Efeitos do sistema intra-uterino de Levonorgestrel sobre marcadores de risco cardiovascular de pacientes com endometriose: estudo comparativo com o análogo do GnRH

FERREIRA, R.A. Effects of the levonorgestrel-releasing intrauterine system on cardiovascular risk mark ers in patients with endometrio sis: a comparative study with the GnRH analogue. 2009. 62 f. Thesis (Doctoral) – Facu ldade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. The aim of this prospective and controlled study was to evaluate th e cardiovascular risk markers associated with endometriosis and the influence of the levonorgestrel intra-uterine system (LNG-IUS) compared with the GnRH analogue (GnRHa) leuprolide acetate on these risks after six months of treatment.

This was a randomized, prospective, ope n clinical study, with 44 patients with laparoscopically and histologically confirmed en dometriosis. Patients were randomized into two groups: LNG-IUS group, 22 patients submitted to LNG-IUS insertion, and GnRHa group, 22 patients who received a monthly GnRHa in jection for six months. Body mass index, systolic and diastolic arterial blood pressure, heart rate and laboratory cardiovascular risk markers such as interleukin-6 (IL-6), tumor n ecrosis factor-alpha (TNF-alpha), C-reactive protein (CRP), homocysteine (HMC), lipid pr ofile, total leucocytes, and vascular cell adhesion molecule (VCAM) were measured before and six months after treatment. Results: in the LNG-IUS group, there was reduction of the levels of VCAM (92.8 +4.2 to 91.2+2.7 ng/mL, p = 0.04), CRP (0.38+0.30 to 0.28+0.21 mg /dL, p = 0.03), total cholesterol (247.0+85.0 to 180.0+31.0 mg/dL, p = 0.0002), triglycerides (118.0+ 76.0 to 86.5+41.5 mg/dL, p = 0.003), LDL (160.5+66.0 to 114.5+25.5 mg/dL, p = 0.0005) and HDL (63.0+20.5 to 48.5+10.5 mg/dL, p = 0.002). The GnRHa gr oup showed an increase of HMC levels (11.5+2.9 to 13.0+2.7 µmol/L, p = 0.04) and a reduc tion of IL-6 levels (4.3+3.9 to 2.3+0.8 pg/mL, p = 0.005), VCAM (94.0+3.8 to 92.0+1.6 ng/ mL, p = 0.03) and total leucocytes (7330+2554 to 6350+1778, p = 0.01). Conclusions: This study shows that some cardiovascular risk markers are influenced by both GnRHa and LNG-IUS, but the latter had a greater positive impact on the lipid profile, which could lead to a favorable effect during long- term treatment.

endometriosis, levonorgestrel, cardiovascular diseases, leuprolide, risk factors. LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Características dos grupos SIU- LNG e aGnRH (acetato de Leuprolide) pré- tratamento................................................................................................................. 41 Tabela 2- Efeitos do SIU-LNG e do aGnRH (A cetato de Leuprolide) sobre marcadores clínicos de risco cardiovascular em mulheres com endometriose ........................... 42 Tabela 3- Efeitos do SIU-LNG e do aGnRH (acet ato de Leuprolide) sobre os marcadores de risco cardiovasculares séricos em pacien tes com endometriose em seis meses de tratamento................................................................................................................. 44 Tabela 4- Efeitos do SIU-LNG e do aGnRH (acetato de Leuprolide) sobre o perfil lipídico em pacientes com endometriose em seis meses de tratamento...................................... 44 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1- Fluxograma do estudo............................................................................................... 37 LISTA DE ABREVIATURAS aGnRH - agonista do hormônio liberador de gonadotrofinas COCs – contraceptivos orais combinados CT – colesterol total DP – desvio padrão da média DPC – dor pélvica crônica DCV – doenças cardiovasculares FC – freqüência cardíaca HDL – lipoproteína de alta densidade HDL-C – HDL colesterol HHO – eixo hipotálamo hipófise ovariano LDL – lipoproteína de baixa densidade LDL – C – LDL colesterol Fig. - figura GnRH - hormônio liberador de gonadotrofinas ICAM-1 – molécula intra-celular de adesão tipo 1 IL-1 – Interleucina-1 IL-6 – Interleucina-6 IMC – índice de massa corporal LCT – leucócitos LNG – levonorgestrel MPA – acetato de medroxiprogesterona MMPs - metaloproteases NK – células natural killers PAD – pressão arterial diastólica PAS – pressão arterial sistólica PCR – proteína C reativa PDGF – fator de crescimento derivado de plaquetas SIU – sistema intra-uterino SIU-LNG – sistema intra-uterino liberador de levonorgestrel TIMPs – inibidores teciduais de metaloproteases (tissue inhibitors of metalloproteases) TNF – fator de necrose tumoral (Tumoral necrosis factor) TNF-α – fator de necrose tumoral alfa TNF-β – fator de necrose tumoral beta TGF-β - fator de crescimento transformador β TGL – triglicérides VCAM-1 – molécula de adesão de célula vascular tipo 1 VEGF - fator de crescimento endotelial vascular SUMÁRIO SUMÁRIO∗ INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 22 1. Endometriose........................................................................................................................ 23 1.1 1.3.Endometriose e inflamação .......................................................................................... 24 1.2 Endometriose e Sistema Cardiovascular ............................................................................ 26 1.3 Opções terapêuticas para endometriose.............................................................................. 28 1.3.1. Sistema intra-uterino liberador de levonorgestrel (SIU-LNG) ...................................... 30 1.3.1.1. SIU-LNG no tratamento da dor pélvica associada à endometriose............................. 31 OBJETIVO ............................................................................................................................. 33 CASUÍSTICA E MÉTODOS ................................................................................................ 35 RESULTADOS ....................................................................................................................... 40 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 45 CONCLUSÕES....................................................................................................................... 51 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS** ............................................................................. 52 ARTIGO.................................................................................................................................. 56 ∗ A redação desta tese foi realizada segundo as “Diretrizes para apresent ação de dissertações e teses da USP” (UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. Diretrizes para a apresentação de dissertações e teses da USP: documentos eletrônicos ou impressos. São Paulo: SIBi-USP, 2004, 110p.). **As referências bibliográficas foram redigidas conforme normas da International Comittee of Medical Journal Editors (Vancouver Style) - Grupo de Vancouver. INTRODUÇÃO 23 1. Endometriose A presença de tecido endometrial funci onante ectópico, ou seja, fora da cavidade uterina, caracteriza a endometriose. Em mulheres no menacme, estima-se a prevalência de endometriose de 5 a 10% (1, 2), porém essa in cidência é controvers a devido ao grande número de subdiagnósticos e à grande variação entre as populações estudadas. Pacientes com endometriose podem apresentar dor pélvica crôni ca, dismenorréia, infertilidade e distúrbios menstruais (3), interferindo significantement e na qualidade de vida das mulheres que a apresentam (4). Apesar de descrita há vários anos, os conhecimentos sobre a fisiopatologia, a patogênese e a evolução espontânea dessa doenç a ainda são escassos. Existem muitas teorias que tentam explicar o aparecimento dos focos de endometriose, mas nenhuma delas consegue isoladamente justificar os diferentes comportamentos da endometriose. Uma das hipóteses mais propagadas para a sua etiologia, ch amada teoria de Sampson, é a de que haveria aderência de tecido endometr ial pós-menstrual na cavidade peritoneal e demais órgãos devido ao fluxo tubário retrógrado. Porém, com a realização de um número maior de laparoscopias, surgiu a comprovação de que praticamente 90% das mulheres têm trompas pérvias com fluxo retrógrado e, no enta nto, a maioria não apresenta endometriose, fazendo com que essa hipótese não tenha força suficiente para explicar completamente a etiologia dessa moléstia. Baseado nisso, alguns autores vem defendendo a presença de que algum outro fator, ou fatores associados ao fluxo retrógrado, seriam capazes de permitir a implantação deste tecido na cavidade abdominal . Discute-se a idéia de que a endometriose seria decorrente de um desequilíbrio entre fatores pró e antiinflamatórios que comprometeriam a integridade da matriz extr acelular favorecendo a implantação do tecido endometrial descamado na cavidade abdominal, promovendo o desenvolvimento dos focos de endometriose (5). 24 1.1. Endometriose e inflamação Já foi descrito que a adesão entre o tecido endometrial e o peritôni o ocorreria por meio das integrinas, que modulam a adesão celular (6), como a molécula intra-celular de adesão tipo 1 (ICAM-1) e a molécula das células vasc ulares de adesão tipo 1 (VCAM-1) (7). A matriz extracelular peritoneal é invadida pelas células do e ndométrio aderido ao peritônio, provavelmente devido a uma diferença de co ncentração entre enzimas de degradação de componentes da matriz extracelular e seus reguladores. As metaloproteases (MMPs) são enzimas zinco-dependentes com capacidade de promover a remode lação da matriz extracelular quando associados a seus inibidores (TIMPs- tissue inhibitors of metalloproteases). Vários estudos demonstraram um aumento na quantidade de algumas MMPs e redução de TIMPs produzidos pelo endo métrio tópico e ectópico de paciente com endometriose quando comparados com o endométrio de pacientes sem a doe nça, justificando uma maior capacidade invasora deste tecido no fluxo menstrual retrógrado (5). Outros marcadores inflamatórios, como as citocinas e fatores de crescimento, também apresentam papel importante no surgimento e desenvolvimento dos implantes endometriais. Citocinas e fatores de crescimento são proteína s ou glicoproteínas, em geral sintetizados por leucócitos e outras células pa ra o meio extracelular, levando a atividades autócrina e parácrina, além de promoverem comunicação ce lular com o sistema imunológico. À citocina Interleucina-1 (IL-1), produzida por macróf agos e monócitos ativados, é atribuída a estimulação da angiogênese em lesões endomet rióticas, através da estimulação de outros fatores angiogênicos, como a IL-6 e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (8), e também promoveria maior atividade das ICAMs- 1 (9). Células epiteliais e estromais do endométrio produzem a IL-6, ao serem estimuladas, dentre outros, pela IL-1 e pelo fator de crescimento tumoral (TGLF) (8, 10). As concen trações de IL-6 durante o ciclo menstrual são variáveis, isto é, são menores durante a fase proliferativa e maiores na fase secretora (11). 25 Zarmakoupis e cols. demonstraram que a IL-6 inibe a proliferação das células estromais endometriais (12). Assim, como o estrogênio estim ula a proliferação endo metrial, acredita-se que isso ocorra pela redução da síntese de inibidores do crescimento celular endometrial como a IL-6. Estudos in vitro, em pacientes com endometriose, demonstraram alterações na resposta da IL-6 em macrófagos presentes no sangue e no peritônio e no estroma endometrial (13, 14, 15). Os resultados são conflitantes em relação ao que foi encontrado no fluido peritoneal de pacientes com endometriose, onde alguns estudos demonstraram aumento na concentração de IL-6 (16, 17) enquanto outros revelaram diminuição (18, 19) e um estudo não encontrou diferenças entre pacientes com endometrios e e o grupo controle ( 20). O VEGF produzido pelos implantes endometrióticos estimula a ne ovascularização (21). A IL-1 estimula a produção de VEGF, assim como a hipóxia teci dual, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformador β (TGLF-β) e as prostaglandinas. (8, 22, 23). Os fatores de necrose tumoral (TNF) sã o citocinas que apresentam ações diversas no organismo. Enquanto a TNF- β é produzida pelos linfócitos, a TNF- α é sintetizada pelos macrófagos, monócitos ativados, células natural-killers (NK), neutrófilos, células endometriais, dentre outras. Estudos demonstraram que a concentração elevada de TNF- α no fluido peritoneal de pacientes com endometriose se relaciona com o estágio da doença (24) e seja devida a maior atividade dos macrófagos e monócitos (13, 25). Outras evidências também relacionam o estresse oxidativo e o estado inflamatório intrínsecos com o aparecimento e desenvolvime nto da endometriose (26, 27, 28, 29). Além disso, a endometriose também tem sido asso ciada a outras doenças metabólicas, como dislipidemia, resistência insulínica e aterosclerose (30, 31). 26 1.2. Endometriose e sistema cardiovascular. As doenças cardiovasculares (DCV) repres entam a principal causa de morte em mulheres após a menopausa (32). O evento pr imordial para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares é a presença de ateroscleros e, que é um processo crônico, progressivo e sistêmico, caracterizado por resposta inflamatór ia e fibroproliferativa da parede arterial a agressões ao endotélio (33). Os principais fatores de risco relacionados com lesão arterial são: obesidade, hipercolesterolemia, hipertensão arte rial sistêmica, diabetes mellitus, tabagismo, hiperhomocisteinemia, envelhecimento e suscetibilidade genética (34). As lesões iniciais dessa moléstia já estão presentes em adolescentes e adultos jovens, levando décadas para manifestar sintomatologia clínica (35). A disfunção endotelial causada pelos fatores de risco anteriormente citados se ria o primeiro passo para o desenvolvimento da aterosclerose, alterando as propriedades homeostáticas no rmais do endotélio. Assim, as diferentes formas de agressão endotelial aumentam permeabilidade endotelial e a adesão do mesmo a leucócitos e plaquetas. Além disso, a injúria ao endotélio faz com que este apresente propriedades pró-coagulantes ao invés de anti -coagulantes e sintetize moléculas vasoativas, citocinas e fatores de crescimento. Se a res posta inflamatória não remover ou neutralizar efetivamente os agentes promotores de disf unção, ela pode se perpetuar e estimular a migração e proliferação de células musculares lisas na área de inflamação (34). A manutenção dessa resposta leva ao espessamento da parede arterial, a migração de macrófagos e linfócitos para área afetada, aumentando o dano arterial pela produção de enzimas hidrolíticas e citocinas que podem promover necrose focal co m conseqüente fibros e (36). Esse ciclo contínuo de acumulação de células mononucleares, migração e proliferação de células musculares lisas e formação de fibrose, leva a formação da placa composta por uma capa fibrosa sobre uma camada lipídic a e de células necróticas, re sponsável pelas manifestações clínicas da aterosclerose devido à obstrução ao fluxo sangüíneo na artéria acometida. 27 A possível associação entre endometriose e aterosclerose tem sido aventada (31). A endometriose afeta mulheres jovens, enquanto a aterosclerose é considerada doença de idades mais avançadas. No entanto, ambas as doenças são caracterizadas por aumento da atividade macrofágica e produção de citocinas inflamatórias. Devido ao fato da inflamação exercer papel crucial no desenvolviment o da aterosclerose, acre dita-se que pacientes com endometriose, que se traduz por uma doença in flamatória crônica, possam apresentar risco aumentado para doenças cardiovasculares (DCV) (31). Alguns marcadores inflamatórios, comume nte descritos em pacientes de risco aumentado para DCV, como a IL-6, o fator de necrose tumoral α (TGLF-α) (37, 38), presença de macrófagos ativados, expressão de mol éculas de adesão celular (ICAM e VCAM), marcadores de estresse oxidativo (39, 40, 41) , entre outros, vêm sendo descritos como aumentados tanto no fluido peritoneal como no soro de pacientes portadoras de endometriose. Também foi descrito aumento de metaloprotei nases (MMPs), importante para destruição da matriz extracelular, tanto em pacientes ateroscleróticas (42) como em pacientes endometrióticas (5) e aumento de proteína C reativa, preditor bioquímico inflamatório de maior valor para DCV (43, 44). Por outro lado, alterações do metabolismo lipídico são fortemente relacionadas a risco cardiovascular (45). Atualmente, poucos autores compararam o perfil lipídico basal de mulheres portadoras de endometriose com controles, porém nenhum deles avaliou as pacientes sem o efeito de medicações que potencialmente podem alterar a síntese de lipoproteínas (1, 10, 11). Devido a esta limitação, têm sido descritos desde um perfil lipídico desfavorável até ausência de alteração nestas variáveis (1, 30, 46, 47). Já vimos que alguns dos tratamentos clínicos atualmente propostos para a endometriose, com melhora significativa da dor pélvica provocada pela doen ça, são os análogos do GnRH (aGnRH) e o sistema intra-uterino liberador de levonorgestrel (SIU-LNG) (48) e que, enquanto o primeiro atua através do bloqueio do eixo hipotálamo-hipófise-ovariano levando a 28 um quadro de hipoestrogenismo, com repercussões negativas sobre o metabolismo lipídico (46), o SIU-LNG provoca atrofi a das glândulas endometriais (49). Existem, entretanto, especulações de que o progestágeno abso rvido sistemicamente poderia influenciar negativamente o metabolismo lipídico (50) embora exista relato com resultado diferente (51). Assim, como as pacientes portadoras de endo metriose são jovens e assintomáticas do ponto de vista cardiovascular, a av aliação de disfunção endotelial, um evento precoce no aparecimento da aterosclerose, irá contribuir para a investigação da associação dessas duas doenças que apresentam várias características fisiopatológicas comu ns. Além disso, caso exista associação, possibilita a intervenção precoce preventiva do aparelho cardiovascular nesse grupo de pacientes. Como a proposta de tratamento de pacientes com endometriose é em geral por períodos prolongados, e estas pacientes podem já apresentar elevação de marcadores inflamatórios e de disfunção endotelia l, torna-se importante avaliar os efeitos dos diferentes tratamentos sobre eventuais fatore s de risco de doença cardiovascular, como marcadores inflamatórios e lipoproteínas. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência do SIU-LNG sobre os marcadores in flamatórios e de risco cardiovascular em um período de seis meses, comparado ao tratamento clássico com aGnRH. 1.3. Opções terapêuticas para a endometriose Os esquemas terapêuticos atualmente pr opostos variam de ci rúrgico a clínico, exclusivos ou associados, na dependência do quadro clínico da paciente e do desejo ou não de concepção. Ao contrário dos procedimentos cirúrgicos, os medicamentos hormonais não reduzem as lesões, apenas realizam a supressão da função ovariana. Também são utilizados anti- inflamatórios não esteroidais, visando espe cificamente à melhora da sintomatologia envolvendo a dor pélvica e a dismenorréia. Tr atamento hormonal inclui o uso do análogo do 29 GnRH (aGnRH), considerado o padrão ouro (52), progestágenos, de rivados do androgênio (Danazol) e contraceptivos orais combinados (COC). Os análogos do GnRH são drogas sintéticas com estrutura molecular semelhante à do próprio GnRH, com a substituição de um dos aminoácidos da cadeia do polipeptídio orig inal. A ligação inicial ao receptor produz um efeito positivo de liberação de gonadotrofinas chamado de efeito "flare-up". Depois, a permanência no receptor leva a um bloqueio do mesmo com um efeito inibidor que cursa com a supressão do eixo hipotálamo- hipófise-ovário (HHO) (53). O uso de análogos do GnRH, com bloqueio hipofisário prolongado e criação de um estado hipoestrogênico, acarreta melhora significativa nos quadros de dor pélv ica e melhora nas taxa s de fertilidade nas pacientes submetidas a procedimento de Reprod ução Assistida (54), porém apresenta efeitos colaterais importantes. Com a s upressão da atividade ovariana, o estado de hipoestrogenismo criado acarreta sintomatologia i gual à observada em mulheres na pós-menopausa, além de levarem a redução da massa óssea, principalm ente se utilizadas po r período superior a 6 meses (55), muito embora a terapia de add-back possa ser utilizada concomitantemente ao tratamento prolongado com aGnRH (56). Os contraceptivos orais combinados (COCs), em uso contínuo ou cíclico, também têm apresentado um efeito equivalente ao dos an álogos de GnRH, quando usados por um período maior do que seis meses. Provavelmente é o efei to simultâneo e contínuo da progesterona que permite o tratamento da endometriose (57). Tem a vantagem de repor os estrogênios não produzidos pela hipófise supressa, mas aprese nta limitações, contra-indicações e efeitos colaterais dos estrogênios sintéticos e progest agênios. Já é bem estabelecido o aumento do risco de episódios tromboembólic os relacionados ao uso do CO Cs (58) e interferência no sistema imunológico relacionado com reagudização ou piora na evolução de doenças auto- imunes como o Lúpus Eritematoso Sistêmico e a Síndrome de Anticorpo Anti-Fosfolípides (59). 30 Um progestágeno também utilizado em pacientes com endometriose é o acetato de medroxiprogesterona (60), na forma intramuscular de depósito, que também acarreta o hipoestrogenismo e logo, a redução da massa óssea em longo prazo. Por outro lado, quando a queixa principal é a dor pélvica ou a paciente nã o tem o desejo de uma gestação, o MPA e os COC são utilizados visando o alívio sintomático (61). Porém, estes também tem seus efeitos colaterais bem conhecidos: ganho de peso, acne, mastodinia e irregularidade menstrual. Por tudo isso, o maior desafio a ser enfrenta do é a aderência ao tratamento prolongado da endometriose. 1.3.1. Sistema Intra-útero liberador de levonorgestrel (SIU-LNG) Houve, então, a necessidade de se pesquisa r novas altern ativas terapêuticas. E uma bem promissora foi inicialmente desenvolvida por Luukainen et al., em 1970 (62). Trata-se de um dispositivo plástico com formato de um “T” (SIU-LNG), medindo 32mm, envolvido em sua haste vertical por um cilindro contendo 52mg de levonorgestrel, um potente progestágeno, derivado da 19-nortestosterona, que é coberto por uma membrana sintética (polydimethylsiloxane) a qual promove a liberação intra-uterina de 20 µg do esteróide por dia, durante 5 anos. Tal possibilidade de um tratamento prolongado, sem a necessidade do uso diário do medicamento, coloca-o em uma situ ação favorável à sua aderência. O SIU-LNG age, promovendo a atrofia e inatividade do endométrio, através de sua atividade progestagênica (60), sem no entanto inibir a ovulação e a produção estrogênica ovariana (63, 64). 31 1.3.1.1. Sistema Intra-útero liberador de levonorgestrel (SIU-LNG) no tratamento da dor pélvica associada à endometriose Apesar de inicialmente desenvolvido como contraceptivo, o SIU-LNG vem sendo utilizado em outras situações. Fedele et al., em 1997, estudou 23 mulheres portadoras de adenomiose e que já após 1 ano de util ização do SIU-LNG, foi observado redução do sangramento menstrual em 16 delas e diminuição significativa do volume uterino (65). Foram observados resultados semelhantes em outros estudos que também avaliaram mulheres com esta mesma patologia (66, 67). Vercellini et al. acompanharam 20 paci entes com diagnóstico laparoscópico de endometriose, identificando uma considerável redução da perda sanguínea menstrual bem como da dismenorréia (68) após a utili zação do SIU-LNG por 12 meses. O mesmo autor comparou dois grupos de mulheres com endo metriose, após terem sido submetidas à laparoscopia cirúrgica, reali zando o tratamento com o SI U-LNG (n=20) versus conduta expectante (n=20), observando-se recorrência de dismenorréia moderada ou severa em 10% das pacientes no primeiro gr upo contra 45% nas do segundo (69). Em um estudo clínico randomizado publicado por Petta et al. (48), 82 pacientes co m dor pélvica crônica (DPC) e endometriose foram divididas em dois grupos de tratamento: um recebeu o SIU-LNG (n=39) e o outro se submeteu a aplicações intramusculares mensais de aGnRH (Lupron depot 3,75mg) (n=43). Já após o primeiro mês de tratamento, foi observada a diminuição significante da DPC, através da análise da escala visual de dor, sem diferença entre os grupos, permanecendo assim até o sexto mês desse estudo. As taxas de amenorréia foram de 70% e 98% ao final do estudo, respectivamente no grupo do SIU-LNG e do aGnRH. Fedele et al. encontraram redução da dismenorréia e da disp areunia bem como das lesões presentes em 11 mulheres portadoras de endometriose do sept o retovaginal, após 12 meses de uso do SIU- LNG (70). Em 2004, Lockhat et al avaliaram 34 mulheres com diagnóstico laparoscópico de 32 endometriose submetidas à colocação do SIU-LNG, identificando melhora significante na DPC e além da redução do estádio da doença no “second look” laparoscópico, realizado após 6 meses de tratamento nas 29 pacientes que permaneceram no estudo (71). Três pacientes desistiram devido a DPC, uma devido ao apar ecimento de acne e uma por razões pessoais. Aquelas que continuaram usando o SIU-LNG fora m avaliadas semestralmente, durante mais 30 meses (72). A taxa de continuidade do uso do SIU-LNG foi de 68%, 62% e 56%, respectivamente após 12, 24 e 36 meses do início do tratamento. As razões mais freqüentes para a descontinuação do método foram irregula ridade menstrual (14 ,7%), dor abdominal (11,8%) e ganho de peso (8,8%). No entanto, o controle da DPC e da perda sanguínea menstrual permaneceram menores até o final do estudo entre aquelas que continuaram com o SIU-LNG. Existem diversos estudos que demonstraram benefícios tais como redução do sangramento menstrual e do volume uterino em mulheres portadoras de miomatose uterina (73, 74, 75, 76). OBJETIVO 34 O objetivo deste estudo foi avaliar a infl uência do SIU-LNG sobre os marcadores inflamatórios e de risco cardiovascular em um período de seis meses, comparado ao tratamento clássico com GnRHa. CASUÍSTICA E MÉTODOS 36 Trata-se de um ensaio clínico aberto, randomizado, prospectivo e controlado, no qual foram avaliadas 40 pacientes portadoras de endometriose com idade entre 18 e 40 anos e com a função ovariana preservada, selecionadas de maneira consecutiva no ambulatório de dor pélvica e endoscopia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. O diagnóstico de endometriose foi confirmado por laparoscopia e histologia realizadas entre 3 e 24 meses antes da inclusão no estudo. Todas apresentavam dor pélvica crônica e estavam sem tratamento medicamentoso no momento da randomização, há pe lo menos três meses para contraceptivos hormonais orais e há seis meses para progestágenos de depósito e análogos do GnRH. O tamanho amostral foi calculado pelo pr ograma GraphPad StatMate® (Graphpad Software, San Diego Califórnia, USA). Com um a inclusão de 16 pacientes com endometriose e sem tratamento, detectaríamos uma alteração superior ou igual a 20% na média do low- density lipoprotein colesterol (LDL-C) consider ando os resultados de Al-Omari et al. (77), com α = 5% e poder de teste de 90% , durante o período de seis meses de tratamento. Foi incluído um número maior de pacientes do que o necessário considerando a possibilidade de perda ao longo do seguimento. Foram excluídas pacientes obesas (Índice de Massa Corporal – IMC>30Kg/m 2), tabagistas, diabéticas, etilistas ou usuárias de drogas, pacientes com desejo atual de concepção, portadoras de doenças crônicas, portadoras de processos inflamatórios e/ou infecciosos agudos e/ou crônicos, pacientes com antecedente pessoal e/ou familia r de eventos tromboem bólicos ou em uso de medicações que conhecidamente interfiram nos marcadores de inflamação em período inferior a 15 dias (como antiinflamatórios hormonais e não hormonais). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de É tica em Pesquisa do referido hospital e todas as pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Foram selecionadas 62 pacientes para a rea lização desse estudo. No entanto, seis não quiseram participar e 12 foram excluídas por nã o se enquadrarem nos critérios de inclusão. 37 Realizou-se a alocação das 44 pacientes restan tes através de uma seqüência de randomização gerada pelo software GraphPad StatMate for Windows (GraphPad StatMate version 1.01i, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com), tendo sido 22 colocadas no grupo SIU-LNG e 22 no grupo aGnR H. No grupo aGnRH, uma das pacientes engravidou antes da aplicação do medicamento e três pacientes mudaram-se para outra cidade, perdendo o seguimento nesse estudo. Ao final, o grupo SIU-LNG foi composto de 22 pacientes submetidas à colocação do SIU-LNG, realizada conforme todas as instruções criadas pelo laboratório fabricante e sempre por um único examinador, enquanto o grupo aGnRH constituiu-se de 18 pacientes tratad as com acetato de leuprolida 3,75mg, com aplicações intra-musculares mensais, por um período de seis meses. (Fig. 1). Women assessed for eligibility (n=62) Excluded (n=18) Not meeting inclusion criteria (n=12) Refused to participate (n=6) Randomized: 44 Allocated to SIU-LNG (n=22) Received SIU-LNG (n=22) Allocated to GnRHa (n=22) Received GnRHa (n=21) Did not received GnRHa (n=1) Patient became pregnant before insertion Lost to follow up (n=0) Discontinued intervention (n=0) Analyzed (n=22) Lost to follow up (n=3) Patients have moved to another town. Discontinued intervention (n=0) Analyzed (n=18) Figura1: Fluxograma do estudo 38 As pacientes foram avaliadas quanto ao IMC, pressão arterial sistólica e diastólica (PAS e PAD), freqüência cardíaca (FC), escore de do r e a dosagem de marcadores inflamatórios e de lesão endotelial previamente ao início do tratamento e após seis meses de uso das medicações. Foi utilizada a escala visual analógica para avaliação do escore de dor. As pacientes relatavam a intensidade da dor apresentada diariamente. A escala visual consiste em uma avaliação subjetiva da dor em uma escala en tre 0 e 10, onde 0 representa ausência de dor e 10 a maior intensidade de dor (78). A paciente anotava em uma linha não graduada de 10 cm a intensidade da dor apresentada. Foram colhidos 20 mL de sangue total para análise dos marcadores inflamatórios e de risco cardiovascular, após jejum de 12 horas. Os marcadores séricos analisados foram: a interleucina 6 (IL-6), o fator de necrose tumoral- α (TNF-α) e a homocisteína, todos avaliados através do método de quimiluminescênci a, utilizando-se o aparelho DPC Immulite ® 1000 (Diagnostic Products Corporation, Siemens ®, Los Angeles, CA, USA ®). A proteína C reativa foi realizada pelo método de imunoensaio turb idimétrico com látex, com aparelho Konelab 60i (Wiener lab., Rosário, Argentina). O leucograma foi dosado por contagem automatizada, utilizando-se o aparelho Coulter Gens e Cou lter STKS (Florida, USA). Do perfil lipídico, foram dosados: colesterol total (CT), high-density lipoprotein colesterol (HDL-C), low- density lipoprotein colesterol (LDL-C) e triglicérides (T GL). O aparelho utilizado foi o BT 3000 plus (Wiener lab ®, Rosario, Argentina). Para o colesterol total, TGL e HDL-C o método empregado foi o enzimático. O LDL-C foi calcula do a partir da fórmula de Friedewald: LDL- C = colesterol total – (HDL-C + TGL/5), uma vez que não havia, nas amostras, dosagem de TGL superior a 400mg/dL (79). A molécula de adesão das células vasculares (VCAM) foi dosada pelo método de Elisa (R &D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Todas estas variáveis foram dosados imediatamente antes do início das medicações e após 6 meses de uso das medicações. 39 Foi utilizado o teste de Kolmogorov-Smirnov para verificação da normalidade das amostras. Para as variáveis cuja distribuição era normal, utilizou-se o teste t não pareado para a comparação inter-grupos e o teste t pareado pa ra intra-grupo. Na ausência de distribuição normal, os testes utiliza dos foram o Mann-Whitney e o Wilcoxon, respectivamente para comparações inter-grupos e intra-grupo. As aná lises estatísticas foram realizadas com o auxílio dos softwares SPSS 16.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) e GraphPad 5.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA). O nível de significância adotado foi de 5%. RESULTADOS 41 A média de idade das pacientes foi de 28,8 + 4,9 anos e 31,4 + 5,8 anos nos grupos SIU- LNG e aGnRH, respectivamente, sem diferença estatística entre ambos (p=0,14). Não houve diferença pré-tratamento entre os marcadores cl ínicos e laboratoriais de risco cardiovascular bem como no perfil lipídico entre os dois grupos (Tabela 1). Tabela 1 – Características dos grupos SIU-LNG e aGnRH pré-tratamento. SIU-LNG (n=22) aGnRH (n=18) Valor p Basal (media + DP) Basal (média + DP) basal SIU-LNG x basal aGnRH Dor (Escala de dor) 7,3+ 1,6 7,2+ 1,5 0,66 IMC (Kg/m2) 23,6±4,3 24,5±4,5 0,97 PA sistólica (mmHg) 107,7±9,7 112,8±13,2 0,29 PA diastólica (mmHg) 72,3±6,1 75,5±7,8 0,14 FC (bpm) 74,2±4,6 76,8±5,9 0,12 Homocisteína(µmol/L) 12,4±3,7 11,5±2,9 0,56 IL-6 (pg/mL) 2,26 + 0,67 2,98±1,5 0,07 VCAM (ng/mL) 93,0±3,3 93,9±4 0,36 Leucócitos(x 10 3 células) 7,3±2,1 7,5±2,6 0,83 PCR (mg/dL) 0,39±0,3 0,4±0,3 1,0 TNF-α (pg/mL) 6,0±1,5 5,83±1,8 0,76 CT (mg/dL) 242,3 + 82,2 228,6 + 57,7 0,95 TGL (mg/dL) 115,3 + 75,8 128,9 + 91,4 0,93 LDL-C (mg/dL) 158,7 + 65 142,7 + 40 0,81 HDL-C (mg/dL) 60,5 + 19,3 60 + 15,6 0,94 IMC= Índice Massa Corporal, PA= Pressão Arterial, FC= Freqüência Cardíaca, IL-6: Interleucina-6, VC AM-1: molécula de adesão de célula vascular, PCR: proteína C reativa; TNF: fator de necrose tumora l, CT: colesterol total, TGL: triglicérides, LDL-C: LDL colester ol e HDL-C: HDL colesterol. 42 Entre as variáveis clínicas analisadas (Tabela 2), não houve variação entre o período pré e o pós-tratamento dos dois grupos de estudo. Tabela 2 – Efeitos do SIU-LNG e do aGnRH (A cetato de Leuprolide) sobre marcadores clínicos de risco cardiovascular em mulheres com endometriose SIU-LNG (n=22) aGnRH (n=18) Basal (media + DP) 6 meses (média + DP) Basal (média + DP) 6 meses (média + DP) IMC (Kg/m2) 23,6±4,3 23,8±4,5 24,5±4,5 24,3±4,5 PA sistólica (mmHg) 107,7±9,7 105,9±10,1 112,8±13,2 111,7±12,9 PA diastólica (mmHg) 72,3±6,1 71,8±6,6 75,5±7,8 75,0±6,2 FC (bpm) 72,4±4,6 72,8±5,8 76,8±5,9 78,0±7,9 IMC= Índice Massa Corporal, PA= Pressão Arterial, e FC= Freqüência Cardíaca. p>0,05 para todas as variáveis Em ambos os grupos, houve redução signi ficativa do escore de dor de 7,3+ 1,5 para 1,2+1,75 (grupo SIU-LNG) e de 7,1+ 1,46 para 0,7+ 1,37 (grupo aGnRH) após seis meses de tratamento (p<0,001). Porém, essa melhora nã o foi diferente entre as duas medicações avaliadas (p=0,21). Quanto à dosagem dos marcadores sérico s, não houve diferença nos valores pré- tratamento entre os grupos (Tabela 3). O gr upo SIU-LNG apresentou redução dos níveis séricos de VCAM e da PCR (Tabela 3). Em re lação ao lipidograma, observou-se, durante o período de tratamento, redução de 25,4% dos níveis de CT (Basal: 242,3 + 82,2mg/dL vs. 6 meses: 180,8 + 31,6mg/dL, p=0,0007), de 20,8% dos níveis de HDL-C (Basal: 60,5 + 43 19,3mg/dL vs. 6 meses: 47,9 + 10,8mg/dL, p=0,0048), de 27,2% dos níveis de LDL-C (Basal: 158,7 + 65mg/dL vs. 6 meses: 115,6 + 25,3mg/dL, p=0,0016) e 25,8% dos níveis de TGL (Basal: 115,3 + 75,8mg/dL vs. 6 meses: 85,5 + 41,2mg/dL, p=0,0079) (Tabela 4). O grupo de usuárias de aGnRH apresentou elevação dos níveis de homocisteína, diminuição do número de leucócitos totais e da IL-6 (Tabela 3). Os demais marcadores não apresentaram modificação no período de tratamento nesse grupo (Tabela 3). Em relação aos níveis lipídicos, houve 25 pacientes com o nível de CT acima do recomendado (200mg/dL) no início do estudo, sendo 13 do grupo SIU-LNG e 12 do grupo aGnRH, o que contribuiu para a média ter sido elevada. Em ambos os grupos, sete pacientes possuíam valores superiores à 300mg/dL, se ndo cinco do grupo SIU-LNG. Avaliando-se os resultados do grupo aGnRH (tabela 4), não houve variação nos valores do CT (Basal: 228,6 + 57,7mg/dL vs. 6 meses: 223,5 + 58,4mg/dL, p=0,58), do HDL-C (Basal: 60 + 15,6mg/dL vs. 6 meses: 54,7 + 16,6mg/dL, p=0,08), do LDL-C (Basal: 142,7 + 40mg/dL vs. 6 meses: 138,9 + 42,8mg/dL, p=0,54) e dos TGL (Basal: 128,9 + 91,4mg/dL vs. 6 meses: 149,2 + 76,9mg/dL, p=0,26). Comparando-se os resulta dos pós-tratamento entre os grupos, o grupo SIU-LNG apresentou menores níveis de CT (SIU-LNG: 180,8 + 31,6 mg/dL vs. aGnRH: 223,5 + 58,4 mg/dL, p=0,0055), TGL (SIU-LNG: 85,5 + 41,2 mg/dL vs. aGnRH: 149,2 + 76,9 mg/dL, p=0,0011) e de LDL-C (115,6 + 25,3 mg/dL vs. 138,9 + 42,8 mg/dL, p=0,0144). Nas demais variáveis, não houve diferença entre os grupos no período pós-tratamento (Tabelas 3 e 4). 44 Tabela 3 – Efeitos do SIU-LNG e do aGnRH (acetato de Leuprolide) sobre os marcadores de risco cardiovasculares séricos em pacientes com endometriose em seis meses de tratamento SIU-LNG (n=22) aGnRH (n=18) Basal (média+DP) 6 meses (média+DP) Basal (média+DP) 6 meses (média+DP) Homocisteína(µmol/L) 12,4±3,7 11,4±3,8 11,5±2,9 13,1±2,6* IL-6 (pg/mL) 2,26 + 0,67 2,24 + 0,56 2,98±1,5 2,15 + 0,3* VCAM (ng/mL) 93,3±3,3 91,5±2,5* 93,7±4 92,2±1,5 Leucócitos(x 10 3 células) 7,3±2,1 6,9±1,7 7,5±2,6 6,5±1,8* PCR (mg/dL) 0,39±0,3 0,29±0,2* 0,4±0,3 0,37±0,30 TNF-α (pg/mL) 6,0±1,5 6,3±1,3 5,83±1,8 5,81±1,7 IL-6: Interleucina-6, VCAM-1: molécula de adesão de célula vascular, PCR: proteína C reativa e TNF: fator de necrose tumoral. * p<0,05 comparado ao pré-tratamento Tabela 4 – Efeitos do SIU-LNG e do aGnRH (acetato de Leuprolide) sobre o perfil lipídico em pacientes com endometriose em seis meses de tratamento SIU-LNG (n=22) aGnRH (n=18) Basal 6 meses Basal 6 meses CT (mg/dL) 242,3 + 82,2 180,8 + 31,6* τ 228,6 + 57,7 223,5 + 58,4 TGL (mg/dL) 115,3 + 75,8 85,5 + 41,2*τ 128,9 + 91,4 149,2 + 76,9 LDL-C (mg/dL) 158,7 + 65 115,6 + 25,3* τ 142,7 + 40 138,9 + 42,8 HDL-C (mg/dL) 60,5 + 19,3 47,9 + 10,8* 60 + 15,6 54,7 + 16,6 CT: colesterol total, TGL: triglicérides, LDL-C: LDL colesterol e HDL-C: HDL colesterol. Os valores estão expressos em média+ DP. * p<0,05 comparado ao pré-tratamento. τ p<0,05 comparando-se os pós-tratamentos. DISCUSSÃO 46 Nesse trabalho, avaliamos as alterações do perfil lipídico em paci entes portadoras de endometriose submetidas ao tratamento com SI U-LNG, comparativamente ao uso de aGnRH, modalidade já consagrada de tratamento. Nossos dados mostraram que o uso do SIU-LNG em portadoras de endometriose promoveu uma redução significativa nos níveis de CT, TG, LDL- C e HDL-C, além de uma diminuição dos marca dores inflamatórios VCAM e PCR após seis meses de avaliação, enquanto que o uso de aGnRH não promoveu modificações das variáveis lipídicas após o mesmo período de tratamento, embora tenha tido efeitos favoráveis sobre os marcadores inflamatórios IL-6 e leucócitos e desfavoráveis sobre a homocisteína. Não há estudos prévios em pacientes co m endometriose envolvendo comparação randomizada dos tratamentos utili zados nesse trabalho (SIU-LNG versus a GnRH) para avaliação de marcadores de risco cardiovascul ar. Porém há estudos que avaliaram os efeitos do aGnRH portadoras de endometriose. À se melhança de nossos achados, estes estudos mostraram que o uso de aGnRH não promoveu al teração dos níveis da s lipoproteínas (80, 81),. Entretanto, há relatos at é de piora do perfil lipídico após o uso de leuprolida em pacientes com leiomiomatose (82, 83) e do uso de triptorrelina em pacientes com endometriose (84, 85). Os esteróides sexuais atuam de maneira ma rcante sobre perfil lipídico, e algumas alterações podem ter um impacto sobre a aterogên ese. Os efeitos dos progestágenos sintéticos sobre o perfil lipídico variam conforme a resp ectiva atividade androgênica, a dose e a via de administração e associação ou não com estrogêni o. Quando combinado com o etinilestradiol, o levonorgestrel oral está associado a um aumento do LDL- C e diminuição do HDL-C (1, 45, 86, 87). Em contraste, o uso de combinações com desogestrel, progestágeno de menor afinidade androgênica, resulta em aumento do HDL-C, sem modificação do LDL-C (46, 88). O uso de levonorgestrel exclusivo, sob a form a de implantes, promove diminuição do CT, TG, LDL-C e HDL-C em mulheres normais (30, 47, 48, 89, 90, 91), em bora outros estudos 47 mostrem apenas redução dos níveis de CT e do HDL-C, quando comparado aos níveis encontrados em não-usuárias de métodos hormona is (51), sem alteração dos níveis de LDL-C e TGL. Por outro lado, ao contrário dos nosso s achados, o uso de levonorgestrel sob a forma de dispositivo intra-uterino nã o promoveu diferenças significant es nas concentrações séricas de CT, TGL, LDL e HDL, quando estudado em população normal ou em pacientes com menorragia (50, 92), e promoveu em outro est udo com mulheres norma is, com desejo de anticoncepção, aumento nos níveis de HDL, co mparadas com outras que não utilizavam nenhum contraceptivo hormonal (93). Em nosso estudo, o uso do SIU-LNG esteve as sociado a um decréscimo de todas as lipoproteínas após 6 meses de sua inserção quando comparado ao período pré-medicação, ao contrário do observado no grupo em uso de aG nRH e diferente do encontrado nos estudos anteriores citados, quando o SIU-LNG foi u tilizado em populações com mulheres normais. Embora o SIU-LNG produza altas concentrações locais de LNG no tecido endometrial com baixas concentrações plasmáticas, há sempre uma chance de ter um efeito metabólico, a depender do tempo de uso e da população estudada. O uso de progestágenos ganha importância em populações de maior risco meta bólico, como possivelmen te são as pacientes com endometriose. Modificações dos valores do lipidograma são importantes, pois alteram o risco de arteriosclerose e doença coronariana, ressaltan do-se o papel do LDL-C na aterogênese, sendo, por isso, o parâmetro mais importante a ser normalizado em casos de dislipidemia (85). A importância clínica de uma diminuição de LDL-C se deve ao seu envolvimento na aterogênese. Situações como tabagismo, hiperten são arterial, diabetes mellitus e dislipidemia podem promover a lesão endotelial, que contribui para a expressão de moléculas de adesão (VCAM, P-selectina) e a liberação de citocinas (interleucina 1, TNF- α). Conseqüentemente, ocorre a migração de células mononucleares (leucócitos e monócitos) e a penetração das 48 partículas do LDL que serão oxidadas no esp aço subendotelial. Quando os monócitos se localizam no espaço subendotelial, ocorre a tr ansformação destas células em macrófagos, que fagocitam as partículas de LDL oxidadas e formam as células espumosas. Estas células perpetuam o status inflamatório aumentado, predispõem a migração de miócitos modificados da camada média para a camada íntima arterial e a formação de colágeno, contribuindo para a formação da placa ateromatosa. Assim, o níve l elevado de LDL pode ser o gatilho para um processo proliferativo celula r nos vasos arteriai s, culminando com o desenvolvimento da aterosclerose (94). É possível que as mulheres com endometri ose apresentem maior predisposição à aterogênese, mas esta associação ainda não foi comprovada. Níveis elevados de LDL-C foram observados no fluido peritoneal (FP) de mulher es com endometriose (31). Entretanto, estes autores não correlacionaram as dosagens plasmá ticas de LDL-C com os seus níveis no FP e também não avaliaram os outros parâmetros do perfil lipídico. Se a quantidade de lipoproteínas presentes no FP tiver relação com os seus níveis plasmáticos (95), pode-se esperar que os níveis séricos de LDL-C sejam mais elevados em mulheres com endometriose. A ação do SIU-LNG favorável, com diminuição do LDL-C, se contrapõe à ação do aGnRH, que não mostrou efeitos sobre o CT e LDL-C, o que poderia trazer vantagens metabólicas desse tipo de tratamento, além de outras vantagens clínicas de seu uso em tempo prolongado sobre aceitabilidade e adesão ao tratamento, já comprovadas (48, 96). A diminuição de HDL-C não é desejável do ponto de vista metabólico, mas há evidências de que, após um ano de tratamento, os níveis de HDL-C tendem a se normalizar novamente em usuárias de SIU-LNG (97) Obtivemos uma diminuição significativa nos níveis de VCAM e PCR nas pacientes usuárias do SIU-LNG, o que pode corrobo rar uma ação favorável sobre o processo inflamatório. A PCR é um marcador sensível de atividade inflamatória e tem sido utilizada 49 como um fator de risco independente para DCV, particularmente coronariopatia. Nos hepatócitos, a produção de PCR é regulada pela ação do fator de necrose tumoral e da interleucina-6 (98). O SIU-LNG foi capaz de diminuir os níve is de PCR sem alterar TNF- α e IL-6, o que sugere uma ação hepática direta, talvez na redução de síntese protéica. Efeitos metabólicos do aGnRH são clar amente relacionados ao estado de hipoestrogenismo, como por exemplo em relaçã o a piora do perfil lipídico, à semelhança do que ocorre com mulheres na pós menopausa (99, 100, 101). Entretanto, tal resultado pode não ter sido observado nesse estudo pelo curto período de uso do aGnRH. Além disso, houve um aumento de 14% da homocisteína, que tem si do associada à maior ocorrência de eventos aterotrombóticos. Diversos artigos demonstraram aumento nos níveis séricos de homocisteína em mulheres na pós-menopausa e que reduziram após a realização de terapia de reposição estrogênica (102, 103, 104, 105). Em relação ao levonorgestrel, artigos que avaliaram contraceptivos orais que continham este progest ágeno demonstraram não haver alteração na homocisteinemia (106, 107), o qu e vai de encontro aos nossos achados no grupo SIU-LNG, embora reconheçamos a limitação desse achado, pois não foram avaliados os níveis séricos de folato em ambos os grupos. Houve diminuição dos leucócitos totais ap enas no grupo aGnRH, embora esse dado isolado não tenha um grande significado clínic o. A resposta inflamatória sistêmica envolve alterações nos níveis de leucócitos circul antes, mas recentes estudos têm proposto que a avaliação de subpopulações leucocitárias, como a taxa neutrófilo-linfócito, seja um melhor índice de resposta inflamatór ia em pacientes com doenças crônicas ou com endometriose (108, 109). Os níveis séricos de TNF- α não variaram em nenhum dos grupos de tratamento. Numerosos investigadores tem sugerido que há uma associação entre a presença de endometriose e um sistema imune alterado (110, 111). Um aumento da inflamação peritoneal, 50 evidenciado por elevação das citocinas per itoneais, é bem estabelecido (112). Citocinas inflamatórias, especialmente a TNF- α, que são produzidas pelos macrófagos, tem um importante papel na fisiopatol ogia da endometriose. O TNF- α podem ativar leucócitos inflamatórios que podem levar a produção de outra s citocinas pró-inflamatórias, como IL-1, IL-6 e mais TNF-α (113), que estimulam a adesão de células endometriais e também induzem as metaloproteinases, ambas necessárias para o desenvolvimento da doença (114). Entretanto, essas alterações ocorrem em tecidos e FP, e os níveis séricos nem sempre refletem essas alterações teciduais. Pode-se questionar se o efeito benéfico obti do sobre os níveis de lipoproteínas após o uso de SIU-LNG seja decorrente apenas da intervenção terapê utica, que envolvia orientação dietética e prática de exercícios físicos. Estas orientações er am semelhantes aos dois grupos de estudo, e não se observou variação significativa do peso corporal em nenhum dos grupos, o que seria esperado se a aderência fosse satisfatória. Assim, esp eculamos que esse efeito seja decorrente da ação direta do levonorgestrel. Uma hipótese seria a mediação da redução hepática da síntese e/ou catabolismo das lipoproteínas, uma vez que a redução atingiu todas as variáveis lipídicas analisadas (115). CONCLUSÕES 52 Nossos dados permitem concluir que, em paci entes portadoras de endometriose, o uso de SIU-LNG, promoveu uma redução significativa nas lipoproteínas, além de uma diminuição de alguns marcadores inflamatórios após seis meses de avaliação. Obviamente, não podemos inferir sobre esses efeitos em tempo prolongado de tratamento. En tretanto, essa perspectiva é favorável, tendo em vista que o tratamento cla ssicamente empregado para a endometriose, o aGnRH, não promoveu modificações das vari áveis lipídicas após o mesmo período de tratamento. Dados anteriores de nosso grupo mostram que o uso de SIU-LNG tem efeito comparável ao uso de aGnRH em relação à dor associada a endometriose em curto (48) e longo prazo (96), tendo sido capaz de reduzir também os níveis de CA-125 (116). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54 1. 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Po stal 676 - São Carlos, SP, Brasil, CEP- 13565-905 Tel: +55 16 33518340 Fax: +55 16 32536075 Email: [email protected] 2

Background: The study was conducted to evaluate the cardiovascular risk markers associated with endometriosis and the influence of the levonorgestrel intrauteri ne system (LNG-IUS) compared with the GnRH analogue (GnRHa) leuprolide acetate on these risk markers after six months of treatment. Study design: This was a randomized, prospective, open clinical study, with 44 patients with laparoscopically and histologically confirmed en dometriosis. Patients were randomized into two groups: the LNG-IUS group, comprised of 22 patients who underwent LNG-IUS insertion, and the GnRHa group, comprised of 22 patients who received a monthly GnRHa injection for six months. Body mass index; systol ic and diastolic arterial blood pressure; heart rate; and laboratory cardiovascular risk markers such as interl eukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), C-reactive protein (CRP), homocysteine (HMC), lipid profile, total leukocytes, and vascular cell adhesion molecule (VCAM) were measured before and six months after treatment.

After six months of treatment, a significant reduction in pain score occurred in both groups with no significant difference in improvement between the two medications evaluated. In the LNG-IUS group, from pretreatment to post treatment period, th ere was a significant reduction in the levels (mean+ SD) of VCAM (92.8 + 4.2 to 91.2+ 2.7 ng/mL, p =.04), CRP (0.38+0.30 to 0.28+0.21 mg/dL, p =.03), total cholesterol (247.0+ 85.0 to 180.0+31.0 mg/dL, p =.0002), triglycerides (118.0+ 76.0 to 86.5+ 41.5 mg/dL, p =.003), LDL (160.5+ 66.0 to 114.5+25.5 mg/dL, p =.0005), and HDL (63.0+ 20.5 to 48.5+ 10.5 mg/dL, p =.002). The GnRHa group showed an increase in HMC levels (11.5+ 2.9 to 13.0+2.7 µmol/L, p =.04) and a reduction in IL-6 levels (4.3+ 3.9 to 2.3+0.8 pg/mL, p =.005), VCAM (94.0+ 3.8 to 92.0+1.6 3 ng/mL, p =.03), and total leukocytes (7330+2554 to 6350+1778, p = .01). In the GnRH group, the remaining variables, including lipid profile, did not show any statistical difference.

This study shows that some cardiovascul ar risk markers are influenced by both GnRHa and the LNG-IUS, but the latter had a greater positive impact on the lipid profile, which could lead to a favorable effect during long-term treatment.

endometriosis, levonorgestrel, cardiovascular diseases, leuprolide, risk factors. 4 1. Introduction A possible association between endometriosis and atherosc lerosis has been proposed [1]. Endometriosis affects young wo men, whereas atherosclerosis oc curs at more advanced ages. However, both diseases are characte rized by increased macrophage activity and production of inflammatory cytokines. Because inflammation plays a crucial role in the development of atherosclerosis, patients w ith endometriosis, which represents a chronic inflammatory disease, are believed to be at a possible higher risk for developing cardiovascular diseases (CVD) [1]. Some inflammatory markers commonly detected in patients at increased risk for CVD, such as interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha ) [2, 3], presence of activated macrophages, and expr ession of cell adhesion molecule s, such as intercellular adhesion molecule (ICAM) and vascular ce ll adhesion molecule (VCAM), markers of oxidative stress [4-6], among others, have been re ported to be increased both in the peritoneal fluid (PF) and serum of patients with endometri osis. There are reports of an increase in metalloproteinases (MMPs), which have an important action on the destruction of the extracellular matrix both in patie nts with atherosclerosis [7] and endometriosis [8], and of an increase in C-reactive protein ( CRP), a biochemical inflammatory marker of great value as a predictor for CVD [9, 10] . In addition, changes in lipid me tabolism are strongly related to cardiovascular risk [11]. Few investigators have compared the basal lipid profile of women with endometriosis to that of a control group, and none of them have evaluated patients in the absence of the effect of medication that may pot entially alter the synthesis of lipoproteins [1, 10, 11]. Because of this limitation, results of lipid profile of women with endometriosisWITH WHAT, PLEASE STATE ranging from an unfavorable lipid prof ile to no change in these variables [12-15]. 5 Some of the clinical treatments curr ently proposed for endometriosis, with a significant improvement in the pelvic pain caused by the disease, are GnRH analogues (GnRHa) and the levonorgestrel -releasing intrauterine system (LNG-IUS) [16]. GnRHa acts by blocking the hypothalamus-pitu itary-ovarian axis, leading to signs and symptoms of hypoestrogenism with negative e ffects on lipid metabolism [13] . In contrast, the LNG-IUS causes atrophy of the endometrial glands due to a predominantly local effect of progestogen [17]; however, it has been specu lated that systemically absorbed progestogen may adversely influence lipid metabolism [18, 19]. Since the treatment proposed for patients with endometriosis is usually of long-term duration and because these patients may already present with elevation of inflammatory and endothelial dysfunction markers, it is important to evaluate the effects of different treatments on risk factors for CVD, such as inflammato ry markers and lipoproteins. Thus, the objective of the present study was to evaluate the in fluence of the LNG-IUS on inflammatory and cardiovascular risk markers in women treated wi th this IUS for six months and to compare it to the effect of classical treatment with GnRHa. 2. Patients and methods A randomized, prospective, open label, cont rolled clinical assay was carried out to evaluate 44 patients with endometriosis, aged 18 to 40 years, consecutively selected at the pelvic pain and endoscopy outpatient clinic of the University Hospital, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, Brazil. The diagnosis of e ndometriosis was confirmed by laparoscopy and histology performed 3 to 24 months before incl usion in the study. All patients had chronic pelvic pain, and none of them had been treated w ith either oral hormone contraceptives for at least three months or with depot progestogens or GnRHa for at l east six months at the time of randomization. 6 Sample size was calculate d with the GraphPad StatMate® program (Graphpad Software, San Diego, CA, USA). By including 16 untreated patients with endometriosis, a mean change of 20% or more in low-dens ity lipoprotein choleste rol (LDL-C) would be detected on the basis of the results re ported by Al-Omari et al. [20], with α = 5% and a 90% test power during the six-month period of tr eatment. A larger number of patients than necessary was included due to a possible loss of patients during follow-up. Exclusion criteria were as follows: obes e patients with a body mass index (BMI) ≥30 kg/m2, smokers, diabetics, alcohol or drug users, patients currently wishing to conceive, patients with chronic disease, patients with acute and/or chronic inflammatory and/or infectious processes, and patients with a pers onal and/or family history of thromboembolic events or taking medications known to inte rfere with inflammation markers (such as hormonal and non-hormonal anti-inflammatory ag ents) for a period of less than 15 days before the study. The study was approved by the Institutional Re view Board of the Hospital, and all patients gave written informed consent to participate. Sixty-two patients were first selected for the study. However, six refused to participat e and 12 were excluded because they did not satisfy the inclusion criteria. The remaini ng 44 patients were randomized by a computer program (GraphPad Software, San Diego, Ca, USA) at a 1:1 proportion to the LING-IUS group (N = 22) and to the GnRHa group (N = 22). In the GnRHa group, one patient became pregnant before the administration of the drug, a nd three patients moved to another city and, thus, were lost to follow-up. Thus, the LNG-IU S group finally consisted of 22 patients who had undergone placement of the device according to the manufacturer’s instructions, always by the same examiner, while the GnRHa group consisted of 18 patients treated with 3.75 mg leuprolide injected intramuscularly on a monthly basis for a period of six months (Fig. 1). 7 BMI, systolic and diastolic arterial pressu re, heart rate, pain sc ore, lipid profile, inflammatory markers and markers of endothelia l injury were determ ined in all patients before the beginning of treatment and after six m onths of use of the therapies. The pain score was determined using a visual analogue scale. The patients reported th e intensity of pain experienced daily. The visual scale consists of a subjective eval uation of pain on a scale from 0 to 10, where 0 represents the absence of pain and 10 the highest intensity of pain [21]. The patients marked on a non-graduated 10 cm line for the intensity of pain they felt. After a 12-h fast, 20 mL of whole blood were collected. The serum markers analyzed were IL-6, TNF-alpha and homocysteine , all of which were determined by chemiluminescence using a DPC Immulite ® 1000 instrument (Diagnostic Products Corporation, Siemens®, Los Angeles, CA, USA ®). C-reactive protein was determined by the latex turbidimetric immunoassay using a Konelab 60i instrument (Wiener Lab ®, Rosario, Argentina). The leukogram was determined by automated counting using the Coulter Gens and Coulter STKS instruments (Miami, FL, US A). The lipid profile was determined by measuring total cholesterol (TC), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and triglycerides (TG) using a BT 3000 plus instrument (Wiener Lab®, Rosario, Argentina). TC, TG and HDL -C were determined by the enzymatic method. LDL-C was calculated by the Friedewald formula: LDL-C = total cholesterol – (HDL-C + TG/5); there was no TG value higher than 400 mg/dL detected in any sample [22]. VCAM was determined by ELISA (R&D System s, Minneapolis, MN, USA). All of these variables were determined immediately be fore the beginning of treatment with the medications and after six months of their use. Similar guidelines for dietary guidance and fo r the practice of physical exercise were given for both groups. 8 The Kolmogorov-Smirnov test was used to determine the normality of the sample. Data regarding variables with a normal distribution were analyzed statistically by the unpaired t-test for intergroup comparison and by the paired t-test for intragroup comparisons. In the absence of a normal distribution, data were analyzed statistically by the Mann-Whitney and Wilcoxon test for inter- and intragroup compar isons, respectively. The statistical analyses were performed using SPSS 16.0 for Windows so ftware (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) and the GraphPad 5.0 for Windows software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA), with the level of significance set at 5%. 3. Results Patient age (mean ± SD) was 28.8 + 4.9 years for the LNG-IUS group and 31.4 + 5.8 years for the GnRHa group, with no signifi cant difference between groups (p =.14). Regarding the clinical variables investigated (T able 1), no significant change was observed in either group between the pre- and post-treatment periods. After six months of treatment, a significan t reduction in pain score occurred in both groups, from 7.3+1.5 to 1.2+1.75 for the LNG-IUS group and from 7.1+ 1.46 to 0.7+1.37 for the GnRHa group (p<.001), with no significant difference in improvement between the two medications evaluated (p = .21). Mean serum marker values did not differ be tween groups before treatment (Table 2). The LNG-IUS group had a significant reduction in mean serum VCAM and CRP at 6 months of treatment (Table 2). Also, during the treatment period, the LNG-IUS group had a significant reduction of 25.4% in m ean TC levels (basal: 242.3 + 82.2 mg/dL vs. 6 months: 180.8 + 31.6 mg/dL, p = .0007), of 20.8% in mean HDL-C levels (basal: 60.5 + 19.3 mg/dL vs. 6 months: 47.9 + 10.8 mg/dL, p = .0048), of 27.2% in mean LDL-C levels (basal: 158.7 + 9 65 mg/dL vs. 6 months: 115.6 + 25.3 mg/dL, p = .0016), and of 25.8% in mean TG levels (basal: 115.3 + 75.8mg/dL vs. 6 months: 85.5 + 41.2 mg/dL, p = .0079) (Table 3). During the treatment period, the GnRHa gr oup had a signifiicant increase in homocysteine levels (basal: 11.5 + 2.9µMol/L vs. 6 months: 13.1 + 2.6 µMol/L), a decrease in mean total leukocyte number (basal: 7500 + 2600 leukocytes vs. 6 months: 6500 + 1800 leukocytes, p = .0153) and of mean IL-6 (basal: 2.98 + 1.5 pg/mL vs. 6 months: 2.15 + 0.3 pg/mL, p = .0087) (Table 2), and no significant ch anges in the remaining markers. Regarding lipid values, the GnRHa group showed no signi ficant variation in me an TC, HDL-C, LDL-C or TG levels (Table 3). Comparison of the post-treatment results be tween the two groups revealed that the LNG-IUS group had significantly lower le vels of mean TC (LNG-IUS: 180.8 + 31.6 mg/dL vs. GnRHa: 223.5 + 58.4 mg/dL, p = .0055), TG (LNG-IUS: 85.5 + 41.2 mg/dL vs. GnRHa: 149.2 + 76.9 mg/dL, p = .0011), and LDL-C (115.6 + 25.3 mg/dL vs. 138.9 + 42.8 mg/dL, p = .0144) than the GnRHa group, with no significant difference between the groups regarding the remaining variables (Tables 2 and 3). 4. Discussion Our data showed that the us e of the LNG-IUS by women wi th endometriosis resulted in a significant reduction in TC, TG, LDL-C and HDL-C levels, as well as a decrease in the inflammatory markers VCAM and CRP after si x months of treatment, whereas the use of GnRHa (leuprolide) did not promote significant changes in lipid variables after the same period of time, although it had favorable eff ects on the inflammatory marker IL-6 and leukocytes, but unfavorable effects on homocysteine. Sex steroids have a marked influence on th e lipid profile, and some alterations can have an impact on atherogenesis. The use of a LNG-releasing implan t causes a reduction in 10 TC, TG, LDL-C and HDL-C in normal women [14-16, 23-25], although other studies have only shown a reduction in TC and HDL-C when compared to women using no hormonal contraceptives [19], with no changes in LDL-C or TG levels. On the other hand, in contrast to the present findings, the use of the LNG-IUS di d not cause significant changes in serum TC, TGL, LDL-C or HDL-C concentrations in a normal population or in patients with menorrhagia [18, 26], and, in another study in normal women who use this method for birth control, it caused an increase in HDL-C levels when compared to women taking no hormonal contraception [27]. Modifications in lipid profile values are im portant because they increase the risk of arteriosclerosis and coronary disease. LDL- C plays a particularly important role in atherogenesis and it is, therefore, the most im portant parameter to be normalized in cases of dyslipidemia [28]. Thus, , since LDL-C contribut es to the formation of the atheromatous plaque its reduction is clinically important. The favorable action of the LNG-IUS, with a reduction of LDL-C, is in contrast to the action of GnRHa, which had no effect on TC or LDL-C. Thus, treatm ent with the LNG-IUS may have metabolic advantages in addition to patient’s acceptance and compliance with its prolonged use, as previously reported [16, 29]. The reduction of HDL-C is not desirable from a metabolic viewpoint, but there is evidence that , after one year of tr eatment, HDL-C levels tend to normalize among users of the LNG-IUS [30]. We observed a significant redu ction of mean VCAM and CRP levels in patients using the LNG-IUS, a fact that may support a favor able action of the implant against an inflammatory process. CRP is a sensitive marker of inflammatory activity that has been used as an independent risk factor for CVD, especially coronary artery disease. In the hepatocytes, CRP production is regulated by the action of TNF and IL-6 [31]. The LNG-IUS reduced CRP 11 levels without changing TNF-alpha or IL-6 levels, which regulate its production [32], suggesting a direct hepatic action, perhaps on the reduction of protein synthesis. The metabolic effects of GnRHa, mainly a worsening of the lipid profile, are related to a state of hypoestrogenism, like that occurring in postmenopausal women [32-34]. However, this

may not have been observed in the present study due to the short period of use of GnRHa. In addition, there was a 14% increase in homocysteine, which has been associated with a more frequent occurrence of atherothrombotic events. Studies on oral contraceptives containing LNG found that there was no change in homocysteinemia [35, 36], a fact that agrees with our findings for the LNG-IUS group, although we do recognize the limitations of this result because we did not determine the serum levels of folate in either group. A reduction of total leukocytes occurred only in the GnRHa group, although this result alone, is not of great clinical significance. It may be questioned whether the beneficial effect on lipoprotein levels after the use of the LNG-IUS was simply due to the therapeutic intervention, which involved dietary guidance and the practice of physical exercise. No significant variation in mean body weight was observed in either group, a fact that would be expected with satisfactory compliance. Thus, we speculate that this effect may be due to a direct action of LNG. A hypothesis would be that this occurs via the mediating role of the hepatic reduction of lipoprotein synthesis and/or catabolism because the reduction occurred in all lipid variables analyzed [37]. Thus, the present data permit us to concl ude that the use of the LNG-IUS promoted a significant reduction in lipoprot eins among women with endometriosis, as well as the reduction of some inflammatory markers after si x months of treatment. Obviously, we cannot predict the duration of these effects with prolonged treatment courses. However, this perspective is favorable because the treatment cl assically used for endometriosis, GnRHa, did not cause significant changes in the lipid variables after the same period of treatment. 12

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