Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose

The objective of this study wa s to analyze the relation and the predominance of the immune response patterns Th1 and Th2 in patients with endometriosis. Patients and Methods: Between February 2004 and Ap ril 2005, 98 patients were evaluated and divided into two groups, according to the presence (Group A) or absence of endometriosis (Group B), confi rmed by histology. Peripheral blood and peritoneal fluid were collected from all pat ients to obtain the concentrations of interleukines (IL) 2, 4 and 10, tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and interferon-gamma (IFN-gamma) using flow cytometry. Besides the presence of endometriosis, we analyzed phase of m enstrual cycle, clinical complaints, classification, site and histological differentiation of the disease.

We observed higher concentrations of IFN-gamma (median of 1.5pg/ml in Group A and 0.4pg/ml in Group B, p=0.03) and IL-10 (median of 38.6pg/ml in Group A and 15.7pg/ml in Group B, p=0.03) in peritoneal fluid of patients with endometriosis in relation to those without the disease. Patients with endometriosis presented a significant alteration in IL-4/IFN-gamma (p<0.001), IL-4/IL-2 (p=0.006), IL-10/IFN-gamma (p<0.001) and IL-10/IL-2 (p<0.001) ratio concentrations of peritoneal fluid, with IL-4 and IL-10 predominance, refl ecting a Th2 response predominance over the Th1.

The results allow concluding tha t, in this study, it was observed a cytokine elevation related to Th2 immune re sponse, indicating a predominance of this pattern of response in patients with endometriosis. Key words: endometriosis, immunology, cytokines, Th1 cells, Th2 cells 1. INTRODUÇÃO Introdução ____________________________________________________________________________ 2 A endometriose se c aracteriza pela presença de glâ ndula e/ou estroma endometriais em áreas extra-uterinas, localizando-se principalmente nos ovários e nos ligamentos útero-sacros (Metzger & Haney, 1989), comprometendo cerca de 10 a 15% das mulheres durante a menacme (Eskenazi & Warner, 1997). A importância da afec ção reflete-se na quantidade cres cente de pesquisas publicadas nos últim os 20 anos, destacando- se, em especial, a busca contínua pelo esc larecimento de sua patogênese, pois ao se entender o motivo do desenvolvimento do foco de end ometriose, será possível direcionar esforços para melhorar as formas atuais de diagnóstico e tratamento ( Giudice & Kao, 2004). Neste contexto, duas correntes prin cipais de hipóteses etiopatogênic as são citadas há quase um século, com suas respectivas atualizações. A primeira delas é denominada t eoria da metaplasia celômica, segundo a qual ocorreria transformação de mesotéli o em tecido endomet rial (Meyer, 1919). Revendo esta teoria, Zheng et al., em 2005, avaliaram 110 casos de endometriose ovariana e 30 ovários sem endo metriose por meio de a nálise imuno-histoquímica, com especial ênfase às áreas de endomet riose inicial, definida pela transiç ão de ovário normal para focos de endometriose. Nestas, o núm ero de células positivas para um marcador de célula estromal endometrial foi si gnificativamente mais elevado do que nas c élulas dos ovários normais, porém, mais baixo do que nas áreas de endometriose bem es tabelecida. Esses dados sugerem que as áreas de transições de ovários normais para os foco s de endometriose inicial são sedes de processos de metaplasia, tanto no componente epitelial como no estromal. A hipótese mais conhecida é a teoria da m enstruação retrógrada, segundo a qual haveria implante de células endometriais provenientes do refluxo do sangue menstrual pelas tubas uterinas para a cavidade abdominal (Sampson, 1927). Este implante ocorreria pela influência de um ambiente hormonal favorável e de fatores imunológicos que não eliminariam essas células deste local impróprio (Weed & Arquembourg, 1980, Missmer & Cramer, 2003, Siristatidis et al., 2006). A partir da observação de diversos aspectos desta afecção, Nisolle e Donnez, em 1997, lançaram um conceito que dividiu a endometriose em três Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 3 doenças distintas: peritoneal, ovariana e de septo reto-vaginal, esta última denominada de endometriose infiltrativa profunda (Koninckx & Martin, 1992). Segundo estes autores, a doenç a peritoneal se c aracteriza pela presença de implantes superficiais no perit ônio; a ovariana inc lui os implantes superficiais d e ovário e os cistos típicos da doença, os endometriomas; e a endometriose profunda acomete as regiões retro-cervical e para-cervical, o septo reto-vaginal, o reto-sigmóide, os ureteres e a bexiga, de forma infiltrativa, com lesões de profundidade maior do que cinco milímetros (Cornillie et al., 1990). Os sintomas característicos das pacientes com endometriose são dor pélvica, infertilidade e alterações dos hábitos intestinais e urinários durante o período menstrual (Podgaec & Abrão, 2004) . No entanto, apesar de diversas pesquisas tentarem encontrar métodos laborat oriais que permitissem o diagnóstico da moléstia sem a necessi dade de um procedimento cirúrgico ( Abrão et al., 1997, Podgaec, 2000, Bedaiwy et al., 2002, Khan et al., 2006), o diagnóstico definitivo ainda depende de métodos invas ivos, como a vídeo-laparoscopia, que torna possível a visualização das lesões s ugestivas da doença e a obtenção de amostra tecidual que confirme, pela análise histológica, essa suspeita. Durante o procedim ento cirúrgico, aplica-se a class ificação da American Society for Reproduct ive Medicine (ASRM, 1986), que divi de a e ndometriose em quatro estádios. A gravidade progride co m a quantidade e tamanho dos focos de doença e com a presença de aderências, sendo o estádio IV o mais avançado. Os dados hist ológicos podem ser descritos de acordo com a similarid ade c om o endométrio tópico, conforme estudo de nosso s erviço, que identific ou a possibilidade de relacionar estas informa ções com o prognóstic o de cada caso (Abrao et al., 2003). Considerações sobre o papel do sistema imunológico na endometriose Diversos autores se dedicaram ao estudo da participação do papel d o sistema imunológico na endometriose, tendo s ido detectadas uma série de anormalidades (Berkk anoglu & Arici, 2003). O principal raciocínio p ercorrido até Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 4 então, atualiza a teoria do refluxo mens trual, no sentido de que as células endometriais que penetram na cavidade peritoneal deveriam ser eliminadas pelos participantes do sistema de defesa do organi smo, pois tais células não pertencem a este local. Nas mulheres com endometriose, este mecanismo sofreria um viés e esta varredura não ocorreria de forma correta, o que permitiri a o implante e o desenvolvimento dessas células na cavid ade peritoneal, dando origem ao foco endometriótico inicial (Harada et al., 2001). Habitualmente, as células endom etriais, mantendo-se na cavidade peritoneal, são identificadas como an tígenos que devem ser submetidos à resposta imune loc al. Dentre outras célu las, os macrófagos agem como célu las apresentadoras de antígeno, ao fagocitar em, processarem e apresentarem os antígenos aos linfóc itos T. Esta apresentação ocorre através das moléc ulas codificadas pelo com plexo de histocompat ibilidade principal (CHP) presentes em sua superfície celular. Existem molécu las de classe I e II do CHP, sendo que o antígeno pode se ligar a qualque r uma destas moléculas. Ao haver a ligação do antígeno à molécula de classe I, ocorre atração de linfócitos T citotóxicos e, quando a ligação se completa à molécula de classe II, ocorre atração de lin fócitos T helper (auxiliadores). Após esta etapa, é possível afirmar que os linfócitos T citotóxicos liberam substâncias letais, re sponsáveis pela morte da célula-alvo. De forma distinta, os linfócitos T helper não possuem esta ação direta, mas secretam citocinas que podem levar à morte celular (Benjamini et al., 2002). Alterações na atuação de linfóc itos, macrófagos e cito cinas podem estar envolvidas na gênes e da endometriose (Harada et al., 2001). Imunidade celular Macrófagos: os macrófagos peritoneais são as princip ais células da cavidade peritoneal e constit uem importante fonte de produção de cit ocinas, incluindo as interleucinas (IL) 1, 6, 8 e 10, o fator de necrose tumoral alfa (TNF- alfa), o fator de crescimento tecidual bet a (TGF-beta) e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) (Oosterlynck et al., 1994; McLaren et al., 1996; Bedaiwy et al., 2002). A função fagocítica dos macrófagos é vasta, graças a Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 5 receptores de superfície presentes nesta s células e ao poder regulatório de diversos fatores como citocinas, glic ocorticóides, lipopoliss acárides, fatores estimuladores de colônias de macrófagos e retinóides. Como algumas citocinas parecem estar presentes em níveis anormais no fluido peritoneal de mulheres com endometriose, esta ação dos macróf agos pode apresentar falhas, o que contribuiria para o desenvolv imento da doen ça (Lebovic et al., 2001). No fluid o peritoneal das pac ientes com endometrios e, os macrófagos peritoneais parecem estar elevados em número, concentração e estado de ativação (Ulukus & Arici, 2005). Células Natural Killer: as células natural killer (NK) participam dos mecanismos que regulam o clearance de células endometriais regurgitadas para a cavidade peritoneal, porém, os estudos re lativos a este tópico são ainda conflitantes. O número ou a porcentagem de células NK em mulheres com endometriose pode estar diminuído (Ota et al., 2002), aumentado (Hill et al., 1988, Matsubayashi et al., 2001), inalterado (Oos terlynck et al., 1991) ou v ariável, de acordo com o estádio (ASRM, 1986) da doença (Dias Jr et al., 2005). Desta forma, um fato que permiti ria às células endometriais que se depositam retrogradamente na ca vidade peritoneal s e impl antarem, residiria na diminuição do poder de cito toxicidade das células NK contra o tecido endometrial (Wilson et al., 1994). Esta condição se ba searia no aumento da expressão dos receptores inibitórios k iller nas células NK per itoneais de mulheres com endometriose, pois, esses receptores são os responsáveis pela inibição da ação citotóxica destas células (Wu et al., 2000). Linfócitos: os estudos relativos ao número de linfócitos presente em mulheres com endometriose não são conc lusivos. Já foi demonstrado haver diminuição na proliferação de linfócitos no sangue periférico na resposta ao reconhecimento de antígenos endometriais (Steele et al., 1984), aumento do número de linfócitos T helper no sangue periférico de mulheres com endometriose (Badawy et al., 1987) e concentr ações normais de linfócitos no s angue (Hill et al., Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 6 1988) e no endométrio tópico em mulher es com endometriose (Mettler et al., 1996). Citocinas: são prot eínas de baixo pes o molecular que at uam como mensageiros do sist ema imunológico e r eguladores da atividad e das dif erentes células deste sistema. Estão envolvidas em várias etapas da resposta imune, como quim iotaxia e estímulo à mitose, à angiogênese e à diferenciação celular. Neste grupo estão incluídas , entre outras substâncias, 31 interleucinas, VEGF, TNF-alfa, interferon-gama (IFN-gama) e TGF-beta (Harada et al., 2001). Há indícios do env olvimento de ci tocinas em diferentes etapas da patogênese da endometriose, como: migr ação de macrófagos na cavidad e peritoneal; estímulo à adesão da célula es tromal à fibronectina, favorecendo o implante peritoneal; adesão da célula endometrial ao peritônio por aç ão das enzimas matriz metaloproteinases (MMPs) que degradam a matriz ex tracelular; e manutenção do implante peritoneal por estímulo à angiogênese (Seli et al., 2003). Concentrações elevadas de citocinas no fluido peritoneal de mulheres com endometriose poderiam refletir alterações na síntese destas substâncias por macrófagos peritoneais, linfócit os, implan tes ectópicos endometriais e células mesoteliais do peritônio (Wu & Ho, 2003, Podgaec & Abrão, 2005) . Esta linha d e pesquisa tem sido explorada em diversas instituições, analisando-se aspectos variados do envolvimento des tas substâ ncias na endometriose, conforme as observações de alguns estudos . Assim, Lebovic et al., em 2000, demon straram que a IL-1 beta atuaria nas les ões de en dometriose, induzindo a produção de fatores angiogênicos como o VEGF e a IL -6 em células estromais de tecid o endometrial ectópico, mas não em células estromais normais. Iwabe et al (2002) demonstraram que a interleucina-6 e o TNF -alfa revelaram-se elevados no fluid o peritoneal de pacientes com endometrios e, sendo que a presença desta interleucina associada a lesões glandular es vermelhas poderia se relacio nar às situações de infertilidade. Em 2002, Pizzo et al., registraram elevação das concentrações séricas e no fluido perit oneal de TGF-beta e IL-8 em pacientes com endometriose, cujas Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 7 dosagens diminuíram conforme a maior se veridade do quadro. De modo inverso, Arici (2002) observou que as concentrações de IL-8 es tavam realmente elevadas, mas aumentaram, correlacionando-se com os estádios mais graves da doença. Imunidade Humoral Em pacientes com endometriose, foram observadas alterações na atividade de linfócitos B e pres ença de auto-anticorpos circulantes em maior concentração do que em mulheres sem a doença (Gleic her et al., 1 987). Weed e Arquembourg, em 1980, publicaram artigo inovador, ao demonstrarem a influência do s istema imune na endomet riose. Foi observada a pr esença de depós itos d e imunoglobulina G (IgG) e complemento no endométrio tópico, com correspondente redução nas concentrações séricas totais de complemento em mulheres com endometriose, supondo que o endométrio ec tópico atuasse na induç ão de resposta auto-imune. Este evento foi c onfirmado em outro estudo que revelou elevação dos níveis das frações C3 e C4 do complemento no soro e fluido peritoneal de mulheres com endometrios e quando comparadas a c ontroles (Mathur et al., 1990). Desta forma, levantou-se a hipótese da endometriose ser uma doença auto- imune por apresentar uma série de características comuns a este tipo de afecção (Nothnick, 2001), como: ati vação policlo nal de células B, anormalidades imunológicas nas funções das células T e B, dano tecidual, envolvimento de diversos órgãos, possível ocorrência familiar com base gené tica associada, preponderância do s exo feminino e pres ença de auto-antico rpos para uma variedade de fosfolípides, histonas e polinucleotídeos. No entant o, até os dias atua is, nenhum auto-anticorpo conseguiu ser detectado como marcador específico para endometriose. Há conjecturas quanto a possíveis antígenos, como transferrina endomet rial e alfa 2-HS glicoproteína de células glandulares epiteliais, que poderiam induzir à formação de anticorpos, pois foram identificadas c oncentrações mais el evadas destas substâncias no fluido peritoneal de pacientes com endometriose quando comparadas a mulheres sem a doença (Mathur et al., 1999). Dmowski et al. (1995) identificaram a presença de Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 8 auto-anticorpos em metade de um gr upo de 84 pacientes com endometriose submetidas à fertiliza ção in vitro , incluindo-se antic orpos anti- cardiolipina, anti- fosfatidilserina, anti-fosfatid iletanolamina, a nti-fosfatidilglicerol, anti-ácido fosfátic o e anti-histona. Em nosso meio, Abrão et al. (1997) registraram elevação de anticorpos anti-cardiolipina nos estádios iniciais da endometriose. Resposta Th1/Th2 A hipótese do balanç o Th1/Th2 surgiu no final dos anos 80, a partir de observações em ratos acerca de dois subtipos de linfócitos T helper, chamados de Th, que diferiam nos padrões de secreção de citocinas e em outras funções (Mosmann et al., 1986). O conceito foi aplicado par a o sistem a imune humano (Romagnani, 1991) e, alguns anos depois, os ef eitos da respost a Th1 e T h2 em doenças tornaram-se important e linha de pesquisa. (Abbas et al., 1996). Embora as célulasTh1 e Th2 estejam consagradas com a responsabilidade de coordenar o sistema imune, algum as discrepâncias têm sido descritas nesta hipótese. (Singh et al., 1999). Células Th1 agem contra células cancerígenas e agentes patogênic os intracelulares, como vírus, e atuam na resposta de hipersensibilidade do tipo tardia a antígenos virais e bacterianos. Células Th2 atuam na proteção contra patógenos extracelulares, como parasitas multic elulares. O padrão de resposta imune Th1 é descrito como sendo o mais agressivo dos dois e, quando encontra-se exacerbado, pode gerar doenç as como artrit e reumatóide, esc lerose múlt ipla e diabete tipo 1. O padrão Th2 está pres ente nas d oenças relacionadas com a atuação da IgE e a fenômenos alérgicos (Benjamini et al., 2002). Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 9 Esta diferenciação dos padrões de resposta imune ocorre, segund o Benjamini et al. (2002), a par tir do contato dos linfócitos ditos Th precursores com o antígeno. Este padrão é então determinado, dependendo das seguintes variáveis: • citocinas envolvidas neste contato; • via de exposição ao antígeno; • afinidade e interação antígeno / complexo de histocompatibilidade principal (CHP) / receptores dos linfócitos T; • natureza das células apresentadoras do antígeno. Quando há estimulo de IL-12 e IL-18 (sintetizadas por células NK e macrófagos) no contato do antígeno com o lin fócito Th precursor, ocorre a diferenciação para a resposta Th1, que estimula a pr odução de IL-2, TNF-alfa e IFN-gama, desencadeando um processo de resposta imune predominantemente celular, que envolve a participação de células NK, macrófagos, linfócitos T citotóxicos e secreção de outras citocinas , como VEGF, e de enzimas, como as matriz metaloproteinases (MMPs). A respos ta Th2 ocorre quand o, no contato do linfócito T h precursor com o antígeno, há estímulo de IL- 4 (produzida por mastócitos), levando à produção de mais IL-4, além de IL-5, 10 e 13, o que induz à atração de linfócitos B, desencadeando um processo envolv endo, de modo predominante, a imunidade humoral, co m a prod ução de imunoglobu linas e ativação de eosinófilos (Figura 1). Cumpre assinalar que ambas as respost as co- existem, havendo preponderânc ia de uma ou da outra de ac ordo com diferentes situações e que as citocinas da resposta Th1 inibem a secreção das citocinas da resposta Th2 e vice-versa (Benjamini et al., 2002). Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 10 Figura 1: Padrões de resposta imune Th1 e Th2 (adaptado de Benjamini et al., 2002). Linfócito TMacrófago Citocinas envolvidas na Resposta Th1 A interleucina-2 (IL-2) é uma citocina produzida primariamente por linfócitos T ativados, com atuação essenc ial na prom oção da expansão c lonal das células T antígeno-específicas. A IL-2 estimula a proliferaç ão e a diferenciaç ão d e monócitos e células NK, como também a produção de outras cit ocinas por estas células (Goldsmith & Greene, 1994). O fator de necrose tumoral-alfa (T NF-alfa) é um polipeptídeo de 157 aminoácidos, com peso de 17kDa, inicialmente identificado por atuar contra certas linhagens celulares. Sabe-se hoje que te m a capac idade de ativar citoc inas e outros fatores associados à res posta inflamatória. Neutrófilos, linfócitos ativados, macrófagos e células NK produzem TNF-alfa ( Ruddle, 1992). Uma das principais atribuições do TNF-alfa se encontra na re sistência às infecções e ao crescimento Th1 Th2 Imunidade Celular Imunidade Humoral IFN-gama TNF-alfa IL-2 IL-4 IL-10 IL-4IL-12 / IL-18 Macrófagos, Células NK, CD8 Citocinas, MMP, VEGF Células B Imunoglobulinas Antígeno Antígeno Célula NK Mastócito Th precursor Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 11 de tumores. No entanto, em excesso pode participar de diversas situações clínicas graves como choque séptico ( Tracey et al., 1987) e doenças auto-imunes ( Pujol- Borrell et al., 1987). O interferon gama (IFN-gama) é uma glicoproteína de 143 aminoácidos e Citocinas envolvidas na Resposta Th2 a produzida, primariamente, por ucina 10 (IL-10) é uma cito cina in icialmente designada como fator Resposta Th1 Th2 em diferentes situações clínicas nder o papel das 20kDa observada, pela primeira vez, como tendo atividade antiviral em culturas de leucócitos humanos infectados por vírus Sindbis ( Wheelock & Sibley, 1965). Produzido por linfócit os T e células NK, o IFN-gama é um inibi dor de replicação viral e tem influênc ia na produção de anticorpos por células B e na reg ulação do complexo de antígenos classe I e II do CHP (Ijzermans & Marquet, 1989). A interleucina 4 (IL-4) é uma cito cin linfócitos T ativados, mastócitos e basófilos. Induz a produção de IgE por linfócitos B, inibe a ação de macrófagos e a ativação de linfócitos T e regula a aç ão de monócitos, bloqueando a síntese de citocinas como IL-1, IL-6 e TNF-alfa (Gazvani et al, 2001). A interle inibidor da síntese de citocinas (CSIF) por ser um produto das células T h2 que inibia a produção de citocinas produzidas pelas células Th1 ( Fiorentino et al., 1989). Modula a função de monócitos e ma crófagos e regula a respost a imune celular por suprimir a produção de s ubstâncias pró-inflamatórias como prostaglandina E2, TNF-alfa, IL-1, IL-6, IL-8 e superóxido (Simhan et al, 2004). Em relação ao conceito da proteção ao feto, expresso na predominância do padrão de resposta Th2 durante a gestação, a IL-10 tem papel de destaque, sendo produzida na interface feto-materna que c ontrola a resposta imune contra o feto (Vigano et al., 2002). Vários est udos foram conduzidos para se compree descobertas relativas às respostas Th1 e Th2, com a perspectiva de se avançar na patogênese e, consequentem ente, no diagnóstico e tratamento de uma série Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 12 de afecções (Alviggi et al, 2006, Xia et al, 2006, Meiler et al., 2006). Indivíduos portadores do vírus da imun odeficiência humana (HIV) que não desenvolvem a síndrome induzida pelo vírus por longos períodos, apresentam resposta Th2 restrita, observada pelas baixas concentrações de IL-4, sugerindo ser este fato um reflexo da modulação e/ou da regulação entre as respostas Th1/Th2, o que manteria o vírus sob c ontrole (Tanaka et al., 1999). Foi observado que a res posta imune celular específica ao HIV é invers amente relacionada à vir emia plasmática, ou seja, quanto melhor a resposta Th1, m enor a carga viral (Norris & Rosenberg, 2001). Exposições freqüentes a alérgenos pode m provocar ativação de células nsib sta parar na relação se ilizadas pela IgE, que lib eram mediador es como histamina, leucotrienos e prostaglandinas, os quais induzem a manifestações clínicas alérgicas. A regulação exagerada de genes que controlam a express ão de IL-4 (Th2) e/ou o déficit na modulação da resposta Th2 poderia ser responsável pela resposta Th2 exagerada a alérgenos ambientais que ocorre em indivíduos atópicos (Singh et al., 1999). Arumugan et al. (2005) aventaram a parti cipação do padrão de respo Th1 na patogênese do acidente vascular cerebral ao observarem que, na microvascularização da região cerebral afetada po r este tipo de evento, há ativação de células endotelia is e recrutamento de leucócitos, dentre os quais os linfócitos T, adquirindo características infl amatórias. De forma semelhante, outros estudos mostraram que a porcentagem de células T positivas para o IFN- gama (Th1) encontrava-se signific ativamente ma is elev ada nos pacientes com angin a instável quando comparados àqueles c om angi na estável. Haveria, assim, a participação desta citocina na ativação de macrófagos, formação de trombos e desestabilização de placas ateroescleróticas (Adler et al., 2005). Na área reprodutiva, o sistema imunológico parece se am das respostas Th1 e Th2. Mul heres com falha de implantação embrionária ou abortamento habitual tendem a apresentar desvio deste balanço, pendendo para a resposta Th1. Segundo Kwak- Kim et al . (2005), as células e citocinas que protegem o embrião, para não ser rec onhecido pelo sistema imune materno como corpo estranho e ser eliminado, são produzidas pelas células Th2 (IL-4, 5, 6, 9, 10, Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 13 13), havendo conc entrações mais elevadas des tas citocinas durante uma gestação normal. Doenças como lupus e ar trite reumatóide tendem a melhorar na gravidez, talvez porque os nív eis de citocinas da resposta Th1 perm anecem baixos (Schulze-Koops & Kalden, 2001). Resposta Th1/Th2 na endometriose Há pouca informação disponível ana lisando espec ificamente a interação Como se depreende dos dados de liter atura, a endometriose é uma doença entre as citocinas env olvidas e a preponder ância de c ada tipo de resposta imune em pacientes com endometriose. Conforme descrito anteriormente, a maioria dos autores refere-se à participação de det erminada cit ocina na endometriose, sem observar o comportamento do conjunto rela tivo às respostas Th1 ou Th2. Neste particular, Hsu et al. (1997) avaliaram a expressão de citocinas por linfócit os no sangue periférico e fluido peritoneal de 36 pacient es com endometriose e de outras 14 pacientes de grupo controle se m a doença. Para essa análise, foi utilizada a reação de polimerase em cadeia por transcriptase reversa (PCR-RT). Os autores observaram que os níveis de RNA mens ageiro (mRNA) da IL-4 nas células do sangue periférico e do fluido peritoneal de pacientes com endometrios e achavam-se mais elevados quando comparados ao g rupo controle, enquanto os níveis do mRNA do IFN-gama mostravam-se diminuídos. que se apresenta com diferentes facetas, a partir, provavelmente, do refluxo endometrial ou da metaplasia celular, de forma superfi cial ou profunda, podendo provocar dor pélv ica e infertilida de ou mesmo nenhum s intoma clínico. A participação do s istema imunológico em alguma etapa deste processo baseia-se de forma consistente na lit eratura atual. A respos ta imune humor al poderia explicar a ocorrência da endometri ose de forma global, conforme as características de uma doenç a auto-imu ne. Partic ularmente nas formas mais agressivas, com acometimento infiltrativo, a atividade da imunidade celular parece predominar, com a aç ão de células, enzim as e citocin as, que pr opiciam adesão, Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Introdução ____________________________________________________________________________ 14 infiltração e manutenção do foc o de tecido endometrial ectópico. Sendo assim, de modo semelhante às pesquisas que tratam das mais variadas situações clínicas, o presente estudo proc ura avaliar os padr ões de res posta imune Th1 e Th2 n a endometriose. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose 2. PROPOSIÇÃO Proposição ____________________________________________________________________________ 16 Propusemo-nos, neste estudo, a: 1. avaliar os padrões de resposta imune Th1 e T h2 em pacientes com endometriose por meio de dos agens séricas e no fluido peritoneal de interleucina- 2, fator de necrose tumoral – alfa e interferon-gama, envolvidos na resposta Th1, e das interleucinas 4 e 10, relativas à resposta Th2. 2. relacionar em pac ientes com endometriose, as dosagens s éricas e no fluido peritoneal dessas citocinas com: • a fase do ciclo menstrual; • o quadro clínico; • os locais de acometimento (peritônio, ovário e doença profunda); • o estadiamento da endometriose ( American Society for Reproductive Medicine, 1996); • a classificação histológica. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose 3. PACIENTES E MÉTODOS Pacientes e Métodos ____________________________________________________________________________ 18 3.1. Pacientes 3.1.1. Local do estudo e pacientes O estudo foi desenvolvido no Setor de Endometriose da Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da F aculdade de Medicina da Univer sidade de São Paulo (HCFMUSP), de Janeiro de 2004 a Novembro de 2005, onde foram avaliadas 98 pacientes atendidas de forma consecutiva, e que foram divididas em dois grupos: Grupo A, cons tituído de pacientes com endometriose e Grupo B, formado por mulheres sem a moléstia. O total de pacientes foi determinado baseando-se na possibilidade de realiz ar este número de procedimentos cirúrgicos, em nosso serviço, no per íodo de tempo estipulado. O estudo foi aprovado pelo Comit ê de Ética e Pesquis a do HCF MUSP (Pr otocolo 601/03) e todas as pacientes leram e assinaram o termo de consentimento pós-informação (Anexo 1). A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) contribuiu para a realizaç ão deste es tudo com verba aprovada no processo 05/01218-3. 3.1.2. Critérios de inclusão Determinaram-se, para o Grupo A, os seguintes critérios de inclusão: • idade entre 18 e 40 anos; • endometriose comprovada histologicamente; • ausência de doenças auto-imunes , confirmada por anamnese, exame físico e por exames laboratoriais quando necessário; • ausência de fator masculin o como causa de infertilid ade, comprovada por análise seminal (OMS, 1994); • ciclos menstruais eumenorréicos, com intervalo entre os fluxos menstruais variando de 26 a 34 dias (Bastos, 1994); Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Pacientes e Métodos ____________________________________________________________________________ 19 • não utilização de terapêutica hormonal nos três meses que antecederam o procedimento cirúrgico, inc luindo análogos do GnRH, progestagênios e contraceptivos hormonais. Para o Grupo B, foram selecionad as pacientes com quadro clínico sugestivo de endometriose, com indicação de vídeo-laparoscopia, utilizando-se os mesmos critérios de inclus ão aplicados par a o Grupo A, exceto pela c onfirmação da ausência de endometriose durante a cirurgia. 3.2. Métodos 3.2.1. Dinâmica do estudo Todas as pacientes f oram avaliadas pe la história clí nica, exam e físico e exames c omplementares (dosagem de CA 125, ultra-sonografia pélvica e /ou transvaginal e ressonância nuclear mag nética, quando apropriado), conforme indicação clínica, para definiç ão da su speita de endometriose. A laparos copia permitiu separar os dois grupos de estudo: o com endometriose, pela confirmação histológica das amostras teciduais das áreas suspeitas, e aquele em que se descartou a presença da doença. Foi anotado o dia do cicl o menstrual em que a paci ente se encontrava no momento do procedimento cirúrgico (Ane xos 2 e 3), sendo considerad a fase folicular do primeiro ao décimo quarto dia do ciclo menstrual e, fase lútea, do décimo quinto ao último dia do ciclo menstrual. Antes da anestesia geral para a vídeo- laparoscopia, foram colhidos 5ml de sangue periférico em tubo seco. A paci ente foi submetida à laparosc opia, seguindo a rotina habitual do ser viço. Pela punção secundária foi feita a coleta de fluido peritoneal depositado em fundo de saco anterior e/ ou posterior, variando d e volume entre 2 e 10ml, o qual foi também armazenado em tubo seco. O material foi encaminhado ao laboratório para ser centrifugado, aliquotado e congelado em freezer à -20ºC. Depois de est ocado, somente foi descongelado com a coleta Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Pacientes e Métodos ____________________________________________________________________________ 20 completa de todos os dados, para a realização das dosagens de TNF-alf a, IFN- gama e das interleucinas 2, 4 e 10. 3.2.2. Quadro clínico Todas as pacientes foram questionadas quanto à presenç a de seis sintomas associados à endometriose (Anexos 2 e 3), quais sejam: a. dismenorréia: dor em cólica no per íodo menstrual, considerada para o estudo somente de intensidade severa, quando a pac iente referia que a dor não melhorava completamente com analgésicos, mas não a impedia de exercer suas atividades habituais ou incapac itante, quando a paciente referia que a dor a impedia de exercer suas atividades habituais (Laufer e Goldstein, 1998); b. dispareunia de profundidade: dor pélvica durante a relação sexual; c. dor pélvica acíclica: dor pélvic a sem relação com o ciclo menstrual por pelo menos seis meses, sem melhora com a utilização de analgésicos; d. infertilidade: dificuldade para engravidar em casa l com vida se xual ativa (duas ou mais relaç ões sexuais por sema na) e sem utilizar mét odo contraceptivo por pelo menos um ano; e. alterações intestinais cíclicas: sintomas intestinais durante o período menstrual, incluindo aceleração ou dimi nuição do trânsito intestinal, dor à evacuação, puxo, tenesmo e/ou sangramento nas fezes; f. alterações urinárias cíclicas : sintomas urinário s durante o período menstrual, incluindo disúria, hematúria, polaciúria e/ou urgência miccional. 3.2.3. Estadiamento da Endometriose As pacientes com endometriose tive ram sua doença c lassificada durante o procedimento cirúrgico pelos critérios da American Society for Reproductive Medicine (ASMR), revisado em 1996 (Figura 2), em estádios de I a IV (Anexo 4). Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Pacientes e Métodos ____________________________________________________________________________ 21 Figura 2: Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive Medicine (1996). Estádio I (mínima): 1-5 Estádio II (leve): 6-15 Estádio III (moderada): 16-40 Estádio IV (severa): > 40 ENDOMETRIOSE 3 cm Superficial Profunda D superficial Profunda E superficial Profunda OBLITERAÇÃO DO FUNDO DE SACO POSTERIOR 1 2 1 4 1 4 2 4 2 16 2 16 4 6 4 20 4 20 Parcial Completa 4 40 OVÁRIO PERITÔNIO ADERÊNCIAS 2/3 Envolvidos D Velamentosa Densa E Velamentosa Densa 1 4 1 4 1 4* 2 8 2 8 2 8* 4 16 4 16 4 16 TROMPA OVÁRIO D Velamentosa Densa E Velamentosa Densa 1 4* 2 8* 4 16 * Se as fímbrias tubárias estiverem totalmente envolvidas por aderências, mude o escore para 16. Porcentagem de implantes: Lesões vermelhas (claras, vermelhas, rosadas, em chama, vesículas): ___% Lesões brancas (brancas, amareladas, marrons, defeitos de peritônio): ___% Lesões pretas (pretas, depósitos de hemossiderina, azuis): ___% Endometriose adicional: _________________________________________ Patologias associadas: __________________________________________ Usar em caso de trompas e ovários normaisED Usar em caso de trompas e ovários anormaisED Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Pacientes e Métodos ____________________________________________________________________________ 22 3.2.4. Endometriose: locais de doença e classificação histológica As pacientes com endometriose fora m avaliadas quanto à presença de focos de doença no peritônio, ov ário e/ou em localização infiltrativa profunda, que inclui as r egiões retro-cervical, para-ce rvical, septo r eto-vaginal, reto-sigmóide, ureteres e bexiga (Anexo 4). Os locais de comprometimento foram consider ados observando-se critérios de gravidade do processo, ou seja, doença profunda mais grave que a ovariana, que por sua vez é mais grave que a doença peritoneal. Assim, foram atribuídos como cr itérios para se considerar doença peritoneal, a existência de foc os periton eais exclu sivos, sem a presença de doença profunda e em ovários. A doença ovariana foi determinada na ausência da doença pr ofunda, independente de focos per itoneais. Para a doença pr ofunda, não houve restrições pela presença de endometriose peritoneal ou ovariana. A análise histológica dos tecidos ressecados (Ane xo 4) seguiu os padrões da classificação proposta por Abrão et al., em 2003, que divide a doença em: • a) padrão estromal: presença de es troma morfologic amente similar ao do endométrio tópico em qualquer fase do ciclo (Figura 3a); • b) padrão glandular bem diferenciado: presença de epitélio superficial ou constituindo espaços glandulares ou cístic os, composto por células epiteliais co m morfologia indistinguível dos endométrios tópicos nas diferentes fases do ciclo menstrual (Figura 3b); • c) padrão glandular indi ferenciado: presença de epit élio su perficial o u constituindo espaços glandulares ou cístic os, sem as características morfológicas vistas no epitélio endometrial tópico (Figura 3c); • d) padrão glandular misto de diferenciaç ão: presença, na mesma localização, de epitélios com padrão bem diferenciado e indiferenciado (F igura 3d). Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Pacientes e Métodos ____________________________________________________________________________ 23 Figura 3a. Foco de en dometriose estromal em meio à fibrose (Hemat oxilina eosina, HE - 100x); 3b. Foco de en dometriose, padrões estromal e glandular bem diferenciado (HE - 400x); 3c. Endometriose de padrões estromal e glandular indiferenciado (HE- 400 x); 3d. Endometriose de padrões estromal e glandular misto de diferenciação (HE – 100x). a b c d 3.2.5. Método laboratorial O método laboratorial para as dosagens de TNF-alfa, IFN-gama, IL-2, IL-4 e IL-10 foi o BD Cytometric Bea d Array (C BA), catálogo 551809, produzido pela Pharmingen, Becton Dickinson, Co. (San Diego, Califórnia, EUA) e aplicado em um aparelho apropriado para citometria de fluxo (BD FACSCalibur, Franklin Lakes, New Jersey, EUA, F igura 4). Todos os expe rimentos foram realiz ados de ac ordo com as especificações do fabricante e a c oncentração das amostras foi calculada com o uso de padrões conhecidos (Anexos 5 e 6). Figura 4: Aparelho de citometria de fluxo utilizado no estudo (BD FACSCalibur) Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Pacientes e Métodos ____________________________________________________________________________ 24 3.3. Método estatístico Para otimizar a análise estatística, os estádios I e II (1996) foram reunidos e denominados como estádio inicial da endometr iose e, os estádios III e IV, como estádio avançado. Além disso , quanto à classificação hist ológica, foi considerado como diferencial a presença ou não de e ndometriose de padr ão indiferenciado, por ser o tipo histológico de pior prognóstico (Abrão et al., 2003). As variáveis categóricas foram a nalisadas pelo teste de qui-quadrado e as variáveis quantitativas contínuas foram comparadas pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney para duas amostras indepen dentes (Grupo A e B). As pacie ntes com endometriose foram categorizadas, de acordo com o estádio (ASRM, 1996), o local de acometimento e a classifica ção histológic a. Efetuou-se anális e não paramétrica, com o teste estatístico Krusk al-Wallis para verificar se as dosagens séricas e do fluido peritoneal eram semel hantes ou diferentes, alternativamente. Os cálculos estatístic os foram feitos pelo software SPSS (SPSS Inc., USA), adotando-se o nível de significância de 5%. Para se estabelecer a predominância de um tipo de resposta imune, Th1 ou Th2, optou-se pela a nálise de dados ca tegorizados utilizand o o percentil d a variável que estava sendo avaliada. O percentil escolhido foi o de nível proporcional aos tamanhos das amostras e aplic ou-se o teste de McNemar, adotando-se nível de significância de 5%. (Everitt, 1977). Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose 4. RESULTADOS Resultados ______________________________________________________________________ 26 Foram analisadas 98 mulheres, sendo 65 com endometriose (Grupo A) e 33 sem endometriose (Grupo B). A média de idade das pacientes do Grupo A foi 32,1 (±5,4) anos, semelhante à do Grupo B, com média igual a 32,9 ( ±5,1) anos (Gráfico 1). Gráfico 1: Comparação da média de idade das pacientes do Grupo A (com endometriose) em relação às pacientes do Grupo B (sem endometriose) 15 20 25 30 35 40 45 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Percentil Idade Grupo A* Grupo B* *p>0,05 As características clínicas dos dois grupos são demonstradas na Tabela 1. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Resultados ______________________________________________________________________ 27 Tabela 1: Características das 65 pacientes do Grupo A (com endo metriose) e das 33 pacientes d o Grupo B (sem endometriose), analisadas d e acordo com a fase do ciclo menstrual e com o quadro clínico. Grupo A Grupo B Característica n % n % p Fase do ciclo menstrual Folicular 56 86,2 25 75,8 0,199 Lútea 9 13,8 8 24,2 Dismenorréia Presente 42 64,6 9 27,3 <0,001* Ausente 23 35,4 24 72,7 Dispareunia Presente 32 49,2 12 36,4 0,226 Ausente 33 50,8 21 63,6 Dor acíclica Presente 39 60,0 13 39,4 0,053 Ausente 26 40,0 20 60,6 Infertilidade Presente 22 33,8 8 24,2 0,330 Ausente 43 66,2 25 75,8 Alteração Intestinal Cíclica Presente 32 49,2 2 6,1 <0,001* Ausente 33 50,8 31 93,9 Alteração Urinária Cíclica Presente 2 3,1 0 0,0 0,309 Ausente 63 96,9 33 100,0 *p<0,05 Entre as pacientes com endometri ose que referiam dispareunia de profundidade (n=32), 65,5% apr esentavam a forma infilt rativa profunda da doenç a e, dentre aquelas que não apr esentavam este si ntoma (n=33), 30,3% eram portadoras de endometriose profunda (Anexos 2 e 4). Ao se analisar o quadro clínico das pacientes com endometriose e a gravidade dos casos, observamos haver r elação dir eta entre a severidade de ambos, ou seja, quanto mais intenso o sintom a, mais grave a doença (Gráfico 2). Esta gravidade foi calculada pela ocorrênc ia da endometriose em seus diferentes locais de acometimento e do est adiamento da ASRM (1996), ou s eja, considerou- Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Resultados ______________________________________________________________________ 28 se mais grave a manifestação da endometriose profunda e do estádio avançado e, menos grave, a doença peritoneal e o estádio inicial. Gráfico 2 : Análise d a gravidade do quadro clínico r eferido pelas paciente s com endometriose em relação à gravidade da doença confirmada em procedimento cirúrgico. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Quadro Clínico Gravidade da endometriose A Tabela 2 compara as concentrações das citocinas encontradas nos dois grupos. Observou-se diferença signific ante nas concentrações do IFN-gama (presente na resposta Th1) e da IL-10 (presente na resposta Th2) medidos no fluido perit oneal das pacientes com end ometriose em relação àquelas sem endometriose, sendo que as pacientes co m endometriose apresentaram valores mais elevados desses dois marcadores. Ao se verificar em quais casos estas alterações ocorreram, foi possível obs ervar que 9 de 13 pacientes que apresentaram IFN-gama elevado, eram portadoras de endometriose profunda (Anexos 4 e 5). No c aso da IL-10, esta particularidade não foi observada. Além disso, deve ser citado que em oito pacientes do Grupo A e quatro do Grupo B, não havia fluido peritoneal suficiente a ser coletado. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Resultados ______________________________________________________________________ 29 Tabela 2: Mediana das concentrações séricas e do fluido p eritoneal das citocinas (pg/ml) das pacientes com (Grupo A) e sem endometriose (Grupo B). Citocinas Grupo A Grupo B p TNF-alfa (sangue) 2,3 3,7 0,188 IFN-gama (sangue) 1,6 2,1 0,571 IL-2 (sangue) 7,4 8,3 0,447 IL-4 (sangue) 1,9 2,0 0,731 IL-10 (sangue) 3,2 3,1 0,904 TNF-alfa (fluido peritoneal) 3,1 1,4 0,364 IFN-gama (fluido peritoneal) 0,5* 0,1 0,039* IL-2 (fluido peritoneal) 0,2 0,2 0,072 IL-4 (fluido peritoneal) 1,7 0,9 0,557 IL-10 (fluido peritoneal) 28,6* 15,7 0,035* *p<0,05 As Tabelas 3 e 4 indicam a relação entre os padrões de respostas Th1 e Th2 a partir das concentrações das citocinas séric as e do fluido peritoneal, utilizando-se a categorização d os result ados e o teste de MacNemar. Nestas análises são comparados quais resultados estão mais elevados e são descritos os níveis de signific ância (valores de p) de cada relação das citocinas, quais sejam, IL4/TNF-alfa, IL-4/IFN-gama, IL-4/IL-2, IL-10/TNF-alfa, IL-10/IFN-gama e IL-10/IL- 2. Desta forma, notamos diferenças signifi cantes nas relações IL-4/IFN-gama, IL- 4/IL-2, IL-10/IFN-gama e IL-10/IL-2 das dosagens do fluido peritoneal do gr upo de pacientes com endometriose, com predomín io de IL-4 e IL-10 (resposta Th2) sobre IFN-gama e IL-2 (resposta Th1). Não houv e diferenç a estatisticament e significativa da relação Th1/Th2 envolvendo as citocinas séricas. De m odo semelhante, não se observou diferença na análise desta relação comparando-se os diferentes parâmetros avaliados, quais sejam, estadiamento da ASRM, lo cal de acometimento e diferenciação histológica da endometriose, independente do local de coleta das amostras. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Resultados ______________________________________________________________________ 30 Tabela 3: Descrição dos níveis de significância da relação entre as concentrações séricas das citocinas envolvidas na resposta Th1 (TNF-alfa, IFN-gama e IL-2) e na resposta Th2 (IL-4 e IL-1 0) nas pa cientes dos grupos com e sem en dometriose (Grupos A e B, respectivamente). Grupo A Grupo A Grupo B Grupo B n=65 IL-4 n=65 IL-10 n=33 IL-4 n=33 IL-10 TNF-alfa 0,41 0,58 0,82 0,89 IFN-gama 0,50 0,68 0,34 0,36 IL-2 0,39 0,59 0,85 0,85 Tabela 4 : Descrição dos níveis de significân cia da relação entre a s concentra ções do fluido peritoneal das cit ocinas envolvidas na re sposta Th1 (TNF-alfa, IFN-gama e IL-2) e na resposta Th2 (IL-4 e IL-10) nas pacientes dos grupos com e sem endome triose (Grupos A e B, respectivamente). Grupo A Grupo A Grupo B Grupo B n=57 IL-4 n=57 IL-10 n=29 IL-4 n=29 IL-10 TNF-alfa 0,89 0,32 0,68 0,50 IFN-gama <0,001* <0,001* 0,09 0,09 IL-2 0,006* <0,001* 0,19 0,10 *p<0,05 A Tabela 5 descreve e compara os valores das medianas das concentrações séricas das cit ocinas entre as pacientes dos grupos com endometriose (A) e sem a doenç a (B) de ac ordo com a fase do c iclo menstrual e com o sintoma referido pelas pacientes. Foi encontrada elevação do TNF-alfa nas pacientes do Grupo A com dis pareunia de profundidade quando compar adas ao Grupo B. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Resultados ______________________________________________________________________ 31 Tabela 5: Comparaçã o das medi anas das concentraçõe s séricas d as citocina s (pg/ml) entre os grupos de pacientes com (Grupo A) e sem endometriose (Grupo B) de ac ordo com fase do ciclo menstrual e com o quadro clínico. Característica TNF-alfa IFN-gama IL-2 IL-4 IL-10 Fase Folicular do ciclo menstrual Grupo A (n=56) 2,3 1,7 7,8 1,9 3,3 Grupo B (n=25) 3,5 1,8 9,2 2,5 3,0 Fase Lútea do ciclo menstrual Grupo A (n=9) 3,7 1,4 5,6 1,7 2,4 Grupo B (n=8) 4,1 2,3 7,5 2,0 3,7 Dismenorréia - Presente Grupo A (n=42) 2,6 1,7 7,2 2,0 3,3 Grupo B (n=9) 4,4 2,4 9,3 3,0 4,9 Dispareunia - Presente Grupo A (n=32) 4,5* 1,6 7,6 1,8 3,0 Grupo B (n=12) 2,3 2,3 8,0 2,9 3,6 Dor acíclica – Presente Grupo A (n=39) 2,0 0,0 6,1 1,7 3,2 Grupo B (n=13) 3,5 2,1 9,7 2,6 3,0 Infertilidade – Presente Grupo A (n=22) 2,2 1,7 5,9 1,7 2,5 Grupo B (n=8) 4,2 1,3 2,7 2,0 3,1 Alteração Intestinal Cíclica – Presente Grupo A (n=32) 2,3 1,4 6,1 1,5 3,6 Grupo B (n=2) 6,2 2,8 8,1 2,2 2,6 Alteração Urinária Cíclica – Presente Grupo A (n=2) 2,3 0,8 4,6 1,4 2,8 Grupo B (n=0) - - - - - * p<0,05 A comparação das m edianas das concent rações das citocinas dosadas no fluido peritoneal de acordo com a fase do ci clo menstrual e com o quadro clínico entre as mulheres avaliadas encontra -se na Tabela 6. As pacientes com endometriose que ap resentaram infertilidad e mostraram concentrações de IL-2 mais eleva das que o s controles. Entre o total de pa cientes co m infertilidade e endometriose (n=22), nota-se que 63,6% (n=14) apresentav am endometriose profunda (Anexos 2 e 4). Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Resultados ______________________________________________________________________ 32 Tabela 6: Comparação das medianas das con centrações das citocinas dosadas no fluido peritoneal (pg/ml) entre os grupos de pacientes com (Grupo A) e sem endo metriose (Grupo B) de acordo com fase do ciclo menstrual e com o quadro clínico. Característica TNF- alfa IFN- gama IL-2 IL-4 IL-10 Fase Folicular do ciclo menstrual Grupo A (n=56) 2,3 1,7 7,8 1,9 3,3 Grupo B (n=25) 0,7 0,0 0,0 0,8 19,0 Fase Lútea do ciclo menstrual nte res te rese Grupo A (n=9) 3,7 1,4 5,6 1,7 2,4 Grupo B (n=8) 2,1 0,0 0,0 0,0 30,0 Dismenorréia - Prese Grupo A (n=42) 2,6 1,7 7,2 2,0 3,3 Grupo B (n=9) 4,4 0,0 1,0 8,1 24,4 Dispareunia - Presente Grupo A (n=32) 2,3 1,6 7,6 1,8 3,0 Grupo B (n=12) 4,0 0,0 0,0 1,8 10,8 Dor acíclica – Presente Grupo A (n=39) 2,0 0,0 6,1 1,7 3,2 Grupo B (n=13) 1,6 0,0 0,0 0,9 30,7 Infertilidade – Presente Grupo A (n=22) 2,2 1,7 5,9* 1,7 2,5 Grupo B (n=8) 0,0 0,0 0,2 1,5 30,1 Alteração Intestinal Cíclica – P en Grupo A (n=32) 2,3 1,4 6,1 1,5 3,6 Grupo B (n=2) 3,1 0,0 0,0 0,0 30,7 Alteração Urinária Cíclica – P nte Grupo A (n=2) 2,3 0,8 4,6 1,4 2,8 Grupo B (n=0) - - - - - * p<0,05 A comparação das medianas das concentrações séricas das citocinas entre características das pacientes dos Grupos A e B, mostra não haver diferença quanto ao estadiamento (ASRM, 1996), lo cal de aco metimento e diferenc iação histológica da endometriose (Tabela 7). Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Resultados ______________________________________________________________________ 33 Tabela 7: Comparaçã o das medi anas das concentraçõe s séricas d as citocina s (pg/ml) entre os grupos de pacientes com (Grupo A) e sem endometriose (Grupo B) de ac ordo com estadiamento (ASRM, 1996), local de acom etimento e classifica ção histológ ica da endometriose. Característica TNF-alfa IFN-gama IL-2 IL-4 IL-10 Estadiamento Grupo A – Inicial (n=28) 3,8 2,0 8,1 2,1 2,8 Grupo A – Avançada (n=37) 2,3 1,5 6,1 1,7 3,7 Grupo B (n=33) 3,7 2,1 6,1 2,0 3,1 Local de acometimento Grupo A – Com doença peritoneal (n=12)∆ 2,3 1,8 3,4 2,1 3,3 Grupo A – Sem doença peritoneal (n=36) 2,4 1,5 8,8 1,7 3,2 Grupo B (n=33) 3,7 2,1 6,1 2,0 3,1 Grupo A – Com doença ovariana (n=19)∆∆ 2,7 1,6 8,9 1,9 3,4 Grupo A – Sem doença ovariana (n=24) 2,3 2,0 0,0 1,9 2,5 Grupo B (n=33) 3,7 2,1 6,1 2,0 3,1 Grupo A – Com doença profunda (n=34)∆∆∆ 2,0 1,6 8,3 1,7 3,4 Grupo A - Sem doença profunda (n=31) 3,8 1,9 7,8 2,1 3,0 Grupo B (n=33) 3,7 2,1 6,1 2,0 3,1 Tipo histológico Grupo A – Com doença indiferenciada (n=39) 2,4 1,5 6,1 1,7 3,3 Grupo A – Sem doença indiferenciada (n=26) 2,2 2,0 7,8 2,2 3,2 Grupo B (n=33) 3,7 2,1 6,1 2,0 3,1 ∆ - focos peritoneais exclusivos, sem a presença de doença profunda e em ovários ∆∆ - ausência da doença profunda, independente de focos peritoneais ∆∆∆ - independente da presença de endometriose peritoneal ou ovariana A Tabela 8 avalia as concentrações das citocinas dosadas no fluido peritoneal nos grupos estudados , em relação ao estadi amento (ASRM, 1996), local de comprometimento e clas sificação histológica da doença. Notamos ser a concentração de IL-10 mais elevada nos casos de endometriose de ovár io, na ausência de doença profunda, independente da presença de focos peritoneais. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Resultados ______________________________________________________________________ 34 Tabela 8: Comparação das medianas das con centrações das citocinas dosadas no fluido peritoneal (pg/ml) entre os grupos de pacientes com (Grupo A) e sem endo metriose (Grupo B) de acordo com estadiamento (ASRM, 1996 ), local de acometimento e diferenciação histológica da endometriose. Característica TNF-alfa IFN-gama IL-2 IL-4 IL-10 Estadiamento Grupo A – Inicial (n=28) 3,3 0,0 0,0 1,2 18,7 Grupo A – Avançada (n=37) 2,9 0,0 0,0 2,1 46,1 Grupo B (n=33) 1,4 0,0 0,0 0,0 25,7 Local de acometimento Grupo A – Com doença peritoneal (n=12)∆ 2,8 0,0 0,8 2,0 27,1 Grupo A – Sem doença peritoneal (n=36) 3,4 0,0 0,0 1,6 30,9 Grupo B (n=33) 1,4 0,0 0,0 0,0 25,7 Grupo A – Com doença ovariana (n=19)∆∆ 2,4 0,0 0,0 1,7 50,0* Grupo A – Sem doença ovariana (n=24) 3,8 0,0 0,0 2,0 18,7 Grupo B (n=33) 1,4 0,0 0,0 0,0 25,7 Grupo A – Com doença profunda (n=34)∆∆∆ 3,2 0,0 0,0 2,0 30,9 Grupo A - Sem doença profunda (n=31) 2,4 0,0 0,0 0,6 25,5 Grupo B (n=33) 1,4 0,0 0,0 0,0 25,7 Tipo histológico Grupo A – Com doença indiferenciada (n=39) 2,3 0,0 0,0 1,8 35,7 Grupo A – Sem doença indiferenciada (n=26) 3,4 0,0 0,0 1,6 28,0 Grupo B (n=33) 1,4 0,0 0,0 0,0 25,7 * p<0,05 ∆ - focos peritoneais exclusivos, sem a presença de doença profunda e em ovários ∆∆ - ausência da doença profunda, independente de focos peritoneais ∆∆∆ - independente da presença de endometriose peritoneal ou ovariana Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose 5. DISCUSSÃO Discussão ______________________________________________________________________ 36 As pesquisas dentro da área médica se des envolvem c om grande velocidade em diferentes setores do con hecimento, atingindo co m facilidade uma vasta gama de pessoas que atuam na sear a científica, graças aos meios de comunicação disponíveis at ualmente. No tocante à endometriose, observa-se, com freqüência, discussões de grupos de espec ialistas acerca de quase todos os tópicos da doença. Como e porque a endom etriose se desenv olve? Qual o perfil epidemiológico da mulher com endometriose? Qual o melhor tratamento? É possível exemplificar esta visão ao se analisar recente public ação, onde médicos de diferentes serviços europe us se reuniram para desenv olver recomendações para o diagnóstico e tratamento da endomet riose. Algumas conclusões surgiram de meta-anális e de estudos randomizado s e controlados, como a sugestão do uso igualmente eficaz de qualqu er droga hormonal para o tratamento da dor em mulher es com diagnóstico confirmado de endometriose. No entanto, a falta de pesquis as com des enho adequado, trou xe apenas dados informativos como a afirmação que a ablaç ão cirúrgica dos focos de doença tem pouca efic ácia no tratament o da dor em pacientes co m endometriose mínima e que não há evidência suficiente para de terminar se a exc isão de e ndometriose moderada e severa melhora as taxas de gestação (Kennedy et al., 2005). Tais assertivas podem ser confront adas com artigos publicados relativos a cada ass unto mencionado. De forma se melhante, as questõ es abordadas no presente estudo foram propostas no sentido de trazer novas informações que pudessem garantir substrato no campo da imunologia, tópi co atual e promissor, que se r elaciona c om a etiopatogenia, o diagnóstico e o tratamento da endometriose. Os grupos e a dinâmica do estudo Nos 23 meses de c oleta de dados, foram incluídas 98 mulheres , todas com indicação clínica de vídeo-laparoscopi a. Diagnosticamos endometriose em 65 destas pacientes (Grupo A) e confirmou-se sua ausência em 33 pacientes ( Grupo Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 37 B). Esta é, em nossa óptica, a solução que ampara a realização de pesquis a que tem a proposta de c omparar um determi nado fator entre mulheres com e sem endometriose, pois, a visualização da pelve descarta o viés da dúvida da presença ou não da doença. A escolha de grupo c ontrole de paci entes com sintomas, mas sem a mol éstia permite comparar o quadro clínico referido pelas mulheres de ambos os grupos. Além disso, a semelhança dos períodos relativos à fase do ciclo menstrual em que as pacientes se encontravam no momento da coleta do sangue e do fluido peritoneal e da faixa etária de ambos os grupos, assegura outros parâmetros que poderiam invalidar a amostra estudada. Na análise do quadro clínico, nota-se haver diferença significante no grupo de mulher es com endometriose que apr esentaram maior percentual de dismenorréia severa ou incapacitante e alteração intestinal cíclica quand o comparadas às sem a doenç a. Este dado acha-se de acordo com perfis clínicos da doença, como já foi descrito em 1995, e revisado em 2000, em nosso serviço (Abrão et al., 1995, Abrão & Podgaec, 2000), onde ao redor de 90% das pacientes com endometriose referiram dismenorréia durante o interrogatório clínico e 40%, alterações intestinais cíclicas, cifras semelhantes às análises epidemiológicas feitas em outros países (Hemmings et al., 2004; Perry, 2005). A outra questão relativa ao quadro cl ínico originou-se da comparação entre a intens idade dos sintomas referidos pelas pacientes e a gravidade da doenç a diagnosticada nos procediment os cirúrgic os. Desvelou-se relação direta neste quesito, ou seja, quanto maior a intensida de dos sintomas, mais grave a moléstia. Como exemplo, 65,5% das pacientes com endometriose que p ossuíam dispareunia de profundidade apresentavam a forma infiltrativa profunda da doença e dentre aquelas que não referiram este sintoma, somente 30.3% eram portadoras de endometriose profunda. A propósito, F aucconier e Chapron (2003) obt iveram dados similares, revelando que, em caso s de endometriose profunda, os sintomas têm certa especificidade com o local de acometimento da lesão. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 38 Método laboratorial O método laboratorial util izado neste estudo foi a c itometria de fluxo. O termo citometria se refere à me dida (metria) das células (cito). Esta pode ser das propriedades físicas (tamanho, volume ) ou bioquímicas das células (conteúd o protéico, lipídico) e, tradici onalmente, tem sido realiz ada por microscopia ótica ou fluorescente, processo lento e operado r-dependente. O termo citometria de flu xo se refere ao mesmo procedimento de m edida das p ropriedades celulares, porém realizada conforme a passagem do fluxo celular por um grupo de detectores. O processo ocorre a partir da introdução de amostra celular no centro de uma corrente de fluido para mant er um foco hidrodinâmic o. No ponto de medida, a corrente celular é “cortada” por um raio de luz a laser que informa a um detector, através da medida de luz obtida, o tamanho da partícula em questão. Esta medida é feita em milhares de células, independente da hete rogeneidade da amostra (Chen et al., 1999). Com esta técnica, as medidas das concentrações das citocinas estudadas (IFN-gama, TNF-alfa, IL-2, IL-4 e IL-10) foram processadas a par tir de uma únic a amostra de cinco microlitros de sangue e outra de cinco mic rolitros de fluid o peritoneal em uma única passagem, pr ocedimento de extrema vantagem em relação aos kits tradicionais de dosagem de citocinas que utilizam o método ELISA (ensaio de imunoabsorção lig ado à enzima), onde ca da citocina deve ser dosada separadamente (Cook et al., 2001). N ão há na literatura descrição de estud o semelhante a este, analisando, com este método, este grupo de citocinas em pacientes com endometriose. Estudo que apresent a certa analogia com o nosso foi conduz ido pelo CDC (Center for Diseas es Control ) norte-americano em área endêmic a para leishmaniose visceral em Bangladesh, analisando com método de múltiplo ensaio, diversas citocinas relacionadas às res postas Th1 e Th2 em 110 indivíduos da região. Os autores observ aram que os pacientes que apresentaram elevação das citocinas envolv idas na resposta Th1, tornando- a compet ente, tenderam a desenvolver quadros limitados da doença. No entanto, a resposta Th2 Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 39 predominante se ass ociou a quadros clínicos mais graves, incluindo os c asos de calazar (Kurkjian et al., 2006). Comparação entre as dosagens das citocinas nos grupos de estudo A concepção do estudo parte do princí pio que alterações do sistema imune estão env olvidas com a endometriose. Desta forma, ao serem realiz adas as dosagens séricas e no fluido per itoneal da IL-2, IL-4, IL-10, TNF-alfa e IFN- gama, estes resultados foram comparados entre as pac ientes com e s em endometriose. As primeir as diferenças estatisticam ente signific ativas foram observadas nas pacientes com endometriose que possuíam concentrações mais elevadas de IFN- gama e IL-10 no fluido peritoneal em relação àquelas sem endometriose. A literatura é farta e conflitante ao analisar a ação de cada citocina na endometriose. Um dos estudos inic iais que avaliou es te tema trouxe resultados semelhantes aos nossos, sobretudo os refe rentes a IL-10. Punnonen et al. ( 1996) analisaram as concentrações de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10 no fluido peritoneal de 15 pac ientes com endometriose e de 12 mulheres submet idas à laqueadura tubária para observar o tipo de res posta imune enc ontrada na endometriose. Concluíram que as concentrações de IL-6 e IL-10 estavam elevadas nas pacientes com a doença. Da m esma forma, Tabibz adeh et al. (2003) observaram elevaçã o de IL-10 no fluido peritoneal de pacientes com endometriose. De modo diverso, ao se avaliar a atuação da IL-6 e IL-10, verificou-se que a secreção destas citocinas por célula s de sangue periférico em pacient es submetidas à fertilização in vitro estava mais elevada nas férteis do grupo controle do que nas com endometriose. Além diss o, a secreção de IL-10 também achava- se mais alta nas pacientes férteis do que nas com infertilidade sem causa aparente. Esses resultados trouxeram evidências de que a resp osta Th2 facilitaria a implantação trofoblástica no início da gestação (Ginsburg et al., 2005). Ho et al., em 1997, realizaram pesquis a para verificar alterações nas subpopulações linfocitárias em pacie ntes com endometriose. Os autores coletaram fluido perit oneal de pacientes submetidas à laparos copia, efet uaram Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 40 fenotipagem das células e anal isaram as concentrações de IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-gama. As taxas de IL -10 e IL12 est avam significativamente mais elevadas nas pacientes com estádios iniciais de endometriose, enquanto os níveis de IL-4 não se alteraram. A IL-4 também não apresentou diferenças em suas concentrações no fluido per itoneal de 24 pacientes co m endometriose e de 2 8 mulheres sem a doença, em relação à fase do ciclo m enstrual e ao estadiamento da endometriose (Gazvani et al., 2001). No que concerne ao IFN-gama, resu ltado diferente do obtido em nosso estudo foi observado por Khorra m et al. (1993) que realiz aram cirurgia pélvica em 36 mulheres, sendo 12 controles e 24 c om endom etriose. Observaram que as concentrações de IFN-gama no fluido perit oneal não se alteraram nas pacientes com endometriose. Dois estudos descreveram a importância desta citocina na patogênese da endometriose. Nishida et al. (2005) public aram pesquisa relevante, por sua metodologia e conclusões obtidas, cujo objetivo foi avaliar os efeitos do IFN-gama na inibição do cres cimento celular e da apoptos e em cultura de c élulas endometriais. Os autores notaram haver inibição da proliferação celular e da síntese de DNA das células estromais do endométrio tópico de pac ientes com endometriose e de células endometriais es tromais normais, induzindo a apoptose nestas células. Com estes resultados, pr opuseram que as c élulas endometriais ectópicas apresentaram maior resistênc ia à apoptose induzida por IFN-gama, o que aumentaria a chance destas células s obreviverem e se im plantarem fora do útero. O segundo estudo foi realizado por Wu et al. (2004), os quais analisaram o endométrio tópico e ectópico de oito mul heres com endometriose. Concluíram que o estímulo peritoneal de IFN-gama está significativamente associado c om a expressão de moléculas de adesão celular (ICAM-1) na endometriose. Tal fato permitiria que células do refluxo endom etrial menstrual se espalhassem e invadissem outros sítios. Na questão do diagnóstico laboratori al aplicando o uso de c itocinas na endometriose, Bedaiwy et al. (2002) rea lizaram dosagens séri cas e do fluido Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 41 peritoneal de IL-1beta, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13 e TNF-alfa em 130 mulheres submetidas a vídeo-laparoscopia por infe rtilidade, dor pélvic a, laqueadura tubária ou reversão de laqueadura tubária. Dest e grupo, 56 pacientes apresent avam endometriose. Os autores concluíram que níveis acima de 15 pg/ml de T NF-alfa no fluido peritoneal proporcionaram 100% de sensibilidade e 89% d e especificidade e, quando a concentração sérica da IL-6 situava-se acim a de 2 pg/ml, a sensibilidade foi de 90% e a espec ificidade de 67% para as pacientes com endometriose em comparação ao grupo cont role. Em nosso est udo, a dosagem de TNF-alfa não mostrou tal diferença estatística. Diversos autores conferem ao T NF-alfa ação significativa na endometriose. Bergqvist et al. (2001) analisar am a pr esença de IL-1beta, IL-6 e TNF-alfa no endométrio tópico de pacientes com e sem endometriose e no fo co de endometriose. Concluíram estar a produç ão dessas três citocinas elev ada no endométrio tópico das pacientes com a d oença, ass im como no próprio tecido endometriótico quando comparados às mul heres sem endometriose. De igua l modo, Braun et al. (2002) realizaram cultura de cé lulas provenientes de endométrio tópico e ectópico com fluido peritoneal e TNF-alfa. Observaram que as células en dometriais de mulhe res com endometriose utiliz am fatores do fluid o peritoneal, como o TNF-alfa, para facilit ar a prolif eração do tecido ec tópico, enquanto as mesmas células de mulheres sem a doença não realizam esta atividade. Avaliação da relação entre citocinas e da resposta Th1 Th2 Como interpretação in icial, a aná lise dos dados obtidos em nosso estudo não permite a extrapolação dos resultados quanto à atividade Th1 e Th2, pois, houve elevação de uma citocina de cada tipo de res posta: IFN-gama da resposta Th1 e IL-10 da resposta Th2. No entanto, a interpretação destes dados depende da relação entre as citocinas, ou seja, se observamos a elevação da concentração de uma citocina em detrimento da redução de outra citocina, o que refletiria indiretamente o balanço das respostas Th1 e Th2. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 42 Em nosso estudo, os resultados re velaram que as concentrações de IL-4 (citocina da resposta Th2) mostravam-se mais elevadas no fluido peritoneal das pacientes com endometriose relativament e ao IFN- gama e a IL-2 (citocinas da resposta Th1), assim como a IL-1 0 (Th2) que apresentava o mesmo comportamento. Nas mulheres s em endomet riose, este comportamento não foi observado. Desta for ma, é pos sível inferir o predomínio do padrão de resposta Th2 sobre a Th1 nas pacientes com endometriose. Conforme mencionado e citado com um a série de referências, diversos estudos analis aram pontualmente uma citocina is olada ou um painel destas substâncias, obtendo resultados que demons travam elevação ou diminuiç ão de determinada citocina. Neste estudo em particular, também foram obtidos resultados deste tipo, com a elev ação do IFN-gama e da IL-10 no fluido peritoneal das pac ientes com endometriose. Mas a informação mais significativa remete à relação entre as citocinas trazendo a balança da resposta imune para o braço Th2. Resultado obtido por Hsu et al. (1997) pode ser citado por apresentar con clusão comparável, apesar de a metodologia ser diferente, ao observarem elevação da expressão dos níveis de RNA mensageir o (mRNA) da IL-4 nas células Th2 do sangue periférico e do fluido peritoneal de pacientes com endometriose. Antsiferova et al. (2005) aplicar am os dois métodos, citometria de fluxo e análise da expressão de IL-2, IL-4 e IL-10 através de seu RNA mensageiro (mRNA) por reação de polimerase em cadeia por transcriptase reversa (PCR-RT), para analisar a síntese de citocinas e a ativação linfocitária no sangue perif érico e no tecido endometrial (tópico e ectópico) de 15 pacientes com endometriose e de 20 mulher es sem a doença. Os resultados deste estudo revelaram que a expressão do mRNA e a síntese intracelular de IL-4 e IL-10 estavam elevadas nos linfócitos periféricos e a concentração de li nfócitos B achava-se alta nos focos d e endometriose. Os autores apresentam conclusão s emelhante à do pr esente estudo, afirmando que “o desenvolvim ento da endometriose se acompa nha d a ativação de resposta imune do tipo Th2 em níveis local e sistêmico”. A observação da m aior presença de auto-anticorpos em mulheres com endometriose também é coerente com este resultado. Em estudo conjunto de Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 43 nosso ser viço com o Departamento de Reumatologia do HCFMUSP, foram analisadas quarenta e cinco pacientes com endometriose, sem lupus erite matoso sistêmico (LES) e quinze, com LES, porém sem endomet riose. Anticorpos anti- nucleares foram detectados em 18% das pacientes com endometriose e em 93% das mulheres com LES (Pasoto et al., 2005). Avaliação das citocinas e da resp osta Th1 Th2: comparação c om os diferentes parâmetros da endometriose Neste estudo, elaborou-se uma pr oposição baseada em dados de literatura que suger em que as citocinas relacionadas às respostas Th1 e Th2 estão envolvidas com a gênese da endometriose. Na elab oração des ta hipótese , para depurar as informações que seriam obt idas, as s eguintes perguntas foram lançadas: • em pacientes com endometriose, alguma citocina se altera e, consequentemente, algum tipo de resposta linfocitária predomina, de acordo com a fase do ciclo mens trual em que esta paciente se encontra quando comparada com pacientes sem a doença? • há alguma modificaç ão de acor do com o quadro clínico que a paciente apresenta ou com o estádio (ASRM, 1996), local de ac ometimento ou diferenciação histológica da endometriose? Os resultados demonstraram não haver di ferença estatística relativa à fase do ciclo menstrual em que as citocinas f oram dosadas, assim como quanto à diferenciação histológica da endomet riose. No entanto, observaram-se diferenças significantes nas seguintes situações: • quadro clí nico: elev ação de TNF- alfa sérico nas pacientes com endometriose com dispareunia de profund idade e elevação da IL-2 no fluido peritoneal nas pacientes com endometri ose que apresentav am infertilidad e quando comparadas às sem endometriose; • local de acometimento: elevaç ão da IL-10 nas pac ientes com endometriose ovariana e sem endometri ose profunda, independ ente de lesões Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 44 peritoneais, em relação às sem endometrios e no ov ário e àquelas pacientes sem endometriose. Fase do ciclo menstrual Há extensa controvérsia em estabelecer se há variação na concentração de citocinas de acordo com a fase do c iclo menstrual, ou seja, se a produção e secreção destas substâncias sofrem inte rferência de algum ti po de hormônio. No presente estudo, não se detectou diferença nas dosagens das citocinas quando se verificou a presença de endomet riose, pois, comparando-se as c oncentrações de cada citoc ina na fase folicular e na fase lútea, na presença e na ausência da doença, não houve variação estatística. Alguns estudos se contrapõem a es te dado, justificando a influência da progesterona na atuação das c itocinas. Tabibzadeh et al. (1989) relataram que os níveis de I L-6 expressos por células endome triais são baixos na fase proliferativa do ciclo enquanto as concentrações de estrogênio permanecem elevadas; os níveis de IL-6 são maiores dur ante a fa se secretora do ciclo quando a atividad e estrogênica é baixa. Estas flutuações reflet em haver relação inversa entre esta citocina e a ação estrogênic a. Harada et al. (1997) observaram variações cí clicas nas concentrações de IL-6 no fluido peritoneal de pacientes com endometriose, as quais são significativamente mais elevadas na fase lútea do que na folicular . Arici et al. (2003) registraram ser os ní veis de IL-18 no fluido peritoneal significantemente mais elevados na fase lútea do que na folic ular de pacientes com endometriose, não apresentando difer enças entre as mulheres c om dor pélvica ou infertilidade. Um fato que poderia ser consi derado de forma análoga na endometriose, consiste na observação de von Wolff et al. (2000) , os quais mostraram que algumas citocinas como a IL-1 beta e a IL-6 apresentam elevação progressiva em suas expr essões no endométrio durante a fase lútea em ciclos n aturais. Considerando-se a ação da progesterona, este hormônio contribui para a supressão natural da imunidade celular que ocorre na gravidez, permitindo o desenvolvimento do feto, o que caracter iza um efeito de predominânc ia Th2. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 45 Estudo com ratos que se tornaram artr íticos por inoculaç ão experimental do agente da doença de Lyme ( Borrelia burgdorferi), demonstrou o efeito regulador da progesterona na resposta Th2. Quando as ratas se to rnavam prenhas a artrite melhorava e os níveis de IL-4 (T h2) se elevavam. De modo sem elhante, em ratas sob efeito apenas da progesterona, os resu ltados obtidos eram os mesmos (Moro et al., 2001). Um dos principa is tratamentos clínicos da endomet riose consiste no uso de progesterona, em diferentes vias de administração, com bons resultados (Crosignani et al., 2005, Petta et al., 2005), talvez por este mesmo motivo. Por outro lado, em estudo onde fo i coletado fluido peritoneal de 30 mulheres com endometriose e de 20 mulheres sem a doença, para análise de IL-6 e dos esteróides ov arianos, verificou-se elevação significativa de IL-6 e de estradiol nas pacientes com estádios inic iais de endometriose (Khan et al., 2002). Citando outros estudos relativos a este tema, em pacientes com endometriose, não foram observadas diferenças quanto à fa se do ciclo menstrual em que foram realizadas as dosagens de IL-4, IL-6, IL-12 e IL-18 ( Mahnke et al., 2000, Gazvani et al., 2001, Zhang et al., 2004). Quadro clínico da endometriose Os dois pilares clínic os da endometriose são a dor p élvica e a infertilidade. Cerca de 50% das pacientes com dor pélvica, incluindo-se dismenorréia, dispareunia de prof undidade e dor pélvica acíclic a, submetidas a vídeo- laparoscopia, têm o diagnóstico de endometriose confirmado (Lamvu et al., 2005). O binômio dor pélv ica e endometriose tem sido alvo de pe squisas de alta complexidade, envolv endo a neurociênc ia, que tent a atualmente atrelar o processo de sensibilização central à causa da dor em pacientes com essa doença. Nesta teoria, a lesão ectópica, mesm o de pequena proporção, provocaria um estímulo no circuito neural que permanec eria ativado mesmo após a ressecção cirúrgica do foco de endometriose, o que explicaria a permanência e a recidiva de dor (Berkley et al., 2005). Outro dado re levante pode ser ana lisado por estudo realizado em grupo de 100 pacientes com endometriose, sendo 50 com dor pélvica e 50 sem dor, que revelou que 86% das mulheres com dor pélvica cr ônica Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 46 e 38% das sem esta queixa preencheram os critérios para o diagnóst ico de depressão (Lorençatto et al., 2006). Nos casos de maior extensão da doença, com aderências e significativa distorção anatômica, a explicação para a sintomatologia referida pelas pacientes tem sido creditada ao processo inflamatór io que se instala na pelve, com aumento de produção de prostaglandinas e enzimas lisossomais, induzindo à formação de fibrose (Thomson & Redwine, 2005). As alterações observadas no presente estudo são concordantes com estes dados, pois, em pacientes com dispareunia de profundidade houve elev ação das concentrações de T NF-alfa, citocina participante da resposta Th1, a qual, conforme discutido anterior mente, corresponde ao processo de ação das célu las NK, linfócitos T citotóxicos, secreção de VEGF e enz imas matriz me taloproteinases. Em particular, a dispareunia de profundidade pode indicar a presença de lesões de endometriose profunda, o que, da mesma forma, seria c oerente com os resultados obtid o pela elevação da IL-2 nos casos deste tipo de doença, como será discutido a seguir. No quesit o infertilid ade, as pacientes d o Grupo A que referiram este sintoma (22 casos) apresentaram concentra ções de IL-2 no fluido peritoneal mais elevadas em comparação com as do Grupo B (8 casos). Ao se analis ar em quais pacientes esta elevação ocorreu, nota-se que em 63,6% das mulheres (14 c asos), a endomet riose profunda foi detectada. Agrupando-se estas in formações, os casos de endometriose profunda são os mais complexos e que, em geral, geram mais evidências que comprometem a fe rtilidade dev ido aos proc essos fibróticos que podem atingir as tubas uterinas, órgãos essenciais no processo de fertilização espontânea (Chapron et al., 200 4, Darai et al., 2005). Esses dad os são coerentes com a predominância de uma citocina que faz parte do padrão de resposta imune Th1. Vale ressaltar que, além destas raz ões descritas na etiolo gia da infertilidad e associada à endometriose, outros mecanismos envolvidos nesta questão têm sido extensamente discutidos em diferentes linhas de pesquisa, inc luindo a própria imunologia, fatores genéticos e hormonais (R ossi et al., 2005; Sk rzypczak et al., 2005, Wunder et al., 2005). Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 47 Estadiamento, locais de acometime nto e classificação histológica da endometriose O estadiamento da endometriose, pr oposto em 1985 e revisado em 1996 pela American Society for Reproductive Medicine, procura classificar a doença de acordo com a extensão de ac ometimento da pelve, considerando a presença de lesões e de processos aderenciais periton eais e ovar ianos. Apesar de aceito até os dias at uais, pois permite a compr eensão da grav idade desc rita nas diversas publicações sobre endometriose, há lac unas importantes nesta classificação como, por exemplo, a falta de informaç ão acerca de formas graves da doenç a urinária e intestinal (Averbach et al., 2005, Abrão et al., 2006). Desta forma, a observação proposta por Nisolle & Donnez , em 1997, dividindo a doença em três entidades distintas, incluindo principalment e a endom etriose infiltrativa profunda neste quesito, amplia didaticamente o modo de se discutir a extens ão e a gravidade da endometriose. Além disso, a análise histológica da endometriose (Abrão et al., 2003) traz a possibilidade de obs ervarem-se as caracter ísticas das lesões, comparativamente ao endom étrio tópico, e alcançar dados prognósticos. A somatória destes três parâmetros permite inserir cada caso em seu real as pecto clínico, s endo importante salientar a ausência de est udos que depuraram a análise de pac ientes com endometriose no formato em questão. Em relação ao estadiamento e à classi ficação histológica da endometriose, nosso estudo não observou diferenças sign ificativas quanto às concentrações de citocinas e ao tipo de res posta Th1 e Th2. Keenan et al. (1994) coletaram fluid o peritoneal de 62 mulheres durante cirurgia laparosc ópica por doenças ginecológicas benignas e is olaram ma crófagos perit oneais par a submetê-los a cultura por 24 horas. Concluí ram que a secreção de IL-6 por macrófagos peritoneais estava elevada nas pacientes com endometriose e se relacionou com o estádio da doença. O IFN-gama não apresent ou alterações significativas. Esses dados são concordantes com os obtidos em nosso estudo. Quanto ao TNF-alfa, resultado difer ente do observado em nossa análise foi registrado por Pizzo et al. (2002) em est udo com número restrito de casos. Foram Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 48 comparados dois gr upos de pacientes, co m (26 casos) e sem (5 casos) endometriose, havendo elev ação de T NF-alfa e TGF-beta no sangue e no fluid o peritoneal de pacientes com endometriose quando comparadas ao grupo controle. O TNF-alfa apresent ou decrés cimo nos estádios mais avançados da doença. Outro estudo observ ou concentrações elev adas de TNF-alfa e IL-6 no fluido peritoneal de pac ientes com endometriose, sem haver relação com o estádio da doença, mas sim com a presença de les ões vermelhas glandulares (Iwabe et al., 2002). Por fim, Richter et al. (2005.) analisando a dos agem do TNF-alfa no fluido peritoneal de 100 pacientes , das quais 35 com pelv e normal e 65 com endometriose, obtiveram resultados significativos: as concentrações médias desta citocina no grupo controle foram de 6,2 pg/ml, no grupo com endometriose estádios I/II, 56,33 pg/ml e no grupo co m endometriose estádios III/IV , 200,15 pg/ml. Um estudo envolvendo a IL-10 em casos de doença avançada demonstrou elevação desta citocina no fluido peritoneal de pacientes com este tipo específico de endometriose (Tabibzadeh et al., 2003) De modo diverso, na presente anális e, a IL-10 se apresentou mais elevada no fluido peritoneal de pacientes com endometriose no ovário, porém sem doenç a profunda, independe nte da presença de lesões peritoneais. Os dados estatísticos não demonstraram haver diferenças significativas nas concentrações das citocinas nos caso s de endometriose profunda. No entanto, conforme as informações descr itas, parece haver tendência para se cogitar a hipótese da participação ma is efetiva do padrão de resposta T h1 nestes casos, pois: • na primeira análise das citocinas isoladamente, o IFN-gama mostrou- se elevado no fluido peritoneal e, ao se verificar quais casos estavam alterados, foi possível observar que 9 de 13 pacient es (69,2%) que apresentaram IFN-gama elevado, eram portadoras de endometriose profunda; • foi encontrada elevaç ão do TNF -alfa nas pacientes do Grupo A com dispareunia de profundidade quando comparadas ao Grupo B, sendo que entre as Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 49 pacientes com endometriose que referiam dispareunia de pr ofundidade (n=32), 65,5% tinham a forma infiltrativa profunda da doença; • as pacientes com endometriose que referiam quadro de infertilidade possuíam concentrações de IL-2 mais elevadas d o que as pacientes sem endometriose; entre o total de pacientes com infertilidade e en dometriose (n=22), 63.6% (n=14) revelaram endometriose profunda. O único estudo dis ponível na literatu ra relativo a es te tema não obteve resultados passíveis de discussão, pois analisou o perfil de citocinas (IL-6, TGFbeta, IFN-gama, TNF-alfa e IL-10) em apenas 13 pacientes (D'Hooghe et al., 2001). Perspectivas Entender a etiopatogenia de uma doença signific a abrir um leque de alternativas clínicas que podem atingir o principal objetivo da Medicina: a cura de um paciente. A endometriose é uma doen ça de perfil ímpar e o objetivo de seu tratamento depende da m anifestação da dor e/ou da infertilidad e. O presente estudo pressupõe e sugere co nclusões que uma linha de pes quisa fértil nest e tópico passa pelas terapêuticas imuno-moduladoras (D'Hooghe et al., 2003 ; Olive et al., 2004; Fedele et al., 2004). O tratamento clínico clássico par a a endometriose se baseia na supressão hormonal ovariana, no sentido de cria r um ambiente hipoes trogênico que produza atrofia dos focos da doença de forma semelhante ao induz ido no endométrio tópico (Petta et al., 2005). No ent anto, o uso prolongado de determinadas dr ogas, como os análogos do GnRH, pode traz er efeitos indesejados ; a sus pensão d o tratamento, em geral, conduz a recorrênc ia dos sintomas e as pacientes com desejo reprodutivo não se beneficiam pela própria ação inibidora da ovulação da maioria destes medicamentos (Kennedy et al., 2005). Ao se estabelecer a v ia preferencial de resposta Th1/Th2 na endometriose, as drogas imuno-moduladoras poderiam dire cionar este processo. Um exemplo deste mecanismo envolve a tuberculose, infecção c ausada pela Mycobacterium Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 50 tuberculosis, grave problema de saúde mundial co m estimativa de 7.5 milhões de casos por ano, sendo 95% nos países em desenvolvimento. Na falta de produção de IFN-gama (resposta Th1), a doença te m curso rápido e fatal, não haven do dúvida que a respost a imune ef etiva contra o bacilo requer atuação da via Th1. Em 2002, estudo env olvendo países africanos e euro peus analisou as dos agens das citocinas envolvidas nestas respostas; os dad os obtidos revelaram que os marcadores da resposta Th2 diminuíram em 30% após 2 a 3 meses de tratamento e quase 70% após o final do tratamento em relação aos pacientes c ontroles sadios. Es te resultado demonstrou que a cura da tuberculos e se associa à mudança da resposta imune par a uma at ividade maior da respos ta Th1 e m enor da resposta Th2 (Lienhardt et al., 2002). Neste sentido, embora o TNF- alfa tenha participaç ão fundamental n o sistema imune, quando pres ente em exce sso pode trazer conseqüências indesejadas como, por exemplo, em pacient es com artrite reumatóide. Com este raciocínio, drogas antagonistas do T NF-alfa, como etanercept, inflixim abe e adalimumab, foram desenvolv idas, havendo atualmente mais de meio milh ão de pessoas utilizando este tipo de tratamento (Khanna et al., 2004). Os estudos da aplicabilidade destas substâncias têm se multiplic ado para outras situações clínicas severas como doença de Chron e espond ilite anquilos ante, havendo a sugestão para se inic iar estudos em casos graves de endometriose (Bullimore, 2003). O TNF-alf a estimula as enzima s matriz metaloproteinases (MMPs), presentes no foco de endométrio ectópico, favorecendo o implante dos mesmos (Sillem et al., 1998). As drogas que inib em a ação desta citocina poderiam bloquear a ligação c om essas enzimas, o que impediria a adesão do tecido endometrial à superfícies ectópic as, havendo desta forma a racionalidade para o uso deste tratamento em pacientes com endometrio se (Nothnick & D’Ho oghe, 2003). Um estudo experimental foi realizado em 12 macacas com endometriose peritoneal espontânea, aplicando-se etarnecept em 8 animais e água em 4, por via subcutânea, durante 8 semanas. Os autores observaram diminuição s ignificativa Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Discussão ______________________________________________________________________ 51 na superfície peritoneal do ente do grupo de macacas tratadas com a medicação (Barrier et al., 2004). Deste modo, a continuação dest a pesquisa, seja aumentando o número de pacientes avaliadas, assim como em conjunto com outras análises que podem ser conduzidas com o mesmo material colet ado que avaliem outros dados relativos à resposta imune de pacientes com en dometriose, pode tr azer infor mações relevantes ao entendimento de questões básicas desta doença que irão proporcionar a busca de alternativas consistentes na prática clínica. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose 7. ANEXOS Anexos ______________________________________________________________________ 55 Anexo 1: Termo de Consentimento pós-informação. HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO TERMO DE CONSENTIMENTO PÓS -INFORMAÇÃO (Obrigatório Para Pesquisas Científicas em Seres Humanos - Resolução Nº 01 de 13.6.1988 - CNS) I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME DO PACIENTE: ____________________________________________________________________________________ DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº: _________________________SEXO: M  F X DATA NASCIMENTO:___/___/___ ENDEREÇO: _________________________________________________________________Nº_____APTO_____ BAIRRO: __________________________________________________CIDADE: _______________________________________ CEP: _____________ TELEFONE: (___) _________________________ 2. RESPONSÁVEL LEGAL: ___________________________________________________________________________________ NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.): _________________________________ DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº: _________________________SEXO: M  F X DATA NASCIMENTO:___/___/___ ENDEREÇO: _________________________________________________________________Nº_____APTO_____ BAIRRO: __________________________________________________CIDADE: _______________________________________ CEP: _____________ TELEFONE: (___) _________________________ II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: Avaliação de marcadores biológicos no sangue e fluido peritoneal de pacientes portadoras de endometriose. 2. PESQUISADOR: Sérgio Podgaec CARGO/FUNÇÃO: Médico Pós-Graduando INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº: 72644 UNIDADE DO HCFMUSP: Departamento de Ginecologia 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: SEM RISCO  RISCO MÍNIMO  (probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano RISCO MÉDIO X RISCO MAIOR  como consequência imediata ou tardia do estudo) 4. APROVAÇÃO DO PROTOCOLO DE PESQUISA PELA COMISSÃO DE ÉTICA PARA ANÁLISE DE PROJETOS DE PESQUISA: 601/03 5. DURAÇÃO DA PESQUISA: .2 anos III - EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU REPRESENTANTE LEGAL 1. Justificativa e objetivos da pesquisa: para o tratamento da sua doença, a senhora terá que ser submetida a uma cirurgia. O objetivo deste estudo é avaliar se a coleta de sangue de seu braço e d e líquido que existe em seu abdome no início da ci rurgia pode ajudar no diagn óstico e tratamento da sua doença que se chama endometriose. 2. Procedimentos que serão utilizados e propósitos, in cluindo a identificação dos procedi mentos que são experimentais: conforme co mentado acima, a senhora será submetida a ciru rgia e tam bém a coleta de sangue do braço e de líquido do abdômen durante esta cirurgia. 3. Desconfortos e riscos esperados: dur ante a cirurgia podem ocorrer co mplicações, já que a senhora estará anestesiada, mas, conforme comentado, sua doença exige esta ciru rgia. Todo o procedimento da pesquisa será realizado enquanto a senhora estiver anestesiada. Os desconfortos podem ocorre depois, como: dor no loc al da cirurgia, fraqueza, vômito (pela anestesia), infecção no corte e hematoma (mancha roxa na pele). ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 56 4. Benefícios que p oderão ser obti dos: com esta pes quisa da qual a senhor a está participando, tentam os descobrir se co m os exames de sangue e do líquido de seu abdome poderíamos evitar a cirurgia nos casos de endometriose. 5. Procedimentos alternativos que possam ser vantajosos para o indivíduo: não há. 6. Esclareci mento sobre a garantia de receber r esposta a qualquer pergunta ou escl arecimento, a qualquer dúvida acerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a pesquisa e o tratamento do indivíduo: X Sim  Não 7. Esclarecimento sobre a liberdade de retirar seu con sentimento a qualquer momento e deixar de participar no estudo, sem que isto traga prejuízo à continuação do seu cuidado e tratamento: X Sim  Não 8. Com promisso sobre a segurança d e que não se iden tificará o indiví duo e que se manterá o caráter confidencial da informação relacionada com a sua privacidade: X Sim  Não 9. Compromisso de proporcionar informação atualizada obtida durante o estudo, ainda que esta possa afetar a vontade do indivíduo em continuar participando: X Sim  Não 10. Disponibilidade de assistência no HCFMUSP: X Sim  Não 11. OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES: ___________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ IV - CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO Declaro que, após ter sido convenientemente esclarecido pelo pesquisador, conforme registro nos itens 1 a 11, do inciso III, consinto em participar, na qualidade de paciente, do Projeto de Pesquisa referido no inciso II São Paulo, ____de ____________de 20___. ___________________________________________ ________________________________________ assinatura do paciente ou responsável legal assinatura do pesquisador que obteve o c onsentimento (carimbo ou nome Legível) NOTA: Este termo deverá ser elaborado em duas vias, ficando uma via em poder do paciente ou seu representante legal e outra deverá ser juntada ao prontuário pelo paciente. ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 57 Anexo 2: Idade, dia do ciclo menstrual (relativo às coletas de sangue e fluido peritoneal) e quadro clínico das pacientes do Grupo A (com endometriose). Iniciais Idade Dia do ciclo Dismenorréia Dispareunia Dor acíclica Infertilidade Alteração intestinal Alteração urinária CFO 37 5 sim não sim não não Não SMM 32 3 sim não sim não sim Não FMO 18 4 sim não sim não não Não COM 34 2 não não não sim não Não MSQM 26 9 sim sim não não não Não AR 23 3 não sim não não não Não MLOSC 40 13 sim sim sim não sim Não CAC 27 10 não sim sim sim sim Não SVFB 39 7 não não sim sim sim Não RCA 30 5 sim não não não não Não DRD 33 27 sim sim sim sim sim Não ST 30 1 não não sim não não Não LPM 28 5 sim não não não sim Não FCSSD 25 3 sim sim não não sim Não SAW 29 16 sim não sim não não Não MIRCB 30 1 não sim sim não não Não JCP 25 13 sim sim não não não Não FAG 30 14 não sim não não não Não IMS 26 2 não não sim não não Não CRB 39 9 sim sim sim não sim Não VMF 36 8 não não não sim não Não APMJ 31 5 sim sim não não não Não FF 31 4 não sim não não não Não PRLG 38 8 não não não sim não Não RCSS 39 2 não não sim sim não Não VCPS 28 5 sim não não sim não Não VIS 23 4 não não sim não não Não DFSR 26 4 sim não sim não sim Não TIL 35 7 não não não não não Não BDM 29 11 sim não não não sim Sim VPSC 24 7 sim não sim não não Não RS 29 6 sim sim sim não não Não TCB 22 3 sim sim sim não não Não MASS 34 24 sim não sim não não Não AECSF 37 2 sim sim sim não sim Não RGP 31 3 sim não não não não Não CEM 33 10 sim sim sim não sim Não HMBV 40 11 não sim sim não sim Não MCCS 38 2 não não sim não não Não JJ 20 24 sim não não não não Não MNNS 35 3 sim sim não sim sim Não CG 40 3 sim sim não sim sim Não ITPS 40 8 sim não sim não não Não HOC 37 26 sim não não não sim Não ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 58 Iniciais Idade Dia do ciclo Dismenorréia Dispareunia Dor acíclica Infertilidade Alteração intestinal Alteração urinária ASF 27 7 sim sim sim sim sim Não ASS 36 2 sim não não não sim Não CN 35 19 sim sim sim sim sim Não LMJ 37 17 não sim não sim não Não JZP 40 17 sim não não sim sim Não STK 34 3 não sim não sim não Não LGRC 30 9 sim sim sim sim sim Não CK 33 6 não sim não não sim Não SF 33 1 sim sim sim não sim Não MHTS 39 9 sim sim sim sim sim Não JGD 36 3 sim não sim não sim Não AAS 31 6 não não sim não sim Não ECAH 36 2 sim sim sim sim não Não EAS 32 8 sim não sim não sim Não NJM 37 3 sim sim sim sim sim Não CR 31 6 não não não sim não Não MSV 33 22 não não sim não não Não TG 29 9 sim sim sim não sim Não MAT 35 1 não sim sim sim sim Sim KNML 29 4 sim não sim sim sim Não SVEG 37 3 sim sim sim não sim Não ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 59 Anexo 3: Idade, dia do ciclo menstrual (relativo às coletas de sangue e fluido peritoneal) e quadro clínico das pacientes do Grupo B (sem endometriose). Iniciais Idade Dia do ciclo Dismenorréia Dispareunia Dor acíclica Infertilidade Alteração intestinal Alteração urinária MELS 33 9 não não não não sim não não EBMM 27 4 sim não não sim não não não LMMC 28 12 sim não não não não não não AAP 33 10 sim não não não não não não SCMB 30 4 não sim sim não não não não ETS 29 8 sim não não não sim não não PSS 24 19 sim não não sim sim sim não MPMF 37 7 sim não sim sim não não não LFM 38 26 sim não não sim não não não MHBC 40 9 sim não não não não ]não não FGBM 36 4 sim não sim sim não não não LAS 36 5 não não não sim não sim não NQM 34 2 não não não sim não não não SRRBS 36 26 sim não não não não não não VHS 28 5 sim não não não não não não RGC 38 5 sim não não não não não não MLC 28 3 sim não não não não não não RSA 37 1 sim não não sim não não não LRSC 40 9 não sim sim sim não não não JMX 36 21 sim não não não sim não não ACVB 32 10 sim não não não não não não PLS 27 10 sim não sim não não não não MSM 40 2 não sim sim sim não não não CARS 37 27 sim não não não sim não não AMSS 32 15 não sim sim não não não não MSS 39 28 não sim sim não não não não DPS 21 17 não sim sim não sim não não MA 26 6 não sim não não não não não TRCS 34 5 sim não não sim não não não YT 38 3 não sim sim sim não não não JAS 29 3 sim não sim não não não não MAS 34 8 não sim sim sim sim não não EGMA 27 5 sim não não não sim não não ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 60 Anexo 4 : Pacientes do Grupo A (com endometrios e) divididas pelo estadiamento da endometriose segundo a American Soc iety for Reproductive Medicine (1986), loc al de acometimento da doença (peritônio, ovário e doe nça pr ofunda) e tipo hi stológico da endometriose observado nas biópsias obtidas durante o procedimento cirúrgico. Iniciais Estádio Peritônio Ovário Profunda Tipo histológico CFO 1 sim não não E SMM 1 sim não não E + M FMO 1 não sim não E + BD COM 1 sim não não BD MSQM 1 sim não não E + BD AR 1 sim não não E + BD MLOSC 1 sim não não E + M CAC 1 sim não não E+M SVFB 1 sim não não E+M RCA 2 não sim não E + I DRD 2 sim sim não E + M ST 2 não sim não E + BD LPM 2 sim sim não E + M FCSSD 2 não sim não E + BD SAW 2 não sim não E MIRCB 2 sim não sim E + I JCP 2 não sim não E + BD FAG 2 sim não não E IMS 2 não sim não E + BD CRB 2 não sim não E VMF 2 sim não não E + BD APMJ 2 sim não não E + BD FF 2 sim sim não E + BD PRLG 2 não sim não E + BD RCSS 2 não sim não E+M VCPS 2 sim não não E+BD VIS 2 não sim não E+M DFSR 2 sim não sim E+BD TIL 3 não sim sim E + BD BDM 3 não sim não E + M VPSC 3 não sim não E + BD RS 3 não não sim E+M TCB 3 não sim não E+M MASS 3 sim sim não E+M AECSF 3 sim sim sim E+BD RGP 4 sim sim sim E + M CEM 4 não sim sim E + BD HMBV 4 não sim sim E + I MCCS 4 não sim sim E + M JJ 4 sim sim sim E + I MNNS 4 não não sim E + M ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 61 Iniciais Estádio Peritônio Ovário Profunda Tipo histológico CG 4 não sim sim E + M ITPS 4 não sim sim E + BD HOC 4 não não sim E + BD ASF 4 não sim sim E + M ASS 4 sim sim não E + M CN 4 não sim sim E + M LMJ 4 sim sim sim E + M JZP 4 sim sim sim E + M STK 4 não sim sim E +M LGRC 4 sim sim sim E + M CK 4 não não sim E + M SF 4 sim sim sim E + M MHTS 4 não não sim E + M JGD 4 não não sim E + M AAS 4 não não sim E+M ECAH 4 não sim sim E+M EAS 4 não sim sim E+BD NJM 4 sim sim sim E+M CR 4 não não sim E+M MSV 4 sim sim sim E+BD TG 4 sim não sim E+M MAT 4 não não sim E+M KNML 4 não sim sim E+M SVEG 4 não não sim E+M Legenda: E – padrão estromal, BD – padrão bem diferenciado, M – padrão misto, I – padrão indiferenciado (classificação descrita na seção Pacientes e Métodos) ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 62 Anexo 5 : Concentrações em pg/ml das citocinas analisadas no sangue e no fluido peritoneal das pacientes do Grupo A (com endometriose). Iniciais TNF-alfa INF-gama IL-2 IL-4 IL-10 TNF-alfa INF-gama IL-2 IL-4 IL-10 Sangue Sangue Sangue Sangue Sangue FP FP FP FP FP CFO 3.9 6.8 6,3 3.7 4 ind ind ind Ind 10 SMM 7.7 5.2 16,4 3.4 8.9 ind ind ind Ind 7,6 FMO 5.8 6.2 11,6 3.1 3 ind ind ind Ind ind COM ind 2.3 10,2 1.6 2.3 4,8 ind Ind Ind 6,9 MSQM ind 1.9 ind 2.3 2.7 7,4 3,4 3,5 Ind 25,2 AR 3.4 2.1 ind 3.6 2.7 3,3 ind 2,8 241,3 449,2 MLOSC 6.9 4 10,6 4.4 4.2 3,9 ind 2,7 Ind 13 CAC 3,8 ind 2,8 ind 1,9 2,1 ind 1,9 2,3 15,1 SVFB ind ind ind ind 2,5 ausente ausente ausente Ausente ausente RCA 6.4 6.1 8,9 2.8 3 ind ind Ind 1,2 16,8 DRD 4.9 6.3 12,1 3.4 2.8 ausente ausente ausente Ausente ausente ST 11.5 10.3 25,5 5.4 6.1 ind ind ind Ind 97,1 LPM 6.6 1.6 10,5 2 3.3 ind ind ind Ind 53,5 FCSSD 5.5 1.4 19,4 4.1 4 ind ind ind Ind 101.8 SAW 3.7 ind 10,5 ind 3.2 10,1 3,3 3,1 1,6 62,7 MIRCB ind ind 10,2 1.9 2 3,8 ind 4,3 1,4 6,9 JCP 5.1 2.3 27 1.8 3.1 11,3 2,7 5,6 2,4 14,3 FAG 4 2 8,3 2.4 1.8 4,9 ind ind Ind 18,7 IMS 5.6 ind 7,8 1.9 3.2 8,9 ind 6,1 2,4 277,3 CRB 2.3 1.3 7,4 1.3 2.4 7,2 ind 5,4 2,8 15,9 VMF 1.3 3.7 ind 1.6 4 4,8 5,6 3,7 2,1 15,9 APMJ 1.3 3.7 ind 2.1 2 ind ind ind 22,9 111,3 FF ind ind 7,8 ind 5.7 2,4 ind 2,8 5,4 772,5 PRLG ind 1.5 10,4 3.1 2.5 ind ind ind Ind 25,7 RCSS 1,7 ind ind ind 1,9 ausente ausente ausente Ausente ausente VCPS 6.4 2.4 ind 2.4 2.5 1,6 ind 2,9 587,9 202,4 VIS ind ind ind ind ind 4,2 ind ind Ind 15,5 DFSR ind ind ind ind 1,4 3,8 2,3 ind 5,6 28 TIL 1.5 1.6 8,3 2.4 6.6 6,3 ind ind 2,3 26 BDM 3.1 1.5 9,1 2.8 3.7 8,7 2,3 4,6 16,7 114,4 VPSC 4.1 3.3 33 2.3 3.9 3,4 ind ind 6,1 219,5 RS 2,4 ind ind ind 1,8 2,2 ind ind Ind 115,5 TCB 1,8 ind ind ind 2,4 1,8 ind ind 13 46,7 MASS 1,4 ind ind ind 1,8 ind ind ind Ind 1,9 AECSF 1,9 ind 3,4 ind 3,5 ausente ausente ausente Ausente ausente RGP 6.2 6.6 17 3.9 3.5 ind ind ind 2,3 174,9 CEM ind 2.8 19,4 ind 3.3 3,4 1,7 ind 1,5 28,6 HMBV 7.5 5.5 18,7 4.3 4.5 ind 1,7 ind 1,7 5,6 MCCS 6.7 6 17,5 2.6 4.3 ind ind ind Ind 10,3 JJ 9.6 6.5 25,5 2.8 4.1 ind ind ind Ind 449,4 MNNS 2.7 1.4 8,7 1.3 1.4 ausente ausente ausente Ausente ausente CG 3.7 2.8 16,5 ind 8.9 ind ind ind Ind >5000 ITPS 5.6 11.7 34 6.3 6.2 ind ind ind Ind 55,9 ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 63 HOC ind 1.4 ind ind 1.5 30,3 ind 50,6 38,1 5,9 Iniciais TNF-alfa INF-gama IL-2 IL-4 IL-10 TNF-alfa INF-gama IL-2 IL-4 IL-10 Sangue Sangue Sangue Sangue Sangue FP FP FP FP FP ASF 2.3 ind 7 1.7 2.2 2,3 ind Ind 9,8 181,6 ASS 5.2 ind ind ind 4.5 2,4 ind 2,7 Ind 115,5 CN 2 ind 5,6 1.7 ind 7,5 1,7 4,2 33,9 53,4 LMJ 5,7 1,8 2,3 3,6 2,4 3,2 ind 1,5 2,3 25,7 JZP 4 1.8 6,1 2.4 3.8 6,3 3,8 7,1 3 56,3 STK ind 1.5 11,6 ind 3.3 4,8 ind 5,1 1,4 45,8 LGRC ind ind 2,9 ind 3.8 7,5 2,5 5,2 2,2 272,3 CK 4.8 3.8 12,8 2.6 4.8 8,8 3,4 2,4 2,3 30,9 SF ind 1.7 6 1.9 4.3 1,8 ind Ind 1,9 26,2 MHTS 4.8 3 9,5 3.8 6.4 7,2 2 Ind Ind 23 JGD ind ind ind ind ind ausente ausente ausente Ausente ausente AAS 3.2 2.1 ind 1.2 3.6 ind ind Ind Ind 11,3 ECAH 1.7 1.8 20,3 1.7 12.9 ausente ausente ausente Ausente ausente EAS ind ind 6,1 2.3 5.7 4,5 ind Ind Ind 160,8 NJM 2.3 3 8,8 2.5 3.8 3,2 ind 2,9 2,1 46,3 CR 2.3 3 ind 6.3 4.1 ausente ausente ausente Ausente ausente MSV 2 ind ind ind ind 3,1 ind ind Ind 21,6 TG 1,5 ind ind 29,8 4,9 ind ind ind 27,6 40,4 MAT 1,4 ind ind ind 1,8 266,3 211,3 226 121,1 200,6 KNML 1,7 ind ind ind 1,9 ind ind Ind 2192 ind SVEG ind ind ind ind 2,4 2,6 ind Ind 2 4,4 Legenda: FP – fluido peritoneal , ind – indeterminado, aus ente – ausência de fluido peritoneal na pelve da paciente ______________________________________________________________________ Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose Anexos ______________________________________________________________________ 64 Anexo 6 : Concentrações em pg/ml das citocinas analisadas no sangue e no fluido peritoneal das pacientes do Grupo B (sem endometriose) ______________________________________________________________________ IL-10 Iniciais TNF-alfa INF-gama IL-2 IL-4 IL-10 TNF-alfa INF-gama IL-2 IL-4 Sangue Sangue Sangue Sangue Sangue FP FP FP FP FP MELS 9.6 6 9,2 2.8 3.3 ind ind ind ind 46,1 EBMM 8.3 6.5 17,7 2.6 3 ind ind ind ind 7,7 LMMC 6.8 5.6 11,4 3.8 3.1 ind ind ind ind 37,9 AAP 7.6 6.3 12,1 3.1 4.2 ind ind ind 1,6 10 SCMB 6.3 7 14,9 2.9 3.3 ind ind ind 241,8 52,1 ETS 8.4 6.6 14,6 2.5 5.1 ind ind ind ind 3,7 PSS 8.8 5.6 10,9 3.1 3.3 ind ind ind ind 31,3 MPMF 10.4 6.3 6,1 3.4 3.9 1,8 ind ind ind 6,6 LFM 6.4 2.4 11,9 2 4 ind ind ind 1,8 77 MHBC 1.9 ind 4,3 ind 3.9 ausente ausente ausente ausente ausente FGBM ind ind ind ind ind 4,9 ind ind ind 9,8 LAS 3.5 ind 5,2 1.3 1.8 6,2 ind ind ind 30 NQM ind 1.8 9,7 ind 1.7 1568 ind 35,4 298,3 5,9 SRRBS 3.7 ind 8,3 ind 7.5 6,2 ind ind ind 30 VHS 4.9 1.7 6,5 1.6 3.7 7,5 3,4 6,2 2,8 5,2 RGC ind 3.7 11,1 2.4 2 ausente ausente ausente ausente ausente MLC ind ind 7,5 ind 2 ind ind ind 1,8 12,2 RSA ind 1.6 2,5 2.7 2.7 ind 2 ind ind 42,8 LRSC 2.9 ind 9,6 3 6 4,8 ind 3,2 215 65,8 JMX ind ind 2,5 1.5 2.5 ausente ausente ausente ausente ausente ACVB ind ind 3,4 1.6 2.8 1,9 ind ind ind 9,2 PLS 5.1 1.7 9,3 2.9 3 12,1 ind ind ind 58,2 MSM 5.6 3 12,3 3.8 6.5 ausente ausente ausente ausente ausente CARS ind ind ind ind 1.2 ind ind ind 41,7 30,1 AMSS 3.2 2.1 9,3 2 1.5 2,1 ind ind ind 10,8 MSS 4.6 2.4 6,6 2 4.9 20,7 ind 2,2 ind 5,8 DPS 4.4 2.5 2,9 4.1 6.9 4 ind 2,4 14,9 23 MA 2.7 2.3 8 4.1 3.7 5,1 ind 2 ind 25,7 TRCS 3.2 2.1 11,9 ind 3 1,4 ind ind 66,3 51,4 YT 4.8 2.4 26 3.2 5.2 ind ind ind 773,1 >5000 JAS 2,5 ind ind ind 1,9 ind ind ind 1,8 3,2 MAS 1,8 ind ind ind 2,4 7,4 ind ind 8,4 92,7 EGMA 3,9 ind ind ind 2,9 ind ind ind 1,5 27,9 Legenda: FP – fluido peritoneal , ind – indeterminado, aus ente – ausência de fluido peritoneal na pelve da paciente Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose 6. CONCLUSÕES Conclusões ______________________________________________________________________ 53 1. Pacientes com endometriose apresentaram: a) predomínio do padrão de resposta Th2 sobre o Th1 quando comparadas às pacientes sem a doença; b) concentrações mais elevadas de interferon-gama e interleucina-10 no fluido peritoneal em relação às pacientes sem endometriose; c) concentrações mais elevadas do fator de necrose tumoral-alfa sérico quando havia dispareunia de profundid ade em r elação às pacientes sem endometriose que também referiam este sintoma; d) concent rações mais elevadas da in terleucina-2 no fluido peritoneal quando h avia infertilida de em relação às pacientes sem e ndometriose qu e também referiam este sintoma;, e) concentrações mais elevadas da interleucina-10 na presença de doença ovariana e na ausênc ia da forma infiltrati va profunda, independente da ocorrência de focos peritoneais, quando com paradas às pacientes com endometriose, porém sem doença ovariana e aquelas sem endometriose. 2. Pacientes com endometriose não apr esentaram diferenças significant es nas concentrações de citocinas quanto ao estadiamento e à classificação histológica da doença. Padrões de resposta imune em pacientes com endometriose 8. REFERÊNCIAS Referências Bibliográficas ______________________________________________________________________ 66 01. Abbas AK, Murphy KM, Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature. 1996;383:787-93. 02. Abrao MS , Dias Jr JA , Podgaec S , Carvalho FM , Averbach M . Bowel endometriosis and sc histosomiasis: a rare but possible assoc iation. Fertil Steril. 2006;85:1060. e1-2. 03. Abrão MS, Podgaec S, Izzo CR, Melo PV, Porto RC, Ramos LO, Pinotti JA. Perfil epidemiológico e clínico da endometriose: análise de 180 casos. Rev Bras Ginecol Obstet. 1995;17: 779-84. 04. Abrao MS, Podgaec S, Filho BM, Ramo s LO, Pinotti JA, de Oliveira RM. The use of biochemic al markers in t he diagnosis of pelvic endometriosis. Hum Reprod. 1997;12:2523-7. 05. 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