Avaliação das células iNKT em pacientes com endometriose

........................................................................................................ xix 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 1 1.1 Considerações gerais sobre o sistema imunológico ........................... 6 1.2 Considerações sobre os sistemas imunológico e a endometriose ... 14 1.3 As células Natural Killer .................................................................... 17 1.4 Subtipos de células iNKT .................................................................. 22 1.5 Células iNKT e endometriose ........................................................... 26 2. OBJETIVOS ........................................................................................... 27 3. MÉTODOS ............................................................................................. 29 3.1 Critérios de inclusão e exclusão ....................................................... 31 3.2 Dinâmica do estudo .......................................................................... 32 3.3 Quadro clínico ................................................................................... 33 3.4 Estadiamento da endometriose ........................................................ 34 3.5 Locais da endometriose .................................................................... 36 3.6 Confirmação da endometriose .......................................................... 36 3.7 Obtenção das células mononucleares do sangue periférico ............. 37 3.7.1 Sangue heparinizado .............................................................. 37 3.8 Análise dos marcadores de células iNKT por citometria de fluxo ..... 37 3.8.1 Descongelamento das células mononucleares do sangue periférico (CMSP) ................................................................. 37 3.8.2 Imunofenotipagem de superfície celular em células mononucleares do sangue periférico .................................... 38 3.8.3 Estimulação das células iNKT para medição de citocinas ...... 44 viii 3.8.4 Marcação por imuinofluorescência na microscopia confocal .. 45 3.9 Análise estatística ............................................................................ 46 4. RESULTADOS ...................................................................................... 49 4.1 Dados demongráficos e clínicos ...................................................... 49 4.2 Estadiamento da endometriose ....................................................... 52 4.3 Análise das frequências das células iNKT ....................................... 53 4.4 Análise das frequências dos subtipos de células iNKT .................... 55 4.5 Análise das frequências das células inkt e subtipos em relação aos sintomas da endometriose ...................................................... 58 4.6 Análise das células inkt e o estádio da endometriose ..................... 66 4.7 Avaliação das células iNKT nas lesões de endometriose ................ 74 5. DISCUSSÃO .......................................................................................... 76 6. CONCLUSÕES ...................................................................................... 87 7. ANEXOS ................................................................................................ 90 8. REFERÊNCIAS ................................................................................... 112 ix Listas Abreviaturas α-GalCer α-galactosylceramida APC Antigen Presenting Cells (Células Apresentadoras de Antígenos) AR Artrite reumatóide ASRM American Society of Reproductive Medicine bFGF basic fibroblast growth fator (fator de crescimento de fibroblasto básico) BSA Bovine Serum Albumin CCR Receptor de quimiocinas CD Cluster of Differentiation CIVD Common variable immunodeficiency (imunodeficiência comum variável) CLTs Cytotoxic T Lymphocytes (Linfócitos T citotóxicos) CXCR CXC chemokine receptor (CXC receptor de quimiocinas) DAPI 4′,6-diamidino-2-phenylindole DMEM Dulbecco modified eagle medium DMSO Dimethyl Sulfoxide DN Duplo negativo EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (Ácido etilenodiamino tetra- acético) EVA Escala visual analógica FACSDiva fluorescence-activated cell sorting Diva FSC Forward-scattered light GnRH Hormônio liberador de gonadotrofinas HE Hematoxilina-Eozina HIV Human Immunodeficiency Virus (Vírus da imunodeficiência humana) HLA Human leukocyte antigen (Antígeno leucocitário humano) x HTLV Human T-Cell Lymphotropic Virus (Vírus linfotrófico da célula T humana) IFN-gama Interferon gama Ig Imunoglobulina IgA Imunoglobulina A IgD Imunoglobulina D IgE Imunoglobulina E IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M IL Interleucina IL-17R Receptor de Interleucina 17 IL-1Ra IL-1 receptor antagonista (antagonista do receptor da interleucina 1) IMC Indice de massa corporea iNKT Invariant Natural Killer T (Natural Killer T invariante) IP interferon-inducible protein (proteína 10 induzida por interferon) LES Lupus Eritematoso Sistemico MHC Major Histocompatibility Complex (Complexo Maior de Histocompatibilidade) NK Natural Killer iNKT Natural Killer T NKG2D Receptor de ativação das células NK NKTDN Natural Killer T duplo negativo (CD4- e CD8-) NKTDP tural Killer T duplo positivo (CD4+ e CD8+) PBS Phosphate buffered saline PDGF Platelet derived growth fator (Fator de crescimento derivado de plaquetas) SSC Side-scattered light TCR T Cell Receptor (Receptor de Céluls T) TGFβ Transforming Groth Factor - β (Fator de Crescimento Transformante – β) Th T helper TNF-α Tumor Necrosis Factor - alpha (Fator de Necrose Tumoral – alfa) Treg Células T reguladoras xi Vα24 Receptor de células iNKT Vβ11 Receptor de células iNKT VEGF Vascular Endothelial Growth Factor (Fator de Crescimento Vascular endotelial) xii Figuras Figura 1 - Classificação de endometriose da American Society for Reproductive Medicine, revisada em 1996 ............................. 35 Figura 2 - A - Endometriose profunda de retossigm oide aderida à região retrocervical. B - Endometriose profunda de região retrocervical, envolvendo os ligamentos útero -sacros bilaterais. ................................................................................. 36 Figura 3 - Representação gráfica de Imunofenotipagem. Density Plot de citometria de fluxo de linfócitos ( 3a), seleção de gate para análise de viabilidade celular ( 3b), seleção de gate de linfócitos CD3 para CD4+ e CD8+ ( 3c) e células natural Killer T (iNKT) (3d). ..................................................... 41 Figura 4 - Representação gráfica de Imunofenotipagem. Density Plot citometria de fluxo de linfócitos C D3 ( 4a), CD3+CCR7+ (4b) e CD3+CD25+ ( 4c). Density Plot de citometria de fluxo de linfócitos CD4+ e CD8+ ( 4d), seleção de gate de linfócitos CD8+CCR7+ ( 4e), CD8+CD25+ ( 4f) e linfócitos CD4+CCR7+ (4g) e CD4+CD25+ (4h). .................................. 42 Figura 5 - Representação gráfica de Imunofenotipagem de células iNKT e seus sub-tipos (5b – 5h). Density Plot de citometria de fluxo de células iNKT com marcadores Vbeta11 e Valpha24 (5a), seleção de gate de células iNKT CD4+ e iNKT CD8+ ( 5b), seleção de gate de células iNKT CD8+ CCR7+ (5c) e iNKT CD8+ CD25+ ( 5d), seleção de gate de células iNKT DN CCR7+ ( 5e) e iNKT DN CD25+ ( 5f), seleção de gate de células iNKT CD4+CCR7+ (5g) e iNKT CD4+CD25+ (5h). ................................................................... 43 Figura 6 - Imunocoloração confocal de células iNKT em lesões de endometriose. (A) Mesclagem representativa de células coradas marcadas com CD3 (vermelho), CD1D (verde), CD4 (amarelo) e DAPI (azul) de áreas saudáveis e áreas de endometriose. (B) Porcentagem de células iNKT em áreas saudáveis e endometriose do tecido (n = 9). ................ 74 xiii Gráficos Gráfico 1 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose. ......................................................................... 54 Gráfico 2 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintomas clínicos de dismenorréia com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA. ............................. 59 Gráfico 3 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de dor pélvica acíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA. ........................................................ 62 Gráfico 4 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT CD4+ IL17+ no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e intensidade de sintoma de dor pélvica acíclica. ...................... 62 Gráfico 5 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de dispareunia com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA.... ................................................................... 63 Gráfico 6 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de alteração intestinal cíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA. ..................................... 64 Gráfico 7 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de alteração urinária cíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA. ..................................... 65 Gráfico 8 - Médias das frequências d e células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo estádio I/II ou II I/IV da doença nas pacientes com endometriose profunda. ........................... 67 xiv Gráfico 9 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e grupo controle na fase secretora do ciclo menstrual. .................................................. 72 Gráfico 10 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT e células CD3+ no tecido com lesão de endometriose e tecido normal sem lesão de endometriose. ......................................................................... 75 xv Quadros Quadro 1 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT DN (A) e iNKT DN IL17+ (B) no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose .......... 57 Quadro 2 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT CD4+ CCR7+ ( A) e iNKT CD4+ IL17+ (B) no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e intensidade de sintoma de dismenorréia. .......................................................................... 60 Quadro 3 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células (A) iNKT CD4+ CD25+ na fase proliferativa em pacientes com endometriose e grupo controle; ( B) iNKT DN na fase proliferativa em pacientes com endometriose e grupo controle; ( C) iNKT DN CD25+ em pacientes com endometriose profunda na fase proliferativa e secretora do ciclo menstrual; ( D) iNKT DN IL17+ na fase secretora em pacientes com endometriose e grupo controle ...................................................................... 73 xvi Tabelas Tabela 1 - Intensidade de secreção de citocinas pelos subtipos de células iNKT CD4+, DN e CD8+ após estimulação. Adaptado de O'Reilly et al., 2011. ........................................... 24 Tabela 2 - Avaliação de semelhança dos dados clínicos de idade, índice de massa corpórea e fase do ciclo menstrual entre as pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose. ......................................................................... 49 Tabela 3 - Avaliação de semelhança dos sintomas clínicos entre as pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose .......................................................................... 51 Tabela 4 - Avaliação de semelhança em relação ao estádio da endometriose entre as pacientes com endometriose profunda infiltrativa .................................................................. 52 Tabela 5 - Descrição das médias das frequên cias das células iNKT no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e resultado da comparação entre os grupos. ............................. 53 Tabela 6 - Descrição das médias das frequências dos subtipos de células iNKT CD4+, DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 no sangue periférico s egundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e resultado da comparação entre os grupos. Resultados em média e desvio padrão. .................................. 55 Tabela 7 - Descrição das médias das frequências dos subtipos de células iNKT secretoras de IL -6, IL-10 e IL -17 no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e resultado da comparação entre os grupos. Resultados em média e desvio padrão. ........................................................... 56 Tabela 8 - Descrição das médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa (grupo endometriose) e sem endomet riose (grupo controle ) e a fase do ciclo menstrual. Resultado da comparação entre os grupos e entre as fases do ciclo menstrual. ....................... 70 xvii Resumo Corrêa FJS. Avaliação das células iNKT em pacientes com endometriose [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2018. Introdução: A endometriose é uma doença com características inflamatórias que atinge as mulheres em idade reprodutiva. A patogênese da endometriose não está esclarecida. Tem sido demonstrada associação entre distúrbios imunológicos e endometriose, como alterações nos macrófagos, células NK, citocinas e nas r epostas Th1, Th2 e Th17. As células iNKT, um tipo especial de linfócitos T, tem importante papel na resposta inflamatória como mediadores das repostas Th1, Th2 e Th17. Objetivos: o objetivo principal deste estudo foi comparar as frequências das células iNKT e seus subtipos entre pacientes com endometriose e pacientes sem endometriose. Procuramos também comparar as frequências destas células em ambos os grupos relacionando com alguns os aspectos clínicos e cirúrgicos da doença. Métodos: Realizamos estudo tra nsversal, prospectivo entre fevereiro de 2013 a fevereiro de 2015 que avaliou a porcentagem de células iNKT e os subtipos iNKT CD4+, iNKT CD4+ CCR7+, iNKT CD4+ CD25+, iNKT DN, iNKT DN CCR7+, iNKT DN CD25+, iNKT CD4+ IL6+, iNKT CD4+ IL10+, iNKT CD4+ IL17+, iNKT CD8+ IL6+, iNKT CD8+ IL10+, iNKT CD8+ IL17+, iNKT DN IL6+, iNKT DN IL10+, iNKT DN IL17+ no sangue periférico, por citometria de fluxo, em pacientes com endometriose profunda (n = 47) e sem endometriose (n = 26). As frequências de células iNKT e seus subtipos foram comparadas entre os grupos de acordo com os sintomas, fase do ciclo, estádio da doença e classificação histológica. Resultados: Na avaliação da frequência das células iNKT, iNKT DN e iNKT DN IL17+ foi evidenciada diminuição significativa nas pacientes com endometriose (p=0,010, p=0,020, p=0,050; respectivamente). Além disso, foi observada diminuição significativa nas frequências das células iNKT CD4+ CCR7+ e aumento significativo das células iNKT CD4+ IL -17+ em pacientes com endometriose e dis menorréia severa em comparação a dismenorréia ausente/leve. Nas pacientes com endometriose e dor acíclica severa observou-se diminuição significativa da frequência das células iNKT CD4+ IL17+ em comparação a dor acíclica ausente/leve (p=0,048). Houve diminuição das células iNKT nas pacientes com endometriose em relação ao grupo controle na fase secretora do ciclo menstrual (p=0,030). Na avaliação da fase do ciclo menstrual foi observado na fase proliferativa aumento significativo na frequência das células iNKT CD4+ CD25+ (p=0,022) e diminuição significativa das células iNKT DN (p=0,011) nas pacientes com endometriose. Na fase secretora foi evidenciado diminuição significativa na frequência das células iNKT DN IL17+ (p=0,049) nas pacientes com endometriose. F oi identificado também nas pacientes com endometriose uma diminuição na frequência das células iNKT DN CD25+ na fase xviii secretora em relação a fase proliferativa do ciclo menstrual. Conclusões: As células iNKT e os subtipos iNKT DN e iNKT DN IL17+ se mostrar am alteradas nas pacientes com endometriose profunda. Subtipos específicos de células iNKT estão alteradas nas pacientes com endometriose profunda em pacientes com dismenorréia e dor acíclica severas. As fases do ciclo menstrual estão relacionadas a alteração nas frequências das células iNKT e dos subtipos iNKT CD4+ CD25+, iNKT DN, iNKT DN IL17+ e iNKT DN CD25+ nas pacientes com endometriose profunda. Estes resultados sugerem participação das células iNKT no desenvolvimento da endometriose. Descritores: endometriose; células T matadoras naturais; interleucinas; citometria de fluxo; microscopia confocal; dor pélvica. xix

Corrêa FJS. Evaluation of iNKT cells in patients with endometriosis [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2018.

Endometriosis is a disease with inflammatory characteristics that affects women of reproductive age. The pathogenesis of endometriosis is unclear. There has been an association between immune disorders and endometriosis, such as changes in macrophages, NK cells, cytokines, and Th1, Th2 and Th17 responses. iNKT cells, a special type of T lymphocytes, play an important role in the inflammatory response as mediators of the Th1, Th2 and Th17 responses. Objectives: The main ob jective of this study was to compare the frequencies of iNKT cells and their subtypes between patients with endometriosis and patients without endometriosis. We also compare the frequencies of these cells in both groups relating to some clinical and surgic al aspects of the disease. Methods: We performed a prospective cross -sectional study between February 2013 and February 2015, which evaluated the percentage of iNKT cells and iNKT CD4+, iNKT CD4+ CCR7+, iNKT CD4+ CD25+, iNKT DN, iNKT DN CCR7+, iNKT DN CD25+, iNKT CD4+ IL6+ , iNKT CD8+ IL17+, iNKT DN IL6+, iNKT DN IL10+, iNKT DN IL17+ in the peripheral blood, by flow cytometry, in patients with deep endometriosis (n = 47), iNKT CD4+ IL10+, iNKT CD4+ IL17+, iNKT CD8+ ) and without endometriosis (n = 26). The frequencies of iNKT cells and their subtypes were compared between groups according to symptoms, stage of the cycle, stage of the disease and histological classification.

iNKT, iNKT DN and iNKT DN IL17+ cells showed significant decrease in patient s with endometriosis (p = 0.010, p = 0.020, p = 0.050, respectively). In addition, a significant decrease in iNKT CD4+ CCR7+ cell numbers and a significant increase of iNKT CD4+ IL17+ cells were observed in patients with endometriosis and severe dysmenorrhea compared to absent / mild dysmenorrhea. In patients with endometriosis and severe acyclic pain, there was a significant decrease in the frequency of iNKT CD4+ IL17+ cells compared to absent / mild acyclic pain (p = 0.048). There was a decrease in iNKT cells in patients with endometriosis compared to the control group in the secretory phase of the menstrual cycle (p = 0.030). In the menstrual cycle, a significant increase in iNKT CD4+ CD25+ cells (p = 0.022) and a significant decrease in iNKT DN cells (p = 0.011) was observed in the proliferative phase in patients with endometriosis. In the secretory phase there was a significant decrease in the frequency of iNKT DN IL17 + cells (p = 0.049) in patients with endometriosis. It was also identified in patients with endometriosis a decrease in the frequency of iNKT DN CD25+ cells in the secretory phase in relation to the proliferative phase of the menstrual cycle.

iNKT cells and subtypes iNKT DN e iNKT DN IL17+ have been altered in patients with dee p endometriosis. Specific subtypes of iNKT cells are altered in patients with deep endometriosis in patients with severe xx dysmenorrhea and acyclic pain. The phases of the menstrual cycle are related to changes in the frequencies of iNKT cells and subtypes iNKT CD4+ CD25+, iNKT DN, iNKT DN IL17+ and iNKT DN CD25+ in patients with deep endometriosis. These results suggest the participation of iNKT cells in the development of endometriosis. Descriptors: endometriosis; natural killer T -cells; interleukins; fl ow cytometry; microscopy, confocal; pelvic pain. 1 1 Introdução Introdução 2 1 INTRODUÇÃO A endometriose é caracterizada pela presença de glândulas endometriais e/ou estroma fora da cavidade uterina, que acomete, principalmente, mulheres no períod o reprodutivo ( Giudice; Kao, 2004). Carl Von Rokitansky, em 1860, descreveu, pela primeira vez focos de endométrio ectópico em peças de autópsia, caracterizando a endometriose . Entretanto, estudos históricos relatam sintomas sugestivos da doença encontrados em mulheres há mais de dois mil anos ( Nezhat et al., 2012). Estima-se que 10% a 15% das mulheres no período reprodutivo tenham endometriose, mas esta pode ser encontrada em 2 a 4% das mulheres após a menopausa (Strathy et al., 1982; Moen, 1991). A doença tem impacto severo em relação ao bem - estar geral, físico, mental e social das mulheres acometidas ( Damario; Rock, 1995; Ferrero et al., 2005; Luisi et al., 2009; Bassi et al., 2011). Dismenorréia, dispareunia profunda, dor pélvica crônica, sangramento anormal e infertilidade são os principais sintomas associados à endometriose ( Kennedy et al., 2005 ). Sintomas intestinais como disquezia, hematoquezia, obstipação, tenesmo, distensão abdominal e sintomas urinários como polaciúria, dor ao urinar e hematúria, também, podem ocorrer dependendo da localiza ção das lesões nesses órgãos ( Abrao et al., 1994 ; Kennedy et al., 2005 ; Giudice, 2010 ). Os primeiros sintomas da endometriose manifestam-se na adolescência antes dos 15 anos em 38%, e, antes dos 20 anos em, aproximadamente, 66% das mulheres acometidas Introdução 3 (Ballweg, 2003). O início precoce dos sintomas e a pouca importância dada ao sintoma de dismenorréia pelos profi ssionais de saúde e pela própria paciente contribuem para longo tempo entre o início do qu adro clínico e o diagnóstico da doença. Arruda et al. (2003) demonstraram que o tempo para o diagnóstico da endometriose desde o início dos sintomas é de 7 anos e 12,1 anos, em média, quando os sintomas iniciaram antes dos 19 anos de idade. A falta de um exame não invasivo, factível e com boa acurácia é um dos fatores que contribuem para o retardo no diagnóstico (Arruda et al., 2003; Ballard et al., 2006 ; Garry, 2006; Nnoaham et al., 2011 ; Riazi et al., 2015). As lesões de endometriose se apresentam de formas e localizações variadas, o que dificulta a sua padronização e classificação. A doença pode ser dividida em profunda ou superficial quando apresenta mais ou menos de cinco milímetros de diâmetro, respectivamente, d e acordo com a definição de Cornillie ( Cornillie et al., 1990 ). Em 1997, com objetivo de facilitar a padronização da doença, Nisolle e Donnez propuseram uma classificação da endometriose em três tipos: a endometriose peritoneal, a endometriose ovariana e a endometriose do septo retovaginal. A doença pe ritoneal foi caracterizada pela presença de lesões superfi ciais no peritônio; a doenç a ovariana foi descrita pela presença de endometriose superficial ou os cistos de endometriose conhecidos como endometrioma; e a doença do septo retovaginal, foi caracterizada por lesões que acomet eriam as regiões retrocervical, paracervical, o septo retovaginal, o retossigmoide, os ureteres e a bexiga de forma infiltrativa e profunda com lesões maiores do que cinco Introdução 4 milímetros em profundidade ( Nisolle; Donnez, 1997 ). Várias classificações para endometriose já foram propostas por diversos autores ( ASRM, 1997; Adamson, 2011; Haas et al., 2013). A classificação proposta pela associação americana de medicina reprodutiva (ASRM), revisada em 1996, mais amplamente utilizada nos estudos sobre endometriose propõe a divisão da doença em quatro estádios (estádio I – mínima, estádio II – leve, estádio III – moderada e estádio IV – severa) de acordo com os achados cirúrgicos (ASRM, 1997). Essa classificação foi desenvolvida, principalmente, para avaliar o impacto na fertilidade da mulher, mas sua correlação com a intensidade de dor é fraca (Canis et al., 1993 ; ASRM, 1997; Vercellini et al., 2007). Em função da diversidade de sinais, sintomas e var iedade de lesões que envolvem a doença, diagnóstico clínico da endometriose é difícil e incerto. Pesq uisas sobre o diagnóstico da endometrios e são realizadas comparando-se as manifestações clínicas, as técnicas de imagem, marcadores biológicos e as técnicas cirúrgicas (Scarselli et al., 2005; Riazi et al., 2015 ). Entretanto, a laparoscopia com visualização das lesões e confirmação histológica da presença de glândulas e estroma endometriais ainda é o método de escolha para o diagnóstico de endometriose ( Nnoaham et al., 2012 ; Fassbender et al., 2015 ). O quadro clínico é importante em relação à definição de quais pacientes devem ser submetidas a uma investigação mais profunda e específica para endometriose. No exame físico, o toque vag inal bimanual apresenta acurácia de 63% e 55% no diagnóstico da endometriose de reto -sigmoide e retrocervical, Introdução 5 respectivamente ( Abrao et al., 2007 ). Os diversos tipos de marcadores investigados para o diagnóstico da endometriose avaliados isoladamente ou em painéis apresentam baixa acurácia e não tem aplicação clínica ( May et al., 2010). A ressonância nuclear magnética e a ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal tem excelente acurácia e aplicação clínica no diagnóstico das lesões de endometriose infiltrativa profunda e dos endometriomas ovarianos (Abrao et al., 2007; Bazot; Darai, 2008; Gonçalves et al., 2009 ). A ultrassonografia transvaginal é o exame de imagem que apresenta a melhor relação custo -benefício na endometriose profunda e ovariana e, portanto, a primeira escolha no diagnóstico da doença ( Abrao et al., 2009; Gonçalves et al., 2010). Apesar de a doença ter sido descrita há mais de um século e meio, a patogênese da endometriose, ainda, não foi esclarecida. Várias teorias foram propostas para explicar o desenvolvimento da doença. A principal hipótese d a patogênese da endometriose baseia -se em algumas teorias, dentre as quais é possível destacar duas de maior relevância: a teoria da metaplasia celômica e a teoria da menstruação retrógrada. Uma das teorias mais antiga s, a da metaplasia, proposta por Meyer em 1919, sugere que, sob diversas influências, o tecido celômico poderia se transformar em endométrio (Vinatier et al., 2001 ; Vercellini et al., 2014 ). A teoria mais citada na literatura, proposta por Sampson em 1927, pro põe que o fenômeno fisiológico do refluxo de endomé trio pelas trompas uterinas durante a menstruação poderia, em certas condições, sobrepor aos mecanismos de defesa locais, implantar e proliferar ( Sampson, 1927 ). As razões para a Introdução 6 ocorrência da endometriose são provavelmente n umerosas e envolvem o endométrio, o sistema imunológico, o peritônio e as tubas uterinas ( Vinatier et al., 2001). 1.1 Considerações gerais sobre o sistema imunológico Existem, fundamentalmente, dois tipos de resposta imune com características diferentes, a inata e a adquirida ( Delves; Roitt, 2000a; Yatim; Lakkis, 2015). A resposta imune inata proporciona a primeira linha de defesa contra microrganismos. Os principais componentes utilizados na resposta imune inata são as barreiras físicas e químicas como o epitélio e as substâncias produzidas na sua superfície; as células fagocíticas como os neutrófilos, monócitos e macrófagos; as células que l iberam mediadores inflamatórios como os basófilos, mastócitos e eosinófilos; e as células NK responsáveis pela destruição dos microrganismos ( Flajnik; Kasahara, 2010 ; Beaulieu et al., 2015). Os componentes molecula res da resposta imune inata incluem o complemento, proteínas de fase aguda e citocinas (Delves; Roitt, 2000a). A resposta imune adquirida é um modelo de resposta mais elaborada que envolve a prol iferação de linfócitos B e T que ocorre quando os receptores de superfície dessas células se ligam aos antígenos estranhos ao organismo (Delves; Roitt, 2000b). Uma característica desse tipo de resposta imunológica é o mecanismo de memória imunológica e a sua capacidade de melhorar a resposta após exposições repetidas ao antígeno. As células B Introdução 7 secretam imunoglobulinas, os anticorpo s antígeno-específicos responsáveis pela eliminação dos microrganismos extracelulares. Os linfócitos T auxiliam os linfócitos B a produzir anticorpos e podem erradicar patógenos intracelulares ativando os macrófagos e matando as células infectadas (Delves; Roitt, 2000b; Silverstein, 2003; Balenga; Rafati, 2007; Litman et al., 2010). Os linfócitos humanos podem ser divididos em três categorias principais baseados em suas funções biológicas e presença de determinados antígenos de superfície, os Linfócitos B, os Linfó citos T e as células NK (Brandtzaeg, 1996; Abbas, 2012). Os linfócitos apresentam em sua membrana celular, proteínas que são utilizadas como marcadores fenotípicos na distinção funcional das diferentes populações de linfócitos, denominados Cluster of Differentiation (CD) (Zola, 2001; Abbas, 2012). Os linfócitos B são os responsáveis pela resposta imune humoral por meio da produção de anticorpos, que são proteínas (imunoglobulinas) divididas em cinco classes, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE de acordo com a sequência de aminoácidos na região constante da ca deia pesada (Ramanarayanan, 1985; Delves; Roitt, 2000a; Abbas, 2012). Os linfócitos T são células relacionadas a imunidade celular, com capacidade de reconhecer antígenos de microrganismos intracelulares e destruí-los ou às células infectadas. Esses linfócitos possuem, em sua membrana, moléculas que at uam como receptores de antígenos distintas dos anticorpos. As células T apresentam uma especificidade no reconhecimento dos antígenos. Apenas antígenos, ligados a proteínas do Introdução 8 hospedeiro codificadas pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC – Major Histocompatibility Complex ) e que se expressam na superfície de outras células, são reconhecidos pelos linfócitos T ( Borrego et al., 2002 ; Goldberg; Rizzo, 2015a, Goldberg ; Rizzo, 2015b). De acordo com as suas funções, os linfócitos T são divididos em subpopulações, sendo as populações mais bem caracterizadas as células T Helper (Th) ou auxiliadores e os linfócitos T citolíticos ou citotóxicos (CLTs). Após estimulação antigênica, as células Th secretam citocinas que têm a função de estimular a proliferação e diferenciação das células T, a ativação de células B, dos macrófagos e de outros leucócitos. Os linfócitos Th, em relação aos antígenos de superfície, são CD3+CD4+CD8 -, sendo, assim, identificados fenotipicamente (Onoe et al., 2007). Os CLTs são responsáveis por destruir as células infe ctadas por vírus e outros microrganismos intracelulares que produzem antígenos estranhos. Esses linfócitos são identificados pelos antígenos de superfície CD3+CD4 -CD8+. Alguns linfócitos T têm como função principal inibir as respostas imunológicas e são chamadas de células T reguladoras (Treg) ( Delves; Roitt, 2000a ; Delves; Roitt, 2000b; Langier et al., 2010 ; Abbas, 2012; Benoist; Mathis, 2012; Barbi et al., 2013; Rothstein; Camirand, 2015) A terceira classe de linfócitos são as células NK que constituem 5% a 20% das células mononucleares no sangue e no baço, mas são raras nos órgãos linfoides ( Barao; Ascensao, 1998). As células NK são derivadas de precursores da medula óssea, mostram -se como linfócitos grandes com grânulos citoplasmáticos numerosos e com antígenos de superfície CD3 - Introdução 9 CD56+CD16+ (Moretta et al., 2002a, Moretta et al., 2002b; Caligiuri, 2008). Entretanto, em função da diferença de fenótipos de superfície e linhagem celular, essas células não constituem linfócitos T, tampouco linfócitos B, além de não expressarem receptores antigênicos semelhantes às células T e B. As células NK reconhecem as células infectadas destruindo -as diretamente e secretando citocinas inflamatórias. Esses linfócitos NK são, ainda, uma fonte importante de Interferon gama (IFN -gama) que ativa os macrófagos para destruir os microrganismos fagocitados ( Moretta et al., 2002a, Moretta et al., 2002b ; Caligiuri, 2008 ). As principais citocinas do sistema imune inato que estimulam as funções das células NK são as IL-12, IL-15, IL-18 e o IFN -gama. Essas citocinas aumentam a atividade citotóxica das células NK e a quantidade de IFN -gama secretada por estas ( Delves; Roitt, 2000a; Delves; Roitt, 2000b; Sinkovics; Horvath, 2005; Abbas, 2012). A resposta imune inata, além de fornecer a primeira defesa contra microrganismos, também, inicia a resposta imune adaptativa por meio de sinais que induzem em associa ção com o antígeno a proliferação e a diferenciação de linfócitos T e B com especificidade aos antígenos. O sistema imune adaptativo utiliza três estratégias principais para combater a maioria dos microrganismos: o reconhecimento dos antígenos pelos linfócitos; a imunidade celular com ativação dos linfócitos T e eliminação dos microrganismos intracelulares e a imunidade humoral com ativação dos linfócitos B e eliminação dos microrganismos extracelulares ( Delves; Roitt, 2000a; Delves; Roitt, 2000b; Abbas, 2012). Os antígenos são apresentados aos linfócitos pelas células apresentadoras de antígenos (APC – do inglês – Introdução 10 antigen presenting cells ). As células dendríticas são as APCs mais especializadas com função de capturar os antígenos microbianos e os transportar até os órgãos li nfoides e apresentá -los aos linfócitos T. Os linfócitos ativados pelos antígenos desencadeiam vários mecanismos com a função de eliminá -los. Os linfócitos Th ativados se transformam em células efetoras cujas funções são mediadas em grande parte pelas citoc inas secretadas (Delves; Roitt, 2000a; Delves; Roitt, 2000b; Abbas, 2012). Uma delas é a interleucina 2 (IL -2), que atua como fator de crescimento sobre os linfócitos Th CD4+ ativados por antígenos e estimula a sua proliferação em forma de expansão clonal. Esses linfócitos efetores deixam os órgãos linfóides e migram para os locais de infecção e inflamação. Outras células Th CD4+ efetoras secretam citocinas que recrutam leucócitos e que estimulam a produção de substâncias microbicidas nos fagócitos ajudando - os a destruir os microrganismos. Os linfócitos CD8+ ativados diferenciam -se em CLTs que destroem as células com microrganismos no citoplasma e eliminam os reservatórios da infecção. Os linfócitos B ativados proliferam e diferenciam-se em células secretoras de anticorpos (Abbas, 2012). Para a adequada resposta os linfócitos B aos antígenos proteicos, há necessidade de sinais ativadores dos linfócitos Th CD4+. Uma parcela das células B diferenciam -se em plasmócitos secretore s de anticorpos. Os anticorpos se ligam a microrganismos e os impedem de infectar outras células do organismo ou colonizar os tecidos. A imunoglobulina G (IgG) recobre os microrganismos e os transformam em alvos para a fagocitose por neutrófilos e macrófag os. Paralelamente, as imunoglobulinas G e M (IgG e Introdução 11 IgM) ativam o sistema complemento cujos produtos promovem a fagocitose ou a destruição direta dos microrganismos (Abbas, 2012). Existe uma classificação de células T CD4+ de acordo com suas características funcionais como o tipo de citocinas que elas produzem (Forsthuber; Ji, 2007; Abbas, 2012). Três tipos principais de células T CD4+, ou seja, Th1, Th2 e Th17, funcionam na defesa do hospedeiro contra diferentes tipos de microrganismos e estão envolvidos em tipos diferentes de lesão ao tecido nas patologias imunomediadas (Mosmann, 1989; Forsthuber; Ji, 2007 ; Abbas, 2012 ). Essas células se diferenciam a partir de células T virgens em resposta a determinadas citocinas presentes no início das respostas imunes. Da mesma forma, as células Th1, Th2 e Th17 expressam diferentes proteínas de superfície que determina fenótipo diverso entre elas (Abbas, 2012 ). Vários estudos têm demonstrado que a resposta anormal com a perda do equilíbrio entre as respostas Th1, Th2 e Th17 pode estar associada a uma varieda de de doenças como o lúpus eritematoso, o mieloma múltiplo, a dermatite atópica, a pré -eclâmpsia, a osteoporose, a uveíte, a artrite reumatóide, a asma e a endometriose ( Serrano Hernandez, 2009; Andreoli et al., 20 11; Santodomingo-Garzon; Swain, 2011; Dolff et al., 2011; Shi et al., 2011 ; Campanati et al., 2014 ; Zhang et al., 2014 ; Batista et al., 2015; Feng et al., 2015; Talaat et al., 2015; Vargas-Rojas et al., 2015). As células Th1 se diferenciam induzidas, principalmente, pelas citocinas IL -12 e IFN -gama em reposta a microrganismos que ativam as células dendríticas, macrófagos e células NK. Os principais microrganismos cujos antígenos estimulam essa diferenciação são as bactérias Introdução 12 intracelulares, as micobactérias e alguns parasitas capazes de infectar células dendríticas e macrófagos. Essas cél ulas desenvolvidas secretam IFN-gama que amplifica o padrão induzido ao promover mais diferenciação em Th1. O IFN-gama, ainda, pode inibir a diferenciação de células T virgens nos subtipos Th2 e Th17, promovendo, então, a polarização de resposta imune em u ma direção. A principal citocina produzida pelas células Th1 efetoras é o IFN -gama que participa da resposta imune por meio de um conjunto de ações como a ativação dos macrófagos que culmina na destruição por estes, dos microrganismos fagocitados. Outras c itocinas produzidas pelas células Th1 são o fator de necrose tumoral (TNF do inglês – tumor necrosis factor ) e a IL -10. O TNF e as diversas quimiocinas produzidas pelas células Th1 contribuem para o recrutamento de leucócitos e aumento da inflamação. A IL -10 atua, principalmente, inibindo as células dendríticas e os macrófagos suprimindo, portanto, a reposta Th1, caracterizando uma resposta com feedback negativo ( Abbas, 2012; Ahn et al., 2015 ; Kralickova; Vetvicka, 2015 ). As células Th1 têm importante atuação imunológica nas doenças autoimunes e dano ao tecido associado a infecções crônicas. As células Th2, por sua vez, se diferenciam pelo estímulo da citocina IL-4 em resposta aos antígenos do helmintos e de alergenos, que causam estimulação crônica das células T. Essas células respondem ao estímulo crônico e persistent e por patógenos e antígenos com pouca inflamação e pouca produção de citocinas pró-inflamatórias, diferentemente das respostas Th1 e Th17 em que há muita inflamação ( Abbas, 2012 ). As células Th2 Introdução 13 expressam, em sua superfície, os genes das citocinas IL -4, IL-5 e IL -13. A IL-4 produz um feedback positivo em relação às células Th2, aumentando sua diferenciação, amplificando sua reação. Além disso a produção dessa citocina tem a função de inibir o desenvolvimento das células e respostas Th1 e Th17. Essa citocina é o maior estimulo à produção de anticorpos IgE pelas células Th2. A IgE é muito importante na resposta imune mediada por eosinófilos contra infecções por helmintos, além de mediar as reações de hipersensibilidade como as alergias ( Damsker et al., 2010 ; Abbas, 2012). A IL-13 tem ação semelh ante à da IL -4 com produção de efeitos biológicos associados à inflamação alérgica e à defesa contra helmintos. A associação da IL -13 com a IL -4 induz à ativação dos macrófagos alternativos que contribuem para a reparação de tecidos e fibrose. A IL-5 tem como principais ações ativar os eosinófilos maduros e estimular o crescimento e diferenciação de eosinófilos. Essa citocina, ainda, serve como ligação principal entre a ativação das células T e a inflamação por eosinófilos (Abbas, 2012). Nos últimos anos, houve grande interesse em relação a estudos sobre as células Th17, descobertas há menos t empo que as Th1 e Th2 (Forsthuber; Ji, 2007 ; Andreoli et al., 2011 ). As principais citocinas produzidas pelos linfócitos Th17 são a IL -17, IL -22 e a IL -21. As células Th17 efetoras têm papel de induzir a inflamação por neutrófi los para destruir bactérias e fungos extracelulares. Além disso, estudos demonstraram a importância dessas células para o patogênese de doenças inflamatórias como a psoríase, artrite reumatoide, esclerose múltipla entre outras (Boissier Introdução 14 et al., 2008 ; Hedegaard et al., 2008 ; Meloni et al., 2009; Quaglino et al., 2011; Ekman et al., 2013; Campanati et al., 2014, ; Javadian et al., 2014; Xia et al., 2015 ). A IL-17 tem atuação como importante ligação entre o sistema imune adaptativo mediado pelas células T e o sistema imune inato por meio do seu componente inflamatório; como indutoras de reações inflamatórias ricas em neutrófilos e como estimuladora da produção de substâncias antimicrobianas. A IL -22 contribui para a inflamação loc al e para lesão tecidual, e a IL-21 tem uma grande variação de afeitos nas células B, T e NK com importante função em relação às respostas dos anticorpos e a proliferação de células T CD8+ e das células NK (Abbas, 2012). 1.2 Considerações sobre os sistemas imunológico e a endometriose Estudos revelam que o sistema imunológico está associado à patogênese da endometriose e que a falta de uma imunovigilância no peritônio é considerada fator causal comum de ssa doença. Distúrbios na homeostase imunológica podem facilitar a implantação, proliferação e angiogênese do tecido endometrial ( Oral; Arici, 1997; Matarese et al., 2003 ; Christodoulakos et al., 2007). A interação de moléculas como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e as angiopoetinas é responsável pela regulação da angiogênese. Uma variedade de citocinas tais como IL-1, IL -6 e IL -8 estimulam a expressão do VEGF nas células endometriais (Ahn et al., 2015). O estradiol tem um papel importante para a estimulação da expressão de Introdução 15 VEGF nas células endometriais ( Shifren et al., 1996 ). Vários estudos demostraram a associação de níveis elevados de VEGF e endometriose. Níveis maiores de VEGF no fluido peritoneal foram encontrados em mulheres com endometriose avançada comparados com mulheres com endometriose leve ou saudáveis ( McLaren et al., 1996b ). Foi observado, também, uma associação direta entre elevados níveis de VEGF no plasma e no fluido peritoneal com aumento da atividade proliferativa e densidade de micro-vasos nas lesões de endometriose ( Bourlev et al., 2006 ). Alguns estudos demonstraram que macrófagos peritoneais ativados e neutrófilos, também, são capazes de produzir e secretar VEGF ( McLaren et al., 1996a ; Mueller et al., 2000 ; Gargett; Masuda, 2010 ). Com base nessa s observações, pode -se concluir que alterações imunológicas de fatores e citocinas que estimulam a angiogênese no ambiente peritoneal tem relação direta com o desenvolvimento da endometriose. A endometriose está associada a uma redistribuição da população de linfócitos e da citotoxicidade das células Natural Killer (NK) e Th1, induzida pela produção de citocinas pró -inflamatórias e anti -inflamatórias do tipo Th2 (Nap et al., 2004 ; Agic et al., 2006 ; Martinez et al., 2007 ). Pacientes com endometriose têm maior efeito imunossupressor sobre a citotoxicidade das células NK, levando à diminuição da atividade citotóxica podendo permitir o desenvolvimento de f ragmentos de endométrio em lesões endometriais ectópicas (Ho et al., 1995; Somigliana et al., 1996). Alterações no número de células dendríticas estão relacionadas à endometriose. Dois estudos mostraram resultados divergentes e opostos sobre o efeito da depleção de Introdução 16 células dendríticas na endometriose. O primeiro observou aumento das lesões de endometriose ( Stanic et al., 2014 ) e o segundo uma atenuação das lesões de endometriose relacionados à depleção do número de células dendríticas (Pencovich et al., 2014). As citocinas têm um papel essencial na re sposta imune normal contra patógenos ou injurias. Vários autores já demonstraram que a desregulação no número e na função das citocinas tem sido associado à presença ou desenvolvimento da endometriose (Monsanto et al., 2016). Outros autores já demonstraram níveis aumentados de citocinas IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e TNF -α em mulheres com endometriose ( Gilmore et al., 1992; Arici et al., 1996 ; Tseng et al ., 1996 ; Harada et al., 1997 ; Antsiferova et al., 2005; Gmyrek et al., 2005; Kalu et al., 2007; Gmyrek et al., 2008; Osuga et al., 2011 ; Lambert et al., 2014 ; Malutan et al., 2015 ; Monsanto et al., 2016). Podgaec et al. identificaram um perfil pre dominante de citocinas séricas e do fluido peritoneal associado com respostas Th1 (TNF -α, IFN-γ, IL-2) e Th2 (IL -4, IL -10) em pacientes com endometriose. Os resultados sugerem que a endometriose é uma doença que envolve um comportamento inflamatório complexo com um claro componente Th2, apesar do aumento dos níveis de IFN-γ (Podgaec et al., 2007). Em um estudo similar, Fairbanks et al. (2009) avaliaram os níveis de IL -12 e IL -18 e compararam com o estádio, o local da doença e sua classificação histológica. Embora nã o existam diferenças em relação aos padrões de resposta imune Th1/Th2 e o local das lesões, sintomas clínicos específicos podem estar associados a Introdução 17 uma maior produção de citocinas específicas, com padrão de resposta imune Th1 e, também, à endometriose profu nda ( Fairbanks et al., 200 9; Podgaec et al., 2010). 1.3 As células Natural Killer T Nos últimos anos, as pesquisas sobre o papel das células T Natural Killer (Natural Killer T - NKT) têm revelado a sua importância em relação ao controle da resposta imune Th1 e Th2 e sua possível relação com algumas doenças (Au-Yeung; Fowell, 2007). As células NKT são uma subclasse de linfócitos T que expressam o receptor de células T (TCR) α/β com um repertório restrito ( Godfrey et al., 2000 ; Godfrey et al., 2005, Godfrey et al., 2010). Essas células, também, expressam uma gama muito mais limitada da região de genes de TCR variável. Em ratos, o mais expresso é um rearranjo de cadeia  TCR invariante ( V14-J18), com região CDR3 conservada e com coexpressão de V8.2, V2 ou V7. Células T similares estão presentes em humanos e outras espécies de mamíferos. Em humanos, a população homóloga de células NKT expressam um rearranjo de TCR cadeia  (V24-J18) contendo uma cadeia  (V11). Essas células são extremamente conservadas na evolução, de forma que células NKT de ratos reconhecem o CD1d humano ligado a antígeno glicolipídico e vice -versa, fato que sugere a importância dessas células em pontos críticos e únicos do sistema imune ( Dellabona et al., 1994 ; Brossay et al., 1998 ; Godfrey et al., 2004b). As células NKT compartilham as propriedades das células T e das Introdução 18 células Natural Killer (NK), e constituem cerca de 0,2% de todas as células T do sangue periférico (Godfrey et al., 2000; Macho-Fernandez; Brigl, 2015). Contrariamente aos linfócitos T e T reguladores, o TCR da célula NKT não interage com antígenos apresentados pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e cl asse II. Essas células NKT reconhecem, apenas, glicolipídeos apresentados pel o CD1d, uma molécula apresentadora de antígenos não clássica que se associa à microglobulina β2 (Kronenberg; Gapin, 2002; Godfrey; Kronenberg, 2004a). A expressão CD1d ocorre em queratinócitos epidermais na pele, e em várias outras células periféricas epiteliais ou estromais em diversos órgãos como intestino grosso, intestino delgado, estômago, esô fago, vesícula biliar, fígado, rim, pâncreas, conjuntiva, testículo e epidídimo, mama, pele e útero ( Canchis et al., 1993 ; Sieling, 2000 ; Fishelevich et al., 2006 ). Canchis et al. demonstraram, por imunoistoquímica, a presença de moléculas CD1d tanto no epitélio quanto em células e stromais no tecido endometrial ( Canchis et al., 1993 ). A expressão da molécula CD1d ao nível celular ocorre em células dendríticas, timócitos, células B, monócitos, macrófagos, células epiteliais e estromais (Balato et al., 2012). As células NKT respondem de forma diferente à produção de citocinas da resposta imune Th1 e Th2 ou citocinas regulatórias, de acordo com o glicoesfingolipídeo apresentado ( Balato et al., 2009 ; Godfrey; Kronenberg, 2004). Em virtude de reconhecerem, especificamente, apenas, antígenos glicolipídicos em associa ção ao CD1d, as células NKT reconhecem classes de antígenos ignorados pelas células T convencionais. Introdução 19 O composto mais eficiente em relação à ativação da maioria das células NKT é um glicolipídio sintético (derivado da esponja marinha) conhecido como -galactosylceramida ( -GalCer) ( Sidobre et al., 2002 ; Hayakawa et al., 2004). O complexo formado pela -GalCer e o CD1d se liga ao receptor TCR das células NKT e desencadeia a resposta destas. Outros antígenos glicolipídicos como o gangliosidio GD3, o glicofosfatidilinositol, a fosfoetanolamina e outras formas de -GalCer foram testados em sua capacidade d e estimular as células NKT (Godfrey; Kronenberg, 2004 ). As células NKT são classificadas em dois tipos principais de células, as NKT tipo I e tipo II. As células NKT tipo I, também conhecidas como células NKT clássicas, NKT V14 invariante (V 14i), ou células NKT invariantes (iNKT), são as mais estudadas e caracterizadas pelo seu receptor TCR e pelo reconhecimento do complexo CD1d + -GalCer que induz a resposta rápida essas células. As células NKT tipo II ou não clássicas diferem-se das células clássicas por apresentarem um TCR com repertório diverso e por não reconhecerem o antígeno -GalCer. Existe, ainda, um grupo heterogêneo de células “ NKT-similares” que não são CD1d restritas ( Godfrey; Kronenberg, 2004; Boyson et al., 2008). As células iNKT, rapidamente, secretarem grandes quantidades tanto citocinas Th1 incluindo IFN- e TNF quanto Th2 incluindo IL-4, IL-10 e IL-13, após estimulação do seu receptor TCR ( Taniguchi et al., 2003 ; Kronenberg, 2005; Au-Yeung; Fowell, 2007 ; Bendelac et al., 2007 ). Michel et al., em 2007, identificaram a produção de IL -17 por células iNKT estimuladas por antígenos diversos ( Michel et al., 2007 ). Em 2008, Niemeyer et al., em um Introdução 20 estudo de avaliação do perfil de expressão gênica das células iNKT identificaram aumento em relação à expressão dos genes da IL -17 e do receptor IL-17R. A descoberta desses autores caracteriza uma am pliação no espectro de ação destas células que incluem resposta Th1, Th2 e Th17. Além disso, as células iNKT têm a característica importante de servir como ligação entre o sistema imune inato e o sistema imune adaptativo. Isto se deve à capacidade destas c élulas de induzirem a ativação de subtipos de leucócitos como as células B, as células dendríticas e as células NK (Bezbradica et al., 2005). Estudos têm demonstrado a capacidade das células iNKT em mediar as funções imunes tanto pr otetoras quanto regulatórias, tais como rejeição tumoral, proteção contra microrganismos infecciosos, manutenção da tolerância aos transplantes e inibição do desenvolvimento das doenças autoimunes ( Taniguchi et al., 2003 ). Apesar da capacidade de estimular a liberação de citocinas do tipo Th1 e Th2 simultaneamente, a ativação das células iNKT pode polarizar a resposta autoimune em direção ao perfil Th1 em alguns casos e Th2 em outras condições ( Godfrey; Kronenberg, 2004 ; Balato et al., 2009). Outros estudos demonstraram que defeitos seletivos no número de células iNKT e da produção de citocinas estão presentes em indivíduos afetados por diferentes doenças, tais como diabetes tipo I, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, cirrose biliar primária, asma alérgica, esclerose múltipla, infecção pelo vírus imunodeficiência humana -1 e tuberculose pulmonar ( Yanagihara et al., 1999 ; Oishi et al., 2001 ; van der Introdução 21 Vliet et al., 2002 ; Chan et al., 2003 ; Lin et al., 2005 ; Snyder-Cappione et al., 2007; Fletcher; Baxter, 2009). Carvalho et al. demonstraram uma diminuição no número absoluto de células iNKT em pacientes com imunodeficiência comum variável (CVID) comparados ao grupo controle ( Carvalho et al., 2010). A função e a atividade de diferentes tipos de células imunológicas que medeiam a im unossupressão ou imunoregulação direcionam os resultados da resposta imune na saúde e doença. Esses tipos celulares incluem as células T regulatórias (Treg), as células supressoras derivadas da medula e as células iNKT. As células iNKT tipo I e tipo II têm importante papel em relação à indução ou prevenção de doenças autoimunes, inflamação e câncer ( Kumar; Delovitch, 2014 ). Os efeitos patogênicos e protetores das células iNKT e seus subtipos, após a est imulação agonista in vivo são determinados, principalmente, pelo momento da ativação, pela estrutura de antígenos lipídicos reconhecido, pela interação com diferentes células dendríticas e pelo perfil de secreção de citocinas. Estudos recentes mostraram que tipos distintos de CD1d ligados às células dendríticas podem regular diferentes perfis de citocinas secretadas pelas células iNKT, tipo Th1 (IL-12, IFN), tipo Th2 (IL -4, IL-9, IL-10, IL-13, fator estimulador de colônias granulócitos – macrófagos) ou Th17 (IL -17A, IL-21 e IL -22) in vivo (Kumar; Delovitch, 2014 ; Lindau et al., 2013 ; Viale et al., 2012 ). Outras citocinas secretadas pelas células iNKT incluem IL -2, IL -5, IL -6, TNF  e TGF β. Portanto, dependendo do tipo de interação entre os subtipos de células iNKT, células dendríticas e citocinas secretadas pelas células iNKT ativadas Introdução 22 podem ativar ou suprimir a resposta imune adaptativa ( Kumar; Delovitch, 2014). 1.4 Subtipos de células iNKT As células iNKT podem ser divi didas de acordo com os marcadores de superfície expressos e de forma ampla em subtipos CD4+ ou CD4 - e CD8+ ou CD8 -. Portanto, os subtipos de células iNKT podem ser definidos como CD4+, CD4 -CD8- ou duplo negativo (DN) e CD8+. Em 1999 um estudo demonstrou fe nótipo, função e desenvolvimentos heterogêneo nos distintos subtipos de células iNKT e que estas estão distribuídas, diferentemente, em um padrão tecido -específico ( Hammond et al., 1999 ). Diferenças subtipo -específicas na expressão de marcadores de superfície foram descritas com iNKT CD4+ exibindo baixa expressão de CCR5 mas expressão aumentada de CCR4 em relação a iNKT CD4-. Estas, por sua vez, expressam CCR1, CCR6, CXCR6 e NKG2D mas todas as iNKT expressam altos níveis de CXCR3 e CXCR 4. O subtipo CD4 - expressa baixos níveis de CD62L e altos níveis de CD11a, sugerindo fenótipo tecidual infiltrativo enquanto o subtipo CD4+ expressa, preferencialmente, CD62L exibindo um fenótipo direcionado a linfonodos ( Kim et al., 2002 ; Juno et al., 2012). A identificação dessas subpopulações pode explicar o comportamento biológico paradoxal d as células iNKT que, ao produzirem rapidamente grandes quantidades de citocinas Th1 e Th2, promovem imunidade mediada Introdução 23 por células em uma situação e suprimem a mesma imunidade celular em outra situação. As atividades das células iNKT podem ser benéficas ou prejudiciais em diferentes situações, aspecto este relacionado ao balanço entre as repostas imunes Th1 e Th2 mediadas pelas células iNKT (Lin et al., 2006). Em humanos as células iNKT CD4+ produzem citocinas de ambas as respostas Th1 e Th2 ( IFN, TNF, IL-4, IL-10 e IL-13). De forma diversa, as células iNKT CD8+ e iNKT CD4-CD8- (duplo negativo, DN) produzem, primariamente, citocinas Th1 (IFN, TNF) (Gumperz et al., 2002 ; Coquet et al., 2008). Em estudo publicado em 2011 sobre subtipos de células iNKT expandidas e estimuladas de doadoras saudáveis , os autores observaram um percentual de expressão de subtipos de iNKT frescas de 15,6±9,0%, 48,6 ± 15,4% e 33,5 ± 18,1% para CD4 +, DN e CD8 + respectivamente. Foi observado, também, que os três subtipos de células iNKT são capazes de secretar citocinas Th1 e Th2 com iNKT CD8+ demonstrando atividade Th1 / citolítica mais potente e as células CD4 + a atividade Th2 mais intensa. As células NKTDN apresentaram atividade intermediária entre perfil Th1/Th2. Ainda em relação a esse estudo, os autores avaliaram a secreção das citocinas de resposta Th1, Th2, Th9, Th17 e Th22 (IFN , IL-1, IL-2, IL-4, IL- 5, IL -6, IL -9, IL-10, IL -12p70, IL -13, IL -17a e IL -22) por citometria de fluxo após estimulação dos três subtipos de iNKT (O'Reilly et al., 2011 ). Os resultados foram descritos de acordo com a intensidade da secreção da citocina nos subtipos CD4+, DN e CD8+. Introdução 24 Tabela 1 - Intensidade de secreção de citocinas pelos subtipos de células iNKT CD4+, DN e CD8+ após estimulação. Adaptado de O'Reilly et al., 2011 Citocina CD4+ DN CD8+ IFN - ± + TNFα - ± + IL-2 + ± ± IL-4 + ± - IL-5 + ± - IL-6 + + + IL-9 + 0 0 IL-10 + - - IL-12p70 + + + IL-13 + ± - IL-17a 0 + 0 IL-22 0 0 0 (+) = mais intensa, (±) = intermediária (-) = menos intensa e (0) = ausente. Os diferentes perfis de citocinas prod uzidas pelas células iNKT sugerem que essas células podem ter ações diferentes nas diversas células imunes efetoras importantes nas respostas imunes Th1 e Th2 ( Lin et al., 2006). Após estimulação das subpopulações de células iNKT (CD4+, CD8+ e CD4-CD8-), este estudo observou que as células iNKT CD4+ induziram a maior ativação das células NK e células B sem ativação das células T CD8+, as células iNKT CD8+ induziram a ativação das células envolvidas na resposta Th1 (células NK e células T CD8+) e as células iNKT DN induziram a menor ativação das células NK e B, moderada atividade estimuladora sobre as células T CD4+ e ausência de atividade sobre as célul as T CD8+ (Lin et al., 2006). Introdução 25 Em 2013, um estudo australiano demonstrou a heterogeneidade entre diferentes tecidos e sangue periférico dentro das s ubpopulações CD4+ e CD4- das células iNKT (Chan et al., 2013 ). Nesse estudo, a analise comparativa revelou alta heterogeneidade na expressão de antígenos de superfície por subtipos de células iNKT CD4+ e CD4-. Além disso os autores identificaram vários antígenos cuja expressão diferencial correlaciona com a resposta à citocina ( Chan et al., 2013 ). Os achados revelam que a classificação de subtipos de células iNKT CD4+ e CD4 - é deficiente em demonstrar a diversidade desta linhagem celular (Chan et al., 2013). As células iNKT CD4+, DN e CD8+ podem ajudar na diferenciação das células B e induzir a secreção de anticorpos pelos linfócitos B ( Zeng et al., 2013 ). Em 2013 demonstrou -se que todos os principais subtipos de células iNKT expandidas induziram a secreção de IgG, IgA e IgM por células B autólogas, mas não de IgE (Bai et al., 2001, Zeng et al., 2013). Vários estudos demonstraram que alterações na frequência e funções dos subtipos de células iNKT foram observadas em indivíduos com doenças (Araki et al., 2003 ; Kenna et al., 2003 ; Montoya et al., 2007 ; Im et al., 2008 ; Bricard et al., 2009 ). Nos últimos anos, estudos têm demonstrado possibilidade de terapia imunológica com estimulação específica de subtipos de iNKT para alguns tipos d e doenças. Vários grupos estão tentando modular o perfil efetor das células iNKT com fins de aplicação terapêutica por meio de modificação do ambiente de citocinas, do modo de ativação celular e da estrutura dos antígenos glicolipídicos (O'Reilly et al., 2011). Introdução 26 As células iNKT são caracterizadas pela expressão de um receptor de células T invariante com os marcadores V 24j18 e V 11. A partir da identificação de linfócitos T viáveis, as células iNKT podem ser selecionadas por citometria de fluxo utilizando -se os marcadores V 24j18 e V 11 específicos para estas células. 1.5 Células iNKT e endometriose Apesar da com provada relação entre a endometriose e sistema imunológico, não há na literatura estudo que tenha avaliado a correlação entre endometriose e células iNKT. Diante das importantes informações que correlacionam alterações no sistema imunológico com a endome triose e da importância das células iNKT no controle do sistema imune identificamos a hipótese de que essas células podem estar alteradas em pacientes com endometriose pélvica profunda. A comprovação dessa hipótese é importante passo no sentido de identificar o papel das células iNKT em relação ao fator imunológico da doença, permitindo, assim, maior entendimento sobre o sistema imune e a gênese da endometriose. 27 2 Objetivos Objetivos 28 2. OBJETIVOS Este estudo tem como objetivos: a) Analisar a presença de células iNKT e seus subtipos no sangue em pacientes com endometriose profunda infiltrativa e em pacientes sem a doença; b) Analisar a secreção de citocinas pelas células iNKT e seus subtipos em pacientes endometriose e sem a doença; c) Relacionar a presença de células iNKT e seus subtipos no sangue em pacientes com endometriose e: c.1) sintomas clínicos c.2) fase do ciclo menstrual c.3) estadiamento da endometriose d) Analisar a presença de células iNKT no tecido comparando lesão de endometriose com área adjacente sem endometriose. 29 3 Métodos Métodos 30 3. MÉTODOS Realizamos um estudo transversal no Setor de Endometriose da Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCF MUSP), em que foram avaliadas 73 pacientes consecutivas submetidas à videolaparosc opia no período de julho de 2013 a julho de 2015 . As pacientes foram divididas em dois grupos, sendo grupo endometriose (n=47) aquelas com endometriose profunda infiltrativa e grupo controle (n=26) as pacientes sem endometriose. Previamente ao início do estudo, o calculo amostral foi realizado supondo confiança de 95% e poder de 80%, sabendo que estudos anteriores mostraram que o percentual de células iNKT no sangue em mulheres normais varia de 0,1% a 2%, logo, foi considerado o valor médio dessa variabilidade para cálculo da amostra (0,95%) e dado um desvio padrão aproximado de 0,27% nas células iNKT seriam necessárias 29 mulheres em cada grupo para identificar diferença média de 0,2% de células iNKT entre mulheres com e sem endometriose (Carvalho et. al., 2010). Caso a diferença esperada seja de pelo menos 0,5% entre os grupos, a amostra necessária para realização do estudo é de 5 mulheres em cada grupo. O presente estudo foi aprovad o pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital das Clínicas de Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (Anexo 1). Todas as pacientes foram esclarecidas sobre o estudo, leram e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2 Métodos 31 e 3). Este estudo foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo 2012/05425-7. 3.1 Critérios de inclusão e exclusão As pacientes com endometriose foram selecionadas segundo os seguintes critérios de inclusão : idade entre 18 e 49 anos; presença endometriose profunda infiltrativa intestinal e/ou retrocervical com comprovação histológica em espécimes obtidos durante a cirurgia; períodos menstruais eumenorreicos, com intervalo entre os ciclos variando de 26 -34 dias. Para o grupo controle, os critérios de inclusão foram: idade entre 18 e 49 anos; ausência endometriose confirmada pela laparoscopia ou anatomopatologia (em casos de biópsia de lesões suspeitas); períodos menstruais eumenorreicos, com intervalo entre os ciclos variando de 26 -34 dias. Os critérios de exclusão utilizados para ambos os grupos foram: presença de doenças autoimunes confirmadas por anamnese, exame físico e por exames laboratoriais quando necessário; presença de neoplasia maligna suspeita ou diagnosticada; diagnóstico de processos infecciosos nos três meses prévios à cirurgia; presença de sinais clínicos ou laboratoriais de falência ovariana; utilização de terapêutica hormonal (análogos do GnRH, progestagênios e contraceptivos hormonais) nos últimos três meses que antecederam a coleta da amostra. Métodos 32 3.2 Dinâmica do estudo As pacientes com suspeita clínica de endometriose foram avaliadas com história clínica, exame físico e exames complementares como a ultrassonografia pélvica transvaginal com p reparo intestinal e a ressonância nuclear magnética de acordo com a rotina do Setor de Endometriose do HCFMUSP. A cirurgia foi indicada para os casos de pacientes com sintomas de dor e/ou infertilidade em consonância com os achados dos exames clínicos e ra diológicos. Nos casos de pacientes com dor, mas sem achados relevantes nos exames de imagem, a cirurgia foi indicada quando não houve melhora dos sintomas ao tratamento clínico com contraceptivos hormonais orais combinados e/ou antiinflamatórios. Em relaçã o às pacientes submetidas a videolaparoscopia por endometriose no período do estudo, foram selecionados 47 casos que se adequavam aos critérios de inclusão e exclusão. O grupo controle foi formado por pacientes submetidas à laparoscopia para laqueadura tu bária no HCFMUSP que não infringiam os critérios de inclusão e exclusão propostos no estudo. A videolaparoscopia, em ambos os grupos, foi realizada de acordo com o protoc olo do setor do HCFMUSP . As pacientes do grupo com endometriose tiveram as lesões re ssecadas. Durante o procedimento cirúrgico, foram identificados os locais das lesões e feito o estadiamento da doença. No grupo controle, foi realizado inventário minucioso da cavidade abdominal para descartar a presença de lesões de endometriose e realiza da Métodos 33 biópsia nas lesões eventualmente suspeitas. A história clínica das pacientes e as características intraoperatórias da doença foram transcritas em formulário específico para uso posterior dos dados nos cálculos estatísticos. As amostras de sangue foram coletadas das pacientes com endometriose no momento da realização da laparoscopia. Os dados provenientes das pacientes portadoras de endometriose foram considerados após exame histológico (estadiamento e local) das lesões de endometriose. Como grupo contro le, foram utilizadas amostras de sangue de pacientes saudáveis, não portadoras de endometriose, obtidas durante procedimento para laqueadura tubária. Um total de 73 amostras de sangue foi avaliado neste estudo. O sangue periférico foi coletado por punção venosa no antebraço, após indução da anestesia geral. Em seguida, foi transferido para um tubo contendo anticoagulante. Após a coleta das amostras de todos os casos, foram realizadas a separação das células e armazenadas para futuros experimentos. 3.3 Quadro clínico Quanto aos sintomas clínicos, foram considerados os seis sintomas mais frequentes associados à endometriose, descritos abaixo. Todas as pacientes do estudo foram inqueridas sobre a presença e a intensidade destes sintomas com uso da Escala Visual Analógica (EVA) de dor ( Anexo Métodos 34 4). Os sintomas foram classificados em leves ou intensos de acordo com EVA < 7 ou EVA ≥ 7, respectivamente. a) dismenorreia: dor em cólica no período menstrual; b) dispareunia de profundidade: dor pélvica e/ou no fundo vaginal durante a relação sexual; c) dor pélvica acíclica: dor pélvica sem relação com o c iclo menstrual por, pelo menos, três meses, sem melhora com uso de analgésicos; d) alterações urinárias cíclicas: sintomas urinários durante o período menstrual, incluindo disúria, hematúria, polaciúria e/ou urgência miccional; e) alterações intestinais cíclicas: sintomas intestinais durante o período menstrual, incluindo aceleração ou diminuição do trânsito intestinal, dor à evacuação, puxo, tenesmo e/ou sangramento nas fezes; f) infertilidade: dificuldade para engravidar em casal com vida sexual ativa (duas ou mais relações sexuais por semana) e sem método contraceptivo por, pelo menos, um ano. Pacientes em uso de métodos naturais ou de barreira e pacientes não expostas a gravidez até o momento do estudo foram classificadas como “sem tentativa”. 3.4 Estadiamento da Endometriose As lesões de endometriose foram classificadas durante o procedimento cirúrgico de acordo com os critérios da American Society for Reproductive Medicine (ASMR), revisado em 1996, em estádios de I – IV (Figura 1). Métodos 35 Figura 1 – Classificação de endometriose da American Society for Reproductive Medicine, revisada em 1996 Para fins de comparação e cálculos estatísticos, definimos os estádios I e II como estádios iniciais e os estádios III e IV como estádios avançados (ASRM, 1997). Métodos 36 3.5 Locais da endometriose As pacientes com endometriose foram selecionadas de acordo com a presença de lesão de endometriose profunda infiltrativa no retossigmoide e/ou na região retrocervical (Figuras 2). Figura 2 - A - Endometriose profunda d e retossigmoide aderida à região retrocervical. B - Endometriose profunda de região retrocervical, envolvendo os ligamentos útero-sacros bilaterais 3.6 Confirmação da endometriose Os tecidos excisados na cirurgia foram fixados em formalina e blocos de parafina, posteriormente coradas com Hematoxilina-Eosina (HE) e avaliadas em microscópio ótico para confirmação do diagnóstico da endometriose. A B Métodos 37 3.7 Obtenção das células mononucleares do sangue periférico 3.7.1 Sangue heparinizado O sangue foi centr ifugado a 3000 rpm a 10° C durante 8 min. O plasma foi descartado. O precipitado de leucócitos totais foi retirado e lavado com solução fisiológica (previamente aquecida em banho -maria à 37°C), centrifugado novamente a 3000 rpm a 10° C durante 8 min. O so brenadante foi descartado. Em seguida, as células foram colocadas em 2 mL de meio de cultura DMEM contendo soro bovino fetal 10% (previamente aquecida em banho-maria a 37°C) para contagem, em câmara de Neubauer, do número total de células. Os leucócitos t otais foram estocados em nitrogênio líquido em alíquotas contendo 2x 106 células em 1 mL de meio de congelamento (soro bovino fetal + 5% DMSO, em temperatura ambiente. 3.8 Análise dos marcadores de células iNKT por citometria de fluxo 3.8.1 Descongelamento das células mononucleares do sangue periférico (CMSP) Esse procedimento foi realizado em cabine de segurança biológica nível 2, previamente esterilizada por 15 minutos sob luz ultravioleta. Métodos 38 As amostras de CMSP criopreservadas foram mantidas em gelo seco até o momento do seu descongelamento. Os criotubos foram parcialmente descongelados em banho -maria a 37ºC. Foi adicionado 1mL de meio de cultura R10 nas células, gotejado lentamente. Posteriormente, foi transferido o conteúdo total da amostra para um t ubo cônico contendo R10, previamente identificado, utilizando -se, também, do procedimento de gotejamento. Para a realização da lavagem das células, foi adicionado mais 1mL de R10 e esse volume transferido para o tubo contendo R10. Em seguida, o tubo foi c entrifugado por 10 min a 250 x g em temperatura de 4 a 6ºC; o sobrenadante desprezado e adicionados 2mL de R10, para realização da contagem celular por meio da câmara de Neubauer e do contador celular automatizado Countess™ (Invitrogen), utilizando os mesmos procedimento e cálculos descritos anteriormente. Novamente o tubo foi centrifugado e as células ressuspendidas em R10 no volume de 1,0x10 6 células/ml e as células foram transferidas, respectivamente, para uma placa de 96 poços com fundo em V (NUNC® Brand Products), previamente identificada. 3.8.2 Imunofenotipagem de superfície celular em células mononucleares do sangue periférico Com o objetivo de caracterizar as células T Natural Killer – iNKT do sangue periférico, as amostras descongeladas foram pr ocessadas para Métodos 39 realização de imunofenotipagem de superfície celular utilizando -se a técnica de citometria de fluxo. Após a transferência das células para uma placa de 96 poços com fundo em V (NUNC® Brand Products), previamente identificada, a placa foi centrifugada a 250 x g por 5 min., para a lavagem celular. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e as células ressuspendidas em 170 μL de Tampão MACS, composto por 498ml de tampão salina fosfatada 7,2 (GIBCO™) (PBS 1X), 2 mL de EDTA [500mM], 2,5 g de albu mina de soro bovino (SIGMA®) (BSA). Após centrifugação subsequente, o sobrenadante foi desprezado. Para iniciar a marcação das proteínas presentes na superfície das células, foram adicionados tampão MACS, e os anticorpos monoclonais CD3 (clone UCHT1), V β11 (clone C21) e V α24 (clone C15) da Beckman Coulter (Califórnia, CA, EUA) ; CD4 (clone RPA -T4), CD8 (clone RFT -8), CD14 (clone M5E2), CD19 (clone HIB19), CD25 (clone M-A251) da Biolegend (San Diego, CA, USA) e CCR7 (clone 3D12) da BD Bioscience (San Jose, C A, USA) previamente titulados, assim como o marcador de viabilidade Live/Dead. As células permaneceram sob incubação por 30 minutos, no escuro, em temperatura ambiente. Após o término da incubação, a placa foi centrifugada a 250 x g por 5 minutos, o sobrena dante foi desprezado e as células foram lavadas com 170 μL de tampão MACS, para serem novamente, centrifugadas , por duas vezes. Na etapa final da técnica de imunofenotipagem de superfície celular, foram adicionados 100 µl de paraformaldeído a 1% (PFA 1%), composto por 9 mL de PBS (1x) e 1 mL de Métodos 40 paraformaldeído 10x (SIGMA®), visando promover a fixação dos anticorpos monoclonais à superfície celular. Em seguida, as células foram transferidas, respectivamente, para microtubos (Fisherbrand®, Houston, TX) previamente identificados e permaneceram armazenadas sob ref rigeração até o momento da leitura no citômetro de fluxo modelo LSRFortessa (BD), dotado de detectores capazes de adquirir e analisar eventos com até 14 cores. Os linfócitos foram identificados entre as células mononucleares do sangue periférico por meio da citometria de fluxo utilizando -se o Forward- scattered light (FSC) que avalia as partículas de acordo com a área de superfície celular ou tamanho da célula e o Side-scattered light (SSC) que avalia a granularidade celular ou a complexidade interna da cél ula ( Figura 6A). Dessa forma é possível diferenciar os linfócitos das outras células mononucleares. A partir da identificação dos linfócitos por tamanho (FSC) e complexidade (SSC), foi, então, realizada a avaliação da viabilidade celular utilizando-se os marcadores live/dead ( Figura 6B). Os marcadores CD14 e CD19 foram utilizados para diferenciar os linfócitos T dos monócitos que expressam o CD14 e o linfócito B que expressa o CD19 ( Figura 6B). Após essa estratégia de obrigatoriamente ser negativo para CD 14/CD19 e marcador de viabilidade, precedeu-se à marcação de linfócitos T utilizando a proteína CD3. Identificados os linfócitos T, realizou -se um dot plot com os marcadores CD4 e CD8 para identificar os subtipos de linfócitos ( Figura 6C) e outro dot pl ot com marcadores Vβ11 e Vα24 duplos marcados específicos Métodos 41 para células iNKT (Figura 6D). As células iNKT foram selecionadas do gate Vβ11+ Vα24+ para posterior identificação dos subtipos de células iNKT. Os subtipos de linfócitos e de células iNKT foram ide ntificados com uso dos marcadores CD4, CD8, CD25 e CCR7 ( Figuras 6, 7 e 8). Foram verificadas as frequências de linfócitos T CD3+, CD3+CCR7+, CD3+CD4+, CD3+CD4+CCR7+, CD3+CD4+CD25+, CD3+CD8+, CD3+CD8+CCR7+, CD3+CD8+CD25+, CD3+CD25+) e de células iNKT e seu s subtipos NKTCD8+, iNKT CD8+ CCR7+, iNKT CD8+ CD25+, iNKT DP, iNKT CD4+, iNKT CD4+ CCR7+, iNKT CD4+ CD25+, iNKT DN, iNKT DN CCR7+ e iNKT DN CD25+. Figura 3 - Representação gráfica de Imunofenotipagem. Density Plot de citometria de fluxo de linfócitos ( 3a), seleção de gate para análise de viabilidade celular ( 3b), seleção de gate de lin fócitos CD3 para CD4+ e CD8+ ( 3c) e células natural Killer T (iNKT) (3d) 3c 3b 3a 3d Métodos 42 Figura 4 - Representação gráfica de Imunofenotipagem. Density Plot de citometria de fluxo de li nfócitos CD3 ( 4a), CD3+CCR7+ ( 4b) e CD3+CD25+ ( 4c). Density Plot de citometria de flu xo de linfócitos CD4+ e CD8+ ( 4d), seleção de gate de linfócitos CD8+CCR7+ ( 4e), CD8+CD25+ ( 4f) e linfócitos CD4+CCR7+ (4g) e CD4+CD25+ (4h) Métodos 43 Figura 5 - Representação gráfica de Imunofenotipagem de células iNKT e seus sub-tipos (5b – 5h). Density Plot de citometria de fluxo de células iNKT com marcadores Vbeta11 e Valpha24 (5a), seleção de gate de células iNKT CD4+ e iNKT CD8+ ( 5b), seleção de gate de células iNKT CD8+ CCR7+ ( 5c) e iNKT CD8+ CD25+ (5d), seleção de gate de células iNKT DN CCR7+ (5e) e iNKT DN CD25+ (5f), seleção de gate de células iNKT CD4+CCR7+ (5g) e iNKT CD4+CD25+ (5h) O resultado da citometria de fluxo identificou as porcentagens de células iNKT e seus subtipos no sangue periférico das pacientes dos dois grupos de estudo. Métodos 44 3.8.3 Estimulação das células iNKT para medição de citocinas Para a medição d a produção de citocinas, as células mononucleares do sangue periférico foram descongeladas e inc ubadas na presença de α - galactosilceramida (αGalCer), uma substancia agonista específica de iNKT. Após 1 hora a 37 oC e CO2 a 5%, adicionou-se Monensina (Golgi Stop, BD Biosciences) e Brefeldina A (Golgi Plug, BD Biosciences). Após incubação durante 18 h, a s células foram lavadas e incubadas com anticorpos monoclonais para a superfície. As células foram lavadas e fixadas e permeabilizadas utilizando reagentes de fixação / permeabilização da Life Technologies de acordo com as instruções do fabricante. As célu las foram incubadas com IL -10 (clone JES3 -1931), da Beckman Coulter (Califórnia, CA, EUA), IL-6 (clone MQ2-13A5) da BD (San Jose, CA, EUA) e IL-17 (clone : BL168) da Biolegend (San Diego, CA, EUA). As células foram adquiridas em um citômetro de fluxo LSR F ortessa (BD Biosciences). Células não estimuladas foram usadas para cada painel, para análise intracelular. Todas as amostras foram adquiridas usando o software FACSDiva (BD Biosciences) e, em seguida, analisadas com o software FlowJo versão 9.9 (Tree Star). Métodos 45 3.8.4 Marcação por imunofluorescência na microscopia confocal As lesões de endometriose foram cortadas em seções de 5mM para a realização marcação da imunofluorescência. As lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina, para a realização da leitura por um patologista para definir o local específico das lesões de endometriose e áreas saudáveis nas seções. Depois disto, as secções foram despar afinadas e submetidas a uma etapa de recuperação de epitopos incubados aquecido durante 15 minutos em mi croondas em solução tampão de citrato de sódio. Depois disto, fora m incubados durante a noite a 4° C, com anticorpos primários, anticorpo CD1d de camundongo anti-humano de (BD Biosciences) e anticorpo policlonal de coelho CD3 anti-humano da Abcam (Cambridge, UK). Em seguida, os tecidos foram lavados e incubados com anticorpos secundários Alexa 488 anti -camundongo e Alexa 568 anti -coelho da Life Technologies, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA), durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, os t ecidos foram lavados e incubados com anti -CD4 (clone RPA -T4), por 2 horas. E finalmente, incubado com DAPI por 5 minutos e a fixação da lâmina foi realizada com o reagente antifade da Prolong Golg Life Technologies, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, E UA). As imagens foram adquiridas em microscópio confocal LSM 710 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). As seções foram gravadas usando uma versão 11.0 do ZEN 2012 SP2 (preto, 64 bits) (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Métodos 46 3.9 Análise estatística Para elaboração do estu do proposto nesta tese, foram observadas mulheres com endometriose profunda infiltrativa intestinal e/ou retrocervical e mulheres sem endometriose relativamente ao percentual de células iNKT e subtipos no sangue periférico. Além das células iNKT e subtipo s, as mulheres foram avaliadas segundo grau de sintomas apresentados com uso de escalas visuais analógicas (EVA). O objetivo do estudo é verificar se os percentuais de células iNKT e seus subtipos diferem entre os grupos de mulheres com endometriose e sem endometriose. As características pessoais e clínicas qualitativas foram descritas segundo grupos com uso de frequências absolutas e relativas e verificada a associação com os grupos com uso de testes qui -quadrado ou testes exatos (teste exato de Fisher ou teste da razão de verossimilhanças) (Kirkwood ; Sterne, 2006), os escores de sintomas foram descritos segundo grupos com uso de medidas, mínimos e máximos e comparado entre os grupos com uso de testes Mann -Whitney (Kirkwood ; Sterne, 2006) e as idades e I MC dos pacientes foram descritos segundo grupos com uso de média e desvio padrão e comparados entre os grupos com uso de testes t -Student (Kirkwood; Sterne, 2006). Os níveis de iNKT e percentuais de cada tipo de célula foram descritos segundo grupos c om u so de medidas resumo (média, desvio Métodos 47 padrão, mediana, mínimo e máximo) e comparado entre os grupos com uso de testes Mann-Whitney. Apenas nos pacientes com endometriose profunda, foram descritos os valores de iNKT e dos percentuais de cada tipo de célula s egundo cada sintoma categorizado como ausente/leve e grave (≥ 7 pontos), infertilidade e estádio com uso de medidas resumo e comparados os valores das células iNKT e percentuais de cada tipo de célula segundo os sintomas com uso de testes Mann -Whitney. Para ambos os grupos as células iNKT e os percentuais de cada tipo foram comparados entre as fases do ciclo menstrual e em cada fase do ciclo foram comparados os grupos com uso de testes Mann-Whitney, porém devido ao número de comparações da mesma variável foi considerado nível de significância de 0,0125 (p= 0,0125) conforme correção de Bonferroni. As análises foram realizadas com uso do software IBM-SPSS for Windows versão 20.0 e tabulados com uso do software Microsoft-Excel 2003 e os testes foram realizados com nível de significância de 5%. 48 4 Resultados Resultados 49 4. RESULTADOS 4.1 Dados demográficos e clínicos Os dados clínicos das pacientes selecionadas foram comparados para avaliação de semelhança entre os grupos. A Tabela 2 mostra que não houve diferença significativa na idade média das pacientes no dia da cirurgia (p=0,0876). Entretanto, o IMC médio das pacientes com endometriose profunda foi estatisticamente menor do que daquelas do grupo controle (p = 0,046). Da mesma forma, a fase do ciclo menstrual na data da cirurgia não foi diferente entre os grupos estudados (p=0,067) (Tabela 2). Tabela 2 - Avaliação de semelhança dos dados clínicos de idade, índice de massa corpórea e fase do ciclo menstrual entre as pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose Variável Grupo Total p Controle Endometriose (N=26) (N=47) (N=73) Idade (anos), média ± DP 34,5 ± 4,6 34,3 ± 6,2 34,4 ± 5,7 0,876 ** IMC (Kg/m²), média ± DP 24,1 ± 3,1 22,5 ± 3,3 23 ± 3,3 0,046** Fase do ciclo menstrual, n (%) 0,067 Proliferativa 14 (53,8) 15 (31,9) 29 (39,7) Secretora 12 (46,2) 32 (68,1) 44 (60,3) Teste qui-quadrado; * Teste exato de Fisher; # Teste da razão de verossimilhanças; ** Teste t-Student; £ Teste Mann-Whitney Resultados 50 A intensidade dos sintomas clínicos, segundo escala visual analógica de dor, foi comparada para avaliação de semelhança entre os grupos de endometriose profunda e sem endometriose (Tabela 3). O número de pacientes com níveis de sintomas intensos (EVA ≥ 7) foi estatisticamente maior nas pacientes com endometriose profunda para os sintomas de dismenorréia (p<0,001), dor pélvica acíclica (p<0,001), dispareunia (p<0,038) e alteração intestinal cíclica (p0,999). A infertilidade também foi estatisticamente maior nas mulheres com endometriose profunda quando comparadas ao grupo sem endometriose (p < 0,001). Resultados 51 Tabela 3 - Avaliação de semelhança dos sintomas clínicos entre as pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose Teste qui-quadrado; * Teste exato de Fisher; # Teste da razão de verossimilhanças; ** Teste t-Student; £ Teste Mann-Whitney. Sintomas clínicos baseados na escala visual analógica de dor (0 – 10). DM: dismenorréia; DPA: dor pélvica acíclica; DP: dispareunia; AIC: alteração intestinal cíclica; AUC: alteração urinária cíclica. Grupo Variável Controle Endometriose Total p (N = 26) (N = 47) (N = 73) DM, n (%) <0,001 EVA < 7 23 (88,5) 17 (36,2) 40 (54,8) EVA ≥ 7 3 (11,5) 30 (63,8) 33 (45,2) mediana (mín.; máx.) 0 (0; 10) 8 (0; 10) 5 (0; 10) <0,001£ DPA, n (%) 0,308* EVA < 7 24 (92,3) 38 (80,9) 62 (84,9) EVA ≥ 7 2 (7,7) 9 (19,1) 11 (15,1) mediana (mín.; máx.) 0 (0; 10) 0 (0; 10) 0 (0; 10) 0,038£ DP, n (%) 0,084* EVA < 7 25 (96,2) 37 (78,7) 62 (84,9) EVA ≥ 7 1 (3,8) 10 (21,3) 11 (15,1) mediana (mín.; máx.) 0 (0; 8) 0 (0; 10) 0 (0; 10) <0,001£ AIC, n (%) 0,046* EVA 0,999* EVA < 7 26 (100) 46 (97,9) 72 (98,6) EVA ≥ 7 0 (0) 1 (2,1) 1 (1,4) mediana (mín.; máx.) 0 (0; 0) 0 (0; 8) 0 (0; 8) 0,191£ Infertilidade, n (%) <0,001# Não 26 (100) 9 (19,1) 35 (47,9) Sim 0 (0) 25 (53,2) 25 (34,2) Sem tentativa 0 (0) 13 (27,7) 13 (17,8) Resultados 52 4.2 Estadiamento da endometriose O estadiamento da doença fo i avaliado nas pacientes com a doença. A tabela 4 mostra os resultados encontrados onde há um nú mero de pacientes com endometriose estádio III e IV é três vezes superior ao de pacientes com endometriose grau I e II (Tabela 4). Tabela 4 - Avaliação de semelhança em relação ao estádio da endometriose entre as pacientes com endometriose profunda infiltrativa Grupo Variável Controle Endometriose Total (N = 26) (N = 47) (N = 73) Estadio, n (%) I/II 0 (0%) 11 (23,4) 11 (23,4) III/IV 0 (0%) 36 (76,6) 36 (76,6) Estadiamento I-II: mínimo-leve, III-IV: moderado-grave. Resultados 53 4.3 Análise das frequências das células iNKT As células iNKT foram avaliadas em relação sua frequência no sangue periférico entre os dois grupos do estudo . Houve diferença estatisticamente significativa em relação ao percentual d e células iNKT no sangue (p=0,010 ) de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e m comparação àquelas sem endometriose (Tabela 5). Tabela 5 - Descrição das médias das frequên cias das células iNKT no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e resultado da comparação entre os grupos Grupo Variável Controle Endometriose Total p (N = 26) (N = 47) (N = 73) NKT, média ± DP 0,23 ± 0,25 0,17 ± 0,55 0,2 ± 0,46 0,010 Teste de Mann-Whitney; DP = desvio padrão. Resultados 54 No Gráfico 1 podemos observar a distribuição das frequências de células iNKT nos dois grupos de estudo (Gráfico 1). Gráfico 1 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrati va e sem endometriose p=0,01 0 Resultados 55 4.4 Análise das frequências dos subtipos de células iNKT A frequência dos subtipos das células iNKT CD4+, DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 nessas células foi avaliada comparativamente entre as pacientes com e sem endometriose. Foi observado uma menor frequência de células iNKT DN nas mulheres com endometriose em relação àquelas sem endometriose (p=0,020). Não houve diferença significativa nos outros subtipos CD4+ e DN (Tabela 6). Tabela 6 - Descrição das médias das frequências dos subtipos de células iNKT CD4+, DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 no sangue periférico s egundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e resultado da comparação entre os grupos. Resultados em média e desvio padrão Grupo Variável Controle Endometriose Total p (N = 26) (N = 47) (N = 73) iNKT CD4+ 32,2 ± 21 37 ± 27,4 35,2 ± 25,1 0,673 iNKT CD4+/CCR7 31,6 ± 31 35,6 ± 30,6 34,1 ± 30,6 0,439 iNKT CD4+/CD25 25,8 ± 18,5 33,5 ± 23,1 30,8 ± 21,8 0,168 iNKT DN 48,2 ± 21,4 34,6 ± 24,5 39,6 ± 24,2 0,020 iNKT DN/CCR7 6,76 ± 14,08 11,18 ± 15,87 9,54 ± 15,27 0,801 iNKT DN/CD25 33,8 ± 29,8 39,7 ± 31,8 37,4 ± 30,9 0,416 Teste Mann-Whitney Resultados 56 Os subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN foram avaliadas em relação secreção de IL -6, IL-10 e IL -17. A frequência das células iNKT DN IL17 menor no grupo de pacie ntes com endometriose c omparadas ao grupo controle sem endometriose (p=0,050). Não houve diferença signific ativa nos outros subtipos CD4+, CD8+ e DN (Tabela 7). Tabela 7 - Descrição das médias das frequências dos subtipos de células iNKT secretoras de IL -6, IL -10 e IL -17 no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e resultado da comparação entre os grupos. Resultados em média e desvio padrão Grupo Variável Controle Endometriose Total p (N = 26) (N = 47) (N = 73) iNKT CD4+/IL6 5,55 ± 5,71 1,37 ± 1,94 3,09 ± 4,34 0,081 iNKT CD4+/IL10 3,08 ± 2,26 4,36 ± 5,51 3,86 ± 4,48 0,856 iNKT CD4+/IL17 13 ± 4 8,7 ± 5,5 10,4 ± 5,3 0,160 iNKT CD8+/IL6 6,37 ± 5,8 3,44 ± 4,25 4,42 ± 4,89 0,196 iNKT CD8+/IL10 3,81 ± 2,91 4,53 ± 3,88 4,29 ± 3,53 0,881 iNKT CD8+/IL17 9,11 ± 4,65 10,99 ± 14,18 10,36 ± 11,75 0,455 iNKT DN/IL6 1,99 ± 2,57 0,74 ± 1,12 1,21 ± 1,86 0,127 iNKT DN/IL10 0,35 ± 0,39 0,44 ± 0,88 0,41 ± 0,72 0,356 iNKT DN/IL17 11,5 ± 5 7,8 ± 4,2 9,2 ± 4,8 0,050 Teste Mann-Whitney Resultados 57 No Quadro 1 podemos observar a distribuição das frequências de células iNKT DN e iNKT DN IL-17+ nos dois grupos de estudo (Quadro 1). Quadro 1 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT DN (A) e iNKT DN IL17+ (B) no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose p=0,050 p=0,020 A B Resultados 58 4.5 Análise das frequências das células iNKT e subtipos em relação aos sintomas da endometriose As células iNKT e os subtipos estudados foram avaliadas em relação às suas frequências e a intensidade dos sintomas de dismenorréia, dispareunia, dor pélvica acíclica, alteração intestinal cíclica e alteração urinária cíclica nas pacientes com endometriose pro funda infiltrativa. A intensidade dos sintomas foi dividida em dois grupos < 7 e ≥ 7 de acordo com a EVA de dor. No Gráfico 2, mostramos o resultado da comparação das médias das frequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa versus o grupo controle e a intensidade do sintoma clínico de dismenorré ia. Foi observado uma significativa menor frequência das células iNKT CD4+ CCR7 nas pacientes com endometriose profunda em comparação as pacientes sem a doença . Não houve diferença significativa em relação aos o utros subtipos de iNKT com expressão dos marcadores CCR7 e CD25 . As frequências dos subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL-17 também foram avaliadas nas pacientes com endometriose pro funda infiltrativa e grupo controle em relação à intensidade da dismenorréia (Gráfico 2). A frequência das células iNKT CD4+ IL17 foi significativamente menor no grupo de pacientes com dismenorréia leve (EVA < 7) comparadas ao grupo com dismenorréia Resultados 59 intensa (EVA ≥ 7). Não houve diferença signific ativa nos outros subtipos de células CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL-17 (Gráfico 2). Gráfico 2 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico de pacientes com endometriose profu nda infiltrativa e sintomas clínicos de dismenorréia com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA Resultados 60 No Quadro 2 podemos observar a distribuição das frequências de células iNKT CD4+ CCR7+ e iNKT CD4+ IL -17+ no sangue periférico de pacientes com endometriose pro funda infiltrativa e intensidade de sintoma de dismenorréia (Quadro 2). Quadro 2 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT CD4+ CCR7+ (A) e iNKT CD4+ IL17+ (B) no sangue periférico de pacientes com endometriose profund a infiltrativa e intensidade de sintoma de dismenorréia p=0,022 p=0,038 A B EVA< 7 EVA ≥ 7 EVA< 7 EVA ≥ 7 Resultados 61 A seguir demonstramos o resultado da comparação das médias das frequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes c om endometriose profunda infiltrativa versus o grupo controle e a intensidade do sintoma clínico de dor pélvica acíclica. Não foi observado diferença estatisticamente significativa na frequência destas células e a intensidade da dor pélvica acíclica . As fr equências dos subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL -6, IL-10 e IL -17 também foram avaliadas nas pacientes com end ometriose profunda infiltrativa em relação ao grupo controle e a intensidade da dor pélvica acíclica (Gráfico 3). Dentre es tas, apenas a frequência das células iNKT CD4+ IL17 foi significativamente menor no grupo de pacientes com dor pélvica acíclica leve comparadas ao grupo com dor intensa (Gráfico 4). Não houve diferença signific ativa nos outros subtipos CD4+, CD8+ e DN. Resultados 62 Gráfico 3 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de dor pélvica acíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA Gráfico 4 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT CD4+ IL17+ no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e intensidade de sintoma de dor pélvica acíclica EVA< 7 EVA ≥ 7 p=0,048 Resultados 63 Os resultado s da comparação das médias das frequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa versus pacientes do grupo controle e a intensidade do sintoma clínico de dispareunia estão demonstrados no Gráfico 5 . Não foi observado diferença estatisticamente significativa na frequência destas células e a intensidade da dispareunia entre os grupos . As frequências dos subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL-17 também foram avaliadas nas pacientes com endometriose profunda infiltrativa e no grupo controle. Não houve diferença significativa nos subtipos CD4+, CD8+ e DN entre os grupos (Gráfico 5). Gráfico 5 - Médias das f requências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de dispareunia com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA Resultados 64 Os resultados da comparação das médias das frequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa versus o grupo controle e a intensidade do sintoma clínico de alteração intestinal cíclica estão demonstrados no Gráfico 6. Não foi observado diferença estatisticamente significativa na frequência destas células e a intensidade da alteração intestinal cíclica entre os grupos . As frequências dos subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL-17 também foram avaliadas nas pacientes com endometriose profunda infiltrativa e no grupo controle . Não houve diferença signific ativa nas frequências dos subtipos CD4+, CD8+ e DN (Gráfico 6). Gráfico 6 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de alteração intestinal cíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA Resultados 65 Os resultados da comparação das médias das frequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes com endo metriose profunda infiltrativa e de pacientes do grupo controle em relação a intensidade do sintoma clínico de alteraçã o urinária cíclica estão demonstrados no Gráfico 7 . Não foi observado diferença estatisticamente significativa na frequência destas células e a intensidade da alteração urinária cíclica. As f requências dos subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL -6, IL-10 e IL-17 também foram avaliadas nas pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose . Não houve diferença signific ativa nos subt ipos CD4+, CD8+ e DN entre o s grupos (Gráfico 7). Gráfico 7 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de alteração urinária cíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA Resultados 66 4.6 Análise das células iNKT e o estádio da endometriose Um outro aspecto avaliado no presente estudo foi a relação entre a frequência das células iNKT e seus subtipos com o estádio da endometriose. As médias das frequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN com a expressão de marcadores CCR7 e CD25, assim como dos subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL -6, IL -10 e IL -17 no sangue periférico de pacientes com estádio I/II foram comparados àquelas com estádio III/IV de endometriose. Das 46 pacientes com endometriose 11 (23 ,4%) tiveram a doença classificada em está dio I/II e 35 (76,6 %) em estádio III/IV. Entretanto, só foi possível detectar as frequências das células iNKT CD4+/IL6, iNKT CD4+/IL10, iNKT CD4+/IL17, iNKT CD8+/IL6, iNKT CD8+/IL10, iNKT CD8+/IL17 em uma das pacientes com estádio I/II de endometriose. Da mesma forma , não foi possível medir as frequências das células iNKT DN/IL6, iNKT DN/IL10, iNKT DN–/IL17 em nenhuma das pacientes com endometriose es tádio I/II. Nos casos em que os cálculos estatísticos puderam ser realizados de forma adequada, não foi observada diferença significativa na s frequências das células avaliadas e o estádio da endometriose profunda (Gráfico 8). Resultados 67 Gráfico 8 - Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo estádio I/II ou III/IV da doença nas pacientes com endometriose profunda Resultados 68 4.5 Avaliação das células iNKT nas diferentes fases do ciclo menstrual Por fim, foi inv estigado a influê ncia da fase do ciclo menstrual nas células iNKT assim como nos seus subtipos analisados neste estudo. Foram comparadas as frequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN com a expressão de marcadores CCR7 e CD25, assim como dos subtipos de células iNKT CD4+, iNKT CD8+ e iNKT DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL- 17 no sangue periférico de pacientes das pacientes com endometriose profunda versus pacientes sem endometriose em cada fase do ciclo menstrual separadamente. Realizamos ainda a comparação das frequências das mesmas células descritas acima dentro de cada grupo isoladamente comparando a fase proliferativa com a fase secretora. Portanto, comparamos dentro do grupo controle as frequências das células iNKT e subtipos entre as pacientes que se encontrava m na fase proliferativa com aquelas que se encontravam na fase secretora ao momento da cirurgia. De forma idêntica realizamos a comparação dentro do grupo de pacientes com endometriose profunda. Os resultados identificaram que pacientes na fase secretora com endometriose profunda apresentaram uma menor frequência células iNKT quando comparadas as pacientes sem a doença na mesma fase do ciclo menstrual. Entre as pacientes que se encontravam na fase proliferativa foram observadas duas diferenças sign ificativas. As células iNKT CD4+ CD25 apresentaram uma maior frequência nas pacientes com endometriose profunda quando comparadas as pacientes do grupo controle. No entanto, Resultados 69 as células iNKT CD4+ DN foram identificadas em menor frequência nas pacientes com endometr iose quando comparadas as pacientes sem endometriose. No grupo de pacientes com endometriose profunda identificamos uma maior frequênc ia das células iNKT DN CD25 na fase proliferativa quando comparada com a fase secretora (tabela 8). Além disso, na fase se cretora do ciclo menstrual, encontramos menor frequência de células iNKT DN IL17+ nas pacientes com endometriose profunda quando comparadas as pacientes do grupo controle (Tabela 8). Resultados 70 Tabela 8 - Descrição das médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa (grupo endometriose) e sem endometriose (grupo controle) e a fase do ciclo menstrual. Resultado da comparação entre os grupos e entre as fases do ciclo menstrual Variável Fase do ciclo menstrual Grupo p Controle Endometriose iNKT Proliferativa 0,07 (0,02; 0,56) 0,04 (0; 0,19) 0,128 Secretora 0,25 (0,01; 0,94) 0,05 (0; 3,61) 0,030 p 0,295 0,880 iNKT CD4+ Proliferativa 31,1 (7,2; 73,1) 30,1 (0; 100) 0,734 Secretora 28,6 (0; 69,6) 34,1 (0; 81,1) 0,747 p 0,936 0,479 iNKT CD4+/CCR7 Proliferativa 41,3 (0; 83,1) 53,8 (0; 77,5) 0,470 Secretora 0 (0; 92,3) 40,6 (0; 83,5) 0,460 p 0,316 0,368 iNKT CD4+/CD25 Proliferativa 33,2 (0; 58,6) 44,6 (0; 60) 0,022 Secretora 25,6 (0; 57,7) 30 (0; 81,7) 0,555 p 0,674 0,121 iNKT DN Proliferativa 55,8 (23,1; 87,5) 28,8 (0; 73,3) 0,011 Secretora 53,1 (0; 69,2) 30,6 (0; 81,7) 0,357 p 0,611 0,542 iNKT DN/CCR7 Proliferativa 0,5 (0; 36,6) 4,27 (0; 48,6) >0,999 Secretora 0,1 (0; 45,5) 6,9 (0; 60) 0,745 p 0,689 0,897 iNKT DN/CD25 Proliferativa 46,2 (0; 76,2) 62,5 (0; 100) 0,101 Secretora 17 (0; 72,3) 37,3 (0; 87,5) 0,722 p 0,437 0,032 iNKT CD4+/IL6 Proliferativa 4,17 (0; 14,9) 0 (0; 1,89) 0,250 Secretora 2,98 (1,13; 4,83) 1,59 (0; 6,19) 0,667 p 0,857 0,543 iNKT CD4+/IL10 Proliferativa 3,01 (0; 7,46) 1,82 (0; 3,77) 0,571 Secretora 2,32 (1,93; 2,71) 3,31 (0; 20) 0,400 p 0,381 0,260 iNKT CD4+/IL17 Proliferativa 14,8 (8,3; 16) 8,6 (3,8; 16,4) 0,786 Secretora 11,7 (6,6; 16,9) 9,8 (0; 17,5) 0,711 p >0,999 >0,999 iNKT CD8+/IL6 Proliferativa 4,52 (0; 16,8) 0 (0; 10,7) 0,571 Secretora 5,74 (1,27; 10,2) 0,8 (0; 10) 0,308 p >0,999 0,808 continua Resultados 71 Tabela 8 (conclusão) - Descrição das méd ias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa (grupo endometriose) e sem endometriose (grupo controle) e a fase do ciclo menstrual. Resultado da comparação entre os gr upos e entre as fases do ciclo menstrual Teste Mann-Whitney; Dados expressos como mediana (mín.; máx.). Variável Fase do ciclo menstrual Grupo p Controle Endometriose iNKT CD8+/IL10 Proliferativa 3,85 (1,32; 9,8) 7,14 (0; 9,52) >0,999 Secretora 2,68 (2,53; 2,82) 3,01 (0; 11,1) 0,923 p 0,857 0,639 iNKT CD8+/IL17 Proliferativa 6,15 (4,07; 17,6) 13,3 (9,52; 14,3) 0,250 Secretora 10,8 (9,6; 12) 3,95 (0; 54,5) 0,308 p 0,381 0,139 iNKT DN/IL6 Proliferativa 1,28 (0; 7,66) 2,27 (0; 3,45) 0,786 Secretora 0,61 (0,48; 3,57) 0 (0; 1,96) 0,217 p >0,999 0,142 iNKT DN/IL10 Proliferativa 0,52 (0; 1,02) 0 (0; 2,27) >0,999 Secretora 0,19 (0; 0,3) 0 (0; 2,44) 0,573 p 0,571 0,836 iNKT DN/IL17 Proliferativa 10,2 (5,2; 13,9) 13,6 (3,2; 13,8) >0,999 Secretora 14 (8,1; 21,4) 7,1 (0; 13,8) 0,049 p 0,393 0,446 Resultados 72 No Gráfico 9 podemos observar a distribuição das frequências de células iNKT na fase secretora nos dois grupos de estudo (Gráfico 9). Gráfico 9 - Representação em dotplot da di stribuição das frequências das células iNKT no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e grupo controle na fase secretora do ciclo menstrual p=0,030 Resultados 73 No Quadro 3 podemos observar a distribuição das frequências de células iNKT CD4+ CD25+ e iNKT DN na fase proliferativa em pacientes com en dometriose e grupo controle, iNKT DN CD25+ em pacientes com endometriose profunda na fase proliferativa e secretora do ciclo menstrual e iNKT DN IL17+ na fase secretora em pacientes com endometriose e grupo controle (Quadro 3). Quadro 3 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células (A) iNKT CD4+ CD25+ na fase proliferativa em pacientes com endometriose e grupo controle; ( B) iNKT DN na fase proliferativa em pacientes com end ometriose e grupo controle; (C) iNKT DN CD25+ em pacientes com endometriose profunda na fase proliferativa e secretora do ciclo menstrual; (D) iNKT DN IL17+ na fase secretora em pacientes com endometriose e grupo controle B C A D p=0,022 p=0,011 p=0,032 p=0,049 Resultados 74 4.7 Avaliação das células iNKT nas lesões de endometriose Para avaliar a possível relação entre do número de células iNKT tecidual e a endometriose realizamos analise por imunocoloração confocal dessas células no tecido com lesão de endometriose comparando com o tecido saudável, sem endometriose, adjacente (Figura 6). Figura 6 - Imunocoloração confocal de células iNKT em lesões de endometriose. (A) Mesclagem representativa de células coradas marcadas com CD3 (vermelho), CD1D (verde), CD4 (amarelo) e DAPI (azul) de áreas saudáveis e áreas de endometriose. (B) Porcentagem de células iNKT em áreas saudáveis e endometriose do tecido (n = 9) Resultados 75 No Gráfico 10 podemos observar que não houve diferença estatística nas média s das frequências de células iNKT e células CD3+ no tecido com lesão de e ndometriose e tecido normal sem lesão de endometriose (Gráfico 10). Gráfico 10 - Representação em dotplot da distribuição das frequências das células iNKT e células CD3+ no tecido com lesão de endometriose e tecido normal sem lesão de endometriose * p=0,14 76 5 Discussão Discussão 77 5. DISCUSSÃO O papel do sistema imunológico na patogênese da endometriose foi amplamente demonstra do nas últimas décadas. E studos anteriores observaram que diversas citocinas podem ser anormalmente expressas ou produzidas em pacientes com endometriose (Bergqvist et al., 2001; Bedaiwy et al., 2002; Cheong et al., 2002; Berkkanoglu ; Arici, 2003; Kyama et al., 2006; Kalu et al., 2007; Othman et al., 2008; Salmassi et al., 2008; Ahn et al., 2015, Thiruchelvam et al., 2015; Mons anto et al., 2016; Miller et al., 2017). Da mesma forma, o comportamento variável da resposta Th1, Th2 e Th17 foi observado por alguns autores em mulheres com endometriose (Antsiferova et al., 2005; Podgaec et al., 2007; Fairbanks et al., 2009; Podgaec et al., 2010; Szymanowski et al., 2013 ; Osuga et al., 2016 ). Outros estudos demonstraram atividade irregular ou diferente em componentes celulares do sistema imunológico como macrófagos, linfócitos T e B, células NK e células dendríticas nas pacientes com end ometriose (Berkkanoglu. Arici, 2003; Kyama et al., 2006; Dias Jr et al., 2012; Capobianco , Rovere-Querini, 2013; Ahn et al., 2015; Thriruchelvam et al., 2015) . Considerando as diversas alterações no sistema imunológico previamente observadas na endometriose e ainda o importante papel das células iNKT na resposta imune (Bendelac et al., 2007; Balato et al., 2009), decidimos avaliar se as células iNKT estão alteradas em pacientes com endometriose. Discussão 78 O estudo foi realizado com dois grupos distintos de paciente s, um formado por portadoras de endometriose profunda e o outro por pacientes sem endometriose. A escolha do grupo de pacientes especificamente com endometriose prof unda se deve a alguns fatores: a maior parte das pacientes com indicação para cirurgia no s erviço é portadora de lesão profunda infilt rativa e para se evitar o viés de colocar no mesmo grupo pacientes com diferentes tipos de lesão de endometriose. O grupo controle foi composto apenas por pacientes submetidas à laqueadura tubária bilateral laparoscópica por três razões: fertilidade prévia comprovada, indicação cirúrgica não relacionada a patologias pélvicas e possibilidade de confirmar a ausência de lesões de endometriose pela laparoscopia. Os grupos de estudo foram equivalentes em relação às características basais dos pacientes, como idade e fase do ciclo menstrual. No entanto, foi observado um IMC médio maior no grupo controle do que nas pacientes com endometriose profunda. Esse resultado está de acordo com achados de pesquisas anteriores em que o IMC médio observado foi menor em pacientes com endometriose quando comparados a mulheres saudáveis sem endometriose (Backonja et al., 2017; Liu; Zhang, 2017). O número de pacientes com dismenorréia intensa (EVA ≥ 7) e sintomas intestinais foi significativamente superior no grupo com endometriose profunda. Esse achado é considerado normal e esperado em função das características clinicas da endometriose cujos sintomas de dor pélvica intensa são frequentes, em especial a dismenorréia, com prevalência entre 50% a 90% entre as portadoras da doença. (Giudice et al., 2010). Discussão 79 Nos resultados desta pesquisa encontramos uma frequência significativamente menor de células iNKT no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda em comparação com mulheres sem endometriose. Frequências diminuídas de células iNKT foram previamente descritas em diferentes doenças, tais como, infecção por HIV e HTLV e imunodeficiência comum variável ( Fulcher et al., 2009 ; Ndhlovu et al., 200 9; Snyder-Cappiobe et al., 2009). Outros estudos observaram que defeitos seletivos na quantidade de células iNKT e produção de citocinas estão presentes em indivíduos afetados por diferentes doenças, como diabetes tipo I, lúpus eritematoso sistêmico, artri te reumatoide, cirrose biliar primária, asma alérgica, esclerose múltipla, ví rus da imunodeficiência humana -1 e tuberculose pulmonar (Yanagihara et al., 1999; Oishi et al., 2001; van der Vliet et al., 2002; Chan et al., 2003; Lin et al., 2005; Snyder -Cappione et al., 2007; Fletcher e Baxter, 2009) . Entretanto, o tipo de ação (patogênico ou protetor) das células iNKT é bastante complexo, variável e dependente de fatores como: momento da ativação, tipo de estimulo recebido, interação com diferentes células dendríticas e perfil de citocinas secretadas. Diante da relação entre diminuição das células iNKT e a endometriose, procuramos entender de que forma a alteração destas células estaria envolvida no desenvolvimento, manutenção ou evolução da doença. Sabemos po r estudos anteriores que a endometriose está associada a alterações na distribuição de linfócitos, nas células NK e nas respostas imunes Th1, Th2 e Th17 que levam a modificações na liberação de citocinas (Nap et al., 2004; Agic el al., 2006; Martinez et al ., 2007, Podgaec et al., Discussão 80 2007). Por outro lado, as células iNKT, quando estimuladas e dependendo no tipo de estimulo, tem a propriedade de secretar grandes quantidades de citocinas com padrão Th1, Th2 e Th17 (Taniguchi et al., 2003 ; Kronenberg, 2005; Au-Yeung; Fowell, 2007; Bendelac et al., 2007; Michel et al., 2007). Aggarwal et al ., em 2014 avaliaram a atividade citolítica das células NK e iNKT e citocinas de resposta Th1 e Th2 em pacientes com artrite reumatoide (AR). Os autores observaram uma diminuição da significativa na frequências das células iNKT nas pacientes com AR comparado s aos controles saudáveis (p<0,001). Além disso, enc ontraram aumento de expressão nas células iNKT das citocinas Th1 pró-inflamatórias IFN, TNF, IL-8 e IL-18 e diminuição da citocina Th2 anti -inflamatória IL-4 em pacientes com AR. Outro achado relevante foi a relação direta entre o aumento das citocinas I FN, TNF  e IL-18 e a diminuição da IL-4 com a gravidade da doença. Alterações das cél ulas iNKT também tem papel relevante no Lupus Eritematoso Sistemico (LES). As células iNKT estão diminuídas em frequência e em número absoluto em pacientes com LES. Como consequência há também nesses casos um desequilíbrio na relação Th1/Th2, aumento na se creção de IL -17, alteração na supressão da produção de auto -anticorpos e na função das células dendríticas, com implicação relevante na imunorregulaçao da doença (Chen et al., 2015). Portanto, as alterações na frequência de células iNKT, neste caso a diminuição, podem alterar ou polarizar o perfil de resposta imune com aumento ou diminuição na secreção de determinadas citocinas pró - Discussão 81 inflamatórias ou anti -inflamatórias que podem ser relacionadas ao desenvolvimento, manutenção e evolução da endometriose. Outro aspecto relevante é a possível influencia da fase do ciclo menstrual no sistema imune especialmente nos órgãos reprodutivos. Estrogênio e progesterona são suficientes para controlar varias d as funções endometriais, regulando a expressão de milhares de g enes durante o ciclo menstrual (Bulu n, 2009). Um perfil diferente nas frequências de células inflamatórias e secreção de citocinas é observado no sangue periférico, no líquido peritoneal e na urina de mulheres com endometriose , dependendo da fase do ciclo menstrual (Whitcomb et al., 2014; Sikora et al. , 2015; Rakhila et al., 2016) . Esses dados sugerem um papel importante dos hormônios esteróides sexuais na f isiologia do microambiente imunológico (Whitcomb et al., 2014; Sikora et al., 2015; Rakhila et al., 2016). A importância do estrogênio no desenvolvimento e manutenção da endometriose está bem estabelecida (Zhao et al., 2015). Mostramos, no presente estudo, que as células iNKT ainda estão diminuídas na fase secretora no grupo de pacientes com endometrios e profunda em comparação com aquele de pacientes sem endometriose. Essa diferença pode estar relacionada a anormalidades na secreção ou ação da progesterona em pacientes com endometriose (Patel, 2017; Patel, 2018). A resistência do receptor de progesterona é um dos fatores que tem sido relacionado ao desenvolvimento e manutenção da endometriose (Patel 2017; Patel 2018). Anormalidades na fisiologia da progesterona estão diretamente ligadas a modificações no ambiente imune no endométrio tópico Discussão 82 e ectópico. Portanto, supomos que as células iNKT diminuídas em pacientes com endometriose podem estar relacionadas à disfunção da progesterona frequentemente associada à doença. No mesmo contexto, nós indagamos se os subtipos de células iNKT estarão diminuídos na doenç a. Observamos uma diminuição dos sub tipos iNKT DN, os mais predominantes em humanos e que apresentam funções efetoras importantes durante a resposta imune (Gumperz et al., 2002; Lee et al., 2002). Questionamos ainda se as células iNKT poderiam expressar o utros marcadores de superfície, como os marcadores de ativação. Lee et al. 2002, mostraram que os su btipos de células iNKT CD4+ em indivíduos saudáveis expressam exclusivamente cadei a alfa da interleucina 2 (CD25). Neste estudo demonstramos que as células iNKT DN expressaram CD25 com maior frequência na fase proliferativa comparado à fase secretora de pacientes com endometriose profunda. Em contrapartida, não foi observado esse mesmo resultado em relação à expressão de CD25 pelas células iNKT CD4+. Estes resultados demonstraram que pacientes com endometriose têm subgrupos iNKT DN regulados e mostram um perfil regulatório na fase proliferativa da endometriose. Aspectos relacionados ao perfil hormonal das fases do ciclo menstrual, ação hormonal normal ou anor mal (secreção, mutações de receptores, resistência à progesterona) e resposta imune à estimulação hormonal podem ter um papel nas variações observadas nessas células. Além disso, a homogeneidade entre os grupos estudados no ciclo menstrual Discussão 83 é essencial para evitar erros e resultados falsos. Os dados basais do presente estudo mostram frequência semelhante de pacientes em fase proliferativa e secretora entre a endometriose e o grupo controle. Nosso estudo também compa rou as frequências de células iNKT no sangue periférico de acordo com os sintomas de endometriose (dismenorréia, dispareunia, dor pélvica acíclica , alterações intestinais cíclicas, alterações urinárias cíclicas) e estado de fertilidade. Identificamos diminuição das células iNKT CD4+ CCR7 + em pacientes com endometriose e dismenorreia intensa (EVA ≥ 7). A s evidências sugerem que cada subpopulação de células iNKT (CD4 +, CD8 + e CD4 -CD8-) produz um perfil de citocinas e ativação de células NK e B leva ndo a uma resposta Th diferente (Lin et al., 2006). O'Reilly et al., 2011, observaram um padrão de secreção diverso de citocinas IFNγ, TNFα, IL -1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL -12p70, IL -13, IL -17a e IL -22 após estimulação de células iNKT CD4+, CD8 + e iNKT CD4- CD8-. Vários estudos demonstraram que a frequência e as funções de sub tipos de células iNKT foram observadas em pacientes com diferentes doenças (Araki et al., 2003; Kenna et al., 2003; Montoya et al., 2007; Im et al., 2008; Bricard et a l., 2009; Laganà et al., 2016). As células iNKT DN possuem um importante padrão Th1, liberando maiores quantidades de IFNγ e TNFα após a estimulação (L iao et al., 2011). Neste aspecto , nossos resultados atuais demonstram uma porcentagem diminuída de iNKT DN em pa cientes com endometriose. Como as células iNKT DN produz em uma resposta Th1, como o equilíbrio T h1 / Th2 é Discussão 84 essencial para a homeostase imune e como as irregularidades Th1 / Th2 são observadas em pacientes com endometriose, é plausível supor uma implicação dessa anormalidade na fisiopatologia da endo metriose (Antsiferova et al. , 2005; Podgaec et al., 2007; Fairbanks et al., 2009; Podgaec et al., 2010; Liao et al., 2011; Szymanowski et al., 2013). No entanto, neste estudo, não foi possível demonstrar o perfil Th1 (IFNg e TNFa) em células iNKT DN ou em outros subtipos . No entanto, demonstramos que as cél ulas iNKT DN secretam citocinas IL -17 em menor proporção em pacientes com endometriose quando comparadas com mulheres sem endometriose. Foi observado também que estas células ainda estão diminuídas na fase secretora em pacientes com endometriose profunda. Por outro lado, mostramos um aumento na frequência de células iNKT CD4+ IL17 + em pacientes com endometriose e dismenorréia intensa (EVA ≥ 7) versus dismenorréia leve (EVA < 7). Além disso, observou-se um aumento da frequência de células iNKT CD4+ IL17+ em pacientes com endometriose e dor pélvica acíclica intensa (EVA ≥ 7) em comparação com pacientes com dor pélvica acíclica leve (EAV < 7) . A dismenorreia é o sintoma mais comum relacionado à endometrios e. O número de linfócitos T CD4+ e os níveis de IL -17 estão relacionados ao mecanismo de dor na condição inflamatória. A interleucina -17 é um membro de uma família de citocinas, que são predo minantemente produzidas por células T CD4 + ativadas. A IL -17 possui potentes propriedades pró -inflamatórias e está envolvida na modulação da resposta imune em distúrbios inflamatórios e dor Discussão 85 (Iwakura et al., 2011; Sun et al., 2017). Estudos anteriores mostr aram que níveis aumentados de IL -17 estão implicados na dor visceral e neuropática (Noma et al., 2011; Day et al., 2014). Demonstrou -se que o comportamento associado à dor está reduzido em camundongos após bloqueio da produção de IL-17 em modelos inflamató rios em nervos plantar ou isquiático e em modelos de lesão em nervos periféricos (Meng et al., 2013; Knier et al., 2015). As frequências anormais de iNKT CD4+ IL17 + observadas em nossos resultados podem ser, em parte, uma possível explicação para os sintomas de dor relacionados à endometriose. Como a frequência de células iNKT neste estudo não foi influenciada de acordo com os diferentes estágios da doença, é plausível pensar em uma provável homogeneidade na frequência das células iNKT, independente de alg umas caracte rísticas da doença. A diferença observada na frequência de células iNKT em pacientes com endometriose pode desempenhar um papel relevante no diagn óstico da doença, uma vez que as células podem ser um marcador potencial para a presença de endometriose ou alguns tipos de lesões de endometriose como a endometriose profunda infiltrativa. Em conjunto, os resultados de nosso estudo e o conhecimento prévio sobre a relação entre o sistema imune e a endometriose nos levam a supor que as células iNKT e seus subtipos podem desempenhar um papel importante na patogênese dessa doença. Anormalidades na frequência de células iNKT podem prejudicar o bom funcionamento do sistema Discussão 86 imunológico, permitindo a implantação e proliferação de lesões endometriose. As células iNKT também podem ter uma importância no tratamento da endometriose. Uma vez que outros estudos demonstraram recentemente um efeito positivo da imunoterapia pela ativação de células iNKT com diferentes antígenos na doença hepática, doença s autoimunes como AR e LES e terapia antitumoral, existe uma possibilidade real no uso desta forma de tratamento para outras doenças inflamatórias como endometriose (Subleski et al., 2011; Ghinnagow et al., 2017). As células iNKT têm um papel importante na homeostase imunológica e podem ser uma peça essencial no quebra -cabeça desta doença enigmática chamada endometriose. Os resultados do nosso estudo podem contribuir para o entendimento da fisiopatologia da endometriose e podem auxiliar no desenvolvimento de novos agent es diagnósticos e terapêuticos. Mais estudos são necessários para se chegar a conclusões definitivas a respeito do papel das células iNKT na endometriose. 87 6 Conclusões Conclusões 88 6. CONCLUSÕES Este estudo permitiu as seguintes conclusões: Pacientes com endometriose profunda tem a frequência de células iNKT, iNKT DN e iNKT DN IL17+ diminuída em relação às pacientes sem endometriose. A frequência das células iNKT não estão alteradas nas pacientes com endometriose profunda em relação aos sintomas de clínicos da doença. A frequência das células iNKT CD4+ CCR7+ encontra -se diminuída em pacientes com endometriose profunda e dismenorréia intensa. A frequência das células iNKT CD4+ IL17+ encontra -se aumentada em pacientes com endometriose profunda e dismeno rréia intensa e diminuída em pacientes com dor pélvica acíclica intensa em relação àquelas com dor pélvica acíclica leve. Não existe diferença nas frequências das células iNKT e os subtipos estudados em relação ao estádio da endometriose I/II ou III/IV. A fase secretora do ciclo menstrual está associada a menor frequência de células iNKT e iNKT DN IL17+ nas pacientes com endometriose profunda. As células iNKT CD4+ CD25+ e iNKT DN encontram-se com menor frequência na fase proliferativa do ciclo menstrual em comparação com os controles. Conclusões 89 As células iNKT DN CD25+ estão diminuídas na fase secretora em comparação a fase proliferativa nas pacientes com endometriose profunda. 90 7 Anexos Anexos 91 7. ANEXOS Anexo 1 - Parecer consubstanciado do comitê de éti ca e pesquisa com aprovação do estudo. Anexos 92 Anexo 1 (Cont.) - Parecer consubstanciado do comitê de ética e pesquisa com aprovação do estudo. Anexos 93 Anexo 2 - Termo de consentimento livre e esclarecido para pacientes com endometriose. HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ____________________________________________________________________________________ I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME: DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : SEXO M F DATA NASCIMENTO: ./ /. ENDEREÇO: Nº . APTO: .................. BAIRRO: CIDADE:...................................................................... CEP: TELEFONE: DDD (............)...................................................................... 2. RESPONSÁVEL LEGAL: . NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.):. DOCUMENTO DE IDENTIDADE: SEXO: M F DATA NASCIMENTO: ./ / ENDEREÇO: Nº:……… APTO:……………. BAIRRO: CIDADE: ……………………………………………... CEP: TELEFONE: DDD (………)……………………………………………….. _______________________________________________________________________________________ II - DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: “AVALIAÇÃO DAS CÉLULAS iNKT EM PACIENTES COM ENDOMETRIOSE” PESQUISADOR: MAURICIO SIMÕES ABRÃO CARGO/FUNÇÃO: PROFESSOR DOUTOR - INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº .CRM-SP: 52842 UNIDADE DO HCFMUSP: DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA 2. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: RISCO MÍNIMO RISCO MÉDIO RISCO BAIXO RISCO MAIOR 3. DURAÇÃO DA PESQUISA: 03 ANOS X Anexos 94 HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP 1 – A endometriose é uma doença ginecológica que acontece quando o tecido da parte interna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do abdômen, tais como: ovário, intestino, bexiga e peritôneo. Essa doença pode causar dores intensas no abdômen, principalmente cólicas no período menstrual, prejudicando muito a qualidade de vida das mulheres portadoras de endometriose. 2 - A Senhora está sendo convidada a participar de uma pesquisa que tem como objetivo verificar a presença de células que possam ser importantes na endometriose. A análise será feita em uma pequena quantidade de líquido presente no abdome e em uma pequena quantidade de sangue. Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo. 3 – Neste estudo, não serão realizados procedimentos experimentais. 4 - Será realizado procedimento rotineiro de coleta de sangue venoso (30 ml) no antebraço imediatamente antes do início do ato cirúrgico, esta coleta é igual à coleta de sa ngue para exames laboratoriais comuns. A coleta do líquido peritoneal (líquido que se encontra livre no interior do abdome) será realizada no início da cirurgia por meio de aspiração com seringa conectada a uma cânula de aspiração. Não há necessidade de pu ncionar ou penetrar com a cânula em qualquer órgão ou tecido para coleta do líquido peritoneal. A cirurgia é indicada para diagnóstico e tratamento da endometriose. A cirurgia será realizada por videolaparoscopia (cirurgia realizada por 3 a 4 pequenos orif ícios de 5mm a 10mm de diâmetro) em que será feita uma avaliação minuciosa da cavidade e órgãos pélvicos e abdominais e identificação das lesões de endometriose. Caso seja necessário pode haver mudança no local e tamanho das incisões por necessidade técnic a da cirurgia. Os dados do seu prontuário médico, referentes a esta internação, também serão consultados. 5 – Não se espera que haja qualquer efeito adverso adicional para a paciente, além do risco mínimo da coleta de sangue (pequeno hematoma no local da p unção no antebraço) e dos riscos da própria cirurgia, quando também será coletado o fluido peritoneal. A coleta do liquido peritoneal não acrescenta risco adicional à realização da cirurgia. 6 – Não há benefício direto para o participante: Trata-se de estudo testando a hipótese de que poderemos identificar células que possivelmente estejam envolvidas na progressão da endometriose. Somente, ao final do estudo, poderemos concluir algum benefício para a paciente, ou seja, conhecer melhor a doença e posteriorme nte contribuir para a escolha do melhor tratamento. 7 – Não há procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais a paciente possa optar. 8 – Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esc larecimentos de eventuais dúvidas. O principal investigador é o Dr. Frederico José Silva Corrêa, que pode ser encontrado no endereço (Hospital das Clínicas – Av. Dr. Enéas de Carvalho, 255 – Divisão de Clínica Ginecológica, 10° andar, sala 10.166 – São Pau lo/SP, Tel.(11) 2661 -6647. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comité de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio Anexos 95 Pires de Campos, 225 – 5° andar, tel: (11) 2661 -6442, ramais 16, 17, 18 ou 20. FAX: (11) 2661-6442 – ramal 26. E-mail: [email protected] 9 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na Instituição. 10 – As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outras pacientes, não sendo divulgada a identificação de nenhuma paciente. 11 – A paciente tem o direito de se manter atualizada sobre todos os resultados parciais da pesquisa. 12 – Não há despesas pessoais par a o participante em qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada à sua participação. 13 – Os dados obtidos e o material coletado serão utilizados somente para o estudo em questão. Acredito ter sid o suficientemente informada a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo “AVALIAÇÃO DAS CÉLULAS iNKT EM PACIENTES COM ENDOMETRIOSE”. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro, também, que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso ao tratamento hospitalar quando necessário. Concord o, voluntariamente, em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o desenvolvimento deste, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. __________________________________ Data: ____/____/____ Assinatura do paciente/representante legal ______________________________________ Data: ____/____/____ Assinatura da testemunha (para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabet os, semianalfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual) Declaro que obtive, de forma apropriada e voluntária, o Consentimento Livre e Esclarecido desta paciente ou representante legal para a participação neste estudo. __________________________________ Data: ____/____/____ Assinatura do responsável pelo estudo Dr. Frederico José Silva Corrêa Anexos 96 Anexo 3 - Termo de consentimento livre e esclarecido para pacientes sem endometriose. HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ___________________________________________________________________________________ I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME: DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : SEXO M F DATA NASCIMENTO: ./ /. ENDEREÇO: Nº . APTO: .................. BAIRRO: CIDADE:...................................................................... CEP: TELEFONE: DDD (............)...................................................................... 2. RESPONSÁVEL LEGAL: . NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.):. DOCUMENTO DE IDENTIDADE: SEXO: M F DATA NASCIMENTO: ./ / ENDEREÇO: Nº:……… APTO:……………. BAIRRO: CIDADE: …………………………………………………... CEP: TELEFONE: DDD (………)……………………………………………….. _______________________________________________________________________________________ II - DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: “AVALIAÇÃO DAS CÉLULAS iNKT EM PACIENTES COM ENDOMETRIOSE” PESQUISADOR: MAURÍCIO SIMÕES ABRÃO CARGO/FUNÇÃO: PROFESSOR DOUTOR INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº .CRM-SP: 52842 UNIDADE DO HCFMUSP: DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA 2. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: RISCO MÍNIMO RISCO MÉDIO RISCO BAIXO RISCO MAIOR 3. DURAÇÃO DA PESQUISA: 03 ANOS X Anexos 97 HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP 1 – A endometriose é uma doença ginecológica que acontece quando o tecido da parte interna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do abdômen, tais como: ovário, intestino, bexiga e peritôneo. Essa doença pode causar dores intensa s no abdômen, principalmente cólicas no período menstrual, prejudicando muito a qualidade de vida das mulheres portadoras de endometriose. 2 - A Senhora está sendo convidada a participar de uma pesquisa que tem como objetivo verificar a presença de célula s que possam ser importantes na endometriose. A análise será feita em uma pequena quantidade de líquido presente no abdome e em uma pequena quantidade de sangue. Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo. 3 – Neste estudo, não serão realizados procedimentos experimentais. 4 - Será realizado procedimento rotineiro de coleta de sangue venoso (30 ml) no antebraço imediatamente antes do início do ato cirúrgico, esta coleta é igual à coleta de sangue para exames laboratoriais comuns. A coleta do líquido peritoneal (líquido que se encontra livre no interior do abdome) será realizada no início da cirurgia por meio de aspiração com seringa conectada a uma cânula de aspiração. Não há necessidade de puncionar ou penetrar c om a cânula em qualquer órgão ou tecido para coleta do líquido peritoneal. A cirurgia é indicada para laqueadura tubária bilateral (ligadura das trompas) A cirurgia será realizada por videolaparoscopia (cirurgia realizada por 3 a 4 pequenos orifícios de 5 mm a 10mm de diâmetro) em que será feita uma avaliação minuciosa da cavidade e órgãos pélvicos e abdominais e identificação de possíveis lesões e ligadura das trompas. Caso seja necessário pode haver mudança no local e tamanho das incisões por necessidade técnica da cirurgia. Os dados do seu prontuário médico, referentes a esta internação, também serão consultados. 5 – Não se espera que haja qualquer efeito adverso adicional para a paciente, além do risco mínimo da coleta de sangue (pequeno hematoma no loca l da punção no antebraço) e dos riscos da própria cirurgia, quando também será coletado o fluido peritoneal. A coleta do liquido peritoneal não acrescenta risco adicional à realização da cirurgia. 6 – Não há benefício direto para o participante: Trata-se de estudo testando a hipótese de que poderemos identificar células que possivelmente estejam envolvidas na progressão da endometriose. Somente no final do estudo poderemos concluir algum benefício para a paciente, ou seja, conhecer melhor a doença e posteri ormente contribuir para a escolha do melhor tratamento. 7 – Não há procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais a paciente possa optar. 8 – Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimentos de eventuais dúvidas. O principal investigador é o Dr. Frederico José Silva Corrêa, que pode ser encontrado no endereço (Hospital das Clínicas – Av. Dr. Enéas de Carvalho, 255 – Divisão de Clínica Ginecológica, 10° andar, sala 10.166 – São Paulo/SP, Tel.(11) 2661 -6647. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio Anexos 98 Pires de Campos, 225 – 5° andar, tel: (11) 2661 -6442, ramais 16, 17, 18 ou 20. FAX: (11) 2661-6442 – ramal 26. E-mail: [email protected] 9 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na Instituição. 10 – As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outras pacientes, não sendo divulgada a identificação de nenhuma paciente. 11 – A paciente tem o direito de se manter atualizada sobre todos os resultados parciais da pesquisa. 12 – Não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada à sua participação. 13 – Os dados obtidos e o material coletado serão utilizados somente para o estudo em questão. Acredito ter sido suficientemente informada a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo “AVALIAÇÃO DAS CÉLULAS iNKT EM PACIENTES COM ENDOMETRIOSE”. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a se rem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concord o, voluntariamente, em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. __________________________________ Data: ____/____/____ Assinatura do paciente/representante legal ______________________________________ Data: ____/____/____ Assinatura da testemunha (Para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semianalfa betos ou portadores de deficiência auditiva ou visual.) Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido desta paciente ou representante legal para a participação neste estudo. __________________________________ Data: ____/____/____ Assinatura do responsável pelo estudo Dr. Frederico José Silva Corrêa Anexos 99 Anexo 4 - Escala Visual Analógica (EVA) Anexos 100 Anexo 5 - Tabela com a d escrição e comparação das médias das frequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico , segundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e resultado da comparação entre os grupos . Resultados com média e desvio padrão. Grupo Variável Controle Endometriose p (N = 26) (N = 47) iNKT 0,23 ± 0,25 0,17 ± 0,55 0,010 iNKT CD4+ 32,2 ± 21 37 ± 27,4 0,673 iNKT CD4+/CCR7 31,6 ± 31 35,6 ± 30,6 0,439 iNKT CD4+/CD25 25,8 ± 18,5 33,5 ± 23,1 0,168 iNKT DN 48,2 ± 21,4 34,6 ± 24,5 0,020 iNKT DN/CCR7 6,76 ± 14,08 11,18 ± 15,87 0,801 iNKT DN/CD25 33,8 ± 29,8 39,7 ± 31,8 0,416 iNKT CD4+/IL6 5,55 ± 5,71 1,37 ± 1,94 0,081 iNKT CD4+/IL10 3,08 ± 2,26 4,36 ± 5,51 0,856 iNKT CD4+/IL17 13 ± 4 8,7 ± 5,5 0,160 iNKT CD8+/IL6 6,37 ± 5,8 3,44 ± 4,25 0,196 iNKT CD8+/IL10 3,81 ± 2,91 4,53 ± 3,88 0,881 iNKT CD8+/IL17 9,11 ± 4,65 10,99 ± 14,18 0,455 iNKT DN/IL6 1,99 ± 2,57 0,74 ± 1,12 0,127 iNKT DN/IL10 0,35 ± 0,39 0,44 ± 0,88 0,356 iNKT DN/IL17 11,5 ± 5 7,8 ± 4,2 0,050 Teste Mann-Whitney Anexos 101 Anexo 6 - Tabela com a descrição e comparação das médias d as frequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintoma de dismenorréia de intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e desvio padrão. Dismenorréia Variável < 7 ≥ 7 p (N = 17) (N = 30) iNKT 0,08 ± 0,1 0,23 ± 0,69 0,538 iNKT CD4+ 38,4 ± 23,6 36,1 ± 29,8 0,613 iNKT CD4+/CCR7 51 ± 21,7 26,9 ± 31,8 0,022 iNKT CD4+/CD25 31,2 ± 21,7 34,9 ± 24,3 0,547 iNKT DN 27,5 ± 23,7 39,3 ± 24,3 0,098 iNKT DN/CCR7 12,67 ± 15,57 10,27 ± 16,28 0,330 iNKT DN/CD25 48,1 ± 28,5 35 ± 33,1 0,193 iNKT CD4+/IL6 1 ± 1,17 1,61 ± 2,4 >0,999 iNKT CD4+/IL10 3,21 ± 2,67 5,02 ± 6,76 0,925 iNKT CD4+/IL17 4,3 ± 4 11,1 ± 4,7 0,038 iNKT CD8+/IL6 3,87 ± 5,19 3,2 ± 3,97 0,835 iNKT CD8+/IL10 5,64 ± 4,5 3,91 ± 3,63 0,461 iNKT CD8+/IL17 14,11 ± 22,78 9,26 ± 7,61 0,593 iNKT DN/IL6 0,65 ± 0,92 0,77 ± 1,25 0,867 iNKT DN/IL10 0,2 ± 0,41 0,55 ± 1,03 0,706 iNKT DN/IL17 5,4 ± 4,2 8,9 ± 4 0,246 Teste Mann-Whitney Anexos 102 Anexo 7 - Tabela com a desc rição e comparação das médias das frequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintoma de dor pélvica acíclica de intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e desvio padrão. Dor pélvica aciclica Variável < 7 ≥ 7 p (N = 38) (N = 9) iNKT 0,19 ± 0,6 0,08 ± 0,09 0,593 iNKT CD4+ 36,8 ± 27,1 38,2 ± 31,7 0,958 iNKT CD4+/CCR7 34,4 ± 30,1 42,2 ± 35,1 0,635 iNKT CD4+/CD25 32,4 ± 23,4 39,5 ± 22,9 0,493 iNKT DN 34,4 ± 25,1 36,2 ± 22,4 0,851 iNKT DN/CCR7 11,81 ± 16,94 8,07 ± 9,01 >0,999 iNKT DN/CD25 39,7 ± 31,8 39,9 ± 34,8 0,894 iNKT CD4+/IL6 0,74 ± 1,02 3,89 ± 3,25 0,267 iNKT CD4+/IL10 4,8 ± 6,5 3,18 ± 1,13 0,921 iNKT CD4+/IL17 7 ± 5,2 13,1 ± 3,9 0,048 iNKT CD8+/IL6 3,72 ± 4,83 2,73 ± 2,76 0,945 iNKT CD8+/IL10 5,2 ± 4,24 2,84 ± 2,44 0,454 iNKT CD8+/IL17 13,27 ± 16,36 5,31 ± 2,92 0,539 iNKT DN/IL6 0,93 ± 1,3 0,31 ± 0,35 0,710 iNKT DN/IL10 0,34 ± 0,77 0,67 ± 1,18 0,503 iNKT DN/IL17 8,3 ± 5 6,7 ± 1,3 0,503 Teste Mann-Whitney Anexos 103 Anexo 8 - Tabela com a descrição e comparação das médias das frequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintoma de dispareunia de intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e desvio padrão. Dispareunia Variável < 7 ≥ 7 p (N = 37) (N = 10) iNKT 0,21 ± 0,61 0,05 ± 0,07 0,111 iNKT CD4+ 38 ± 27,2 32,7 ± 29,5 0,582 iNKT CD4+/CCR7 39,2 ± 31,4 21,7 ± 23,7 0,209 iNKT CD4+/CD25 33,5 ± 23,7 33,5 ± 22,2 0,960 iNKT DN 34,4 ± 25,1 35,7 ± 23,4 0,702 iNKT DN/CCR7 13,4 ± 17,09 3,05 ± 5,22 0,092 iNKT DN/CD25 42,4 ± 32,2 29,1 ± 29,7 0,311 iNKT CD4+/IL6 1,32 ± 2,05 1,79 ± 0 0,800 iNKT CD4+/IL10 4,71 ± 6,1 2,8 ± 0,16 0,909 iNKT CD4+/IL17 8,1 ± 5 11 ± 9,2 0,582 iNKT CD8+/IL6 3,25 ± 4,26 3,92 ± 4,86 >0,999 iNKT CD8+/IL10 5 ± 4,25 3,34 ± 2,93 0,454 iNKT CD8+/IL17 11,05 ± 16,09 10,86 ± 9,76 0,635 iNKT DN/IL6 0,96 ± 1,2 0 ± 0 0,161 iNKT DN/IL10 0,33 ± 0,73 0,81 ± 1,41 0,811 iNKT DN/IL17 7,6 ± 4,3 8,6 ± 4,6 0,811 Teste Mann-Whitney Anexos 104 Anexo 9 - Tabela com a descrição e comparação das médias das frequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintoma de alteração intestinal cíclica de intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e desvio padrão. Alteração intestinal cíclica Variável < 7 ≥ 7 p (N = 40) (N = 7) iNKT 0,18 ± 0,59 0,11 ± 0,1 0,701 iNKT CD4+ 34 ± 26,3 55 ± 29 0,081 iNKT CD4+/CCR7 37,6 ± 31,7 24,7 ± 22,8 0,293 iNKT CD4+/CD25 34,6 ± 23,5 27,4 ± 21,6 0,363 iNKT DN 36,9 ± 24,3 20,6 ± 22,4 0,171 iNKT DN/CCR7 12,36 ± 16,7 4,12 ± 6,5 0,297 iNKT DN/CD25 41,7 ± 32,2 28,4 ± 29,5 0,370 iNKT CD4+/IL6 0,59 ± 1,01 3,19 ± 2,6 0,183 iNKT CD4+/IL10 4,83 ± 6,49 3,11 ± 1,16 >0,999 iNKT CD4+/IL17 8,6 ± 6,2 8,7 ± 3,7 0,630 iNKT CD8+/IL6 2,99 ± 4,27 5,09 ± 4,63 0,291 iNKT CD8+/IL10 5,03 ± 4,17 2,67 ± 2,06 0,555 iNKT CD8+/IL17 12,83 ± 15,62 4,26 ± 0,65 0,555 iNKT DN/IL6 0,83 ± 1,26 0,41 ± 0,36 >0,999 iNKT DN/IL10 0,55 ± 0,98 0,08 ± 0,15 0,937 iNKT DN/IL17 7,9 ± 4,8 7,3 ± 0,4 0,811 Teste Mann-Whitney Anexos 105 Anexo 10 - Tabela com a descrição e comparação das médias das frequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sint oma de alteração urinária cíclica de intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e desvio padrão. Alteração urinária cíclica Variável < 7 ≥ 7 p (N = 46) (N = 1) iNKT 0,18 ± 0,55 0,03 ± 0 0,591 iNKT CD4+ 36,7 ± 27,6 50 ± 0 0,714 iNKT CD4+/CCR7 34,5 ± 30,2 77,5 ± 0 0,154 iNKT CD4+/CD25 32,8 ± 23 60 ± 0 0,200 iNKT DN 34,4 ± 24,7 45 ± 0 0,698 iNKT DN/CCR7 10,27 ± 14,91 48,6 ± 0 0,143 iNKT DN/CD25 39,1 ± 32 62,5 ± 0 0,615 iNKT CD4+/IL6 1,31 ± 2,05 1,89 ± 0 0,600 iNKT CD4+/IL10 4,42 ± 5,81 3,77 ± 0 0,727 iNKT CD4+/IL17 9,1 ± 5,5 3,8 ± 0 0,545 iNKT CD8+/IL6 3,7 ± 4,31 0 ± 0 0,429 iNKT CD8+/IL10 4,14 ± 3,75 9,52 ± 0 0,286 iNKT CD8+/IL17 11,11 ± 14,76 9,52 ± 0 0,857 iNKT DN/IL6 0,61 ± 1,07 2,27 ± 0 0,308 iNKT DN/IL10 0,29 ± 0,72 2,27 ± 0 0,308 iNKT DN/IL17 7,3 ± 4 13,6 ± 0 0,462 Teste Mann-Whitney Anexos 106 Anexo 11 - Tabela com a descrição e comparação das médias das frequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em pacientes com endometriose profunda infiltrativa estádio I/II ou III/IV . Resultados em média e desvio padrão. Estadio Variável I/II III/IV p (N = 11) (N = 33) iNKT 0,08 ± 0,1 0,21 ± 0,63 0,574 iNKT CD4+ 32,2 ± 24,9 38,4 ± 28,3 0,652 iNKT CD4+/CCR7 39,1 ± 26 34,4 ± 32,4 0,716 iNKT CD4+/CD25 37,3 ± 15,9 32,2 ± 25,2 0,770 iNKT DN 41,8 ± 21 32,2 ± 25,4 0,146 iNKT DN/CCR7 15,7 ± 16,61 9,58 ± 15,56 0,081 iNKT DN/CD25 44,8 ± 26 37,7 ± 34 0,842 iNKT CD4+/IL6 0 ± 0 1,52 ± 1,99 0,600 iNKT CD4+/IL10 6,45 ± 0 4,15 ± 5,76 0,364 iNKT CD4+/IL17 3,2 ± 0 9,2 ± 5,4 0,364 iNKT CD8+/IL6 9,09 ± 0 3 ± 4,09 0,429 iNKT CD8+/IL10 9,09 ± 0 4,17 ± 3,8 0,429 iNKT CD8+/IL17 54,5 ± 0 7,65 ± 6,93 0,143 iNKT DN/IL6 0,74 ± 1,12 iNKT DN/IL10 0,44 ± 0,88 iNKT DN/IL17 7,8 ± 4,2 Teste Mann-Whitney Anexos 107 Anexo 12 - Dados clinicos de 47 pacientes com endometriose profunda N° Idade Raça IMC DM DPA DP AIC AUC Infertilidade Estadio Fase ciclo 1 28 Branca 19,8 6 6 0 4 0 Sim III/IV Secretora 2 21 Branca 23,2 8 2 6 5 0 Sim III/IV Proliferativa 3 31 Branca 21,8 5 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora 4 41 Branca 21,9 3 0 2 0 0 Sim I/II Secretora 5 41 Branca 19,6 9 0 7 9 0 Não III/IV Proliferativa 6 34 Parda 22,3 9 4 0 0 0 Sim I/II Secretora 7 33 Amarela 23,1 5 0 0 0 0 Não tentou III/IV Secretora 8 31 Branca 18,6 0 0 8 7 0 Sim III/IV Secretora 9 40 Branca 21,3 9 6 7 5 0 Sim III/IV Secretora 10 35 Branca 27,5 7 7 0 0 0 Sim III/IV Secretora 11 27 Branca 19,1 9 8 5 0 0 Não tentou III/IV Proliferativa 12 49 Branca 19,4 0 0 1 0 0 Não III/IV Proliferativa 13 36 Branca 24,3 7 0 0 4 0 Não tentou III/IV Proliferativa 14 36 Branca 21,1 0 0 0 0 0 Não tentou I/II Secretora 15 34 Branca 18,4 9 0 6 0 0 Não III/IV Secretora 16 32 Branca 23,8 8 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora 17 35 Branca 21,9 0 0 0 0 0 Não III/IV Secretora 18 30 Branca 20,7 9 0 4 0 8 Sim III/IV Proliferativa 19 30 Branca 19,8 9 6 10 9 0 Não III/IV Proliferativa 20 38 Branca 17,9 0 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora 21 47 Branca 22,0 7 8 7 0 0 Não tentou III/IV Secretora 22 29 Branca 22,1 7 0 5 0 0 Sim III/IV Secretora 23 39 Branca 20,8 8 5 4 0 4 Sim III/IV Proliferativa 24 35 Branca 20,6 9 9 9 0 0 Sim III/IV Secretora 25 30 Branca 22,2 9 0 0 10 0 Não tentou III/IV Proliferativa 26 35 Branca 24,2 10 7 0 6 5 Não tentou III/IV Secretora 27 25 Negra 17,7 8 6 7 0 0 Sim I/II Secretora 28 30 Branca 20,7 8 5 7 0 0 Sim III/IV Proliferativa 29 37 Branca 23,2 10 0 0 0 0 Não tentou III/IV Proliferativa 30 43 Branca 25,2 8 0 7 9 0 Sim I/II Secretora 31 29 Branca 20,3 5 0 0 0 0 Sim I/II Proliferativa 32 37 Negra 20,2 8 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora 33 37 Branca 25,1 1 0 0 0 0 Não III/IV Secretora 34 37 Branca 27,2 10 0 0 3 0 Não tentou I/II Secretora 35 36 Branca 23,1 9 0 2 0 0 Não tentou III/IV Secretora 36 27 Branca 25,8 8 0 0 0 0 Não tentou I/II Proliferativa 37 28 Branca 18,2 4 2 0 0 0 Não tentou I/II Secretora 38 45 Branca 33,3 5 0 0 0 0 Não III/IV Proliferativa 39 45 Branca 26,1 5 0 5 0 0 Sim I/II Secretora 40 27 Branca 22,6 7 10 0 0 0 Não III/IV Secretora 41 30 Branca 23,9 3 0 2 0 0 Sim I/II Secretora 42 36 Amarela 22,0 8 7 0 7 0 Não tentou III/IV Secretora 43 38 Branca 23,2 6 3 0 0 0 Não III/IV Secretora 44 32 Branca 21,9 0 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora 45 21 Branca 20,9 10 8 0 7 0 Sim III/IV Secretora 46 37 Branca 32,4 10 10 10 0 0 Sim III/IV Secretora 47 39 Branca 25,4 8 0 3 0 0 Sim III/IV Proliferativa Anexos 108 Anexo 13 - Dados clinicos de 26 pacientes com endometriose profunda N° Idade Raça IMC DM DPA DP AIC AUC Infertilidade Fase ciclo 1 31 Branca 26,1 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 2 34 Negra 20,4 0 0 0 0 0 Não Secretora 3 39 Parda 24,2 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 4 35 Parda 19,4 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 5 30 Branca 20,7 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 6 25 Parda 24,6 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 7 31 Branca 25,1 0 0 0 0 0 Não Secretora 8 35 Parda 26,1 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 9 43 Branca 23,0 6 8 8 0 0 Não Secretora 10 43 Branca 22,3 7 5 0 0 0 Não Secretora 11 32 Branca 21,5 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 12 36 Branca 26,8 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 13 33 Parda 24,1 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 14 35 Branca 23,6 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 15 38 Parda 28,4 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 16 37 Branca 25,7 0 0 0 0 0 Não Secretora 17 33 Branca 30,8 0 0 0 0 0 Não Secretora 18 36 Parda 23,6 0 0 0 0 0 Não Secretora 19 33 Branca 21,6 0 0 0 0 0 Não Secretora 21 33 Parda 22,9 4 0 0 0 0 Não Secretora 22 34 Branca 20,3 0 0 0 0 0 Não Secretora 23 44 Branca 19,8 4 5 0 5 0 Não Secretora 24 27 Branca 21,7 10 0 0 0 0 Não Secretora 25 30 Parda 31,1 0 0 0 0 0 Não Proliferativa 26 32 Branca 26,4 2 0 0 0 0 Não Proliferativa 27 39 Branca 25,4 10 10 0 5 0 Não tentou Proliferativa Anexos 109 Anexo 14 – Resultado das frequências das células iNKT e subtipos de 47 pacientes com endometriose profunda. continua N iNKT iNKT CD4+ iNKT CD4+/ CCR7 iNKT CD4+/ CD25 iNKT DN iNKT DN/ CCR7 iNKT DN/ CD25 iNKT CD4+ / IL6 iNKT CD4+/ IL10 iNKT CD4+/ IL17 iNKT CD8+/ IL6 iNKT CD8+/ IL10 iNKT CD8+/ IL17 iNKT DN/ IL6 iNKT DN/ IL10 iNKT DN/ IL17 1 0,083 16,2 67,7 0 0 0,00 0 0 8,33 1,96 0 9,8 2 0,002 100 0 50 66,7 0,00 100 3 0,000 40,9 41,3 17,63 28 0,00 28,6 0 0 0 0 11,1 0 0 0 0 4 0,102 60 55,6 27,5 37,7 6,90 34,5 5 0,039 73 44,6 40,3 1,38 0,00 66,7 6 0,036 16,7 0 0 50 0,00 0 7 0,012 44,4 75 0 0 0,00 8 0,000 53 13,6 0 0 0,00 0 1,79 2,680 4,46 10 5 5 0 0 7,14 9 0,049 40 0 0 54,3 0,00 0 0 0 25 0 0 13,8 10 0,038 52,9 79,7 70,3 45 23,80 66,7 0 0 7,14 11 0,034 67 66,7 50,3 14,9 14,30 85,7 12 0,035 55,1 68,4 54,3 28,6 20,00 80 13 0,031 30,3 55 44,6 22,5 22,20 66,7 14 0,034 71,3 45,4 32,1 5,5 23,50 58,8 0 6,450 3,23 9,09 9,09 54,5 15 0,160 60,3 0 18,2 18,2 0,00 0 16 0,109 10,6 0 0 81,2 44,90 68,1 0 20,000 10 7,14 7,14 0 0 0 8,47 17 0,036 81,1 0 16,2 16,2 0,00 0 18 0,033 50 77,5 60 45 48,60 62,5 1,89 3,770 3,77 0 9,52 9,52 2,27 2,27 13,6 19 0,190 18,4 0 40,3 40,3 0,00 6,9 20 0,303 12,7 48,6 68,3 69 10,00 68,3 2,22 3,7 9,63 0,274 3,01 2,74 0,649 0,812 4,71 21 0,000 0,00 2,91 17,5 0 6,45 9,68 0 2,44 4,88 22 0,094 46,6 83,5 57,7 28,4 55,90 54,2 23 0,047 13,3 73,3 24 0,017 0 0 30 60 0,00 0 25 0,159 93,6 0 0 0 0,00 0 Anexos 110 Anexo 14 – Resultado das frequências das células iNKT e subtipos de 47 pacientes com endometriose profunda (conclusão). N iNKT iNKT CD4+ iNKT CD4+/ CCR7 iNKT CD4+/ CD25 iNKT DN iNKT DN/ CCR7 iNKT DN/ CD25 iNKT CD4+ / IL6 iNKT CD4+/ IL10 iNKT CD4+/ IL17 iNKT CD8+/ IL6 iNKT CD8+/ IL10 iNKT CD8+/ IL17 iNKT DN/ IL6 iNKT DN/ IL10 iNKT DN/ IL17 26 0,040 76 0 2,38 4,76 0,00 0 27 0,000 0 11,2 53,3 30,6 8,89 53,3 28 0,174 10,1 53,8 55,9 52,3 4,27 55,9 29 0,061 0 0 8,35 16,7 0,00 0 0 0,000 8,57 0 0 13,3 0 0 3,23 30 0,017 66,7 50 48,3 46,7 14,30 50 31 0,020 24,3 72,2 42,1 29,7 9,09 54,5 32 0,851 28,2 0 5,56 5,56 0,00 0 33 0,000 0 42,4 28,6 12,50 56,2 34 0,030 14,8 0 31,8 61,5 0,00 0 35 3,610 6,09 0 81,7 81,7 0,00 2,25 36 0,096 29,9 44,8 39 29 11,50 49 37 0,062 76,9 60,00 87,5 38 0,070 17 65,6 47,8 15,6 0,00 80 39 0,349 11,8 49 54,1 66,9 15,40 41,3 40 0,151 8,18 66,7 48,4 56,8 8,00 40 41 0,104 26,9 63,1 44,45 24,8 23,10 64,1 42 0,247 25 39,8 35,5 35,5 10,40 47 6,19 4,420 11,5 4,46 1,91 3,82 0,585 0 7,02 43 0,111 44,7 48,7 20,8 20,8 22,20 19,4 44 0,042 55,6 18,5 45 1,59 2,220 10,2 0,795 1,1 3,95 0,642 0,253 7,77 46 5,66 1,89 3,77 47 0 1,820 16,4 10,7 7,14 14,3 3,45 0 13,8 Anexos 111 Anexo 15 – Resultado das frequências das células iNKT e subtipos de 26 pacientes sem endometriose profunda N iNKT iNKT CD4+ iNKT CD4+/CCR 7 iNKT CD4+/ CD25 iNKT DN iNKT DN/ CCR7 iNKT DN/ CD25 iNKT CD4+ /IL6 iNKT CD4+/ IL10 iNKT CD4+/ IL17 iNKT CD8+/ IL6 iNKT CD8+/ IL10 iNKT CD8+/ IL17 iNKT DN/ IL6 iNKT DN/ IL10 iNKT DN/ IL17 1 0,558 7,15 40,3 36,1 66,6 3,88 44 14,9 7,460 14,9 16,8 4,8 9,07 7,66 0,806 13,9 2 0,580 41,5 39,5 5,87 52,5 1,78 43,7 3 0,024 73,1 60,8 30,4 23,1 6,04 64 4 0,379 68,8 54,5 36,4 31,2 0,03 60 5 0,270 8,38 42,3 5,63 59,1 1,45 43,1 1,85 3,7 14,8 4,52 1,58 4,07 1,28 1,02 8,44 6 0,032 36,4 59,6 36 51,7 0,00 55,4 12 0 16 7,89 1,32 5,26 2,08 0 10,4 7 0,193 50 60 12 40 0,00 55 8 0,058 31,6 62,2 18,9 55,8 0,00 48 9 0,620 25,2 0 37,1 62,6 0,15 0 10 0,382 69,6 0 41,5 26,7 0,10 0 11 0,098 19,5 0 36 73,4 0,25 0 12 0,053 20,7 0 0 31 0,08 0 13 0,039 43,5 0 0 52,2 0,00 0 14 0,507 11,3 0 58,6 87,5 0,50 0 15 0,100 14,7 40 26 57,4 1,30 46,2 16 0,101 44,4 0 0 38,9 0,01 0 4,83 1,93 16,9 10,2 2,82 9,6 0,608 0,304 14 17 0,061 0 0 0 0,02 0 18 0,306 38,2 0 28 54,5 0,02 0 19 0,938 28,6 34 23,2 63,2 1,61 34 1,13 2,71 6,55 1,27 2,53 12 0,477 0,191 8,11 20 0,052 0 0 0 0 0,09 0 21 0,303 26,9 57,1 28,5 69,2 0,01 66,7 22 0,034 66,2 34,00 72,3 3,57 0 21,4 23 0,013 21,1 92,3 57,7 53,7 45,50 68,2 24 31,7 0 3,01 8,27 0 3,85 6,15 0,258 0,517 5,17 25 0,063 62,6 83,1 49,3 31,3 36,60 69 4,17 2,78 13,9 3,92 9,8 17,6 0 0 10,2 26 0,066 30,6 58,3 35,70 76,2 112 8 Referências Referências 113 8. 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