontrollgewebe reduziert werden. In Kombination mit hCG zeigte Medroxyprogesteronacetat (MPA) den gleichen Effekt auf die Dezidualisierung des ektopen endometrialen Gewebes wie Progesteron. Im G egensatz zu der Behandlung mit Progesteron und hCG zeigte sich jedoch nach Applika tion von MPA und hCG eine deutlich höhere interindividuelle Varianz des Geweb es verschiedener Patientinnen in der Reaktion auf die Behandlung. Interessanterweise zei gte sich in den ektopen endometrialen Läsionen, in denen eine starke Dezidualisierungsrea ktion durch die Behandlung mit MPA und hCG ausgelöst wurde, eine starke Expression akt ivierter Caspase 3, einem Marker für apoptotische Zellen, im dezidualisierten Stroma. Di e Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen erstmalig, dass es möglich ist ektope endometriale Stromazellen in vivo terminal zu differenzieren und somit Apoptose in d iesen Zellen auszulösen. Auf die Ergebnisse der vorliegenden Studie können weiterfüh rende Analysen aufbauen, um neuartige Behandlungsstrategien für die Endometriose zu entwickeln. Literaturverzeichnis 82 6 Literaturverzeichnis 1 American Society for Reproductive Medicine (1997): Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 67 , 817-21. 2 Andrews, M. C., Andrews, W. C. and Strauss, A. F. ( 1959): Effects of progestin- induced pseudopregnancy on endometriosis: clinical and microscopic studies. Am J Obstet Gynecol 78 , 776-85. 3 Aoki, D., Katsuki, Y., Shimizu, A., Kakinuma, C. an d Nozawa, S. (1994): Successful heterotransplantation of human endometrium in SCID mice. Obstet Gynecol 83 , 220- 8. 4 Arumugam, K. and Lim, J. M. (1997): Menstrual chara cteristics associated with endometriosis. Br J Obstet Gynaecol 104 , 948-50. 5 Attia, G. R., Zeitoun, K., Edwards, D., Johns, A., Carr, B. R. and Bulun, S. E. 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Anhang 92 7 Anhang 7.1 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Nachweis der Speziesspezifität der verwendeten Oligonukleotide........................ 37 Abb. 2: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach 7tägiger Behandlung ...................... 39 Abb. 3: Wachstumsverhalten der ektopen Läsionen ........................................................... 39 Abb. 4: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen ............................................ 41 Abb. 5: Expression von dPRL und IGFBP1 ........................................................................ 42 Abb. 6: Immunhistochemischer Nachweis der dPRL-Expression ...................................... 43 Abb. 7: Expression von FOXO1 und GJA1 ......................................................................... 44 Abb. 8: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression................................... 45 Abb. 9: Immunhistochemischer Nachweis der GJA1-Expression ...................................... 46 Abb. 10: Expressionsanalyse von GJA1.............................................................................. 47 Abb. 11: Expressionsanalyse von CD82 ............................................................................. 47 Abb. 12: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression .................................... 48 Abb. 13: Proliferation der ektopen Läsionen....................................................................... 49 Abb. 14: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach 10tägiger Behandlung .................. 51 Abb. 15: Wachstumsverhalten der ektopen Läsionen ......................................................... 52 Abb. 16: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen .......................................... 53 Abb. 17: Expression verschiedener Dezidualisierungsmarker auf Transkriptionsebene .... 54 Abb. 18: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression................................. 55 Abb. 19: Expressionsanalyse von GJA1.............................................................................. 56 Abb. 20: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression .................................... 57 Abb. 21: Proliferation der ektopen Läsionen....................................................................... 58 Abb. 22: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach Behandlung .................................. 59 Abb. 23: Wachstumsverhalten der ektopen Läsionen ......................................................... 60 Abb. 24: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen .......................................... 61 Abb. 25: Relative Expression von dPRL und FOXO1 auf Transkriptionsebene................. 62 Abb. 26: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression................................. 63 Abb. 27: Relative Expression von GJA1 auf Transkriptionsebene ..................................... 63 Abb. 28: Expressionsanalyse von GJA1 auf Proteinebene.................................................. 64 Abb. 29: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression .................................... 65 Abb. 30: Proliferation der ektopen Läsionen....................................................................... 66 Abb. 31: Nachweis aktivierter Caspase 3............................................................................ 67 Anhang 93 7.2 Abkürzungen A Adenin Abb. Abbildung A. bidest zweifach destilliertes Wasser ACTB β-Aktin APS Ammoniumpersulfat Bp/kb Basenpaare/Kilobasen BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) C Cytosin cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat CD82/KAI-1 cluster of differentiation 82 cDNA Complementary DNA (zur mRNA komplementäre DN A) COX-1/2 Zyklooxygenase-1/2 C t-Wert cycle threshold -Wert DAB Diaminobenzidin DEPC Diethylpyrocarbonat DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxynukleosidtriphosphat dPRL deziduales Prolaktin DTT Dithiothreitol ECL Enhanced chemiluminescence (verstärkte Chemil uminiszenz) EDTA Ethylendiaminotetraacetat EGF epidermal growth factor et al. et altera (und andere) FOXO-1 Forkhead-Box-Protein O1 FSH Follikelstimulierendes Hormon G Guanin GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase GJA1 Gap Junction Protein alpha 1 (Connexin43) Anhang 94 GnRH Gonadotrophin-Releasing-Hormon hCG Humanes Choriongonadotropin HE Hämatoxylin-Eosin HPLC High performance liquid chromatography HRP Horse raddish peroxidase (Meerrettich-Peroxid ase) IgG Immunglobulin G IGFBP-1 Insulin-like growth factor-binding protein 1 IHC Immunhistochemie i.p. intraperitoneal kDa Kilodalton LH Luteinisierendes Hormon M-MLV RT Moloney-murine leukemia virus reverse tra nscriptase MPA Medroxyprogesteronacetat mRNA messenger RNA (Boten-RNA) NCBI National Center for Biotechnology Informatio n NK-Zellen Natürliche Killerzellen NOD non-obese diabetic NSAR nichtsteroidale Antirheumatika PBS Phosphat buffered saline (Phosphat-gepufferte Saline) PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenre aktion) Pen/Strep Penicillin-/Streptomycin-Lösung Poly-A polyadenyliert RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RT Raumtemperatur RT Reverse Transkription RT-PCR Reverse Transkriptions-PCR s.c. subkutan SCID severe combined immunodeficiency SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese T Thymin TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TEMED N,N,N’,N’,-Tetramethylethylendiamin Anhang 95 Tm Hybridisierungstemperatur der Primer bei der P CR TNF-alpha Tumornekrosefaktor alpha Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol U Unit (Einheit der Enzymaktivität) üN über Nacht UpM Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett v/v Volumen pro Volumen WB Western Blot w/v weight per volume (Gewicht pro Volumen) Allgemein gebräuchliche Abkürzungen und physikalisc he Maßeinheiten sind nicht gesondert aufgeführt. Danksagung 96 8 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Durchführung dieser Arbeit unterstützt haben und mir mit Rat und Tat zur Seite standen. Ich danke Frau Prof. Dr. Ruth Grümmer und Frau Prof . Dr. Elke Winterhager für die Möglichkeit, diese Arbeit am Institut für Molekular biologie anfertigen zu können und für die intensive fachliche Unterstützung sowie für die Möglichkeit der Teilnahme an zahlreichen Kongressen und Tagungen, auf denen ich meine Arbeit präsentieren konnte. Im Speziellen danke ich Frau Prof. Dr. Ruth Grümmer für die hervorragende Betreuung dieser Arbeit. Ein besonderer Dank gebührt allen Angehörigen des Instituts für Molekularbiologie für die Hilfsbereitschaft und die tolle Arbeitsatmosphäre. Dr. Alexander Gellhaus, Dr. Jessica Wagener, Stephanie Kaiser und Friederike Kipkeew da nke ich für die ständige Diskussionsbereitschaft und die Hilfestellungen, di e sie mir oftmals bei Problemen und Fragestellungen geleistet haben. An dieser Stelle m öchte ich nicht versäumen, Gabriele Sehn, Ursula Schmücker, Claudine Kühn und Kathrin Kazuschke meinen besonderen Dank auszusprechen, da sie mich tatkräftig bei der Labor arbeit unterstützt und alle meine Fragen geduldig beantwortet haben. Der Abteilung für Gynäkologie des Universitätsklink ums Essen unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Kimmig danke ich für die Bereitstel lung der Gewebeproben. Auch möchte ich mich bei der Abteilung Pathologie des Universit ätsklinikums Essen unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Schmid und hier besonders bei Frau Stephanie Levin für die Hilfe bei der Durchführung der immunnhistochemischen Färbungen recht herzlich bedanken. Ganz herzlich möchte ich mich bei meiner Familie un d meinen Freunden für ihr Verständnis und ihre Unterstützung bedanken. Die hier durchgeführten Arbeiten wurden von Bayer H ealthCare Pharmaceuticals unterstützt. Lebenslauf 97 9 Lebenslauf Der Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten.