{"paper_id":"4930bd1a-95f6-4de8-b082-b33cafdb6460","body_text":"Medizinische Fakultät \nder \nUniversität Duisburg-Essen \n \nAus dem Institut für Molekularbiologie \n \n \n \n \n \nDie Wirkung von hCG auf die Dezidualisierung ektoper \nendometrialer Läsionen als therapeutischer Ansatz zur \nBehandlung der Endometriose \n \n \n \n \nInaugural-Dissertation \nzur  \nErlangung des Doktorgrades der \nNaturwissenschaften in der Medizin \ndurch die Medizinische Fakultät der \nUniversität Duisburg-Essen \n \n \n \n \n \nVorgelegt von \nYvonne Koch \naus Wuppertal \n2013 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDekan: Herr Univ.-Prof. Dr. med. J. Buer \n1.Gutachter: Frau Prof. Dr. rer. nat. R. Grümmer \n2.Gutachter: Herr Priv-Doz. Dr. med. M. L. Heubner \n \nTag der mündlichen Prüfung: 20. Dezember 2013 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nTeilaspekte dieser Arbeit wurden auf Tagungen vorgestellt oder als Abstracts veröffentlicht: \n \nKoch Y, Sannecke C, Tötsch M, Wimberger P, Kimmig R , Winterhager E, Grümmer R \n(2011):  Induktion der Dezidualisierung in humanen ektopen endometrialen Läsionen in vivo . \nJ Reprod.Med.Endokrinol. 1: 37. \n \nKoch Y, Wimberger P, Kimmig R, Winterhager E, Grümm er R (2011): Induction of \nDecidualization in human ectopic endometrial lesion s in vivo . Proceedings of the 6\nth  \nInternational Conference on the Female Reproductive Tract, Frauenchiemsee. \n \nKoch Y, Wimberger P, Kimmig R, Winterhager E, Grümm er R (2011):  Induction of \nDecidualization in human ectopic endometrial lesion s in vivo . Proceedings of the 11 \nth  World \nCongress on Endometriosis, Montpellier. \n \nGrümmer R, Wimberger P, Kimmig R, Koch Y (2012): Decidualization in human ectopic \nendometrial lesions in vivo  is induced by hCG. Proceedings of the 28 \nth  Annual Meeting of the \nEuropean Society of Human Reproducion & Embryology (ESHRE), Istanbul. \n \n \n\n I \nInhaltsverzeichnis \nInhaltsverzeichnis........................................................................................................................I \n1 Einleitung ....................................... .................................................................................... 1 \n1.1 Endometriose................................... ........................................................................... 1 \n1.1.1 Definition und Pathogenese ................... ................................................................ 1 \n1.1.2 Symptomatik und Diagnostik................... .............................................................. 4 \n1.1.3 Aktuelle Therapieoptionen.................... ................................................................. 5 \n1.2 Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der Endometriose............................. 8 \n1.3 Die Dezidualisierung........................... ....................................................................... 9 \n1.4 Das heterologe Mausmodell zur Untersuchung der Endometriose.......................... 11 \n1.5 Zielsetzung .................................... ........................................................................... 13 \n2 Material und Methoden ............................ ........................................................................ 14 \n2.1 Material ....................................... ............................................................................. 14 \n2.1.1 Chemikalien .................................. ....................................................................... 14 \n2.1.2 Verbrauchsmaterialien ........................ ................................................................. 16 \n2.1.3 Laborgeräte.................................. ......................................................................... 17 \n2.1.4 Enzyme....................................... .......................................................................... 18 \n2.1.5 Molekularbiologische und proteinbiochemische Kits.......................................... 18 \n2.1.6 Kulturmedien, Puffer und Lösungen............ ........................................................ 19 \n2.1.7 bp-Längenstandards/Molekulargewichtsstandards .............................................. 20 \n2.1.8 Oligonukleotide.............................. ...................................................................... 20 \n2.1.9 Antikörper ................................... ......................................................................... 21 \n2.1.10 Software und Datenbanken .................... .............................................................. 21 \n2.2 Methoden....................................... ........................................................................... 22 \n2.2.1 Humanes Endometriumgewebe.................... ........................................................ 22 \n2.2.2 Tierexperimentelle Arbeiten .................. .............................................................. 23 \n2.2.2.1 Versuchstiere.............................. .................................................................. 23 \n2.2.2.2 Transplantation des endometrialen Gewebes.. ............................................. 23 \n2.2.2.3 Substanzapplikationen...................... ............................................................ 24 \n2.2.2.4 Entnahme der transplantierten Fragmente.... ................................................ 24 \n2.2.3 Molekularbiologische Methoden................ .......................................................... 25 \n2.2.3.1 RNA-Isolierung aus Gewebe .................. ..................................................... 25 \n\n II  \n2.2.3.2 Photometrische Konzentrations- und Reinheit sbestimmung von \nNukleinsäuren............................................................................................... 25 \n2.2.3.3 Reverse Transkription (RT) ................. ........................................................ 26 \n2.2.3.4 Polymerasekettenreaktion (PCR) ............. .................................................... 26 \n2.2.3.5 Agarosegelelektrophorese ................... ......................................................... 27 \n2.2.3.6 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose gelen.............................. 28 \n2.2.3.7 Quantitative Echtzeit-PCR .................. ......................................................... 28 \n2.2.4 Proteinbiochemische Methoden ................. .......................................................... 30 \n2.2.4.1 Proteinextraktion aus Gewebe............... ....................................................... 30 \n2.2.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration........ ................................................. 30 \n2.2.4.3 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelek trophorese (SDS-PAGE).... 31 \n2.2.4.4 Western Blot............................... .................................................................. 31 \n2.2.4.5 Proteinfärbung auf der Nitrozellulosemembra n........................................... 32 \n2.2.4.6 Immundetektion von Proteinen auf der Nitroz ellulosemembran ................. 32 \n2.2.4.7 Chemilumineszenz-Nachweis (ECL-Reaktion) ... ........................................ 33 \n2.2.5 Morphologische Methoden ...................... ............................................................ 33 \n2.2.5.1 Histologische Analyse...................... ............................................................ 33 \n2.2.5.2 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung............. .................................................. 34 \n2.2.5.3 Immunhistochemische Analyse................ .................................................... 34 \n2.2.6 Statistische Auswertung ...................... ................................................................. 36 \n3 Ergebnisse ....................................... ................................................................................. 37 \n3.1 Validierung der Oligonukleotid-Primer .......... ......................................................... 37 \n3.2 Effekt von Progesteron in Kombination mit cAMP- steigernden Substanzen auf die \nDezidualisierung....................................................................................................... 37 \n3.2.1 Effekt auf das Uterusgewicht der Maus ........ ....................................................... 38 \n3.2.2 Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen ................................... 39 \n3.2.2.1 Größe und Gewicht der ektopen humanen endom etrialen Läsionen ........... 39 \n3.2.2.2 Morphologie der ektopen humanen endometrial en Läsionen ...................... 40 \n3.2.2.3 Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ektopen humanen \nendometrialen Läsionen ............................................................................... 41 \n3.2.2.4 Proliferation der ektopen humanen endometri alen Läsionen....................... 48 \n3.3 Vergleich des Effektes der Kombination von hCG mit Progesteron bzw. \nMedroxyprogesteronacetat (MPA) auf die Dezidualisierung .................................. 50 \n3.3.1 Effekt auf das Uterusgewicht der Maus ........ ....................................................... 51 \n\n III  \n3.3.2 Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen ................................... 51 \n3.3.2.1 Größe und Gewicht der ektopen humanen endom etrialen Läsionen ........... 51 \n3.3.2.2 Morphologie der ektopen humanen endometrial en Läsionen ...................... 52 \n3.3.2.3 Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ektopen humanen \nendometrialen Läsionen ............................................................................... 53 \n3.3.2.4 Proliferation der ektopen humanen endometri alen Läsionen....................... 57 \n3.4 Entzug von Dezidualisierungsinduktoren ......... ....................................................... 58 \n3.4.1 Effekt auf das Uterusgewicht der Maus ........ ....................................................... 59 \n3.4.2 Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen ................................... 59 \n3.4.2.1 Größe und Gewicht der ektopen humanen endom etrialen Läsionen ........... 59 \n3.4.2.2 Morphologie der ektopen humanen endometrial en Läsionen ...................... 60 \n3.4.2.3 Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ektopen humanen \nendometrialen Läsionen ............................................................................... 61 \n3.4.2.4 Proliferation der ektopen humanen endometri alen Läsionen....................... 65 \n3.5 Einfluss der verschiedenen Behandlungen auf die  Apoptoserate von ektopen \nendometrialen Läsionen ........................................................................................... 66 \n4 Diskussion ....................................... ................................................................................. 69 \n4.1 Induktion der Dezidualisierung ektopen Endometr iums in vivo .............................. 69 \n4.2 Vergleich des Effektes von Progesteron und MPA auf die Dezidualisierung ......... 76 \n4.3 Entzug von Dezidualisierungsinduktoren ......... ....................................................... 77 \n4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick................ ............................................................ 78 \n5 Zusammenfassung.................................. .......................................................................... 81 \n6 Literaturverzeichnis............................. ............................................................................. 82 \n7 Anhang ........................................... .................................................................................. 92 \n7.1 Abbildungsverzeichnis .......................... ................................................................... 92 \n7.2 Abkürzungen .................................... ........................................................................ 93 \n8 Danksagung....................................... ............................................................................... 96 \n9 Lebenslauf ....................................... ................................................................................. 97 \n \n \n \n\nEinleitung 1 \n1 Einleitung \n1.1  Endometriose \n1.1.1  Definition und Pathogenese \n \nDie Endometriose zählt zu den häufigsten benignen g ynäkologischen Erkrankungen bei \nFrauen im reproduktionsfähigen Alter und ist pathol ogisch durch das Vorkommen von \nendometrialem Gewebe mit charakteristischen funktio nsfähigen Drüsen und Stromazellen \naußerhalb der Gebärmutter (Cavum uteri) definiert. Die auftretende Form der \nEndometriose wird aufgrund der Lage der Endometrios eherde in die peritoneale \nEndometriose (Peritoneum), die ovarielle Endometriose (Eierstöcke) und die rektovaginale \nbzw. tief infiltrierende Endometriose (im Bereich der Bindegewebsplatte zwischen Rektum \nund Vagina) unterteilt (Donnez et al., 1995), wobei  die peritoneale Endometriose die \nhäufigste Form darstellt. Alle drei Erscheinungsfor men unterscheiden sich in Pathogenese, \nSymptomatik, Krankheitsverlauf und infolgedessen in  der Behandlung (Dunselman et al., \n2001). Die versprengten Endometrioseherde verfügen meistens ähnlich wie uterines \n(eutopes) Endometrium über Östrogen- und Progestero nrezeptoren, weshalb Proliferation \nund Funktion der versprengten Endometrioseherde dur ch ovarielle Hormone gesteuert \nwerden können. Es konnte gezeigt werden, dass in 70 % der Patientinnen das ektope \nendometriale Gewebe während des 28tägigen Monatszyk lus analog zum eutopen \nEndometrium wächst, in manchen Fällen jedoch das ek tope Drüsenepithel sowie Stroma \nunabhängig von der Zyklusphase zu sein scheint (Ber gqvist et al., 1984). Das könnte \ndadurch begründet sein, dass geringere Expressionsl evel der beiden Hormonrezeptoren in \nden Endometrioseherden im Vergleich zum eutopen End ometrium beobachtet wurden \n(Bergqvist et al., 1985b). Darüberhinaus manifestie rt sich die Erkrankung sowohl \nmakroskopisch als auch mikroskopisch sehr heterogen . Die endometriotischen Läsionen \nkönnen sehr klein sein, es kann jedoch vor allem an  den Eierstöcken zur Entwicklung \ngrößerer, blutgefüllter Zysten kommen (Metzger et a l., 1988). Die Klassifikation der \nLäsionen erfolgt nach Richtlinien der revidierten V ersion der American Society for \nReproductive Medicine (rASRM-Klassifikation (1997)) . Dabei wird der Schweregrad der \nErkrankung in 4 Stadien von minimal bis schwer unte rteilt (I = minimal; II = gering; III = \nmäßig; IV = schwer). Für die Einteilung wird ein Pu nktesystem verwendet, welches sich \nauf die Anzahl, Größe und Lokalisation der Läsionen  stützt. Zusätzlich wird die Aktivität \n\nEinleitung 2 \ndurch eine Beschreibung der Färbung der Endometrios eherde in die Klassifikation \neinbezogen. Rote Läsionen zeigen eine starke Vaskul arisierung und mitotische Aktivität \n(Donnez et al., 1994; Nisolle et al., 1993). Diese Läsionen sind aggressiv, stellen das erste \nStadium der Erkrankung dar und entwickeln sich zu s chwarz-braunen Läsionen weiter \n(Donnez et al. 1995, 1996). Verglichen mit roten Lä sionen sind schwarz-braune Läsionen \nweniger aktiv und werden von fibrotischem Gewebe um geben (Donnez et al. 1995, 1996). \nWeiße Läsionen zeigen eine geringe mitotische Aktiv ität und eine schwache stromale \nVaskularisierung. Daher wird davon ausgegangen, das s sich diese Läsionen im \nRuhestadium befinden (Nisolle et al., 1993; Donnez et al., 1996). \n \nSowohl die Pathogenese als auch die Ätiologie der v erschiedenen Formen der \nEndometriose sind bis heute nicht abschließend gekl ärt. Die beiden wichtigsten Theorien \nzur Entstehung der Endometriose sind die Metaplasie theorie und die Implantations-\n/Transplantationstheorie. Bei der Metaplasie-Theori e, welche Anfang des letzten \nJahrhunderts von Robert Meyer entwickelt wurde, wir d angenommen, dass sich die \nEndometrioseherde durch Umwandlung (Metaplasie) aus  pluripotenten Zellen des \nCoelomepithels unter Einfluss von Östrogenen - mit oder ohne andere Kofaktoren wie z.B. \ninflammatorische Stimuli - bilden (Gardner et al., 1953). Das - wenn auch seltene - \nAuftreten von Endometriose bei Östrogen-behandelten  Männern spricht für diese Theorie \n \n(Pinkert et al., 1979; Schrodt et al., 1980). In Er weiterung der Metaplasie-Theorie geht die \nInduktionstheorie davon aus, dass diese Transformat ion undifferenzierter Zellen in \nendometriumähnliche Zellen auch durch Substanzen in duziert werden kann, welche \nwährend der Menstruation in der Peritonealflüssigke it vorhanden sind (Merrill, 1966). \nAuch der Ursprung der rekto-/vaginalen Endometriose  wird mit der Metaplasie-Theorie \nerklärt (Donnez et al. 1995, 1996). Das Konzept der  Implantations- bzw. \nTransplantationstheorie beinhaltet, dass während de r Menstruation überlebensfähige \nendometriale Zellen durch einen Rückfluss über die Eileiter (Tuben) in die Bauchhöhle \ngelangen (retrograde Menstruation), dort an untersc hiedlichsten peritonealen Oberflächen \nimplantieren und über die Fähigkeit kontinuierliche n Wachstums verfügen (Sampson, \n1927). Die Transplantationstheorie wird durch die B eobachtungen untermauert, dass 77% \nder Frauen mit Vaginalobstruktionen eine peritoneal e Endometriose ausbilden (Olive und \nHenderson, 1987), Frauen bei hormoneller Unterdrück ung des Menstruationszyklus und \nFrauen in der postmenopausalen Phase aber nur selte n eine Endometriose entwickeln \n(Punnonen et al., 1980). Zusätzlich geht die Transp lantationstheorie davon aus, dass \n\nEinleitung 3 \nendometriales Gewebe durch Blut- oder Lymphgefäße  oder durch operative Eingriffe aus \ndem Cavum uteri verschleppt werden und extrauterin implantieren kann (Sampson, 1927; \nJavert, 1949). Die Transplantationstheorie gilt für  die Entstehung der peritonealen \nEndometriose als recht gesichert und bietet auch ei ne Erklärung für seltene und \nungewöhnliche Implantationsorte wie Lymphknoten, Lunge und Gehirn.  Epidemiologische \nStudien haben gezeigt, dass das Risiko Endometriose  zu entwickeln durch eine verkürzte \nZyklus- und eine verlängerte Menstruationsdauer erh öht wird (Cramer et al., 1986; \nArumugam und Lim, 1997; Vercellini et al., 1997) un d somit der Umfang der retrograden \nMenstruation eine wichtige Rolle spielt (D'Hooghe e t al., 2003). Obwohl davon \nausgegangen wird, dass es bei neun von zehn Frauen zu einer retrograden Menstruation \nkommt, adhäriert das endometriale Gewebe nur bei ei ner von zehn Frauen an das \nPeritoneum und proliferiert sowie invadiert in das darunterliegende Gewebe, so dass \nendometriale Läsionen entstehen (Koninckx et al., 1980; Blumenkrantz et al., 1981; Halme \net al., 1984). Daher müssen zusätzliche Faktoren be teiligt sein, welche die Entstehung \neiner Endometriose fördern. In verschiedenen Studie n werden veränderte immunologische \nProzesse als Ursache für die Entstehung einer Endom etriose genannt. Eine Reduktion der \nhumoralen und zellvermittelten Zytotoxizität und so mit ein gestörter immunologischer \nAbwehrmechanismus wird beschrieben, der letztendlic h auch bei kleineren Mengen \nmenstruellen Gewebes für das Auftreten einer ektope n Implantation des Endometriums \nverantwortlich sein kann (Dmowski et al., 1989; Vig ano et al., 1991; Oosterlynck et al., \n1991). In der Peritonealflüssigkeit von an Endometr iose erkrankten Frauen ist die Zahl der \naktivierten Makrophagen erhöht (Muscato et al., 198 2; Halme et al., 1982). Diese \nvermehrten aktivierten peritonealen Makrophagen in Endometriosepatienten produzieren \nWachstumsfaktoren, welche Implantation und Wachstum  der durch retrograde \nMenstruation in die Peritonealhöhle gelangten endom etrialen Zellen verstärken könnten \n(Kauma et al., 1988). Zusätzlich ist die Zahl der L ymphozyten und der \nKomplementfaktoren C3c und C4 in der Peritonealflüssigkeit erkrankter Frauen signifikant \nerhöht (Badawy et al., 1984) und somit auch die Konzentration vieler peritonealer Faktoren \nwie TNF-alpha (Eisermann et al., 1988), Matrix-Meta llo-Proteinasen, Wachstumsfaktoren \netc., welche die Adhäsion des ektopischen Endometri ums an das Peritoneum und \nnachfolgend die Invasion und die Angiogenese der Lä sionen fördern (Zhang et al., 1993; \nD'Hooghe und Debrock, 2002). Eine genetische Prädis position für die Entwicklung der \nErkrankung ist ebenfalls nicht auszuschließen, da d ie Prävalenz von Endometriose sich um \n7% erhöht, sobald Verwandte ersten Grades von der Erkrankung betroffen sind (Malinak et \n\nEinleitung 4 \nal., 1980; Lamb et al., 1986). Es wird davon ausgeg angen, dass der Endometriose eine \nmultifaktorielle Ätiologie zugrunde liegt, bei der sowohl genetische, immunologische als \nauch hormonelle Faktoren zum Tragen kommen. Genaue Zahlen zur Prävalenz von \nEndometriose gibt es nicht, da nur bei einem Teil d er betroffenen Frauen typische \nBeschwerden auftreten. Oft wird eine Endometriose n ur zufällig entdeckt und daher häufig \nerst nach vielen Jahren der Erkrankung diagnostiziert (Gao et al., 2006). Es wird geschätzt, \ndass etwa 10% der weiblichen Bevölkerung im reprodu ktionsfähigen Alter von \nEndometriose betroffen sind (Eskenazi und Warner, 1997; Grummer, 2006; Simoens et al., \n2007). Bei Frauen mit unerfülltem Kinderwunsch ist der Anteil betroffener Frauen \nerheblich höher. Je nach Literaturangabe beträgt di eser zwischen 40 bis 60% (D'Hooghe et \nal., 2004). \n \n1.1.2  Symptomatik und Diagnostik  \n \nDie Intensität und die Art der Beschwerden stehen n icht zwingend im Zusammenhang mit \ndem Grad der Auspägung der Endometriose (Vernon et al., 1986; Kennedy et al., 2005; \nSimoens et al., 2007). Patientinnen mit einer ausge dehnten Erkrankung können \nsymptomfrei sein, während Patientinnen mit einer nu r minimalen Ausbreitung und Göße \nder versprengten Endometrioseherde unter gravierend en klinischen Symptomen leiden \nkönnen (Mahmood und Templeton, 1990). Viele der bet roffenen Frauen leiden unter \nZyklusstörungen (Zwischenblutungen und Schmierblutu ngen), einer ausgeprägten \nRegelblutung, die meist lange anhält (Menorrhagie) und/oder einer schmerzhaften \nRegelblutung (Dysmenorrhoe). Mitunter halten die ch ronischen Unterleibs- und \nRückenschmerzen über einen längeren Zeitraum an ode r treten völlig unabhängig vom \nZyklus auf und führen dadurch zu einer verminderten  Lebensqualität. Liegen die \nEndometrioseherde in der Bauchhöhle zwischen dem Da rm und der Gebärmutter \n(Douglas-Raum), können sie zu Schmerzen beim Geschl echtsverkehr (Dyspareunie) \nführen (Gao et al., 2006). Häufig korreliert die En dometriose mit Subfertilität (Story und \nKennedy, 2004). Der ursächliche Zusammenhang zwischen Endometriose und Subfertilität \nist allerdings nicht geklärt und bisher wurde kein Zusammenhang zwischen dem Ausmaß \nder Erkrankung und der Subfertilität gefunden. Zum einen können Verwachsungen und \nVernarbungen in den für die Schwangerschaft wichtig en Organen wie den Eileitern und \nEierstöcken den Transport der Eizelle behindern und  so zur Subfertilität führen. Zum \n\nEinleitung 5 \nanderen spielen - wie im vorhergehenden Kapitel bes chrieben - wahrscheinlich \ninflammatorische Prozesse wie z.B. die erhöhte Anza hl aktivierter Makrophagen und die \ndadurch erhöhten Interleukin 1- und Prostanoidderiv atkonzentrationen in der \nPeritonealflüssigkeit eine Rolle (Halme et al., 198 2; Drake et al., 1983). Es können aber \nauch verschiedene Faktoren im eutopen Endometrium e rkrankter Frauen per se verändert \nsein und zu einer reduzierten Rezeptivität des Endometriums führen (Kao et al., 2003). \nUm eine peritoneale Endometriose zu diagnostizieren  wird üblicherweise eine \nlaparoskopische Untersuchung durchgeführt. Nur so ist es möglich, auch milde Formen der \nEndometriose zu erfassen. Sichtbare Endometrioseher de werden dabei operativ entfernt \nund idealerweise histologisch analysiert, um die Di agnose abzusichern (Galle, 1989; \nKennedy et al., 2005). Entnommene Endometrioseherde  zeigen eine klassische benigne \nMorphologie des Endometriums mit Drüsen und umgebendem Stroma. Zur Diagnose einer \novariellen Endometriose ist eine nicht-invasive Ult raschalluntersuchung üblich. Ihre \nDiagnosegenauigkeit kann durch Kombination mit eine r Farbdopplerultrasonographie \nverbessert werden (Brosens, 1997). Zusätzliche Hilfen zur Diagnose der ovariellen und tief \ninfiltrierenden Endometriose sind die Computertomog raphie und die \nMagnetresonanztomographie. Allerdings kann auch hie r eine sichere Diagnose nur nach \nGewebeentnahme und anschließender histopathologisch er Untersuchung gestellt werden \n(Rock und Markham, 1992). \n \n1.1.3  Aktuelle Therapieoptionen \n \nBis heute lässt sich eine Endometriose nicht vollst ändig heilen. Mangelnde Kenntnisse \nüber die Pathogenese der Endometriose erschweren di e Entwicklung neuer wirksamer \nTherapiestrategien (Grummer, 2006). Zur Zeit wird d ie Endometriose medikamentös, \noperativ oder mit einer Kombination aus beidem ther apiert. Die Entfernung der \nEndometrioseherde bei einer operativen Laparoskopie  ist normalerweise die erste \nTherapiewahl. Bei dieser Therapie tritt jedoch eine  hohe Rezidivrate auf. Dieser operative \nEingriff, wenngleich auch mit minimaler invasiver O perationstechnik durchgeführt, stellt \nfür die Patientinnen ein potenzielles Risiko dar un d sollte daher nicht unbegrenzt \nwiederholt werden. Da es bisher keine spezifische u nd nachhaltige, ursächlich wirkende \nmedikamentöse Behandlung gibt, ist das Ziel einer m edikamentösen Therapie ein Milieu \nzu schaffen, welches das Fortbestehen der ektopen L äsionen verhindert und die Resorption \n\nEinleitung 6 \nund/oder Regression dieser ektopen Läsionen verstär kt (Metzger et al., 1988). Die \naktuellen Behandlungsmöglichkeiten beschränken sich  daher auf die Reduzierung der  \nSymptomatik, um einen Zugewinn an Lebensqualität zu ermöglichen. \nDa in Endometrioseläsionen eine erhöhte Expression von Zyklooxygenase nachgewiesen \nwerden konnte (Chishima et al., 2002), werden in de r Therapie der Endometriose \nnichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) als Schmerzmi ttel eingesetzt. NSAR wirken über \ndie Hemmung des Enzyms Zyklooxygenase, vermindern d adurch die Synthese von \nProstaglandinen und blockieren die Entzündungs- und  Schmerzkaskade. Die \nWirkstoffklasse der nichtselektiven NSAR, welche be ide Zyklooxygenasen - COX-1 und \nCOX-2 - hemmen, führen jedoch durch die Hemmung der  Zyklooxygenase-1 zu \ngastrointestinalen sowie renalen Störungen und in E inzelfällen auch zu Blutungsstörungen. \nSelektive COX-2-Inhibitoren, die zweite Wirkstoffkl asse der NSAR, verfügen über eine \nbessere Verträglichkeit als COX-1-Inhibitoren. Inzw ischen wurde jedoch einigen COX-2-\nInhibitoren die Zulassung aufgrund potenzieller kar dialer Nebenwirkungen entzogen, so \ndass diese nun nicht mehr routinemäßig zur Behandlu ng der Endometriose eingesetzt \nwerden. \nBegleitend zur chirurgischen wird meistens eine end okrine Behandlung der Endometriose \ndurchgeführt, da es sich bei der Endometriose um ei ne Östrogen-abhängige Erkrankung \nhandelt und beobachtet wurde, dass sich Endometrios eherde während einer Amenorrhoe, \nbesonders während der Schwangerschaft, verkleinern oder ganz zurückbilden (Dizerega et \nal., 1980). Die Östrogensynthese wird daher medikam entös supprimiert und somit der \nhormonelle Zyklus blockiert, um das Wachstum der En dometrioseherde oder das \nWiederauftreten der Endometriose nach einer operati ven Laparoskopie zu verzögern. \nGeeignet sind sogenannte Gonadotrophin-Releasing-Ho rmon (GnRH)-Agonisten, \nÖstrogen-Gestagen-Kombinationen (orale Kontrazeptiv a) oder verschiedene Gestagene \n(Giudice und Kao, 2004). Das Testosteron-Derivat \n Danazol, welches früher verbreitet zur \nBehandlung der Endometriose eingesetzt wurde, wird heute aufgrund seiner androgenen \nPartialwirkung kaum noch eingesetzt. Die Gabe von A romatase-Hemmern wird als ein \nvielversprechender neuer hormoneller Therapieansatz  gehandelt. Noch sind keine \nAromatase-Hemmer ausdrücklich zur Behandlung der Endometriose zugelassen. \nDie allgemein übliche medikamentöse Therapie der En dometriose ist die Behandlung mit \nGnRH-Agonisten zur Induktion eines hypoöstrogenen S tatus. Dabei handelt es sich um \nSubstanzen, welche kompetitiv zum endogenen GnRH an  die entsprechenden Rezeptoren \nbinden und die Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Achse b lockieren. Nach anfänglichem \n\nEinleitung 7 \nAnstieg der Gonadotropinwerte kommt es nach wenigen  Tagen durch die kontinuierliche \nStimulation der hypophysären Zellen zu einer Desens itivierung dieser Zellen, dadurch zu \neiner Herunterregulation von FSH (Follikelstimulier endes Hormon) und LH \n(Luteinisierendes Hormon) und zur Hemmung der Stero idsynthese in den Ovarien. Die \nBehandlung mit einem GnRH-Agonisten führt zu einer Amenorrhoe und zu einer \nReduktion der Endometrioseläsionen und der endometr ioseassoziierten Symptome. Die \nstarke Absenkung der Serum-Östrogenkonzentration fü hrt jedoch zu klimakterischen \nBeschwerden wie u.a. Hitzewallungen, Kopfschmerzen,  Depressionen, \nLeistungsschwäche, Veränderungen der vaginalen Schl eimhäute sowie einer verminderten \nLibido und einer Knochendemineralisierung. Um der s ignifikanten Abnahme der \nKnochendichte entgegenzuwirken, muss spätestens nac h sechs Monaten eine Add-back-\nTherapie mit Östrogenen durchgeführt werden, wobei jedoch überprüft werden muss, ob es \nunter der Add-back-Therapie nicht wieder zu einem W achstum der Endometrioseläsionen \nkommt. \nDer Einsatz oraler Kontrazeptiva stellt eine weiter e gängige medikamentöse \nTherapieoption dar. Dabei handelt es sich um Hormon präparate aus synthetischen \nÖstrogenen kombiniert mit unterschiedlichen Gestage nen. Das Konzept bei der Gabe von \noralen Kontrazeptiva zur Behandlung der Endometrios e beruht auch hier auf ihrer \nGonadotropin-inhibierenden Wirkung, wodurch die ova rielle Östrogensekretion gehemmt \nwird. Durch den daraus resultierenden hypoöstrogene n, hypergestagenen Zustand kommt \nes zu einer Abschwächung der Beschwerden. Die Behan dlung hat aber nur einen geringen \nEinfluss auf die Ausprägung der Endometrioseherde. Die meisten oralen Kontrazeptiva \nsind zudem nicht ausdrücklich zur Behandlung der Endometriose zugelassen. \nBei der Gabe von Gestagenen bzw. Progestagenen (syn thetische Gestagene) zur \nBehandlung der Endometriose wird der Organismus in einen schwangerschaftsähnlichen \nZustand versetzt, wobei die Östradiol-abhängige LH- Ausschüttung blockiert wird. Dies \nführt nach mehreren Monaten der Einnahme zur anfäng lichen Dezidualisierung des \nendometrialen Gewebes und schließlich zur Atrophie der Endometrioseläsionen. Bei \nlängerfristiger Therapie kann es jedoch auch hierbe i zu einem ausgeprägten \nklimakterischen Syndrom kommen. \nDie zurzeit gängigen endokrinen Behandlungen greife n somit gravierend in den \nHormonhaushalt ein. Es ist erforderlich, die Medika mente bis zu sechs Monate \neinzunehmen um eine Wirkung zu erzielen (Simoens et  al., 2007) und die Rezidivrate bei \nder nur medikamentös behandelten Endometriose beträ gt bis zu 50 Prozent in den ersten \n\nEinleitung 8 \nbeiden Jahren nach der Behandlung (Nisolle-Pochet e t al., 1988; D'Hooghe et al., 2004). \nZudem sind die aktuellen hormonellen Behandlungsmet hoden bei Patientinnen mit \nKinderwunsch nur begrenzt anwendbar, da durch die h ormonelle Therapie der weibliche \nMonatszyklus unterdrückt wird und die betroffenen F rauen während der Therapie nicht \nschwanger werden können. Seit den 60er Jahren des l etzten Jahrhunderts wurden \nzahlreiche neue Medikamente zur Behandlung der Endo metriose erprobt - jedesmal mit \nneuen Erwartungen - bei denen sich im Endeffekt abe r nur die Höhe der Kosten und die \nArt der Nebenwirkungen geändert haben (Candiani et al., 1990). Aus diesem Grund \nbesteht ohne Zweifel dringender Bedarf neue Therapi estrategien mit erträglicheren \nNebenwirkungen zu entwickeln. \n \n1.2  Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der Endometriose \n \nZurzeit wird in der Forschung das Augenmerk auf einige grundlegende zellbiologische und \nbiochemische Pathogenesemechanismen gelenkt, um das Wachstum und die Persistenz der \nektopen endometrialen Läsionen zu hemmen. Ein Ansat zpunkt stellt z.B. die \nUnterdrückung des Angiogeneseprozesses dar, da die Entwicklung der ektopen \nendometrialen Läsionen stark von der Etablierung ei ner ausreichenden Blutzufuhr an der \nInvasionsstelle abhängt und ein Persistieren der ek topen Läsionen durch eine \nNeovaskularisierung überhaupt erst ermöglicht wird.  Weiterhin ist der \nÖstrogenmetabolismus ein Ziel medikamentöser Strate gien, da die ektopen Läsionen \nÖstrogen-abhängig wachsen. Da Endometrioseherde in der Bauchhöhle eine \ninflammatorische Reaktion hervorrufen, gibt es eini ge Arbeitsgruppen die sich mit den \ndadurch entstehenden Veränderungen des Immunsystems  beschäftigen und dort ein \nmögliches Angriffsziel einer medikamentösen Therapie sehen (Giudice und Kao, 2004). \nDa inzwischen davon ausgegangen wird, dass das endo metriale Stroma für die Etablierung \nder Endometrioseherde eine wichtige Rolle spielt (N isolle et al., 2000a), könnte ein \ntherapeutischer Ansatz in der terminalen Differenzi erung (Dezidualisierung) dieser \nektopen endometrialen Stromazellen liegen. Diese bi ndegewebige Umwandlung könnte \nletztendlich zu einer Atrophie der endometriotische n Läsionen führen. Bergqvist et al. \n(1985) konnten zeigen, dass ohne endometriales Stro ma, welches die Drüsen umgibt, das \nDrüsenepithel atrophiert. Dies zeigt, dass die Bewa hrung des endometrialen Stromas für \ndie Aufrechterhaltung der normalen morphologischen Eigenschaften des glandulären \n\nEinleitung 9 \nEpithels notwendig ist. Die vorliegende Arbeit foku ssiert sich daher auf die Induktion der \nDezidualisierung ektoper endometrialer Läsionen. \n \n1.3  Die Dezidualisierung \n \nDas humane Endometrium unterliegt während der gesam ten weiblichen \nReproduktionsphase einer zyklischen Regeneration, U mwandlung und Differenzierung. \nDer Menstruationszyklus wird durch die ovariellen S teroidhormone Östrogen und \nProgesteron gesteuert. Nach der Abstoßung des diffe renzierten Endometriums \n(Menstruation) proliferiert das Endometrium unter d em Einfluss von Östrogen. Dieser \nRegenerationsprozess umfasst endometriales Epithelw achstum, Angiogenese und \nProliferation der endometrialen Stromazellen (Maruy ama und Yoshimura, 2008). Der \novarielle Progesteronanstieg in der Lutealphase des  Menstruationszyklus stoppt das rapide \nWachstum der proliferativen Phase abrupt und induzi ert eine umfassende Umbildung des \ndurch das Östradiol vorbereiteten Endometriums wie morphologische und funktionale \nÄnderungen des luminalen Epithels, der epithelialen  Drüsen, des Gefäßsystems und der \nstromalen Zellen (Jones et al., 2006). Die morpholo gische und biochemische \nDifferenzierung der endometrialen Stromazellen zu D eziduazellen wird als \nDezidualisierung bezeichnet. Diese beginnt in der L utealphase des Menstruationszyklus \nund erreicht ihre volle Ausprägung in der Schwanger schaft nach der Einnistung des \nEmbryos. Bei Ausbleiben einer Schwangerschaft sinkt  der Progesteronspiegel im Blut, das \ndifferenzierte Endometrium wird abgestoßen und ein neuer Zyklus beginnt (Jones et al., \n2006). \nHistologisch ist die Dezidualisierung durch das Auf treten größerer, abgerundeter \nepitheloider Zellen charakterisiert, die zunächst d ie Spiralarterien umgeben und unter dem \nMikroskop als blaß gefärbte Zellen erscheinen. Das Größenwachstum dieser Zellen wird \ndurch die Einlagerung von Glykogen und Lipiden in d as Zyoplasma hervorgerufen. Nach \nImplantation einer Blastozyste breitet sich die Dez idualisierung im Endometrium aus und \nes entwickelt sich die Decidua gravitatis. Diese mo rphologischen Änderungen sind mit \nÄnderungen auf molekularer Ebene verbunden. Viele Z ellfunktionen wie eine veränderte \nSteroidhormonrezeptorexpression und ein veränderter  Steroidmetabolismus, eine \nUmformung der extrazellulären Matrix und des Zytosk eletts sowie eine veränderte \nExpression von intrazellulären Enzymen, Wachstumsfa ktoren, Zytokinen und ihrer \n\nEinleitung 10  \nRezeptoren und Dezidua-spezifischen Transkriptionsf aktoren wurden beschrieben \n(Gellersen und Brosens, 2003). Als Konsequenz besit zen die dezidualisierten \nendometrialen Stromazellen die besondere Fähigkeit,  die Trophoblastinvasion zu \nregulieren, inflammatorischen und oxidativen Insult en entgegenzuwirken und lokale \nmaternale Immunantworten zu verringern (Maruyama un d Yoshimura, 2008). \nHauptsekretionsprodukte dezidualisierter Zellen sin d deziduales Prolaktin (dPRL) und \nInsulin-like growth factor-binding protein 1 (IGFBP 1), zwei Proteine, welche nur in \ndezidualisierten endometrialen Stromazellen exprimi ert werden und die daher als \nspezifische Marker dezidualisierter Zellen eingeset zt werden (Maruyama und Yoshimura, \n2008). Als früherer Dezidualisierungsmarker kann zu dem die Expression des \nTranskriptionsfaktors Forkhead-Box-Protein O1 (FOXO1) bestimmt werden. FOXO1 wird \nschon zu Beginn der Dezidualisierung heraufregulier t (Lynch et al., 2009). Bei den \nTransmembranproteinen Connexin43 (GJA1) und CD82 ha ndelt es sich um weitere \nDezidualisierungsmarker, welche offensichtlich im e ndometrialen Stroma und bei der \nDezidualisierung eine wichtige Rolle spielen (Gelle rsen et al., 2007; Ramathal et al., \n2010). Die Dezidualisierung ist für die Implantatio n des Embryos und die nachfolgende \nPlazentation unerlässlich. \n \nEs ist bekannt, dass der Dezidualisierungsprozeß be im Menschen durch Progesteron \ninduziert wird (Huang et al., 1987; Tseng et al., 1 992; Tang und Gurpide, 1993). Jedoch \nsind die an dem Prozeß der Dezidualisierung beteili gten Faktoren und Signalwege bisher \nnur wenig verstanden (Jones et al., 2006; Lynch et al., 2009). Zahlreiche Studien haben \ngezeigt, dass humane endometriale Stromazellen in vitro in der Anwesenheit bestimmter \nHormone und Wachstumsfaktoren dezidualisieren (Dimi triadis et al., 2002). Zwei \nvoneinander unabhängige Signale können eine Dezidua lisierungsreaktion in den stromalen \nZellen hervorrufen. Es gibt einen Progesteronrezept or-vermittelten und einen zyklischen \nAdenosinmonophosphat (cAMP)-vermittelten Signalweg (Mizuno et al., 1998). Letzterer \nkann aber mit dem Progesteronrezeptor-vermittelten Signalweg interagieren, unter \nanderem durch die Expression von Transkriptionsfakt oren, die die Funktion des \nProgesteronrezeptors modulieren (Gellersen und Bros ens, 2003). Die Induktion der \nDezidualisierung und letztendlich die Sekretion von  dPRL und IGFBP-1 werden also \ndurch eine komplexe Interaktion multipler Faktoren ausgelöst (Tseng et al., 1992). \n \n\nEinleitung 11  \nDie Induktion der Differenzierung des ektopen Endom etriums zur Dezidua bietet einen \ninteressanten Ansatzpunkt zur Behandlung der Endome triose. Dies wird durch die \nBeobachtungen unterstützt, dass Endometrioseherde w ährend einer Schwangerschaft \ndezidualisieren und nach der Geburt sogar apoptotis ch werden können (Moen und Muus, \n1991). Neben den oben aufgeführten in vitro -Studien gibt es bisher jedoch keine in vivo -\nStudien zur Induktion der Dezidualisierung in ektop em Endometrium. Daher wurde in der \nvorliegenden Arbeit der Effekt verschiedener Gestag ene in Kombination mit cAMP-\nsteigendernden Substanzen auf die Dezidualisierung ektoper humaner endometrialer \nGewebefragmente im Tiermodell untersucht. \n \n1.4  Das heterologe Mausmodell zur Untersuchung der Endometriose \n \nSpontan auftretende Endometriose kommt nur beim Men schen und einigen \nmenstruierenden nicht-humanen Primaten vor (D'Hoogh e und Debrock, 2002). Ethische \nund praktische Erwägungen sowie die hohen Kosten de r Tierexperimente an nicht-\nhumanen Primaten haben die Wissenschaftler dazu ver anlasst, eine Vielzahl von in vivo -\nTiermodellen - hauptsächlich mit Nagetieren - zu en twickeln, um die Physiologie des \nhumanen Endometriums und die zugrundeliegenden path ophysiologischen Mechanismen \nder Endometrioseentwicklung zu untersuchen (Rossi e t al., 2000; Fazleabas et al., 2002; \nGrummer, 2006). Da Nagetiere eine Endometriose nich t spontan entwickeln, wird diese \nunter experimentellen Bedingungen durch die Transpl antation von endometrialem Gewebe \nin die Labortiere induziert (Story und Kennedy, 200 4; Grummer, 2006). In der \nEndometrioseforschung werden zwei verschiedene Tran splantationsmodelle angewandt. \nBei den autologen Tiermodellen wird Endometriumgewe be desselben Tieres oder eines \ngenetisch identischen Tieres verwendet. Etabliert w urde diese Methode bei Kaninchen \n(Dunselman et al., 1989), Hamstern (Steinleitner et  al., 1991), Ratten (Vernon und Wilson, \n1985) und Mäusen (Cummings und Metcalf, 1995; Rossi et al., 2000). Aufgrund geringerer \nHaltungskosten, einfacher Handhabung und einer gute n Verfügbarkeit sind diese \nLabortiere in der Endometrioseforschung weit verbre itet. Die Übertragbarkeit der \nErgebnisse auf die menschliche Spezies ist bei dies em Modell jedoch aufgrund der \nphylogenetischen und biochemischen Unterschiede des  Endometriums nicht ohne weiteres \nmöglich (Story und Kennedy, 2004). Daher wurden het erologe Tiermodelle entwickelt, bei \ndenen humanes Endometriumgewebe in die Bauchhöhle i mmundefizienter Mäuse \n\nEinleitung 12  \ntransplantiert wurde, um der humanen Situation nähe r zu kommen. Immundefiziente \nMäuse ermöglichen ein Persistieren des transplantierten heterologen Endometriumgewebes \nüber einen längeren Zeitraum. Lange Zeit wurde fast  ausschließlich die homozygote \nNacktmausmutante (nu/nu) verwendet, welche eine ang eborene Thymusaplasie besitzt. \nDiesen Nacktmäusen fehlt daher ein intaktes T-Zellsystem (Wortis, 1971), wohingegen das \nB-Zell-Abwehrsystem und die natürlichen Killerzelle n (NK-Zellen) weiterhin aktiv sind. \nZamah et al. (1984) konnten zeigen, dass humanes en dometriales Gewebe erfolgreich in \nNacktmäuse transplantiert werden kann und das Gewebe seine grundlegende Morphologie, \nseine biochemischen Eigenschaften und somit seine h umanen Charakteristiken beibehält. \nHumanes ektopes Gewebe, das nach einiger Zeit der K ultivierung in Nacktmäusen diesen \nwieder entnommen wird, ähnelt morphologisch und his tologisch endometriotischen \nLäsionen von erkrankten Frauen (Zamah et al., 1984;  Bruner et al., 1997; Nisolle et al., \n2000b; Grummer et al., 2001; Bruner-Tran et al., 20 02). Die Erkenntnisse, die aus \nausgedehnten Studien zum Effekt verschiedener pharm akologischer Substanzen auf \nhumanes, in immundefiziente Mäuse transplantiertes Gewebe gewonnen wurden, zeigen, \ndass die Medikamentensuszeptibilität nach der Trans plantation erhalten bleibt (Bergqvist \net al., 1985a). So kann in diesem Modell z.B. der Effekt medikamentöser Therapien auf die \nGenexpression und Physiologie der ektopen Fragmente  näher untersucht werden (Fechner \net al., 2007; Monckedieck et al., 2009). Das hetero loge Endometriose-Mausmodell bietet \ndaher eine hervorragende Möglichkeit zur Identifizi erung und Testung neuer \ntherapeutischer Strategien für die Behandlung der E ndometriose. Um die Immunantwort \nauf das transplantierte humane Gewebe weiter zu red uzieren, wird inzwischen vermehrt \nmit NOD ( non-obese diabetic )-SCID ( severe combined immunodeficiency )-Mäusen \ngearbeitet, die im Unterschied zu den Nacktmäusen m ehrere immunologische Defizienzen \nwie die funktionale Inkompetenz von T-, B- und NK-Z ellen besitzen. Diese Mäuse sind \ndeshalb ideale Kandidaten um Fremdtransplantate zu erhalten, und haben hohe Raten der \nTransplantatannahme (Aoki et al., 1994). Bereits zw ei Tage nach der Transplantation \nadhärieren die endometrialen Fragmente und nach vie r Tagen wachsen murine Blutgefäße \nin die ektopen Läsionen ein (Grummer et al., 2001).  Endometriotische Läsionen, die in \nNOD-SCID-Mäusen kultiviert wurden, besitzen eine be sser erhaltene Morphologie und \nExpression von Steroidhormonrezeptoren verglichen m it ektopen Läsionen, die in der \nNacktmaus kultiviert wurden (Grummer et al., 2001).  Daher wurde in der vorliegenden \nArbeit das heterologe NOD-SCID-Mausmodell zur Unter suchung der Wirkung \n\nEinleitung 13  \nverschiedener Behandlungen auf die Induktion der De zidualisierung sowie auf die \nProliferations- und Apoptoserate in den ektopen endometrialen Läsionen verwendet. \n \n1.5  Zielsetzung \n \nDie zur Zeit aktuellen Behandlungen der Endometrios e sind immer noch mit \nunerwünschten Nebenwirkungen und hohen Rezidivraten  verbunden. Aus diesem Grund \nbesteht eine Notwendigkeit spezifischere therapeutische Strategien zu entwickeln. \nDa inzwischen davon ausgegangen wird, dass das endometriale Stroma eine wichtige Rolle \nbei der Etablierung der Endometrioseherde spielt (N isolle et al., 2000a), könnte die \nterminale Differenzierung dieser stromalen Zellen z u Deziduazellen und eine in diesen \nZellen ausgelöste nachfolgende Apoptose einen vielv ersprechender Ansatz für innovative \nmedizinische Anwendungen bieten. Durch vorhergehend e Studien anderer Arbeitsgruppen \nist bekannt, dass die kombinierte Behandlung von Pr ogestinen und cAMP die \nDezidualisierung humaner endometrialer Stromazellen  in vitro  verstärken kann (Gellersen \nund Brosens, 2003). In der vorliegenden Arbeit wird  daher untersucht, ob die \nDezidualisierung auch in vivo  in ektopen endometrialen Fragmenten in einem etabl ierten \nheterologen Endometriose-Mausmodell induziert werden kann, um somit die Persistenz der \nendometrialen Läsionen zu reduzieren. Um die Dezidu alisierung der endometrialen \nStromazellen auszulösen bzw. zu verstärken werden d ie Mäuse nach der Transplantation \nmit Progesteron alleine oder in Kombination mit den  cAMP-steigernden Substanzen \nForskolin oder hCG behandelt. Zusätzlich zum Proges teron soll in der vorliegenden Arbeit \nvergleichend der Effekt von MPA in Kombination mit hCG auf die Dezidualisierung \nektopen endometrialen Gewebes untersucht werden. Di e Morphologie, der \nDezidualisierungsgrad, die Proliferations- und Apop toserate des ektopen endometrialen \nGewebes wird mittels verschiedener Methoden in den unterschiedlichen \nBehandlungsansätzen vergleichend analysiert. \n \n \n \n \n \n \n\nMaterial und Methoden 14  \n2 Material und Methoden \n2.1  Material \n2.1.1  Chemikalien \n \nAgarose NEEO Ultra-Qualität    Roth, Karlsruhe \nAmmoniumperoxodisulfat     Merck, Darmstadt \nBenzylbenzoat      Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nß-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nBorsäure       Roth, Karlsruhe \nBromphenolblau      Merck, Darmstadt \nBSA        Roth, Karlsruhe \nDAB Liquid Substrat-Chromogen-System   Dako, Hambur g \nDeoxycholat Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nDEPC        Roth, Karlsruhe \nDesoxynucleotidmix (je 10 mM)    Genecraft, \n Köln \nD-Glucose Monohydrat     Serva, Heidelberg \nDMEM       Invitrogen, Karlsruhe \nDMSO        Roth, Karlsruhe \nDTT 0,1 M       Invitrogen, Karlsruhe \nEDTA > 99%       Roth, Karlsruhe \nEosin        Roth, Karlsruhe \nEssigsäure 100%      Roth, Karlsruhe \nEthanol absolut Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nEthidiumbromid [10 mg/ml]     Serva, Heidelberg \nFormaldehyd 37%      Roth, Karlsruhe \nForskolin       Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nGlycerin       Riedel-de Haën, Seelze \nGlycin        Roth, Karlsruhe \nHämatoxylin Thermo-Scientific, Pittsburgh, \nPA, USA \nHam’s F-12 Biochrom, Berlin \nHPLC-H\n2O       Merck, Darmstadt \nIsopropanol       J.T. Baker, Deventer, NL \n\nMaterial und Methoden 15  \nIsotone NaCL-Lösung (0,9%)    Braun, Melsungen \nKaliumchlorid       Riedel-de Haen, Seelze \nKaliumdihydrogenphosphat     Merck, Darmstadt \nKetamin       Ceva, Düsseldorf \nMethanol zur Analyse     Sigma-Aldrich, Taufkirchen  \nMedroxyprogesteronacetat     Sigma-Aldrich, Taufkir chen \nMilchpulver fettfrei      TSI, Zeven \nNatriumchlorid      Roth, Karlsruhe \nNatriumcitrat       Merck, Darmstadt \nNatriumdeoxycholat      Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nNatriumhydrogencarbonat     Roth, Karlsruhe \nNatriumdihydrogenphosphat     Merck, Darmstadt \nNatriumdodecylsulfat ultra pure > 99%   Roth, Karls ruhe \nNonidet P40       Lonza, Basel, Schweiz \nOligo(dT) \n20 -Starteroligonucleotide    Invitrogen, Karlsruhe \nOvogest® (humanes Choriongonadotropin)   Intervet, Boxmeer, Niederlande \nParaplast Tissue Embedding Medium (Paraffin) Mc Cor mick Scientific, St. \nLouis, MO, USA   \nPBS Dulbecco       Biochrom, Berlin \nPenicillin (10 U/ml)/Streptomycin (10 µg/ml)-Lösung Invitrogen, Karlsruhe \nPonceau S       Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nProgesteron       Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nProtease/Phosphatase-Inhibitor Tablette   Roche, Ma nnheim \nRizinusöl Apotheke, Universitätsklinikum \nEssen \nRotiphorese NF-Acrylamid/Bis-Lösung 40%(19:1) Roth, Karlsruhe \nRoti-Quant zur Proteinbestimmung    Roth, Karlsruhe  \nSalzsäure rauchend       Roth, Karlsruhe \nSalzsäure 37%      Roth, Karlsruhe \nShandon Xylene Substitute Thermo-Scientific, Pittsb urgh, \nUSA \nShandon Xylene Substitute Mountant Thermo-Scientifi c, Pittsburgh, \nUSA \nSuprapur Wasserstoffperoxid (30%) Merck, Darmstadt \n\nMaterial und Methoden 16  \nTEMED  Serva, Heidelberg \nTris  Roth, Karlsruhe \nTween®20  Sigma-Aldrich, Taufkirchen \nXylazin  Ceva, Düsseldorf \nZitronensäure-Monohydrat  Merck, Darmstadt \n \n2.1.2  Verbrauchsmaterialien \n \nEinkanal-Pipetten  Eppendorf, Hamburg \nEinmalskalpelle HMD Healthcare Ltd.; \nHereford, UK \nEinmalspritzen (1 ml) Terumo Europe N. V., Leuven, \nBelgien \nKüvetten       Sarstedt, Nümbrecht \nInjektionskanülen (20G, 23G und 27G) Becton Dickins on, Bedford, \nMA, USA \nMikrotiterplatten (ABI Prism) Applied Biosystems, \nWeiterstadt \nNahtmaterial (Vicryl 6/0, 5/0) Ethicon, Norderstedt  \nNitrozellulosemembran Hybond-C Extra  Amersham Bios ciences, \nFreiburg \nObjektträger Engelbrecht, Edermünde \nPetrischalen  Sarstedt, Nümbrecht \nPipettenspitzen (10 – 100 µl, 100 – 1000 µl)  Sarst edt, Nümbrecht \nPipettenspitzen (0,5 – 10 µl) Biozym Scientific, He ssisch \nOldendorf \nPCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml     Roth, Karlsruhe \nPolypropylen-Reaktionsgefäße (12 ml, 15 ml, 50 ml) Greiner Bio-One, \nFrickenhausen \nReaktionsgefäße (1,5 ml)     Sarstedt, Nümbrecht \nReaktionsgefäße (2 ml)     Eppendorf, Hamburg \nRöntgenfilme Super RX Fuji Medical   Fujifilm, Düss eldorf \n\nMaterial und Methoden 17  \nSerologische Pipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml) Greiner Bio-One, \nFrickenhausen \nUV-Küvetten       Eppendorf, Hamburg \nWhatman 3MM-Papier  Biometra, Göttingen \n \n2.1.3  Laborgeräte \n \nAgarose-Gelelektrophoresekammer Selbstbau Medizinte chnik \nUniversitätsklinikum Essen \nAnalysenwaage Precisa 4000c Söntgen, Bottrop-Kirchh ellen \nAxiophot Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Oberkochen \nBlockthermostat BT 1301 HLC Bio Tech, Bovenden \nBrutschrank Hera Cell 240i Thermo Fisher Scientific , \nLangenselbold \nFeinwaage ALJ 220-4NM Kern, Balingen \nGeldokumentationssystem Herolab SU-1 Herolab Laborg eräte, Wiesloch \nHomogenisator Polytron PT3100 Kinematica, Littau-Lu cerne, \nSchweiz \nKühlzentrifuge Biofuge 28RS Heraeus, Hanau \nLaborwippe 3013  GFL, Burgwedel \nMagnetrührer IKAMAG® IKA®-Werke, Staufen \nParaffinausgießstation PA/3,3 Chirurgie & Elektrome chanik, \nLudwigslust \nPCR-Maschine T3 Thermocycler Biometra, Göttingen \npH-Meter HI 9025 Hanna Instruments, Kehl am \nRhein \nPhotometer BioPhotometer plus Eppendorf, Hamburg \nPipettierhilfe pipetus® Hirschmann Laborgeräte, \nEberstadt \nProteintransferkammer Bio-Rad, München \nRealTime PCR-Maschine ABI Prism 7300 Applied Biosys tems, \nWeiterstadt \nMikrotom 2050 Supercut Reichert-Jung Leica, Wetzlar  \n\nMaterial und Methoden 18  \nSDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresekammer Bio-Rad, München \nSpannungsgerät PHERO-stab. 500 Biotec-Fischer, Reis kirchen \nSpannungsgerät Bio-Rad, München \nStereomikroskop Stemi DV4 Zeiss, Oberkochen \nSterilbank Class II Nuaire, Plymouth, USA \nTaumelschüttler Rotamax 120 Heidolph, Schwabach \nUltraschallprozessor (GE 50)  Thomas Scientific, Sw edesboro, \nNJ, USA \nVortexer L46 GLW, Würzburg \nWasserbad GFL, Burgwedel \nZentrifuge 5415D Eppendorf, Hamburg \nZentrifuge Rotina 38R Hettich, Tuttlingen \n \nAlle verwendeten Geräte und Materialien bzw. Chemik alien entsprachen dem allgemeinen \nLaborstandard und wurden in Analysequalität von den oben aufgeführten Firmen bezogen. \n \n2.1.4  Enzyme \n \nDNase I [1 U/µl] u. Puffer (Molekularbiologie)  Inv itrogen, Karlsruhe \nM-MLV Reverse Transkriptase [200 U/µl] u. Puffer In vitrogen, Karlsruhe \nTaq-DNA-Polymerase BioTherm™ [5 U/µl] u. Puffer  Ge necraft, Köln \n \n2.1.5  Molekularbiologische und proteinbiochemische Kits \n \nE.Z.N.A. GelExtraction Kit (V-spin) Omega Bio-Tek, Norcross, GA, \nUSA \nE.Z.N.A. Total RNA Midi Kit Omega Bio-Tek, Norcross , GA, \nUSA \nPower SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems,  \nWeiterstadt \nSupersignal West Dura Extended Duration-Substrat Th ermo-Scientific, Pittsburgh, \nPA, USA \n\nMaterial und Methoden 19  \n2.1.6  Kulturmedien, Puffer und Lösungen \n \nSoweit nicht anders beschrieben, wurden alle Lösungen mit A. bidest angesetzt. \n \n×10 SDS-Laufpuffer  25 mM Tris/HCl pH 8.8; 95 mM Glyc in, 0.1% SDS (w/v) \n×10 Transferpuffer  25 mM Tris/HCl pH 8-10.5; 192 mM Glycin \n×10 TBS-Puffer  20 mM Tris, 137 mM NaCl pH 7.6 \nTBS-T    ×1 TBS-Puffer, 0.15% 10%-iges Tween \nBlotting-Puffer  10% (v/v) Methanol, 10% (v/v) ×10 Transferpuffer \nSDS-Trenngelpuffer  1,5 M Tris pH 8.8, 0.4% SDS \nSDS-Sammelgelpuffer 0,5 M Tris pH 6.8, 0.4% SDS \nMoscona 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 0.4 mM NaH \n2PO 4×H2O,  \n0,2 mM KH 2PO 4, 12 mM NaHCO 3, 9 mM D-Glucose ×H2O,  \npH 7.4 \nPBS/BSA   0.5-1 % (w/v) BSA (Fraktion V) in ×1 PBS gelöst, pH 7.5 \nRIPA-Puffer 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.2, 0.1% SD S, 1% Triton X-\n100, 1% Deoxycholate, 5 mM EDTA, 1 Cocktailtablette  \n(EDTA free Complete Proteinase Inhibitoren) \nPonceau-Lösung 0.5% (w/v) Ponceau S, 1% (v/v) Essig säure \nStripping-Puffer 62,5 mM Tris/HCL pH 6,7, 100 mM ß- Mercaptoethanol,  \n2% SDS \n×10  DNA-Ladepuffer  50% (v/v) Glycerin, 0,25% (w/v) Bromphenolblau, 75 mM \nEDTA  \n4× SDS-Probenpuffer 20% (v/v) 1 M Tris/HCl, 27,7 µM S DS, 0,6 µM \nBromphenolblau, 40% (v/v) Glycerin, 20% (v/v) β-\nMercaptoethanol, 20% (v/v) A. bidest \nTBE-Puffer 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2 mM EDTA \nEndometrium-Nährmedium 49,5% (v/v) DMEM, 49.5% (v/v ) Ham’s F12, 1% (v/v) \nPen/Strep \nXylazin-Ketamin-Lösung 80% (v/v) 0,9%-ige NaCL-Lösu ng, 16% (v/v) 10%-ige \nKetaminlösung, 4% (v/v) Xylazin \nCitratpuffer 1,8 mM Zitronensäure, 8,2 mM Natriumci trat \n \n\nMaterial und Methoden 20  \n1000  \n900  \n800  \n700  \n500  \n400  \n300  \n600  \n200  \n100  \nPageRuler™ Prestained \nProtein Ladder  \n100 bp DNA -\nLeiter  \n2.1.7  bp-Längenstandards/Molekulargewichtsstandards \n \n \n  \n \n \n \n2.1.8  Oligonukleotide \n \nAlle Oligonukleotide wurden mit dem Programm Primer  Selection Tools entworfen. Die \nÜberprüfung der Spezifität der ausgewählten Sequenz en erfolgte mit Hilfe des \nSequenzvergleichprogramms BLAST (Basic Local Alignm ent Search Tool) in der EMBL \n(European Molecular Biology Laboratory)-Datenbank. Die Synthese wurde anschließend \nbei der Firma Invitrogen in Auftrag gegeben und die  erhaltenen Oligonukleotide mit \nHPLC-H\n2O auf eine Konzentration von 100 pmol/µl eingestellt. \n \nPrimer-\nbezeichnung \nAccession \nnumber Sequenz (5` /barb2right/barb2right /barb2right/barb2right 3`) Position Fragmentgröße \n(bp) \nFOXO1-F GACAGCCCTGGATCACAGTT 1241-1260 \nFOXO1-R NM002015.3 AGATGGCGGGTACACCATAG 1419-1438 198 \nIGFBP1-F CTATGATGGCTCGAAGGCTC 764-783 \nIGFBP1-R NM000596.2 TTCTTGTTGCAGTTTGGCAG 900-919 156 \nGJA1-F TGGATTCAGCTTGAGTGCTG 781-800 \nGJA1-R NM000165.3 GATATTCAAGGCCAGGGACA 906-925 145 \ndPRL-F CATCAACAGCTGCCACACTT 437-456 \ndPRL-R NM000948.4 CGTTTGGTTTGCTCCTCAAT 630-649 213 \nACTB-F AGCACAGAGCCTGGCCTTTGCC 27-48 \nACTB-R NM001101.3 CACATGCCGGAGCCGTTGTCGA 113-134 108 \n \nBezeichnung Fragmentgrößen \n100 bp DNA-Leiter \n(Genecraft, Köln) \n100, 200, 300, 400, 500, 600, \n700, 800, 900, 1000 bp                 \nPageRuler™ Prestained \nProtein-Leiter (Fermentas, \nSt.Leon-Rot) \n10 , 17, 26, 43, 43, 55, 72 , 95, \n130, 170 kDa  \n\nMaterial und Methoden 21  \n2.1.9  Antikörper \n \nPrimäre Antikörper \n \nKlonalität \n \nVerdünnung \n \nApplikation \n \nHersteller \n \nKaninchen anti humanes \nConnexin43 polyklonal 1:2000; WB; IHC Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, \nUSA \nMaus anti humanes \nGAPDH monoklonal \n 1:1000 WB Millipore, Billerica, MA, USA \nKaninchen anti humanes \nFOXO1 polyklonal 1:50 IHC Cell Signaling, Danvers, MA, \nUSA \nMaus anti humanes KAI-1 monoklonal  1:50 IHC Santa Cruz Biotechnology, \nHeidelberg \nMaus anti humanes CD82 monoklonal  1:5000 WB Diaclone, Besançon, Frankreich \nKaninchen anti-humanes \nCaspase 3 (cleaved) polyklonal 1:200 IHC Zytomed, Carlsbad, CA, USA \nMaus anti humanes \nProlaktin monoklonal \n 1:25 IHC Zytomed, Carlsbad, CA, USA \nMaus anti humanes Ki-67 monoklonal  1:400 IHC Dako, Hamburg \n \nSekundäre Antikörper \n \nKlonalität \n \nVerdünnung \n \nApplikation \n \nHersteller \n \nZiege anti Kaninchen IgG-\nHRP polyklonal 1:10.000 WB Santa Cruz Biotechnologies, \nHeidelberg \nZiege anti Maus IgG-HRP \n \npolyklonal \n \n1:10.000 \n \nWB \n Santa Cruz Biotechnologies, \nHeidelberg \nEsel anti Maus IgG \n(biotinyliert) \npolyklonal 1:100 IHC Dako, Hamburg \nEsel anti Kaninchen IgG \n(biotinyliert) \npolyklonal 1:200 IHC Dako, Hamburg \n \n2.1.10  Software und Datenbanken \n \nABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Weiterstadt) \nSPSS Software, Version 16.0 \nTINA 2.09g (raytest Isotopenmessgeräte GmbH, Straubenhardt) \nNIS-Elements BR (Basic Research) Imaging Software Version 2.30 \n (Nikon) \nGraphPad Prism 4 \nBLAST      http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST \nPrimer Selection Tools   http://biotools.umassmed.e du \n \n\nMaterial und Methoden 22  \n2.2  Methoden \n2.2.1  Humanes Endometriumgewebe \n \nFür die vorliegende Arbeit wurde endometriales Gewe be von 16 prämenopausalen \nPatientinnen im Alter zwischen 30 und 50 Jahren ver wendet, welches im Rahmen von \nHysteroskopien in der gynäkologischen Abteilung des  Universitätsklinikums Essen \n(Leitung: Prof. Dr. Kimmig) gewonnen wurde. Die Hys teroskopien und diagnostischen \nKürettagen wurden aufgrund benigner Indikationen wi e z.B. Uterus myomatosus oder zur \nAbklärung von Subfertilität durchgeführt. Die Geweb eentnahme sowie die anschließende \nVerwendung zu Forschungszwecken erfolgten mit Einve rständnis der Patientinnen. \nInformationen zur allgemeinen Anamnese und vorherig en Behandlungen wurden den \nPatientenakten entnommen. Ein Auschlusskriterium fü r die Verwendung des \nendometrialen Gewebes war die Einnahme hormoneller Präparate in den letzten 3 Monaten \nvor Gewebeentnahme. Zusätzlich zur Anamnese wurde h istologisch nach den Kriterien \nvon Noyes (1950) eine Zyklusbestimmung durchgeführt . Deziduagewebe aus reifen \nPlazenten wurde ebenfalls von der gynäkologischen K linik des Universitätsklinikums \nEssen zur Verfügung gestellt. \nUnmitttelbar nach der Entnahme wurde das endometria le Gewebe in 4°C kalte \nMosconalösung überführt. Das Gewebe wurde im Labor des Institutes für \nMolekularbiologie an Sterilbänken mit laminarem Luf tstrom in 1,5 mm große Fragmente \ngeschnitten. 1-2 Fragmente wurden jeweils zur späte ren RNA- und Proteinextraktion in \nflüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C g elagert. Zur histologischen Analyse \nwurde zusätzlich 1 Fragment in 4% Formalin fixiert.  Die übrigen Fragmente wurden bis \nzur Transplantation in Endometrium-Nährmedium bei 3 7°C unter 5% CO \n2 Partialdruck in \neiner wassergesättigten Atmosphäre inkubiert. Die T ransplantation der endometrialen \nGewebestücke in immundefiziente Mäuse erfolgte spät estens 3 Stunden nach \nGewebeentnahme. \n \n \n \n\nMaterial und Methoden 23  \n2.2.2  Tierexperimentelle Arbeiten \n2.2.2.1  Versuchstiere \n \nFür die Versuche wurden weibliche zyklische NOD-SCI D-Mäuse aus der Zucht des \nZentralen Tierlabors des Universitätsklinikums Esse n (Leitung: Priv.-Doz. Dr. Hilken) \neingesetzt. Die Mäuse wurden unter kontrollierten B edingungen (Temperatur, \nLuftfeuchtigkeit) in einer pathogenfreien Umgebung mit reguliertem Licht/Dunkel Zyklus \n(12h/12h) gehalten und hatten unbegrenzten Zugang z u Nahrung und Wasser. Es fanden \nausschließlich den Richtlinien entsprechende autokl avierte Käfige mit Filterhauben \nVerwendung. \n Bei Versuchsbeginn hatten die Tiere ein Alter von 2  bis 6 Monaten, wobei \nalle Tiere eines Versuchsansatzes in etwa das gleic he Alter aufwiesen (+/- 2 Wochen). Die \nTierversuche wurden nach § 15 des Tierschutzgesetze s genehmigt (LANUV AZ 50.05-\n230-83/04 und AZ 87-51.04.2010.A034). \n \n2.2.2.2  Transplantation des endometrialen Gewebes \n \nDie vorbereiteten Endometriumfragmente wurden mitte ls Laparatomie in die \nimmundefizienten Mäuse transplantiert, welche zuvor  durch intraperitoneale Injektion von \n160 µl einer Mischung aus NaCL, Xylazin und Ketamin  (20:1:4) betäubt wurden. Pro \nMaus wurden vier Fragmente in einer Schlinge aus Na htmaterial (Vicryl, 6/0) am \nparietalen Peritoneum der Bauchwand angenäht ohne u nnötige Reizungen und \n \nVerletzungen zu verursachen. Die Bauchwand und die Haut wurden mit \nEinzelknopfnähten (Vicryl, 5/0) wieder verschlossen . Zusätzlich wurde die Wunde mit \nAluminiumklammern zusammengehalten und täglich kontrolliert. \nDa das Endometriumgewebe unterschiedlicher Patienti nnen eine hohe interindividuelle \nSchwankung in der Reaktion auf Hormonbehandlungen z eigen kann, wurde für jeden \nVersuchsansatz das Gewebe derselben Patientin in ve rschiedene Mäuse transplantiert. Je \nnach Versuchsansatz handelte es sich dabei um 2 bis 4 Mäuse. \n \n \n \n \n\nMaterial und Methoden 24  \n2.2.2.3  Substanzapplikationen \n \nAls Gestagene wurden Progesteron und Medroxyprogest eronacetat (MPA) verwendet, \nwelche in Benylbenzoat gelöst und in einer Konzentr ation von 50 µg subkutan (s.c.) in \neinem Volumen von 100 µl Benzylbenzoat:Rizinusöl (1 :4) appliziert wurden. Um den \nintrazellulären cAMP-Spiegel zu erhöhen, wurden zwe i verschiedene Substanzen \neingesetzt: Zum einen das Diterpenoid Forskolin, ei n Adenylatzyklaseaktivator, und zum \nanderen humanes Choriongonadotropin (hCG), welches hauptsächlich über den \ncAMP/Proteinkinase A (PKA)-Signalweg wirkt (Tang un d Gurpide, 1993; Maruyama und \nYoshimura, 2008). Forskolin wurde in DMSO gelöst un d jeweils 100 µg intraperitoneal \n(i.p.) in einem Volumen von 100 µl DMSO:NaCl (1:4) appliziert. Humanes CG wurde in \neiner Konzentration von 7,5 IU gelöst in 100 µl NaC l i.p. injiziert. Pro Versuchsreihe \ndiente eine Maus als Vehikelkontrolle, welcher nur das jeweilige Lösungsmittel appliziert \nwurde. Am Ende der jeweiligen Versuchsreihen wurden  die endometrialen \nGewebefragmente entnommen und wie unter 2.2.2.4 beschrieben aufgearbeitet. \n \n2.2.2.4  Entnahme der transplantierten Fragmente \n \nNach Beendigung der jeweiligen Versuchsansätze wurd en die Mäuse durch zervikale \nDislokation getötet und gewogen. Das Fell im Bereic h des Bauchraums wurde mit 70%-\nigem Ethanol sterilisiert und mit einer Schere ange schnitten. Das Fell wurde rostrokaudal \nabgezogen. Nach Lokalisation der transplantierten F ragmente anhand der Fixierungsnähte \nwurde die Bauchhöhle beginnend in der Bauchmitte er öffnet. Unter einem \nStereomikroskop wurden die Fragmente zunächst verme ssen und anschließend aus dem \nmurinen Gewebe präpariert. Das Gewicht der Fragment e wurde mit einer Feinwaage \nermittelt. Zur RNA- und Proteinextraktion wurden je weils 3 Fragmente \n pro Maus getrennt \nin flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Aufarbeitung bei -80°C \ngelagert. Je 1 Fragment wurde zur histologischen An alyse über Nacht in 4% Formalin \nfixiert. \nZur Überprüfung der Auswirkungen der Substanzapplik ation auf den Organismus der \nMaus wurde zusätzlich der Uterus präpariert. Der Ut erus wurde möglichst nahe am \nÜbergang zum Eileiter gehalten und mit einer Schere  vom Mesometrium getrennt. Der \nfreigelegte Uterus wurde an den beiden Eileitern un d am unteren Ende des Cervix uteri \n\nMaterial und Methoden 25  \nabgetrennt. Das Uterusgewicht wurde bestimmt und al s prozentualer Anteil des \nKörpergewichtes dargestellt. \n \n2.2.3  Molekularbiologische Methoden \n2.2.3.1  RNA-Isolierung aus Gewebe \n \nDie endometrialen Fragmente wurden jeweils in 50 ml  Reaktionsgefäße, in denen 2 ml \nLysispuffer und 40 µl \nβ-Mercaptoethanol vorgelegt wurden, überführt und mi t einem \nHomogenisator bei 16.000 - 17.000 UpM aufgeschlosse n. Der Homogenisatorstab wurde \nzuvor für 10 min mit 0,1 M NaOH behandelt und ansch ließend gründlich mit DEPC-H 2O \ngewaschen. Diethylpyrocarbonat (DEPC) modifiziert H istidinreste in Proteinen zu N-\nCarbethoxyhistidin und führt dadurch u.a. zur Hemmu ng von Enzymen wie RNasen. \nZwischen der Aufarbeitung der verschiedenen Fragmen tproben wurde der \nHomogenisatorstab ebenfalls mit DEPC-H 2O gewaschen. Die Isolierung von RNA aus \ndem homogenisierten Gewebe wurde mit dem „E.Z.N.A. Total RNA Midi Kit“ der Firma \nOmega Bio-Tek nach Herstellerangaben durchgeführt. Dabei wurde über eine Säule die \nRNA  aufgereinigt  und  schließlich  in  150 µl  DE PC-H2O  eluiert.  Vor der Lagerung bei \n-80°C wurde die Konzentration der RNA bestimmt (siehe 2.2.3.2). \n \n2.2.3.2  Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren \n \nDie Konzentration und die Reinheit von Nukleinsäure lösungen können mit Hilfe eines \nPhotometers anhand der Absorption von UV-Licht best immt werden. Das \nAbsorptionsmaximum der heterozyklischen Nukleinsäur en liegt bei 260 nm und das der \naromatischen Aminosäurereste bei 280 nm. Daher wurd e die Absorption bei diesen beiden \nWellenlängen gemessen. Als Leerwert diente das jewe ils eingesetzte Lösungsmittel. Ein \nAbsorptionswert von 1,0 bei 260 nm entspricht einer  Konzentration von 50 µg/ml bei \ndoppelsträngiger DNA und 40 µg/ml bei einzelsträngi ger DNA oder RNA. Um den \nReinheitsgrad der Nukleinsäurelösung zu bestimmen, wird der Quotient aus der \nAbsorption bei 260 nm und 280 nm gebildet. Bei DNA- Lösungen zeigt ein Koeffizient \nzwischen 1,8 und 2,0 eine reine Probe an, bei RNA-Lösungen ein Koeffizient zwischen 1,9 \n\nMaterial und Methoden 26  \nund 2,2. Geringere Werte weisen auf eine Verunreini gung mit UV-absorbierenden Stoffen \nwie z.B. Proteinen hin. Alle verwendeten Proben entsprachen diesen Reinheitskriterien. \n \n2.2.3.3  Reverse Transkription (RT)  \n \nVor der Reversen Transkription wurde zunächst ein D Nase-Verdau durchgeführt, um \neventuell noch in den Proben enthaltene DNA abzubauen. Hierfür wurden 2 µg RNA mit 2 \nµl 10 \n× DNase-Puffer und 1 µl DNase I (Invitrogen) versetz t, mit DEPC-H 2O auf 20 µl \naufgefüllt und für 15 min bei RT inkubiert. Um die DNase zu inaktivieren, wurden die \nRNA-Proben im vorgeheizten Thermocycler für 10 min bei 65°C inkubiert. Danach \nwurden die Proben auf 8°C gekühlt. Nach diesem erst en Schritt erfolgte die Reverse \nTranskription mit dem M-MLV-RT-System der Firma Inv itrogen. Dazu wurden auf die \nProben 30 µl eines vorher angefertigten Reagenzieng emisches gegeben, bestehend aus 10 \nµl 5 × Puffer, 2,5 µl dNTPs [10 mM], 4 µl DTT, 1µl oligo( dT) 20 -Primer, 1 µl M-MLV RT \n[200 U/µl] und 11,5 µl DEPC-H 2O. Die Oligo(dT) 20 -Primer, die sich an den Poly-A-\nSchwanz der mRNAs anlagern, dienten dabei als Start punkt für die Reverse Transkriptase. \nDie Umschreibung in die cDNA erfolgte für 1 h bei 3 7°C. Der Ansatz wurde anschließend \nfür 5 min auf 95°C erhitzt, um die Reverse Transkri ptase zu inaktivieren und die Proben \ndaraufhin auf 8°C gekühlt. Die Lagerung der cDNA er folgte bei - 20°C. Die cDNA konnte \nnun als Ausgangsmaterial für die folgenden PCR-Reaktionen dienen. \n \n2.2.3.4  Polymerasekettenreaktion (PCR) \n \nDie PCR-Methode wurde eingesetzt, um die Funktional ität der Primer zu überprüfen und \nmögliche Kreuzreaktionen der Oligonukleotide mit murinen Sequenzen auszuschließen. Zu \ndiesem Zweck wurden die Primer an cDNA aus murinem Uterus-, humanem \nEndometrium- und humanem Deziduagewebe getestet. Zu sätzlich wurden semiquantitive \nPCRs zur Amplifikation spezifischer cDNA-Sequenzen in RT-Ansätzen zur Herstellung \nvon Standardreihen für die quantitative Echtzeit-PC R durchgeführt. Der durch die reverse \nTranskription synthetisierte cDNA-Strang (s. 2.2.3. 3) dient dabei als Matrize für die \nAmplifikation eines spezifischen cDNA-Abschnittes. Dazu wurden 4 µl des reversen \nTranskriptionsansatzes (s. 2.2.3.3) mit genspezifischen Primern in der PCR eingesetzt.  \n\nMaterial und Methoden 27  \nPCR-Ansatz:  \n4 µl   RT-Ansatz \n5 µl  10 \n×-Puffer \n1 µl  dNTPs \n1 µl  Primer -F, -R [25 pmol/µl] \n0,5 µl  Taq-Polymerase [5U/µl] \nad 50 µl H\n20 \n \nDie PCR wurde unter folgenden Bedingungen im Thermocycler durchgeführt: \nTemperatur (°C)  Zeit Zyklen \n94 2 min 1 \n94 45 sec \n60 45 sec \n72 2 min \n35 \n72 5 min 1 \n \n2.2.3.5  Agarosegelelektrophorese \n \nNach Beendigung der PCR wurde die Größe des amplifi zierten Produkts in einer \nGelelektrophorese kontrolliert. Für eine optimale F ragment-Auftrennung wird die \nAgarosekonzentration des Gels auf die Länge der zu trennenden Nukleinsäuren \nabgestimmt. Aufgrund der Größe der zu erwartenden D NA-Fragmente wurden 2%-ige \nAgarosegele verwendet. Die entsprechende Menge Agar ose wurde mit 1 \n×TBE-Puffer \nversetzt und durch Aufkochen in der Mikrowelle gelö st, mit Ethidiumbromid \n(Endkonzentration 0,5 mg/ml) zum Anfärben der DNA v ersetzt und in einen Gelträger mit \neinem entsprechend gewählten Kamm gegossen. Das erh ärtete Gel wurde in die \nElektrophoresekammer gelegt, mit 1 × TBE-Puffer überschichtet und der Gelkamm \nentfernt. Die Proben wurden mit 10 × DNA-Ladepuffer versetzt und anschließend in die \nTaschen des Agarosegels geladen. Als Größenstandard  wurden 10 µl einer 100 bp DNA-\nStandard-Leiter aufgetragen, um später die Größe de r DNA-Fragmente bestimmen zu \nkönnen. Die elektrophoretische Trennung der DNA-Fra gmente erfolgte für ca. 1 h bei 120 \nV. Eine Auswertung und Dokumentation der Ergebnisse  wurde unter UV-Licht (312 nm) \nan dem Geldokumentationssystem Herolab SU-1 vorgenommen. \n \n\nMaterial und Methoden 28  \n2.2.3.6  Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen \n \nZur Aufreinigung der DNA aus Agarosegelen wurde das  „E.Z.N.A. GelExtraction Kit“ der \nFirma Omega Bio-Tek verwendet. Die gewünschte Bande  wurde unter UV-Licht mit \neinem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten, in ei n 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und \nin Bindepuffer gelöst. Anschließend wurde die DNA/A garose-Lösung auf eine HiBind® \nSpinsäule aufgetragen und die cDNA nach drei Waschs chritten mit 40 µl Elutionspuffer \n(10 mM Tris-HCl, pH 8,5) \n eluiert. Die Konzentration und Reinheit der cDNA-Lö sung \nwurde gemessen (siehe 2.2.3.2) und zur Herstellung von Standardreihen für die \nquantitative Echtzeit-PCR verwendet. \n \n2.2.3.7  Quantitative Echtzeit-PCR \n \nMit der Echtzeit-PCR ist es möglich, mRNA aus Zelle n oder Geweben indirekt zu \nquantifizieren. Dafür wurde die mRNA durch eine Rev erse Transkription in cDNA \numgeschrieben (s. 2.2.3.3) und mit dieser eine Echt zeit-PCR (ABI Prism 7300 Sequence \nDetection System) durchgeführt. Zur quantitativen B estimmung der Expressionswerte \nwurden Standardkurven der spezifischen Produkte und  des Haushaltsgens ACTB  in einer \nEchtzeit-PCR erstellt. Dazu wurden die cDNA-Lösunge n aus der Aufreinigung aus \nAgarosegelen (s. 2.2.3.6) auf eine Konzentration vo n 1 ng/µl eingestellt und jeweils eine \nVerdünnungsreihe mit den Konzentrationen 100 pg/µl,  10 pg/µl, 1 pg/µl, 100 fg/µl, 10 \nfg/µl, 1 fg/µl, 0,1 fg/µl angesetzt. Diese Standard reihen wurden zunächst in einer Echtzeit-\nPCR getestet. Zur Durchführung der quantitativen Ec htzeit-PCR wurde ein Gemisch aus \nallen benötigten Komponenten mit Ausnahme der cDNA angesetzt und jeweils 19 µl in die \nVertiefungen einer 96er-Lochplatte pipettiert. Ansc hließend wurde 1 µl der cDNA (s. \n2.2.3.3) der zu untersuchenden Proben zu den vorgel egten 19 µl gegeben. Jede Probe \nwurde in einem dreifachen Ansatz amplifiziert. \n \nEchtzeit-PCR-Ansatz:  \n10 µl  Power SYBR® Green I PCR Master Mix \n0,15 µl  Primer -F, -R [25 pmol/µl] \n1 µl   RT-Ansatz \n8,7 µl  H\n2O \n \n\nMaterial und Methoden 29  \nDem Reaktionsansatz ist der Fluoreszenzfarbstoff SY BR® Green I zugesetzt, der mit \ndoppelsträngiger DNA einen charakteristisch fluores zierenden Komplex bildet. Bei jedem \nZyklus der PCR lässt sich daher die Fluoreszenz als  Maß für die Produktentstehung \nverfolgen. Die Bedingungen zur Durchführung der PCR  sind in der unten stehenden \nTabelle dargestellt und werden im Text näher erläutert. \n \nTemperatur (°C)  Zeit Zyklen \n50 2 min 1 \n95 10 min 1 \n95 15 sec \n60 1 min \n45 \n95 15 sec 1 \n60 30 sec 1 \n95 15 sec 1 \n \nNach zweiminütiger Erhitzung der Proben bei 50°C fo lgte die Aktivierung der \nAmphTaqGold® DNA-Polymerase für 10 Minuten bei 95°C. Eine Erhitzung für 15 sec bei \n95°C und eine 1minütige Inkubation bei 60°C wurden 45 \n× wiederholt. Abschließend \nwurden für die Ermittlung der Dissoziationskurve di e Proben in 0,1°C Schritten von 60°C \nauf 95°C erhitzt. Durch das Aufschmelzen der DNA-St ränge wurden die interkalierten \nSYBR® Green I-Moleküle freigesetzt und die Abnahme der Fluoreszenz gemessen. \nUnspezifisch entstandene Produkte lassen sich damit  detektieren. Zusätzlich wurde die \nSpezifität bei einer anschließenden Auftrennung der  Echtzeit-PCR-Proben in einem 2% \nAgarosegel überprüft. Die Daten über den Anstieg de r Fluoreszenz bei der PCR-Reaktion \ngeben anhand der jeweils gleichzeitig ermittelten S tandardkurven Aufschluss über die \nAusgangsmenge der amplifizierten Sequenz. Die Anzah l der Temperaturzyklen (C t-Wert) \nwurde bestimmt, ab der die Fluoreszenz einen fixen Wert innerhalb der exponentiellen \nPhase der Reaktion erreichte. Je höher der C t-Wert ist, also je mehr Zyklen notwendig sind, \num den einer bestimmten Produktmenge entsprechenden  Fluoreszenzwert zu erreichen, \ndesto geringer war die Ausgangsmenge der amplifizie rten DNA. Die unterschiedliche \nSyntheserate bei der Reversen Transkription wurde d urch einen externen Standard \nnormalisiert. Als Standard wurde das Haushaltsgen ACTB  gewählt. Aufgrund der großen \ninterindividuellen Unterschiede des Ausgangsgewebes  wurde die relative Expression der \nuntersuchten Gene im Vehikeltier gleich 1 gesetzt u nd die x-fache Expression im Substanz \nbehandelten Tier entsprechend bestimmt, um auf dies e Weise den Effekt der verwendeten \n\nMaterial und Methoden 30  \nSubstanzen bestimmen zu können.  Die Auswertung wurde mit dem Programm Excel \ndurchgeführt. \n \n2.2.4  Proteinbiochemische Methoden \n2.2.4.1  Proteinextraktion aus Gewebe \n \nZur Proteinexktraktion wurden die Gewebefragmente i n 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt, \nin denen 200 µl RIPA-Puffer vorgelegt wurde. Eine P roteaseinhibitortablette wurde immer \nfrisch zu dem RIPA-Puffer zugegeben. Mittels eines Ultraschallstabes (2 \n× 30 sec, mittlere \nStufe) wurden die Zellen weitgehend aufgeschlossen.  Die Proben wurden während der \nUltraschallbehandlung auf Eis gekühlt, um ein stark es Erhitzen zu verhindern. Um die \nZellen vollständig aufzuschließen, wurde das Lysat anschließend mehrfach mit einer \nInjektionskanüle (20G) aufgezogen. Die homogene Sus pension wurde für 30 min auf Eis \ngestellt und anschließend für 10 min bei 4°C und 13 .000 UpM zentrifugiert. Der \nproteinhaltige Überstand wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und ein Aliquot zur \nBestimmung der Proteinkonzentration eingesetzt. \n \n2.2.4.2  Bestimmung der Proteinkonzentration \n \nDie Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte na ch der Methode von Bradford (1976) \nmit der den Farbstoff CBBG250 („Coomassie Brilliant blau-G250“) enthaltenden Roti-\nQuant-Lösung. Dazu wurden 2 µl der Proteinlösung zu  798 µl A. bidest pipettiert. Die \nLösung wurde gemischt, mit 200 µl Roti-Quant-Lösung  versetzt (1:500 Verdünnung), mit \ndem Vortexer gemischt und für 10 min im Dunkeln ink ubiert. Für den Leerwert wurden \n800 µl A. bidest mit 200 µl Roti-Quant-Lösung gemis cht und ebenfalls für 10 min im \nDunkeln inkubiert. Zuvor wurde unter Verwendung von  BSA-Lösungen bekannter \nKonzentration eine Eichkurve erstellt. Die optische  Dichte der Proteinlösungen wurde mit \neinem Photometer bei 595 nm gemessen und anhand der  vorher ermittelten Eichkurve die \njeweilige Proteinkonzentration der Proben bestimmt.  Dieser Schritt ermöglichte die \nAuftragung gleicher Mengen an Protein in der nachfo lgenden SDS-PAGE, um ein \nvergleichbares Ergebnis zu erhalten. \n \n\nMaterial und Methoden 31  \n2.2.4.3  Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) \n \nZur Auftrennung von Proteinen in Abhängigkeit ihres  Molekulargewichts wurde die \ndenaturierende diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach \nder Methode von Laemmli (1970) durchgeführt. \nEs wurden 12%-ige Trenngele und 4%-ige Sammelgele v erwendet. Die Gele wurden mit \ndem BioRad Gelgießsystem nach den unten angegebenen Zusammensetzungen gegossen. \n \nReagenzien Trenngel 12% Sammelgel 4% \nH20 2,2 ml 1,625 ml \nSDS-Trenngelpuffer 1,25 ml - \nSDS-Sammelgelpuffer - 0,625 ml \nAcrylamid/Bis-Lösung 1,5 ml 0,267 ml \n10 % APS 50 µl 7,5 µl \nTEMED 1,25 µl 2,5 µl \n \nVon jeder Probe wurden 10 µg Protein im Verhältnis 1:4 mit reduzierendem 4\n× SDS-\nProbenpuffer für 5 min bei 95°C aufgekocht, auf Eis  abgekühlt und danach in die Taschen \nder Gele gefüllt. Zusätzlich wurde eine Tasche mit 6 µl des Größenstandards beladen. Eine \nAusnahme bildete die Detektion von CD82. Um diese mit dem angegebenen Antikörper zu \nermöglichen, wurde die SDS-PAGE mit 30 µg Protein u nter nicht-reduzierenden \nBedingungen durchgeführt. \nDie Elektrophorese erfolgte im Sammelgel zur Fokuss ierung der Proteine bei einer \nSpannung von 70 V. Erreichte die Lauffront das Tren ngel, wurde die Stromspannung erst \nauf 120 V, dann auf 150 V erhöht. Die Elektrophores e erfolgte bis zum Auslaufen der \nBromphenolblaufront (ca. 1,5 h - 2 h). \n \n2.2.4.4  Western Blot \n \nIn dieser Arbeit erfolgte der elektrophoretische Tr ansfer der zuvor in der SDS-PAGE \nseparierten Proteine auf eine proteinbindende Träge rmembran aus Nitrozellulose mit dem \nNass-Blot-System von BioRad. Zunächst wurden zwei L agen Vlies, vier zurechtgeschnitte \nWhatman-Papiere und die Nitrozellulose-Membran in 1\n×Blotting-Puffer getränkt. Die \n\nMaterial und Methoden 32  \nBlotkammer wurde wie folgt - ausgehend von der Kath ode - luftblasenfrei \nzusammengebaut: Auf ein Vlies wurden zwei Lagen Wha tman-Papier, das SDS-Trenngel, \ndie Nitrozellulose-Membran, erneut zwei Lagen Whatm an-Papier und ein weiteres Vlies \nübereinander geschichtet. Der komplette Sandwich-Au fbau wurde zwischen zwei Gitter \ngepresst, verriegelt und in die dafür vorgesehenen Halteschienen eingeführt. In die Nass-\nBlot-Apparatur wurde ein Kühlaggregat eingesetzt un d ein Rührfisch wurde hinzugefügt. \nNachdem der vorgekühlte Blotting-Puffer in die Kamm er eingefüllt wurde, erfolgte das \nBlotten für zwei Stunden bei RT bei einer Stromstär ke von 70 mA von der Kathode zur \nAnode. Um eine gleichmäßige Wärmeverteilung zu gara ntieren, wurde während des \nBlottens langsam gerührt. Nach dem Blotten wurde da s Sandwich demontiert und der Blot \nmit der Proteinseite nach oben kurz in TBS-T gewaschen. \n \n2.2.4.5  Proteinfärbung auf der Nitrozellulosemembran \n \nUm den erfolgreichen Proteintransfer zu überprüfen, erfolgte ein erster reversibler visueller \nNachweis der Proteinbanden auf der Nitrozelluloseme mbran mit einer Ponceau-Rot-\nFärbung. Die Proteinnachweisgrenze dieser Färbemeth ode liegt bei 100 ng Protein pro \nBande. Diese Färbemethode zeigt, ob das Protein gle ichmäßig in die unterschiedlichen \nTaschen des SDS-Gels geladen wurde. Hierzu wurde di e Membran solange in der \nFärbelösung inkubiert, bis rote Banden sichtbar wur den. Der überschüssige Farbstoff \nwurde mit H \n2O von der Membran gewaschen und die Membranen zur D okumentation \neingescannt. Durch Zugabe von TBS-T kann die Membran wieder entfärbt werden. \n \n2.2.4.6  Immundetektion von Proteinen auf der Nitrozellulosemembran  \n \nAuf der Membran lassen sich die transferierten Prot eine mit geeigneten Antikörpern \nnachweisen. \n Die hier verwendeten Antikörper sind unter 2.1.9 au fgeführt. Vor der \nAntikörperreaktion wurden die restlichen freien Pro teinbindungsstellen der \nNitrozellulosemembran für 1 h bei RT mit einer Lösu ng aus 10% (w/v) Magermilchpulver \nin TBS-T blockiert. Die anschließende Inkubation mi t dem in 2% (w/v) Magermilchpulver \noder 5% BSA (w/v) (CD82) in TBS-T verdünnten Primär antikörper erfolgte üN bei 4°C.  \nVor der Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde n die ungebundenen restlichen \n\nMaterial und Methoden 33  \nPrimärantikörper durch dreimaliges Waschen mit TBS- T entfernt (2 ×5 min, 1 ×15 min). \nEs folgte eine 60minütige Inkubation bei RT mit ein em HRP-gekoppelten \nSekundärantikörper. Durch diesen sekundären Antikörper kann der Komplex aus primärem \nAntikörper und Protein wie unter 2.2.4.7 beschriebe n sichtbar gemacht werden. Die \nMembran wurde daraufhin zweimal für 10 min gewasche n, um ungebundene Antikörper \nzu entfernen, und konnte anschließend zum Chemilumi neszenz-Nachweis eingesetzt \nwerden. \n \n2.2.4.7  Chemilumineszenz-Nachweis (ECL-Reaktion) \n \nDer Nachweis der Chemilumineszenzreaktion erfolgte nach Towbin und Gordon (1984) \nunter Verwendung des ECL-Systems der Firma Thermo-S cientific gemäß \nHerstellerangaben. Durch Auflegen eines Röntgenfilm s auf den mit der ECL-Lösung \nbehandelten Blot kommt es nach Entwicklung des Rönt genfilms zu einer Schwärzung des \nFilms an den belichteten Stellen. Der Film wurde je  nach Antikörper unterschiedlich lange \nbelichtet.\n Die Intensität der so entstandenen Banden gibt Aufs chluss über die relative \nMenge des Proteins. Die jeweilige spezifische Prote inexpression wurde durch die \nGAPDH-Expression normalisiert. Die Höhe der Banden wurde mit einem in der SDS-\nPAGE mitgeführten Standard verglichen, der eine Aus sage über das Molekulargewicht der \nBande auf dem Röntgenfilm erlaubt. Nach Scannen des  entwickelten, belichteten \nRöntgenfilms konnten relative Veränderungen zwische n untersuchten Proben quantitativ \nerfasst werden. Die densitometrischen Analysen der Proteinbanden erfolgten durch das \nProgramm TINA 2.09g. \n \n2.2.5  Morphologische Methoden  \n2.2.5.1  Histologische Analyse \n \nZur morphologischen Untersuchung wurden die endomet rialen Fragmente in Paraffin \neingebettet. Dazu wurde als erstes das präparierte Endometriumgewebe zunächst üN in 4% \nFormalin fixiert. Nach der Fixierung wurde das Fixi erungsmittel ausgewaschen und das \nGewebe durch eine aufsteigende Alkoholreihe entwäss ert. Über das Intermediärmedium \nXylol wurde das Gewebe in 60°C flüssiges Paraffin e ingebracht und nach Durchdringung \n\nMaterial und Methoden 34  \nin Paraffin eingebettet und abgekühlt. Das Gewebe i m Paraffinblock wurde auf einem \nMikrotom in eine Schichtdicke von 7 µm geschnitten und jeweils 3 Schnitte auf einen \nObjektträger gebracht. Bei jedem fünften Objektträg er wurden die Gewebeschnitte mittels \nHämatoxylin-Eosin (s. 2.2.5.2) angefärbt, um den en dometrialen Charakter der \nmakroskopisch erkannten Läsionen zu bestätigen (Noc i et al., 1995), die durchschnittliche \ndezidualisierte Arealgröße zu bestimmen und geeigne te Schnitte für die \nimmunhistochemischen Färbungen herauszusuchen. Die Auswertung und \nmorphologischen Analysen der HE- und immunhistochem isch gefärbten Gewebeschnitte \nerfolgte am Axiophot Mikroskop mit Hilfe der NIS-Elements BR Software. \n \n2.2.5.2  Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung \n \nAls Vorbereitung auf die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurden die Schnitte in Xylol \nentparaffiniert und dann über eine absteigende Alko holreihe schrittweise wieder hydriert. \nNach Spülen in Leitungswasser und A. bidest wurden die Schnitte mit Hämatoxylin \ngefärbt. Hämatoxylin ist ein natürlicher Farbstoff,  der in Form des basischen Hämalaun \nalle sauren Gewebebestandteile wie Nukleinsäuren in tensiv blau färbt. Ungebundenes \nHämatoxylin wurde mit warmem Leitungswasser abgewaschen. Als nächster Schritt wurde \nmit Eosin gefärbt. Bei Eosin handelt es sich um ein en sauren synthetischen Farbstoff, der \nbasische Zellstrukturen rot anfärbt. Dazu gehören v or allem die Proteine des Zytoplasmas. \nAuch hier wurde ungebundener Farbstoff abgewaschen.  Nach den Färbungen wurden die \nSchnitte wieder durch eine aufsteigende Alkoholreih e entwässert und daraufhin mit einem \nXylen-Substitut behandelt. Nun konnten die Schnitte  mit Shandon Xylene Substitute \nMountant eingedeckt werden. \n \n2.2.5.3  Immunhistochemische Analyse \n \nDie immunhistochemische Analyse ermöglicht den Nach weis eines Proteins mit Hilfe von \nAntikörpern an Gewebeschnitten. Zu diesem Zweck wur den die Schnitte in Xylol \nentparaffiniert, über eine absteigende Alkoholreihe  rehydriert und für 5 min mit PBS \ngewaschen. Zur Antigendemaskierung wurden die Schni tte anschließend für 20 min in 10 \nmM Natriumcitratpuffer (pH 6) gekocht. Nach ca. 10m inütigem Abkühlen der Schnitte \n\nMaterial und Methoden 35  \nwurden diese erneut für 20 min in PBS gewaschen. Je der Schnitt wurde mit einem \nhydrophoben Markierungstift (Dako, Hamburg) umkreis t und im Weiteren ein Volumen \nvon 20 µl aller verwendeten Lösungen direkt auf die  Schnitte aufgetragen. Um eine \nendogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren, wurden  die Schnitte für 10 min in einer \nWasserstoffperoxid-Lösung (1:40 in Methanol verdünnt) unter Lichtschutz inkubiert. Freie \nBindungsstellen wurden danach für 20 min mit 0,5%-i gem BSA in PBS abgesättigt. Der \nprimäre und sekundäre Antikörper wurde - wie unter 2.1.9 angegeben - in PBS/BSA \nverdünnt. Die Inkubation des primären Antikörpers e rfolgte üN bei 4°C. Die \nungebundenen Antikörper wurden anschließend durch W aschen mit PBS entfernt. \nDaraufhin wurden die Schnitte mit einem entsprechen den sekundären Biotin-gekoppelten \nAntikörper (siehe 2.1.9) für 60 min inkubiert. Auch  hier wurden nach der Inkubationszeit \ndie ungebundenen Antikörper durch Waschen mit PBS e ntfernt. Anschließend wurden die \nSchnitte für 30 min mit einem Strept.A/B-Komplex/HR P inkubiert, mit PBS gewaschen \nund mit dem chromogenen Substrat für die Peroxidase  (DAB) solange inkubiert bis eine \nFarbreaktion erkennbar wurde, jedoch höchstens 25 m in. Die Reaktion wurde daraufhin \nmit A. bidest abgestoppt. Zusätzlich wurde eine Geg enfärbung mit Hämatoxylin \ndurchgeführt. Nach erneutem Waschen mit A. bidest w urden die Schnitte in einer \naufsteigenden Alkoholreihe entwässert, mit einem Xy len-Substitut behandelt und mit \nXylene Substitute Mountant eingedeckt. Die Auswertung erfolgte an einem Zeiss Axiophot \nMikroskop. Als Positivkontrolle diente Deziduageweb e aus reifer humaner Plazenta und \nals Negativkontrolle Schnitte, die mit PBS/BSA ohne  Primärantikörper inkubiert wurden. \nDie Auswertung der Färbungen erfolgte über semiquan titative Bestimmung des \nProzentsatzes angefärbten Gewebes am Gesamtgewebe e ines repräsentativen Schnittes, \ndabei wurde die Intensität der Färbung in neun vers chiedene Klassen (0 = keine Färbung \nbis 8 = sehr starke Färbung) eingeteilt. \nDie Immunhistochemie für Prolaktin, aktivierte Casp ase 3 als Apoptosemarker und dem \nProliferationsmarker Ki-67 wurde im histologischen Labor des Institutes für Pathologie des \nUniversitätsklinikums Essen (Leitung: Prof. Dr. Sch mid) durchgeführt. Zur Bestimmung \nder Proliferationsrate der endometrialen Drüsenepit helzellen wurden nach der Ki-67-\nFärbung von einem repräsentativen Schnitt pro Fragm ent alle Drüsenepithelzellen \nausgezählt und der prozentuale Anteil der Ki-67-pos itiven Zellen an der Gesamtzellzahl \nder Drüsenepithelzellen bestimmt. Zur Ermittlung des prozentualen Anteils Ki-67-positiver \nStromazellen wurden bei einer 40fachen Vergrößerung  alle gefärbten und ungefärbten \nStromazellen eines Gesichtsfeldes (entspricht ca. 30-50% eines Schnittes) ausgezählt. \n\nMaterial und Methoden 36  \n2.2.6  Statistische Auswertung \n \nDie statistische Auswertung der Expressionsanalysen  erfolgte mit dem Statistikprogramm \nSPSS 16.0. Für die Auswertung der RNA- und Proteine xpression wurden jeweils drei \nunabhängige Messungen mit mindestens drei verschied enen Fragmenten pro \nBehandlungsansatz durchgeführt. Bei der histologisc hen Auswertung der Fragmente \nwurden von jedem Behandlungsansatz mindestens drei verschiedene Fragmente analysiert. \nZur Überprüfung der Signifikanzen wurde ein nicht p arametrischer Mann-Whitney-Test \nfür den Vergleich zweier unabhängiger Gruppen einge setzt. Die Signifikanz wurde anhand \ndes Quantils der zu überprüfenden Unwahrscheinlichk eit festgelegt. Das Quantil, welches \nmit P angegeben wird, wurde auf einen Wert von P = 0,05 festgelegt, wobei dieser Wert \neine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% angibt. Unterschiede mit P \n≤ 0,05 wurden somit als \nstatistisch signifikant angesehen. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nErgebnisse 37  \n3 Ergebnisse \n3.1  Validierung der Oligonukleotid-Primer \n \nDas humane ektope Endometriumgewebe, das in die Per itonealhöhle immundefizienter \nMäuse transplantiert wurde, verwächst dort mit muri nem Gewebe. Bei der Präparation der \nhumanen ektopen Läsionen nach Versuchsende konnte d aher humanes und murines \nGewebe nicht vollständig voneinander getrennt werde n. Alle in dieser Arbeit verwendeten \nOligonukleotide wurden daher vorab an humanem Endom etrium und murinem \nUterusgewebe auf ihre Speziesspezifität überprüft u m mögliche Kreuzreaktionen mit \nmurinen Sequenzen auszuschließen und somit Veränder ungen in der Genexpression \nspezifisch in den humanen endometrialen Zellen nachweisen zu können. \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbb. 1: Nachweis der Speziesspezifität der verwendeten Oligonukleotide \nAgarosegelelektrophoresen der mit den jeweiligen Ol igonukleotiden in einer PCR amplifizierten \nProdukte. Für die semiquantitativen PCRs wurde cDNA  aus humanem Endometrium (hEM) sowie \nmurinem Uterusgewebe (mU) verwendet. \n \nBei Verwendung der humanspezifischen Oligonukleotid e zeigte sich eine Bande für das \njeweilige amplifizierte Produkt nur bei humanem end ometrialem Gewebe, wodurch \nKreuzreaktionen mit murinen Sequenzen ausgeschlossen wurden (Abb. 1). \n \n3.2  Effekt von Progesteron in Kombination mit cAMP-stei gernden \nSubstanzen auf die Dezidualisierung \n \nEs ist bekannt, dass die Dezidualisierung von human em Endometrium durch Progesteron \ninitiiert und aufrechterhalten wird (Ramathal et al ., 2010) und dass humane \nEndometriumzellen in vitro  bei Zugabe von Progesteron dezidualisieren (Geller sen und \n PRL \nIGFBP1 \n FOXO1 \n GJA1 \n ACTB \nmU hEM \n\nErgebnisse 38  \nBrosens, 2003). Es konnte zudem gezeigt werden, das s dass Ausmaß der Dezidualisierung \nhumaner Endometriumzellen durch eine kombinierte Behandlung mit Gestagen und cAMP \nsignifikant verstärkt wird (Gellersen und Brosens, 2003). Um zu überprüfen, ob die \nDezidualisierung von ektopem Endometriumgewebe in vivo  durch Progesteron alleine oder \nin Kombination mit Substanzen, die den cAMP-Signalw eg aktivieren, induziert werden \nkann, wurde nach Transplantation endometrialer Frag mente in NOD-SCID-Mäuse eine \nBehandlung dieser Mäuse mit Progesteron alleine ode r in Kombination mit Forskolin, \neinem Adenylatzyklaseaktivator oder mit hCG, welche s hauptsächlich über den cAMP-\nSignalweg wirkt, durchgeführt. Für jeden Versuchsan satz wurde das Gewebe derselben \nPatientin parallel in 4 NOD-SCID-Mäuse transplantie rt. Die Mäuse erhielten folgende \nBehandlungen: 1. Progesteron (50 µg/d, s.c.), 2. Pr ogesteron (50 µg/d, s.c.) + Forskolin \n(100 µg/d, i.p.), 3. Progesteron (50 µg/d, s.c.) + hCG (7,5 IU/d, i.p.), 4. Vehikelkontrolle. \nDie Substanzapplikation erfolgte täglich über einen  Zeitraum von 7 Tagen. 24 Stunden \nnach der letzten Applikation wurden die endometrialen Gewebefragmente entnommen, wie \nunter 2.2.2.4 beschrieben aufgearbeitet und im Hinblick auf Größe, Gewicht, Morphologie, \nProliferationsrate und Expression verschiedener Dezidualisierungsmarker analysiert. \n \n3.2.1  Effekt auf das Uterusgewicht der Maus \n \nUm eine mögliche Wirkung der verwendeten Substanzen  auf das Endometrium der Mäuse \nzu untersuchen, wurde der Uterus jeder Maus am Ende  der Versuchsreihe entnommen und \ndas Naßgewicht bestimmt. Das Gewicht wurde auf das Körpergewicht der Maus bezogen \nund prozentual dargestellt. Die Uterusgewichte ware n in den behandelten Mäusen \ntendenziell reduziert, zeigten jedoch keine signifi kanten Unterschiede zwischen den \nverschiedenen Behandlungsgruppen (Abb. 2). \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nErgebnisse 39  \n \n \n \n \n \n \n \nAbb. 2: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach 7tägiger Behandlung \nDargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler der  Uterusgewichte als prozentualer Anteil am \nKörpergewicht (KG). V = Vehikel; P = Progesteron; F  = Forskolin; hCG = humanes \nChoriongonadotropin. \n \n3.2.2  Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen \n3.2.2.1  Größe und Gewicht der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nNach 7tägiger Kultur in NOD-SCID-Mäusen wurde die G röße der ektopen endometrialen \nFragmente in situ  gemessen. Anschließend wurden die endometrialen Ge webefragmente \nentnommen und deren Gewicht bestimmt. \n \nV P P + F P + hCG \n0\n1\n2\n3\n4\n5Größe [mm 2]\nV P P + F P + hCG \n0\n1\n2\n3\n4Gewicht [mg] \nA B\n \nAbb. 3: Wachstumsverhalten  der ektopen Läsionen \nGröße ( A) und Gewicht ( B) der humanen endometrialen Fragmente nach 7tägiger  Kultur und \nBehandlung in der NOD-SCID Maus. Pro Behandlungsgru ppe wurden 16 Fragmente analysiert. \nGewicht und Größe sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. V = Vehikel; P = Progesteron; \nF = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \nEs zeigte sich eine Korrelation der Größe und des G ewichtes der ektopen Fragmente. \nSowohl die Fragmentgröße als auch das -gewicht ware n nach Behandlung mit Progesteron \nalleine tendenziell erhöht (Abb. 3). Die kombiniert e Behandlung von Progesteron mit \nForskolin bzw. hCG führte zu einer leichten Gewicht sabnahme der Fragmente im \nV P P + F P + hCG \n0.0 \n0.2 \n0.4 \n0.6 \n0.8 \n1.0  Uterusgewicht/KG [%] \n\nErgebnisse 40  \nVergleich zur Vehikelkontrolle (Abb. 3B). Bei keine r Behandlung wurde jedoch ein \nsignifikanter Unterschied in Größe oder Gewicht der  ektopen endometrialen Läsionen im \nVergleich zur Kontrolle festgestellt. \n \n3.2.2.2  Morphologie der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nDie Auswertung der Paraffin-Serienschnitte zeigte e ine gut erhaltene Morphologie der \nhumanen endometrialen Fragmente nach 7tägiger Kulti vierungsdauer in den NOD-SCID \nMäusen. Es ließen sich charakteristische endometria le Histomorphologien mit Drüsen und \numgebendem Stroma erkennen (Abb. 4A-D). Dezidualisi erte Zellen sind leicht anhand \nihres epitheloiden Erscheinungsbildes zu definieren . Mit steigender Dezidualisierung sind \ndie Zellgrenzen weniger deutlich zu erkennen, wahrs cheinlich aufgrund der verstärkten \nBildung extrazellulärer Matrix (Frank et al., 1994) . Areale mit dezidualisierten Zellen \nwurden in allen Läsionen gefunden. In Kontrollfragm enten (Abb. 4A) und nach \nBehandlung mit Progesteron alleine (Abb. 4B) waren jedoch nur wenige kleine Areale \ndezidualisierter Zellen zu erkennen. Nach Behandlun g mit Forskolin in Kombination mit \nProgesteron (Abb. 4C) fand eine Zunahme dezidualisi erter stromaler Zellen statt. Nach \nkombinierter Behandlung von Progesteron und hCG war en große dezidualisierte Areale zu \nbeobachten (Abb. 4D). Die dezidualiserten Areale wu rden morphometrisch quantifiziert \n(Abb. 4E). In ektopem humanem endometrialem Gewebe,  welches mit einer Kombination \nvon Progesteron und Forskolin behandelt wurde, war die Gesamtfläche dezidualisierten \nStromas im Vergleich zur Kontrolle und zu den Läsio nen, die mit Progesteron alleine \nbehandelt wurden, erhöht. Nach 7tägiger kombinierte r Behandlung von Progesteron und \nhCG wurde die stärkste Zunahme dezidualisierter Areale festgestellt. \n \n\nErgebnisse 41  \nV P P + F P + hCG \n0\n2\n4\n6 rel. dezidualisierte Fläche \nA B\nC D E\nDE \nS\nS\nS\nS\nDE \nDE \n \nAbb. 4: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen \nHistomorphologie humaner endometrialer Fragmente na ch 7tägiger Kultur in unbehandelten ( A) \nsowie behandelten (B-D) NOD-SCID Mäusen. ( B) Progesteron; ( C) Progesteron kombiniert mit \nForskolin; ( D) Progesteron kombiniert mit hCG. Die Schnitte wurden  mit Hämatoxylin und Eosin \ngefärbt und zeigen charakteristische Strukturen end ometrialen Gewebes. Bereiche mit \ndezidualisierten stromalen Zellen sind umrandet. DE  = Drüsenepithel; S = Stroma. Balken = 50 \nµm. ( E) Morphometrische Quantifizierung dezidualisierter Areale. Pro Behandlungsgruppe wurden \nvier Fragmente analysiert. Dargestellt ist der Mitt elwert ± Standardfehler. Der prozentuale Anteil \nder dezidualisierten Fläche an der Gesamtfläche des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und \ndie x-fache Fläche im Substanz behandelten Tier ent sprechend bestimmt. V = Vehikel; P = \nProgesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \n3.2.2.3  Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ekto pen humanen \nendometrialen Läsionen \n \nDer Grad der Dezidualisierung wurde in ektopen endometrialen Fragmenten nach Kultur in \nunterschiedlich behandelten NOD-SCID Mäusen mit Hil fe verschiedener \nDezidualisierungsmarker analysiert. \n \nDeziduales PRL und IGFBP-1\n \nDie Quantifizierung der klassischen Dezidualisierun gsmarker dPRL und IGFBP-1 in den \nektopen endometrialen Läsionen erfolgte auf Transkr iptionsebene durch eine quantitative \nPCR (Abb. 5AB). Während eine alleinige Substitution  mit Progesteron keinen Effekt \nzeigte, war eine leichte Erhöhung der Transkription  der Dezidualisierungsmarker dPRL \nund IGFBP-1 nach Behandlung mit Progesteron und Forskolin und ein signifikanter \n\nErgebnisse 42  \nAnstieg der dPRL - und IGFBP1 -Expression in den ektopen endometrialen Fragmenten  \nnach 7tägiger Kultur in NOD-SCID-Mäusen, die mit ei ner Kombination von Progesteron \nund hCG behandelt wurden, im Vergleich zum Vehikel und den anderen Behandlungen zu \nverzeichnen. Die Expression von dPRL  und IGFBP1  in den ektopen endometrialen \nFragmenten konnte somit durch cAMP-steigernde Subst anzen erhöht werden, wobei die \nApplikation von hCG zu einer signifikant höheren St eigung von IGFBP1  führte als \nForskolin. \n \nA B\nV P P + F P + hCG \n0\n2\n4\n6\n8\n10 *\n*\nIGFBP1 \n*\nrel. Genexpression \nV P P + F P + hCG \n0\n10 \n20 \n30 \n40 *\ndPRL \n*\nrel. Genexpression \n \nAbb. 5: Expression von dPRL  und IGFBP1  \nRelative Genexpression von dPRL  ( A) und IGFBP1  ( B) in ektopen humanen endometrialen \nFragmenten nach 7tägiger Kultur in NOD-SCID Mäusen.  Dargestellt ist der jeweilige Mittelwert ± \nStandardfehler der Expression dreier Patientinnen. Es wurde gegen das entsprechende ACTB -\nSignal abgeglichen. Die relative Expression des Veh ikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die \nx-fache Expression im Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. Die dPRL - und IGFBP1 -\nExpression ist nach kombinierter Behandlung von Pro gesteron und hCG signifikant hochreguliert \n(* p ≤ 0,05). V = Vehikel; P = Progesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \nDa dPRL- und IGFBP1-Proteine sezerniert werden, kom men sie nur in geringen Mengen \nin den sezernierenden Zellen vor. Aus diesem Grund war es nicht möglich, Prolaktin und \nIGFBP1 in Western Blots mit Proteinproben aus den i solierten ektopen Läsionen zu \ndetektieren. Diese Beobachtung stimmt mit denen and erer Gruppen überein (Birgit \nGellersen, persönliche Mitteilung). Um die dezidual isierten Areale näher zu analysieren, \nwurde daher in den in unbehandelten und behandelten  Mäusen kultivierten ektopen \nendometrialen Läsionen das Hormon dPRL immunhistoch emisch untersucht. Als \nPositivkontrolle wurde dezidualisiertes Gewebe eine r reifen Plazenta verwendet. Wie in \nAbb. 6A zu erkennen ist, wurden auch im Kontrollgew ebe nicht alle dezidualisierten \nZellen angefärbt, da das deziduale Prolaktin sezern iert wird und daher nicht zu jedem \nZeitpunkt in ausreichender Menge in allen Zellen vo rhanden ist um detektiert werden zu \n\nErgebnisse 43  \nkönnen. Eine ähnliche Färbung wurde in dezidualisie rten Arealen humaner ektoper \nendometrialer Fragmente nach Behandlung mit Progest eron und hCG beobachtet (Abb. \n6B). Nur die kombinierte Behandlung mit Progesteron  und hCG induzierte eine \nausreichende Menge an Prolaktinprotein, so dass die ses immunhistochemisch \nnachgewiesen werden konnte, während in allen andere n Versuchsgruppen keine \nimmunhistochemische Färbung beobachtet werden konnt e (Abb. 6C-E). Somit korrelierte \ndie in der quantitativen PCR beobachtete Expression ssteigerung mit einem Anstieg der \nProteinexpression in mit Progesteron und hCG behand eltem ektopen endometrialen \nGewebe. \n \ndPRL \nV P P + F P + hCG \n0\n10 \n20 \n30 \n40 gefärbte Schnitte [%] \nA B\nC D E\nK P + hCG \nV P P + F \nF\n \nAbb. 6: Immunhistochemischer Nachweis der dPRL-Expression \n(A-F) Immunhistochemischer Nachweis von dPRL. ( A) Färbung humaner Dezidua für dPRL \n(braun). ( B) Ektopes endometriales Fragment nach 7tägiger komb inierter Behandlung von \nProgesteron und hCG. Es ist eine deutliche stromale  Färbung zu erkennen. ( C) unbehandelte \nKontrolle; ( D) Progesteron; ( E) Progesteron kombiniert mit Forskolin. Balken A, B  = 30 µm, \nBalken C-E = 50 µm. ( F) Quantitative Auswertung de immunhistochemischen F ärbung für dPRL. \nK = Positivkontrolle; V = Vehikel; P = Progesteron;  F = Forskolin; hCG = humanes \nChoriongonadotropin.  \n\nErgebnisse 44  \nFOXO1 und GJA1  \nDie Expression der Dezidualisierungsmarker FOXO1  (Abb. 7A) und GJA1  (Abb. 7B) \nwurde sowohl durch die Behandlung mit Progesteron u nd Forskolin als auch durch \nProgesteron und hCG signifikant in den ektopen endometrialen Fragmenten hochreguliert. \n \nV P P + F P + hCG \n0\n2\n4\n6\n8\nFOXO1 \n**\nrel. Genexpression \nV P P + F P + hCG \n0\n1\n2\n3\n4\nGJA1 \n**\nrel. Genexpression \nA B\n \nAbb. 7: Expression von FOXO1  und GJA1  \nRelative Genexpression von FOXO1  ( A) und GJA1  ( B) in ektopen humanen endometrialen \nFragmenten nach 7tägiger Kultur in NOD-SCID-Mäusen. Dargestellt ist der jeweilige Mittelwert ± \nStandardfehler dreier Patientinnen. Es wurde gegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. \nDie relative Expression des Vehikelfragmentes wurde  gleich 1 gesetzt und die x-fache Expression \nim Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt.  * p ≤ 0,05 im Vergleich zur \nVehikelkontrolle. V = Vehikel; P = Progesteron; F =  Forskolin; hCG = humanes \nChoriongonadotropin. \n \nEs stellte sich heraus, dass selbst von dezidualisi ertem Gewebe einer reifen Plazenta 100 \nµg Gesamtprotein benötigt wurden, um die FOXO1-Expr ession mittels Western Blot \ndetektieren zu können. Diese Menge an Gesamtprotein  konnte aus den kleinen \nendometrialen Fragmenten nicht in ausreichendem Maß e isoliert werden. Daher wurde die \nFOXO1-Expression auf Proteinebene immunhistochemisc h analysiert und quantifiziert. \nDie immunhistochemischen Färbungen zeigten nur nach  kombinierter Behandlung mit \nProgesteron und hCG eine großflächige Expression vo n FOXO1 in den endometrialen \nStromazellen (Abb. 8D). Im Vehikelfragment und nach  Behandlung mit Progesteron \nalleine oder in Kombination mit Forskolin waren - w enn überhaupt - nur kleine Areale \nangefärbter Zellen zu beobachten (Abb. 8A-C). Die s emiquantitative Auswertung der \nimmunhistochemischen Färbungen zeigte 7 Tage nach d er Transplantation nur in den \nektopen Fragmenten, die in mit Progesteron und hCG behandelten Mäusen kultiviert \nwurden, eine signifikante Erhöhung der FOXO1-Expression im Vergleich zur Kontrolle. \n \n\nErgebnisse 45  \nA B\nC D\nE F\nV P P + F P + hCG \n0.0 \n0.5 \n1.0 \n1.5 \n2.0 \n2.5 \n*\nrelative Intensität / \nVehikelkontrolle \nD\nK\nP + F \nV\nP + hCG \nP\n \nAbb. 8: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression \nFOXO1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron ( B), Progesteron und \nForskolin ( C), Progesteron und hCG ( D) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 7 Tagen Kultur. \n(E) Färbung humaner Dezidua für FOXO1 als Positivkont rolle. Balken = 50 µm. ( F) \nSemiquantitative Auswertung der FOXO1-Färbung. Pro Behandlungsgruppe wurden vier \nFragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwer t ± Standardfehler. Die relative Intensität des \nVehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt. * p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikelkontrolle. K = \nPositivkontrolle; V = Vehikel; P = Progesteron; F =  Forskolin; hCG = humanes \nChoriongonadotropin. \n \nZur Lokalisation der GJA1-Expression wurde eine imm unhistochemische Färbung \ndurchgeführt. Als Positivkontrolle wurde dezidualis iertes Gewebe einer reifen Plazenta \nverwendet (Abb. 9E). Es war eine starke Färbung der  Membran dezidualisierter Zellen zu \nerkennen. In den Kontrollfragmenten (Abb. 9A) und d en mit Progesteron und Forskolin \n(Abb. 9C) behandelten Fragmenten waren vereinzelt Z ellen zu sehen, die eine Expression \nvon GJA1 zeigten. Nach Behandlung mit Progesteron a lleine (Abb. 9B) und nach \nkombinierter Behandlung von Progesteron und hCG (Ab b. 9D) war jedoch der \n\nErgebnisse 46  \nüberwiegende Teil der Stromazellen der jeweiligen F ragmente angefärbt. Endometriale \nDrüsenepithelzellen zeigten keine Expression von GJA1. \n \nA B\nD\nC\nE\nT\nD\nV P P + F \nKP + hCG \n \nAbb. 9: Immunhistochemischer Nachweis der GJA1-Expression \nGJA1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron ( B), Progesteron und \nForskolin ( C) und Progesteron und hCG ( D) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 7 Tagen \nKultur. ( E) Dezidualisiertes Gewebe einer reifen Plazenta als  Positivkontrolle. K = \nPositivkontrolle; V = Vehikel; P = Progesteron; F =  Forskolin; hCG = humanes \nChoriongonadotropin; T = Tropoblast; D = Dezidua. Balken = 40 µm. \n \nDas Gap Junction-Protein GJA1 ist ein membranständi ges Protein und konnte im \nGegensatz zu den sezernierten Proteinen Prolaktin u nd IGFBP1 gut im Western Blot \nnachgewiesen werden. Das GJA1-Protein liegt in der Zelle unterschiedlich stark \nphosphoryliert vor. Diese Phosphorylierungsstadien sind im Western Blot anhand drei \nunterschiedlicher Banden zu erkennen (Abb. 10B). De nsitometrisch ausgewertet wurde \nGJA1-Gesamtprotein unabhängig vom Phosphorylierungs status (Abb. 10A). \nKorrespondierend zu der quantitativen PCR stieg die  GJA1-Proteinexpression nach \nkombinierter Behandlung mit Progesteron und hCG im Vergleich zum Vehikel und den \nanderen Behandlungen am stärksten an, jedoch war di eser Anstieg nicht signifikant. Das \nErgebnis der Western Blot-Analyse korrelierte somit  zu der immunhistochemischen \nAusprägung der GJA1-Expression. \n\nErgebnisse 47  \nV P P + F P + hCG \n0.0 \n0.5 \n1.0 \n1.5 \n2.0 \n2.5 rel. Expression \nA B\nGJA1 \nGAPDH \nV P P+F P+hCG \nP0 \nP1 \nP2 \n \nAbb. 10: Expressionsanalyse von GJA1 \n(A) Densitometrische Auswertung der Western Blots für  GJA1 (n = 3). Angegeben sind die \nMittelwerte und die Standardfehler, die gegen das e ntsprechende GAPDH-Signal abgeglichen \nwurden. ( B) Repräsentativer Western Blot. Bei P0-P2 handelt e s sich um unterschiedliche \nPhosphorylierungsstadien von GJA1 (P0 = 41 kDa, P1 = 44 kDa, P2 = 46 kDa). V = Vehikel; P = \nProgesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \nCD82 \n \nDas CD82 ( cluster of differentiation 82 )-Protein, ein Zelloberflächenprotein der \nTetraspaninfamilie, ist in den Prozess der dezidual en Umbildung endometrialer \nStromazellen involviert und wird während der Dezidu alisierung heraufreguliert (Gellersen \net al., 2007). Da das Expressionslevel des Dezidual isierungsmarkers CD82 \nbekanntermaßen posttranskriptionell reguliert wird (Gellersen et al., 2007), wurde das \nCD82-Expressionslevel nur auf Proteinebene untersucht. Im Western Blot zeigte sich, dass \ndie CD82-Expression nach kombinierter Behandlung mi t Progesteron und Forskolin leicht \nanstieg. Diese Tendenz war nach kombinierter Behand lung mit Progesteron und hCG noch \netwas stärker (Abb. 11). Der beobachtete Anstieg na ch Behandlung mit Forskolin oder \nhCG war jedoch nicht signifikant. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbb. 11: Expressionsanalyse von CD82  \n(A) Densitometrische Auswertung der Western Blots für  CD82. Angegeben sind die Mittelwerte \nund die Standardabweichungen der verschiedenen Messungen (n = 3), die gegen das entsprechende \nGAPDH-Signal abgeglichen wurden. ( B) Repräsentativer Western Blot. V = Vehikel; P = \nProgesteron; F = Forskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin. \nV P P + F P + hCG \n0.0 \n0.5 \n1.0 \n1.5 \n2.0 rel. Expression \nA B\nCD82 \nGAPDH \nV P P+F P+hCG \n\n\nErgebnisse 48  \nAuch für den immunhistochemischen Nachweis von CD82  wurde als Positivkontrolle \ndezidualisiertes Gewebe einer reifen Plazenta verwe ndet. In Abb. 12E ist eine spezifische \nFärbung des membrandurchspannenden Glykoproteins in  der Membran dezidualisierter \nZellen zu erkennen. Die ektopen endometrialen Geweb efragmente aus den Kontrolltieren \n(Abb. 12A) sowie aus den nur mit Progesteron behand elten Tieren (Abb. 12B) zeigten \nkeine Färbung für CD82. Nach Behandlung mit Progest eron und Forskolin waren größere \nZellareale zu beobachten, in denen die Zellmembrane n angefärbt waren (Abb. 12C). Nach \nkombinierter Behandlung von Progesteron und hCG war  fast das ganze Fragment \nspezifisch gefärbt (Abb. 12D). Die immunhistochemis che Färbung spiegelte somit das \nErgebnis der Western Blot-Analyse zur CD82-Expression wider. \n \nA B\nD\nC\nE\nT\nD\nV P P + F \nKP + hCG \n \nAbb. 12: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression \nCD82-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron ( B), Progesteron und \nForskolin ( C) und Progesteron und hCG ( D) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 7 Tagen \nKultur. ( E) Dezidualisiertes Gewebe einer reifen Plazenta als  Positivkontrolle. K = \nPositivkontrolle; V = Vehikel; P = Progesteron; F =  Forskolin; hCG = humanes \nChoriongonadotropin; T = Tropoblast; D = Dezidua. Balken A-E = 50 µm.  \n \n3.2.2.4  Proliferation der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nEs konnte in den vorhergehenden Kapiteln gezeigt we rden, dass humanes ektopes \nendometriales Gewebe in vivo  durch eine Kombination von Progesteron und einer c AMP-\nsteigernden Substanz dezidualisiert werden kann. Da her wurde als nächstes untersucht, ob \n\nErgebnisse 49  \nmit dieser kombinierten Behandlung auch ein Prolife rationsstopp in den ektopen \nendometrialen Läsionen hervorgerufen wird. Der Prol iferationsmarker Ki-67 wurde dazu \nimmunhistochemisch analysiert, um einen Effekt der unterschiedlichen Behandlungen auf \ndie Proliferation der in NOD-SCID-Mäusen kultiviert en endometrialen Fragmente zu \nuntersuchen. Die mit Ki-67 gefärbten Zellkerne im Drüsenepithel sowie im Stroma wurden \nim Verhältnis zur Gesamtzahl der Epithel- bzw. Stro mazellen ausgezählt und als \nprozentuale Proliferationsrate angegeben. \n \nV P P + F P + hCG \n0\n5\n10 \n15 \n20 \n25 \nStromazellen \n Proliferationsrate [%] \nV P P + F P + hCG \n0\n10 \n20 \n30 \n40 \n50 \nDrüsenepithelzellen \n Proliferationsrate [%] \nA B\nC D\nE F\nV P\nP + F P + hCG \n \nAbb. 13: Proliferation der ektopen Läsionen \nNachweis der Proliferation in humanen endometrialen  Fragmenten nach Kultivierung in der NOD-\nSCID Maus über 7 Tage unter Behandlung verschiedene r Substanzen. (A-D) \nImmunhistochemische Färbung mit einem Antikörper ge gen den Proliferationsmarker Ki-67. Die \nZellkerne proliferierender Zellen sind braun gefärbt. Es wurde eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin \ndurchgeführt. ( A) Vehikel; ( B) Progesteron; ( C) Progesteron + Forskolin; ( D) Progesteron + hCG. \nBalken: = 50 µm. (E,F) Quantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbung der \nStromazellen (E) sowie Drüsenepithelzellen ( F). Pro Behandlungsgruppe wurden vier Fragmente \nanalysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standa rdfehler. V = Vehikel; P = Progesteron; F = \nForskolin; hCG = humanes Choriongonadotropin.\n \n\nErgebnisse 50  \nDie quantitative Auswertung der immunhistochemische n Färbungen ergab für das Stroma \nsowie das Drüsenepithel der mit Progesteron alleine  und für das Stroma der mit \nProgesteron und Forskolin behandelten endometrialen  Fragmente eine tendenziell erhöhte \nProliferationsrate im Vergleich zur Vehikelkontroll e (Abb. 13EF), während die \nProliferationsrate im Drüsenepithel nach 7tägiger k ombinierter Behandlung mit \nProgesteron und hCG reduziert war (Abb. 13F). Im St roma der ektopen endometrialen \nFragmente war die Proliferationsrate nach kombinier ter Behandlung mit Progesteron und \nhCG niedriger im Vergleich zur Behandlung mit Proge steron alleine oder in Kombination \nmit Forskolin, es war jedoch kein Unterschied im Ve rgleich zur Kontrolle zu beobachten \n(Abb. 13E). \n \n3.3  Vergleich des Effektes der Kombination von hCG mit Progesteron \nbzw. Medroxyprogesteronacetat (MPA) auf die Dezidualisierung \n \nMedroxyprogesteronacetat (MPA) ist ein synthetische s Gestagen, welches zusätzlich zu \nden Progesteronrezeptoren auch an die Glucocorticoi drezeptoren bindet und diese aktiviert \n(Moghissi und Boyce, 1976; Bruner-Tran et al., 2006 ). In vitro  erzielt die kombinierte \nGabe von MPA und cAMP einen stärkeren Effekt auf di e Dezidualisierung humaner \nendometrialer Stromazellen als die Gabe von Progest eron und cAMP, während MPA \nalleine nur einen schwachen Effekt auf die Dezidual isierung auslöst (Gellersen und \nBrosens, 2003). In der vorliegenden Arbeit wurde da her untersucht, ob MPA in \nKombination mit hCG auch auf die Dezidualisierung v on ektopem humanem \nEndometriumgewebe in vivo  besser wirkt als Progesteron und hCG. Hierzu wurde  pro \nVersuchsansatz Gewebe einer Patientin parallel in d rei NOD-SCID-Mäuse transplantiert. \nDie Mäuse erhielten folgende Behandlungen: 1. Proge steron (50 µg/d) + hCG (7,5 IU/d), \n2. MPA (50 µg/d) + hCG (7,5 IU/d), 3. Vehikelkontro lle. Zudem wurde die Dauer der \nBehandlung von 7 auf 10 Tage erhöht um zu untersuch en, ob der Effekt auf die \nDezidualisierung durch eine längere Behandlung gest eigert werden kann. 24 Stunden nach \nder letzten Applikation wurden die endometrialen Ge webefragmente entnommen und \naufgearbeitet. \n \n \n\nErgebnisse 51  \n3.3.1  Effekt auf das Uterusgewicht der Maus \n \nNach Beendigung des Versuches wurde den NOD-SCID-Mä usen der Uterus entnommen \nund das Naßgewicht bestimmt. Das Organgewicht wurde  auf das Körpergewicht der Maus \nbezogen und prozentual dargestellt. Die Uterusgewic hte zeigten keine Unterschiede \nzwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen (Abb. 14). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbb. 14: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach 10tägiger Behandlung \nDargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler der  Uterusgewichte als prozentualer Anteil am \nKörpergewicht (KG) nach 10tägiger Behandlung der NO D-SCID Mäuse. Es zeigt sich kein \nUnterschied zwischen den Versuchsgruppen (n = 5). V  = Vehikel; P = Progesteron; MPA = \nMedroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \n3.3.2  Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen \n3.3.2.1  Größe und Gewicht der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nNach 10 Tagen Kultur wurden den unterschiedlich beh andelten NOD-SCID-Mäusen die \nendometrialen Gewebefragmente entnommen und deren Größe und Gewicht bestimmt. Die \nkombinierte Behandlung mit MPA und hCG hatte ebenso  wie die Behandlung mit \nProgesteron und hCG keinen Einfluss auf die Größe d er endometrialen Gewebefragmente \n(Abb. 15A). Tendenziell zeigte sich eine Zunahme de s Gewichtes der endometrialen \nLäsionen nach Behandlung mit Progesteron bzw. MPA u nd hCG im Vergleich zur \nKontrolle, jedoch zeigte sich kein signifikanter Un terschied zwischen den \nVersuchsgruppen (Abb. 15B). \n \nV P + hCG MPA + hCG \n0.0 \n0.2 \n0.4 \n0.6 \n0.8 \n1.0 Uterusgewicht/KG [%] \n\nErgebnisse 52  \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n1\n2\n3\n4\n5Größe [mm 2]\nV P + hCG MPA + hCG \n0\n1\n2\n3\n4Gewicht [mg] \nA B\n \nAbb. 15: Wachstumsverhalten der ektopen Läsionen \nGröße ( A) und Gewicht ( B) der humanen endometrialen Fragmente nach 10tägiger Kultur in NOD-\nSCID Mäusen. Pro Behandlungsgruppe wurden 20 Fragme nte analysiert. Gewicht und Größe sind \nals Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. V = Ve hikel; P = Progesteron; MPA = \nMedroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \n3.3.2.2  Morphologie der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nNach 10tägiger Kultur und Behandlung in der NOD-SCI D-Maus wurde die Morphologie \nder ektopen humanen endometrialen Läsionen untersuc ht. In den Kontrollfragmenten \n(Abb. 16A) waren - wie zuvor nach 7tägiger Behandlu ng (vgl. Abb. 4A) - nur kleine \nAreale dezidualisierter Zellen zu erkennen. Nach Behandlung mit hCG in Kombination mit \nProgesteron (Abb. 16B) bzw. mit MPA (Abb. 16C) ware n große dezidualisierte Areale zu \nbeobachten. Die morphometrische Quantifizierung erg ab eine signifikante Zunahme \ndezidualisierter Areale nach 10tägiger kombinierter  Behandlung mit hCG und Progesteron \nbzw. MPA (Abb. 16D), jedoch waren die interindividu ellen Schwankungen nach \nBehandlung mit MPA und hCG sehr hoch. Schon bei der  morphologischen Betrachtung \nder ektopen Läsionen fiel auf, dass das Gewebe manc her Patientinnen nur schwach auf \nMPA ansprach, wohingegen in dem Gewebe anderer Pati entinnen eine extrem starke \nDezidualisierungsreaktion ausgelöst wurde. Es zeigt e sich jedoch kein signifikanter \nUnterschied zwischen den Behandlungen mit den beiden verschiedenen Gestagenen. \n \n\nErgebnisse 53  \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n1.0 ×× ××10 6\n2.0 ×× ××10 6\n3.0 ×× ××10 6\n*\n*\nrel. dezidualisierte Fläche \nC D\nA B\nV P + hCG \nMPA + hCG \n \nAbb. 16: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen \nHistomorphologie humaner endometrialer Fragmente na ch 10tägiger Kultur in unbehandelten ( A) \nsowie mit Progesteron und hCG ( B) und MPA und hCG ( C) behandelten NOD-SCID Mäusen. Die \nSchnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt u nd zeigen charakteristische Strukturen \nendometrialen Gewebes. Bereiche mit dezidualisierte n stromalen Zellen sind umrandet. Balken = \n50 µm. ( D) Morphometrische Quantifizierung dezidualisierter Areale. Pro Behandlungsgruppe \nwurden fünf Fragmente analysiert. Dargestellt ist d er Mittelwert ± Standardfehler. Der prozentuale \nAnteil der dezidualisierten Fläche an der Gesamtflä che des Vehikelfragmentes wurde gleich 1 \ngesetzt und die x-fache Fläche im Substanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. * p ≤ 0,05 im \nVergleich zur unbehandelten Kontrolle. V = Vehikel;  P = Progesteron; MPA = \nMedroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \n3.3.2.3  Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ekto pen humanen \nendometrialen Läsionen \n \nDer Grad der Dezidualisierung in den ektopen endome trialen Fragementen wurde nach \n10tägiger Behandlung und Kultur in NOD-SCID-Mäusen mit Hilfe verschiedener \nDezidualisierungsmarker analysiert. Im Folgenden wu rde nur noch deziduales PRL als \neiner der beiden Hauptsekretionsprodukte dezidualis ierter Zellen als spezifischer Marker \nuntersucht. \n \n\nErgebnisse 54  \ndPRL \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n200 \n400 \n600 \n800 \n*** \nrel. Genexpression \nFOXO1 \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n20 \n40 \n60 \nrel. Genexpression \nA B\nFOXO1 \n \n \nAbb. 17: Expression verschiedener Dezidualisierungsmarker auf Transkriptionsebene \nRelative Genexpression von dPRL  ( A) und FOXO1  ( B) in ektopen humanen endometrialen \nFragmenten nach 10tägiger Kultur in NOD-SCID Mäusen . Dargestellt ist der jeweilige Mittelwert \n± Standardfehler ektoper Fragmente fünf verschieden er Patientinnen. Es wurde gegen das \nentsprechende ACTB -Signal abgeglichen. Die relative Expression des Ve hikelfragmentes wurde \ngleich 1 gesetzt und die x-fache Expression im Subs tanz behandelten Tier entsprechend bestimmt. \nDie dPRL -Expression ist nach kombinierter Behandlung von Pr ogesteron und hCG im Vergleich \nzur unbehandelten Kontrolle signifikant hochreguliert (*** ≤ 0,005). V = Vehikel; P = Progesteron; \nMPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \nIn Abb. 17A sind die Ergebnisse der quantitativen P CR für die dPRL -Expression in den \nektopen humanen endometrialen Fragmente dargestellt . Hierbei zeigte sich nach \nkombinierter Behandlung mit Progesteron und hCG ein e stark signifikante Erhöhung der \ndPRL -Expression (p = 0,005) im Vergleich zur Vehikelkon trolle. Somit ruft eine 10tägige \nBehandlung offensichtlich einen deutlicheren Effekt  hervor als eine 7tägige Behandlung \n(vgl. Abb. 5). Die kombinierte Behandlung von MPA u nd hCG führte zwar ebenfalls zu \neiner erhöhten dPRL -Expression, diese war jedoch nicht signifikant, obwohl der Mittelwert \neiner 350fachen Expressionserhöhung im Vergleich zu m Vehikel entspach, da das \nEndometriumgewebe mancher Patientinnen auf diese Behandlung kaum mit einem Anstieg \nder dPRL -Expression reagierte. \nIm Hinblick auf die Transkription von FOXO1  zeigte sich nach täglicher Applikation von \nhCG in Kombination mit Progesteron bzw. MPA über ei nen Zeitraum von 10 Tagen ein \ntendenzieller Anstieg der FOXO1 -Expression in den ektopen endometrialen Fragmenten  \nim Vergleich zur Kontrolle (Abb. 17B). Auch bei die ser Expressionsanalyse bestätigte \nsich, dass nach einer kombinierten Behandlung von M PA und hCG die interindividuellen \nSchwankungen deutlich höher waren als nach kombinie rter Behandlung von Progesteron \nund hCG, was zu einem deutlich höheren Standardfehler führte. \n \n\nErgebnisse 55  \nZur Untersuchung der FOXO1-Expression auf Proteineb ene in den ektopen humanen \nendometrialen Fragmenten nach 10tägiger Behandlung und Kultur in NOD-SCID-Mäusen \nwurde ein immunhistochemischer Nachweis durchgeführ t (Abb. 18A-C). \nVehikelfragmente zeigten keine Expression von FOXO1  (Abb. 18A). Nach Behandlung \nmit hCG in Kombination mit Progesteron bzw. MPA war  eine großflächige nukleäre \nExpression von FOXO1 in den dezidualisierten Stomaz ellen zu erkennen (Abb. 18BC). \nDie semiquantitative Auswertung der immunhistochemi schen Färbungen zeigte eine \nsignifikante Erhöhung der FOXO1-Expression im Vergl eich zur Vehikelkontrolle in den \nektopen Fragmenten, welche mit Progesteron bzw. MPA und hCG behandelt wurden (Abb. \n18). Hierbei zeigte sich kein signifikanter Untersc hied zwischen den beiden verschiedenen \nGestagenen. \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n2\n4\n6\n8\n10 \n*\n*\nrelative Intensität / \nVehikelkontrolle \nA B\nC D\nV P + hCG \nMPA + hCG \n \nAbb. 18: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression \nFOXO1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron und hCG ( B) und mit \nMPA und hCG ( C) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 10 Tagen Kultur.  Balken = 50 µm. ( D) \nSemiquantitative Auswertung der FOXO1-Färbung. Pro Behandlungsgruppe wurden fünf \nFragmente analysiert. Dargestellt ist der Mittelwer t ± Standardfehler. Die relative Intensität des \nVehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt. * p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikelkontrolle. V = \nVehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesterona cetat; hCG = humanes \nChoriongonadotropin. \n \nIm Hinblick auf die Expression von GJA1  zeigte sich nach 10tägiger kombinierter \nBehandlung von hCG mit Progesteron bzw. MPA keine S teigerung der Transkription im \n\nErgebnisse 56  \nVergleich zur Kontrolle (Abb. 19A). Es zeigte sich jedoch eine gesteigerte GJA1-\nProteinexpression in den unterschiedlich behandelte n ektopen humanen endometrialen \nLäsionen, die aber nicht signifikant war (Abb. 19BC ). Die immunhistochemische Analyse \nder GJA1-Expression zeigte in den Kontrollfragmente n vereinzelt Zellen, die an der \nMembran eine Expression von GJA1 aufwiesen (Abb. 19 D). Nach kombinierter \nBehandlung mit hCG und Progesteron (Abb. 19E) bzw. MPA (Abb. 19F) waren die \nMembranen fast aller Stromazellen der jeweiligen Fr agmente angefärbt. Durch diesen \nimmunhistochemischen Nachweis der GJA1-Expression k onnte gezeigt werden, dass der \nim Western Blot gezeigte Anstieg der Proteinexpress ion auf einer gesteigerten Expression \nvon GJA1 im Stroma beruht. \n \nC\nGJA 1 \nGAPDH \nV\n P + \n hCG \nMPA  + \n hCG \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n2\n4\n6\n8rel. Proteinexpression \nBA\nFED\nP0 \nP1 \nP2 \nV P + hCG MPA  + hCG \nV P + hCG MPA + hCG \n0.0 \n0.5 \n1.0 \n1.5 \n2.0 \n2.5 rel. Genexpression \n \nAbb. 19: Expressionsanalyse von GJA1 \nExpression von GJA1 in ektopen humanen endometriale n Fragmenten fünf verschiedener \nPatientinnen nach 10tägiger Kultur in NOD-SCID Mäus en. ( A) Dargestellt ist der jeweilige \nMittelwert ± Standardfehler der Ergebnisse der quan titativen Echtzeit-PCR zur GJA1 -Expression. \nEs wurde gegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. Die relative Prolaktinexpression des \nVehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x- fache Expression im Substanz behandelten \nTier entsprechend bestimmt. ( B) Densitometrische Auswertung von Western Blots zur  GJA1-\nExpression. Angegeben sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen der verschiedenen \nMessungen, die gegen das entsprechende GAPDH-Signal  abgeglichen worden sind. ( C) \nRepräsentativer Western Blot. P0-P2 = unterschiedliche Phosphorylierungsstadien von GJA1 (P0 = \n41 kDa, P1 = 44 kDa, P2 = 46 kDa). (D-F) Immunhistochemischer Nachweis der GJA1-Expression \nnach Kultivierung in unbehandelten ( D), mit Progesteron und hCG ( E) und MPA und hCG ( F) \nbehandelten NOD-SCID-Mäusen nach 10 Tagen Kultur. B alken = 50 µm. V = Vehikel; P = \nProgesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \nDie CD82-Expression wurde auf Proteinebene immunhis tochemisch analysiert und \nquantifiziert. Die ektopen endometrialen Gewebefrag mente aus den Kontrolltieren wiesen \n\nErgebnisse 57  \nkeine Membranfärbung für CD82 auf (Abb. 20A). Nach Behandlung mit hCG in \nKombination mit Progesteron bzw. MPA war eine Expre ssion von CD82 an den \nZellmembranen der Stromazellen zu beobachten (Abb. 20BC). Die semiquantitative \nAuswertung der immunhistochemischen Färbungen ergab  eine tendenzielle Erhöhung der \nCD82-Expression im Vergleich zur Vehikelkontrolle  nach Behandlung mit hCG in \nKombination mit beiden Gestagenen (Abb. 20D). \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n2\n4\n6\nrelative Intensität / \nVehikelkontrolle \nA B\nC D\nMPA +hCG \nV P + hCG \n \nAbb. 20: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression \nCD82-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A), mit Progesteron und hCG ( B) und mit \nMPA und hCG ( C) behandelten NOD-SCID-Mäusen nach 10 Tagen Kultur.  Balken = 50 µm. ( D) \nSemiquantitative Auswertung der CD82-Färbung. Pro B ehandlungsgruppe wurden fünf Fragmente \nanalysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standa rdfehler. Die relative Intensität des \nVehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt. V = Vehik el; P = Progesteron; MPA = \nMedroxyprogesteronacetat; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \n3.3.2.4  Proliferation der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nDie quantitative Auswertung der immunhistochemische n Färbungen des \nProliferationsmarkers Ki-67 zeigte eine tendenziell  reduzierte Proliferationsrate des \nStromas der für 10 Tage mit Progesteron und hCG beh andelten endometrialen Fragmente \nsowie eine abgesenkte Proliferationsrate der Drüsen epithelzellen bei der Kombination von \n\nErgebnisse 58  \nhCG mit beiden Gestagenen im Vergleich zur Vehikelk ontrolle (Abb. 21). Diese \nUnterschiede waren aber nicht signifikant. \n \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n5\n10 \n15 \nStromazellen \nProliferationsrate [%] \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n20 \n40 \n60 \nDrüsenepithelzellen \nProliferationsrate [%] \nCBA\nV P + hCG MPA + hCG \nED\n \nAbb. 21: Proliferation der ektopen Läsionen \nNachweis der Proliferation humaner endometrialer Fragmente nach Kultivierung in der NOD-SCID \nMaus über 10 Tage unter Behandlung verschiedener Su bstanzen. ( A-C) Immunhistochemie mit \neinem Antikörper gegen den Proliferationsmarker Ki-67. Die Zellkerne proliferierender Zellen sind \nbraun gefärbt. Es wurde eine Gegenfärbung mit Hämat oxylin durchgeführt. ( A) Vehikel; ( B) \nProgesteron und hCG; ( C) MPA und hCG. Balken: = 40 µm. Quantitative Auswer tung der \nimmunhistochemischen Färbung der Stromazellen ( D) sowie Drüsenepithelzellen ( E). Pro \nBehandlungsgruppe wurden vier Fragmente analysiert.  Dargestellt ist der Mittelwert ± \nStandardfehler. V = Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogesteronacetat; hCG = humanes \nChoriongonadotropin. \n \n3.4  Entzug von Dezidualisierungsinduktoren \n \nWie zuvor beschrieben wird diskutiert, dass Endomet rioseherde während einer \nSchwangerschaft dezidualisieren und nach der Geburt  apoptotisch werden können (Moen \nund Muus, 1991).\n Für Letzteres könnte der Entzug von Progesteron ver antwortlich sein \n(Healy und Hodgen, 1983). Aus diesem Grund wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, bei \nder nach 10 Tagen die Behandlung zur Induktion der Dezidualisierung der in NOD-SCID-\nMäuse transplantierten humanen endometrialen Fragme nte beendet und die Kultur für \nweitere 7 Tage ohne Behandlung fortgesetzt wurde. N ach diesem Zeitraum wurden die \n\nErgebnisse 59  \nFragmente analysiert. Da sich in den vorangegangene n Versuchen gezeigt hatte, dass die \nstärkste Induktion der Dezidualisierung mit Progest eron in Kombination mit hCG erreicht \nwerden konnte, wurde diese Behandlung für die folge nden Versuche eingesetzt. Für jeden \nVersuch wurde das Gewebe derselben Patientin parall el in zwei NOD-SCID-Mäuse \ntransplantiert. Einer dieser Mäuse wurde Progestero n (50 µg/d) + hCG (7,5 IU/d) \nappliziert. Die zweite Maus diente als Vehikelkontr olle. Die Substanzapplikation erfolgte \nüber einen Zeitraum von 10 Tagen. Nach einem Zeitra um von 17 Tagen wurden die \nendometrialen Gewebefragmente entnommen und aufgearbeitet. \n \n3.4.1  Effekt auf das Uterusgewicht der Maus \n \nUm die Wirkung der applizierten Substanzen auf den Uterus als Zielorgan zu überprüfen, \nwurden auch bei dieser Versuchsreihe die Uterusgewichte der Mäuse nach Beendigung des \nVersuches ermittelt (Abb. 22). Zwar zeigte sich ein  erhöhtes Uterusgewicht nach der \nBehandlung mit Progesteron und hCG, jedoch war dies nicht signifikant. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbb. 22: Uterusgewichte der NOD-SCID Mäuse nach Behandlung \nDargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler der  Uterusgewichte als prozentualer Anteil am \nKörpergewicht (KG) nach Kultivierung und Behandlung in NOD-SCID Mäusen. V = Vehikel; P = \nProgesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \n \n3.4.2  Effekt auf die humanen ektopen endometrialen Läsionen \n3.4.2.1  Größe und Gewicht der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nNach 17 Tagen wurden den Mäusen die endometrialen G ewebefragmente entnommen und \nderen Gewicht und Größe bestimmt. Während sich nach 10tägiger Behandlung eine leichte \nErhöhung des Gewichtes gezeigt hatte (vgl. Abb. 15) , war nach weiteren 7 Tagen ohne \nBehandlung kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle zu beobachten (Abb. 23). \nV P + hCG \n0.0 \n0.5 \n1.0 \n1.5 Uterusgewicht/KG [%] \n\nErgebnisse 60  \nV P + hCG \n0\n1\n2\n3\n4Größe [mm 2]\nV P + hCG \n0\n1\n2\n3\n4Gewicht [mg] \nA B\n \nAbb. 23: Wachstumsverhalten der ektopen Läsionen \nGröße ( A) und Gewicht ( B) der humanen endometrialen Fragmente dreier versch iedener \nPatientinnen nach 10tägiger Kultur und Behandlung i n NOD-SCID Mäusen und weiterer 7tägiger \nKultur ohne Behandlung. Pro Behandlungsgruppe wurde n 12 Fragmente analysiert. Gewicht und \nGröße sind als Mittelwert ± Standardfehler dargeste llt. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = \nhumanes Choriongonadotropin. \n \n \n3.4.2.2  Morphologie der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nNach einer 10tägigen Behandlung mit Progesteron und  hCG gefolgt von 7 Tagen ohne \nBehandlung wurden die ektopen humanen endometrialen  Läsionen histomorphologisch \nuntersucht. Während in den Kontrollfragmenten nur k leine Areale dezidualisierter Zellen \nzu erkennen waren (Abb. 24A), zeigten sich in den b ehandelten Läsionen deutlich größere \ndezidualisierte Areale (Abb. 24B). Die morphometris che Auswertung dieser Areale zeigte, \ndass die Gesamtfläche dezidualisierten Stromas im V ergleich zur Kontrolle erhöht war \n(Abb. 24C). Im Gegensatz zu den unter 3.3.2.2 besch riebenen Versuchen, bei denen nach \neiner 10tägigen Behandlung mit Progesteron und hCG ein signifikanter Anstieg der \ndezidualisierten Fläche beobachtet wurde (vgl. Abb.  16), war dieser Anstieg nach weiteren \n7 Tagen Kultur ohne Behandlung nicht mehr signifikant. \n \n\nErgebnisse 61  \nV P + hCG \n0\n2\n4\n6\n8rel. dezidualisierte Fläche \nA B\nC\nV P + hCG \n \nAbb. 24: Histomorphologische Analyse der ektopen Läsionen \nHistomorphologie humaner endometrialer Fragmente na ch 10tägiger Kultur in NOD-SCID \nMäusen, die mit Progesteron und hCG bzw. dem Vehike l behandelt wurden und weiterer 7tägiger \nKultur ohne Behandlung. ( A) Vehikelkontrolle, ( B) Behandlung mit Progesteron und hCG. Die \nSchnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt u nd zeigen charakteristische Strukturen \nendometrialen Gewebes. Balken = 50 µm. ( C) Morphometrische Quantifizierung dezidualisierter \nAreale. Pro Behandlungsgruppe wurden drei Fragmente  analysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± \nStandardfehler. Der prozentuale Anteil der dezidual isierten Fläche an der Gesamtfläche des \nVehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt und die x- fache Fläche im Substanz behandelten Tier \nentsprechend bestimmt. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \n3.4.2.3  Expression von Dezidualisierungsmarkern in den ekto pen humanen \nendometrialen Läsionen \n \nDer Grad der Dezidualisierung in den ektopen endome trialen Fragmenten wurde nach \n17tägiger Kultur in NOD-SCID-Mäusen wie in den vorh ergehenden Versuchsreihen mit \nHilfe verschiedener Dezidualisierungsmarker analysiert. \n \nIn Abb. 25 sind die Ergebnisse der quantitativen PC R für dPRL  und FOXO1  in den \nektopen humanen endometrialen Fragmenten von drei v erschiedenen Patientinnen nach \n10tägiger Behandlung und weiterer 7tägiger Kultur o hne Behandlung in NOD-SCID-\nMäusen dargestellt. Die signifikante Erhöhung der dPRL -Expression, die bereits in der \nvorhergehenden Versuchsreihe nach 10tägiger kombini erter Behandlung mit Progesteron \n\nErgebnisse 62  \nund hCG gezeigt wurde (vgl. Abb. 17A), stieg nach 1 0tägiger Behandlung mit Progesteron \nund hCG und anschließender 7tägiger Kultur ohne Beh andlung in den ektopen \nendometrialen Fragmenten nochmals deutlich an (Abb.  25A). Im Gegensatz hierzu zeigte \nsich im Hinblick auf die die Expression des Dezidua lisierungsmarkers FOXO1  kein \nsignifikanter Unterschied zur Kontrolle (Abb. 25B). \n \nFOXO1 \nV P + hCG \n0\n2\n4\n6\n8\n10 \nrel. Genexpression \nA B\ndPRL \nV P + hCG \n0\n100 \n200 \n300 \n400 \n500 \n15000 \n35000 *\nrel. Genexpression \n \nAbb. 25: Relative Expression von dPRL  und FOXO1  auf Transkriptionsebene \nRelative Genexpression von dPRL  ( A) und FOXO1  ( B) in ektopen humanen endometrialen \nFragmenten nach 10tägiger bzw. 17tägiger Kultur in NOD-SCID Mäusen. Dargestellt sind die \nErgebnisse der quantitativen Echtzeit-PCR ektoper F ragmente dreier Patientinnen als Mittelwert ± \nStandardfehler. Es wurde gegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. Die dPRL -\nExpression ist nach kombinierter Behandlung mit Pro gesteron und hCG signifikant hochreguliert \n(* ≤ 0,05). V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \nAuf Proteinebene zeigten die Kontrollen nach 17tägi ger Kultur in NOD-SCID-Mäusen \neine schwache Expression von FOXO1 in der immunhist ochemischen Untersuchung (Abb. \n26A). Eine solche Expression war in den vorhergehen den Versuchsreihen nach kürzerer \nKulturdauer in den endometrialen Kontrollfragmenten  nicht zu beobachten (vgl. Abb. 8A \nund Abb. 18A). Nach 10tägiger Behandlung mit Proges teron und hCG und anschließender \n7tägiger Kultur ohne Behandlung in der NOD-SCID-Mau s wiesen größere Bereiche der \nektopen Fragmente eine Expression von FOXO1 in den endometrialen Stromazellen auf \n(Abb. 26B). Die semiquantitative Auswertung der imm unhistochemischen Färbungen \nergab jedoch keine signifikanten Unterschiede zwisc hen unbehandelten und behandelten \nFragmenten (Abb. 26C). \n \n\nErgebnisse 63  \nV P + hCG \n0\n1\n2\n3\n4\n5relative Intensität \nA\nC\nV P + hCG \nB\nrelative Intensität / \nVehikelkontrolle \n \nAbb. 26: Immunhistochemischer Nachweis der FOXO1-Expression \nFOXO1-Expression nach Kultivierung in unbehandelten  ( A) und mit Progesteron und hCG \nbehandelten ( B) NOD-SCID-Mäusen nach 17 Tagen Kultur. Balken = 40 µm. ( D) Semiquantitative \nAuswertung der FOXO1-Färbung. Pro Behandlungsgruppe  wurden drei Fragmente analysiert. \nDargestellt ist der Mittelwert ± Standardfehler. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes \nChoriongonadotropin.  \n \nDie Transkription von GJA1  unterschied sich nach 10tägiger kombinierter Behan dlung mit \nProgesteron und hCG und nachfolgender 7tägiger Kult ur ohne Behandlung nicht \nsignifikant von der Kontrolle (Abb. 27). \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbb. 27: Relative Expression von GJA1  auf Transkriptionsebene \nRelative Genexpression von GJA1  in ektopen humanen endometrialen Fragmenten drei \nverschiedener Patientinnen nach 17tägiger Kultur in  NOD-SCID Mäusen. Dargestellt ist der \njeweilige Mittelwert ± Standardfehler der Ergebniss e der quantitativen Echtzeit-PCR. Es wurde \ngegen das entsprechende ACTB -Signal abgeglichen. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = \nhumanes Choriongonadotropin. \nGJA1 \nV P + hCG \n0\n1\n2\n3\n4\n5\nrel. Genexpression \n\nErgebnisse 64  \nEine leichte Erhöhung der GJA1-Proteinexpression, w ie sie in der Western Blot-Analyse \nnach 10tägiger Behandlung mit Progesteron und hCG i n den ektopen humanen \nendometrialen Läsionen gezeigt wurde (vgl. Abb. 19B ), blieb auch nach weiteren 7 Tagen \nKultur ohne Behandlung erhalten, war jedoch nicht s ignifikant (Abb. 28A). Eine stärkere \nGJA1-Proteinexpression zeigte sich auch in den beha ndelten ektopen Fragmenten nach \n17tägiger Kultur im Vergleich zur Kontrolle in der immunhistochemischen Analyse (Abb. \n28C). \n \nV P + hCG \n0\n1\n2\n3\n4\nrel. Genexpression \nGJA1 \nGAPDH \nV\nP + \nhCG \nP0 \nP1 \nP2 \nA\nC\nV P + hCG \nB\nD\n \nAbb. 28: Expressionsanalyse von GJA1 auf Proteinebene \nExpression von GJA1 in ektopen humanen endometriale n Fragmenten drei verschiedener \nPatientinnen nach 17tägiger Kultur in NOD-SCID Mäus en. ( A) Densitometrische Auswertung von \nWestern Blots zur GJA1-Expression. Angegeben sind d ie Mittelwerte und die \nStandardabweichungen der verschiedenen Messungen, d ie gegen das entsprechende GAPDH-\nSignal abgeglichen worden sind. ( B) Repräsentativer Western Blot. P0-P2 = unterschied liche \nPhosphorylierungsstadien von GJA1 (P0 = 41 kDa, P1 = 44 kDa, P2 = 46 kDa). (CD) \nImmunhistochemischer Nachweis der GJA1-Expression n ach Kultivierung in unbehandelten ( C) \nund Progesteron und hCG behandelten ( D) NOD-SCID-Mäusen nach 17 Tagen Kultur. Balken = \n40 µm. V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin. \n \nDie immunhistochemische Analyse der CD82-Expression  zeigte in den \nKontrollfragmenten nur wenige Zellen, die an der Me mbran eine Expression von CD82 \naufwiesen (Abb. 29A). Nach kombinierter Behandlung von Progesteron und hCG waren \ndie Membranen fast aller Stromazellen in den ektope n endometrialen Fragmenten \nangefärbt (Abb. 29B). Die semiquantitative Auswertu ng der immunhistochemischen \n\nErgebnisse 65  \nFärbungen ergab einen signifikanten Unterschied zwischen unbehandelten und behandelten \nFragmenten (Abb. 29C). \n \nV P + hCG \n0\n2\n4\n6\n*\nrelative Intensität / \nVehikelkontrolle \nA B\nC\nV P + hCG \n \nAbb. 29: Immunhistochemischer Nachweis der CD82-Expression \nCD82-Expression nach Kultivierung in unbehandelten ( A) und für 10 Tage mit Progesteron und \nhCG behandelten ( B) NOD-SCID-Mäusen nach 17 Tagen Kultur. Balken = 50  µm. ( C) \nSemiquantitative Auswertung der CD82-Färbung. Pro B ehandlungsgruppe wurden drei Fragmente \nanalysiert. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standa rdfehler. Die relative Intensität des \nVehikelfragmentes wurde gleich 1 gesetzt. * p ≤ 0,05 im Vergleich zur Vehikelkontrolle. V = \nVehikel; P = Progesteron; hCG = humanes Choriongonadotropin.  \n \n3.4.2.4  Proliferation der ektopen humanen endometrialen Läsionen \n \nDie quantitative Auswertung der immunhistochemische n Färbungen für Ki-67 (Abb. 30) \nergab für das Stroma sowie das Drüsenepithel der fü r 10 Tage mit Progesteron und hCG \nbehandelten und für weitere 7 Tage ohne Behandlung in NOD-SCID-Mäusen kultivierten \nektopen endometrialen Fragmente eine im Vergleich z ur Vehikelkontrolle signifikant \nreduzierte Proliferationsrate des endometrialen Str omas (Abb. 30C), während die \nProliferation der Drüsenepithelzellen nur leicht reduziert war (Abb. 30D). \n \n\nErgebnisse 66  \nV P + hCG \n0\n5\n10 \n15 \n20 \nStromazellen \n*\nProliferationsrate [%] \nV P + hCG \n0\n10 \n20 \n30 \n40 \n50 \nDrüsenepithelzellen \nProliferationsrate [%] \nA B\nV P + hCG \nC D\n \nAbb. 30: Proliferation der ektopen Läsionen \nNachweis der Proliferation humaner endometrialer Fr agmente nach 10tägiger Behandlung \nProgesteron und hCG gefolgt von einer 7tägigen Kultivierung ohne Behandlung in der NOD-SCID \nMaus. (AB) Immunhistochemien mit einem Antikörper g egen den Proliferationsmarker Ki-67. Die \nZellkerne proliferierender Zellen sind braun gefärbt. Es wurde eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin \ndurchgeführt. ( A) Vehikel; ( B) Progesteron + hCG. Balken: = 50 µm. Quantitative Auswertung der \nimmunhistochemischen Färbung der Stromazellen ( C) sowie Drüsenepithelzellen ( D). Pro \nBehandlungsgruppe wurden Fragmente von vier verschi edenen Patientinnen analysiert. Dargestellt \nist der Mittelwert ± Standardfehler. Die Proliferat ionsrate der Stromazellen ist nach 10tägiger \nkombinierter Behandlung von Progesteron und hCG und weiterer 7tägiger Kultur im Vergleich zur \nVehikelkontrolle signifikant reduziert (* ≤ 0,05). V = Vehikel; P = Progesteron; hCG = humanes  \nChoriongonadotropin. \n \n \n3.5  Einfluss der verschiedenen Behandlungen auf die Apo ptoserate von \nektopen endometrialen Läsionen \n \nIn den vorhergehenden Kapiteln konnte gezeigt werde n, dass es möglich ist, die \nDezidualisierung ektopen endometrialen Gewebes in vivo  zu induzieren. Die nächste zu \nuntersuchende Frage wäre, ob diese dezidualisierten  Stromazellen mit der Zeit apoptotisch \nwerden und somit ein Persistieren der ektopen endom etrialen Fragmente in vivo  verhindert \nwerden kann. Daher wurden zur Untersuchung von Apop toseparametern Paraffinschnitte \n\nErgebnisse 67  \nder humanen Endometriumfragmente aller Versuchsreihen mit einem Antikörper gegen die \naktivierte Caspase 3, ein Mitglied in der Apoptosesignalkaskade, inkubiert. \n \nV P + hCG MPA + hCG \n0\n10 \n20 \n30 \n40 \n50 gefärbte Schnitte [%] \nA B\nC D\nMPA +hCG \nV P + hCG \n \nAbb. 31: Nachweis aktivierter Caspase 3 \nImmunhistochemischer Nachweis der aktivierten Caspa se 3 in unbehandelten ( A), mit P und hCG \n(B) und mit MPA und hCG ( C) behandelten humanen ektopen endometrialen Läsione n nach 10 \nTagen Kultur in NOD-SCID-Mäusen. Apoptotische Zellkerne sind braun gefärbt. Balken = 10 µm. \n(D) Quantitative Darstellung des immunhistochemischen  Nachweises von aktivierter Caspase 3. V \n= Vehikel; P = Progesteron; MPA = Medroxyprogestero nacetat; hCG = humanes \nChoriongonadotropin. \n \nNach 7tägiger Behandlung mit Progesteron alleine od er in Kombination mit Forskolin \nbzw. hCG konnte keine spezifische Färbung der Zellk erne für aktivierte Caspase 3 \nfestgestellt werden. Ebenso konnte nach 10tägiger B ehandlungsdauer mit Progesteron und \nhCG (Abb. 31B) sowie nach Entzug dieser Dezidualisi erungsinduktoren, d.h. nach \n10tägiger Behandlung und anschließender Kultivierun g der ektopen Fragmente für einen \nZeitraum von sieben Tagen, keine Apoptose in den ek topen endometrialen Läsionen \nausgelöst werden. In den unbehandelten Fragmenten a ller Versuchsreihen wurde keine \nspezifische Färbung der Zellkerne für aktivierte Ca spase 3 gefunden (Abb. 31A). \nInteressanterweise waren nach 10tägiger Behandlung mit MPA und hCG in den ektopen \nendometrialen Fragmenten große Areale zu beobachten , in denen die Zellkerne der \ndezidualisierten Stromazellen, nicht aber der Drüse nepithelzellen, eine Färbung für \n\nErgebnisse 68  \naktivierte Caspase 3 aufwiesen (Abb. 31CD). Jedoch war eine Expression von aktivierter \nCaspase 3 nur in den mit MPA und hCG behandelten Ge webefragmenten aus Patientinnen \nzu erkennen, die auch schon in den vorhergehenden Analysen der Dezidualisierungsmarker \ndie stärkste Reaktion auf die Induktion der Dezidualisierung zeigten. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nDiskussion 69  \n4 Diskussion \n4.1  Induktion der Dezidualisierung ektopen Endometriums in vivo  \n \nEs wird davon ausgegangen, dass die stromale Kompon ente des Endometriums eine \nwesentliche Rolle bei der Etablierung und Persisten z der Endometriose spielt (Nisolle et \nal., 2000a). Ein möglicher therapeutischer Ansatz z ur Behandlung der Endometriose \nkönnte daher darin liegen, durch eine Induktion der  Dezidualisierung der \nendometriotischen Stromazellen diese Zellen termina l zu differenzieren und damit die \nÜberlebensdauer zu terminieren. Normalerweise sind die meisten menstruellen Zellen \nterminal differenziert und zeigen daher eine reduzi erte Kapazität zu ektoper Invasion und \nÖstrogen-vermitteltem Wachstum (Bruner-Tran et al.,  2006). Scott und Te Linde (1954) \nkonnten im Tiermodell zeigen, dass die Transplantat ion von operativ entnommenem \nhumanem Endometrium aus der Proliferationsphase des  Menstruationszyklus sich am \nerfolgreichsten darstellt. Endometriales Gewebe aus  der Sekretions- und prämenstruellen \nPhase ist weniger erfolgreich zu transplantieren und die Transplantationsfähigkeit reduziert \nsich weiterhin bei dezidualisiertem Gewebe mit der Dauer einer Schwangerschaft, so dass \ndas stark dezidualisierte Gewebe am Ende der Schwan gerschaft kaum mehr zu \ntransplantieren ist (Scott and Te Linde, 1954). Die  Theorie einer nichtadäquaten \nDifferenzierung des eutopen Endometriums bei erkrankten Frauen wird durch die Tatsache \nunterstützt, dass Endometriose in fast 60% der Pati entinnen mit Infertilität verbunden ist \n(Grummer et al., 2001; Ledger, 1999). Ein Abbau des  endometrialen Stromas könnte die \nfür das Wachstum der endometriotischen Läsionen not wendige Interaktion zwischen dem \nstromalen und epithelialen Kompartiment beeinflussen (Cunha et al., 1980, 1985; Osteen et \nal., 1994; Nisolle et al., 2000b). Nisolle et al. ( 2000) und Grümmer et al. (2001) konnten \nzeigen, dass epitheliale Zellen ihre ursprüngliche Morphologie nur in Bereichen \nbeibehalten, in denen das Stroma stark entwickelt i st. Ohne endometriales Stroma, welches \ndie Drüsen umgibt, atrophiert auch das Drüsenepithe l (Bergqvist et al., 1985a). Diese \nBeobachtung bildet u.a. die Grundlage der therapeut ischen Verwendung kontinuierlich \neingesetzter hochdosierter Progestine (Kistner, 195 8; Metzger und Haney, 1988). In 77% \nder endometriotischen Läsionen schwangerer Frauen w urde bei einer Studie eine \nDezidualisierung gefunden (Moen und Muus, 1991). In  experimentellen Studien mit \noperativ induzierter Endometriose in Affen konnte e ine vollständige oder deutliche \nRegression der Implante nach der Geburt demonstrier t werden (Schenken et al., 1987). \n\nDiskussion 70  \nJedoch wurde schon 1965 beschrieben, dass eine hist ologische Regression \nendometriotischer Läsionen nicht durchweg in der Sc hwangerschaft beobachtet wurde \n(McArthur und Ulfelder, 1965). \nDa aus zahlreichen in vitro -Studien bekannt ist, dass die Gabe von Progestinen  in \nKombination mit cAMP zu einer verstärkten Dezidualisierung von humanen endometrialen \nStromazellen im Vergleich zu der Behandlung mit Pro gestinen alleine führt (Kim et al., \n1998; Gellersen und Brosens, 2003; Tsuno et al., 20 09), wurde in der vorliegenden Arbeit \nerstmalig versucht, die Dezidualisierung auch in humanen ektopen endometrialen Läsionen \nin vivo  durch die zusätzliche Aktivierung des cAMP/PKA-Sig nalweges hervorzurufen \nbzw. zu verstärken. Als Substanzen, die den intraze llulären cAMP-Spiegel erhöhen, wurde \nzum einen Forskolin appliziert, das eine direkte Ak tivierung der Adenylatzyklase bewirkt, \nzum anderen das heterodimere Glykoproteinhormon hCG, das den cAMP-Anstieg über die \nBindung an G-Protein-gekoppelte LH/hCG (Luteinisier endes Hormon \n/Choriongonadotropin)-Rezeptoren und nachfolgend in  einem Rezeptor-abhängigen \nProzess die Aktivierung der \nα-Untereinheit des trimeren G-Proteins hervorruft, w elches \ndann die katalytische Aktivität der Adenylatzyklase  auslöst (Weedon-Fekjaer und Tasken, \n2012). Als Maß für die Dezidualisierung wurden die morphologischen und biochemischen \nÄnderungen des endometrialen Stromas herangezogen. Die stromalen Fibroblasten \ndifferenzieren zu runden, großen epitheloiden sezer nierenden Deziduazellen. Spezifische \nbiochemische Marker dieser Transformation endometri aler Stromazellen sind PRL und \nIGFBP-1 (Tseng et al., 1992; Gellersen und Brosens,  2003). Anhand dieser Parameter \nkonnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, d ass die Dezidualisierung ektopen \nendometrialen Gewebes signifikant durch die Applika tion von Progesteron und hCG \ninduziert werden kann, während die Behandlung mit P rogesteron alleine keinen und die \nKombination von Progesteron und Forskolin einen deu tlich schwächeren Effekt zeigte. \nDieser signifikante Effekt einer kombinierten Behan dlung mit Progesteron und hCG \nverstärkte sich mit der Behandlungsdauer. Während n ach 7tägiger Behandlung ein 20fach \nerhöhtes Expressionslevel von dPRL  erreicht wurde, war das Transkriptlevel von dPRL  im \nVergleich zur Kontrolle nach 10 tägiger kombinierte r Behandlung mit Progesteron und \nhCG nun beinahe 100fach erhöht. Es konnte zuvor schon gezeigt werden, dass Progesteron \nnur ein schwacher Induktor der Dezidualisierung ist  und zudem eine längere Dauer der \nProgesteronwirkung nötig ist. So wird auch die dezi duale Umformung der eutopen \nstromalen Zellen beim Menschen erst ungefähr zehn T age nach dem postovulatorischen \nAnstieg des ovariellen Progesteronlevels zunächst um die Spiralarterien herum sichtbar (de \n\nDiskussion 71  \nZiegler et al., 1998). In in vitro -Studien wurde festgestellt, dass eine 2wöchige Behandlung \nhumaner endometrialer Stromazellen notwendig ist, u m die Dezidualisierung durch die \nalleinige Gabe von Progesteron zu induzieren (Mizun o et al., 1998). Die Ergebnisse der \noben aufgeführten Studien deuten darauf hin, dass d ie Expression der Dezidua-\nspezifischen Gene wahrscheinlich nicht unter der di rekten transkriptionellen Kontrolle des \naktivierten Progesteronrezeptors liegt, sondern die  Interaktion des nukleären \nProgesteronrezeptors mit anderen Transkriptionsfakt oren den Progesteroneffekt im \ndifferenzierenden endometrialen Stroma vermittelt ( Tseng et al., 1992; Gellersen und \nBrosens, 2003). Dafür spricht auch die Tatsache, da ss viele Dezidua-spezifischen Gene, \ndarunter das deziduale Prolaktingen, keine palindro mischen Progesteron-responsiven \nElemente in ihren Promotoren besitzen (Gellersen un d Brosens, 2003). Der genaue \nmolekulare Mechanismus, über den Progesteron die Di fferenzierung reguliert, ist noch \nnicht wirklich verstanden. Es ist bekannt, dass die  Dezidualisierung des Endometriums \nzusätzlich zum Progesteron über weitere Faktoren be einflußt und gesteuert wird. So kann \nauch die Stimulierung des cAMP/PKA-Signalweges eine n starken Einfluß auf die \nDezidualisierung haben (Tseng et al., 1992; Frank e t al., 1994; Gellersen und Brosens, \n2003). In den letzten Jahren wurde herausgefunden, dass der cAMP/PKA-Signalweg mit \ndem Progesteronsignalweg interagiert, diesen reguli ert und modifiziert (Maruyama und \nYoshimura, 2008). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung \nder ektopen Fragmente mit Progesteron und cAMP-stei gernden Substanzen zu einer \nvestärkten Dezidualisierung im Vergleich zur allein igen Behandlung mit Progesteron \nführte, wobei hCG ein signifikant besserer Induktor  der Dezidualisierung ektopen \nendometrialen Gewebes war als Forskolin. Es ist bek annt, dass cAMP die trankriptionelle \nAktivität des Prolaktinrezeptors verstärkt, obwohl dieser Mechanismus noch nicht ganz \nverstanden ist (Gellersen und Brosens, 2003). Der B eginn des Dezidualisierungsprozesses \nbenötigt wahrscheinlich einen erhöhten intrazellulä ren cAMP-Level und eine \nkontinuierliche Aktivierung des Proteinkinase A (PK A)-Signalweges (Gellersen und \nBrosens, 2003). Nachdem zwar gezeigt wurde, dass di e Zugabe von cAMP oder Forskolin \nzum Kulturmedium die Dezidualisierung endometrialer  Stromazellen in vitro  induzieren \nkann (Sugino et al., 2002; Gellersen und Brosens, 2003), konnte in der vorliegenden Arbeit \nerstmalig gezeigt werden, dass die kombinierte Gabe  von Progestinen und cAMP-\nInduktoren auch in vivo  den Dezidualisierungsprozess der Stromazellen ekto pen \nendometrialen Gewebes verstärken kann. Interessant ist hier vor allen Dingen der von hCG \nausgelöste starke Effekt auf die Dezidualisierung. Humanes Choriongonadotropin wird \n\nDiskussion 72  \nwährend der Schwangerschaft vom Trophoblasten gebildet und sezerniert und spielt, neben \nseiner klassischen endokrinen Funktion zur Aufrecht erhaltung der Progesteronproduktion \ndurch den Gelbkörper, eine wichtige Rolle bei der V orbereitung des Endometriums auf \neine Implantation (Tang und Gurpide et al., 1993; Kajihara et al., 2011). Das Endometrium \nbesitzt im Gegensatz zu anderen Geweben, die nicht zum Reproduktionssystem gehören, \neine große Menge an LH/hCG-Rezeptoren (Reshef et al ., 1990; Han et al, 1997; Gellersen \nund Brosens, 2003; Prast et al., 2008) und ist währ end der Schwangerschaft einem hohen \nLevel an hCG ausgesetzt (Maruyama und Yoshimura, 20 08). Das \nDezidualisierungspotential von hCG zeigt in zahlrei chen in vitro -Studien widersprüchliche \nErgebnisse. Tang und Gurpide (1993) konnten zeigen,  dass die Differenzierung primärer \nendometrialer Stromazellen in Deziduazellen in vitro  durch urinäres hCG verstärkt wird. \nEs wurde auch beschrieben, dass hCG die Produktion von dPRL in humanem \nDeziduagewebe in vitro  stimuliert (Rosenberg und Bhatnagar, 1984). Demgeg enüber steht \neine Studie, bei der die morphologische und biochem ische Differenzierung primärer \nhumaner endometrialer Stromazellen durch die alleinige Gabe von hCG nicht induziert und \nder durch Progesteron hervorgerufene Effekt auf die  Dezidualisierung durch die \nzusätzliche Gabe von hCG nicht verstärkt werden konnte, wobei in dieser Veröffentlichung \nnicht ersichtlich war, welche hCG-Präparation verwe ndet wurde (Kasahara et al., 2001). \nEine kürzlich erschienene Studie berichtet, dass be i Verwendung einer rekombinanten \nhCG-Präparation die Expression des Dezidualisierung smarkers dPRL in einer \nimmortalisierten endometrialen Stromazelllinie heru nterreguliert werden kann, jedoch die \nVerwendung von urinärem hCG die Expression steigert  (Kajihara et al., 2011). Somit \nkönnten für die widersprüchlichen Ergebnisse der St udien die unterschiedlich verwendeten \nhCG-Präparationen, rekombinantes versus urinäres hC G, verantwortlich sein. Humanes \nChoriongonadotropin setzt sich aus zwei Untereinhei ten zusammen: Der α-Untereinheit, \nwelche ebenfalls an dem Aufbau der Glykoproteinhorm one FSH, LH und TSH \n(Thyreoidea-stimulierendes Hormon) beteiligt ist, u nd der β-Untereinheit, die dem hCG-\nMolekül seine biologische Spezifität verleiht (Yarr am et al., 2004). In den meisten \nrekombinanten hCG-Präparationen ist auschließlich β-hCG enthalten. In der vorliegenden \nArbeit wurde eine natürlich vorkommende Mischung au s hCG-Molekülen mit ihren \ncharakteristischen Glykolisierungseigenschaften und  freien α- und β-Untereinheiten \nverwendet, die aus humanem weiblichem Urin extrahie rt wurde. In den verschiedenen \nurinären hCG-Präparationen kann das Level funktione ll intakter hCG-Moleküle und \nanderer enthaltener hCG-Formen schwanken (Yarram et  al., 2004). Es wurde zudem \n\nDiskussion 73  \ndiskutiert, dass urinäre Präparationen nicht verwen det werden sollten, da diese mit EGF \n(epidermal growth factor ) kontaminiert sein könnten und EGF ungewollte zell uläre \nReaktionen auslösen kann, auf der anderen Seite bie ten urinäre hCG-Präparationen den \nVorteil, dass das Hormon in diesen Präparaten über unterschiedliche Modifikationen, wie \nz.B. Glykosylierungen, verfügt, welche für die biol ogische Funktion von hCG erforderlich \nund daher besser für die Untersuchung von in vivo -Effekten des Hormons geeignet sind \n(Saleh et al., 2007). Ein hoher Glykolysierungsgrad von hCG trägt zudem zur Stabilität des \nMoleküls bei und verlängert somit seine Halbwertszeit (Tsampalas et al., 2010). \n \nIn der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich zu den spezifischen Dezidualisierungsmarkern \nPRL und IGFBP-1 auch die Expression von FOXO-1, GJA 1 und CD82 als weitere an der \nDezidualisierung beteiligte Faktoren analysiert. De r Transkriptionsfaktor FOXO-1 ist ein \nfrüherer Indikator für eine beginnende Dezidualisie rungsreaktion, da FOXO1 zusammen \nmit dem Transkriptionsfaktor C/EBP \nβ (CCAAT/enhancer-binding-Protein β) den dPRL -\nPromotor aktiviert (Gellersen und Brosens, 2003) un d eine erhöhte Expression von \nFOXO1 notwendig ist, damit die Prolaktinproduktion in den Zellen induziert werden kann. \nGJA1 spielt eine wichtige Rolle bei der interzellul ären Kommunikation, da es in Form von \nGap Junction-Kanälen die zytoplasmatischen Komparti mente zweier benachbarter Zellen \nmiteinander verbindet. Es wird bereits sehr früh wä hrend der Dezidualisierung \nheraufreguliert, und es wurde gezeigt, dass humanes  dezidualisiertes Gewebe ausgedehnte \nGap Junctions besitzt (Tsuno et al., 2009; Yu et al ., 2011). GJA1 sowie funktionelle Gap \nJunction-Kanäle werden für die morphologischen und biochemischen Veränderungen \nwährend der Differenzierung endometrialer Stromazel len benötigt (Laws et al., 2008; Yu \net al., 2011). CD82, welches während der Dezidualis ierung heraufreguliert wird, spielt \nebenfalls eine wichtige Rolle bei der Differenzieru ng der endometrialen Stromazellen \n(Gellersen et al., 2007). Obwohl eine signifikante Induktion der Dezidualisierung des \nektopen Endometriums anhand morphologischer Paramet er sowie der Expression der \nspezifischen Dezidualisierungsmarker PRL und IGFBP1  nur nach kombinierter \nBehandlung mit Progesteron und hCG auftrat, zeigte sich in der vorliegenden Arbeit \ninteressanterweise sowohl bei der kombinierten Behandlung mit Progesteron und Forskolin \nals auch hCG eine signifikante Steigerung der Trans kription von FOXO-1 und GJA1  in \ndem ektopen endometrialen Gewebe im Vergleich zur K ontrolle. Es ist bekannt, dass das \nFOXO1-Protein in vivo  im Nukleus dezidualisierter stromaler Zellen akkum uliert \n(Gellersen und Brosens, 2003). Dies war auch in der  vorliegenden Studie gut im \n\nDiskussion 74  \nimmunhistochemischen Nachweis zu erkennen, wobei di e FOXO1-Expession nach \n7tägiger Behandlung mit Progesteron und hCG z.T. au ch im Zytoplasma nachweisbar war. \nDieser Anstieg der Expression von FOXO1 und GJA1 ze igte sich nach Behandlung mit \nProgesteron und Forskolin jedoch nur auf Transkript -, nicht aber auf Proteinebene, \nwährend für beide Behandlungen, Progesteron und For skolin sowie Progesteron und hCG, \ntendenziell ein Anstieg der CD82-Proteinexpression zu beobachten war. Somit aktiviert \noffensichtlich auch die Behandlung mit Progesteron und Forskolin die Signalkaskade der \nDezidualisierung in ektopem endometrialem Gewebe in vivo . Möglicherweise benötigt \ndieser Weg in vivo  jedoch einen längeren Applikationszeitraum. Dass d ie Applikation von \nProgesteron in Kombination mit hCG zu einer deutlic h stärkeren \nDezidualisierungsreaktion führt als in Kombination mit Forskolin, könnte an den \nunterschiedlichen Signalwegen dieser beiden cAMP-In duktoren liegen. Die Spezifität und \nzeitliche Regulation des cAMP/PKA-Signalweges, der durch die Bindung von hCG an \nLH/hCG-Rezeptoren ausgelöst wird, wird durch die Ge nerierung lokal begrenzter cAMP-\nAnsammlungen in der Zelle gewährleistet (Weedon-Fek jaer und Tasken, 2012).  \nPhosphodiesterasen und die diskrete räumliche und z eitliche Aktivierung einer \nspezifischen Isoform der PKA sowie Proteinkinase A- Ankerproteine regulieren und \norganisieren diesen Prozess (Weedon-Fekjaer und Tas ken, 2012). Forskolin stimuliert \njedoch nichtselektiv fast alle Isoformen der Adenyl atzyklase und greift auf diese Weise \nzentral in die Signaltransduktionswege vieler G-Pro tein-gekoppelter Rezeptoren ein. Eine \nErhöhung des cAMP-Spiegels in der Zelle durch Forsk olin hat daher zahlreiche \nbiologische Reaktionen zur Folge. Dies könnte den geringeren Effekt von Forskolin auf die \nDezidualisierung erklären, da das durch Forskolin e ntstandene cAMP in der Zelle nicht \nausschließlich mit dem Dezidualisierungssignalweg verknüpft ist. \nNach 10tägiger Behandlung der ektopen endometrialen  Fragmente in NOD-SCID-Mäusen \nmit Progesteron und hCG  zeigte sich auf Transkriptebene nach Untersuchung d es frühen \nDezidualisierungsmarkers FOXO1  zwar ein Anstieg der Expression im Vergleich zur \nKontrolle, jedoch ergaben sich keine Signifikanzen mehr. Dies könnte darin begründet \nsein, dass die Dezidualisierung zu diesem Zeitpunkt  auch im Kontrollfragment beginnt. \nDie in dieser Arbeit verwendeten Mäuse wurden vor V ersuchsbeginn nicht ovariektomiert, \nso dass das endogene Progesteron nach 10 Tagen in d en Kontrollfragmenten eine \nschwache Dezidualisierungsreaktion auslösen könnte.  Auf Proteinebene zeigte sich jedoch \nnach 10tägiger Behandlung mit Progesteron und hCG e ine stark signifikant erhöhte \nExpression des Transkriptionsfaktors FOXO1 im Vergl eich zur Kontrolle. In den \n\nDiskussion 75  \nKontrollfragmenten wurde demnach zunächst nur die FOXO1 -mRNA, jedoch noch kein \nFOXO1-Protein synthetisiert und somit auch noch kei n PRL. Auch für GJA1, einem noch \nfrüheren Marker als FOXO1, zeigte sich in den Kontr ollen zu diesem Zeitpunkt ein zu den \nbeiden Behandlungen gesteigertes GJA1 -Transkriptlevel, jedoch keine erhöhte \nProteinexpression.  \n \nDie induzierte Dezidualisierungsreaktion hatte im u ntersuchten Zeitraum von bis zu 10 \nTagen keinen Effekt auf die Größe und das Gewicht d er transplantierten \nEndometriumfragmente. Dies ist erklärbar, da es sic h bei der Dezidualisierung zunächst \num eine morphologische und biochemische Umbildung d er endometrialen Stromazellen \nhandelt (Tsuno et al., 2009). \nIm Hinblick auf die Proliferation des ektopen endom etrialen Gewebes zeigte das \nglanduläre Epithel der Kontrollfragmente eine durch schnittliche Proliferationsrate von ca. \n30 % und bestätigt die Ergebnisse der Studie von Gr ümmer et al. (2001). Der \ndurchschnittliche prozentuale Anteil Ki-67 positive r Zellen des Stromas betrug ca. 10 %. \nSomit proliferierten hauptsächlich die Drüsenepithe lzellen in den ektopen humanen \nendometrialen Fragmenten. Es konnte gezeigt werden,  dass die Behandlung der ektopen \nLäsionen mit Progesteron und hCG, die eine starke D ezidualisierungsreaktion induzierte, \ntendenziell zu einer Reduktion der Proliferationsra te der Drüsenepithelzellen führte. \nObwohl Progesteron einen antiproliferativen Effekt auf das Endometrium hat (Moyer und \nFelix, 1998), konnte in der vorliegenden Arbeit nac h alleiniger Progesteronbehandlung \nsowie nach Behandlung mit Progesteron und Forskolin  keine Hemmung der Proliferation \nim Vergleich zur Kontrolle beobachtet werden. Dies könnte an dem in der Literatur \nbeschriebenen verzögerten Effekt von Progesteron li egen (de Ziegler et al., 1998; Mizuno \net al., 1998). \n \nEs konnte hier somit gezeigt werden, dass durch ein e Behandlung mit Progesteron in \nKombination mit hCG erfolgreich eine Dezidualisieru ng des endometrialen Stromas in \nhumanen ekopen endometrialen Läsionen induziert werden kann. \n \nIn der tierexperimentellen Forschung stellen Veränd erungen des Uterusgewichtes generell \neinen gängigen Indikator für Östrogen- sowie Proges teronwirkung dar und werden daher \nstets zusätzlich analysiert. Im Hinblick auf das Ge wicht des Uterus konnte in der \nvorliegenden Arbeit kein auffälliger Effekt im Mausorganismus festgestellt werden. Jedoch \n\nDiskussion 76  \nweist die Maus eine andere Dezidualisierungskaskade  auf als der Mensch. Somit kann \nhierdurch keine Aussage darüber getroffen werden, o b die in den hier durchgeführten \nExperimenten verwendeten Dosierungen der unterschie dlichen Progestine und cAMP-\nsteigernden Substanzen im eutopen Endometrium des M enschen zu signifikanten \nVeränderungen führen. \n \n4.2  Vergleich des Effektes von Progesteron und MPA auf die \nDezidualisierung \n \nZusätzlich zum Progesteron wurde in der vorliegende n Arbeit vergleichend der Effekt von \nMPA in Kombination mit hCG auf die Dezidualisierung  ektopen endometrialen Gewebes \nuntersucht. Das synthetische steroidale Progestin M PA wird schon lange zur \nmedikamentösen Behandlung der Endometriose eingeset zt (Valle, 2002; Bruner-Tran et \nal., 2006). Es konnte gezeigt werden, dass die tägl iche Einnahme von 30 mg MPA über \neinen Zeitraum von 90 Tagen in manchen Frauen zu ei ner deutlichen Atrophie des \nglandulären Epithels und zu einer dezidualen Reakti on des endometrialen Stromas führt \n(Moghissi und Boyce, 1976). Obwohl MPA mit einigem Erfolg zur Endometriose-\nBehandlung eingesetzt wird, werden durch die Einnah me unerwünschte Nebenwirkungen \ndurch die Aktivierung von Zellsignalwegen nach Inte raktion mit anderen nahe verwandten \nSteroidrezeptoren hervorgerufen (Moghissi und Boyce , 1976; Bruner-Tran et al., 2006). In \nKombination mit hCG zeigte MPA den gleichen Effekt auf die Dezidualisierung des \nektopen endometrialen Gewebes wie Progesteron. Es k am zu einer signifikanten Zunahme \nder dezidualisierten Stromabereiche in den ektopen Läsionen und parallel zu einer \ngesteigerten Expression von Dezidualisierungsmarker n. Im Gegensatz zu der Behandlung \nmit Progesteron und hCG zeigte sich jedoch nach App likation von MPA und hCG eine \ndeutlich höhere interindividuelle Varianz des Geweb es verschiedener Patientinnen in der \nReaktion auf die Behandlung. Zum einen reagierte na ch Behandlung mit MPA und hCG \nein geringerer Prozentsatz der Gewebe mit einer Dez idualisierungsreaktion als nach \nBehandlung mit Progesteron und hCG, zum anderen fie l die Reaktion bei den Geweben, \ndie auf die Behandlung ansprachen, aber stärker aus , so dass große Varianzen in den \nuntersuchten Parametern resultierten. \n Interessanterweise zeigte sich in den ektopen \nendometrialen Läsionen, in denen eine starke Dezidu alisierungsreaktion durch die \nBehandlung mit MPA und hCG ausgelöst wurde, eine st arke Expression aktivierter \n\nDiskussion 77  \nCaspase 3, einem Apoptosemarker, im dezidualisierten Stroma. Die Caspase 3 zählt zu den \nEffektorcysteinproteasen, die einerseits sekundäre Zielproteine wie DNAsen oder weitere \nCaspasen aktivieren, andererseits zelleigene Protei ne wie Aktin und Lamin spalten und \ndaher aktiv am Abbau des Zytoskeletts und der Kerns truktur beteiligt sind (Pop und \nSalvesen, 2009). Die Ergebnisse der vorliegenden Un tersuchung zeigen, dass es möglich \nist ektope endometriale Stromazellen in vivo  terminal zu differenzieren und somit \nApoptose in diesen Zellen auszulösen. Dies bietet e inen interessanten Ansatz zur \nEntwicklung einer neuer therapeutischen Behandlung der Endometriose. Die Varianz \nzwischen den unterschiedlichen Patientinnen und deren Ursache soll in Folgeexperimenten \nmit größeren Fallzahlen untersucht werden. \n \n4.3  Entzug von Dezidualisierungsinduktoren \n \nUm zu überprüfen, ob ein Hormonabfall nach der Indu ktion der Dezidualisierung zu einer \nRegression der ektopen endometriotischen Läsionen f ührt, wie es Healy und Hodgen \n(1983) für die Regression endometriotischer Läsion nach der Geburt postuliert hatten, \nwurde in einer weiteren Versuchsreihe der Effekt ei nes Entzugs der \nDezidualisierungsinduktoren nach einer vorrangegang enen 10tägigen Behandlung auf die \nMorphologie und Physiologie der ektopen endometrial en Fragmente untersucht. Da die \nApplikation von Progesteron und hCG in den vorangeg angenen Versuchen die \nverläßlichste Induktion einer Dezidualisierungsreak tion im Endometrium verschiedener \nPatientinnen aufwies, wurde dieser Versuchsansatz m it dieser hormonellen Behandlung \ndurchgeführt, indem die transplantierten Mäuse zunä chst für 10 Tage mit Progesteron und \nhCG behandelt wurden und die Kultur des ektopen hum anen Gewebes anschließend für \nweitere 7 Tage ohne Behandlung fortgesetzt wurde. D ie Auswertung der ektopen \nFragmente am Ende dieser Versuchsreihe zeige in der  histomorphologische Analyse eine \ngrößere Fläche dezidualisierten Gewebes im Vergleic h zur Kontrolle, die jedoch nun nicht \nmehr - wie unmittelbar nach der 10tägigen Behandlun g mit Progesteron und hCG - \nsignifikant war. Es zeigte sich jedoch weiterhin ei n signifikant gesteigertes dPRL -\nTranskriptlevel als Marker für die physiologische F unktion der dezidualisierten Zellen. Im \nGegensatz dazu zeigte sich in den ektopen Fragmente n für die Transkriptmenge der frühen \nDezidualisierungsmarker FOXO-1 und GJA1  eine Abnahme nach Entzug der \nDezidualisierungsinduktoren im Vergleich zu den 10t ägig behandelten Fragmenten. \n\nDiskussion 78  \nParallel ergab die Untersuchung auf Proteinebene zw ar immer noch einen deutlichen \nAnstieg der FOXO-1-Expression im Vergleich zur Kontrolle, jedoch war dieser nicht mehr \nsignifikant, wie dies zuvor bei 10tägiger Behandlun g beobachtet wurde. Auch war die \nExpression von FOXO-1 nun wieder fast ausschließlic h im Zytoplasma der ektopen \nendometrialen Stromazellen lokalisiert. Diese Befun de weisen darauf hin, die \nBehandlungsdauer zur terminalen Differenzierung des  ektopen endometrialen Gewebes \nmöglicherweise nicht ausgereicht hat. Es wurde zuvor in in vitro -Studien gezeigt, dass eine \ndauerhafte Gabe von Progesteron und cAMP notwendig ist um den dezidualen Phänotyp \nendometrialer Stromazellen aufrechtzuerhalten (Tana ka et al., 1993; Telgmann und \nGellersen, 1998) und dass diese nach Entzug des cAM P-Stimulus in vitro  ihren \nundifferenzierten Phänotyp wiedererhalten und die E xpression der Differenzierungsmarker \ndPRL und IGFBP-1 einstellen (Gellersen und Brosens,  2003). Andererseits konnte 7 Tage \nnach Entzug der Dezidualisierungsinduktoren eine te ndenzielle Größenabnahme der \nektopen Fragmente und eine signifikante Reduktion d er Proliferationsrate in den \nendometrialen Stromazellen der ektopen Fragmente ge zeigt werden. Somit könnte dieser \nProliferationsstopp und als Folge eine Reduktion de r Größe der ektopen Läsionen \nmöglicherweise durch eine längere vorausgehende Phase der Behandlung verstärkt werden. \nIn weiterführenden Experimenten soll geklärt werden , ob eher durch eine dauerhafte \nBehandlung mit Progestinen und hCG oder zusätzlich durch einen nachfolgenden Entzug \nder Dezidualisierungsinduktoren ein therapeutischer  Effekt auf die Persistenz der ektopen \nendometrialen Läsionen erreicht werden kann. \n \n4.4  Schlussfolgerungen und Ausblick \n \nDie Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass  es möglich ist durch die Behandlung \nmit Progestinen in Kombination mit hCG die Dezidual isierung ektoper humaner \nendometrialer Läsionen in vivo zu induzieren, somit einen Proliferationsstopp \nhervorzurufen und letztendlich in diesen terminal d ifferenzierten Stromazellen Apoptose \nauszulösen. Zuvor konnte bereits gezeigt werden, da ss die Dezidualisierung endometrialen \nGewebes einen hemmenden Einfluss auf die Persistenz  endometriotischer Läsionen haben \nkann und dass eine Progestintherapie sowie die hohe  Serumprogesteronkonzentration \nwährend der Schwangerschaft in manchen Frauen einen  therapeutischen Einfluss auf die \nErkrankung besitzt, da durch die Dezidualisierung d er endometrialen Stromazellen \n\nDiskussion 79  \nletztendlich eine Atrophie des ektopen Gewebes indu ziert wird (Novak und Hoge, 1958; \nAndrews et al., 1959; Olive und Haney, 1986; Metzge r und Haney, 1988; Mahmood und \nTempleton, 1990; Tabanelli et al., 1992; Bruner-Tra n et al., 2002; 2006). Moen und Muus \n(1991) konnten jedoch in 23% der schwangeren Frauen  keine Dezidualisierung der \nendometriotischen Läsionen als Reaktion auf die Sch wangerschaft finden. Dies steht in \nÜbereinstimmung mit der Beobachtung, dass endometri otische Läsionen in manchen \nFällen weder auf normale zyklische Variationen noch  auf eine exogene hormonale \nTherapie reagieren (Bergqvist et al., 1984; Brosens et al., 1987; Metzger et al., 1988; Moen \nund Muus, 1991). Klemmt et al. (2006) konnten zeige n, dass endometriotische Läsionen \nund eutopes Endometrium einiger erkrankter Frauen ü ber eine reduzierte Kapazität zur \nDezidualisierung verfügen. Eine nichtadäquate Differenzierung des eutopen Endometriums \nbei Endometriose-Patientinnen könnte ein Grund für das Auftreten der Erkrankung sowie \nfür die hohe Rezidivrate sein, da diese reduzierte Differenzierungskapazität der \nendometrialen Stromazellen mit einer erhöhten Überlebens- und Proliferationsfähigkeit der \nstromalen Zellen in der ektopen Umgebung assoziiert  sein könnte. Dieses reduzierte \nPotential zur Dezidualisierung ist vermutlich durch  die nachgewiesene \nProgesteronresistenz des Endometriums von an Endometriose erkrankten Frauen begründet \n(Attia et al., 2000; Bruner-Tran et al., 2006). Die  Menge der Progesteronrezeptoren in \nendometriotischem Gewebe ist variabel und stellt daher eine Erklärungsmöglichkeit für die \nunterschiedliche Effektivität von Progesteron als t herapeutischen Wirkstoff in erkrankten \nFrauen dar (Bergqvist et al., 1981; Janne et al., 1 981; Bruner-Tran et al., 2006). Somit ist \ndie alleinige Therapie mit Progesteron nicht immer erfolgreich. In der vorliegenden Arbeit \nkonnte gezeigt werden, dass durch die gleichzeitige  Verabreichung von Progesteron und \nhCG die Dezidualisierungsreaktion der endometrialen  Stromazellen deutlich verstärkt \nwerden kann. \nHierin könnte ein neuartiger Therapieansatz für die  zukünftige Endometriose-Behandlung \nliegen, den es gilt, in weiterführenden Analysen zu  optimieren. Hierzu müssen die \noptimalen Dosen für das Progestin und hCG ausgestes tet werden. Durch die starke \nWirkung von hCG könnte möglicherweise eine erfolgre iche Therapie auch in erkrankten \nFrauen mit endometrialer Progesteronresistenz durch geführt werden. Zudem bleibt zu \nanalysieren, inwieweit dieser Effekt durch die Verw endung von Progestinen, die nicht \nausschließlich an den Progesteronrezeptor binden (w ie MPA) verstärkt werden kann. \nNeben dem Effekt auf die ektopen endometrialen Läsi onen könnte eine solche Behandlung \nzudem eine adäquate Dezidualisierung des eutopen En dometriums auslösen. Hierdurch \n\nDiskussion 80  \nkönnte das Invasions- und Wachstumspotential der du rch die retrograde Menstruation in \ndie Peritonealhöhle gelangten Zellen und damit die Neuenstehung von endometriotischen \nLäsionen reduziert oder verhindert werden. So konnt e bereits in verschiedenen Studien \ngezeigt werden, dass die Verabreichung von Progesti nen nicht nur die Dezidualisierung \nendometriotischer Läsionen, sondern auch die Dezidu alisierung des eutopen \nEndometriums induziert (Cornillie et al., 1987; Del igdisch, 2000; Phillips et al., 2003), so \ndass eine Kombination von Progestinen und hCG vermu tlich auch die Dezidualisierung \ndes eutopen Endometriums verstärken würde. Eine Beh andlung mit hCG stellt zudem eine \nnatürliche und spezifische Möglichkeit dar, auf das  ektope Fragment zu wirken ohne \nandere Organe außerhalb des Reproduktionssystems zu  beeinflussen. Somit könnte die \nBehandlung mit hCG in Kombination mit Progestinen e ine Möglichkeit zur Entwicklung \nneuer Therapieansätze in der Endometriosebehandlung darstellen. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nZusammenfassung 81  \n5 Zusammenfassung \n \nTrotz jahrzehntelanger Forschung ist die Pathogenes e der Endometriose heutzutage immer \nnoch nicht ausreichend verstanden und die vorhanden en Therapiemöglichkeiten sind \nbegrenzt. Die aktuelle medikamentöse Behandlung der  Endometriose basiert auf der \nhormonellen Unterdrückung des Menstruationszyklus. Da diese Therapie mit \nunerwünschten Nebenwirkungen und hohen Rezidivraten  verbunden ist, besteht eine \nNotwendigkeit spezifischere therapeutische Strategi en zu entwickeln. In der Literatur \nwurde beschrieben, dass die Schwere der Erkrankung entscheidend dadurch beeinflusst \nwird, ob die endometrialen Zellen an den ektopen St ellen proliferieren oder differenzieren. \nZiel dieser Arbeit war es daher mit Hilfe des human isierten Endometriose-Mausmodells \ndie Wirkung von Progestinen kombiniert mit zyklisch en Adenosinmonophosphat (cAMP)-\nsteigernden Substanzen auf die Induktion der termin alen Differenzierung \n(Dezidualisierung) humanen ektopen endometrialen Ge webes in vivo  zu untersuchen. In \nder vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass  die Dezidualisierung ektopen \nendometrialen Gewebes signifikant durch die Applika tion von Progesteron und humanem \nChoriongonadotropin (hCG) induziert werden kann, wä hrend die Behandlung mit \nProgesteron alleine keinen und die Kombination von Progesteron und Forskolin einen \ndeutlich schwächeren Effekt zeigte. \n Durch Induktion der terminalen Differenzierung der \nektopen endometrialen Stromazellen konnte die Proli ferationsrate im Vergleich zum \nKontrollgewebe reduziert werden. In Kombination mit  hCG zeigte \nMedroxyprogesteronacetat (MPA) den gleichen Effekt auf die Dezidualisierung des \nektopen endometrialen Gewebes wie Progesteron. Im G egensatz zu der Behandlung mit \nProgesteron und hCG zeigte sich jedoch nach Applika tion von MPA und hCG eine \ndeutlich höhere interindividuelle Varianz des Geweb es verschiedener Patientinnen in der \nReaktion auf die Behandlung. Interessanterweise zei gte sich in den ektopen endometrialen \nLäsionen, in denen eine starke Dezidualisierungsrea ktion durch die Behandlung mit MPA \nund hCG ausgelöst wurde, eine starke Expression akt ivierter Caspase 3, einem Marker für \napoptotische Zellen, im dezidualisierten Stroma. Di e Ergebnisse der vorliegenden \nUntersuchung zeigen erstmalig, dass es möglich ist ektope endometriale Stromazellen in \nvivo  terminal zu differenzieren und somit Apoptose in d iesen Zellen auszulösen. Auf die \nErgebnisse der vorliegenden Studie können weiterfüh rende Analysen aufbauen, um \nneuartige Behandlungsstrategien für die Endometriose zu entwickeln. \n\nLiteraturverzeichnis 82  \n6 Literaturverzeichnis \n \n1 American Society for Reproductive Medicine (1997): Revised American Society for \nReproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 67 \n, 817-21. \n2 Andrews, M. C., Andrews, W. C. and Strauss, A. F. 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Abbildung \nA. bidest  zweifach destilliertes Wasser \nACTB   \nβ-Aktin \nAPS   Ammoniumpersulfat \nBp/kb   Basenpaare/Kilobasen \nBSA   Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) \nC   Cytosin \ncAMP   zyklisches Adenosinmonophosphat \nCD82/KAI-1  cluster of differentiation 82  \ncDNA   Complementary DNA (zur mRNA komplementäre DN A) \nCOX-1/2  Zyklooxygenase-1/2 \nC\nt-Wert  cycle threshold -Wert \nDAB   Diaminobenzidin \nDEPC   Diethylpyrocarbonat \nDMEM  Dulbecco’s Modified Eagle Medium \nDMSO   Dimethylsulfoxid \nDNA   Desoxyribonukleinsäure \nDNase   Desoxyribonuklease \ndNTP   Desoxynukleosidtriphosphat \ndPRL   deziduales Prolaktin \nDTT   Dithiothreitol \nECL   Enhanced chemiluminescence (verstärkte Chemil uminiszenz) \nEDTA   Ethylendiaminotetraacetat \nEGF   epidermal growth factor  \net al.   et altera (und andere) \nFOXO-1  Forkhead-Box-Protein O1 \nFSH   Follikelstimulierendes Hormon \nG   Guanin \nGAPDH  Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase \nGJA1   Gap Junction Protein alpha 1 (Connexin43) \n\nAnhang 94  \nGnRH   Gonadotrophin-Releasing-Hormon \nhCG   Humanes Choriongonadotropin \nHE   Hämatoxylin-Eosin \nHPLC High performance liquid chromatography  \nHRP   Horse raddish peroxidase (Meerrettich-Peroxid ase) \nIgG   Immunglobulin G \nIGFBP-1  Insulin-like growth factor-binding protein  1 \nIHC   Immunhistochemie \ni.p.   intraperitoneal \nkDa   Kilodalton \nLH   Luteinisierendes Hormon \nM-MLV RT  Moloney-murine leukemia virus reverse tra nscriptase \nMPA   Medroxyprogesteronacetat \nmRNA   messenger RNA (Boten-RNA) \nNCBI   National Center for Biotechnology Informatio n \nNK-Zellen  Natürliche Killerzellen \nNOD   non-obese diabetic  \nNSAR   nichtsteroidale Antirheumatika \nPBS   Phosphat buffered saline (Phosphat-gepufferte  Saline) \nPCR   polymerase chain reaction (Polymerasekettenre aktion) \nPen/Strep  Penicillin-/Streptomycin-Lösung \nPoly-A   polyadenyliert \nRNA   Ribonukleinsäure \nRNase   Ribonuklease \nRT   Raumtemperatur \nRT   Reverse Transkription \nRT-PCR  Reverse Transkriptions-PCR \ns.c.   subkutan \nSCID   severe combined immunodeficiency  \nSDS   Natriumdodecylsulfat \nSDS-PAGE  SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese \nT   Thymin \nTBE   Tris-Borat-EDTA-Puffer \nTEMED  N,N,N’,N’,-Tetramethylethylendiamin \n\nAnhang 95  \nTm   Hybridisierungstemperatur der Primer bei der P CR \nTNF-alpha  Tumornekrosefaktor alpha \nTris   2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol \nU   Unit (Einheit der Enzymaktivität) \nüN   über Nacht \nUpM   Umdrehungen pro Minute \nUV   Ultraviolett \nv/v   Volumen pro Volumen \nWB   Western Blot \nw/v   weight per volume (Gewicht pro Volumen) \n \nAllgemein gebräuchliche Abkürzungen und physikalisc he Maßeinheiten sind nicht \ngesondert aufgeführt. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nDanksagung 96  \n8 Danksagung \n \nAn dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Durchführung dieser \nArbeit unterstützt haben und mir mit Rat und Tat zur Seite standen. \n \nIch danke Frau Prof. Dr. Ruth Grümmer und Frau Prof . Dr. Elke Winterhager für die \nMöglichkeit, diese Arbeit am Institut für Molekular biologie anfertigen zu können und für \ndie intensive fachliche Unterstützung sowie für die  Möglichkeit der Teilnahme an \nzahlreichen Kongressen und Tagungen, auf denen ich meine Arbeit präsentieren konnte. \nIm Speziellen danke ich Frau Prof. Dr. Ruth Grümmer  für die hervorragende Betreuung \ndieser Arbeit. \n \nEin besonderer Dank gebührt allen Angehörigen des Instituts für Molekularbiologie für die \nHilfsbereitschaft und die tolle Arbeitsatmosphäre. Dr. Alexander Gellhaus, Dr. Jessica \nWagener, Stephanie Kaiser und Friederike Kipkeew da nke ich für die ständige \nDiskussionsbereitschaft und die Hilfestellungen, di e sie mir oftmals bei Problemen und \nFragestellungen geleistet haben. An dieser Stelle m öchte ich nicht versäumen, Gabriele \nSehn, Ursula Schmücker, Claudine Kühn und Kathrin Kazuschke meinen besonderen Dank \nauszusprechen, da sie mich tatkräftig bei der Labor arbeit unterstützt und alle meine Fragen \ngeduldig beantwortet haben. \n \nDer Abteilung für Gynäkologie des Universitätsklink ums Essen unter der Leitung von \nHerrn Prof. Dr. Kimmig danke ich für die Bereitstel lung der Gewebeproben. Auch möchte \nich mich bei der Abteilung Pathologie des Universit ätsklinikums Essen unter Leitung von \nHerrn Prof. Dr. Schmid und hier besonders bei Frau Stephanie Levin für die Hilfe bei der \nDurchführung der immunnhistochemischen Färbungen recht herzlich bedanken. \n \nGanz herzlich möchte ich mich bei meiner Familie un d meinen Freunden für ihr \nVerständnis und ihre Unterstützung bedanken. \n \n \nDie hier durchgeführten Arbeiten wurden von Bayer H ealthCare Pharmaceuticals \nunterstützt. \n\nLebenslauf 97  \n9 Lebenslauf \n \nDer Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten.","source_license":"CC0","license_restricted":false}