{"paper_id":"6679273e-2a1e-4b3d-acd4-ffb6d22d6637","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nDEPARTAMENTO DE GENÉTICA \n \n \n \n \n \n \nJULIANA MEOLA \n \n \n \n \n \nANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM \nENDOMETRIOSE \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2008 \n\nJULIANA MEOLA \n \n \n \n \n \n \nA\nNÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM ENDOMETRIOSE. \n \n[DIFFERENTIAL GENE EXPRESSION ANALYSIS IN ENDOMETRIOSIS]. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2008 \nTese apresentada ao Departamento de \nGenética da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto da Universidade de São \nPaulo para obtenção do  título de Doutor \nem Ciências Biológicas. \nÁrea de concentração: Genética \nOrientadora: Prof ª Dr ª. Lúcia Regina \nMartelli \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n \n \n \n \n \nMeola, Juliana \nAnálise da Expressão Gênica Diferencia l em Endometriose / Juliana Meola; \norientadora: Prof a Dr a Lúcia Regina Martelli. Ri beirão Preto, São Paulo, \n2008. \n132p.: il. ; 30cm \n \nTese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Genética. Área de \nConcentração: Genética) - Faculdade de  Medicina de Ri beirão Preto da \nUniversidade de São Paulo. \n \n 1. Endometriose, 2. Expressão Gênica Dife rencial, 3. Endométrio, 4. Hibridação \nSubtrativa , 5. PCR em Tempo Real.  \n\nFOLHA DE APROVAÇÃO \n \nJuliana Meola \n \nAnálise da Expressão Gênica Diferencial em Endometriose. \n \n \n \n \nAprovado em: \n \nBanca Examinadora \n \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:_______________________ \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:_______________________ \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:_______________________ \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:_______________________ \n \nProf. Dr._____________________________________________________________ \nJulgamento:__________________________Assinatura:_______________________ \nTese apresentada ao Departamento de \nGenética da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto para obtenção do título de \nDoutor em Ciências Biológicas. \nÁrea de concentração: Genética \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“ As verdades científicas  \nserão sempre paradoxais, \nse julgadas pela experiência \nde todos os dias, \na qual somente capta a aparência \nenganadora das coisas.” \nKarl H. Marx (1898). \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedico...\n.....A Deus,\npor caminhar comigo em todos os momentos,\naté mesmo naqueles em que eu não consegui perceber sua \npresença.\n.... aos meus pais amados,\nque são responsáveis por tudo que sou.\n.....aos meus irmãos,\n pelo carinho e compreensão.\n.....ao meu namorado,\npelo incentivo, amor, amizade e acima de \ntudo pelo companheirismo.\n....A todos os demais da minha família,\nos quais amo muito....\n\nAGRADECIMENTOS \nÀs pacientes, que generosamente tornaram esta pesquisa possível, o meu carinho especial. \n \nÀ Profa. Dra. Lúcia Regina Martelli, agradeço pelo apoio, incentivo e confiança. \n \nAos membros da Banca Examinadora pelas sugestões e críticas. \n \nAo Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani e Dr. Júli o César Rosa e Silva, agradeço a atenção, \nensinamentos e as amostras cedidas. \n \nAo Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, agradeço ao suporte técnico. \n \nAo Prof. Dr. Luiz Gonzaga Tone, agradeço ao suporte técnico.  \n \nÀ Profa. Dra. Silvana Giuliatti e ao aluno de doutorado Luciano A. S. Bernardes, do Grupo de \nBioinformática (GBI), agradeço pelo suporte estatístico e a amizade. \n \nÀ Profa Dra Cláudia C. Paro de Paz, agradeço pelo suporte estatístico e amizade. \n \nÀ Profa. Dra. Ester S. Ramos, agradeço pelo convívio agradável e colaboração científica. \n \nAo Prof. Dr. Raysildo B. Lôbo pelo apoio no desenvolvimento da pesquisa. \n \nAo Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade \nde São Paulo. \n \nAo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. \n \nÀ Agência Paulista de Tecnologia dos Ag ronegócios, Secretaria da Agricultura e \nAbastecimento. \n \nAos técnicos do Laboratório de Genética do Bloco C, em especial ao Sílvio A. Santos, Marli \nA. V. Galerani e Reginaldo A Vila. \n \nAo meu grupo de pesquisa Ana Carolina Laus, Da niel B. Dentillo, Fábio R Pablos, Fernando \nH Biase, Gismar Vieira, Juliana Cuzzi, Mari a Silvina J. de Vozzi e Reginaldo Justino \nFerreira. Em especial a minha amiga Luciana C.  V. Castelli, companheira de todas as horas, \ninclusive as de mau humor. \n\nAos demais amigos e amigas do bloco C do Departamento de Genética pelas alegrias \ncompartilhadas no dia a dia. \n \nÀ equipe do Laboratório de Genética Molecu lar e Bioinformática (LGMB), em especial \nLidiane C. Melato, Fernanda G. Barbuzano, An emari Ramos Dinarte dos Santos e Daniel G. \nPinheiro. \n \nÀ equipe do Laboratório de Oncol ogia Pediátrica, em especial Prof a. Dr a. Agda Karina \nBrodoloni Eterovic, Prof. Dr. Ca rlos Alberto Scrideli, Prof a. Dr a. Rosane de Paula Gomes \nQueiroz e aos doutorandos Fábio Motta, Vanessa, Maria Angélica, Priscila... \n \nAo Programa de Excelência Acadêmica da Coor denação de Aperfeiçoamento de Pessoal de \nNível Superior (PROEX/CAP ES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e \nTecnológico (CNPq), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX/CNPq) e \nFundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência (FAEPA) pelo apoio financeiro. \n \n\n \n \ni\nSUMÁRIO \nRESUMO ......................................................................................................................................ii \nABSTRACT ..................................................................................................................................iii \nINTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 1 \nENDOMETRIOSE ................................................................................................................... 2 \nETIOLOGIA DA ENDOMETRIOSE .......................................................................................... 5 \nFATORES DE RISCO, ENDOMETRIOSE E CÂNCER.............................................................. 10 \nTÉCNICAS DE DETECÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM ENDOMETRIOSE .. 11 \nOBJETIVOS ................................................................................................................................ 14 \nMATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................. 16 \nCASUÍSTICA ........................................................................................................................ 17 \nAMOSTRAS.......................................................................................................................... 18 \nISOLAMENTO DO RNA TOTAL........................................................................................... 18 \nRÁPIDA HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA DE CDNA (RASH).................................................... 18 \nSíntese do cDNA ...................................................................................................... 19 \nDigestão Enzimática com MboI e Ligação dos Adaptadores............................... 19 \nPCR e Purificação dos Produtos ............................................................................ 20 \nDigestão do teste....................................................................................................... 20 \nHibridação Subtrativa............................................................................................. 20 \nLigação ao plasmídeo pZErO®-1 e Transformação Bacteriana ........................ 21 \nScreening das Colônias e Análise por Seqüenciamento ....................................... 21 \nANÁLISES POR BIOINFORMÁTICA...................................................................................... 21 \nVALIDAÇÃO DOS DADOS DA RASH POR PCR EM TEMPO REAL ....................................... 22 \nANÁLISE ESTATÍSTICA....................................................................................................... 26 \nRESULTADOS ............................................................................................................................. 27 \nBIBLIOTECAS DE HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA DE CDNA (RASH) ..................................... 28 \nVALIDAÇÃO POR PCR EM TEMPO REAL............................................................................ 46 \nDISCUSSÃO ................................................................................................................................ 50 \nCONCLUSÕES............................................................................................................................. 59 \nREFERÊNCIAS ........................................................................................................................... 61 \nANEXOS ..................................................................................................................................... 73 \nMANUSCRITO ............................................................................................................................ 99 \n\n \n \nii\nRESUMO \nMEOLA, J. Análise da expressão gênica diferencial em endometriose.  2008. 132 p. Tese \n(Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ri beirão Preto – Departamento de Genética, \nUniversidade de São Paulo, Ribeirão Preto. \nA endometriose é uma doença ginecológica beni gna, de etiologia complexa e multifatorial, \ncaracterizada pela presença de estroma e tecido  glandular tipo endométrio fora da cavidade \nuterina. Afeta de 10 a 15% da população feminina, que apresentam  sintomatologia variada, \nincluindo dor pélvica e infertilidade. Para elucidar mecanismos potenciais que estejam \nenvolvidos com a fisiopatologia complexa dest a doença, analisamos o perfil de expressão \ngênico diferencial pela metodologia de hibridaç ão subtrativa em tecido  eutópico e ectópico \n(lesões peritoniais e endometrio ma ovariano) de 17 mulheres com endometriose, no início da \nfase proliferativa do ciclo menstrual. Foram id entificados 291 genes de sregulados nas lesões \nendometrióticas, considerados como genes candidatos. Para a validação dos dados, utilizamos \na metodologia de PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC, indicados como \nsuperexpressos; e MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP como menos expressos nas lesões . \nDiferenças significativas de expressão nas lesõ es peritoniais foram obtidas para os genes \nSPARC, MYC, IGFBP1, PAEP e nos endometriomas ovarianos para os genes MMP3 e PAEP. \nSugerimos que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI  e  PAEP  seja \nresponsável pela perda da homeostase celular na s lesões endometrióticas, contribuindo para a \nimplantação e sobrevivência do tecido ectópico  no ambiente extra-uterino. Este trabalho \ndisponibilizou ao banco de dados da literatu ra, 291 genes com expre ssão gênica diferencial \nem lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas como candidatos a investigações futuras. \n \nPalavras-chave: Endometriose, Expressão Gê nica Diferencial, Endométrio, Hibridação \nSubtrativa, PCR em Tempo Real. \n\n \n \niii\n \nABSTRACT \nMEOLA, J. Differential gene expression analysis in endometriosis. 2008. 132 p. Tese \n(Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ri beirão Preto – Departamento de Genética, \nUniversidade de São Paulo, Ribeirão Preto. \nEndometriosis is a benign gynecological disease, which presents a multifactorial and complex \netiology, characterized by the pr esence of stromal and glandular  endometrium tissue outside \nthe uterine cavity. Ten to 15% of the female population is affected by the disease with a wide-\nranging symptomatology including pelvic pain  and infertility. To clarify the potential \nmechanisms involved in the complex physiopat hology of this disease, we analyzed the \ndifferential gene expression profile by subtract ive hybridization in euto pic and ectopic tissue \n(peritoneal lesions and ovarian  endometriomas) from 17 wome n with endometriosis, in the \nearly proliferative phase of th e menstrual cycle. We  identified 291 genes deregulated in the \nendometriotic lesions, considered as candidate  genes. For data validation, Real Time PCR \nwas applied for genes CTGF and SPARC , indicated as overexpr essed; and for genes MYC, \nMMP3, IGFBP1 and PAEP, indicated as downregulated in the lesions. Significant differences \nin the peritoneal lesions expr ession were obtained for genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP  \nand in the ovarian endometriomas for genes MMP3 and PAEP . We suggest that the \nderegulation of genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI  and  PAEP  is responsible for loss of \ncellular homeostasis in the endometriotic le sions, contributing for the implantation and \nmaintenance of the ectopic tissue in the extra- uterine environment. This study provided 291 \ngenes with differential gene e xpression, in peritoneal and ovari an lesions, to the literature \ndatabase as candidates for future investigations.  \n \nKey-words: Endometriosis, Differential Ge ne Expression, Endometrium, Subtractive \nHybridization, Real Time PCR.  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nI\nNTRODUÇÃO \n \n \n \n \n\n 2\nENDOMETRIOSE \nA endometriose é uma doença ginecológica benigna, estrógeno-dependente, bastante \nagressiva, que afeta 10 a 15% das mulheres na  idade reprodutiva (Thomas e Prentice, 1992; \nYang et al., 2004). É caracterizada pelo crescime nto de estroma e tecido glandular tipo \nendométrio fora da cavidade uterina, denom inado endométrio ectópico (Sampson, 1927; \nPoliness et al., 2004).  \nO tecido ectópico é histologicamente seme lhante ao endométrio normal de mulheres \nsem endometriose e ao endométrio normal, eutópi co, de mulheres afetadas pela doença. Mas, \ntais tecidos diferem entre si bioquímica e fu ncionalmente em numerosas vias, incluindo \nreceptividade a esteróides, potencial proliferativo e invasivo (Gaetje et al., 1995; Vinatier et \nal., 2001; Nap et al., 2004; Viganò et al., 2004; Ulukus et al., 2006). O local mais comum de \nimplantes endometrióticos é a cavidade pélvica,  principalmente o peritônio pélvico. Podem \ntambém ser encontrados nos ovários e septo re to-vaginal, e ocasionalmente no pericárdio, \npleura, fígado, rim, bexiga, cérebro  e raramente em homens (Lebovic et al., 2001; Giudice e \nKao, 2004).  \nAlguns sintomas são característicos desta doe nça, como a dismenorréia (dor pélvica \ndurante a menstruação), dispaneuria (dor duran te o ato sexual), dor pélvica não cíclica e \ninfertilidade (Poliness et al. , 2004). A prevalência de e ndometriose entre mulheres \nassintomáticas é de 2 a 22%, e em mulheres  com dismenorréia é de 40 a 60% (Farquhar, \n2000). Além disso, 25 a 50% de mulheres infértei s apresentam endometriose e 30 a 50% de \nmulheres com endometriose  são inférteis (D´Hooghe et al., 2003). Tais porcentagens variam \nde acordo com os critérios de diagnóstico adot ados. Evidências sugerem que esses sintomas \nassociados com a doença resultam de uma reação inflamatória peritonial  local, ocasionada \npelos implantes endometriais ectópicos (Lebovic et al., 2001) que sofrem sangramento cíclico \n(Arya e Shaw, 2005). \n\n \n \n3\nMecanismos que associam endometriose com infertilidade têm sido sugeridos, como: \n(1) distorção da anatomia pélvica devido a ad esões endometrióticas, que poderiam prejudicar \na liberação do oócito ou inibir seu transporte; (2) função peritonial alterada em pacientes com \nendometriose devido ao aumento do volume do flui do peritonial, aumento da concentração de \nmacrófagos ativados, prostaglandi nas, interleucina 1 (IL-1), TNF  (tumor necrosis factor ) e \nproteases. Tais alterações causariam efeitos adversos no oócito, espermatozóide e embrião \n(Birmingham, 2006); (3) falha de implantação devido à redução da expressão endometrial de \nα Vβ integrinas (Lessey et al., 1994) e L-selectina em mulheres  com endometriose durante a \nfase de implantação (Genbacev et al. , 2003). Entretanto, a hipótes e de que a doença causa \ninfertilidade ou diminui a fecundidade permanece controversa. \nO diagnóstico de endometriose inicialmente é feito com a história clínica da paciente. \nEntretanto, a sintomatologia variada e sua po bre correlação com a severidade da doença \npodem dificultar este diagnóstico (Vercellini et al , 1991). Na maioria dos casos, a \nendometriose é cirurgicamente estadiada com ba se na localização, extensão e tipo de lesão \npor laparoscopia. Além disso, o diagnóstico fina l é dado pela análise histopatológica da lesão \n(Brosens et al., 2004).  \nA American Society for Reproductive Medicine (1997) organizou e propôs a \nclassificação da endometriose em quatro estadi os: forma mínima (estadio I), leve (II), \nmoderada (III) e severa (IV). Tal método é baseado em um sistema de escores unificados nos \nquatro estadios, na avaliação percentual e volume das lesões, incluindo a predição sobre a \nprobabilidade de gravidez após o tratamento. Embora este método de classificação seja \nmundialmente aceito, ele pobremente prediz a ch ance de gravidez após terapia, devido à \narbitrariedade na atribuição dos escores, que  é feita de acordo com a observação de cada \npatologista (Birmingham, 2006).  \n\n \n \n4\nAlém desta classificação, morfologicamente  os implantes peritoniais e ovarianos \npodem ser diferenciados em: lesões vermelhas, negras (azulada ou arro xeada, pregueada), e \nbrancas (American Society for Reproductive Me dicine, 1997). As lesões vermelhas são mais \nagressivas, ativas, elevadas, apresentando hi stologia semelhante ao epitélio eutópico \nproliferativo (Nisolle e Donnez, 1997). Além di sso, acredita-se serem mais vascularizadas e \ncom maior poder invasivo, correspondendo ao pr imeiro estágio de desenvolvimento da \ndoença. Já as lesões negras, também ativas , correspondem ao estadio mais avançado da \ndoença. As lesões brancas são menos vascular izadas, inativas, aparecem posteriormente às \nlesões negras e apresentam aspecto cicatricial (Nisolle et al., 1993; Brosens, 1994). \nOs exames complementares à laparoscopi a incluem a dosagem sorológica do CA 125 \ne CA 19-9, exames ginecológicos, ultra-sonograf ia transvaginal e a ressonância magnética. \nEntretanto, os mesmos não são adequadamente sensíveis e específicos, sendo a laparoscopia, \napesar de onerosa e invasiva, o método dia gnóstico mais confiável (Thomas, 1995; Rosa e \nSilva, 2007). A ultra-sonografia transvaginal é confiável na detecção de endometriomas, \ncontudo, assim como a ressonância  magnética, falha em detect ar endometriose ovariana e \nperitonial superficiais (Brosens et al, 2004). Embora os antígenos tumorais CA 125 e CA 19-9 \nsejam detectados em maiores concentrações no soro e no fluido peritonial de pacientes com \nendometriose, sendo especificamente correlacionados com a doença, ambos apresentam baixa \nsensibilidade (Foster, 2003). \nO tratamento adequado deve ser individualizado para cada paciente. A recomendação \npara tratamento medicamentoso e/ou cirúrgico de pende da ausência ou pr esença de sintomas, \ngrau da doença, idade da paciente e sua futura ambição de fertilidade. Geralmente, \nrecomenda-se o tratamento cirúrgico quando há danos ovarianos e tubários, cistos \nendometrióticos, outras doenças ginecológicas associadas, ou quando houver falha na terapia \ncom drogas. Já a terapia medicamentosa é mais apropriada em casos de doença recorrente ou \n\n \n \n5\ninício de tratamento. Apenas em casos extrem os indica-se a histerectomia (Thomas, 1995). A \nterapia com drogas padrão para a endometriose  inclui: analgésicos (drogas antiinflamatórias \nnão esteroidais), contraceptivos orais,  agentes androgênicos, progestágenos e \nantiprogestogênicos, antigonado trofinas e análogos do GnRH  (hormônio liberador da \ngonadotrofina) (Mounsey et al , 2006). Tais medicamentos têm alcances variados, mas as \nfunções são as mesmas, incluindo supressão da atividade ovariana, menstrual e atrofia dos \nimplantes endometrióticos (Farquhar, 2007). Embora,  os tipos de tratamentos sejam variados, \na recorrência da endometriose  ocorre em mais de 60% do s casos. Mesmo após terapias \nradicais, como a histerectomia, sua recorrência é de 5 a 10% (Arya e Shaw, 2005). \n \nETIOLOGIA DA ENDOMETRIOSE \nVárias teorias têm sido propostas para explicar as várias localizações da endometriose. \nSão elas: \nA teoria da metaplasia celômica, primeira mente descrita em 1919 por Meyer, sugere \nque o epitélio celômico possa se transformar, por metaplasia em tecido tipo endométrio. Esta \nteoria explicaria a endometriose ovariana e foi estendida para a serosa peritonial, que tem \npotencial de proliferação e diferenciação (Vinatier et al., 2001; Arya e Shaw, 2005). Tal teoria \ntambém é atrativa para explicar a ocorrência de endometriose na ausência de menstruação (El \nMahgoud e Yaseen, 1980). Entretan to, alguns fatores contrários  devem ser considerados: o \nfato que a endometriose ocorre na maioria dos casos quando o endométrio está presente, e \ndesta forma os homens seriam poupados da doença; a endometriose  poderia ocorrer em \nqualquer lugar onde os tecidos são derivados de epitélio celômico; se a metaplasia celômica \nfosse semelhante à metaplasia comum, a freqüê ncia de endometriose seria maior com a idade \n(Vinatier et al., 2001; Nap et al., 2004). \n\n \n \n6\nA teoria de restos embrionários, proposta por Russel (1899), baseia-se na existência de \ncélulas originárias do ducto de Müller com po tencial de desenvolvimento em endométrio \nfuncionante. Questiona-se tal teoria, pois a di stribuição anatômica da endometriose não se \nrelaciona com as vias dos ductos de Müller (Nap et al., 2004). \nAlém disso, acredita-se que essas teorias possam ser vistas como complementares, \npois, metaplasia e crescimento de resí duos Müllerianos podem ser induzidos \nexperimentalmente por debris menstruais (Fujii, 1991). Tal descoberta corrobora com a teoria \nda indução, proposta por Levander e Norman em  1955. Esta teoria, que é uma extensão da \nteoria da metaplasia celômica,  propõe que o endométrio mens trual degradado libera fatores \nendógenos, bioquímicos e imunológicos, que indu zem a metaplasia do epitélio seroso do \novário e as células serosas do mesotélio, resu ltando em tecido endometrial (Arya e Shaw, \n2005).  \nA teoria da implantação metastática ou teor ia de Sampson (1927) propõe que, durante \na menstruação haja um refluxo de tecido endometrial via tuba uterina para dentro da cavidade \nabdominal, onde este tecido poderia implantar. Vários fatores corroboram para esta teoria, que \né a mais aceita para explicar a origem da e ndometriose. São eles:o fluxo menstrual retrógrado \nocorre em 90% das mulheres (Halme et al. , 1984); a presença de células epiteliais \nendometriais viáveis no fluido peritonial (Kruitwagen et al. , 1991), ou seja, as células \nendometriais têm características de adesão, implantação, cresci mento e angiogênese (Viganò \net al , 2004); e a associação entre fluxo menstr ual obstruído e endometriose (Olive e \nHenderson, 1987).  \nEntretanto, é importante salientar que apenas  o refluxo tubário não é suficiente para \nestabelecer a doença, po is, 90% das mulheres possuem mens truação retrógrada e apenas 10 a \n15% desenvolvem endometriose. Assim sendo, após a disseminação das células menstruais, \nalguns estágios são necessários para o estabelecimento e manutenção da doença, como:  \n\n \n \n7\n1) ESCAPE  DO SISTEMA IMUNOLÓGICO \nAcredita-se que a patogênese da doença está  associada com a capacidade das células \nendometriais ectópicas de neutra lizar a resposta imune local, de vido a defeitos no sistema de \nvigilância imunológica e supressão de  células do sistema imune (Lebovic et al. , 2001; \nSiristatidis et al. , 2006). Algumas alteraçõ es em mulheres com endometriose têm sido \ndemonstradas como: a modificação na ex pressão de antígenos do sistema HLA ( human \nlymphocyte antigen) de classe I, que são relevant es no reconhecimento imune (Semino et al., \n1995); a diminuição da atividade de NK ( natural killer ) e citotoxicidade contra as células \nendometriais ectópi cas (Oosterlynck et al. , 1991); a secreção de fatores como TGF- β \n(transforming growth factor) e prostaglandina E2 que inibem as funções dos linfócitos (Hirata \net al., 1994). \n \n2) MECANISMOS DE ADESÃO:  \nAs moléculas de adesão, como integrinas e caderinas, são as principais mediadoras da \nadesão célula-célula e célula-matriz celular, e sua expressão é importante para a adesão \ncelular inicial de tecidos que sofrem descamação (Beliard et al., 1997). Algumas moléculas de \nadesão como as integrinas α 2β1, α 3β1, α 4β1, α 5β1 e E-caderina são expressas em lesões \nendometrióticas, podendo estar associadas com a doença (Witz, 2003).  \n \n3) MECANISMOS DE INVASÃO:  \nO mecanismo de invasão pelo tecido ectópi co é dependente de metaloproteases da \nmatriz (MMP) e de seus inibidores teciduais específicos (TIMPs). As MMPs têm funções \nimportantes no controle de mudanças cíclicas do endométrio, na proliferação e inibição de \ncrescimento, além disso, são reguladas por estrógeno e progesterona (Rodgers et al., 1994). A \nsíntese e secreção desregulada de MMPs po r lesões endometrióticas, combinada com \n\n \n \n8\naberrantes quantidades de TIMPs no fluido peri tonial, podem alterar o ambiente proteolítico \nnormal da cavidade peritonial, induzindo um am biente mais agressivo e facilitando a invasão \ndas células ectópicas (Viganò et al., 2004).  \n \n4) MECANISMOS DE APOPTOSE \nA morte celular programada, comumente c onhecida como apoptose, é um processo \nfisiológico responsável pela manutenção da homeostase celular durante o ciclo menstrual. Ela \nelimina as células senescente s da camada funcional do endomé trio uterino durante a fase \nsecretora tardia do ciclo menstrual, substi tuindo-as por células novas durante a fase \nproliferativa do ciclo. Contudo, em mulheres com endometriose a porcentagem de células que \npassa por apoptose é menor, indicando que al gumas células podem continuar a exibir \natividades fisiológicas errôneas (Dmowski et al., 2001). Várias moléculas regulam a apoptose \ncomo p53, Bax ( BCL2-associated X protein ) e c-myc ( v-myc myelocytomatosis viral \noncogene homolog)  que estimulam a morte celu lar programada, e Bcl-2 ( B-cell \nCLL/lymphoma 2) e Bcl-xL (BCL2-like 1) que inibem a apoptose (Sattler et al., 1997; Harada \net al., 2004). O aumento da Bcl-2 já foi demonstrado em pacientes afetadas por Meresman e \ncolaboradores (2000). \n \n5) NEOVASCULARIZAÇÃO \nA vascularização dos implantes endometr ióticos é provavelmente um dos mais \nimportantes fatores no processo de sobrevivên cia e invasão de outros tecidos. O ambiente \nperitoneal é altamente angiogênico e o aument o na atividade e nas quantidades do VEGF-A \n(vascular endothelial growth factor ) foi demonstrado no fluido peri tonial e no endométrio de \nmulheres com endometriose (Donnez et al., 1998). Além disso, outros fatores angiogênicos, \nincluindo interleucinas 1, 6 e 8, EGF ( epidermal growth factors ), IGF ( insulin-like growth \n\n \n \n9\nfactors) e Endo-I são reconhecidamente expressos pelo endométrio eutópico e ectópico em \npacientes com endometriose (Taylor et al., 2001; Laschke e Menger, 2007). \n \n6) PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS ECTÓPICAS \nA endometriose requer estrógeno para con tinuar proliferando e tende a regredir \nquando é privada deste hormônio. A aromatase é um a enzima que cataliza a biosíntese de \nestrógeno. Considerando que a expressão de arom atase é alta em cistos endometrióticos e \nimplantes endometriais extra-ovarianos, suge re-se que esta expressão aberrante esteja \nenvolvida na patogênese da doença, pois é um estímulo de  crescimento independente do \novário (Zeitoun e Bulun, 1999). Junto com hormôni os esteróides, fatores de crescimento \nespecíficos parecem favorecer a proliferaç ão dos implantes endometrióticos (Taylor et al. , \n2001). \n \nConsiderando as diferentes origens possíveis, localizações e respostas hormonais, foi \nsugerido que a endometriose peritonial, o endometrioma ovariano e os nódulos adenomióticos \ndo septo reto-vaginal seriam três entidades di stintas com diferentes patogêneses (Nisolle e \nDonnez, 1997). Entretanto existem contrové rsias, pois Viganò e colaboradores (2004) \ndescreveram dados patológicos, cirúrgicos e ep idemiológicos que consistentemente sugeriam \nque as lesões peritoniais, ova rianas e profundas constituíam di ferentes expressões de uma \nmesma doença, com um único mecanismo patogênico, isto é, a menstruação retrógrada.  \nDevido às várias teorias apresentadas s obre a patogênese da endometriose e dados \nainda não conclusivos sobre sua origem, sua etiologia é considerada complexa e multifatorial, \nsendo que as teorias propostas devem ser complementares e não exclusivas. \n \n\n \n \n10\nFATORES DE RISCO, ENDOMETRIOSE E CÂNCER \nAlguns estudos sugerem aumento da incidê ncia da endometriose durante a idade \nreprodutiva, sendo rara antes da menarca e com tendência a diminuir depois da menopausa \n(Houston, 1984). Assim sendo, mulheres com menarca precoce ou menopausa tardia têm risco \naumentado de desenvolver a doença, enquanto que mulheres que fazem uso de contraceptivos \norais apresentam risco diminuído (Farquhar, 2 007). Também se sugere que mulheres com \nciclos menstruais curtos e intensos, ou nulíp aras, tenham maior risco de desenvolver a doença \n(Darrow et al. , 1993; Vercellini et al. , 1997; Missmer e Cramer, 2003). Entretanto, outros \nfatores de risco como classe social, raça, alto índice de massa corpórea, uso de álcool, tabaco \ne cafeína são considerados pouco consistentes (Viganò et al., 2004). \nAcredita-se que a endometriose tenha tendênc ia familial, poligênica e multifatorial, \nsendo observado maior risco da doença, de 5 a 8%, em mulheres com histórico familiar \npositivo em parentes de primeiro grau (Bisc hoff e Simpson, 2004). Além disso, estudos de \nligação e em gêmeos têm identificado vários  genes candidatos com potencial biológico \nplausível envolvido com a suscetibilidade para a doença, como genes supressores tumorais \n(PTEN - phosphatase and tensin hom olog, TP53 - tumor protein p53 ), receptores de \nestrógeno, progesterona e andrógeno entre ou tros (Giudice e Kao, 2004). Outros genes \npolimórficos vêm sendo associados à endometriose como GALT (galactose-I-phosphato \nuridly transferase ), NAT2 (N-acetyl transferase 2 ), CYP1A1 (cytochrome P450 1A1 ) e \nGSTM1 (glutathione-S-transferase M1) (Bischoff e Simpson, 2004). \nHá também relatos de algumas alterações genômicas detectadas por CGH \n(comparative genomic  hybridization ) e CGH array em pacientes com endometriose, que \npoderiam estar associadas ao desenvolvimento da doença (Gogusev et al., 1999; Gogusev et \nal., 2000; Guo et al., 2004). O microambiente ovariano e o ambiente peritonial podem estar \ntambém relacionados a essas alterações (Koninckx et al., 1998). \n\n \n \n11\nEmbora alguns dados sugiram aumento de ri sco de câncer ovariano em mulheres com \nendometriose, as evidências biológicas que confirmem a presença da doença como condição \npré-neoplasica são insuficientes. Enquanto a endometriose exibe alguns aspectos de \nmalignidade tais como aumento de cresci mento, vascularização e invasão tecidual, \ncaracterísticas tumorais como expansão monoclonal e anomalias genéticas, permanecem \nindefinidas. (Viganò et al. , 2006). Achados histológicos indicam uma associação entre \nendometriose e carcinoma de células claras de  ovário e carcinoma endometrióide (Vercellini \net al., 1993). Estima-se que 1% dos cas os de endometriose está re lacionado ao câncer, e que \n88,4% dos casos de câncer relacionados à e ndometriose são carcinomas, enquanto apenas \n11,6% são sarcomas (Heaps et al., 1990). Estudos experimentais em camundongos indicam os \ngenes Pten e K-ras (v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog ) como envolvidos \nno desenvolvimento de endometriose e/ou carcino ma endometrióide ovariano (Dinulescu et \nal., 2005). \n \nTÉCNICAS DE DETECÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM ENDOMETRIOSE \nAlguns estudos visam detectar o perfil de expressão gênica diferencial em lesões \nendometrióticas, bem como nos tecidos eutópi cos de mulheres com e sem endometriose. \nEyster e colaboradores ( 2002) usaram a técnica de microarray para comparar endométrio \neutópico e implantes endometrióticos de três  pacientes na fase proliferativa do ciclo \nmenstrual, identificando genes do citoesque leto e com funções no sistema imune como \ndiferencialmente expressos. Outra publicação  comparou o perfil de expressão em endométrio \neutópico de mulheres com e sem endometriose na fase s ecretora do ciclo menstrual, \nidentificando moléculas como interleucinas (IL)-1 β e IL-G, TNF e VEGF como desreguladas \nna endometriose (Giudice et al. , 2001). Paralelamente a este trabalho, Kao e colaboradores \ncompararam o endométrio eutópico de mulheres  com e sem endometriose, mas na “janela de \n\n \n \n12\nimplantação” (2003). Neste trabalho, os dados foram divididos em três grupos: grupo 1, onde \nos genes que são superexpressos normalmente na “janela de implantação” encontram-se \nmenos expressos em mulheres com endometri ose; grupo 2, onde genes normalmente menos \nexpressos têm expressão aumentada em mulheres com a doença; e grupo 3, onde genes menos \nexpressos no tecido normal têm expressão aind a menor no tecido eutópi co das pacientes com \nendometriose. Outra publicação descreveu o perfil de expressão co mparando endometriose \novariana com tecido eutópico das mesmas pacientes nas fases proliferativa e secretora do \nciclo menstrual (Arimoto et al. , 2003). Matsuzaki e colaboradores (2005) compararam \nendométrio normal de mulheres sem endometr iose com lesões endometrióticas profundas \ntambém nas fases proliferativa e secretora. Esses trabalhos utilizaram a técnica de microarray \nde cDNA, o que representa um problema, pois os microarrays tipicamente usam  chips  \ncomerciais fabricados com out ras finalidades que não estudos  direcionados à doença em \ninvestigação (Bischoff e Simpson, 2004). Para lelamente, os genes analisados são pré-\ndeterminados, dificultando o screening completo e característico das lesões. \nTécnicas de screening que poderiam contornar este prob lema incluem as bibliotecas \nde SH ( Subtraction Hybridization ), as bibliotecas de SAGE ( Serial Analysis of Gene \nExpression), RDA ( Representational Difference Analysis ) entre outras (J iang e Fisher, 1993; \nHubank e Schatz, 1994; Velculescu et al., 1995). As bibliotecas de hibridação subtrativa são \nbibliotecas de cDNAs deriva das de dois grupos celulares distintos, onde um deles é \nrepresentado em excesso durante  a hibridação subtrativa. Tal técnica permite isolar cDNAs \nque são representativos apenas de um  dos dois grupos an alisados (Taylor et al. , 2002). A \ntécnica de RaSH ( Rapid Subtraction Hybridization), descrita por Jiang e colaboradores  \n(2000), é uma metodologia simplificada de hibridaç ão subtrativa, que consiste na digestão \nenzimática de cDNAs de dupla fita em pequ enos fragmentos, ligados a adaptadores e \namplificados por PCR, seguido de incubação dos fragmentos de PCR tester com excesso de \n\n \n \n13\nfragmentos driver para hibridação e subtração. Hu e colaboradores  (2006) usaram a \nmetodologia de hibridação subtrativa para compar ar o perfil de expressã o gênica entre tecido \nectópico de lesões peritoniais e tecido eutópico  das mesmas mulheres nas fases proliferativa e \nsecretora do ciclo menstrual. Eles identific aram 14 possíveis candi datos com importante \nfunção na patogênese da endometriose. \n \nMudanças na expressão gênica em dete rminado momento são determinantes em \nprocessos fisiológicos normais e anormais . Explicar os mecanismos relacionados à \nfisiopatologia complexa da endometriose, buscando esclarecer o perfil da expressão gênica e a \nfunção de genes envolvidos em tais fenômenos, permitiria elucidar o ambiente molecular das \nlesões endometrióticas. Futuramente, novos mar cadores moleculares podem ser identificados, \npermitindo um diagnóstico menos invasivo e possíveis terapêuticas. Neste trabalho, \ninvestigamos o perfil de expressão gênica diferencial entre lesões endometrióticas (peritoniais \ne ovarianas) e endométrio eutópico das mesmas pacientes, na fase proliferativa inicial do ciclo \nmenstrual.  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nO\nBJETIVOS \n \n \n \n\n \n \n15\nO objetivo principal deste trabalho é analisar  a expressão gênica diferencial em lesões \nendometrióticas peritoniais e ovarianas e em tecido eutópico das mesmas pacientes, pela \ntécnica de RaSH.  \nOs objetivos intermediários foram: \n(1) analisar o perfil de expressão em lesões endometrióticas e em endométrio eutópico de \npacientes com diagnóstico confirmado de endometriose; \n(2) identificar genes candidatos relacionados à fisiopatologia da doença; \n(3) comparar o padrão de expressão dos genes selecionados em lesões peritoniais e \nendometriomas ovarianos.  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nM\nATERIAL E MÉTODOS \n \n \n \n\n \n \n17\nEste estudo foi desenvolvido no Laboratório  de Genética Molecular e Citogenética \nMolecular Humana, do Departamento de Genétic a da Faculdade de Me dicina de Ribeirão \nPreto da Universidade de São Paulo (FMRP-US P, Brasil), em colaboração com o serviço de \nReprodução Humana do Departamento de Gine cologia e Obstetrícia da FMRP-USP, com o \nGrupo de Bioinformática da FMRP-USP, e com apoio dos laboratórios de Genética Molecular \ne Bioinformática da Fundação Hemocentro e de Oncologia Pediátrica do Departamento de \nPediatria e Puericultura da FMRP-USP. O proj eto foi aprovado pelo Comitê de Ética em \nPesquisa (CEP) do Hospital das Clínic as da FMRP-USP, processo HCRP n o 11736/2004 \n(Anexo A). Todas as pacientes pa rticipantes da pesquisa assinaram o termo de consentimento \nlivre e esclarecido.  \n \nCASUÍSTICA \nForam selecionadas 28 pacientes, que preencher am os seguintes critérios de inclusão: \npacientes em idade reprodutiva (18 a 40 anos),  no início da fase proliferativa do ciclo \nmenstrual (dias 5-8), apresentando ciclos mens truais regulares e sem história de uso de \nqualquer tipo de terapia hormonal nos últimos seis meses antes da coleta. O estadio da \nendometriose foi determinado de acordo com a classificação da American Society for \nReproductive Medicine (American Society for Reproductive Medicine, 1997). \nAs pacientes foram divididas em dois grupos: grupo controle, com onze pacientes sem \ndiagnóstico de endometriose e/ou infertilidade, encaminhadas ao serviço pelo Ambulatório de \nPlanejamento Familiar com indicação para la queadura tubária; grupo afetado, com dezessete \npacientes com diagnóstico de endometriose, sendo que, dez pacientes foram encaminhadas ao \nserviço para laparoscopia pe lo Ambulatório de Dor Pélv ica e Endoscopia (AGDE) com \nindicação de dor pélvica, e sete foram encaminhadas pelo Ambulatório de Infertilidade \nConjugal do HCFMRP-USP com indicação de infertilidade.  \n\n \n \n18\nAMOSTRAS \nAs biópsias de endométrio das pacientes do grupo controle (n=11) foram coletadas \nutilizando Cureta de Novak.  \nAs biópsias de endométrio eutópico (n= 17) e ectópico (n=17)  das pacientes com \ndiagnóstico de endometriose foram coletadas por laparoscopia. Das dezessete biópsias de \nendométrio ectópico, oito eram lesões peritoniai s (4 vermelhas e 4 negras), sendo quatro em \nestadio II, duas em estadio III e duas em estadio IV, e nove corresponderam a lesões \novarianas (endometrioma ovariano) em estadios III (2) e IV (7). A confirmação diagnóstica \nfoi feita após análise histopatológica de toda s as amostras. As amostras foram armazenadas \nem freezer a -80\n0C após tratamento com criopreservador Tissue-Teck®  O.C.T. Compound  \n(Sakura Finetek USA. Inc., Torrance, CA). \n \nISOLAMENTO DO RNA TOTAL \nAs amostras foram lavadas em so lução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na 2HPO4 \n1,11g/L; Na 2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH 2PO4 0,20g/L pH7,0) para retirar o criopreservador \ndos tecidos. Em seguida, extraiu-se R NA total (50mg de tecido) com TRIZOL ®  Reagent \n(Invitrogen Life Technologies , Paisley,UK) de acordo com as instruções do fabricante. A \nintegridade do RNA foi analisada por eletrofo rese. As concentrações de RNA total foram \nmedidas em espectrofotômetro a densidade óptica de 260nm. O RNA permaneceu \narmazenado à -80\n0C para procedimentos posteriores. \n \nRÁPIDA HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA DE CDNA (RASH) \nOs procedimentos da técnica de RaSH  adotados neste trabalho seguiram a \nmetodologia descrita por Jiang e colaboradores (2000). Foram construídas duas bibliotecas de \nhibridação subtrativa de cDNA denominadas  de RHENDN e RHENEN. Na biblioteca \n\n \n \n19\nRHENDN, o tester é o cDNA obtido do pool de RNA do tecido eutópico, enquanto que, na \nRHENEN, utilizou-se o RNA do tecido ectópico como tester. Seis amostras pareadas foram \nescolhidas aleatoriamente para  a construção das bibliotecas , sendo, seis de endométrio \nectópico (3 lesões ovarianas e 3 peritoniais) e seis de endo métrio eutópico das mesmas \npacientes. O protocolo está brevemente descrito abaixo: \n \nSíntese do cDNA \nA partir do pool de 25 µg de RNA total, utilizando mesma concentração de cada \namostra, sintetizamos cDNAs de dupla fita utilizando 200U da enzima SuperScriptTM II \nReverse Transcriptase (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), 1x First Strand Buffer  \n(Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK), 200 µM de cada dNTP, e 0,5 µg de oligo(dT) 12-\n18 (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK) , para síntese da primeira fita. Para a síntese da \nsegunda fita, foram utilizados 10U de E. coli DNA ligase  ( Invitrogen Life Technologies , \nPaisley, UK) e 40U de E. coli DNA Polymerase I  ( Invitrogen), 2U de E.coli RNase H  \n(Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), 200 µM de cada dNTP, 1x Second Buffer  \n(Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK). O gene ACTB (actin beta) foi amplificado por \nPCR, a partir do cDNA sintetizado, para aval iar a qualidade da síntese. Os cDNAs foram \nextraídos por fenol/clorofórmio (1:1) e precipitado com etanol. \n \nDigestão Enzimática com MboI e Ligação dos Adaptadores \nOs cDNAs foram digeridos com 20U da enzima de restrição MboI ( Invitrogen Life \nTechnologies, Paisley, UK) por 1 hora a 37 0C, e em seguida extrairam- se os fragmentos pelo \nmétodo fenol/clorofórmio (1:1), precipitados com etanol. Os fragmentos foram ligados com \n20 µM dos adaptadores XDPN-14 - 5’ CTGATCACTCGAGA - 3’e XDPN-12- 5’GATC \nTCTCGAGT3’, usando 1x T4 DNA Ligase Buffer (Invitrogen Life Technologies , Paisley, \n\n \n \n20\nUK), 9U T4 DNA Ligase (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), e a mistura incubada a \n140C overnight. \n \nPCR e Purificação dos Produtos \nPara checar a ligação aos ad aptadores e amplificar o cDNA digerido, este foi diluído \ncom LoTE (3mM Tris-HCL, pH 7,5; 0,2 mM EDTA pH 7,5) ( Invitrogen Life Technologies , \nPaisley, UK), em um volume final de 100µL; e 2µL do cDNA foram amplificados com 10µM \ndo primer XDPN-18 - 5’CTGATCACTCGAGAGATC3’ (complementar aos adaptadores), \n1U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), 200 µM de cada \ndNTP, 1x Taq Buffer (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK). Foram realizadas 20 \nreações de PCR nestas condições, e em seguida  os produtos foram misturados e purificados \npor fenol/clorofórmio e precipitados com etanol. \nTodos estes procedimentos foram realizados para o cDNA obtido do pool de RNA \ntanto do tecido eutópico como do tecido ectópico. \n \nDigestão do teste  \nForam digeridos 10 µg do tester (eutópico ou ectópico) com 20U da enzima XhoI \n(Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) por 6h à 37 °C. O produto foi extraído com \nfenol/clorofórmio e precipitado com etanol.  \n \nHibridação Subtrativa \nNa construção da biblioteca RHENDN, 100 ηg do tester (eutópico) foram misturados \ncom 5 µg do driver (ectópico). Assim como na RHENEN, 100 ηg do tester (ectópico) foram \nmisturados com 5µg do driver (eutópico). Foram ad icionados à mistura tester/driver, 16,6 µl \nda Solução de Hibridação (0,5M de NaCl; 50mM de Tris/HCl; SDS 0,2%; formamida 40%). \n\n \n \n21\nApós denaturação a 100 0C por 5 minutos, a solução foi incubada a 42 0C por 48 h. Em \nseguida, a mistura da hibridação foi extraída por  fenol/clorofórmio, precipitada com etanol e \ndiluída em LoTE. \n \nLigação ao plasmídeo pZErO® -1 e Transformação Bacteriana \nTrês microlitros da solução de hibridação foram ligados à 1 µg do plasmídeo pZErO\n® -\n1 ( Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK), previamente digerido com a enzima de \nrestrição XhoI, e a soluçnao incubada a 16 0C por 3 horas. Em seguida, realizamos a \neletroporação a 2,5 V, 25 µFD e 200 OHMS para transformação das bactérias competentes \nOne Shot®  Top 10 Eletrocomp ™  E. coli (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) com 2 \nµL dos plasmídeos recombinantes.  \n \nScreening das Colônias e Análise por Seqüenciamento \nAs colônias foram randomicamente seleci onadas e amplificadas por PCR com os \nprimers M13 forward - 5’CATTTTGCTGCCGGTC3’ e M13 reverse – \n5’CAGGAAACAGCTATGACC3’ para a confir mação do inserto. Após confirmação, o \nproduto foi seqüenciado no MegaBaceTM 1000 (Amesham Biosciences, Piscataway, NJ, USA ) \nutilizando DYEnamic ET Dye Terminator  Sequencing Kit  ( Amesham Biosciences, \nPiscataway, NJ, USA), segundo as normas do fornecedor. \n \nANÁLISES POR BIOINFORMÁTICA \nAs seqüências obtidas foram analisadas pelos softwares Phred (Ewing et al. , 1998; \nEwing e Green, 1998) e Phrap (Green, 1996) utilizando os seguintes padrões: phred cutoff de \n0,09, cross_match versão 0,990319, minmatch 10, minscore 20; e foram aceitas seqüências \ncom o mínimo de 100pb com qualidade. Após estas análises, as se qüências de melhor \n\n \n \n22\nqualidade foram submetidas ao programa de alinhamento blast (Altschul et al., 1990). Estas \ncomparações foram feitas contra os bancos  de dados: do genoma mitocondrial humano \n(blastn, evalue=1e-05), genoma de bactérias ( blastn, evalue=1e -30), seqüências do fungo \nSaccharomyces ( blastn, evalue=1e-30), proteínas ribossomais ( blastx, evalue=1e-30), RefSeq \nhumano (blastn, evalue=1e-30), seqüências do UniGene (blastn, evalue=1e-25), ESTs humanas \n(blastn, evalue=1e-20), nr humano ( blastx, evalue=1e-20), e nr não humano ( blastx, evalue=1e-\n15 ). \nA partir dos resultados do blast, apenas com o banco obtido de RefSeq, (seqüências de \nreferência) foram selecionadas as seqüências que no alinhamento apresentavam no mínimo  \n90% do comprimento da seqüência alvo. Devido ao  critério de seleção adotado, os genes \nselecionados do blast podem ser considerados homólogos às seqüências encontradas nas \nbibliotecas. Assim, estes genes foram categorizados quanto suas funções em processos \nbiológicos, função molecular e component e celular de acordo com os termos do Gene \nOntology (GO) (http://www.geneontology.org). \nAlém disso, para encontrar associações fe itas entre dados na literatura sobre \nendometriose e os genes obtidos nas bibliotecas, usamos o programa de busca de acesso \npúblico PDQ wizard v.0.1 Searching PubMed  (Grimes et al. , 2006) disponível on line  \n(http://www.gti.ed.ac.uk/pdqwizard\n). \n \nVALIDAÇÃO DOS DADOS DA RASH POR PCR EM TEMPO REAL  \nPara validar os dados de expressão gênica diferencial obtidos pela metodologia de \nhibridação subtrativa de cDNA, ap licamos a técnica de PCR em tempo real para seis genes. \nPara a seleção dos genes consideramos: quantas  vezes suas seqüências foram obtidas, e sua \nfunção relacionada à etiologia da do ença. Os genes selecionados foram: SPARC (secreted \nprotein, acidic, cysteine-rich – 10 vezes) e CTGF (connective tissue growth factor  – 7 vezes) \n\n \n \n23\nencontrados como superexpressos no  endométrio ectópico; e os genes PAEP (progestagen-\nassociated endometrial protein  – 126 vezes) , IGFBP1 (insulin-like growth factor binding \nprotein 1  – 6 vezes) , MMP3 (matrix metallopeptidase 3  – 23 vezes)  e MYC (v-myc \nmyelocytomatosis viral oncogene homolog  – 2 vezes) encontrados como menos expressos no \nendométrio ectópico.  \nUm micrograma de RNA total de cada amos tra foi transcrito reversamente usando o \nHigh Capacity cDNA Archive Kit (A pplied Biosystems, Warrington, UK)  segundo as \ninstruções do fabricante. Das 45 amostras totais  coletadas, 44 (10 de endométrio controle, 17 \nde tecidos eutópicos e 17 de t ecidos ectópicos) foram analisadas para a quantificação relativa \nda expressão dos genes selecionados no aparelho ABI PRISM TM 7500 Sequence Detection \nSystems (Applied Biosystems, Warrington, UK). Uma das amostras de endométrio controle foi \nescolhida aleatoriamente como calibrador da reação. As reações foram executadas utilizando \no sistema TaqMan® Gene Expression Assays  (TaqMan® MGB probes, FAM™ dye-labeled)  \nda Applied Biosystems . As sondas e os primers para os genes PAEP (Hs01046125_m1), \nCTGF (Hs00170014_m1), IGFBP1 (Hs00236877_m1), MMP3 (Hs00968308_m1), SPARC \n(Hs00277762_m1), MYC (Hs00153408_m1) e GAPDH (g lyceraldehyde-3phosphate \ndehydrogenase) (Hs99999905_m1, controle endógeno) foram obtidos usando Assay-on-\nDemand™ Gene Expression Products (App lied Biosystems, Warrington, UK) . Para testar a \neficiência das sondas e primers na reação de amplificação dos genes foram construídas curvas \nde calibração a partir de dilu ições seriadas (não diluído, 10 -1, 10-2 e 10 -3), em triplicata, do \ncDNA obtido por pool de quantidades iguais de todas as amostras. A curva-padrão foi \nconstruída a partir da curva de calibraçã o. Foram consideradas as curvas-padrão com slope \nentre -3,6 e -3,1. As figuras 1 e 2 representam, respectivamente, a curva de calibração e curva-\npadrão construídas para o gene MMP3. \n\n \n \n24\nA PCR em tempo real foi realizada para cada amostra em duplicata seguindo as \nseguintes condições: 10 µL do TaqMan® Universal PCR Master Mix  (2x) ( Applied \nBiosystems, Warrington, UK), 1 µL do TaqMan® Gene Expression Assay Mix (20X) (Applied \nBiosystems, Warrington, UK) e 9 µL de cDNA diluído (diluição de 1/50) em volume final de \n2 0µL reação. As condições da reação foram 50º C por 2 minutos, então 95ºC por 10 minutos, \nseguidos de 40 ciclos a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. \nO nível de expressão para os genes anal isados foi calculado para cada amostra de \nacordo com o método de 2 -∆∆CT (ou 2-Ct), descrito previamente no Applied Biosystems User \nBulletin # 2  (PN 4303859) ( Applied Biosystems, Warrington, UK ) e citado na literatura \n(Schmittgen et al., 2000; Livak and Schmittgen, 2001). O GAPDH (controle endógeno) e o \ncalibrador foram usados como normalizadores para os cálculos do 2-∆∆CT.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n25\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 1: Curva de calibração para o gene MMP3. Foi colocada a fluorescência \nda amplificação versus o número de ciclos da PCR. \nFonte: ABI PRISM\nTM 7500 Sequence Detection Systems  ( Applied Biosystems, \nWarrington, UK). \n \nFigura 2: Curva-padrão do gene MMP3 indicando um slope de – 3,1. \nFonte: ABI PRISM TM 7500 Sequence Detection Systems  ( Applied \nBiosystems, Warrington, UK). \n \n\n \n \n26\nANÁLISE ESTATÍSTICA \nA variável expressão gênica foi transformada pelo log 10. A transformação logarítmica \nfoi necessária, pois não foi atendida uma das suposições (linearidade)  feitas em análises \nempregando-se os modelos lineares. Estas an álises especificam que a média condicional \nE(y⏐x = x 0) da variável resposta y dado o valor x 0 do vetor preditor x, é linear em x 0. A \naplicação dos modelos lineares pode ser es tendida supondo-se que uma transformação \napropriada da variável respos ta dada por t(y), em que E {t(y)⏐x}, seja linear em x, na função \nt(y) = β0 + βTx + ε, para β0 e βT desconhecidos. O termo ε (erro aleatório) é independente de x \ne tem média zero (Cook and Weisberg, 1994). \nAs análises estatísticas foram realizadas no software SAS 2003  (2002-2003, SAS \nInstitute Inc., Cary, NC, USA). Aplicamos o Teste T não pareado para comparar as médias de \nexpressão dos genes obtidas entre: (1) endométri o controle de mulheres sem endometriose e \nendométrio eutópico de mulheres com endome triose, e (2) tecido ectópico peritonial e \nectópico ovariano. Usou-se o Teste de T pareado para comparar as médias de expressão dos \ngenes obtidas entre: (3) tecido eutópico e ectópico (lesões peritoniais + endometrioma \novariano), (4) tecido eutópico e ectópico de pa cientes com lesões peritoniais, e (5) tecido \neutópico e ectópico de pacientes com lesões ovarianas. T odos os testes foram realizados \nconforme os procedimentos GLM. Além disso, foram feitas análises de correlação pelo PROC \nCORR entre os níveis de expressão gênica obtid os nos tecidos ectópicos com o estadiamento \ndas lesões. Análises com P < 0,05 foram consideradas significantes.  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nR\nESULTADOS \n \n \n \n \n\n \n \n28\nBIBLIOTECAS DE HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA DE CDNA (RASH) \nApós a confecção das bibliotecas, 768 cl ones foram obtidos para a biblioteca \nRHENDN, dos quais 627 eram seqüências de qualidade, categorizadas  como: mitocondrial \n(176), EST do fungo Saccharomyces (0), UniGene (4), outros não redundantes (1), ribossomal \n(16), EST Humano (8), bactérias (2) (dados sumarizados tabela I - Anexo B), e RefSeq (420). \nJá para a RHENEN, obteve-se 1056 clones, dos quais 712 tinham qualidade e foram \nclassificadas como: mitocondrial (39), EST do fungo Saccharomyces (3), UniGene (21), \noutros não redundantes (1 ), ribossomal (136), EST Humano (18), bactérias (4) (dados \nsumarizados na tabela I - Anexo B), e RefSeq (490). As seqüências listadas como \nmitocondrial, EST do fungo Saccharomyces, bactérias, e outros não redundantes foram \nconsideradas como contaminantes. \nDas 910 RefSeq, 109 foram excluídas das análises como falso-positivas (tabela II - \nAnexo C), pois apareceram em ambas as bi bliotecas. Assim, após a seleção das RefSeq que \napresentaram no mínimo 90% de homol ogia com a seqüência alvo do alinhamento, \npermaneceram: 345 RefSeq para a biblioteca RHENDN e 380 para a RHENEN. Estas \nseqüências estão sumarizadas na tabela III (aba ixo), que representa os genes superexpressos e \nos menos expressos no tecido ectópico co mparado com o eutópico de mulheres com \nendometriose.  \n \n\n \n \n29\nTabela III: Estão representados abaixo os genes superexpressos e menos expressos no tecido ectópico em relação ao eutópico de m ulheres com \nendometriose, localização cromossômica, alterações cromossômicas e referências relacionadas à endometriose. \n \n \nGENES SUPEREXPRESSOS \nN◦ Acesso Descrição Símbolo \nNúmero de \nSeqüências \nLocalização \nCromossômica\nAlterações \nGenomicas CGH \n(Gogusev et al.,  \n1999; Gogusev et \nal., 2000) \nReferencias \nGenes x \nEndometriose \nNM_015381 \nfamily with sequence similarity 19 (chemokine \n(C-C motif)-like), member A5  FAM19A5 1  22q13.32     \nNM_013349 \n \nneuron derived neurotrophic factor NENF 1 1q32.3  Ganho 1q   \nNM_153005 \n \nRIO kinase 1 (yeast) RIOK1 1 6p24.3  Ganho 6p   \nNM_002510 \n \nglycoprotein (transmembrane) nmb  GPNMB 1 7p15     \nNM_005973 \npapillary renal cell carcinoma (translocation-\nassociated) PRCC 1 1q21.1  Ganho 1q   \nNM_000671 \nalcohol dehydrogenase 5 (class III), chi \npolypeptide (ADH5)  ADH5 1  4q21-q25     \nNM_004899 \nbrain and reproductive organ-expressed \n(TNFRSF1A modulator) BRE 2 2p23.2     \nNM_019054 \n \nfamily with sequence similarity 35, member A FAM35A 1 10q23.2     \nNM_015393 \n \nDKFZP564O0823 protein DKFZP564O0823 1 4q13.3-q21.3     \n \n \n    \n \n \n \nContinua \n\n \n \n30\n \n \n    Continuação \nNM_001008215 \n \nhypothetical protein MGC52110   MGC52110 1  2q11.2     \nNM_006886 \nATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 \ncomplex, epsilon subunit ATP5E 1 20q13.32     \nNM_001012506 \n \ncoiled-coil domain containing 66   CCDC66 1  3p14.3     \nNM_001011655 \n \ntransmembrane protein 44  TMEM44 1  3q29     \nNM_018255 elongation protein 2 homolog (S. cerevisiae) ELP2 1 18q12.2     \nNM_014188 \nSSU72 RNA polymerase II CTD phosphatase \nhomolog (S. cerevisiae) SSU72 1 1p36.33     \nNM_001037163 \n \nhypothetical protein LOC84792  MGC12966 1  7p22.1     \nNM_006493 \n \nceroid-lipofuscinosis, neuronal 5 CLN5 1 13q21.1-q32   \n Montagna et \nal., 2007. \nNM_005578 \nLIM domain containing preferred translocation \npartner in lipoma LPP 1 3q28     \nNM_006572 \nguanine nucleotide binding protein (G protein), \nalpha 13 GNA13 1 17q24.3  Ganho 17q   \nNM_005114 \nheparan sulfate (glucosamine) 3-O-\nsulfotransferase 1 HS3ST1 1 4p16     \nNM_001039591 \n \nubiquitin specific peptidase 9, X-linked  USP9X 1  Xp11.4     \nNM_006196 poly(rC) binding protein 1 PCBP1 1 2p13-p12     \nNM_170740 \naldehyde dehydrogenase 5 family, member A1 \n(succinate-semialdehyde dehydrogenase) ALDH5A1 1 6p22.2-p22.3  Ganho 6p   \nNM_012420 \ninterferon-induced protein with tetratricopeptide \nrepeats 5 IFIT5 1 10q23.31     \nNM_001032383 \n \npolyglutamine binding protein 1  PQBP1 1  Xp11.23     \nNM_014924 \n \nKIAA0831 KIAA0831 1 14q22.3     \nNM_002165 \ninhibitor of DNA binding 1, dominant negative \nhelix-loop-helix protein  ID1 1  20q11     \n\n \n \n31\n      Continuação \nNM_022484 \n \ntransmembrane protein 168 TMEM168 1 7q31.32  Ganho 7q   \nNM_015932 proteasome maturation protein POMP 1 13q12.3     \nNM_003014 \n \nsecreted frizzled-related protein 4 SFRP4 1 7p14.1     \nNM_020122 \n \npotassium channel modulatory factor 1 KCMF1 1 2p11.2     \nNM_203330 \n \nCD59 molecule, complement regulatory protein CD59 1 11p13     \nNM_182810 \nactivating transcription factor 4 (tax-responsive \nenhancer element B67) ATF4 1 22q13.1     \nNM_001386 \n \ndihydropyrimidinase-like 2  DPYSL2 1  8p22-p21     \nNM_138786 \n \ntransmembrane 4 L six family member 18 TM4SF18 1 3q25.1     \nNM_021999 \n \nintegral membrane protein 2B ITM2B 1 13q14.3     \nNM_012072 \n \nCD93 molecule CD93 1 20p11.21     \nNM_002795 \nproteasome (prosome, macropain) subunit, beta \ntype, 3  PSMB3 1  17q12  Ganho 17q   \nNM_000712 \n \nbiliverdin reductase A   BLVRA 1  7p14-cen     \nNM_001007224 \n \nGTPase, IMAP family member 6  GIMAP6 1 7q36.1  Ganho 7q   \nNM_033429 \n \ncalmodulin-like 4 CALML4 1 15q23     \nNM_015972 \n \npolymerase (RNA) I polypeptide D, 16kDa POLR1D 1 13q12.2     \nNM_003375 \n \nvoltage-dependent anion channel 2 VDAC2 1 10q22     \nNM_015190 \n \nDnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 9 DNAJC9 1 10q22.2     \nNM_002970 \n \nspermidine/spermine N1-acetyltransferase SAT1 1 Xp22.1     \n\n \n \n32\n      Continuação \nNM_001025368 \n \nvascular endothelial growth factor A  VEGFA 1  6p12  Ganho 6p \nGarcía-Manero \net al., 2007. \nNM_015483 \nkelch repeat and BTB (POZ) domain containing \n2 KBTBD2 1 7p14.3     \nNM_017747 \n \nankyrin repeat and KH domain containing 1 ANKHD1 1 5q31.3     \nNM_014267 \n \nchromosome 11 open reading frame 58 C11orf58 1 11p15.1     \nNM_007236 \n \ncalcium binding protein P22 CHP 1 15q13.3     \nNM_001031684 \n \nsplicing factor, arginine/serine-rich 7, 35kDa  SFRS7 1  2p22.1     \nNM_016085 \n \nchromosome 2 open reading frame 28 C2orf28 1 2p23.3     \nNM_003302 \n \nthyroid hormone receptor interactor 6 TRIP6 1 7q22  Ganho 7q   \nNM_020121 \n \nUDP-glucose ceramide glucosyltransferase-like 2 UGCGL2 1 13q32.1     \nNM_004568 \nserpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), \nmember 6 SERPINB6 1 6p25  Ganho 6p   \nNM_003994 \n \nKIT ligand KITLG 1 12q22   \nOsuga et al., \n2000.  \nNM_003336 \nubiquitin-conjugating enzyme E2A (RAD6 \nhomolog) UBE2A 1 Xq24-q25     \nNM_000466 \n \nperoxisome biogenesis factor 1  PEX1 1  7q21.2  Ganho 7q   \nNM_002078 \n \ngolgi autoantigen, golgin subfamily a, 4  GOLGA4 1  3p22-p21.3     \nNM_006694 \n \njumping translocation breakpoint JTB 1 1q21  Ganho 1q   \nNM_002399 Meis homeobox MEIS2 1  15q14     \nNM_016282 \n \nadenylate kinase 3 AK3 1 9p24.1-p24.3     \nNM_000019 \nHomo sapiens acetyl-Coenzyme A \nacetyltransferase 1  ACAT1 1  11q22.3-q23.1     \n\n \n \n33\n      Continuação \nNM_005803 \n \nflotillin 1 FLOT1 1 6p21.3  Ganho 6p   \nNM_002484 \nnucleotide binding protein 1 (MinD homolog, E. \ncoli)  NUBP1 1 16p13.13     \nNM_004938 \n \ndeath-associated protein kinase 1 DAPK1 1 9q34.1     \nNM_016299 \n \nheat shock 70kDa protein 14  HSPA14 1 10p13     \nNM_001967 \neukaryotic translation initiation factor 4A, \nisoform 2  EIF4A2 1  3q28     \nNM_001539 \n \nDnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 1  DNAJA1 1  9p13-p12     \nNM_000107 \n \ndamage-specific DNA binding protein 2, 48kDa  DDB2 1 11p12-p11     \nNM_000184 \n \nhemoglobin, gamma G   HBG2 1  11p15.5     \nNM_198530 \n \nmatrix-remodelling associated 7 MXRA7 1 17q25.1-q25.2  Ganho 17q   \nNM_001514 \n \ngeneral transcription factor IIB  GTF2B 1  1p22-p21     \nNM_003199 \n \ntranscription factor 4 TCF4 1 18q21.1     \nNM_005066 \nsplicing factor proline/glutamine-rich \n(polypyrimidine tract binding protein associated) SFPQ 1 1p34.3     \nNM_006636 \nmethylenetetrahydrofolate dehydrogenase \n(NADP+ dependent) 2, methenyltetrahydrofolate \ncyclohydrolase MTHFD2 1 2p13.1     \nNM_001001522 \n \ntransgelin  TAGLN 1  11q23.2   \n Kyama et al., \n2006 \nNM_018222 \n \nparvin, alpha PARVA 1 11p15.3     \nNM_000378 \n \nWilms tumor 1  WT1 1  11p13   \nMatsuzaki et \nal., 2006.  \nNM_016107 \n \nzinc finger RNA binding protein ZFR 1 5p13.3     \n       \n\n \n \n34\nContinuação \nNM_018025 \n \nG patch domain containing 1 GPATCH1 1 19q13.11     \nNM_006169 \n \nnicotinamide N-methyltransferase NNMT 1 11q23.1     \nNM_006324 \n \ncraniofacial development protein 1 CFDP1 1 16q22.2-q22.3    \nNM_020154 \n \nchromosome 15 open reading frame 24 C15orf24 1 15q14     \nNM_019048 \n \nasparagine synthetase domain containing 1 ASNSD1 1 2p24.3-q21.3     \nXM_943856 \nPREDICTED: hypothetical protein LOC648185, \ntranscript variant 1 LOC648186 1       \nNM_020532 \n \nreticulon 4  RTN4 1 2p16.3     \nNM_001031700 \n \nchromosome 4 open reading frame 18  C4orf18 1  4q32.1     \nNM_152280 \n \nsynaptotagmin XI SYT11 1 1q21.2  Ganho 1q   \nNM_001204 \nbone morphogenetic protein receptor, type II \n(serine/threonine kinase)  BMPR2 1  2q33-q34     \nNM_032784 \n \nR-spondin 3 homolog (Xenopus laevis) RSPO3 1 6q22.33  Ganho 6q   \nNM_001568 \neukaryotic translation initiation factor 3, subunit \n6 48kDa  EIF3S6 1  8q22-q23     \nNM_014236 \n \nglyceronephosphate O-acyltransferase GNPAT 1 1q42  Ganho 1q   \nNM_001293 \n \nchloride channel, nucleotide-sensitive, 1A  CLNS1A 1  11q13.5-q14     \nNM_004162 \n \nRAB5A, member RAS oncogene family RAB5A 1 3p24-p22     \nNM_002696 \npolymerase (RNA) II (DNA directed) \npolypeptide G  POLR2G 1 11q13.1     \nNM_053025 \n \nmyosin, light chain kinase MYLK 1 3q21     \nNM_022488 \nATG3 autophagy related 3 homolog (S. \ncerevisiae) ATG3 1 3q13.2     \n\n \n \n35\n      Continuação \nNM_002667 \n \nphospholamban PLN 1 6q22.1  Ganho 6q   \nNM_002222 \n \ninositol 1,4,5-triphosphate receptor, type 1  ITPR1 1  3p26-p25     \nNM_004277 solute carrier family 25, member 27 SLC25A27 1 6p11.2-q12  Ganho 6p   \nNM_017599 \nvezatin, adherens junctions transmembrane \nprotein VEZT 1 12q22     \nNM_001025079 \n \nCD47 molecule   CD47 1  3q13.1-q13.2     \nNM_017680 \n \nasporin ASPN 1 9q22     \nNM_002072 \nguanine nucleotide binding protein (G protein), q \npolypeptide  GNAQ 1 9q21     \nNM_003349 \n \nubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1  Kua-UEV 1 20q13.2     \nNM_001037637 \n \nbasic transcription factor 3   BTF3 1  5q13.2     \nNM_005084 \nphospholipase A2, group VII (platelet-activating \nfactor acetylhydrolase, plasma) PLA2G7 1 6p21.2-p12  Ganho 6p   \nNM_182490 \n \nzinc finger protein 227 ZNF227 1 19q13.32     \nNM_022059 \n \nchemokine (C-X-C motif) ligand 16 CXCL16 1 17p13     \nNM_002300 \n \nlactate dehydrogenase B  LDHB 1  12p12.2-p12.1     \nNM_020313 \n \ncytokine induced apoptosis inhibitor 1 CIAPIN1 1 16q13-q21    \nNM_016047 \n \nsplicing factor 3B, 14 kDa subunit SF3B14 1 2pter-p25.1     \nNM_198178 \n \nmicrophthalmia-associated transcription factor MITF 1 3p14.2-p14.1     \nNM_199189 \n \nmatrin 3 MATR3 1 5q31.2     \nNM_001020658 \n \npumilio homolog 1 (Drosophila)  PUM1 1  1p35.2     \n       \n\n \n \n36\nContinuação \nNM_153000 \n \nadenomatosis polyposis coli down-regulated 1 APCDD1 1 18p11.22     \nNM_001015881 \n \nTSC22 domain family, member 3  TSC22D3 1  Xq22.3     \nNM_006003 \nubiquinol-cytochrome c reductase, Rieske iron-\nsulfur polypeptide 1 UQCRFS1 1 19q12-q13.1     \nNM_001031713 \n \nchromosome 6 open reading frame 79   CCDC90A 1  6p24.3-p23  Ganho 6p   \nNM_001839 \n \ncalponin 3, acidic  CNN3 1  1p22-p21     \nNM_001039367 \nATPase, H+ transporting, lysosomal 31kDa, V1 \nsubunit E1  \n ATP6V1E1 1  22q11.1     \nNM_001008897 \n \nt-complex 1   TCP1 2  6q25.3-q26  Ganho 6q   \nNM_015291 \n \nDnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 16 DNAJC16 2 1p36.1     \nNM_006197 \n \npericentriolar material 1 PCM1 2 8p22-p21.3     \nNM_206839 \n \nmortality factor 4 like 1 MORF4L1 2 15q24     \nXM_942776 \nPREDICTED: synaptopodin 2, transcript variant \n3 SYNPO2 2       \nNM_016091 \neukaryotic translation initiation factor 3, subunit \n6 interacting protein EIF3S6IP 2 22q     \nNM_006628 \n \ncyclic AMP phosphoprotein, 19 kD ARPP-19 2 15q21.2     \nNM_138290 \n \nRap2-binding protein 9 RPIB9 2 7q21.12  Ganho 7q   \nNM_198467 \n \nround spermatid basic protein 1-like RSBN1L 2 7q11.23  Ganho 7q   \nNM_003850 \n \nsuccinate-CoA ligase, ADP-forming, beta subunit SUCLA2 2 13q12.2-q13.3     \nNM_001748 \n \ncalpain 2, (m/II) large subunit  CAPN2 2  1q41-q42  Ganho 1q   \nNM_002264 \n \nkaryopherin alpha 1 (importin alpha 5) KPNA1 2  3q21     \n\n \n \n37\n      Continuação \nNM_002023 \n \nfibromodulin  FMOD 2  1q32  Ganho 1q   \nNM_018374 \n \ntransmembrane protein 106B TMEM106B 2 7p21.3     \nNM_013236 \n \nataxin 10 ATXN10 2 22q13.31     \nNR_001564 \n \nX (inactive)-specific transcript XIST 2 Xq13.2     \nNM_004990 \n \nmethionine-tRNA synthetase MARS 2 12q13.2     \nNM_000454 \nsuperoxide dismutase 1, soluble (amyotrophic \nlateral sclerosis 1 (adult) (SOD1)  SOD1 2  21q22.11     \nNM_001001395 \n \nLIM domain only 3 (rhombotin-like 2)  LMO3 2  12p12.3     \nNM_001039618 CREB/ATF bZIP transcription factor  CREBZF 2  11q14     \nNM_007168 \nATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), \nmember 8 ABCA8 2 17q24  Ganho 17q   \nNM_000177 \n \ngelsolin (amyloidosis, Finnish type)   GSN 2  9q33     \nNM_002738 \n \nprotein kinase C, beta 1  PRKCB1 2 16p11.2    \nNM_013448 \n \nbromodomain adjacent to zinc finger domain, 1A BAZ1A 2 14q12-q13     \nNM_173473 \n \nchromosome 10 open reading frame 104 C10orf104 2 10q22.1     \nNM_213674 \n \ntropomyosin 2 (beta) TPM2 2 9p13.2-p13.1     \nNM_013254 \n \nTANK-binding kinase 1 TBK1 2 12q14.1     \nNM_005506 \n \nscavenger receptor class B, member 2 SCARB2 2 4q21.1     \nNM_001031679 \n \nmethionine sulfoxide reductase B3   MSRB3 2  12q14.3     \nNM_199511 \n \ncoiled-coil domain containing 80 CCDC80 2 3q13.2     \n\n \n \n38\n \n \n    Continuação \nNM_013234 \neukaryotic translation initiation factor 3, subunit \n12 EIF3S12 2 19q13.2     \nNM_020338 zinc finger, MIZ-type containing 1 ZMIZ1 2 10q22.3     \nNM_138957 \n \nmitogen-activated protein kinase 1  MAPK1  2  22q11.21      \nXM_371853 \nPREDICTED: similar to 60S ribosomal protein \nL27a  LOC389435 2       \nNM_001615 \n \nactin, gamma 2, smooth muscle, enteric  ACTG2 2  2p13.1     \nNM_001001894 \n \ntetratricopeptide repeat domain 3   TTC3 3  21q22.2     \nNM_005724 \n \ntetraspanin 3 TSPAN3 3 15q24.3     \nNM_206876 \nprotein phosphatase 1, catalytic subunit, beta \nisoform  PPP1CB  3  2p23      \nNM_015375 \n \nreceptor interacting protein kinase 5 RIPK5 3 1q32.1  Ganho 1q   \nNM_000943 \n \npeptidylprolyl isomerase C (cyclophilin C)   PPIC 3  5q23.2     \nNM_000700 \n \nannexin A1  ANXA1 3  9q12-q21.2     \nNM_002802 \nproteasome (prosome, macropain) 26S subunit, \nATPase, 1  PSMC1 3  14q32.11     \nNM_014585 \nsolute carrier family 40 (iron-regulated \ntransporter), member 1 SLC40A1 3 2q32     \nNM_000426 \nlaminin, alpha 2 (merosin, congenital muscular \ndystrophy)  LAMA2 3 6q22-q23  Ganho 6q   \nNM_006513 \n \nseryl-tRNA synthetase SARS 3 1p13.3-p13.1     \nNM_014367 \n \nchromsome 3 open reading frame 28 C3orf28 3 3q21.1     \nNM_003756 \neukaryotic translation initiation factor 3, subunit \n3 gamma, 40kDa EIF3S3 3  8q24.11     \nNM_004684 \n \nSPARC-like 1 (mast9, hevin) SPARCL1 4 4q22.1     \n\n \n \n39\n      Continuação \nNM_004064 \n \ncyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1) CDKN1B 4 12p13.1-p12   \n Matsuzaki et \nal., 2001. \nNM_012134 \nleiomodin 1 (smooth muscle) LMOD1 4 1q32  Ganho 1q   \nNM_002345 \n \nlumican  LUM 4  12q21.3-q22     \nNM_001780 \n \nCD63 molecule  CD63 4  12q12-q13     \nNM_022138 \n \nSPARC related modular calcium binding 2 SMOC2 4 6q27  Ganho 6q   \nNM_201442 \n \ncomplement component 1, s subcomponent C1S 4 12p13     \nNM_001743 \n \ncalmodulin 2 (phosphorylase kinase, delta)  CALM2 4  2p21     \nNM_006360 \nPCI domain containing 1 (herpesvirus entry \nmediator) PCID1 4 11p13     \nNM_003295 \n \ntumor protein, translationally-controlled 1 TPT1 4 13q12-q14     \nNM_002166 \ninhibitor of DNA binding 2, dominant negative \nhelix-loop-helix protein  ID2 5  2p25     \nNM_004048 \n \nbeta-2-microglobulin B2M 5 15q21-q22.2   \nSomigliana et \nal., 2001.  \nNM_201348 \nproline/arginine-rich end leucine-rich repeat \nprotein PRELP 5 1q32  Ganho 1q   \nNM_001018020 \n \ntropomyosin 1 (alpha)   TPM1 5  15q22.1     \nNM_004537 \n \nnucleosome assembly protein 1-like 1 NAP1L1 5 12q21.2     \nNM_003333 \nubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion \nproduct 1 UBA52 6 19p13.1-p12     \nNM_014624 \n \nS100 calcium binding protein A6 S100A6 7 1q21  Ganho 1q   \nNM_001901 \n \nconnective tissue growth factor  CTGF 7  6q23.1  Ganho 6q \nFlores et al., \n2007. \nNM_006098 \nguanine nucleotide binding protein (G protein), \nbeta polypeptide 2-like 1 GNB2L1 9 5q35.3     \n\n \n \n40\n \n \n    Continuação \nNM_003118 \nsecreted protein, aci dic, cysteine-rich \n(osteonectin)  SPARC 10  5q31.3-q32     \nNM_033138 \n \ncaldesmon 1 CALD1 17 7q33  Ganho 7q   \nNM_001613 \n \nactin, alpha 2, smooth muscle, aorta  ACTA2 29  10q23.3     \n      \n \n380       \nGENES MENOS EXPRESSOS \nN◦ Acesso Descrição Simbolos \nNúmero de \nSeqüências \nLocalização \nCromossomica\n Alterações \nGenomicas CGH \n(Gogusev et al., \n1999; Gogusev et \nal., 2000) \nReferencias \nGenes x \nEndometriose \nNM_032940 \npolymerase (RNA) II (DNA directed) \npolypeptide C, 33kDa   POLR2C  1   16q13-q21    \nNM_181472 \nCKLF-like MARVEL transmembrane domain \ncontaining 7   CMTM7  1   3p22.3    \nNM_002568 \n \npoly(A) binding protein, cytoplasmic 1   PABPC1  1   8q22.2-q23    \nNM_014300 \n \nSEC11-like 1 (S. cerevisiae)   SEC11A  1   15q25.3    \nNM_018509 \n \nleucine rich repeat containing 59   LRRC59  1   17q21.33    \nNM_015330 \n \nSPECC1-like   SPECC1L  1   22q11.23  Perda 22q  \nNM_080821 \n \nchromosome 20 open reading frame 108   C20orf108  1   20q13.2    \nNM_001014795 \n \nintegrin-linked kinase   ILK  1   11p15.5-p15.4   \nNM_005907 \n \nmannosidase, alpha, class 1A, member 1   MAN1A1  1   6q22    \nXM_934318 \nPREDICTED: similar to eukaryotic translation \ninitiation factor 3, subunit 8   LOC653352  1    \n       \n\n \n \n41\nContinuação \nNM_012426 \n \nsplicing factor 3b, subunit 3, 130kDa   SF3B3  1   16q22.1    \nNM_001002292 \n \nG protein-coupled receptor 177   GPR177  1   1p31.3  Perda 1p  \nNM_144570 \n \nchromosome 16 open reading frame 34   HN1L  1   16p13.3    \nNM_006601 \n \nprostaglandin E synthase 3 (cytosolic)   PTGES3  1   12q13.3    \nNM_004047 \nATPase, H+ transporting, lysosomal 21kDa, V0 \nsubunit b   ATP6V0B  1   1p32.3  Perda 1p  \nNM_000715 \n \ncomplement component 4 binding protein, alpha   C4BPA  1   1q32    \nNM_006022 \n \nTSC22 domain family, member 1   TSC22D1  1   13q14    \nNM_207307 \n \nchromosome 3 open reading frame 25   C3orf25  1   3q21.3    \nNM_002423 \n \nmatrix metalloproteinase 7 (matrilysin, uterine)   MMP7  1   11q21-q22   \nBruner-Tran et \nal., 2006. \nNM_003754 \neukaryotic translation initiation factor 3, subunit \n5 epsilon, 47kDa   EIF3S5  1   11p15.4    \nNM_001797 \n \ncadherin 11, type 2, OB-cadherin (osteoblast)   CDH11  1   16q22.1    \nNM_014064 \n \nchromosome 9 open reading frame 32   C9orf32  1   9q34.11  Perda 9q  \nNM_014306 \n \nchromosome 22 open reading frame 28   C22orf28  1   22q12  Perda 22q  \nNM_001005335 \n \nheterogeneous nuclear ribonucleoprotein L   HNRPL  1   19q13.2    \nNM_175932 \nproteasome (prosome, macropain) 26S subunit, \nnon-ATPase, 13   PSMD13  1   11p15.5    \nNM_001428 \n \nenolase 1, (alpha)   ENO1  1   1p36.3-p36.2 Perda 1p  \nNM_030767 \n \nAT-hook transcription factor   AKNA  1   9q32  Perda 9q  \nNM_145729 \n \nmitochondrial ribosomal protein L24   MRPL24  1   1q21-q22    \nNM_003720 \n \nDown syndrome critical region gene 2   DSCR2  1   21q22.3    \n\n \n \n42\n      Continuação \nNM_022075 \nLAG1 homolog, ceramide synthase 2 (S. \ncerevisiae)   LASS2  1   1q21.2    \nNM_002950 \n \nribophorin I   RPN1  1   3q21.3    \nNM_000088 \n \ncollagen, type I, alpha 1   COL1A1  1   17q21.33    \nNM_003564 \n \ntransgelin 2   TAGLN2  1   1q21-q25    \nNM_001012663 \nsolute carrier family 3 (activators of dibasic and \nneutral amino acid transport), member 2   SLC3A2  1   11q13    \nNM_003580 \nneutral sphingomyelinase (N-SMase) activation \nassociated factor   NSMAF  1   8q12-q13    \nNM_022762 \nrequired for meiotic nuclear division 5 homolog \nB (S. cerevisiae)   RMND5B  1   5q35.3    \nNM_019894 \n \ntransmembrane protease, serine 4   TMPRSS4  1   11q23.3    \nNM_001001998 \n \nexosome component 10   EXOSC10  1   1p36.22  Perda 1p  \nNM_000942 \n \npeptidylprolyl isomerase B (cyclophilin B)   PPIB  1   15q21-q22    \nNM_198334 \n \nglucosidase, alpha; neutral AB   GANAB  1   11q12.3    \nNM_001017402 \n \nlaminin, beta 3   LAMB3  1   1q32    \nNM_021729 \nvacuolar protein sorting 11 homolog (S. \ncerevisiae)   VPS11  1   11q23    \nNM_015070 \n \nzinc finger CCCH-type containing 13   ZC3H13  1   13q14.12    \nNM_031457 \nmembrane-spanning 4-domains, subfamily A, \nmember 8B   MS4A8B  1   11q12.2    \nNM_002117 \n \nmajor histocompatibility complex, class I, C   HLA-C  1   6p21.3   \nKusume et al., \n2005. \nNM_000597 \ninsulin-like growth factor binding protein 2, \n36kDa   IGFBP2  1   2q33-q34   \nTang et al., \n1994. \nNM_005204 \n \nmitogen-activated protein kinase kinase kinase 8   MAP3K8  1   10p11.23    \nNM_004078 \n \ncysteine and glycine-rich protein 1   CSRP1  1   1q32    \n\n \n \n43\n      Continuação \nNM_004394 \n \ndeath-associated protein   DAP  1   5p15.2    \nNM_173728 \nRho guanine nucleotide exchange factor (GEF) \n15   ARHGEF15  1   17p13.1    \nNM_001669 \n \narylsulfatase D   ARSD  2   Xp22.3    \nNM_005168 \n \nRho family GTPase 3   RND3  2   2q23.3    \nNM_000362 \nTIMP metallopeptidase inhibitor 3 (Sorsby \nfundus dystrophy, pseudoinflammatory)   TIMP3  2   22q12.3  Perda 22q  \nNM_006816 \n \nlectin, mannose-binding 2   LMAN2  2   5q35.3    \nNM_016057 \n \ncoatomer protein complex, subunit zeta 1   COPZ1  2   12q13.2-q13.3   \nNM_001733 \n \ncomplement component 1, r subcomponent   C1R  2   12p13    \nNM_152927 \n \ncopine I   CPNE1  2   20q11.22    \nNM_003321 \n \nTu translation elongation factor, mitochondrial   TUFM  2   16p11.2    \nNM_006801 \nKDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) endoplasmic \nreticulum protein retention receptor 1   KDELR1  2   19q13.3    \nNM_004356 \n \nCD81 molecule   CD81  2   11p15.5    \nNM_000358 \n \ntransforming growth factor, beta-induced, 68kDa   TGFBI  2   5q31   \nArimoto et al., \n2003. \nNM_003355 \nuncoupling protein 2 (mitochondrial, proton \ncarrier)   UCP2  2   11q13    \nNM_002467 \nv-myc myelocytomatosis viral oncogene \nhomolog (avian)   MYC  2   8q24.21   \nJohnson et al., \n2005. \nNM_006701 \n \nthioredoxin-like 4A   TXNL4A  2   18q23    \nNM_052886 \n \nmal, T-cell differentiation protein 2   MAL2  2   8q23    \nNM_014764 \n \nDAZ associated protein 2   DAZAP2  2   12q12    \n       \n\n \n \n44\nContinuação \nNM_015343 \n \ndullard homolog (Xenopus laevis)   DULLARD  2   17p13    \nXM_932704 \nPREDICTED: similar to 60S ribosomal protein \nL29 (Cell surface heparin binding protein HIP)   LOC643433  1    \nNM_016395 \nprotein tyrosine phosphatase-like A domain \ncontaining 1   PTPLAD1  2   15q22.2    \nNM_001540 \n \nheat shock 27kDa protein 1   HSPB1  2   7q11.23   \nEl-Ghobashy et \nal., 2005 \nNM_004285 \nhexose-6-phosphate dehydrogenase (glucose 1-\ndehydrogenase)   H6PD  1   1p36  Perda 1p  \nNM_001034850 \n \nfamily with sequence similarity 134, member B   FAM134B  1   5p15.1    \nNM_005347 \nheat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated \nprotein, 78kDa)   HSPA5  2   9q33-q34.1  Perda 9q  \nNM_014372 \n \nring finger protein 11   RNF11  2   1pter-p22.1  Perda 1p  \nNM_177967 \n \nUBA domain containing 2   UBAC2  2   13q32.3    \nNM_015331 \n \nnicastrin   NCSTN  2   1q22-q23    \nNM_001349 \n \naspartyl-tRNA synthetase   DARS  2   2q21.3    \nNM_001001481 \n \nubiquitin-conjugating enzyme E2W (putative)   UBE2W  2   8q21.11    \nNM_002425 \n \nmatrix metallopeptidase 10 (stromelysin 2)   MMP10  2   11q22.3    \nNM_001469 \nX-ray repair complementing defective repair in \nChinese hamster cells 6 (Ku autoantigen, 70kDa)   XRCC6  2 \n  22q13.2-\nq13.31  Perda 22q  \nNM_007355 \nheat shock protein 90kDa alpha (cytosolic), class \nB member 1   HSP90AB1  3   6p12    \nNM_057164 \n \ncollagen, type VI, alpha 3   COL6A3  3   2q37    \nNM_005040 \n \nprolylcarboxypeptidase (angiotensinase C)   PRCP  3   11q14    \nNM_003128 \n \nspectrin, beta, non-erythrocytic 1   SPTBN1  3   2p21    \n       \n\n \n \n45\nContinuação \nNM_005727 \n \ntetraspanin 1   TSPAN1  3   1p34.1  Perda 1p  \nNM_002797 \nproteasome (prosome, macropain) subunit, beta \ntype, 5   PSMB5  3   14q11.2    \nNM_006732 \nFBJ murine osteosarcoma viral oncogene \nhomolog B   FOSB  2   19q13.32    \nNM_020130 \n \nchromosome 8 open reading frame 4   C8orf4  3   8p11.2    \nNM_001940 \n \natrophin 1   ATN1  3   12p13.31    \nNM_014713 \nlysosomal-associated pr otein transmembrane 4 \nalpha   LAPTM4A  3   2p24.1    \nNM_001101 \n \nHomo sapiens actin, beta   ACTB  4   7p15-p12    \nNM_002087 \n \ngranulin   GRN  3   17q21.32    \nNM_014679 \n \ncentrosomal protein 57kDa   CEP57  1   11q21    \nNM_175744 \n \nras homolog gene family, member C   RHOC  4   1p13.1  Perda 1p  \nNM_005566 \n \nlactate dehydrogenase A   LDHA  4   11p15.4    \nNM_001002235 \nserpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 \nantiproteinase, antitrypsin), member 1   SERPINA1  6   14q32.1    \nNM_000596 \n \ninsulin-like growth factor binding protein 1   IGFBP1  6   7p13-p12   \nKlemmt et al., \n2006 \nNM_001961 \n \neukaryotic translation elongation factor 2   EEF2  7   19pter-q12    \nNM_002422 \nmatrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, \nprogelatinase)   MMP3  23   11q22.3   \nUzan et al., \n2004 \nNM_000518 \n \nhemoglobin, beta   HBB  25   11p15.5    \nNM_001018049 \n \nprogestagen-associated endometrial protein    PAEP  126   9q34  Perda 9q \nCornillie et al., \n1991. \n      345     \n \n\n \n \n46\n \nPortanto, foram identificados 191 genes supe rexpressos e 100 genes menos expressos. \nAlém disso, estão destacadas nesta tabela, as referências na literatura que previamente \nassociaram os genes encontrados com a doença,  bem como, suas localizações cromossômicas \ne em quais destas regiões, já foram encontrada s, por CGH, alterações genômicas em lesões \nendometrióticas. \nA tabela IV (anexo D) apresenta a ca tegorização dos gene s encontrados nas \nbibliotecas quanto suas participações em processos biológicos. Esses genes foram \nrelacionados a 283 processos biológicos diferentes. \n \nVALIDAÇÃO POR PCR EM TEMPO REAL \nPara a validação da RaSH foram selecionados dois genes ( CTGF e SPARC) indicados \ncomo superexpressos e quatro genes (MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP) como menos expressos \nno endométrio ectópico. Todas as análises de  PCR aplicadas aos seis genes validaram os \ndados encontrados pela metodologia RaSH nas bibliotecas. Estes resu ltados, indicados nas \nfiguras por (3), podem ser observados nas figuras 3, 4 e 5. \nTambém estão representados nestas figuras os demais dados de quantificação relativa, \nsegundo o método 2 -∆∆CT (ou 2-Ct), observados para as e xpressões gênicas analisadas nos \ndiferentes tecidos estudados, assim como, estão indicados por * quais destas diferenças foram \nsignificativas. Não detectamos correlação significativa entre os níveis de expressão obtidos no \nendométrio ectópico e o estadiamento da doença. \n\n \n \n47\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 3: Dados da PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC apontados como superexpressos pela RaSH no \nendométrio ectópico. NE= endométrio controle (n=10), EU = e ndométrio eutópico (n=17), EC = endométrio ectópico (n=17, \nperitonial + ovariana), EC_P = ectópico pe ritonial (n=8), EC_O = ectópico ovariano (n=9), EU_P = eutópico de pacientes \ncom lesão peritonial (n=8) e EU_O = eutópico de pacientes com lesão ovariana. Os números em parênteses foram usados para \nindicar as comparações entre: (1) NE x EU, (2) EC_P x EC _O, (3) EU x EC, (4) EU_P x EC_P e (5) EU_O x EC_O. As \ncomparações marcadas por * apresentaram diferença significativa com P ≤ 0,05. \n(1) (3) (4) (5) (2) \n(1) (3)* (4)* (5) (2)* \n\n \n \n48\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 4: Dados da PCR em tempo real para os genes MYC e MMP3 apontados como menos e xpressos pela RaSH no \nendométrio ectópico. NE= endométrio controle (n=10), EU = e ndométrio eutópico (n=17), EC= endométrio ectópico (n=17, \nperitonial + ovariana), EC_P = ectópico pe ritonial (n=8), EC_O = ectópico ovariano (n=9), EU_P = eutópico de pacientes \ncom lesão peritonial (n=8) e EU_O = eutópico de pacientes com lesão ovariana. Os números em parênteses foram usados para \nindicar as comparações entre: (1) NE x EU, (2) EC_P x EC _O, (3) EU x EC, (4) EU_P x EC_P e (5) EU_O x EC_O. As \ncomparações marcadas por * apresentaram diferença significativa com P ≤ 0,05. \n(1) (3) (4)* (5) (2)\n(1) (3)* (4)[ (5)* (2)\n\n \n \n49\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 5: Dados do RT-PCR em tempo real para os genes IGFBP1 e PAEP apontados como menos expressos pela RaSH no \nendométrio ectópico. NE= endométrio controle (n=10), EU = e ndométrio eutópico (n=17), EC = endométrio ectópico (n=17, \nperitonial + ovariana), EC_P = ectópico pe ritonial (n=8), EC_O = ectópico ovariano (n=9), EU_P = eutópico de pacientes \ncom lesão peritonial (n=8) e EU_O = eutópico de pacientes com lesão ovariana. Os números em parênteses foram usados para \nindicar as comparações entre: (1) NE x EU, (2) EC_P x EC _O, (3) EU x EC, (4) EU_P x EC_P e (5) EU_O x EC_O. As \ncomparações marcadas por * apresentaram diferença significativa com P ≤ 0,05. \n(1) (3) (4)* (5) (2)* \n(1) (3)* (4)* (5)* (2) \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nD\nISCUSSÃO\n\n \n \n51\n \nBuscando elucidar o perfil de expressão gênica nas lesões endometrióticas e identificar \ngenes que estejam envolvidos com esta doe nça complexa, vários trabalhos envolvendo a \ntécnica de microarranjos  foram realizados (Giudice et al., 2001; Eyster et al., 2002; Lebovic \net al., 2002; Arimoto  et al. , 2003; Kao et al., 2003; Absenger et al., 2004; Matsuzaki et al., \n2004; Matsuzaki et al. , 2005; Kato et al. , 2006; Wu et al. , 2006; Flores et al. , 2007). A \naplicação desta técnica no estudo da endomet riose é problemática, pois são usados chips \ncomerciais fabricados para outras finalid ades que não estudos direcionados à doença \n(Bischoff e Simpson, 2004), somando-se o fato dos genes analisados serem pré-determinados, \nnão permitindo o screening completo e característico das lesões.  \nAssim, as bibliotecas de hibridação subtrativas são técnicas de screening que \ncontornam este problema. A biblioteca de hibr idação subtrativa rápida  (RaSH) isola genes \ndiferencialmente expressos, incluindo novos gene s e transcritos raros. Além disso, apresenta \nvantagens em relação às demais técnicas de hibridação subtrativa, pois simplifica os passos de \nhibridação e subtração. Além de ser eficient e na subtração diminuindo os falso-positivos, \npode ser realizada de fo rma menos onerosa (Jiang et al., 2000). Hu e colaboradores (2006) \naplicaram a técnica de hibridação subtrativa de  fase sólida usando beads magnéticos em \nendométrios eutópico e ectópico de mulheres  com endometriose peritonial, nas fases \nproliferativa e secretora do cicl o menstrual. No presente trabalho, foram analisados também \nendométrios eutópico e ectópico de mulheres  com endometriose, entretanto, selecionamos \npacientes na fase proliferativa inicial do ci clo menstrual, incluindo lesões peritoniais e \novarianas. Já que o perfil de expressão gênica é variável com as fases do ciclo menstrual, a \nescolha de uma fase específica do ciclo, bem como a seleção de amostras pareadas é \nfundamental para homogeneização das variações cíclicas e individuais.  \nA metodologia RaSH foi eficiente em detectar  transcritos diferencialmente expressos, \npois obtivemos 1339 seqüências de qualidade, que após rigorosas seleções e classificações \n\n \n \n52\n \nresultaram em 291 genes indicados como desregulados, sendo 191 superexpressos e 100 \nmenos expressos nas lesões (Tabela III). Embora  a técnica tenha sido eficiente em detectar \ndiferenças na expressão gênica, ela possui cer ta limitação. Nem todas as seqüências de cDNA \ncomuns podem ser completamente removidas após a subtração (Hu et al. , 2006). Uma \nmaneira de detectar esses falso-positivos é realizar duas bibliotecas: inicialmente o tester é \navaliado como tester, a seguir ele passa a ser usado como driver. Seguindo este princípio, \nconstruímos duas bibliotecas: RHENEN ( tester=ectópico X driver=eutópico) e RHENDN \n(tester=eutópico x driver=ectópico), que indicaram 13% de seqüências falso-positivas entre as \nRefseq.  \nProcurando comparar os genes encontrados no presente trabalho com dados descritos \nna literatura, encontramos 17 genes que já foram associados à endometriose, como por \nexemplo MYC, MMP3,IGFBP1,CTGF e PAEP, e 274 genes que ainda não foram estudados \nna doença, e que portanto são alvos pa ra análises futuras, entre eles o SPARC. Além disso, \ncomparando as localizações cromossômicas dos genes obtidos com as regiões que apresentam \nalterações genômicas detectadas previamente em lesões endometrióticas por CGH, 36 genes \nsuperexpressos e 16 genes menos expressos estava m em regiões de ganho e perda de material \ngenômico, respectivamente (Tabela III). Entre estes genes, encontram-se o PAEP em região \nde perda 9q e CTGF em região de ganho 6q. Já foi demonstrado que alterações genômicas em \npacientes com endometriose podem estar associadas ao desenvolvimento da doença (Gogusev \net al. , 1999; Gogusev et al. , 2000), o que poderia justifi car alguns dados de expressão \ndiferencial encontrados. \nAlguns eventos são necessários para o estabe lecimento da endometr iose, tanto para a \nimplantação como para manutenção do tecido ectópico. Tais eventos são: fluxo menstrual \nretrógrado seguido de escape do sistema imune pelas células endometrióticas, adesão, \ninvasão, proliferação celular, inibição de apoptose, angiogênese, produção local de estrógenos \n\n \n \n53\n \ne resposta à lesão (Nap et al., 2004). A desregulação de genes que estejam envolvidos com \nestes processos pode levar ao estabelecimento e sobrevivência dos implantes endometrióticos. \nPortanto, após o agrupamento dos genes diferencialmente expressos quanto a sua participação \nem processos biológicos (Anexo D), relacionamos 283 processos diferentes, dos quais os mais \nrelevantes para a doença foram: angiogênese (2 genes), adesão celular (18), motilidade celular \n(14), proliferação celular (18), resposta de defesa (7), processos do sistema imune (13), \nproteólise (17), regulação do cres cimento celular (4), resposta à lesão (9), remodelamento \ntecidual (3), comunicação celular (49), diferenc iação celular (24) e morte celular programada \n(15). \nPara a validação das bibliotecas subtrativas foram selecionados os genes  CTGF e \nSPARC encontrados como superexpressos e os genes PAEP, IGFBP1, MMP3 e MYC \nencontrados como menos expressos no endométrio  ectópico. Além de analisar os dados nas \n12 amostras utilizadas para a construção das bibliotecas, ampliamos o número amostral para \n44 (10 endométrios controles de mulheres sem endometriose, 17 tecidos eutópicos e 17 \ntecidos ectópicos de mulheres com endometri ose, sendo 8 peritoniais e 9 ovarianas) com o \nintuito de estabelecer possível envolvimento dos genes com a doença. \nTodos os genes validaram as diferenças de  expressão detectadas  pelas bibliotecas. \nEntretanto, estas diferenças fo ram significativas entre os grupos  de endométrio eutópico e \nectópico (todas as lesões) apenas para os genes SPARC, MMP3 e PAEP. Quando as análises \nforam feitas separando-se o grupo de lesões peritoniais dos endometriomas ovarianos e \ncomparando-os com seus tecidos autólogos, difere nças significativas na s lesões peritoniais \nforam obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP  e nos endometriomas ovarianos \npara os genes MMP3 e PAEP. Além disso, os genes SPARC e IGFBP1 mostraram diferenças \nsignificativas de expressão, quando comparamos  as lesões peritoniais com as ovarianas. \nProvavelmente, o agrupamento das lesões tenha mascarado diferenças de expressão que são \n\n \n \n54\n \ncaracterísticas específicas dos locais onde as  lesões se formam. Assim, as diferenças \nobservadas entre o endométrio eutópico e as le sões endometrióticas de pacientes afetadas \npodem ser explicadas como conseqüência direta  dos diferentes ambientes endócrinos, como o \nfluido peritonial e o microambiente intra-ovaria no das lesões, em relação ao ambiente intra-\nuterino (Koninckx et al., 1998).  \nO SPARC é uma proteína matricelular anti-adesiva que media as interações entre a \nmatriz extracelular e as célul as (Bradshaw e Sage, 2001). Tal gene está envolvido em vários \nprocessos biológicos incluindo remodelamento tecidual, adesão ce lular, angiogênese, \nproliferação, migração e invasão tumoral (Bradshaw e Sage, 2001; Kato et al., 2001, Framson \ne Sage, 2004). A superexpressão do SPARC já foi associada a diminuição de E-caderina em \nmelanoma aumentando o potenci al invasivo do tumor (Smit et al. , 2007), ao aumento de \nmotilidade celular em câncer de mama devido suas propriedades anti-adesivas (Briggs et al., \n2002; Campo Mcknight et al., 2006) e estimulação do VEGF em células endoteliais levando \nao aumento de angiogênese (Kato et al., 2001). Além disso, foi demonstrado que o SPARC \ntem efeito de regulação positiva sobre CTGF, e este por sua vez responde ao SPARC por \nfeedback negativo (Zhou et al., 2006). O CTGF é um membro da família das CCN ( Cyr61, \nCTGF, NOV), que parece estar envolvido em diversas  funções celulares como a proliferação, \nadesão, migração, apoptose, produção da matriz  extracelular, desenvolvimento embrionário, \ndiferenciação tecidual, angiogê nese, cicatrização, além de estar associado com várias \npatologias como fibrose, inflamação e crescimento tumoral (Lau e Lam, 1999; Moussad e \nBrigstock, 2000; Rageh et al. , 2001). Absenger e colaborador es (2004) detectaram um \naumento de expressão do CTFG no endométrio eutópico de p acientes com endometriose em \nrelação ao endométrio c ontrole, por técnica de microarrays. Posteriormente, também foi \ndetectada uma superexpressão deste gene em le sões endometrióticas induzidas em modelo \nanimal (Flores et al., 2007). Embora diferenças significativas entre os endométrios eutópico e \n\n \n \n55\n \nectópico tenham sido detectadas apenas para o SPARC, é provável que a expressão alterada \ndestes dois genes permita o estabelecimento e manutenção dos implantes endometrióticos, por \nregularem mecanismos de invasão e angiogênese.  \nO desarranjo da matriz extracelular é um evento normal e essencial para o \ndesenvolvimento embrionário, morfogênese, reprodução, reabsorção e remodelamento \ntecidual. As MMPs e seus inibidores (TIMPs ) têm participação essencial neste evento \n(Nagase e Woessner, 1999). Embora a expre ssão endometrial das MMPs e TIMPs seja \nregulada ciclicamente (Goffin et al., 2003), perfis alterados de e xpressão têm sido detectados \nem tecidos de endométrio ectópico e eutópico de pacientes com endometriose, o que pode ser \nresultado da falta de resposta à progesterona encontrada em mulheres com esta doença. Tal \ndeficiência de resposta pode  estar associada com a falh a na supressão das MMPs e \nconsequentemente invasão do tecido endometrial em locais extra-uterinos (Bruner-Tran et al., \n2002). Gilabert-Estellés e colaboradores (2003) encontraram uma maior expressão da MMP-3 \nem tecido endometrial eutópico de mulheres com endometriose que no endométrio controle. \nAlém disso, detectaram uma menor atividade proteolítica em endometrioma ovariano, como \nresultado da superexpressão do TIMP-I. Cont udo, Uzan e colaboradores (2004) detectaram \numa maior expressão da MMP-3 no endométrio normal de mulheres sem endometriose em \nrelação ao eutópico de paci entes com endometriose. Além  disso, mostraram uma maior \nexpressão desta metaloproteínase em endome triose colo-retal, qua ndo comparada a lesões \nperitoniais e endometrioma ovariano. Neste trabalho, encontramos uma menor expressão do \ngene MMP3 em lesões endometrióticas, o que pode indicar uma menor atividade invasiva das \nlesões por já estarem localmente estabelecidas. \nA superexpressão do MYC pode levar tanto à proliferação celular como à apoptose \n(Thompson, 1998). A indução da morte celular pr ogramada por este gene está relacionada \ncom a liberação do citocromo c (Juin et al., 1999). A superexpressão do  gene anti-apoptótico \n\n \n \n56\n \nBCL-2 ( B-cell lymphoma/leukaemia-2 ) protege as células da ação do MYC por bloquear a \nliberação do citocromo c (Wagner et al., 1993; Yang e Korsmeyer, 1996), mas não tem efeito \nna sua ação proliferativa (Hoffman e Liebermann, 1998). Já o BAX ( BCL2-associated X \nprotein), membro pró-apoptótico da família bcl- 2, estimula a morte celular por liberar o \ncitocromo c e consequentemente induzir o MYC (Mitchell et al. , 2000). No endométrio \neutópico de mulheres com endometriose, já foram descritas tanto a diminuição de células \napoptóticas (Braun et al. , 2002) como a superexpressão do BCL-2 e a repressão do BAX \n(Meresman et al. , 2000). Apesar disso, Johnson e colaboradores (2005) encontraram uma \nmaior expressão do MYC no endométrio eutópico de mulheres com endometriose, em relação \nao endométrio de mulheres normais. Embora os dados sobre a regulação e funções associadas \nà expressão do MYC sejam controversos na literatura, é possível que a baixa expressão deste \ngene em lesão endometriótica seja resultado da perda de estimulação de apoptose pela via de \nregulação MYC, BCL-2 e BAX alterada nas lesões endometrióticas.  \nO IGF-I ( insulin-like growth factor-I ) e o IGF-II estão presentes no endométrio \nhumano, e são potentes indutores de prolifer ação e crescimento em cultura de células \nendometriais (Giudice et al., 2003; Irwin et al., 1993). Estes fatores são regulados pela família \nde insulin-like growth factor binding proteins  (IGFBPs), sendo que o IGFBP-1 atua como \ninibidor do IGF-I (Adashi, 1995) . Algumas funções como supr essão tumoral, indução de \napoptose e diminuição da proliferação celular foram associadas ao aumento de expressão do \nIGFBP-1 em câncer de próstata e de mama (Ngo et al., 2003; Subramanian et al., 2007). Foi \ndetectada uma menor expressão deste gene em fluido folicular de pacientes com endometriose \nmoderada e severa (Cunha-Filho et al. , 2003), um aumento de expressão no endométrio \neutópico de babuínos com endometriose em relação ao endométrio normal (Kim et al., 2007) \ne uma expressão reduzida em lesões endometri óticas quando comparada com tecido eutópico \nde pacientes com endometriose (Klemmt et al., 2006). Além disso, aumento de IGF-I e IGF-II \n\n \n \n57\n \nfoi detectado no fluido peritonial de pacientes com endometriose (Giudice et al., 1994). Esses \ndados da literatura apóiam os resultados de desregulação do IGFBP1 encontrados no presente \ntrabalho, e reforçam a idéia de que a expressão alterada do sistema IGF na endometriose pode \nser um dos fatores responsáveis pelo crescimento do tecido ectópico.  \nO PAEP codifica a glicodelina, uma glicopro teína com diversas funções como \nimunossupressão (Rachmilewitz et al. , 2003), contracepção (Oehninger et al ., 1995), \ndiferenciação celular e supressão tumoral (Kämäräinen et al., 1997; Koistinen et al., 2005). \nConsidera-se que a expressão desta glicoprot eína é mais freqüente em carcinoma ovariano \nbem diferenciado, sendo mais expressa em esta dios tumorais inicia is e associada a um \nprognóstico favorável (Mandelin et al., 2003). Alguns trabalhos têm associado a expressão da \nglicodelina e suas funções com doenças gineco lógicas malignas e benignas, dentre elas a \nendometriose (Cornillie e t al ., 1991; Horowitz et al. , 2001). As lesões endometrióticas \napresentam menor grau de diferenciação ou re tardo neste processo, em relação ao tecido \neutópico de mulheres com endometriose (Nisolle et al., 1995; Klemmt et al., 2006). Abrao e \ncolaboradores (2003) também associaram lesõ es endometrióticas me nos diferenciadas com \nestadios III e IV da doença. Kao e colabora dores (2003) encontraram menor expressão de \nglicodelina em tecido eutópico de mulheres co m endometriose na fase secretora do ciclo \nmenstrual, quando comparado ao endométrio eu tópico de pacientes sem endometriose. Neste \ntrabalho, detectamos uma menor expressão do PAEP em lesões endometrióticas do que no \nendométrio eutópico, o que poderia ser um indí cio de perda de diferenciação nas lesões, \nrelacionada à perda de função da glicodelina. \nPortanto, a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP causariam \nperda da homeostase celular nas lesões endom etrióticas, contribuindo para a implantação e \nsobrevivência do tecido ectópico no ambiente extra-uterino. Consideramos que análises de um \n\n \n \n58\n \nnúmero maior de amostras são necessárias, bem como testes para determinar funções gênicas \nnas lesões para caracterização de sua participação no desenvolvimento da doença.  \nO endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose compartilham \nalterações que não são encontradas no endométrio  eutópico de mulheres sem endometriose, o \nque corrobora a idéia de que este endométrio a lterado, ao cair na cavidade peritonial, tem um \npotencial inicial de desenvolver a endometrio se (Sharpe-Timms, 20 01). Entretanto, no \npresente trabalho, quando o grupo controle fo i comparado ao endométrio eutópico de \npacientes com endometriose, nenhuma difere nça significativa foi encontrada nos genes \nestudados. Um número maior de amostras deve ser analisado para que esses resultados sejam \nconclusivos. \nOs dados discordantes da lit eratura devem-se primeirament e às diferentes fases do \nciclo menstrual analisadas. Em segundo lugar, aos diferentes tipos de lesões avaliadas, e por \nfim às diferentes técnicas utilizadas na inves tigação da endometriose. As três variantes, de \nmaneira geral, são consideradas responsáveis pelos resultados inconclusivos sobre o tema. \nEm resumo, este projeto disponibilizou ao  banco de dados da literatura 291 genes \ncandidatos com expressão gênica desregulada na fase proliferativa inicial do ciclo menstrual \nem lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas. Os genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBP1 \ne PAEP devem ser analisados em um número maio r e mais diversificado de amostras, pois \npodem estar envolvidos com mecanismos de implantação e manutenção dos implantes \nendometrióticos. A investigação futura desses  genes poderá contribuir para a elucidação da \nfisiopatologia da endometriose.  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nC\nONCLUSÕES \n \n \n\n \n \n60\n \n1) A técnica RaSH foi eficiente em detectar expressão diferencial entre os tecidos \neutópico e ectópico da pacientes com endometriose. \n2)  Foram identificados como candidatos 291 genes desregulados nas lesões \nendometrióticas: 191 superexpressos e 100 menos expressos. \n3)  Entre os genes selecionados após a análise comparativa de expressão nos tecidos \neutópico e ectópico, e após validação por técnica de PCR em tempo real, o gene \nSPARC foi superexpresso e os genes MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP menos expressos \nnas lesões. \n4) Diferenças significativas de expressão nas lesões peritoniais foram obtidas para os \ngenes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP ; e nos endometriomas ova rianos para os genes \nMMP3 e PAEP. \n5) Os genes SPARC e IGFBP1 mostraram diferenças significativas de expressão, quando \ncomparamos as lesões peritoniais com as ovarianas. \n6) Sugerimos que os genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP estejam envolvidos \ncom mecanismos de implantação e manutenção dos implantes endometrióticos. \n7) Nossos resultados sugerem que as diferenças  observadas entre o endométrio eutópico \ne as lesões endometrióticas de pacientes afetadas pela endometriose são conseqüências \ndos diferentes ambientes endócrinos desses tecidos. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nR\nEFERÊNCIAS \n \n \n \n \n\n \n \n62\n \nAbrao MS, Neme RM, Carvalho FM, Aldrighi JM,  Pinotti JA. 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Unamplified (hw) Homo sapiens cDNA clone \nhw45c10 5', mRNA sequence /clone=hw45c10 /clone_end=5' \n/gb=CN484301 /gi=46565805 /ug=Hs.268803 /len=618   1\nXM_498557 \ntgnl|UG|Hs#S21593118 PREDICTED: Homo sapiens \nLOC440123 (LOC440123), mRNA /cds=p(1,363) \n/gb=XM_498557 /gi=51471158 /ug=Hs.585252 /len=2284   1\nAK074908 \ntgnl|UG|Hs#S4806911 Homo sapiens cDNA FLJ90427 fis, clone \nNT2RP3000481, highly similar to Homo sapiens \nRanBP7/importin 7 mRNA /gb=AK074908 /gi=22760659 \n/ug=Hs.523470 /len=3781 1  \nBX641108 \ntgnl|UG|Hs#S16819761 Homo sapiens mRNA; cDNA \nDKFZp779O0231 (from clone DKFZp779O0231) \n/gb=BX641108 /gi=34365429 /ug=Hs.5724 /len=3994   1\nDB275414 \ntgnl|UG|Hs#S29666869 DB275414 UTERU3 Homo sapiens \ncDNA clone UTERU3000431 5', mRNA sequence \n/clone=UTERU3000431 /clone_end=5' /gb=DB275414 \n/gi=83216722 /ug=Hs.586927 /len=570   1\nBG254392 \ntgnl|UG|Hs#S3226548 602368978F1 NIH_MGC_91 Homo \nsapiens cDNA clone IMAGE:4477195 5', mRNA sequence \n/clone=IMAGE:4477195 /clone_end=5' /gb=BG254392 \n/gi=12764208 /ti=44312233 /ug=Hs.536415 /len=1174   1\nBU177744 \ntgnl|UG|Hs#S4753448 AGENCOURT_7984442 NIH_MGC_72 \nHomo sapiens cDNA clone IMAGE:6166598 5', mRNA \nsequence /clone=IMAGE:6166598 /clone_end=5' \n/gb=BU177744 /gi=22691728 /ti=158177112 /ug=Hs.581964 \n/len=873   1\nAK126809 \ntgnl|UG|Hs#S16885895 Homo sapiens cDNA FLJ44859 fis, \nclone BRALZ2003330 /gb=AK126809 /gi=34533443 \n/ug=Hs.293884 /len=1790   1\n \n \n continua\n\n \n \n76\n \n \n continuação\nBM141654 \ntgnl|UG|Hs#S3994991 if24c05.x1 Melton Normalized Human \nIslet 4 N4-HIS 1 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:5677424 \n3', mRNA sequence /clone=IMAGE:5677424 /clone_end=3' \n/gb=BM141654 /gi=17151719 /ug=Hs.571918 /len=543   1\nAJ318805 \ntgnl|UG|Hs#S4013186 AJ318805 Homo sapiens adipose tissue \nHomo sapiens cDNA clone 2040, mRNA sequence /clone=2040 \n/gb=AJ318805 /gi=18141682 /ug=Hs.86538 /len=5223   2\nCR749357 \ntgnl|UG|Hs#S21592430 Homo sapiens mRNA; cDNA \nDKFZp779K1237 (from clone DKFZp779K1237) \n/cds=p(249,1814) /gb=CR749357 /gi=51476439 /ug=Hs.239818 \n/len=3237   1\nBG832050 \ntgnl|UG|Hs#S3617992 602765051F1 NIH_MGC_42 Homo \nsapiens cDNA clone IMAGE:4907125 5', mRNA sequence \n/clone=IMAGE:4907125 /clone_end=5' /gb=BG832050 \n/gi=14179637 /ti=45245335 /ug=Hs.588885 /len=848   1\nCR604926 \ntgnl|UG|Hs#S21297145 full-length cDNA clone \nCS0DF038YH05 of Fetal brain of Homo sapiens (human) \n/gb=CR604926 /gi=50485733 /ug=Hs.197922 /len=1566   2\nAL831995 \ntgnl|UG|Hs#S4623373 Homo sapiens mRNA; cDNA \nDKFZp451J163 (from clone DKFZp451J163) /gb=AL831995 \n/gi=21732534 /ug=Hs.268675 /len=5411   1\nAB014581 \ntgnl|UG|Hs#S1090801 Homo sapiens mRNA for KIAA0681 \nprotein, partial cds /cds=p(1,1618) /gb=AB014581 /gi=3327175 \n/ug=Hs.300863 /len=4323   1\nNM_001025 \ntgnl|UG|Hs#S1727727 Homo sapiens ribosomal protein S23 \n(RPS23), mRNA /cds=p(94,525) /gb=NM_001025 /gi=71772514 \n/ug=Hs.567333 /len=3325   1\nAY283618 \ntgnl|UG|Hs#S15730155 Homo sapiens hypothetical protein \nmRNA, complete cds /cds=p(72,4766) /gb=AY283618 \n/gi=30908949 /ug=Hs.136102 /len=6409 1  \nAL833852 \ntgnl|UG|Hs#S4621549 Homo sapiens mRNA; cDNA \nDKFZp761G0111 (from clone DKFZp761G0111) \n/cds=p(1,1197) /gb=AL833852 /gi=21739329 /ug=Hs.477921 \n/len=4792   2\nAB007940 \ntgnl|UG|Hs#S1244987 Homo sapiens mRNA for KIAA0471 \nprotein, partial cds /cds=p(284,1525) /gb=AB007940 \n/gi=3413903 /ug=Hs.495391 /len=6834   1\nCA437837 \ntgnl|UG|Hs#S6143167 UI-H-DH0-aur-e-06-0-UI.s1 \nNCI_CGAP_DH0 Homo sapiens cDNA clone UI-H-DH0-aur-e-\n06-0-UI 3', mRNA sequence /clone=UI-H-DH0-aur-e-06-0-UI \n/clone_end=3' /gb=CA437837 /gi=24802257 /ug=Hs.159204 \n/len=691   1\nAF146796 \ntgnl|UG|Hs#S2333428 Homo sapiens sodium dependent \nphosphate transporter isoform NaPi-IIb mRNA, complete cds \n/cds=p(36,2105) /gb=AF146796 /gi=6910977 /ug=Hs.479372 \n/len=4135 1  \nAL050204 \ntgnl|UG|Hs#S1570007 Homo sapiens mRNA; cDNA \nDKFZp586F1223 (from clone DKFZp586F1223) /gb=AL050204 \n/gi=4884443 /ug=Hs.28540 /len=1655 1  \n    4 21\nOUTRAS NÃO REDUNDANTES \nN◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN \nXP_519919 \n \nPREDICTED: exostosin 1 [Pan troglodytes]   1\n   \n\n \n \n77\nContinuação\nAAL31950 \n \nCDH1-D [Gallus gallus] 1  \n    1 1\nRIBOSSOMAL \nN◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN \nNM_021104 \nHomo sapiens ribosomal protein L41 (RPL41), transcript variant \n1, mRNA 1   \nNM_000991 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L28 (RPL28), mRNA 2   \nNM_000967 \nHomo sapiens ribosomal protein L3 (RPL3), transcript variant 1, \nmRNA 3   \nNM_007104 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L10a (RPL10A), mRNA   6\nNM_000988 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L27 (RPL27), mRNA   4\nNM_001015 \n \nHomo sapiens ribosomal protein S11 (RPS11), mRNA   8\nNM_000989 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L30 (RPL30), mRNA   10\nNM_0010350\n06 \nHomo sapiens ribosomal protein L17 (RPL17), transcript variant \n2, mRNA   3\nNM_000979 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L18 (RPL18), mRNA   1\nNM_000981 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L19 (RPL19), mRNA   4\nNM_000971 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L7 (RPL7), mRNA   1\nNM_001025 \ntgnl|UG|Hs#S1727727 Homo sapiens ribosomal protein S23 \n(RPS23), mRNA /cds=p(94,525) /gb=NM_001025 /gi=71772514 \n/ug=Hs.567333 /len=3325   18\nNM_000970 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L6 (RPL6), mRNA   10\nNM_022551 \n \nHomo sapiens ribosomal protein S18 (RPS18), mRNA   3\nNM_000987 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L26 (RPL26), mRNA   1\nNM_001012 \n \nHomo sapiens ribosomal protein S8 (RPS8), mRNA   6\nNM_000661 \n \nHomo sapiens ribosomal protein L9 (RPL9), mRNA   4\nNM_001007 \n \nHomo sapiens ribosomal protein S4, X-linked (RPS4X), mRNA   1\nU09953 \ngp|U09953|1323733|E3F957CA13F7BFEF ribosomal protein L9 \n[Homo sapiens]   10\nAL049597 \ngp|AL049597|10443242|28AB564EA6F7F504 dJ612B15.1 \n(novel protein similar to 60S ribosomal protein L17 (RPL17)) \n[Homo sapiens]   4\nAB007158 \ngp|AB007158|3088342|E6A62203E15257C1 ribosomal protein \nS23 [Homo sapiens] 1 21\nBC000606 \ntn|BC000606|AAH00606|5C859DBA21287948 Similar to \nribosomal protein L14.[Homo sapiens]   1\nL07287 \ngp|L07287|292435|049D53AB5F7B46B6 ribosomal protein L26 \n[Homo sapiens] 2 4\nL16558 \ngp|L16558|307388|A6EEB4DFC83C6F96 ribosomal protein L7 \n[Homo sapiens]   3\nU76609 \ngp|U76609|1658578|1D1E47A337A71ADC ribosomal L5 \nprotein [Homo sapiens]   1\nM90054 \ngp|M90054|337580|E9F238D9F8CA0D67 ribosomal protein L3 \n[Homo sapiens] 6  \n\n \n \n78\n \n \n Continuação\nBC000802 \ntn|BC000802|AAH00802|E9CE3CBD59524F81 Similar to \nribosomal protein S9.[Homo sapiens] 1  \nAF348700 \ntn|AF348700|AAK31162|2FE469F736571002 \n(UBA52)Ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion \nproduct 1 (Fragment).[Homo sapiens]   5\nX69391 \ngp|X69391|36138|3E209D02DFF365D9 ribosomal protein L6 \n[Homo sapiens]   7\n    16 136\nEST HUMAN \nN◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN \nCR736145 \nCR736145 Homo sapiens library (Ebert L) Homo sapiens cDNA \nclone IMAGp998K151889 ; IMAGE:767750 5', mRNA \nsequence   1\nBG620235 \n602618512F1 NIH_MGC_79 Homo sapiens cDNA clone \nIMAGE:4732082 5', mRNA sequence   1\nBI003963 \nPM0-HN0078-150201-006-h03 HN0078 Homo sapiens cDNA, \nmRNA sequence   2\nCN359804 \n17000600087525 GRN_PRENEU Homo sapiens cDNA 5', \nmRNA sequence   1\nDB013855 \nDB013855 TESOP2 Homo sapiens cDNA clone TESOP2002507 \n5', mRNA sequence 1  \nCA445375 \nUI-H-ED0-axn-c-09-0-UI.s1 NCI_CGAP_ED0 Homo sapiens \ncDNA clone UI-H-ED0-axn-c-09-0-UI 3', mRNA sequence 1  \nCV394835 \nQV3-CT0556-041000-370-f06 CT0556 Homo sapiens cDNA, \nmRNA sequence 1  \nDA274667 \nDA274667 BRCOC2 Homo sapiens cDNA clone \nBRCOC2001106 5', mRNA sequence   1\nCX753754 \nAGENCOURT_41387044 NIH_MGC_281 Homo sapiens cDNA \nclone IMAGE:7779333 5', mRNA sequence   2\nCB216464 \nNISC_nq05d07.y1 NICHD_HS_Ut2 Homo sapiens cDNA clone \nIMAGE:5938212 5', mRNA sequence 1  \nBF678057 \n602085103F1 NIH_MGC_83 Homo sapiens cDNA clone \nIMAGE:4249321 5', mRNA sequence 1  \nBX091607 \nBX091607 Soares_testis_NHT Homo sapiens cDNA clone \nIMAGp998F024495 ; IMAGE:1837825, mRNA sequence   1\nAW956406 \nEST368476 MAGE resequences, MAGD Homo sapiens cDNA, \nmRNA sequence   1\nAI056701 \noy53e02.x1 NCI_CGAP_Brn23 Homo sapiens cDNA clone \nIMAGE:1669562 3' similar to contains Alu repetitive element;, \nmRNA sequence   2\nCA446906 \nUI-H-ED1-axv-o-23-0-UI.s1 NCI_CGAP_ED1 Homo sapiens \ncDNA clone UI-H-ED1-axv-o-23-0-UI 3', mRNA sequence   1\nCV347023 \nMR2-CI0127-051200-009-g03 CI0127 Homo sapiens cDNA, \nmRNA sequence 1  \nBX118116 \nBX118116 Soares placenta Nb2HP Homo sapiens cDNA clone \nIMAGp998K21214 ; IMAGE:143756, mRNA sequence 1  \nAL521622 \nAL521622 Homo sapiens NEUROBLASTOMA COT 10-\nNORMALIZED Homo sapiens cDNA clone CS0DB003YG18 5-\nPRIME, mRNA sequence   1\nBP417704 \nBP417704 Homo sapiens small intestine Homo sapiens cDNA \nclone HIE00750r 3', mRNA sequence   2\nCV341138 \nMR0-GN0025-250800-001-a03 GN0025 Homo sapiens cDNA, \nmRNA sequence 1  \nCB853216 \nUI-CF-FN0-agd-o-24-0-UI.s1 UI-CF-FN0 Homo sapiens cDNA \nclone UI-CF-FN0-agd-o-24-0-UI 3', mRNA sequence   1\n\n \n \n79\n \n \n Continuação\nAV747712 \nAV747712 NPC Homo sapiens cDNA clone NPCCPH06 5', \nmRNA sequence   1\n    8 18\n BACTÉRIA   \nN◦ Acesso Descrição RHENDN RHENEN \nU00096 \n \nEscherichia coli K-12 MG1655 complete genome 2 4\n  2 4\n    207 222\n \n\n \n \n80\nANEXO C \nTabela II: Seqüências consideradas como falso-positivas \n \nRefSeq \nN◦ Acesso Descrição \n \nSímbolo RHENDN RHENEN \nNM_147780 \n \ncathepsin B  \nCTSB \n9 1\nNM_001002 \n \nribosomal protein, large, P0  \nRPLP0 \n8 1\nNM_021034 \ninterferon induced transmembrane protein 3 (1-\n8U)  \nIFITM3 \n2 1\nXM_934326 \nPREDICTED: similar to eukaryotic translation \ninitiation factor 3, subunit 8, transcript variant 16 \nLOC653352 \n2 1\nNM_002775 \n \nprotease, serine, 11 (IGF binding)  \nPRSS11 \n1 1\nNM_013230 \n \nCD24 molecule \nCD24 \n1 1\nXM_937409 \n \nPREDICTED: zinc finger protein 516  \nZNF516 \n1 1\nNM_005016 \n \npoly(rC) binding protein 2  \nPCBP2 \n1 2\nNM_005801 \n \nputative translation initiation factor  \nSUI1 \n1 2\nNM_002567 \n \nprostatic binding protein  \nPBP \n1 2\nNM_003746 \n \ndynein, cytoplasmic, light polypeptide 1  \nDNCL1 \n1 2\nNM_005004 \nNADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta \nsubcomplex, 8, 19kDa  \nNDUFB8 \n1 3\nNM_000090 \n \ncollagen, type III, alpha 1  \nCOL3A1 \n5 3\nNM_021103 \n \nthymosin, beta 10  \nTMSB10 \n3 4\nNM_001009 \n \nribosomal protein S5  \nRPS5 \n3 5\nNM_002489 \nNADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha \nsubcomplex, 4, 9kDa  \nNDUFA4 \n1 7\nNM_021109 \n \nthymosin, beta 4, X-linked  \nTMSB4X \n1 8\nNM_001021 \n \nribosomal protein S17 \nRPS17 \n2 9\nNM_000998 \n \nribosomal protein L37a  \nRPL37A \n1 10\n     45 64\n \n\n \n \n \n81\nANEXO D \nTabela IV: Classificação dos genes superexpressos e menos expressos quanto suas funções em processos biológicos. \n \n \nPROCESSO BIOLÓGICO G ENES SUPEREXPRESSOS Q UANTIDADE G ENES MENOS EXPRESSOS QUANTIDADE \n \npositive regulation of MAPKKK cascade NENF 1  0 \n \ncellular homeostasis \nPRKCB1, SLC40A1, CLN5, CLNS1A, \nTPT1, PLN 6 MYC 1 \n \nATP synthesis coupled proton transport ATP6V1E1, ATP5E 2 ATP6V0B 1 \n \nDNA ligation  0 XRCC6 1 \n \nDNA recombination SFPQ 1 XRCC6 1 \n \nDNA repair SFPQ 1 XRCC6 1 \n \nDNA replication CTGF, NAP1L1 2  0 \n \nER to Golgi vesicle-mediated transport  0 KDELR1 1 \n \nER-associated protein catabolism UBA52 1  0 \n \nNLS-bearing substrate import into nucleus KPNA1 1  0 \n \nNotch receptor processing  0 NCSTN 1 \n \nRNA splicing SFRS7, SFPQ 2 SF3B3 1 \n \nWnt receptor signaling pathway SFRP4, RSPO3 2  0 \n \nactin filament polymerization GSN 1  0 \n    \n \ncontinua \n\n \n \n \n82\n    continuação \n \nactin filament severing GSN 1 0 \n \nactivation of JNK activity  0 PTPLAD1 1 \n \nactivation of MAPK activity  0 CD81 1 \n \nacute-phase response  0 SERPINA1 1 \n \namino acid metabolism ATF4 1  0 \n \namino acid transport  0 SLC3A2 1 \n \namyloid precursor protein catabolism  0 NCSTN 1 \n \nanaerobic glycolysis LDHB 1 LDHA 1 \n \nangiogenesis VEGFA, CTGF 2  0 \n \nanion transport VDAC2 1  0 \n \nanti-apoptosis ANXA1, TPT1, CIAPIN1 3 HSPB1, HSPA5 2 \n \nantigen processing and presentation  0 HLA-C 1 \n \napoptosis BRE, DAPK1, CIAPIN1 3 DAP, C8orf4, MYC 3 \n \nasparagine biosynthesis ASNSD1 1  0 \n \naspartyl-tRNA aminoacylation  0 DARS 1 \n \nautophagy ATG3 1  0 \n \naxon guidance \nUBA52 1  0 \n     \n\n \n \n \n83\ncontinuação \n \naxonogenesis S100A6 1  0 \n \nbarbed-end actin filament capping GSN 1 SPTBN1 1 \n \nbehavior  0 FOSB 1 \n \nblood coagulation GNAQ, CD59 2  0 \n \ncalcium ion homeostasis TPT1 1  0 \n \ncalcium ion transport ITPR1, PLN, TPT1 3 SLC3A2 1 \n \ncarbohydrate metabolism PPP1CB 1 SLC3A2, H6PD, GANAB 3 \n \ncell adhesion \nCD47, CTGF, KITLG, SCARB2, LPP, \nPARVA, VEZT, TRIP6, CFDP1, \nGPNMB, LAMA2, CD93 12 \nTGFBI, LAMB3, TSPAN1, \nCOL6A3, CDH11, ILK  6 \n \ncell cycle arrest CDKN1B 1 MYC 1 \n \ncell division PPP1CB 1 TXNL4A, SPECC1L 2 \n \ncell growth  0 SLC3A2 1 \n \ncell migration \nVEGFA, TRIP6, CXCL16, GNA13, \nUBA52, CTGF, LAMA2 7  0 \n \ncell motility \nANXA1, TPM1, CTGF, TSPAN3, \nGNA13, CALD1, CDKN1B, TRIP6, \nCXCL16, VEGFA, UBA52, LAMA2 12 HSPB1, TSPAN1 2 \n \ncell proliferation \nMITF, CDKN1B, S100A6, TSPAN3, \nCFDP1, KITLG, ANXA1, VEGFA, \nGPNMB, BMPR2, PPP1CB, NAP1L1 12 \nTGFBI, GRN, MYC, TSPAN1, \nILK, CD81  6 \n \ncell-cell adhesion CD93, VEZT, CTGF 3 CDH11 1 \n \ncell-cell signaling \nS100A6, ALDH5A1, UBA52, MAPK1, \nGNAQ 5 GRN \n1 \n\n \n \n \n84\n    continuação \n \ncell-matrix adhesion CD47, TRIP6,CTGF 3 ILK 1 \n \ncellular lipid metabolism GNPAT 1  0 \n \ncentral nervous system development ALDH5A1 1 ATN1 1 \n \nceramide metabolism  0 NSMAF 1 \n \nchemotaxis CXCL16, MAPK1 2 CMTM7 1 \n \nchloride transport CLNS1A 1  0 \n \nchromatin modification MORF4L1 1  0 \n \nciliary or flagellar motility  0 HLA-C 1 \n \ncirculation' CLNS1A, PLN 2  0 \n \ncollagen catabolism'  0 MMP3, MMP7, MMP10 3 \n \ncollagen fibril organization LUM 1  0 \n \ncomplement activation, classical pathway C1S 1 C4BPA, C1R 2 \n \ndevelopment ID1, ID2, CFDP1, MITF 4 PAEP, FOSB 2 \n \ndopamine metabolism ALDH5A1 1  0 \n \nendocytosis RAB5A 1  0 \n \nentry of virus into host cell  0 CD81 1 \n \nepidermis development CTGF \n1 COL1A1, LAMB3 2 \n\n \n \n \n85\n    Continuação \n \nethanol oxidation ADH5 1  0 \n \nether lipid biosynthesis GNPAT 1  0 \n \nfatty acid biosynthesis  0 PTGES3 1 \n \nfatty acid metabolism GNPAT 1  0 \n \nfemale gamete generation USP9X 1  0 \n \nfocal adhesion formation TRIP6 1  0 \n \nfolic acid and derivative biosynthesis MTHFD2 1  0 \n \ngamma-aminobutyric acid catabolism ALDH5A1 1  0 \n \ngamma-aminobutyric acid metabolism ALDH5A1 1  0 \n \ngluconeogenesis ATF4 1  0 \n \nglucose metabolism  0 H6PD 1 \n \nglycogen metabolism PPP1CB 1  0 \n \nglycolysis  0 ENO1 1 \n \nheme catabolism BLVRA 1  0 \n \nhemopoiesis KITLG 1  0 \n \nhomophilic cell adhesion  0 CDH11 1 \n \nimmune response \nB2M, IFIT5, POMP, CD59, C1S , \nTBK1 6 HLA-C, C4BPA 2 \n\n \n \n \n86\n    Continuação \n \nimmune system process \nIFIT5, MITF, B2M, CXCL16, POMP, \nKITLG, C1S, TBK1, CD59, CD93 10 HLA-C, CD81, C4BPA 3 \n \ninduction of apoptosis MAPK1 1  0 \n \ninduction of positive chemotaxis VEGFA 1  0 \n \ninflammatory response ANXA1, PLA2G7, C1S  3 SERPINA1, C4BPA 2 \n \ninnate immune response TBK1, C1S  2 C4BPA, C1R  2 \n \nintegrin-mediated signaling pathway CD47 1 ILK 1 \n \nintra-Golgi vesicle-mediated transport  0 COPZ1 1 \n \nintracellular protein transport KPNA1 1 KDELR1, COPZ1 2 \n \nintracellular signaling cascade PRKCB1, SH2B3 2  0 \n \nion transport ATP6V1E1, ITPR1, ATP5E, SLC40A1 4 ATP6V0B 1 \n \niron ion homeostasis SLC40A1 1 MYC 1 \n \niron ion transport SLC40A1 1  0 \n \nkeratinocyte differentiation ANXA1 1  0 \n \nlipid biosynthesis  0 LASS2 1 \n \nlipid catabolism PLA2G7 1  0 \n \nlipid metabolism ANXA1 1 CPNE1 1 \n \nlymphocyte chemotaxis CXCL16 1  0 \n\n \n \n \n87\n    Continuação \n \nmRNA catabolism, nonsense-mediated decay  0 EXOSC10 1 \n \nmRNA metabolism PCBP1 1  0 \n \nmRNA polyadenylation  0 PABPC1 1 \n \nmRNA processing  0 HNRPL 1 \n \nmRNA stabilization'  0 PABPC1 1 \n \nmacrophage activation CD93 1  0 \n \nmembrane protein ectodomain proteolysis  0 NCSTN 1 \n \nmetabolism BLVRA, SUCLA2, GNPAT, ALDH5A1 4 ARSD, MAN1A1 2 \n \nmethionyl-tRNA aminoacylation MARS 1  0 \n \nmitochondrial transport SLC25A27 1 UCP2 1 \n \nmitosis  0 TXNL4A 1 \n \nmorphogenesis SLC40A1 1  0 \n \nmuscle contraction PLN, CALD1 2  0 \n \nmuscle development LAMA2, TAGLN 2 TAGLN2, COL6A3 2 \n \nnegative regulation of anti-apoptosis RTN4 1  0 \n \nnegative regulation of apoptosis VEGFA 2  0 \n \nnegative regulation of axon extension RTN4 1  0 \n\n \n \n \n88\n    Continuação \n \nnegative regulation of caspase activity  0 HSPA5 1 \n \nnegative regulation of cell adhesion  0 TGFBI 1 \n \nnegative regulation of cell proliferation GPNMB, CDKN1B  2  0 \n \nnegative regulation of gene expression, \nepigenetic CREBZF 1  0 \n \nnegative regulation of transcription CREBZF, ID1, ID2 3  0 \n \nnervous system development SOD1, VEGFA, DPYSL2, ITM2B 4  0 \n \nnitric oxide transport  0 HBB 1 \n \nnuclear mRNA splicing, via spliceosome SFRS7, SFPQ, SF3B14 3 TXNL4A, SF3B3 2 \n \nnucleosome assembly NAP1L1 1  0 \n \nnucleotide-excision repair DDB2 1  0 \n \none-carbon compound metabolism MTHFD2 1  0 \n \norgan morphogenesis KITLG, GNPAT 2  0 \n \nossification SPARC 1 CDH11 1 \n \noxygen transport HBG2 1 HBB 1 \n \npentose-phosphate shunt  0 H6PD 1 \n \npeptide cross-linking ANXA1 1  0 \n \npeptidoglycan metabolism  0 MMP3, MMP7, MMP10 3 \n\n \n \n \n89\n    Continuação \n \nperoxisome organization and biogenesis PEX1 1  0 \n \nphagocytosis CD93 1  0 \n \nphosphate transport  0 COL1A1, COL6A3 2 \n \nphosphatidylinositol biosynthesis  0 CD81 1 \n \nphosphoinositide metabolism  0 CD81 1 \n \nphospholipase C activation GNAQ 1  0 \n \npositive regulation of B cell proliferation  0 CD81 1 \n \npositive regulation of anti-apoptosis BRE 1  0 \n \npositive regulation of cell migration TRIP6 1  0 \n \npositive regulation of cell proliferation \nVEGFA, NAP1L1, CDKN1B, S100A6, \nPPP1CB  5 GRN, MYC, CD81, ILK  4 \n \npositive regulation of enzyme activity  0 NCSTN 1 \n \npositive regulation of fibroblast proliferation S100A6 1  0 \n \npositive regulation of gluconeogenesis ARPP-19 1  0 \n \npositive regulation of glucose import ARPP-19 1  0 \npositive regulation of nitric oxide \nbiosynthesis  0 HBB, HSP90AB1 2 \n \npositive regulation of transcription UBA52 1  0 \n \npositive regulation of translation  \n0 PABPC1 1 \n \npostreplication repair UBE2A 1  0 \n\n \n \n \n90\n    Continuação \n \nposttranslational protein folding UGCGL2 1  0 \n \npotassium ion transport CHP 1  0 \n \nprostaglandin biosynthesis  0 PTGES3 1 \n \nprotein amino acid ADP-ribosylation GNAQ 1  0 \n \nprotein amino acid glycosylation UGCGL2 1 RPN1, MAN1A1 2 \n \nprotein amino acid phosphorylation \nBMPR2, PRKCB1, DAPK1, TBK1, \nRIPK5, MYLK, MAPK1 7 ILK, MAP3K8 2 \n \nprotein biosynthesis \nEIF3S6, EIF4A2, UBA52, EIF3S3, \nMARS, SARS, EIF3S12, EIF3S6IP 8 \nDARS, EEF2, TUFM, EIF3S5, \nMRPL24 5 \n \nprotein catabolism PSMC1 1  0 \n \nprotein complex assembly  0 DARS, SF3B3 2 \n \nprotein import into nucleus, translocation  0 CEP57 1 \n \nprotein kinase C activation GNB2L1 1  0 \n \nprotein kinase cascade DAPK1 1  0 \n \nprotein localization  0 CD81 1 \n \nprotein modification UBA52 1  0 \n \nprotein processing  0 NCSTN 1 \n \nprotein repair MSRB3 1  0 \n \nprotein retention in ER  0 KDELR1 1 \n\n \n \n \n91\n    Continuação \n \nprotein transport PEX1, RAB5A, ATG3 3 KDELR1, LMAN2, VPS11 3 \n \nprotein ubiquitination UBA52, ATG3 2  0 \n \nproteolysis \nCAPN2, C1S, PSMB3, USP9X, \nUBE2A, UBA52 6 \nC1R, MMP3, MMP7, MMP10, \nPRCP, SEC11A, TMPRSS4, \nPSMB5, NCSTN, RNF11, C4BPA 11 \n \nproton transport ATP6V1E1, ATP5E 2 UCP2, ATP6V0B 2 \n \nrRNA processing  0 EXOSC10 1 \n \nreceptor mediated endocytosis CXCL16 1  0 \n \nregulation of DNA recombination KPNA1 1  0 \n \nregulation of Rho protein signal transduction  0 ARHGEF15 1 \n \nregulation of apoptosis TPT1, RTN4 2  0 \n \nregulation of cell adhesion LAMA2 1 TGFBI\n 1 \n \nregulation of cell growth CTGF, MORF4L1 2 IGFBP1, IGFBP2 2 \n \nregulation of cell migration LAMA2 1  0 \n \nregulation of cell volume CLNS1A 1  0 \n \nregulation of embryonic development LAMA2 1  0 \n \nregulation of heart contraction TPM1 1  0 \n \nregulation of muscle contraction TPM1 1  0 \n \nregulation of progression through cell cycle VEGFA, S100A6 2 FOSB 1 \n\n \n \n \n92\n    Continuação \n \nregulation of synaptic plasticity UBA52 1  0 \n \nregulation of transcription factor activity' CREBZF 1  0 \n \nregulation of translation PUM1, PCID1, RSBN1L 3  0 \n \nregulation of translational initiation EIF4A2, EIF3S3 2 HSPB1, EIF3S5 2 \n \nresponse to DNA damage stimulus BRE 1  0 \n \nresponse to hypoxia VEGFA 1  0 \n \nresponse to oxidative stress SOD1 1  0 \n \nresponse to stimulus RSPO3 1 TGFBI, TIMP3 2 \n \nresponse to stress MAPK1, ATF4 2  0 \n \nresponse to unfolded protein DNAJA1, HSPA14 2 HSPB1, HSP90AB1 2 \n \nresponse to virus CREBZF, TBK1 2  0 \n \nresponse to wounding \nCTGF, PLA2G7, GNA13, C1S, \nANXA1, CD59, GNAQ 7 SERPINA1, C4BPA 2 \n \nsensory perception of sound ITM2B, MITF 2 COL1A1 1 \n \nseptin ring assembly NUBP1 1  0 \n \nseryl-tRNA aminoacylation SARS 1  0 \n \nsignal peptide processing  0 SEC11A 1 \n \nskeletal development BMPR2, PRELP 2 COL1A1 1 \n\n \n \n \n93\n    Continuação \n \nsmall GTPase mediated signal transduction RAB5A, CHP 2 RND3, PTPLAD1, RHOC 3 \n \nsmooth muscle contraction CNN3 1  0 \n \nspliceosome assembly  0 TXNL4A 1 \n \nsuccinyl-CoA metabolism SUCLA2 1  0 \n \nsuccinyl-CoA pathway SUCLA2 1  0 \n \nsuperoxide metabolism SOD1 1  0 \n \nsynaptic transmission MAPK1 1  0 \n \ntRNA processing SARS 1  0 \n \ntelomere maintenance  0 PTGES3 1 \n \ntetrahydrofolate metabolism MTHFD2 1  0 \n \ntranscription from RNA polymerase II \npromoter BTF3, GTF2B, ELP2 3 TSC22D1, POLR2C 2 \n \ntranscription initiation GTF2B 1  0 \n \ntranslational elongation  0 TUFM 1 \n \ntranslational initiation EIF3S12 1  0 \n \ntricarboxylic acid cycle SUCLA2 1  0 \n \ntryptophan transport  0 SLC3A2 1 \n \ntubulin folding \nTCP1 1  0 \n\n \n \n \n94\n    Continuação \n \nubiquitin cycle UBE2A, Kua-UEV, BRE 3 UBE2W 1 \n \nubiquitin-dependent protein catabolism USP9X, PSMB3, UBE2A 3 PSMB5 1 \n \nvasculogenesis VEGFA 1  0 \n \nvesicle-mediated transport GOLGA4 1 CPNE1 1 \n \nvisual perception CLNS1A, LUM 2 TGFBI, TIMP3 2 \n \nepithelial cell differentiation WT1, VEGFA 2 PAEP 1 \n \nepithelial cell proliferation CDKN1B, VEGFA 2 GRN 1 \n \nI-kappaB kinase/NF-kappaB cascade TBK1 1 PTPLAD1 1 \n \nmelanocyte differentiation MITF 1  0 \n \nprotein folding \nPPIC, TCP1, DNAJA1, DNAJC9, \nDNAJC16, POMP, HSPA14 7 \nPPIB, HSPB1, PTGES3, \nHSP90AB1 4 \n \nregulation of cell cycle \nCDKN1B, S100A6, WT1, VEGFA, \nBMPR2 5 MYC, FOSB 2 \n \nregulation of cell differentiation MITF, GNAQ 2  0 \n \nregulation of epithelial cell proliferation CDKN1B, VEGFA 2 GRN 1 \n \nregulation of growth UBA52, CTGF, MORF4L1 3 IGFBP1, IGFBP2 2 \n \ntissue remodeling SPARC, CTGF 2 CDH11 1 \nactomyosin structure organization and \nbiogenesis CNN3 1  0 \nadaptive immune response C1S 1 C4BPA 1 \nantigen processing and presentation of \nendogenous peptide antigen via MHC class I' B2M 1 HLA-C 1 \n\n \n \n \n95\n    Continuação \ncell communication \nMITF, BRE, CHP, PRKCB1, S100A6, \nFMOD, ID1, TRIP6, SFRP4, GNA13, \nNENF, KITLG, ITPR1, CALM2, \nDAPK1, TBK1, ANXA1, VEGFA, \nDPYSL2, ALDH5A1, UBA52, \nBMPR2, GNB2L1, CD47, SPARC, \nCTGF, CD59, RAB5A, MAPK1, \nPPIC, RSPO3, GNAQ \n32 \nRHOC, IGFBP1, ARHGEF15, \nPTGES3, MS4A8B, RND3, \nNCSTN, MYC, ILK, PTPLAD1, \nHSPA5, CD81, TIMP3, CEP57, \nGRN, NSMAF, GPR177 \n17 \ncell cycle \nWT1, UBA52, CDKN1B, S100A6, \nMAPK1, PPP1CB, CALM2, ANXA1, \nVEGFA, BMPR2, 10 \nTXNL4A, SPECC1L, PSMD13, \nMYC, FOSB  5 \ncell cycle process \nCDKN1B, S100A6, WT1, VEGFA, \nBMPR2, PPP1CB 6 TXNL4A, PSMD13, MYC, FOSB 4 \ncell death \nMITF, BRE, CFDP1, ITM2B, DAPK1, \nANXA1, RTN4, VEGFA, TPT1, \nTSC22D3, MAPK1 \n11 DAP, MYC, HSPA5, HSPB1 4 \ncell differentiation \nSFRP4, MITF, BRE, S100A6, CLN5, \nWT1, CFDP1, GNA13, ITM2B, \nDAPK1, ANXA1, RTN4, VEGFA, \nTPT1, UBA52, CTGF, TSC22D3, \nMAPK1, GNAQ 19 \nDAP, MYC, HSPA5, HSPB1, \nPAEP 5 \ncell morphogenesis \nS100A6, CFDP1, GNA13, RTN4, \nVEGFA, UBA52, CTGF, MORF4L1 8 IGFBP1, IGFBP2, SLC3A2, ILK 4 \ncell surface receptor linked signal \ntransduction ANXA1, CD59 2  0 \ncell-substrate adhesion TRIP6, CD47, CTGF 3 ILK 1 \nchemical homeostasis \nPRKCB1, SLC40A1, CLN5, TPT1, \nPLN 5 MYC 1 \ndeath \nMITF, BRE, CFDP1, ITM2B, DAPK1, \nANXA1, RTN4, VEGFA, TPT1, \nTSC22D3, MAPK1 \n11 DAP, MYC, HSPA5, HSPB1 4 \ndefense response PLA2G7, C1S, TBK1, ANXA1, CD59 5 SERPINA1, C4BPA 2 \ndouble-strand break repair via \nnonhomologous end joining  0 XRCC6 1 \n\n \n \n \n96\n    Continuação \nelectron transport \nBLVRA, UQCRFS1, PCM1, RSPO3, \nALDH5A1 5  0 \nembryonic development \nVEZT, GNA13, VEGFA, BMPR2, \nLAMA2, GNAQ 6 GRN 1 \nfibroblast growth factor receptor signaling \npathway  0 CEP57 1 \ngeneration of precursor metabolites and \nenergy SLC25A27 1  0 \nG-protein coupled receptor protein signaling \npathway CALM2, GNAQ, GNA13, C1S 4  0 \ninduction of apoptosis by extracellular \nsignals DAPK1 1 TIMP3, DAP 2 \nlong-term strengthening of neuromuscular \njunction UBA52 1  0 \nnegative regulation of progression through \ncell cycle WT1 1  0 \nnegative regulation of transcription factor \nactivity ID1, ID2 2  0 \nnegative regulation of transcription from \nRNA polymerase II promoter MEIS2 1 FOSB 1 \nnucleobase, nucleoside, nucleotide and \nnucleic acid metabolism DPYSL2, AK3 2  0 \npositive regulation of 1-phosphatidylinositol \n4-kinase activity  0 CD81 1 \npositive regulation of I-kappaB kinase/NF-\nkappaB cascade TBK1 1 GPR177, RHOC 2 \npositive regulation of peptidyl-tyrosine \nphosphorylation  0 CD81 1 \npositive regulation of transcription from \nRNA polymerase II promoter ATF4 1  0 \npositive regulation of transcription, DNA-\ndependent  0 XRCC6 1 \n\n \n \n \n97\n    Continuação \npositive regulation of vascular endothelial \ngrowth factor receptor signaling pathway VEGFA 1  0 \nprogrammed cell death \nMITF, BRE, CFDP1, ITM2B, DAPK1, \nANXA1, RTN4, VEGFA, TPT1, \nTSC22D3, MAPK1 \n11 DAP, MYC, HSPA5, HSPB1 4 \nprotein amino acid N-linked glycosylation \nvia asparagine  0 RPN1 1 \nprotein ubiquitination during ubiquitin-\ndependent protein catabolism  0 RNF11 1 \nregulation of cell proliferation \nMITF, CDKN1B, S100A6, CFDP1, \nANXA1, VEGFA, GPNMB, BMPR2, \nPPP1CB, NAP1L1 \n10 MYC, ILK, CD81, GRN 4 \nregulation of cyclin-dependent protein kinase \nactivity CDKN1B 1  0 \nregulation of transcription from RNA \npolymerase II promoter ID1, TCF4 2 MYC 1 \nregulation of transcription, DNA-dependent \nWT1, LMO3, TSC22D3, PQBP1, \nBTF3, CREBZF, GTF2B, MEIS2, \nSFPQ, BAZ1A, ANKHD1, ZMIZ1, \nZNF227, ATF4, MITF, MORF4L1 16 \nENO1, MYC, TSC22D1, FOSB, \nLASS2, AKNA 6 \nrelease of cytoplasmic sequestered NF-\nkappaB TRIP6 1  0 \nretrograde vesicle-mediat ed transport, Golgi \nto ER  0 COPZ1 1 \nsignal transduction \nPPIC, VEGFA, DPYSL2, GNAQ, \nITPR1, KITLG, DAPK1, GNB2L1, \nGNA13, S100A6, MAPK1 11 \nIGFBP1, GRN, NSMAF, \nPTGES3, MS4A8B 5 \nTranscription \nWT1, LMO3, PQBP1, BTF3, \nCREBZF, POLR2G, SFPQ, PCM1, \nBAZ1A, POLR1D, ANKHD1, ZMIZ1, \nZNF227, ATF4, MORF4L1 15 ENO1, TSC22D1, POLR2C 3 \ntransforming growth factor beta receptor \ncomplex assembly FMOD 1  0 \ntransmembrane receptor protein \nserine/threonine kinase signaling pathway BMPR2 1  0 \n\n \n \n \n98\n    Continuação \ntransmembrane receptor protein tyrosine \nkinase signaling pathway SPARC 1 TIMP3 1 \nTransport \nHBG2, CLNS1A, SLC25A27, \nUQCRFS1, ABCA8, SYT11 6 HBB, PAEP, UCP2, LAPTM4A 4 \ntricarboxylic acid cycle intermediate \nmetabolism LDHB 1 LDHA 1 \nvirion attachment, binding of host cell \nsurface receptor  0 CD81 1 \nsem função conhecida \nMGC52110, TMEM44, CCDC66, \nCCDC90A, MGC12966, PRCC, \nSSU72, C11orf58, C3orf28, \nKIAA0831, FAM19A5, FAM35A, \nTMEM168, RPIB9, C10orf104, \nCCDC80, XIST 17 \nFAM134B, C22orf28, RMND5B, \nUBAC2, LOC643433, \nLOC653352 6 \n \n \n \n \n\n \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nM\nANUSCRITO \nSUBMETIDO PARA A FERTILITY AND STERILITY (FNS-S-07-0173) \n \n\n                             Elsevier Editorial System(tm) for Fertility and Sterility\n                                  Manuscript Draft\nManuscript Number: \nTitle: Glycodelin expression in normal endometrium without endometriosis, and in eutopic and ectopic tissue \nof women with endometriosis.\nArticle Type: Reproductive Biology\nSection/Category: \nKeywords: endometriosis; endometrium; gene expression; glycodelin\nCorresponding Author: Prof Juliana Meola, \nCorresponding Author's Institution: \nFirst Author: Juliana  Meola, M.Sc.\nOrder of Authors: Juliana  Meola, M.Sc.; Daniel  B Dentillo, Ph.D.; Júlio C Rosa e Silva, M.D., PhD.; Rui A \nFerriani, M.D., PhD.; Luciana C Veiga, M.Sc.; Cláudia  C Paro de Paz, PhD.; Silvana Giuliatti, PhD.; Lúcia \nMartelli, M.D., PhD.\nAbstract: Objective: To better understand the molecular environment of endometriotic lesions, and to \nelucidate potential mechanisms that underlie the complex physiopathology of endometriosis, we analyzed \nthe expression of the glycodelin gene.\nDesign: Prospective laboratory study.\nSetting: University hospital.\nPatients: Eleven healthy fertile women and seventeen patients with endometriosis diagnosis in early \nproliferative phase of the menstrual cycle.\nIntervention(s): Endometrial biopsy specimens were obtained from normal endometrium of healthy women \nwithout endometriosis, and from eutopic and ectopic endometrium tissues (pelvic and ovarian endometriotic \nimplants) of endometriosis patients.\nMain Outcome Measure(s): The glycodelin relative expression level by real time PCR analysis.\n\nResult(s): Glycodelin down-regulation was found in the endometriotic lesions, 332.26 and 123.17-fold lower, \nrespectively, when compared to the eutopic tissue (P<0.05) and the normal endometrium (P<0.0001).\nConclusion: According to these findings, we believe that glycodelin may be one of the molecules responsible \nfor loss of cellular homeostasis in endometriotic lesions.\nSuggested Reviewers: Robert W Rebar  M.D.\nrrebar@asrm.org\nDavid L Keefe\ndkeefe@hsc.usf.edu\nCarlos A Petta\ncpetta@attglobal.net\nOpposed Reviewers: \n\nFigure\nClick here to download high resolution image\n\nFigure\nClick here to download high resolution image\n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n2\nTITLE PAGE\nTitle: Glycodelin expression in normal endometrium without endometriosis, and in \neutopic and ectopic tissue of women with endometriosis.\nAuthors: Juliana Meola, M.Sc.a\nDaniel Blassioli Dentillo, Ph.D.a, \nJúlio César Rosa e Silva, M.D., PhD.b,\nRui Alberto Ferriani, M.D., PhD.b\nLuciana Caricati Veiga, M.Sc.a\nCláudia Cristina Paro de Paz, Ph.D.a,c\nSilvana Giuliatti, Ph.D.a\nLúcia Martelli, M.D., PhD.a\nThis study was performed in the Laboratory of Molecular Genetics and Human \nMolecular Cytogenetics, Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto \n(FMRP-USP), Brazil.\nDepartment affiliations:\na Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São \nPaulo, Ribeirão Preto, 14049-900, Brazil.\nb Department of Gynecology and Obstetrics, School of Medicine of Ribeirão Preto, \nUniversity of São Paulo, Ribeirão Preto, 14049-900, Brazil. \nc APTA - Department of Agriculture - São Paulo State Government, Ribeirão Preto, \n14030-670, Brazil.\nFinancial support: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior \n(CAPES/PROEX), Brasília, Distrito Federal, Brazil; and Fundação de Apoio ao Ensino, \nPesquisa e Assistência (FAEPA/HCFMRP-USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.\n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n3\nCAPSULE\nGlycodelin down-regulation in endometriotic lesions compared to eutopic endometrium \nof endometriosis patients and normal endometrium of women without endometriosis \nprobably indicates alteration in the normal cell differentiation, proliferation and \napoptosis.\n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n4\nSTRUCTURED ABSTRACT AND KEY WORDS\nABSTRACT\nObjective: To better understand the molecular environment of endometriotic lesions, \nand to elucidate potential mechanisms that underlie the complex physiopathology of \nendometriosis, we analyzed the expression of the glycodelin gene.\nDesign: Prospective laboratory study.\nSetting: University hospital.\nPatients: Eleven healthy fertile women and seventeen patients with endometriosis \ndiagnosis in early proliferative phase of the menstrual cycle.\nIntervention(s): Endometrial biopsy specimens were obtained from normal \nendometrium of healthy women without endometriosis, and from eutopic and ectopic \nendometrium tissues (pelvic and ovarian endometriotic implants) of endometriosis \npatients.\nMain Outcome Measure(s): The glycodelin relative expression level by real time PCR \nanalysis.\nResult(s): Glycodelin down-regulation was found in the endometriotic lesions, 332.26 \nand 123.17-fold lower, respectively, when compared to the eutopic tissue ( P<0.05) and \nthe normal endometrium (P<0.0001).\nConclusion: According to these findings, we believe that glycodelin may be one of the \nmolecules responsible for loss of cellular homeostasis in endometriotic lesions.\nKEY WORDS: endometriosis, endometrium, gene expression, glycodelin.\n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n5\nINTRODUCTION\nEndometriosis is an estrogen-dependent, very aggressive, common benign \ngynecological disease, that affects at least 10% of women in reproductive age (1). It is \ncharacterized by the growth of glands and endometrial stroma outside the uterine cavity, \nknown as ectopic tissue (2). Histologically, it is identical to the normal endometrium \n(eutopic) but it is biochemically and functionally different in a number of pathways \nincluding the receptivity to steroids and the invasive potential (3). The most common \nimplantation site is the peritoneum but, occasionally, lesions were detected in the \npleural cavity, liver, kidney, bladder and rarely, in men (4). It is characterized by \nsymptoms such as dysmenorrhea, dyspaneuria, dysuria and pelvic pain (5). Around 30 \nto 50% of infertile patients present the disease (6); however, many women with\nendometriotic implants can be asymptomatic (7).\nThe etiology of endometriosis is complex and multifactorial. The implantation \ntheory of Sampson, although controversial, is the most widely accepted (8). This theory \nis supported by the occurrence of retrograde menstrual flow in 90% of women (9) and \nviable endometrial epithelial cells in the peritoneal fluid (10), that is, endometrial cells \npresenting adhesion, implantation, growth, and angiogenesis characteristics (11) and an \nimmune surveillance escape mechanism (4). Moreover, 1% of the endometriosis cases \nare related to cancer (12), and the disease has shown polygenic tendencies due to a \nhigher risk of 5 to 8% of occurrence in women with a family history of endometriosis in \nfirst degree relatives (13).\nGene expression changes at specific moments are determinant in normal and \nabnormal physiological processes. The explanation of mechanisms which support the \ncomplex physiopathology of endometriosis, in order to clarify the expression and \nfunction of correlated genes, allows the elucidation of the molecular environment of \n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n6\nendometriotic lesions. Some studies have associated glycodelin expression and its \nfunctions to malignant and benign gynecological diseases such as endometriosis (14).\nGlycodelin is a glycoprotein from the human lipocalins superfamily and is \nmainly expressed in reproductive tissues (15). This protein contains a number of \nglycosylation sites and many isoforms have already been described (15), glycodelin A \nbeing the one found in the amniotic fluid (16), endometrium and decidua (17). The \nPAEP (progestagen-associated endometrial protein) gene, official symbol for the \nglycodelin gene, is located in the chromosomal region 9q34 (18), composed by 7 exons \nand has four response putative elements for glucocorticoids/progesterone upstream from\nits promoter region. Therefore, the glycodelin synthesis seems to be regulated by \nprogesterone (19).\nGene expression in the normal endometrial tissue is regulated during the \nmenstrual cycle phases, being down-regulated in the proliferative phase, up-regulated \ninitially and down-regulated at the end of the secretory phase (20). This means that it is \nabundant during the implantation window in normal cycles compared to infertile \nwomen’s cycles (21) and rare in the periovulatory period, when fertilization may occur \n(22, 23). It is also widely expressed at the beginning of pregnancy involving embryo \nprotection in the maternal-fetal interface (24). Glycodelin also inhibits the sperm-oocyte \nconnection because it binds to the sperm head (25). \nAlthough the precise function of glycodelin is still unknown, it is believed that \nits activity could depend on the type of glycosilation undergone. Some of the proposed \nfunctions are: immunosuppression (26), contraception (25), participation in \nangiogenesis (27, 28), and apoptosis (29, 30). Moreover, there are also activities \nindependent from glycosilation such as glandular morphogenesis induction, epithelial \ndifferentiation and tumor suppression (31, 32).\n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n7\nThe purpose of our study was to compare the PAEP gene expression levels in \nnormal endometrial tissue from women without endometriosis and in the eutopic and \nectopic endometrium (pelvic and ovarian endometriotic implants) from endometriosis \npatients.\nMATERIAL AND METHODS\nThis study was realized in the Laboratory of Molecular Genetics and Human \nMolecular Cytogenetics, Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto \n(FMRP-USP), Brazil. The project was approved by the Research Ethics Committee \n(CEP) of the University Hospital from the FMRP-USP (# 11736/2004). Written \ninformed consent was obtained from each patient.\nSamples\nTwenty-eight patients were selected using the following inclusion criteria: \nreproductive age (18 to 40 years); early proliferative phase of the menstrual cycle (days \n5-8); with regular cycles and no history of any hormonal therapy during the last six\nmonths before the biopsies. The endometriosis stage was settled in agreement with the \nAmerican Society for Reproductive Medicine classification (33).\nThe patients were divided into two groups: (A) the control group, where \nnormal endometrial biopsies were collected using a Novak curette from 11 women with \nno diagnosis of endometriosis nor infertility, referred to our service by the Family \nPlanning Ambulatory with tubal ligation indication; (B) 17 patients with endometriosis \ndiagnosis, referred to our service by the Endoscopy and Pelvic Pain Ambulatory and\nInfertility Ambulatory of the University Hospital due to pelvic pain and/or infertility \nindication. Biopsies of eutopic (n=17) and ectopic (n=17) endometrium of the same \npatients were collected by laparoscopy. Among the 17 ectopic endometrium biopsies, 8 \nwere stage II (4), III (2) and IV (2) peritoneal lesions, and 9 were stage III (2) and IV \n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n8\n(7) ovarian lesions. The diagnosis was confirmed through histopathological analysis. \nThe samples were stored at -80 0C after cryopreservation treatment with Tissue-Teck \nO.C.T. Compound (Sakura Finetek USA. Inc., Torrance, CA).\nRNA extraction\nThe samples were washed in PBS (1x) (NaCl 8.50g/L; Na 2HPO4 1.11g/L; \nNa2HPO4.12H2O 2.81g/L; KH 2PO4 0.20g/L pH7.0) to remove the cryoprotector from \nthe tissues. Then, the total RNA was extracted (50mg of tissue) using TRIZOL \nReagent (Invitrogen Life Technologies, Paisley,UK.) according to the manufacturer’s\ninstructions. The RNA integrity was analyzed by electrophoresis. The total RNA \nconcentrations were obtained using a spectrophotometer at an optical density of 260nm. \nThe RNA was stored at -80°C for future procedures.\ncDNA synthesis\nOne microgram of total RNA from each sample was reversely transcripted \nusing the High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) \naccording to the manufacturer’s instructions.\nQuantitative Real Time – PCR (Q RT-PCR)\nFrom all 45 collected samples, 44 (10 normal endometrium tissues, 17 eutopic \nand 17 ectopic tissues) were submitted to real time PCR analysis in the ABI PRISM TM\n7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Warrington, UK) for relative \nquantification of the glycodelin gene expression. One of the normal endometrium \nsamples was randomly chosen to be used as calibrator. The reactions were performed \nusing the TaqMan ® Gene Expression Assays system (TaqMan® MGB probes, FAM™\ndye-labeled) from Applied Biosystems. The probes and the primers for the PAEP\n(Hs01046125_m1) and GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, \nendogenous control) (Hs99999905_m1) genes were obtained using the Assay-on-\n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n9\nDemand™ Gene Expression Products (Applied Biosystems, Warrington, UK). In order \nto verify the efficiency of the probes and primers in the amplification reaction for the \ngenes PAEP and GAPDH, calibration curves were built in threefold from serial \ndilutions (non-diluted, 10 -1, 10-2 and 10 -3) of the cDNA obtained from a pool of equal \namounts of all samples. Using the calibration curve, the standard-curve was built. The \nstandard-curves with slope between -3.6 and -3.1 were considered. \nA Q RT-PCR was performed in double for each sample according to the \nfollowing conditions: 10µL of TaqMan® Universal PCR Master Mix (2x) (Applied \nBiosystems, Warrington, UK), 1µL of TaqMan® Gene Expression Assay Mix (20X) \n(Applied Biosystems, Warrington, UK) and 9µL of diluted cDNA (1/50 dilution) in a \nfinal volume of 20µL for each reaction. The reaction conditions were 50ºC for 2 \nminutes, then 95ºC for 10 minutes, followed by 40 cycles at 95ºC for 15 seconds and \n60ºC for 1 minute. The glycodelin expression level was calculated for each sample \naccording to the 2 -ΔΔCT method as previously described in the Applied Biosystems User \nBulletin  2 (PN 4303859) (Applied Biosystems, Warrington, UK) and according to the \nliterature (34, 35). The GAPDH (endogenous) and the calibrator sample were used as \nnormalizers for the 2-ΔΔCT calculus.\nStatistical analysis\nThe glycodelin gene expression variable was transformed by log 10. The \nlogarithmic transformation was necessary because one of the suppositions (linearity) \nmade in the linear models analyses was not answered. These analyses specify that the \nconditional average E(y x = x0) from the response variable y given the x 0 value of the \npredictor vector x, is linear in x 0. The application of the linear models can be extended \nsupposing that an appropriated transformation of the answer variable given by t(y), \n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n10\nwhere Et(y)x, be linear in x, in the function t(y) = 0 + Tx + , for unknown 0 e \nT. The term  (random error) is independent from x and has an average of zero (36).\nThe statistical analyses were carried out using the statistical software package \nSAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). The Dunnetts test was used \naccording to the GLM procedures to compare the mean value of 2 -ΔΔCT for the PAEP\nexpression obtained from (1) normal endometrium and ectopic tissue, (2) normal\nendometrium and eutopic tissue, (3) peritoneal and ovarian lesions. To compare the \naverage glycodelin expression in the eutopic and ectopic tissues, the paired T test was \nused. Correlation analyses were performed by the PROC CORR among the PAEP\nexpression levels obtained in the ectopic tissues and the lesions staging. Analyses with \nP  0.05 were considered to be statistically significant. The mean value of 2 -ΔΔCT was \nused to calculate the mean fold-change of gene expression in each group.\nRESULTS\nThe relative quantification for the glycodelin gene expression in the different \ntissues is represented in Figure 1. We have observed a significant difference in \nexpression between the ectopic and the eutopic endometrium of patients with \nendometriosis (P0.05), and between the ectopic endometrium tissues of patients with \nendometriosis and controls (normal endometrium, P0.0001). On average, the \nglycoprotein expression was approximately 332-fold down-regulated in the \nendometriotic lesions in relation to the average expression observed in the eutopic \ntissues and 123-fold down-regulated in relation to the average expression observed in \nthe normal endometrium. However, we have not observed any significant difference in\nexpression between the eutopic endometrium tissues of women with endometriosis and \nnormal endometrium of the control group.\n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n11\nWhen the results of the PAEP gene relative quantifications were compared in the \ndifferent types of lesion sites, ovarian or peritoneal, no significant difference in \nglycodelin expression at the different locations was observed. Although there are no \nsignificant differences, the values of glycodelin expression in the peritoneal and ovarian \ntissues are represented in Figure 2. Moreover, no significant correlation between the \nglycodelin expression levels from ectopic endometrium tissues and the disease staging \nwas observed.\nDISCUSSION\nWe believe that comparative studies of gene expression between ectopic and \neutopic endometrial cells can elucidate the mechanisms involved in the complex and \nmultifactorial development of endometriosis. As previously described, these tissues are \nbiochemically and functionally different in a number of pathways including the \nreceptivity to steroids and the invasive potential (3). Moreover, according to the most \nacceptable etiological theory for endometriosis , the cells present in the menstrual \nreflow are in the early proliferative phase of the cycle, which is an important phase for \nthe alterations analyzes in endometrial cell gene expression.\nAdditionally, in a previous report from our group (unpublished observations), \nwe analyzed the expression profiling of endometrium from women with endometriosis \nusing subtractive hybridization in the early proliferative phase of the menstrual cycle. \nData indicated glycodelin as one of the differentially expressed genes in the ectopic \nendometrium when compared to the eutopic one.\nThe endometrium is the only adult tissue able to undergo intense proliferation, \nsecretion, regression and regeneration during each menstrual cycle, and such cyclic \nalterations are rigorously regulated by hormones and gene expression variations (37). \nCellular differentiation is an intrinsic characteristic of this process and some studies \n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n12\nhave suggested that glycodelin has important functions in epithelial cell differentiation. \nGlycodelin cDNA transfection studies in MCF-7 breast cancer cells (38) and in \nendometrial adenocarcinoma cells (Ishikawa cells) (31, 32) have showed that \nsimultaneously to glycodelin expression induction, malignant cells have been converted \nto a normal phenotype presenting less proliferation and apoptosis induction. \nFurthermore, there was an up-regulation expression of markers of organized epithelia, \nsuch as cytokeratins 8 and 18 as well as E-cadherin, and down-regulation of vimentin, \nMUC1 and Bcl-XL genes, associated to tumor development and chemoresistance \ninduction. Therefore, it has been suggested that glycodelin has a tumor suppressor \nfunction and its synthesis-stimulating pathways should be reevaluated, for future \napplications in supporting chemotherapy of malignant tumors (32). It has also been \nshowed that histone deacetylase inibitors suppress the endometrium and endometriotic \ncells proliferation (39), and these inhibitors are able to directly stimulate glycodelin up-\nregulation in malignant cells inducing the differentiation to normal features (40).\nIn this study, glycodelin down-regulation in endometriotic lesions compared to \neutopic endometrium of endometriosis patients and normal endometrium of women \nwithout endometriosis probably indicates an alteration in the normal cell differentiation, \nproliferation control and apoptosis induction, i.e., cellular homeostasis alteration \nassociated to loss of the glycodelin functions. It is possible that such loss of function is a \nresult of genomic alterations in the endometriotic lesions because loss at the 9q34 \nchromosome region, where the PAEP gene is located, was found in ectopic \nendometrium tissue (41). \nKao et al. (21) found a lower glycodelin expression in the secretory phase of the \nmenstrual cycle using microarray analyses and northern blot validation in eutopic tissue \nof patients with endometriosis when compared to normal endometrium of women \n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n13\nwithout endometriosis. We believe that these discordant data are primarily due to the \ndifferent cycle phases analyzed. Also, it is possible that the differences could be due to \nthe different applied methodologies. The quantification using real time PCR is \nconsidered the gold standard methodology for gene expression quantification because it \ncan measure very large and very small amounts of transcripts, with high sensitivity and \nspecificity when compared to other techniques such as northern blot (42). Although we \nhave not detected significant differences in glycodelin gene expression among these \ntissues, a higher expression was observed in the eutopic tissue than in the normal \nendometrium. This finding corroborates the idea that glycodelin performs functions in \ncell homeostasis maintenance. A larger number of samples are necessary to confirm this \nhypothesis.\nStudies with anti-glycodelin antibodies have showed that glycodelin expression \nwas more frequent in well-differentiated ovarian serous carcinomas when compared to \npoorly differentiated, and the expression of this glycoprotein was also more frequent in \nearly stages when compared to advanced tumoral stages. Moreover, glycodelin \nexpression was associated with better prognosis (43). Although a higher glycodelin \nexpression has been observed in the peritoneal lesions when compared to the ovarian \nones, this difference was not significant. A higher expression was expected in the \nperitoneal lesions, where the early stages of endometriosis were predominant, than in \nthe ovarian lesions. \nAccording to these considerations, we believe that glycodelin may be one of the \nmolecules responsible for cellular homeostasis loss in endometriotic lesions.\nACKNOWLEDGEMENTS\nWe are grateful to the patients for their participation in this study; to the \nmultidisciplinary teamworking from the Human Reproduction Division of the \n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n14\nDepartment of Gynecology and Obstetrics, FMRP – USP for the sample collection; to \nthe technical support of the Pediatrics Oncology Laboratory of the Department of \nPediatrics and Puericulture, FMRP-USP.\n\n 1 \n 2 \n 3 \n 4 \n 5 \n 6 \n 7 \n 8 \n 9 \n10 \n11 \n12 \n13 \n14 \n15 \n16 \n17 \n18 \n19 \n20 \n21 \n22 \n23 \n24 \n25 \n26 \n27 \n28 \n29 \n30 \n31 \n32 \n33 \n34 \n35 \n36 \n37 \n38 \n39 \n40 \n41 \n42 \n43 \n44 \n45 \n46 \n47 \n48 \n49 \n50 \n51 \n52 \n53 \n54 \n55 \n56 \n57 \n58 \n59 \n60 \n61 \n62 \n63 \n64 \n65 \n15\nREFERENCES\n1. 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The vertical and \nhorizontal axes represent, respectively, the mean value of 2 -ΔΔCT for glycodelin in\ndifferent lesions and the different lesion sites.","source_license":"CC0","license_restricted":false}