Influência da endometriose sobre a resposta ovariana em ciclos de reprodução assistida: provável associação com prejuízo do desenvolvimento folicular, mas não do pool de reserva

CARVALHO, B.R. Endometriosis influence on ovarian response in assisted reproduction cycles: probable association with damage to follicular development, but not to follicular reserve. 2008. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

Ovarian reserve evaluation in assisted reproduction (AR) aims to identify women in whom follicular exhaustion determines reproductive difficulties. More than age, the presence of other subfertility factors, such as endometriosis (EDT), implies potential negative interference on ovarian response. Objective: To evaluate follicular ovarian reserve in subfertile patients with endometriosis and dete rmine the best predictor of poor response in AR. Methods: We evaluated 87 AR cycles of women presenting with less than 40 years of age, regular menses, no endocrine diseases and with both ovaries, divided in 30 EDT cycles (cases) and 57 cycles in women with subfertility associated to male factor (controls). Ovarian reserve was determined based on basal levels of anti-müllerian hormone (AMH) and follicle- stimulating hormone (FSH), small antral foll icle count (AFC) and medium ovarian volume (MOV). Receiver Operating Characteristic curves (ROC – AUC) were obtained for evaluation of discriminatory capacity of each test in identifying poor response. Results: EDT patients presented significantly higher basal FSH levels when compared to controls (9,13 ± 5,09 mUI/mL vs. 6,28 ± 2,45 mUI/mL; p < 0,05) and ther e were no differences in AMH, AFC and MOV between groups. The total number of oocy tes retrieved was lower in endometriosis when compared to controls (5,33 ± 3,43 vs. 8,2 8 ± 5,8; p < 0,05) and significantly correlated with AMH in both groups (EDT: r = 0,61; C ontrol: r = 0,58; p<0,0001). Basal FSH presented significant correlation with the number of oocyt es retrieved only among EDT patients (r = - 0,48; p<0,01); in EDT patients, either, basal AM H was the individual marker with the best discriminatory potential for poor responders id entification (AUC = 0,875), followed by basal FSH (AUC = 0,682) and MOV (AUC = 0,665), wh ereas among controls, AMH was the best marker (AUC = 0,8372), followed by MOV (AUC = 0,709) and AFC (AUC = 0,686).

Basal FSH is significantly higher in subf ertile patients with endometriosis and correlates with ovarian respons e in AR among these patients. Basal AMH, by the way, is the individual marker with the best discriminatory potential in determining poor response, which is not dependent on endometriosis presence . AFC and MOV did not presented as good predictors of poor response. The association between endometriosis and subfertility, therefore, may be linked to prejudice to growth/developmen t of the ovarian follicle, but not to damage to the real ovarian follicular reserve.

Endometriosis. Ovarian Reserve. Assisted Reproduction. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Modulação do recrutamento e do desenvolvimento folicular pelo hormônio anti-mülleriano. ......................................................................................... 24 Figura 2. Perfil metodológico do estudo.................................................................... 37 Figura 3. Marcadores basais de reserva ovariana em pacientes subférteis portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo) ........................ 42 Figura 4. Correlações (r) entre os marcad ores de reserva ovariana e o número de folículos com diâmetro médio ≥ 18 mm no dia de administração da hCG, em portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo) ........................ 45 Figura 5. Correlações (r) entre os marca dores de reserva ovariana e o número total de oócitos aspirados, em portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo). ................................................................................................ 46 Figura 6. Curvas Receiver Operator Characteristic (ROC) para Idade, Hormônio Folículo-Estimulante e (FSH) e Ho rmônio Anti-Mülleriano (AMH) como preditores de má resposta, em portador as de endometriose e controles (fator masculino exclusivo).................................................................................................. 48 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Características clínicas e dose de gonadotrofina utilizada para o estímulo ovariano em pacientes subférteis portador as de endometriose e controles (fator masculino exclusivo)....................................................................................................... 40 Tabela 2. Marcadores basais de reserva ova riana em pacientes subférteis portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo)............................................... 41 Tabela 3. Variáveis de resposta ovar iana ao estímulo gonadotrófico exógeno em pacientes subférteis portadoras de e ndometriose e controles (fator masculino exclusivo) ........................................................................................................................ 41 Tabela 4. Correlações entre os marcador es de reserva ovariana e a resposta ao estímulo em ciclos de reprodução assist ida, em portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo) ............................................................................. 44 Tabela 5. Marcadores de reserva ovariana em pacientes subférteis portadoras de endometriose e controles, de acordo com o número total de oócitos aspirados ............. 49 SUMÁRIO RESUMO

LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ . 18 1.1. Contexto ........................................................................................................................ 18 1.2. Avaliação de reserva e resposta ovariana...................................................................... 20 1.2.1. Estradiol e inibina-B basais ........................................................................................ 21 1.2.2. Hormônio folículo-estimulante basal ......................................................................... 22 1.2.3. Testes dinâmicos de estimulação ovariana................................................................. 23 1.2.4. Hormônio anti-mülleriano basal................................................................................. 23 1.2.5. Contagem de folículos antrais .................................................................................... 25 1.2.6. Volume ovariano ........................................................................................................ 26 1.3. Endometriose e subfertilidade ....................................................................................... 27 2. OBJETIVOS .................................................................................................................. . 30 2.1. Objetivo geral ................................................................................................................ 30 2.2. Objetivos específicos..................................................................................................... 30 3. CASUÍSTICA E METODOLOGIA ............................................................................. 32 3.1. Casuística....................................................................................................................... 32 3.2. Estimativa da amostra.................................................................................................... 3 3 3.3. Métodos ......................................................................................................................... 33 3.3.1. Avaliação ovariana basal............................................................................................ 33 3.3.2. Metodologia das dosagens.......................................................................................... 34 3.3.3. Protocolo de indução .................................................................................................. 35 3.3.4. Avaliação da resposta ovariana .................................................................................. 35 3.4. Análises estatísticas ....................................................................................................... 38 4. RESULTADOS .............................................................................................................. . 40 4.1. Reserva ovariana: endometriose versus controles (fator masculino exclusivo)............ 40 4.2. Correlações: marcadores de reserva versus a resposta ao estímulo............................... 42 4.3. Marcadores de reserva ovariana e predição de má resposta ao estímulo ...................... 47 5. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 51 5.1. Reserva e resposta ovariana em mulheres subférteis portadoras de endometriose ....... 51 5.2. Marcadores de reserva ovariana: correlações com a resposta a RA na endometriose .. 54 5.3. Marcadores de reserva ovariana e predição de má resposta ao estímulo ...................... 57 6. CONCLUSÕES............................................................................................................... 63 7. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 65 8. APÊNDICES. .................................................................................................................. 77 APÊNDICE A – Carvalho BR et al. Ovarian Reserve Evaluation: State of the art. J Assist Reprod Gen 2008;25:311-322................................................................................. 77 APÊNDICE B – Termo de consentimento de guarda de material ....................................... 89 APÊNDICE C – Termo de consentimento livre e esclarecido............................................. 91 1. INTRODUÇÃO 18 1. INTRODUÇÃO 1.1. CONTEXTO A dissipação dos movimentos feministas e a crescente inserção da mulher no mercado profissional ao longo da segunda metade do s éculo XX foram fatores determinantes da remodelação de seu papel social e resultaram em nítida tendência de se postergar a maternidade (LERIDON, 1998). Estudos dem onstram a expressiva multiplicação na proporção de nascimentos em mulheres com id ade igual ou superior a 35 anos entre as décadas de 1970 e 1990, especialmente nos país es desenvolvidos, onde se estima que tais eventos possam corresponder a mais de 25% dos nascimentos até o fim da década atual (TE VELDE & PEARSON, 2002). Conquanto seja um reflexo de um processo que vislumbra a equidade sócio-econômica entre os gêneros, a pressão da sociedad e moderna pelo adiamento da maternidade desconsidera inadvertidamente a finitude da função reprodutiva feminina e implica um aumento na prevalência da subfertilidade (TE VELDE & PEARSON, 2002), tornando-se cada vez maior a procura por serviços de reprodução assistida (RA). Como resultado desse aumento, especial atenção tem sido dada à avaliação do potencial reprodutivo frente ao esperado enve lhecimento ovariano. A perda progressiva da população folicular ovariana é demonstrada de sde meados do século XX, estimada como sendo da ordem de 75% entre 30 e 40 anos de idade (BLOCK, 1951; RICHARDSON et al., 1987; GOUGEON, 1996), e acompanhada paralelament e de perdas significativas também na qualidade dos oócitos (TE VELDE & PEARSON, 2002). Entretanto, as alterações ocorrem eminentemente em ambiente gonadal e grande parcela das mulheres nessa faixa etária permanece com ciclos menstruais aparente mente normais (TE VELDE & PEARSON, 2002), 19 constituindo sua identificação um grande desafio à medicina reprodutiva. No contexto, a avaliação da reserva f uncional da gônada feminina surge como tentativa de identificar mulheres em que a exaust ão folicular determine as dificuldades em se obter uma gestação, ainda que espontânea. No cas o específico da assistência em RA, almeja- se melhor aconselhar os casais e nortear pr otocolos de estimulação, amenizando encargos emocionais e financeiros de um processo te rapêutico cujos resultados ainda se encontram aquém do desejado. Além disso, temos que consid erar que à idade associam-se fatores outros de subfertilidade, que exigem ainda mais ri gor na individualização dos esquemas de indução. A presença de entidades nosológicas como a endometriose e a síndrome dos ovários policísticos, por exemplo, impli ca interferências negativas mar cantes sobre a fertilidade e, possivelmente, a resposta ovariana, o que é comumente desconsiderado pela comunidade científica, que analisa uniformemente todos os grupos de pacientes, independentemente dos fatores de subfertilidade presentes. Infelizmente, segundo revisão recente r ealizada (APÊNDICE A), ainda não se conseguiu determinar um marcador ou esquema propedêutico suficientemente acurado para o uso protocolar em serviços de RA (CARVALHO et al., 2008), mas são incontáveis as lacunas restantes, o que instiga a pesquisa e permite que novos dados surjam a cada dia. A proposta de uma avaliação individualizada baseada nas car acterísticas clínicas e nos fatores de infertilidade de cada paciente abre uma possib ilidade de eleger marcadores mais ou menos eficazes para determinada população e talvez permita melhores valores prognósticos dos exames atualmente disponíveis. 20 1.2. AVALIAÇÃO DE RESERVA E RESPOSTA OVARIANA Com grande entusiasmo, marcadores sérico s e ultrassonográficos têm sido testados, com objetivo de avaliar quantitativamente e qu alitativamente a reserva funcional ovariana, buscando a identificação de mulheres com menor chance de obter uma gestação, principalmente as candidatas a ciclos de RA, mesmo depois de repetidas tentativas. A despeito da vasta literatura acerca do tema, o conhecimento até pouco tempo garantia apenas modestas propriedades preditivas quanto aos resultados de RA (BROEKMANS et al., 2006), ficando sua utilização deveras aquém do suficiente à necessidade clínica. Acreditamos que um teste de avaliação da reserva ovariana seria ideal se permitisse inferir a quantidade e a qualidade dos folículos primordiais restantes nos ovários após um ciclo menstrual normal, bem como da capacidade dos folículos recrutados no ciclo vigente de se desenvolverem adequadamente, garantindo processos saudáveis de ovulação, fertilização, embriogênese e implantação. Em outras palavr as, o teste ideal seri a aquele capaz de determinar as chances de gestação no ciclo atual, espontâneo ou induzido, assim como de respaldar a sucessividade dos ci clos ovulatórios e, assim, estim ar o potencial reprodutivo da mulher em longo prazo. São comumente utilizados com tal finalidade marcadores séricos e ultrassonográficos aferidos na fase folicular precoce (basais), além de testes dinâmicos de estimulação ovariana. Entre os marcadores classicamente utilizados estão o estradiol (E2), a inibina-B e o hormônio folículo-estimulante (FSH) basais, e os testes de estimulação com o citrato de clomifeno, o FSH exógeno e os análogos do hormônio liberador de gonadotrofinas (aGnRH). Modernamente, assumem destaque na literatura a dosagem do hormônio anti-Mülleriano basal (AMH) e a ultrassonografia para a realização das medidas ovarianas e da contagem de folículos antrais (CFA). 21 1.2.1. Estradiol e inibina-B basais Estudos avaliando o E2 basal na predição da reserva e da resposta ovariana em RA, mesmo os favoráveis ao uso, não têm sido capazes de demonstrar correlação com o desenvolvimento folicular observado (FRATA RELLI et al., 2000), re produzir diferenças significativas entre pacientes más e boas respondedoras (FIÇICI OGLU et al., 2006) ou predizer a ocorrência de gestação (SCOTT et al., 1989; LICCIARDI et al., 1995; SMOTRICH et al., 1995). Estudos avaliando a inibina-B geraram boa s perspectivas quanto ao seu uso na predição da elevação estrogêni ca, do número de oócitos obtidos e das taxas de cancelamento em ciclos de RA (SEIFER et al., 1997); ainda, correlações si gnificativas ao FSH basal e à CFA têm sido demonstradas (TINKANEN et al., 2001). Outros estudos, entretanto, não foram capazes de reiterar os resultados favoráveis ao uso da inibina-B como marcador da reserva ovariana (HALL et al., 1999; CORSON et al ., 1999; SCHEFFER et al., 2007), faltando na literatura dados que confirmem sua associaç ão com maturação folicular e a qualidade oocitária (FRANCHIMONT et al., 1990; FOWLER et al., 1995). Sendo assim, as controvérsias existentes, a baixa acurácia pred itiva e a falta de padronização de cut offs com sensibilidade e especificidade atrativas sugerem que se evite o uso rotineiro do E2 e da inibina-B basais enquanto determinantes da inclusão de casais em programas de RA (BROEKMANS et al., 2006), devendo-se dispor de suas dosagens apenas em casos individualizados eventuais. 22 1.2.2. Hormônio folículo-estimulante basal O FSH basal, sem dúvida, ainda é o mais es tudado dentre os marcadores da reserva ovariana em todo o mundo (SILBERSTEIN et al., 2006) e inúmeros estudos têm revelado seu potencial como preditor da resposta folicular (FRANCO et al., 2002), do número de oócitos aspirados, das taxas de cancelamento (ASHRAFI et al., 2005) e de gestação (WATT et al., 2000; KLINKERT et al., 2005; VAN DER STEEG et al., 2007) em ciclos de RA. No entanto, relata-se a ocorrência de gestação em aproximadamente metade das mulheres com seus valores sé ricos basais elevados (VAN MONTFRANS et al., 2000). As controvérsias permanecem ao se demonstrarem taxas de gravidez em mulheres com menos de 35 anos e FSH basal elevado superiores às de mu lheres mais velhas e com níveis normais da gonadotrofina (LUNA et al., 2007). Dessa forma, sugere-se que a acurácia do FS H basal na predição de má resposta somente se faça adequada quando considerados limiares excessivamente altos (BROEKMANS et al., 2006), o que, pela ocorrê ncia efêmera, reduz seu valor na prática clínica e impede que seja usado como um critéri o estrito de exclusão de casais candidatos a ciclos de RA; pode-se, contudo, a ssociar a outros marcadores di sponíveis ou utilizá-lo de forma individualizada, como screening inicial a nortear o acons elhamento. Como sugerido previamente, o FSH basal elevado subsidiaria o aconselhamento mais cuidadoso de pacientes com mais de 35 anos, principalmente no que con cerne ao maior número de ciclos cancelados e à menor reposta ovariana ao estímulo (LUNA et al., 2007). 23 1.2.3. Testes dinâmicos de estimulação ovariana Os testes de estímulo com aGnRH ( GAST) e FSH (EFORT) assumem alguma importância na predição da resposta a ciclos de RA (KWEE et al., 2003; KWEE et al., 2006), mas não parecem ser superiores a marcadores estáticos, nem mesmo quando se realizam testes subseqüentes, o que se aplica principalm ente ao GAST (HENDRIKS et al., 2005; BROEKMANS et al., 2006). Para o clássico teste do citrato de cl omifeno, conquanto ainda assuma algum valor prognóstico na avaliação de mulh eres com mais de 35 anos ou com história prévia de má resposta (CORSON et al., 1999), estudos têm demonstrado sens ibilidades mais expressivas para os marcadores basais na predição do desenvolvimento folicul ar (WATT et al., 2000; FRANCO et al., 2002; KWEE et al., 2003; JA IN et al., 2004; HENDRIKS et al., 2005; HAADSMA et al., 2007). Ao se programar o uso de teste dinâmico para predição da resposta em ciclos de RA, há de se considerar o acréscimo aos já elevados custos do tratamento em RA e os efeitos adversos potenciais, em que se pesem os riscos de hiperestimulação ovariana inadvertida, ainda que mínimos, sem relação direta com tent ativa real de se obter uma gestação. Assim, tem-se dado preferência aos marcadores basais de reserva e resposta ovariana, reservando os testes de estímulo para casos específicos. 1.2.4. Hormônio anti-mülleriano basal O AMH é expresso nos folículos ovarianos de sde a 36ª semana de vida intra-uterina (RAJPERT-DE MEYTS et al., 1999) e com maio res concentrações a pa rtir da puberdade (FANCHIN et al., 2003). Seu pa pel biológico na mulher aind a é pouco esclarecido, mas sua 24 expressão é mantida até que a diferenciação em folículo antral seja suficiente para a seleção e a dominância, quando a modulação do crescimento folicular é assumida pelo FSH (WEENEN et al., 2004). Dessa forma, as ev idências levam a crer que o AM H atue como um modulador do recrutamento folicular (DURLINGER et al., 1999; FANCHIN et al., 2003; VISSER et al., 2007) e um determinante da permissividade à ação do FSH (DURLINGER et al., 1999; DURLINGER et al., 2001) e do LH (DI CLEMENTE et al., 1994) nos folículos ovarianos (Figura 1). Figura 1. Modulação do recrutamento e do desenvolvimento folicular pelo hormônio anti- mülleriano (adaptado de Visser & Themmen, 2005). Uma vez considerado indicativo do pool de folículos primordiais recrutáveis presentes na gônada (GOUGEON, 1996; SCHEFFER et al., 1999), o AMH tem sido sugerido na prática clínica como um marcador mais fidedigno da sua reserva folicular e, assim, um melhor preditor da resposta ao estímulo em ciclos de RA (VAN ROOIJ et al., 2002; TE VELDE & 25 PEARSON, 2002; GRUIJTERS et al., 2003; FANCHIN et al., 2003; VISSER & THEMMEN, 2005; MUTTUKRISHNA et al., 2005; SCHEFFER et al., 2007). Ainda, suas concentrações plasmáticas pouco variáveis ao longo do cicl o menstrual (HEHENKAMP et al., 2006; LA MARCA et al., 2006; ELGINDY et al., 2008; TSEP ELIDIS et al., 2007) e mesmo entre os ciclos consecutivos (FANCHIN et al., 2005) c onferem uniformidade na interpretação e maleabilidade quanto ao momento de coleta, o que o torna mais atrativo que os marcadores clássicos como E2, inibina-B e FSH. Por ser um teste relativamente novo, a es cassez de estudos ainda impede que se deduza a real importância do AMH na avaliação da função ovariana. Entretanto, tomando por base os resultados favoráveis e as correlações si gnificativas com a CFA e diferentes variáveis de resposta em ciclos de RA (FIÇIC IOGLU et al., 2006; LA MARCA et al., 2007), acreditamos no futuro promissor desse marcador e já se pode inferir que tenha valor no mínimo semelhante ao atribuído à CFA na pred ição de má resposta ovariana (BROER et al., 2008). 1.2.5. Contagem de folículos antrais É prevalente na literatura que a CFA seja um bom marcador da reserva ovariana e um preditor adequado da resposta em ciclos de RA. A revisão si stemática de Broekmans et al., conquanto não tenha determinado valor da CFA na predição de má resposta ovariana, admitiu sua importância como teste de screening de casais candidatos a ciclos de RA (BROEKMANS et al., 2006). Estudos recentes têm mostrado correlações significativas com as concentrações dos marcadores séricos classicamente utilizad os (HAADSMA et al., 2007) e o AMH (FANCHIN et al., 2003; VISSER & THEMMEN, 2005), assim co mo diferenças significativas entre as 26 mulheres normo e más respondedoras ao estím ulo em RA (ELGINDY et al., 2008), chegando a CFA a ser apontada como o melhor dentre t odos os marcadores disponíveis de reserva e resposta ovariana (BANCSI et al., 2002; SCHEFFER et al., 2003). Especial atenção tem sido dada aos folíc ulos antrais pequenos, tendo-se observado associação significativa entre a resposta normal em RA e a CFA de folículos com diâmetros ≤ 5-6 mm (KLINKERT et al., 2005; HAADSMA et al., 2007), bem como correlações significativas com todos os testes endócrinos de reserva ovariana disponí veis, diferentemente do observado com folículos maiores, condizente s apenas com o volume ovariano e os níveis de inibina-B (HAADSMA et al., 2007). Em síntese, os resultados da literatura parecem confluir para a consagração da CFA como um bom marcador da reserva e preditor da resposta ovariana, além de se destacar pela praticidade de sua execução, até mesmo como pa rte do exame ultrassonográfico rotineiro na avaliação ginecológica de mulheres candidatas a ciclos de RA. 1.2.6. Volume Ovariano Assim como a CFA, tem-se tentado associ ar o volume ovariano (VO) aferido pela ultrassonografia ao patrimônio funcional da gônada e ao sucesso em ciclos de RA. Apesar de estudos terem demonstrado nítida relação direta entre o número de oócitos em ciclos de RA e VO (SYROP et al., 1999), e correlações signif icativas entre diminuição das medidas ovarianas, aumento da idade e níveis elevados de FSH basal (BOWEN et al., 2007), a análise minuciosa dos dados disponíveis não permite encontrar ainda aplicab ilidade clínica na predição de má reposta ou gestação ( BROEKMANS et al., 2006). Dados recentes demonstram não haver diferenças entre as médias de VO de mu lheres normo e má respondedoras em ciclos de RA (ELGINDY et al., 2008). 27 1.3. ENDOMETRIOSE E SUBFERTILIDADE Estima-se que as queixas de subfertilidade estejam presentes em aproximadamente 60% dos casos de endometriose (MOURA et al ., 1999; LITTMAN et al., 2005) e que mais da metade das mulheres subférteis sem causa aparente venham a receber o diagnóstico da doença em exame laparoscópico investigativo (HILL, 1992). Em outras palavras, estima-se que as chances de se diagnosticar endometriose sejam seis a oito vezes maiores em mulheres com dificuldades reprodutivas submetidas a exame laparoscópico (VERKAUF, 1987). A despeito da habitual asso ciação entre endometriose e su bfertilidade, ainda não se conseguiu determinar um mecanismo etiopatogênico único que a explique. Na ausência de distorções anatômicas e da barreira mecânica ao funcionamento normal das tubas uterinas (SCHENKEN et al., 1984), é possível que o el o fisiopatológico envolva alterações moleculares do microambiente pélvico-peritonial e ovariano, com influência negativa sobre o desenvolvimento folicular (SCHENKEN et al ., 1984; TUMMON et al., 1991; TOYA et al., 2000), o processo ovulatório (SUGINAMI & YANO, 1988), a qualidade do oócito e o processos de fertilização, embriogênese (SIMÓN et al., 1994; PELLICER et al., 1995; GARRIDO et al., 2000; LEBOVIC et al., 2001) e implantação embrionária (LESSEY et al., 1994; ARICI et al., 1996; KAO et al., 2003). Embora o advento das técnic as de RA de alta comp lexidade (Fertilização in vitro – FIV – e Injeção intracitoplasmática de espermat ozóides – ICSI) tenha trazido algum alento à população de mulheres subférteis portadoras da endometriose (TUMMON et al., 1991; SOLIMAN et al., 1993; KODAMA et al., 1996), a tendência moderna de se esperar piores resultados reprodutivos entre as portadoras da doença parece preponderar; são apontadas diferenças significativas entre o número de oócitos aspirados, as taxas de fertilização, 28 implantação e gestação das mulheres subférte is portadoras e não portadoras (BARNHART et al., 2002). Com base em estudos recentes, entretant o, o comprometimento dos resultados dos procedimentos de RA em pacientes com endome triose ainda permanece uma controvérsia da medicina reprodutiva. Trabalhos recentes têm ora confirmado alguma interferência (TRINDER & CAHILL, 2002; REIS et al., 2004; SUZUKI et al., 2005; GUPTA et al., 2006; KUMBAK et al., 2008), ora afirma do que os resultados de RA são, ao menos, semelhantes aos encontrados em não portadoras da doe nça (MATSON & YOVICH, 1986; DMOWSKI et al., 1995; GEBER et al., 1995; OLIVENNES et al., 1995; ISAACS et al., 1997; HICKMAN, 2002; AL-FADHLI et al., 2006). Considerando-se a grande quantidade de estudos e especulações acerca da subfertilidade associada à endometriose, surpr eende a escassez na l iteratura de artigos relacionando a doença à avaliação dos marcadores de reserva e resposta ovariana em RA. Os escassos estudos sugerem que tais marcadores podem apresentar comportamentos distintos entre portadoras e não porta doras da endometriose (PAL et al. 1998; HOCK et al., 2001; BARNHART et al., 2002; LEMOS et al., 2008), sendo, assim, possível antever algum valor na predição da resposta gonadal ao estím ulo exógeno controlado, seja referente ao desenvolvimento folicular, ao número de oócitos obtidos ou à ocorrência de gestação. Até a presente data, não encontramos estudos correlacionando os níveis sanguíneos de marcadores de reserva ovariana com resposta a ciclos de RA ou determinando a capacidade discriminatória desses marcadores na predição de má resposta entre as portadoras da endometriose. 29 2. OBJETIVOS 30 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL Avaliar a reserva folicular e a resposta ovariana em ciclos de reprodução assistida de mulheres subférteis portadoras de endometriose. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Avaliar a reserva folicular de mulheres subférteis portadoras de endometriose, pelas dosagens basais dos hormônios anti-mülleri ano (AMH) e folículo estimulante (FSH), a contagem de folículos antrais pequenos (CFA) e a medida do volume ovariano médio (VOM), estes dois últimos parâmetros avaliados através da ultrassonografia. • Identificar marcadores indivi duais que possam se destacar na inferência da reserva ovariana e predição da resposta em ciclos de RA, em mulheres inférteis portadoras de endometriose. • Avaliar a capacidade discriminatória dos mar cadores da reserva folicular ovariana na predição da má resposta a ciclos de reproduç ão assistida (RA) em mulheres subférteis portadoras de endometriose. 31 3. CASUÍSTICA E METODOLOGIA 32 3. CASUÍSTICA E METODOLOGIA 3.1. CASUÍSTICA Foi realizada avaliação prospectiva de 278 ciclos em 227 pacientes subférteis submetidas a procedimentos de Reprodução Assistida (RA) no serviço de Reprodução Humana do Hospital das Clínicas da Faculdad e de Medicina de Ri beirão Preto (HCFMRP- USP), da Universidade de São Paulo, entre junho de 2006 e fevereiro de 2008. Este projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pes quisa do HCFMRP-USP, que foi favorável a sua execução e todas as pacientes assinaram termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO B). Os critérios de inclusão no estudo foram: (1) infertilidade primária ou secundária, com pelo menos dois anos de evolução, associada à endometriose ou a fator masculino; (2) idade inferior ou igual a 40 anos; (3) ciclos menstr uais regulares; (4) ausê ncia de patologias endócrinas com possível efeito deletério sobre o potencial reprodutivo (disfunções tireoidianas, hiperprolactinemia, anovulação hiperandrogênica, alterações do metabolismo glicídico); (5) presença de ambos os ovários . Todas as pacientes haviam sido submetidas previamente a videolaparoscopia para confirmação de presença da endometriose. Foram critérios de exclusão do estudo: (1) identificação ultrass onográfica de cistos ovarianos endometrióticos ou foliculares; (2) antecedente cirúrgico com abordagem ovariana potencialmente deletéria à população folicular (oof oroplastia); (3) uso de hormônios nos três meses antecedentes à coleta do sangue. Para a composição do estudo, preencheram os critérios de inclus ão 78 pacientes (95 ciclos), tendo sido posteriormente excluídas 6 p acientes (8 ciclos): duas pacientes (2 ciclos) pela presença de cistos foliculares; duas (3 ciclos) por endometrio mas ovarianos; e duas (3 33 ciclos) por ooforoplastia prévia. As paciente s incluídas foram divididas em dois grupos: o grupo I incluiu 30 ciclos de repr odução assistida, realizados em 24 mulheres subférteis portadoras de endometriose; o grupo II (grupo controle) incluiu 57 ci clos, em 48 pacientes cuja subfertilidade foi atribuída exclusivamente a fator masculino. 3.2. ESTIMATIVA DE AMOSTRA Com a média de 9,5 ± 4,8 oócitos captados em pacientes normais (Bancsi, 2002), considerando como alteração significativa a queda de 40% no número de oócitos captados em pacientes com endometriose, usando teste bicaudal com poder de 80% e nível de significância de 5%, foi estimado o mínimo de 30 ciclos para o grupo de casos de endometriose e 30 ciclos para grupo controle. 3.3. MÉTODOS 3.3.1. Avaliação ovariana basal As coletas das amostras de sangue de p acientes candidatas a ciclos de reprodução assistida (RA) foi realizada durante o início da fa se folicular precoce (entre o 3º e o 5º dia) de ciclo menstrual prévio, preferencialmente no ci clo imediatamente antecedente ao início do tratamento para indução de ovulação, como se faz rotineiramente em nosso serviço. As amostras foram centrifugadas a 2500 rpm e os respectivos soros armazenados em temperatura de -70°C para análise posterior conjunta e as alíquotas do soro armazenado foram separadas para dosagem em único momento dos hor mônios anti-mülleriano (AMH) e folículo estimulante (FSH), e estradiol (E2). 34 No mesmo dia da coleta, todas as pacientes foram submetidas a exame ultrassonográfico bidimensional, pela via transv aginal, para contagem de folículos antrais com diâmetro médio de até 6 mm e medida dos volumes de ambos os ovários, tendo-se utilizado aparelho ATL HDI 3000 (ATL U ltrasound, Bothel, WA, USA), com sonda endovaginal na frequência de 4,0 a 9,0 MHz. O cálculo do volume ovariano foi feito a partir da fórmula: Volume ovariano = me dida 1 X medida 2 X medida 3 X π/6, derivada da forma clássica para cálculo do volume de estruturas esféricas (YAMAN et al., 2003), em que as medidas 1, 2 e 3 corresponderam aos máximos diâmetros perpendiculares para cada ovário. 3.3.2. Metodologia das dosagens A dosagem do AMH foi realizada no La boratório de Imunologia Clínica do Departamento de Clínica Médica do Hospital da s Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paul o, por teste imunoenzimá tico ultrassensível – ELISA (Immunotech Inc, France), com respectivos coeficientes de variabilidade inter e intra- ensaios de 14,2% e 12,3%. Para o FSH, a de terminação foi feita no Laboratório de Reprodução Humana do Departamento de Gineco logia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, por quimioluminescência (Immulite 2000, DPC, USA), com coeficientes de variação interensaios de 2,9% a 4,2% e intra-ensaio de 4,2%. O E2 também foi dosado no Laboratório de Reprodução Humana do Departamento de Gineco logia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, por quimioluminescência (Immulite 2000, DPC, USA), com coeficientes de variação intra-ensaio de 2,95%. 35 3.3.3. Protocolo de indução Os ciclos de RA iniciaram-se no máximo 3 meses após a coleta das amostras de sangue e avaliação ultrassonográfica. Resumidamente, a inibição hipofisária foi realizada pela administração subcutânea diária do acetato de leuprolida (Lupron® - Abbott), iniciada na fase médio-luteal do ciclo imediatamente antecedente ao programado para início do tratamento. Após o fluxo menstrual, a estimulação ovariana fo i iniciada com doses di árias de folitrofina recombinante (Gonal-F® - Serono) ou de gonadotrofina pós-menopausal (Menopur® - Ferring Pharmaceuticals), tendo-se realizado a m onitoração via ultrassonografia endovaginal e reajustado as doses de maneira individualizada a partir do sétimo dia de tratamento. A administração da gonadotrofina coriônica recombinante (hCG) (Ovidrel® - Serono) foi realizada quando um mínimo de três folícul os ovarianos dominantes atingiram diâmetro médio maior ou igual a 18 mm; a aspiração folicu lar para captação oocitária foi realizada 34- 36 horas após a administração da hCG. 3.3.4. Avaliação da resposta ovariana De acordo com Bancsi et al., do ponto de vista prático, se riam necessários ao menos quatro oócitos para a obtenção de dois embriões transferíveis ao final de um ciclo de RA, se consideradas taxas de fertilização entre 50% e 60% (BANCSI et al., 2002); porém, a má resposta ovariana ao estímulo em RA não en contra na literatura definição consensual, podendo ser analisada não apenas pelo número de oócitos aspirados (BANCSI et al., 2002; ELGINDY et al., 2008; KLINKERT et al., 2005; LA MARCA et al., 2007; LUNA et al., 2008), mas, também, pela contagem de folículos dominantes com diâmetro médio ≥ 18 mm no dia de administração da hCG (JENKINS et al., 1991; EVERS et al., 1998). Dessa forma, 36 optamos por inicialmente classificar as pa cientes em dois grupos, considerando os dois critérios separadamente (folículos dominantes e oócitos aspirados). Para o critério “folículos dominantes”, foi considerada má resposta o desenvolvimento de menos de quatro unidades. Para o critério “oócitos aspi rados”, foi considerada má res posta a obtenção de menos de quatro unidades aspiradas. As etapas do estudo encontram-se resumidas na Figura 2. 37 Figura 2. Perfil metodológico do estudo. 227 casais subférteis; 278 ciclos consecutivos de reprodução assistida 78 pacientes; 95 ciclos Critérios de inclusão no estudo: • Infertilidade com evolução ≥ 2 anos; • Associação com endometriose ou fator masculino; • Idade ≤ 40 anos; • Ciclos menstruais regulares; • Ausência de patologias endócrinas; • Presença de ambos os ovários. Critérios de exclusão do estudo: • Cistos ovarianos simples (2 pacientes, 2 ciclos) • Cistos ovarianos endometrióticos (2 pacientes, 3 ciclos); • Ooforoplastia prévia (2 pacientes, 3 ciclos) • Uso recente de hormônios (nenhum evento). 72 mulheres incluídas; 87 ciclos: • Casos de endometriose: 24 pacientes; 30 ciclos. • Controles (fator masculino exclusivo): 48 pacientes; 57 ciclos. (1) Avaliação da reserva ovariana: • Hormônio anti-mülleriano (AMH) basal • Hormônio folículo-estimulante (FSH) basal • Contagem ultrassonográfica de folículos antrais ≤ 6 mm (CFA) • Volume ovariano médio (VOM) (2) Protocolo longo de estimulação (acetato de leuprolida + gonadotrofinas) (3) Indução de ovulação (hCG recombinante) (4) Avaliação da resposta ovariana: • Número de folículos ≥ 18 mm no dia da hCG • Número total de oócitos aspirados • Número de oócitos em MII aspirados 38 3.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS Os dados obtidos a partir das dosagens hor monais e medidas ultrassonográficas foram cruzados com características dos grupos e os re sultados da indução de ovulação em ciclo de reprodução assistida. Com isso foram analisadas as associações com a resposta ovariana, pela contagem do número de folículos com diâmetro médio ≥ 18 mm no dia de administração da gonadotrofina coriônica recombinante, o número total de oócitos aspira dos e o número de oócitos em metáfase II. Utilizando o programa GraphPad Prism versão 5.00 (GraphPad Software, Inc, 2007), todos os resultados foram submetidos ao te ste de normalidade de D`Agostino & Pearson, tendo sido aplicados testes t de Student para amostras com distribuição normal e teste de Mann-Whitney para amostras sem padrão de normalidade; as correlações foram obtidas a partir do cálculo dos coeficientes de Pear son. Além disso, foram traçadas as curvas Receiver Operating Characteristic (ROC) e obtidas as áreas sob as curvas (AUC), sensibilidade, especificidade e valores preditivos utili zando-se o programa MedC alc versão 9.3.7.0 (2007). Para interpretação de curvas ROC, AUC = 1,0 significam perfeita discriminação e AUC = 0,5 implica ausência completa de poder discriminatório do teste (BROEKMANS et al., 2006). 39 4. RESULTADOS 40 4. RESULTADOS 4.1. RESERVA OVARIANA: ENDOMETRIOSE VERSUS CONTROLES (FATOR MASCULINO EXCLUSIVO) Entre as pacientes com endometriose e o grupo controle, não houve diferenças significativas quanto a idade, índice de massa corporal (IMC) e do se de gonadotrofina recombinante utilizada (Tabela 1). Tabela 1. Características clínicas e dose de gonadotrofina utilizada para o estímulo ovariano em pacientes subférteis portador as de endometriose e controles (fator masculino exclusivo). Endometriose Controle p Idade em anos (range) 35 (28 - 39) 33 (24 - 40) 0,2373 IMC (kg/m2) 23,65 ± 3,67 24,11 ± 3,73 0,6849 Dose FSH exógeno (UI) 2198 ± 1094 2015 ± 710 0,8532 Nota: idade expressa como mediana; demais valores e xpressos como média ± desvio padrão. IMC = índice de Massa Corporal; FSH = Hormônio Folículo-estimulante. Houve diferença significativa entre os ní veis séricos do FSH basal de pacientes subférteis portadoras de endometriose e paciente s controles. Já os níveis séricos basais do AMH, a contagem de folículos antrais (CFA ) e o volume ovariano médio (VOM), não se apresentaram significativamente distintos entr e os grupos (Tabela 2; Figura 3). Entre as variáveis da resposta ovariana, o número de oócitos aspirados foi o único a apresentar diferença significativa entre os grupos (Tabela 3). 41 Tabela 2. Marcadores basais de reserva ovarian a em pacientes subférteis portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo). Endometriose Controles p FSH basal (mUI/mL) 9,13 ± 5,09 6,28 ± 2,45 0,0109 AMH basal (pmol/L) 12,04 ± 8,73 13,71 ± 11,71 0,872 CFA basal 8,0 ± 5,38 9,87 ± 4,62 0,0625 VOM (cm3) 5,64 ± 2,2 5,74 ± 1,78 0,8125 Nota: valores expressos como média ± desvio padrão. Legenda: FSH = Hormônio Folículo-estimulante; AMH = Hormônio Anti-mülleriano; E2 = Estradiol; CFA = Contagem de Folículos Antrais; VOM = Volume Ovariano médio. Tabela 3. Variáveis de resposta ovariana ao estímulo gonadotrófico exógeno em pacientes subférteis portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo). Endometriose Controles p Folículos ≥ 18 mm 3,63 ± 2,67 3,83 ± 2,52 0,6612 Oócitos aspirados 5,33 ± 3,43 8,28 ± 5,8 0,0372 Oócitos em MII aspirados 3,93 ± 3,00 5,05 ± 3,17 0,1191 Nota: valores expressos como média ± desvio padrão. Legenda: MII = Metáfase II. 42 Figura 3. Marcadores basais de reserva ovaria na em pacientes subférteis portadoras de endometriose e controles (fator masculino ex clusivo). Legenda: EDT = Endometriose; FSH = Hormônio Folículo-estimulante; AMH = Hormôn io Anti-mülleriano; CFA = Contagem de Folículos Antrais. * p < 0,05. 4.2. Correlações: marcadores de reserva versus a resposta ao estímulo A Tabela 4 apresenta os coeficientes de co rrelação de Pearson entr e os marcadores de reserva ovariana e a resposta ao estímulo em cicl os de reprodução assistida, em portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo). O número de folículos com diâmetro médio ≥ 18 mm no dia de administração da hCG correlacionou-se significativamente com o AMH tanto no grupo com endometriose (r = 0,54; p < 0,01) quanto nos controles (r = 0,39; p < 0,01). Também no grupo com endometriose, o número de folículos ≥ 18 mm no dia da hCG se correla cionou significativamente com FSH (r = - 0,47; p < 0,01) e VOM (r = 0,42; p < 0,05), enquanto que estas variáveis não estiveram 43 correlacionadas no grupo controle. Neste últim o obteve-se correlação significativa somente com a idade (r = - 0,40; p < 0,01) (Figura 4). O número total de oócitos aspirados corre lacionou-se significativamente com o AMH tanto no grupo com endometriose (r = 0,61; p<0,001) quanto nos controles (r = 0,58; p<0,0001), de forma bastante similar. No grupo co m endometriose, o número total de oócitos aspirados também se correlacionou signifi cativamente com o FSH (r = -0,48; p<0,01); enquanto que no grupo controle obteve-se corr elação significativa com a CFA (r = 0,59; p < 0,0001) e com a idade (r = -0,35; p<0,01) (Figura 5). O número de oócitos aspirados em metáfase II (MII) correlacionou-se significativamente com o AMH tanto no grupo com endometriose (r = 0,54; p<0,01) quanto nos controles (r = 0,51; p<0,0001). No grupo com e ndometriose, o número de oócitos em MII também se correlacionou significativamente com o FSH (r = -0,55; p<0,01). No grupo controle, obteve-se correlação significativa co m a CFA (r = 0,66; p < 0,0001) e a idade (r = - 0,29; p<0,05). Quando cruzados os níveis de AMH e FSH ba sais, foi encontrada correlação negativa significativa entre o AMH e o FSH (r = -0,51; p 0,05). Tabela 4. Correlações entre os marcadores de reserva ovariana e a resposta ao estímulo em ciclos de reprodução assistida, em portadoras de endometriose e controles (fator masculino exclusivo). Controles Endometriose Folículos ≥ 18 mm Oócitos Oócitos MII Folículos ≥ 18 mm Oócitos Oócitos MII r p r p r p r p r p r p Idade -0,4 0,0024 -0,35 0,0083 -0,29 0,0259 -0,19 0,3191 -0,17 0,3658 -0,21 0,255 IMC (kg/m2) 0,18 0,1978 -0,044 0,75 -0,044 0,7546 -0,25 0,2363 -0,18 0,3875 -0,24 0,2518 FSH (mUI/mL) -0,018 0,8952 -0,12 0,3652 -0,072 0,5953 -0,47 0,0093 -0,48 0,0073 -0,55 0,0015 AMH (pmol/L) 0,39 0,0036 0,58 < 0,0001 0,51 < 0,0001 0,54 0,0022 0,61 0,0003 0,54 0,0019 CFA basal 0,14 0,3876 0,59 < 0,0001 0,66 < 0,0001 0,18 0,4347 0,27 0,2248 0,27 0,2318 VOM (cm 3) 0,22 0,1177 0,07 0,6051 0,11 0,43 0,42 0,0201 0,18 0,3472 0,24 0,2018 Legenda: r = coeficiente r de Spearman; IMC = Índice de Massa Corporal; FSH = Hormônio Folículo-estimulante; AMH = Hormônio Anti-mülleriano; CFA = Contage m de Folículos Antrais; VOM = Volume Ovariano Médio. 44 Figura 4. Correlações (r) entre os marcadores de reser va ovariana e o número de folículos com diâmetro médio ≥ 18 mm no dia de administração da hCG, em portadoras de endometriose e co ntroles (fator masculino exclusivo). As correlações significativas estão expressas em se us respectivos gráficos. As linhas tracejadas indicam os intervalos de confiança de 95%. Legenda: FSH = Hormônio Folículo-estimulante; AMH = H ormônio Anti- mülleriano; VOM = Volume Ovariano Médio; NS = não significativo. 45 Figura 5. Correlações entre os marcadores de reserva ovariana e o número total de oócitos aspirados, em portadoras de endometri ose e controles (fator masculino exclusivo). As correlações significativas estão ex pressas em seus respectivos gr áficos. As linhas tracejadas i ndicam os intervalos de confiança de 95%. Legenda: FSH = Hormônio Folículo-estimulante; AMH = Hormônio Anti-mü lleriano; CFA = Contagem de Folículos Ant rais; NS = não significativo. 46 47 4.3. MARCADORES DE RESERVA OVARIANA E PREDIÇÃO DE MÁ RESPOSTA AO ESTÍMULO Embora acreditemos no desenvolvimento folicular como a principal manifestação da resposta ovariana ao estímulo gonadotrófico exóg eno e, assim, que a má resposta deva ser caracterizada pela presença de menos de quatro folículos com diâmetro médio ≥ 18 mm no dia de administração da hCG (JENKINS et al ., 1991; EVERS et al., 1998), as correlações entre os vários marcadores estudados e os dife rentes critérios de res posta ovariana em nosso estudo demonstraram comportamentos próximos (número de folículos e número de oócitos aspirados). Sendo assim e considerando a notória tendência atualmente vista na literatura, adotamos como critério de má resposta ova riana a obtenção de número total de oócitos aspirados inferior a quatro (B ANCSI et al., 2002; ELGINDY et al., 2008; KLINKERT et al., 2005; LA MARCA et al., 2007; LUNA et al ., 2008), ainda que elementos externos relacionados ao processo de captação possam influenciar negativamente sobre o esse resultado. A Tabela 5 apresenta as análises estatísticas e as áreas sob as curvas (AUC) para os marcadores clínicos (idade e IMC), séricos ( FSH e AMH basais) e ultrassonográficos (CFA e VOM), em portadoras de endometriose e contro les, considerando como má resposta a obtenção de número inferior a 4 oócitos aspirados. Entre pacientes portadoras de endometrio se, as más respondedoras apresentaram níveis significativamente inferiores de AMH em relação às normorespondedoras (3,51 ± 5,81 pmol/L vs. 15,15 ± 7,48 pmol/L, respectivamente). O AMH basal foi o marcador individual com melhor potencial discriminatório para má resposta (AUC = 0,875), seguido de FSH basal (AUC = 0,682) e VOM (AUC = 0,665). 48 Entre as pacientes sem endometriose, as más respondedoras apresentaram níveis significativamente inferiores do AMH em relação às normorespondedoras (4,22 ± 4,64 pmol/L vs. 15,74 ± 11,78 pmol/L, respectivamente). O AMH foi o marcador individual com melhor potencial discriminatório para má resposta (AUC = 0,8372), seguido do VOM (AUC = 0,709) e da CFA (AUC = 0,686). As áreas sob as curvas encontradas para os três marcadores vs. má resposta pelo número de oócitos aspirados estão representadas graficamente na Figura 6. Figura 6. Curvas Receiver Operator Characteristic (ROC) para Idade, Hormônio Folículo- Estimulante e (FSH) e Hormônio Anti-Mülleri ano (AMH) como preditores de má resposta (menos de 4 oócitos aspirados, em portador as de endometriose e controles (fator masculino exclusivo). As linhas tracejadas indicam os intervalos de confiança de 95%. Tabela 5. Marcadores de reserva ovariana em pacientes subférteis port adoras de endometriose e controles, de acordo com o número total de oócitos aspirados. 33 75 45,45 IMC (kg/m2) 25,28 ± 3,43 23,24 ± 3,87 0,2945 0,643 > 22,6 85,71 52,94 FSH basal (mUI/mL) 13,39 ± 8,06 7,585 ± 3,93 0,1395 0,682 > 8,08 62,5 83,36 AMH basal (pmol/L) 3,51 ± 5,81 15,15 ± 7,48 0,0005 0,875 ≤ 2,71 75 90,91 CFA basal 9,0 ± 8,2 7,625 ± 4,19 0,9703 0,51 ≤ 6,0 66,67 50 VOM (cm3) 4,91 ± 2,93 5,905 ± 1,88 0,2819 0,665 ≤ 2,7 37,5 100 Controles (Fator masculino) Idade 34,4 ± 4,624 33,11 ± 4,37 0,3884 0,5888 > 33 70 53,19 IMC (kg/m2) 22,8 ± 3,18 24,38 ± 3,8 0,2319 0,628 ≤ 21,4 55,56 82,22 FSH basal (mUI/mL) 6,25 ± 1,331 6,29 ± 2,64 0,7057 0,539 > 5,65 80 42,55 AMH basal (pmol/L) 4,22 ± 4,643 15,74 ± 11,78 0,0009 0,837 ≤ 9,15 90 76,6 CFA basal 7,29 ± 3,352 10,34 ± 4,7 0,1235 0,686 ≤ 7,0 71,43 73,68 VOM (cm3) 4,63 ± 1,217 5,98 ± 1,8 0,0285 0,709 ≤ 5,05 70 65,96 Nota: números de oócitos expressos como média ± desvio padrão; sensibilidade e especificidade expressas em porcentagem. Legenda : IMC = Índice de Massa Corporal; FSH = Hormônio Folículo-estimulante; AMH = Hormônio Anti-mülleriano; CFA = Contagem de Folículos Antrais; VOM = Volume Ovariano médio. 49 50 5. DISCUSSÃO 51 5. DISCUSSÃO 5.1. RESERVA E RESPOSTA OVARIANA EM MULHERES SUBFÉRTEIS PORTADORAS DE ENDOMETRIOSE Embora estejam disponíveis na literatura inúmeros estudos sobre a avaliação da reserva ovariana a partir de marcadores sérico s e ultrassonográficos, são escassos os dados abordando especificamente a endometriose. Os re sultados obtidos neste estudo demonstraram que pacientes subférteis portadoras de endometriose, independentemente do estádio da doença (classificação da American Society for Reproductive Medicine (ASRM, 1985)), apresentam níveis basais significativamente mais elevados do FSH quando comparadas às não portadoras, ainda que os valores permaneçam dentro da faixa de normalidade. Já os níveis basais de AMH, a CFA e o VOM não se apresentaram com diferenças significativas entre os grupos. Os poucos estudos que avaliaram a reserva ovariana especificamente em portadoras de endometriose apresentam controvérsias quanto à interferência da doença sobre o aparato funcional da gônada, mas os resultados tendem a sugerir a existência de algum prejuízo do comportamento biológico de folículos e oócit os no processo reprodu tivo destas pacientes (PAL et al. 1998; HOCK et al., 2001; BARNHART et al., 2002; LEMOS et al., 2008). Enquanto o estudo de Hock et al. dem onstrou elevação significativa do FSH basal apenas na doença avançada, defendendo a perda progressiva do aparato funcional ovariano na medida do avanço da endometriose (HOCK et al., 2001), outros não demonstraram diferenças nos níveis basais do FSH entre portadoras de endometriose e aquelas com fator tubário, ou entre as portadoras da doença em graus diferentes (LIMA et al., 2006). Um estudo brasileiro recente avaliou mu lheres subférteis com endometriose mínima/leve e apontou para a ex istência de decréscimo signi ficativo dos níveis basais do 52 AMH quando comparadas àquelas com fator tubário (1,26 ± 0,7 ng/mL e 2,02 ± 0,72 ng/mL, respectivamente; p = 0,004), enquanto as dife renças nos níveis basais de FSH (5,2 ± 1,8 mUI/mL e 4,9 ± 1,0 mUI/mL, respectivamente; p > 0,05) e na CFA (12 ± 1,3 e 11 ± 1,6, respectivamente; p = 0,732) não atingiram significância (LEMOS et al., 2008). No contexto, apesar de os resultados enc ontrados neste estudo contrariarem os poucos dados da literatura atual sobre o comportamento de marcadores da reserva frente à resposta ovariana, concordamos que exista algum comprometimento na resposta folicular ovariana em pacientes com endometriose. A diminuição do número de oócitos captados confirma de forma quantitativa e objetiva o prejuízo na resposta à estimulação ovariana. Já os marcadores séricos e ultrassonográficos sugerem um potencial mecanismo de influência da endometriose sobre esta capacidade de resposta, a partir da el evação dos níveis de FSH, com manutenção dos valores do AMH, do VOM e da CFA, permitindo-nos a associação a eventos da fisiologia reprodutiva. Com o respaldo de preceitos clássicos acer ca do funcionamento do eixo hipotálamo- hipófise-ovariano, o papel do FSH basal na avalia ção da reserva ovaria na já foi bastante estudado e a elevação deste marcador parece estar relacionada à resp osta disfuncional dos folículos pré-antrais e antrais, exigindo da hipófise estimulação compensatória à falta da retroalimentação negativa (EVERS et al., 1998) . Em sendo assim, supõe-se que a resposta ovariana com desenvolvimento folicular in adequado possa ser a tradução do comprometimento da qualidade dos oócitos ou dos fo lículos recrutados, o que manteria níveis precocemente elevados de FSH, sem a obrigatoriedade do esgotamento da reserva de folículos primordiais recrutáveis. O AMH tem sido apontado como sendo o marcador da população folicular propriamente dita, uma vez que é secretado por folículos em estágios mais precoces do desenvolvimento (primário, secundário e pré-antral inicial) (WEE NEN et al., 2004) e, assim, 53 representa o pool de folículos primordiais recrutáveis ex istentes na gônada. Apesar de ser o papel biológico do hormônio na mulher ainda pouco esclarecido, est udos recentes levam a crer que atue como um modulador do recrutamento folicular, limitando a transição do folículo primordial para o primário (DURLINGER et al., 1999; RAJPERT-DE MEYTS et al., 1999; NILSSON & SKINNER 2001; FANCHIN et al., 2003; VISSER & THEMMEN 2005; CARLSSON et al., 2006; VISSER et al., 2007), assim como de terminante na permissividade à ação do FSH (DURLINGER et al., 1999; DURLINGER et al., 2001) e do LH (DI CLEMENTE et al., 1994) nos folículos ovarianos. Para Nilsson et al., o AMH interferiria na foliculogênese reduzindo a expr essão de fatores estimulatóri os, aumentando a expressão de fatores inibitórios e regulando vias intrínsecas celulares de sinalização que resultariam em inibição do desenvolvimento dos folículos primordiais (NILSSON et al., 2007). Dessa forma, é possível dissociar os conceito s de reserva e respos ta ovariana, que se expressariam, respectivamente, pelos níveis séricos do AMH (produzido por folículos primários, secundários e pré- antrais iniciais) e do FSH (em resposta ao desenvolvimento adequado de folículos pré-antrais tardios, antrais e dominante pré-ovulatório). No presente estudo, a verificação de um aumento dos valores basais do FSH em portadoras de endometriose, sem elevação dos níveis basais do AMH, permite postularmos que a interferência da doença não ocorra sobre a reserva funcional ovariana propriamente dita, mas sobre a progressão folicular, mais especificamente em eventos da transição entre as fases moduladas por AMH e FSH. O suposto comprometimento da qualidade oocitária secundário à presença da endometriose responde por certa re fratariedade dos folículos selecionados, que demandam maior estímulo hipofisário e term inam por responder ao comando, explicando assim a equivalência encontrada no número de folículos ≥ 18mm no dia do hCG entre os dois grupos. Ainda, a manutenção de valores simila res no VOM e na CFA confirma a falta de interferência da doença sobre o pool de folículos primordiais. 54 Não podemos, contudo, detalhar o processo pelo qual a endometriose compromete a qualidade folicular. A nosso ver isso demandari a um estudo de desenho distinto do atual, visando desvendar mecanismos celulares e mol eculares interessando células da granulosa e oócito, e as modificações pelas quais estes pa ssam desde a fase folicular primária até o momento pré-ovulatório. A redução do número de oócitos captados co m mesmo número de folículos recrutados no dia do hCG também sugere o comprome timento na qualidade da resposta, se considerarmos que, do ponto de vista técnico, am bos os grupos foram submetidos à punção pela mesma equipe de profissionais, sob as mesmas condições e critérios de indicação; chama a atenção, no entanto, a similaridade entre os grupos com relação ao número de oócitos maduros, que sugere, por fim, a dissociação dos conceitos de maturidade e qualidade oocitária. Cabe aqui ressaltar os resultados obtidos por Pelli cer et al., que demonstraram elevação dos níveis de progesterona no flui do folicular das portadoras de endometriose, indicando maturidade oocitária adequada (PELLI CER et al., 1998), enquanto a qualidade de embriões provenientes dessa população se apresenta reduzida (PELLICER et al., 1995). Em concordância com nossos resultados es tão os dados de Mínguez et al., que demonstraram haver diferenças significativas na média de oócitos aspirados entre portadoras e não portadoras de endometriose (11,3 ± 6,4 e 14,2 ± 8,3, respectivamente; p = 0,004), sem, entretanto, serem distintas as médias de gametas maduros (MÍNGUEZ et al., 1997). 5.2. MARCADORES DE RESERVA O VARIANA: CORRELAÇÕES COM A RESPOSTA A RA NA ENDOMETRIOSE A literatura atual é bastante rica em artigos que buscam o melhor marcador de reserva na avaliação de pacientes subf érteis de modo geral. Entretanto a individualização de grupos 55 específicos de pacientes, pode eventualmente apontar marcadores mais ou menos eficazes como preditores de reserva ovariana. Não encont ramos na literatura estudos estabelecendo as correlações dos marcadores de reserva com a resposta ovariana exclusivamente em portadoras de endometriose, mas dados referentes a outras causas de subfertilidad e (ELGINDY et al., 2008) ou incluindo as portadoras da doença em grupos genéricos de mulheres subférteis (MUTTUKRISHNA et al., 2005). Por isso, avaliamo s os diferentes marcadores considerando separadamente as pacientes po rtadoras de endometriose da quelas subférteis por fator masculino exclusivamente. A resposta ovariana ao estímulo para RA é caracterizada por critérios diversos na literatura, mais freqüentemente associados ao desenvolvimento folicular e ao número total de oócitos aspirados. Em nosso estudo, o AMH basal apresentou correlação positiva significativa com a resposta ovariana em RA, independentem ente da presença da endometriose. O FSH basal, contudo, apenas apresentou correlação si gnificativa negativa com a resposta entre as portadoras da doença. Essas correlações fora m observadas para o número de folículos com diâmetro médio ≥ 18 mm no dia de administração da hCG, o número total de oócitos aspirados e os gametas no estágio II da me táfase (MII). No grupo sem endometriose, correlacionaram-se significativamente com a res posta a CFA (total de oócitos e oócitos em MII) e a idade (folículos ≥ 18 mm), o que não foi observado nas portadoras da doença. Corroborando nossos achados, ao estudare m a subfertilidade restrita ao fator masculino, Elgindy et al. demonstraram haver correlações significativas de AMH basal e CFA (r = 0,88; p< 0,001) com o número de oócitos aspi rados. Entretanto, para estes autores os valores de FSH também foram significativam ente correlacionados à resposta, embora de forma menos intensa que a ocorrida para as duas primeiras variáveis (r = -0,41; p<0,05) (ELGINDY et al. 2008). 56 Excluindo as causas endócrinas, mas não a endometriose, Wunder et al. confirmaram a forte correlação do AMH com o número de oócitos aspirados, total (r = 0,357; p < 0,0001) ou em MII (r = 0,32; p < 0,0001), e a ocorrência de gestação. No mesmo estudo, apontaram correlações fortemente negativas do marcador com a idade e o FSH basal, mas não fizeram as correlações destes com o número de oócitos obtidos (WUNDER et al., 2008). A partir da inclusão, num mesmo grupo, de mulheres subférteis sem causa aparente, com síndrome dos ovários policísticos, fator tubário, endometriose e fator idade, e não deixando claro se doenças endócrinas foram critérios de exclusão, Muttukrishna et al. também correlacionaram significativamente o AMH (r = 0,509; p < 0,001) e o FSH (r = 0,318; p < 0,001) basais com o número de oócitos aspirados (MUTTUKRISHNA et al., 2005). Sendo assim, é notória a falta de um elo entr e a reserva folicular ovariana e a resposta em ciclos de RA de portador as da endometriose. A lacuna do conhecimento resulta de um cenário que ora ignora interferências já descri tas da endometriose sobre o funcionamento do eixo hipotálamo-hipófise-ovaria no (SCHENKEN et al., 1984) e ora traduz a subfertilidade como doença uniforme e não um sintoma de doenças distintas que repercutem efemeramente sobre o perfil hormonal. Um resultado curioso deste estudo foi a obt enção de correlação ne gativa significativa entre AMH e FSH apenas nas pacientes subférteis portadoras da endometriose, mas não nas pacientes do grupo controle. Forte correlação ne gativa entre tais marcadores foi apontada em estudos prévios, que, entretanto, não excluíra m das amostras os casos de endometriose (SINGER et al., 2008), o que suporta a afirmativa de que a doença interfere sobre a resposta da gônada feminina ao estímulo gonadotrófico exógeno e o FSH basal funciona como bom preditor da resposta nessa população específica. Nossos resultados, assim, oferecem solução ao s vieses atuais em alguns aspectos: (a) ratificam o elo entre reserva e resposta ovarian a ao estabelecerem correlações significativas 57 entre os níveis de AMH e as diferentes variáveis de resposta, ratificando o uso desse marcador na propedêutica da mulher candidata a RA; (b) reforçam as suspeitas que a endometriose interfere, ao menos indiretamente, sobr e o funcionamento adequado do eixo HHO e a fisiologia dos folículos a partir da seleção para dominância, na medida em que apontam para o FSH basal como um preditor de resposta poten cialmente interessante na população subfértil portadora da doença; e (c) restringem o uso da CFA às não portadoras. 5.3. MARCADORES DE RESERVA OVARIANA E PREDIÇÃO DE MÁ RESPOSTA AO ESTÍMULO Considerando-se a sugestiva interferência da endometriose sobre a fertilidade natural ou em ciclos de RA e a necessidade de melhor aconselhar as portadoras da doença em serviços de medicina reprodutiva, torna-se extremamente atrativa a idéia de se determinar não apenas os marcadores que se correlacionam adequadamente à resposta, mas aquele com a maior capacidade de predizer as más re spondedoras. O traçado de curvas do tipo Receiver Operating Characteristic (ROC) e o cálculo das áreas s ob as curvas (AUC) para cada marcador frente à resposta prestam-se a esse fim. Por sua associação mais fidedigna à rese rva ovariana propriamente dita, estudos recentes têm buscado no AMH basal melhor capacidade preditiva da resposta folicular. Novamente, contudo, não dispomos de estudos di recionados para a endometriose como fator de subfertilidade. Nossos resultados demonstraram nítida e significativa redução do AMH basal mulheres em más respondedoras independe ntemente da presença da endometriose, sendo ele o marcador com melhor potencial discriminatório de má resposta em ambos os grupos. Alguma capacidade de predizer má resposta também foi demonstrada para FSH e VOM entre as portadoras da doença, e para VOM e CFA entre os controles. 58 No estudo de Muttukrishna et al., em que se avaliaram mulheres previamente más respondedoras, o AMH foi considerado o melhor marcador isolado de resposta ovariana ao estímulo exógeno (AUC = 0,798) (MUTTUKRIS HNA et al., 2004). O mesmo grupo viria a declarar que o AMH basal identifica corretamente 87% das más respondedoras (sensibilidade) e 64% das normorespondedoras (esp ecificidade), quando considerado cut off aproximado de 1,43 pmol/L (MUTTUKRISHNA et al., 2005). Neste estudo encontramos uma sensibilidade e especificidade de 90% e 76,6%, respectivamente, entre os cont roles, consider ando níveis ≤ 9,15 pmol/L. Entre as portadoras de endomet riose apontamos sensibilidade de 75% e especificidade de 90,91% para níveis ≤ 2,71 pmol/L. É interessante constatar a controvérsia ge rada em torno do valor de corte do AMH basal na discriminação da má resposta (CARVALHO et al., 2008; BROER et al., 2008). Apesar de termos encontrado valores dist antes quando comparados os grupos com e sem endometriose, acreditamos que o nível de corte apontado por Muttukrishna et al. (MUTTUKRISHNA et al., 2005) não seja co ndizente com a realidade da população que procura serviços de RA, já que apenas cerca de 17% das pacientes em nossa casuística apresentaram níveis de AMH basal < 1,43 pmol/L. O uso de níveis muito reduzidos também marcou o estudo de Fiçicioglü et al., em que o AMH basal apresentou a maior área sob a curva (AUC = 0,92) na predição de má respos ta, com sensibilidade e especificidade de 90,9 para cut off de aproximadamente 0,18 pmol/L (FIÇICIOGLÜ et al., 2006), nível possivelmente indetectável a depender do kit utilizado. Os números que encontramos para os c ontroles aproximam-se dos encontrados no estudo de Tremellen et al., que apontaram boa cap acidade na predição de má resposta para o AMH basal < 8,1 pmol/L, com sensibilidade de 80% e especificidade de 85% (TREMELLEN et al., 2005), e o estudo de La Marca et al., com sensibilidade de 80% e especificidade de 93% para limiar aproximado de 5,35 pmol/L (LA MARCA et al., 2007). 59 Com relação ao FSH basal, Ashrafi et al. constataram que mulheres sem endometriose (critério de exclusão daquele es tudo) apresentando níveis de FSH ≥ 15 UI/mL tiveram menos oócitos aspirados e maior número de ciclos de RA cancelados em comparação àquelas com níveis inferiores, sem ter ha vido diferença significativa nas doses de gonadotrofinas administradas (ASHRAFI et al., 2005). Da mesm a forma, um estudo prévio desenvolvido em nosso serviço avaliou mulheres sem endometriose com idade maior de 30 anos e constatou ser o FSH basal > 10 mUI/mL um bom preditor pa ra determinar a dominância de menos de 4 folículos ao final de ciclos induzidos (FRANCO et al., 2002). A questão da falta de um consenso para os ní veis de corte se repete para o FSH basal. Um aspecto interessante a se observar na litera tura é a tendência de se considerar valores plasmáticos muito elevados para o FSH basal na predição da má resposta ovariana em RA. Considerando-se que em geral a elevação do FSH costuma ser discreta antes dos 42 anos de idade (TREMELLEN et al., 2005) e julgando serem mulheres mais jovens a grande maioria das pacientes que buscam assistência em RA, pode-se afirmar que o embasamento de conclusões a partir de níveis elevados imp lica importante e limitador viés. Nossos dados são concordantes com isso ao evidenciarem níveis basais do FSH > 10 mUI/mL somente em 20% dos ciclos com endometriose e 5,26% dos ciclos sem a doença, e níveis ≥ 15 mUI/mL em apenas 13,3% das portadoras da doença e 1,75% dos controles. Pe lo cálculo das curvas ROC, sugerimos que níveis basais de FSH > 8,08 mUI/mL apresentam sensibilidade de 62,5% e especificidade de 83,36% na determinação da má resposta em portadoras da endometriose, enquanto que nas não portadoras, esses valo res foram de 80% e 42,55%, respectivamente, para níveis > 5,65 mUI/mL. Ce rtamente, considerar um cut-off tão baixo implica redução da especificidade do teste, ou seja, que muita s pacientes poderão ser consideradas como potenciais más respondedoras sem o serem. Por i sso, julgamos que o FSH basal não seja um 60 bom preditor de má resposta e, assim, não se ju stifica contra-indicar uma tentativa de indução da ovulação supondo má resposta baseada somente nesse marcador. A CFA também é considerada na literatura um bom preditor de má resposta ovariana, embora não se encontrem, novamente, estudos direcionados às portadoras da endometriose. Em nosso estudo, a CFA considerou apenas fo lículos com até 6 mm de diâmetro, buscando eliminar a modulação pelo FSH e estabelecer o verdadeiro nexo entre reserva e resposta ovariana. Entre os controles apontou sensibilidade de 71,43% e especificidade de 73,68% para cut off ≤ 7,0, mas não demonstrou capacidade discrimi natória da má resposta em portadoras da endometriose. Klinkert et al. demonstraram que a frequênc ia de resposta normal à estimulação foi significativamente mais elevada em paciente s que apresentaram CFA de cinco ou mais unidades ≤ 5 mm (KLINKERT et al., 2005) e Haadsm a et al., em consonância, apontaram correlação significativa dos folículos ≤ 6 mm com todos os testes endócrinos de reserva ovariana disponíveis, diferentemente do obser vado para folículos ovarianos maiores, condizentes apenas com o volume ovariano e os níveis de inibina- B (HAADSMA et al., 2007). Considerando folículos com até 10 mm de diâmetro, Muttukrishna et al. demonstraram que a CFA é capaz de apontar 89% das pacientes más respondedoras a ciclos de RA, mas com reduzida especificidade de 39% (MUTTUKRIS HNA et al., 2005). Fiçici oglü et al., ainda, encontraram boa capacidade discriminatória de ste marcador (AUC = 0,78) na determinação de má resposta (FIÇICIOGLÜ et al., 2006), ap roximando-se dos nossos achados para as não portadoras de endometriose. Elgindy et al. encontraram diferenças de vo lume ovariano entre mu lheres de até 37 anos com resposta normal e má resposta ao estímulo (4,1 ± 0,66 cm 3 e 3,36 ± 0,71cm 3, respectivamente; p = 0,007) (ELGINDY et al., 2008), à semelhança do encontrado neste 61 estudo entre os controles, mas não na endometriose. Nossos dados sobre o VOM demonstraram sua razoável capacidade preditora de má resposta entre as não portadoras de endometriose, com sensibilidade de 70% e especificidade de 65,96% para cut off ≤ 5,05 cm3. Na endometriose, contudo, com sensibilidade de 58,82% e especificidade 92,31%, a CFA não se mostrou tão interessante. Uma limitação deste estudo foi não termos avaliado o comportamento dos diversos marcadores como preditores de gestação, uma vez que esta é o principal objetivo a se atingir em ciclos de RA. Essa avali ação não fez parte dos objetivos, entretanto, por não se terem descartado o fator masculino de infertilidad e entre os grupos. A nosso ver, avaliar os marcadores frente à ocorrênc ia de gestação vincularia eventuais conclusões a viés inquestionável, mesmo sabendo que todos os casai s submeteram-se a ICSI e que esta técnica supostamente reduz significativamente a interferência do fator masculino sobre os resultados finais. Outro ponto a ser considerado está na amostra limitada de pacientes, podendo se tornar mais claro o papel dos predit ores de resposta ovariana ao estímulo quando estudado em populações maiores. 62 6. CONCLUSÕES 63 6. CONCLUSÕES 1. Os níveis séricos basais do hormônio folículo-estimulante (FSH) estão significativamente elevados entre as pacientes subférteis portadoras de endometriose, independentemente do estádio da doença, quando comparados a às mulheres não portadoras da doença. Sabendo que as concentrações desta gonadotrofina na circulação são moduladas pela população de folículos antrais maiores, a associação entre endometriose e subfertilidade deve estar vinculada a alterações do crescimento/de senvolvimento do folículo ovariano e não a prejuízos sobre a reserva folicular gonadal propriamente dita. 2. Os níveis basais do hormônio anti-Mülleria no (AMH) apresentam correlações positivas expressivas com a resposta ovariana ao es tímulo gonadotrófico exógeno em ciclos de reprodução assistida (RA), independentement e da presença da endometriose. O FSH basal, por sua vez, apenas o faz entre as portadoras da doença, não havendo correlação expressiva com a resposta entre as não portadoras. 3. Entre as mulheres subférteis não portadoras de endometrios e, a contagem de folículos antrais pequenos (CFA) correla ciona-se positivamente à resposta ovariana em ciclos de RA. 4. O AMH basal é o marcador com o melhor pot encial discriminatório de má resposta ovariana ao estímulo gonadotrófico exógeno em ciclos de RA, independentemente da presença da endometriose. Entre as porta doras da doença, contudo, pode-se somar a ele o FSH basal, que também é bom predito de má resposta nesta popul ação. A CFA, por sua vez, não apresenta bom potencial discriminatório para má resposta em RA. 64 7. REFERÊNCIAS 65 7. REFERÊNCIAS Al-Fadhli R, Kelly SM, Tulandi T, Tanr SL. Effects of different stages of endometriosis on the outcome of in vitro fertilization. J Obstet Gynaecol Can 2006;28(10):888-91. American Society for Reproductive Medicine . Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 1997, 67: 817-21. Arici A, Oral E, Bukulmez O, Duleba A, Oliv e DL, Jones EE. The effect of endometriosis on implantation: results from the Yale University in vitro fertilization and embryo transfer program. 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Este material será guardado em um freezer no Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas de Ribeirão Pret o, identificado por um número, de forma a garantir o sigilo de sua identidade. Este sangue guardado poderá ser utilizado para novos exames ou para pesquisa, e o(a) Sr(a) será informado(a) de possíveis informações adquiridas a partir deste material e poderá se beneficiar das descobertas que ocorrerem em estudos com o seu material. Este banco de amostras chama-se “Banco de Amostras Sangüíneas de Pacientes com Infertilidade Conjugal do Laboratório de Gine cologia e Obstetrícia do HCFMRP” e seu responsável é o Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani (tel.: 3602-2815 ou 3602-2816). Para a utilização do seu material guard ado, será solicitada novamente a sua autorização. Todas as pesquisas serão autorizadas por um Comitê de Ética em Pesquisa e o(a) Sr(a) será comunicado(a) e poderá concordar ou não com o uso do material neste estudo. Autorizo coletar e guardar uma amostra do meu sangue para uso futuro em pesquisas, com meu consentimento. Nome do paciente:________________________________________________________ _______________________________________________________________________ __________________________________ ____________ Assinatura do paciente Data 90 Eu conversei sobre a guarda de material em banco de amostra com o paciente utilizando uma linguagem adequada e apropriada. Acredito que o informei o suficiente para tomada de decisão de maneira livre e esclarecida. __________________________________ ____________ Assinatura do médico Data Nome, endereço e telefone do responsável pelo banco de amostras: Prof Dr. Rui Alberto Ferriani Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia do HCFMRP Tel: 3602-2815 ou 3602-2816 91 APÊNDICE C TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Nome da pesquisa: HORMÔNIO ANTI-MÜLLERIANO, HORMÔNIO FOLÍCULO-ESTIMULANTE, CONTAGEM DE FOLÍCULOS ANTRAIS E MEDIDA DO VOLUME OVARIANO COMO MARCADORES DA RESERVA FOLICULA R E PREDITORES DA RESPOSTA À HIPERESTIMULAÇÃO GONADOTRÓFICA EM CICLOS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA, EM MULHERES PORTADORAS DE ENDOMETRIOSE Pesquisadores envolvidos: Orientadora: Professora Doutora Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva Pesquisadores: Bruno Ramalho de Carvalho; Dr Júlio Cé sar Rosa e Silva; Professor Doutor Rui Alberto Ferriani; Professora Doutora Rosana Maria dos Reis; Professor Doutor Marcos Felipe Silva de Sá 1. CONTEXTO Este texto é direcionado às mulheres aten didas no Hospital das C línicas de Ribeirão Preto, com diagnóstico de infertilidade conj ugal e encaminhadas para tratamento no Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia com técnica de reprodução assistida, podendo ser ou não portadoras de endometriose. 2. Justificativa e objetivo da pesquisa: Essa é uma pesquisa que vai estudar as conseqüências da endometriose sobre a reserva ovariana, ou seja, sobre as chances de os ová rios responderem ao estímulo feito durante o tratamento com reprodução assistida. 92 Para isso, serão realizadas dosagens horm onais no sangue colhido e armazenado antes do seu ciclo de reprodução assistida, incl usive de um hormônio que ainda está sendo pesquisado, o hormônio anti-mülleriano. A idéia de avaliar o hormônio anti-mulleri ano, além do hormônio FSH (classicamente dosado) e das medidas dos seus ovários já feita s por ulta-som é tentar encontrar marcadores para fazermos a previsão de que pacientes terão melhor re sposta e, consequentemente, maiores chances de uma gravidez. 3. Os procedimentos que serão utilizados: Para este estudo, você não precisará colher mais amostras de sangue ou ser submetida a qualquer novo exame. Será utilizado o sangue que já foi colhido, du rante a sua avaliação pré-basal, antes do seu ciclo de reprodução assi stida. Esse sangue será armazenado em três recipientes e apenas utilizaremos um deles para realização desta pesquisa, permanecendo os demais congelados, para possíveis novas pesquisa s com vistas a melhor ar os resultados de reprodução assistida. 4. Os riscos esperados: Não há riscos esperados. Não serão feita s pesquisas de doenças ou qualquer outras avaliações nesta pesquisa, que não as dosagens ho rmonais já mencionadas, além da utilização dos dados constantes do seu prontuário médico. Tendo lido todo o texto e recebido as informações acima, e ciente dos meus direitos, abaixo relacionados, eu, ______________________________________________________ ____________________________, RG ______________, Registro no HCFMRP 93 ________________, concordo e aceito o convite para participar como VOLUNTÁRIA da pesquisa em questão. Declaro, assim, que: Autorizo a utilização do sangue armazenado apenas para esta pesquisa. Autorizo a utilização do sangue armazenado pa ra esta pesquisa e outras pesquisas que venham a acontecer, que envolvam reprodução assistida. São meus direitos: 1. Possuir uma cópia deste documento, ficando outra igual com o pesquisador responsável; 2. A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida acerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros relacionados com a pesquisa para a qual sou voluntária; 3. A liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, em qualquer fase dele, sem penalização alguma e sem que isso traga prejuízo ao meu cuidado; 4. A segurança de que não serei identificada e qu e será mantido o cará ter confidencial da informação relacionada com a minha privacidade; 5. O compromisso de me proporcionar informação atualizada durante o estudo, ainda que esta possa afetar minha vontade de continuar participando. Ribeirão Preto (SP), ____ de _________________ de 2006. __________________________________________ VOLUNTÁRIA ________________________________________________ Dra Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva Pesquisadora responsável