{"paper_id":"91351b0a-0562-451e-ad91-725a23066026","body_text":"FREDERICO JOSÉ SILVA CORRÊA \n \n \n \n \n \n \nAvaliação das células iNKT em  \npacientes com endometriose \n \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina \nda Universidade de São Paulo para obtenção \nde título de Doutor em Ciências \nPrograma de Obstetrícia e Ginecologia \nOrientador: Prof. Dr. Maurício Simões Abrão \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSão Paulo \n2018\n\nDados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)\nPreparada pela Biblioteca da\nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo\n©reprodução autorizada pelo autor\nResponsável: Erinalva da Conceição Batista, CRB-8 6755\nCorrêa, Frederico José Silva\n   Avaliação das células iNKT em pacientes com\nendometriose / Frederico José Silva Corrêa. -- São\nPaulo, 2018.\n   Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da\nUniversidade de São Paulo.\n   Programa de Obstetrícia e Ginecologia.\n   Orientador: Maurício Simões Abrão.\n   Descritores: 1.Endometriose 2.Células T\nmatadoras naturais 3.Interleucinas 4.Citometria de\nfluxo 5.Microscopia confocal 6.Dor pélvica \nUSP/FM/DBD-439/18\n\niii \n \nDedicatória \n \n \n \n \n \n \nAos meus pais \n Marcos e Nina \npelo exemplo de vida e de amor à família. \nMeu eterno respeito e gratidão. \n \n \n \nAos meus amados irmãos \nBruno, Rafael e Izadora \nPela amizade, incentivo e companheirismo. \n \n \n \nAos meus filhos \n João Victor, Geovanna e João Marcos, \ncriaturas maravilhosas que Deus me presenteou \ne que são a razão da minha vida. \n  \n\niv \n \nAgradecimentos \n \n \nAo Professor Doutor Mauricio Simões Abrão , obrigado  pela confiança , \nincentivo, orientação e amizade. Exemplo de competência e dedicação. \nSerei sempre grato.   \nÀ Professora Doutora Karina Inácio Carvalho  pelo apoio, orientação e \namizade. \nAo Professor Doutor Edmund Chada Baracat  pela oportunidade d e \nrealizar esse trabalho na pós graduação de Obstetrícia e Ginecologia da \nUSP. \nÀ Ana Eduarda Z. Carvalho  pelo apoio na realização dos experimentos, \nconfecção de figuras e pela amizade.  \nÀ Maria Lucia Carnevale Marin  pelo apoio na coleta de material, \narmazenamento e realização de experimentos. \nAos Srs. Marcus Vinicius de Nigro Corpa , Cristovao Luis P. Mangueira e \nThiago Pinheiro Arrais Aloia  pelo apoio na realização de experimentos e \npelas sugestões. \nAo Professor Doutor Sérgio Podgaec  pela amizade, sugestões  e \ncontribuições. \nAos Doutores Patrick Bellelis , João Antônio Dias Junior , Luiz Flávio \nCordeiro Fernandes , Lidia Hyun Joo Myung  pelas contribuições e \namizade. \nAo Doutor Rômulo Medeiros de Almeida pela amizade, apoio e incentivo. \n\nv \n \nAgradeço aos pacientes que participaram voluntariamente e sem as quais \nesse trabalho não seria possível. \nAgradeço a Deus por ter me permitido realizar esse objetivo e por tudo que \ntem realizado na minha vida.  \n \n \n  \n\nvi \n \n \n \n \n \n \n \n \nNormatização Adotada \n \n \n \n \n \nEsta dissertação ou tese está de aco rdo com as seguintes normas, em \nvigor no momento desta publicação: \n \nReferências: adaptado de International Committee of Medical Journals \nEditors (Vancouver). \n \nUniversidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de \nBiblioteca e Documentação. Guia de a presentação de dissertações, teses e \nmonografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. \nL. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos \nCardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e \nDocumentação; 2011.  \n \nAbreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals \nIndexed in Index Medicus. \n \n \n \n  \n\nvii \n \nSumário \n \n \n \nLista de abreviaturas, siglas e símbolos ........................................................ ix \nLista de figuras .............................................................................................. xii \nLista de gráficos ........................................................................................... xiii \nLista de quadros ............................................................................................ xv \nLista de tabelas ............................................................................................ xvi \nResumo ........................................................................................................ xvi \nAbstract ........................................................................................................ xix \n1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 1 \n1.1 Considerações gerais sobre o sistema imunológico ........................... 6 \n1.2 Considerações sobre os sistemas imunológico e a endometriose ... 14 \n1.3 As células Natural Killer .................................................................... 17 \n1.4 Subtipos de células iNKT .................................................................. 22 \n1.5 Células iNKT e endometriose ........................................................... 26 \n2. OBJETIVOS ........................................................................................... 27 \n3. MÉTODOS ............................................................................................. 29 \n3.1 Critérios de inclusão e exclusão ....................................................... 31 \n3.2 Dinâmica do estudo .......................................................................... 32 \n3.3 Quadro clínico ................................................................................... 33 \n3.4 Estadiamento da endometriose ........................................................ 34 \n3.5 Locais da endometriose .................................................................... 36 \n3.6 Confirmação da endometriose .......................................................... 36 \n3.7 Obtenção das células mononucleares do sangue periférico ............. 37 \n3.7.1 Sangue heparinizado .............................................................. 37 \n3.8 Análise dos marcadores de células iNKT por citometria de fluxo ..... 37 \n3.8.1 Descongelamento das células mononucleares do sangue \nperiférico (CMSP) ................................................................. 37 \n3.8.2 Imunofenotipagem de superfície celular em células \nmononucleares do sangue periférico .................................... 38 \n3.8.3 Estimulação das células iNKT para medição de citocinas ...... 44 \n\nviii \n \n3.8.4 Marcação por imuinofluorescência na microscopia confocal .. 45 \n3.9 Análise estatística ............................................................................ 46 \n4. RESULTADOS ...................................................................................... 49 \n4.1 Dados demongráficos e clínicos ...................................................... 49 \n4.2 Estadiamento da endometriose ....................................................... 52 \n4.3 Análise das frequências das células iNKT ....................................... 53 \n4.4 Análise das frequências dos subtipos de células iNKT .................... 55 \n4.5 Análise das frequências das células inkt e subtipos em relação \naos sintomas da endometriose ...................................................... 58 \n4.6 Análise das células inkt e o estádio da endometriose ..................... 66 \n4.7 Avaliação das células iNKT nas lesões de endometriose ................ 74 \n5. DISCUSSÃO .......................................................................................... 76 \n6. CONCLUSÕES ...................................................................................... 87 \n7. ANEXOS ................................................................................................ 90 \n8. REFERÊNCIAS ................................................................................... 112 \n \n \n \n\nix \n \nListas \n \nAbreviaturas \n \nα-GalCer α-galactosylceramida  \nAPC Antigen Presenting Cells (Células Apresentadoras de \nAntígenos) \nAR Artrite reumatóide \nASRM American Society of Reproductive Medicine \nbFGF basic fibroblast growth fator (fator de crescimento de \nfibroblasto básico)  \nBSA Bovine Serum Albumin \nCCR Receptor de quimiocinas \nCD Cluster of Differentiation \nCIVD Common variable immunodeficiency (imunodeficiência \ncomum variável) \nCLTs Cytotoxic T Lymphocytes (Linfócitos T citotóxicos) \nCXCR CXC chemokine receptor  (CXC receptor de quimiocinas) \nDAPI 4′,6-diamidino-2-phenylindole \nDMEM Dulbecco modified eagle medium \nDMSO Dimethyl Sulfoxide \nDN Duplo negativo \nEDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (Ácido etilenodiamino tetra-\nacético) \nEVA Escala visual analógica \nFACSDiva fluorescence-activated cell sorting Diva \nFSC Forward-scattered light \nGnRH Hormônio liberador de gonadotrofinas \nHE Hematoxilina-Eozina \nHIV Human Immunodeficiency Virus (Vírus da imunodeficiência \nhumana) \nHLA Human leukocyte antigen (Antígeno leucocitário humano) \n  \n\nx \n \nHTLV Human T-Cell Lymphotropic Virus (Vírus linfotrófico da célula \nT humana) \nIFN-gama Interferon gama \nIg Imunoglobulina \nIgA Imunoglobulina A \nIgD Imunoglobulina D \nIgE Imunoglobulina E \nIgG Imunoglobulina G \nIgM Imunoglobulina M \nIL Interleucina \nIL-17R Receptor de Interleucina 17 \nIL-1Ra IL-1 receptor antagonista (antagonista do receptor da \ninterleucina 1) \nIMC Indice de massa corporea  \niNKT Invariant Natural Killer T (Natural Killer T invariante) \nIP interferon-inducible protein (proteína 10 induzida por \ninterferon) \nLES Lupus Eritematoso Sistemico  \nMHC Major Histocompatibility Complex (Complexo Maior de \nHistocompatibilidade) \nNK Natural Killer \niNKT Natural Killer T \nNKG2D Receptor de ativação das células NK \nNKTDN Natural Killer T duplo negativo (CD4- e CD8-) \nNKTDP tural Killer T duplo positivo (CD4+ e CD8+) \nPBS Phosphate buffered saline \nPDGF Platelet derived growth fator (Fator de crescimento derivado \nde plaquetas) \nSSC Side-scattered light \nTCR T Cell Receptor (Receptor de Céluls T) \nTGFβ Transforming Groth Factor - β (Fator de Crescimento \nTransformante – β) \nTh T helper \nTNF-α Tumor Necrosis Factor  - alpha (Fator de Necrose Tumoral – \nalfa) \nTreg Células T reguladoras \n\nxi \n \nVα24 Receptor de células iNKT \nVβ11 Receptor de células iNKT \nVEGF Vascular Endothelial Growth Factor (Fator de Crescimento \nVascular endotelial) \n \n \n \n  \n\nxii \n \nFiguras \n \nFigura 1 -  Classificação de endometriose da American Society for \nReproductive Medicine, revisada em 1996 ............................. 35 \nFigura 2 -  A - Endometriose profunda de retossigm oide aderida à \nregião retrocervical. B - Endometriose profunda de região \nretrocervical, envolvendo os ligamentos útero -sacros \nbilaterais. ................................................................................. 36 \nFigura 3 -  Representação gráfica de Imunofenotipagem. Density Plot \nde citometria de fluxo de linfócitos ( 3a), seleção de gate \npara análise de viabilidade celular ( 3b), seleção de gate \nde linfócitos CD3 para CD4+ e CD8+ ( 3c) e células \nnatural Killer T (iNKT) (3d). ..................................................... 41 \nFigura 4 -  Representação gráfica de Imunofenotipagem. Density Plot \ncitometria de fluxo de linfócitos C D3 ( 4a), CD3+CCR7+ \n(4b) e CD3+CD25+ ( 4c). Density Plot  de citometria de \nfluxo de linfócitos CD4+ e CD8+ ( 4d), seleção de gate de \nlinfócitos CD8+CCR7+ ( 4e), CD8+CD25+ ( 4f) e linfócitos \nCD4+CCR7+ (4g) e CD4+CD25+ (4h). .................................. 42 \nFigura 5 - Representação gráfica de Imunofenotipagem de células \niNKT e seus sub-tipos (5b – 5h). Density Plot de citometria \nde fluxo de células iNKT com marcadores Vbeta11 e \nValpha24 (5a), seleção de gate de células iNKT CD4+ e \niNKT CD8+ ( 5b), seleção de gate de células iNKT CD8+ \nCCR7+ (5c) e iNKT CD8+ CD25+ ( 5d), seleção de gate \nde células iNKT DN CCR7+ ( 5e) e iNKT DN CD25+ ( 5f), \nseleção de gate de células iNKT CD4+CCR7+ (5g) e iNKT \nCD4+CD25+ (5h). ................................................................... 43 \nFigura 6 -  Imunocoloração confocal de células iNKT em lesões de \nendometriose. (A) Mesclagem representativa de células \ncoradas marcadas com CD3 (vermelho), CD1D (verde), \nCD4 (amarelo) e DAPI (azul) de áreas saudáveis e áreas \nde endometriose. (B) Porcentagem de células iNKT em \náreas saudáveis e endometriose do tecido (n = 9). ................ 74 \n  \n\nxiii \n \nGráficos \n \nGráfico 1 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências \ndas células iNKT no sangue periférico segundo grupos de \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem \nendometriose. ......................................................................... 54 \nGráfico 2 -  Médias das  frequências de células iNKT e subtipos  no \nsangue periférico de pacientes com endometriose \nprofunda infiltrativa e sintomas clínicos de dismenorréia \ncom intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA. ............................. 59 \nGráfico 3 -  Médias das frequências de células iNKT e subtipos no \nsangue periférico segundo grupos de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e \nsintomas clínicos de dor pélvica acíclica com intensidade \n<7 e ≥ 7 segundo a EVA. ........................................................ 62 \nGráfico 4 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências \ndas células iNKT CD4+ IL17+ no sangue periférico de \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e \nintensidade de sintoma de dor pélvica acíclica. ...................... 62 \nGráfico 5 -  Médias das frequências de células iNKT e subtipos no \nsangue periférico segundo grupos de pacientes com  \nendometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e \nsintomas clínicos de dispareunia com intensidade <7 e ≥ 7 \nsegundo a EVA.... ................................................................... 63 \nGráfico 6 -  Médias das frequências de células iNKT e subtipos no \nsangue periférico segundo grupos de pacientes com  \nendometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e \nsintomas clínicos de alteração intestinal  cíclica com \nintensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA. ..................................... 64 \nGráfico 7 -  Médias das frequências de células iNKT e subtipos no \nsangue periférico segundo grupos de pacientes com  \nendometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e \nsintomas clínicos de alteração urinária  cíclica com \nintensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA. ..................................... 65 \nGráfico 8 -  Médias das frequências d e células iNKT e subtipos no \nsangue periférico segundo estádio I/II ou II I/IV da doença \nnas pacientes com endometriose profunda. ........................... 67 \n  \n\nxiv \n \nGráfico 9 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências \ndas células iNKT no sangue periférico de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa e grupo controle na fase \nsecretora do ciclo menstrual. .................................................. 72 \nGráfico 10 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências \ndas células iNKT e células CD3+ no tecido com lesão de \nendometriose e tecido  normal sem lesão de \nendometriose. ......................................................................... 75 \n \n  \n\nxv \n \nQuadros \n \nQuadro 1 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências \ndas células iNKT DN (A) e iNKT DN IL17+ (B) no sangue \nperiférico segundo grupos de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa e sem endometriose .......... 57 \nQuadro 2 - Representação em dotplot da distribuição das frequências \ndas células iNKT CD4+ CCR7+ ( A) e iNKT CD4+ IL17+ \n(B) no sangue periférico de pacientes com endometriose \nprofunda infiltrativa e intensidade de sintoma de \ndismenorréia. .......................................................................... 60 \nQuadro 3 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências \ndas células (A) iNKT CD4+ CD25+ na fase proliferativa \nem pacientes com endometriose e grupo controle; ( B) \niNKT DN na fase proliferativa  em pacientes com \nendometriose e grupo controle; ( C) iNKT DN CD25+  em \npacientes com endometriose profunda na fase \nproliferativa e secretora do ciclo menstrual; ( D) iNKT DN \nIL17+ na fase secretora em pacientes com endometriose \ne grupo controle ...................................................................... 73 \n \n \n \n \n  \n\nxvi \n \nTabelas \n \nTabela 1 -  Intensidade de secreção de citocinas pelos subtipos de \ncélulas iNKT CD4+, DN e CD8+ após estimulação. \nAdaptado de O'Reilly et al., 2011. ........................................... 24 \nTabela 2 -  Avaliação de semelhança dos dados clínicos de idade, \níndice de massa corpórea e fase do ciclo menstrual entre \nas pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem \nendometriose. ......................................................................... 49 \nTabela 3 -  Avaliação de semelhança dos sintomas clínicos entre as \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem \nendometriose .......................................................................... 51 \nTabela 4 -  Avaliação de semelhança em relação ao  estádio da \nendometriose entre as pacientes com endometriose \nprofunda infiltrativa .................................................................. 52 \nTabela 5 -  Descrição das médias das frequên cias das células iNKT \nno sangue periférico segundo grupos de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa e  sem endometriose e \nresultado da comparação entre os grupos. ............................. 53 \nTabela 6 -  Descrição das médias das frequências dos subtipos de \ncélulas iNKT CD4+, DN e a expressão de marcadores \nCCR7 e CD25 no sangue periférico s egundo grupos de \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem \nendometriose e resultado da comparação entre os grupos. \nResultados em média e desvio padrão. .................................. 55 \nTabela 7 -  Descrição das médias das frequências dos subtipos de \ncélulas iNKT secretoras de IL -6, IL-10 e IL -17 no sangue \nperiférico segundo grupos de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e \nresultado da comparação entre os grupos.  Resultados em \nmédia e desvio padrão. ........................................................... 56 \nTabela 8 -  Descrição das médias das frequências de células iNKT e \nsubtipos no sangue periférico segundo grupos de \npacientes com endometriose profunda infiltrativa  (grupo \nendometriose) e sem endomet riose (grupo controle ) e a \nfase do ciclo menstrual. Resultado da comparação entre \nos grupos e entre as fases do ciclo menstrual. ....................... 70 \n \n  \n\nxvii \n \nResumo \n \n \nCorrêa FJS. Avaliação das células iNKT em pacientes com endometriose  \n[tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2018. \nIntrodução: A endometriose é uma doença com características inflamatórias \nque atinge as mulheres em idade reprodutiva. A patogênese da \nendometriose não está esclarecida. Tem sido demonstrada associação entre \ndistúrbios imunológicos e endometriose, como alterações nos macrófagos, \ncélulas NK, citocinas e nas r epostas Th1, Th2 e Th17. As células iNKT, um \ntipo especial de linfócitos T, tem importante papel na resposta inflamatória \ncomo mediadores das repostas Th1, Th2 e Th17.  Objetivos: o objetivo \nprincipal deste estudo foi comparar as frequências das células iNKT e seus \nsubtipos entre pacientes com endometriose e pacientes sem endometriose. \nProcuramos também comparar as frequências destas células em ambos os \ngrupos relacionando com alguns os aspectos clínicos e cirúrgicos da \ndoença. Métodos: Realizamos estudo tra nsversal, prospectivo entre \nfevereiro de 2013 a fevereiro de 2015 que avaliou a porcentagem de células \niNKT e os subtipos iNKT CD4+, iNKT CD4+ CCR7+, iNKT CD4+ CD25+, \niNKT DN, iNKT DN CCR7+, iNKT DN CD25+, iNKT CD4+ IL6+, iNKT CD4+ \nIL10+, iNKT CD4+ IL17+, iNKT CD8+ IL6+, iNKT CD8+ IL10+, iNKT CD8+ \nIL17+, iNKT DN IL6+, iNKT DN IL10+, iNKT DN IL17+ no sangue periférico, \npor citometria de fluxo, em pacientes com endometriose profunda  (n = 47) e \nsem endometriose (n = 26). As frequências de células iNKT e seus subtipos \nforam comparadas entre os grupos de acordo com os sintomas, fase do \nciclo, estádio da doença e classificação histológica.  Resultados: Na \navaliação da frequência das células iNKT, iNKT DN e iNKT DN IL17+ foi \nevidenciada diminuição significativa nas pacientes com endometriose \n(p=0,010, p=0,020, p=0,050; respectivamente). Além disso, foi observada \ndiminuição significativa nas frequências das células iNKT CD4+ CCR7+ e \naumento significativo das células iNKT CD4+ IL -17+ em pacientes com \nendometriose e dis menorréia severa em comparação a dismenorréia \nausente/leve. Nas pacientes com endometriose e dor acíclica severa \nobservou-se diminuição significativa da frequência das células iNKT CD4+ \nIL17+ em comparação a dor acíclica ausente/leve (p=0,048). Houve \ndiminuição das células iNKT nas pacientes com endometriose em relação ao \ngrupo controle na fase secretora do ciclo menstrual (p=0,030). Na avaliação \nda fase do ciclo menstrual foi observado na fase proliferativa aumento \nsignificativo na frequência das células iNKT CD4+ CD25+ (p=0,022) e \ndiminuição significativa das células iNKT DN (p=0,011) nas pacientes com \nendometriose. Na fase secretora foi evidenciado diminuição significativa na \nfrequência das células iNKT DN IL17+ (p=0,049) nas pacientes com \nendometriose. F oi identificado também nas pacientes com endometriose \numa diminuição na frequência das células iNKT DN CD25+ na fase \n\nxviii \n \nsecretora em relação a fase proliferativa do ciclo menstrual. Conclusões: As \ncélulas iNKT e os subtipos iNKT DN e iNKT DN IL17+  se mostrar am \nalteradas nas pacientes com endometriose profunda. Subtipos específicos \nde células iNKT estão alteradas nas pacientes com endometriose profunda \nem pacientes com dismenorréia e dor acíclica severas. As fases do ciclo \nmenstrual estão relacionadas a alteração nas frequências das células iNKT e \ndos subtipos iNKT CD4+ CD25+, iNKT DN, iNKT DN IL17+ e iNKT DN \nCD25+ nas pacientes com endometriose profunda. Estes resultados \nsugerem participação das células iNKT no desenvolvimento da \nendometriose.  \nDescritores: endometriose; células T matadoras naturais; interleucinas; \ncitometria de fluxo; microscopia confocal; dor pélvica. \n \n \n \n \n \n  \n\nxix \n \nAbstract \n \n \nCorrêa FJS. Evaluation of iNKT cells in patients with endometriosis [thesis]. \nSão Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2018. \nIntroduction: Endometriosis is a disease with inflammatory characteristics \nthat affects women of reproductive age. The pathogenesis of endometriosis \nis unclear. There has been an association between immune disorders and \nendometriosis, such as changes in macrophages, NK cells, cytokines, and \nTh1, Th2 and Th17 responses. iNKT cells, a special type of T lymphocytes, \nplay an important role in the inflammatory response as mediators of the Th1, \nTh2 and Th17 responses.  Objectives: The main ob jective of this study was \nto compare the frequencies of iNKT cells and their subtypes between \npatients with endometriosis and patients without endometriosis. We also \ncompare the frequencies of these cells in both groups relating to some \nclinical and surgic al aspects of the disease.  Methods: We performed a \nprospective cross -sectional study between February 2013 and February \n2015, which evaluated the percentage of iNKT cells and iNKT CD4+, iNKT \nCD4+ CCR7+, iNKT CD4+ CD25+, iNKT DN, iNKT DN CCR7+, iNKT DN \nCD25+, iNKT CD4+ IL6+ , iNKT CD8+ IL17+, iNKT DN IL6+, iNKT DN IL10+, \niNKT DN IL17+ in the peripheral blood, by flow cytometry, in patients with \ndeep endometriosis (n = 47), iNKT CD4+ IL10+, iNKT CD4+ IL17+, iNKT \nCD8+ ) and without endometriosis (n = 26). The frequencies of iNKT cells \nand their subtypes were compared between groups according to symptoms, \nstage of the cycle, stage of the disease and histological classification.  \nResults: iNKT, iNKT DN and iNKT DN IL17+ cells showed significant \ndecrease in patient s with endometriosis (p = 0.010, p = 0.020, p = 0.050, \nrespectively). In addition, a significant decrease in iNKT CD4+ CCR7+ cell \nnumbers and a significant increase of iNKT CD4+ IL17+ cells were observed \nin patients with endometriosis and severe dysmenorrhea compared to absent \n/ mild dysmenorrhea. In patients with endometriosis and severe acyclic pain, \nthere was a significant decrease in the frequency of iNKT CD4+ IL17+ cells \ncompared to absent / mild acyclic pain (p = 0.048). There was a decrease in \niNKT cells in patients with endometriosis compared to the control group in the \nsecretory phase of the menstrual cycle (p = 0.030). In the menstrual cycle, a \nsignificant increase in iNKT CD4+ CD25+ cells (p = 0.022) and a significant \ndecrease in iNKT DN cells (p = 0.011) was observed in the proliferative \nphase in patients with endometriosis. In the secretory phase there was a \nsignificant decrease in the frequency of iNKT DN IL17 + cells (p = 0.049) in \npatients with endometriosis. It was also identified in patients  with \nendometriosis a decrease in the frequency of iNKT DN CD25+ cells in the \nsecretory phase in relation to the proliferative phase of the menstrual cycle.  \nConclusions: iNKT cells and subtypes  iNKT DN e iNKT DN IL17+ have \nbeen altered in patients with dee p endometriosis. Specific subtypes of iNKT \ncells are altered in patients with deep endometriosis in patients with severe \n\nxx \n \ndysmenorrhea and acyclic pain. The phases of the menstrual cycle are \nrelated to changes in the frequencies of iNKT cells and subtypes iNKT CD4+ \nCD25+, iNKT DN, iNKT DN IL17+ and iNKT DN CD25+ in patients with deep \nendometriosis. These results suggest the participation of iNKT cells in the \ndevelopment of endometriosis.    \nDescriptors: endometriosis; natural killer T -cells; interleukins; fl ow \ncytometry; microscopy, confocal; pelvic pain. \n \n \n\n 1 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1 Introdução \n \n \n  \n\n Introdução 2 \n \n \n \n1 INTRODUÇÃO \n \n \n A endometriose é caracterizada pela presença de glândulas \nendometriais e/ou estroma fora da cavidade uterina, que acomete, \nprincipalmente, mulheres no períod o reprodutivo ( Giudice; Kao, 2004). Carl \nVon Rokitansky, em 1860, descreveu, pela primeira vez focos de endométrio \nectópico em peças de autópsia, caracterizando a endometriose . Entretanto, \nestudos históricos relatam sintomas sugestivos da doença encontrados  em \nmulheres há mais de dois mil anos ( Nezhat et al., 2012). Estima-se que 10% \na 15% das mulheres no período reprodutivo tenham endometriose, mas esta \npode ser encontrada em 2 a 4% das mulheres após a menopausa (Strathy et \nal., 1982; Moen, 1991). A doença tem impacto severo em relação ao bem -\nestar geral, físico, mental e social das mulheres acometidas ( Damario; Rock, \n1995; Ferrero et al., 2005; Luisi et al., 2009; Bassi et al., 2011). \n Dismenorréia, dispareunia profunda, dor pélvica crônica, sangramento \nanormal e infertilidade são os principais sintomas associados à \nendometriose ( Kennedy et al., 2005 ). Sintomas intestinais como disquezia, \nhematoquezia, obstipação, tenesmo, distensão abdominal e sintomas \nurinários como polaciúria, dor ao urinar e hematúria, também, podem ocorrer \ndependendo da localiza ção das lesões nesses órgãos ( Abrao et al., 1994 ; \nKennedy et al., 2005 ; Giudice, 2010 ). Os primeiros sintomas da \nendometriose manifestam-se na adolescência antes dos 15 anos em 38%, e, \nantes dos 20 anos em,  aproximadamente, 66% das mulheres acometidas \n\n Introdução 3 \n \n \n \n(Ballweg, 2003). O início precoce dos sintomas e a pouca importância dada \nao sintoma de dismenorréia pelos profi ssionais de saúde e pela própria \npaciente contribuem para longo tempo entre o início do qu adro clínico e o \ndiagnóstico da doença. Arruda et al. (2003) demonstraram que o tempo para \no diagnóstico da endometriose desde o início dos sintomas é de 7 anos e \n12,1 anos, em média, quando os sintomas iniciaram antes dos 19 anos de \nidade. A falta de um exame não invasivo, factível e com boa acurácia é um \ndos fatores que contribuem para o retardo no diagnóstico  (Arruda et al., \n2003; Ballard et al., 2006 ; Garry, 2006; Nnoaham et al., 2011 ; Riazi et al., \n2015). \nAs lesões de endometriose se apresentam de formas e localizações \nvariadas, o que dificulta a sua padronização e classificação. A doença pode \nser dividida em profunda ou superficial quando apresenta mais ou menos de \ncinco milímetros de diâmetro, respectivamente, d e acordo com a definição \nde Cornillie ( Cornillie et al., 1990 ). Em 1997, com objetivo de facilitar a \npadronização da doença, Nisolle e Donnez propuseram uma classificação da \nendometriose em três tipos: a endometriose peritoneal, a endometriose \novariana e a endometriose do septo retovaginal. A doença pe ritoneal foi \ncaracterizada pela presença de lesões superfi ciais no peritônio; a doenç a \novariana foi descrita pela presença de endometriose superficial ou os cistos \nde endometriose conhecidos como endometrioma; e a doença do septo \nretovaginal, foi caracterizada  por lesões que acomet eriam as regiões \nretrocervical, paracervical, o septo retovaginal, o retossigmoide, os ureteres \ne a bexiga de forma infiltrativa e profunda com lesões maiores do que cinco \n\n Introdução 4 \n \n \n \nmilímetros em profundidade ( Nisolle; Donnez, 1997 ). Várias classificações \npara endometriose já foram propostas por diversos autores ( ASRM, 1997; \nAdamson, 2011; Haas et al., 2013). A classificação proposta pela associação \namericana de medicina reprodutiva (ASRM), revisada em 1996, mais \namplamente utilizada nos estudos sobre endometriose propõe a divisão da \ndoença em quatro estádios (estádio I – mínima, estádio II – leve, estádio III – \nmoderada e estádio IV – severa) de acordo com os achados cirúrgicos \n(ASRM, 1997). Essa classificação foi desenvolvida, principalmente, para \navaliar o impacto na fertilidade da mulher, mas sua correlação com a \nintensidade de dor é fraca (Canis et al., 1993 ; ASRM, 1997; Vercellini et al., \n2007).  \nEm função da diversidade de sinais, sintomas e var iedade de lesões \nque envolvem a doença, diagnóstico clínico da endometriose é difícil e \nincerto. Pesq uisas sobre o diagnóstico da endometrios e são realizadas \ncomparando-se as manifestações clínicas, as técnicas de imagem, \nmarcadores biológicos e as técnicas cirúrgicas (Scarselli et al., 2005; Riazi et \nal., 2015 ). Entretanto, a laparoscopia com visualização das lesões e \nconfirmação histológica da presença de glândulas e estroma endometriais \nainda é o método de escolha para o diagnóstico de endometriose ( Nnoaham \net al., 2012 ; Fassbender et al., 2015 ). O quadro clínico é importante em \nrelação à definição de quais pacientes devem ser submetidas a uma \ninvestigação mais profunda e específica para endometriose. No exame \nfísico, o toque vag inal bimanual apresenta acurácia de 63% e 55% no \ndiagnóstico da endometriose de reto -sigmoide e retrocervical, \n\n Introdução 5 \n \n \n \nrespectivamente ( Abrao et al., 2007 ). Os diversos tipos de marcadores \ninvestigados para o diagnóstico da endometriose avaliados isoladamente ou \nem painéis apresentam baixa acurácia e não tem aplicação clínica ( May et \nal., 2010). A ressonância nuclear magnética e a ultrassonografia transvaginal \ncom preparo intestinal tem excelente acurácia e aplicação clínica no \ndiagnóstico das lesões de endometriose infiltrativa profunda e dos \nendometriomas ovarianos (Abrao et al., 2007; Bazot; Darai, 2008; Gonçalves \net al., 2009 ). A ultrassonografia transvaginal é o exame de imagem que \napresenta a melhor relação custo -benefício na endometriose profunda e \novariana e, portanto, a primeira escolha no diagnóstico da doença ( Abrao et \nal., 2009; Gonçalves et al., 2010). \n Apesar de a doença ter sido descrita há mais de um século e meio, a \npatogênese da endometriose, ainda, não foi esclarecida. Várias teorias \nforam propostas para explicar o desenvolvimento  da doença. A principal \nhipótese d a patogênese da endometriose baseia -se em algumas teorias, \ndentre as quais é possível destacar duas de maior relevância: a teoria da \nmetaplasia celômica e a teoria da menstruação retrógrada. Uma das teorias \nmais antiga s, a da metaplasia, proposta por  Meyer em 1919, sugere que, \nsob diversas influências, o tecido celômico poderia se transformar em \nendométrio (Vinatier et al., 2001 ; Vercellini et al., 2014 ). A teoria mais citada \nna literatura, proposta por Sampson em 1927, pro põe que o fenômeno \nfisiológico do refluxo de endomé trio pelas trompas uterinas durante a \nmenstruação poderia, em certas condições, sobrepor aos mecanismos de \ndefesa locais, implantar e proliferar ( Sampson, 1927 ). As razões para a \n\n Introdução 6 \n \n \n \nocorrência da endometriose são provavelmente n umerosas e envolvem o \nendométrio, o sistema imunológico, o peritônio e as tubas uterinas ( Vinatier \net al., 2001).  \n \n1.1 Considerações gerais sobre o sistema imunológico \n \n Existem, fundamentalmente, dois tipos de resposta imune com \ncaracterísticas diferentes, a inata e a adquirida ( Delves; Roitt, 2000a; Yatim; \nLakkis, 2015). \n A resposta imune inata proporciona a primeira linha de defesa contra \nmicrorganismos. Os principais componentes utilizados na resposta imune \ninata são as barreiras físicas e químicas como o epitélio e as substâncias \nproduzidas na sua superfície; as células fagocíticas como os neutrófilos, \nmonócitos e macrófagos; as células que l iberam mediadores inflamatórios \ncomo os basófilos, mastócitos e eosinófilos; e as células NK responsáveis \npela destruição dos microrganismos ( Flajnik; Kasahara, 2010 ; Beaulieu et \nal., 2015). Os componentes molecula res da resposta imune inata incluem o \ncomplemento, proteínas de fase aguda e citocinas (Delves; Roitt, 2000a).  \n A resposta imune adquirida é um modelo de resposta mais elaborada \nque envolve a prol iferação de linfócitos B e T que ocorre quando os \nreceptores de superfície dessas células se ligam aos antígenos estranhos ao \norganismo (Delves; Roitt, 2000b). Uma característica desse tipo de resposta \nimunológica é o mecanismo de memória imunológica e a sua capacidade de \nmelhorar a resposta após exposições repetidas ao antígeno. As células B \n\n Introdução 7 \n \n \n \nsecretam imunoglobulinas, os anticorpo s antígeno-específicos responsáveis \npela eliminação dos microrganismos extracelulares. Os linfócitos T auxiliam \nos linfócitos B a produzir anticorpos e podem erradicar patógenos \nintracelulares ativando os macrófagos e matando as células infectadas \n(Delves; Roitt, 2000b; Silverstein, 2003; Balenga; Rafati, 2007; Litman et al., \n2010).  \n Os linfócitos humanos podem ser divididos em três categorias \nprincipais baseados em suas funções biológicas e presença de \ndeterminados antígenos de superfície, os Linfócitos B, os Linfó citos T e as \ncélulas NK (Brandtzaeg, 1996; Abbas, 2012). Os linfócitos apresentam em \nsua membrana celular, proteínas que são utilizadas como marcadores \nfenotípicos na distinção funcional das diferentes populações de linfócitos, \ndenominados Cluster of Differentiation (CD) (Zola, 2001; Abbas, 2012). \n Os linfócitos B são os responsáveis pela resposta imune humoral por \nmeio da produção de anticorpos, que são proteínas (imunoglobulinas) \ndivididas em cinco classes, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE de acordo com a \nsequência de aminoácidos na região constante da ca deia pesada \n(Ramanarayanan, 1985; Delves; Roitt, 2000a; Abbas, 2012).  \n Os linfócitos T são células relacionadas a imunidade celular, com \ncapacidade de reconhecer antígenos de microrganismos intracelulares e \ndestruí-los ou às células infectadas. Esses linfócitos possuem, em sua \nmembrana, moléculas que at uam como receptores de antígenos distintas \ndos anticorpos. As células T apresentam uma especificidade no \nreconhecimento dos antígenos. Apenas antígenos, ligados a proteínas do \n\n Introdução 8 \n \n \n \nhospedeiro codificadas pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC – \nMajor Histocompatibility Complex ) e que se expressam na superfície de \noutras células, são reconhecidos pelos linfócitos T ( Borrego et al., 2002 ; \nGoldberg; Rizzo, 2015a, Goldberg ; Rizzo, 2015b). De acordo com as suas \nfunções, os linfócitos T são divididos em subpopulações, sendo as \npopulações mais bem caracterizadas as células T Helper (Th) ou \nauxiliadores e os linfócitos T citolíticos ou citotóxicos (CLTs). Após \nestimulação antigênica, as células Th secretam citocinas que  têm a função \nde estimular a proliferação e diferenciação das células T, a ativação de \ncélulas B, dos macrófagos e de outros leucócitos. Os linfócitos Th, em \nrelação aos antígenos de superfície, são CD3+CD4+CD8 -, sendo, assim, \nidentificados fenotipicamente (Onoe et al., 2007). Os CLTs são responsáveis \npor destruir as células infe ctadas por vírus e outros microrganismos \nintracelulares que produzem antígenos estranhos. Esses linfócitos são \nidentificados pelos antígenos de superfície CD3+CD4 -CD8+. Alguns \nlinfócitos T têm como função principal inibir as respostas imunológicas e são \nchamadas de células T reguladoras (Treg) ( Delves; Roitt, 2000a ; Delves; \nRoitt, 2000b; Langier et al., 2010 ; Abbas, 2012; Benoist; Mathis, 2012; Barbi \net al., 2013; Rothstein; Camirand, 2015)  \n A terceira classe de linfócitos são as células NK que constituem 5% a \n20% das células mononucleares no sangue e no baço, mas são raras nos \nórgãos linfoides ( Barao; Ascensao, 1998). As células NK são derivadas de \nprecursores da medula óssea, mostram -se como linfócitos grandes com \ngrânulos citoplasmáticos numerosos e com antígenos de superfície CD3 -\n\n Introdução 9 \n \n \n \nCD56+CD16+ (Moretta et al., 2002a, Moretta et al.,  2002b; Caligiuri, 2008).  \nEntretanto, em função da diferença de fenótipos de superfície e linhagem \ncelular, essas células não constituem linfócitos T, tampouco linfócitos B, \nalém de não expressarem receptores  antigênicos semelhantes às células T \ne B. As células NK reconhecem as células infectadas destruindo -as \ndiretamente e secretando citocinas inflamatórias. Esses linfócitos NK são, \nainda, uma fonte importante de Interferon gama (IFN -gama) que ativa os \nmacrófagos para destruir os microrganismos fagocitados ( Moretta et al., \n2002a, Moretta et al., 2002b ; Caligiuri, 2008 ). As principais citocinas do \nsistema imune inato que estimulam as funções das  células NK são as IL-12, \nIL-15, IL-18 e o IFN -gama. Essas citocinas aumentam a atividade citotóxica \ndas células NK e a quantidade de IFN -gama secretada por estas ( Delves; \nRoitt, 2000a; Delves; Roitt, 2000b; Sinkovics; Horvath, 2005; Abbas, 2012).  \n A resposta imune inata, além de fornecer a primeira defesa contra \nmicrorganismos, também, inicia a resposta imune adaptativa por meio de \nsinais que induzem em associa ção com o antígeno a proliferação e a \ndiferenciação de linfócitos T e B com especificidade aos antígenos. O \nsistema imune adaptativo utiliza três estratégias principais para combater a \nmaioria dos microrganismos: o reconhecimento dos antígenos pelos \nlinfócitos; a imunidade celular com ativação dos linfócitos T e eliminação dos \nmicrorganismos intracelulares e a imunidade humoral com ativação dos \nlinfócitos B e eliminação dos microrganismos extracelulares ( Delves; Roitt, \n2000a; Delves; Roitt, 2000b; Abbas, 2012). Os antígenos são apresentados \naos linfócitos pelas células apresentadoras de antígenos (APC – do inglês – \n\n Introdução 10 \n \n \n \nantigen presenting cells ). As células dendríticas são as APCs mais \nespecializadas com função de capturar os antígenos microbianos e os \ntransportar até os órgãos li nfoides e apresentá -los aos linfócitos T. Os \nlinfócitos ativados pelos antígenos desencadeiam vários mecanismos com a \nfunção de eliminá -los. Os linfócitos Th ativados se transformam em células \nefetoras cujas funções são mediadas em grande parte pelas citoc inas \nsecretadas (Delves; Roitt, 2000a; Delves; Roitt, 2000b; Abbas, 2012). Uma \ndelas é a interleucina 2 (IL -2), que atua como fator de crescimento sobre os \nlinfócitos Th CD4+ ativados por antígenos e estimula a sua proliferação em \nforma de expansão clonal. Esses linfócitos efetores deixam os órgãos \nlinfóides e migram para os locais de infecção e inflamação. Outras células \nTh CD4+ efetoras secretam citocinas que recrutam leucócitos e que \nestimulam a produção de substâncias microbicidas nos fagócitos ajudando -\nos a destruir os microrganismos. Os linfócitos CD8+ ativados diferenciam -se \nem CLTs que destroem as células com microrganismos no citoplasma e \neliminam os reservatórios da infecção. Os linfócitos B ativados proliferam e \ndiferenciam-se em células secretoras de anticorpos (Abbas, 2012).  \n Para a adequada resposta os linfócitos B aos antígenos proteicos, há \nnecessidade de sinais ativadores dos linfócitos Th CD4+. Uma parcela das \ncélulas B diferenciam -se em plasmócitos secretore s de anticorpos. Os \nanticorpos se ligam a microrganismos e os impedem de infectar outras \ncélulas do organismo ou colonizar os tecidos. A imunoglobulina G (IgG) \nrecobre os microrganismos e os transformam em alvos para a fagocitose por \nneutrófilos e macrófag os. Paralelamente, as imunoglobulinas G e M (IgG e \n\n Introdução 11 \n \n \n \nIgM) ativam o sistema complemento cujos produtos promovem a fagocitose \nou a destruição direta dos microrganismos (Abbas, 2012). \nExiste uma classificação de  células T CD4+ de acordo com suas \ncaracterísticas funcionais como o tipo de citocinas que elas produzem \n(Forsthuber; Ji, 2007; Abbas, 2012). Três tipos principais de células T CD4+, \nou seja, Th1, Th2 e Th17, funcionam na defesa do hospedeiro contra \ndiferentes tipos de microrganismos e estão envolvidos em tipos diferentes de \nlesão ao tecido nas patologias imunomediadas (Mosmann, 1989; Forsthuber; \nJi, 2007 ; Abbas, 2012 ). Essas células se diferenciam a partir de células T \nvirgens em resposta a determinadas citocinas presentes no início das \nrespostas imunes. Da mesma forma, as células Th1, Th2 e Th17 expressam \ndiferentes proteínas de superfície que determina fenótipo diverso entre elas \n(Abbas, 2012 ). Vários estudos têm demonstrado que a resposta anormal \ncom a perda do equilíbrio entre as respostas Th1, Th2 e Th17 pode estar \nassociada a uma varieda de  de doenças como o lúpus eritematoso, o \nmieloma múltiplo, a dermatite atópica, a pré -eclâmpsia, a osteoporose, a \nuveíte, a artrite reumatóide, a asma e a endometriose ( Serrano Hernandez, \n2009; Andreoli et al., 20 11; Santodomingo-Garzon; Swain, 2011; Dolff et al., \n2011; Shi et al., 2011 ; Campanati et al., 2014 ; Zhang et al., 2014 ; Batista et \nal., 2015; Feng et al., 2015; Talaat et al., 2015; Vargas-Rojas et al., 2015). \nAs células Th1 se diferenciam induzidas, principalmente, pelas \ncitocinas IL -12 e IFN -gama em reposta a microrganismos que ativam  as \ncélulas dendríticas, macrófagos e células NK. Os principais microrganismos \ncujos antígenos estimulam essa diferenciação são as bactérias \n\n Introdução 12 \n \n \n \nintracelulares, as micobactérias e alguns parasitas capazes de infectar \ncélulas dendríticas e macrófagos. Essas cél ulas desenvolvidas secretam \nIFN-gama que amplifica o padrão induzido ao promover mais diferenciação \nem Th1. O IFN-gama, ainda, pode inibir a diferenciação de células T virgens \nnos subtipos Th2 e Th17, promovendo, então, a polarização de resposta \nimune em u ma direção. A principal citocina produzida pelas células Th1 \nefetoras é o IFN -gama que participa da resposta imune por meio de um \nconjunto de ações como a ativação dos macrófagos que culmina na \ndestruição por estes, dos microrganismos fagocitados. Outras c itocinas \nproduzidas pelas células Th1 são o fator de necrose tumoral (TNF do inglês \n– tumor necrosis factor ) e a IL -10. O TNF e as diversas quimiocinas \nproduzidas pelas células Th1 contribuem para o recrutamento de leucócitos \ne aumento da inflamação. A IL -10 atua, principalmente, inibindo as células \ndendríticas e os macrófagos suprimindo, portanto, a reposta Th1, \ncaracterizando uma resposta com feedback negativo ( Abbas, 2012; Ahn et \nal., 2015 ; Kralickova; Vetvicka, 2015 ). As células Th1 têm importante \natuação imunológica nas doenças autoimunes e dano ao tecido associado a \ninfecções crônicas.  \n As células Th2, por sua vez, se diferenciam pelo estímulo da citocina \nIL-4 em resposta aos antígenos do helmintos e de alergenos, que causam \nestimulação crônica das células T. Essas células respondem ao estímulo \ncrônico e persistent e por patógenos e antígenos com pouca inflamação e \npouca produção de citocinas pró-inflamatórias, diferentemente das respostas \nTh1 e Th17 em  que há muita inflamação ( Abbas, 2012 ). As células Th2 \n\n Introdução 13 \n \n \n \nexpressam, em sua superfície, os genes das citocinas IL -4, IL-5 e IL -13. A \nIL-4 produz um feedback positivo em relação às células Th2, aumentando \nsua diferenciação, amplificando sua reação. Além disso a produção dessa \ncitocina tem a função de inibir o desenvolvimento  das células e respostas \nTh1 e Th17. Essa citocina é o maior estimulo à produção de anticorpos IgE \npelas células Th2. A IgE é muito importante na resposta imune mediada por \neosinófilos contra infecções por helmintos, além de mediar as reações de \nhipersensibilidade como as alergias ( Damsker et al., 2010 ; Abbas, 2012). A \nIL-13 tem ação semelh ante à da IL -4 com produção de efeitos biológicos \nassociados à inflamação alérgica e à defesa contra helmintos. A associação \nda IL -13 com a IL -4 induz à ativação dos macrófagos alternativos que \ncontribuem para a reparação de tecidos e fibrose. A IL-5 tem como principais \nações ativar os eosinófilos maduros e estimular o crescimento e \ndiferenciação de eosinófilos. Essa citocina, ainda, serve como ligação \nprincipal entre a ativação das células T e a inflamação por eosinófilos \n(Abbas, 2012). \n Nos últimos anos, houve grande interesse em relação a estudos sobre \nas células Th17, descobertas há menos t empo que as Th1 e Th2  \n(Forsthuber; Ji, 2007 ; Andreoli et al., 2011 ). As principais citocinas \nproduzidas pelos linfócitos Th17 são a IL -17, IL -22 e a IL -21. As células \nTh17 efetoras têm papel de induzir a inflamação por neutrófi los para destruir \nbactérias e fungos extracelulares. Além disso, estudos demonstraram a \nimportância dessas células para o patogênese de doenças inflamatórias \ncomo a psoríase, artrite reumatoide, esclerose múltipla entre outras (Boissier \n\n Introdução 14 \n \n \n \net al., 2008 ; Hedegaard et al., 2008 ; Meloni et al.,  2009; Quaglino et al., \n2011; Ekman et al., 2013; Campanati et al., 2014, ; Javadian et al., 2014; Xia \net al., 2015 ). A IL-17 tem atuação como importante ligação entre o sistema \nimune adaptativo mediado pelas células T e o sistema imune inato por meio \ndo seu componente inflamatório; como indutoras de reações inflamatórias \nricas em neutrófilos e como estimuladora da produção de substâncias \nantimicrobianas. A IL -22 contribui para a inflamação loc al e para lesão \ntecidual, e a IL-21 tem uma grande variação de afeitos nas células B, T e NK \ncom importante função em relação às respostas dos anticorpos e a \nproliferação de células T CD8+ e das células NK (Abbas, 2012).  \n \n1.2 Considerações sobre os sistemas imunológico e a endometriose  \n \n Estudos revelam que o sistema imunológico está associado à \npatogênese da endometriose e que a falta de uma imunovigilância no \nperitônio é considerada fator causal comum de ssa doença. Distúrbios na \nhomeostase imunológica podem facilitar a implantação, proliferação e \nangiogênese do tecido endometrial ( Oral; Arici, 1997; Matarese et al., 2003 ; \nChristodoulakos et al., 2007).  \n A interação de moléculas como o fator de crescimento endotelial \nvascular (VEGF) e as angiopoetinas é responsável pela regulação da \nangiogênese. Uma variedade de citocinas tais como  IL-1, IL -6 e IL -8 \nestimulam a expressão do VEGF nas células endometriais (Ahn et al., 2015). \nO estradiol tem um papel importante para a estimulação da expressão de \n\n Introdução 15 \n \n \n \nVEGF nas células endometriais ( Shifren et al., 1996 ). Vários estudos \ndemostraram a associação de níveis elevados de VEGF e endometriose. \nNíveis maiores de VEGF no fluido peritoneal foram encontrados em \nmulheres com endometriose avançada comparados com mulheres com \nendometriose leve ou saudáveis ( McLaren et al., 1996b ). Foi observado, \ntambém, uma associação direta entre elevados níveis de VEGF no plasma e \nno fluido peritoneal com aumento da atividade proliferativa e densidade de \nmicro-vasos nas lesões de endometriose ( Bourlev et al., 2006 ). Alguns \nestudos demonstraram que macrófagos peritoneais ativados e neutrófilos, \ntambém, são capazes de produzir e secretar VEGF ( McLaren et al., 1996a ; \nMueller et al., 2000 ; Gargett; Masuda, 2010 ). Com base nessa s \nobservações, pode -se concluir que alterações imunológicas de fatores e \ncitocinas que estimulam a angiogênese no ambiente peritoneal tem relação \ndireta com o desenvolvimento da endometriose. \n A endometriose está associada a uma redistribuição da população  de \nlinfócitos e da citotoxicidade das células Natural Killer (NK) e Th1, induzida \npela produção de citocinas pró -inflamatórias e anti -inflamatórias do tipo Th2 \n(Nap et al., 2004 ; Agic et al., 2006 ; Martinez et al., 2007 ). Pacientes com \nendometriose têm maior efeito imunossupressor sobre a citotoxicidade das \ncélulas NK, levando à diminuição da atividade citotóxica podendo permitir o \ndesenvolvimento de f ragmentos de endométrio em lesões endometriais \nectópicas (Ho et al., 1995; Somigliana et al., 1996). Alterações no número de \ncélulas dendríticas estão relacionadas à endometriose. Dois estudos \nmostraram resultados divergentes e opostos sobre o efeito da depleção de \n\n Introdução 16 \n \n \n \ncélulas dendríticas na endometriose. O primeiro observou aumento das \nlesões de  endometriose ( Stanic et al., 2014 ) e o segundo uma atenuação \ndas lesões de endometriose relacionados à depleção do número de células \ndendríticas (Pencovich et al., 2014). \n As citocinas têm um papel essencial na re sposta imune normal contra \npatógenos ou injurias. Vários autores já demonstraram que a desregulação \nno número e na função das citocinas tem sido associado à presença ou \ndesenvolvimento da endometriose (Monsanto et al., 2016).  \n Outros autores já demonstraram níveis  aumentados de citocinas IL-1, \nIL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e TNF -α em mulheres com endometriose ( Gilmore et \nal., 1992; Arici et al., 1996 ; Tseng et al ., 1996 ; Harada et al., 1997 ; \nAntsiferova et al., 2005; Gmyrek et al., 2005; Kalu et al., 2007; Gmyrek et al., \n2008; Osuga et al., 2011 ; Lambert et al., 2014  ; Malutan et al., 2015 ; \nMonsanto et al., 2016). \n Podgaec et al. identificaram um perfil pre dominante de citocinas \nséricas e do fluido peritoneal associado com respostas Th1 (TNF -α, IFN-γ, \nIL-2) e Th2 (IL -4, IL -10) em pacientes com endometriose. Os resultados \nsugerem que a endometriose é uma doença que envolve um comportamento \ninflamatório complexo com um claro componente Th2, apesar do aumento \ndos níveis de IFN-γ (Podgaec et al., 2007). Em um estudo similar, Fairbanks \net al. (2009) avaliaram os níveis de IL -12 e IL -18 e compararam com o \nestádio, o local da doença e sua classificação histológica. Embora nã o \nexistam diferenças em relação aos padrões de resposta imune Th1/Th2 e o \nlocal das lesões, sintomas clínicos específicos podem estar associados a \n\n Introdução 17 \n \n \n \numa maior produção de citocinas específicas, com padrão de resposta \nimune Th1 e, também, à endometriose profu nda ( Fairbanks et al., 200 9; \nPodgaec et al., 2010). \n \n1.3 As células Natural Killer T \n \n Nos últimos anos, as pesquisas sobre o papel das células T Natural \nKiller (Natural Killer T - NKT) têm revelado a sua importância em relação ao \ncontrole da resposta imune Th1 e Th2 e sua possível relação com algumas \ndoenças (Au-Yeung; Fowell, 2007). As células NKT são uma subclasse de \nlinfócitos T que expressam o receptor de células T (TCR) α/β  com um \nrepertório restrito ( Godfrey et al., 2000 ; Godfrey et al., 2005, Godfrey et al., \n2010). Essas células, também, expressam uma gama muito mais limitada da \nregião de genes de TCR variável. Em ratos, o mais expresso é um rearranjo \nde cadeia  TCR invariante ( V14-J18), com região CDR3 conservada e \ncom coexpressão de V8.2, V2 ou V7. Células T similares estão \npresentes em humanos e outras espécies de mamíferos. Em humanos, a \npopulação homóloga de células NKT expressam um rearranjo de TCR \ncadeia  (V24-J18) contendo uma cadeia  (V11). Essas células são \nextremamente conservadas na evolução, de forma que células NKT de ratos \nreconhecem o CD1d humano ligado a antígeno glicolipídico e vice -versa, \nfato que sugere a importância dessas células em pontos críticos e únicos do \nsistema imune ( Dellabona et al., 1994 ; Brossay et al., 1998 ; Godfrey et al., \n2004b). As células NKT compartilham as propriedades das células T e das \n\n Introdução 18 \n \n \n \ncélulas Natural Killer (NK), e constituem cerca de 0,2% de todas as células T \ndo sangue periférico (Godfrey et al., 2000; Macho-Fernandez; Brigl, 2015). \n Contrariamente aos linfócitos T e T reguladores, o TCR da célula NKT \nnão interage com antígenos apresentados pelo complexo principal de \nhistocompatibilidade (MHC) de classe I e cl asse II. Essas células NKT \nreconhecem, apenas, glicolipídeos apresentados pel o CD1d, uma molécula \napresentadora de antígenos não clássica que se associa à microglobulina β2 \n(Kronenberg; Gapin, 2002; Godfrey; Kronenberg, 2004a). A expressão CD1d \nocorre em queratinócitos epidermais na pele, e em várias outras células \nperiféricas epiteliais ou estromais em diversos órgãos como intestino grosso, \nintestino delgado, estômago, esô fago, vesícula biliar, fígado, rim, pâncreas, \nconjuntiva, testículo e epidídimo, mama, pele e útero ( Canchis et al., 1993 ; \nSieling, 2000 ; Fishelevich et al., 2006 ). Canchis et al. demonstraram, por \nimunoistoquímica, a presença de moléculas CD1d tanto no epitélio quanto \nem células e stromais no tecido endometrial ( Canchis et al., 1993 ). A \nexpressão da molécula CD1d ao nível celular ocorre em células dendríticas, \ntimócitos, células B, monócitos, macrófagos, células epiteliais e estromais \n(Balato et al., 2012). \n As células NKT respondem de forma diferente à produção de \ncitocinas da resposta imune Th1 e Th2 ou citocinas regulatórias, de acordo \ncom o glicoesfingolipídeo apresentado ( Balato et al., 2009 ; Godfrey; \nKronenberg, 2004). Em virtude de reconhecerem, especificamente, apenas, \nantígenos glicolipídicos em associa ção ao CD1d, as células NKT \nreconhecem classes de antígenos ignorados pelas células T convencionais. \n\n Introdução 19 \n \n \n \nO composto mais eficiente em relação à ativação da maioria das células \nNKT é um glicolipídio sintético (derivado da esponja marinha) conhecido \ncomo -galactosylceramida ( -GalCer) ( Sidobre et al., 2002 ; Hayakawa et \nal., 2004). O complexo formado pela -GalCer e o CD1d se liga ao receptor \nTCR das células NKT e desencadeia a resposta destas. Outros antígenos \nglicolipídicos como o gangliosidio GD3, o glicofosfatidilinositol, a \nfosfoetanolamina e outras formas de -GalCer foram testados em sua \ncapacidade d e estimular as células NKT (Godfrey; Kronenberg, 2004 ). As \ncélulas NKT são classificadas em dois tipos principais de células, as NKT \ntipo I e tipo II. As células NKT tipo I, também conhecidas como células NKT \nclássicas, NKT V14 invariante (V 14i), ou células NKT invariantes (iNKT), \nsão as mais estudadas e caracterizadas pelo seu receptor TCR e pelo \nreconhecimento do complexo CD1d + -GalCer que induz a resposta rápida \nessas células. As células NKT tipo II ou não clássicas diferem-se das células \nclássicas por apresentarem um TCR com repertório diverso e por não \nreconhecerem o antígeno -GalCer. Existe, ainda, um grupo heterogêneo de \ncélulas “ NKT-similares” que não são CD1d restritas ( Godfrey; Kronenberg, \n2004; Boyson et al., 2008). \n As células iNKT, rapidamente, secretarem grandes quantidades tanto \ncitocinas Th1 incluindo IFN- e TNF quanto Th2 incluindo IL-4, IL-10 e IL-13, \napós estimulação do seu receptor TCR ( Taniguchi et al., 2003 ; Kronenberg, \n2005; Au-Yeung; Fowell, 2007 ; Bendelac et al., 2007 ). Michel et al., em \n2007, identificaram a produção de IL -17 por células iNKT estimuladas por \nantígenos diversos ( Michel et al., 2007 ). Em 2008, Niemeyer et al., em um \n\n Introdução 20 \n \n \n \nestudo de avaliação do perfil de expressão gênica das células iNKT \nidentificaram aumento em relação à expressão dos genes da IL -17 e do \nreceptor IL-17R. A descoberta desses autores caracteriza uma am pliação no \nespectro de ação destas células que incluem resposta Th1, Th2 e Th17. \nAlém disso, as células iNKT têm a característica importante de servir como \nligação entre o sistema imune inato e o sistema imune adaptativo. Isto se \ndeve à capacidade destas c élulas de induzirem a ativação de subtipos de \nleucócitos como as células B, as células dendríticas e as células NK \n(Bezbradica et al., 2005).   \n Estudos têm demonstrado a capacidade das células iNKT em mediar \nas funções imunes tanto pr otetoras quanto regulatórias, tais como rejeição \ntumoral, proteção contra microrganismos infecciosos, manutenção da \ntolerância aos transplantes e inibição do desenvolvimento das doenças \nautoimunes ( Taniguchi et al., 2003 ). Apesar da capacidade de estimular a \nliberação de citocinas do tipo Th1 e Th2 simultaneamente, a ativação das \ncélulas iNKT pode polarizar a resposta autoimune em direção ao perfil Th1 \nem alguns casos e Th2 em outras condições ( Godfrey; Kronenberg, 2004 ; \nBalato et al., 2009). \n Outros estudos demonstraram que defeitos seletivos no número de \ncélulas iNKT e da produção de citocinas estão presentes em indivíduos \nafetados por diferentes doenças, tais como diabetes tipo I,  lúpus \neritematoso sistêmico, artrite reumatoide, cirrose biliar primária, asma \nalérgica, esclerose múltipla, infecção pelo vírus imunodeficiência humana -1 \ne tuberculose pulmonar ( Yanagihara et al., 1999 ; Oishi et al., 2001 ; van der \n\n Introdução 21 \n \n \n \nVliet et al., 2002 ; Chan et al., 2003 ; Lin et al., 2005 ; Snyder-Cappione et al., \n2007; Fletcher; Baxter, 2009). Carvalho et al. demonstraram uma diminuição \nno número absoluto de células iNKT em pacientes com imunodeficiência \ncomum variável (CVID) comparados ao grupo controle ( Carvalho et al., \n2010). \n A função e a atividade de diferentes tipos de células imunológicas que \nmedeiam a im unossupressão ou imunoregulação direcionam os resultados \nda resposta imune na saúde e doença. Esses tipos celulares incluem as \ncélulas T regulatórias (Treg), as células supressoras derivadas da medula e \nas células iNKT. As células iNKT tipo I e tipo II têm  importante papel em \nrelação à indução ou prevenção de doenças autoimunes, inflamação e \ncâncer ( Kumar; Delovitch, 2014 ). Os efeitos patogênicos e protetores das \ncélulas iNKT e seus subtipos, após a est imulação agonista in vivo  são \ndeterminados, principalmente, pelo momento da ativação, pela estrutura de \nantígenos lipídicos reconhecido, pela interação com diferentes células \ndendríticas e pelo perfil de secreção de citocinas. Estudos recentes \nmostraram que tipos distintos de CD1d ligados às células dendríticas podem \nregular diferentes perfis de citocinas secretadas pelas células iNKT, tipo Th1 \n(IL-12, IFN), tipo Th2 (IL -4, IL-9, IL-10, IL-13, fator estimulador de colônias \ngranulócitos – macrófagos) ou Th17 (IL -17A, IL-21 e IL -22) in vivo (Kumar; \nDelovitch, 2014 ; Lindau et al., 2013 ; Viale et al., 2012 ). Outras citocinas \nsecretadas pelas células iNKT incluem IL -2, IL -5, IL -6, TNF  e TGF β. \nPortanto, dependendo do tipo de interação entre os subtipos de células \niNKT, células dendríticas e citocinas secretadas pelas células iNKT ativadas \n\n Introdução 22 \n \n \n \npodem ativar ou suprimir a resposta imune adaptativa ( Kumar; Delovitch, \n2014).  \n \n1.4 Subtipos de células iNKT \n  \n As células iNKT podem ser divi didas de acordo com os marcadores \nde superfície expressos e de forma ampla em subtipos CD4+ ou CD4 - e \nCD8+ ou CD8 -. Portanto, os subtipos de células iNKT podem ser definidos \ncomo CD4+, CD4 -CD8- ou duplo negativo (DN) e CD8+. Em 1999 um \nestudo demonstrou fe nótipo, função e desenvolvimentos heterogêneo nos \ndistintos subtipos de células iNKT e que estas estão distribuídas, \ndiferentemente, em um padrão tecido -específico ( Hammond et al., 1999 ). \nDiferenças subtipo -específicas na expressão de marcadores de superfície \nforam descritas com iNKT CD4+ exibindo baixa expressão de CCR5 mas \nexpressão aumentada de CCR4 em relação a iNKT CD4-. Estas, por sua \nvez, expressam CCR1, CCR6, CXCR6 e NKG2D mas todas as iNKT \nexpressam altos níveis de CXCR3 e CXCR 4. O subtipo CD4 - expressa \nbaixos níveis de CD62L e altos níveis de CD11a, sugerindo fenótipo tecidual \ninfiltrativo enquanto o subtipo CD4+ expressa, preferencialmente, CD62L \nexibindo um fenótipo direcionado a linfonodos ( Kim et al., 2002 ; Juno et al., \n2012).  \n A identificação dessas subpopulações pode explicar o comportamento \nbiológico paradoxal d as células iNKT que, ao produzirem rapidamente \ngrandes quantidades de citocinas Th1 e Th2, promovem imunidade mediada \n\n Introdução 23 \n \n \n \npor células em uma situação e suprimem a mesma imunidade  celular em \noutra situação. As atividades das células iNKT podem ser benéficas ou \nprejudiciais em diferentes situações, aspecto este relacionado ao balanço \nentre as repostas imunes Th1 e Th2 mediadas pelas células iNKT (Lin et al., \n2006). Em humanos as células iNKT CD4+ produzem citocinas de ambas as \nrespostas Th1 e Th2 ( IFN, TNF, IL-4, IL-10 e IL-13). De forma diversa, as \ncélulas iNKT CD8+ e iNKT CD4-CD8- (duplo negativo, DN) produzem, \nprimariamente, citocinas Th1 (IFN, TNF) (Gumperz et al., 2002 ; Coquet et \nal., 2008).  \n Em estudo publicado em 2011 sobre subtipos de células iNKT \nexpandidas e estimuladas de doadoras saudáveis , os autores observaram \num percentual de expressão de subtipos de iNKT frescas de 15,6±9,0%, \n48,6 ± 15,4% e 33,5  ± 18,1% para CD4 +, DN e CD8 + respectivamente. Foi \nobservado, também, que os três subtipos de células iNKT são capazes de \nsecretar citocinas Th1 e Th2 com iNKT CD8+ demonstrando atividade Th1 / \ncitolítica mais potente e  as células CD4 + a atividade  Th2 mais intensa. As \ncélulas NKTDN apresentaram atividade intermediária entre perfil Th1/Th2. \nAinda em relação a esse estudo, os autores avaliaram a secreção das \ncitocinas de resposta Th1, Th2, Th9, Th17 e Th22 (IFN , IL-1, IL-2, IL-4, IL-\n5, IL -6, IL -9, IL-10, IL -12p70, IL -13, IL -17a e IL -22) por citometria de fluxo \napós estimulação dos três subtipos de iNKT (O'Reilly et al., 2011 ). Os \nresultados foram descritos de acordo com a intensidade da secreção da \ncitocina nos subtipos CD4+, DN e CD8+. \n \n\n Introdução 24 \n \n \n \nTabela 1 -  Intensidade de secreção de citocinas pelos subtipos de células \niNKT CD4+, DN e CD8+ após estimulação. Adaptado de O'Reilly \net al., 2011 \n \nCitocina CD4+ DN CD8+ \nIFN - ± + \nTNFα - ± + \nIL-2 + ± ± \nIL-4 + ± - \nIL-5 + ± - \nIL-6 + + + \nIL-9 + 0 0 \nIL-10 + - - \nIL-12p70 + + + \nIL-13 + ± - \nIL-17a 0 + 0 \nIL-22 0 0 0 \n(+) = mais intensa, (±) = intermediária  (-) = menos intensa e (0) = ausente. \n \n Os diferentes perfis de citocinas prod uzidas pelas células iNKT \nsugerem que essas células podem ter ações diferentes nas diversas células \nimunes efetoras importantes nas respostas imunes Th1 e Th2 ( Lin et al., \n2006). Após estimulação das subpopulações de células iNKT (CD4+, CD8+ \ne CD4-CD8-), este estudo observou que as células iNKT CD4+ induziram a \nmaior ativação das células NK e células B sem ativação das células T CD8+, \nas células iNKT CD8+ induziram a ativação das células envolvidas na \nresposta Th1 (células NK e células T CD8+) e as células iNKT DN induziram \na menor ativação das células NK e B, moderada atividade estimuladora \nsobre as células T CD4+ e ausência de atividade sobre as célul as T CD8+ \n(Lin et al., 2006).  \n\n Introdução 25 \n \n \n \n Em 2013, um estudo australiano demonstrou a heterogeneidade entre \ndiferentes tecidos e sangue periférico dentro das s ubpopulações CD4+ e \nCD4- das células iNKT (Chan et al., 2013 ). Nesse estudo, a analise \ncomparativa revelou alta heterogeneidade na expressão de antígenos de \nsuperfície por subtipos de células iNKT CD4+ e CD4-. Além disso os autores \nidentificaram vários antígenos cuja expressão diferencial correlaciona com a \nresposta à citocina ( Chan et al., 2013 ). Os achados revelam que a \nclassificação de subtipos de células iNKT CD4+ e CD4 - é deficiente em \ndemonstrar a diversidade desta linhagem celular (Chan et al., 2013). \n As células iNKT CD4+, DN e CD8+ podem ajudar na diferenciação \ndas células B e induzir a secreção de anticorpos pelos linfócitos B ( Zeng et \nal., 2013 ). Em 2013 demonstrou -se que todos os principais subtipos de \ncélulas iNKT expandidas induziram a secreção de IgG, IgA e IgM por células \nB autólogas, mas não de IgE (Bai et al., 2001, Zeng et al., 2013). \n Vários estudos demonstraram que alterações na frequência e funções \ndos subtipos de células iNKT foram observadas em indivíduos com doenças \n(Araki et al., 2003 ; Kenna et al., 2003 ; Montoya et al., 2007 ; Im et al., 2008 ; \nBricard et al., 2009 ). Nos últimos anos, estudos têm demonstrado \npossibilidade de terapia imunológica com estimulação específica de subtipos \nde iNKT para alguns tipos d e doenças. Vários grupos estão tentando \nmodular o perfil efetor das células iNKT com fins de aplicação terapêutica \npor meio de modificação do ambiente de citocinas, do modo de ativação \ncelular e da estrutura dos antígenos glicolipídicos (O'Reilly et al., 2011).   \n\n Introdução 26 \n \n \n \n As células iNKT são caracterizadas pela expressão de um receptor de \ncélulas T invariante com os marcadores V 24j18 e V 11. A partir da \nidentificação de linfócitos T viáveis, as células iNKT podem ser selecionadas \npor citometria de fluxo utilizando -se os marcadores V 24j18 e V 11 \nespecíficos para estas células.  \n \n1.5 Células iNKT e endometriose \n  \n Apesar da com provada relação entre a endometriose e sistema \nimunológico, não há na literatura estudo que tenha avaliado a  correlação \nentre endometriose e células iNKT.  \n Diante das importantes informações que correlacionam alterações \nno sistema imunológico com a endome triose e da importância das células \niNKT no controle do sistema imune  identificamos a hipótese de que essas \ncélulas podem estar alteradas em pacientes com endometriose pélvica \nprofunda. A comprovação dessa hipótese é importante passo no sentido de \nidentificar o papel das células iNKT em relação ao fator imunológico da \ndoença, permitindo, assim, maior entendimento sobre o sistema imune e a \ngênese da endometriose.  \n \n\n 27 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2 Objetivos \n \n \n  \n\n Objetivos 28 \n \n \n \n2. OBJETIVOS \n \n \nEste estudo tem como objetivos: \n \na) Analisar a presença de células iNKT e seus subtipos  no sangue \nem pacientes com endometriose  profunda infiltrativa  e em \npacientes sem a doença; \n \nb) Analisar a secreção de citocinas pelas células iNKT e seus \nsubtipos em pacientes endometriose e sem a doença;  \n \nc) Relacionar a presença de células iNKT e seus subtipos no sangue \nem pacientes com endometriose e:  \nc.1) sintomas clínicos \nc.2) fase do ciclo menstrual \nc.3) estadiamento da endometriose \n \nd) Analisar a presença de células iNKT no tecido comparando lesão \nde endometriose com área adjacente sem endometriose. \n \n \n\n 29 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3 Métodos \n \n \n  \n\n Métodos 30 \n \n \n \n3. MÉTODOS \n \n \n Realizamos um estudo transversal no Setor de Endometriose da \nClínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo (HCF MUSP), em que foram avaliadas 73  \npacientes consecutivas submetidas à videolaparosc opia no período de julho \nde 2013 a julho de 2015 . As pacientes foram divididas em dois grupos, \nsendo grupo endometriose  (n=47) aquelas com endometriose profunda \ninfiltrativa e grupo controle (n=26) as pacientes sem endometriose. \n Previamente ao início do estudo, o calculo amostral foi realizado \nsupondo confiança de 95% e poder de 80%, sabendo que estudos anteriores \nmostraram que o percentual de células iNKT no sangue em mulheres \nnormais varia de 0,1% a 2%, logo, foi considerado o valor médio dessa \nvariabilidade para cálculo da amostra (0,95%) e dado um desvio padrão \naproximado de 0,27% nas células iNKT seriam necessárias 29 mulheres em \ncada grupo para identificar diferença média de 0,2% de células iNKT entre \nmulheres com e sem endometriose (Carvalho et. al., 2010). Caso a diferença \nesperada seja de pelo menos 0,5% entre os grupos, a amostra necessária \npara realização do estudo é de 5 mulheres em cada grupo.  \n O presente estudo foi aprovad o pelo Comitê de Ética e Pesquisa do \nHospital das Clínicas de Faculdade de Medicina da Universidade de São \nPaulo (Anexo 1). Todas as pacientes foram esclarecidas sobre o estudo, \nleram e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2 \n\n Métodos 31 \n \n \n \ne 3). Este estudo foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à \nPesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo 2012/05425-7. \n \n3.1 Critérios de inclusão e exclusão \n \n As pacientes com endometriose foram selecionadas segundo os \nseguintes critérios de inclusão : idade entre 18 e 49 anos; presença \nendometriose profunda infiltrativa intestinal e/ou retrocervical com \ncomprovação histológica em espécimes obtidos durante a cirurgia; períodos \nmenstruais eumenorreicos, com intervalo entre os ciclos variando de 26 -34 \ndias. Para o grupo controle, os critérios de inclusão foram: idade entre 18 e \n49 anos; ausência endometriose confirmada pela laparoscopia ou \nanatomopatologia (em casos de biópsia de lesões suspeitas); períodos \nmenstruais eumenorreicos, com intervalo entre os  ciclos variando de 26 -34 \ndias.  \n Os critérios de exclusão utilizados para ambos os grupos foram: \npresença de doenças autoimunes confirmadas por anamnese, exame físico \ne por exames laboratoriais quando necessário; presença de neoplasia \nmaligna suspeita ou diagnosticada; diagnóstico de processos infecciosos \nnos três meses prévios à cirurgia; presença de sinais clínicos ou \nlaboratoriais de falência ovariana; utilização de terapêutica hormonal \n(análogos do GnRH, progestagênios e contraceptivos hormonais) nos \núltimos três meses que antecederam a coleta da amostra. \n \n\n Métodos 32 \n \n \n \n3.2 Dinâmica do estudo \n \n As pacientes com suspeita clínica de endometriose foram avaliadas \ncom história clínica, exame físico e exames complementares como a \nultrassonografia pélvica transvaginal com p reparo intestinal e a ressonância \nnuclear magnética de acordo com a rotina do Setor de Endometriose do \nHCFMUSP. A cirurgia foi indicada para os casos de pacientes com sintomas \nde dor e/ou infertilidade em consonância com os achados dos exames \nclínicos e ra diológicos. Nos casos de pacientes com dor, mas sem achados \nrelevantes nos exames de imagem, a cirurgia foi indicada quando não houve \nmelhora dos sintomas ao tratamento clínico com contraceptivos hormonais \norais combinados e/ou antiinflamatórios. Em relaçã o às pacientes \nsubmetidas a videolaparoscopia por endometriose no período do estudo, \nforam selecionados 47 casos que se adequavam aos critérios de inclusão e \nexclusão. \n O grupo controle foi formado por pacientes submetidas à laparoscopia \npara laqueadura tu bária no HCFMUSP que não infringiam os critérios de \ninclusão e exclusão propostos no estudo.  \n A videolaparoscopia, em ambos os grupos, foi realizada de acordo \ncom o protoc olo do setor do HCFMUSP . As pacientes do grupo com \nendometriose tiveram as lesões re ssecadas. Durante o procedimento \ncirúrgico, foram identificados os locais das lesões e feito o estadiamento da \ndoença. No grupo controle, foi realizado inventário minucioso da cavidade \nabdominal para descartar a presença de lesões de endometriose e realiza da \n\n Métodos 33 \n \n \n \nbiópsia nas lesões eventualmente suspeitas. A história clínica das pacientes \ne as características intraoperatórias da doença foram transcritas em \nformulário específico para uso posterior dos dados nos cálculos estatísticos. \n As amostras de sangue foram coletadas das pacientes com \nendometriose no momento da realização da laparoscopia. Os dados \nprovenientes das pacientes portadoras de endometriose foram considerados \napós exame histológico (estadiamento  e local) das lesões de endometriose. \nComo grupo contro le, foram utilizadas amostras de sangue de pacientes \nsaudáveis, não portadoras de endometriose, obtidas durante procedimento \npara laqueadura tubária. Um total de 73 amostras de sangue foi avaliado \nneste estudo.  \n O sangue periférico foi coletado por punção  venosa no antebraço, \napós indução da anestesia geral. Em seguida, foi transferido para um tubo \ncontendo anticoagulante.  Após a coleta das amostras de todos os casos, \nforam realizadas a separação das células e armazenadas para futuros \nexperimentos.  \n  \n3.3 Quadro clínico \n \n Quanto aos sintomas clínicos, foram considerados os seis sintomas \nmais frequentes associados à endometriose, descritos abaixo. Todas as \npacientes do estudo foram inqueridas sobre a presença e a intensidade \ndestes sintomas com uso da Escala  Visual Analógica (EVA) de dor ( Anexo \n\n Métodos 34 \n \n \n \n4). Os sintomas foram classificados  em leves ou intensos  de acordo com \nEVA < 7 ou EVA ≥ 7, respectivamente.  \na)  dismenorreia: dor em cólica no período menstrual; \nb)  dispareunia de profundidade: dor pélvica e/ou no fundo vaginal \ndurante a relação sexual; \nc)  dor pélvica acíclica: dor pélvica sem relação com o c iclo menstrual \npor, pelo menos, três meses, sem melhora com uso de analgésicos; \nd)  alterações urinárias cíclicas: sintomas urinários durante o período \nmenstrual, incluindo disúria, hematúria, polaciúria e/ou urgência \nmiccional; \ne)  alterações intestinais cíclicas: sintomas intestinais durante o período \nmenstrual, incluindo aceleração ou diminuição do trânsito intestinal, \ndor à evacuação, puxo, tenesmo e/ou sangramento nas fezes; \nf)  infertilidade: dificuldade para engravidar em casal com vida sexual \nativa (duas ou mais relações sexuais por semana) e sem método \ncontraceptivo por, pelo menos, um ano. Pacientes em uso de métodos \nnaturais ou de barreira e pacientes não expostas a gravidez até o \nmomento do estudo foram classificadas como “sem tentativa”.  \n \n3.4 Estadiamento da Endometriose \n \n As lesões de endometriose foram classificadas durante o \nprocedimento cirúrgico de acordo com os critérios da American Society for \nReproductive Medicine  (ASMR), revisado em 1996, em estádios de I – IV \n(Figura 1).  \n\n Métodos 35 \n \n \n \n \nFigura 1 –  Classificação de endometriose da American Society for \nReproductive Medicine, revisada em 1996 \n \n \n Para fins de comparação e cálculos estatísticos, definimos os estádios \nI e II como estádios iniciais e os estádios III e IV como estádios avançados \n(ASRM, 1997). \n \n  \n\n\n Métodos 36 \n \n \n \n3.5 Locais da endometriose \n \nAs pacientes com endometriose foram selecionadas de acordo com a \npresença de lesão de endometriose profunda infiltrativa no retossigmoide \ne/ou na região retrocervical (Figuras 2). \n \nFigura 2 -  A - Endometriose profunda d e retossigmoide aderida à região \nretrocervical. B - Endometriose profunda de região retrocervical, \nenvolvendo os ligamentos útero-sacros bilaterais \n \n \n3.6 Confirmação da endometriose  \n \n Os tecidos excisados na cirurgia foram fixados em formalina e \nblocos de parafina, posteriormente coradas com Hematoxilina-Eosina (HE) e \navaliadas em microscópio ótico para confirmação do diagnóstico da \nendometriose.  \n \n  \nA \n B \n\n Métodos 37 \n \n \n \n3.7 Obtenção das células mononucleares do sangue periférico \n \n3.7.1 Sangue heparinizado \n \n O sangue foi centr ifugado a 3000 rpm a 10° C durante 8 min. O \nplasma foi descartado. \n O precipitado de leucócitos totais foi retirado e lavado com solução \nfisiológica (previamente aquecida em banho -maria à 37°C), centrifugado \nnovamente a 3000 rpm a 10° C durante 8 min. O so brenadante foi \ndescartado. Em seguida, as células foram colocadas em 2 mL de meio de \ncultura DMEM contendo soro bovino fetal 10% (previamente aquecida em \nbanho-maria a 37°C) para contagem, em câmara de Neubauer, do número \ntotal de células. \n Os leucócitos t otais foram estocados em nitrogênio líquido em \nalíquotas contendo 2x 106 células em 1 mL de meio de congelamento (soro \nbovino fetal + 5% DMSO, em temperatura ambiente. \n \n3.8 Análise dos marcadores de células iNKT por citometria de fluxo \n \n3.8.1  Descongelamento das células mononucleares do sangue \nperiférico (CMSP) \n \n Esse procedimento foi realizado em cabine de segurança biológica \nnível 2, previamente esterilizada por 15 minutos sob luz ultravioleta. \n\n Métodos 38 \n \n \n \n As amostras de CMSP criopreservadas foram mantidas em gelo  seco \naté o momento do seu descongelamento. Os criotubos foram parcialmente \ndescongelados em banho -maria a 37ºC. Foi adicionado 1mL de meio de \ncultura R10 nas células, gotejado lentamente. Posteriormente, foi transferido \no conteúdo total da amostra para um t ubo cônico contendo R10, \npreviamente identificado, utilizando -se, também, do procedimento de \ngotejamento. Para a realização da lavagem das células, foi adicionado mais \n1mL de R10 e esse volume transferido para o tubo contendo R10. \n Em seguida, o tubo foi c entrifugado por 10 min a 250 x g em \ntemperatura de 4 a 6ºC; o sobrenadante desprezado e adicionados 2mL de \nR10, para realização da contagem celular por meio da câmara de Neubauer \ne do contador celular automatizado Countess™ (Invitrogen), utilizando os \nmesmos procedimento e cálculos descritos anteriormente. \n Novamente o tubo foi centrifugado e as células ressuspendidas em \nR10 no volume de 1,0x10 6 células/ml e as células foram transferidas, \nrespectivamente, para uma placa de 96 poços com fundo em V (NUNC® \nBrand Products), previamente identificada. \n \n3.8.2  Imunofenotipagem de superfície celular em células \nmononucleares do sangue periférico \n \n Com o objetivo de caracterizar as células T Natural Killer – iNKT do \nsangue periférico, as amostras descongeladas foram pr ocessadas para \n\n Métodos 39 \n \n \n \nrealização de imunofenotipagem de superfície celular utilizando -se a técnica \nde citometria de fluxo. \n Após a transferência das células para uma placa de 96 poços com \nfundo em V (NUNC® Brand Products), previamente identificada, a placa foi \ncentrifugada a 250 x g por 5 min., para a lavagem celular. Em seguida, o \nsobrenadante foi desprezado e as células ressuspendidas em 170  μL de \nTampão MACS, composto por 498ml de tampão salina fosfatada 7,2 \n(GIBCO™) (PBS 1X), 2  mL de EDTA [500mM], 2,5  g de albu mina de soro \nbovino (SIGMA®) (BSA). Após centrifugação subsequente, o sobrenadante \nfoi desprezado. \n Para iniciar a marcação das proteínas presentes na superfície das \ncélulas, foram adicionados tampão MACS, e os anticorpos monoclonais CD3 \n(clone UCHT1), V β11 (clone C21) e V α24 (clone C15) da Beckman Coulter  \n(Califórnia, CA, EUA) ; CD4 (clone RPA -T4), CD8 (clone RFT -8), CD14 \n(clone M5E2), CD19 (clone HIB19), CD25 (clone M-A251) da Biolegend (San \nDiego, CA, USA) e CCR7 (clone 3D12) da BD Bioscience (San Jose, C A, \nUSA) previamente titulados, assim como o marcador de viabilidade \nLive/Dead. As células permaneceram sob incubação por 30 minutos, no \nescuro, em temperatura ambiente. Após o término da incubação, a placa foi \ncentrifugada a 250 x g por 5 minutos, o sobrena dante foi desprezado e as \ncélulas foram lavadas com 170  μL de tampão MACS, para serem \nnovamente, centrifugadas , por duas vezes. Na etapa final da técnica de \nimunofenotipagem de superfície celular, foram adicionados 100  µl de \nparaformaldeído a 1% (PFA 1%), composto por 9  mL de PBS (1x) e 1 mL de \n\n Métodos 40 \n \n \n \nparaformaldeído 10x (SIGMA®), visando promover a fixação dos anticorpos \nmonoclonais à superfície celular.  \n Em seguida, as células foram transferidas, respectivamente, para \nmicrotubos (Fisherbrand®, Houston, TX) previamente identificados e \npermaneceram armazenadas sob ref rigeração até o momento da leitura no \ncitômetro de fluxo modelo LSRFortessa (BD), dotado de detectores capazes \nde adquirir e analisar eventos com até 14 cores. \n Os linfócitos foram identificados entre as células mononucleares do \nsangue periférico por meio da citometria de fluxo utilizando -se o Forward-\nscattered light (FSC)  que avalia as partículas de acordo com a área de \nsuperfície celular ou tamanho da célula e o Side-scattered light (SSC)  que \navalia a granularidade celular ou a complexidade interna da cél ula ( Figura \n6A). Dessa forma é possível diferenciar os linfócitos das outras células \nmononucleares.  A partir da identificação dos linfócitos por tamanho (FSC) e \ncomplexidade (SSC), foi, então, realizada a avaliação da viabilidade celular \nutilizando-se os marcadores live/dead ( Figura 6B). Os marcadores CD14 e \nCD19 foram utilizados para diferenciar os linfócitos T dos monócitos que \nexpressam o CD14 e o linfócito B que expressa o CD19 ( Figura 6B).  Após \nessa estratégia de obrigatoriamente ser negativo para CD 14/CD19 e \nmarcador de viabilidade, precedeu-se à marcação de linfócitos T utilizando a \nproteína CD3.   \n Identificados os linfócitos T, realizou -se um dot plot com os \nmarcadores CD4 e CD8 para identificar os subtipos de linfócitos ( Figura 6C) \ne outro dot pl ot com marcadores Vβ11 e Vα24 duplos marcados específicos \n\n Métodos 41 \n \n \n \npara células iNKT (Figura 6D). As células iNKT foram selecionadas do gate \nVβ11+ Vα24+ para posterior identificação dos subtipos de células iNKT. Os \nsubtipos de linfócitos e de células iNKT foram ide ntificados com uso dos \nmarcadores CD4, CD8, CD25 e CCR7 ( Figuras 6, 7 e 8). Foram verificadas \nas frequências de linfócitos T CD3+, CD3+CCR7+, CD3+CD4+, \nCD3+CD4+CCR7+, CD3+CD4+CD25+, CD3+CD8+, CD3+CD8+CCR7+, \nCD3+CD8+CD25+, CD3+CD25+) e de células iNKT e seu s subtipos \nNKTCD8+, iNKT CD8+ CCR7+, iNKT CD8+ CD25+, iNKT DP, iNKT CD4+, \niNKT CD4+ CCR7+, iNKT CD4+ CD25+, iNKT DN, iNKT DN CCR7+ e iNKT \nDN CD25+. \n \nFigura 3 -  Representação gráfica de Imunofenotipagem. Density Plot  de \ncitometria de fluxo de linfócitos ( 3a), seleção de gate para \nanálise de viabilidade celular ( 3b), seleção de gate de lin fócitos \nCD3 para CD4+ e CD8+ ( 3c) e células natural Killer T  (iNKT) \n(3d) \n3c\n3b \n3a\n3d\n\n Métodos 42 \n \n \n \n \nFigura 4 -  Representação gráfica de Imunofenotipagem. Density Plot  de \ncitometria de fluxo de li nfócitos CD3 ( 4a), CD3+CCR7+ ( 4b) e  \nCD3+CD25+ ( 4c). Density Plot  de citometria de flu xo de \nlinfócitos CD4+ e CD8+ ( 4d), seleção de gate de linfócitos \nCD8+CCR7+ ( 4e), CD8+CD25+ ( 4f) e linfócitos CD4+CCR7+ \n(4g) e CD4+CD25+ (4h) \n \n \n \n \n \n\n\n Métodos 43 \n \n \n \n \n \nFigura 5 -  Representação gráfica de Imunofenotipagem de células iNKT e \nseus sub-tipos (5b – 5h). Density Plot de citometria de fluxo de \ncélulas iNKT com marcadores Vbeta11 e Valpha24 (5a), seleção \nde gate de células iNKT CD4+ e iNKT CD8+ ( 5b), seleção de \ngate de células iNKT CD8+ CCR7+ ( 5c) e iNKT CD8+ CD25+ \n(5d), seleção de gate de células iNKT DN CCR7+ (5e) e iNKT \nDN CD25+ (5f), seleção de gate de células iNKT CD4+CCR7+ \n(5g) e iNKT CD4+CD25+ (5h) \n \n O resultado da citometria de fluxo identificou as porcentagens de \ncélulas iNKT e seus subtipos no sangue periférico das pacientes dos dois \ngrupos de estudo. \n \n\n\n Métodos 44 \n \n \n \n3.8.3 Estimulação das células iNKT para medição de citocinas  \n \n Para a medição d a produção de citocinas, as células mononucleares \ndo sangue periférico  foram descongeladas e inc ubadas na presença de α -\ngalactosilceramida (αGalCer), uma substancia  agonista específica de iNKT. \nApós 1 hora a 37 oC e CO2 a 5%, adicionou-se Monensina (Golgi Stop, BD \nBiosciences) e Brefeldina A (Golgi Plug, BD Biosciences). Após incubação \ndurante 18 h, a s células foram lavadas e incubadas com anticorpos \nmonoclonais para a superfície. As células foram lavadas e fixadas e \npermeabilizadas utilizando reagentes de fixação / permeabilização da Life \nTechnologies de acordo com as instruções do fabricante. As célu las foram \nincubadas com IL -10 (clone JES3 -1931), da Beckman Coulter (Califórnia, \nCA, EUA), IL-6 (clone MQ2-13A5) da BD (San Jose, CA, EUA) e IL-17 (clone \n: BL168) da Biolegend (San Diego, CA, EUA). As células foram adquiridas \nem um citômetro de fluxo LSR F ortessa (BD Biosciences). Células não \nestimuladas foram usadas para cada painel, para análise intracelular. Todas \nas amostras foram adquiridas usando o software FACSDiva (BD \nBiosciences) e, em seguida, analisadas com o software FlowJo versão 9.9 \n(Tree Star). \n \n \n \n  \n\n Métodos 45 \n \n \n \n3.8.4 Marcação por imunofluorescência na microscopia confocal \n \n As lesões de endometriose foram cortadas em seções de 5mM  para a \nrealização  marcação da  imunofluorescência. As lâminas foram coradas \ncom hematoxilina e eosina, para a realização da leitura por um patologista \npara definir o local específico das lesões de endometriose e áreas saudáveis \nnas seções. Depois disto, as secções foram despar afinadas e submetidas a \numa etapa  de recuperação de epitopos incubados aquecido durante 15 \nminutos em mi croondas em solução tampão de citrato de sódio. Depois \ndisto, fora m incubados durante a noite a 4° C, com anticorpos primários, \nanticorpo CD1d de camundongo anti-humano de (BD Biosciences) e \nanticorpo policlonal de coelho CD3 anti-humano da Abcam (Cambridge, UK). \nEm seguida, os tecidos foram lavados e incubados com anticorpos \nsecundários Alexa 488 anti -camundongo e Alexa 568 anti -coelho da Life \nTechnologies, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA), durante 2 \nhoras à temperatura ambiente. Em seguida, os t ecidos foram lavados e \nincubados com anti -CD4 (clone RPA -T4), por 2 horas. E finalmente, \nincubado com DAPI por 5 minutos e a fixação da lâmina foi realizada  com o \nreagente antifade da  Prolong Golg Life Technologies, Thermo Fisher \nScientific (Waltham, MA, E UA). As imagens foram adquiridas em \nmicroscópio confocal LSM 710 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). As seções \nforam gravadas usando uma versão 11.0 do ZEN 2012 SP2 (preto, 64 bits) \n(Carl Zeiss, Jena, Alemanha). \n \n\n Métodos 46 \n \n \n \n3.9 Análise estatística \n \n Para elaboração do estu do proposto nesta tese,  foram observadas \nmulheres com endometriose profunda infiltrativa intestinal e/ou retrocervical \ne mulheres sem endometriose relativamente ao percentual de células iNKT e \nsubtipos no sangue periférico. \n Além das células iNKT e subtipo s, as mulheres foram avaliadas \nsegundo grau de sintomas apresentados com uso de escalas visuais \nanalógicas (EVA). \n O objetivo do estudo é verificar se os percentuais de células iNKT e \nseus subtipos diferem entre os grupos de mulheres com endometriose e sem \nendometriose. \n As características pessoais e clínicas qualitativas foram descritas  \nsegundo grupos com uso de frequências absolutas e relativas e verificada a \nassociação com os grupos com uso de testes qui -quadrado ou testes exatos \n(teste exato de Fisher ou teste da razão de verossimilhanças) (Kirkwood ; \nSterne, 2006), os escores de sintomas foram descritos segundo grupos com \nuso de medidas, mínimos e máximos e comparado entre os grupos com uso \nde testes Mann -Whitney (Kirkwood ; Sterne, 2006) e as idades e I MC dos \npacientes foram descritos segundo grupos com uso de média e desvio \npadrão e comparados entre os grupos com uso de testes t -Student \n(Kirkwood; Sterne, 2006). \n Os níveis de iNKT e percentuais de cada tipo de célula foram \ndescritos segundo grupos c om u so de medidas resumo (média, desvio \n\n Métodos 47 \n \n \n \npadrão, mediana, mínimo e máximo) e comparado entre os grupos com uso \nde testes Mann-Whitney. \n Apenas nos pacientes com endometriose profunda, foram descritos os \nvalores de iNKT e dos percentuais de cada tipo de célula s egundo cada \nsintoma categorizado como ausente/leve e grave (≥ 7 pontos), infertilidade  e \nestádio com uso de medidas resumo e comparados os valores das células \niNKT e percentuais de cada tipo de célula segundo os sintomas com uso de \ntestes Mann -Whitney. Para ambos os grupos as células iNKT e os \npercentuais de cada tipo foram comparados entre as fases do ciclo \nmenstrual e em cada fase do ciclo foram comparados os grupos com uso de \ntestes Mann-Whitney, porém devido ao número de comparações da mesma \nvariável foi considerado nível de significância de 0,0125 (p= 0,0125) \nconforme correção de Bonferroni. \n As análises foram realizadas com uso do software IBM-SPSS for \nWindows versão 20.0 e tabulados com uso do software Microsoft-Excel 2003 \ne os testes foram realizados com nível de significância de 5%. \n  \n\n 48 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4 Resultados \n \n \n  \n\n Resultados 49 \n \n \n \n4. RESULTADOS \n \n \n4.1 Dados demográficos e clínicos  \n \n Os dados clínicos das pacientes selecionadas foram comparados \npara avaliação de semelhança entre os grupos. A Tabela 2 mostra que não \nhouve diferença significativa na idade média das pacientes no dia da cirurgia \n(p=0,0876). Entretanto,  o IMC médio das pacientes com endometriose \nprofunda foi estatisticamente menor do que daquelas do grupo controle (p = \n0,046).  Da mesma forma, a fase do ciclo menstrual na data da cirurgia não \nfoi diferente entre os grupos estudados (p=0,067) (Tabela 2).   \n \nTabela 2 -  Avaliação de semelhança dos dados clínicos de idade, índice de \nmassa corpórea e fase do ciclo menstrual entre as pacientes \ncom endometriose profunda infiltrativa e sem endometriose \n \nVariável \nGrupo \nTotal \np Controle Endometriose \n(N=26) (N=47) (N=73) \nIdade (anos), média ± DP 34,5 ± 4,6 34,3 ± 6,2 34,4 ± 5,7 0,876 ** \nIMC (Kg/m²), média ± DP  24,1 ± 3,1 22,5 ± 3,3 23 ± 3,3 0,046** \nFase do ciclo menstrual, n (%)    0,067 \nProliferativa 14 (53,8) 15 (31,9) 29 (39,7)  \nSecretora 12 (46,2) 32 (68,1) 44 (60,3)  \nTeste qui-quadrado; * Teste exato de Fisher; # Teste da razão de verossimilhanças; ** Teste \nt-Student; £ Teste Mann-Whitney \n \n \n  \n\n Resultados 50 \n \n \n \nA intensidade dos sintomas clínicos, segundo escala visual  \nanalógica de dor, foi comparada para avaliação de semelhança entre os \ngrupos de endometriose profunda e sem endometriose (Tabela 3). O número \nde pacientes com níveis de  sintomas intensos (EVA ≥ 7) foi estatisticamente \nmaior nas pacientes com endometriose profunda para os sintomas de \ndismenorréia (p<0,001), dor pélvica acíclica  (p<0,001), dispareunia  \n(p<0,038) e alteração intestinal cíclica  (p<0,001). Apenas para o quadro de \nalteração urinaria c íclica não foi observada diferença no n úmero de \npacientes com sintomas mais intensos na comparação entre os dois grupos  \n(p>0,999). A infertilidade também foi estatisticamente maior nas mulheres \ncom endometriose profunda quando comparadas ao grupo sem \nendometriose (p < 0,001).   \n \n  \n\n Resultados 51 \n \n \n \nTabela 3 -  Avaliação de semelhança dos sintomas clínicos entre as \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem \nendometriose \n \nTeste qui-quadrado; * Teste exato de Fisher; # Teste da razão de verossimilhanças; ** Teste \nt-Student; £ Teste Mann-Whitney. Sintomas clínicos baseados na escala visual analógica de \ndor (0 – 10). DM: dismenorréia; DPA: dor pélvica acíclica; DP: dispareunia; AIC: alteração \nintestinal cíclica; AUC: alteração urinária cíclica.  \n  \n  Grupo     \nVariável Controle Endometriose Total p \n  (N = 26) (N = 47) (N = 73)   \nDM, n (%) \n   \n<0,001 \nEVA < 7 23 (88,5) 17 (36,2) 40 (54,8) \n EVA ≥ 7 3 (11,5) 30 (63,8) 33 (45,2) \n mediana (mín.; máx.) 0 (0; 10) 8 (0; 10) 5 (0; 10) <0,001£ \nDPA, n (%) \n   \n0,308* \nEVA < 7 24 (92,3) 38 (80,9) 62 (84,9) \n EVA ≥ 7 2 (7,7) 9 (19,1) 11 (15,1) \n mediana (mín.; máx.) 0 (0; 10) 0 (0; 10) 0 (0; 10) 0,038£ \nDP, n (%) \n   \n0,084* \nEVA < 7 25 (96,2) 37 (78,7) 62 (84,9) \n EVA ≥ 7 1 (3,8) 10 (21,3) 11 (15,1) \n mediana (mín.; máx.) 0 (0; 8) 0 (0; 10) 0 (0; 10) <0,001£ \nAIC, n (%) \n   \n0,046* \nEVA < 7 26 (100) 40 (85,1) 66 (90,4) \n EVA ≥ 7 0 (0) 7 (14,9) 7 (9,6) \n mediana (mín.; máx.) 0 (0; 5) 0 (0; 10) 0 (0; 10) 0,038£ \nAUC, n (%) \n   \n>0,999* \nEVA < 7 26 (100) 46 (97,9) 72 (98,6) \n EVA ≥ 7 0 (0) 1 (2,1) 1 (1,4) \n mediana (mín.; máx.) 0 (0; 0) 0 (0; 8) 0 (0; 8) 0,191£ \nInfertilidade, n (%) \n   \n<0,001# \nNão 26 (100) 9 (19,1) 35 (47,9) \n Sim 0 (0) 25 (53,2) 25 (34,2) \n Sem tentativa 0 (0) 13 (27,7) 13 (17,8) \n \n\n Resultados 52 \n \n \n \n4.2 Estadiamento da endometriose \n \nO estadiamento da doença fo i avaliado nas pacientes com a doença. \nA tabela 4  mostra os resultados encontrados  onde há um nú mero de  \npacientes com endometriose estádio III e IV é três vezes superior ao de \npacientes com endometriose grau I e II (Tabela 4).  \n \nTabela 4 -  Avaliação de semelhança em relação ao  estádio da \nendometriose entre as pacientes com endometriose profunda \ninfiltrativa \n \n  Grupo   \nVariável Controle Endometriose Total \n  (N = 26) (N = 47) (N = 73) \nEstadio, n (%) \n   I/II 0 (0%) 11 (23,4) 11 (23,4) \nIII/IV 0 (0%) 36 (76,6) 36 (76,6) \nEstadiamento I-II: mínimo-leve, III-IV: moderado-grave. \n \n \n  \n\n Resultados 53 \n \n \n \n4.3 Análise das frequências das células iNKT  \n \n As células iNKT foram avaliadas em relação sua frequência no \nsangue periférico entre os dois grupos do estudo . Houve diferença \nestatisticamente significativa em relação ao percentual d e células iNKT no \nsangue (p=0,010 ) de pacientes com endometriose  profunda infiltrativa e m \ncomparação àquelas sem endometriose (Tabela 5).  \n \nTabela 5 -  Descrição das médias das frequên cias das células iNKT no \nsangue periférico segundo grupos de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa e  sem endometriose e \nresultado da comparação entre os grupos \n \n  Grupo     \nVariável Controle Endometriose Total p \n  (N = 26) (N = 47) (N = 73)   \nNKT, média ± DP 0,23 ± 0,25 0,17 ± 0,55 0,2 ± 0,46 0,010 \nTeste de Mann-Whitney; DP = desvio padrão.  \n \n \n \n  \n\n Resultados 54 \n \n \n \nNo Gráfico 1 podemos observar a distribuição das frequências de \ncélulas iNKT nos dois grupos de estudo (Gráfico 1). \n \n \n \nGráfico 1 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências das \ncélulas iNKT no sangue periférico segundo grupos de \npacientes com endometriose profunda infiltrati va e sem \nendometriose \n \n \n \n \n  \np=0,01\n0 \n\n Resultados 55 \n \n \n \n4.4 Análise das frequências dos subtipos de células iNKT \n \nA frequência dos subtipos das células iNKT CD4+, DN e a expressão \nde marcadores CCR7 e CD25 nessas células foi avaliada comparativamente \nentre as pacientes com e sem endometriose. Foi observado uma menor \nfrequência de células iNKT DN nas mulheres com endometriose em relação \nàquelas sem endometriose (p=0,020). Não houve diferença significativa nos \noutros subtipos CD4+ e DN (Tabela 6).  \n \nTabela 6 -  Descrição das médias das frequências dos subtipos de células \niNKT CD4+, DN e a expressão de marcadores CCR7 e CD25 \nno sangue periférico s egundo grupos de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa e sem endometriose e \nresultado da comparação entre os grupos.  Resultados em \nmédia e desvio padrão \n \n  Grupo     \nVariável Controle Endometriose Total p \n  (N = 26) (N = 47) (N = 73)   \niNKT CD4+ 32,2 ± 21 37 ± 27,4 35,2 ± 25,1 0,673 \niNKT CD4+/CCR7 31,6 ± 31 35,6 ± 30,6 34,1 ± 30,6 0,439 \niNKT CD4+/CD25 25,8 ± 18,5 33,5 ± 23,1 30,8 ± 21,8 0,168 \niNKT DN 48,2 ± 21,4 34,6 ± 24,5 39,6 ± 24,2 0,020 \niNKT DN/CCR7 6,76 ± 14,08 11,18 ± 15,87 9,54 ± 15,27 0,801 \niNKT DN/CD25 33,8 ± 29,8 39,7 ± 31,8 37,4 ± 30,9 0,416 \nTeste Mann-Whitney \n \n \n  \n\n Resultados 56 \n \n \n \nOs subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN foram avaliadas em \nrelação secreção de IL -6, IL-10 e IL -17. A frequência das células iNKT DN \nIL17 menor no grupo de pacie ntes com endometriose c omparadas ao grupo \ncontrole sem endometriose (p=0,050). Não houve diferença signific ativa nos \noutros subtipos CD4+, CD8+ e DN (Tabela 7). \n \nTabela 7 -  Descrição das médias das frequências dos subtipos de células \niNKT secretoras de IL -6, IL -10 e IL -17 no sangue periférico \nsegundo grupos de pacientes com endometriose profunda \ninfiltrativa e sem endometriose e resultado da comparação \nentre os grupos. Resultados em média e desvio padrão \n \n  Grupo     \nVariável Controle Endometriose Total p \n  (N = 26) (N = 47) (N = 73)   \niNKT CD4+/IL6 5,55 ± 5,71 1,37 ± 1,94 3,09 ± 4,34 0,081 \niNKT CD4+/IL10 3,08 ± 2,26 4,36 ± 5,51 3,86 ± 4,48 0,856 \niNKT CD4+/IL17 13 ± 4 8,7 ± 5,5 10,4 ± 5,3 0,160 \niNKT CD8+/IL6 6,37 ± 5,8 3,44 ± 4,25 4,42 ± 4,89 0,196 \niNKT CD8+/IL10 3,81 ± 2,91 4,53 ± 3,88 4,29 ± 3,53 0,881 \niNKT CD8+/IL17 9,11 ± 4,65 10,99 ± 14,18 10,36 ± 11,75 0,455 \niNKT DN/IL6 1,99 ± 2,57 0,74 ± 1,12 1,21 ± 1,86 0,127 \niNKT DN/IL10 0,35 ± 0,39 0,44 ± 0,88 0,41 ± 0,72 0,356 \niNKT DN/IL17 11,5 ± 5 7,8 ± 4,2 9,2 ± 4,8 0,050 \nTeste Mann-Whitney \n \n \n  \n\n Resultados 57 \n \n \n \nNo Quadro 1 podemos observar a distribuição das frequências de \ncélulas iNKT DN e iNKT DN IL-17+ nos dois grupos de estudo (Quadro 1). \n \n \nQuadro 1 -  Representação em dotplot da distribuição  das frequências das  \ncélulas iNKT DN (A) e iNKT DN IL17+ (B) no sangue periférico \nsegundo grupos de pacientes com endometriose profunda \ninfiltrativa e sem endometriose \n \n \n  \np=0,050 \np=0,020 \nA \n B \n\n Resultados 58 \n \n \n \n4.5  Análise das frequências  das células iNKT e subtipos em relação \naos sintomas da endometriose \n  \n As células iNKT e os subtipos estudados foram avaliadas em relação \nàs suas frequências e a intensidade dos sintomas de dismenorréia, \ndispareunia, dor pélvica acíclica, alteração intestinal cíclica e alteração \nurinária cíclica nas pacientes com endometriose pro funda infiltrativa. A \nintensidade dos sintomas foi dividida em dois grupos < 7 e ≥ 7 de acordo \ncom a EVA de dor. \n No Gráfico 2, mostramos o resultado da comparação das médias das \nfrequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão \nde marcadores CCR7 e CD25  no sangue periférico de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa versus o grupo controle e a intensidade do \nsintoma clínico de dismenorré ia. Foi observado uma significativa menor \nfrequência das células iNKT CD4+ CCR7 nas pacientes com endometriose \nprofunda em comparação as pacientes sem a doença . Não houve diferença \nsignificativa em relação aos o utros subtipos de iNKT com expressão dos \nmarcadores CCR7 e CD25 . As frequências dos subtipos de células iNKT \nCD4+, CD8+ e DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL-17 também foram avaliadas \nnas pacientes com endometriose pro funda infiltrativa  e grupo controle  em \nrelação à intensidade da  dismenorréia (Gráfico 2). A frequência das células \niNKT CD4+ IL17 foi significativamente menor no grupo de pacientes com \ndismenorréia leve (EVA < 7) comparadas ao grupo com dismenorréia \n\n Resultados 59 \n \n \n \nintensa (EVA ≥ 7). Não houve diferença signific ativa nos outros subtipos de \ncélulas CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL-17 (Gráfico 2). \n \n \nGráfico 2 -  Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue \nperiférico de pacientes com endometriose profu nda infiltrativa e \nsintomas clínicos de dismenorréia com intensidade <7 e ≥ 7 \nsegundo a EVA \n \n \n  \n\n\n Resultados 60 \n \n \n \nNo Quadro 2 podemos observar a distribuição das frequências de \ncélulas iNKT CD4+ CCR7+ e iNKT CD4+ IL -17+ no sangue periférico de \npacientes com endometriose pro funda infiltrativa e intensidade de sintoma \nde dismenorréia (Quadro 2). \n \n \nQuadro 2 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências das \ncélulas iNKT CD4+ CCR7+ (A) e iNKT CD4+ IL17+ (B) no sangue \nperiférico de pacientes com endometriose profund a infiltrativa e \nintensidade de sintoma de dismenorréia \n \n \n  \np=0,022 \n p=0,038 \nA \n B \nEVA< \n7 \nEVA ≥ 7 \n EVA< \n7 \nEVA ≥ 7 \n\n Resultados 61 \n \n \n \nA seguir demonstramos o resultado da comparação das médias das \nfrequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão \nde marcadores CCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes c om \nendometriose profunda infiltrativa versus o grupo controle e a intensidade do \nsintoma clínico de dor pélvica acíclica. Não foi observado diferença \nestatisticamente significativa na frequência destas células e a intensidade da \ndor pélvica acíclica . As fr equências dos subtipos de células iNKT CD4+, \nCD8+ e DN secretoras de IL -6, IL-10 e IL -17 também foram avaliadas nas \npacientes com end ometriose profunda infiltrativa  em relação ao grupo \ncontrole e a intensidade da dor pélvica acíclica  (Gráfico 3). Dentre es tas, \napenas a  frequência das células iNKT CD4+ IL17 foi significativamente \nmenor no grupo de pacientes com dor pélvica acíclica  leve comparadas ao \ngrupo com dor intensa (Gráfico 4). Não houve diferença signific ativa nos \noutros subtipos CD4+, CD8+ e DN. \n  \n\n Resultados 62 \n \n \n \n \nGráfico 3 -  Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue \nperiférico segundo grupos de pacientes com endometriose \nprofunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de \ndor pélvica acíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA \n \n \n \n \nGráfico 4 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências das \ncélulas iNKT CD4+ IL17+ no sangue periférico de pacientes \ncom endometriose profunda infiltrativa e intensidade de \nsintoma de dor pélvica acíclica \n \nEVA< 7 \n EVA ≥ 7 \np=0,048 \n\n Resultados 63 \n \n \n \nOs resultado s da comparação das médias das frequências das \ncélulas iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão de marcadores \nCCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes com endometriose \nprofunda infiltrativa versus pacientes do grupo controle e a intensidade do \nsintoma clínico de dispareunia estão demonstrados no Gráfico 5 . Não foi \nobservado diferença estatisticamente significativa na frequência destas \ncélulas e a intensidade da dispareunia entre os grupos . As frequências dos \nsubtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL-17 \ntambém foram avaliadas nas pacientes com endometriose profunda \ninfiltrativa e no grupo controle. Não houve diferença significativa nos subtipos \nCD4+, CD8+ e DN entre os grupos (Gráfico 5).  \n \n \nGráfico 5 -  Médias das f requências de células iNKT e subtipos no sangue \nperiférico segundo grupos de pacientes com  endometriose \nprofunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de \ndispareunia com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a EVA \n \n\n\n Resultados 64 \n \n \n \nOs resultados da comparação das médias das frequências das \ncélulas iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão de marcadores \nCCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes com endometriose \nprofunda infiltrativa  versus o grupo controle  e a intensidade do sintoma \nclínico de alteração intestinal cíclica estão demonstrados no Gráfico 6. Não \nfoi observado diferença estatisticamente significativa na frequência destas \ncélulas e a intensidade da alteração intestinal cíclica  entre os grupos . As  \nfrequências dos subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de \nIL-6, IL-10 e IL-17 também foram avaliadas nas pacientes com endometriose \nprofunda infiltrativa  e no grupo controle . Não houve diferença signific ativa \nnas frequências dos subtipos CD4+, CD8+ e  DN (Gráfico 6).  \n \n \nGráfico 6 -  Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue \nperiférico segundo grupos de pacientes com  endometriose \nprofunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de \nalteração intestinal cíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a \nEVA \n \n\n\n Resultados 65 \n \n \n \nOs resultados da comparação das médias das frequências das \ncélulas iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN e a expressão de marcadores \nCCR7 e CD25 no sangue periférico de pacientes com endo metriose \nprofunda infiltrativa e de pacientes do grupo  controle em relação a \nintensidade do sintoma clínico de alteraçã o urinária  cíclica estão \ndemonstrados no Gráfico 7 . Não foi observado diferença estatisticamente \nsignificativa na frequência destas células e a intensidade da alteração \nurinária cíclica. As f requências dos subtipos de células iNKT CD4+, CD8+ e \nDN secretoras de IL -6, IL-10 e IL-17 também foram avaliadas nas pacientes \ncom endometriose profunda infiltrativa  e sem endometriose . Não houve \ndiferença signific ativa nos subt ipos CD4+, CD8+ e DN entre o s grupos \n(Gráfico 7).  \n \nGráfico 7 -  Médias das frequências de células iNKT e subtipos no sangue \nperiférico segundo grupos de pacientes com  endometriose \nprofunda infiltrativa e sem endometriose e sintomas clínicos de \nalteração urinária cíclica com intensidade <7 e ≥ 7 segundo a \nEVA  \n\n\n Resultados 66 \n \n \n \n4.6 Análise das células iNKT e o estádio da endometriose \n \nUm outro aspecto avaliado no presente estudo foi a relação entre a \nfrequência das células iNKT e seus subtipos com o estádio da endometriose. \nAs médias das frequências das células  iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN \ncom a expressão de marcadores CCR7 e CD25, assim como dos subtipos \nde células iNKT CD4+, CD8+ e DN secretoras de IL -6, IL -10 e IL -17 no \nsangue periférico de pacientes com estádio I/II foram comparados àquelas \ncom estádio III/IV  de endometriose.  \nDas 46 pacientes com endometriose 11 (23 ,4%) tiveram a doença \nclassificada em está dio I/II e 35 (76,6 %) em estádio III/IV. Entretanto, só foi \npossível detectar as frequências das células iNKT CD4+/IL6, iNKT \nCD4+/IL10, iNKT CD4+/IL17, iNKT CD8+/IL6, iNKT CD8+/IL10, iNKT \nCD8+/IL17 em uma das pacientes com estádio I/II de endometriose. Da \nmesma forma , não foi possível medir as frequências das células iNKT \nDN/IL6, iNKT DN/IL10, iNKT DN–/IL17 em nenhuma das pacientes com \nendometriose es tádio I/II. Nos casos em que os cálculos estatísticos \npuderam ser realizados de forma adequada, não foi observada diferença \nsignificativa na s frequências das células avaliadas e o estádio da \nendometriose profunda (Gráfico 8).  \n \n \n \n\n Resultados 67 \n \n \n \n \nGráfico 8 -  Médias das frequências de  células iNKT e subtipos no sangue \nperiférico segundo estádio I/II ou III/IV da doença nas pacientes \ncom endometriose profunda \n \n \n  \n\n\n Resultados 68 \n \n \n \n4.5 Avaliação das células iNKT nas diferentes fases do ciclo menstrual \n \nPor fim, foi inv estigado a influê ncia da fase do ciclo menstrual nas \ncélulas iNKT assim como nos seus subtipos analisados neste estudo. Foram \ncomparadas as frequências das células iNKT, subtipos iNKT CD4+, iNKT DN \ncom a expressão de marcadores CCR7 e CD25, assim como dos subtipos \nde células iNKT CD4+, iNKT CD8+ e iNKT DN secretoras de IL-6, IL-10 e IL-\n17 no sangue periférico de pacientes  das pacientes com endometriose \nprofunda versus pacientes sem  endometriose em cada fase do ciclo  \nmenstrual separadamente. \nRealizamos ainda a comparação das frequências das mesmas células \ndescritas acima dentro de cada grupo isoladamente comparando a fase \nproliferativa com a fase secretora. Portanto, comparamos dentro do grupo \ncontrole as frequências das células iNKT e subtipos entre as pacientes que \nse encontrava m na fase proliferativa com aquelas que se encontravam na \nfase secretora ao momento da cirurgia. De forma idêntica realizamos a \ncomparação dentro do grupo de pacientes com endometriose profunda.  \nOs resultados identificaram que pacientes na fase secretora com \nendometriose profunda apresentaram uma menor frequência células iNKT \nquando comparadas as pacientes sem a doença na mesma fase do ciclo \nmenstrual. Entre as pacientes que se encontravam na fase proliferativa \nforam observadas duas diferenças sign ificativas. As células iNKT CD4+ \nCD25 apresentaram uma maior frequência nas pacientes com endometriose \nprofunda quando comparadas as pacientes do grupo controle. No entanto, \n\n Resultados 69 \n \n \n \nas células iNKT CD4+ DN foram identificadas em menor frequência nas \npacientes com endometr iose quando comparadas as pacientes sem \nendometriose. No grupo de pacientes com endometriose profunda \nidentificamos uma maior frequênc ia das células iNKT DN CD25  na fase \nproliferativa quando comparada com a fase secretora  (tabela 8). Além disso, \nna fase se cretora do ciclo menstrual, encontramos menor frequência de \ncélulas iNKT DN IL17+ nas pacientes com endometriose profunda quando \ncomparadas as pacientes do grupo controle (Tabela 8).  \n \n  \n\n Resultados 70 \n \n \n \nTabela 8 -  Descrição das médias das frequências de células iNKT e \nsubtipos no sangue periférico segundo grupos de pacientes \ncom endometriose profunda infiltrativa (grupo endometriose) e \nsem endometriose (grupo controle) e a fase do ciclo menstrual. \nResultado da comparação entre os grupos  e entre as fases do \nciclo menstrual \n \nVariável \nFase do \nciclo \nmenstrual \nGrupo \np Controle Endometriose \niNKT \nProliferativa 0,07 (0,02; 0,56) 0,04 (0; 0,19) 0,128 \nSecretora 0,25 (0,01; 0,94) 0,05 (0; 3,61) 0,030 \np 0,295 0,880 \n \niNKT CD4+ \nProliferativa 31,1 (7,2; 73,1) 30,1 (0; 100) 0,734 \nSecretora 28,6 (0; 69,6) 34,1 (0; 81,1) 0,747 \np 0,936 0,479   \niNKT CD4+/CCR7 \nProliferativa 41,3 (0; 83,1) 53,8 (0; 77,5) 0,470 \nSecretora 0 (0; 92,3) 40,6 (0; 83,5) 0,460 \np 0,316 0,368 \n \niNKT CD4+/CD25 \nProliferativa 33,2 (0; 58,6) 44,6 (0; 60) 0,022 \nSecretora 25,6 (0; 57,7) 30 (0; 81,7) 0,555 \np 0,674 0,121   \niNKT DN \nProliferativa 55,8 (23,1; 87,5) 28,8 (0; 73,3) 0,011 \nSecretora 53,1 (0; 69,2) 30,6 (0; 81,7) 0,357 \np 0,611 0,542 \n \niNKT DN/CCR7 \nProliferativa 0,5 (0; 36,6) 4,27 (0; 48,6) >0,999 \nSecretora 0,1 (0; 45,5) 6,9 (0; 60) 0,745 \np 0,689 0,897   \niNKT DN/CD25 \nProliferativa 46,2 (0; 76,2) 62,5 (0; 100) 0,101 \nSecretora 17 (0; 72,3) 37,3 (0; 87,5) 0,722 \np 0,437 0,032 \n \niNKT CD4+/IL6 \nProliferativa 4,17 (0; 14,9) 0 (0; 1,89) 0,250 \nSecretora 2,98 (1,13; 4,83) 1,59 (0; 6,19) 0,667 \np 0,857 0,543   \niNKT CD4+/IL10 \nProliferativa 3,01 (0; 7,46) 1,82 (0; 3,77) 0,571 \nSecretora 2,32 (1,93; 2,71) 3,31 (0; 20) 0,400 \np 0,381 0,260 \n \niNKT CD4+/IL17 \nProliferativa 14,8 (8,3; 16) 8,6 (3,8; 16,4) 0,786 \nSecretora 11,7 (6,6; 16,9) 9,8 (0; 17,5) 0,711 \np >0,999 >0,999   \niNKT CD8+/IL6 \nProliferativa 4,52 (0; 16,8) 0 (0; 10,7) 0,571 \nSecretora 5,74 (1,27; 10,2) 0,8 (0; 10) 0,308 \np >0,999 0,808 \n continua \n\n Resultados 71 \n \n \n \nTabela 8  (conclusão) - Descrição das méd ias das frequências de células \niNKT e subtipos  no sangue periférico segundo grupos de \npacientes com endometriose profunda infiltrativa (grupo \nendometriose) e sem endometriose (grupo controle) e a fase do \nciclo menstrual. Resultado da comparação entre os gr upos e \nentre as fases do ciclo menstrual \nTeste Mann-Whitney; Dados expressos como mediana (mín.; máx.). \n \n \n  \nVariável Fase do ciclo \nmenstrual \nGrupo p Controle Endometriose \niNKT CD8+/IL10 \nProliferativa 3,85 (1,32; 9,8) 7,14 (0; 9,52) >0,999 \nSecretora 2,68 (2,53; 2,82) 3,01 (0; 11,1) 0,923 \np 0,857 0,639   \niNKT CD8+/IL17 \nProliferativa 6,15 (4,07; 17,6) 13,3 (9,52; 14,3) 0,250 \nSecretora 10,8 (9,6; 12) 3,95 (0; 54,5) 0,308 \np 0,381 0,139 \n \niNKT DN/IL6 \nProliferativa 1,28 (0; 7,66) 2,27 (0; 3,45) 0,786 \nSecretora 0,61 (0,48; 3,57) 0 (0; 1,96) 0,217 \np >0,999 0,142   \niNKT DN/IL10 \nProliferativa 0,52 (0; 1,02) 0 (0; 2,27) >0,999 \nSecretora 0,19 (0; 0,3) 0 (0; 2,44) 0,573 \np 0,571 0,836   \niNKT DN/IL17 \nProliferativa 10,2 (5,2; 13,9) 13,6 (3,2; 13,8) >0,999 \nSecretora 14 (8,1; 21,4) 7,1 (0; 13,8) 0,049 \np 0,393 0,446   \n\n Resultados 72 \n \n \n \nNo Gráfico 9 podemos observar a distribuição das frequências de \ncélulas iNKT na fase secretora nos dois grupos de estudo (Gráfico 9). \n \n \n \n \n \n \n \nGráfico 9 -  Representação em dotplot da di stribuição das frequências das \ncélulas iNKT no sangue periférico de pacientes com \nendometriose profunda infiltrativa e  grupo controle na fase \nsecretora do ciclo menstrual \n \n \n  \np=0,030 \n\n Resultados 73 \n \n \n \nNo Quadro 3 podemos observar a distribuição das frequências de \ncélulas iNKT CD4+ CD25+ e iNKT DN na fase proliferativa em pacientes \ncom en dometriose e grupo controle,  iNKT DN CD25+ em pacientes com \nendometriose profunda na fase proliferativa e secretora do ciclo menstrual e  \niNKT DN IL17+ na fase secretora em pacientes com endometriose e grupo \ncontrole (Quadro 3). \n \nQuadro 3 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências das \ncélulas (A) iNKT CD4+ CD25+ na fase proliferativa em \npacientes com endometriose e grupo controle; ( B) iNKT DN na \nfase proliferativa  em pacientes com end ometriose e grupo \ncontrole; (C) iNKT DN CD25+ em pacientes com endometriose \nprofunda na fase proliferativa e secretora do ciclo menstrual; \n(D) iNKT DN IL17+  na fase secretora em pacientes com \nendometriose e grupo controle \n \nB \nC \nA \nD \np=0,022 \np=0,011 \np=0,032 \np=0,049 \n\n Resultados 74 \n \n \n \n4.7 Avaliação das células iNKT nas lesões de endometriose \n \nPara avaliar a possível relação entre do número de células iNKT \ntecidual e a endometriose realizamos analise por imunocoloração  confocal \ndessas células no tecido com lesão de endometriose comparando com o \ntecido saudável, sem endometriose, adjacente (Figura 6).  \n \n \n \nFigura 6 -  Imunocoloração confocal de células iNKT em lesões de \nendometriose. (A) Mesclagem representativa de células coradas \nmarcadas com CD3 (vermelho), CD1D (verde), CD4 (amarelo) e \nDAPI (azul) de áreas saudáveis e áreas de endometriose. (B) \nPorcentagem de células iNKT em áreas saudáveis e \nendometriose do tecido (n = 9) \n\n\n Resultados 75 \n \n \n \nNo Gráfico 10 podemos observar que não houve diferença \nestatística nas média s das frequências de células iNKT e células CD3+ no \ntecido com lesão de e ndometriose e tecido normal sem lesão de \nendometriose (Gráfico 10). \n \n \n \n \n \nGráfico 10 -  Representação em dotplot da distribuição das frequências das \ncélulas iNKT e células CD3+ no tecido com lesão de \nendometriose e tecido normal sem lesão de endometriose \n \n \n \n \n* \n p=0,14 \n\n 76 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5 Discussão \n \n \n  \n\n Discussão 77 \n \n \n \n5. DISCUSSÃO \n \n \nO papel do sistema imunológico na patogênese da endometriose foi \namplamente demonstra do nas últimas décadas. E studos anteriores \nobservaram que diversas citocinas podem ser anormalmente expressas ou \nproduzidas em pacientes com endometriose (Bergqvist et al., 2001; Bedaiwy \net al., 2002; Cheong et al., 2002; Berkkanoglu ; Arici, 2003; Kyama et al., \n2006; Kalu et al., 2007; Othman et al., 2008; Salmassi et al., 2008; Ahn et al., \n2015, Thiruchelvam et al., 2015; Mons anto et al., 2016; Miller et al., 2017). \nDa mesma forma, o comportamento variável da resposta Th1, Th2 e Th17 foi \nobservado por alguns autores em mulheres com endometriose (Antsiferova \net al., 2005; Podgaec et al., 2007; Fairbanks et al., 2009; Podgaec et al., \n2010; Szymanowski et al., 2013 ; Osuga et al., 2016 ). Outros estudos \ndemonstraram atividade irregular ou diferente em componentes celulares do \nsistema imunológico como macrófagos, linfócitos T e B, células NK e células \ndendríticas nas pacientes com end ometriose (Berkkanoglu. Arici, 2003; \nKyama et al., 2006; Dias Jr et al., 2012; Capobianco , Rovere-Querini, 2013; \nAhn et al., 2015; Thriruchelvam et al., 2015) . Considerando as diversas \nalterações no sistema imunológico previamente observadas na \nendometriose e ainda o importante papel das células iNKT na resposta \nimune (Bendelac et al., 2007; Balato et al., 2009), decidimos avaliar se as \ncélulas iNKT estão alteradas em pacientes com endometriose.   \n\n Discussão 78 \n \n \n \nO estudo foi realizado com dois grupos distintos de paciente s, um \nformado por portadoras de endometriose profunda e o outro por pacientes \nsem endometriose. A escolha do grupo de pacientes especificamente com \nendometriose prof unda se deve a alguns fatores: a maior parte das \npacientes com indicação para cirurgia  no s erviço é portadora de lesão \nprofunda infilt rativa e para se evitar o viés de colocar no mesmo grupo \npacientes com diferentes tipos de lesão de endometriose. O grupo controle \nfoi composto apenas por pacientes submetidas à laqueadura tubária bilateral \nlaparoscópica por três razões: fertilidade prévia comprovada, indicação \ncirúrgica não relacionada a patologias pélvicas e possibilidade de confirmar \na ausência de lesões de endometriose pela laparoscopia. \nOs grupos de estudo foram equivalentes em relação às \ncaracterísticas basais dos pacientes, como idade e fase do ciclo menstrual. \nNo entanto, foi observado um IMC médio maior no grupo controle do que \nnas pacientes com endometriose  profunda. Esse resultado está de acordo \ncom achados de pesquisas anteriores em que o IMC médio observado foi  \nmenor em pacientes com endometriose quando comparados a mulheres \nsaudáveis sem endometriose (Backonja et al., 2017; Liu; Zhang, 2017).  \nO número de pacientes com dismenorréia intensa (EVA ≥ 7) e \nsintomas intestinais foi significativamente superior no grupo com \nendometriose profunda. Esse achado é  considerado normal e  esperado em \nfunção das características clinicas da endometriose cujos sintomas de dor \npélvica intensa são frequentes, em especial a dismenorréia, com prevalência \nentre 50% a 90% entre as portadoras da doença. (Giudice et al., 2010). \n\n Discussão 79 \n \n \n \nNos resultados desta  pesquisa encontramos  uma frequência \nsignificativamente menor de células iNKT no sangue periférico de pacientes \ncom endometriose  profunda em comparação com mulheres sem \nendometriose. Frequências diminuídas de células iNKT foram previamente \ndescritas em diferentes doenças, tais  como, infecção por HIV e HTLV e \nimunodeficiência comum variável ( Fulcher et al., 2009 ; Ndhlovu et al., 200 9; \nSnyder-Cappiobe et al., 2009).  Outros estudos observaram que defeitos \nseletivos na quantidade de células iNKT e produção de citocinas estão \npresentes em indivíduos afetados por diferentes doenças, como diabetes \ntipo I, lúpus eritematoso sistêmico, artri te reumatoide, cirrose biliar primária, \nasma alérgica, esclerose múltipla, ví rus da imunodeficiência humana -1 e \ntuberculose pulmonar (Yanagihara et al., 1999; Oishi et al., 2001; van der \nVliet et al., 2002; Chan et al., 2003; Lin et al., 2005; Snyder -Cappione et al., \n2007; Fletcher e Baxter, 2009) . Entretanto, o tipo de ação  (patogênico ou \nprotetor) das células iNKT é bastante complexo, variável e dependente de \nfatores como: momento da ativação, tipo de estimulo recebido, interação \ncom diferentes células dendríticas e perfil de citocinas secretadas. \nDiante da relação entre diminuição das células iNKT e a \nendometriose, procuramos entender de que forma a alteração destas células \nestaria envolvida no desenvolvimento, manutenção ou evolução da doença.  \nSabemos po r estudos anteriores que  a endometriose está associada a  \nalterações na distribuição de linfócitos, nas células NK e nas respostas \nimunes Th1, Th2 e Th17 que levam a modificações na liberação de citocinas  \n(Nap et al., 2004; Agic el al., 2006; Martinez et al ., 2007, Podgaec et al., \n\n Discussão 80 \n \n \n \n2007). Por outro lado, as células iNKT, quando estimuladas e dependendo \nno tipo de estimulo, tem a propriedade de secretar grandes quantidades de \ncitocinas com padrão Th1, Th2 e Th17  (Taniguchi et al., 2003 ; Kronenberg, \n2005; Au-Yeung; Fowell, 2007; Bendelac et al., 2007; Michel et al., 2007). \nAggarwal et al ., em 2014 avaliaram a atividade citolítica das células \nNK e iNKT e citocinas de resposta Th1 e Th2 em pacientes com artrite \nreumatoide (AR). Os autores observaram uma diminuição da significativa na \nfrequências das células iNKT nas pacientes com AR comparado s aos \ncontroles saudáveis (p<0,001). Além disso, enc ontraram aumento de \nexpressão nas células iNKT das citocinas Th1 pró-inflamatórias IFN, TNF, \nIL-8 e IL-18 e diminuição da citocina Th2 anti -inflamatória IL-4 em pacientes \ncom AR. Outro achado relevante foi a relação direta entre o aumento das \ncitocinas I FN, TNF  e IL-18 e a diminuição da IL-4 com a gravidade da \ndoença. \nAlterações das cél ulas iNKT também tem papel relevante no Lupus \nEritematoso Sistemico  (LES). As células iNKT estão diminuídas em \nfrequência e em número absoluto em pacientes com LES. Como \nconsequência há também nesses casos um desequilíbrio na relação \nTh1/Th2, aumento na se creção de IL -17, alteração na supressão da \nprodução de auto -anticorpos e na função das células dendríticas, com \nimplicação relevante na imunorregulaçao da doença (Chen et al., 2015).  \nPortanto, as alterações na frequência de células iNKT, neste caso a \ndiminuição, podem alterar ou polarizar o perfil de resposta imune com \naumento ou diminuição na secreção de determinadas citocinas pró -\n\n Discussão 81 \n \n \n \ninflamatórias ou anti -inflamatórias que podem ser relacionadas ao \ndesenvolvimento, manutenção e evolução da endometriose.  \nOutro aspecto relevante é a possível influencia da fase do ciclo \nmenstrual no sistema imune especialmente nos órgãos reprodutivos. \nEstrogênio e progesterona são suficientes para controlar varias d as funções \nendometriais, regulando a expressão de milhares de g enes durante o ciclo \nmenstrual (Bulu n, 2009). Um perfil diferente nas  frequências de células \ninflamatórias e secreção de citocinas é observado no sangue periférico, no \nlíquido peritoneal e na urina  de mulheres com  endometriose , dependendo \nda fase do ciclo  menstrual (Whitcomb et al., 2014; Sikora et al. , 2015; \nRakhila et al., 2016) . Esses dados sugerem um papel importante dos \nhormônios esteróides sexuais na f isiologia do microambiente imunológico  \n(Whitcomb et al., 2014; Sikora et al., 2015; Rakhila et al., 2016). A \nimportância do estrogênio no desenvolvimento e manutenção da \nendometriose está bem estabelecida (Zhao et al., 2015).  \nMostramos, no presente estudo,  que as células iNKT ainda estão \ndiminuídas na fase secretora no grupo de pacientes com endometrios e \nprofunda em comparação com aquele de pacientes sem endometriose. Essa \ndiferença pode estar relacionada a anormalidades na secreção ou ação da \nprogesterona em pacientes com endometriose  (Patel, 2017; Patel, 2018). A \nresistência do  receptor de progesterona  é um dos fatores que tem sido \nrelacionado ao desenvolvimento e manutenção da endometriose (Patel \n2017; Patel 2018). Anormalidades na fisiologia da progesterona estão \ndiretamente ligadas a modificações no ambiente imune no endométrio tópico \n\n Discussão 82 \n \n \n \ne ectópico. Portanto, supomos que as células iNKT diminuídas em pacientes \ncom endometriose podem estar relacionadas à disfunção da progesterona \nfrequentemente associada à doença.  \nNo mesmo contexto, nós indagamos se os subtipos de células iNKT \nestarão diminuídos na doenç a. Observamos uma diminuição dos sub tipos \niNKT DN, os  mais predominantes em humanos e que apresentam funções \nefetoras importantes durante a resposta imune (Gumperz et al., 2002; Lee et \nal., 2002).  \nQuestionamos ainda se as células iNKT poderiam expressar o utros \nmarcadores de superfície, como os marcadores de ativação. Lee et al. 2002, \nmostraram que os su btipos de células iNKT CD4+ em indivíduos saudáveis  \nexpressam exclusivamente cadei a alfa da interleucina 2 (CD25).  Neste \nestudo demonstramos que as células iNKT DN expressaram CD25 com \nmaior frequência na fase proliferativa comparado à fase secretora de \npacientes com endometriose profunda. Em contrapartida, não foi observado \nesse mesmo resultado em relação à expressão de CD25 pelas células iNKT \nCD4+. Estes resultados demonstraram que pacientes com endometriose têm \nsubgrupos iNKT DN regulados e mostram um perfil regulatório na fase \nproliferativa da endometriose.  \nAspectos relacionados ao perfil hormonal das fases do ciclo  \nmenstrual, ação hormonal normal ou anor mal (secreção, mutações de \nreceptores, resistência à progesterona) e resposta imune à estimulação \nhormonal podem ter um papel nas variações observadas nessas células. \nAlém disso, a homogeneidade entre os grupos estudados no ciclo menstrual \n\n Discussão 83 \n \n \n \né essencial para  evitar erros e resultados falsos. Os dados basais do \npresente estudo mostram frequência semelhante de pacientes em fase \nproliferativa e secretora entre a endometriose e o grupo controle.  \nNosso estudo também compa rou as frequências de células iNKT no  \nsangue periférico de acordo com os sintomas de endometriose \n(dismenorréia, dispareunia, dor pélvica acíclica , alterações intestinais \ncíclicas, alterações urinárias cíclicas) e estado de fertilidade. Identificamos \ndiminuição das células iNKT CD4+ CCR7 + em pacientes com endometriose \ne dismenorreia  intensa (EVA ≥ 7). A s evidências sugerem que cada \nsubpopulação de células iNKT (CD4 +, CD8 + e CD4 -CD8-) produz um perfil \nde citocinas e ativação de células NK e B leva ndo a uma resposta Th \ndiferente (Lin et al., 2006). O'Reilly et al., 2011, observaram um padrão de \nsecreção diverso de citocinas IFNγ, TNFα, IL -1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, \nIL-10, IL -12p70, IL -13, IL -17a e IL -22 após  estimulação de células iNKT \nCD4+, CD8 + e iNKT CD4- CD8-. Vários estudos demonstraram que a \nfrequência e as funções de sub tipos de células iNKT foram observadas em \npacientes com diferentes doenças (Araki et al., 2003; Kenna et al., 2003; \nMontoya et al., 2007; Im et al., 2008; Bricard et a l., 2009; Laganà et al., \n2016). \nAs células iNKT DN possuem um importante padrão Th1, liberando \nmaiores quantidades de IFNγ e TNFα após a estimulação (L iao et al., 2011). \nNeste aspecto , nossos resultados atuais demonstram uma porcentagem \ndiminuída de iNKT DN em pa cientes com endometriose. Como as células  \niNKT DN produz em uma resposta Th1, como o equilíbrio T h1 / Th2 é \n\n Discussão 84 \n \n \n \nessencial para a homeostase imune e como as irregularidades Th1 / Th2 são \nobservadas em pacientes com endometriose, é plausível supor uma \nimplicação dessa anormalidade na fisiopatologia da endo metriose \n(Antsiferova et al. , 2005; Podgaec et al., 2007; Fairbanks et al., 2009; \nPodgaec et al., 2010; Liao et al., 2011; Szymanowski et al., 2013). No \nentanto, neste estudo, não foi possível demonstrar o perfil Th1 (IFNg e \nTNFa) em células iNKT DN  ou em outros subtipos . No entanto, \ndemonstramos que as cél ulas iNKT DN secretam citocinas IL -17 em menor \nproporção em pacientes com endometriose quando comparadas com \nmulheres sem endometriose. Foi observado também que estas células ainda \nestão diminuídas na fase secretora  em pacientes com endometriose \nprofunda.  \nPor outro lado, mostramos um aumento na  frequência de células \niNKT CD4+ IL17 + em pacientes com endometriose e dismenorréia  intensa \n(EVA ≥ 7)  versus dismenorréia leve (EVA < 7). Além disso, observou-se um \naumento da  frequência de células iNKT CD4+ IL17+ em pacientes  com \nendometriose e dor pélvica acíclica  intensa (EVA ≥ 7) em comparação com \npacientes com dor pélvica acíclica leve  (EAV < 7) . A dismenorreia é o \nsintoma mais comum relacionado à endometrios e. O número de linfócitos T \nCD4+ e os níveis de IL -17 estão relacionados ao mecanismo de dor na \ncondição inflamatória. A interleucina -17 é um membro de uma família de \ncitocinas, que são predo minantemente produzidas por células T CD4 + \nativadas. A IL -17 possui potentes propriedades pró -inflamatórias e está \nenvolvida na modulação da resposta imune em distúrbios inflamatórios e dor \n\n Discussão 85 \n \n \n \n(Iwakura et al., 2011; Sun et al., 2017). Estudos anteriores mostr aram que \nníveis aumentados de IL -17 estão implicados na dor visceral e neuropática \n(Noma et al., 2011; Day et al., 2014). Demonstrou -se que o comportamento \nassociado à dor está reduzido em camundongos após bloqueio da produção \nde IL-17 em modelos inflamató rios em nervos plantar ou isquiático e em \nmodelos de lesão em nervos periféricos (Meng et al., 2013; Knier et al., \n2015).  \nAs frequências anormais de iNKT CD4+ IL17 + observadas em \nnossos resultados podem ser, em parte, uma possível explicação para os \nsintomas de dor relacionados à endometriose. Como a frequência de células \niNKT neste estudo não foi influenciada de acordo com os diferentes estágios \nda doença, é plausível pensar em uma provável homogeneidade na \nfrequência das células iNKT, independente de alg umas caracte rísticas da \ndoença. A diferença observada na frequência de células iNKT em pacientes \ncom endometriose pode desempenhar um papel relevante no diagn óstico da \ndoença, uma vez que as  células podem ser um marcador potencial para a \npresença de endometriose ou alguns tipos de lesões  de endometriose como \na endometriose profunda infiltrativa.  \nEm conjunto, os resultados de nosso estudo e o conhecimento \nprévio sobre a relação entre o sistema imune e a endometriose nos levam a \nsupor que as células iNKT e seus subtipos podem desempenhar um papel \nimportante na patogênese dessa doença. Anormalidades na frequência de \ncélulas iNKT podem prejudicar o bom funcionamento do sistema \n\n Discussão 86 \n \n \n \nimunológico, permitindo a implantação e proliferação de lesões \nendometriose.  \nAs células iNKT também podem ter uma importância no tratamento \nda endometriose. Uma vez que outros estudos demonstraram recentemente \num efeito positivo da imunoterapia pela ativação de células iNKT com \ndiferentes antígenos na doença hepática, doença s autoimunes como AR e \nLES e terapia antitumoral, existe uma possibilidade real no uso desta forma \nde tratamento para outras doenças inflamatórias como endometriose \n(Subleski et al., 2011; Ghinnagow et al., 2017).  \nAs células iNKT têm um papel importante na homeostase \nimunológica e podem ser uma peça essencial no quebra -cabeça desta \ndoença enigmática chamada endometriose. Os resultados do nosso estudo \npodem contribuir para o entendimento da fisiopatologia da endometriose e \npodem auxiliar no desenvolvimento de novos agent es diagnósticos e \nterapêuticos. Mais estudos são necessários para se chegar a conclusões \ndefinitivas a respeito do papel das células iNKT na endometriose. \n \n \n \n\n 87 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6 Conclusões \n \n \n  \n\n Conclusões 88 \n \n \n \n6. CONCLUSÕES \n \n \nEste estudo permitiu as seguintes conclusões:  \nPacientes com endometriose profunda tem a frequência de células \niNKT, iNKT DN e iNKT DN IL17+ diminuída em relação  às pacientes sem \nendometriose. \nA frequência das células iNKT não estão alteradas nas pacientes \ncom endometriose profunda em relação aos sintomas de clínicos da doença. \nA frequência das células iNKT CD4+ CCR7+ encontra -se diminuída \nem pacientes com endometriose profunda e dismenorréia intensa. \nA frequência das células iNKT CD4+ IL17+ encontra -se aumentada \nem pacientes com endometriose profunda e dismeno rréia intensa e \ndiminuída em pacientes com dor pélvica acíclica  intensa em relação àquelas \ncom dor pélvica acíclica leve. \nNão existe diferença nas frequências das células iNKT e os subtipos \nestudados em relação ao estádio da endometriose I/II ou III/IV. \nA fase secretora do ciclo menstrual está associada a menor \nfrequência de células iNKT e iNKT DN IL17+ nas pacientes com \nendometriose profunda.  \nAs células iNKT CD4+ CD25+ e iNKT DN encontram-se com menor \nfrequência na fase proliferativa do ciclo menstrual em  comparação com os \ncontroles.  \n\n Conclusões 89 \n \n \n \nAs células iNKT DN CD25+ estão diminuídas na fase secretora em \ncomparação a fase proliferativa nas pacientes com endometriose profunda. \n \n\n 90 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n7 Anexos \n \n \n  \n\n Anexos 91 \n \n \n \n7. ANEXOS \n \nAnexo 1 -  Parecer consubstanciado do comitê de éti ca e pesquisa com \naprovação do estudo. \n\n\n Anexos 92 \n \n \n \nAnexo 1 (Cont.)  - Parecer consubstanciado do comitê de ética e pesquisa com \naprovação do estudo. \n \n\n\n Anexos 93 \n \n \n \nAnexo 2 - Termo de consentimento livre e esclarecido para pacientes com \nendometriose.  \n \nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n____________________________________________________________________________________ \nI - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL \nLEGAL \n1. NOME:  \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº :                                SEXO   M            F   \nDATA NASCIMENTO:  ./ /.  \nENDEREÇO:      Nº          . APTO: .................. \nBAIRRO:   CIDADE:...................................................................... \nCEP:      \nTELEFONE: DDD (............)...................................................................... \n2. RESPONSÁVEL LEGAL: . \nNATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.):. \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE:               SEXO:  M               F    \nDATA NASCIMENTO:  ./ / \nENDEREÇO:     Nº:………   APTO:…………….  \nBAIRRO:     CIDADE: ……………………………………………... \nCEP:      \nTELEFONE: DDD (………)……………………………………………….. \n_______________________________________________________________________________________ \nII - DADOS SOBRE A PESQUISA \n1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: “AVALIAÇÃO DAS CÉLULAS iNKT EM \nPACIENTES COM ENDOMETRIOSE” \n \nPESQUISADOR: MAURICIO SIMÕES ABRÃO \nCARGO/FUNÇÃO: PROFESSOR DOUTOR - INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº \n.CRM-SP: 52842  \nUNIDADE DO HCFMUSP: DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA \n2. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:  \nRISCO MÍNIMO                              RISCO MÉDIO  \n RISCO BAIXO                              RISCO MAIOR \n3. DURAÇÃO DA PESQUISA: 03 ANOS  \n \nX \n\n Anexos 94 \n \n \n \nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP \n1 – A endometriose é uma doença ginecológica que acontece quando o tecido da parte \ninterna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do abdômen, tais como: \novário, intestino, bexiga e peritôneo. Essa doença pode  causar dores intensas no abdômen, \nprincipalmente cólicas no período menstrual, prejudicando muito a qualidade de vida das \nmulheres portadoras de endometriose.  \n2 - A Senhora está sendo convidada a participar de uma pesquisa que tem como objetivo \nverificar a presença de células que possam ser importantes na endometriose. A análise será \nfeita em uma pequena quantidade de líquido presente no abdome e em uma pequena \nquantidade de sangue. Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação \nvoluntária neste estudo.  \n3 – Neste estudo, não serão realizados procedimentos experimentais. \n4 - Será realizado procedimento rotineiro de coleta de sangue venoso (30 ml) no antebraço \nimediatamente antes do início do ato cirúrgico, esta coleta é igual à coleta de sa ngue para \nexames laboratoriais comuns. A coleta do líquido peritoneal (líquido que se encontra livre no \ninterior do abdome) será realizada no início da cirurgia por meio de aspiração com seringa \nconectada a uma cânula de aspiração. Não há necessidade de pu ncionar ou penetrar com a \ncânula em qualquer órgão ou tecido para coleta do líquido peritoneal. A cirurgia é indicada \npara diagnóstico e tratamento da endometriose.  A cirurgia será realizada por \nvideolaparoscopia (cirurgia realizada por 3 a 4 pequenos orif ícios de 5mm a 10mm de \ndiâmetro) em que será feita uma avaliação minuciosa da cavidade e órgãos pélvicos e \nabdominais e identificação das lesões de endometriose. Caso seja necessário pode haver \nmudança no local e tamanho das incisões por necessidade técnic a da cirurgia. Os dados do \nseu prontuário médico, referentes a esta internação, também serão consultados. \n5 – Não se espera que haja qualquer efeito adverso adicional para a paciente, além do risco \nmínimo da coleta de sangue (pequeno hematoma no local da p unção no antebraço) e dos \nriscos da própria cirurgia, quando também será coletado o fluido peritoneal. A coleta do \nliquido peritoneal não acrescenta risco adicional à realização da cirurgia. \n6 – Não há benefício direto para o participante: Trata-se de estudo testando a hipótese de que \npoderemos identificar células que possivelmente estejam envolvidas na progressão da \nendometriose. Somente, ao final do estudo, poderemos concluir algum benefício para a \npaciente, ou seja, conhecer melhor a doença e posteriorme nte contribuir para a escolha do \nmelhor tratamento. \n7 – Não há procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais a paciente \npossa optar. \n8 – Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis pela \npesquisa para esc larecimentos de eventuais dúvidas. O principal investigador é o Dr. \nFrederico José Silva Corrêa, que pode ser encontrado no endereço (Hospital das Clínicas – \nAv. Dr. Enéas de Carvalho, 255 – Divisão de Clínica Ginecológica, 10° andar, sala 10.166 – \nSão Pau lo/SP, Tel.(11) 2661 -6647. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a \nética da pesquisa, entre em contato com o Comité de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio \n\n Anexos 95 \n \n \n \nPires de Campos, 225 – 5° andar, tel: (11) 2661 -6442, ramais 16, 17, 18 ou 20. FAX: (11)  \n2661-6442 – ramal 26. E-mail: marcia.carvalho@hc.fm.usp.br \n9 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar de \nparticipar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na Instituição. \n10 – As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outras pacientes, não sendo \ndivulgada a identificação de nenhuma paciente. \n11 – A paciente tem o direito de se manter atualizada sobre todos os resultados parciais da \npesquisa. \n12 – Não há despesas pessoais par a o participante em qualquer fase do estudo, incluindo \nexames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada à sua participação.  \n13 – Os dados obtidos e o material coletado serão utilizados somente para o estudo em \nquestão. \nAcredito ter sid o suficientemente informada a respeito das informações que li ou \nque foram lidas para mim, descrevendo o estudo “AVALIAÇÃO DAS CÉLULAS iNKT EM \nPACIENTES COM  ENDOMETRIOSE”. \nFicaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem  \nrealizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos \npermanentes. Ficou claro, também, que minha participação é isenta de despesas e que tenho \ngarantia do acesso ao tratamento hospitalar quando necessário. Concord o, voluntariamente, \nem participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes \nou durante o desenvolvimento deste, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer \nbenefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. \n__________________________________  Data: ____/____/____ \nAssinatura do paciente/representante legal  \n______________________________________ Data: ____/____/____ \nAssinatura da testemunha  \n(para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabet os, semianalfabetos ou portadores de \ndeficiência auditiva ou visual) \n \nDeclaro que obtive, de forma apropriada e voluntária, o Consentimento Livre e Esclarecido \ndesta paciente ou representante legal para a participação neste estudo. \n    \n__________________________________  Data: ____/____/____ \nAssinatura do responsável pelo estudo \nDr. Frederico José Silva Corrêa \n  \n\n Anexos 96 \n \n \n \nAnexo 3 - Termo de consentimento livre e esclarecido para pacientes sem \nendometriose.  \nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n___________________________________________________________________________________ \nI - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL \nLEGAL \n1. NOME:  \n    DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº :                     SEXO    M            F   \n DATA NASCIMENTO:  ./ /.  \n ENDEREÇO:      Nº          . APTO: .................. \n BAIRRO:   CIDADE:...................................................................... \n CEP:      \nTELEFONE: DDD (............)...................................................................... \n2. RESPONSÁVEL LEGAL: . \n NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.):. \n DOCUMENTO DE IDENTIDADE:    SEXO:  M               F    \n DATA NASCIMENTO:  ./ / \n ENDEREÇO:                                                                 Nº:………   APTO:…………….  \n BAIRRO:    CIDADE: …………………………………………………... \n CEP:      \nTELEFONE: DDD (………)……………………………………………….. \n_______________________________________________________________________________________ \nII - DADOS SOBRE A PESQUISA \n1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: “AVALIAÇÃO DAS CÉLULAS iNKT \nEM PACIENTES COM ENDOMETRIOSE” \n \nPESQUISADOR: MAURÍCIO SIMÕES ABRÃO \nCARGO/FUNÇÃO: PROFESSOR DOUTOR  INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº \n.CRM-SP: 52842  \nUNIDADE DO HCFMUSP: DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA \n2. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:  \nRISCO MÍNIMO  RISCO MÉDIO  \n RISCO BAIXO             RISCO MAIOR \n \n3. DURAÇÃO DA PESQUISA: 03 ANOS  \n \n \nX \n\n Anexos 97 \n \n \n \nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP \n1 – A endometriose é uma doença ginecológica que acontece quando o tecido da parte \ninterna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do abdômen, tais como: \novário, intestino, bexiga e peritôneo. Essa doença pode causar dores intensa s no abdômen, \nprincipalmente cólicas no período menstrual, prejudicando muito a qualidade de vida das \nmulheres portadoras de endometriose.  \n2 - A Senhora está sendo convidada a participar de uma pesquisa que tem como objetivo \nverificar a presença de célula s que possam ser importantes na endometriose. A análise será \nfeita em uma pequena quantidade de líquido presente no abdome e em uma pequena \nquantidade de sangue. Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação \nvoluntária neste estudo.  \n3 – Neste estudo, não serão realizados procedimentos experimentais. \n4 - Será realizado procedimento rotineiro de coleta de sangue venoso (30 ml) no antebraço \nimediatamente antes do início do ato cirúrgico, esta coleta é igual à coleta de sangue para \nexames laboratoriais comuns. A coleta do líquido peritoneal (líquido que se encontra livre no \ninterior do abdome) será realizada no início da cirurgia por meio de aspiração com seringa \nconectada a uma cânula de aspiração. Não há necessidade de puncionar ou penetrar c om a \ncânula em qualquer órgão ou tecido para coleta do líquido peritoneal.  A cirurgia é indicada \npara laqueadura tubária bilateral (ligadura das trompas)  A cirurgia será realizada por \nvideolaparoscopia (cirurgia realizada por 3 a 4 pequenos orifícios de 5 mm a 10mm de \ndiâmetro) em que será feita uma avaliação minuciosa da cavidade e órgãos pélvicos e \nabdominais e identificação de possíveis lesões e ligadura das trompas. Caso seja necessário \npode haver mudança no local e tamanho das incisões por necessidade técnica da cirurgia. Os \ndados do seu prontuário médico, referentes a esta internação, também serão consultados. \n5 – Não se espera que haja qualquer efeito adverso adicional para a paciente, além do risco \nmínimo da coleta de sangue (pequeno hematoma no loca l da punção no antebraço) e dos \nriscos da própria cirurgia, quando também será coletado o fluido peritoneal. A coleta do \nliquido peritoneal não acrescenta risco adicional à realização da cirurgia. \n6 – Não há benefício direto para o participante: Trata-se de estudo testando a hipótese de que \npoderemos identificar células que possivelmente estejam envolvidas na progressão da \nendometriose. Somente no final do estudo poderemos concluir algum benefício para a \npaciente, ou seja, conhecer melhor a doença e posteri ormente contribuir para a escolha do \nmelhor tratamento. \n7 – Não há procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais a paciente \npossa optar. \n8 – Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis pela \npesquisa para  esclarecimentos de eventuais dúvidas. O principal investigador é o Dr. \nFrederico José Silva Corrêa, que pode ser encontrado no endereço (Hospital das Clínicas – \nAv. Dr. Enéas de Carvalho, 255 – Divisão de Clínica Ginecológica, 10° andar, sala 10.166 – \nSão Paulo/SP, Tel.(11) 2661 -6647. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a \nética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio \n\n Anexos 98 \n \n \n \nPires de Campos, 225 – 5° andar, tel: (11) 2661 -6442, ramais 16, 17, 18 ou 20. FAX: (11) \n2661-6442 – ramal 26. E-mail: marcia.carvalho@hc.fm.usp.br \n9 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar de \nparticipar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na Instituição. \n10 – As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outras pacientes, não sendo \ndivulgada a identificação de nenhuma paciente. \n11 – A paciente tem o direito de se manter atualizada sobre todos os resultados parciais da \npesquisa. \n12 – Não há despesas pessoais  para o participante em qualquer fase do estudo, incluindo \nexames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada à sua participação.  \n13 – Os dados obtidos e o material coletado serão utilizados somente para o estudo em \nquestão. \nAcredito ter  sido suficientemente informada a respeito das informações que li ou \nque foram lidas para mim, descrevendo o estudo “AVALIAÇÃO DAS CÉLULAS iNKT EM \nPACIENTES COM ENDOMETRIOSE”. \nFicaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a se rem \nrealizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos \npermanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho \ngarantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concord o, voluntariamente, \nem participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes \nou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu \npossa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. \n \n__________________________________  Data: ____/____/____ \nAssinatura do paciente/representante legal  \n \n______________________________________ Data: ____/____/____ \nAssinatura da testemunha  \n(Para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semianalfa betos ou portadores de \ndeficiência auditiva ou visual.) \n \nDeclaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido \ndesta paciente ou representante legal para a participação neste estudo. \n    \n__________________________________  Data: ____/____/____ \nAssinatura do responsável pelo estudo \nDr. Frederico José Silva Corrêa \n\n Anexos 99 \n \n \n \nAnexo 4 - Escala Visual Analógica (EVA) \n \n \n \n \n  \n\n\n Anexos 100 \n \n \n \nAnexo 5 -  Tabela com a d escrição e comparação das médias das \nfrequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico , \nsegundo grupos de pacientes com endometriose profunda infiltrativa e sem \nendometriose e resultado da comparação entre os grupos . Resultados com \nmédia e desvio padrão.  \n \n  Grupo   \nVariável Controle Endometriose p \n  (N = 26) (N = 47)   \niNKT 0,23 ± 0,25 0,17 ± 0,55 0,010 \niNKT CD4+ 32,2 ± 21 37 ± 27,4 0,673 \niNKT CD4+/CCR7 31,6 ± 31 35,6 ± 30,6 0,439 \niNKT CD4+/CD25 25,8 ± 18,5 33,5 ± 23,1 0,168 \niNKT DN 48,2 ± 21,4 34,6 ± 24,5 0,020 \niNKT DN/CCR7 6,76 ± 14,08 11,18 ± 15,87 0,801 \niNKT DN/CD25 33,8 ± 29,8 39,7 ± 31,8 0,416 \niNKT CD4+/IL6 5,55 ± 5,71 1,37 ± 1,94 0,081 \niNKT CD4+/IL10 3,08 ± 2,26 4,36 ± 5,51 0,856 \niNKT CD4+/IL17 13 ± 4 8,7 ± 5,5 0,160 \niNKT CD8+/IL6 6,37 ± 5,8 3,44 ± 4,25 0,196 \niNKT CD8+/IL10 3,81 ± 2,91 4,53 ± 3,88 0,881 \niNKT CD8+/IL17 9,11 ± 4,65 10,99 ± 14,18 0,455 \niNKT DN/IL6 1,99 ± 2,57 0,74 ± 1,12 0,127 \niNKT DN/IL10 0,35 ± 0,39 0,44 ± 0,88 0,356 \niNKT DN/IL17 11,5 ± 5 7,8 ± 4,2 0,050 \nTeste Mann-Whitney \n \n  \n\n Anexos 101 \n \n \n \nAnexo 6 -  Tabela com a descrição e comparação das médias d as \nfrequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintoma de dismenorréia \nde intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e desvio padrão. \n \n  Dismenorréia   \nVariável < 7 ≥ 7 p \n  (N = 17) (N = 30)   \niNKT 0,08 ± 0,1 0,23 ± 0,69 0,538 \niNKT CD4+ 38,4 ± 23,6 36,1 ± 29,8 0,613 \niNKT CD4+/CCR7 51 ± 21,7 26,9 ± 31,8 0,022 \niNKT CD4+/CD25 31,2 ± 21,7 34,9 ± 24,3 0,547 \niNKT DN 27,5 ± 23,7 39,3 ± 24,3 0,098 \niNKT DN/CCR7 12,67 ± 15,57 10,27 ± 16,28 0,330 \niNKT DN/CD25 48,1 ± 28,5 35 ± 33,1 0,193 \niNKT CD4+/IL6 1 ± 1,17 1,61 ± 2,4 >0,999 \niNKT CD4+/IL10 3,21 ± 2,67 5,02 ± 6,76 0,925 \niNKT CD4+/IL17 4,3 ± 4 11,1 ± 4,7 0,038 \niNKT CD8+/IL6 3,87 ± 5,19 3,2 ± 3,97 0,835 \niNKT CD8+/IL10 5,64 ± 4,5 3,91 ± 3,63 0,461 \niNKT CD8+/IL17 14,11 ± 22,78 9,26 ± 7,61 0,593 \niNKT DN/IL6 0,65 ± 0,92 0,77 ± 1,25 0,867 \niNKT DN/IL10 0,2 ± 0,41 0,55 ± 1,03 0,706 \niNKT DN/IL17 5,4 ± 4,2 8,9 ± 4 0,246 \nTeste Mann-Whitney \n \n  \n\n Anexos 102 \n \n \n \nAnexo 7 -  Tabela com a desc rição e comparação das médias das \nfrequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintoma de dor pélvica \nacíclica de intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e desvio \npadrão. \n \n  Dor pélvica aciclica   \nVariável < 7 ≥ 7 p \n  (N = 38) (N = 9)   \niNKT 0,19 ± 0,6 0,08 ± 0,09 0,593 \niNKT CD4+ 36,8 ± 27,1 38,2 ± 31,7 0,958 \niNKT CD4+/CCR7 34,4 ± 30,1 42,2 ± 35,1 0,635 \niNKT CD4+/CD25 32,4 ± 23,4 39,5 ± 22,9 0,493 \niNKT DN 34,4 ± 25,1 36,2 ± 22,4 0,851 \niNKT DN/CCR7 11,81 ± 16,94 8,07 ± 9,01 >0,999 \niNKT DN/CD25 39,7 ± 31,8 39,9 ± 34,8 0,894 \niNKT CD4+/IL6 0,74 ± 1,02 3,89 ± 3,25 0,267 \niNKT CD4+/IL10 4,8 ± 6,5 3,18 ± 1,13 0,921 \niNKT CD4+/IL17 7 ± 5,2 13,1 ± 3,9 0,048 \niNKT CD8+/IL6 3,72 ± 4,83 2,73 ± 2,76 0,945 \niNKT CD8+/IL10 5,2 ± 4,24 2,84 ± 2,44 0,454 \niNKT CD8+/IL17 13,27 ± 16,36 5,31 ± 2,92 0,539 \niNKT DN/IL6 0,93 ± 1,3 0,31 ± 0,35 0,710 \niNKT DN/IL10 0,34 ± 0,77 0,67 ± 1,18 0,503 \niNKT DN/IL17 8,3 ± 5 6,7 ± 1,3 0,503 \nTeste Mann-Whitney \n \n \n \n  \n\n Anexos 103 \n \n \n \nAnexo 8 -  Tabela com a descrição e comparação das médias das \nfrequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintoma de dispareunia \nde intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e desvio padrão. \n \n  Dispareunia   \nVariável < 7 ≥ 7 p \n  (N = 37) (N = 10)   \niNKT 0,21 ± 0,61 0,05 ± 0,07 0,111 \niNKT CD4+ 38 ± 27,2 32,7 ± 29,5 0,582 \niNKT CD4+/CCR7 39,2 ± 31,4 21,7 ± 23,7 0,209 \niNKT CD4+/CD25 33,5 ± 23,7 33,5 ± 22,2 0,960 \niNKT DN 34,4 ± 25,1 35,7 ± 23,4 0,702 \niNKT DN/CCR7 13,4 ± 17,09 3,05 ± 5,22 0,092 \niNKT DN/CD25 42,4 ± 32,2 29,1 ± 29,7 0,311 \niNKT CD4+/IL6 1,32 ± 2,05 1,79 ± 0 0,800 \niNKT CD4+/IL10 4,71 ± 6,1 2,8 ± 0,16 0,909 \niNKT CD4+/IL17 8,1 ± 5 11 ± 9,2 0,582 \niNKT CD8+/IL6 3,25 ± 4,26 3,92 ± 4,86 >0,999 \niNKT CD8+/IL10 5 ± 4,25 3,34 ± 2,93 0,454 \niNKT CD8+/IL17 11,05 ± 16,09 10,86 ± 9,76 0,635 \niNKT DN/IL6 0,96 ± 1,2 0 ± 0 0,161 \niNKT DN/IL10 0,33 ± 0,73 0,81 ± 1,41 0,811 \niNKT DN/IL17 7,6 ± 4,3 8,6 ± 4,6 0,811 \nTeste Mann-Whitney \n \n \n  \n\n Anexos 104 \n \n \n \nAnexo 9  - Tabela com a descrição e comparação das médias das \nfrequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sintoma de alteração \nintestinal cíclica de intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e \ndesvio padrão. \n \n  Alteração intestinal cíclica   \nVariável < 7 ≥ 7 p \n  (N = 40) (N = 7)   \niNKT 0,18 ± 0,59 0,11 ± 0,1 0,701 \niNKT CD4+ 34 ± 26,3 55 ± 29 0,081 \niNKT CD4+/CCR7 37,6 ± 31,7 24,7 ± 22,8 0,293 \niNKT CD4+/CD25 34,6 ± 23,5 27,4 ± 21,6 0,363 \niNKT DN 36,9 ± 24,3 20,6 ± 22,4 0,171 \niNKT DN/CCR7 12,36 ± 16,7 4,12 ± 6,5 0,297 \niNKT DN/CD25 41,7 ± 32,2 28,4 ± 29,5 0,370 \niNKT CD4+/IL6 0,59 ± 1,01 3,19 ± 2,6 0,183 \niNKT CD4+/IL10 4,83 ± 6,49 3,11 ± 1,16 >0,999 \niNKT CD4+/IL17 8,6 ± 6,2 8,7 ± 3,7 0,630 \niNKT CD8+/IL6 2,99 ± 4,27 5,09 ± 4,63 0,291 \niNKT CD8+/IL10 5,03 ± 4,17 2,67 ± 2,06 0,555 \niNKT CD8+/IL17 12,83 ± 15,62 4,26 ± 0,65 0,555 \niNKT DN/IL6 0,83 ± 1,26 0,41 ± 0,36 >0,999 \niNKT DN/IL10 0,55 ± 0,98 0,08 ± 0,15 0,937 \niNKT DN/IL17 7,9 ± 4,8 7,3 ± 0,4 0,811 \nTeste Mann-Whitney \n \n  \n\n Anexos 105 \n \n \n \nAnexo 10 -  Tabela com a descrição e comparação das médias das \nfrequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em \npacientes com endometriose profunda infiltrativa e sint oma de alteração \nurinária cíclica de intensidade pela EVA < 7 ou ≥ 7. Resultados em média e \ndesvio padrão. \n \n  Alteração urinária cíclica   \nVariável < 7 ≥ 7 p \n  (N = 46) (N = 1)   \niNKT 0,18 ± 0,55 0,03 ± 0 0,591 \niNKT CD4+ 36,7 ± 27,6 50 ± 0 0,714 \niNKT CD4+/CCR7 34,5 ± 30,2 77,5 ± 0 0,154 \niNKT CD4+/CD25 32,8 ± 23 60 ± 0 0,200 \niNKT DN 34,4 ± 24,7 45 ± 0 0,698 \niNKT DN/CCR7 10,27 ± 14,91 48,6 ± 0 0,143 \niNKT DN/CD25 39,1 ± 32 62,5 ± 0 0,615 \niNKT CD4+/IL6 1,31 ± 2,05 1,89 ± 0 0,600 \niNKT CD4+/IL10 4,42 ± 5,81 3,77 ± 0 0,727 \niNKT CD4+/IL17 9,1 ± 5,5 3,8 ± 0 0,545 \niNKT CD8+/IL6 3,7 ± 4,31 0 ± 0 0,429 \niNKT CD8+/IL10 4,14 ± 3,75 9,52 ± 0 0,286 \niNKT CD8+/IL17 11,11 ± 14,76 9,52 ± 0 0,857 \niNKT DN/IL6 0,61 ± 1,07 2,27 ± 0 0,308 \niNKT DN/IL10 0,29 ± 0,72 2,27 ± 0 0,308 \niNKT DN/IL17 7,3 ± 4 13,6 ± 0 0,462 \nTeste Mann-Whitney \n  \n\n Anexos 106 \n \n \n \nAnexo 11  - Tabela com a descrição e comparação das médias das \nfrequências das células iNKT e subtipos avaliados, no sangue periférico, em \npacientes com endometriose profunda infiltrativa  estádio I/II ou III/IV . \nResultados em média e desvio padrão. \n \n  Estadio   \nVariável I/II III/IV p \n  (N = 11) (N = 33)   \niNKT 0,08 ± 0,1 0,21 ± 0,63 0,574 \niNKT CD4+ 32,2 ± 24,9 38,4 ± 28,3 0,652 \niNKT CD4+/CCR7 39,1 ± 26 34,4 ± 32,4 0,716 \niNKT CD4+/CD25 37,3 ± 15,9 32,2 ± 25,2 0,770 \niNKT DN 41,8 ± 21 32,2 ± 25,4 0,146 \niNKT DN/CCR7 15,7 ± 16,61 9,58 ± 15,56 0,081 \niNKT DN/CD25 44,8 ± 26 37,7 ± 34 0,842 \niNKT CD4+/IL6 0 ± 0 1,52 ± 1,99 0,600 \niNKT CD4+/IL10 6,45 ± 0 4,15 ± 5,76 0,364 \niNKT CD4+/IL17 3,2 ± 0 9,2 ± 5,4 0,364 \niNKT CD8+/IL6 9,09 ± 0 3 ± 4,09 0,429 \niNKT CD8+/IL10 9,09 ± 0 4,17 ± 3,8 0,429 \niNKT CD8+/IL17 54,5 ± 0 7,65 ± 6,93 0,143 \niNKT DN/IL6 \n \n0,74 ± 1,12 \n iNKT DN/IL10 \n \n0,44 ± 0,88 \n iNKT DN/IL17   7,8 ± 4,2   \nTeste Mann-Whitney \n \n  \n\n Anexos 107 \n \n \n \nAnexo 12 - Dados clinicos de 47 pacientes com endometriose profunda \n \n \n \n  \nN° Idade Raça IMC DM DPA DP AIC AUC Infertilidade Estadio Fase ciclo \n1 28 Branca 19,8 6 6 0 4 0 Sim III/IV Secretora \n2 21 Branca 23,2 8 2 6 5 0 Sim III/IV Proliferativa \n3 31 Branca 21,8 5 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora \n4 41 Branca 21,9 3 0 2 0 0 Sim I/II Secretora \n5 41 Branca 19,6 9 0 7 9 0 Não III/IV Proliferativa \n6 34 Parda 22,3 9 4 0 0 0 Sim I/II Secretora \n7 33 Amarela 23,1 5 0 0 0 0 Não tentou III/IV Secretora \n8 31 Branca 18,6 0 0 8 7 0 Sim III/IV Secretora \n9 40 Branca 21,3 9 6 7 5 0 Sim III/IV Secretora \n10 35 Branca 27,5 7 7 0 0 0 Sim III/IV Secretora \n11 27 Branca 19,1 9 8 5 0 0 Não tentou III/IV Proliferativa \n12 49 Branca 19,4 0 0 1 0 0 Não III/IV Proliferativa \n13 36 Branca 24,3 7 0 0 4 0 Não tentou III/IV Proliferativa \n14 36 Branca 21,1 0 0 0 0 0 Não tentou I/II Secretora \n15 34 Branca 18,4 9 0 6 0 0 Não III/IV Secretora \n16 32 Branca 23,8 8 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora \n17 35 Branca 21,9 0 0 0 0 0 Não III/IV Secretora \n18 30 Branca 20,7 9 0 4 0 8 Sim III/IV Proliferativa \n19 30 Branca 19,8 9 6 10 9 0 Não III/IV Proliferativa \n20 38 Branca 17,9 0 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora \n21 47 Branca 22,0 7 8 7 0 0 Não tentou III/IV Secretora \n22 29 Branca 22,1 7 0 5 0 0 Sim III/IV Secretora \n23 39 Branca 20,8 8 5 4 0 4 Sim III/IV Proliferativa \n24 35 Branca 20,6 9 9 9 0 0 Sim III/IV Secretora \n25 30 Branca 22,2 9 0 0 10 0 Não tentou III/IV Proliferativa \n26 35 Branca 24,2 10 7 0 6 5 Não tentou III/IV Secretora \n27 25 Negra 17,7 8 6 7 0 0 Sim I/II Secretora \n28 30 Branca 20,7 8 5 7 0 0 Sim III/IV Proliferativa \n29 37 Branca 23,2 10 0 0 0 0 Não tentou III/IV Proliferativa \n30 43 Branca 25,2 8 0 7 9 0 Sim I/II Secretora \n31 29 Branca 20,3 5 0 0 0 0 Sim I/II Proliferativa \n32 37 Negra 20,2 8 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora \n33 37 Branca 25,1 1 0 0 0 0 Não III/IV Secretora \n34 37 Branca 27,2 10 0 0 3 0 Não tentou I/II Secretora \n35 36 Branca 23,1 9 0 2 0 0 Não tentou III/IV Secretora \n36 27 Branca 25,8 8 0 0 0 0 Não tentou I/II Proliferativa \n37 28 Branca 18,2 4 2 0 0 0 Não tentou I/II Secretora \n38 45 Branca 33,3 5 0 0 0 0 Não III/IV Proliferativa \n39 45 Branca 26,1 5 0 5 0 0 Sim I/II Secretora \n40 27 Branca 22,6 7 10 0 0 0 Não III/IV Secretora \n41 30 Branca 23,9 3 0 2 0 0 Sim I/II Secretora \n42 36 Amarela 22,0 8 7 0 7 0 Não tentou III/IV Secretora \n43 38 Branca 23,2 6 3 0 0 0 Não III/IV Secretora \n44 32 Branca 21,9 0 0 0 0 0 Sim III/IV Secretora \n45 21 Branca 20,9 10 8 0 7 0 Sim III/IV Secretora \n46 37 Branca 32,4 10 10 10 0 0 Sim III/IV Secretora \n47 39 Branca 25,4 8 0 3 0 0 Sim III/IV Proliferativa \n\n Anexos 108 \n \n \n \nAnexo 13  - Dados clinicos de 26 pacientes com endometriose profunda \n \n \n \n \nN° Idade Raça IMC DM DPA DP AIC AUC Infertilidade Fase ciclo \n1 31 Branca 26,1 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n2 34 Negra 20,4 0 0 0 0 0 Não Secretora \n3 39 Parda 24,2 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n4 35 Parda 19,4 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n5 30 Branca 20,7 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n6 25 Parda 24,6 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n7 31 Branca 25,1 0 0 0 0 0 Não Secretora \n8 35 Parda 26,1 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n9 43 Branca 23,0 6 8 8 0 0 Não Secretora \n10 43 Branca 22,3 7 5 0 0 0 Não Secretora \n11 32 Branca 21,5 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n12 36 Branca 26,8 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n13 33 Parda 24,1 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n14 35 Branca 23,6 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n15 38 Parda 28,4 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n16 37 Branca 25,7 0 0 0 0 0 Não Secretora \n17 33 Branca 30,8 0 0 0 0 0 Não Secretora \n18 36 Parda 23,6 0 0 0 0 0 Não Secretora \n19 33 Branca 21,6 0 0 0 0 0 Não Secretora \n21 33 Parda 22,9 4 0 0 0 0 Não Secretora \n22 34 Branca 20,3 0 0 0 0 0 Não Secretora \n23 44 Branca 19,8 4 5 0 5 0 Não Secretora \n24 27 Branca 21,7 10 0 0 0 0 Não Secretora \n25 30 Parda 31,1 0 0 0 0 0 Não Proliferativa \n26 32 Branca 26,4 2 0 0 0 0 Não Proliferativa \n27 39 Branca 25,4 10 10 0 5 0 Não tentou Proliferativa \n\n Anexos 109 \n \n \n \nAnexo 14 – Resultado das frequências das células iNKT e subtipos de 47 pacientes com endometriose profunda. \n \ncontinua  \nN iNKT iNKT \nCD4+ \niNKT \nCD4+/ \nCCR7 \niNKT \nCD4+/ \nCD25 \niNKT DN \niNKT  \nDN/  \nCCR7 \niNKT  \nDN/  \nCD25 \niNKT  \nCD4+ / \nIL6 \niNKT \nCD4+/ \nIL10 \niNKT \nCD4+/ \nIL17 \niNKT  \nCD8+/  \nIL6 \niNKT \nCD8+/ \nIL10 \niNKT  \nCD8+/ \nIL17 \niNKT \n DN/ IL6 \niNKT  \nDN/ IL10 \niNKT  \nDN/ IL17 \n1 0,083 16,2 67,7 0 0 0,00     0 0 8,33 1,96 0 9,8 \n2 0,002 100 0 50 66,7 0,00 100          3 0,000 40,9 41,3 17,63 28 0,00 28,6 0 0 0 0 11,1 0 0 0 0 \n4 0,102 60 55,6 27,5 37,7 6,90 34,5          5 0,039 73 44,6 40,3 1,38 0,00 66,7          6 0,036 16,7 0 0 50 0,00 0          7 0,012 44,4 75 0 0 0,00           8 0,000 53 13,6 0 0 0,00 0 1,79 2,680 4,46 10 5 5 0 0 7,14 \n9 0,049 40 0 0 54,3 0,00 0    0 0 25 0 0 13,8 \n10 0,038 52,9 79,7 70,3 45 23,80 66,7       0 0 7,14 \n11 0,034 67 66,7 50,3 14,9 14,30 85,7          12 0,035 55,1 68,4 54,3 28,6 20,00 80          13 0,031 30,3 55 44,6 22,5 22,20 66,7          14 0,034 71,3 45,4 32,1 5,5 23,50 58,8 0 6,450 3,23 9,09 9,09 54,5    15 0,160 60,3 0 18,2 18,2 0,00 0          16 0,109 10,6 0 0 81,2 44,90 68,1 0 20,000 10 7,14 7,14 0 0 0 8,47 \n17 0,036 81,1 0 16,2 16,2 0,00 0          18 0,033 50 77,5 60 45 48,60 62,5 1,89 3,770 3,77 0 9,52 9,52 2,27 2,27 13,6 \n19 0,190 18,4 0 40,3 40,3 0,00 6,9          20 0,303 12,7 48,6 68,3 69 10,00 68,3 2,22 3,7 9,63 0,274 3,01 2,74 0,649 0,812 4,71 \n21 0,000     0,00   2,91 17,5 0 6,45 9,68 0 2,44 4,88 \n22 0,094 46,6 83,5 57,7 28,4 55,90 54,2          23 0,047 13,3   73,3            24 0,017 0 0 30 60 0,00 0          25 0,159 93,6 0 0 0 0,00 0          \n\n Anexos 110 \n \n \n \nAnexo 14 – Resultado das frequências das células iNKT e subtipos de 47 pacientes com endometriose profunda (conclusão). \n \n \n \n  \nN iNKT iNKT \nCD4+ \niNKT \nCD4+/ \nCCR7 \niNKT \nCD4+/ \nCD25 \niNKT  \nDN \niNKT  \nDN/  \nCCR7 \niNKT  \nDN/  \nCD25 \niNKT  \nCD4+ / \nIL6 \niNKT \nCD4+/ \nIL10 \niNKT \nCD4+/ \nIL17 \niNKT  \nCD8+/  \nIL6 \niNKT \nCD8+/ \nIL10 \niNKT  \nCD8+/ \nIL17 \niNKT  \nDN/  \nIL6 \niNKT  \nDN/  \nIL10 \niNKT  \nDN/  \nIL17 \n26 0,040 76 0 2,38 4,76 0,00 0          27 0,000 0 11,2 53,3 30,6 8,89 53,3          28 0,174 10,1 53,8 55,9 52,3 4,27 55,9          29 0,061 0 0 8,35 16,7 0,00 0 0 0,000 8,57 0 0 13,3 0 0 3,23 \n30 0,017 66,7 50 48,3 46,7 14,30 50          31 0,020 24,3 72,2 42,1 29,7 9,09 54,5          32 0,851 28,2 0 5,56 5,56 0,00 0          33 0,000 0  42,4 28,6 12,50 56,2          34 0,030 14,8 0 31,8 61,5 0,00 0          35 3,610 6,09 0 81,7 81,7 0,00 2,25          36 0,096 29,9 44,8 39 29 11,50 49          37 0,062    76,9 60,00 87,5          38 0,070 17 65,6 47,8 15,6 0,00 80          39 0,349 11,8 49 54,1 66,9 15,40 41,3          40 0,151 8,18 66,7 48,4 56,8 8,00 40          41 0,104 26,9 63,1 44,45 24,8 23,10 64,1          42 0,247 25 39,8 35,5 35,5 10,40 47 6,19 4,420 11,5 4,46 1,91 3,82 0,585 0 7,02 \n43 0,111 44,7 48,7 20,8 20,8 22,20 19,4          44 0,042 55,6   18,5            45        1,59 2,220 10,2 0,795 1,1 3,95 0,642 0,253 7,77 \n46           5,66 1,89 3,77    47        0 1,820 16,4 10,7 7,14 14,3 3,45 0 13,8 \n\n Anexos 111 \n \n \n \nAnexo 15 – Resultado das frequências das células iNKT e subtipos de 26 pacientes sem endometriose profunda \n \n \n \nN iNKT iNKT  \nCD4+ \niNKT \nCD4+/CCR\n7 \niNKT \nCD4+/ \nCD25 \niNKT  \nDN \niNKT  \nDN/  \nCCR7 \niNKT  \nDN/  \nCD25 \niNKT  \nCD4+  \n/IL6 \niNKT \nCD4+/  \nIL10 \niNKT \nCD4+/  \nIL17 \niNKT \nCD8+/ \n IL6 \niNKT \nCD8+/ \n IL10 \niNKT \nCD8+/ \n IL17 \niNKT  \nDN/  \nIL6 \niNKT  \nDN/  \nIL10 \niNKT  \nDN/ \nIL17 \n1 0,558 7,15 40,3 36,1 66,6 3,88 44 14,9 7,460 14,9 16,8 4,8 9,07 7,66 0,806 13,9 \n2 0,580 41,5 39,5 5,87 52,5 1,78 43,7          3 0,024 73,1 60,8 30,4 23,1 6,04 64          4 0,379 68,8 54,5 36,4 31,2 0,03 60          5 0,270 8,38 42,3 5,63 59,1 1,45 43,1 1,85 3,7 14,8 4,52 1,58 4,07 1,28 1,02 8,44 \n6 0,032 36,4 59,6 36 51,7 0,00 55,4 12 0 16 7,89 1,32 5,26 2,08 0 10,4 \n7 0,193 50 60 12 40 0,00 55          8 0,058 31,6 62,2 18,9 55,8 0,00 48          9 0,620 25,2 0 37,1 62,6 0,15 0          10 0,382 69,6 0 41,5 26,7 0,10 0          11 0,098 19,5 0 36 73,4 0,25 0          12 0,053 20,7 0 0 31 0,08 0          13 0,039 43,5 0 0 52,2 0,00 0          14 0,507 11,3 0 58,6 87,5 0,50 0          15 0,100 14,7 40 26 57,4 1,30 46,2          16 0,101 44,4 0 0 38,9 0,01 0 4,83 1,93 16,9 10,2 2,82 9,6 0,608 0,304 14 \n17 0,061 0 0  0 0,02 0          18 0,306 38,2 0 28 54,5 0,02 0          19 0,938 28,6 34 23,2 63,2 1,61 34 1,13 2,71 6,55 1,27 2,53 12 0,477 0,191 8,11 \n20 0,052 0 0 0 0 0,09 0          21 0,303 26,9 57,1 28,5 69,2 0,01 66,7          22 0,034    66,2 34,00 72,3       3,57 0 21,4 \n23 0,013 21,1 92,3 57,7 53,7 45,50 68,2          24  31,7      0 3,01 8,27 0 3,85 6,15 0,258 0,517 5,17 \n25 0,063 62,6 83,1 49,3 31,3 36,60 69 4,17 2,78 13,9 3,92 9,8 17,6 0 0 10,2 \n26 0,066 30,6   58,3 35,70 76,2          \n\n 112 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n8 Referências \n \n \n  \n\n Referências 113 \n \n \n \n8. 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