Análise da Expressão Gênica Diferencial em Endometriose

..................................................................................................................................iii INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 1 ENDOMETRIOSE ................................................................................................................... 2 ETIOLOGIA DA ENDOMETRIOSE .......................................................................................... 5 FATORES DE RISCO, ENDOMETRIOSE E CÂNCER.............................................................. 10 TÉCNICAS DE DETECÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM ENDOMETRIOSE .. 11 OBJETIVOS ................................................................................................................................ 14

E MÉTODOS ............................................................................................................. 16 CASUÍSTICA ........................................................................................................................ 17 AMOSTRAS.......................................................................................................................... 18 ISOLAMENTO DO RNA TOTAL........................................................................................... 18 RÁPIDA HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA DE CDNA (RASH).................................................... 18 Síntese do cDNA ...................................................................................................... 19 Digestão Enzimática com MboI e Ligação dos Adaptadores............................... 19 PCR e Purificação dos Produtos ............................................................................ 20 Digestão do teste....................................................................................................... 20 Hibridação Subtrativa............................................................................................. 20 Ligação ao plasmídeo pZErO®-1 e Transformação Bacteriana ........................ 21 Screening das Colônias e Análise por Seqüenciamento ....................................... 21 ANÁLISES POR BIOINFORMÁTICA...................................................................................... 21 VALIDAÇÃO DOS DADOS DA RASH POR PCR EM TEMPO REAL ....................................... 22 ANÁLISE ESTATÍSTICA....................................................................................................... 26 RESULTADOS ............................................................................................................................. 27 BIBLIOTECAS DE HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA DE CDNA (RASH) ..................................... 28 VALIDAÇÃO POR PCR EM TEMPO REAL............................................................................ 46 DISCUSSÃO ................................................................................................................................ 50 CONCLUSÕES............................................................................................................................. 59 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................... 61 ANEXOS ..................................................................................................................................... 73 MANUSCRITO ............................................................................................................................ 99 ii RESUMO MEOLA, J. Análise da expressão gênica diferencial em endometriose. 2008. 132 p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ri beirão Preto – Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. A endometriose é uma doença ginecológica beni gna, de etiologia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de estroma e tecido glandular tipo endométrio fora da cavidade uterina. Afeta de 10 a 15% da população feminina, que apresentam sintomatologia variada, incluindo dor pélvica e infertilidade. Para elucidar mecanismos potenciais que estejam envolvidos com a fisiopatologia complexa dest a doença, analisamos o perfil de expressão gênico diferencial pela metodologia de hibridaç ão subtrativa em tecido eutópico e ectópico (lesões peritoniais e endometrio ma ovariano) de 17 mulheres com endometriose, no início da fase proliferativa do ciclo menstrual. Foram id entificados 291 genes de sregulados nas lesões endometrióticas, considerados como genes candidatos. Para a validação dos dados, utilizamos a metodologia de PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC, indicados como superexpressos; e MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP como menos expressos nas lesões . Diferenças significativas de expressão nas lesõ es peritoniais foram obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP e nos endometriomas ovarianos para os genes MMP3 e PAEP. Sugerimos que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP seja responsável pela perda da homeostase celular na s lesões endometrióticas, contribuindo para a implantação e sobrevivência do tecido ectópico no ambiente extra-uterino. Este trabalho disponibilizou ao banco de dados da literatu ra, 291 genes com expre ssão gênica diferencial em lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas como candidatos a investigações futuras. Palavras-chave: Endometriose, Expressão Gê nica Diferencial, Endométrio, Hibridação Subtrativa, PCR em Tempo Real. iii

MEOLA, J. Differential gene expression analysis in endometriosis. 2008. 132 p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ri beirão Preto – Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Endometriosis is a benign gynecological disease, which presents a multifactorial and complex etiology, characterized by the pr esence of stromal and glandular endometrium tissue outside the uterine cavity. Ten to 15% of the female population is affected by the disease with a wide- ranging symptomatology including pelvic pain and infertility. To clarify the potential mechanisms involved in the complex physiopat hology of this disease, we analyzed the differential gene expression profile by subtract ive hybridization in euto pic and ectopic tissue (peritoneal lesions and ovarian endometriomas) from 17 wome n with endometriosis, in the early proliferative phase of th e menstrual cycle. We identified 291 genes deregulated in the endometriotic lesions, considered as candidate genes. For data validation, Real Time PCR was applied for genes CTGF and SPARC , indicated as overexpr essed; and for genes MYC, MMP3, IGFBP1 and PAEP, indicated as downregulated in the lesions. Significant differences in the peritoneal lesions expr ession were obtained for genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP and in the ovarian endometriomas for genes MMP3 and PAEP . We suggest that the deregulation of genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI and PAEP is responsible for loss of cellular homeostasis in the endometriotic le sions, contributing for the implantation and maintenance of the ectopic tissue in the extra- uterine environment. This study provided 291 genes with differential gene e xpression, in peritoneal and ovari an lesions, to the literature database as candidates for future investigations. Key-words: Endometriosis, Differential Ge ne Expression, Endometrium, Subtractive Hybridization, Real Time PCR. I NTRODUÇÃO 2 ENDOMETRIOSE A endometriose é uma doença ginecológica benigna, estrógeno-dependente, bastante agressiva, que afeta 10 a 15% das mulheres na idade reprodutiva (Thomas e Prentice, 1992; Yang et al., 2004). É caracterizada pelo crescime nto de estroma e tecido glandular tipo endométrio fora da cavidade uterina, denom inado endométrio ectópico (Sampson, 1927; Poliness et al., 2004). O tecido ectópico é histologicamente seme lhante ao endométrio normal de mulheres sem endometriose e ao endométrio normal, eutópi co, de mulheres afetadas pela doença. Mas, tais tecidos diferem entre si bioquímica e fu ncionalmente em numerosas vias, incluindo receptividade a esteróides, potencial proliferativo e invasivo (Gaetje et al., 1995; Vinatier et al., 2001; Nap et al., 2004; Viganò et al., 2004; Ulukus et al., 2006). O local mais comum de implantes endometrióticos é a cavidade pélvica, principalmente o peritônio pélvico. Podem também ser encontrados nos ovários e septo re to-vaginal, e ocasionalmente no pericárdio, pleura, fígado, rim, bexiga, cérebro e raramente em homens (Lebovic et al., 2001; Giudice e Kao, 2004). Alguns sintomas são característicos desta doe nça, como a dismenorréia (dor pélvica durante a menstruação), dispaneuria (dor duran te o ato sexual), dor pélvica não cíclica e infertilidade (Poliness et al. , 2004). A prevalência de e ndometriose entre mulheres assintomáticas é de 2 a 22%, e em mulheres com dismenorréia é de 40 a 60% (Farquhar, 2000). Além disso, 25 a 50% de mulheres infértei s apresentam endometriose e 30 a 50% de mulheres com endometriose são inférteis (D´Hooghe et al., 2003). Tais porcentagens variam de acordo com os critérios de diagnóstico adot ados. Evidências sugerem que esses sintomas associados com a doença resultam de uma reação inflamatória peritonial local, ocasionada pelos implantes endometriais ectópicos (Lebovic et al., 2001) que sofrem sangramento cíclico (Arya e Shaw, 2005). 3 Mecanismos que associam endometriose com infertilidade têm sido sugeridos, como: (1) distorção da anatomia pélvica devido a ad esões endometrióticas, que poderiam prejudicar a liberação do oócito ou inibir seu transporte; (2) função peritonial alterada em pacientes com endometriose devido ao aumento do volume do flui do peritonial, aumento da concentração de macrófagos ativados, prostaglandi nas, interleucina 1 (IL-1), TNF (tumor necrosis factor ) e proteases. Tais alterações causariam efeitos adversos no oócito, espermatozóide e embrião (Birmingham, 2006); (3) falha de implantação devido à redução da expressão endometrial de α Vβ integrinas (Lessey et al., 1994) e L-selectina em mulheres com endometriose durante a fase de implantação (Genbacev et al. , 2003). Entretanto, a hipótes e de que a doença causa infertilidade ou diminui a fecundidade permanece controversa. O diagnóstico de endometriose inicialmente é feito com a história clínica da paciente. Entretanto, a sintomatologia variada e sua po bre correlação com a severidade da doença podem dificultar este diagnóstico (Vercellini et al , 1991). Na maioria dos casos, a endometriose é cirurgicamente estadiada com ba se na localização, extensão e tipo de lesão por laparoscopia. Além disso, o diagnóstico fina l é dado pela análise histopatológica da lesão (Brosens et al., 2004). A American Society for Reproductive Medicine (1997) organizou e propôs a classificação da endometriose em quatro estadi os: forma mínima (estadio I), leve (II), moderada (III) e severa (IV). Tal método é baseado em um sistema de escores unificados nos quatro estadios, na avaliação percentual e volume das lesões, incluindo a predição sobre a probabilidade de gravidez após o tratamento. Embora este método de classificação seja mundialmente aceito, ele pobremente prediz a ch ance de gravidez após terapia, devido à arbitrariedade na atribuição dos escores, que é feita de acordo com a observação de cada patologista (Birmingham, 2006). 4 Além desta classificação, morfologicamente os implantes peritoniais e ovarianos podem ser diferenciados em: lesões vermelhas, negras (azulada ou arro xeada, pregueada), e brancas (American Society for Reproductive Me dicine, 1997). As lesões vermelhas são mais agressivas, ativas, elevadas, apresentando hi stologia semelhante ao epitélio eutópico proliferativo (Nisolle e Donnez, 1997). Além di sso, acredita-se serem mais vascularizadas e com maior poder invasivo, correspondendo ao pr imeiro estágio de desenvolvimento da doença. Já as lesões negras, também ativas , correspondem ao estadio mais avançado da doença. As lesões brancas são menos vascular izadas, inativas, aparecem posteriormente às lesões negras e apresentam aspecto cicatricial (Nisolle et al., 1993; Brosens, 1994). Os exames complementares à laparoscopi a incluem a dosagem sorológica do CA 125 e CA 19-9, exames ginecológicos, ultra-sonograf ia transvaginal e a ressonância magnética. Entretanto, os mesmos não são adequadamente sensíveis e específicos, sendo a laparoscopia, apesar de onerosa e invasiva, o método dia gnóstico mais confiável (Thomas, 1995; Rosa e Silva, 2007). A ultra-sonografia transvaginal é confiável na detecção de endometriomas, contudo, assim como a ressonância magnética, falha em detect ar endometriose ovariana e peritonial superficiais (Brosens et al, 2004). Embora os antígenos tumorais CA 125 e CA 19-9 sejam detectados em maiores concentrações no soro e no fluido peritonial de pacientes com endometriose, sendo especificamente correlacionados com a doença, ambos apresentam baixa sensibilidade (Foster, 2003). O tratamento adequado deve ser individualizado para cada paciente. A recomendação para tratamento medicamentoso e/ou cirúrgico de pende da ausência ou pr esença de sintomas, grau da doença, idade da paciente e sua futura ambição de fertilidade. Geralmente, recomenda-se o tratamento cirúrgico quando há danos ovarianos e tubários, cistos endometrióticos, outras doenças ginecológicas associadas, ou quando houver falha na terapia com drogas. Já a terapia medicamentosa é mais apropriada em casos de doença recorrente ou 5 início de tratamento. Apenas em casos extrem os indica-se a histerectomia (Thomas, 1995). A terapia com drogas padrão para a endometriose inclui: analgésicos (drogas antiinflamatórias não esteroidais), contraceptivos orais, agentes androgênicos, progestágenos e antiprogestogênicos, antigonado trofinas e análogos do GnRH (hormônio liberador da gonadotrofina) (Mounsey et al , 2006). Tais medicamentos têm alcances variados, mas as funções são as mesmas, incluindo supressão da atividade ovariana, menstrual e atrofia dos implantes endometrióticos (Farquhar, 2007). Embora, os tipos de tratamentos sejam variados, a recorrência da endometriose ocorre em mais de 60% do s casos. Mesmo após terapias radicais, como a histerectomia, sua recorrência é de 5 a 10% (Arya e Shaw, 2005). ETIOLOGIA DA ENDOMETRIOSE Várias teorias têm sido propostas para explicar as várias localizações da endometriose. São elas: A teoria da metaplasia celômica, primeira mente descrita em 1919 por Meyer, sugere que o epitélio celômico possa se transformar, por metaplasia em tecido tipo endométrio. Esta teoria explicaria a endometriose ovariana e foi estendida para a serosa peritonial, que tem potencial de proliferação e diferenciação (Vinatier et al., 2001; Arya e Shaw, 2005). Tal teoria também é atrativa para explicar a ocorrência de endometriose na ausência de menstruação (El Mahgoud e Yaseen, 1980). Entretan to, alguns fatores contrários devem ser considerados: o fato que a endometriose ocorre na maioria dos casos quando o endométrio está presente, e desta forma os homens seriam poupados da doença; a endometriose poderia ocorrer em qualquer lugar onde os tecidos são derivados de epitélio celômico; se a metaplasia celômica fosse semelhante à metaplasia comum, a freqüê ncia de endometriose seria maior com a idade (Vinatier et al., 2001; Nap et al., 2004). 6 A teoria de restos embrionários, proposta por Russel (1899), baseia-se na existência de células originárias do ducto de Müller com po tencial de desenvolvimento em endométrio funcionante. Questiona-se tal teoria, pois a di stribuição anatômica da endometriose não se relaciona com as vias dos ductos de Müller (Nap et al., 2004). Além disso, acredita-se que essas teorias possam ser vistas como complementares, pois, metaplasia e crescimento de resí duos Müllerianos podem ser induzidos experimentalmente por debris menstruais (Fujii, 1991). Tal descoberta corrobora com a teoria da indução, proposta por Levander e Norman em 1955. Esta teoria, que é uma extensão da teoria da metaplasia celômica, propõe que o endométrio mens trual degradado libera fatores endógenos, bioquímicos e imunológicos, que indu zem a metaplasia do epitélio seroso do ovário e as células serosas do mesotélio, resu ltando em tecido endometrial (Arya e Shaw, 2005). A teoria da implantação metastática ou teor ia de Sampson (1927) propõe que, durante a menstruação haja um refluxo de tecido endometrial via tuba uterina para dentro da cavidade abdominal, onde este tecido poderia implantar. Vários fatores corroboram para esta teoria, que é a mais aceita para explicar a origem da e ndometriose. São eles:o fluxo menstrual retrógrado ocorre em 90% das mulheres (Halme et al. , 1984); a presença de células epiteliais endometriais viáveis no fluido peritonial (Kruitwagen et al. , 1991), ou seja, as células endometriais têm características de adesão, implantação, cresci mento e angiogênese (Viganò et al , 2004); e a associação entre fluxo menstr ual obstruído e endometriose (Olive e Henderson, 1987). Entretanto, é importante salientar que apenas o refluxo tubário não é suficiente para estabelecer a doença, po is, 90% das mulheres possuem mens truação retrógrada e apenas 10 a 15% desenvolvem endometriose. Assim sendo, após a disseminação das células menstruais, alguns estágios são necessários para o estabelecimento e manutenção da doença, como: 7 1) ESCAPE DO SISTEMA IMUNOLÓGICO Acredita-se que a patogênese da doença está associada com a capacidade das células endometriais ectópicas de neutra lizar a resposta imune local, de vido a defeitos no sistema de vigilância imunológica e supressão de células do sistema imune (Lebovic et al. , 2001; Siristatidis et al. , 2006). Algumas alteraçõ es em mulheres com endometriose têm sido demonstradas como: a modificação na ex pressão de antígenos do sistema HLA ( human lymphocyte antigen) de classe I, que são relevant es no reconhecimento imune (Semino et al., 1995); a diminuição da atividade de NK ( natural killer ) e citotoxicidade contra as células endometriais ectópi cas (Oosterlynck et al. , 1991); a secreção de fatores como TGF- β (transforming growth factor) e prostaglandina E2 que inibem as funções dos linfócitos (Hirata et al., 1994). 2) MECANISMOS DE ADESÃO: As moléculas de adesão, como integrinas e caderinas, são as principais mediadoras da adesão célula-célula e célula-matriz celular, e sua expressão é importante para a adesão celular inicial de tecidos que sofrem descamação (Beliard et al., 1997). Algumas moléculas de adesão como as integrinas α 2β1, α 3β1, α 4β1, α 5β1 e E-caderina são expressas em lesões endometrióticas, podendo estar associadas com a doença (Witz, 2003). 3) MECANISMOS DE INVASÃO: O mecanismo de invasão pelo tecido ectópi co é dependente de metaloproteases da matriz (MMP) e de seus inibidores teciduais específicos (TIMPs). As MMPs têm funções importantes no controle de mudanças cíclicas do endométrio, na proliferação e inibição de crescimento, além disso, são reguladas por estrógeno e progesterona (Rodgers et al., 1994). A síntese e secreção desregulada de MMPs po r lesões endometrióticas, combinada com 8 aberrantes quantidades de TIMPs no fluido peri tonial, podem alterar o ambiente proteolítico normal da cavidade peritonial, induzindo um am biente mais agressivo e facilitando a invasão das células ectópicas (Viganò et al., 2004). 4) MECANISMOS DE APOPTOSE A morte celular programada, comumente c onhecida como apoptose, é um processo fisiológico responsável pela manutenção da homeostase celular durante o ciclo menstrual. Ela elimina as células senescente s da camada funcional do endomé trio uterino durante a fase secretora tardia do ciclo menstrual, substi tuindo-as por células novas durante a fase proliferativa do ciclo. Contudo, em mulheres com endometriose a porcentagem de células que passa por apoptose é menor, indicando que al gumas células podem continuar a exibir atividades fisiológicas errôneas (Dmowski et al., 2001). Várias moléculas regulam a apoptose como p53, Bax ( BCL2-associated X protein ) e c-myc ( v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog) que estimulam a morte celu lar programada, e Bcl-2 ( B-cell CLL/lymphoma 2) e Bcl-xL (BCL2-like 1) que inibem a apoptose (Sattler et al., 1997; Harada et al., 2004). O aumento da Bcl-2 já foi demonstrado em pacientes afetadas por Meresman e colaboradores (2000). 5) NEOVASCULARIZAÇÃO A vascularização dos implantes endometr ióticos é provavelmente um dos mais importantes fatores no processo de sobrevivên cia e invasão de outros tecidos. O ambiente peritoneal é altamente angiogênico e o aument o na atividade e nas quantidades do VEGF-A (vascular endothelial growth factor ) foi demonstrado no fluido peri tonial e no endométrio de mulheres com endometriose (Donnez et al., 1998). Além disso, outros fatores angiogênicos, incluindo interleucinas 1, 6 e 8, EGF ( epidermal growth factors ), IGF ( insulin-like growth 9 factors) e Endo-I são reconhecidamente expressos pelo endométrio eutópico e ectópico em pacientes com endometriose (Taylor et al., 2001; Laschke e Menger, 2007). 6) PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS ECTÓPICAS A endometriose requer estrógeno para con tinuar proliferando e tende a regredir quando é privada deste hormônio. A aromatase é um a enzima que cataliza a biosíntese de estrógeno. Considerando que a expressão de arom atase é alta em cistos endometrióticos e implantes endometriais extra-ovarianos, suge re-se que esta expressão aberrante esteja envolvida na patogênese da doença, pois é um estímulo de crescimento independente do ovário (Zeitoun e Bulun, 1999). Junto com hormôni os esteróides, fatores de crescimento específicos parecem favorecer a proliferaç ão dos implantes endometrióticos (Taylor et al. , 2001). Considerando as diferentes origens possíveis, localizações e respostas hormonais, foi sugerido que a endometriose peritonial, o endometrioma ovariano e os nódulos adenomióticos do septo reto-vaginal seriam três entidades di stintas com diferentes patogêneses (Nisolle e Donnez, 1997). Entretanto existem contrové rsias, pois Viganò e colaboradores (2004) descreveram dados patológicos, cirúrgicos e ep idemiológicos que consistentemente sugeriam que as lesões peritoniais, ova rianas e profundas constituíam di ferentes expressões de uma mesma doença, com um único mecanismo patogênico, isto é, a menstruação retrógrada. Devido às várias teorias apresentadas s obre a patogênese da endometriose e dados ainda não conclusivos sobre sua origem, sua etiologia é considerada complexa e multifatorial, sendo que as teorias propostas devem ser complementares e não exclusivas. 10 FATORES DE RISCO, ENDOMETRIOSE E CÂNCER Alguns estudos sugerem aumento da incidê ncia da endometriose durante a idade reprodutiva, sendo rara antes da menarca e com tendência a diminuir depois da menopausa (Houston, 1984). Assim sendo, mulheres com menarca precoce ou menopausa tardia têm risco aumentado de desenvolver a doença, enquanto que mulheres que fazem uso de contraceptivos orais apresentam risco diminuído (Farquhar, 2 007). Também se sugere que mulheres com ciclos menstruais curtos e intensos, ou nulíp aras, tenham maior risco de desenvolver a doença (Darrow et al. , 1993; Vercellini et al. , 1997; Missmer e Cramer, 2003). Entretanto, outros fatores de risco como classe social, raça, alto índice de massa corpórea, uso de álcool, tabaco e cafeína são considerados pouco consistentes (Viganò et al., 2004). Acredita-se que a endometriose tenha tendênc ia familial, poligênica e multifatorial, sendo observado maior risco da doença, de 5 a 8%, em mulheres com histórico familiar positivo em parentes de primeiro grau (Bisc hoff e Simpson, 2004). Além disso, estudos de ligação e em gêmeos têm identificado vários genes candidatos com potencial biológico plausível envolvido com a suscetibilidade para a doença, como genes supressores tumorais (PTEN - phosphatase and tensin hom olog, TP53 - tumor protein p53 ), receptores de estrógeno, progesterona e andrógeno entre ou tros (Giudice e Kao, 2004). Outros genes polimórficos vêm sendo associados à endometriose como GALT (galactose-I-phosphato uridly transferase ), NAT2 (N-acetyl transferase 2 ), CYP1A1 (cytochrome P450 1A1 ) e GSTM1 (glutathione-S-transferase M1) (Bischoff e Simpson, 2004). Há também relatos de algumas alterações genômicas detectadas por CGH (comparative genomic hybridization ) e CGH array em pacientes com endometriose, que poderiam estar associadas ao desenvolvimento da doença (Gogusev et al., 1999; Gogusev et al., 2000; Guo et al., 2004). O microambiente ovariano e o ambiente peritonial podem estar também relacionados a essas alterações (Koninckx et al., 1998). 11 Embora alguns dados sugiram aumento de ri sco de câncer ovariano em mulheres com endometriose, as evidências biológicas que confirmem a presença da doença como condição pré-neoplasica são insuficientes. Enquanto a endometriose exibe alguns aspectos de malignidade tais como aumento de cresci mento, vascularização e invasão tecidual, características tumorais como expansão monoclonal e anomalias genéticas, permanecem indefinidas. (Viganò et al. , 2006). Achados histológicos indicam uma associação entre endometriose e carcinoma de células claras de ovário e carcinoma endometrióide (Vercellini et al., 1993). Estima-se que 1% dos cas os de endometriose está re lacionado ao câncer, e que 88,4% dos casos de câncer relacionados à e ndometriose são carcinomas, enquanto apenas 11,6% são sarcomas (Heaps et al., 1990). Estudos experimentais em camundongos indicam os genes Pten e K-ras (v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog ) como envolvidos no desenvolvimento de endometriose e/ou carcino ma endometrióide ovariano (Dinulescu et al., 2005). TÉCNICAS DE DETECÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM ENDOMETRIOSE Alguns estudos visam detectar o perfil de expressão gênica diferencial em lesões endometrióticas, bem como nos tecidos eutópi cos de mulheres com e sem endometriose. Eyster e colaboradores ( 2002) usaram a técnica de microarray para comparar endométrio eutópico e implantes endometrióticos de três pacientes na fase proliferativa do ciclo menstrual, identificando genes do citoesque leto e com funções no sistema imune como diferencialmente expressos. Outra publicação comparou o perfil de expressão em endométrio eutópico de mulheres com e sem endometriose na fase s ecretora do ciclo menstrual, identificando moléculas como interleucinas (IL)-1 β e IL-G, TNF e VEGF como desreguladas na endometriose (Giudice et al. , 2001). Paralelamente a este trabalho, Kao e colaboradores compararam o endométrio eutópico de mulheres com e sem endometriose, mas na “janela de 12 implantação” (2003). Neste trabalho, os dados foram divididos em três grupos: grupo 1, onde os genes que são superexpressos normalmente na “janela de implantação” encontram-se menos expressos em mulheres com endometri ose; grupo 2, onde genes normalmente menos expressos têm expressão aumentada em mulheres com a doença; e grupo 3, onde genes menos expressos no tecido normal têm expressão aind a menor no tecido eutópi co das pacientes com endometriose. Outra publicação descreveu o perfil de expressão co mparando endometriose ovariana com tecido eutópico das mesmas pacientes nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual (Arimoto et al. , 2003). Matsuzaki e colaboradores (2005) compararam endométrio normal de mulheres sem endometr iose com lesões endometrióticas profundas também nas fases proliferativa e secretora. Esses trabalhos utilizaram a técnica de microarray de cDNA, o que representa um problema, pois os microarrays tipicamente usam chips comerciais fabricados com out ras finalidades que não estudos direcionados à doença em investigação (Bischoff e Simpson, 2004). Para lelamente, os genes analisados são pré- determinados, dificultando o screening completo e característico das lesões. Técnicas de screening que poderiam contornar este prob lema incluem as bibliotecas de SH ( Subtraction Hybridization ), as bibliotecas de SAGE ( Serial Analysis of Gene Expression), RDA ( Representational Difference Analysis ) entre outras (J iang e Fisher, 1993; Hubank e Schatz, 1994; Velculescu et al., 1995). As bibliotecas de hibridação subtrativa são bibliotecas de cDNAs deriva das de dois grupos celulares distintos, onde um deles é representado em excesso durante a hibridação subtrativa. Tal técnica permite isolar cDNAs que são representativos apenas de um dos dois grupos an alisados (Taylor et al. , 2002). A técnica de RaSH ( Rapid Subtraction Hybridization), descrita por Jiang e colaboradores (2000), é uma metodologia simplificada de hibridaç ão subtrativa, que consiste na digestão enzimática de cDNAs de dupla fita em pequ enos fragmentos, ligados a adaptadores e amplificados por PCR, seguido de incubação dos fragmentos de PCR tester com excesso de 13 fragmentos driver para hibridação e subtração. Hu e colaboradores (2006) usaram a metodologia de hibridação subtrativa para compar ar o perfil de expressã o gênica entre tecido ectópico de lesões peritoniais e tecido eutópico das mesmas mulheres nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual. Eles identific aram 14 possíveis candi datos com importante função na patogênese da endometriose. Mudanças na expressão gênica em dete rminado momento são determinantes em processos fisiológicos normais e anormais . Explicar os mecanismos relacionados à fisiopatologia complexa da endometriose, buscando esclarecer o perfil da expressão gênica e a função de genes envolvidos em tais fenômenos, permitiria elucidar o ambiente molecular das lesões endometrióticas. Futuramente, novos mar cadores moleculares podem ser identificados, permitindo um diagnóstico menos invasivo e possíveis terapêuticas. Neste trabalho, investigamos o perfil de expressão gênica diferencial entre lesões endometrióticas (peritoniais e ovarianas) e endométrio eutópico das mesmas pacientes, na fase proliferativa inicial do ciclo menstrual. O BJETIVOS 15 O objetivo principal deste trabalho é analisar a expressão gênica diferencial em lesões endometrióticas peritoniais e ovarianas e em tecido eutópico das mesmas pacientes, pela técnica de RaSH. Os objetivos intermediários foram: (1) analisar o perfil de expressão em lesões endometrióticas e em endométrio eutópico de pacientes com diagnóstico confirmado de endometriose; (2) identificar genes candidatos relacionados à fisiopatologia da doença; (3) comparar o padrão de expressão dos genes selecionados em lesões peritoniais e endometriomas ovarianos. M ATERIAL E MÉTODOS 17 Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Genética Molecular e Citogenética Molecular Humana, do Departamento de Genétic a da Faculdade de Me dicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-US P, Brasil), em colaboração com o serviço de Reprodução Humana do Departamento de Gine cologia e Obstetrícia da FMRP-USP, com o Grupo de Bioinformática da FMRP-USP, e com apoio dos laboratórios de Genética Molecular e Bioinformática da Fundação Hemocentro e de Oncologia Pediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura da FMRP-USP. O proj eto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital das Clínic as da FMRP-USP, processo HCRP n o 11736/2004 (Anexo A). Todas as pacientes pa rticipantes da pesquisa assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. CASUÍSTICA Foram selecionadas 28 pacientes, que preencher am os seguintes critérios de inclusão: pacientes em idade reprodutiva (18 a 40 anos), no início da fase proliferativa do ciclo menstrual (dias 5-8), apresentando ciclos mens truais regulares e sem história de uso de qualquer tipo de terapia hormonal nos últimos seis meses antes da coleta. O estadio da endometriose foi determinado de acordo com a classificação da American Society for Reproductive Medicine (American Society for Reproductive Medicine, 1997). As pacientes foram divididas em dois grupos: grupo controle, com onze pacientes sem diagnóstico de endometriose e/ou infertilidade, encaminhadas ao serviço pelo Ambulatório de Planejamento Familiar com indicação para la queadura tubária; grupo afetado, com dezessete pacientes com diagnóstico de endometriose, sendo que, dez pacientes foram encaminhadas ao serviço para laparoscopia pe lo Ambulatório de Dor Pélv ica e Endoscopia (AGDE) com indicação de dor pélvica, e sete foram encaminhadas pelo Ambulatório de Infertilidade Conjugal do HCFMRP-USP com indicação de infertilidade. 18 AMOSTRAS As biópsias de endométrio das pacientes do grupo controle (n=11) foram coletadas utilizando Cureta de Novak. As biópsias de endométrio eutópico (n= 17) e ectópico (n=17) das pacientes com diagnóstico de endometriose foram coletadas por laparoscopia. Das dezessete biópsias de endométrio ectópico, oito eram lesões peritoniai s (4 vermelhas e 4 negras), sendo quatro em estadio II, duas em estadio III e duas em estadio IV, e nove corresponderam a lesões ovarianas (endometrioma ovariano) em estadios III (2) e IV (7). A confirmação diagnóstica foi feita após análise histopatológica de toda s as amostras. As amostras foram armazenadas em freezer a -80 0C após tratamento com criopreservador Tissue-Teck® O.C.T. Compound (Sakura Finetek USA. Inc., Torrance, CA). ISOLAMENTO DO RNA TOTAL As amostras foram lavadas em so lução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na 2HPO4 1,11g/L; Na 2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH 2PO4 0,20g/L pH7,0) para retirar o criopreservador dos tecidos. Em seguida, extraiu-se R NA total (50mg de tecido) com TRIZOL ® Reagent (Invitrogen Life Technologies , Paisley,UK) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do RNA foi analisada por eletrofo rese. As concentrações de RNA total foram medidas em espectrofotômetro a densidade óptica de 260nm. O RNA permaneceu armazenado à -80 0C para procedimentos posteriores. RÁPIDA HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA DE CDNA (RASH) Os procedimentos da técnica de RaSH adotados neste trabalho seguiram a metodologia descrita por Jiang e colaboradores (2000). Foram construídas duas bibliotecas de hibridação subtrativa de cDNA denominadas de RHENDN e RHENEN. Na biblioteca 19 RHENDN, o tester é o cDNA obtido do pool de RNA do tecido eutópico, enquanto que, na RHENEN, utilizou-se o RNA do tecido ectópico como tester. Seis amostras pareadas foram escolhidas aleatoriamente para a construção das bibliotecas , sendo, seis de endométrio ectópico (3 lesões ovarianas e 3 peritoniais) e seis de endo métrio eutópico das mesmas pacientes. O protocolo está brevemente descrito abaixo: Síntese do cDNA A partir do pool de 25 µg de RNA total, utilizando mesma concentração de cada amostra, sintetizamos cDNAs de dupla fita utilizando 200U da enzima SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), 1x First Strand Buffer (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK), 200 µM de cada dNTP, e 0,5 µg de oligo(dT) 12- 18 (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK) , para síntese da primeira fita. Para a síntese da segunda fita, foram utilizados 10U de E. coli DNA ligase ( Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) e 40U de E. coli DNA Polymerase I ( Invitrogen), 2U de E.coli RNase H (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), 200 µM de cada dNTP, 1x Second Buffer (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK). O gene ACTB (actin beta) foi amplificado por PCR, a partir do cDNA sintetizado, para aval iar a qualidade da síntese. Os cDNAs foram extraídos por fenol/clorofórmio (1:1) e precipitado com etanol. Digestão Enzimática com MboI e Ligação dos Adaptadores Os cDNAs foram digeridos com 20U da enzima de restrição MboI ( Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK) por 1 hora a 37 0C, e em seguida extrairam- se os fragmentos pelo método fenol/clorofórmio (1:1), precipitados com etanol. Os fragmentos foram ligados com 20 µM dos adaptadores XDPN-14 - 5’ CTGATCACTCGAGA - 3’e XDPN-12- 5’GATC TCTCGAGT3’, usando 1x T4 DNA Ligase Buffer (Invitrogen Life Technologies , Paisley, 20 UK), 9U T4 DNA Ligase (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), e a mistura incubada a 140C overnight. PCR e Purificação dos Produtos Para checar a ligação aos ad aptadores e amplificar o cDNA digerido, este foi diluído com LoTE (3mM Tris-HCL, pH 7,5; 0,2 mM EDTA pH 7,5) ( Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), em um volume final de 100µL; e 2µL do cDNA foram amplificados com 10µM do primer XDPN-18 - 5’CTGATCACTCGAGAGATC3’ (complementar aos adaptadores), 1U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), 200 µM de cada dNTP, 1x Taq Buffer (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK). Foram realizadas 20 reações de PCR nestas condições, e em seguida os produtos foram misturados e purificados por fenol/clorofórmio e precipitados com etanol. Todos estes procedimentos foram realizados para o cDNA obtido do pool de RNA tanto do tecido eutópico como do tecido ectópico. Digestão do teste Foram digeridos 10 µg do tester (eutópico ou ectópico) com 20U da enzima XhoI (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) por 6h à 37 °C. O produto foi extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. Hibridação Subtrativa Na construção da biblioteca RHENDN, 100 ηg do tester (eutópico) foram misturados com 5 µg do driver (ectópico). Assim como na RHENEN, 100 ηg do tester (ectópico) foram misturados com 5µg do driver (eutópico). Foram ad icionados à mistura tester/driver, 16,6 µl da Solução de Hibridação (0,5M de NaCl; 50mM de Tris/HCl; SDS 0,2%; formamida 40%). 21 Após denaturação a 100 0C por 5 minutos, a solução foi incubada a 42 0C por 48 h. Em seguida, a mistura da hibridação foi extraída por fenol/clorofórmio, precipitada com etanol e diluída em LoTE. Ligação ao plasmídeo pZErO® -1 e Transformação Bacteriana Três microlitros da solução de hibridação foram ligados à 1 µg do plasmídeo pZErO ® - 1 ( Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), previamente digerido com a enzima de restrição XhoI, e a soluçnao incubada a 16 0C por 3 horas. Em seguida, realizamos a eletroporação a 2,5 V, 25 µFD e 200 OHMS para transformação das bactérias competentes One Shot® Top 10 Eletrocomp ™ E. coli (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) com 2 µL dos plasmídeos recombinantes. Screening das Colônias e Análise por Seqüenciamento As colônias foram randomicamente seleci onadas e amplificadas por PCR com os primers M13 forward - 5’CATTTTGCTGCCGGTC3’ e M13 reverse – 5’CAGGAAACAGCTATGACC3’ para a confir mação do inserto. Após confirmação, o produto foi seqüenciado no MegaBaceTM 1000 (Amesham Biosciences, Piscataway, NJ, USA ) utilizando DYEnamic ET Dye Terminator Sequencing Kit ( Amesham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), segundo as normas do fornecedor. ANÁLISES POR BIOINFORMÁTICA As seqüências obtidas foram analisadas pelos softwares Phred (Ewing et al. , 1998; Ewing e Green, 1998) e Phrap (Green, 1996) utilizando os seguintes padrões: phred cutoff de 0,09, cross_match versão 0,990319, minmatch 10, minscore 20; e foram aceitas seqüências com o mínimo de 100pb com qualidade. Após estas análises, as se qüências de melhor 22 qualidade foram submetidas ao programa de alinhamento blast (Altschul et al., 1990). Estas comparações foram feitas contra os bancos de dados: do genoma mitocondrial humano (blastn, evalue=1e-05), genoma de bactérias ( blastn, evalue=1e -30), seqüências do fungo Saccharomyces ( blastn, evalue=1e-30), proteínas ribossomais ( blastx, evalue=1e-30), RefSeq humano (blastn, evalue=1e-30), seqüências do UniGene (blastn, evalue=1e-25), ESTs humanas (blastn, evalue=1e-20), nr humano ( blastx, evalue=1e-20), e nr não humano ( blastx, evalue=1e- 15 ). A partir dos resultados do blast, apenas com o banco obtido de RefSeq, (seqüências de referência) foram selecionadas as seqüências que no alinhamento apresentavam no mínimo 90% do comprimento da seqüência alvo. Devido ao critério de seleção adotado, os genes selecionados do blast podem ser considerados homólogos às seqüências encontradas nas bibliotecas. Assim, estes genes foram categorizados quanto suas funções em processos biológicos, função molecular e component e celular de acordo com os termos do Gene Ontology (GO) (http://www.geneontology.org). Além disso, para encontrar associações fe itas entre dados na literatura sobre endometriose e os genes obtidos nas bibliotecas, usamos o programa de busca de acesso público PDQ wizard v.0.1 Searching PubMed (Grimes et al. , 2006) disponível on line (http://www.gti.ed.ac.uk/pdqwizard ). VALIDAÇÃO DOS DADOS DA RASH POR PCR EM TEMPO REAL Para validar os dados de expressão gênica diferencial obtidos pela metodologia de hibridação subtrativa de cDNA, ap licamos a técnica de PCR em tempo real para seis genes. Para a seleção dos genes consideramos: quantas vezes suas seqüências foram obtidas, e sua função relacionada à etiologia da do ença. Os genes selecionados foram: SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich – 10 vezes) e CTGF (connective tissue growth factor – 7 vezes) 23 encontrados como superexpressos no endométrio ectópico; e os genes PAEP (progestagen- associated endometrial protein – 126 vezes) , IGFBP1 (insulin-like growth factor binding protein 1 – 6 vezes) , MMP3 (matrix metallopeptidase 3 – 23 vezes) e MYC (v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog – 2 vezes) encontrados como menos expressos no endométrio ectópico. Um micrograma de RNA total de cada amos tra foi transcrito reversamente usando o High Capacity cDNA Archive Kit (A pplied Biosystems, Warrington, UK) segundo as instruções do fabricante. Das 45 amostras totais coletadas, 44 (10 de endométrio controle, 17 de tecidos eutópicos e 17 de t ecidos ectópicos) foram analisadas para a quantificação relativa da expressão dos genes selecionados no aparelho ABI PRISM TM 7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Warrington, UK). Uma das amostras de endométrio controle foi escolhida aleatoriamente como calibrador da reação. As reações foram executadas utilizando o sistema TaqMan® Gene Expression Assays (TaqMan® MGB probes, FAM™ dye-labeled) da Applied Biosystems . As sondas e os primers para os genes PAEP (Hs01046125_m1), CTGF (Hs00170014_m1), IGFBP1 (Hs00236877_m1), MMP3 (Hs00968308_m1), SPARC (Hs00277762_m1), MYC (Hs00153408_m1) e GAPDH (g lyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase) (Hs99999905_m1, controle endógeno) foram obtidos usando Assay-on- Demand™ Gene Expression Products (App lied Biosystems, Warrington, UK) . Para testar a eficiência das sondas e primers na reação de amplificação dos genes foram construídas curvas de calibração a partir de dilu ições seriadas (não diluído, 10 -1, 10-2 e 10 -3), em triplicata, do cDNA obtido por pool de quantidades iguais de todas as amostras. A curva-padrão foi construída a partir da curva de calibraçã o. Foram consideradas as curvas-padrão com slope entre -3,6 e -3,1. As figuras 1 e 2 representam, respectivamente, a curva de calibração e curva- padrão construídas para o gene MMP3. 24 A PCR em tempo real foi realizada para cada amostra em duplicata seguindo as seguintes condições: 10 µL do TaqMan® Universal PCR Master Mix (2x) ( Applied Biosystems, Warrington, UK), 1 µL do TaqMan® Gene Expression Assay Mix (20X) (Applied Biosystems, Warrington, UK) e 9 µL de cDNA diluído (diluição de 1/50) em volume final de 2 0µL reação. As condições da reação foram 50º C por 2 minutos, então 95ºC por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. O nível de expressão para os genes anal isados foi calculado para cada amostra de acordo com o método de 2 -∆∆CT (ou 2-Ct), descrito previamente no Applied Biosystems User Bulletin # 2 (PN 4303859) ( Applied Biosystems, Warrington, UK ) e citado na literatura (Schmittgen et al., 2000; Livak and Schmittgen, 2001). O GAPDH (controle endógeno) e o calibrador foram usados como normalizadores para os cálculos do 2-∆∆CT. 25 Figura 1: Curva de calibração para o gene MMP3. Foi colocada a fluorescência da amplificação versus o número de ciclos da PCR. Fonte: ABI PRISM TM 7500 Sequence Detection Systems ( Applied Biosystems, Warrington, UK). Figura 2: Curva-padrão do gene MMP3 indicando um slope de – 3,1. Fonte: ABI PRISM TM 7500 Sequence Detection Systems ( Applied Biosystems, Warrington, UK). 26 ANÁLISE ESTATÍSTICA A variável expressão gênica foi transformada pelo log 10. A transformação logarítmica foi necessária, pois não foi atendida uma das suposições (linearidade) feitas em análises empregando-se os modelos lineares. Estas an álises especificam que a média condicional E(y⏐x = x 0) da variável resposta y dado o valor x 0 do vetor preditor x, é linear em x 0. A aplicação dos modelos lineares pode ser es tendida supondo-se que uma transformação apropriada da variável respos ta dada por t(y), em que E {t(y)⏐x}, seja linear em x, na função t(y) = β0 + βTx + ε, para β0 e βT desconhecidos. O termo ε (erro aleatório) é independente de x e tem média zero (Cook and Weisberg, 1994). As análises estatísticas foram realizadas no software SAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Aplicamos o Teste T não pareado para comparar as médias de expressão dos genes obtidas entre: (1) endométri o controle de mulheres sem endometriose e endométrio eutópico de mulheres com endome triose, e (2) tecido ectópico peritonial e ectópico ovariano. Usou-se o Teste de T pareado para comparar as médias de expressão dos genes obtidas entre: (3) tecido eutópico e ectópico (lesões peritoniais + endometrioma ovariano), (4) tecido eutópico e ectópico de pa cientes com lesões peritoniais, e (5) tecido eutópico e ectópico de pacientes com lesões ovarianas. T odos os testes foram realizados conforme os procedimentos GLM. Além disso, foram feitas análises de correlação pelo PROC CORR entre os níveis de expressão gênica obtid os nos tecidos ectópicos com o estadiamento das lesões. Análises com P < 0,05 foram consideradas significantes. R ESULTADOS 28 BIBLIOTECAS DE HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA DE CDNA (RASH) Após a confecção das bibliotecas, 768 cl ones foram obtidos para a biblioteca RHENDN, dos quais 627 eram seqüências de qualidade, categorizadas como: mitocondrial (176), EST do fungo Saccharomyces (0), UniGene (4), outros não redundantes (1), ribossomal (16), EST Humano (8), bactérias (2) (dados sumarizados tabela I - Anexo B), e RefSeq (420). Já para a RHENEN, obteve-se 1056 clones, dos quais 712 tinham qualidade e foram classificadas como: mitocondrial (39), EST do fungo Saccharomyces (3), UniGene (21), outros não redundantes (1 ), ribossomal (136), EST Humano (18), bactérias (4) (dados sumarizados na tabela I - Anexo B), e RefSeq (490). As seqüências listadas como mitocondrial, EST do fungo Saccharomyces, bactérias, e outros não redundantes foram consideradas como contaminantes. Das 910 RefSeq, 109 foram excluídas das análises como falso-positivas (tabela II - Anexo C), pois apareceram em ambas as bi bliotecas. Assim, após a seleção das RefSeq que apresentaram no mínimo 90% de homol ogia com a seqüência alvo do alinhamento, permaneceram: 345 RefSeq para a biblioteca RHENDN e 380 para a RHENEN. Estas seqüências estão sumarizadas na tabela III (aba ixo), que representa os genes superexpressos e os menos expressos no tecido ectópico co mparado com o eutópico de mulheres com endometriose. 29 Tabela III: Estão representados abaixo os genes superexpressos e menos expressos no tecido ectópico em relação ao eutópico de m ulheres com endometriose, localização cromossômica, alterações cromossômicas e referências relacionadas à endometriose. GENES SUPEREXPRESSOS N◦ Acesso Descrição Símbolo Número de Seqüências Localização Cromossômica Alterações Genomicas CGH (Gogusev et al., 1999; Gogusev et al., 2000) Referencias Genes x Endometriose NM_015381 family with sequence similarity 19 (chemokine (C-C motif)-like), member A5 FAM19A5 1 22q13.32 NM_013349 neuron derived neurotrophic factor NENF 1 1q32.3 Ganho 1q NM_153005 RIO kinase 1 (yeast) RIOK1 1 6p24.3 Ganho 6p NM_002510 glycoprotein (transmembrane) nmb GPNMB 1 7p15 NM_005973 papillary renal cell carcinoma (translocation- associated) PRCC 1 1q21.1 Ganho 1q NM_000671 alcohol dehydrogenase 5 (class III), chi polypeptide (ADH5) ADH5 1 4q21-q25 NM_004899 brain and reproductive organ-expressed (TNFRSF1A modulator) BRE 2 2p23.2 NM_019054 family with sequence similarity 35, member A FAM35A 1 10q23.2 NM_015393 DKFZP564O0823 protein DKFZP564O0823 1 4q13.3-q21.3 Continua 30 Continuação NM_001008215 hypothetical protein MGC52110 MGC52110 1 2q11.2 NM_006886 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, epsilon subunit ATP5E 1 20q13.32 NM_001012506 coiled-coil domain containing 66 CCDC66 1 3p14.3 NM_001011655 transmembrane protein 44 TMEM44 1 3q29 NM_018255 elongation protein 2 homolog (S. cerevisiae) ELP2 1 18q12.2 NM_014188 SSU72 RNA polymerase II CTD phosphatase homolog (S. cerevisiae) SSU72 1 1p36.33 NM_001037163 hypothetical protein LOC84792 MGC12966 1 7p22.1 NM_006493 ceroid-lipofuscinosis, neuronal 5 CLN5 1 13q21.1-q32 Montagna et al., 2007. NM_005578 LIM domain containing preferred translocation partner in lipoma LPP 1 3q28 NM_006572 guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 13 GNA13 1 17q24.3 Ganho 17q NM_005114 heparan sulfate (glucosamine) 3-O- sulfotransferase 1 HS3ST1 1 4p16 NM_001039591 ubiquitin specific peptidase 9, X-linked USP9X 1 Xp11.4 NM_006196 poly(rC) binding protein 1 PCBP1 1 2p13-p12 NM_170740 aldehyde dehydrogenase 5 family, member A1 (succinate-semialdehyde dehydrogenase) ALDH5A1 1 6p22.2-p22.3 Ganho 6p NM_012420 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 5 IFIT5 1 10q23.31 NM_001032383 polyglutamine binding protein 1 PQBP1 1 Xp11.23 NM_014924 KIAA0831 KIAA0831 1 14q22.3 NM_002165 inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein ID1 1 20q11 31 Continuação NM_022484 transmembrane protein 168 TMEM168 1 7q31.32 Ganho 7q NM_015932 proteasome maturation protein POMP 1 13q12.3 NM_003014 secreted frizzled-related protein 4 SFRP4 1 7p14.1 NM_020122 potassium channel modulatory factor 1 KCMF1 1 2p11.2 NM_203330 CD59 molecule, complement regulatory protein CD59 1 11p13 NM_182810 activating transcription factor 4 (tax-responsive enhancer element B67) ATF4 1 22q13.1 NM_001386 dihydropyrimidinase-like 2 DPYSL2 1 8p22-p21 NM_138786 transmembrane 4 L six family member 18 TM4SF18 1 3q25.1 NM_021999 integral membrane protein 2B ITM2B 1 13q14.3 NM_012072 CD93 molecule CD93 1 20p11.21 NM_002795 proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 3 PSMB3 1 17q12 Ganho 17q NM_000712 biliverdin reductase A BLVRA 1 7p14-cen NM_001007224 GTPase, IMAP family member 6 GIMAP6 1 7q36.1 Ganho 7q NM_033429 calmodulin-like 4 CALML4 1 15q23 NM_015972 polymerase (RNA) I polypeptide D, 16kDa POLR1D 1 13q12.2 NM_003375 voltage-dependent anion channel 2 VDAC2 1 10q22 NM_015190 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 9 DNAJC9 1 10q22.2 NM_002970 spermidine/spermine N1-acetyltransferase SAT1 1 Xp22.1 32 Continuação NM_001025368 vascular endothelial growth factor A VEGFA 1 6p12 Ganho 6p García-Manero et al., 2007. NM_015483 kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 2 KBTBD2 1 7p14.3 NM_017747 ankyrin repeat and KH domain containing 1 ANKHD1 1 5q31.3 NM_014267 chromosome 11 open reading frame 58 C11orf58 1 11p15.1 NM_007236 calcium binding protein P22 CHP 1 15q13.3 NM_001031684 splicing factor, arginine/serine-rich 7, 35kDa SFRS7 1 2p22.1 NM_016085 chromosome 2 open reading frame 28 C2orf28 1 2p23.3 NM_003302 thyroid hormone receptor interactor 6 TRIP6 1 7q22 Ganho 7q NM_020121 UDP-glucose ceramide glucosyltransferase-like 2 UGCGL2 1 13q32.1 NM_004568 serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 6 SERPINB6 1 6p25 Ganho 6p NM_003994 KIT ligand KITLG 1 12q22 Osuga et al., 2000. NM_003336 ubiquitin-conjugating enzyme E2A (RAD6 homolog) UBE2A 1 Xq24-q25 NM_000466 peroxisome biogenesis factor 1 PEX1 1 7q21.2 Ganho 7q NM_002078 golgi autoantigen, golgin subfamily a, 4 GOLGA4 1 3p22-p21.3 NM_006694 jumping translocation breakpoint JTB 1 1q21 Ganho 1q NM_002399 Meis homeobox MEIS2 1 15q14 NM_016282 adenylate kinase 3 AK3 1 9p24.1-p24.3 NM_000019 Homo sapiens acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 1 ACAT1 1 11q22.3-q23.1 33 Continuação NM_005803 flotillin 1 FLOT1 1 6p21.3 Ganho 6p NM_002484 nucleotide binding protein 1 (MinD homolog, E. coli) NUBP1 1 16p13.13 NM_004938 death-associated protein kinase 1 DAPK1 1 9q34.1 NM_016299 heat shock 70kDa protein 14 HSPA14 1 10p13 NM_001967 eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 2 EIF4A2 1 3q28 NM_001539 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 1 DNAJA1 1 9p13-p12 NM_000107 damage-specific DNA binding protein 2, 48kDa DDB2 1 11p12-p11 NM_000184 hemoglobin, gamma G HBG2 1 11p15.5 NM_198530 matrix-remodelling associated 7 MXRA7 1 17q25.1-q25.2 Ganho 17q NM_001514 general transcription factor IIB GTF2B 1 1p22-p21 NM_003199 transcription factor 4 TCF4 1 18q21.1 NM_005066 splicing factor proline/glutamine-rich (polypyrimidine tract binding protein associated) SFPQ 1 1p34.3 NM_006636 methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+ dependent) 2, methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase MTHFD2 1 2p13.1 NM_001001522 transgelin TAGLN 1 11q23.2 Kyama et al., 2006 NM_018222 parvin, alpha PARVA 1 11p15.3 NM_000378 Wilms tumor 1 WT1 1 11p13 Matsuzaki et al., 2006. NM_016107 zinc finger RNA binding protein ZFR 1 5p13.3 34 Continuação NM_018025 G patch domain containing 1 GPATCH1 1 19q13.11 NM_006169 nicotinamide N-methyltransferase NNMT 1 11q23.1 NM_006324 craniofacial development protein 1 CFDP1 1 16q22.2-q22.3 NM_020154 chromosome 15 open reading frame 24 C15orf24 1 15q14 NM_019048 asparagine synthetase domain containing 1 ASNSD1 1 2p24.3-q21.3 XM_943856 PREDICTED: hypothetical protein LOC648185, transcript variant 1 LOC648186 1 NM_020532 reticulon 4 RTN4 1 2p16.3 NM_001031700 chromosome 4 open reading frame 18 C4orf18 1 4q32.1 NM_152280 synaptotagmin XI SYT11 1 1q21.2 Ganho 1q NM_001204 bone morphogenetic protein receptor, type II (serine/threonine kinase) BMPR2 1 2q33-q34 NM_032784 R-spondin 3 homolog (Xenopus laevis) RSPO3 1 6q22.33 Ganho 6q NM_001568 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 6 48kDa EIF3S6 1 8q22-q23 NM_014236 glyceronephosphate O-acyltransferase GNPAT 1 1q42 Ganho 1q NM_001293 chloride channel, nucleotide-sensitive, 1A CLNS1A 1 11q13.5-q14 NM_004162 RAB5A, member RAS oncogene family RAB5A 1 3p24-p22 NM_002696 polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide G POLR2G 1 11q13.1 NM_053025 myosin, light chain kinase MYLK 1 3q21 NM_022488 ATG3 autophagy related 3 homolog (S. cerevisiae) ATG3 1 3q13.2 35 Continuação NM_002667 phospholamban PLN 1 6q22.1 Ganho 6q NM_002222 inositol 1,4,5-triphosphate receptor, type 1 ITPR1 1 3p26-p25 NM_004277 solute carrier family 25, member 27 SLC25A27 1 6p11.2-q12 Ganho 6p NM_017599 vezatin, adherens junctions transmembrane protein VEZT 1 12q22 NM_001025079 CD47 molecule CD47 1 3q13.1-q13.2 NM_017680 asporin ASPN 1 9q22 NM_002072 guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide GNAQ 1 9q21 NM_003349 ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1 Kua-UEV 1 20q13.2 NM_001037637 basic transcription factor 3 BTF3 1 5q13.2 NM_005084 phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma) PLA2G7 1 6p21.2-p12 Ganho 6p NM_182490 zinc finger protein 227 ZNF227 1 19q13.32 NM_022059 chemokine (C-X-C motif) ligand 16 CXCL16 1 17p13 NM_002300 lactate dehydrogenase B LDHB 1 12p12.2-p12.1 NM_020313 cytokine induced apoptosis inhibitor 1 CIAPIN1 1 16q13-q21 NM_016047 splicing factor 3B, 14 kDa subunit SF3B14 1 2pter-p25.1 NM_198178 microphthalmia-associated transcription factor MITF 1 3p14.2-p14.1 NM_199189 matrin 3 MATR3 1 5q31.2 NM_001020658 pumilio homolog 1 (Drosophila) PUM1 1 1p35.2 36 Continuação NM_153000 adenomatosis polyposis coli down-regulated 1 APCDD1 1 18p11.22 NM_001015881 TSC22 domain family, member 3 TSC22D3 1 Xq22.3 NM_006003 ubiquinol-cytochrome c reductase, Rieske iron- sulfur polypeptide 1 UQCRFS1 1 19q12-q13.1 NM_001031713 chromosome 6 open reading frame 79 CCDC90A 1 6p24.3-p23 Ganho 6p NM_001839 calponin 3, acidic CNN3 1 1p22-p21 NM_001039367 ATPase, H+ transporting, lysosomal 31kDa, V1 subunit E1 ATP6V1E1 1 22q11.1 NM_001008897 t-complex 1 TCP1 2 6q25.3-q26 Ganho 6q NM_015291 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 16 DNAJC16 2 1p36.1 NM_006197 pericentriolar material 1 PCM1 2 8p22-p21.3 NM_206839 mortality factor 4 like 1 MORF4L1 2 15q24 XM_942776 PREDICTED: synaptopodin 2, transcript variant 3 SYNPO2 2 NM_016091 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 6 interacting protein EIF3S6IP 2 22q NM_006628 cyclic AMP phosphoprotein, 19 kD ARPP-19 2 15q21.2 NM_138290 Rap2-binding protein 9 RPIB9 2 7q21.12 Ganho 7q NM_198467 round spermatid basic protein 1-like RSBN1L 2 7q11.23 Ganho 7q NM_003850 succinate-CoA ligase, ADP-forming, beta subunit SUCLA2 2 13q12.2-q13.3 NM_001748 calpain 2, (m/II) large subunit CAPN2 2 1q41-q42 Ganho 1q NM_002264 karyopherin alpha 1 (importin alpha 5) KPNA1 2 3q21 37 Continuação NM_002023 fibromodulin FMOD 2 1q32 Ganho 1q NM_018374 transmembrane protein 106B TMEM106B 2 7p21.3 NM_013236 ataxin 10 ATXN10 2 22q13.31 NR_001564 X (inactive)-specific transcript XIST 2 Xq13.2 NM_004990 methionine-tRNA synthetase MARS 2 12q13.2 NM_000454 superoxide dismutase 1, soluble (amyotrophic lateral sclerosis 1 (adult) (SOD1) SOD1 2 21q22.11 NM_001001395 LIM domain only 3 (rhombotin-like 2) LMO3 2 12p12.3 NM_001039618 CREB/ATF bZIP transcription factor CREBZF 2 11q14 NM_007168 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 8 ABCA8 2 17q24 Ganho 17q NM_000177 gelsolin (amyloidosis, Finnish type) GSN 2 9q33 NM_002738 protein kinase C, beta 1 PRKCB1 2 16p11.2 NM_013448 bromodomain adjacent to zinc finger domain, 1A BAZ1A 2 14q12-q13 NM_173473 chromosome 10 open reading frame 104 C10orf104 2 10q22.1 NM_213674 tropomyosin 2 (beta) TPM2 2 9p13.2-p13.1 NM_013254 TANK-binding kinase 1 TBK1 2 12q14.1 NM_005506 scavenger receptor class B, member 2 SCARB2 2 4q21.1 NM_001031679 methionine sulfoxide reductase B3 MSRB3 2 12q14.3 NM_199511 coiled-coil domain containing 80 CCDC80 2 3q13.2 38 Continuação NM_013234 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 12 EIF3S12 2 19q13.2 NM_020338 zinc finger, MIZ-type containing 1 ZMIZ1 2 10q22.3 NM_138957 mitogen-activated protein kinase 1 MAPK1 2 22q11.21 XM_371853 PREDICTED: similar to 60S ribosomal protein L27a LOC389435 2 NM_001615 actin, gamma 2, smooth muscle, enteric ACTG2 2 2p13.1 NM_001001894 tetratricopeptide repeat domain 3 TTC3 3 21q22.2 NM_005724 tetraspanin 3 TSPAN3 3 15q24.3 NM_206876 protein phosphatase 1, catalytic subunit, beta isoform PPP1CB 3 2p23 NM_015375 receptor interacting protein kinase 5 RIPK5 3 1q32.1 Ganho 1q NM_000943 peptidylprolyl isomerase C (cyclophilin C) PPIC 3 5q23.2 NM_000700 annexin A1 ANXA1 3 9q12-q21.2 NM_002802 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, ATPase, 1 PSMC1 3 14q32.11 NM_014585 solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1 SLC40A1 3 2q32 NM_000426 laminin, alpha 2 (merosin, congenital muscular dystrophy) LAMA2 3 6q22-q23 Ganho 6q NM_006513 seryl-tRNA synthetase SARS 3 1p13.3-p13.1 NM_014367 chromsome 3 open reading frame 28 C3orf28 3 3q21.1 NM_003756 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 3 gamma, 40kDa EIF3S3 3 8q24.11 NM_004684 SPARC-like 1 (mast9, hevin) SPARCL1 4 4q22.1 39 Continuação NM_004064 cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1) CDKN1B 4 12p13.1-p12 Matsuzaki et al., 2001. NM_012134 leiomodin 1 (smooth muscle) LMOD1 4 1q32 Ganho 1q NM_002345 lumican LUM 4 12q21.3-q22 NM_001780 CD63 molecule CD63 4 12q12-q13 NM_022138 SPARC related modular calcium binding 2 SMOC2 4 6q27 Ganho 6q NM_201442 complement component 1, s subcomponent C1S 4 12p13 NM_001743 calmodulin 2 (phosphorylase kinase, delta) CALM2 4 2p21 NM_006360 PCI domain containing 1 (herpesvirus entry mediator) PCID1 4 11p13 NM_003295 tumor protein, translationally-controlled 1 TPT1 4 13q12-q14 NM_002166 inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein ID2 5 2p25 NM_004048 beta-2-microglobulin B2M 5 15q21-q22.2 Somigliana et al., 2001. NM_201348 proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein PRELP 5 1q32 Ganho 1q NM_001018020 tropomyosin 1 (alpha) TPM1 5 15q22.1 NM_004537 nucleosome assembly protein 1-like 1 NAP1L1 5 12q21.2 NM_003333 ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1 UBA52 6 19p13.1-p12 NM_014624 S100 calcium binding protein A6 S100A6 7 1q21 Ganho 1q NM_001901 connective tissue growth factor CTGF 7 6q23.1 Ganho 6q Flores et al., 2007. NM_006098 guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1 GNB2L1 9 5q35.3 40 Continuação NM_003118 secreted protein, aci dic, cysteine-rich (osteonectin) SPARC 10 5q31.3-q32 NM_033138 caldesmon 1 CALD1 17 7q33 Ganho 7q NM_001613 actin, alpha 2, smooth muscle, aorta ACTA2 29 10q23.3 380 GENES MENOS EXPRESSOS N◦ Acesso Descrição Simbolos Número de Seqüências Localização Cromossomica Alterações Genomicas CGH (Gogusev et al., 1999; Gogusev et al., 2000) Referencias Genes x Endometriose NM_032940 polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide C, 33kDa POLR2C 1 16q13-q21 NM_181472 CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 7 CMTM7 1 3p22.3 NM_002568 poly(A) binding protein, cytoplasmic 1 PABPC1 1 8q22.2-q23 NM_014300 SEC11-like 1 (S. cerevisiae) SEC11A 1 15q25.3 NM_018509 leucine rich repeat containing 59 LRRC59 1 17q21.33 NM_015330 SPECC1-like SPECC1L 1 22q11.23 Perda 22q NM_080821 chromosome 20 open reading frame 108 C20orf108 1 20q13.2 NM_001014795 integrin-linked kinase ILK 1 11p15.5-p15.4 NM_005907 mannosidase, alpha, class 1A, member 1 MAN1A1 1 6q22 XM_934318 PREDICTED: similar to eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 8 LOC653352 1 41 Continuação NM_012426 splicing factor 3b, subunit 3, 130kDa SF3B3 1 16q22.1 NM_001002292 G protein-coupled receptor 177 GPR177 1 1p31.3 Perda 1p NM_144570 chromosome 16 open reading frame 34 HN1L 1 16p13.3 NM_006601 prostaglandin E synthase 3 (cytosolic) PTGES3 1 12q13.3 NM_004047 ATPase, H+ transporting, lysosomal 21kDa, V0 subunit b ATP6V0B 1 1p32.3 Perda 1p NM_000715 complement component 4 binding protein, alpha C4BPA 1 1q32 NM_006022 TSC22 domain family, member 1 TSC22D1 1 13q14 NM_207307 chromosome 3 open reading frame 25 C3orf25 1 3q21.3 NM_002423 matrix metalloproteinase 7 (matrilysin, uterine) MMP7 1 11q21-q22 Bruner-Tran et al., 2006. NM_003754 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 5 epsilon, 47kDa EIF3S5 1 11p15.4 NM_001797 cadherin 11, type 2, OB-cadherin (osteoblast) CDH11 1 16q22.1 NM_014064 chromosome 9 open reading frame 32 C9orf32 1 9q34.11 Perda 9q NM_014306 chromosome 22 open reading frame 28 C22orf28 1 22q12 Perda 22q NM_001005335 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L HNRPL 1 19q13.2 NM_175932 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 13 PSMD13 1 11p15.5 NM_001428 enolase 1, (alpha) ENO1 1 1p36.3-p36.2 Perda 1p NM_030767 AT-hook transcription factor AKNA 1 9q32 Perda 9q NM_145729 mitochondrial ribosomal protein L24 MRPL24 1 1q21-q22 NM_003720 Down syndrome critical region gene 2 DSCR2 1 21q22.3 42 Continuação NM_022075 LAG1 homolog, ceramide synthase 2 (S. cerevisiae) LASS2 1 1q21.2 NM_002950 ribophorin I RPN1 1 3q21.3 NM_000088 collagen, type I, alpha 1 COL1A1 1 17q21.33 NM_003564 transgelin 2 TAGLN2 1 1q21-q25 NM_001012663 solute carrier family 3 (activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2 SLC3A2 1 11q13 NM_003580 neutral sphingomyelinase (N-SMase) activation associated factor NSMAF 1 8q12-q13 NM_022762 required for meiotic nuclear division 5 homolog B (S. cerevisiae) RMND5B 1 5q35.3 NM_019894 transmembrane protease, serine 4 TMPRSS4 1 11q23.3 NM_001001998 exosome component 10 EXOSC10 1 1p36.22 Perda 1p NM_000942 peptidylprolyl isomerase B (cyclophilin B) PPIB 1 15q21-q22 NM_198334 glucosidase, alpha; neutral AB GANAB 1 11q12.3 NM_001017402 laminin, beta 3 LAMB3 1 1q32 NM_021729 vacuolar protein sorting 11 homolog (S. cerevisiae) VPS11 1 11q23 NM_015070 zinc finger CCCH-type containing 13 ZC3H13 1 13q14.12 NM_031457 membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 8B MS4A8B 1 11q12.2 NM_002117 major histocompatibility complex, class I, C HLA-C 1 6p21.3 Kusume et al., 2005. NM_000597 insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa IGFBP2 1 2q33-q34 Tang et al., 1994. NM_005204 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 MAP3K8 1 10p11.23 NM_004078 cysteine and glycine-rich protein 1 CSRP1 1 1q32 43 Continuação NM_004394 death-associated protein DAP 1 5p15.2 NM_173728 Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 15 ARHGEF15 1 17p13.1 NM_001669 arylsulfatase D ARSD 2 Xp22.3 NM_005168 Rho family GTPase 3 RND3 2 2q23.3 NM_000362 TIMP metallopeptidase inhibitor 3 (Sorsby fundus dystrophy, pseudoinflammatory) TIMP3 2 22q12.3 Perda 22q NM_006816 lectin, mannose-binding 2 LMAN2 2 5q35.3 NM_016057 coatomer protein complex, subunit zeta 1 COPZ1 2 12q13.2-q13.3 NM_001733 complement component 1, r subcomponent C1R 2 12p13 NM_152927 copine I CPNE1 2 20q11.22 NM_003321 Tu translation elongation factor, mitochondrial TUFM 2 16p11.2 NM_006801 KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) endoplasmic reticulum protein retention receptor 1 KDELR1 2 19q13.3 NM_004356 CD81 molecule CD81 2 11p15.5 NM_000358 transforming growth factor, beta-induced, 68kDa TGFBI 2 5q31 Arimoto et al., 2003. NM_003355 uncoupling protein 2 (mitochondrial, proton carrier) UCP2 2 11q13 NM_002467 v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) MYC 2 8q24.21 Johnson et al., 2005. NM_006701 thioredoxin-like 4A TXNL4A 2 18q23 NM_052886 mal, T-cell differentiation protein 2 MAL2 2 8q23 NM_014764 DAZ associated protein 2 DAZAP2 2 12q12 44 Continuação NM_015343 dullard homolog (Xenopus laevis) DULLARD 2 17p13 XM_932704 PREDICTED: similar to 60S ribosomal protein L29 (Cell surface heparin binding protein HIP) LOC643433 1 NM_016395 protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 1 PTPLAD1 2 15q22.2 NM_001540 heat shock 27kDa protein 1 HSPB1 2 7q11.23 El-Ghobashy et al., 2005 NM_004285 hexose-6-phosphate dehydrogenase (glucose 1- dehydrogenase) H6PD 1 1p36 Perda 1p NM_001034850 family with sequence similarity 134, member B FAM134B 1 5p15.1 NM_005347 heat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated protein, 78kDa) HSPA5 2 9q33-q34.1 Perda 9q NM_014372 ring finger protein 11 RNF11 2 1pter-p22.1 Perda 1p NM_177967 UBA domain containing 2 UBAC2 2 13q32.3 NM_015331 nicastrin NCSTN 2 1q22-q23 NM_001349 aspartyl-tRNA synthetase DARS 2 2q21.3 NM_001001481 ubiquitin-conjugating enzyme E2W (putative) UBE2W 2 8q21.11 NM_002425 matrix metallopeptidase 10 (stromelysin 2) MMP10 2 11q22.3 NM_001469 X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6 (Ku autoantigen, 70kDa) XRCC6 2 22q13.2- q13.31 Perda 22q NM_007355 heat shock protein 90kDa alpha (cytosolic), class B member 1 HSP90AB1 3 6p12 NM_057164 collagen, type VI, alpha 3 COL6A3 3 2q37 NM_005040 prolylcarboxypeptidase (angiotensinase C) PRCP 3 11q14 NM_003128 spectrin, beta, non-erythrocytic 1 SPTBN1 3 2p21 45 Continuação NM_005727 tetraspanin 1 TSPAN1 3 1p34.1 Perda 1p NM_002797 proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 5 PSMB5 3 14q11.2 NM_006732 FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B FOSB 2 19q13.32 NM_020130 chromosome 8 open reading frame 4 C8orf4 3 8p11.2 NM_001940 atrophin 1 ATN1 3 12p13.31 NM_014713 lysosomal-associated pr otein transmembrane 4 alpha LAPTM4A 3 2p24.1 NM_001101 Homo sapiens actin, beta ACTB 4 7p15-p12 NM_002087 granulin GRN 3 17q21.32 NM_014679 centrosomal protein 57kDa CEP57 1 11q21 NM_175744 ras homolog gene family, member C RHOC 4 1p13.1 Perda 1p NM_005566 lactate dehydrogenase A LDHA 4 11p15.4 NM_001002235 serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1 SERPINA1 6 14q32.1 NM_000596 insulin-like growth factor binding protein 1 IGFBP1 6 7p13-p12 Klemmt et al., 2006 NM_001961 eukaryotic translation elongation factor 2 EEF2 7 19pter-q12 NM_002422 matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase) MMP3 23 11q22.3 Uzan et al., 2004 NM_000518 hemoglobin, beta HBB 25 11p15.5 NM_001018049 progestagen-associated endometrial protein PAEP 126 9q34 Perda 9q Cornillie et al., 1991. 345 46 Portanto, foram identificados 191 genes supe rexpressos e 100 genes menos expressos. Além disso, estão destacadas nesta tabela, as referências na literatura que previamente associaram os genes encontrados com a doença, bem como, suas localizações cromossômicas e em quais destas regiões, já foram encontrada s, por CGH, alterações genômicas em lesões endometrióticas. A tabela IV (anexo D) apresenta a ca tegorização dos gene s encontrados nas bibliotecas quanto suas participações em processos biológicos. Esses genes foram relacionados a 283 processos biológicos diferentes. VALIDAÇÃO POR PCR EM TEMPO REAL Para a validação da RaSH foram selecionados dois genes ( CTGF e SPARC) indicados como superexpressos e quatro genes (MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP) como menos expressos no endométrio ectópico. Todas as análises de PCR aplicadas aos seis genes validaram os dados encontrados pela metodologia RaSH nas bibliotecas. Estes resu ltados, indicados nas figuras por (3), podem ser observados nas figuras 3, 4 e 5. Também estão representados nestas figuras os demais dados de quantificação relativa, segundo o método 2 -∆∆CT (ou 2-Ct), observados para as e xpressões gênicas analisadas nos diferentes tecidos estudados, assim como, estão indicados por * quais destas diferenças foram significativas. Não detectamos correlação significativa entre os níveis de expressão obtidos no endométrio ectópico e o estadiamento da doença. 47 Figura 3: Dados da PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC apontados como superexpressos pela RaSH no endométrio ectópico. NE= endométrio controle (n=10), EU = e ndométrio eutópico (n=17), EC = endométrio ectópico (n=17, peritonial + ovariana), EC_P = ectópico pe ritonial (n=8), EC_O = ectópico ovariano (n=9), EU_P = eutópico de pacientes com lesão peritonial (n=8) e EU_O = eutópico de pacientes com lesão ovariana. Os números em parênteses foram usados para indicar as comparações entre: (1) NE x EU, (2) EC_P x EC _O, (3) EU x EC, (4) EU_P x EC_P e (5) EU_O x EC_O. As comparações marcadas por * apresentaram diferença significativa com P ≤ 0,05. (1) (3) (4) (5) (2) (1) (3)* (4)* (5) (2)* 48 Figura 4: Dados da PCR em tempo real para os genes MYC e MMP3 apontados como menos e xpressos pela RaSH no endométrio ectópico. NE= endométrio controle (n=10), EU = e ndométrio eutópico (n=17), EC= endométrio ectópico (n=17, peritonial + ovariana), EC_P = ectópico pe ritonial (n=8), EC_O = ectópico ovariano (n=9), EU_P = eutópico de pacientes com lesão peritonial (n=8) e EU_O = eutópico de pacientes com lesão ovariana. Os números em parênteses foram usados para indicar as comparações entre: (1) NE x EU, (2) EC_P x EC _O, (3) EU x EC, (4) EU_P x EC_P e (5) EU_O x EC_O. As comparações marcadas por * apresentaram diferença significativa com P ≤ 0,05. (1) (3) (4)* (5) (2) (1) (3)* (4)[ (5)* (2) 49 Figura 5: Dados do RT-PCR em tempo real para os genes IGFBP1 e PAEP apontados como menos expressos pela RaSH no endométrio ectópico. NE= endométrio controle (n=10), EU = e ndométrio eutópico (n=17), EC = endométrio ectópico (n=17, peritonial + ovariana), EC_P = ectópico pe ritonial (n=8), EC_O = ectópico ovariano (n=9), EU_P = eutópico de pacientes com lesão peritonial (n=8) e EU_O = eutópico de pacientes com lesão ovariana. Os números em parênteses foram usados para indicar as comparações entre: (1) NE x EU, (2) EC_P x EC _O, (3) EU x EC, (4) EU_P x EC_P e (5) EU_O x EC_O. As comparações marcadas por * apresentaram diferença significativa com P ≤ 0,05. (1) (3) (4)* (5) (2)* (1) (3)* (4)* (5)* (2) D ISCUSSÃO 51 Buscando elucidar o perfil de expressão gênica nas lesões endometrióticas e identificar genes que estejam envolvidos com esta doe nça complexa, vários trabalhos envolvendo a técnica de microarranjos foram realizados (Giudice et al., 2001; Eyster et al., 2002; Lebovic et al., 2002; Arimoto et al. , 2003; Kao et al., 2003; Absenger et al., 2004; Matsuzaki et al., 2004; Matsuzaki et al. , 2005; Kato et al. , 2006; Wu et al. , 2006; Flores et al. , 2007). A aplicação desta técnica no estudo da endomet riose é problemática, pois são usados chips comerciais fabricados para outras finalid ades que não estudos direcionados à doença (Bischoff e Simpson, 2004), somando-se o fato dos genes analisados serem pré-determinados, não permitindo o screening completo e característico das lesões. Assim, as bibliotecas de hibridação subtrativas são técnicas de screening que contornam este problema. A biblioteca de hibr idação subtrativa rápida (RaSH) isola genes diferencialmente expressos, incluindo novos gene s e transcritos raros. Além disso, apresenta vantagens em relação às demais técnicas de hibridação subtrativa, pois simplifica os passos de hibridação e subtração. Além de ser eficient e na subtração diminuindo os falso-positivos, pode ser realizada de fo rma menos onerosa (Jiang et al., 2000). Hu e colaboradores (2006) aplicaram a técnica de hibridação subtrativa de fase sólida usando beads magnéticos em endométrios eutópico e ectópico de mulheres com endometriose peritonial, nas fases proliferativa e secretora do cicl o menstrual. No presente trabalho, foram analisados também endométrios eutópico e ectópico de mulheres com endometriose, entretanto, selecionamos pacientes na fase proliferativa inicial do ci clo menstrual, incluindo lesões peritoniais e ovarianas. Já que o perfil de expressão gênica é variável com as fases do ciclo menstrual, a escolha de uma fase específica do ciclo, bem como a seleção de amostras pareadas é fundamental para homogeneização das variações cíclicas e individuais. A metodologia RaSH foi eficiente em detectar transcritos diferencialmente expressos, pois obtivemos 1339 seqüências de qualidade, que após rigorosas seleções e classificações 52 resultaram em 291 genes indicados como desregulados, sendo 191 superexpressos e 100 menos expressos nas lesões (Tabela III). Embora a técnica tenha sido eficiente em detectar diferenças na expressão gênica, ela possui cer ta limitação. Nem todas as seqüências de cDNA comuns podem ser completamente removidas após a subtração (Hu et al. , 2006). Uma maneira de detectar esses falso-positivos é realizar duas bibliotecas: inicialmente o tester é avaliado como tester, a seguir ele passa a ser usado como driver. Seguindo este princípio, construímos duas bibliotecas: RHENEN ( tester=ectópico X driver=eutópico) e RHENDN (tester=eutópico x driver=ectópico), que indicaram 13% de seqüências falso-positivas entre as Refseq. Procurando comparar os genes encontrados no presente trabalho com dados descritos na literatura, encontramos 17 genes que já foram associados à endometriose, como por exemplo MYC, MMP3,IGFBP1,CTGF e PAEP, e 274 genes que ainda não foram estudados na doença, e que portanto são alvos pa ra análises futuras, entre eles o SPARC. Além disso, comparando as localizações cromossômicas dos genes obtidos com as regiões que apresentam alterações genômicas detectadas previamente em lesões endometrióticas por CGH, 36 genes superexpressos e 16 genes menos expressos estava m em regiões de ganho e perda de material genômico, respectivamente (Tabela III). Entre estes genes, encontram-se o PAEP em região de perda 9q e CTGF em região de ganho 6q. Já foi demonstrado que alterações genômicas em pacientes com endometriose podem estar associadas ao desenvolvimento da doença (Gogusev et al. , 1999; Gogusev et al. , 2000), o que poderia justifi car alguns dados de expressão diferencial encontrados. Alguns eventos são necessários para o estabe lecimento da endometr iose, tanto para a implantação como para manutenção do tecido ectópico. Tais eventos são: fluxo menstrual retrógrado seguido de escape do sistema imune pelas células endometrióticas, adesão, invasão, proliferação celular, inibição de apoptose, angiogênese, produção local de estrógenos 53 e resposta à lesão (Nap et al., 2004). A desregulação de genes que estejam envolvidos com estes processos pode levar ao estabelecimento e sobrevivência dos implantes endometrióticos. Portanto, após o agrupamento dos genes diferencialmente expressos quanto a sua participação em processos biológicos (Anexo D), relacionamos 283 processos diferentes, dos quais os mais relevantes para a doença foram: angiogênese (2 genes), adesão celular (18), motilidade celular (14), proliferação celular (18), resposta de defesa (7), processos do sistema imune (13), proteólise (17), regulação do cres cimento celular (4), resposta à lesão (9), remodelamento tecidual (3), comunicação celular (49), diferenc iação celular (24) e morte celular programada (15). Para a validação das bibliotecas subtrativas foram selecionados os genes CTGF e SPARC encontrados como superexpressos e os genes PAEP, IGFBP1, MMP3 e MYC encontrados como menos expressos no endométrio ectópico. Além de analisar os dados nas 12 amostras utilizadas para a construção das bibliotecas, ampliamos o número amostral para 44 (10 endométrios controles de mulheres sem endometriose, 17 tecidos eutópicos e 17 tecidos ectópicos de mulheres com endometri ose, sendo 8 peritoniais e 9 ovarianas) com o intuito de estabelecer possível envolvimento dos genes com a doença. Todos os genes validaram as diferenças de expressão detectadas pelas bibliotecas. Entretanto, estas diferenças fo ram significativas entre os grupos de endométrio eutópico e ectópico (todas as lesões) apenas para os genes SPARC, MMP3 e PAEP. Quando as análises foram feitas separando-se o grupo de lesões peritoniais dos endometriomas ovarianos e comparando-os com seus tecidos autólogos, difere nças significativas na s lesões peritoniais foram obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP e nos endometriomas ovarianos para os genes MMP3 e PAEP. Além disso, os genes SPARC e IGFBP1 mostraram diferenças significativas de expressão, quando comparamos as lesões peritoniais com as ovarianas. Provavelmente, o agrupamento das lesões tenha mascarado diferenças de expressão que são 54 características específicas dos locais onde as lesões se formam. Assim, as diferenças observadas entre o endométrio eutópico e as le sões endometrióticas de pacientes afetadas podem ser explicadas como conseqüência direta dos diferentes ambientes endócrinos, como o fluido peritonial e o microambiente intra-ovaria no das lesões, em relação ao ambiente intra- uterino (Koninckx et al., 1998). O SPARC é uma proteína matricelular anti-adesiva que media as interações entre a matriz extracelular e as célul as (Bradshaw e Sage, 2001). Tal gene está envolvido em vários processos biológicos incluindo remodelamento tecidual, adesão ce lular, angiogênese, proliferação, migração e invasão tumoral (Bradshaw e Sage, 2001; Kato et al., 2001, Framson e Sage, 2004). A superexpressão do SPARC já foi associada a diminuição de E-caderina em melanoma aumentando o potenci al invasivo do tumor (Smit et al. , 2007), ao aumento de motilidade celular em câncer de mama devido suas propriedades anti-adesivas (Briggs et al., 2002; Campo Mcknight et al., 2006) e estimulação do VEGF em células endoteliais levando ao aumento de angiogênese (Kato et al., 2001). Além disso, foi demonstrado que o SPARC tem efeito de regulação positiva sobre CTGF, e este por sua vez responde ao SPARC por feedback negativo (Zhou et al., 2006). O CTGF é um membro da família das CCN ( Cyr61, CTGF, NOV), que parece estar envolvido em diversas funções celulares como a proliferação, adesão, migração, apoptose, produção da matriz extracelular, desenvolvimento embrionário, diferenciação tecidual, angiogê nese, cicatrização, além de estar associado com várias patologias como fibrose, inflamação e crescimento tumoral (Lau e Lam, 1999; Moussad e Brigstock, 2000; Rageh et al. , 2001). Absenger e colaborador es (2004) detectaram um aumento de expressão do CTFG no endométrio eutópico de p acientes com endometriose em relação ao endométrio c ontrole, por técnica de microarrays. Posteriormente, também foi detectada uma superexpressão deste gene em le sões endometrióticas induzidas em modelo animal (Flores et al., 2007). Embora diferenças significativas entre os endométrios eutópico e 55 ectópico tenham sido detectadas apenas para o SPARC, é provável que a expressão alterada destes dois genes permita o estabelecimento e manutenção dos implantes endometrióticos, por regularem mecanismos de invasão e angiogênese. O desarranjo da matriz extracelular é um evento normal e essencial para o desenvolvimento embrionário, morfogênese, reprodução, reabsorção e remodelamento tecidual. As MMPs e seus inibidores (TIMPs ) têm participação essencial neste evento (Nagase e Woessner, 1999). Embora a expre ssão endometrial das MMPs e TIMPs seja regulada ciclicamente (Goffin et al., 2003), perfis alterados de e xpressão têm sido detectados em tecidos de endométrio ectópico e eutópico de pacientes com endometriose, o que pode ser resultado da falta de resposta à progesterona encontrada em mulheres com esta doença. Tal deficiência de resposta pode estar associada com a falh a na supressão das MMPs e consequentemente invasão do tecido endometrial em locais extra-uterinos (Bruner-Tran et al., 2002). Gilabert-Estellés e colaboradores (2003) encontraram uma maior expressão da MMP-3 em tecido endometrial eutópico de mulheres com endometriose que no endométrio controle. Além disso, detectaram uma menor atividade proteolítica em endometrioma ovariano, como resultado da superexpressão do TIMP-I. Cont udo, Uzan e colaboradores (2004) detectaram uma maior expressão da MMP-3 no endométrio normal de mulheres sem endometriose em relação ao eutópico de paci entes com endometriose. Além disso, mostraram uma maior expressão desta metaloproteínase em endome triose colo-retal, qua ndo comparada a lesões peritoniais e endometrioma ovariano. Neste trabalho, encontramos uma menor expressão do gene MMP3 em lesões endometrióticas, o que pode indicar uma menor atividade invasiva das lesões por já estarem localmente estabelecidas. A superexpressão do MYC pode levar tanto à proliferação celular como à apoptose (Thompson, 1998). A indução da morte celular pr ogramada por este gene está relacionada com a liberação do citocromo c (Juin et al., 1999). A superexpressão do gene anti-apoptótico 56 BCL-2 ( B-cell lymphoma/leukaemia-2 ) protege as células da ação do MYC por bloquear a liberação do citocromo c (Wagner et al., 1993; Yang e Korsmeyer, 1996), mas não tem efeito na sua ação proliferativa (Hoffman e Liebermann, 1998). Já o BAX ( BCL2-associated X protein), membro pró-apoptótico da família bcl- 2, estimula a morte celular por liberar o citocromo c e consequentemente induzir o MYC (Mitchell et al. , 2000). No endométrio eutópico de mulheres com endometriose, já foram descritas tanto a diminuição de células apoptóticas (Braun et al. , 2002) como a superexpressão do BCL-2 e a repressão do BAX (Meresman et al. , 2000). Apesar disso, Johnson e colaboradores (2005) encontraram uma maior expressão do MYC no endométrio eutópico de mulheres com endometriose, em relação ao endométrio de mulheres normais. Embora os dados sobre a regulação e funções associadas à expressão do MYC sejam controversos na literatura, é possível que a baixa expressão deste gene em lesão endometriótica seja resultado da perda de estimulação de apoptose pela via de regulação MYC, BCL-2 e BAX alterada nas lesões endometrióticas. O IGF-I ( insulin-like growth factor-I ) e o IGF-II estão presentes no endométrio humano, e são potentes indutores de prolifer ação e crescimento em cultura de células endometriais (Giudice et al., 2003; Irwin et al., 1993). Estes fatores são regulados pela família de insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs), sendo que o IGFBP-1 atua como inibidor do IGF-I (Adashi, 1995) . Algumas funções como supr essão tumoral, indução de apoptose e diminuição da proliferação celular foram associadas ao aumento de expressão do IGFBP-1 em câncer de próstata e de mama (Ngo et al., 2003; Subramanian et al., 2007). Foi detectada uma menor expressão deste gene em fluido folicular de pacientes com endometriose moderada e severa (Cunha-Filho et al. , 2003), um aumento de expressão no endométrio eutópico de babuínos com endometriose em relação ao endométrio normal (Kim et al., 2007) e uma expressão reduzida em lesões endometri óticas quando comparada com tecido eutópico de pacientes com endometriose (Klemmt et al., 2006). Além disso, aumento de IGF-I e IGF-II 57 foi detectado no fluido peritonial de pacientes com endometriose (Giudice et al., 1994). Esses dados da literatura apóiam os resultados de desregulação do IGFBP1 encontrados no presente trabalho, e reforçam a idéia de que a expressão alterada do sistema IGF na endometriose pode ser um dos fatores responsáveis pelo crescimento do tecido ectópico. O PAEP codifica a glicodelina, uma glicopro teína com diversas funções como imunossupressão (Rachmilewitz et al. , 2003), contracepção (Oehninger et al ., 1995), diferenciação celular e supressão tumoral (Kämäräinen et al., 1997; Koistinen et al., 2005). Considera-se que a expressão desta glicoprot eína é mais freqüente em carcinoma ovariano bem diferenciado, sendo mais expressa em esta dios tumorais inicia is e associada a um prognóstico favorável (Mandelin et al., 2003). Alguns trabalhos têm associado a expressão da glicodelina e suas funções com doenças gineco lógicas malignas e benignas, dentre elas a endometriose (Cornillie e t al ., 1991; Horowitz et al. , 2001). As lesões endometrióticas apresentam menor grau de diferenciação ou re tardo neste processo, em relação ao tecido eutópico de mulheres com endometriose (Nisolle et al., 1995; Klemmt et al., 2006). Abrao e colaboradores (2003) também associaram lesõ es endometrióticas me nos diferenciadas com estadios III e IV da doença. Kao e colabora dores (2003) encontraram menor expressão de glicodelina em tecido eutópico de mulheres co m endometriose na fase secretora do ciclo menstrual, quando comparado ao endométrio eu tópico de pacientes sem endometriose. Neste trabalho, detectamos uma menor expressão do PAEP em lesões endometrióticas do que no endométrio eutópico, o que poderia ser um indí cio de perda de diferenciação nas lesões, relacionada à perda de função da glicodelina. Portanto, a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP causariam perda da homeostase celular nas lesões endom etrióticas, contribuindo para a implantação e sobrevivência do tecido ectópico no ambiente extra-uterino. Consideramos que análises de um 58 número maior de amostras são necessárias, bem como testes para determinar funções gênicas nas lesões para caracterização de sua participação no desenvolvimento da doença. O endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose compartilham alterações que não são encontradas no endométrio eutópico de mulheres sem endometriose, o que corrobora a idéia de que este endométrio a lterado, ao cair na cavidade peritonial, tem um potencial inicial de desenvolver a endometrio se (Sharpe-Timms, 20 01). Entretanto, no presente trabalho, quando o grupo controle fo i comparado ao endométrio eutópico de pacientes com endometriose, nenhuma difere nça significativa foi encontrada nos genes estudados. Um número maior de amostras deve ser analisado para que esses resultados sejam conclusivos. Os dados discordantes da lit eratura devem-se primeirament e às diferentes fases do ciclo menstrual analisadas. Em segundo lugar, aos diferentes tipos de lesões avaliadas, e por fim às diferentes técnicas utilizadas na inves tigação da endometriose. As três variantes, de maneira geral, são consideradas responsáveis pelos resultados inconclusivos sobre o tema. Em resumo, este projeto disponibilizou ao banco de dados da literatura 291 genes candidatos com expressão gênica desregulada na fase proliferativa inicial do ciclo menstrual em lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas. Os genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP devem ser analisados em um número maio r e mais diversificado de amostras, pois podem estar envolvidos com mecanismos de implantação e manutenção dos implantes endometrióticos. A investigação futura desses genes poderá contribuir para a elucidação da fisiopatologia da endometriose. C ONCLUSÕES 60 1) A técnica RaSH foi eficiente em detectar expressão diferencial entre os tecidos eutópico e ectópico da pacientes com endometriose. 2) Foram identificados como candidatos 291 genes desregulados nas lesões endometrióticas: 191 superexpressos e 100 menos expressos. 3) Entre os genes selecionados após a análise comparativa de expressão nos tecidos eutópico e ectópico, e após validação por técnica de PCR em tempo real, o gene SPARC foi superexpresso e os genes MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP menos expressos nas lesões. 4) Diferenças significativas de expressão nas lesões peritoniais foram obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP ; e nos endometriomas ova rianos para os genes MMP3 e PAEP. 5) Os genes SPARC e IGFBP1 mostraram diferenças significativas de expressão, quando comparamos as lesões peritoniais com as ovarianas. 6) Sugerimos que os genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP estejam envolvidos com mecanismos de implantação e manutenção dos implantes endometrióticos. 7) Nossos resultados sugerem que as diferenças observadas entre o endométrio eutópico e as lesões endometrióticas de pacientes afetadas pela endometriose são conseqüências dos diferentes ambientes endócrinos desses tecidos. 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A NEXOS 74 ANEXO A 75 ANEXO B Tabela I: Seqüências contaminantes e demais classificações (Ribossomal, EST Humana e UniGene) MITOCONDRIAL N◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN J01415 Human mitochondrion, complete genome 176 39 176 39 EST LEVEDURA N◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN T36983 T36983 EST102025 Saccharomyces cerevisiae cDNA 3' end. 1/95 1 T38386 T38386 EST103859 Saccharomyces cerevisiae cDNA 3' end. 1/95 2 0 3 UNIGENE N◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN CN484301 tgnl|UG|Hs#S19724297 hw45c10.y2 Human primary human ocular pericytes. Unamplified (hw) Homo sapiens cDNA clone hw45c10 5', mRNA sequence /clone=hw45c10 /clone_end=5' /gb=CN484301 /gi=46565805 /ug=Hs.268803 /len=618 1 XM_498557 tgnl|UG|Hs#S21593118 PREDICTED: Homo sapiens LOC440123 (LOC440123), mRNA /cds=p(1,363) /gb=XM_498557 /gi=51471158 /ug=Hs.585252 /len=2284 1 AK074908 tgnl|UG|Hs#S4806911 Homo sapiens cDNA FLJ90427 fis, clone NT2RP3000481, highly similar to Homo sapiens RanBP7/importin 7 mRNA /gb=AK074908 /gi=22760659 /ug=Hs.523470 /len=3781 1 BX641108 tgnl|UG|Hs#S16819761 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp779O0231 (from clone DKFZp779O0231) /gb=BX641108 /gi=34365429 /ug=Hs.5724 /len=3994 1 DB275414 tgnl|UG|Hs#S29666869 DB275414 UTERU3 Homo sapiens cDNA clone UTERU3000431 5', mRNA sequence /clone=UTERU3000431 /clone_end=5' /gb=DB275414 /gi=83216722 /ug=Hs.586927 /len=570 1 BG254392 tgnl|UG|Hs#S3226548 602368978F1 NIH_MGC_91 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:4477195 5', mRNA sequence /clone=IMAGE:4477195 /clone_end=5' /gb=BG254392 /gi=12764208 /ti=44312233 /ug=Hs.536415 /len=1174 1 BU177744 tgnl|UG|Hs#S4753448 AGENCOURT_7984442 NIH_MGC_72 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:6166598 5', mRNA sequence /clone=IMAGE:6166598 /clone_end=5' /gb=BU177744 /gi=22691728 /ti=158177112 /ug=Hs.581964 /len=873 1 AK126809 tgnl|UG|Hs#S16885895 Homo sapiens cDNA FLJ44859 fis, clone BRALZ2003330 /gb=AK126809 /gi=34533443 /ug=Hs.293884 /len=1790 1 continua 76 continuação BM141654 tgnl|UG|Hs#S3994991 if24c05.x1 Melton Normalized Human Islet 4 N4-HIS 1 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:5677424 3', mRNA sequence /clone=IMAGE:5677424 /clone_end=3' /gb=BM141654 /gi=17151719 /ug=Hs.571918 /len=543 1 AJ318805 tgnl|UG|Hs#S4013186 AJ318805 Homo sapiens adipose tissue Homo sapiens cDNA clone 2040, mRNA sequence /clone=2040 /gb=AJ318805 /gi=18141682 /ug=Hs.86538 /len=5223 2 CR749357 tgnl|UG|Hs#S21592430 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp779K1237 (from clone DKFZp779K1237) /cds=p(249,1814) /gb=CR749357 /gi=51476439 /ug=Hs.239818 /len=3237 1 BG832050 tgnl|UG|Hs#S3617992 602765051F1 NIH_MGC_42 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:4907125 5', mRNA sequence /clone=IMAGE:4907125 /clone_end=5' /gb=BG832050 /gi=14179637 /ti=45245335 /ug=Hs.588885 /len=848 1 CR604926 tgnl|UG|Hs#S21297145 full-length cDNA clone CS0DF038YH05 of Fetal brain of Homo sapiens (human) /gb=CR604926 /gi=50485733 /ug=Hs.197922 /len=1566 2 AL831995 tgnl|UG|Hs#S4623373 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp451J163 (from clone DKFZp451J163) /gb=AL831995 /gi=21732534 /ug=Hs.268675 /len=5411 1 AB014581 tgnl|UG|Hs#S1090801 Homo sapiens mRNA for KIAA0681 protein, partial cds /cds=p(1,1618) /gb=AB014581 /gi=3327175 /ug=Hs.300863 /len=4323 1 NM_001025 tgnl|UG|Hs#S1727727 Homo sapiens ribosomal protein S23 (RPS23), mRNA /cds=p(94,525) /gb=NM_001025 /gi=71772514 /ug=Hs.567333 /len=3325 1 AY283618 tgnl|UG|Hs#S15730155 Homo sapiens hypothetical protein mRNA, complete cds /cds=p(72,4766) /gb=AY283618 /gi=30908949 /ug=Hs.136102 /len=6409 1 AL833852 tgnl|UG|Hs#S4621549 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp761G0111 (from clone DKFZp761G0111) /cds=p(1,1197) /gb=AL833852 /gi=21739329 /ug=Hs.477921 /len=4792 2 AB007940 tgnl|UG|Hs#S1244987 Homo sapiens mRNA for KIAA0471 protein, partial cds /cds=p(284,1525) /gb=AB007940 /gi=3413903 /ug=Hs.495391 /len=6834 1 CA437837 tgnl|UG|Hs#S6143167 UI-H-DH0-aur-e-06-0-UI.s1 NCI_CGAP_DH0 Homo sapiens cDNA clone UI-H-DH0-aur-e- 06-0-UI 3', mRNA sequence /clone=UI-H-DH0-aur-e-06-0-UI /clone_end=3' /gb=CA437837 /gi=24802257 /ug=Hs.159204 /len=691 1 AF146796 tgnl|UG|Hs#S2333428 Homo sapiens sodium dependent phosphate transporter isoform NaPi-IIb mRNA, complete cds /cds=p(36,2105) /gb=AF146796 /gi=6910977 /ug=Hs.479372 /len=4135 1 AL050204 tgnl|UG|Hs#S1570007 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586F1223 (from clone DKFZp586F1223) /gb=AL050204 /gi=4884443 /ug=Hs.28540 /len=1655 1 4 21 OUTRAS NÃO REDUNDANTES N◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN XP_519919 PREDICTED: exostosin 1 [Pan troglodytes] 1 77 Continuação AAL31950 CDH1-D [Gallus gallus] 1 1 1 RIBOSSOMAL N◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN NM_021104 Homo sapiens ribosomal protein L41 (RPL41), transcript variant 1, mRNA 1 NM_000991 Homo sapiens ribosomal protein L28 (RPL28), mRNA 2 NM_000967 Homo sapiens ribosomal protein L3 (RPL3), transcript variant 1, mRNA 3 NM_007104 Homo sapiens ribosomal protein L10a (RPL10A), mRNA 6 NM_000988 Homo sapiens ribosomal protein L27 (RPL27), mRNA 4 NM_001015 Homo sapiens ribosomal protein S11 (RPS11), mRNA 8 NM_000989 Homo sapiens ribosomal protein L30 (RPL30), mRNA 10 NM_0010350 06 Homo sapiens ribosomal protein L17 (RPL17), transcript variant 2, mRNA 3 NM_000979 Homo sapiens ribosomal protein L18 (RPL18), mRNA 1 NM_000981 Homo sapiens ribosomal protein L19 (RPL19), mRNA 4 NM_000971 Homo sapiens ribosomal protein L7 (RPL7), mRNA 1 NM_001025 tgnl|UG|Hs#S1727727 Homo sapiens ribosomal protein S23 (RPS23), mRNA /cds=p(94,525) /gb=NM_001025 /gi=71772514 /ug=Hs.567333 /len=3325 18 NM_000970 Homo sapiens ribosomal protein L6 (RPL6), mRNA 10 NM_022551 Homo sapiens ribosomal protein S18 (RPS18), mRNA 3 NM_000987 Homo sapiens ribosomal protein L26 (RPL26), mRNA 1 NM_001012 Homo sapiens ribosomal protein S8 (RPS8), mRNA 6 NM_000661 Homo sapiens ribosomal protein L9 (RPL9), mRNA 4 NM_001007 Homo sapiens ribosomal protein S4, X-linked (RPS4X), mRNA 1 U09953 gp|U09953|1323733|E3F957CA13F7BFEF ribosomal protein L9 [Homo sapiens] 10 AL049597 gp|AL049597|10443242|28AB564EA6F7F504 dJ612B15.1 (novel protein similar to 60S ribosomal protein L17 (RPL17)) [Homo sapiens] 4 AB007158 gp|AB007158|3088342|E6A62203E15257C1 ribosomal protein S23 [Homo sapiens] 1 21 BC000606 tn|BC000606|AAH00606|5C859DBA21287948 Similar to ribosomal protein L14.[Homo sapiens] 1 L07287 gp|L07287|292435|049D53AB5F7B46B6 ribosomal protein L26 [Homo sapiens] 2 4 L16558 gp|L16558|307388|A6EEB4DFC83C6F96 ribosomal protein L7 [Homo sapiens] 3 U76609 gp|U76609|1658578|1D1E47A337A71ADC ribosomal L5 protein [Homo sapiens] 1 M90054 gp|M90054|337580|E9F238D9F8CA0D67 ribosomal protein L3 [Homo sapiens] 6 78 Continuação BC000802 tn|BC000802|AAH00802|E9CE3CBD59524F81 Similar to ribosomal protein S9.[Homo sapiens] 1 AF348700 tn|AF348700|AAK31162|2FE469F736571002 (UBA52)Ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1 (Fragment).[Homo sapiens] 5 X69391 gp|X69391|36138|3E209D02DFF365D9 ribosomal protein L6 [Homo sapiens] 7 16 136 EST HUMAN N◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN CR736145 CR736145 Homo sapiens library (Ebert L) Homo sapiens cDNA clone IMAGp998K151889 ; IMAGE:767750 5', mRNA sequence 1 BG620235 602618512F1 NIH_MGC_79 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:4732082 5', mRNA sequence 1 BI003963 PM0-HN0078-150201-006-h03 HN0078 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 2 CN359804 17000600087525 GRN_PRENEU Homo sapiens cDNA 5', mRNA sequence 1 DB013855 DB013855 TESOP2 Homo sapiens cDNA clone TESOP2002507 5', mRNA sequence 1 CA445375 UI-H-ED0-axn-c-09-0-UI.s1 NCI_CGAP_ED0 Homo sapiens cDNA clone UI-H-ED0-axn-c-09-0-UI 3', mRNA sequence 1 CV394835 QV3-CT0556-041000-370-f06 CT0556 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 1 DA274667 DA274667 BRCOC2 Homo sapiens cDNA clone BRCOC2001106 5', mRNA sequence 1 CX753754 AGENCOURT_41387044 NIH_MGC_281 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:7779333 5', mRNA sequence 2 CB216464 NISC_nq05d07.y1 NICHD_HS_Ut2 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:5938212 5', mRNA sequence 1 BF678057 602085103F1 NIH_MGC_83 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:4249321 5', mRNA sequence 1 BX091607 BX091607 Soares_testis_NHT Homo sapiens cDNA clone IMAGp998F024495 ; IMAGE:1837825, mRNA sequence 1 AW956406 EST368476 MAGE resequences, MAGD Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 1 AI056701 oy53e02.x1 NCI_CGAP_Brn23 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:1669562 3' similar to contains Alu repetitive element;, mRNA sequence 2 CA446906 UI-H-ED1-axv-o-23-0-UI.s1 NCI_CGAP_ED1 Homo sapiens cDNA clone UI-H-ED1-axv-o-23-0-UI 3', mRNA sequence 1 CV347023 MR2-CI0127-051200-009-g03 CI0127 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 1 BX118116 BX118116 Soares placenta Nb2HP Homo sapiens cDNA clone IMAGp998K21214 ; IMAGE:143756, mRNA sequence 1 AL521622 AL521622 Homo sapiens NEUROBLASTOMA COT 10- NORMALIZED Homo sapiens cDNA clone CS0DB003YG18 5- PRIME, mRNA sequence 1 BP417704 BP417704 Homo sapiens small intestine Homo sapiens cDNA clone HIE00750r 3', mRNA sequence 2 CV341138 MR0-GN0025-250800-001-a03 GN0025 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence 1 CB853216 UI-CF-FN0-agd-o-24-0-UI.s1 UI-CF-FN0 Homo sapiens cDNA clone UI-CF-FN0-agd-o-24-0-UI 3', mRNA sequence 1 79 Continuação AV747712 AV747712 NPC Homo sapiens cDNA clone NPCCPH06 5', mRNA sequence 1 8 18 BACTÉRIA N◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN U00096 Escherichia coli K-12 MG1655 complete genome 2 4 2 4 207 222 80 ANEXO C Tabela II: Seqüências consideradas como falso-positivas RefSeq N◦ Acesso Descrição Símbolo RHENDN RHENEN NM_147780 cathepsin B CTSB 9 1 NM_001002 ribosomal protein, large, P0 RPLP0 8 1 NM_021034 interferon induced transmembrane protein 3 (1- 8U) IFITM3 2 1 XM_934326 PREDICTED: similar to eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 8, transcript variant 16 LOC653352 2 1 NM_002775 protease, serine, 11 (IGF binding) PRSS11 1 1 NM_013230 CD24 molecule CD24 1 1 XM_937409 PREDICTED: zinc finger protein 516 ZNF516 1 1 NM_005016 poly(rC) binding protein 2 PCBP2 1 2 NM_005801 putative translation initiation factor SUI1 1 2 NM_002567 prostatic binding protein PBP 1 2 NM_003746 dynein, cytoplasmic, light polypeptide 1 DNCL1 1 2 NM_005004 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 8, 19kDa NDUFB8 1 3 NM_000090 collagen, type III, alpha 1 COL3A1 5 3 NM_021103 thymosin, beta 10 TMSB10 3 4 NM_001009 ribosomal protein S5 RPS5 3 5 NM_002489 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 4, 9kDa NDUFA4 1 7 NM_021109 thymosin, beta 4, X-linked TMSB4X 1 8 NM_001021 ribosomal protein S17 RPS17 2 9 NM_000998 ribosomal protein L37a RPL37A 1 10 45 64 81 ANEXO D Tabela IV: Classificação dos genes superexpressos e menos expressos quanto suas funções em processos biológicos. PROCESSO BIOLÓGICO G ENES SUPEREXPRESSOS Q UANTIDADE G ENES MENOS EXPRESSOS QUANTIDADE positive regulation of MAPKKK cascade NENF 1 0 cellular homeostasis PRKCB1, SLC40A1, CLN5, CLNS1A, TPT1, PLN 6 MYC 1 ATP synthesis coupled proton transport ATP6V1E1, ATP5E 2 ATP6V0B 1 DNA ligation 0 XRCC6 1 DNA recombination SFPQ 1 XRCC6 1 DNA repair SFPQ 1 XRCC6 1 DNA replication CTGF, NAP1L1 2 0 ER to Golgi vesicle-mediated transport 0 KDELR1 1 ER-associated protein catabolism UBA52 1 0 NLS-bearing substrate import into nucleus KPNA1 1 0 Notch receptor processing 0 NCSTN 1 RNA splicing SFRS7, SFPQ 2 SF3B3 1 Wnt receptor signaling pathway SFRP4, RSPO3 2 0 actin filament polymerization GSN 1 0 continua 82 continuação actin filament severing GSN 1 0 activation of JNK activity 0 PTPLAD1 1 activation of MAPK activity 0 CD81 1 acute-phase response 0 SERPINA1 1 amino acid metabolism ATF4 1 0 amino acid transport 0 SLC3A2 1 amyloid precursor protein catabolism 0 NCSTN 1 anaerobic glycolysis LDHB 1 LDHA 1 angiogenesis VEGFA, CTGF 2 0 anion transport VDAC2 1 0 anti-apoptosis ANXA1, TPT1, CIAPIN1 3 HSPB1, HSPA5 2 antigen processing and presentation 0 HLA-C 1 apoptosis BRE, DAPK1, CIAPIN1 3 DAP, C8orf4, MYC 3 asparagine biosynthesis ASNSD1 1 0 aspartyl-tRNA aminoacylation 0 DARS 1 autophagy ATG3 1 0 axon guidance UBA52 1 0 83 continuação axonogenesis S100A6 1 0 barbed-end actin filament capping GSN 1 SPTBN1 1 behavior 0 FOSB 1 blood coagulation GNAQ, CD59 2 0 calcium ion homeostasis TPT1 1 0 calcium ion transport ITPR1, PLN, TPT1 3 SLC3A2 1 carbohydrate metabolism PPP1CB 1 SLC3A2, H6PD, GANAB 3 cell adhesion CD47, CTGF, KITLG, SCARB2, LPP, PARVA, VEZT, TRIP6, CFDP1, GPNMB, LAMA2, CD93 12 TGFBI, LAMB3, TSPAN1, COL6A3, CDH11, ILK 6 cell cycle arrest CDKN1B 1 MYC 1 cell division PPP1CB 1 TXNL4A, SPECC1L 2 cell growth 0 SLC3A2 1 cell migration VEGFA, TRIP6, CXCL16, GNA13, UBA52, CTGF, LAMA2 7 0 cell motility ANXA1, TPM1, CTGF, TSPAN3, GNA13, CALD1, CDKN1B, TRIP6, CXCL16, VEGFA, UBA52, LAMA2 12 HSPB1, TSPAN1 2 cell proliferation MITF, CDKN1B, S100A6, TSPAN3, CFDP1, KITLG, ANXA1, VEGFA, GPNMB, BMPR2, PPP1CB, NAP1L1 12 TGFBI, GRN, MYC, TSPAN1, ILK, CD81 6 cell-cell adhesion CD93, VEZT, CTGF 3 CDH11 1 cell-cell signaling S100A6, ALDH5A1, UBA52, MAPK1, GNAQ 5 GRN 1 84 continuação cell-matrix adhesion CD47, TRIP6,CTGF 3 ILK 1 cellular lipid metabolism GNPAT 1 0 central nervous system development ALDH5A1 1 ATN1 1 ceramide metabolism 0 NSMAF 1 chemotaxis CXCL16, MAPK1 2 CMTM7 1 chloride transport CLNS1A 1 0 chromatin modification MORF4L1 1 0 ciliary or flagellar motility 0 HLA-C 1 circulation' CLNS1A, PLN 2 0 collagen catabolism' 0 MMP3, MMP7, MMP10 3 collagen fibril organization LUM 1 0 complement activation, classical pathway C1S 1 C4BPA, C1R 2 development ID1, ID2, CFDP1, MITF 4 PAEP, FOSB 2 dopamine metabolism ALDH5A1 1 0 endocytosis RAB5A 1 0 entry of virus into host cell 0 CD81 1 epidermis development CTGF 1 COL1A1, LAMB3 2 85 Continuação ethanol oxidation ADH5 1 0 ether lipid biosynthesis GNPAT 1 0 fatty acid biosynthesis 0 PTGES3 1 fatty acid metabolism GNPAT 1 0 female gamete generation USP9X 1 0 focal adhesion formation TRIP6 1 0 folic acid and derivative biosynthesis MTHFD2 1 0 gamma-aminobutyric acid catabolism ALDH5A1 1 0 gamma-aminobutyric acid metabolism ALDH5A1 1 0 gluconeogenesis ATF4 1 0 glucose metabolism 0 H6PD 1 glycogen metabolism PPP1CB 1 0 glycolysis 0 ENO1 1 heme catabolism BLVRA 1 0 hemopoiesis KITLG 1 0 homophilic cell adhesion 0 CDH11 1 immune response B2M, IFIT5, POMP, CD59, C1S , TBK1 6 HLA-C, C4BPA 2 86 Continuação immune system process IFIT5, MITF, B2M, CXCL16, POMP, KITLG, C1S, TBK1, CD59, CD93 10 HLA-C, CD81, C4BPA 3 induction of apoptosis MAPK1 1 0 induction of positive chemotaxis VEGFA 1 0 inflammatory response ANXA1, PLA2G7, C1S 3 SERPINA1, C4BPA 2 innate immune response TBK1, C1S 2 C4BPA, C1R 2 integrin-mediated signaling pathway CD47 1 ILK 1 intra-Golgi vesicle-mediated transport 0 COPZ1 1 intracellular protein transport KPNA1 1 KDELR1, COPZ1 2 intracellular signaling cascade PRKCB1, SH2B3 2 0 ion transport ATP6V1E1, ITPR1, ATP5E, SLC40A1 4 ATP6V0B 1 iron ion homeostasis SLC40A1 1 MYC 1 iron ion transport SLC40A1 1 0 keratinocyte differentiation ANXA1 1 0 lipid biosynthesis 0 LASS2 1 lipid catabolism PLA2G7 1 0 lipid metabolism ANXA1 1 CPNE1 1 lymphocyte chemotaxis CXCL16 1 0 87 Continuação mRNA catabolism, nonsense-mediated decay 0 EXOSC10 1 mRNA metabolism PCBP1 1 0 mRNA polyadenylation 0 PABPC1 1 mRNA processing 0 HNRPL 1 mRNA stabilization' 0 PABPC1 1 macrophage activation CD93 1 0 membrane protein ectodomain proteolysis 0 NCSTN 1 metabolism BLVRA, SUCLA2, GNPAT, ALDH5A1 4 ARSD, MAN1A1 2 methionyl-tRNA aminoacylation MARS 1 0 mitochondrial transport SLC25A27 1 UCP2 1 mitosis 0 TXNL4A 1 morphogenesis SLC40A1 1 0 muscle contraction PLN, CALD1 2 0 muscle development LAMA2, TAGLN 2 TAGLN2, COL6A3 2 negative regulation of anti-apoptosis RTN4 1 0 negative regulation of apoptosis VEGFA 2 0 negative regulation of axon extension RTN4 1 0 88 Continuação negative regulation of caspase activity 0 HSPA5 1 negative regulation of cell adhesion 0 TGFBI 1 negative regulation of cell proliferation GPNMB, CDKN1B 2 0 negative regulation of gene expression, epigenetic CREBZF 1 0 negative regulation of transcription CREBZF, ID1, ID2 3 0 nervous system development SOD1, VEGFA, DPYSL2, ITM2B 4 0 nitric oxide transport 0 HBB 1 nuclear mRNA splicing, via spliceosome SFRS7, SFPQ, SF3B14 3 TXNL4A, SF3B3 2 nucleosome assembly NAP1L1 1 0 nucleotide-excision repair DDB2 1 0 one-carbon compound metabolism MTHFD2 1 0 organ morphogenesis KITLG, GNPAT 2 0 ossification SPARC 1 CDH11 1 oxygen transport HBG2 1 HBB 1 pentose-phosphate shunt 0 H6PD 1 peptide cross-linking ANXA1 1 0 peptidoglycan metabolism 0 MMP3, MMP7, MMP10 3 89 Continuação peroxisome organization and biogenesis PEX1 1 0 phagocytosis CD93 1 0 phosphate transport 0 COL1A1, COL6A3 2 phosphatidylinositol biosynthesis 0 CD81 1 phosphoinositide metabolism 0 CD81 1 phospholipase C activation GNAQ 1 0 positive regulation of B cell proliferation 0 CD81 1 positive regulation of anti-apoptosis BRE 1 0 positive regulation of cell migration TRIP6 1 0 positive regulation of cell proliferation VEGFA, NAP1L1, CDKN1B, S100A6, PPP1CB 5 GRN, MYC, CD81, ILK 4 positive regulation of enzyme activity 0 NCSTN 1 positive regulation of fibroblast proliferation S100A6 1 0 positive regulation of gluconeogenesis ARPP-19 1 0 positive regulation of glucose import ARPP-19 1 0 positive regulation of nitric oxide biosynthesis 0 HBB, HSP90AB1 2 positive regulation of transcription UBA52 1 0 positive regulation of translation 0 PABPC1 1 postreplication repair UBE2A 1 0 90 Continuação posttranslational protein folding UGCGL2 1 0 potassium ion transport CHP 1 0 prostaglandin biosynthesis 0 PTGES3 1 protein amino acid ADP-ribosylation GNAQ 1 0 protein amino acid glycosylation UGCGL2 1 RPN1, MAN1A1 2 protein amino acid phosphorylation BMPR2, PRKCB1, DAPK1, TBK1, RIPK5, MYLK, MAPK1 7 ILK, MAP3K8 2 protein biosynthesis EIF3S6, EIF4A2, UBA52, EIF3S3, MARS, SARS, EIF3S12, EIF3S6IP 8 DARS, EEF2, TUFM, EIF3S5, MRPL24 5 protein catabolism PSMC1 1 0 protein complex assembly 0 DARS, SF3B3 2 protein import into nucleus, translocation 0 CEP57 1 protein kinase C activation GNB2L1 1 0 protein kinase cascade DAPK1 1 0 protein localization 0 CD81 1 protein modification UBA52 1 0 protein processing 0 NCSTN 1 protein repair MSRB3 1 0 protein retention in ER 0 KDELR1 1 91 Continuação protein transport PEX1, RAB5A, ATG3 3 KDELR1, LMAN2, VPS11 3 protein ubiquitination UBA52, ATG3 2 0 proteolysis CAPN2, C1S, PSMB3, USP9X, UBE2A, UBA52 6 C1R, MMP3, MMP7, MMP10, PRCP, SEC11A, TMPRSS4, PSMB5, NCSTN, RNF11, C4BPA 11 proton transport ATP6V1E1, ATP5E 2 UCP2, ATP6V0B 2 rRNA processing 0 EXOSC10 1 receptor mediated endocytosis CXCL16 1 0 regulation of DNA recombination KPNA1 1 0 regulation of Rho protein signal transduction 0 ARHGEF15 1 regulation of apoptosis TPT1, RTN4 2 0 regulation of cell adhesion LAMA2 1 TGFBI 1 regulation of cell growth CTGF, MORF4L1 2 IGFBP1, IGFBP2 2 regulation of cell migration LAMA2 1 0 regulation of cell volume CLNS1A 1 0 regulation of embryonic development LAMA2 1 0 regulation of heart contraction TPM1 1 0 regulation of muscle contraction TPM1 1 0 regulation of progression through cell cycle VEGFA, S100A6 2 FOSB 1 92 Continuação regulation of synaptic plasticity UBA52 1 0 regulation of transcription factor activity' CREBZF 1 0 regulation of translation PUM1, PCID1, RSBN1L 3 0 regulation of translational initiation EIF4A2, EIF3S3 2 HSPB1, EIF3S5 2 response to DNA damage stimulus BRE 1 0 response to hypoxia VEGFA 1 0 response to oxidative stress SOD1 1 0 response to stimulus RSPO3 1 TGFBI, TIMP3 2 response to stress MAPK1, ATF4 2 0 response to unfolded protein DNAJA1, HSPA14 2 HSPB1, HSP90AB1 2 response to virus CREBZF, TBK1 2 0 response to wounding CTGF, PLA2G7, GNA13, C1S, ANXA1, CD59, GNAQ 7 SERPINA1, C4BPA 2 sensory perception of sound ITM2B, MITF 2 COL1A1 1 septin ring assembly NUBP1 1 0 seryl-tRNA aminoacylation SARS 1 0 signal peptide processing 0 SEC11A 1 skeletal development BMPR2, PRELP 2 COL1A1 1 93 Continuação small GTPase mediated signal transduction RAB5A, CHP 2 RND3, PTPLAD1, RHOC 3 smooth muscle contraction CNN3 1 0 spliceosome assembly 0 TXNL4A 1 succinyl-CoA metabolism SUCLA2 1 0 succinyl-CoA pathway SUCLA2 1 0 superoxide metabolism SOD1 1 0 synaptic transmission MAPK1 1 0 tRNA processing SARS 1 0 telomere maintenance 0 PTGES3 1 tetrahydrofolate metabolism MTHFD2 1 0 transcription from RNA polymerase II promoter BTF3, GTF2B, ELP2 3 TSC22D1, POLR2C 2 transcription initiation GTF2B 1 0 translational elongation 0 TUFM 1 translational initiation EIF3S12 1 0 tricarboxylic acid cycle SUCLA2 1 0 tryptophan transport 0 SLC3A2 1 tubulin folding TCP1 1 0 94 Continuação ubiquitin cycle UBE2A, Kua-UEV, BRE 3 UBE2W 1 ubiquitin-dependent protein catabolism USP9X, PSMB3, UBE2A 3 PSMB5 1 vasculogenesis VEGFA 1 0 vesicle-mediated transport GOLGA4 1 CPNE1 1 visual perception CLNS1A, LUM 2 TGFBI, TIMP3 2 epithelial cell differentiation WT1, VEGFA 2 PAEP 1 epithelial cell proliferation CDKN1B, VEGFA 2 GRN 1 I-kappaB kinase/NF-kappaB cascade TBK1 1 PTPLAD1 1 melanocyte differentiation MITF 1 0 protein folding PPIC, TCP1, DNAJA1, DNAJC9, DNAJC16, POMP, HSPA14 7 PPIB, HSPB1, PTGES3, HSP90AB1 4 regulation of cell cycle CDKN1B, S100A6, WT1, VEGFA, BMPR2 5 MYC, FOSB 2 regulation of cell differentiation MITF, GNAQ 2 0 regulation of epithelial cell proliferation CDKN1B, VEGFA 2 GRN 1 regulation of growth UBA52, CTGF, MORF4L1 3 IGFBP1, IGFBP2 2 tissue remodeling SPARC, CTGF 2 CDH11 1 actomyosin structure organization and biogenesis CNN3 1 0 adaptive immune response C1S 1 C4BPA 1 antigen processing and presentation of endogenous peptide antigen via MHC class I' B2M 1 HLA-C 1 95 Continuação cell communication MITF, BRE, CHP, PRKCB1, S100A6, FMOD, ID1, TRIP6, SFRP4, GNA13, NENF, KITLG, ITPR1, CALM2, DAPK1, TBK1, ANXA1, VEGFA, DPYSL2, ALDH5A1, UBA52, BMPR2, GNB2L1, CD47, SPARC, CTGF, CD59, RAB5A, MAPK1, PPIC, RSPO3, GNAQ 32 RHOC, IGFBP1, ARHGEF15, PTGES3, MS4A8B, RND3, NCSTN, MYC, ILK, PTPLAD1, HSPA5, CD81, TIMP3, CEP57, GRN, NSMAF, GPR177 17 cell cycle WT1, UBA52, CDKN1B, S100A6, MAPK1, PPP1CB, CALM2, ANXA1, VEGFA, BMPR2, 10 TXNL4A, SPECC1L, PSMD13, MYC, FOSB 5 cell cycle process CDKN1B, S100A6, WT1, VEGFA, BMPR2, PPP1CB 6 TXNL4A, PSMD13, MYC, FOSB 4 cell death MITF, BRE, CFDP1, ITM2B, DAPK1, ANXA1, RTN4, VEGFA, TPT1, TSC22D3, MAPK1 11 DAP, MYC, HSPA5, HSPB1 4 cell differentiation SFRP4, MITF, BRE, S100A6, CLN5, WT1, CFDP1, GNA13, ITM2B, DAPK1, ANXA1, RTN4, VEGFA, TPT1, UBA52, CTGF, TSC22D3, MAPK1, GNAQ 19 DAP, MYC, HSPA5, HSPB1, PAEP 5 cell morphogenesis S100A6, CFDP1, GNA13, RTN4, VEGFA, UBA52, CTGF, MORF4L1 8 IGFBP1, IGFBP2, SLC3A2, ILK 4 cell surface receptor linked signal transduction ANXA1, CD59 2 0 cell-substrate adhesion TRIP6, CD47, CTGF 3 ILK 1 chemical homeostasis PRKCB1, SLC40A1, CLN5, TPT1, PLN 5 MYC 1 death MITF, BRE, CFDP1, ITM2B, DAPK1, ANXA1, RTN4, VEGFA, TPT1, TSC22D3, MAPK1 11 DAP, MYC, HSPA5, HSPB1 4 defense response PLA2G7, C1S, TBK1, ANXA1, CD59 5 SERPINA1, C4BPA 2 double-strand break repair via nonhomologous end joining 0 XRCC6 1 96 Continuação electron transport BLVRA, UQCRFS1, PCM1, RSPO3, ALDH5A1 5 0 embryonic development VEZT, GNA13, VEGFA, BMPR2, LAMA2, GNAQ 6 GRN 1 fibroblast growth factor receptor signaling pathway 0 CEP57 1 generation of precursor metabolites and energy SLC25A27 1 0 G-protein coupled receptor protein signaling pathway CALM2, GNAQ, GNA13, C1S 4 0 induction of apoptosis by extracellular signals DAPK1 1 TIMP3, DAP 2 long-term strengthening of neuromuscular junction UBA52 1 0 negative regulation of progression through cell cycle WT1 1 0 negative regulation of transcription factor activity ID1, ID2 2 0 negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter MEIS2 1 FOSB 1 nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism DPYSL2, AK3 2 0 positive regulation of 1-phosphatidylinositol 4-kinase activity 0 CD81 1 positive regulation of I-kappaB kinase/NF- kappaB cascade TBK1 1 GPR177, RHOC 2 positive regulation of peptidyl-tyrosine phosphorylation 0 CD81 1 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter ATF4 1 0 positive regulation of transcription, DNA- dependent 0 XRCC6 1 97 Continuação positive regulation of vascular endothelial growth factor receptor signaling pathway VEGFA 1 0 programmed cell death MITF, BRE, CFDP1, ITM2B, DAPK1, ANXA1, RTN4, VEGFA, TPT1, TSC22D3, MAPK1 11 DAP, MYC, HSPA5, HSPB1 4 protein amino acid N-linked glycosylation via asparagine 0 RPN1 1 protein ubiquitination during ubiquitin- dependent protein catabolism 0 RNF11 1 regulation of cell proliferation MITF, CDKN1B, S100A6, CFDP1, ANXA1, VEGFA, GPNMB, BMPR2, PPP1CB, NAP1L1 10 MYC, ILK, CD81, GRN 4 regulation of cyclin-dependent protein kinase activity CDKN1B 1 0 regulation of transcription from RNA polymerase II promoter ID1, TCF4 2 MYC 1 regulation of transcription, DNA-dependent WT1, LMO3, TSC22D3, PQBP1, BTF3, CREBZF, GTF2B, MEIS2, SFPQ, BAZ1A, ANKHD1, ZMIZ1, ZNF227, ATF4, MITF, MORF4L1 16 ENO1, MYC, TSC22D1, FOSB, LASS2, AKNA 6 release of cytoplasmic sequestered NF- kappaB TRIP6 1 0 retrograde vesicle-mediat ed transport, Golgi to ER 0 COPZ1 1 signal transduction PPIC, VEGFA, DPYSL2, GNAQ, ITPR1, KITLG, DAPK1, GNB2L1, GNA13, S100A6, MAPK1 11 IGFBP1, GRN, NSMAF, PTGES3, MS4A8B 5 Transcription WT1, LMO3, PQBP1, BTF3, CREBZF, POLR2G, SFPQ, PCM1, BAZ1A, POLR1D, ANKHD1, ZMIZ1, ZNF227, ATF4, MORF4L1 15 ENO1, TSC22D1, POLR2C 3 transforming growth factor beta receptor complex assembly FMOD 1 0 transmembrane receptor protein serine/threonine kinase signaling pathway BMPR2 1 0 98 Continuação transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway SPARC 1 TIMP3 1 Transport HBG2, CLNS1A, SLC25A27, UQCRFS1, ABCA8, SYT11 6 HBB, PAEP, UCP2, LAPTM4A 4 tricarboxylic acid cycle intermediate metabolism LDHB 1 LDHA 1 virion attachment, binding of host cell surface receptor 0 CD81 1 sem função conhecida MGC52110, TMEM44, CCDC66, CCDC90A, MGC12966, PRCC, SSU72, C11orf58, C3orf28, KIAA0831, FAM19A5, FAM35A, TMEM168, RPIB9, C10orf104, CCDC80, XIST 17 FAM134B, C22orf28, RMND5B, UBAC2, LOC643433, LOC653352 6 M ANUSCRITO SUBMETIDO PARA A FERTILITY AND STERILITY (FNS-S-07-0173) Elsevier Editorial System(tm) for Fertility and Sterility Manuscript Draft Manuscript Number: Title: Glycodelin expression in normal endometrium without endometriosis, and in eutopic and ectopic tissue of women with endometriosis. Article Type: Reproductive Biology Section/Category:

endometriosis; endometrium; gene expression; glycodelin Corresponding Author: Prof Juliana Meola, Corresponding Author's Institution: First Author: Juliana Meola, M.Sc. Order of Authors: Juliana Meola, M.Sc.; Daniel B Dentillo, Ph.D.; Júlio C Rosa e Silva, M.D., PhD.; Rui A Ferriani, M.D., PhD.; Luciana C Veiga, M.Sc.; Cláudia C Paro de Paz, PhD.; Silvana Giuliatti, PhD.; Lúcia Martelli, M.D., PhD.

Objective: To better understand the molecular environment of endometriotic lesions, and to elucidate potential mechanisms that underlie the complex physiopathology of endometriosis, we analyzed the expression of the glycodelin gene. Design: Prospective laboratory study. Setting: University hospital. Patients: Eleven healthy fertile women and seventeen patients with endometriosis diagnosis in early proliferative phase of the menstrual cycle. Intervention(s): Endometrial biopsy specimens were obtained from normal endometrium of healthy women without endometriosis, and from eutopic and ectopic endometrium tissues (pelvic and ovarian endometriotic implants) of endometriosis patients. Main Outcome Measure(s): The glycodelin relative expression level by real time PCR analysis. Result(s): Glycodelin down-regulation was found in the endometriotic lesions, 332.26 and 123.17-fold lower, respectively, when compared to the eutopic tissue (P<0.05) and the normal endometrium (P<0.0001).

According to these findings, we believe that glycodelin may be one of the molecules responsible for loss of cellular homeostasis in endometriotic lesions. Suggested Reviewers: Robert W Rebar M.D. [email protected] David L Keefe [email protected] Carlos A Petta [email protected] Opposed Reviewers: Figure Click here to download high resolution image Figure Click here to download high resolution image 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 2 TITLE PAGE Title: Glycodelin expression in normal endometrium without endometriosis, and in eutopic and ectopic tissue of women with endometriosis. Authors: Juliana Meola, M.Sc.a Daniel Blassioli Dentillo, Ph.D.a, Júlio César Rosa e Silva, M.D., PhD.b, Rui Alberto Ferriani, M.D., PhD.b Luciana Caricati Veiga, M.Sc.a Cláudia Cristina Paro de Paz, Ph.D.a,c Silvana Giuliatti, Ph.D.a Lúcia Martelli, M.D., PhD.a This study was performed in the Laboratory of Molecular Genetics and Human Molecular Cytogenetics, Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto (FMRP-USP), Brazil. Department affiliations: a Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 14049-900, Brazil. b Department of Gynecology and Obstetrics, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 14049-900, Brazil. c APTA - Department of Agriculture - São Paulo State Government, Ribeirão Preto, 14030-670, Brazil. Financial support: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES/PROEX), Brasília, Distrito Federal, Brazil; and Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência (FAEPA/HCFMRP-USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 3 CAPSULE Glycodelin down-regulation in endometriotic lesions compared to eutopic endometrium of endometriosis patients and normal endometrium of women without endometriosis probably indicates alteration in the normal cell differentiation, proliferation and apoptosis. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 4 STRUCTURED ABSTRACT AND KEY WORDS

Objective: To better understand the molecular environment of endometriotic lesions, and to elucidate potential mechanisms that underlie the complex physiopathology of endometriosis, we analyzed the expression of the glycodelin gene. Design: Prospective laboratory study. Setting: University hospital. Patients: Eleven healthy fertile women and seventeen patients with endometriosis diagnosis in early proliferative phase of the menstrual cycle. Intervention(s): Endometrial biopsy specimens were obtained from normal endometrium of healthy women without endometriosis, and from eutopic and ectopic endometrium tissues (pelvic and ovarian endometriotic implants) of endometriosis patients. Main Outcome Measure(s): The glycodelin relative expression level by real time PCR analysis. Result(s): Glycodelin down-regulation was found in the endometriotic lesions, 332.26 and 123.17-fold lower, respectively, when compared to the eutopic tissue ( P<0.05) and the normal endometrium (P<0.0001).

According to these findings, we believe that glycodelin may be one of the molecules responsible for loss of cellular homeostasis in endometriotic lesions. KEY WORDS: endometriosis, endometrium, gene expression, glycodelin. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 5

Endometriosis is an estrogen-dependent, very aggressive, common benign gynecological disease, that affects at least 10% of women in reproductive age (1). It is characterized by the growth of glands and endometrial stroma outside the uterine cavity, known as ectopic tissue (2). Histologically, it is identical to the normal endometrium (eutopic) but it is biochemically and functionally different in a number of pathways including the receptivity to steroids and the invasive potential (3). The most common implantation site is the peritoneum but, occasionally, lesions were detected in the pleural cavity, liver, kidney, bladder and rarely, in men (4). It is characterized by symptoms such as dysmenorrhea, dyspaneuria, dysuria and pelvic pain (5). Around 30 to 50% of infertile patients present the disease (6); however, many women with endometriotic implants can be asymptomatic (7). The etiology of endometriosis is complex and multifactorial. The implantation theory of Sampson, although controversial, is the most widely accepted (8). This theory is supported by the occurrence of retrograde menstrual flow in 90% of women (9) and viable endometrial epithelial cells in the peritoneal fluid (10), that is, endometrial cells presenting adhesion, implantation, growth, and angiogenesis characteristics (11) and an immune surveillance escape mechanism (4). Moreover, 1% of the endometriosis cases are related to cancer (12), and the disease has shown polygenic tendencies due to a higher risk of 5 to 8% of occurrence in women with a family history of endometriosis in first degree relatives (13). Gene expression changes at specific moments are determinant in normal and abnormal physiological processes. The explanation of mechanisms which support the complex physiopathology of endometriosis, in order to clarify the expression and function of correlated genes, allows the elucidation of the molecular environment of 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 6 endometriotic lesions. Some studies have associated glycodelin expression and its functions to malignant and benign gynecological diseases such as endometriosis (14). Glycodelin is a glycoprotein from the human lipocalins superfamily and is mainly expressed in reproductive tissues (15). This protein contains a number of glycosylation sites and many isoforms have already been described (15), glycodelin A being the one found in the amniotic fluid (16), endometrium and decidua (17). The PAEP (progestagen-associated endometrial protein) gene, official symbol for the glycodelin gene, is located in the chromosomal region 9q34 (18), composed by 7 exons and has four response putative elements for glucocorticoids/progesterone upstream from its promoter region. Therefore, the glycodelin synthesis seems to be regulated by progesterone (19). Gene expression in the normal endometrial tissue is regulated during the menstrual cycle phases, being down-regulated in the proliferative phase, up-regulated initially and down-regulated at the end of the secretory phase (20). This means that it is abundant during the implantation window in normal cycles compared to infertile women’s cycles (21) and rare in the periovulatory period, when fertilization may occur (22, 23). It is also widely expressed at the beginning of pregnancy involving embryo protection in the maternal-fetal interface (24). Glycodelin also inhibits the sperm-oocyte connection because it binds to the sperm head (25). Although the precise function of glycodelin is still unknown, it is believed that its activity could depend on the type of glycosilation undergone. Some of the proposed functions are: immunosuppression (26), contraception (25), participation in angiogenesis (27, 28), and apoptosis (29, 30). Moreover, there are also activities independent from glycosilation such as glandular morphogenesis induction, epithelial differentiation and tumor suppression (31, 32). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 7 The purpose of our study was to compare the PAEP gene expression levels in normal endometrial tissue from women without endometriosis and in the eutopic and ectopic endometrium (pelvic and ovarian endometriotic implants) from endometriosis patients.

This study was realized in the Laboratory of Molecular Genetics and Human Molecular Cytogenetics, Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto (FMRP-USP), Brazil. The project was approved by the Research Ethics Committee (CEP) of the University Hospital from the FMRP-USP (# 11736/2004). Written informed consent was obtained from each patient. Samples Twenty-eight patients were selected using the following inclusion criteria: reproductive age (18 to 40 years); early proliferative phase of the menstrual cycle (days 5-8); with regular cycles and no history of any hormonal therapy during the last six months before the biopsies. The endometriosis stage was settled in agreement with the American Society for Reproductive Medicine classification (33). The patients were divided into two groups: (A) the control group, where normal endometrial biopsies were collected using a Novak curette from 11 women with no diagnosis of endometriosis nor infertility, referred to our service by the Family Planning Ambulatory with tubal ligation indication; (B) 17 patients with endometriosis diagnosis, referred to our service by the Endoscopy and Pelvic Pain Ambulatory and Infertility Ambulatory of the University Hospital due to pelvic pain and/or infertility indication. Biopsies of eutopic (n=17) and ectopic (n=17) endometrium of the same patients were collected by laparoscopy. Among the 17 ectopic endometrium biopsies, 8 were stage II (4), III (2) and IV (2) peritoneal lesions, and 9 were stage III (2) and IV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 8 (7) ovarian lesions. The diagnosis was confirmed through histopathological analysis. The samples were stored at -80 0C after cryopreservation treatment with Tissue-Teck  O.C.T. Compound (Sakura Finetek USA. Inc., Torrance, CA). RNA extraction The samples were washed in PBS (1x) (NaCl 8.50g/L; Na 2HPO4 1.11g/L; Na2HPO4.12H2O 2.81g/L; KH 2PO4 0.20g/L pH7.0) to remove the cryoprotector from the tissues. Then, the total RNA was extracted (50mg of tissue) using TRIZOL  Reagent (Invitrogen Life Technologies, Paisley,UK.) according to the manufacturer’s instructions. The RNA integrity was analyzed by electrophoresis. The total RNA concentrations were obtained using a spectrophotometer at an optical density of 260nm. The RNA was stored at -80°C for future procedures. cDNA synthesis One microgram of total RNA from each sample was reversely transcripted using the High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) according to the manufacturer’s instructions. Quantitative Real Time – PCR (Q RT-PCR) From all 45 collected samples, 44 (10 normal endometrium tissues, 17 eutopic and 17 ectopic tissues) were submitted to real time PCR analysis in the ABI PRISM TM 7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Warrington, UK) for relative quantification of the glycodelin gene expression. One of the normal endometrium samples was randomly chosen to be used as calibrator. The reactions were performed using the TaqMan ® Gene Expression Assays system (TaqMan® MGB probes, FAM™ dye-labeled) from Applied Biosystems. The probes and the primers for the PAEP (Hs01046125_m1) and GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, endogenous control) (Hs99999905_m1) genes were obtained using the Assay-on- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 9 Demand™ Gene Expression Products (Applied Biosystems, Warrington, UK). In order to verify the efficiency of the probes and primers in the amplification reaction for the genes PAEP and GAPDH, calibration curves were built in threefold from serial dilutions (non-diluted, 10 -1, 10-2 and 10 -3) of the cDNA obtained from a pool of equal amounts of all samples. Using the calibration curve, the standard-curve was built. The standard-curves with slope between -3.6 and -3.1 were considered. A Q RT-PCR was performed in double for each sample according to the following conditions: 10µL of TaqMan® Universal PCR Master Mix (2x) (Applied Biosystems, Warrington, UK), 1µL of TaqMan® Gene Expression Assay Mix (20X) (Applied Biosystems, Warrington, UK) and 9µL of diluted cDNA (1/50 dilution) in a final volume of 20µL for each reaction. The reaction conditions were 50ºC for 2 minutes, then 95ºC for 10 minutes, followed by 40 cycles at 95ºC for 15 seconds and 60ºC for 1 minute. The glycodelin expression level was calculated for each sample according to the 2 -ΔΔCT method as previously described in the Applied Biosystems User Bulletin  2 (PN 4303859) (Applied Biosystems, Warrington, UK) and according to the literature (34, 35). The GAPDH (endogenous) and the calibrator sample were used as normalizers for the 2-ΔΔCT calculus. Statistical analysis The glycodelin gene expression variable was transformed by log 10. The logarithmic transformation was necessary because one of the suppositions (linearity) made in the linear models analyses was not answered. These analyses specify that the conditional average E(y x = x0) from the response variable y given the x 0 value of the predictor vector x, is linear in x 0. The application of the linear models can be extended supposing that an appropriated transformation of the answer variable given by t(y), 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 10 where Et(y)x, be linear in x, in the function t(y) = 0 + Tx + , for unknown 0 e T. The term  (random error) is independent from x and has an average of zero (36). The statistical analyses were carried out using the statistical software package SAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). The Dunnetts test was used according to the GLM procedures to compare the mean value of 2 -ΔΔCT for the PAEP expression obtained from (1) normal endometrium and ectopic tissue, (2) normal endometrium and eutopic tissue, (3) peritoneal and ovarian lesions. To compare the average glycodelin expression in the eutopic and ectopic tissues, the paired T test was used. Correlation analyses were performed by the PROC CORR among the PAEP expression levels obtained in the ectopic tissues and the lesions staging. Analyses with P  0.05 were considered to be statistically significant. The mean value of 2 -ΔΔCT was used to calculate the mean fold-change of gene expression in each group.

The relative quantification for the glycodelin gene expression in the different tissues is represented in Figure 1. We have observed a significant difference in expression between the ectopic and the eutopic endometrium of patients with endometriosis (P0.05), and between the ectopic endometrium tissues of patients with endometriosis and controls (normal endometrium, P0.0001). On average, the glycoprotein expression was approximately 332-fold down-regulated in the endometriotic lesions in relation to the average expression observed in the eutopic tissues and 123-fold down-regulated in relation to the average expression observed in the normal endometrium. However, we have not observed any significant difference in expression between the eutopic endometrium tissues of women with endometriosis and normal endometrium of the control group. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 11 When the results of the PAEP gene relative quantifications were compared in the different types of lesion sites, ovarian or peritoneal, no significant difference in glycodelin expression at the different locations was observed. Although there are no significant differences, the values of glycodelin expression in the peritoneal and ovarian tissues are represented in Figure 2. Moreover, no significant correlation between the glycodelin expression levels from ectopic endometrium tissues and the disease staging was observed.

We believe that comparative studies of gene expression between ectopic and eutopic endometrial cells can elucidate the mechanisms involved in the complex and multifactorial development of endometriosis. As previously described, these tissues are biochemically and functionally different in a number of pathways including the receptivity to steroids and the invasive potential (3). Moreover, according to the most acceptable etiological theory for endometriosis , the cells present in the menstrual reflow are in the early proliferative phase of the cycle, which is an important phase for the alterations analyzes in endometrial cell gene expression. Additionally, in a previous report from our group (unpublished observations), we analyzed the expression profiling of endometrium from women with endometriosis using subtractive hybridization in the early proliferative phase of the menstrual cycle. Data indicated glycodelin as one of the differentially expressed genes in the ectopic endometrium when compared to the eutopic one. The endometrium is the only adult tissue able to undergo intense proliferation, secretion, regression and regeneration during each menstrual cycle, and such cyclic alterations are rigorously regulated by hormones and gene expression variations (37). Cellular differentiation is an intrinsic characteristic of this process and some studies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 12 have suggested that glycodelin has important functions in epithelial cell differentiation. Glycodelin cDNA transfection studies in MCF-7 breast cancer cells (38) and in endometrial adenocarcinoma cells (Ishikawa cells) (31, 32) have showed that simultaneously to glycodelin expression induction, malignant cells have been converted to a normal phenotype presenting less proliferation and apoptosis induction. Furthermore, there was an up-regulation expression of markers of organized epithelia, such as cytokeratins 8 and 18 as well as E-cadherin, and down-regulation of vimentin, MUC1 and Bcl-XL genes, associated to tumor development and chemoresistance induction. Therefore, it has been suggested that glycodelin has a tumor suppressor function and its synthesis-stimulating pathways should be reevaluated, for future applications in supporting chemotherapy of malignant tumors (32). It has also been showed that histone deacetylase inibitors suppress the endometrium and endometriotic cells proliferation (39), and these inhibitors are able to directly stimulate glycodelin up- regulation in malignant cells inducing the differentiation to normal features (40). In this study, glycodelin down-regulation in endometriotic lesions compared to eutopic endometrium of endometriosis patients and normal endometrium of women without endometriosis probably indicates an alteration in the normal cell differentiation, proliferation control and apoptosis induction, i.e., cellular homeostasis alteration associated to loss of the glycodelin functions. It is possible that such loss of function is a

of genomic alterations in the endometriotic lesions because loss at the 9q34 chromosome region, where the PAEP gene is located, was found in ectopic endometrium tissue (41). Kao et al. (21) found a lower glycodelin expression in the secretory phase of the menstrual cycle using microarray analyses and northern blot validation in eutopic tissue of patients with endometriosis when compared to normal endometrium of women 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 13 without endometriosis. We believe that these discordant data are primarily due to the different cycle phases analyzed. Also, it is possible that the differences could be due to the different applied methodologies. The quantification using real time PCR is considered the gold standard methodology for gene expression quantification because it can measure very large and very small amounts of transcripts, with high sensitivity and specificity when compared to other techniques such as northern blot (42). Although we have not detected significant differences in glycodelin gene expression among these tissues, a higher expression was observed in the eutopic tissue than in the normal endometrium. This finding corroborates the idea that glycodelin performs functions in cell homeostasis maintenance. A larger number of samples are necessary to confirm this hypothesis. Studies with anti-glycodelin antibodies have showed that glycodelin expression was more frequent in well-differentiated ovarian serous carcinomas when compared to poorly differentiated, and the expression of this glycoprotein was also more frequent in early stages when compared to advanced tumoral stages. Moreover, glycodelin expression was associated with better prognosis (43). Although a higher glycodelin expression has been observed in the peritoneal lesions when compared to the ovarian ones, this difference was not significant. A higher expression was expected in the peritoneal lesions, where the early stages of endometriosis were predominant, than in the ovarian lesions. According to these considerations, we believe that glycodelin may be one of the molecules responsible for cellular homeostasis loss in endometriotic lesions.

We are grateful to the patients for their participation in this study; to the multidisciplinary teamworking from the Human Reproduction Division of the 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 14 Department of Gynecology and Obstetrics, FMRP – USP for the sample collection; to the technical support of the Pediatrics Oncology Laboratory of the Department of Pediatrics and Puericulture, FMRP-USP. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 15

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