{"paper_id":"5d4eedea-1f10-418a-9c0e-c9408bcc1cd1","body_text":"Paula Beatriz Tavares Fettback  \n \n \n \n \n \nExpressão qualitativa de genes relacionados à ativi dade de células tronco em \nmulheres inférteis com endometriose peritoneal  \n \n \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo para obtenção do título d e \nDoutor em Ciências  \n \n \n \n                                                                                  Programa de Ginecologia  \n  Orientador: Dr. Paulo César Serafini \n \n \n \n \n \n \nSão Paulo \n2010 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) \nPreparada pela Biblioteca da \nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo \n \nreprodução autorizada pelo autor  \n   \n                    Fettback, Paula Beatriz Tavares \n     Expressão qualitativa de genes relacionados à atividade de células tronco em \nmulheres inférteis com endometriose peritoneal  /  Paula Beatriz Tavares Fettback.  \n--  São Paulo, 2010. \n \n    Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Unive rsidade de São Paulo. \nPrograma de Ginecologia. \n \n    Orientador: Paulo César Serafini.  \n      \n   \n \nDescritores:  1.Células-tronco  2.Endométrio  3.Endometriose  4.Expressão gênica  \n \n \n  \nUSP/FM/DBD-389/10 \n \n   \n \n \n\n \n \n \nii \nDedicatória  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAo meu pai, Luiz Sérgio Fettback, o maior orgulho que tenho na vida.  \n \nA Edélcio de Paula Filho, todo o meu amor. Por tudo.  \n  \nÀ minha mãe Eneida Tavares de Lima Fettback, uma grande mulher.  \n \nAos meus irmãos Roberta e Olavo Fettback  \ne à minha avó Liliana Tavares de Lima,  \nmesmo distante levo vocês sempre comigo.  \n \nAo meu avô João Tavares de Lima, exemplo de determinação.  \n \n \n\n \n \n \niii \n \nAgradecimentos  \n \n \n \n                                              Ao Doutor Paulo Serafini, mestre e médico extraordinário.  \n Sua paixão pela medicina e pela ciência me torna, a cada dia, uma médica melhor.  \n Obrigada por jamais ter deixado de confiar e investir em mim.  \n \nAo Doutor Ricardo Pereira, cirurgião inigualável e amigo fiel.  \nObrigada pela confiança e respeito de sempre.  \n \nAo Doutor Eduardo Motta, por todos os ensinamentos dos últimos anos.  \nPelas excelentes sugestões nos exames de qualificação.  \nPela honra de trabalharmos juntos.     \n \nAo Professor Edmund Chada Baracat, \nminhas sinceras admiração e gratidão.  \n \nAo Doutor Gary Smith e ao Professor Timothy Johnson,  \npela oportunidade de viver uma fantástica experiência  \nna Universidade de Michigan.  \n \nAo Doutor André Monteiro da Rocha,  \npelo apoio científico e paciência inesgotável.  \n\n \n \n \niv \n \n \nÀ Jun Ding e Craig Johnson pela colaboração técnica e científica durante meu \naprendizado na Universidade de Michigan.   \n \n      Aos meus amigos, colegas de trabalho e de vida,  \nAlysson Zanatta, Claudia Gomes, Thais Domingues, Paulo Bianchi,  \nEdward Carrilho, Eduardo Miyadahira, Mauro Bibancos,  \nMilton Reitzfeld e Jamil Fonseca.  \n                                                                                              Pelo apoio e amizade diários.  \n \nÀ Doutora Maricy Tacla, obrigada pelo incentivo e carinho sincero.  \n \n A Eder Zucconi e Almir Cunico,  \npelo companheirismo e amizade em um momento  \ntão importante da minha vida.  \n \nA todos os colegas, embriologistas, enfermeiras e funcionários  \ndo grupo Huntington. Obrigada por tudo. \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \nv\n \nEpígrafe  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n           “Se, encontrando a desgraça e o triunfo, \n              conseguires tratar da mesma forma a esses dois impostores; \n                          Tu serás um homem, meu filho!” \n \n                       (Rudyard Kipling)  \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \nvi \nSUMÁRIO  \nLISTA DE TABELAS  viii \nLISTA DE FIGURAS ix \nLISTA DE GRÁFICOS  x \nRESUMO xi \nSUMMARY xiii \n1. INTRODUÇÃO 14 \n2. REVISÃO DE LITERATURA 18 \n2.1 . Células tronco  18 \n2.2.  Células tronco endometriais  22 \n2.3. Genes relacionados à atividade das células tronco e endometriose 27 \n2.4. Células tronco e endometriose 29 \n3. OBJETIVO 32 \n4. CASUÍSTICA E MÉTODOS 33 \n4.1. CASUÍSTICA 33 \n4.1.1. Pacientes 33 \n4.1.2. Consentimento 33 \n4.1.3. Critérios de inclusão 34 \n4.1.4. Critérios de exclusão 34 \n4.2. MÉTODOS  34 \n4.2.1 Obtenção das amostras teciduais  34 \n4.2.2 Isolamento do RNA 35 \n4.2.3 Purificação e validação do RNA 36 \n4.2.4 Análise da expressão gênica pela técnica de transcrição reversa e \nreação em cadeia de polimerase (RT-PCR) \n38 \n\n \n \n \nvii \n5. ANÁLISE ESTATÍSTICA 41 \n6. RESULTADOS 42 \n7. DISCUSSÃO 50 \n8. CONCLUSÕES 58 \n9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 59 \n10. ANEXOS 70 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \nviii \nLISTA DE TABELAS   \nTabela 1 Painel de genes relacionados à atividade d as células \ntronco  \n \n40 \nTabela 2 \n \nCaracterísticas clínicas das pacientes 44 \nTabela 3 \n \nExpressão de genes relacionados à atividade das \ncélulas tronco no peritônio normal, endometriose \nperitoneal superficial e endometriose peritoneal \nprofunda comparados ao endométrio tópico \n \n45 \nTabela 4 \n \nGenes subexpressos e superexpressos no peritônio \nnormal [1],  endometriose peritoneal superficial [2] e \nendometriose peritoneal profunda [3] comparados ao \nendométrio tópico  \n \n47 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \nix \nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1 Células tronco embrionárias e adultas \n \n21 \nFigura 2 \n \nExemplo de um eletroesferograma de uma das \namostras de RNA avaliadas neste estudo. As pontas \nagudas e ausência de ombros para o 18S e 28S \nindicam RNA de alta qualidade \n \n37 \nFigura 3 \n \n \nExemplo de uma placa de 96 poços para realização de  \nReação em Cadeia da Polimerase  \n39 \nFigura 4 Número de genes diferencialmente expressos  (A); \ngenes superexpressos (B) e genes subexpressos (C) n o \nperitônio normal, endometriose peritoneal superfici al \ne endometriose peritoneal profunda comparados  \nao endométrio tópico \n \n46 \nFigura 5 Vias biológicas relacionando o peritônio n ormal, \nendometriose peritoneal superficial e endometriose \nperitoneal profunda ao endométrico tópico  \n \n57 \nFigura 6 Exemplo de curva de amplificação represent ativa dos \nciclos da Transcrição Reversa e Reação em Cadeia da \nPolimerase dos genes  \n \n \n83 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \nx\nLISTA DE GRÁFICOS  \n \nGráfico 1 Gráfico demonstrando a normalização dos valores \ndelta Ct  \n \n85 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \nxi \nRESUMO  \n \nIntrodução : As células tronco podem contribuir na patogênese da endometriose. Os \nobjetivos deste estudo foram avaliar e comparar a e xpressão de genes relacionados à \natividade das células tronco no endométrio tópico ( Et), peritônio normal (PN) e nos \nimplantes de endometriose peritoneal superficial e profunda (EPS/EPP) de mulheres \ninférteis com endometriose.  \nMétodos:  Vinte e quatro amostras de Et, PN, EPS e EPP foram  obtidas durante \nlaparoscopia de seis pacientes. A expressão de 84 g enes relacionados à atividade de \ncélulas tronco foi avaliada pela técnica de transcr ição reversa e reação em cadeia de \npolimerase (RT-PCR).  \nResultados : Todos os genes foram expressos no Et, PN, EPS e E PP. Não houve \ndiferença entre o PN, EPS e EPP. Não houve diferenç a quando as lesões de EPS e EPP \nforam comparadas entre si. Comparados ao Et, 24, 49  e 45 genes foram \ndiferencialmente expressos no PN, EPS e EPP, respec tivamente. Destes genes \ndiferencialmente expressos 23 eram comuns. A anális e funcional dos 23 genes \nevidenciou 5 genes comumente superexpressos (genes reguladores do ciclo celular; \ncomunicação celular e marcador de células embrionár ias) e 18 subexpressos (fatores de \ncrescimento; marcadores de células neurais; marcado r de auto-renovação; marcador de \ncélulas embrionárias; divisão celular simétrica e a ssimétrica; marcadores de células \nhematopoiéticas; comunicação celular, via de sinali zação Notch; via de sinalização \nWnt; marcador de células mesenquimais; marcador met abólico e moduladores do \ncromossomo e da cromatina).  \nConclusões:  Os genes relacionados à atividade de células tronc o estavam \nexpressos no endométrio tópico, nas lesões de endom etriose peritoneal superficial e \n\n \n \n \nxii \nprofunda e no peritônio normal. A expressão gênica foi mais semelhante no peritônio \nnormal e nas lesões de endometriose peritoneal supe rficial e profunda, comparadas ao \nendométrio tópico. Não se observaram diferenças sig nificantes na expressão gênica \nentre as lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda.  \n \nPalavras-chave: células tronco, endométrio, endometriose, expressão gênica.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \nxiii \nSUMMARY  \n \nIntroduction : Stem/progenitor cells may contribute to the patho genesis of \nendometriosis. The objective of this study was to i dentify and compare expression of \ngenes regulating SPCs function in eutopic endometrium (EuE), normal peritoneum (NP) \nand peritonea superficial and deep infiltrative end ometriosis (SE/DIE) of women with \npelvic endometriosis.  \nMethods:  Twenty-four biopsies from EuE, NP, SE and DIE were  obtained during \nlaparoscopy from 6 patients. The expression of 84 s tem cell-related genes was \nperformed using a RT-PCR-based analysis.  \nResults : All genes analyzed were expressed in the EuE, NP,  SE and DIE. No difference \nwas shown between SE, DIE and NP. There was no diff erence when the SE and DIE \nwere compared to each other. Compared to EuE, 24, 49 and 49 genes were differentially \nexpressed in the NP, SE, and DIE, respectively. Of these differentially expressed genes \n23 were the same. Funcional analisis demonstrated t hat 5 genes were commonly \noverexpressed (cell cycle regulators; cell communic ation and embryonic cell marker) \nand 18 underexpressed (growth regulators; neural ce ll markers; self-renewal marker; \nembryonic cell marker; symmetric and asymmetric ste m cell division; hematopoietic \ncell markers; cell communication; Wnt pathway; Notc h pathway; mesenchymal cell \nmarker; metabolic marker; chromosome and chromatin modulators).  \nConclusions:  Stem cell related genes were expressed in the huma n endometrium, \nperitoneal superficial and deep endometriosis lesio ns and in the normal peritoneum. \nThere was no difference when superficial and deep e ndometriosis were compared to \neach other.  \n \nDescriptors: stem cells, endometrium, endometriosis, gene expression.  \n\n \n \n \n14 \n1. INTRODUÇÃO \n  \n  A endometriose é definida pela presença e prolife ração de tecido endometrial \nglandular ou estromal fora da cavidade uterina (Vin atier et al.,  2001; Clement, 2002; \nGiudice e Kao, 2004). Sua incidência varia conforme  a população estudada, sendo \nrelatada em cerca de 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva (Vinatier et al.,  2001) \ne em até 35 a 50% das mulheres inférteis (Kuohung, 2002). É uma doença heterogênea, \nresponsável por sinais e sintomas significativos e de intensidade variável (Olive e Pritts, \n2001). \n Os implantes endometrióticos podem acometer a super fície do peritônio e dos \nórgãos pélvicos, denominada de endometriose superfi cial, sendo histologicamente \ndefinida endometriose profunda quando as lesões inf iltram os tecidos em mais de 5 mm \nde profundidade (Nisolle e Donnez, 1997; Giudice e Kao, 2004).  \n Diversas teorias foram desenvolvidas para explicar  a etiologia da endometriose, no \nentanto, sua patogênese permanece alvo de extensa i nvestigação (Sampson, 1927; \nGruenwald, 1942; Benagiano  e Brosens, 1991; Vinatier et al.,  2001; Clement, 2002; \nDonnez et al.,  2002; Gazvani e Templeton, 2002; D’ Hooghe et al.,  2003; Giudice e \nKao, 2004; Sasson e Taylor, 2008). A teoria dos res tos embrionários é considerada a \nprimeira, descrita por Russel em 1899 (Russel, 1899 ), postula que células embrionárias \nremanescentes na cavidade peritoneal originariam os  focos endométrioticos sobre \ndeterminados estímulos (Russel, 1899; Benagiano  e Brosens, 1991). Esta hipótese \npoderia explicar a ocorrência freqüente das lesões de endometriose em locais derivados \ndos ductos de Muller, como o septo retovaginal, por  exemplo. Contudo, esta teoria é \nincapaz de explicar a distribuição anatômica diverg ente da doença e a restrição de sua \natividade ao período reprodutivo da mulher (Vinatier et al., 2001) . \n  A teoria da metaplasia celômica foi descrita por Meyer em 1919 e publicada em \n1924 (Meyer, 1924). Baseia-se na hipótese de que cé lulas remanescentes do epitélio \n\n \n \n \n15 \ncelômico, presentes no tecido peritoneal e ovariano , originariam os focos \nendometrióticos após transformação metaplásica (Mey er, 1924; Zheng et al ., 2005). \nUma origem embrionária comum, sob a ação de diferen tes estímulos como os \nhormonais, fatores ambientais, citocinas inflamatór ias, resposta imune, entre outros, \ndesencadeariam o processo metaplásico (Gruenwald, 1 942; Gardner, 1953). Evidências \nde implantes ectópicos em sítios distantes da cavid ade pélvica como a cavidade torácica \n(Cassina, 1997), endometriose em homens (Oliker, 19 71; Schrodt, 1980), em mulheres \nainda na infância ou pré-púberais (Schifrin, 1973) e em pacientes com ausência \ncongênita dos ductos de Muller (Olive e Henderson, 1987) fortalecem esta hipótese. No \nentanto, argumenta-se que, se a metaplasia fosse o evento primário na endometriose sua \nincidência aumentaria com a idade, fenômeno comum e m outras afecções metaplásicas \n(Vinatier et al.,  2001). Enfim, estudos que validem ou excluam esta teoria permanecem \nhipotéticos (Sasson e Taylor, 2008).  \n A teoria da menstruação retrógrada é ainda a mais aceita. Fundamenta-se na \nhipótese de que o desenvolvimento dos focos endomet rióticos ocorre devido ao fluxo \nretrógrado de células endometriais pelas tubas uter inas durante o período menstrual \n(Sampson, 1927). Entretanto, esta teoria é incapaz de explicar a presença de \nendometriose em áreas que não apresentam comunicaçã o com a cavidade peritoneal \n(Vinatier et al.,  2001; Sasson e Taylor, 2008). Além disso, células endometriais foram \nidentificadas na cavidade peritoneal de até 90% das  mulheres durante o período \nmenstrual (Halme, 1984), sugerindo que o desenvolvi mento da doença seja dependente \nde outros fatores associados ou predisponentes (Vin atier et al.,  2001; Sasson e Taylor, \n2008). Entre as outras hipóteses destacam-se, a mig ração linfovascular das células \nendometrióticas (Halban, 1925), predisposição genét ica (Simpson et al ., 1980), \ndisfunções imunológicas e inflamatórias (Dmowski et al ., 2001; Starzinski-Powitz, \n\n \n \n \n16 \n2001; D’ Hooghe et al.,  2003; Pogdaec et al ., 2007), estresse oxidativo (Murphy et al ., \n1998), polimorfismos genéticos (Treolar, 2002; Temp fer et al.,  2008; Wieser et al. , \n2003; D’Amora et al.,  2009), resistência à progesterona (Osteen et al ., 2005) e \nrecentemente, o envolvimento de células tronco endo metriais (Gargett, 2004, 2006, \n2007; Schwab e Gargett, 2007) ou provenientes da me dula óssea (Taylor, 2004; Du e \nTaylor, 2007; Mints, 2008; Du e Taylor; 2009).  \n A maior compreensão da biologia funcional das célu las tronco trouxe novas \nperspectivas no conhecimento da patogênese de diver sas afeções ginecológicas (Du e \nTaylor, 2009). A atividade de células da camada bas al do endométrio, denominadas \ncélulas tronco endometriais, foi relacionada à notá vel capacidade regenerativa e \nproliferativa deste tecido (Gazvani e Templeton, 20 02; D 'Hooghe et al.,  2003; Revel, \n2009). No entanto, alterações no número, localizaçã o e nas vias de sinalização \nrelacionadas a estas células podem contribuir com o  desenvolvimento de doenças \nassociadas a uma proliferação endometrial anormal, incluindo endometriose, \nadenomiose, hiperplasia e ao câncer de endométrio ( Gargett, 2007; Revel, 2009). As \nlesões endometrióticas caracterizam-se por sua comp lexidade, apresentando alto \npotencial proliferativo e, por vezes, capacidade infiltrativa (Gargett, 2007). Desta forma, \nteorias associando a atividade das células tronco e ndometriais e da medula óssea à \npatogênese da endometriose foram recentemente propostas (Gargett, 2007; Du e Taylor, \n2007, 2009).  \nGenes reguladores do ciclo celular, remodelamento d a cromatina, diferenciação \ne interação entre as células têm sido implicados na  patogênese de diversas doenças e \npodem ser considerados marcadores da presença de cé lulas tronco (Liu et al ., 2009). \nAnálises pela técnica de microarranjos de DNA, comp arando células endometriais \nestromais e epiteliais de mulheres com e sem endome triose, demonstraram diferença \n\n \n \n \n17 \nsignificante na expressão de diversos genes e de du as importantes vias de sinalização, \nRAS/RAF/MAPK e PI3K (Matsuzaki et al ., 2005). Sugeriram que alterações nestas vias \nde sinalização podem contribuir com o crescimento, proliferação, diferenciação, \napoptose, adesão e migração celular, relacionados a o início e desenvolvimento dos \nfocos endometrióticos (Matsuzaki et al ., 2005). Igualmente, estudo com microarranjo de \nDNA comparou o endométrio tópico e ectópico de mulh eres com endometriose, \ndemonstrando superexpressão de genes que codificam proteínas relacionadas às \nrespostas imune e inflamatória, adesão e remodelame nto da matriz extracelular, entre \noutros, no endométrio ectópico (Eyster et al ., 2007). Além disso, evidenciaram a \nexpressão dos genes CDC2, SOX2 e NCAM-1, funcionalm ente relacionados à \nregulação do ciclo celular, auto-renovação e adesão  celular, respectivamente (Eyster et \nal. , 2007).  \nDesta forma, a identificação de genes e de vias de sinalização relacionados à \natividade das células tronco poderá colaborar para o melhor conhecimento da \npatogênese da endometriose e quiçá no desenvolvimento de futuras medidas preventivas \ne terapêuticas.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n18 \n2. REVISÃO DE LITERATURA  \n \n2.1. Células tronco  \n    Células tronco são células indiferenciadas, raramen te identificadas em tecidos e \nórgãos adultos (Laird et al.,  2008). Estas células caracterizam-se por suas prop riedades \nfuncionais como capacidade de auto-replicação, habi lidade de diferenciação, \nclonogenicidade e elevado potencial proliferativo ( Laird et al ., 2008; Morrison, 2008).  \nDefine-se auto-replicação a capacidade de uma célul a gerar uma cópia idêntica a si \nmesma, preservando desta forma a população de célul as tronco nos tecidos (Laird et al ., \n2008).   Diferenciação é a habilidade de mudança do  fenótipo celular de acordo com as \nfunções a serem exercidas pelas células nos diferen tes órgãos e tecidos (Gargett, 2007). \nClonogenicidade é uma característica clássica das c élulas tronco, definida como a \ncapacidade de uma única célula formar colônias quan do cultivada em baixas densidades \nin vitro  (Van Os et al.,  2004).  \n Em geral, as células tronco são classificadas como  células tronco embrionárias e \nadultas. Células tronco embrionárias são células co mpletamente indiferenciadas, \npresentes exclusivamente nos embriões, podendo ser classificadas como totipotentes ou \npluripotentes, de acordo com seu potencial de difer enciação (Morrison, 2008). As \ncélulas totipotentes são encontradas nos embriões n as primeiras fases de divisão celular \ne são podem se diferenciar em todos os tecidos, inc luindo a placenta e os anexos \nembrionários (Morrison, 2008). As células pluripote ntes estão presentes nos embriões \nna fase de blastocisto e são capazes de diferenciação em quase todos os tecidos, exceto a \nplacenta e os anexos embrionários (Morrison, 2008).  \n\n \n \n \n19 \n A habilidade de diferenciação das células tronco t orna-se mais restrita de acordo \ncom a evolução do desenvolvimento embrionário (Gargett, 2007) (Figura 1).  As células \ntronco adultas são descritas como subpopulações cel ulares raras, relativamente \nindiferenciadas, com elevada capacidade proliferati va e habilidades de diferenciação e \nauto-replicação limitadas ao seu sítio de origem (G argett, 2007; Morrison, 2008; Sasson \ne Taylor, 2008; Du e Taylor, 2009; Cérvelló et al.,  2010). Por um processo conhecido \ncomo divisão assimétrica as células tronco adultas originam as células tronco \nprogenitoras, com capacidade de auto-replicação pre servada e com habilidade de \ndiferenciação funcionalmente limitada (Gargett, 200 7). As células tronco adultas \napresentam também divisão simétrica, originando as células tronco progenitoras \ntransitórias, funcionalmente intermediárias entre a s células tronco adultas e as células \ncompletamente diferenciadas, estas com baixo potenc ial proliferativo e incapazes de \nauto-replicação (Gargett, 2007; Morrison, 2008).   \nAs células tronco adultas são reguladas por um micr oambiente fisiológico \ndenominado nicho (Gargett, 2007; Morrison, 2008). O  nicho consiste em um conjunto \nde células especializadas, responsáveis pela produç ão e liberação de moléculas que \nregulam a função, proliferação e diferenciação das células tronco (Gargett, 2007; \nMorrison, 2008). Os nichos das células tronco varia m conforme os diferentes órgãos e \ntecidos (Gargett, 2007; Morrison, 2008). Comumente,  localizam-se na intersecção entre \na matriz extracelular e as células diferenciadas (G argett, 2007). Em humanos os nichos \nforam melhor caracterizados em tecidos de elevada c apacidade proliferativa como o \nbulbo dos folículos pilosos, criptas intestinais, p eriósteos e sistema nervoso central \n(Gargett, 2007). Moléculas de adesão como as caderi nas e integrinas foram \nidentificadas como as responsáveis pela interação e  integração entre as células tronco, \nas células do nicho e a matriz extracelular (Garget t, 2007). As células do nicho mantêm \n\n \n \n \n20 \no ciclo celular das células tronco em repouso, fase  G0 do ciclo celular, produzindo \nsinais inibitórios ao crescimento e diferenciação c elular, frequentemente envolvendo \nfator transformador de crescimento β (TGF- β) e proteínas ósseas morfogenéticas \n(BMPs) (Li e Xie, 2005). Diferentes moléculas sinal izadoras produzidas pelas células \ndo nicho têm sido implicadas na capacidade deste mi croambiente de controlar o destino \ndas células tronco e a necessidade de renovação e r eparação teciduais quando \nnecessárias (Du e Taylor, 2009). Exemplos de molécu las e vias de sinalização provêm \nde estudos de células germinativas de Drosophillas e aparentemente podem ser \nextrapoladas para células tronco adultas em humanos  (Eckfeldt et al ., 2005), \ndestacando-se a via de sinalização Wnt, B-catenina,  BMPs (Eckfeldt et al.,  2005; Li e \nXie, 2005), vias de sinalização Notch e Hedgehog (G argett, 2007), fator de crescimento \nderivado de fibroblasto 2 (FGF-2), fator de crescim ento derivado da insulina (IGF) e \nfator de crescimento derivado do endotélio vascular  (VEGF) (Gargett, 2007). A \ndespeito da elevada capacidade regenerativa do endo métrio o nicho das células tronco \nendometriais ainda não foi elucidado (Du e Taylor, 2009).  \nEstudos in vivo  de células tronco hematopoiéticas da medula óssea evidenciaram \nque estas células apresentam capacidade de diferenc iação em células nervosas (Mezey, \n2000) e hepatócitos (Lagasse, 2000). Ademais, célul as tronco mesenquimais da medula \nóssea diferenciaram-se em osteoblastos (Cheng, 1994 ), cardiomióticos (Pittenger, \n2004), células neuronais (Cho, 2005) e pneumócitos (Rojas, 2005). Conjuntamente, \nestes dados fortalecem a hipótese de que algumas su bpopulações de células tronco \nadultas apresentam plasticidade, ou seja, não são f uncionalmente limitadas a uma \nlinhagem celular ou tecidual específica (Gargett, 2 007). Esta plasticidade das células \ntronco pode estar associada à reparação e regeneraç ão tecidual identificada em diversos \nprocessos fisiológicos e patológicos (Gargett, 2007).   \n\n \n \n \n21 \nFigura 1 - Células tronco embrionárias e adultas \n   \n \n \n \nCTE - Células tronco embrionárias  \nCT- Células tronco  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n22 \n2.2. Células tronco endometriais  \n \nO endométrio é um dos tecidos mais dinâmicos do cor po humano, apresentando \nregeneração e diferenciação celular durante cada ci clo menstrual, no pós-parto, após \nressecções cirúrgicas, e em mulheres menopausadas e m uso de terapia hormonal \n(Gargett, 2007). O conceito de que células tronco m esenquimais e epiteliais \nremanescentes do período embrionário e localizadas na camada basal do endométrio \nseriam responsáveis por sua intensa atividade regen erativa foi proposto anos atrás \n(Prianishnikov, 1978; Padykula, 1991). Sob estímulo s hormonais as células tronco \nendometriais migrariam da camada basal do endométrio originando células progenitoras \nmais diferenciadas e comprometidas com linhagens ce lulares especificas como células \nepiteliais, estromais e vasculares (Prianishnikov, 1978; Padykula, 1991).  \nSubpopulações de células tronco endometriais foram identificadas pela primeira \nvez no endométrio humano em 2004 (Chan et al.,  2004). Chan e colaboradores (2004) \ndemonstraram que tanto as células endometriais epit eliais como as estromais \napresentavam clonogenicidade (Chan et al.,  2004). Observou-se formação de colônias \nem 22% das células epiteliais e 1,25% das células e stromais em cultura de células \nobtidas durante histerectomia (Chan et al.,  2004). Duas colônias celulares foram \nidentificadas, uma mais rara, com 0,09% de células epiteliais e 0,02% de células \nestromais, maior densidade, potencial proliferativo  e elevada razão núcleo/citoplasma e \numa segunda colônia mais freqüente, apresentando me nor densidade, razão \nnúcleo/citoplasma reduzido e potencial proliferativ o limitado (Chan et al.,  2004). \nSugeriu-se que a colônia de alta densidade originav a-se das células tronco endometrias \nprogenitoras e a de menor densidade das células tro nco transitórias (Chan et al.,  2004). \nAdemais, três fatores de crescimento foram identifi cados e relacionados à \n\n \n \n \n23 \nclonogenicidade das células epitelias e estromais, sendo eles, fator de crescimento \nderivado das plaquetas-BB (PDGF-BB), fator transfor mador de crescimento-α (TGF-α) \ne fator de crescimento da epiderme (EGF) (Chan et al.,  2004). As células epiteliais e \nestromais exibiram maior capacidade clonogênica nas  fases proliferativa e secretória do \nciclo menstrual, respectivamente, sugerindo a exist ência de uma regulação hormonal \n(Chan et al.,  2004). Entretanto, outro estudo demonstrou que a c lonogenicidade das \ncélulas tronco endometrias independe da fase do cic lo menstrual e da atividade cíclica \ndo endométrio (Schwab et al.,  2005). Estes autores isolaram subpopulações de cél ulas \ndo epitélio e do estroma do endométrio de mulheres sem ciclos menstruais, fortalecendo \no conceito de que células da camada basal do endomé trio permanecem funcionalmente \nativas a despeito de estímulo hormonal (Schwab et al. , 2005). Posteriormente, outros \nestudos comprovaram clonogenicidade em cultura de c élulas endometriais humanas \n(Kato et al. , 2007, Dimitrov, 2008, Gargett et al., 2009).  Estudos in vivo  em \ncamundongos foram realizados com o objetivo de iden tificar os potenciais marcadores \ndestas células bem como de seu nicho celular (Chan e Gargett, 2006; Cervelló et al. , \n2007; Szoteck et al. , 2007). Nestes estudos, os núcleos celulares das c élulas uterinas \nforam marcados através de uma técnica de marcação c om corante (Label Retaining \nCells - LRC), a qual consiste na aplicação uterina de pulsos de análogo nucleotídeo 5-\nbromo-2’-deoxyuridina (BrdU), substância que se inc orpora ao DNA durante a divisão \ncelular, seguida de análise destas células em períodos pré determinados após a aplicação \ndo BrdU (Gargett et al. , 2007; Sasson e Taylor, 2008). Durante os ciclos d e divisão e \nproliferação celular o BrdU é progressivamente elim inado do DNA, permanecendo \nretido nas células de menor atividade. Caracteristicamente, as células tronco precursoras \nsão recrutadas à divisão celular somente em situaçõ es de alta atividade proliferativa \ncomo dano e reparação tecidual, permanecendo quiesc entes em seu sitio de origem \n\n \n \n \n24 \n(Gargett, 2007; Gargett et al. , 2007; Sasson e Taylor, 2008). Chan e Gargett (2006)  \ndemonstraram que 3% das células epiteliais dos camu ndongos retiveram o BrdU, após \n56 dias, e até 6% das células estromais, após um período de 84 dias, evidenciando maior \natividade proliferativa do epitélio luminal uterino  durante o período puberal e ciclos \nmenstruais dos camundongos (Chan e Gargett, 2006). Outro estudo realizado por \nCervelló e colaboradores  (2007) demonstrou que 9% de células estromais retiv eram o \nBrdU até 49 dias, com queda para 1,7% após um perío do de 112 dias, no entanto, neste \nestudo nenhuma célula epitelial foi identificada, i nclusive após breve análise no \nvigésimo primeiro dia (Cervelló et al. , 2007). Estes dois estudos identificaram células \nestromais marcadas pelo BrdU próximas à junção endo metrio-miometrial, compatível \ncom a localização das células da camada basal (Chan  e Gargett, 2006; Cervelló et al. , \n2007). Um terceiro estudo, realizado por Szotec e c olaboradores (2007), utilizaram \naplicações diárias de BrdU por 7 dias consecutivos,  evidenciando que somente as \ncélulas do estroma e miométrio dos camundongos reti veram o BrdU após 96 dias, \nestando ausente nas células epiteliais mesmo após o  período de 33 dias (Szotec et al.,  \n2007). Apesar de maior facilidade e disponibilidade  de realização de estudos \nexperimentais em modelos animais, o endométrio dos camundongos difere \nfisiologicamente do endométrio humano, portanto, a interpretação dos resultados para \nhumanos deve ser realizada com cautela.  \nCélulas tronco da medula óssea foram propostas como  fonte alternativa de \ncélulas tronco endometriais (Taylor, 2004). Diverso s estudos demonstraram que células \ncirculantes na corrente sanguínea, provenientes da medula óssea, diferenciaram-se em \nmúltiplos tecidos, incluindo osteoblastos (Cheng, 1 994), hepatócitos (Lagasse, 2000), \nneurônios (Mezey, 2000; Cho, 2005), cardiomiócitos (Pittenger, 2004), pneumócitos \n(Rojas, 2005), entre outros (Du e Taylor, 2008). Ev idências de células endometriais \n\n \n \n \n25 \nepiteliais e estromais, derivadas de doadores de medula óssea, foram detectadas por RT-\nPCR e imunohistoquimica no endométrio de quatro mul heres transplantadas (Taylor, \n2004).  Este autor sugeriu que células tronco deriv adas da medula óssea dos doadores \ncontribuíram para a regeneração do tecido endometri al destas pacientes (Taylor, 2004). \nMarcadores leucocitários (CD45) foram utilizados pa ra diferenciar os leucócitos \nderivados do epitélio endometrial dos doadores e re ceptoras, comprovando que os \nresultados não tinham relação com invasão leucocitá ria das células dos doadores. \nAdicionalmente, fusões entre as células derivadas d a medula óssea e as células nativas \ndo endométrio foram excluídas através de um marcado r de DNA, o qual não evidenciou \nexcesso de material no núcleo das células das trans plantadas (Taylor, 2004). Ademais, a \nextensão do quimerismo variou de 0,2% a 48% e foi p roporcional ao tempo decorrido \napós transplante e biópsia endometrial (Taylor, 200 4). No entanto, a amostra limitada \ndeste estudo não permite determinar o tempo necessá rio entre o transplante e a \nrepopulação celular uterina.  \nEm outro estudo, a presença de células provenientes  da medula óssea de \ncamundongos machos doadores foi detectada no endomé trio de camundongas \ntransplantadas (Du e Taylor, 2007). Apesar de pouco frequentes (< 0,01%), estas células \napresentavam capacidade de diferenciação em células  epiteliais (Du e Taylor, 2007). \nPosteriormente, um estudo demonstrou que células en doteliais da medula óssea \ncontribuem para a formação de novos vasos no endomé trio (Mints et al.,  2008). Neste \nestudo, biópsias endometriais de uma paciente trans plantada de medula óssea foram \nrealizadas durante o parto cesáreo de gestação de 3 6 semanas, dois anos após o \ntransplante, e um ano após. Estes autores demonstra ram que, respectivamente, 14% e \n10% das células endoteliais do endométrio obtidos d urante o parto cesáreo e em um ano \n\n \n \n \n26 \napós o parto, respectivamente, eram provenientes de  células do doador (Mints et al.,  \n2008).  \nSubpopulações de células tronco multipotentes foram  identificadas no tecido \nendometrial (Schwab e Gargett, 2007; Wolff et al.,  2007). Durante quatro semanas, \nculturas de células estromais do endométrio de mulh eres em idade reprodutiva foram \nincubadas com fatores indutores de diferenciação ad ipogênicos, osteogênicos e \nmiogênicos (Schwab e Gargett, 2007). Resultados evi denciaram que algumas destas \ncélulas diferenciaram-se em linhagens de células ad iposas, ósseas, musculares e \ncartilaginosas (Schwab e Gargett, 2007). Wolff et al.  (2007) avaliaram células do \nendométrio e miométrio uterino, miomas, tubas uteri nas e do ligamento uterossacro, \nobtidas de mulheres em idade reprodutiva, e que for am cultivadas durante 21 dias em \nmeios de diferenciação condrogênicos, dexametasona e fatores de crescimento (Wolff et \nal. , 2007). Análise dos resultados demonstrou que some nte as células endometriais \napresentavam marcadores de tecido articular cartila ginoso humano, colágeno tipo II e \nsulfato de glicosaminoglicano, estando ausentes nas  demais culturas celulares (Wolff et \nal. , 2007). Desta maneira, sendo o endométrio humano um tecido de fácil acesso e fonte \npotencial de células pluripotentes, sua aplicabilid ade pode se tornar uma importante \nferramenta na terapêutica médica.  \nRecentemente, estudo coordenado por Simón demonstrou que células periféricas \n(“Side Population Cells”), também denominadas célul as laterais ou satélites, obtidas do \nestroma e do epitélio endometrial, apresentavam car acterísticas genotípicas e funcionais \nrelacionadas à atividade de células tronco somática s (Cervelló et al.,  2010). Capacidade \nclonogênica e habilidade de diferenciação em linhag ens celulares adipogênicas e \nosteogênicas in vitro  foram evidenciadas pelas células periféricas (Simón et al ., 2010).  \n\n \n \n \n27 \nO método para identificação das células periféricas  fundamenta-se na \ncapacidade destas células de excluir a ligação do c orante lipofílico Hoechst 33342 do \nDNA (Sales-Pardo et al.,  2006; Simón et al.,  2010). Esse método foi empregado na \nidentificação células tronco somáticas da pele (Larderet et al.,  2006), miométrio (Ono et \nal.,  2007) e polpa dental (Iohara et al.,  2008). Além disso, foi anteriormente \ndemonstrado, mas não comprovado in vivo , no tecido endometrial (Kato et al.,  2007).  \n Enfim, a despeito dos recentes avanços, os métodos  disponíveis para caracterização \ndas células tronco adultas são ainda limitados e ma rcadores celulares específicos das \ncélulas tronco endometriais ainda não foram identif icados (Cervelló e Simón, 2009; \nCervelló et al.,  2010).  \n \n \n2.3. Genes relacionados à atividade das células tronco e endometriose  \n \nUma cascata de sinais controlados por genes regulad ores podem estar \nrelacionados aos processos de reparação e regeneraç ão tecidual e ao desenvolvimento \nde diversas doenças ginecológicas, incluindo a endo metriose. A expressão monoclonal \nde algumas lesões endometrióticas, a invasão de cél ulas E-caderina negativas e N-\ncaderina positivas em algumas lesões de endometrios e profunda, bem como evidências \nsugerindo que algumas lesões de endometriose podem evoluir para carcinomas de \ncélulas claras do ovário e endometrióide reforçou a  hipótese de que esta doença teria \nrelação com a atividade de células tronco (Jimbo et  al., 1997; Van Gorp et al., 2004; \nGargett, 2007; Gargett et al., 2007). Além dessas o bservações, a presença de \nclonogenicidade em cultura de células provenientes de tecido endometriótico foram \nrelatados (Tanaka et al., 2003; Chan e Gargett, 2004).  \n\n \n \n \n28 \nA expressão gênica das lesões endométrioticas em re lação ao endométrio tópico \nfoi avaliada com o objetivo de identificar genes ou  mecanismos moleculares \npotencialmente relacionados à patogênese dessa afec ção (Arimoto et al.,  2003; Kao et \nal.,  2003; Matsuzaki et al.,  2004; Eyster et al.,  2007; Kao et al.,  2008; Forte et al.,  2009; \nOhlsson et al.,  2009). Nesse aspecto, o endométrio tópico de mulhe res com \nendometriose difere do endométrio de mulheres não a cometidas pela doença (Du e \nTaylor, 2007). Análises pela técnica de microarranjos de DNA demonstraram diferenças \nsignificantes na expressão gênica entre o endométrio tópico e ectópico de mulheres com \nendometriose (Wu et al.,  2006). Estudo realizado por Matsuzaki e colaboradores (2005), \ncomparou a expressão gênica de células endometriais  epiteliais e estromais obtidas por \nmicrodissecção a laser de mulheres com e sem endome triose. Identificaram, pela ténica \nde microarranjo de DNA, superexpressão de diversos genes relacionados a duas \nimportantes vias de sinalização, ou seja, RAS/RAF/M APK e PI3K, nas pacientes com \nendometriose em relação ao grupo controle (Matsuzak i et al.,  2005). A superexpressão \nde 6 genes (RON, SOS, proteína ETA 14-3-3, uPAR, KS R e PI3K p85)  foi validada, \nposteriormente, por RT-PCR. Os autores sugeriram qu e alterações nestas vias de \nsinalização, poderiam contribuir com o crescimento,  proliferação, diferenciação, \napoptose, adesão e migração celular, que se relacio nam com o início e o \ndesenvolvimento dos focos endometrióticos (Matsuzaki et al ., 2005). Além disso, genes \nreguladores do ciclo celular, incluindo CCNA2, CCNE 1 e CCNE2, mostraram-se \nsuperexpressos no endométrio e mulheres com endometriose (Matsuzaki et al.,  2005).   \nEstudo com microarranjo de DNA avaliou 53.000 genes  comparando o \nendométrio tópico e o ectópico de pacientes com end ometriose (Eyster et al ., 2007).   \nDemonstro-se que genes que codificam proteínas rela cionadas à resposta imune e \ninflamatória, adesão e remodelamento da matriz extr acelular, entre outros, estavam \n\n \n \n \n29 \nsuperexpressos no endométrio ectópico (Eyster et al ., 2007). Neste estudo verificou-se \ntambém a expressão dos genes CDC2, SOX2 e NCAM-1, f uncionalmente relacionados \nà regulação do ciclo celular, auto-renovação e adesão celular, respectivamente (Eyster et \nal. , 2007). Estes autores sugeriram que alterações imu nológicas no meio peritoneal \npoderiam favorecer a sobrevivência das células endo metrióticas na cavidade abdominal \n(Eyster et al.,  2007). Além disso, evidenciaram a expressão dos ge nes CDC2, SOX2 e \nNCAM-1, funcionalmente relacionados à regulação do ciclo celular, auto-renovação e \nadesão celular, respectivamente (Eyster et al. , 2007). Além da expressão de diversos \ngenes relacionados à vias de sinalização que poderi am estar associadas à adesão e \ninvasão dos focos endometrióticos (Eyster et al. , 2007).   \n \n \n2.4. Células tronco e endometriose  \n \n As propriedades funcionais das células tronco podem  contribuir com as principais \nteorias que procuram explicar a patogênese da endometriose (Sasson e Taylor, 2009).  \n Osuga e colaboradores (2000)  compararam a concentração do fator de célula tronco \nno fluido peritoneal de mulheres com e sem endometr iose (Osuga et al.,  2000). O fator \nde células tronco é um ligante da proteína de super fície celular c-kit, expresso durante a \nembriogênese, agindo como um fator de crescimento e m várias linhagens celulares, \nincluindo as células hematopoiéticas (Osuga et al.,  2000). Evidenciaram que o fluído \nperitoneal das mulheres com endometriose apresentav a maior concentração do fator de \ncélulas tronco, comparativamente aos controles. Ess as concentrações achavam-se mais \nelevadas nas mulheres com doença inicial em relação  àquelas com endometriose \navançada (Osuga et al. , 2000). Assim, devido às propriedades pleiotrópica s do fator de \n\n \n \n \n30 \ncélulas tronco sugeriram que o aumento desta citoci na poderia ter papel relevante na \npatogênese da afecção.  \n Outros autores avaliaram a expressão dos receptore s de estrogênio, das duas \nisoformas do receptor  de progesterona e da aromatase P450 no endométrio e  em \namostras de endométrio ectópico. Demonstram ser o p adrão de expressão destes \nreceptores na endometriose semelhante à expressão c íclica da camada basal do \nendométrio, porém diferente da camada funcional. Ad icionalmente, o fluxo menstrual \ndas mulheres com endometriose tinha maior concentra ção de células da camada basal, \nem comparação ao de mulheres sem doença (Layendecke r et al. , 2002). Embasado nas \nevidências de que as células tronco residem na cama da basal do endométrio e que \nmulheres com endometriose apresentam maior fluxo me nstrual retrógrado (Halme, \n1984), aventou-se que os implantes endometrióticos poderiam resultar do refluxo de \ncélulas tronco da camada basal (Layendecker et al. , 2002; Sasson e Taylor, 2008).  \nHipótese alternativa sugere que células tronco extr a-uterinas estariam \nrelacionadas ao desenvolvimento de endometriose (Du  e Taylor, 2007). Estudo \nexperimental foi realizado em modelo de camundongo com o objetivo de avaliar se \ncélulas tronco da medula óssea poderiam migrar e se  alojar nas lesões de endometriose \n(Du e Taylor, 2007). Transplante de medula óssea de  camundongos foi realizado após o \ndesenvolvimento de endometriose experimental na cavidade peritoneal de camundongas \nhisterectomizadas, evidenciando que células tronco da medula óssea dos camundongos \nincorporaram-se ao endométrio ectópico, além de apr esentarem diferenciação em \ncélulas epiteliais e estromais em uma freqüência de  0,04% e 0,1%, respectivamente (Du \ne Taylor, 2007).  \nPortanto, evidências sugerem que a atividade de cél ulas tronco endometriais \npode estar relacionada à patogênese da endometriose . Além disso, células tronco extra-\n\n \n \n \n31 \nuterinas poderiam dirigir-se ao endométrio tópico o u à cavidade peritoneal e também a \noutros tecidos, proliferando e diferenciando-se em células endometriais funcionais. \nCélulas tronco da membrana basal do endométrio pode m refluir pelas tubas uterinas e \nestabelecer os implantes ectópicos, corroborando co m a teoria da menstruação \nretrógrada. Igualmente, células tronco da medula ós sea, endometriais ou de outras \nfontes, poderiam ser relacionadas ao desenvolviment o de metaplasia. Além disso, \naquelas originadas dos remanescentes dos ductos de Muller podem proliferar e dar \norigem aos focos endometrióticos. Por fim, as célul as tronco podem migrar pela \ncirculação sanguínea e linfática e gerar focos ectópicos distantes.  \nEnfim, a participação dessas células na gênese da e ndometriose representa ainda \ngrande desafio e motivo de polêmica. A identificaçã o do nicho e de vias de sinalização \ndas células tronco endometriais, bem como de genes e vias biológicas relacionados à \nsua função, poderão contribuir para a melhor compre ensão do papel dessas células na \nfisiologia e no desenvolvimento de doenças do trato  reprodutivo. Assim, propusemos a \nrealização deste estudo com o objetivo de avaliar e  comparar o padrão de expressão de \ngenes relacionados à atividade de células tronco em  lesões de endometriose peritoneal \nprofunda e superficial, no peritônio normal adjacen te e no endométrio tópico em \npacientes inférteis com endometriose pélvica.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n32 \n3. OBJETIVO \n \n \n Avaliar e comparar a expressão de genes relacionad os à atividade de células \ntronco no endométrio tópico, no peritônio normal e em lesões de endometriose \nperitoneal superficial e profunda de pacientes inférteis com endometriose pélvica.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n33 \n4. CASUÍSTICA E MÉTODOS \n \n4.1. CASUÍSTICA \n \n4.1.1 Pacientes  \n \n Neste estudo prospectivo, avaliaram-se quatro amost ras obtidas por biópsias do \nendométrio tópico, de lesões de endometriose perito neal superficial e profunda e do \nperitônio normal, perfazendo o total de vinte e qua tro amostras, de uma coorte de seis \npacientes após realização do cálculo amostral consi derando intervalo de confiança de \n95% e poder da amostra de 0,8.  \n As pacientes estavam incluídas no Programa de Repr odução Assistida do Centro de \nReprodução Humana (CRH) Governador Mário Covas da D ivisão de Ginecologia do \nHospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da U niversidade de São Paulo (HC-\nFMUSP) ou da Clínica Huntington Medicina Reprodutiva.  \n \n4.1.2 Consentimento \n \n Todas as pacientes receberam informação pormenoriz ada sobre o estudo e assinaram \no termo de consentimento livre e esclarecido pós-informado (Anexo 1).  \n O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesqu isa do Departamento de \nObstetrícia e Ginecologia e pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de \nPesquisa da Diretoria Clínica (CAPPesq) do HC-FMUSP (Anexo 2).  \n \n \n \n\n \n \n \n34 \n4.1.3 Critérios de inclusão  \n \n Foram incluídas no estudo mulheres inférteis, com i dade entre 21 e 39 anos. \nApresentavam ciclos menstruais regulares com duração de 23 a 35 dias; índice de massa \ncorpórea (IMC: kg/m \n2) entre 18 e 28 e não tinham antecedentes de cirurg ia prévia para \nendometriose ou uso de hormônios nos três meses que  antecederam a cirurgia. Todas \ntinham suspeita clínica, bem como ultrassom transva ginal com preparo intestinal ou \nressonância magnética de pelve, sugestivos de endometriose peritoneal profunda (Abrão \net al.,  2007; Chamie et al.,   2009).   \n \n4.1.4 Critérios de exclusão \n \n Foram excluídas as pacientes com contra-indicação para gravidez ou cirurgia.  \n \n4.2 MÉTODOS \n \n4.2.1 Obtenção das amostras teciduais \n \n Laparoscopia e histeroscopia diagnósticas foram rea lizadas no mesmo ato \noperatório. As biópsias endometriais foram feitas c om o cateter de Pipelle logo após a \nhisteroscopia.  Parte do tecido endometrial foi env iada para confirmação histológica e \noutra foi imediatamente conservada em solução prese rvadora de RNA (RNAlater , \nRNA Stabilization Reagent, Qiagen). A laparoscopia foi realizada com uma câmera de \n0° pela técnica aberta para a passagem de um trocater de 10 mm na cicatriz umbilical. A \nseguir, três trocateres acessórios foram posicionados.  \n\n \n \n \n35 \n Durante a cirurgia, amostras de lesões suspeitas d e endometriose peritoneal \nsuperficial e profunda e de peritônio normal de sít ios distantes dos focos \nendometrióticos foram removidas. As biópsias de end ometriose peritoneal profunda \nforam realizadas no ligamento útero-sacro de quatro  pacientes e na região retro-vaginal \nde outras duas. As biópsias de endometriose superfi cial foram feitas na região \nretrovaginal nas seis pacientes. As de peritônio no rmal, que constituíram o grupo \ncontrole, foram removidas a uma distância de pelo m enos 5 cm da borda externa das \nlesões de endometriose, sob visualização endoscópic a direta, características de tecido \nperitoneal normal. Todas as biópsias foram efetuada s com tesoura laparoscópica e sem \nutilização de eletrocautério.  \n Os fragmentos das amostras foram, em parte, conser vados em solução preservadora \nde RNA, (RNAlater , Stabilization Reagent, Qiagen); outra parte foi u sada para \nconfirmação histológica. Todas as amostras foram estocadas a -80 C \no. \n \n4.2.2 Isolamento do RNA   \n \n O RNA foi isolado usando o reagente Trizol  (Invitrogen, Carlsbad, CA).  As \namostras de tecidos foram descongeladas e homogenei zadas utilizando homogeneizador \n(Tissumizer, Tekmar, USA), seguido por centrifugaçã o e lise das células (50-100 mg \npor 1ml de reagente Trizol ). As amostras homogeneizadas foram incubadas por 5  \nminutos a 15-30 \noC, e em seguida adicionou-se 0,2 ml de clorofórmio por 1ml de \nTrizol . As amostras foram incubadas a 15-30 oC por 3 minutos e centrifugadas por 15 \nminutos a 2-8 oC. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e precipitada pela \nmistura de álcool isopropílico (0,5 ml de álcool is opropílico por 1 ml de Trizol ). As \namostras foram incubadas a 15-30 oC por 10 minutos e centrifugadas a 2-8 oC. Os pellets \n\n \n \n \n36 \nde RNA foram lavados com 75% de etanol (1 ml por 1m l de Trizol ), misturados e \ncentrifugados por 5 minutos a 2-8\noC. Os pellets de RNA foram secos, dissolvidos em \nágua livre de RNAse e armazenados a -80 oC até utilização posterior.  \n  \n4.2.3  Purificação e validação do RNA  \n \n A purificação do RNA foi realizada através do RNea sy  Mini Kit (RNeasy  Mini \nManual, Qiagen). As amostras foram ajustadas para u m volume de 100 \nµl em água livre \nde RNAse, adicionando 350 µl de solução tampão RLT (fornecido pelo fabricante) . As \namostras de RNA foram diluídas com 250 µl de etanol (96-100%), transferidas para o \ndispositivo da coluna RNeasy  mini kit em tubos de 2 ml e centrifugadas por 15 \nsegundos ( ≥ 10,000 rpm). A fase líquida foi descartada e a col una foi tratada com \nDNase. A seguir, as colunas foram lavadas com 500 µl de solução tampão RPE \n(fornecido pelo fabricante) e centrifugadas por 15 segundos adicionais ( ≥ 10, 000 rpm). \nOs sobrenadantes foram descartados e as colunas cen trifugadas por 2 minutos ( ≥ 10, \n000 rpm). As colunas foram recolocadas em tubos nov os de 1,5 ml, adicionando-se 50 \nµl de água livre de Rnase e as amostras homogeneizad as e centrifugadas por 1 minuto \n(≥10,000 rpm). \n A quantidade e a qualidade do RNA resultando foram  analisadas por \nespectofotometria e eletroforese em gel utilizando um RNA 6000 Nano LabChip® \n(Agilent Technologies, Santa Clara, CA). A qualidad e das amostras de RNA a serem \nanalisadas por PCR foi definida pelos critérios descritos no protocolo do fabricante, RT² \nProfiler TM  PCR Arrays System Versão 3.3 (SABiosciences, Frede rick, MD). Todas as \namostras apresentaram razão de absorbância de 260 n m/280 nm, com variação entre 1,8 \ne 2,1 e exibiram bandas 18S e 28S proeminentes (Figura 2).  \n\n \n \n \n37 \n \n \n \nFigura 2. Exemplo de um eletroesferograma de uma das amostras de RNA   \n                avaliadas neste estudo. As pontas agudas e ausência de ombros para o        \n                18S e 28S indicam RNA de alta qualidade \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n38 \n4.2.4 Análise da expressão gênica pela técnica de t ranscrição reversa e reação em \ncadeia de polimerase (RT-PCR)  \n \n O kit contido na plataforma gênica de células tron co, The Human Stem Cell RT² \nProfiler™ PCR Array/RT2 First Strand Kit (SABioscie nces), foi utilizado para a \npreparação do cDNA de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.  \n Em suma, a transcrição reversa foi realizada por m eio da reação em cadeia \nutilizando o RNA total como padrão para a síntese d o cDNA. A seguir, os produtos \nresultantes foram diluídos e adicionados à mistura contendo o corante fluorescente \nSYBR verde. As alíquotas foram distribuídas em uma placa de 96 poços, com cada \npoço contendo os oligonucleotídeos iniciadores ( primers ) para cada gene (Figura 3).  \n A RT-PCR foi então executada usando uma máquina AB I Prism 7000 (Applied \nBiosystems, Carlsbad, CA). As condições de ciclagem  de RT-PCR foram as seguintes: \n40 ciclos de desnaturação a 95 º C por 15 segundos e extensão do primer a 60ºC por 1 \nminuto. As placas matriz de PCR, contendo um painel  de genes preestabelecido, foram \nempregadas para a normalização dos dados e estimati va do intervalo linear dinâmico do \nensaio. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes. A expressão \ngênica foi calculada usando o método \n∆∆ Ct comparando a expressão do RNA \nmensageiro entre amostras indiferenciadas e diferenciadas (Anexo 3). \n A ontologia de cada gene foi classificada com base  em famílias funcionais e \nfunções biológicas descritas na literatura. Os gene s foram classificados como \npertencentes aos seguintes grupos: reguladores do c iclo celular, moduladores do \ncromossomo e da cromatina, reguladores da divisão c elular simétrica e assimétrica, \nmarcadores de auto-renovação, citocinas e fatores d e crescimento, reguladores da \ncomunicação célula-célula, moléculas de adesão celu lar, marcadores metabólicos, \n\n \n \n \n39 \nmarcadores de células embrionárias, marcadores de c élulas hematopoiéticas, \nmarcadores de células mesenquimais, marcadores de células neurais, vias de sinalização \nNotch e Wnt (Tabela 1).  \n A análise da expressão gênica foi realizada em col aboração com o Departamento \nde Ginecologia e Obstetrícia, Urologia e Fisiologia da Universidade de Michigan, USA.  \n \n \n \n \nFigura 3 – Exemplo de uma placa de 96 poços para realização de Reação em   \n                  Cadeia da Polimerase  \n \n \n \n \n \nC DNA G - Controle de DNA Genômico  \nControle RT- Controle de Transcrição Reversa \nControle PCR- Controle Positivo de Reação em Cadeia da Polimerasa \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n40 \nTabela 1 - Painel de genes relacionados à atividade das células tronco  \n \nMarcadores Específicos de Células Tronco  \n \nReguladores de ciclo celular:\n APC, AXIN1, CCNA2, CCND1, CCND2, CCNE1, CDC2, \nCDC42, EP300, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, MYC, NOTCH2, PARD6A, RB1 \nModuladores do cromossomo e da cromatina:  GCN5L2, HDAC2, MYST1, MYST2, RB1, \nTERT \nReguladores de divisão celular simétrica e assimétr ica:\n DHH, NOTCH1, NOTCH2, NUMB, \nPARD6A \nMarcadores de auto-renovação:\n HSPA9, MYST1, MYST2, NEUROG2, SOX1, SOX2 \nCitocinas e fatores de crescimento:  BMP1, BMP2, BMP3, CXCL12, FGF1, FGF2, FGF3, \nFGF4, GDF2, GDF3, IGF1, JAG1 \nReguladores da comunicação célula-célula:\n DHH, DLL1, GJA1, GJB1, GJB2, JAG1 \nMoléculas de adesão celular: APC, BGLAP, CD4, CD44, CDH1, CDH2, COL9A1, CTNNA1, \nCXCL12, NCAM1 \n Marcadores metabólicos:\n ABCG2, ALDH1A1, ALDH2, FGFR1 \nMarcadores de Diferenciação de Células Tronco \nMarcadores de células embrionárias:  ACTC1, ASCL2, FOXA2, PDX1 (IPF1), ISL1, KRT15, \nMSX1, MYOD1, T \nMarcadores de células hematopoiéticas:\n CD3D, CD4, CD8A, CD8B, MME \nMarcadores de células mesenquimais:  ACAN (AGC1), ALPI, BGLAP, COL1A1, COL2A1, \nCOL9A1, PPARG \nMarcadores de células neurais:\n CD44, NCAM1, OPRS1, S100B, TUBB3 \nVias de Sinalização Importantes para a Manutenção de Células Tronco  \nVia de Sinalização Notch:  DLL1, DLL3, DTX1, DTX2, DVL1, EP300, GCN5L2, HDAC2 , \nJAG1, NOTCH1, NOTCH2, NUMB \nVia de Sinalização Wnt: \n ADAR, APC, AXIN1, BTRC, CCND1, FRAT1, FZD1, MYC, \nPPARD, WNT1   \n \nFonte: SABiosciences \n\n \n \n \n41 \n5. ANÁLISE ESTATÍSTICA \n \n A análise estatística foi realizada através do sof tware Limma (Linear Models for \nMicroarray Data), versão 2.7.0. As diferenças de ex pressão gênica foram avaliadas pelo \nteste estatístico t de Student, valores de p e valo res de p-ajustado. As razões de \nexpressão foram calculadas para normalizar os valor es de limiares de ciclo ( ∆Ct) \n(Anexo 3). Valores de p-ajustado menores que 0,05 f oram considerados significantes \n(Tan e Yan, 2006). Posteriormente, o programa Ingen uity Systems Analysis versão 7.0 \nfoi utilizado para a avaliação das vias biológicas.   \n A análise estatística foi realizada em coolaboraçã o com o Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia, Urologia e Fisiologia da Universidade de Michigan, USA.  \n\n \n \n \n42 \n6. RESULTADOS  \n \n A confirmação diagnóstica das lesões suspeitas de endometriose foi baseada em \nachados histológicos consistentes. De acordo com os  critérios clássicos de Noyes \n(Noyes et al.,  1950), a datação das biópsias de endométrio demons traram 5 pacientes na \nfase proliferativa e 1 paciente na fase secretória inicial do ciclo menstrual. As pacientes \nforam classificadas como estágios III e IV de endom etriose pelos critérios da Sociedade \nAmericana de Medicina Reprodutiva (ASRM). Nenhuma d elas apresentava \nendometrioma ovariano (Tabela 2).   \n Todos os genes avaliados foram expressos nas amost ras teciduais de Et, PN, EPS e \nEPP.  \n Quando as lesões de EPS e EPP foram comparadas ao PN não se observaram \ndiferenças significantes. Da mesma forma, não houve  diferenças quando as lesões de \nendometriose superficial e profunda (EPS/EPP) foram  comparadas entre si. Ao \ncontrário, verificou-se que 24, 49 e 45 genes foram  diferencialmente expressos quando \ncompararam-se as amostras de PN e as lesões de endo metriose superficial (EPS) e \nprofunda (EPP)  ao Et, respectivamente (Tabela 3).   \n Em relação às amostras de Et, número significativa mente menor de genes \nmostraram-se superexpressos (baseado na razão de ex pressão) no PN e nas lesões de \nendometriose superficial e profunda (EPS/EPP) em co mparação ao número de genes \nsubexpressos (Figura 4A).  \n Dos genes superexpressos, 5 deles manifestaram-se em todas as amostras (PN, EPS \ne EPP), comparativamente ao Et; 1 gene mostrava-se superexpresso nas amostras de PN \ne EPP e, 3 outros estavam superexpressos exclusivam ente nas lesões de EPP (Figura \n4B).  \n\n \n \n \n43 \n Quanto aos genes subexpressos, 18 estavam subexpre ssos em todas as amostras \n(PN, EPS e EPP) em relação ao Et; 16 exclusivamente  nas lesões endometrióticas \n(EPS/EPP); 10 somente nas lesões de EPS e 2 genes e xclusivamente subexpressos nas \nlesões de EPP (Figura 4C).  \n Nenhum gene apresentou-se super ou subexpresso exc lusivamente no PN quando \ncomparado ao endométrio tópico (Figura 4).  \n A análise funcional dos 23 genes diferencialmente expressos em todas as \namostras (PN, EPS e EPP), em comparação ao Et, evid enciou 5 genes superexpressos: \nreguladores do ciclo celular - CDC2, CCNA2, CCNE1; comunicação célula-célula - \nCJB1; marcador de células embrionárias - FOXA2, enq uanto 18 genes achavam-se \nsubexpressos: fatores de crescimento - BMP3, CXL12,  FGFR1; marcadores de células \nneurais - S100B, NCAM1; marcador de auto-renovação - SOX2; marcador de células \nembrionárias - ISL1; divisão celular simétrica e as simétrica - DHH, NOTCH2; \nmarcadores de células hematopoiéticas - CD8A, CD3D;  comunicação célula-célula - \nJAG1; Via Wnt - PPARG; Via Notch - NOTCH2, DTX2; ma rcador de células \nmesenquimais - ACAN; marcador metabólico - ALDH2; m oduladores cromossômico e \ncromatina  - MYST1, GCN5L2 (Tabela 4).  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n44 \nTabela 2- Características clínicas das pacientes  \nPaciente \n(n°) \nIdade \n(anos) \nFase do \nCiclo \nMenstrual  \nGrau de \nEndometriose \n(ASRM) \nEndometrioma  \n \n1 \n \n28 FP III Não \n \n2 \n \n34 FP III Não \n \n3 \n \n39 FSI IV Não  \n \n4 \n \n39 FP III Não \n \n5 \n \n38 FP IV Não \n \n6 \n \n37 FP III Não \n \n \nFP: fase proliferativa \nESP: fase secretória inicial  \nASRM: Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n45 \nTabela 3- Expressão de genes relacionados à atividade das células tronco no   \n                 peritônio normal, endometriose peritoneal superficial e endometriose    \n                 peritoneal profunda comparada à do endométrio tópico \n \n  Total de genes  \np ajustado <0,05 \n \nPeritônio normal vs. Endométrio tópico  \n \n \n24 \n \nEndometriose peritoneal superficial vs. Endométrio tópico  \n \n \n49 \n \nEndometriose peritoneal profunda vs. Endométrio tópico \n  \n \n45 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n46 \nFigura 4 - Número de genes diferencialmente expressos (A); genes superexpressos   \n                  (B) e genes subexpressos (C) no peritônio normal, endometriose   \n                  peritoneal superficial e endometriose peritoneal profunda comparados  \n                  ao endométrio tópico  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nPN: peritônio normal  \nEPS: endometriose peritoneal superficial  \nEPP: endometriose peritoneal profunda  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n47 \nTabela 4 - Genes subexpressos e superexpressos no peritônio normal [1],  \n                  endometriose peritoneal superficial [2] e endometriose peritoneal  \n                  profunda [3] comparados ao endométrio tópico  \n \n \nGrupo \nFuncional \nGene Descrição  Razão de Expressão  \nCitocinas e \nfatores de \ncrescimento  \nBMP3 \n \nCXCL12 \n \n \nFGFR1 \n \n \n \n \nJAG1  \nProteína \nmorfogenética \nóssea 3  \n \nFator derivado do \nestroma 1 \n \n \nReceptor do fator \nde crescimento de \nfibroblasto 1 \n \n \nJagged 1  \n \n \n           - 120.5(1) \n- 27.7 (2) \n- 48.2 (3) \n \n- 7.0 (1) \n- 7.9 (2) \n- 5.2 (3) \n \n- 3.2 (1) \n- 3.7 (2)  \n- 3.3 (3)  \n \n \n- 2.5 (1) \n- 5.7 (2) \n- 3.7 (3) \n \nMarcadores de \ncélulas \nneuronais  \nS100B \n \nNCAM1  \nProteína ligadora \nde cálcio S100B \n \n \nMolécula de adesão \nneural 1  \n- 51.7 (1) \n- 36.6 (2) \n- 31.3 (3) \n \n- 5.7 (1) \n- 9.9 (2)  \n- 8.3 (3)  \n \nRegulação da \ncomunicacao \ncélula-célula  \nDHH \n \n \n \nJAG1 \n \n \n \nGJB1 \nHomólogo desert \nhedgehog  \n \n \nJagged 1  \n \n \n \nProteína tipo \njunção Gap, beta 1, \n32kDa  \n- 5.0 (1) \n- 7.0 (2) \n- 6.9 (3) \n \n- 2.5 (1) \n- 5.7 (2) \n- 3.7 (3)  \n \n8.2 (1)  \n3.9 (2)  \n8.5 (3) \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n48 \nMarcadores de \ncélulas \nhematopoiéticas  \nCD8A \n \n \n \n \nCD3D \nMolécula CD8a  \n \n \n \n \nMolécula CD3d, \ndelta (Complexo \nCD3-TCR)  \n- 4.0 (1) \n- 6.4 (2) \n- 3.3 (3) \n \n \n- 2.9 (1) \n- 3.9 (2) \n- 2.0 (3) \n \nModuladores do \ncromossomo e \nda cromatina  \nGCN5L2 \n \n \n \nMYST1 \nControle da sintese \nde aminoacidos \nGCN5 tipo 2 \n \nHistona acetil \ntransfarase MYST \n1 \n \n- 2.5 (1) \n- 3.5 (2) \n- 3.3 (3) \n \n- 1.9 (1) \n- 2.4 (2) \n- 2.2 (3) \n \n \nVia de \nsinalização \nNotch  \nNOTCH2 \n \n \n \nDTX2 \nHomólogo 2 Notch \n \n \n \nHomólogo 2 Deltex \n \n- 1.8 (1) \n- 2.3 (2) \n- 2.0 (3) \n \n- 2.0 (1) \n- 3.7 (2) \n- 2.7 (3) \n \nMarcador de \nauto-renovação  \nSOX2 Região sexual \ndeterminante Y \n- 14.4 (1)  \n- 15.0 (2)  \n- 15.6 (3) \n \nMarcadores de \ncélulas \nembrionárias  \n \nISL1 \n \n \n \n \nFOXA2 \nProteína Isl-1 do \nrealçador do gene \nISL1 \n \n \nProteína forkhead \nBox A2  \n \n- 15.7 (1)  \n- 14.2 (2)  \n- 14.7 (3)  \n \n \n5.2 (1) \n16.6 (2) \n17.5 (3) \n \nVia de \nsinalização  \nWnt  \nPPARG Receptor gama \nativador de \nproliferação de \nperoxisomo \n \n- 6.9 (1) \n- 5.5 (2) \n- 4.8 (3) \nMarcadores de \ncélulas \nmesenquimais  \nACAN Aggrecan  \n \n- 3.3 (1) \n- 4.8 (2) \n- 5.5 (3) \n \n    \n\n \n \n \n49 \n \nMarcadores \nmetabólicos  \n \n \nALDH2 Família aldeído \ndesidrogenase 2  \n- 2.7 (1) \n- 5.0 (2) \n- 4.3 (3) \n    \nDivisão celular \nsimétrica e \nassimétrica  \nNOTCH2 \n \nHomólogo 2 Notch \n - 1.8 (1) \n- 2.3 (2) \n- 2.0 (3) \n \nReguladores do \nciclo cellular  \nCDC2 \n \nCCNA2 \n \n \nCCNE1  \nDivisão do ciclo \ncelular, G1 para S e \nG2 para M  \n  \nCiclina A2  \n \n \n  \nCiclina E1  \n \n3.9 (1) \n8.3 (2) \n7.7 (3) \n2.8 (1)  \n4.3(2)  \n4.7(3)  \n \n3.0 (1)  \n3.3 (2)  \n2.4 (3)  \n \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n50 \n7. DISCUSSÃO  \n \nNosso estudo mostrou que os genes relacionados à at ividade das células tronco \nestão expressos no endométrio humano, nas lesões de  endometriose peritoneal \nsuperficial e profunda, bem como no peritônio norma l. Como a endometriose é uma \ndoença de expressão heterogênea, na dependência de sua localização e extensão (Nisolle \ne Donnez, 1997; Clement, 2002), incluímos pacientes com doença extensa, uma vez que \nestas teriam maior probabilidade de apresentar as d iferentes manifestações das lesões \nendometrióticas, favorecendo a interpretação da exp ressão gênica nos diversos sítios \nanatômicos de um mesmo indivíduo. Nenhuma paciente incluída havia sido submetida a \nprocedimentos cirúrgicos prévios, o que favorece a interpretação da expressão gênica \nsem a interferência de elementos celulares relacion ados ao processo de cicatrização. \nAlém disso, uma vez que a patogênese dos endometrio mas ovarianos permanece \ncontroversa, sendo considerada uma doença distinta da endometriose peritoneal por \nalguns autores (Nisolle e Donnez, 1997), pacientes com endometrioma foram excluídas.  \nAs lesões de endometriose apresentam constituição h istológica complexa, \ncaracterizada por células endometriais epiteliais e  estromais, intensa fibrose, elementos \nvasculares e células imunológicas (Nisolle e Donnez , 1997; Vinatier et al. , 2001; \nClement, 2002; Giudice e Kao, 2004; Eyster et al.,  2007). De acordo com a teoria de \nque todos estes elementos celulares, em conjunto, p articipam na patogênese da \nendometriose, optamos por não dissecar as várias cé lulas que constituem a lesão \nendometriótica e sim realizar a análise tecidual. D esta forma, as expressões gênicas \ndemonstradas nas amostras de endométrio tópico, per itônio normal e das lesões de \nendometriose superficial e profunda representariam a contribuição destas diversas \nlinhagens celulares. Estatisticamente, ao compararm os os resultados das expressões dos \n\n \n \n \n51 \ngenes relacionados à atividade das células tronco n as diferentes lesões de uma mesma \npaciente, minimizaríamos a contribuição de cada ele mento celular. Além disso, a \nrealização de análise qualitativa da expressão gêni ca, em detrimento de análise \nquantitativa, reduziria ainda mais a possível contr ibuição isolada dos elementos \ncelulares  nas lesões endometrióticas.  \n Os dados obtidos demonstraram haver maior expressã o de genes e vias de \nsinalização relacionados à atividade de células tro nco nas lesões endometrióticas e no \nendométrio tópico em relação à expressão no peritôn io normal, sendo que a razão de \nsuperexpressão foi mais significante nas amostras de endométrio normal. Entre os genes \ne vias de sinalização expressos, destacam-se os rel acionados à atividade de auto-\nrenovação, proliferação, adesão e comunição celular , além de citocinas e fatores de \ncrescimento relacionados à resposta inflamatória. E sses achados são condizentes com a \nrápida proliferação e regeneração tecidual inerente  tanto às lesões endometrióticas \nquanto ao endométrio tópico. Igualmente, estudos an teriores demonstraram \nclonogenicidade em cultura de células provenientes de lesões endometrióticas (Tanaka \net al.,  2003; Chan e Gargett, 2004) e do endométrio tópico  (Chan e Gargett, 2004). \nAlém disso, células tronco epiteliais e mesenquimai s já foram isoladas no endométrio \nhumano (Chan e Gargett, 2004; Revel, 2009).  \n A Tabela 4 desvela os genes que se mostraram super  e subexpressos, com as \nrespectivas razões de expressão, nas amostras de pe ritônio normal e de endometriose \nperitoneal superficial e profunda em relação ao endométrio. Quando comparamos com o \nendométrio tópico, observamos que 24, 49 e 45 genes  estavam diferencialmente \nexpressos no peritônio normal e na endometriose sup erficial e profunda, \nrespectivamente. Destes genes, 23 eram comuns.  \n A citocina e fator de crescimento BMP3  apresentou maior razão de \n\n \n \n \n52 \nsuperexpressão no endométrio tópico do que no PN, E PS e EPP. As BMPs, isto é, \nproteínas ósseas morfogenéticas, constituem uma fam ília de proteínas reguladoras da \nformação óssea e cartilaginosa in vivo (Alper, 1994). Possuem capacidade de acelerar \nou iniciar o processo de reparação tecidual, além d e estimularem a neoformação óssea \nquando implantadas em sítios extra ósseos (Alper, 1 994). Demonstrou-se que membros \nda família das BMPs  foram encontrados no nicho de células tronco adult as, produzindo \nsinalização inibidora para o crescimento e diferenc iação celular (Li e Xie, 2005; \nGargett, 2007). Interações complexas entre as vias Notch , Wnt , BMPs  e outras vias \nbiológicas, são fundamentais no processo de embriog ênese, proliferação e regeneração \ntecidual (Zamurovic et al ., 2004). Outrossim, dois genes reguladores do cicl o celular, \nCCNA2  e CCNE1 , funcionalmente relacionados ao atraso, parada e i nício do ciclo de \ndiversas linhagens celulares (Matsuzaki et al ., 2005), estavam superexpressos no PN, \nEPS e EPP em relação ao Et. Importante função do ni cho é a manutenção das células \ntronco adultas em estado de quiescência (Li e Xie, 2005). Avaliados em conjunto, estes \ndados sugerem que os genes BMP3, CCNA2 e CCNE1  poderiam exercer funções \nespecíficas como proliferação, regeneração e repara ção, entre outras, no nicho das \ncélulas tronco localizados no endométrio tópico e ectópico.  \nOs genes NCAM-1 e SOX2  estavam subexpressos nas lesões endometrióticas e \nno peritônio normal quando comparados ao endométrio  tópico. Nesse particular, \ndiferença semelhante na expressão destes genes já h avia sido descrita por Eyster e \ncolaboradores (2007) no endométrio tópico e ectópic o de pacientes com endometriose \n(Eyster et al.,  2007).  \n Outros genes, FOXA2 , CDC2  e CCNA2  apresentaram também superexpressão \nligeiramente superior nas lesões de endometriose em  comparação ao PN, sugerindo \nhaver aumento na sua expressão nos tecidos endometr ióticos. Entretanto, como não \n\n \n \n \n53 \nhouve diferença quando as lesões de endometriose su perficial e profunda foram \ncomparadas, poderíamos inferir que esses genes não estariam relacionados ao \nmecanismo de invasão da doença.  \n Os genes CDC2  e CCNA2  estão funcionalmente ligados à regulação do ciclo \ncelular e são responsáveis, respectivamente, pela e ntrada das células na fase S e pela \nmitose através da promoção das transições G1/S e G2 /M do ciclo celular. A expressão \ndo gene CDC2  é regulada pelo ciclo celular e acha-se restrita à s células com atividade \nproliferativa (Dalton, 1992).  A corroborar com nossos resultados, Eyster e \ncolaboradores (2007) já haviam observado, tanto no endométrio tópico como no \nectópico de mulheres com endometriose, dados simila res (Eyster et al ., 2007). Além \ndisso, Matsuzaki e colaboradores (2005), ao compara rem a expressão gênica em células \nendometriais epiteliais e estromais de mulheres com  endometriose profunda com a de \nmulheres sem doença, demonstraram que o gene CCNA2 estava significativamente \nsuperexpresso nas células do estroma das pacientes com endometriose (Matsuzaki et al ., \n2005).  \nEmbora não tenha sido demonstrada diferença estatís tica na expressão gênica \nentre as lesões de endometriose superficial e profu nda, os genes DTX1 , HPRT1 , e \nCDH1  estavam superexpressos somente nas lesões de EPP, quando comparado ao Et \n(Figura 4C). O gene DTX1  participa da via Notch , via de sinalização importante para a \nmanutenção e homeostase das células tronco (Farnie e Clarke, 2007; Van de Walle et \nal.,  2009). Verificou-se que a via Notch é ativada no nicho das células tronco, sendo \nresponsável pela regulação e manutenção da reparaçã o tecidual e pela ativação da \nproliferação e diferenciação das células-tronco res identes (Gargett, 2007; Gargett et al.,  \n2007). Em nosso estudo, o gene DTX-1 mostrou-se superexpresso nas lesões de EPP, \ncom razão de expressão relativamente superior à raz ão observada nas lesões de EPS. \n\n \n \n \n54 \nEstudos prévios demonstraram que maior atividade da  via Notch leva a aumento da \nexpressão do gene DTX1  e que a via Notch está associada com a capaciedade de invasão \nde algumas doenças, como câncer de mama, por exempl o (Farnie e Clarke, 2007). Estas \nobservações sugerem que a ativação da via de sinali zação Notch  pode também estar \nassociada com a invasividade das lesões endometrióticas.   \nDiferentes funções podem ser relacionadas aos genes  superexpressos nas lesões \nde endometriose, como proliferação, crescimento e f ormação de células musculares, \nfibroblastos e leucócitos, elementos frequentemente  identificados nos implantes \nendometrióticos (Clement, 2007). Embora sejam relat ivamente inespecíficas, essas \nfunções poderiam também ocorrer no nicho das células tronco.  \nA análise funcional dos 84 genes demonstrou haver o ito vias biológicas \nassociadas os 23 genes comuns que se mostraram dife rencialmente expressos nas \namostras de PN, EPS e EPP em relação ao Et. Entre e ssas vias, quatro tiveram maior \nsuperexpressão: duas relacionadas com a EPS e o Et (ciclo celular, desordens do sistema \nmúsculo esquelético e câncer - escore: 50; morfolog ia celular, desenvolvimento e \nfunção do sistema nervoso, proliferação e desenvolv imento celular – escore: 24). Outra \nrelacionada ao PN e ao Et (desenvolvimento celular,  desenvolvimento embrionário e \ndoenças genéticas – escore: 42); e uma ligada à EPP  e ao Et (ciclo celular, apoptose e \ndesenvolvimento e função do tecido conectivo – escore: 22) (Figura 5).  \nDevido às características funcionais das células tr onco, estas células podem \ncontribuir com as diferentes teorias da endometrios e (Du e Taylor, 2009). De acordo \ncom observações de que mulheres com endometriose ap resentam mais refluxo \nmenstrual quando comparadas com mulheres sem endome triose (Halme, 1984), da \nexistência de células tronco na camada basal do endométrio (Leyendecker et al.,  2002) e \nque o defeito primário na endometriose pode se orig inar no endométrio tópico \n\n \n \n \n55 \n(Dmowski et al.,  2001), especula-se que o refluxo de células tronco  a partir da camada \nbasal do endométrio seja a origem dos focos endomet rióticos (Leyendecker et al.,  2002; \nStarzinski-Powitz et al.,  2003). Além disso, como a endometriose é uma doenç a \ncrônica, é necessário, geralmente, alguns anos para  o desenvolvimento dos focos \nendometrióticos e sua manifestação clínica. Desta f orma, a semelhança na expressão \nentre as lesões endometrióticas e o PN, bem como a significante superexpressão no \nendométrio tópico demonstradas neste estudo, podem retratar a maior ou menor \natividade celular relacionada às funções exercidas por esses genes no tecido peritoneal \nnormal e endometriótico secundárias ao fluxo menstrual retrógrado.  \nNo entanto, as semelhanças na expressão dos genes r elacionados às células \ntronco entre o PN, EPS e EPP, assim como as diferen ças compartilhadas entre estes \ntecidos quando comparados ao Et, sugerem que, em re lação à expressão destes genes, a \nendometriose seria mais semelhante ao tecido perito neal normal do que ao endométrio. \nEssas observações são mais consistentes com as hipó teses da metaplasia celômica e dos \nrestos embrionários e podem sugerir que o peritônio  das mulheres com endometriose \nteria expressão gênica anômala, com superexpressão de genes e vias de sinalização \nrelacionados à ativação de células tronco, predispo ndo assim ao desenvolvimento dos \nfocos endometrióticos. Adicionalmente, estes achado s poderiam decorrer de um \nambiente peritoneal comum ou de fatores ativadores semelhantes nesses tecidos.  \nA caracterização da expressão gênica de amostras de  PN obtidas de mulheres \nlivres da doença representaria importante contribui ção para a análise e validação dos \ndados demonstrados neste estudo. Entretanto, todas as biópsias de tecido peritoneal \nnormal avaliadas foram realizadas em sítios seguram ente distantes das lesões \nendometrióticas, com margem de segurança maior que 5 cm, sob visualização \nendoscópica direta e posterior comprovação histológ ica. Desta forma, nossos achados \n\n \n \n \n56 \nrepresentam o padrão de expressão gênica do tecido peritoneal normal. Contudo, não \npodemos excluir a possibilidade de que estas observ ações possam resultar de um \nambiente peritoneal comum, de menstruação retrógrad a anterior ou de proliferação \nlinfovascular de células tronco provenientes de fontes alternativas. \nEnfim, as semelhanças compartilhadas entre o peritô nio normal, a endometriose \nperitoneal superficial e profunda em relação ao end ométrio, sugerem que, quanto à \nexpressão dos genes avaliados em nosso estudo, o te cido endometriótico teria \ncomportamento mais semelhante ao do tecido peritone al do que ao endométrio tópico. \nDa mesma forma, essas observações sugerem que o per itônio das mulheres com \nendometriose poderia apresentar expressão gênica an ômala, com superexpressão de \ngenes e vias de sinalização relacionados à ativação  de células tronco, podendo interagir \ncom outros fatores associados à patogênese dessa afecção.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n57 \nFigura 5 - Vias biológicas relacionando o peritônio normal, endometriose   \n                  peritoneal superficial e endometriose peritoneal profunda ao   \n                  endométrico tópico  \n \n \n \n \n \nPN: peritônio normal  \nEPS: endometriose peritoneal superficial  \nEPP: endometriose peritoneal profunda  \n \n \n \n\n \n \n \n58 \n8. CONCLUSÕES  \n \nNosso estudo permite concluir que, em mulheres infé rteis com endometriose \nperitoneal:  \n- Os 84 genes relacionados à atividade de células t ronco estavam expressos no \nendométrio tópico, nas lesões de endometriose perit oneal superficial e profunda e no \nperitônio normal;   \n- A expressão gênica foi mais semelhante no peritôn io normal e nas lesões de \nendometriose peritoneal superficial e profunda, comparadas ao endométrio tópico;  \n - Não se observaram diferenças significantes na ex pressão gênica entre as lesões de \nendometriose peritoneal superficial e profunda.  \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n59 \n9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  \n \n1. Abrão MS, Goncalves MO, Dias JA Jr, Podgaec S, C hamie LP, Blasbalg R. \nComparision between clinical examination, transvagi nal sonography and magnetic \nresonance imaging for the diagnosis of deep endomet riosis. Hum Reprod 2007; 22(12): \n3092-7.  \n2. Alonso L, Fuchs E. 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ANEXOS  \n \nAnexo 1 – Modelo do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido  \n \n HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA \nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n                             \n______________________________________________________________ \n DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU R ESPONSÁVEL \nLEGAL \n1.NOME:.:.............................................................................       \n   ........................................................... \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ........................................ SEXO :    .M \n□   F  □ \nDATA NASCIMENTO: ......../......../......  \nENDEREÇO ................................................................................. Nº ...........................   \nAPTO: .................. \nBAIRRO:  ........................................................................ CIDADE   \n............................................................. \nCEP:.........................................  TELEFONE: DDD (............)         \n2. RESPONSÁVEL LEGAL \n.............................................................................................................................. \nNATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) \n.................................................................................. \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE :....................................SEXO:  M \n□   F □   \nDATA NASCIMENTO.: ....../......./...... \nENDEREÇO:............................................................................................. Nº...................  \nAPTO: ............................. BAIRRO: ................................................................................  \nCIDADE: ...................................................................... \nCEP:..............................................TELEFONE: \n(............).................................................................................. \nDADOS SOBRE A PESQUISA \n1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA  \n   Expressão de genes comuns a linhagens de células  tronco em mulheres inférteis com \nendometriose profunda \nPESQUISADOR : Paula Beatriz Tavares Fettback \nCARGO/FUNÇÃO: Médico observador do Centro de Reprodução Humana Governador \nMario Covas   \n\n \n \n \n71 \nINSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº  117477 – SP  \nUNIDADE DO HCFMUSP: Departamento de Obstetrícia e G inecologia da Faculdade \nde Medicina da Universidade de São  Paulo. \n3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: \n     RISCO MÍNIMO \n□  RISCO MÉDIO □ \n RISCO BAIXO X □  RISCO MAIOR □ \n4. DURAÇÃO DA PESQUISA :  12 meses  \n \nEssas informações estão sendo fornecidas para sua p articipação voluntária neste \nestudo, o qual o objetivo principal visa avaliar a expressão de genes relacionados às \nfunções de células tronco em pacientes com infertil idade e endometriose profunda, \npodendo contribuir para o melhor conhecimento das c ausas desta doença e futuramente \ncolaborar com possíveis tratamentos.  \nO estudo será feito com pacientes com indicação pré via de cirurgia por vídeo-\nlaparoscopia. Durante a cirurgia serão retirados pe quenos fragmentos (pedacinhos) de \nendometriose menores que 1 centímetro, pedacinhos d o tecido normal e da camada \ndentro do útero. Estes pedacinhos serão conservados  para posterior análise da expressão \nde genes potencialmente envolvidos com função de cé lulas tronco. Não haverá nenhum \nprejuízo para a senhora devido a retirada desses pequenos fragmentos \nA senhora fará a cirurgia de vídeo-laparoscopia por  técnica comumente utilizada \ne previamente indicada devido dor e/ou infertilidad e. Esta cirurgia consiste em fazer \npequenos cortes na barriga, sendo o primeiro no umb igo com aproximadamente 2-3 \ncentímetros e mais três pequenos cortes de 1-2 cent ímetros abaixo para visualizar a \nendometriose com uma câmera e realizar a cirurgia c om os instrumentos cirúrgicos \npróprios da vídeo-laparoscopia. Para a retirada dos  fragmentos de endometriose e da \ncamada de dentro do útero serão aplicadas as mesmas  técnicas cirúrgicas utilizadas \n\n \n \n \n72 \nnormalmente na prática clínica, não havendo maior risco para a senhora durante ou após \no procedimento cirúrgico. Não haverá nenhum desconf orto ou risco adicional para a \nsenhora durante a realização dos procedimentos descritos e da pesquisa já que a cirurgia \nfaz parte do tratamento para dor e/ou infertilidade que a senhora está fazendo.  \n Não há benefício direto para sua participação nest e estudo, pois se trata de \nestudo experimental testando a possibilidade de que  genes relacionados às funções de \ncélulas tronco estariam envolvidos no desenvolvimen to da endometriose.  Somente no \nfinal do estudo poderemos concluir a presença de algum benefício.  \n Como alternativa à cirurgia de vídeo-laparoscopia,  que tem como objetivo a \nmelhora da dor e da infertilidade, a senhora poderá ser submetida a um procedimento de \nreprodução assistida, como a fertilização in vitro , não havendo, no entanto, benefícios \nna melhora da dor.  \n A senhora terá acesso, a qualquer tempo, às inform ações sobre procedimentos, \nriscos e benefícios relacionados à pesquisa, inclusive para esclarecer eventuais dúvidas. \n O principal investigador é o Professor Doutor Edmu nd Chada Baracat e a \npesquisadora executante é a Dra. Paula Beatriz Tava res Fettback, que podem ser \nencontrados no Instituto Central do Hospital das Cl ínicas – FMUSP – Avenida Doutor \nEnéas de Carvalho Aguiar, 255; CEP: 05403-900 São Paulo – SP – Brasil.  \nTelefone: (11) 30696647 \n  Se a senhora tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre \nem contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 \n– 5º andar.  \nTelefone: (11) 3069-6442 ramais 16, 17, 18 ou 20, FAX: 3069-6442 ramal 26 –  \nE-mail:cappesq@hcnet.usp.br  \n\n \n \n \n73 \n A senhora terá tem liberdade de retirar seu consen timento a qualquer momento e de \ndeixar  de participar do estudo, sem que isto traga prejuíz o à continuidade do seu \ntratamento nesta instituição.  \n Durante todo o estudo a sua confidencialidade, sig ilo e privacidade serão \ngarantidos. As informações obtidas serão  analisada s em conjunto com outros pacientes, \nnão sendo divulgado a identificação de nenhum pacie nte. Os dados obtidos por este estudo \nserão utilizados somente para pesquisa. \n A senhora terá o direito de ser mantida atualizada  sobre os resultados parciais da \npesquisa e de resultados que sejam do conhecimento dos pesquisadores.  \n Não haverá despesas pessoais para a senhora em qua lquer fase do estudo, incluindo \nexames e consultas. Também não há compensação finan ceira relacionada à sua \nparticipação. Se existir qualquer despesa adicional , ela será absorvida pelo orçamento da \npesquisa. A senhora terá toda assistência no Hospit al das Clínicas (HC-FMUSP) durante a \npesquisa.  \n Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos  procedimentos ou tratamentos \npropostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante tem direito a tratamento \nmédico na Instituição. \n Eu, Paula Beatriz Tavares Fettback, pesquisadora r esponsável comprometo-me a \nutilizar os dados coletados somente para a pesquisa.  \n Acredito ter sido suficientemente informado a resp eito das informações que li ou \nque foram lidas para mim, descrevendo o estudo: “Ex pressão de genes comuns a \nlinhagens de células tronco em mulheres inférteis c om endometriose profunda”. Eu \ndiscuti com a Dra Paula Beatriz Tavares Fettback \n sobre a minha decisão em participar \nnesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os \n\n \n \n \n74 \nprocedimentos a serem realizados, seus desconfortos  e riscos, as garantias de \nconfidencialidade e de esclarecimentos permanentes.  Ficou claro também que minha \nparticipação é isenta de despesas e que tenho garan tia do acesso a tratamento hospitalar \nquando necessário. Concordo voluntariamente em part icipar deste estudo e poderei \nretirar o meu consentimento a qualquer momento, ant es ou durante o mesmo, sem \npenalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefí cio que eu possa ter adquirido, ou \nno meu atendimento neste Serviço. \n \n \n \n \n------------------------------------------------------ \nAssinatura do paciente/representante legal Data         /       /       \n \n \n \n \n \n \n----------------------------------------------------------- \nAssinatura da testemunha Data         /       /       \n \n(Para casos de pacientes menores de 18 anos, analfa betos, semi-analfabetos ou \nportadores de deficiência auditiva ou visual.) \n \n \n(Somente para o responsável do projeto \n) \n\n \n \n \n75 \nDeclaro que obtive de forma apropriada e voluntária  o Consentimento Livre e \nEsclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo. \n \n------------------------------------------------------ \nAssinatura do responsável pelo estudo Data        /        /       \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n76 \nAnexo 2 – Aprovações  \n \n\n \n \n \n77 \n\n\n \n \n \n78 \n \n \n \n\n \n \n \n79 \n \n \n \n \n\n \n \n \n80 \n \n \n\n \n \n \n81 \n \n \n \n\n \n \n \n82 \n \n \n \n\n \n \n \n83 \nAnexo 3 - Cálculo da expressão gênica pelo método delta-delta Ct ( \n∆∆ Ct)  \n \n  \n \n- Limiar (“Threshold”)  \n \n O software usa um parâmetro chamado “threshold” (l imiar) para definir o nível de \nfluorescência de RT-PCR detectável. Baseado no núme ro de ciclos requeridos para \ncruzar o limiar, o software compara as amostras tes tadas quantitativamente: uma \namostra com maior número de cópias inicial cruzará o limiar mais cedo do que uma \namostra com um menor número de copias inicial do alvo.  \n \n \n \nFigura 6 - Exemplo de curva de amplificação representativa dos ciclos da  \n                  Transcrição Reversa e Reação em Cadeia da Polimerase dos genes  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n84 \n \n- Ct (“Cycle Threshold”)  \n \n \n O Ct de uma determinada amostra corresponde ao cic lo de PCR em que esta \ncruzou o limiar (“threshold”). O valor de Ct depend e da quantidade inicial de alvo, e da \neficiência de amplificação. O nível de expressão de cada gene foi calculado pelo método \nde delta-delta Ct ( \n∆∆ Ct):  \n \n• \n∆Ct (delta Ct) = Ct gene – Ct gene de controle (housekeeping gene);   \n \n• Normalizacao dos valores de \n∆Ct: Cálculo da média S: Média do ∆Ct (Gráfico 1);  \n \n• \n∆∆ CT (delta-delta CT): ∆CT - média S  \n \n \n \n \n\n \n \n \n85 \n \n \n \n \nGráfico 1 - Gráfico demonstrando a normalização dos valores delta Ct \nEndométrio tópico Peritônio Normal Endometriose Superficial Endometriose Profunda","source_license":"CC0","license_restricted":false}