{"paper_id":"672fce66-7c53-4e99-8286-7466ff5a7fb6","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nPROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA  \n \n \n \n \n \n \n \nIZADORA ORMENEZI \n \n \n \n \nExpressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs em lesões de \nadenomiose \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2021 \n \n \n \n\n \nRibeirão Preto \n2021 \nIZADORA ORMENEZI \n \n \n \n \nExpressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs em lesões de \nadenomiose \n \n \nVersão original  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDissertação apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto da Universidade de São Paulo para \nobtenção do título de Mestre em Ciências. \nÁrea de Conce ntração: Ginecologia e Obstetrícia – \nOpção: Biologia da Reprodução. \nOrientador: Prof. Dr.: Omero Benedicto Poli Neto \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \nAUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE \nTRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIO NAL OU ELETRÔNICO, \nPARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n                                           FICHA CATALOGRÁFICA \n \n  \nOrmenezi, Izadora.  \nExpressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs em lesões de \nadenomiose, 2021. 75 p.il;30xcm \n \nDissertação de mes trado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nda Universidade de São Paulo. \nDepartamento Ginecologia e Obstetrícia \nOrientador: Poli-Neto, Omero Benedicto.  \n \n1. Adenomiose, 2. Biogênese dos miRNAs, 3. Drosha, 4. Dicer, 5. Exportina -\n5. \n \n\n \n \n \nFOLHA DE APROVAÇÃO \n \n \nIzadora Ormenezi \nExpressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs em lesões de \nadenomiose \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAprovado em:  \nBanca examinadora \n \nProf(a). Dr(a).___________________________________________________________ \nInstituição: ________________________ Julgamento: __________________________ \nProf(a). Dr(a). __________________________________________________________ \nInstituição: ________________________ Julgamento: __________________________ \nProf(a). Dr(a). _________________________________________________________ \n \nDissertação apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto da Universidade de São Paulo para \nobtenção do título de Mestre em Ciências. \nÁrea de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia- Opção: \nBiologia da Reprodução. \nOrientador: Prof. Dr.: Omero Benedicto Poli Neto \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedico este trabalho a minha filha, Antonella. \nVocê que me ensinou o que é o amor genuíno, que me fez renascer e que é meu \nincentivo diário para ser uma pessoa melhor, mais forte e mais humana. \n\n \nAGRADECIMENTOS \nÀ Deus, pela dádiva da vida, pela saúd e e suporte a todo momento para concretização \ndos meus sonhos. \nAos meus pais por não medirem esforços para me apoiarem. Por todo amor, dedicação e \nincentivo oferecidos para me capacitar e chegar até aqui. Sem vocês não seria possível.  \nAo meu esposo, Guilherme, por todo apoio, afeto, admiração e compreensão.  \nÁ minha querida irmã, Izabela, por todo amor e apoio. Por todos os abraços silenciosos \ne orações. \nÀ minha sogra, Martha, por me oferecer grande apoio para me tornar uma profissional \nrealizada. À minha cunhada, Ana Paula, pela torcida carinhosa. \nAos meus fa miliares, Madrinha Jane, Tia Elaine, Tia Mercedes, Gabi, por \ncarinhosamente se preocuparem com meu futuro e torcerem genuinamente por mim.  \nÀ minha prima, Natália, pela amorosa torcida e dedicação. \nÁ minha querida amiga, Maynara, por toda escuta amorosa, todo apoio e torcida durante \nessa jornada. Você me inspira. \nAo meu orientador Prof. Omero, pela oportunidade de aprender, pela compreensão, por \nconfiar em meu trabalho e oportunizar meu crescimento profissional e científico.  \nAo Prof. Alfredo  (in memorian), por todo apoio na execução do trabalho e importante \ncolaboração. Por toda contribuição à Ciência brasileira, por todos anos de dedicação à \ndocência e por todo conhecimento compartilhado.  \nÀ técnica do laboratório multiusuário, Cris Padovan, por todo acolh imento, escuta \namiga, dedicação, prontidão em ajudar sempre, e pela alegria de viver, que nos abastece \ne anima diariamente com sua energia e vitalidade. \n\n \nÁ técnica do laboratório de Oncopatologia, Laura, por toda ajuda na execução da \ntécnica do trabalho, pela amizade e dedicação. \nÀ técnica do laboratório de Sistema de Microspcopia Multifóton, Roberta, por todo \ndirecionamento e conhecimento compartilhado. \nÀs minhas queridas amigas, Letícia, Renata, Luana, Juliana pela amizade e \ncompanheirismo e por proporcionarem boas risadas e leveza no dia a dia. \nAo programa de pós-graduação em Ginecologia e Obstetrícia pela contribuição à minha \nformação.  \nÀ Suelen, secretária da pós -graduação em Ginecologia e Obstetrícia pelo cuidado e \ndedicação aos alunos, e em especial por toda ajuda na minha chegada.  \nÀ Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo \nsuporte financeiro imprescindível.  \nA todos que fizeram e fazem parte da minha caminhada e contribuem para minha \nevolução enquanto ser humano e profissional, minha gratidão.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Eu quero desaprender para aprender de novo.  \nraspar as tintas com que me pintaram. \ndesencaixotar emoções \nrecuperar sentidos.” \nRubem Alves \n \n \n \n\n \nLISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS \n \nATP: Adenosinatrifosfato \nAUB: do inglês, abnormal uterine bleeding , ou sangramento uterino anormal  \nBcl-2: do inglês, B-cell lymphoma 2. Proteína envolvida no processo de controle da \napoptose \nCOX-2: Ciclo-oxigenase-2 \nCXCL10: do inglês, C-X-C motif chemokine ligand 10, ouligante 10 de quimiocina com \nmotivo C-X-C \nDGCR8: do inglês, DiGeorge syndrome critical region gene 8 . Subunidade DGCR8 do \ncomplexo microprocessador  \nDUM: Data da última menstruação \n EMID: do inglês, endometrial-myometrial interface, ou interface endometrial-\nmiometrial  \nER: do inglês, estrogen receptor¸ou receptor de estrogênio \nES: Células tronco embrionárias \nExp-5: Exportina-5 \nfCLIP-sec: do inglês, formaldehyde cross-linking immunoprecipitation and sequencing , \nou imunoprecipitação e sequenciamento de reticulação de formaldeído \nFMRP: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nGnRH-a: Agonista do hormônio liberador de gonadotrofina  \nHC: Hospital das Clínicas \nIC: Intervalo de confiança \nJZSMCs: Céulas musculares lisas da zona juncional  \nJZ: do inglês, junctional zone, ou zona juncional \nkDa:  kilodalton \nmiRNAs: microRNAs \nMUSA: do inglês, Morphological Uterus Sonographic Assessment, ou “Avaliação \nSonográfica Morfológica do Útero” \n\n \nmRNA: RNA mensageiro \nMyl9: do inglês, Myosin Light Chain 9, ou cadeia leve 9 da miosina \nNgn2: Neurogenina 2 \nNGS: do inglês, new generation sequencing, ou sequenciamento de nova geração \npre-miRs: Precursor de micro-RNAs \nPGE2: Prostaglandina E2 \npH: Potencial hidrogeniônico \npri-miRs :  microRNAs primários \nPolII: Enzima Polimerase II \nPTEN: do inglês, phosphatase and tensin homologue , ou gene homólogo de fosfatase e \ne tensina \nRho: Coeficiente de correlação de postos de Spearman. \nRISC: do inglês, RNA silencing induction complex, ou c omplexo de indução do \nsilenciamento do RNA \nRNA: Ácido ribonucleico \nRNAi:  RNA de interferência \nSERPAT: Serviço de patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto \nStAR: do inglês, steroidogenic acute regulatory protein  ou proteína reguladora aguda \nesteroidogênica \nSNORD: do inglês, small nucleolar RNAs, C/ D box, ou pequenos RNAs nucleolares, \nC/D. \nTbr1: Proteína T-box cerebral 1 \nTIAR: do inglês, mechanism of tissue injury and repair, ou mecanismo de lesão e \nreparo tecidual  \nUSP: Universidade de São Paulo \n \n  \n\n \nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1- Modelo de lesão e reparo de tecido (TIAR) ...................................................17 \nFigura 2- Biogênese dos miRNAs..................................................................................18 \nFigura 3- Regulação da expressão dos miRNAs.............................................................19 \nFigura 4- Delineamento Experimental............................................................................20 \nFigura 5- Controles positivos..........................................................................................21 \nFigura 6- Análise quantitativa ........................................................................................22 \nFigura 7- Localização celular dos marcadores..............................................................23 \nFigura 8- Percentual de células positivas no endométrio eutópico...............................24 \nFigura 9- Percentual de células positivas no endométrio eutópico e ectópico................25 \nFigura 10- Análise da correlação do percentual de células positivas..............................26 \nFigura 11- Marcação imunohistoquímica da proteína Drosha........................................27 \nFigura 12- Marcação munohistoquímica da proteína Exportina-5..................................28 \nFigura 13- Marcação imunohistoquímica da proteína Dicer.......................................... 29 \n \n  \n\n \n                                             LISTA DE TABELAS \n \nTabela 1- Anticorpos utilizados na imunohistoquímica ................................................60 \nTabela 2- Caracterização clínica das pacientes incluídas no \nestudo...............................................................................................................................61 \nTabela 3- Informações clínicas das pacientes controles incluídas no \nestudo...............................................................................................................................62 \nTabela 4- Percentual de células epiteliais positivas para cada anticorpo em cada \ncondição...........................................................................................................................64\nTabela 5- Percentual de células positivas  para o marcador \nDrosha..............................................................................................................................65 \nTabela 6- Percentual de células positivas  para o marcador Exportina -\n5.......................................................................................................................................66 \nTabela 7- Percentual de c élulas positivas  para o marcador \nDicer...............................................................................................................................67 \n  \n\n \nRESUMO \n \nIZADORA, O.  Expressão das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs em \nlesões de adenomiose. 2021. (75) p. Dissertação de mestrado – Faculdade de Medicina \nde Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2021. \n \nA adenomiose é uma condição ginecológica caracterizada pela presença de \ntecido endometrial glandular e estromal dentro do miométrio uterino. Evidências \nrecentes  têm  indicado que uma desregulação da expressão dos miRNAs podem ter \npapel chave na fisiopatologia da endometriose e adenomiose, uma vez que \ndesempenham  papéis importantes nos processos de apoptose, invasão, proliferação \ncelular, remodelamento da matriz, hipóxia, inflamação e angiogênese. A desregulação \nglobal do miRNA é frequentemente o resultado de defeitos na via de biogênese do \nmiRNA, como mutação genômica ou expressão / localização aberrante de enzimas e \ncofatores responsáveis pela maturação do miRNA. Variações na expressão das proteínas \nenvolvidas no processo de biogênese dos miRNAs em lesões adenomióticas podem ser \na base da explicaçãoda variabilidade no conjunto de miRNAs associados à adenomiose \ndisponíveis na literatura. Neste estudo, objetivamos avaliar a expressão das proteínas \nDicer, Drosha, Exportina-5 no endométrio eutópico e ectópico de pacientes com \nadenomiose. Dados clínicos, espécimes de endométrio ectópico e eutópico de 22 \npacientes com  adenomiose e 10 espécimes de endométrio eutópico de mulheres sem \ndoenças do endométrio foram avaliados por imuno-histoquímica (IHC). As lâminas \nforam  selecionadas de acordo com a maior representatividade de tecido epitelial típico \nde endométrio (eutópico ou ectópico) por um consenso de dois observadores. Foi \nrealizado o processo de leitura automatizada das lâminas utilizando imagens das \nescaneadas por um sistema Olympus BX61VS Slide Scanner  através do software \nVS120 Virtual Slide Microscope. Para a análise digital quantitativa das imagens, \nutilizou-se a ferramenta QuPath. Observamos uma expressão imunohistoquímica de \nDrosha  progressivamente menor no endométrio eutópico e ectópico de mulheres com \nadenomiose quando comparados ao endométrio eutópico de mulheres sem a doença (p = \n0.016) (IC 95% da diferença: 3.4% a 27.4%). A correlação observada no percentual de \ncélulas imunomarcadas para a Drosha nos tecidos eutópicos e ectópicos pareados sugere \numa expressão coordenada entre os sítios.  Não observamos diferença na expressão de \nExportina-5 e Dicer  entre o endométrio eutópico de mulheres com adenomiose e o \nendométrio eutópico das mulheres sem a doença. O comprometimento da expressão \ndessa proteína, e talvez da Dicer/Exportina-5, pode justificar a importância da via de \nbiogênese dos miRNAs na fisiopatologia da doença e, consequentemente, na \ninterpretação dos sintomas e na proposição de terapias efetivas. \n \n \nPalavras chaves: Adenomiose, miRNA, Drosha, Dicer, Exportina-5, sangramento. \n \n  \n\n \nABSTRACT \nIZADORA, O.  Expression of regulatory protein s of miRNA biogenesis in \nadenomyosis lesions.  2021. (7 5) p. Master’s dissertation.  Ribeirão Preto Medical \nSchool - University of São Paulo, Ribeirão Preto. 2021. \nAdenomyosis is a gynecological condition characterized by the presence of glandular \nand strom al endometrial tissue within the uterine myometrium.  Recent evidence has \nindicated that a dysregulation of miRNAs expression may play a key role in the \npathophysiology of endometriosis and adenomyosis, as they play important roles in the \nprocesses of apopt osis, invasion, cell proliferation, matrix remodeling, hypoxia, \ninflammation and angiogenesis.  Global miRNA dysregulation is often the result of \ndefects in the miRNA biogenesis pathway, such as genomic mutation or aberrant \nexpression/localization of enzyme s and cofactors responsible for miRNA maturation.  \nVariations in the expression of proteins involved in the biogenesis process of miRNAs \nin adenomyotic lesions may be the basis for explaining the variability in the set of \nmiRNAs associated with adenomyosis available in the literature. In this study, we aimed \nto evaluate the expression of proteins Dicer, Drosha, Exportin -5 in the eutopic and \nectopic endometrium of patients with adenomyosis. Clinical data, ectopic and eutopic \nendometrium specimens from 22 pati ents with adenomyosis and 10 eutopic \nendometrium specimens from women without endometrial disease were evaluated by \nimmunohistochemistry (IHC).  The slides were selected according to the greater \nrepresentation of typical endometrial epithelial tissue (eutop ic or ectopic) by a \nconsensus of two observers.  The automated slide reading process was performed using \nimages scanned by an Olympus BX61VS Slide Scanner system through the VS120 \nVirtual Slide Microscope software.  For the quantitative digital analysis of t he images, \nthe QuPath tool was used. We observed a progressively lower immunohistochemical \nexpression of Drosha in the eutopic and ectopic endometrium of women with \nadenomyosis when compared to the eutopic endometrium of women without the disease \n(p = 0.016) (95% CI of the difference: 3.4% to 27.4%). The observed correlation in the \npercentage of cells immunostained for Drosha in the paired eutopic and ectopic tissues \nsuggests a coordinated expression between the sites. We did not observe differences in \nthe expression of Exportina -5 and Dicer between the eutopic endometrium of women \nwith adenomyosis and the eutopic endometrium of women without the disease. The \nimpairment of the expression of this protein, and perhaps of Dicer/Exportin -5, may \njustify the importance of the miRNA biogenesis pathway in the pathophysiology of the \ndisease and, consequently, in the interpretation of symptoms and in the proposal of \neffective therapies. \nKeywords: Adenomyosis, miRNA, Drosha, Dicer, Exportin-5, bleeding. \n \n\n \nSUMÁRIO \n1. FIGURAS ................................................................................................................ 17 \n2. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 31 \n2.1. Adenomiose ................................................................................................................. 31 \n2.2. Patogênese da Adenomiose ......................................................................................... 32 \n2.3. Expressão e regulação dos miRNAs na adenomiose ................................................... 37 \n2.4. Desregulação das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs .......................... 38 \n3. OBJETIVOS............................................................................................................ 42 \n3.1. Objetivo Geral ............................................................................................................. 42 \n4.  CASUÍSTICA, PACIENTES E MÉTODOS ......................................................... 44 \n4.1. Delineamento do estudo .............................................................................................. 44 \n4.2. Pacientes ...................................................................................................................... 44 \n4.3. Dados clínicos ............................................................................................................. 45 \n4.4. Imunohistoquímica ...................................................................................................... 46 \n4.5. Análise das imagens histológicas ................................................................................ 47 \n4.6. Análise digital quantitativa das imagens ..................................................................... 48 \n4.7. Análise estatística ........................................................................................................ 49 \n5. RESULTADOS ....................................................................................................... 51 \n5.1. Avaliação clínica dos pacientes ................................................................................... 51 \n5.2. Caracterização qualitativa da expressão das pro teínas reguladoras da biogênese dos \nmiRNAs................................................................................................................................... 51 \n5.3. Avaliação quantitativa da expressão das proteínas reguladoras da biogênese dos \nmiRNAs................................................................................................................................... 51 \n6. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 59 \n7. TABELAS ............................................................................................................... 61 \n8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 70 \n \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n  \nFiguras \n \n \n \n \n\n \nFIGURAS \n \n \n \n \n \n \nFigura 1.  Modelo de lesão e reparo de tecido (TIAR) que representa os mecanismos da gênese das lesões \nadenomióticas. Fonte: Adaptada de (MALL, 2009). \n \n \n \n  \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 2. Biogênese dos miRNAs, com início no núcleo, onde o pri -miRNA origina-se a \npartir do DNA, posteriormente é processado a partir das proteínas Drosha e  seu cofator , \nformando um  pré -miRNA,  que será transportado para citoplasma  atrav és da Exportina. No \ncitoplasma o pré -miRNA irá interagir com a Dicer, tornando -se então miRNA maduro. Fonte: \nAdaptada de (OLENA; PATTON, 2010). \n  \n\n\n \nFigura 3.  Regulação da expressão dos miRNAs. Fonte: Adaptado de Iorio;Crocio (201 3) \n(MANUSCRIPT, 2013). \n  \n\n\n \n \n \n \n \nFigura 4.  Delineamento Experimental. Amostras biológicas foram retrospectivamente \ncoletados. Realizada análise imunohistoquímica das pacientes com adenomiose e controle. \nFonte: Elaborado pela autora. \n \n  \n\n\n \n \nFigura 5 – Controles positivos para cada marcador. A. Para o controle positivo de Drosha foi \nutilizado amostra de tecido de adenocarcinoma de pulmão B. Para controle positivo do \nmarcador Exportina -5 foi utilizado amostra de cólon normal. C. Amostra de placenta para \ncontrole positivo do marcador Dicer. Fonte: Elaborado pela autora. \n\n\n \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 6.  Análise quantitativa digital das amostras no software QuPath. A. Ferramentas de \ndesenho polygon e brush. B e C- Delimitação de uma região usa ndo linhas finas poligonais e \nseleção da região de interesse através do pincel de espessura variável.  D e E.  Detecção dos \nlimites das células de acordo com sua variação morfológica. Fonte: Elaborado pela autora. \n \n \n  \n\n\n \n \n \n \n \nFigura 7 - Localização dos marcad ores nas amostras de endométrio. A. Drosha possuí \nlocalização nuclear e celular. B. Exportina-5 localização citoplasmática. C. Dicer apresenta \nlocalização citoplasmática. Fonte: Elaborado pela autora. \n \n \n  \n\n\n \n \n \n \n \nFigura 8.  Percentual de células positivas no endométrio eutópico de mulheres controles e com \nadenomiose para os marcadores Drosha, Exportina-5 e Dicer. Fonte: Elaborado pela autora. \n\n\n \n  \n \n \nFigura 9 - Percentual de células positivas no endométrio eutópico e endométrio ectópico de \nmulheres com adenomiose para os marcadores Drosha, Exportina -5 e Dicer. Fonte: Elaborado \npela autora. \n \n \n \n \n \n \n\n\n \n \n \n \n \n \nFigura 10.  Análise da correlação do percentual de células positivas no endométrio eutópico e \nendométrio ectópico de mulheres com adenomiose para o marcador Drosha.  Fonte: Elaborado \npela autora. \n \n  \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 11 . Marcação imunohistoquímica da proteína Drosha no endométrio eutópico (A) e \nectópico de mulheres com adenomiose (B) e no endométrio eutópico de pacientes controles (C). \nFonte: Elaborado pela autora. \n \n  \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 12. Marcação imunohistoquímica da proteína Exportina-5 no endométrio eutópico (A) e \nectópico de mulheres com adenomiose (B) e no endométrio eutópico de pacientes controles (C). \nFonte: Elaborado pela autora. \n \n \n  \n\n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 13. Marcação imunohistoquímica da proteína Dicer no endométrio eutópico (A) e \nectópico de mulheres com adenomiose (B) e no endométrio eutópico de pacientes controles (C). \nFonte: Elaborado pela autora.\n\n\n30 \n \n \n \n  \nIntrodução  \n \n \n \n \n\n\n31 \n \n1. INTRODUÇÃO \n \n \n1.1. Adenomiose  \nA adenomiose é uma condição gineco lógica caracterizada pela presença de \ntecido endometrial glandular e estromal dentro do miométrio uterino. Ela foi \ninicialmente descrita em meados do século XVIX (BENAGIANO et al., 2012) e estima-\nse que afeta cerca de 20% das mulheres em idade reprodutiva (DEVLIEGER; \nD’HOOGHE; TIMMERMAN, 2003). Estudos apontam que mulheres com menos de 40 \nanos representam 20% dos casos, enquanto mulh eres com idade entre 40 e 50 anos, \n80% dos casos de adenomiose (ARTICLE, 2016) . Do ponto de vista clínico, está \nassociada à dor pélvica, sangramento uterino anormal (AUB) e infertilidade \n(VANNUCCINI et al. , 2017) , no entanto estima -se que um terço das mulheres seja \nassintomático (PERIC; FRASER, 2006) . Todavia, esses sintomas também estão \nassociados a outras condições muitas vezes superpostas, como endometriose e \nleiomiomas, o que dificulta o diagnóstico (LAZZERI et al., 2014).   Um segundo ponto \né a falta de uniformidade nos critérios histológicos para o diagnóstico da doença \n(VERCELLINI et al., 2006).  \nClassicamente ela tem sido descrita como uma condição que acomete mulheres \nmultíparas, entre a 4ª e 5ª década de vida  (PARAZZINI et al. , 1997)  e aquelas \nsubmetidas a cirurgias uterinas como curetagem, cesárea, e miomect omia, pois estas \nintervenções podem interromper a interface endometrial -miometrial (EMI) e facilitar a \ninvasão, implantação, incorporação e estabelecimento de colônias endometriais dentro \nda parede miometrial, aumentando o risco de adenomiose (GUO, 2020) .  Em \ncontrapartida o tabagismo tem sido apontado como um fator protetor (VERCELLINI et \nal., 2006) . Mas assim como a prevalência, os fatores de risco associados não estão \ndefinidos com precisão. \nVia de regra, o padrão ouro para o diagnóstico é a análise histológica de material \nobtido por biopsia ou histerectomia. Já o diagnóstico pré -operatório é um d esafio \n(LEVGUR, 2007) . Recentemente, a padronização da reportagem dos achados \nultrassonográficos, particularmente com o consenso do Morphological Uterus  \nSonographic Assessment (MUSA) (GUPTA et al., 2016) parece estar contribuindo para \nisso, inclusive, com uma proposta de classificação morfológica e de extensão da doe nça \n\n32 \n \n(CLINIC; HOSPITAL, [ s. d. ]). Assim como o ultrassom, a ressonância magnética \ntambém tem emergido como ferramenta não invasiva promissora no d iagnóstico \npresumido da doença (TELLUM et al., 2019). Ambos os métodos parecem ter uma boa \nacurácia (CHAMPANERIA et al., 2010), embora ela precise ser confirmada em estudos \nfuturos. \nO tratamento padrão da adenomiose é a histerectomia, mas não há terapia \nmédica para tratar os sintomas e, ao mesmo tempo , permitir que as pacientes \nengravidem (PONTIS et al. , 2017) . As  terapias médicas são tratamentos hormonais, \numa vez que a adenomiose é uma condição dependente de estrogênio e responde ao \ntratamento médico com drogas antiestrogênicas e agonista do hormônio libe rador de \ngonadotrofina (GnRh-a) (ANGIONI et al., 2014) que podem induzir temporariamente a \nregressão da adenomiose e melhorar os sintomas (PONTIS et al., 2017). \n1.2.Patogênese da Adenomiose \nÉ sugerido que a(s) causa(s) da endometriose e adenomiose  parecem estar \nintimamente relacionadas a alguns dos proce ssos fisiológicos de reprodução \n(LEYENDECKER; WILDT, 2011) . Trauma seguido de resposta inflamatória tecidua l \nespecífica e reparo envolvendo mecanismos específicos, ainda que fisiológicos, \ncelulares, bioquímicos e moleculares podem ser considerados os principais eventos no \ndesenvolvimento da doença (LEYENDECKER; WILDT, 2011) .  Os mecanismos \nenvolvidos na etiologia da adenomiose ainda n ão estão completamente elucidados e há \nduas teorias mais amplamente aceitas, a teoria da invaginação e a da metaplasia \n(GARCÍA-SOLARES et al., [s. d.]). A primeira e mais popular hipótese  aponta que os \nfocos adenomi óticos surgem durante os períodos de regeneração, cicatrização e \nreepitelização do endométrio  (BENAGIANO et al. , 2012) , após eventos uterinos \ntraumáticos que ocasionam uma invaginação da parte profunda do endométrio entre os \nfeixes de fibras musculares lisas do miométrio, através da zona juncional (JZ) \ninterrompida por crônicas contrações peristálticas miometrais  (GARGETT; SCHWAB; \nDEANE, 2016; LEYENDECK ER et al. , 2015; VANNUCCINI; PETRAGLIA, 2019)  \npossivelmente devido à perda de coesão do tecido causada  por enzimas específicas, \ncomo Bcl-2 (DEVLIEGER; D’HOOGHE; TIMMERMAN, 2003; UEKI et al., 2004). A \nJZ representa o terço interno do miométrio (BROSENS et al., 2010). Este mecanismo é \ndenominado de mecanismo de lesão e reparo tecidual (TIAR), que tem sido renovada \npela teoria da ruptura da interface endometrial-miometrial (EMID) (GUO, 2020).  \n\n33 \n \nDo ponto de vista da expressão prot éica, o endométrio ectópico a presenta uma \nmaior expres são de receptores de estrogênio (ER) , acompanhado por uma expressão \nconsistente de Bcl-2 ao longo do ciclo menstrual, em comparação ao endométrio \neutópico (UEKI et al. , 2004) . Isso evidencia que uma constante expressão de B cl-2, \njuntamente com ER ao longo do ciclo pode promover a proliferação de glândulas \nadenomióticas e estromais (UEKI et al. , 2004) . A produção suprafisiológica de \nestrogênio (hiperestrogenismo) devido à atividade parácrina local no endométrio \neutópico e e ctópico de pacientes com adenomiose pode ser um estado preliminar, \ncontribuindo para a origem da doença (GARCÍA-SOLARES et al. , [ s. d. ]).  O \nhiperestrogenismo pode possibilitar elevada atividade uterina mediada pela  ocitocina, \nresultando em aumento de tensões mecânicas que podem lesar as  células na zona \njuncional (ZJ), ativando o mecanismo TIAR em resposta à autotraumatização do tecido \n(LEYENDECKER et al. , 2015; LEYENDECKER; WILDT, 2011; MALL, 2009; \nSHAKED; JAFFA; GRISARU, 2014) . As contrações miometriais peristálticas  crônicas \ninduzem microtrauma  à JZ, causando um ciclo vicioso no qual a produção local de \nestrogênio, mediada por COX -2(CHEN et al. , 2010)  e induzida por interleucina -1 \n(GARCÍA-SOLARES et al., [s. d.]), resulta na produção da prostaglandina E2  (PGE2), \nque por sua vez ativa a prot eina StAR (proteína reguladora aguda esteroidogênica) e a \naromatase P450 (MALL, 2009) .  Essa ativação aumenta os níveis de estradiol, \ncontribuindo para o estad o hiperestrogênico n o endométrio eutópico (GARCÍA-\nSOLARES et al., [s. d.]) (Figura 1).  Por sua vez, a tividade hiperperistáltica sustentada \ne lesão crônica, proliferação e inflamação atrasam o processo de cicatrizaç ão e resultam \nem aumento do número de focos de “infiltração” tecidual (VANNUCCINI et al., 2017). \nAs propriedades migratórias e invasivas  das células epiteliais endometriais  \nintensificadas pelo estrogênio fundamentam a capacidade do endométrio para infiltrar a \nzona juncional miometrial e o crescimento do tecido ectópico (PHYSIOLOGY, 2015). \nA segunda teoria, a teoria da metaplasia, aponta que as les ões adenomi óticas \npodem se originar de restos de c élulas müllerianas (FERENCZY, 1998). É sabido que o \nendométrio é rico em v árias popula ções de c élulas-tronco (HUFNAGEL; TAYLOR, \n2015). Embora essas c élulas tenham um papel importante na fisiologia, regenera ção e \nreparo endometrial, potencialmente também desempenham um papel relevante na \ngeração de endometriose (HUFNAGEL; TAYLOR, 2015) . Como as c élulas-tronco \nadultas têm um papel fundamental na manuten ção da homeostase do tecido, é provável \n\n34 \n \nque sua fun ção seja aberrante na doen ça ginecológica benigna associada à proliferação \nendometrial alterada (GARGETT; SCHWAB; DEANE, 2016), incluindo a adenomiose. \nAs c élulas progenitoras que transpassam a ZJ e atingem o miométrio podem levar à \nadenomiose uterina focal. Alternativamente, a adenomiose pode se diferenciar de \ncélulas-tronco multipotentes originadas da medula óssea e outras fontes  \n(VANNUCCINI et al., 2017) , embora essa alternativa seja mais remota e a literatura \ntenha explorado pouco essa possibilidade. \nDesde o final do século XX, mais especificamente a partir do século XXI, houve \num grande desenvolvimento das capacidades de processamento computacional e da \ncompreensão da genômica humana. Isso tem permitido melhorarmos nossa \ncompreensão sobre a biologia das doenças de um modo nunca visto antes \n(GUTTMACHER; COLLINS; PH, 2003). E isso não tem sido diferente para as doenças \nginecológicas. Vários estudos têm investigado as alterações genéticas e epigenéticas \nenvolvidas na orquestração da fisiopatologia da adenomiose (ARTICLE, 2019; D et al., \n2010; GROOTHUIS, 2007; HUANG et al., 2010; JUO et al., 2006; KADO et al., 2002; \nKANG et al., 2010; KITAWAKI et al., 2001, 2004; KIYOMIZU; KITAWAKI; \nOBAYASHI, 2006; MOROSOVA et al., 2012; ROZATI; VANAJA; NASARUDDIN, \n2010; SHAN et al., 2006; TSAI et al., 2018). A desregulação de genes e vias no \nendométrio eutópico envolvidos na síntese de hormônios esteróides sexuais, e em \neventos celulares como proliferação e fibrose, inflamação e neuroangiogênese, podem \npredispor à migração ectópica e implantação (VANNUCCINI et al., 2017).  Muitos \ngenes são expressos diferencialmente em adenomiose, incluindo CXCL10, Calbindin D-\n28K, fatores relacionados à prostaglandina, COX-2 e genes relacionados ao câncer e \nmorte celular (HEVER et al., 2006). Evidências recentes também têm indicado que uma \ndesregulação da expressão dos microRNAs podem ter papel chave na fisiopatologia da \nendometriose e adenomiose (OHLSSON TEAGUE; PRINT; HULL, 2009), uma vez \nque desempenham papéis importantes nos processos de apoptose, invasão, proliferação \ncelular, remodelamento da matriz, hipóxia, inflamação e angiogênese (OHLSSON \nTEAGUE; PRINT; HULL, 2009). Apesar de terem suas particularidades, tanto a \nendometriose quanto a adenomiose resultam da invasão e proliferação ectópica das \ncélulas endometriais, apresentando assim, uma patogênese semelhante em muitos \nsentidos (HAWKINS et al., 2015). \n\n35 \n \nOs microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificantes \nque contém cerca de 22 nucleotídeos (18 a 25). São bem conservados do ponto de vista \nevolutivo, e tem como principal função a regulação gênica pós transcricional. Estima-se \nque eles têm como alvo cerca de 60% dos genes de humanos. Os miRNAs modulam o \nprocesso pós-transcricional por interagirem diretamente com o RNA mensageiro \n(mRNA) através do pareamento de bases complementares. Este pareamento é perfeito \nem plantas, mas não em animais. Os miRNAs são capazes de reconhecer um mRNA \nalvo (geralmente uma sequência da região não traduzida na extremidade 3’ do mRNA - \n3'UTR) usando apenas 2-7 nucleotídeos (seed region) da extremidade 5’ do miRNA. \nCuriosamente, os mRNAs alvos de miRNAs em espécies de mamíferos são altamente \nconservados (FRIEDMAN et al., 2009). A atuação do miRNA maduro sobre o mRNA \nse dá com auxílio de um complexo enzimático chamado complexo de indução do \nsilenciamento do RNA (RISC), impossibilitando que o ribossomo acesse a informação \nno mRNA, diminuindo ou bloqueando a síntese da proteína. Em suma, essa interação \nculmina no silenciamento do mRNA através de repressão translacional ou degradação \ndo mRNA. Embora a promoção da sub-regulação transcricional dos genes seja o mais \nfrequente, já foi observado que alguns miRNA podem promover ativação da transcrição \ne intensificação da tradução, inclusive em humanos (ZHANG; FAN; ZHANG, 2014). \nA biogênese dos miRNAs inclui sua transcrição no núcleo celular, exportação \npara o citoplasma e subsequente processamento e maturação (Figura 2) (ZHAO; TANG; \nWU, 2014). Os miRNA primários (pri-miRNAs), transcrito pela RNA polimerase II \n(SUN; TSAO, 2008; ZHAO; TANG; WU, 2014) são inicialmente processados no \nnúcleo da célula por um complexo nuclear formado pela ribonuclease III Drosha e seu \ncofator DGCR8 (LEE et al., 2003; ZAMORE et al., 2014). A Drosha é uma proteína \nnuclear (160 kD) da família de ribonucleases III, forma um grande complexo de \nmicroprocessadores ~ 650 kDa juntamente com a proteína dsRBD DGCR8 em humanos \n(GREGORY; YAN; AMUTHAN, 2004) e um complexo de ~500 kDa juntamente com \na proteína dsRBD Pasha em moscas (Drosophila melanogaster) (DENLI; TOPS; \nPLASTERK, 2004; HAN et al., 2004; LUND, 2014). A molécula representativa do pri-\nmiRNA exibe uma estrutura secundária complexa em formato de grampo (harpin), com \numa haste em dupla fita, uma alça com bases não complementares e sequências \nflanqueadoras (BARTEL; LEE; FEINBAUM, 2004). Esta estrutura é exportada para o \ncitoplasma por meio da exportina-5 (Exp-5) (SINGH et al., 2008). A Exp-5 é uma \nproteína membro da família da carioferina de fatores de transporte núcleo-\n\n36 \n \ncitoplasmáticos e desempenha um papel na passagem de miRNAs do núcleo para o \ncitoplasma (IVAN; SCHMITTGEN, 2008) . No caso de depleção de Exp-5 por RNA de \ninterferência (RNAi), o nível de miRNAs maduros diminui, mas o pré-miRNA não se \nacumula no núcleo. A falta de acumulação pode ser devido à instabilidade do pré-\nmiRNA. Isto sugere a possibilidade de que a interação de pré-miRNA com Exp-5 é \nnecessário para a estabilidade do pré-miRNA (BRENNECKE; COHEN, 2003). \nNo citoplasma, os pri -miRNAs são liberados por hidrólise do fator de \nexportação e clivados pela Dicer (CHENDRIMADA et al., 2005) uma ribonuclease III \n(~220 kDa) dependente de ATP com múltiplos domínios sendo responsável por clivar \nRNAs de ~70 nucleotídeos (pré -miRs) em miRs maduros, removendo a alça na \nestrutura stem -loop  (IVAN; SCHMITTGEN, 2008; SUN; TSAO, 2008; ZHANG; \nDAHLBERG; TAM, 2007)  resultando na formação de um dúplex de RNA (IVAN; \nSCHMITTGEN, 2008; SINGH et al. , 2008) . Este dúplex de RNA é incorporado ao \ncomplexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), no qual as duas fitas de RNA \nsão separadas (SINGH et al., 2008; ZHANG; DAHLBERG; TAM, 2007) . O complexo \nde silenciamento induzido por RNA (RISC) possui um membro da família Argonauta \n(proteína catalítica) e uma fita guia de RNA.  Uma das fitas permanece associada ao \nRISC e constitui o miRNA maduro (DALMAY, 2008; IVAN; SCHMITTGEN, 2008) , \nao passo que a fita complementar sofre degradação (Figura 2). \n \n \n \n  \n\n37 \n \n1.3.Expressão e regulação dos miRNAs na adenomiose \nAlguns estudos têm  avaliado o perfil de ex pressão de miRNA na adenomiose.  \nRecentemente, pesquisas demonstraram que miRNAs têm função importante como \nmediadores significativos em fisiologia celular e fisiopatologia (YANG et al., 2016) e \nparecem ser potentes reguladores da expressão gênica na endometriose/adenomiose e \nestão associados a distúrbios reprodutivos, aumentando a perspectiva de usar os \nmiRNAs como biomarcadores e,  eventualmente, alvos terapêuticos  (OHLSSON \nTEAGUE; PRINT; HULL, 2009) . Herdon et al. (2016), verificaram através de análises \ntranscriptômicas globais que o endométrio eutópico de mulher es com adenomiose exibe \numa desregulação das vias que predispõem o desenvolvimento, migração e sobrevida \ndos implantes endometriais ectópicos, sendo a via da apoptose  a mais \nsignificativamente desr egulada no endométrio de mulheres com adenomiose  \n(HERNDON et al., 2016). Comparando os transcriptomas do endométrio proliferativo \nde mulheres com e sem adenomiose observaram 140 alterações e 884 genes \ndesregulados nas amostras de adenomiose em comparação com o controle. Os genes \nmais altamente expressos foram os pequenos genes nucléicos de RNA C / D (SNORD), \nque foram aumentados de 2 a 15 vezes (HERNDON et al. , 2016) .  Através de \nsequenciamento de nova geração (NGS) foi possível identificar que o gene KRAS \napresenta grande recorrência de mutações em adenomiose (INOUE et al., 2019), além \nde apresentar alterações recorrentes em algumas patolo gias, c omo carcinoma uterino \n(CANCER; ATLAS, 2013) e endometriose (OGAWA et al., 2017). \nTambém já foi observado que diversos transcritos de miRNA apresentam \nexpressão alterada em adenomiose. Os miR -9,miR-1, miR -139, miR -149, miR -\n197,miR-326 e miR -339 (HERNDON et al. , 2016)  miR-181a, miR -191, miR -195e \nmiR-200b (BORISOV et al., [s. d.]) tiveram sua expressão aumentada em adenomiose, \nenquanto os miR -10b, miR -200c, miR -10a, miR -221 e miR -31estão regulados \nnegativamente em adenomiose (BORISOV et al., [s. d.]). Outro achado interess ante é \nque a expressão do miR -17 nos tecidos endometriais eutópicos de pacientes com \nadenomiose é significativamente aumentada enquanto a expressão da proteína PTEN é \nreduzida, indicando que o miR -17 pode regular a expressão de PTEN e, \nconsequentemente, af etar a expressão de proteínas envolvi das na apoptose e ciclo \ncelular , uma vez que o gene regula negativamente a via PI3K / Akt, estimulando a \napoptose e bloqueando a prolifera ção e crescimento celular,  sugerindo que  miR -17 \n\n38 \n \npode desempenhar um papel na promoção da viabilidade celular, invasão e metástase no \ndesenvolvimento de adenomiose (HU; LI; HE, 2017). \n Guo et al. (2015), identificaram 156 miRNAs com expressão diferencial, dentre \neles, 46 miR NAs estão significantemente des regulados em lesões adenomióticas \nectópicas em comparação com o endométrio normal. Os miR -10b, miR-371b-5p, miR-\n92b-5p, miR -30c e miR -100 aprese ntaram-se significativamente downregulated \nenquanto os miR-143, miR-532-3p, miR-513a, miR-466 e miR-451a upregulated (28).  \nNas células epiteliais endometriais isoladas do endométrio ectópico da \nadenomiose, a superexpressão do miR -10b diminuiu significativ amente a taxa de \nmigração e invasão celular, sugerindo que o miR -10b pode desempenhar um papel \ninibidor no desenvolvimento das lesões, por reprimir a invasão de células  epiteliais \nadenomióticas (PHYSIOLOGY, 2015). \nAnálises do perfil de expressão de miRNAs das células musculares lisas  das \nzonas juncionais (JZSMCs) em adenomiose indicam que os nív eis de expressão de \nmiRNAs associados à proliferação e apoptose, incluindo Let -7a, miR -16, miR -181 e \nmiR-20a foram alterados, e Let -7a apresentou uma diferença significativa em sua \nexpressão, apresentando-se downregulated em amostras de pacientes com adeno miose \n(HUANG et al. , 2021) . Recentemente, tem sido proposto que a identificação de \nmiRNAs reciprocamente desregulados (particularmente miR -10b, miR-200c, miR-191) \nna fase proliferativa do endométrio eutópico de mulheres com adenomiose podem \najudar no diagnóstico minimamente invasivo da condição (BORISOV et al., [s. d.]). \nEnfim, apesar dos dados serem inequívocos na demonstração do papel dos \nmiRNAs na fisiologia da adenomiose os estudos são muito hetero gêneos de modo a não \ntermos até o presente momento um padrão uniforme de quais miRNAs são realmente \nimportantes no processo da doença. Isso pode ser devido aos métodos de arranjos, \nheterogeneidade dos tecidos, métodos de sequenciamento ou interferência das  proteínas \nreguladoras da biogênese dos miRNAs.   \n \n1.4.Desregulação das proteínas reguladoras da biogênese dos miRNAs \nA desregulação global do miRNA é frequentemente o resultado de defeitos na \nvia de biogênese do miRNA, como mutação genômica ou expressão / localização \naberrante de enzimas e cofatores responsáveis pela maturação do miRNA (GURTNER \net al., 2016). A maquinaria da biogênese dos miRNAs é finamente regulada. Diferentes \n\n39 \n \nmecanismos reguladores podem controlar a expressão do miRNA em nível genético ou \nepigenético, além de envolver o mecanismo de biogênese ou o recrutamento de fatores \nespecíficos de transcrição (MANUSCRIPT, 2013) . (Figura 3). Essa regulação ocorre \nem diferentes níveis, desde a transcrição do pri-miR, seu processamento (Dicer e \nDrosha) transporte (Exportina-5) e modificação (via edição, metilação, uridilação e \nadenilação) e carregamento na proteína Argonauta (HA; KIM, 2014). Alterações nos \nníveis de expressão de Dicer e Drosha acompanham as desregulações de miRNAs em \nvárias neoplasias, incluindo cânceres de mama e de ovário (BERNSTEIN et al., 2003). \nA expressão alterada dos genes envolvidos na biogênese do miRNA tem sido implicada \ncomo uma possível causa das diferenças nos perfis de miRNA entre tecidos normais e \ncancerígenos, e potencialmente responsáveis por características comportamentais das \ncélulas como sobrevivência em ambiente ectópico, invasividade, e proliferação(76,77).  \n A desre gulação de diferentes cofatores, como o DGCR8, pode afetar a \nexpressão do miRNA com importantes implicações biológicas . Por exemplo,  \ncamundongos knock -out para DG CR8, apresentaram alterações na proliferação e \ndiferenciação de células ES  (WANG et al. , 2007) , fo i possível observar uma perda \nglobal de miRNAs em células knock -out para DCGR8, evidenciando que DGCR8 é \ndeterminante na maturação dos miRNA. Além disso, as adenosina desaminases que \natuam no RNA (ADARs) podem afetar a expressão de microRNAs que reconhecem  \nresíduos de adenosina, conforme relatado para o miR -142: a edição do pri -miR-142 \nresulta na supressão de seu processamento por Drosha, degradação por um componente \nde complexo RISC e níveis reduzidos do produto maduro  (YANG et al., 2006).  \nO acúmulo de pri -miRNAs e a depleção correspondente de miRNAs maduros \nocorre em cânceres humanos em comparação com tecidos normais, indicando \nfortemente que o comprometimento de etapas cruciais na biogênese de miRNA poderia \nser a causa subjacente da desrregulação dos miRNAs (GURTNER et al. , 2016) . A \ninibição da biogênese de microRNA, pela depleção de Dicer1 e Drosha, tende acelerar a \ntransformação celular e  aumentar a tumorigênese in vivo  (KUMAR et al. , 2007) . A \nperda condicional de Dicer1 , por exemplo , nos tecidos pulmonares de camundongos \naumenta o desenvolvimento de tumores pulmonares (KUMAR et al., 2009).  Alterações \nde expressão dos principais reguladores da biogênese de miRNAs estão presentes no \ntecido canceroso endometrial e podem ser potencialmente responsáveis pelos perfis \nalterados de miRNAs observados na doença  (TORRES et al. , 2011) .Também foi \n\n40 \n \nobservado que perda de Dicer e / ou Drosha também tem sido inversamente \ncorrelacionada com o desfecho no câncer de pulmão  (KARUBE et al., 2005), câncer do \nepitélio ovariano (SPANNUTH et al., 2009) e, mais recentemente, em outros tipos de \ntumores como carcinoma nasofaríngeo   (GUO et al., 2012) , neuroblastoma (OLENA; \nPATTON, 2010) e mama (RIMOKH et al., 2009). \nNossa hipótese é que  variações na expressão das proteínas envolvidas no \nprocesso de biogênese dos miRNAs em lesões adenomióticas, caso existam, possam  ser \na base da explicação da variabilidade no conjunto de miRNAs associados à adenomiose \ndisponíveis na literatura. Também poderia abrir novas frentes de investigação do papel \ndessas proteínas na fisiopatologia da doença. \n  \n\n41 \n \n \n  \nObjetivo \n\n42 \n \n2.  OBJETIVO \n \n2.1. Objetivo Geral \nAvaliar a expressão das proteínas Dicer, D rosha, E xportina-5 no endométrio \neutópico e ectópico de pacientes com adenomiose. \n \n \n\n43 \n \n  \nCasuística, pacientes e \nmétodos \n\n44 \n \n3.  CASUÍSTICA, PACIENTES E MÉTODOS \n3.1. Delineamento do estudo \nO estudo é retrospectivo com base em uma série prospectiva. O estudo foi \naprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da instituição (CAAE:  \n79643617.8.0000.5440 ), no qual foi solicitado dispensa do termo de consentimento \nlivre e esclarecido. Foram incluídos neste estudo dados clínicos resgatados de \nprontuários médicos, e spécimes de endométrio ectópico oriundos de mulheres com \nadenomiose dispostos em blocos de parafina e espécimes adicionais de endométrio \neutópico oriundos de mulheres submetidas à histerectomia sem doenças do endométrio, \ntambém dispostos em blocos de parafina, previamente coletados, entre 2005 a 2017. O \nmaterial foi identificado no Serviço de Patologia (SERPAT) do Hospital das Clínicas da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HC -FMRP-\nUSP), através de busca eletrônica e listagem de todos os diagnósticos histológicos de \nadenomiose e endométrio normal. Os blocos corre spondentes foram revistos, \nconsecutivamente, por ordem cronológica decrescente, com objetivo de checar quesitos \ntécnicos da qualidade do bloco, e representatividade do tecido -alvo (endométrio \neutópico e endométrio ectópico) (Figura 4). Este trabalho foi de senvolvido no \nlaboratório de Oncopatologia, do Departamento de Patologia, da Faculdade de Medicina \nda Universidade de São Paulo (FMRP/USP) em colaboração com o Serviço de \nPatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da \nUniversidade de São Paulo (SERPAT) do HC-FMRP-USP.  \n3.2.Pacientes \nEste estudo incluiu 22 espécimes de endométrio de pacientes com adenomiose e \n10 espécimes de endométrio eutópico de mulheres sem doenças do endométrio. Foram \nincluídas no estudo amostras oriundas de mulheres com adenomiose não nulíparas, com \ndor pélvica e sangramento uterino anormal não responsivo ao tratamento clínico com \ncontraceptivos hormonais, sem patologias associadas como leiomiomatose, \nendometriose, e/ou pólipo endometrial que foram submetidas à histerectomia total e que \nrelataram não estar fazendo uso de medicamentos hormonais nos últimos dois meses, \nnão usuárias de dispositivo intrauterino de qualquer tipo. Foram selecionadas apenas \namostras histológicas que foram compatíveis com a fase proliferativa do ciclo \nmenstrual. Os critérios de elegibilidade para as amostras controle foram: mulheres não \n\n45 \n \nnulíparas, submetidas à histerectomia total e salpingooforectomia para tratamento de \ntumores epiteliais benignos de ovário sem história de dor pélvica ou sangramento \nuterino anormal, ou uso de contraceptivos hormonais nos últimos dois meses. Também \nforam selecionadas apenas amostras histológicas que foram compatíveis com a fase \nproliferativa do ciclo menstrual. Fizemos uma primeira seleção das amostras inferindo a \nfase do ciclo menstrual pelo dia da última menstruação informada no prontuário \nmédico. Confirmamos a fase com a identificação morfológica das seguintes \ncaracterísticas: glândulas retas e estreitas, e epitélio glandular cubo-colunar. Cromatina \nnuclear dispersa e figuras mitóticas presentes. Células estromais também com atividade \nmitótica e bordas mal definidas. Na fase proliferativa tardia, glândulas com maior \ntamanho e tortuosas com pseudoestratificação do epitélio, mostrando núcleos em \ndiferentes níveis. Células estromais pequenas e com formato de fuso semelhante às \ncélulas pré-decíduais. \n \n3.3.Dados clínicos \nOs dados clínicos abaixo listados foram coletados nos prontuários registrados no \nHospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP/USP das \npacientes. Esses dados são registrados rotineiramente pela equipe clínica que \nacompanha a paciente e encontram-se disponíveis para uso em pesquisa, mediante \naprovação em comitê de ética. \n(i) Caracterização das pacientes:  \n Idade \n Paridade \n Patologias associadas \n Menarca \n Data da última menstruação (DUM) \n(ii) Características ultrassonográficas seguindo a classificação \nproposta por  Van den Bosch et al., 2018 (88),quando possível: \n Localização na parede uterina: anterior, posterior, lateral esquerda, \nlateral direita ou fúndica \n Diferenciação: focal, difusa ou adenomioma \n Lesões císticas ou não císticas \n\n46 \n \n Envolvimento da parede uterina: tipo 1 (zona juncional), tipo 2 \n(camada intermediária do miométrio) ou tipo 3 (camada externa do \nmiométrio)  \n Extensão da adenomiose: moderada ou severa \n Tamanho das lesões \n \n3.4. Imunohistoquímica \nAs amostras de endometrio eutópico e ectópico de mulheres com adenomiose \nforam analisados de forma pareada. Em virtude da heterogeneidade do componente \ntissular do estroma, optamos por fazer a análise apenas do tecido epitelial glandular. \nAs amostras de tecido incluídas em  parafina foram cortadas no micrótomo \n(LEICA RM2245) em secções de 4 µm de espessura e depositadas em lâminas de vidro \npreviamente tratadas (ENTELLAN®) para realização das re ações de \nimunohistoquímica. O material foi submetido a desparafinizaçãoem xilol por três vezes \nde cinco minutos e em sequência submetido à desidratação em gradiente de álcool \n(absoluto I, absoluto II, 95%, 90%, 80% e 70%) por um minuto cada. Foi feita a \nhidratação em água corrente e água destilada. Posteriormente, a recuperação antigênica \nfoi realizada através da fervura dos cortes, em tampão citrato 0,1M pH 6.0, por 40 \nminutos na panela à vapor (90°C), exceto para o anticorpo Anti -Dicer, que foi feito a \nrecuperação antigênica utilizando o tampão de recuperação DIVA Reveal  Decloaker \n10x. Após recuperação, as lâminas foram deixadas em temperatura ambiente por 20 \nminutos e em sequência foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com  hidrogen \nperoxidase b lock, (DHP -125, Spring Bioscience , USA) .  Posteriormente, as lâminas \nforam lavadas em TBST ( TRIS-Buffered Saline 0.05 with Tween 20) por cinco minutos. \nPara bloqueio das ligações inespecíficas foi utilizado o  kit ULTRAV ( BIOGEN, \nCambridge, Massachusetts, EUA )  por  10 minutos. Em seguida  foi realizada a \nincubação com o anticorpo primário anti-human diluído em BSA 0,1% (albumina de \nsoro bovino), para os seguinte s marcadores (tabela abaixo) overnight à -4ºC. Os \nanticorpos utilizados na imunohistoquímica, marca, clone e diluição estão apresentados \nna Tabela 1. \nApós a incubação com anticorpo primário, feita a lavagem com TBST  ( TRIS-\nbuffered saline)  e adição de REVEAL Complement (DCMT-15, Spring Bioscience, \nUSA) - anticorpo secundário - por 10 minutos.  Em seguida o material foi incubado por \n\n\n47 \n \n15 minutos em HRP Conjugate  (Horseradish peroxidase , DHRR -125, Spring \nBioscience, USA). A reação  foi revelada com crómogeno  DAB ( 3,3′-\nDiaminobenzidina, Spring Bioscience, USA). As lâminas foram  lavadas em água \ndestilada por cinco minutos e  contracoradas com Hematoxilina de Harris durante 40 \nsegundos. Os cortes foram então hidratados em gradientes crescentes de álcool e \ndiafinizados em xilol, e montados em meio permanente para obervação ao microscópio.  \nOs tecidos utilizados como controle positivo na imunoh istoquímica para os \nmarcadores Drosha, Exportina-5 e Dicer foram, consecutivamentes, adenocarcinoma de \npulmão, cólon normal e pla centa. Como controle negativo de cada caso utilizou -se uma \nseção do tecido analisado incubado apenas com o diluente do anticorpo e protéina sérica \nbovina (BSA) (Figura 5). \n3.5.Análise das imagens histológicas \nAs lâminas foram selecionadas de acordo com a maior  representatividade de \ntecido epitelial típico de endométrio (eutópico ou ectópico) por um consenso de dois \nobservadores. Para avaliação da imunocoloração,  foi utilizado um microscópio de luz \nconvencional (Axiostar Plus, Zeiss, Göttingen, Alemanha) e foram examinados todos os \ncampos que continham as lesões, sendo consideradas células positivas aquelas coradas \nde marrom escuro após as reações. Em cada lâmina foram analisados 10 campos de \naumento 40 x, com priorização dos campos de marcação mais intensa. As categorias \nforam definidas por porcentagem de células positivas: 0 (0% –5%), + (6% –25%), ++ \n(26%–50%), e +++ (51%–100%) (TAN et al., 2011; ZHANG et al., 2016).  \nFoi realizado o processo de leitura automatizada das lâminas utilizando imagens \ndas lâminas escaneadas por um sistema Olympus BX61VS Slide Scanner ( Olympus \nOptical do Bras il Ltda, São Paulo, Brasil ) através do software VS120 Virtual Slide \nMicroscope ( Olympus Optical do Brasil Ltda, São Paulo, Brasil ), localizado no \nLaboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica (LMME) do Departamento de \nBiologia Celular e Bioagentes Patogênicos, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \n(FMRP). Foram digitalizados cinco áreas de lesões adenomióticas e duas áreas de \nendométrio eutópico para cada lâmina, utilizando a objetiva  com  aumento  de  20 x, \ntodas as  imagens foram geradas no formato tiff. \n  \n\n48 \n \n3.6. Análise digital quantitativa das imagens \nPara a análise digital quantitativa das imagens, utilizou-se a ferramenta QuPath \n(https://qupath.github.io) (Universidade de Edinburgh, Reino Unido) (BANKHEAD et \nal., 2017) . Inicialmente foram criados projetos específicos (endometrio eutópico de \nmulheres controle; endometrio eutópico de mulheres com adenomiose; e endometrio \nectópico) onde as imagens foram carregadas como tipo brightfield, adequada a \ncoloração com DAB que utilizamos. Esta etapa é importante e interfere no processo de \nseparação automatizada das marcações. Ela usa um método de deconvolução de cores \ndentro do espectro RGB (do inglês red, green, e blue) (RUIFROK; JOHNSTON, 2001). \nO software permite a seleção de vetores específicos para identificação de imagens \nimunohistoquímicas marcadas com hematoxilina e DAB.  \n Uma vez carregadas, as imagens foram anotadas. Esse processo de anotação \nrepresenta a seleção de objetos ou áreas de interesse da análise. Embora esse processo \npudesse ser automatizado, nós preferimos selecionar manualmente todo o tecido \nglandular representado na imagem. Para isso usamos duas ferramentas de desenho \ndisponíveis (polygon e brush). No primeiro, era possível delimitar uma região usando \nlinhas finas poligonais, e na segunda, era possível selecionar uma região usando um \npincel de espessura variável (Figura 6).  \nApós a etapa de seleção das áreas de interesse, nós procedemos com o processo \nde detecção de células usando uma função build-in chamada ‘positive cell detection’, \npois foi a que mais se adaptou às nossas análises preliminares (Figura 6). Os parâmetros \nreferentes à detecção de núcleos, células, e intensidade de background foram, via de \nregra, padronizados entre as imagens dentro de cada projeto, utilizando os ajustes \npadrões sugeridos pelo software. Ajustes individuais finos foram feitos no parâmetro de \ndetecção dos limites das células devido a uma variação morfológica do tamanho das \nmesmas entre as lâminas (Figura 6). \nUsamos como parâmetro de detecção de intensidade a média de marcação \nnuclear ou celular, respectivamente para os anticorpos com marcação exclusiva nuclear \nou mista (nuclear e citoplasmática). Classificamos a intensidade de marcação em +, ++, \nou +++ usando os limiares de detecção de cor de 0.2, 0.4 e 0.6, respectivamente. A \nrazão entre a contagem de células positivas (independente da intensidade) e a contagem \ntotal de células foi usada para gerar o índice de marcação celular, expresso em \nporcentagem. A classificação da intensidade de marcação também foi analisada, mas de \n\n\n49 \n \nmaneira qualitativa. \n \n3.7.Análise estatística \nA quantificação da imunomarcação dos anticorpos foi expressa pela média e o \nerro padrão do percentual de células positivas entre o total de células identificadas por \namostra. Para análise da diferença do número percentual de células epiteliais marcadas \npositivamente pelos anticorpos ente o endométrio eutópico de mulheres sem \nadenomiose e o endométrio eutópico de mulheres com adenomiose, foi utilizado o teste \nde Mann Whitney para dois grupos independentes. Para análise da diferença do número \npercentual de células epiteliais marcadas positivamente pelos anticorpos entre o \nendométrio eutópico e o endométrio ectópico de mulheres com adenomiose, utilizamos \no teste de Wilcoxon para duas amostras pareadas (Wilcoxon signed rank test). Para \nanálise de correlação entre o número percentual de células epiteliais marcadas \npositivamente pelos anticoropos entre o endométrio eutópico e o endométrio ectópico \nde mulheres com adenomiose, foi utilizado o método de correlação de Spearman. \nUsamos o teste exato de Fisher para testar a hipótese nula da avaliação subjetiva da \nproporção de células comprometidas em cada tecido, referente à cada proteína. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n50 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n  \nResultados \n\n51 \n \n4. RESULTADOS \n \n4.1.Avaliação clínica dos pacientes \nA caracterização da casuística está detalhada nas Tabela 2 e Tabela 3.  \n4.2.Caracterização qualitativa da expressão das proteínas reguladoras da biogênese \ndos miRNAs \nDetectamos através da detecção de intensida de de marcação, a localização das \nproteínas, sendo os parâmetros utilizados: nuclear ou celular ou mista (nuclear e \ncitoplasmática). Foi possível verificar que a proteína Drosha tem localização nuclear e \ncelular, enquanto as proteínas Exportina -5 e Dicer e stão localizadas apenas no \ncitoplasma das células endometriais (Figura 7).  As células epiteliais foram o foco da \nimunomarcação, uma vez que o estroma é muito heterogêneo na composição celular e \npode inviabilizar uma análise adequada.  As análises de intensidade de marcação foram \nrealizadas de maneira qualitativa, classificando em +, ++ ou +++. \n4.3.Avaliação quantitativa da expressão das proteínas reguladoras da biogênese dos \nmiRNAs \nA média  (Me) e o erro padrão (se) do percentual de células positivas estão \nrepresentados na tabela 4. O percentual de células examinadas para cada condição está \nrepresentado nas tabelas 5, 6 e 7. \nObservamos menor expressão de Drosha no endom étrio eutópico de mulheres \ncom adenomiose em comparação com o endom étrio eutópico das mulheres  sem a \ndoença (p = 0.016) (IC  95% da diferença: 3.4% a 27.4%)  (Figura 8).  Além disso, \nobservamos men or expressão de Drosha no endomé trio ectópico de mulheres  com \nadenomiose do que no endomé trio eutópico das mesmas mulheres ( p = 0.004 ; IC 95% \nda diferença: 2.3% a 16.7 %) (Figura 9). Também foi possível observar uma correlação \nmoderada entre a expressão de Drosha no endom étrio ectópico de mulheres com \nadenomiose e no endom étrio eutópico das mesmas mulheres ( p = 0.034, rho = 0.454 ) \n(Figura 10). \nNão observamos  diferença na expressão de Exportina -5 entre o endométrio \neutópico de mulheres com adenomiose e o endométrio eutópico das mulheres sem a \ndoença: p = 0.428 (IC9 5% da diferença: -18.1% a 7.9%) (Figura 8). Também não \n\n52 \n \nobservamos diferença na expressão de Expor tina-5 entre o endométrio ectópico de \nmulheres com adenomiose e o endométrio eutópico das mesmas mulheres: p=0.337 \n(IC95% da diferença: -4.0% a 13.6%) (Figura 9).  \nEm relação à  expressão de Dicer, não identificamos diferença entre o \nendométrio eutópico de mulheres com adenomiose e o endométrio eutópico das \nmulheres sem  a doença: p=0.399 (IC95% da diferença: -0.01% a 2.01%)  (Figura 6) . \nNão observamos diferença na expressão de Dicer entre o endométrio ectópico de \nmulheres com adenomiose e o endomé trio eutópico das mesmas mulheres: p = 0.218 \n(IC95% diferença: -0.3% a 0.05%) (Figura 10). \n \n \n \n  \n\n53 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n. \n \n  \nDiscussão \n\n54 \n \nDISCUSSÃO \nNosso estudo mostra que a expressão imunohistoquímica de Drosha é \nprogressivamente menor no endométrio eutópico e ectópico de mulheres com \nadenomiose quando comparados ao endométrio eutópico de mulheres sem a doença. A \ncorrelação observada no percentual de células imunomarcadas para a Drosha nos \ntecidos eutópicos e ectópicos pareados sugere uma expressão coordenada entre os sítios. \nQuanto à Dicer e Exportina-5 não identificamos diferenças significativas da expressão \nnos tecidos estudados. No entanto, algumas observações precisam ser apontadas. Com \nrelação à Dicer, a baixa expressão, ao menos na fase proliferativa, e o número reduzido \nda casuística podem ser as responsáveis pela impossibilidade de rejeitar a hipótese de \nnulidade. Quanto à expressão de Exportina-5, a maior heterogeneidade (dispersão) da \nsua expressão no endométrio eutópico de mulheres sem adenomiose pode ser a \nresponsável por essa impossibilidade. \nAs razões para as alterações que detectamos são desconhecidas.  Não é possível \nafirmar se essas alterações detectadas são herdadas ou se são adquiridas pelas células de \nalguma maneira ao longo da vida.  De todo modo, estudos re centes têm mostrado que \nessas proteínas têm papel relevante na receptividade endometrial e infertilidade  (LOKE; \nRAINCZUK; DIMITRIADIS, 2019), e também no câncer endometrial (TORRES et al., \n2011). Neste último, a expressão reduzida pode inclusive estar diretamente associada a \ndesfechos clínicos desfavoráveis e diminuição da sobrevida (TORRES et al. , 2011) . \nCom base nesses achados, embora plausível, não é possível garantir se essas alterações \ncomuns podem justificar o aumento de risco de câncer de endométrio em mulheres com \nadenomiose (JOHNATTY et al., 2020). Outro ponto interessante é com relação à baixa \nexpressão de D icer. Do ponto de vista biológico, a deleção de Dicer pode direta ou \nindiretamente causar a depleção d os receptores de progesterona (HAWKINS et al. , \n2012), cuja menor expressão também é observado na adenomiose (INOUE et al., 2019).  \nA express ão diferencial de Drosha entre os endom étrios eut ópicos e ect ópicos \npode justificar a express ão alterada dos miRNAs em adenomiose , uma vez que, \nalterações nos níveis de expressão de Drosha acompanham as desregulações de \nmicroRNAs em várias neoplasias, incluindo cânceres de mama e de ovário \n(BERNSTEIN et al., 2003). Torres et al. (2011), verificou que alterações de expressão \ndos principais reguladores da biogênese dos microRNAs estão presentes no tecido \n\n55 \n \ncancerígeno endometrial e podem ser potencialmente responsáveis pelos perfis alterados \ndos microRNAs observados nessa neoplasia (TORRES et al. , 2011) : os níveis de \nexpressão de Drosha foram significativamente mais baixos em amostras de câncer de \nendométrio em comparação com os controles e a  expressão diminuída de Drosha se \ncorrelacionou com o maior grau histológico da doença (TORRES et al. , 2011) . O s \nníveis de mRNA de Dicer e Drosha c orrelacionados com os n íveis de expr essão da \nproteína correspondente encontram -se reduzidos nas amostras de c âncer de ov ário \n(SPANNUTH et al. , 2009) , além disso,  a express ão de mRNA de Dicer e Drosha  é \nvariável entre espécimes de câncer de ovário epitelial invasivo e em linhas de células de \ncâncer de ov ário e est ão significativamente associadas à sobrevivência, indicando que \nos níveis de mRNA de Dicer e Drosha em c élulas de câncer de ovário são clinicamente \nrelevantes (SPANNUTH et al., 2009). \nDrosha e seu cofator, DGCR8, formam o complexo microprocessador e s ão \ncruciais para a etapa inicial de matura ção de miRNA: processamento nuclear de p ri-\nmiRNAs (PONG; GULLEROVA; ROAD, 2018) . Al ém dos pri -miRNAs, a Drosha \ntambém pode ter como alvo outros transcritos contendo a estrutra hairpin, como \nhairpins encontrados em éxons de mRNA (PONG; GULLEROVA; ROAD, 2018) .O \nmapeamento de todo o genoma de substratos nascentes de Drosha atrav és formaldehyde \ncross-linking immunoprecipitation and sequencing (fCLIP -seq) revelou que Drosha \ntambém processa substratos n ão canônicos, sugerindo que pode ter fun ções diferentes \nda matura ção de miRNA (KIM; KIM, 2018) . Pong; Gullerova (2018) (PONG; \nGULLEROVA; ROAD, 2018) publicaram uma revisão sobre as fun ções não canônicas \ndas prote ínas reguladoras da biog ênese dos miRNAs. A aus ência do complexo \nmicroprocessador durante o desenvolvimento leva à perda das propriedades das células-\ntronco e à diferenciação prematura em progenitores neurais do prosencéfalo de murinos, \na Drosha desestabiliza diretamente o mRNA da Neurogenina 2 (Ngn2) e, assim, diminui \nos n íveis de Ngn2, um fator de transcri ção neurog ênico (PONG; GULLEROVA; \nROAD, 2018) . Outro estudo apontado na revis ão mostrou que a abla ção de DGCR8 \nprejudica a corticog ênese em camundongos de forma mais pronunc iada do que a \ndepleção de Dicer, um fenômeno causado pela desregulação do transcrito da proteína T-\nbox cerebral 1 (Tbr1), que previu estruturas em hairpin em sua sequ ência de \ncodificação, concluindo que, e DGCR8 s ão, portanto, importantes para manter a \npropriedade de auto -renovação de progenitores neurais murinos, que é alcançada pela \n\n56 \n \ndesestabilização de transcritos que codificam fatores de diferencia ção. Além de \nimplicações na neurog ênese, Drosha est á implicada no desenvolvimento mieloide, em \nque desestabiliza diretamente o mRNA da cadeia leve 9 da miosina (Myl9) e o mRNA \nalvo de Drosha 1 (Todr1), cujos produtos prot éicos são inibidores da mielopoiese e s ão \nessenciais para o desenvolvimento das c élulas dendr íticas(PONG; GULLEROVA; \nROAD, 2018). \nDas proteínas estudadas, a Exportin-5 é a mais altamente regulada pelo \nestrogênio. Já o efeito da progesterona parece fundamental para o aumento da expressão \nde Dicer, e pode induzir uma redução na expressão da Drosha (NOTHNICK, 2012), ao \nmenos no tecido sadio. Talvez isso explique a baixa expressão identificada no nosso \nestudo. A identificação de baixa expressão de Dicer nessa fase do ciclo menstrual tanto \nno endométrio eutópico quanto no endométrio ectópico de mulheres com adenomiose, \nsugere que esse componente da biogênese não deve ser o responsável pelas alterações \nna modulação da maturidade dos miRNAs associados a esta patologia. Outra \njustificativa poderia ser o envolvimento dos hormônios esteroides sexuais no processo \nde regulação da expressão de miRNAs. É sabido que os receptores nucleares para os \nhormônios esteroides, inclusive que o receptor alfa do estrogênio modula a biossíntese \nde miRNAs (FUJIYAMA-NAKAMURA; YAMAGATA; KATO, 2010) e que a \nexpressão desta isoforma do receptor é diferentemente expressa no endométrio \nadenomiótico (MEHASSEB et al., 2011). \n Do ponto de vista da  susceptibilidade genética, alguns estudos têm identificado \numa associação entre polimorfismos de D icer e/ou Drosha  e risco para endometriose \n(MEDEIROS et al. , 2021)  e aborto espontâneo reccorrente (GHASEMI et al. , 2019) , \ncondições sabidamente associadas à adenomiose (LEYENDECKER et al. , 2015; \nSOMIGLIANA et al. , 2006) . Outra hipótese que pode ser aventada, embora também \nnão seja segura em explicar a variação na expressão dessas proteínas em espécimes de \nadenomiose é o envolvimento das proteínas p53, p63 e p73 (BOOMINATHAN, 2010) . \nEssas proteínas podem modular a expressão de Dicer e Drosha (BOOMINATHAN, \n2010) e parecem estar alterados em espécimes de adenomiose  (HOSPITAL, 1996; \nNETO; FERREIRA; RAMALHO, 1975) . \nNosso estudo algumas limitações. A sele ção de pacientes e controles foi muito \nrigorosa. Embora importante, o uso de critérios estritos levou a uma redução \n\n57 \n \nsignificativa da elegibilidade. De qualquer forma, consideramos esse ponto fundamental \npara um estudo piloto. A padronização da fase do cicl o menstrual também parece ser \nmuito importante, pois os esteróides sexuais podem interferir drasticamente na \nexpressão dessas proteínas (NOTHNICK, 2011). Neste estudo não incluímos amostras \nde mulheres que estavam em uso de progestagênio, pois acreditamos que isso poderia \nter interferido na análise da expressão tecidual das proteínas -alvo. Além disso, nossa \ncasuística também não contém amostras da fase secretória, uma vez que boa parte das \ncirurgias de histerectomia são realizadas no período proliferativo do ciclo menstrual. \nOutro ponto é a utilização da técnica imunohistoquímica apenas. No entanto, \napesar do sequenciamento de RNA (RNAseq) ser considerado o padrão ouro para \navaliação de perfis de genes ao nível da tr anscrição, a avaliação da expressão de \nproteínas pela imunohistoquímica em amostras teciduais embebidas em parafina e \nfixadas em formalina (formalin -fixed paraffin -embedded tissue samples) demonstrou \ncorrelações altas e estatisticamente significativas com o RNAseq (SOROKIN et al. , \n2020).O uso da metodologia de análise digital das imagens com supervisão de \nconferência de um patologista agrega valor substancial à mensuração quantitativa da \nmarcação imunohistoquímica (RIZZARDI et al., 2012).  \n \n \n\n58 \n \n  \nConclusão \n\n59 \n \n \n \n5. CONCLUSÃO \nA expressão de Drosha é reduzida aparentemente de maneira coordenada no \nendométrio eutópico e ectópico de mulheres com adenomiose. Esse achado, juntamente \ncom a evidência da relação entre essa proteína e o câncer endometrial, justifica o \ndirecionamento de pesquisas futuras para compreender o papel da Drosha na \nfisiopatologia da adenomiose e, eventualmente, sua relação com o câncer de endométrio \nevidencia a importância. O comprometimento da expressão dessa proteína, e talvez da \nDicer/Exportina-5, pode justificar a importância da via de biogênese dos miRNAs na \nfisiopatologia da doença e, consequentemente, na interpretação dos sintomas e na \nproposição de terapias efetivas. \n  \n\n60 \n \n \n  \nTabelas \n\n61 \n \n6. TABELAS \n \n \nTabela 1: Anticorpos utilizados na imunohistoquímica.  \n \nAnticorpo Marca Clone Diluição Controle \npositivo \nAnti- Drosha  ABCAM/UK ab102015 1:100 Adenocarcinoma \nde pulmão \nAnti- Dicer ABCAM/UK ab82539 1:60 Placenta \nAnti-Exportin-\n5 \nABCAM/UK ab129006 1:200 Cólon  \nNota: para controle negativo não utilizamos anticorpo primário \n  \n\n62 \n \nTabela 2: Caracterização clínica das pacientes incluídas no estudo. \n Casos (n = 22) Controles (n = 10) p value \nIdade (média±dp) 41.8±3.6 42.2±3.1 .751 \nMenarca (média±dp) 11.9±1.7 12.6±1.1 .258 \nGestações (mediana,intervalo) 4, 0-8 2.5, 2-4 .073 \nParidade (mediana, intervalo) 2.5, 0-4 2, 1-4 .298 \nLocalização (n, %) \n \n--- --- \n           Parede anterior 6, 27.3 --- --- \n           Parede posterior 8, 36.4 --- --- \n           Mista 8, 36.4 \n  \nEnvolvimento da camada uterina \n \n--- --- \n        Tipo 1-2 15, 68.2 --- --- \n        Tipo 2-3 5, 22.7 --- --- \n        Tipo 1-2-3 2, 9.1 --- --- \nNotas: tipo 1 = zona de junção; tipo 2 = miométrio médio; tipo 3 = miométrio externo.\n\n63 \n \nTabela 3: Informações clínicas das pacientes controles incluídas no estudo. \nIdade Paridade Patologias \nAssociadas Menarca Hábitos D.U.M Data da \ncirurgia \n39 anos G4P4A0C4 DPC e SOP 13 anos Ex-\ntabagista 06/05/2010 17/05/20\n10 \n38 anos G4P3A1C1 Nega 13 anos Nega 10/2006 23/10/20\n06 \n36 anos G5P2A4PN2 Nega 14 anos Nega 17/04/2007 20/04/20\n07 \n46 anos G2P2A0PN2 Fibromialgia 9 anos Nega 02/2006 08/02/20\n06 \n47 anos G3P3A0PN3 Anemia 8 anos Nega 04/04/2007 09/04/20\n07 \n39 anos G2P2A0PN2 HAS 12 anos Nega 14/09/2008 15/09/20\n08 \n38 anos G1 Anemia 13 anos Nega 29/10/2007 09/11/20\n07 \n48 anos G5P3A2C Nega 11 anos Ex-\ntabagista 21/03/2009 27/03/20\n09 \n39 anos G2P2A0PN2 Nega 9 anos Nega 03/09/2007 14/09/20\n07 \n44 anos G2P1A1PN1 DPC 10 anos Ex-\ntabagista 07/10/2006 16/10/20\n06 \n45 anos G4P3A1PN3 \nNIC I e \nNICII 13 anos Não \ninformado 10/06/2008 22/06/20\n08 \n48 anos G2P2A0C2 Nega 13 anos \nNão \ninformado 17/07/2007 25/07/20\n07 \n43 anos G4P2A2C2 Nega 10 anos \nNão \ninformado 15/07/2006 21/07/20\n06 \n45 anos G8P8A0N8 NIC II 13 anos Não \ninformado 25/04/2006 04/05/20\n06 \n39 anos G4P4C1A0 \nDispareunia \ne anemia 14 anos Nega 26/09/2007 31/09/20\n07 \n42 anos G6P2A4C2 Nega 12 anos Etilismo \nSocial 12/08/2007 19/08/20\n07 \n39 anos G4P4A0PN4 Nega 14 an Não 24/02/2006 02/03/20\n06 \n\n64 \n \n \nNotas: Data da última menstruação (D.U.M).  Gravidez (G). Parto(s) (P). Aborto (A). \nCesárea (C). Parto Normal (PN). \n  \nos informado \n41 anos G4P2A2PN2 Nega 13 anos Não \ninformado 13/08/2007 19/08/20\n07 \n43 anos G4P3A1C1P\nN3 \nNega 13 anos Ex-\ntabagista 05/2006 12/05/20\n06 \n40 anos G4P3A1PN3 Nega 11 anos Nega 13/01/2007 17/01/20\n07 \n43 anos G2P2A0C2 DMII 12 anos Nega Dezembro \nde 2008 \n13/02/20\n09 \n37 anos G3P2A0C1 Nega 12 anos Nega Não \ninformado \n13/08/20\n08 \n\n65 \n \nTabela 4: Percentual de células epiteliais positivas para cada anticorpo em cada condição. \n \n \nAnticorpo Condição Endométrio % (Me±se) Contagem de \ncélulas \nAnti-Drosha \nControle Eutópico \n85.2±2.9 \n \n \n3168 \n \nAdenomiose \nEutópico 69.9±3.4 3818 \nEctópico 59.6±3.2 2562 \nAnti-Dicer \nControle Eutópico 2.4±1.8 2932 \n \nAdenomiose \nEutópico 0.1±0.0 3015 \nEctópico 0.2±0.0 2232 \n \n \n \nAnti-Exportina-\n5 \nControle Eutópico 67.8±7.6 3352 \n \nAdenomiose \nEutópico 76.3±2.6 3190 \nEctópico 72.4±3.4 2436 \n\n66 \n \n \nTabela 5: Percentual de células positivas para o marcador Drosha. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nNotas: Diferença entre endométrio normal e eut ópico (Teste exato de Fisher, p = 0.0058)  e diferença \nentre endométrio normal e ectópico (teste exato de Fisher, p = 0.0058). \n \n \n  \nDROSHA 0&1 2 3 \nendométrio normal  0(%) 4(%) 6(%) \nendométrio eutópico 0(%) 0(%) 22(%) \nendométrio ectópico 0(%) 0(%) 22(%) \n\n67 \n \nTabela 6: Percentual de células positivas para o marcador Exportina-5. \n \nEXPORTINA-5 0 1 2 3 \nendométrio normal 1(%) 0(%) 3(%) 6(%) \nendométrio eutópico 0(%) 0(%) 3(%) 19(%) \nendométrio ectópico 0(%) 0(%) 3(%) 19(%) \n \n \nNotas: Diferença entre endométrio normal e eutó pico (Teste exato de Fisher, p = 0.3204)  e diferença \nentre endométrio normal e ectópico (teste exato de Fisher, p = 0.3204). \n \n \n \n  \n\n68 \n \nTabela 7: Percentual de células positivas para o marcador Dicer. \n \n \n \n \n \n \n \nNotas: Diferença entre endométrio normal e eut ópico (Teste exato de Fisher, p = 0 .6367) e diferença \nentre endométrio normal e ectópico (teste exato de Fisher, p = 0.6367) \n  \nDICER 0&1 2&3 \nendométrio normal 9(%) 1(%) \nendométrio eutópico 17(%) 5(%) \nendométrio ectópico 17(%) 5(%) \n\n69 \n \n \n  \nReferências Bibliográficas \n\n70 \n \n7.  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