Expressão qualitativa de genes relacionados à atividade de células tronco em mulheres inférteis com endometriose peritoneal

Stem/progenitor cells may contribute to the patho genesis of endometriosis. The objective of this study was to i dentify and compare expression of genes regulating SPCs function in eutopic endometrium (EuE), normal peritoneum (NP) and peritonea superficial and deep infiltrative end ometriosis (SE/DIE) of women with pelvic endometriosis.

Twenty-four biopsies from EuE, NP, SE and DIE were obtained during laparoscopy from 6 patients. The expression of 84 s tem cell-related genes was performed using a RT-PCR-based analysis.

All genes analyzed were expressed in the EuE, NP, SE and DIE. No difference was shown between SE, DIE and NP. There was no diff erence when the SE and DIE were compared to each other. Compared to EuE, 24, 49 and 49 genes were differentially expressed in the NP, SE, and DIE, respectively. Of these differentially expressed genes 23 were the same. Funcional analisis demonstrated t hat 5 genes were commonly overexpressed (cell cycle regulators; cell communic ation and embryonic cell marker) and 18 underexpressed (growth regulators; neural ce ll markers; self-renewal marker; embryonic cell marker; symmetric and asymmetric ste m cell division; hematopoietic cell markers; cell communication; Wnt pathway; Notc h pathway; mesenchymal cell marker; metabolic marker; chromosome and chromatin modulators).

Stem cell related genes were expressed in the huma n endometrium, peritoneal superficial and deep endometriosis lesio ns and in the normal peritoneum. There was no difference when superficial and deep e ndometriosis were compared to each other. Descriptors: stem cells, endometrium, endometriosis, gene expression. 14 1. INTRODUÇÃO A endometriose é definida pela presença e prolife ração de tecido endometrial glandular ou estromal fora da cavidade uterina (Vin atier et al., 2001; Clement, 2002; Giudice e Kao, 2004). Sua incidência varia conforme a população estudada, sendo relatada em cerca de 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva (Vinatier et al., 2001) e em até 35 a 50% das mulheres inférteis (Kuohung, 2002). É uma doença heterogênea, responsável por sinais e sintomas significativos e de intensidade variável (Olive e Pritts, 2001). Os implantes endometrióticos podem acometer a super fície do peritônio e dos órgãos pélvicos, denominada de endometriose superfi cial, sendo histologicamente definida endometriose profunda quando as lesões inf iltram os tecidos em mais de 5 mm de profundidade (Nisolle e Donnez, 1997; Giudice e Kao, 2004). Diversas teorias foram desenvolvidas para explicar a etiologia da endometriose, no entanto, sua patogênese permanece alvo de extensa i nvestigação (Sampson, 1927; Gruenwald, 1942; Benagiano e Brosens, 1991; Vinatier et al., 2001; Clement, 2002; Donnez et al., 2002; Gazvani e Templeton, 2002; D’ Hooghe et al., 2003; Giudice e Kao, 2004; Sasson e Taylor, 2008). A teoria dos res tos embrionários é considerada a primeira, descrita por Russel em 1899 (Russel, 1899 ), postula que células embrionárias remanescentes na cavidade peritoneal originariam os focos endométrioticos sobre determinados estímulos (Russel, 1899; Benagiano e Brosens, 1991). Esta hipótese poderia explicar a ocorrência freqüente das lesões de endometriose em locais derivados dos ductos de Muller, como o septo retovaginal, por exemplo. Contudo, esta teoria é incapaz de explicar a distribuição anatômica diverg ente da doença e a restrição de sua atividade ao período reprodutivo da mulher (Vinatier et al., 2001) . A teoria da metaplasia celômica foi descrita por Meyer em 1919 e publicada em 1924 (Meyer, 1924). Baseia-se na hipótese de que cé lulas remanescentes do epitélio 15 celômico, presentes no tecido peritoneal e ovariano , originariam os focos endometrióticos após transformação metaplásica (Mey er, 1924; Zheng et al ., 2005). Uma origem embrionária comum, sob a ação de diferen tes estímulos como os hormonais, fatores ambientais, citocinas inflamatór ias, resposta imune, entre outros, desencadeariam o processo metaplásico (Gruenwald, 1 942; Gardner, 1953). Evidências de implantes ectópicos em sítios distantes da cavid ade pélvica como a cavidade torácica (Cassina, 1997), endometriose em homens (Oliker, 19 71; Schrodt, 1980), em mulheres ainda na infância ou pré-púberais (Schifrin, 1973) e em pacientes com ausência congênita dos ductos de Muller (Olive e Henderson, 1987) fortalecem esta hipótese. No entanto, argumenta-se que, se a metaplasia fosse o evento primário na endometriose sua incidência aumentaria com a idade, fenômeno comum e m outras afecções metaplásicas (Vinatier et al., 2001). Enfim, estudos que validem ou excluam esta teoria permanecem hipotéticos (Sasson e Taylor, 2008). A teoria da menstruação retrógrada é ainda a mais aceita. Fundamenta-se na hipótese de que o desenvolvimento dos focos endomet rióticos ocorre devido ao fluxo retrógrado de células endometriais pelas tubas uter inas durante o período menstrual (Sampson, 1927). Entretanto, esta teoria é incapaz de explicar a presença de endometriose em áreas que não apresentam comunicaçã o com a cavidade peritoneal (Vinatier et al., 2001; Sasson e Taylor, 2008). Além disso, células endometriais foram identificadas na cavidade peritoneal de até 90% das mulheres durante o período menstrual (Halme, 1984), sugerindo que o desenvolvi mento da doença seja dependente de outros fatores associados ou predisponentes (Vin atier et al., 2001; Sasson e Taylor, 2008). Entre as outras hipóteses destacam-se, a mig ração linfovascular das células endometrióticas (Halban, 1925), predisposição genét ica (Simpson et al ., 1980), disfunções imunológicas e inflamatórias (Dmowski et al ., 2001; Starzinski-Powitz, 16 2001; D’ Hooghe et al., 2003; Pogdaec et al ., 2007), estresse oxidativo (Murphy et al ., 1998), polimorfismos genéticos (Treolar, 2002; Temp fer et al., 2008; Wieser et al. , 2003; D’Amora et al., 2009), resistência à progesterona (Osteen et al ., 2005) e recentemente, o envolvimento de células tronco endo metriais (Gargett, 2004, 2006, 2007; Schwab e Gargett, 2007) ou provenientes da me dula óssea (Taylor, 2004; Du e Taylor, 2007; Mints, 2008; Du e Taylor; 2009). A maior compreensão da biologia funcional das célu las tronco trouxe novas perspectivas no conhecimento da patogênese de diver sas afeções ginecológicas (Du e Taylor, 2009). A atividade de células da camada bas al do endométrio, denominadas células tronco endometriais, foi relacionada à notá vel capacidade regenerativa e proliferativa deste tecido (Gazvani e Templeton, 20 02; D 'Hooghe et al., 2003; Revel, 2009). No entanto, alterações no número, localizaçã o e nas vias de sinalização relacionadas a estas células podem contribuir com o desenvolvimento de doenças associadas a uma proliferação endometrial anormal, incluindo endometriose, adenomiose, hiperplasia e ao câncer de endométrio ( Gargett, 2007; Revel, 2009). As lesões endometrióticas caracterizam-se por sua comp lexidade, apresentando alto potencial proliferativo e, por vezes, capacidade infiltrativa (Gargett, 2007). Desta forma, teorias associando a atividade das células tronco e ndometriais e da medula óssea à patogênese da endometriose foram recentemente propostas (Gargett, 2007; Du e Taylor, 2007, 2009). Genes reguladores do ciclo celular, remodelamento d a cromatina, diferenciação e interação entre as células têm sido implicados na patogênese de diversas doenças e podem ser considerados marcadores da presença de cé lulas tronco (Liu et al ., 2009). Análises pela técnica de microarranjos de DNA, comp arando células endometriais estromais e epiteliais de mulheres com e sem endome triose, demonstraram diferença 17 significante na expressão de diversos genes e de du as importantes vias de sinalização, RAS/RAF/MAPK e PI3K (Matsuzaki et al ., 2005). Sugeriram que alterações nestas vias de sinalização podem contribuir com o crescimento, proliferação, diferenciação, apoptose, adesão e migração celular, relacionados a o início e desenvolvimento dos focos endometrióticos (Matsuzaki et al ., 2005). Igualmente, estudo com microarranjo de DNA comparou o endométrio tópico e ectópico de mulh eres com endometriose, demonstrando superexpressão de genes que codificam proteínas relacionadas às respostas imune e inflamatória, adesão e remodelame nto da matriz extracelular, entre outros, no endométrio ectópico (Eyster et al ., 2007). Além disso, evidenciaram a expressão dos genes CDC2, SOX2 e NCAM-1, funcionalm ente relacionados à regulação do ciclo celular, auto-renovação e adesão celular, respectivamente (Eyster et al. , 2007). Desta forma, a identificação de genes e de vias de sinalização relacionados à atividade das células tronco poderá colaborar para o melhor conhecimento da patogênese da endometriose e quiçá no desenvolvimento de futuras medidas preventivas e terapêuticas. 18 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Células tronco Células tronco são células indiferenciadas, raramen te identificadas em tecidos e órgãos adultos (Laird et al., 2008). Estas células caracterizam-se por suas prop riedades funcionais como capacidade de auto-replicação, habi lidade de diferenciação, clonogenicidade e elevado potencial proliferativo ( Laird et al ., 2008; Morrison, 2008). Define-se auto-replicação a capacidade de uma célul a gerar uma cópia idêntica a si mesma, preservando desta forma a população de célul as tronco nos tecidos (Laird et al ., 2008). Diferenciação é a habilidade de mudança do fenótipo celular de acordo com as funções a serem exercidas pelas células nos diferen tes órgãos e tecidos (Gargett, 2007). Clonogenicidade é uma característica clássica das c élulas tronco, definida como a capacidade de uma única célula formar colônias quan do cultivada em baixas densidades in vitro (Van Os et al., 2004). Em geral, as células tronco são classificadas como células tronco embrionárias e adultas. Células tronco embrionárias são células co mpletamente indiferenciadas, presentes exclusivamente nos embriões, podendo ser classificadas como totipotentes ou pluripotentes, de acordo com seu potencial de difer enciação (Morrison, 2008). As células totipotentes são encontradas nos embriões n as primeiras fases de divisão celular e são podem se diferenciar em todos os tecidos, inc luindo a placenta e os anexos embrionários (Morrison, 2008). As células pluripote ntes estão presentes nos embriões na fase de blastocisto e são capazes de diferenciação em quase todos os tecidos, exceto a placenta e os anexos embrionários (Morrison, 2008). 19 A habilidade de diferenciação das células tronco t orna-se mais restrita de acordo com a evolução do desenvolvimento embrionário (Gargett, 2007) (Figura 1). As células tronco adultas são descritas como subpopulações cel ulares raras, relativamente indiferenciadas, com elevada capacidade proliferati va e habilidades de diferenciação e auto-replicação limitadas ao seu sítio de origem (G argett, 2007; Morrison, 2008; Sasson e Taylor, 2008; Du e Taylor, 2009; Cérvelló et al., 2010). Por um processo conhecido como divisão assimétrica as células tronco adultas originam as células tronco progenitoras, com capacidade de auto-replicação pre servada e com habilidade de diferenciação funcionalmente limitada (Gargett, 200 7). As células tronco adultas apresentam também divisão simétrica, originando as células tronco progenitoras transitórias, funcionalmente intermediárias entre a s células tronco adultas e as células completamente diferenciadas, estas com baixo potenc ial proliferativo e incapazes de auto-replicação (Gargett, 2007; Morrison, 2008). As células tronco adultas são reguladas por um micr oambiente fisiológico denominado nicho (Gargett, 2007; Morrison, 2008). O nicho consiste em um conjunto de células especializadas, responsáveis pela produç ão e liberação de moléculas que regulam a função, proliferação e diferenciação das células tronco (Gargett, 2007; Morrison, 2008). Os nichos das células tronco varia m conforme os diferentes órgãos e tecidos (Gargett, 2007; Morrison, 2008). Comumente, localizam-se na intersecção entre a matriz extracelular e as células diferenciadas (G argett, 2007). Em humanos os nichos foram melhor caracterizados em tecidos de elevada c apacidade proliferativa como o bulbo dos folículos pilosos, criptas intestinais, p eriósteos e sistema nervoso central (Gargett, 2007). Moléculas de adesão como as caderi nas e integrinas foram identificadas como as responsáveis pela interação e integração entre as células tronco, as células do nicho e a matriz extracelular (Garget t, 2007). As células do nicho mantêm 20 o ciclo celular das células tronco em repouso, fase G0 do ciclo celular, produzindo sinais inibitórios ao crescimento e diferenciação c elular, frequentemente envolvendo fator transformador de crescimento β (TGF- β) e proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) (Li e Xie, 2005). Diferentes moléculas sinal izadoras produzidas pelas células do nicho têm sido implicadas na capacidade deste mi croambiente de controlar o destino das células tronco e a necessidade de renovação e r eparação teciduais quando necessárias (Du e Taylor, 2009). Exemplos de molécu las e vias de sinalização provêm de estudos de células germinativas de Drosophillas e aparentemente podem ser extrapoladas para células tronco adultas em humanos (Eckfeldt et al ., 2005), destacando-se a via de sinalização Wnt, B-catenina, BMPs (Eckfeldt et al., 2005; Li e Xie, 2005), vias de sinalização Notch e Hedgehog (G argett, 2007), fator de crescimento derivado de fibroblasto 2 (FGF-2), fator de crescim ento derivado da insulina (IGF) e fator de crescimento derivado do endotélio vascular (VEGF) (Gargett, 2007). A despeito da elevada capacidade regenerativa do endo métrio o nicho das células tronco endometriais ainda não foi elucidado (Du e Taylor, 2009). Estudos in vivo de células tronco hematopoiéticas da medula óssea evidenciaram que estas células apresentam capacidade de diferenc iação em células nervosas (Mezey, 2000) e hepatócitos (Lagasse, 2000). Ademais, célul as tronco mesenquimais da medula óssea diferenciaram-se em osteoblastos (Cheng, 1994 ), cardiomióticos (Pittenger, 2004), células neuronais (Cho, 2005) e pneumócitos (Rojas, 2005). Conjuntamente, estes dados fortalecem a hipótese de que algumas su bpopulações de células tronco adultas apresentam plasticidade, ou seja, não são f uncionalmente limitadas a uma linhagem celular ou tecidual específica (Gargett, 2 007). Esta plasticidade das células tronco pode estar associada à reparação e regeneraç ão tecidual identificada em diversos processos fisiológicos e patológicos (Gargett, 2007). 21 Figura 1 - Células tronco embrionárias e adultas CTE - Células tronco embrionárias CT- Células tronco 22 2.2. Células tronco endometriais O endométrio é um dos tecidos mais dinâmicos do cor po humano, apresentando regeneração e diferenciação celular durante cada ci clo menstrual, no pós-parto, após ressecções cirúrgicas, e em mulheres menopausadas e m uso de terapia hormonal (Gargett, 2007). O conceito de que células tronco m esenquimais e epiteliais remanescentes do período embrionário e localizadas na camada basal do endométrio seriam responsáveis por sua intensa atividade regen erativa foi proposto anos atrás (Prianishnikov, 1978; Padykula, 1991). Sob estímulo s hormonais as células tronco endometriais migrariam da camada basal do endométrio originando células progenitoras mais diferenciadas e comprometidas com linhagens ce lulares especificas como células epiteliais, estromais e vasculares (Prianishnikov, 1978; Padykula, 1991). Subpopulações de células tronco endometriais foram identificadas pela primeira vez no endométrio humano em 2004 (Chan et al., 2004). Chan e colaboradores (2004) demonstraram que tanto as células endometriais epit eliais como as estromais apresentavam clonogenicidade (Chan et al., 2004). Observou-se formação de colônias em 22% das células epiteliais e 1,25% das células e stromais em cultura de células obtidas durante histerectomia (Chan et al., 2004). Duas colônias celulares foram identificadas, uma mais rara, com 0,09% de células epiteliais e 0,02% de células estromais, maior densidade, potencial proliferativo e elevada razão núcleo/citoplasma e uma segunda colônia mais freqüente, apresentando me nor densidade, razão núcleo/citoplasma reduzido e potencial proliferativ o limitado (Chan et al., 2004). Sugeriu-se que a colônia de alta densidade originav a-se das células tronco endometrias progenitoras e a de menor densidade das células tro nco transitórias (Chan et al., 2004). Ademais, três fatores de crescimento foram identifi cados e relacionados à 23 clonogenicidade das células epitelias e estromais, sendo eles, fator de crescimento derivado das plaquetas-BB (PDGF-BB), fator transfor mador de crescimento-α (TGF-α) e fator de crescimento da epiderme (EGF) (Chan et al., 2004). As células epiteliais e estromais exibiram maior capacidade clonogênica nas fases proliferativa e secretória do ciclo menstrual, respectivamente, sugerindo a exist ência de uma regulação hormonal (Chan et al., 2004). Entretanto, outro estudo demonstrou que a c lonogenicidade das células tronco endometrias independe da fase do cic lo menstrual e da atividade cíclica do endométrio (Schwab et al., 2005). Estes autores isolaram subpopulações de cél ulas do epitélio e do estroma do endométrio de mulheres sem ciclos menstruais, fortalecendo o conceito de que células da camada basal do endomé trio permanecem funcionalmente ativas a despeito de estímulo hormonal (Schwab et al. , 2005). Posteriormente, outros estudos comprovaram clonogenicidade em cultura de c élulas endometriais humanas (Kato et al. , 2007, Dimitrov, 2008, Gargett et al., 2009). Estudos in vivo em camundongos foram realizados com o objetivo de iden tificar os potenciais marcadores destas células bem como de seu nicho celular (Chan e Gargett, 2006; Cervelló et al. , 2007; Szoteck et al. , 2007). Nestes estudos, os núcleos celulares das c élulas uterinas foram marcados através de uma técnica de marcação c om corante (Label Retaining Cells - LRC), a qual consiste na aplicação uterina de pulsos de análogo nucleotídeo 5- bromo-2’-deoxyuridina (BrdU), substância que se inc orpora ao DNA durante a divisão celular, seguida de análise destas células em períodos pré determinados após a aplicação do BrdU (Gargett et al. , 2007; Sasson e Taylor, 2008). Durante os ciclos d e divisão e proliferação celular o BrdU é progressivamente elim inado do DNA, permanecendo retido nas células de menor atividade. Caracteristicamente, as células tronco precursoras são recrutadas à divisão celular somente em situaçõ es de alta atividade proliferativa como dano e reparação tecidual, permanecendo quiesc entes em seu sitio de origem 24 (Gargett, 2007; Gargett et al. , 2007; Sasson e Taylor, 2008). Chan e Gargett (2006) demonstraram que 3% das células epiteliais dos camu ndongos retiveram o BrdU, após 56 dias, e até 6% das células estromais, após um período de 84 dias, evidenciando maior atividade proliferativa do epitélio luminal uterino durante o período puberal e ciclos menstruais dos camundongos (Chan e Gargett, 2006). Outro estudo realizado por Cervelló e colaboradores (2007) demonstrou que 9% de células estromais retiv eram o BrdU até 49 dias, com queda para 1,7% após um perío do de 112 dias, no entanto, neste estudo nenhuma célula epitelial foi identificada, i nclusive após breve análise no vigésimo primeiro dia (Cervelló et al. , 2007). Estes dois estudos identificaram células estromais marcadas pelo BrdU próximas à junção endo metrio-miometrial, compatível com a localização das células da camada basal (Chan e Gargett, 2006; Cervelló et al. , 2007). Um terceiro estudo, realizado por Szotec e c olaboradores (2007), utilizaram aplicações diárias de BrdU por 7 dias consecutivos, evidenciando que somente as células do estroma e miométrio dos camundongos reti veram o BrdU após 96 dias, estando ausente nas células epiteliais mesmo após o período de 33 dias (Szotec et al., 2007). Apesar de maior facilidade e disponibilidade de realização de estudos experimentais em modelos animais, o endométrio dos camundongos difere fisiologicamente do endométrio humano, portanto, a interpretação dos resultados para humanos deve ser realizada com cautela. Células tronco da medula óssea foram propostas como fonte alternativa de células tronco endometriais (Taylor, 2004). Diverso s estudos demonstraram que células circulantes na corrente sanguínea, provenientes da medula óssea, diferenciaram-se em múltiplos tecidos, incluindo osteoblastos (Cheng, 1 994), hepatócitos (Lagasse, 2000), neurônios (Mezey, 2000; Cho, 2005), cardiomiócitos (Pittenger, 2004), pneumócitos (Rojas, 2005), entre outros (Du e Taylor, 2008). Ev idências de células endometriais 25 epiteliais e estromais, derivadas de doadores de medula óssea, foram detectadas por RT- PCR e imunohistoquimica no endométrio de quatro mul heres transplantadas (Taylor, 2004). Este autor sugeriu que células tronco deriv adas da medula óssea dos doadores contribuíram para a regeneração do tecido endometri al destas pacientes (Taylor, 2004). Marcadores leucocitários (CD45) foram utilizados pa ra diferenciar os leucócitos derivados do epitélio endometrial dos doadores e re ceptoras, comprovando que os resultados não tinham relação com invasão leucocitá ria das células dos doadores. Adicionalmente, fusões entre as células derivadas d a medula óssea e as células nativas do endométrio foram excluídas através de um marcado r de DNA, o qual não evidenciou excesso de material no núcleo das células das trans plantadas (Taylor, 2004). Ademais, a extensão do quimerismo variou de 0,2% a 48% e foi p roporcional ao tempo decorrido após transplante e biópsia endometrial (Taylor, 200 4). No entanto, a amostra limitada deste estudo não permite determinar o tempo necessá rio entre o transplante e a repopulação celular uterina. Em outro estudo, a presença de células provenientes da medula óssea de camundongos machos doadores foi detectada no endomé trio de camundongas transplantadas (Du e Taylor, 2007). Apesar de pouco frequentes (< 0,01%), estas células apresentavam capacidade de diferenciação em células epiteliais (Du e Taylor, 2007). Posteriormente, um estudo demonstrou que células en doteliais da medula óssea contribuem para a formação de novos vasos no endomé trio (Mints et al., 2008). Neste estudo, biópsias endometriais de uma paciente trans plantada de medula óssea foram realizadas durante o parto cesáreo de gestação de 3 6 semanas, dois anos após o transplante, e um ano após. Estes autores demonstra ram que, respectivamente, 14% e 10% das células endoteliais do endométrio obtidos d urante o parto cesáreo e em um ano 26 após o parto, respectivamente, eram provenientes de células do doador (Mints et al., 2008). Subpopulações de células tronco multipotentes foram identificadas no tecido endometrial (Schwab e Gargett, 2007; Wolff et al., 2007). Durante quatro semanas, culturas de células estromais do endométrio de mulh eres em idade reprodutiva foram incubadas com fatores indutores de diferenciação ad ipogênicos, osteogênicos e miogênicos (Schwab e Gargett, 2007). Resultados evi denciaram que algumas destas células diferenciaram-se em linhagens de células ad iposas, ósseas, musculares e cartilaginosas (Schwab e Gargett, 2007). Wolff et al. (2007) avaliaram células do endométrio e miométrio uterino, miomas, tubas uteri nas e do ligamento uterossacro, obtidas de mulheres em idade reprodutiva, e que for am cultivadas durante 21 dias em meios de diferenciação condrogênicos, dexametasona e fatores de crescimento (Wolff et al. , 2007). Análise dos resultados demonstrou que some nte as células endometriais apresentavam marcadores de tecido articular cartila ginoso humano, colágeno tipo II e sulfato de glicosaminoglicano, estando ausentes nas demais culturas celulares (Wolff et al. , 2007). Desta maneira, sendo o endométrio humano um tecido de fácil acesso e fonte potencial de células pluripotentes, sua aplicabilid ade pode se tornar uma importante ferramenta na terapêutica médica. Recentemente, estudo coordenado por Simón demonstrou que células periféricas (“Side Population Cells”), também denominadas célul as laterais ou satélites, obtidas do estroma e do epitélio endometrial, apresentavam car acterísticas genotípicas e funcionais relacionadas à atividade de células tronco somática s (Cervelló et al., 2010). Capacidade clonogênica e habilidade de diferenciação em linhag ens celulares adipogênicas e osteogênicas in vitro foram evidenciadas pelas células periféricas (Simón et al ., 2010). 27 O método para identificação das células periféricas fundamenta-se na capacidade destas células de excluir a ligação do c orante lipofílico Hoechst 33342 do DNA (Sales-Pardo et al., 2006; Simón et al., 2010). Esse método foi empregado na identificação células tronco somáticas da pele (Larderet et al., 2006), miométrio (Ono et al., 2007) e polpa dental (Iohara et al., 2008). Além disso, foi anteriormente demonstrado, mas não comprovado in vivo , no tecido endometrial (Kato et al., 2007). Enfim, a despeito dos recentes avanços, os métodos disponíveis para caracterização das células tronco adultas são ainda limitados e ma rcadores celulares específicos das células tronco endometriais ainda não foram identif icados (Cervelló e Simón, 2009; Cervelló et al., 2010). 2.3. Genes relacionados à atividade das células tronco e endometriose Uma cascata de sinais controlados por genes regulad ores podem estar relacionados aos processos de reparação e regeneraç ão tecidual e ao desenvolvimento de diversas doenças ginecológicas, incluindo a endo metriose. A expressão monoclonal de algumas lesões endometrióticas, a invasão de cél ulas E-caderina negativas e N- caderina positivas em algumas lesões de endometrios e profunda, bem como evidências sugerindo que algumas lesões de endometriose podem evoluir para carcinomas de células claras do ovário e endometrióide reforçou a hipótese de que esta doença teria relação com a atividade de células tronco (Jimbo et al., 1997; Van Gorp et al., 2004; Gargett, 2007; Gargett et al., 2007). Além dessas o bservações, a presença de clonogenicidade em cultura de células provenientes de tecido endometriótico foram relatados (Tanaka et al., 2003; Chan e Gargett, 2004). 28 A expressão gênica das lesões endométrioticas em re lação ao endométrio tópico foi avaliada com o objetivo de identificar genes ou mecanismos moleculares potencialmente relacionados à patogênese dessa afec ção (Arimoto et al., 2003; Kao et al., 2003; Matsuzaki et al., 2004; Eyster et al., 2007; Kao et al., 2008; Forte et al., 2009; Ohlsson et al., 2009). Nesse aspecto, o endométrio tópico de mulhe res com endometriose difere do endométrio de mulheres não a cometidas pela doença (Du e Taylor, 2007). Análises pela técnica de microarranjos de DNA demonstraram diferenças significantes na expressão gênica entre o endométrio tópico e ectópico de mulheres com endometriose (Wu et al., 2006). Estudo realizado por Matsuzaki e colaboradores (2005), comparou a expressão gênica de células endometriais epiteliais e estromais obtidas por microdissecção a laser de mulheres com e sem endome triose. Identificaram, pela ténica de microarranjo de DNA, superexpressão de diversos genes relacionados a duas importantes vias de sinalização, ou seja, RAS/RAF/M APK e PI3K, nas pacientes com endometriose em relação ao grupo controle (Matsuzak i et al., 2005). A superexpressão de 6 genes (RON, SOS, proteína ETA 14-3-3, uPAR, KS R e PI3K p85) foi validada, posteriormente, por RT-PCR. Os autores sugeriram qu e alterações nestas vias de sinalização, poderiam contribuir com o crescimento, proliferação, diferenciação, apoptose, adesão e migração celular, que se relacio nam com o início e o desenvolvimento dos focos endometrióticos (Matsuzaki et al ., 2005). Além disso, genes reguladores do ciclo celular, incluindo CCNA2, CCNE 1 e CCNE2, mostraram-se superexpressos no endométrio e mulheres com endometriose (Matsuzaki et al., 2005). Estudo com microarranjo de DNA avaliou 53.000 genes comparando o endométrio tópico e o ectópico de pacientes com end ometriose (Eyster et al ., 2007). Demonstro-se que genes que codificam proteínas rela cionadas à resposta imune e inflamatória, adesão e remodelamento da matriz extr acelular, entre outros, estavam 29 superexpressos no endométrio ectópico (Eyster et al ., 2007). Neste estudo verificou-se também a expressão dos genes CDC2, SOX2 e NCAM-1, f uncionalmente relacionados à regulação do ciclo celular, auto-renovação e adesão celular, respectivamente (Eyster et al. , 2007). Estes autores sugeriram que alterações imu nológicas no meio peritoneal poderiam favorecer a sobrevivência das células endo metrióticas na cavidade abdominal (Eyster et al., 2007). Além disso, evidenciaram a expressão dos ge nes CDC2, SOX2 e NCAM-1, funcionalmente relacionados à regulação do ciclo celular, auto-renovação e adesão celular, respectivamente (Eyster et al. , 2007). Além da expressão de diversos genes relacionados à vias de sinalização que poderi am estar associadas à adesão e invasão dos focos endometrióticos (Eyster et al. , 2007). 2.4. Células tronco e endometriose As propriedades funcionais das células tronco podem contribuir com as principais teorias que procuram explicar a patogênese da endometriose (Sasson e Taylor, 2009). Osuga e colaboradores (2000) compararam a concentração do fator de célula tronco no fluido peritoneal de mulheres com e sem endometr iose (Osuga et al., 2000). O fator de células tronco é um ligante da proteína de super fície celular c-kit, expresso durante a embriogênese, agindo como um fator de crescimento e m várias linhagens celulares, incluindo as células hematopoiéticas (Osuga et al., 2000). Evidenciaram que o fluído peritoneal das mulheres com endometriose apresentav a maior concentração do fator de células tronco, comparativamente aos controles. Ess as concentrações achavam-se mais elevadas nas mulheres com doença inicial em relação àquelas com endometriose avançada (Osuga et al. , 2000). Assim, devido às propriedades pleiotrópica s do fator de 30 células tronco sugeriram que o aumento desta citoci na poderia ter papel relevante na patogênese da afecção. Outros autores avaliaram a expressão dos receptore s de estrogênio, das duas isoformas do receptor de progesterona e da aromatase P450 no endométrio e em amostras de endométrio ectópico. Demonstram ser o p adrão de expressão destes receptores na endometriose semelhante à expressão c íclica da camada basal do endométrio, porém diferente da camada funcional. Ad icionalmente, o fluxo menstrual das mulheres com endometriose tinha maior concentra ção de células da camada basal, em comparação ao de mulheres sem doença (Layendecke r et al. , 2002). Embasado nas evidências de que as células tronco residem na cama da basal do endométrio e que mulheres com endometriose apresentam maior fluxo me nstrual retrógrado (Halme, 1984), aventou-se que os implantes endometrióticos poderiam resultar do refluxo de células tronco da camada basal (Layendecker et al. , 2002; Sasson e Taylor, 2008). Hipótese alternativa sugere que células tronco extr a-uterinas estariam relacionadas ao desenvolvimento de endometriose (Du e Taylor, 2007). Estudo experimental foi realizado em modelo de camundongo com o objetivo de avaliar se células tronco da medula óssea poderiam migrar e se alojar nas lesões de endometriose (Du e Taylor, 2007). Transplante de medula óssea de camundongos foi realizado após o desenvolvimento de endometriose experimental na cavidade peritoneal de camundongas histerectomizadas, evidenciando que células tronco da medula óssea dos camundongos incorporaram-se ao endométrio ectópico, além de apr esentarem diferenciação em células epiteliais e estromais em uma freqüência de 0,04% e 0,1%, respectivamente (Du e Taylor, 2007). Portanto, evidências sugerem que a atividade de cél ulas tronco endometriais pode estar relacionada à patogênese da endometriose . Além disso, células tronco extra- 31 uterinas poderiam dirigir-se ao endométrio tópico o u à cavidade peritoneal e também a outros tecidos, proliferando e diferenciando-se em células endometriais funcionais. Células tronco da membrana basal do endométrio pode m refluir pelas tubas uterinas e estabelecer os implantes ectópicos, corroborando co m a teoria da menstruação retrógrada. Igualmente, células tronco da medula ós sea, endometriais ou de outras fontes, poderiam ser relacionadas ao desenvolviment o de metaplasia. Além disso, aquelas originadas dos remanescentes dos ductos de Muller podem proliferar e dar origem aos focos endometrióticos. Por fim, as célul as tronco podem migrar pela circulação sanguínea e linfática e gerar focos ectópicos distantes. Enfim, a participação dessas células na gênese da e ndometriose representa ainda grande desafio e motivo de polêmica. A identificaçã o do nicho e de vias de sinalização das células tronco endometriais, bem como de genes e vias biológicas relacionados à sua função, poderão contribuir para a melhor compre ensão do papel dessas células na fisiologia e no desenvolvimento de doenças do trato reprodutivo. Assim, propusemos a realização deste estudo com o objetivo de avaliar e comparar o padrão de expressão de genes relacionados à atividade de células tronco em lesões de endometriose peritoneal profunda e superficial, no peritônio normal adjacen te e no endométrio tópico em pacientes inférteis com endometriose pélvica. 32 3. OBJETIVO Avaliar e comparar a expressão de genes relacionad os à atividade de células tronco no endométrio tópico, no peritônio normal e em lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda de pacientes inférteis com endometriose pélvica. 33 4. CASUÍSTICA E MÉTODOS 4.1. CASUÍSTICA 4.1.1 Pacientes Neste estudo prospectivo, avaliaram-se quatro amost ras obtidas por biópsias do endométrio tópico, de lesões de endometriose perito neal superficial e profunda e do peritônio normal, perfazendo o total de vinte e qua tro amostras, de uma coorte de seis pacientes após realização do cálculo amostral consi derando intervalo de confiança de 95% e poder da amostra de 0,8. As pacientes estavam incluídas no Programa de Repr odução Assistida do Centro de Reprodução Humana (CRH) Governador Mário Covas da D ivisão de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da U niversidade de São Paulo (HC- FMUSP) ou da Clínica Huntington Medicina Reprodutiva. 4.1.2 Consentimento Todas as pacientes receberam informação pormenoriz ada sobre o estudo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido pós-informado (Anexo 1). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesqu isa do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa da Diretoria Clínica (CAPPesq) do HC-FMUSP (Anexo 2). 34 4.1.3 Critérios de inclusão Foram incluídas no estudo mulheres inférteis, com i dade entre 21 e 39 anos. Apresentavam ciclos menstruais regulares com duração de 23 a 35 dias; índice de massa corpórea (IMC: kg/m 2) entre 18 e 28 e não tinham antecedentes de cirurg ia prévia para endometriose ou uso de hormônios nos três meses que antecederam a cirurgia. Todas tinham suspeita clínica, bem como ultrassom transva ginal com preparo intestinal ou ressonância magnética de pelve, sugestivos de endometriose peritoneal profunda (Abrão et al., 2007; Chamie et al., 2009). 4.1.4 Critérios de exclusão Foram excluídas as pacientes com contra-indicação para gravidez ou cirurgia. 4.2 MÉTODOS 4.2.1 Obtenção das amostras teciduais Laparoscopia e histeroscopia diagnósticas foram rea lizadas no mesmo ato operatório. As biópsias endometriais foram feitas c om o cateter de Pipelle logo após a histeroscopia. Parte do tecido endometrial foi env iada para confirmação histológica e outra foi imediatamente conservada em solução prese rvadora de RNA (RNAlater , RNA Stabilization Reagent, Qiagen). A laparoscopia foi realizada com uma câmera de 0° pela técnica aberta para a passagem de um trocater de 10 mm na cicatriz umbilical. A seguir, três trocateres acessórios foram posicionados. 35 Durante a cirurgia, amostras de lesões suspeitas d e endometriose peritoneal superficial e profunda e de peritônio normal de sít ios distantes dos focos endometrióticos foram removidas. As biópsias de end ometriose peritoneal profunda foram realizadas no ligamento útero-sacro de quatro pacientes e na região retro-vaginal de outras duas. As biópsias de endometriose superfi cial foram feitas na região retrovaginal nas seis pacientes. As de peritônio no rmal, que constituíram o grupo controle, foram removidas a uma distância de pelo m enos 5 cm da borda externa das lesões de endometriose, sob visualização endoscópic a direta, características de tecido peritoneal normal. Todas as biópsias foram efetuada s com tesoura laparoscópica e sem utilização de eletrocautério. Os fragmentos das amostras foram, em parte, conser vados em solução preservadora de RNA, (RNAlater , Stabilization Reagent, Qiagen); outra parte foi u sada para confirmação histológica. Todas as amostras foram estocadas a -80 C o. 4.2.2 Isolamento do RNA O RNA foi isolado usando o reagente Trizol  (Invitrogen, Carlsbad, CA). As amostras de tecidos foram descongeladas e homogenei zadas utilizando homogeneizador (Tissumizer, Tekmar, USA), seguido por centrifugaçã o e lise das células (50-100 mg por 1ml de reagente Trizol ). As amostras homogeneizadas foram incubadas por 5 minutos a 15-30 oC, e em seguida adicionou-se 0,2 ml de clorofórmio por 1ml de Trizol . As amostras foram incubadas a 15-30 oC por 3 minutos e centrifugadas por 15 minutos a 2-8 oC. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e precipitada pela mistura de álcool isopropílico (0,5 ml de álcool is opropílico por 1 ml de Trizol ). As amostras foram incubadas a 15-30 oC por 10 minutos e centrifugadas a 2-8 oC. Os pellets 36 de RNA foram lavados com 75% de etanol (1 ml por 1m l de Trizol ), misturados e centrifugados por 5 minutos a 2-8 oC. Os pellets de RNA foram secos, dissolvidos em água livre de RNAse e armazenados a -80 oC até utilização posterior. 4.2.3 Purificação e validação do RNA A purificação do RNA foi realizada através do RNea sy  Mini Kit (RNeasy  Mini Manual, Qiagen). As amostras foram ajustadas para u m volume de 100 µl em água livre de RNAse, adicionando 350 µl de solução tampão RLT (fornecido pelo fabricante) . As amostras de RNA foram diluídas com 250 µl de etanol (96-100%), transferidas para o dispositivo da coluna RNeasy  mini kit em tubos de 2 ml e centrifugadas por 15 segundos ( ≥ 10,000 rpm). A fase líquida foi descartada e a col una foi tratada com DNase. A seguir, as colunas foram lavadas com 500 µl de solução tampão RPE (fornecido pelo fabricante) e centrifugadas por 15 segundos adicionais ( ≥ 10, 000 rpm). Os sobrenadantes foram descartados e as colunas cen trifugadas por 2 minutos ( ≥ 10, 000 rpm). As colunas foram recolocadas em tubos nov os de 1,5 ml, adicionando-se 50 µl de água livre de Rnase e as amostras homogeneizad as e centrifugadas por 1 minuto (≥10,000 rpm). A quantidade e a qualidade do RNA resultando foram analisadas por espectofotometria e eletroforese em gel utilizando um RNA 6000 Nano LabChip® (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). A qualidad e das amostras de RNA a serem analisadas por PCR foi definida pelos critérios descritos no protocolo do fabricante, RT² Profiler TM PCR Arrays System Versão 3.3 (SABiosciences, Frede rick, MD). Todas as amostras apresentaram razão de absorbância de 260 n m/280 nm, com variação entre 1,8 e 2,1 e exibiram bandas 18S e 28S proeminentes (Figura 2). 37 Figura 2. Exemplo de um eletroesferograma de uma das amostras de RNA avaliadas neste estudo. As pontas agudas e ausência de ombros para o 18S e 28S indicam RNA de alta qualidade 38 4.2.4 Análise da expressão gênica pela técnica de t ranscrição reversa e reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) O kit contido na plataforma gênica de células tron co, The Human Stem Cell RT² Profiler™ PCR Array/RT2 First Strand Kit (SABioscie nces), foi utilizado para a preparação do cDNA de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Em suma, a transcrição reversa foi realizada por m eio da reação em cadeia utilizando o RNA total como padrão para a síntese d o cDNA. A seguir, os produtos resultantes foram diluídos e adicionados à mistura contendo o corante fluorescente SYBR verde. As alíquotas foram distribuídas em uma placa de 96 poços, com cada poço contendo os oligonucleotídeos iniciadores ( primers ) para cada gene (Figura 3). A RT-PCR foi então executada usando uma máquina AB I Prism 7000 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). As condições de ciclagem de RT-PCR foram as seguintes: 40 ciclos de desnaturação a 95 º C por 15 segundos e extensão do primer a 60ºC por 1 minuto. As placas matriz de PCR, contendo um painel de genes preestabelecido, foram empregadas para a normalização dos dados e estimati va do intervalo linear dinâmico do ensaio. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes. A expressão gênica foi calculada usando o método ∆∆ Ct comparando a expressão do RNA mensageiro entre amostras indiferenciadas e diferenciadas (Anexo 3). A ontologia de cada gene foi classificada com base em famílias funcionais e funções biológicas descritas na literatura. Os gene s foram classificados como pertencentes aos seguintes grupos: reguladores do c iclo celular, moduladores do cromossomo e da cromatina, reguladores da divisão c elular simétrica e assimétrica, marcadores de auto-renovação, citocinas e fatores d e crescimento, reguladores da comunicação célula-célula, moléculas de adesão celu lar, marcadores metabólicos, 39 marcadores de células embrionárias, marcadores de c élulas hematopoiéticas, marcadores de células mesenquimais, marcadores de células neurais, vias de sinalização Notch e Wnt (Tabela 1). A análise da expressão gênica foi realizada em col aboração com o Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Urologia e Fisiologia da Universidade de Michigan, USA. Figura 3 – Exemplo de uma placa de 96 poços para realização de Reação em Cadeia da Polimerase C DNA G - Controle de DNA Genômico Controle RT- Controle de Transcrição Reversa Controle PCR- Controle Positivo de Reação em Cadeia da Polimerasa 40 Tabela 1 - Painel de genes relacionados à atividade das células tronco Marcadores Específicos de Células Tronco Reguladores de ciclo celular: APC, AXIN1, CCNA2, CCND1, CCND2, CCNE1, CDC2, CDC42, EP300, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, MYC, NOTCH2, PARD6A, RB1 Moduladores do cromossomo e da cromatina: GCN5L2, HDAC2, MYST1, MYST2, RB1, TERT Reguladores de divisão celular simétrica e assimétr ica: DHH, NOTCH1, NOTCH2, NUMB, PARD6A Marcadores de auto-renovação: HSPA9, MYST1, MYST2, NEUROG2, SOX1, SOX2 Citocinas e fatores de crescimento: BMP1, BMP2, BMP3, CXCL12, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, GDF2, GDF3, IGF1, JAG1 Reguladores da comunicação célula-célula: DHH, DLL1, GJA1, GJB1, GJB2, JAG1 Moléculas de adesão celular: APC, BGLAP, CD4, CD44, CDH1, CDH2, COL9A1, CTNNA1, CXCL12, NCAM1 Marcadores metabólicos: ABCG2, ALDH1A1, ALDH2, FGFR1 Marcadores de Diferenciação de Células Tronco Marcadores de células embrionárias: ACTC1, ASCL2, FOXA2, PDX1 (IPF1), ISL1, KRT15, MSX1, MYOD1, T Marcadores de células hematopoiéticas: CD3D, CD4, CD8A, CD8B, MME Marcadores de células mesenquimais: ACAN (AGC1), ALPI, BGLAP, COL1A1, COL2A1, COL9A1, PPARG Marcadores de células neurais: CD44, NCAM1, OPRS1, S100B, TUBB3 Vias de Sinalização Importantes para a Manutenção de Células Tronco Via de Sinalização Notch: DLL1, DLL3, DTX1, DTX2, DVL1, EP300, GCN5L2, HDAC2 , JAG1, NOTCH1, NOTCH2, NUMB Via de Sinalização Wnt: ADAR, APC, AXIN1, BTRC, CCND1, FRAT1, FZD1, MYC, PPARD, WNT1 Fonte: SABiosciences 41 5. ANÁLISE ESTATÍSTICA A análise estatística foi realizada através do sof tware Limma (Linear Models for Microarray Data), versão 2.7.0. As diferenças de ex pressão gênica foram avaliadas pelo teste estatístico t de Student, valores de p e valo res de p-ajustado. As razões de expressão foram calculadas para normalizar os valor es de limiares de ciclo ( ∆Ct) (Anexo 3). Valores de p-ajustado menores que 0,05 f oram considerados significantes (Tan e Yan, 2006). Posteriormente, o programa Ingen uity Systems Analysis versão 7.0 foi utilizado para a avaliação das vias biológicas. A análise estatística foi realizada em coolaboraçã o com o Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Urologia e Fisiologia da Universidade de Michigan, USA. 42 6. RESULTADOS A confirmação diagnóstica das lesões suspeitas de endometriose foi baseada em achados histológicos consistentes. De acordo com os critérios clássicos de Noyes (Noyes et al., 1950), a datação das biópsias de endométrio demons traram 5 pacientes na fase proliferativa e 1 paciente na fase secretória inicial do ciclo menstrual. As pacientes foram classificadas como estágios III e IV de endom etriose pelos critérios da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM). Nenhuma d elas apresentava endometrioma ovariano (Tabela 2). Todos os genes avaliados foram expressos nas amost ras teciduais de Et, PN, EPS e EPP. Quando as lesões de EPS e EPP foram comparadas ao PN não se observaram diferenças significantes. Da mesma forma, não houve diferenças quando as lesões de endometriose superficial e profunda (EPS/EPP) foram comparadas entre si. Ao contrário, verificou-se que 24, 49 e 45 genes foram diferencialmente expressos quando compararam-se as amostras de PN e as lesões de endo metriose superficial (EPS) e profunda (EPP) ao Et, respectivamente (Tabela 3). Em relação às amostras de Et, número significativa mente menor de genes mostraram-se superexpressos (baseado na razão de ex pressão) no PN e nas lesões de endometriose superficial e profunda (EPS/EPP) em co mparação ao número de genes subexpressos (Figura 4A). Dos genes superexpressos, 5 deles manifestaram-se em todas as amostras (PN, EPS e EPP), comparativamente ao Et; 1 gene mostrava-se superexpresso nas amostras de PN e EPP e, 3 outros estavam superexpressos exclusivam ente nas lesões de EPP (Figura 4B). 43 Quanto aos genes subexpressos, 18 estavam subexpre ssos em todas as amostras (PN, EPS e EPP) em relação ao Et; 16 exclusivamente nas lesões endometrióticas (EPS/EPP); 10 somente nas lesões de EPS e 2 genes e xclusivamente subexpressos nas lesões de EPP (Figura 4C). Nenhum gene apresentou-se super ou subexpresso exc lusivamente no PN quando comparado ao endométrio tópico (Figura 4). A análise funcional dos 23 genes diferencialmente expressos em todas as amostras (PN, EPS e EPP), em comparação ao Et, evid enciou 5 genes superexpressos: reguladores do ciclo celular - CDC2, CCNA2, CCNE1; comunicação célula-célula - CJB1; marcador de células embrionárias - FOXA2, enq uanto 18 genes achavam-se subexpressos: fatores de crescimento - BMP3, CXL12, FGFR1; marcadores de células neurais - S100B, NCAM1; marcador de auto-renovação - SOX2; marcador de células embrionárias - ISL1; divisão celular simétrica e as simétrica - DHH, NOTCH2; marcadores de células hematopoiéticas - CD8A, CD3D; comunicação célula-célula - JAG1; Via Wnt - PPARG; Via Notch - NOTCH2, DTX2; ma rcador de células mesenquimais - ACAN; marcador metabólico - ALDH2; m oduladores cromossômico e cromatina - MYST1, GCN5L2 (Tabela 4). 44 Tabela 2- Características clínicas das pacientes Paciente (n°) Idade (anos) Fase do Ciclo Menstrual Grau de Endometriose (ASRM) Endometrioma 1 28 FP III Não 2 34 FP III Não 3 39 FSI IV Não 4 39 FP III Não 5 38 FP IV Não 6 37 FP III Não FP: fase proliferativa ESP: fase secretória inicial ASRM: Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva 45 Tabela 3- Expressão de genes relacionados à atividade das células tronco no peritônio normal, endometriose peritoneal superficial e endometriose peritoneal profunda comparada à do endométrio tópico Total de genes p ajustado <0,05 Peritônio normal vs. Endométrio tópico 24 Endometriose peritoneal superficial vs. Endométrio tópico 49 Endometriose peritoneal profunda vs. Endométrio tópico 45 46 Figura 4 - Número de genes diferencialmente expressos (A); genes superexpressos (B) e genes subexpressos (C) no peritônio normal, endometriose peritoneal superficial e endometriose peritoneal profunda comparados ao endométrio tópico PN: peritônio normal EPS: endometriose peritoneal superficial EPP: endometriose peritoneal profunda 47 Tabela 4 - Genes subexpressos e superexpressos no peritônio normal [1], endometriose peritoneal superficial [2] e endometriose peritoneal profunda [3] comparados ao endométrio tópico Grupo Funcional Gene Descrição Razão de Expressão Citocinas e fatores de crescimento BMP3 CXCL12 FGFR1 JAG1 Proteína morfogenética óssea 3 Fator derivado do estroma 1 Receptor do fator de crescimento de fibroblasto 1 Jagged 1 - 120.5(1) - 27.7 (2) - 48.2 (3) - 7.0 (1) - 7.9 (2) - 5.2 (3) - 3.2 (1) - 3.7 (2) - 3.3 (3) - 2.5 (1) - 5.7 (2) - 3.7 (3) Marcadores de células neuronais S100B NCAM1 Proteína ligadora de cálcio S100B Molécula de adesão neural 1 - 51.7 (1) - 36.6 (2) - 31.3 (3) - 5.7 (1) - 9.9 (2) - 8.3 (3) Regulação da comunicacao célula-célula DHH JAG1 GJB1 Homólogo desert hedgehog Jagged 1 Proteína tipo junção Gap, beta 1, 32kDa - 5.0 (1) - 7.0 (2) - 6.9 (3) - 2.5 (1) - 5.7 (2) - 3.7 (3) 8.2 (1) 3.9 (2) 8.5 (3) 48 Marcadores de células hematopoiéticas CD8A CD3D Molécula CD8a Molécula CD3d, delta (Complexo CD3-TCR) - 4.0 (1) - 6.4 (2) - 3.3 (3) - 2.9 (1) - 3.9 (2) - 2.0 (3) Moduladores do cromossomo e da cromatina GCN5L2 MYST1 Controle da sintese de aminoacidos GCN5 tipo 2 Histona acetil transfarase MYST 1 - 2.5 (1) - 3.5 (2) - 3.3 (3) - 1.9 (1) - 2.4 (2) - 2.2 (3) Via de sinalização Notch NOTCH2 DTX2 Homólogo 2 Notch Homólogo 2 Deltex - 1.8 (1) - 2.3 (2) - 2.0 (3) - 2.0 (1) - 3.7 (2) - 2.7 (3) Marcador de auto-renovação SOX2 Região sexual determinante Y - 14.4 (1) - 15.0 (2) - 15.6 (3) Marcadores de células embrionárias ISL1 FOXA2 Proteína Isl-1 do realçador do gene ISL1 Proteína forkhead Box A2 - 15.7 (1) - 14.2 (2) - 14.7 (3) 5.2 (1) 16.6 (2) 17.5 (3) Via de sinalização Wnt PPARG Receptor gama ativador de proliferação de peroxisomo - 6.9 (1) - 5.5 (2) - 4.8 (3) Marcadores de células mesenquimais ACAN Aggrecan - 3.3 (1) - 4.8 (2) - 5.5 (3) 49 Marcadores metabólicos ALDH2 Família aldeído desidrogenase 2 - 2.7 (1) - 5.0 (2) - 4.3 (3) Divisão celular simétrica e assimétrica NOTCH2 Homólogo 2 Notch - 1.8 (1) - 2.3 (2) - 2.0 (3) Reguladores do ciclo cellular CDC2 CCNA2 CCNE1 Divisão do ciclo celular, G1 para S e G2 para M Ciclina A2 Ciclina E1 3.9 (1) 8.3 (2) 7.7 (3) 2.8 (1) 4.3(2) 4.7(3) 3.0 (1) 3.3 (2) 2.4 (3) 50 7. DISCUSSÃO Nosso estudo mostrou que os genes relacionados à at ividade das células tronco estão expressos no endométrio humano, nas lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda, bem como no peritônio norma l. Como a endometriose é uma doença de expressão heterogênea, na dependência de sua localização e extensão (Nisolle e Donnez, 1997; Clement, 2002), incluímos pacientes com doença extensa, uma vez que estas teriam maior probabilidade de apresentar as d iferentes manifestações das lesões endometrióticas, favorecendo a interpretação da exp ressão gênica nos diversos sítios anatômicos de um mesmo indivíduo. Nenhuma paciente incluída havia sido submetida a procedimentos cirúrgicos prévios, o que favorece a interpretação da expressão gênica sem a interferência de elementos celulares relacion ados ao processo de cicatrização. Além disso, uma vez que a patogênese dos endometrio mas ovarianos permanece controversa, sendo considerada uma doença distinta da endometriose peritoneal por alguns autores (Nisolle e Donnez, 1997), pacientes com endometrioma foram excluídas. As lesões de endometriose apresentam constituição h istológica complexa, caracterizada por células endometriais epiteliais e estromais, intensa fibrose, elementos vasculares e células imunológicas (Nisolle e Donnez , 1997; Vinatier et al. , 2001; Clement, 2002; Giudice e Kao, 2004; Eyster et al., 2007). De acordo com a teoria de que todos estes elementos celulares, em conjunto, p articipam na patogênese da endometriose, optamos por não dissecar as várias cé lulas que constituem a lesão endometriótica e sim realizar a análise tecidual. D esta forma, as expressões gênicas demonstradas nas amostras de endométrio tópico, per itônio normal e das lesões de endometriose superficial e profunda representariam a contribuição destas diversas linhagens celulares. Estatisticamente, ao compararm os os resultados das expressões dos 51 genes relacionados à atividade das células tronco n as diferentes lesões de uma mesma paciente, minimizaríamos a contribuição de cada ele mento celular. Além disso, a realização de análise qualitativa da expressão gêni ca, em detrimento de análise quantitativa, reduziria ainda mais a possível contr ibuição isolada dos elementos celulares nas lesões endometrióticas. Os dados obtidos demonstraram haver maior expressã o de genes e vias de sinalização relacionados à atividade de células tro nco nas lesões endometrióticas e no endométrio tópico em relação à expressão no peritôn io normal, sendo que a razão de superexpressão foi mais significante nas amostras de endométrio normal. Entre os genes e vias de sinalização expressos, destacam-se os rel acionados à atividade de auto- renovação, proliferação, adesão e comunição celular , além de citocinas e fatores de crescimento relacionados à resposta inflamatória. E sses achados são condizentes com a rápida proliferação e regeneração tecidual inerente tanto às lesões endometrióticas quanto ao endométrio tópico. Igualmente, estudos an teriores demonstraram clonogenicidade em cultura de células provenientes de lesões endometrióticas (Tanaka et al., 2003; Chan e Gargett, 2004) e do endométrio tópico (Chan e Gargett, 2004). Além disso, células tronco epiteliais e mesenquimai s já foram isoladas no endométrio humano (Chan e Gargett, 2004; Revel, 2009). A Tabela 4 desvela os genes que se mostraram super e subexpressos, com as respectivas razões de expressão, nas amostras de pe ritônio normal e de endometriose peritoneal superficial e profunda em relação ao endométrio. Quando comparamos com o endométrio tópico, observamos que 24, 49 e 45 genes estavam diferencialmente expressos no peritônio normal e na endometriose sup erficial e profunda, respectivamente. Destes genes, 23 eram comuns. A citocina e fator de crescimento BMP3 apresentou maior razão de 52 superexpressão no endométrio tópico do que no PN, E PS e EPP. As BMPs, isto é, proteínas ósseas morfogenéticas, constituem uma fam ília de proteínas reguladoras da formação óssea e cartilaginosa in vivo (Alper, 1994). Possuem capacidade de acelerar ou iniciar o processo de reparação tecidual, além d e estimularem a neoformação óssea quando implantadas em sítios extra ósseos (Alper, 1 994). Demonstrou-se que membros da família das BMPs foram encontrados no nicho de células tronco adult as, produzindo sinalização inibidora para o crescimento e diferenc iação celular (Li e Xie, 2005; Gargett, 2007). Interações complexas entre as vias Notch , Wnt , BMPs e outras vias biológicas, são fundamentais no processo de embriog ênese, proliferação e regeneração tecidual (Zamurovic et al ., 2004). Outrossim, dois genes reguladores do cicl o celular, CCNA2 e CCNE1 , funcionalmente relacionados ao atraso, parada e i nício do ciclo de diversas linhagens celulares (Matsuzaki et al ., 2005), estavam superexpressos no PN, EPS e EPP em relação ao Et. Importante função do ni cho é a manutenção das células tronco adultas em estado de quiescência (Li e Xie, 2005). Avaliados em conjunto, estes dados sugerem que os genes BMP3, CCNA2 e CCNE1 poderiam exercer funções específicas como proliferação, regeneração e repara ção, entre outras, no nicho das células tronco localizados no endométrio tópico e ectópico. Os genes NCAM-1 e SOX2 estavam subexpressos nas lesões endometrióticas e no peritônio normal quando comparados ao endométrio tópico. Nesse particular, diferença semelhante na expressão destes genes já h avia sido descrita por Eyster e colaboradores (2007) no endométrio tópico e ectópic o de pacientes com endometriose (Eyster et al., 2007). Outros genes, FOXA2 , CDC2 e CCNA2 apresentaram também superexpressão ligeiramente superior nas lesões de endometriose em comparação ao PN, sugerindo haver aumento na sua expressão nos tecidos endometr ióticos. Entretanto, como não 53 houve diferença quando as lesões de endometriose su perficial e profunda foram comparadas, poderíamos inferir que esses genes não estariam relacionados ao mecanismo de invasão da doença. Os genes CDC2 e CCNA2 estão funcionalmente ligados à regulação do ciclo celular e são responsáveis, respectivamente, pela e ntrada das células na fase S e pela mitose através da promoção das transições G1/S e G2 /M do ciclo celular. A expressão do gene CDC2 é regulada pelo ciclo celular e acha-se restrita à s células com atividade proliferativa (Dalton, 1992). A corroborar com nossos resultados, Eyster e colaboradores (2007) já haviam observado, tanto no endométrio tópico como no ectópico de mulheres com endometriose, dados simila res (Eyster et al ., 2007). Além disso, Matsuzaki e colaboradores (2005), ao compara rem a expressão gênica em células endometriais epiteliais e estromais de mulheres com endometriose profunda com a de mulheres sem doença, demonstraram que o gene CCNA2 estava significativamente superexpresso nas células do estroma das pacientes com endometriose (Matsuzaki et al ., 2005). Embora não tenha sido demonstrada diferença estatís tica na expressão gênica entre as lesões de endometriose superficial e profu nda, os genes DTX1 , HPRT1 , e CDH1 estavam superexpressos somente nas lesões de EPP, quando comparado ao Et (Figura 4C). O gene DTX1 participa da via Notch , via de sinalização importante para a manutenção e homeostase das células tronco (Farnie e Clarke, 2007; Van de Walle et al., 2009). Verificou-se que a via Notch é ativada no nicho das células tronco, sendo responsável pela regulação e manutenção da reparaçã o tecidual e pela ativação da proliferação e diferenciação das células-tronco res identes (Gargett, 2007; Gargett et al., 2007). Em nosso estudo, o gene DTX-1 mostrou-se superexpresso nas lesões de EPP, com razão de expressão relativamente superior à raz ão observada nas lesões de EPS. 54 Estudos prévios demonstraram que maior atividade da via Notch leva a aumento da expressão do gene DTX1 e que a via Notch está associada com a capaciedade de invasão de algumas doenças, como câncer de mama, por exempl o (Farnie e Clarke, 2007). Estas observações sugerem que a ativação da via de sinali zação Notch pode também estar associada com a invasividade das lesões endometrióticas. Diferentes funções podem ser relacionadas aos genes superexpressos nas lesões de endometriose, como proliferação, crescimento e f ormação de células musculares, fibroblastos e leucócitos, elementos frequentemente identificados nos implantes endometrióticos (Clement, 2007). Embora sejam relat ivamente inespecíficas, essas funções poderiam também ocorrer no nicho das células tronco. A análise funcional dos 84 genes demonstrou haver o ito vias biológicas associadas os 23 genes comuns que se mostraram dife rencialmente expressos nas amostras de PN, EPS e EPP em relação ao Et. Entre e ssas vias, quatro tiveram maior superexpressão: duas relacionadas com a EPS e o Et (ciclo celular, desordens do sistema músculo esquelético e câncer - escore: 50; morfolog ia celular, desenvolvimento e função do sistema nervoso, proliferação e desenvolv imento celular – escore: 24). Outra relacionada ao PN e ao Et (desenvolvimento celular, desenvolvimento embrionário e doenças genéticas – escore: 42); e uma ligada à EPP e ao Et (ciclo celular, apoptose e desenvolvimento e função do tecido conectivo – escore: 22) (Figura 5). Devido às características funcionais das células tr onco, estas células podem contribuir com as diferentes teorias da endometrios e (Du e Taylor, 2009). De acordo com observações de que mulheres com endometriose ap resentam mais refluxo menstrual quando comparadas com mulheres sem endome triose (Halme, 1984), da existência de células tronco na camada basal do endométrio (Leyendecker et al., 2002) e que o defeito primário na endometriose pode se orig inar no endométrio tópico 55 (Dmowski et al., 2001), especula-se que o refluxo de células tronco a partir da camada basal do endométrio seja a origem dos focos endomet rióticos (Leyendecker et al., 2002; Starzinski-Powitz et al., 2003). Além disso, como a endometriose é uma doenç a crônica, é necessário, geralmente, alguns anos para o desenvolvimento dos focos endometrióticos e sua manifestação clínica. Desta f orma, a semelhança na expressão entre as lesões endometrióticas e o PN, bem como a significante superexpressão no endométrio tópico demonstradas neste estudo, podem retratar a maior ou menor atividade celular relacionada às funções exercidas por esses genes no tecido peritoneal normal e endometriótico secundárias ao fluxo menstrual retrógrado. No entanto, as semelhanças na expressão dos genes r elacionados às células tronco entre o PN, EPS e EPP, assim como as diferen ças compartilhadas entre estes tecidos quando comparados ao Et, sugerem que, em re lação à expressão destes genes, a endometriose seria mais semelhante ao tecido perito neal normal do que ao endométrio. Essas observações são mais consistentes com as hipó teses da metaplasia celômica e dos restos embrionários e podem sugerir que o peritônio das mulheres com endometriose teria expressão gênica anômala, com superexpressão de genes e vias de sinalização relacionados à ativação de células tronco, predispo ndo assim ao desenvolvimento dos focos endometrióticos. Adicionalmente, estes achado s poderiam decorrer de um ambiente peritoneal comum ou de fatores ativadores semelhantes nesses tecidos. A caracterização da expressão gênica de amostras de PN obtidas de mulheres livres da doença representaria importante contribui ção para a análise e validação dos dados demonstrados neste estudo. Entretanto, todas as biópsias de tecido peritoneal normal avaliadas foram realizadas em sítios seguram ente distantes das lesões endometrióticas, com margem de segurança maior que 5 cm, sob visualização endoscópica direta e posterior comprovação histológ ica. Desta forma, nossos achados 56 representam o padrão de expressão gênica do tecido peritoneal normal. Contudo, não podemos excluir a possibilidade de que estas observ ações possam resultar de um ambiente peritoneal comum, de menstruação retrógrad a anterior ou de proliferação linfovascular de células tronco provenientes de fontes alternativas. Enfim, as semelhanças compartilhadas entre o peritô nio normal, a endometriose peritoneal superficial e profunda em relação ao end ométrio, sugerem que, quanto à expressão dos genes avaliados em nosso estudo, o te cido endometriótico teria comportamento mais semelhante ao do tecido peritone al do que ao endométrio tópico. Da mesma forma, essas observações sugerem que o per itônio das mulheres com endometriose poderia apresentar expressão gênica an ômala, com superexpressão de genes e vias de sinalização relacionados à ativação de células tronco, podendo interagir com outros fatores associados à patogênese dessa afecção. 57 Figura 5 - Vias biológicas relacionando o peritônio normal, endometriose peritoneal superficial e endometriose peritoneal profunda ao endométrico tópico PN: peritônio normal EPS: endometriose peritoneal superficial EPP: endometriose peritoneal profunda 58 8. CONCLUSÕES Nosso estudo permite concluir que, em mulheres infé rteis com endometriose peritoneal: - Os 84 genes relacionados à atividade de células t ronco estavam expressos no endométrio tópico, nas lesões de endometriose perit oneal superficial e profunda e no peritônio normal; - A expressão gênica foi mais semelhante no peritôn io normal e nas lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda, comparadas ao endométrio tópico; - Não se observaram diferenças significantes na ex pressão gênica entre as lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda. 59 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Abrão MS, Goncalves MO, Dias JA Jr, Podgaec S, C hamie LP, Blasbalg R. Comparision between clinical examination, transvagi nal sonography and magnetic resonance imaging for the diagnosis of deep endomet riosis. Hum Reprod 2007; 22(12): 3092-7. 2. Alonso L, Fuchs E. Stem cells of the skin epithe lium. Proc Natl Acad Sci Suppl 2003; 1:11830-5. 3. Alper J. 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APTO: .................. BAIRRO: ........................................................................ CIDADE ............................................................. CEP:......................................... TELEFONE: DDD (............) 2. RESPONSÁVEL LEGAL .............................................................................................................................. NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) .................................................................................. DOCUMENTO DE IDENTIDADE :....................................SEXO: M □ F □ DATA NASCIMENTO.: ....../......./...... ENDEREÇO:............................................................................................. Nº................... APTO: ............................. BAIRRO: ................................................................................ CIDADE: ...................................................................... CEP:..............................................TELEFONE: (............).................................................................................. DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA Expressão de genes comuns a linhagens de células tronco em mulheres inférteis com endometriose profunda PESQUISADOR : Paula Beatriz Tavares Fettback CARGO/FUNÇÃO: Médico observador do Centro de Reprodução Humana Governador Mario Covas 71 INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 117477 – SP UNIDADE DO HCFMUSP: Departamento de Obstetrícia e G inecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: RISCO MÍNIMO □ RISCO MÉDIO □ RISCO BAIXO X □ RISCO MAIOR □ 4. DURAÇÃO DA PESQUISA : 12 meses Essas informações estão sendo fornecidas para sua p articipação voluntária neste estudo, o qual o objetivo principal visa avaliar a expressão de genes relacionados às funções de células tronco em pacientes com infertil idade e endometriose profunda, podendo contribuir para o melhor conhecimento das c ausas desta doença e futuramente colaborar com possíveis tratamentos. O estudo será feito com pacientes com indicação pré via de cirurgia por vídeo- laparoscopia. Durante a cirurgia serão retirados pe quenos fragmentos (pedacinhos) de endometriose menores que 1 centímetro, pedacinhos d o tecido normal e da camada dentro do útero. Estes pedacinhos serão conservados para posterior análise da expressão de genes potencialmente envolvidos com função de cé lulas tronco. Não haverá nenhum prejuízo para a senhora devido a retirada desses pequenos fragmentos A senhora fará a cirurgia de vídeo-laparoscopia por técnica comumente utilizada e previamente indicada devido dor e/ou infertilidad e. Esta cirurgia consiste em fazer pequenos cortes na barriga, sendo o primeiro no umb igo com aproximadamente 2-3 centímetros e mais três pequenos cortes de 1-2 cent ímetros abaixo para visualizar a endometriose com uma câmera e realizar a cirurgia c om os instrumentos cirúrgicos próprios da vídeo-laparoscopia. Para a retirada dos fragmentos de endometriose e da camada de dentro do útero serão aplicadas as mesmas técnicas cirúrgicas utilizadas 72 normalmente na prática clínica, não havendo maior risco para a senhora durante ou após o procedimento cirúrgico. Não haverá nenhum desconf orto ou risco adicional para a senhora durante a realização dos procedimentos descritos e da pesquisa já que a cirurgia faz parte do tratamento para dor e/ou infertilidade que a senhora está fazendo. Não há benefício direto para sua participação nest e estudo, pois se trata de estudo experimental testando a possibilidade de que genes relacionados às funções de células tronco estariam envolvidos no desenvolvimen to da endometriose. Somente no final do estudo poderemos concluir a presença de algum benefício. Como alternativa à cirurgia de vídeo-laparoscopia, que tem como objetivo a melhora da dor e da infertilidade, a senhora poderá ser submetida a um procedimento de reprodução assistida, como a fertilização in vitro , não havendo, no entanto, benefícios na melhora da dor. A senhora terá acesso, a qualquer tempo, às inform ações sobre procedimentos, riscos e benefícios relacionados à pesquisa, inclusive para esclarecer eventuais dúvidas. O principal investigador é o Professor Doutor Edmu nd Chada Baracat e a pesquisadora executante é a Dra. Paula Beatriz Tava res Fettback, que podem ser encontrados no Instituto Central do Hospital das Cl ínicas – FMUSP – Avenida Doutor Enéas de Carvalho Aguiar, 255; CEP: 05403-900 São Paulo – SP – Brasil. Telefone: (11) 30696647 Se a senhora tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 – 5º andar. Telefone: (11) 3069-6442 ramais 16, 17, 18 ou 20, FAX: 3069-6442 ramal 26 – E-mail:[email protected] 73 A senhora terá tem liberdade de retirar seu consen timento a qualquer momento e de deixar de participar do estudo, sem que isto traga prejuíz o à continuidade do seu tratamento nesta instituição. Durante todo o estudo a sua confidencialidade, sig ilo e privacidade serão garantidos. As informações obtidas serão analisada s em conjunto com outros pacientes, não sendo divulgado a identificação de nenhum pacie nte. Os dados obtidos por este estudo serão utilizados somente para pesquisa. A senhora terá o direito de ser mantida atualizada sobre os resultados parciais da pesquisa e de resultados que sejam do conhecimento dos pesquisadores. Não haverá despesas pessoais para a senhora em qua lquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação finan ceira relacionada à sua participação. Se existir qualquer despesa adicional , ela será absorvida pelo orçamento da pesquisa. A senhora terá toda assistência no Hospit al das Clínicas (HC-FMUSP) durante a pesquisa. Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou tratamentos propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante tem direito a tratamento médico na Instituição. Eu, Paula Beatriz Tavares Fettback, pesquisadora r esponsável comprometo-me a utilizar os dados coletados somente para a pesquisa. Acredito ter sido suficientemente informado a resp eito das informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo: “Ex pressão de genes comuns a linhagens de células tronco em mulheres inférteis c om endometriose profunda”. Eu discuti com a Dra Paula Beatriz Tavares Fettback sobre a minha decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os 74 procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garan tia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em part icipar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, ant es ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefí cio que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. ------------------------------------------------------ Assinatura do paciente/representante legal Data / / ----------------------------------------------------------- Assinatura da testemunha Data / / (Para casos de pacientes menores de 18 anos, analfa betos, semi-analfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual.) (Somente para o responsável do projeto ) 75 Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo. ------------------------------------------------------ Assinatura do responsável pelo estudo Data / / 76 Anexo 2 – Aprovações 77 78 79 80 81 82 83 Anexo 3 - Cálculo da expressão gênica pelo método delta-delta Ct ( ∆∆ Ct) - Limiar (“Threshold”) O software usa um parâmetro chamado “threshold” (l imiar) para definir o nível de fluorescência de RT-PCR detectável. Baseado no núme ro de ciclos requeridos para cruzar o limiar, o software compara as amostras tes tadas quantitativamente: uma amostra com maior número de cópias inicial cruzará o limiar mais cedo do que uma amostra com um menor número de copias inicial do alvo. Figura 6 - Exemplo de curva de amplificação representativa dos ciclos da Transcrição Reversa e Reação em Cadeia da Polimerase dos genes 84 - Ct (“Cycle Threshold”) O Ct de uma determinada amostra corresponde ao cic lo de PCR em que esta cruzou o limiar (“threshold”). O valor de Ct depend e da quantidade inicial de alvo, e da eficiência de amplificação. O nível de expressão de cada gene foi calculado pelo método de delta-delta Ct ( ∆∆ Ct): • ∆Ct (delta Ct) = Ct gene – Ct gene de controle (housekeeping gene); • Normalizacao dos valores de ∆Ct: Cálculo da média S: Média do ∆Ct (Gráfico 1); • ∆∆ CT (delta-delta CT): ∆CT - média S 85 Gráfico 1 - Gráfico demonstrando a normalização dos valores delta Ct Endométrio tópico Peritônio Normal Endometriose Superficial Endometriose Profunda