Expressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs em lesões de adenomiose

IZADORA, O. Expression of regulatory protein s of miRNA biogenesis in adenomyosis lesions. 2021. (7 5) p. Master’s dissertation. Ribeirão Preto Medical School - University of São Paulo, Ribeirão Preto. 2021. Adenomyosis is a gynecological condition characterized by the presence of glandular and strom al endometrial tissue within the uterine myometrium. Recent evidence has indicated that a dysregulation of miRNAs expression may play a key role in the pathophysiology of endometriosis and adenomyosis, as they play important roles in the processes of apopt osis, invasion, cell proliferation, matrix remodeling, hypoxia, inflammation and angiogenesis. Global miRNA dysregulation is often the result of defects in the miRNA biogenesis pathway, such as genomic mutation or aberrant expression/localization of enzyme s and cofactors responsible for miRNA maturation. Variations in the expression of proteins involved in the biogenesis process of miRNAs in adenomyotic lesions may be the basis for explaining the variability in the set of miRNAs associated with adenomyosis available in the literature. In this study, we aimed to evaluate the expression of proteins Dicer, Drosha, Exportin -5 in the eutopic and ectopic endometrium of patients with adenomyosis. Clinical data, ectopic and eutopic endometrium specimens from 22 pati ents with adenomyosis and 10 eutopic endometrium specimens from women without endometrial disease were evaluated by immunohistochemistry (IHC). The slides were selected according to the greater representation of typical endometrial epithelial tissue (eutop ic or ectopic) by a consensus of two observers. The automated slide reading process was performed using images scanned by an Olympus BX61VS Slide Scanner system through the VS120 Virtual Slide Microscope software. For the quantitative digital analysis of t he images, the QuPath tool was used. We observed a progressively lower immunohistochemical expression of Drosha in the eutopic and ectopic endometrium of women with adenomyosis when compared to the eutopic endometrium of women without the disease (p = 0.016) (95% CI of the difference: 3.4% to 27.4%). The observed correlation in the percentage of cells immunostained for Drosha in the paired eutopic and ectopic tissues suggests a coordinated expression between the sites. We did not observe differences in the expression of Exportina -5 and Dicer between the eutopic endometrium of women with adenomyosis and the eutopic endometrium of women without the disease. The impairment of the expression of this protein, and perhaps of Dicer/Exportin -5, may justify the importance of the miRNA biogenesis pathway in the pathophysiology of the disease and, consequently, in the interpretation of symptoms and in the proposal of effective therapies.

Adenomyosis, miRNA, Drosha, Dicer, Exportin-5, bleeding. SUMÁRIO 1. FIGURAS ................................................................................................................ 17 2. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 31 2.1. Adenomiose ................................................................................................................. 31 2.2. Patogênese da Adenomiose ......................................................................................... 32 2.3. Expressão e regulação dos miRNAs na adenomiose ................................................... 37 2.4. Desregulação das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs .......................... 38 3. OBJETIVOS............................................................................................................ 42 3.1. Objetivo Geral ............................................................................................................. 42 4. CASUÍSTICA, PACIENTES E MÉTODOS ......................................................... 44 4.1. Delineamento do estudo .............................................................................................. 44 4.2. Pacientes ...................................................................................................................... 44 4.3. Dados clínicos ............................................................................................................. 45 4.4. Imunohistoquímica ...................................................................................................... 46 4.5. Análise das imagens histológicas ................................................................................ 47 4.6. Análise digital quantitativa das imagens ..................................................................... 48 4.7. Análise estatística ........................................................................................................ 49 5. RESULTADOS ....................................................................................................... 51 5.1. Avaliação clínica dos pacientes ................................................................................... 51 5.2. Caracterização qualitativa da expressão das pro teínas reguladoras da biogênese dos miRNAs................................................................................................................................... 51 5.3. Avaliação quantitativa da expressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs................................................................................................................................... 51 6. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 59 7. TABELAS ............................................................................................................... 61 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 70 Figuras FIGURAS Figura 1. Modelo de lesão e reparo de tecido (TIAR) que representa os mecanismos da gênese das lesões adenomióticas. Fonte: Adaptada de (MALL, 2009). Figura 2. Biogênese dos miRNAs, com início no núcleo, onde o pri -miRNA origina-se a partir do DNA, posteriormente é processado a partir das proteínas Drosha e seu cofator , formando um pré -miRNA, que será transportado para citoplasma atrav és da Exportina. No citoplasma o pré -miRNA irá interagir com a Dicer, tornando -se então miRNA maduro. Fonte: Adaptada de (OLENA; PATTON, 2010). Figura 3. Regulação da expressão dos miRNAs. Fonte: Adaptado de Iorio;Crocio (201 3) (MANUSCRIPT, 2013). Figura 4. Delineamento Experimental. Amostras biológicas foram retrospectivamente coletados. Realizada análise imunohistoquímica das pacientes com adenomiose e controle. Fonte: Elaborado pela autora. Figura 5 – Controles positivos para cada marcador. A. Para o controle positivo de Drosha foi utilizado amostra de tecido de adenocarcinoma de pulmão B. Para controle positivo do marcador Exportina -5 foi utilizado amostra de cólon normal. C. Amostra de placenta para controle positivo do marcador Dicer. Fonte: Elaborado pela autora. Figura 6. Análise quantitativa digital das amostras no software QuPath. A. Ferramentas de desenho polygon e brush. B e C- Delimitação de uma região usa ndo linhas finas poligonais e seleção da região de interesse através do pincel de espessura variável. D e E. Detecção dos limites das células de acordo com sua variação morfológica. Fonte: Elaborado pela autora. Figura 7 - Localização dos marcad ores nas amostras de endométrio. A. Drosha possuí localização nuclear e celular. B. Exportina-5 localização citoplasmática. C. Dicer apresenta localização citoplasmática. Fonte: Elaborado pela autora. Figura 8. Percentual de células positivas no endométrio eutópico de mulheres controles e com adenomiose para os marcadores Drosha, Exportina-5 e Dicer. Fonte: Elaborado pela autora. Figura 9 - Percentual de células positivas no endométrio eutópico e endométrio ectópico de mulheres com adenomiose para os marcadores Drosha, Exportina -5 e Dicer. Fonte: Elaborado pela autora. Figura 10. Análise da correlação do percentual de células positivas no endométrio eutópico e endométrio ectópico de mulheres com adenomiose para o marcador Drosha. Fonte: Elaborado pela autora. Figura 11 . Marcação imunohistoquímica da proteína Drosha no endométrio eutópico (A) e ectópico de mulheres com adenomiose (B) e no endométrio eutópico de pacientes controles (C). Fonte: Elaborado pela autora. Figura 12. Marcação imunohistoquímica da proteína Exportina-5 no endométrio eutópico (A) e ectópico de mulheres com adenomiose (B) e no endométrio eutópico de pacientes controles (C). Fonte: Elaborado pela autora. Figura 13. Marcação imunohistoquímica da proteína Dicer no endométrio eutópico (A) e ectópico de mulheres com adenomiose (B) e no endométrio eutópico de pacientes controles (C). Fonte: Elaborado pela autora. 30 Introdução 31 1. INTRODUÇÃO 1.1. Adenomiose A adenomiose é uma condição gineco lógica caracterizada pela presença de tecido endometrial glandular e estromal dentro do miométrio uterino. Ela foi inicialmente descrita em meados do século XVIX (BENAGIANO et al., 2012) e estima- se que afeta cerca de 20% das mulheres em idade reprodutiva (DEVLIEGER; D’HOOGHE; TIMMERMAN, 2003). Estudos apontam que mulheres com menos de 40 anos representam 20% dos casos, enquanto mulh eres com idade entre 40 e 50 anos, 80% dos casos de adenomiose (ARTICLE, 2016) . Do ponto de vista clínico, está associada à dor pélvica, sangramento uterino anormal (AUB) e infertilidade (VANNUCCINI et al. , 2017) , no entanto estima -se que um terço das mulheres seja assintomático (PERIC; FRASER, 2006) . Todavia, esses sintomas também estão associados a outras condições muitas vezes superpostas, como endometriose e leiomiomas, o que dificulta o diagnóstico (LAZZERI et al., 2014). Um segundo ponto é a falta de uniformidade nos critérios histológicos para o diagnóstico da doença (VERCELLINI et al., 2006). Classicamente ela tem sido descrita como uma condição que acomete mulheres multíparas, entre a 4ª e 5ª década de vida (PARAZZINI et al. , 1997) e aquelas submetidas a cirurgias uterinas como curetagem, cesárea, e miomect omia, pois estas intervenções podem interromper a interface endometrial -miometrial (EMI) e facilitar a invasão, implantação, incorporação e estabelecimento de colônias endometriais dentro da parede miometrial, aumentando o risco de adenomiose (GUO, 2020) . Em contrapartida o tabagismo tem sido apontado como um fator protetor (VERCELLINI et al., 2006) . Mas assim como a prevalência, os fatores de risco associados não estão definidos com precisão. Via de regra, o padrão ouro para o diagnóstico é a análise histológica de material obtido por biopsia ou histerectomia. Já o diagnóstico pré -operatório é um d esafio (LEVGUR, 2007) . Recentemente, a padronização da reportagem dos achados ultrassonográficos, particularmente com o consenso do Morphological Uterus Sonographic Assessment (MUSA) (GUPTA et al., 2016) parece estar contribuindo para isso, inclusive, com uma proposta de classificação morfológica e de extensão da doe nça 32 (CLINIC; HOSPITAL, [ s. d. ]). Assim como o ultrassom, a ressonância magnética também tem emergido como ferramenta não invasiva promissora no d iagnóstico presumido da doença (TELLUM et al., 2019). Ambos os métodos parecem ter uma boa acurácia (CHAMPANERIA et al., 2010), embora ela precise ser confirmada em estudos futuros. O tratamento padrão da adenomiose é a histerectomia, mas não há terapia médica para tratar os sintomas e, ao mesmo tempo , permitir que as pacientes engravidem (PONTIS et al. , 2017) . As terapias médicas são tratamentos hormonais, uma vez que a adenomiose é uma condição dependente de estrogênio e responde ao tratamento médico com drogas antiestrogênicas e agonista do hormônio libe rador de gonadotrofina (GnRh-a) (ANGIONI et al., 2014) que podem induzir temporariamente a regressão da adenomiose e melhorar os sintomas (PONTIS et al., 2017). 1.2.Patogênese da Adenomiose É sugerido que a(s) causa(s) da endometriose e adenomiose parecem estar intimamente relacionadas a alguns dos proce ssos fisiológicos de reprodução (LEYENDECKER; WILDT, 2011) . Trauma seguido de resposta inflamatória tecidua l específica e reparo envolvendo mecanismos específicos, ainda que fisiológicos, celulares, bioquímicos e moleculares podem ser considerados os principais eventos no desenvolvimento da doença (LEYENDECKER; WILDT, 2011) . Os mecanismos envolvidos na etiologia da adenomiose ainda n ão estão completamente elucidados e há duas teorias mais amplamente aceitas, a teoria da invaginação e a da metaplasia (GARCÍA-SOLARES et al., [s. d.]). A primeira e mais popular hipótese aponta que os focos adenomi óticos surgem durante os períodos de regeneração, cicatrização e reepitelização do endométrio (BENAGIANO et al. , 2012) , após eventos uterinos traumáticos que ocasionam uma invaginação da parte profunda do endométrio entre os feixes de fibras musculares lisas do miométrio, através da zona juncional (JZ) interrompida por crônicas contrações peristálticas miometrais (GARGETT; SCHWAB; DEANE, 2016; LEYENDECK ER et al. , 2015; VANNUCCINI; PETRAGLIA, 2019) possivelmente devido à perda de coesão do tecido causada por enzimas específicas, como Bcl-2 (DEVLIEGER; D’HOOGHE; TIMMERMAN, 2003; UEKI et al., 2004). A JZ representa o terço interno do miométrio (BROSENS et al., 2010). Este mecanismo é denominado de mecanismo de lesão e reparo tecidual (TIAR), que tem sido renovada pela teoria da ruptura da interface endometrial-miometrial (EMID) (GUO, 2020). 33 Do ponto de vista da expressão prot éica, o endométrio ectópico a presenta uma maior expres são de receptores de estrogênio (ER) , acompanhado por uma expressão consistente de Bcl-2 ao longo do ciclo menstrual, em comparação ao endométrio eutópico (UEKI et al. , 2004) . Isso evidencia que uma constante expressão de B cl-2, juntamente com ER ao longo do ciclo pode promover a proliferação de glândulas adenomióticas e estromais (UEKI et al. , 2004) . A produção suprafisiológica de estrogênio (hiperestrogenismo) devido à atividade parácrina local no endométrio eutópico e e ctópico de pacientes com adenomiose pode ser um estado preliminar, contribuindo para a origem da doença (GARCÍA-SOLARES et al. , [ s. d. ]). O hiperestrogenismo pode possibilitar elevada atividade uterina mediada pela ocitocina, resultando em aumento de tensões mecânicas que podem lesar as células na zona juncional (ZJ), ativando o mecanismo TIAR em resposta à autotraumatização do tecido (LEYENDECKER et al. , 2015; LEYENDECKER; WILDT, 2011; MALL, 2009; SHAKED; JAFFA; GRISARU, 2014) . As contrações miometriais peristálticas crônicas induzem microtrauma à JZ, causando um ciclo vicioso no qual a produção local de estrogênio, mediada por COX -2(CHEN et al. , 2010) e induzida por interleucina -1 (GARCÍA-SOLARES et al., [s. d.]), resulta na produção da prostaglandina E2 (PGE2), que por sua vez ativa a prot eina StAR (proteína reguladora aguda esteroidogênica) e a aromatase P450 (MALL, 2009) . Essa ativação aumenta os níveis de estradiol, contribuindo para o estad o hiperestrogênico n o endométrio eutópico (GARCÍA- SOLARES et al., [s. d.]) (Figura 1). Por sua vez, a tividade hiperperistáltica sustentada e lesão crônica, proliferação e inflamação atrasam o processo de cicatrizaç ão e resultam em aumento do número de focos de “infiltração” tecidual (VANNUCCINI et al., 2017). As propriedades migratórias e invasivas das células epiteliais endometriais intensificadas pelo estrogênio fundamentam a capacidade do endométrio para infiltrar a zona juncional miometrial e o crescimento do tecido ectópico (PHYSIOLOGY, 2015). A segunda teoria, a teoria da metaplasia, aponta que as les ões adenomi óticas podem se originar de restos de c élulas müllerianas (FERENCZY, 1998). É sabido que o endométrio é rico em v árias popula ções de c élulas-tronco (HUFNAGEL; TAYLOR, 2015). Embora essas c élulas tenham um papel importante na fisiologia, regenera ção e reparo endometrial, potencialmente também desempenham um papel relevante na geração de endometriose (HUFNAGEL; TAYLOR, 2015) . Como as c élulas-tronco adultas têm um papel fundamental na manuten ção da homeostase do tecido, é provável 34 que sua fun ção seja aberrante na doen ça ginecológica benigna associada à proliferação endometrial alterada (GARGETT; SCHWAB; DEANE, 2016), incluindo a adenomiose. As c élulas progenitoras que transpassam a ZJ e atingem o miométrio podem levar à adenomiose uterina focal. Alternativamente, a adenomiose pode se diferenciar de células-tronco multipotentes originadas da medula óssea e outras fontes (VANNUCCINI et al., 2017) , embora essa alternativa seja mais remota e a literatura tenha explorado pouco essa possibilidade. Desde o final do século XX, mais especificamente a partir do século XXI, houve um grande desenvolvimento das capacidades de processamento computacional e da compreensão da genômica humana. Isso tem permitido melhorarmos nossa compreensão sobre a biologia das doenças de um modo nunca visto antes (GUTTMACHER; COLLINS; PH, 2003). E isso não tem sido diferente para as doenças ginecológicas. Vários estudos têm investigado as alterações genéticas e epigenéticas envolvidas na orquestração da fisiopatologia da adenomiose (ARTICLE, 2019; D et al., 2010; GROOTHUIS, 2007; HUANG et al., 2010; JUO et al., 2006; KADO et al., 2002; KANG et al., 2010; KITAWAKI et al., 2001, 2004; KIYOMIZU; KITAWAKI; OBAYASHI, 2006; MOROSOVA et al., 2012; ROZATI; VANAJA; NASARUDDIN, 2010; SHAN et al., 2006; TSAI et al., 2018). A desregulação de genes e vias no endométrio eutópico envolvidos na síntese de hormônios esteróides sexuais, e em eventos celulares como proliferação e fibrose, inflamação e neuroangiogênese, podem predispor à migração ectópica e implantação (VANNUCCINI et al., 2017). Muitos genes são expressos diferencialmente em adenomiose, incluindo CXCL10, Calbindin D- 28K, fatores relacionados à prostaglandina, COX-2 e genes relacionados ao câncer e morte celular (HEVER et al., 2006). Evidências recentes também têm indicado que uma desregulação da expressão dos microRNAs podem ter papel chave na fisiopatologia da endometriose e adenomiose (OHLSSON TEAGUE; PRINT; HULL, 2009), uma vez que desempenham papéis importantes nos processos de apoptose, invasão, proliferação celular, remodelamento da matriz, hipóxia, inflamação e angiogênese (OHLSSON TEAGUE; PRINT; HULL, 2009). Apesar de terem suas particularidades, tanto a endometriose quanto a adenomiose resultam da invasão e proliferação ectópica das células endometriais, apresentando assim, uma patogênese semelhante em muitos sentidos (HAWKINS et al., 2015). 35 Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificantes que contém cerca de 22 nucleotídeos (18 a 25). São bem conservados do ponto de vista evolutivo, e tem como principal função a regulação gênica pós transcricional. Estima-se que eles têm como alvo cerca de 60% dos genes de humanos. Os miRNAs modulam o processo pós-transcricional por interagirem diretamente com o RNA mensageiro (mRNA) através do pareamento de bases complementares. Este pareamento é perfeito em plantas, mas não em animais. Os miRNAs são capazes de reconhecer um mRNA alvo (geralmente uma sequência da região não traduzida na extremidade 3’ do mRNA - 3'UTR) usando apenas 2-7 nucleotídeos (seed region) da extremidade 5’ do miRNA. Curiosamente, os mRNAs alvos de miRNAs em espécies de mamíferos são altamente conservados (FRIEDMAN et al., 2009). A atuação do miRNA maduro sobre o mRNA se dá com auxílio de um complexo enzimático chamado complexo de indução do silenciamento do RNA (RISC), impossibilitando que o ribossomo acesse a informação no mRNA, diminuindo ou bloqueando a síntese da proteína. Em suma, essa interação culmina no silenciamento do mRNA através de repressão translacional ou degradação do mRNA. Embora a promoção da sub-regulação transcricional dos genes seja o mais frequente, já foi observado que alguns miRNA podem promover ativação da transcrição e intensificação da tradução, inclusive em humanos (ZHANG; FAN; ZHANG, 2014). A biogênese dos miRNAs inclui sua transcrição no núcleo celular, exportação para o citoplasma e subsequente processamento e maturação (Figura 2) (ZHAO; TANG; WU, 2014). Os miRNA primários (pri-miRNAs), transcrito pela RNA polimerase II (SUN; TSAO, 2008; ZHAO; TANG; WU, 2014) são inicialmente processados no núcleo da célula por um complexo nuclear formado pela ribonuclease III Drosha e seu cofator DGCR8 (LEE et al., 2003; ZAMORE et al., 2014). A Drosha é uma proteína nuclear (160 kD) da família de ribonucleases III, forma um grande complexo de microprocessadores ~ 650 kDa juntamente com a proteína dsRBD DGCR8 em humanos (GREGORY; YAN; AMUTHAN, 2004) e um complexo de ~500 kDa juntamente com a proteína dsRBD Pasha em moscas (Drosophila melanogaster) (DENLI; TOPS; PLASTERK, 2004; HAN et al., 2004; LUND, 2014). A molécula representativa do pri- miRNA exibe uma estrutura secundária complexa em formato de grampo (harpin), com uma haste em dupla fita, uma alça com bases não complementares e sequências flanqueadoras (BARTEL; LEE; FEINBAUM, 2004). Esta estrutura é exportada para o citoplasma por meio da exportina-5 (Exp-5) (SINGH et al., 2008). A Exp-5 é uma proteína membro da família da carioferina de fatores de transporte núcleo- 36 citoplasmáticos e desempenha um papel na passagem de miRNAs do núcleo para o citoplasma (IVAN; SCHMITTGEN, 2008) . No caso de depleção de Exp-5 por RNA de interferência (RNAi), o nível de miRNAs maduros diminui, mas o pré-miRNA não se acumula no núcleo. A falta de acumulação pode ser devido à instabilidade do pré- miRNA. Isto sugere a possibilidade de que a interação de pré-miRNA com Exp-5 é necessário para a estabilidade do pré-miRNA (BRENNECKE; COHEN, 2003). No citoplasma, os pri -miRNAs são liberados por hidrólise do fator de exportação e clivados pela Dicer (CHENDRIMADA et al., 2005) uma ribonuclease III (~220 kDa) dependente de ATP com múltiplos domínios sendo responsável por clivar RNAs de ~70 nucleotídeos (pré -miRs) em miRs maduros, removendo a alça na estrutura stem -loop (IVAN; SCHMITTGEN, 2008; SUN; TSAO, 2008; ZHANG; DAHLBERG; TAM, 2007) resultando na formação de um dúplex de RNA (IVAN; SCHMITTGEN, 2008; SINGH et al. , 2008) . Este dúplex de RNA é incorporado ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), no qual as duas fitas de RNA são separadas (SINGH et al., 2008; ZHANG; DAHLBERG; TAM, 2007) . O complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) possui um membro da família Argonauta (proteína catalítica) e uma fita guia de RNA. Uma das fitas permanece associada ao RISC e constitui o miRNA maduro (DALMAY, 2008; IVAN; SCHMITTGEN, 2008) , ao passo que a fita complementar sofre degradação (Figura 2). 37 1.3.Expressão e regulação dos miRNAs na adenomiose Alguns estudos têm avaliado o perfil de ex pressão de miRNA na adenomiose. Recentemente, pesquisas demonstraram que miRNAs têm função importante como mediadores significativos em fisiologia celular e fisiopatologia (YANG et al., 2016) e parecem ser potentes reguladores da expressão gênica na endometriose/adenomiose e estão associados a distúrbios reprodutivos, aumentando a perspectiva de usar os miRNAs como biomarcadores e, eventualmente, alvos terapêuticos (OHLSSON TEAGUE; PRINT; HULL, 2009) . Herdon et al. (2016), verificaram através de análises transcriptômicas globais que o endométrio eutópico de mulher es com adenomiose exibe uma desregulação das vias que predispõem o desenvolvimento, migração e sobrevida dos implantes endometriais ectópicos, sendo a via da apoptose a mais significativamente desr egulada no endométrio de mulheres com adenomiose (HERNDON et al., 2016). Comparando os transcriptomas do endométrio proliferativo de mulheres com e sem adenomiose observaram 140 alterações e 884 genes desregulados nas amostras de adenomiose em comparação com o controle. Os genes mais altamente expressos foram os pequenos genes nucléicos de RNA C / D (SNORD), que foram aumentados de 2 a 15 vezes (HERNDON et al. , 2016) . Através de sequenciamento de nova geração (NGS) foi possível identificar que o gene KRAS apresenta grande recorrência de mutações em adenomiose (INOUE et al., 2019), além de apresentar alterações recorrentes em algumas patolo gias, c omo carcinoma uterino (CANCER; ATLAS, 2013) e endometriose (OGAWA et al., 2017). Também já foi observado que diversos transcritos de miRNA apresentam expressão alterada em adenomiose. Os miR -9,miR-1, miR -139, miR -149, miR - 197,miR-326 e miR -339 (HERNDON et al. , 2016) miR-181a, miR -191, miR -195e miR-200b (BORISOV et al., [s. d.]) tiveram sua expressão aumentada em adenomiose, enquanto os miR -10b, miR -200c, miR -10a, miR -221 e miR -31estão regulados negativamente em adenomiose (BORISOV et al., [s. d.]). Outro achado interess ante é que a expressão do miR -17 nos tecidos endometriais eutópicos de pacientes com adenomiose é significativamente aumentada enquanto a expressão da proteína PTEN é reduzida, indicando que o miR -17 pode regular a expressão de PTEN e, consequentemente, af etar a expressão de proteínas envolvi das na apoptose e ciclo celular , uma vez que o gene regula negativamente a via PI3K / Akt, estimulando a apoptose e bloqueando a prolifera ção e crescimento celular, sugerindo que miR -17 38 pode desempenhar um papel na promoção da viabilidade celular, invasão e metástase no desenvolvimento de adenomiose (HU; LI; HE, 2017). Guo et al. (2015), identificaram 156 miRNAs com expressão diferencial, dentre eles, 46 miR NAs estão significantemente des regulados em lesões adenomióticas ectópicas em comparação com o endométrio normal. Os miR -10b, miR-371b-5p, miR- 92b-5p, miR -30c e miR -100 aprese ntaram-se significativamente downregulated enquanto os miR-143, miR-532-3p, miR-513a, miR-466 e miR-451a upregulated (28). Nas células epiteliais endometriais isoladas do endométrio ectópico da adenomiose, a superexpressão do miR -10b diminuiu significativ amente a taxa de migração e invasão celular, sugerindo que o miR -10b pode desempenhar um papel inibidor no desenvolvimento das lesões, por reprimir a invasão de células epiteliais adenomióticas (PHYSIOLOGY, 2015). Análises do perfil de expressão de miRNAs das células musculares lisas das zonas juncionais (JZSMCs) em adenomiose indicam que os nív eis de expressão de miRNAs associados à proliferação e apoptose, incluindo Let -7a, miR -16, miR -181 e miR-20a foram alterados, e Let -7a apresentou uma diferença significativa em sua expressão, apresentando-se downregulated em amostras de pacientes com adeno miose (HUANG et al. , 2021) . Recentemente, tem sido proposto que a identificação de miRNAs reciprocamente desregulados (particularmente miR -10b, miR-200c, miR-191) na fase proliferativa do endométrio eutópico de mulheres com adenomiose podem ajudar no diagnóstico minimamente invasivo da condição (BORISOV et al., [s. d.]). Enfim, apesar dos dados serem inequívocos na demonstração do papel dos miRNAs na fisiologia da adenomiose os estudos são muito hetero gêneos de modo a não termos até o presente momento um padrão uniforme de quais miRNAs são realmente importantes no processo da doença. Isso pode ser devido aos métodos de arranjos, heterogeneidade dos tecidos, métodos de sequenciamento ou interferência das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs. 1.4.Desregulação das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs A desregulação global do miRNA é frequentemente o resultado de defeitos na via de biogênese do miRNA, como mutação genômica ou expressão / localização aberrante de enzimas e cofatores responsáveis pela maturação do miRNA (GURTNER et al., 2016). A maquinaria da biogênese dos miRNAs é finamente regulada. Diferentes 39 mecanismos reguladores podem controlar a expressão do miRNA em nível genético ou epigenético, além de envolver o mecanismo de biogênese ou o recrutamento de fatores específicos de transcrição (MANUSCRIPT, 2013) . (Figura 3). Essa regulação ocorre em diferentes níveis, desde a transcrição do pri-miR, seu processamento (Dicer e Drosha) transporte (Exportina-5) e modificação (via edição, metilação, uridilação e adenilação) e carregamento na proteína Argonauta (HA; KIM, 2014). Alterações nos níveis de expressão de Dicer e Drosha acompanham as desregulações de miRNAs em várias neoplasias, incluindo cânceres de mama e de ovário (BERNSTEIN et al., 2003). A expressão alterada dos genes envolvidos na biogênese do miRNA tem sido implicada como uma possível causa das diferenças nos perfis de miRNA entre tecidos normais e cancerígenos, e potencialmente responsáveis por características comportamentais das células como sobrevivência em ambiente ectópico, invasividade, e proliferação(76,77). A desre gulação de diferentes cofatores, como o DGCR8, pode afetar a expressão do miRNA com importantes implicações biológicas . Por exemplo, camundongos knock -out para DG CR8, apresentaram alterações na proliferação e diferenciação de células ES (WANG et al. , 2007) , fo i possível observar uma perda global de miRNAs em células knock -out para DCGR8, evidenciando que DGCR8 é determinante na maturação dos miRNA. Além disso, as adenosina desaminases que atuam no RNA (ADARs) podem afetar a expressão de microRNAs que reconhecem resíduos de adenosina, conforme relatado para o miR -142: a edição do pri -miR-142 resulta na supressão de seu processamento por Drosha, degradação por um componente de complexo RISC e níveis reduzidos do produto maduro (YANG et al., 2006). O acúmulo de pri -miRNAs e a depleção correspondente de miRNAs maduros ocorre em cânceres humanos em comparação com tecidos normais, indicando fortemente que o comprometimento de etapas cruciais na biogênese de miRNA poderia ser a causa subjacente da desrregulação dos miRNAs (GURTNER et al. , 2016) . A inibição da biogênese de microRNA, pela depleção de Dicer1 e Drosha, tende acelerar a transformação celular e aumentar a tumorigênese in vivo (KUMAR et al. , 2007) . A perda condicional de Dicer1 , por exemplo , nos tecidos pulmonares de camundongos aumenta o desenvolvimento de tumores pulmonares (KUMAR et al., 2009). Alterações de expressão dos principais reguladores da biogênese de miRNAs estão presentes no tecido canceroso endometrial e podem ser potencialmente responsáveis pelos perfis alterados de miRNAs observados na doença (TORRES et al. , 2011) .Também foi 40 observado que perda de Dicer e / ou Drosha também tem sido inversamente correlacionada com o desfecho no câncer de pulmão (KARUBE et al., 2005), câncer do epitélio ovariano (SPANNUTH et al., 2009) e, mais recentemente, em outros tipos de tumores como carcinoma nasofaríngeo (GUO et al., 2012) , neuroblastoma (OLENA; PATTON, 2010) e mama (RIMOKH et al., 2009). Nossa hipótese é que variações na expressão das proteínas envolvidas no processo de biogênese dos miRNAs em lesões adenomióticas, caso existam, possam ser a base da explicação da variabilidade no conjunto de miRNAs associados à adenomiose disponíveis na literatura. Também poderia abrir novas frentes de investigação do papel dessas proteínas na fisiopatologia da doença. 41 Objetivo 42 2. OBJETIVO 2.1. Objetivo Geral Avaliar a expressão das proteínas Dicer, D rosha, E xportina-5 no endométrio eutópico e ectópico de pacientes com adenomiose. 43 Casuística, pacientes e métodos 44 3. CASUÍSTICA, PACIENTES E MÉTODOS 3.1. Delineamento do estudo O estudo é retrospectivo com base em uma série prospectiva. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da instituição (CAAE: 79643617.8.0000.5440 ), no qual foi solicitado dispensa do termo de consentimento livre e esclarecido. Foram incluídos neste estudo dados clínicos resgatados de prontuários médicos, e spécimes de endométrio ectópico oriundos de mulheres com adenomiose dispostos em blocos de parafina e espécimes adicionais de endométrio eutópico oriundos de mulheres submetidas à histerectomia sem doenças do endométrio, também dispostos em blocos de parafina, previamente coletados, entre 2005 a 2017. O

foi identificado no Serviço de Patologia (SERPAT) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HC -FMRP- USP), através de busca eletrônica e listagem de todos os diagnósticos histológicos de adenomiose e endométrio normal. Os blocos corre spondentes foram revistos, consecutivamente, por ordem cronológica decrescente, com objetivo de checar quesitos técnicos da qualidade do bloco, e representatividade do tecido -alvo (endométrio eutópico e endométrio ectópico) (Figura 4). Este trabalho foi de senvolvido no laboratório de Oncopatologia, do Departamento de Patologia, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMRP/USP) em colaboração com o Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (SERPAT) do HC-FMRP-USP. 3.2.Pacientes Este estudo incluiu 22 espécimes de endométrio de pacientes com adenomiose e 10 espécimes de endométrio eutópico de mulheres sem doenças do endométrio. Foram incluídas no estudo amostras oriundas de mulheres com adenomiose não nulíparas, com dor pélvica e sangramento uterino anormal não responsivo ao tratamento clínico com contraceptivos hormonais, sem patologias associadas como leiomiomatose, endometriose, e/ou pólipo endometrial que foram submetidas à histerectomia total e que relataram não estar fazendo uso de medicamentos hormonais nos últimos dois meses, não usuárias de dispositivo intrauterino de qualquer tipo. Foram selecionadas apenas amostras histológicas que foram compatíveis com a fase proliferativa do ciclo menstrual. Os critérios de elegibilidade para as amostras controle foram: mulheres não 45 nulíparas, submetidas à histerectomia total e salpingooforectomia para tratamento de tumores epiteliais benignos de ovário sem história de dor pélvica ou sangramento uterino anormal, ou uso de contraceptivos hormonais nos últimos dois meses. Também foram selecionadas apenas amostras histológicas que foram compatíveis com a fase proliferativa do ciclo menstrual. Fizemos uma primeira seleção das amostras inferindo a fase do ciclo menstrual pelo dia da última menstruação informada no prontuário médico. Confirmamos a fase com a identificação morfológica das seguintes características: glândulas retas e estreitas, e epitélio glandular cubo-colunar. Cromatina nuclear dispersa e figuras mitóticas presentes. Células estromais também com atividade mitótica e bordas mal definidas. Na fase proliferativa tardia, glândulas com maior tamanho e tortuosas com pseudoestratificação do epitélio, mostrando núcleos em diferentes níveis. Células estromais pequenas e com formato de fuso semelhante às células pré-decíduais. 3.3.Dados clínicos Os dados clínicos abaixo listados foram coletados nos prontuários registrados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP/USP das pacientes. Esses dados são registrados rotineiramente pela equipe clínica que acompanha a paciente e encontram-se disponíveis para uso em pesquisa, mediante aprovação em comitê de ética. (i) Caracterização das pacientes:  Idade  Paridade  Patologias associadas  Menarca  Data da última menstruação (DUM) (ii) Características ultrassonográficas seguindo a classificação proposta por Van den Bosch et al., 2018 (88),quando possível:  Localização na parede uterina: anterior, posterior, lateral esquerda, lateral direita ou fúndica  Diferenciação: focal, difusa ou adenomioma  Lesões císticas ou não císticas 46  Envolvimento da parede uterina: tipo 1 (zona juncional), tipo 2 (camada intermediária do miométrio) ou tipo 3 (camada externa do miométrio)  Extensão da adenomiose: moderada ou severa  Tamanho das lesões 3.4. Imunohistoquímica As amostras de endometrio eutópico e ectópico de mulheres com adenomiose foram analisados de forma pareada. Em virtude da heterogeneidade do componente tissular do estroma, optamos por fazer a análise apenas do tecido epitelial glandular. As amostras de tecido incluídas em parafina foram cortadas no micrótomo (LEICA RM2245) em secções de 4 µm de espessura e depositadas em lâminas de vidro previamente tratadas (ENTELLAN®) para realização das re ações de imunohistoquímica. O material foi submetido a desparafinizaçãoem xilol por três vezes de cinco minutos e em sequência submetido à desidratação em gradiente de álcool (absoluto I, absoluto II, 95%, 90%, 80% e 70%) por um minuto cada. Foi feita a hidratação em água corrente e água destilada. Posteriormente, a recuperação antigênica foi realizada através da fervura dos cortes, em tampão citrato 0,1M pH 6.0, por 40 minutos na panela à vapor (90°C), exceto para o anticorpo Anti -Dicer, que foi feito a recuperação antigênica utilizando o tampão de recuperação DIVA Reveal Decloaker 10x. Após recuperação, as lâminas foram deixadas em temperatura ambiente por 20 minutos e em sequência foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com hidrogen peroxidase b lock, (DHP -125, Spring Bioscience , USA) . Posteriormente, as lâminas foram lavadas em TBST ( TRIS-Buffered Saline 0.05 with Tween 20) por cinco minutos. Para bloqueio das ligações inespecíficas foi utilizado o kit ULTRAV ( BIOGEN, Cambridge, Massachusetts, EUA ) por 10 minutos. Em seguida foi realizada a incubação com o anticorpo primário anti-human diluído em BSA 0,1% (albumina de soro bovino), para os seguinte s marcadores (tabela abaixo) overnight à -4ºC. Os anticorpos utilizados na imunohistoquímica, marca, clone e diluição estão apresentados na Tabela 1. Após a incubação com anticorpo primário, feita a lavagem com TBST ( TRIS- buffered saline) e adição de REVEAL Complement (DCMT-15, Spring Bioscience, USA) - anticorpo secundário - por 10 minutos. Em seguida o material foi incubado por 47 15 minutos em HRP Conjugate (Horseradish peroxidase , DHRR -125, Spring Bioscience, USA). A reação foi revelada com crómogeno DAB ( 3,3′- Diaminobenzidina, Spring Bioscience, USA). As lâminas foram lavadas em água destilada por cinco minutos e contracoradas com Hematoxilina de Harris durante 40 segundos. Os cortes foram então hidratados em gradientes crescentes de álcool e diafinizados em xilol, e montados em meio permanente para obervação ao microscópio. Os tecidos utilizados como controle positivo na imunoh istoquímica para os marcadores Drosha, Exportina-5 e Dicer foram, consecutivamentes, adenocarcinoma de pulmão, cólon normal e pla centa. Como controle negativo de cada caso utilizou -se uma seção do tecido analisado incubado apenas com o diluente do anticorpo e protéina sérica bovina (BSA) (Figura 5). 3.5.Análise das imagens histológicas As lâminas foram selecionadas de acordo com a maior representatividade de tecido epitelial típico de endométrio (eutópico ou ectópico) por um consenso de dois observadores. Para avaliação da imunocoloração, foi utilizado um microscópio de luz convencional (Axiostar Plus, Zeiss, Göttingen, Alemanha) e foram examinados todos os campos que continham as lesões, sendo consideradas células positivas aquelas coradas de marrom escuro após as reações. Em cada lâmina foram analisados 10 campos de aumento 40 x, com priorização dos campos de marcação mais intensa. As categorias foram definidas por porcentagem de células positivas: 0 (0% –5%), + (6% –25%), ++ (26%–50%), e +++ (51%–100%) (TAN et al., 2011; ZHANG et al., 2016). Foi realizado o processo de leitura automatizada das lâminas utilizando imagens das lâminas escaneadas por um sistema Olympus BX61VS Slide Scanner ( Olympus Optical do Bras il Ltda, São Paulo, Brasil ) através do software VS120 Virtual Slide Microscope ( Olympus Optical do Brasil Ltda, São Paulo, Brasil ), localizado no Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica (LMME) do Departamento de Biologia Celular e Bioagentes Patogênicos, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Foram digitalizados cinco áreas de lesões adenomióticas e duas áreas de endométrio eutópico para cada lâmina, utilizando a objetiva com aumento de 20 x, todas as imagens foram geradas no formato tiff. 48 3.6. Análise digital quantitativa das imagens Para a análise digital quantitativa das imagens, utilizou-se a ferramenta QuPath (https://qupath.github.io) (Universidade de Edinburgh, Reino Unido) (BANKHEAD et al., 2017) . Inicialmente foram criados projetos específicos (endometrio eutópico de mulheres controle; endometrio eutópico de mulheres com adenomiose; e endometrio ectópico) onde as imagens foram carregadas como tipo brightfield, adequada a coloração com DAB que utilizamos. Esta etapa é importante e interfere no processo de separação automatizada das marcações. Ela usa um método de deconvolução de cores dentro do espectro RGB (do inglês red, green, e blue) (RUIFROK; JOHNSTON, 2001). O software permite a seleção de vetores específicos para identificação de imagens imunohistoquímicas marcadas com hematoxilina e DAB. Uma vez carregadas, as imagens foram anotadas. Esse processo de anotação representa a seleção de objetos ou áreas de interesse da análise. Embora esse processo pudesse ser automatizado, nós preferimos selecionar manualmente todo o tecido glandular representado na imagem. Para isso usamos duas ferramentas de desenho disponíveis (polygon e brush). No primeiro, era possível delimitar uma região usando linhas finas poligonais, e na segunda, era possível selecionar uma região usando um pincel de espessura variável (Figura 6). Após a etapa de seleção das áreas de interesse, nós procedemos com o processo de detecção de células usando uma função build-in chamada ‘positive cell detection’, pois foi a que mais se adaptou às nossas análises preliminares (Figura 6). Os parâmetros referentes à detecção de núcleos, células, e intensidade de background foram, via de regra, padronizados entre as imagens dentro de cada projeto, utilizando os ajustes padrões sugeridos pelo software. Ajustes individuais finos foram feitos no parâmetro de detecção dos limites das células devido a uma variação morfológica do tamanho das mesmas entre as lâminas (Figura 6). Usamos como parâmetro de detecção de intensidade a média de marcação nuclear ou celular, respectivamente para os anticorpos com marcação exclusiva nuclear ou mista (nuclear e citoplasmática). Classificamos a intensidade de marcação em +, ++, ou +++ usando os limiares de detecção de cor de 0.2, 0.4 e 0.6, respectivamente. A razão entre a contagem de células positivas (independente da intensidade) e a contagem total de células foi usada para gerar o índice de marcação celular, expresso em porcentagem. A classificação da intensidade de marcação também foi analisada, mas de 49 maneira qualitativa. 3.7.Análise estatística A quantificação da imunomarcação dos anticorpos foi expressa pela média e o erro padrão do percentual de células positivas entre o total de células identificadas por amostra. Para análise da diferença do número percentual de células epiteliais marcadas positivamente pelos anticorpos ente o endométrio eutópico de mulheres sem adenomiose e o endométrio eutópico de mulheres com adenomiose, foi utilizado o teste de Mann Whitney para dois grupos independentes. Para análise da diferença do número percentual de células epiteliais marcadas positivamente pelos anticorpos entre o endométrio eutópico e o endométrio ectópico de mulheres com adenomiose, utilizamos o teste de Wilcoxon para duas amostras pareadas (Wilcoxon signed rank test). Para análise de correlação entre o número percentual de células epiteliais marcadas positivamente pelos anticoropos entre o endométrio eutópico e o endométrio ectópico de mulheres com adenomiose, foi utilizado o método de correlação de Spearman. Usamos o teste exato de Fisher para testar a hipótese nula da avaliação subjetiva da proporção de células comprometidas em cada tecido, referente à cada proteína. 50 Resultados 51 4. RESULTADOS 4.1.Avaliação clínica dos pacientes A caracterização da casuística está detalhada nas Tabela 2 e Tabela 3. 4.2.Caracterização qualitativa da expressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs Detectamos através da detecção de intensida de de marcação, a localização das proteínas, sendo os parâmetros utilizados: nuclear ou celular ou mista (nuclear e citoplasmática). Foi possível verificar que a proteína Drosha tem localização nuclear e celular, enquanto as proteínas Exportina -5 e Dicer e stão localizadas apenas no citoplasma das células endometriais (Figura 7). As células epiteliais foram o foco da imunomarcação, uma vez que o estroma é muito heterogêneo na composição celular e pode inviabilizar uma análise adequada. As análises de intensidade de marcação foram realizadas de maneira qualitativa, classificando em +, ++ ou +++. 4.3.Avaliação quantitativa da expressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs A média (Me) e o erro padrão (se) do percentual de células positivas estão representados na tabela 4. O percentual de células examinadas para cada condição está representado nas tabelas 5, 6 e 7. Observamos menor expressão de Drosha no endom étrio eutópico de mulheres com adenomiose em comparação com o endom étrio eutópico das mulheres sem a doença (p = 0.016) (IC 95% da diferença: 3.4% a 27.4%) (Figura 8). Além disso, observamos men or expressão de Drosha no endomé trio ectópico de mulheres com adenomiose do que no endomé trio eutópico das mesmas mulheres ( p = 0.004 ; IC 95% da diferença: 2.3% a 16.7 %) (Figura 9). Também foi possível observar uma correlação moderada entre a expressão de Drosha no endom étrio ectópico de mulheres com adenomiose e no endom étrio eutópico das mesmas mulheres ( p = 0.034, rho = 0.454 ) (Figura 10). Não observamos diferença na expressão de Exportina -5 entre o endométrio eutópico de mulheres com adenomiose e o endométrio eutópico das mulheres sem a doença: p = 0.428 (IC9 5% da diferença: -18.1% a 7.9%) (Figura 8). Também não 52 observamos diferença na expressão de Expor tina-5 entre o endométrio ectópico de mulheres com adenomiose e o endométrio eutópico das mesmas mulheres: p=0.337 (IC95% da diferença: -4.0% a 13.6%) (Figura 9). Em relação à expressão de Dicer, não identificamos diferença entre o endométrio eutópico de mulheres com adenomiose e o endométrio eutópico das mulheres sem a doença: p=0.399 (IC95% da diferença: -0.01% a 2.01%) (Figura 6) . Não observamos diferença na expressão de Dicer entre o endométrio ectópico de mulheres com adenomiose e o endomé trio eutópico das mesmas mulheres: p = 0.218 (IC95% diferença: -0.3% a 0.05%) (Figura 10). 53 . Discussão 54 DISCUSSÃO Nosso estudo mostra que a expressão imunohistoquímica de Drosha é progressivamente menor no endométrio eutópico e ectópico de mulheres com adenomiose quando comparados ao endométrio eutópico de mulheres sem a doença. A correlação observada no percentual de células imunomarcadas para a Drosha nos tecidos eutópicos e ectópicos pareados sugere uma expressão coordenada entre os sítios. Quanto à Dicer e Exportina-5 não identificamos diferenças significativas da expressão nos tecidos estudados. No entanto, algumas observações precisam ser apontadas. Com relação à Dicer, a baixa expressão, ao menos na fase proliferativa, e o número reduzido da casuística podem ser as responsáveis pela impossibilidade de rejeitar a hipótese de nulidade. Quanto à expressão de Exportina-5, a maior heterogeneidade (dispersão) da sua expressão no endométrio eutópico de mulheres sem adenomiose pode ser a responsável por essa impossibilidade. As razões para as alterações que detectamos são desconhecidas. Não é possível afirmar se essas alterações detectadas são herdadas ou se são adquiridas pelas células de alguma maneira ao longo da vida. De todo modo, estudos re centes têm mostrado que essas proteínas têm papel relevante na receptividade endometrial e infertilidade (LOKE; RAINCZUK; DIMITRIADIS, 2019), e também no câncer endometrial (TORRES et al., 2011). Neste último, a expressão reduzida pode inclusive estar diretamente associada a desfechos clínicos desfavoráveis e diminuição da sobrevida (TORRES et al. , 2011) . Com base nesses achados, embora plausível, não é possível garantir se essas alterações comuns podem justificar o aumento de risco de câncer de endométrio em mulheres com adenomiose (JOHNATTY et al., 2020). Outro ponto interessante é com relação à baixa expressão de D icer. Do ponto de vista biológico, a deleção de Dicer pode direta ou indiretamente causar a depleção d os receptores de progesterona (HAWKINS et al. , 2012), cuja menor expressão também é observado na adenomiose (INOUE et al., 2019). A express ão diferencial de Drosha entre os endom étrios eut ópicos e ect ópicos pode justificar a express ão alterada dos miRNAs em adenomiose , uma vez que, alterações nos níveis de expressão de Drosha acompanham as desregulações de microRNAs em várias neoplasias, incluindo cânceres de mama e de ovário (BERNSTEIN et al., 2003). Torres et al. (2011), verificou que alterações de expressão dos principais reguladores da biogênese dos microRNAs estão presentes no tecido 55 cancerígeno endometrial e podem ser potencialmente responsáveis pelos perfis alterados dos microRNAs observados nessa neoplasia (TORRES et al. , 2011) : os níveis de expressão de Drosha foram significativamente mais baixos em amostras de câncer de endométrio em comparação com os controles e a expressão diminuída de Drosha se correlacionou com o maior grau histológico da doença (TORRES et al. , 2011) . O s níveis de mRNA de Dicer e Drosha c orrelacionados com os n íveis de expr essão da proteína correspondente encontram -se reduzidos nas amostras de c âncer de ov ário (SPANNUTH et al. , 2009) , além disso, a express ão de mRNA de Dicer e Drosha é variável entre espécimes de câncer de ovário epitelial invasivo e em linhas de células de câncer de ov ário e est ão significativamente associadas à sobrevivência, indicando que os níveis de mRNA de Dicer e Drosha em c élulas de câncer de ovário são clinicamente relevantes (SPANNUTH et al., 2009). Drosha e seu cofator, DGCR8, formam o complexo microprocessador e s ão cruciais para a etapa inicial de matura ção de miRNA: processamento nuclear de p ri- miRNAs (PONG; GULLEROVA; ROAD, 2018) . Al ém dos pri -miRNAs, a Drosha também pode ter como alvo outros transcritos contendo a estrutra hairpin, como hairpins encontrados em éxons de mRNA (PONG; GULLEROVA; ROAD, 2018) .O mapeamento de todo o genoma de substratos nascentes de Drosha atrav és formaldehyde cross-linking immunoprecipitation and sequencing (fCLIP -seq) revelou que Drosha também processa substratos n ão canônicos, sugerindo que pode ter fun ções diferentes da matura ção de miRNA (KIM; KIM, 2018) . Pong; Gullerova (2018) (PONG; GULLEROVA; ROAD, 2018) publicaram uma revisão sobre as fun ções não canônicas das prote ínas reguladoras da biog ênese dos miRNAs. A aus ência do complexo microprocessador durante o desenvolvimento leva à perda das propriedades das células- tronco e à diferenciação prematura em progenitores neurais do prosencéfalo de murinos, a Drosha desestabiliza diretamente o mRNA da Neurogenina 2 (Ngn2) e, assim, diminui os n íveis de Ngn2, um fator de transcri ção neurog ênico (PONG; GULLEROVA; ROAD, 2018) . Outro estudo apontado na revis ão mostrou que a abla ção de DGCR8 prejudica a corticog ênese em camundongos de forma mais pronunc iada do que a depleção de Dicer, um fenômeno causado pela desregulação do transcrito da proteína T- box cerebral 1 (Tbr1), que previu estruturas em hairpin em sua sequ ência de codificação, concluindo que, e DGCR8 s ão, portanto, importantes para manter a propriedade de auto -renovação de progenitores neurais murinos, que é alcançada pela 56 desestabilização de transcritos que codificam fatores de diferencia ção. Além de implicações na neurog ênese, Drosha est á implicada no desenvolvimento mieloide, em que desestabiliza diretamente o mRNA da cadeia leve 9 da miosina (Myl9) e o mRNA alvo de Drosha 1 (Todr1), cujos produtos prot éicos são inibidores da mielopoiese e s ão essenciais para o desenvolvimento das c élulas dendr íticas(PONG; GULLEROVA; ROAD, 2018). Das proteínas estudadas, a Exportin-5 é a mais altamente regulada pelo estrogênio. Já o efeito da progesterona parece fundamental para o aumento da expressão de Dicer, e pode induzir uma redução na expressão da Drosha (NOTHNICK, 2012), ao menos no tecido sadio. Talvez isso explique a baixa expressão identificada no nosso estudo. A identificação de baixa expressão de Dicer nessa fase do ciclo menstrual tanto no endométrio eutópico quanto no endométrio ectópico de mulheres com adenomiose, sugere que esse componente da biogênese não deve ser o responsável pelas alterações na modulação da maturidade dos miRNAs associados a esta patologia. Outra justificativa poderia ser o envolvimento dos hormônios esteroides sexuais no processo de regulação da expressão de miRNAs. É sabido que os receptores nucleares para os hormônios esteroides, inclusive que o receptor alfa do estrogênio modula a biossíntese de miRNAs (FUJIYAMA-NAKAMURA; YAMAGATA; KATO, 2010) e que a expressão desta isoforma do receptor é diferentemente expressa no endométrio adenomiótico (MEHASSEB et al., 2011). Do ponto de vista da susceptibilidade genética, alguns estudos têm identificado uma associação entre polimorfismos de D icer e/ou Drosha e risco para endometriose (MEDEIROS et al. , 2021) e aborto espontâneo reccorrente (GHASEMI et al. , 2019) , condições sabidamente associadas à adenomiose (LEYENDECKER et al. , 2015; SOMIGLIANA et al. , 2006) . Outra hipótese que pode ser aventada, embora também não seja segura em explicar a variação na expressão dessas proteínas em espécimes de adenomiose é o envolvimento das proteínas p53, p63 e p73 (BOOMINATHAN, 2010) . Essas proteínas podem modular a expressão de Dicer e Drosha (BOOMINATHAN, 2010) e parecem estar alterados em espécimes de adenomiose (HOSPITAL, 1996; NETO; FERREIRA; RAMALHO, 1975) . Nosso estudo algumas limitações. A sele ção de pacientes e controles foi muito rigorosa. Embora importante, o uso de critérios estritos levou a uma redução 57 significativa da elegibilidade. De qualquer forma, consideramos esse ponto fundamental para um estudo piloto. A padronização da fase do cicl o menstrual também parece ser muito importante, pois os esteróides sexuais podem interferir drasticamente na expressão dessas proteínas (NOTHNICK, 2011). Neste estudo não incluímos amostras de mulheres que estavam em uso de progestagênio, pois acreditamos que isso poderia ter interferido na análise da expressão tecidual das proteínas -alvo. Além disso, nossa casuística também não contém amostras da fase secretória, uma vez que boa parte das cirurgias de histerectomia são realizadas no período proliferativo do ciclo menstrual. Outro ponto é a utilização da técnica imunohistoquímica apenas. No entanto, apesar do sequenciamento de RNA (RNAseq) ser considerado o padrão ouro para avaliação de perfis de genes ao nível da tr anscrição, a avaliação da expressão de proteínas pela imunohistoquímica em amostras teciduais embebidas em parafina e fixadas em formalina (formalin -fixed paraffin -embedded tissue samples) demonstrou correlações altas e estatisticamente significativas com o RNAseq (SOROKIN et al. , 2020).O uso da metodologia de análise digital das imagens com supervisão de conferência de um patologista agrega valor substancial à mensuração quantitativa da marcação imunohistoquímica (RIZZARDI et al., 2012). 58 Conclusão 59 5. CONCLUSÃO A expressão de Drosha é reduzida aparentemente de maneira coordenada no endométrio eutópico e ectópico de mulheres com adenomiose. Esse achado, juntamente com a evidência da relação entre essa proteína e o câncer endometrial, justifica o direcionamento de pesquisas futuras para compreender o papel da Drosha na fisiopatologia da adenomiose e, eventualmente, sua relação com o câncer de endométrio evidencia a importância. O comprometimento da expressão dessa proteína, e talvez da Dicer/Exportina-5, pode justificar a importância da via de biogênese dos miRNAs na fisiopatologia da doença e, consequentemente, na interpretação dos sintomas e na proposição de terapias efetivas. 60 Tabelas 61 6. TABELAS Tabela 1: Anticorpos utilizados na imunohistoquímica. Anticorpo Marca Clone Diluição Controle positivo Anti- Drosha ABCAM/UK ab102015 1:100 Adenocarcinoma de pulmão Anti- Dicer ABCAM/UK ab82539 1:60 Placenta Anti-Exportin- 5 ABCAM/UK ab129006 1:200 Cólon Nota: para controle negativo não utilizamos anticorpo primário 62 Tabela 2: Caracterização clínica das pacientes incluídas no estudo. Casos (n = 22) Controles (n = 10) p value Idade (média±dp) 41.8±3.6 42.2±3.1 .751 Menarca (média±dp) 11.9±1.7 12.6±1.1 .258 Gestações (mediana,intervalo) 4, 0-8 2.5, 2-4 .073 Paridade (mediana, intervalo) 2.5, 0-4 2, 1-4 .298 Localização (n, %) --- --- Parede anterior 6, 27.3 --- --- Parede posterior 8, 36.4 --- --- Mista 8, 36.4 Envolvimento da camada uterina --- --- Tipo 1-2 15, 68.2 --- --- Tipo 2-3 5, 22.7 --- --- Tipo 1-2-3 2, 9.1 --- --- Notas: tipo 1 = zona de junção; tipo 2 = miométrio médio; tipo 3 = miométrio externo. 63 Tabela 3: Informações clínicas das pacientes controles incluídas no estudo. Idade Paridade Patologias Associadas Menarca Hábitos D.U.M Data da cirurgia 39 anos G4P4A0C4 DPC e SOP 13 anos Ex- tabagista 06/05/2010 17/05/20 10 38 anos G4P3A1C1 Nega 13 anos Nega 10/2006 23/10/20 06 36 anos G5P2A4PN2 Nega 14 anos Nega 17/04/2007 20/04/20 07 46 anos G2P2A0PN2 Fibromialgia 9 anos Nega 02/2006 08/02/20 06 47 anos G3P3A0PN3 Anemia 8 anos Nega 04/04/2007 09/04/20 07 39 anos G2P2A0PN2 HAS 12 anos Nega 14/09/2008 15/09/20 08 38 anos G1 Anemia 13 anos Nega 29/10/2007 09/11/20 07 48 anos G5P3A2C Nega 11 anos Ex- tabagista 21/03/2009 27/03/20 09 39 anos G2P2A0PN2 Nega 9 anos Nega 03/09/2007 14/09/20 07 44 anos G2P1A1PN1 DPC 10 anos Ex- tabagista 07/10/2006 16/10/20 06 45 anos G4P3A1PN3 NIC I e NICII 13 anos Não informado 10/06/2008 22/06/20 08 48 anos G2P2A0C2 Nega 13 anos Não informado 17/07/2007 25/07/20 07 43 anos G4P2A2C2 Nega 10 anos Não informado 15/07/2006 21/07/20 06 45 anos G8P8A0N8 NIC II 13 anos Não informado 25/04/2006 04/05/20 06 39 anos G4P4C1A0 Dispareunia e anemia 14 anos Nega 26/09/2007 31/09/20 07 42 anos G6P2A4C2 Nega 12 anos Etilismo Social 12/08/2007 19/08/20 07 39 anos G4P4A0PN4 Nega 14 an Não 24/02/2006 02/03/20 06 64 Notas: Data da última menstruação (D.U.M). Gravidez (G). Parto(s) (P). Aborto (A). Cesárea (C). Parto Normal (PN). os informado 41 anos G4P2A2PN2 Nega 13 anos Não informado 13/08/2007 19/08/20 07 43 anos G4P3A1C1P N3 Nega 13 anos Ex- tabagista 05/2006 12/05/20 06 40 anos G4P3A1PN3 Nega 11 anos Nega 13/01/2007 17/01/20 07 43 anos G2P2A0C2 DMII 12 anos Nega Dezembro de 2008 13/02/20 09 37 anos G3P2A0C1 Nega 12 anos Nega Não informado 13/08/20 08 65 Tabela 4: Percentual de células epiteliais positivas para cada anticorpo em cada condição. Anticorpo Condição Endométrio % (Me±se) Contagem de células Anti-Drosha Controle Eutópico 85.2±2.9 3168 Adenomiose Eutópico 69.9±3.4 3818 Ectópico 59.6±3.2 2562 Anti-Dicer Controle Eutópico 2.4±1.8 2932 Adenomiose Eutópico 0.1±0.0 3015 Ectópico 0.2±0.0 2232 Anti-Exportina- 5 Controle Eutópico 67.8±7.6 3352 Adenomiose Eutópico 76.3±2.6 3190 Ectópico 72.4±3.4 2436 66 Tabela 5: Percentual de células positivas para o marcador Drosha. Notas: Diferença entre endométrio normal e eut ópico (Teste exato de Fisher, p = 0.0058) e diferença entre endométrio normal e ectópico (teste exato de Fisher, p = 0.0058). DROSHA 0&1 2 3 endométrio normal 0(%) 4(%) 6(%) endométrio eutópico 0(%) 0(%) 22(%) endométrio ectópico 0(%) 0(%) 22(%) 67 Tabela 6: Percentual de células positivas para o marcador Exportina-5. EXPORTINA-5 0 1 2 3 endométrio normal 1(%) 0(%) 3(%) 6(%) endométrio eutópico 0(%) 0(%) 3(%) 19(%) endométrio ectópico 0(%) 0(%) 3(%) 19(%) Notas: Diferença entre endométrio normal e eutó pico (Teste exato de Fisher, p = 0.3204) e diferença entre endométrio normal e ectópico (teste exato de Fisher, p = 0.3204). 68 Tabela 7: Percentual de células positivas para o marcador Dicer. Notas: Diferença entre endométrio normal e eut ópico (Teste exato de Fisher, p = 0 .6367) e diferença entre endométrio normal e ectópico (teste exato de Fisher, p = 0.6367) DICER 0&1 2&3 endométrio normal 9(%) 1(%) endométrio eutópico 17(%) 5(%) endométrio ectópico 17(%) 5(%) 69 Referências Bibliográficas 70 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANGIONI, S et al. Pain control and quality of life after laparoscopic en -block resection of deep infiltrating endometriosis ( DIE ) vs . incomplete surgical treatment with or without GnRHa administration after surgery. [s. l.], 2014. ARTICLE, Original. Adenomyosis : genetics of estrogen metabolism Abstract :. [s. l.], p. 2–7, 2019. ARTICLE, C M E Review. Cme review article 26. [s. l.], v. 71, n. 9, 2016. BANKHEAD, Peter et al. QuPath : Open source software for digital pathology image analysis. [ s. l.], n. November, p. 1–7, 2017. BARTEL, David P; LEE, Ro salind; FEINBAUM, Rhonda. MicroRNAs : Genomics , Biogenesis , Mechanism , and Function Genomics : The miRNA Genes. [s. l.], v. 116, p. 281–297, 2004. BENAGIANO, Giuseppe et al. The pathophysiology of uterine adenomyosis : an update. Fertility and Sterility, [s. l.], v. 98, n. 3, p. 572–579, 2012. BERNSTEIN, Emily et al. Dicer is essential for mouse development. [ s. l.], v. 35, n. 3, p. 215 –217, 2003. BOOMINATHAN, Lakshmanane. Regulators of MicroRNA Processing Complex. [ s. l. ], v. 5, n. 5, 2010. BORISOV, Evgeny et al. Analysis of Reciprocally Dysregulated miRNAs in Eutopic Endometrium Is a Promising Approach for Low Invasive Diagnostics of Adenomyosis. [s. l.], p. 1–14, BRENNECKE, Julius; COHEN, Stephen M. Towards a complete description of the microRNA complement of animal genomes. [s. l.], p. 1–3, 2003. BROSENS, Ivo et al. The enigmatic uterine junctional zone : the missing link between reproductive disorders and major obstetrical disorders ?. [s. l.], v. 25, n. 3, p. 569–574, 2010. CANCER, The; ATLAS, Genome. Integrated genomic characterization of endometrial carcinoma. [ s. l.], n. 53, 2013. CHAMPANERIA, Rita et al. Ultrasound scan and magnetic resonance imaging for the diagnosis of adenomyosis : systematic review comparing test accuracy. [ s. l.], n. December 2009, p. 1374 –1384, 2010. CHEN, Yi -jen et al. Suppression of migratory / invasive ability and induction of apoptosis in adenomyosis-derived mesenchymal stem cells by cyclooxygenase-2 inhibitors. Fertility and Sterility, [s. l.], v. 94, n. 6, p. 1972-1979.e4, 2010. CHENDRIMADA, Thimmaiah P et al. LETTERS TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. [s. l.], v. 436, n. August, p. 4–8, 2005. CLINIC, Gynecological; HOSPITAL, Chelsea. A sonographic classificatio n and reporting system for diagnosing adenomyosis. [s. l.], D, Aisha A De Graaff M et al. B lymphocyte stimulator L 817C > T promoter polymorphism and the predisposition for the development of deep infiltrating endometriosis. Fertility and Sterility, [s. l.], v. 94, n. 3, p. 1108–1110, 2010. 71 DALMAY, T. MicroRNAs and cancer. [s. l.], 2008. DENLI, Ahmet M; TOPS, Bastiaan B J; PLASTERK, Ronald H A. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. [s. l.], p. 231–235, 2004. DEVLIEGER, Roland; D’HOOGHE, Thomas; TIMMERMAN, Dirk. Uterine adenomyosis in the infertility clinic. Human Reproduction Update, [s. l.], v. 9, n. 2, p. 139–147, 2003. FERENCZY, Alex. Pathophysiology of adenomyosis. [s. l.], v. 4, n. 4, p. 312–322, 1998. FRIEDMAN, Robin C et al. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. [ s. l.], p. 92–105, 2009. FUJIYAMA-NAKAMURA, Sally; YAMAGATA, Kaoru; KATO, Shigeaki. CHAPTER 5 HORMONAL REPRESSION OF miRNA BIOSYNTHESIS THROUGH A NUCLEAR STEROID HORMONE RECEPTOR. [s. l.], p. 43–55, 2010. GARCÍA-SOLARES, Javier et al. Pathogenesis of uterine adenomyosis : invagination or metaplasia ?. Fertility and Sterility, [s. l.], v. 109, n. 3, p. 371–379, GARGETT, Caroline E; SCHWAB, Kjiana E; DEANE, James A. Endometrial stem / progenitor cells : the first 10 years. [s. l.], v. 22, n. 2, p. 137–163, 2016. GHASEMI, Marzieh et al. The effects of DICER1 and DROSHA polymorphisms on susceptibility to recurrent spontaneous abortion. [s. l.], n. September, p. 1–6, 2019. GREGORY, Richard I; YA N, Kai -ping; AMUTHAN, Govindasamy. The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. [s. l.], v. 208, n. 2003, p. 2053–2056, 2004. GROOTHUIS, P G. Progesterone receptor polymorphism + 331G / A is associated with a decreased risk of deep infiltrating endometriosis. [s. l.], v. 22, n. 1, p. 129–135, 2007. GUO, Xiaofang et al. The microRNA-processing enzymes : Drosha and Dicer can predict prognosis of nasopharyngeal carcinoma. [s. l.], p. 49–56, 2012. GUO, Sun-wei. The Pathogenesis of Adenomyosis vis- à -vis Endometriosis. [s. l.], 2020. GUPTA, Devashana et al. Endometrial biomarkers for the non -invasive diagnosis of endometriosis. The Cochrane database of systematic reviews, [s. l.], v. 4, n. 4, p. CD012165, 2016. GURTNER, Aymone et al. Dysregulation of microRNA biogenesis in cancer : the impact of mutant p53 on Drosha complex activity. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, [s. l.], p. 1– 9, 2016. GUTTMACHER, Alan E; COLLINS, Francis S; PH, D. Welcome to the Genomic Era. [ s. l.], p. 13– 15, 2003. HA, Minju; KIM, V Narry. Regulation of microRNA biogenesis. Nature Publishing Group, [s. l.], v. 15, n. 8, p. 509–524, 2014. HAN, Jinju et al. The Drosha -DGCR8 complex in primary microRNA processing The Drosha – DGCR8 complex in primary microRNA processing. [s. l.], p. 3016–3027, 2004. HAWKINS, Shannon M et al. Dysregulation of Uterine Signaling Pathways in Progesterone Receptor- Cre Knockout of Dicer. [s. l.], v. 26, n. September, p. 1552–1566, 2012. HAWKINS, Shannon M et al. Functional MicroRNA Involved in Endometriosis. [s. l.], v. 25, n. May 2011, p. 821–832, 2015. 72 HERNDON, Christopher N et al. Global Transcriptome Abnormalities of the Eutopic Endometrium From Women With Adenomyosis. [s. l.], v. 23, n. 10, p. 1289–1303, 2016. HEVER, A et al. Molecular characterization of human adenomyosis. [ s. l.], v. 12, n. 12, p . 737–748, 2006. HOSPITAL, Lenox Hill. P53 Expression in Adenomyosis in Endometrial Carcinoma Patients. [ s. l.], v. 246, p. 241–246, 1996. HU, Haiyan; LI, Huijuan; HE, Yuanli. MicroRNA ‑ 17 downregulates expression of the PTEN gene to promote the occurrence and development of adenomyosis. [s. l.], p. 3805–3811, 2017. HUANG, Po-chin et al. Association between phthalate exposure and glutathione S -transferase M1 polymorphism in adenomyosis , leiomyoma and endometriosis. [s. l.], v. 25, n. 4, p. 986–994, 2010. HUANG, Jun-Hua et al. Upregulated microRNA let-7a accelerates apoptosis and inhibits proliferation in uterine junctional zone smooth muscle cells in adenomyosis under conditions of a normal activated hippo-YAP1 axis. Reproductive Biology and Endocrinology, [s. l.], v. 19, n. 1, p. 81, 2021. HUFNAGEL, Demetra; TAYLOR, Hugh S. The Role of Stem Cells in the Etiology and Pathophysiology of Endometriosis. [s. l.], 2015. INOUE, Satoshi et al. Uterine adenomyosis is an oligoclonal disorder associated with K RAS mutations. Nature Communications, [s. l.], 2019. IVAN, Guest Editor M; SCHMITTGEN, Thomas D. Regulation of microRNA processing in development , differentiation and cancer. [s. l.], v. 12, n. 5, p. 1811–1819, 2008. JOHNATTY, Sharon E et al. Co-existence of leiomyomas , adenomyosis and endometriosis in women with endometrial cancer. [s. l.], p. 1–10, 2020. JUO, S H et al. CYP17 , CYP1A1 and COMT polymorphisms and the risk of adenomyosis and endometriosis in Taiwanese women. [s. l.], v. 21, n. 6, p. 1498–1502, 2006. KADO, Noriko et al. Association of the CYP17 gene and CYP19 gene polymorphisms with risk of endometriosis in Japanese women. [s. l.], v. 17, n. 4, p. 897–902, 2002. KANG, Shan et al. Association between genetic polymorphisms in fibroblast g rowth factor ( FGF ) 1 and FGF2 and risk of endometriosis and adenomyosis in Chinese women. [ s. l.], v. 25, n. 7, p. 1806 – 1811, 2010. KARUBE, Yoko et al. Reduced expression of Dicer associated with poor prognosis in lung cancer patients. [s. l.], v. 96, n. 2, p. 111–115, 2005. KIM, Baekgyu; KIM, V Narry. fCLIP -seq for transcriptomic footprinting of dsRNA -binding proteins :. Methods, [s. l.], n. June, 2018. KITAWAKI, Jo et al. Interferon- g gene dinucleotide ( CA ) repeat and interleukin -4 promoter region ( 2 590C / T ) polymorp hisms in Japanese patients with endometriosis. [ s. l.], v. 19, n. 8, p. 1765 – 1769, 2004. KITAWAKI, Jo et al. Oestrogen receptor-alpha gene polymorphism is associated with endometriosis , adenomyosis and leiomyomata. [s. l.], v. 16, n. 1, p. 51–55, 2001. KIYOMIZU, Miyo; KITAWAKI, Jo; OBAYASHI, Hiroshi. Association of Two Polymorphisms in the Peroxisome Proliferator -Activated Receptor -wy Gene With Adenomyosis , Endometriosis , and Leiomyomata in Japanese Women. [s. l.], p. 3–8, 2006. 73 KUMAR, Madhu S et al. Dicer1 functions as a haploinsufficient tumor suppressor Dicer1 functions as a haploinsufficient tumor suppressor. [s. l.], p. 2700–2704, 2009. KUMAR, Madhu S et al. Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis. [s. l.], v. 39, n. 5, p. 673–677, 2007. LAZZERI, Lucia et al. Preoperative and postoperative clinical and transvaginal ultrasound findings of adenomyosis in patients with deep infiltrating endometriosis. Reproductive Sciences, [s. l.], v. 21, n. 8, p. 1027–1033, 2014. LEE, Yoontae et al. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. [ s. l.], v. 425, n. September, p. 1–5, 2003. LEVGUR, Michael. Diagnosis of adenomyosis: a review. The Journal of reproductive medicine, v. 52, n. 3, p. 177-193, 2007. LEYENDECKER, G et al. Adenomyosis and endometriosis . Re -visiting their association and further insights into the mechanisms of auto-traumatisation . An MRI study. [s. l.], p. 917–932, 2015. LEYENDECKER, Gerhard; WILDT, Ludwig. A new concept of endometrios is and adenomyosis : tissue injury and repair ( TIAR ). [s. l.], v. 5, n. 2, p. 125–142, 2011. LOKE, Hannah; RAINCZUK, Kate; DIMITRIADIS, Evdokia. MicroRNA Biogenesis Machinery Is Dysregulated in the Endometrium of Infertile Women Suggesting a Role in Receptivity and Infertility. [s. l.], p. 1–11, 2019. LUND, Elsebet. Nuclear Export of MicroRNA. [s. l.], v. 95, n. 2004, 2014. MALL, G Leyendecker L Wildt G. The pathophysiology of endometriosis and adenomyosis : tissue injury and repair. [s. l.], p. 529–538, 2009. MANUSCRIPT, Author. NIH Public Access. [s. l.], v. 18, n. 3, p. 215–222, 2013. MEDEIROS, Rui et al. and different diseases : Case -control and review studies . [ s. l. ], v. 119, n. September 2020, 2021. MEHASSEB, Mohamed Khairy et al. Estrogen and progesterone receptor isoform distribution through the menstrual cycle in uteri with and without adenomyosis. Fertility and Sterility, [s. l.], v. 95, n. 7, p. 2228-2235.e1, 2011. MOROSOVA, Elena B et al. Functional Gene Polymorphism of Matrix Metallopr oteinase-1 Is Associated with Benign Hyperplasia of Myo - and Endometrium in the Russian Population. [ s. l.], v. 16, n. 9, p. 1032–1037, 2012. NETO, Omero B Poli; FERREIRA, Hebert M; RAMALHO, Leandra N Z. Expression of p63 Differs in Peritoneal Endometrios is , Endometriomas , Adenomyosis , Rectovaginal Septum Endometriosis , and Abdominal Wall Endometriosis. [s. l.], v. 11, p. 1099–1102, 1975. NOTHNICK, Warren B. NIH Public Access. [s. l.], v. 37, n. 2, p. 265–273, 2011. NOTHNICK, Warren B. The role of mi cro-RNAs in the female reproductive tract. Reproduction, [s. l.], v. 143, n. 5, p. 559–576, 2012. OGAWA, H et al. Cancer-Associated Mutations in Endometriosis without Cancer. [s. l.], 2017. OHLSSON TEAGUE, E. Maria C.; PRINT, Cristin G.; HULL, M. Louise. The role of microRNAs in endometriosis and associated reproductive conditions. Human Reproduction Update, [s. l.], v. 16, n. 2, p. 142–165, 2009. 74 OLENA, Abigail F.; PATTON, James G. Genomic organization of microRNAs. Journal of Cellular Physiology, [s. l.], v. 222, n. 3, p. 540–545, 2010. PARAZZINI, Fabio et al. Risk factors for adenomyosis. [s. l.], v. 12, n. 6, p. 1275–1279, 1997. PERIC, H; FRASER, I S. The symptomatology of adenomyosis. [s. l.], v. 20, n. 4, p. 547–555, 2006. PHYSIOLOGY, Cellular. M iR-10b Directly Targets ZEB1 and PIK3CA to Curb Adenomyotic Epithelial Cell Invasiveness via Upregulation of E-Cadherin and Inhibition of Akt Phosphorylation. [s. l.], v. 200071, p. 2169–2180, 2015. PONG, Sheng Kai; GULLEROVA, Monika; ROAD, South Parks. N on-canonical functions of microRNA pathway enzymes — Drosha, DGCR8, Dicer and Ago proteins. [s. l.], p. 0–2, 2018. PONTIS, A et al. Adenomyosis : a systematic review of medical treatment Adenomyosis : a systematic review of medical treatment. [s. l.], v. 3590, n. October, 2017. RIMOKH, R et al. Prognostic value of Dicer expression in human breast cancers and association with the mesenchymal phenotype. [s. l.], p. 673–683, 2009. RIZZARDI, Anthony E et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. [s. l.], p. 1–10, 2012. ROZATI, Roya; VANAJA, Maria Celes tina; NASARUDDIN, Khaja. Genetic contribution of the interferon gamma dinucleotide -repeat polymorphism in South Indian women with endometriosis. [ s. l.], v. 36, n. 4, p. 825–831, 2010. RUIFROK, Arnout; JOHNSTON, Dennis A. Ruifrok AC , Johnston DA . Quanti fication of histochemical staining by color deconvolution . Anal Quant Cytol Histol 23 : 291 -299. [ s. l. ], n. September 2017, p. 291–299, 2001. SHAKED, Sivan; JAFFA, Ariel J; GRISARU, Dan. Uterine peristalsis -induced stresses within the uterine wall may sprout adenomyosis. [s. l.], 2014. SHAN, Kang et al. Polymorphisms in the promoter regions of the matrix metalloproteinases-7 , -9 and the risk of endometriosis and adenomyosis in China. [s. l.], v. 12, n. 1, p. 35–39, 2006. SINGH, Sunit K et al. MicroRNAs – micro in size but macro in function. [s. l.], v. 275, p. 4929–4944, 2008. SOMIGLIANA, Edgardo et al. Association between endometriosis and cancer: A comprehensive review and a critical analysis of clinical and epidemiological evidence. Gynecologic Oncology, [s. l.], v. 101, n. 2, p. 331–341, 2006. SOROKIN, Maxim et al. RNA Sequencing in Comparison to Immunohistochemistry for Measuring Cancer Biomarkers in Breast Cancer and Lung Cancer Specimens. [s. l.], 2020. SPANNUTH, A et al. NIH Public Access. [s. l.], v. 359, n. 25, p. 2641–2650, 2009. SUN, Bryan K; TSAO, Hensin. Small RNAs in development and disease. Journal of American Dermatology, [s. l.], v. 59, n. 5, p. 725–737, 2008. TAN, Xiaogang et al. A 5-MicroRNA signature for lung squamous cell carci noma diagnosis and hsa- miR-31 for prognosis. Clinical Cancer Research, [s. l.], v. 17, n. 21, p. 6802–6811, 2011. TELLUM, Tina et al. Diagnosing adenomyosis with MRI : a prospective study revisiting the junctional zone thickness cutoff of 12 mm as a diagnostic marker. [s. l.], 2019. 75 TORRES, Anna et al. Major regulators of microRNAs biogenesis Dicer and Drosha are down - regulated in endometrial cancer. Tumor Biology, [s. l.], v. 32, n. 4, p. 769–776, 2011. TSAI, Chia-lung et al. Taiwanese Journal of Obstet rics & Gynecology Associations between a single nucleotide polymorphism of stress -induced phosphoprotein 1 and endometriosis / adenomyosis. Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology, [s. l.], v. 57, n. 2, p. 270–275, 2018. UEKI, Ken et al. Expression o f Apoptosis -Related Proteins in Adenomyotic Uteri Treated with Danazol and GnRH Agonists. [s. l.], n. 3, p. 248–258, 2004. VANNUCCINI, Silvia et al. Pathogenesis of adenomyosis: an update on molecular mechanisms. Reproductive BioMedicine Online, [s. l.], v. 35, n. 5, p. 592–601, 2017. VANNUCCINI, Silvia; PETRAGLIA, Felice. Recent advances in understanding and managing adenomyosis [ version 1 ; referees : 2 approved ] Referee Status :. [s. l.], v. 8, p. 1–10, 2019. VERCELLINI, Paolo et al. Adenomyosis : epidemiological factors. [ s. l. ], v. 20, n. 4, p. 465 –477, 2006. WANG, Yangming et al. DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. [s. l.], v. 39, n. 3, p. 380–385, 2007. YANG, R Q et al. Microarray analysis of microRNA deregulation and angiogenesis-related proteins in endometriosis. [s. l.], v. 4, n. 2, p. 1–8, 2016. YANG, Weidong et al. Modulation of microRNA processing and expression through RNA editing by ADAR deaminases. [s. l.], v. 13, n. 1, p. 13–21, 2006. ZAMORE, Phillip D et al . Ribo-gnome : The Big World of Small RNAs. [ s. l. ], v. 1519, n. 2005, 2014. ZHANG, Cuizhen et al. Expression of DROSHA in the Uterus of Mice in Early Pregnancy and Its Potential Significance during Embryo Implantation. Reproductive Sciences, [s. l.], v. 23, n. 2, p. 154– 162, 2016. ZHANG, Wenyong; DAHLBERG, James E; TAM, Wayne. MicroRNAs in Tumorigenesis A Primer. The American Journal of Pathology, [s. l.], v. 171, n. 3, p. 728–738, 2007. ZHANG, Yijun; FAN, Miaomiao; ZHANG, Xue. Cellular microRNAs up -regulate transcription via interaction with promoter TATA -box motifs Cellular microRNAs up -regulate transcription via interaction with promoter TATA-box motifs. [s. l.], 2014. ZHAO, Min; TANG, Qiuqin; WU, Wei. miR -20a contributes to endometriosis by regulati ng NTN4 expression. [s. l.], p. 5793–5797, 2014.