Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de mulheres com infertilidade relacionada à endometriose como preditores de sucesso gestacional após ICSI

ALBUQUERQUE, FO. Oxidative stress markers in serum and follicular fluid of women with endometriosis-related infertility as predictors of successful pregnancy after ICSI. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. INTRODUCTION. The pathogenic mechanisms responsible for the reduction of fertility in women with endometriosis (E) remain poorly understood. Some evidence suggests the involvement of oxidative stress (OS) in the genesis of infertility-related disease . However, we have no studies evaluating different markers of oxidative stress in both serum and follicular fluid (FF) of infertile women with endometriosis, which is important to the overall understanding of this complex process. On the other hand, we have no studies examining the potential predictive role of OS markers in serum and FF in the occurrence of clinicai pregnancy (CP) and live bom (LB) after controlled ovarian stimulation (COS) for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in infertile women with and without endometriosis. OBJECTIVES. To compare eight markers of oxidative stress in serum on the day of oocyte retrieval and in FF of infertile women with and without endometriosis undergoing COS and ICSI to assess their accuracy in predicting the occurrence of CP and LB after ICSI. PATIENTS ANO METHODS. We performed a Cross-Sectional study from October 2009 to October 201 O. The 151 eligible patients were interviewed and 132 signed informed consent (with 65 in the contrai group, consisting of infertility due to tubal and / or male factor and 67 of the endometriosis group with infertility related exclusively to the disease). Thirty-three of the 132 patients did not undergo oocyte retrieval. Of the 99 patier:its which have had captured oocytes, we obtained blood samples from 50 women without endometriosis and 49 with endometriosis and FF samples from 32 patients without endometriosis and 35 with endometriosis. Eighty-seven serum samples (43 with and 44 without E) and 61 FF samples (29 with and 32 without E) were analyzed. On the day of oocyte retrieval, peripheral blood and FF samples were collected for analysis of total hydroperoxides (FOX1), malondialdehyde (MOA), advanced oxidation protein products (AOPP), 8 -hydroxy 2 deoxyguanosine (8OHdG), vitamin E (Vit E), glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOO) and total antioxidant capacity (TAC) concentrations. The total protein levei was determined using Labtest kits. The results obtained within and between groups were-compared.-ln-all0analyzes we considered the level of significance of 5 % (p < 0.05). For assessing the discriminatory power of each OS marker for the occurrence of CP and LB after ICSI, ROC curves were constructed. For markers considered adequate predictors (area under the curve ;::: 70 %), we determined cutoff values with better sensitivity, specificity and accuracy for discriminating CP and LB in both groups. RESUL TS. The patients with endometriosis had higher serum leveis of GSH (p = 0.03) and SOO (p = 0.02), lower serum leveis of TAC (p < 0.01) and higher follicular 8OHdG leveis (p < O, 01) and Vit E levels (p = 0.03) compared to those without endometriosis. ln the endometriosis group, the serum presented higher leveis of FOX1 (p < 0.01 ), AOPP (p = 0.03), Vit E (p <0.01) and SOO (P <0.01) and lower leveis of 8OHdG, TAC and GSH (p < 0.01) compareci to FF. ln the group without endometriosis, the serum had higher leveis of FOX1 (p < 0.01 ), Vit E (p <0.01) and SOO (p = 0.02) and lower leveis of GSH (p < 0.01) compareci to FF. ln the endometriosis group, no OS marker was identified as good serum predictor of CP and LB. ln the FF of this group, 8OHdG was the only marker that was presented as an appropriate predictor of CP (cutoff value (CV) : 28.02 ng / ml, sensitivity (S): 87.5 % , specificity (Sp): 100 % and accuracy (A): 89%). ln the group without endometriosis, 8OHdG was presented as the best serum predictor of CP (cutoff : 15.59 ng / ml, sensitivity (S): 78.57 % , specificity (Sp): 54.55 % and accuracy (A): 72 %) and LB (cutoff value: 18.11 ng / ml, S: 81.82% , Sp: 67.86 % and A: 72%). ln this group, GSH was the only marker considered adequate follicular predictor of CP 0/C : 277.25 nmol / g protein , S 73.91 % , E: 85.71 % and A : 77 % ) and LB 0/C : 277.25 nmol / g protein , S : 85.71 % , Sp: 73.91 % and A: 77%). CONCLUSIONS. The results indicate the occurrence of systemic and follicular oxidative stress in infertile patients with endometriosis undergoing COS for ICSI. Some of the studied markers showed to be good predictors of clinicai pregnancy and live birth after ICSI, opening prospects for their use in determining gestational prognosis after ICSI.

endometriosis; infertility; oxidative stress; serum; follicular fluid; ICSI; predictor of pregnancy. Lista de Figuras Figura 1. Esquema das pnnc1pais reações ocorridas durante o processo de peroxidação lipídica (LIMA, 2001) ............................................................................. 30 Figura 2. Esquema representativo da peroxidação lipídica, enfocando as principais substâncias formadas durante o processo e as metodologias disponíveis para a sua avaliação (LIMA, 2001) . ....................................................... 30 Figura 3. Fluxograma do Estudo ............................................................................... 52 Figura 4. Curvas ROC das medidas das concentrações de marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular (FF) considerados adequados discriminadores (Área sob a curva -AUC ;;;: 70) de ocorrência de gestação clínica (GC) e nascidos vivos (NV) após ICSI para pacientes com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana. 8OHdG: 8-hidroxideoxiguanosina, expressa em ng/ml; GSH: glutationa reduzida, expressa em nmol/g proteína; CAT: capacidade antioxidante total, expressa em mEq Trolox/L. A) e B): grupo com endometriose; C), D), E) e F): grupo sem endometriose . ......................................... 73 lista de Tabelas Tabela 1. Variáveis clínicas, resposta à estimulação ovariana e resultados de ICSI em pacientes inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada . ................................................................................................. 67 Tabela 2. Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada com gonadotrofinas no dia da captação oocitária ..................................................... 69 Tabela 3. Área sob a curva (AUC), valores de corte, sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo e acurácia dos marcadores de estresse oxidativo dosados no soro do dia da captação oocitária e fluido folicular de pacientes inférteis sem endometriose e com endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada, considerados adequados preditores de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI.. .................................... 72 lista de Abreviaturas AOPP CAT CC coe CP CuZn-S0D DEPC­ D11- DI11- DNA­ DTNB­ EDCs­ EDTA­ EO - ESCA FIV FMRP FOX1 FSH FSHr GnRH GnRHa GR GSH GSSG H202 hCG Produtos Avançados de Oxidação Protéica Capacidade Antioxidante Total Células do Cumu/us oophorus Complexo Cumulus oophorus Corpúsculo Polar Cobre-Zinco Superóxido Dismutase Dietilpirocarbonato Segundo dia de desenvolvimento embrionário Terceiro dia de desenvolvimento embrionário Ácido Desoxirribonucleico Ácido Ditionitrobenzóico Desreguladores Endócrinos (Endocrine Disrupting Chemicals) Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético Estresse Oxidativo Esterilidade Sem Causa Aparente Fertilização in vitro Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Total de Hidroperóxidos Hormônio Folículo Estimulante Hormônio Folículo Estimulante recombinante Hormônio Liberador de Gonadotrofinas Agonista do Hormônio Liberador de Gonadotrofinas Glutationa Redutase Glutationa (Reduzida) Glutationa Oxidada Peróxido de Hidrogênio Gonadotrofina Coriônica Humana hCGr HEPES HPLC HTF­ ICSI IM IMC IVM LOOH MOA MIi Mn-SO0 NOS RNA RNS ROS SHO soo TBARS TCLE TNF-a TRA USP USTV VIT E 13-hCG Gonadotrofina Coriônica Humana recombinante Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfónico Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Meio de Cultura Fluido Tubário Humano (Human Tuba/ Fluid) Injeção lntracitoplasmática de Espermatozóide lntramuscular Índice de Massa Corporal Maturação in vitro Hidroperóxido Lipídico Malondialdeído Metáfase li Manganês Superóxido Dismutase Óxido Nítrico Sintetase Ácido Ribonucleico Espécies Reativas de Nitrogênio Espécies Reativas de Oxigênio Síndrome da Hiperestimulação Ovariana Superóxido Dismutase Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (Thiobarbituric acid reactive substances) Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Fator de Necrose Tumoral Alfa Técnicas de Reprodução Assistida Universidade de São Paulo Ultrassonografia Transvaginal Vitamina E Subunidade Beta da Gonadotrofina Coriônica Humana Sumário 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 26 Espécies reativas do oxigênio, antioxidantes, estresse oxidativo e trato reprodutivo feminino .............................................................................................. 27 Endometriose e Estresse Oxidativo ...................................................................... 33 E d t • • f rtld d I·d d • , • n orne nose, In e 1 1 a e e qua I a e ooc1tana .................................................. 36 2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 42 3. OBJETIVOS ......................................................................................................... 46 OBJETIVOS GERAIS ............................................................................................ 47 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 47 4. PACIENTES E MÉTODOS ................................................................................... 49 Pacientes ............................................................................................................... 50 Casuística e Fluxograma do Estudo ...................................................................... 51 Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea .................. 53 Captação Oocitária e Denudamento Oocitário ...................................................... 54 ICSI, Taxas de Fertilização, Implantação, Gestação Clínica e Nascido Vivo ........ 56 Amostras Obtidas e Processamento ..................................................................... 57 Sangue ............................................................................................................... 57 Fluido Folicular ................................................................................................... 58 Metodologias ......................................................................................................... 58 1. Determinação da concentração total de hidroperóxidos (FOX1) .................... 58 2. Mensuração da concentração de malondialdeído (MOA) ............................... 59 3. Determinação da concentração dos produtos avançados de oxidação protéica (AOPPs) ............................................................................................... 60 4. Determinação da 8-Hidroxi 2 deoxiguanosina (8-OHdG) ............................... 60 5. Determinação da concentração de vitamina E (Vit E) .................................... 61 6. Determinação da concentração de glutationa (GSH) - concentração total de grupos tióis ou sulfidrilas ............................................................................... 62 7. Determinação da Superóxido Dismutase (SOO) ............................................ 63 8. Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) ................................ 63 9. Determinação de Proteínas Totais (MOA, GSH e FOX são expressos por g proteína) ............................................................................................................. 64 Análise Estatística ................................................................................................. 64 5. RESULTADOS ..................................................................................................... 66 6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 74 7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 85 8. REFERÊNCIAS ····························································································••N••·· 87 MANUSCRITO .......................................................................................................... 98 1. Introdução Introdução 1 27 Espécies reativas do oxigênio, antioxidantes, estresse oxidativo e trato reprodutivo feminino As espécies reativas, substâncias que possuem elétrons desemparelhados e alta capacidade de reagir com outros substratos, são formadas como produtos intermediários da metabolização celular e em concentrações fisiológicas parecem ter importância na modulação de inúmeros processos fisiológicos do trato reprodutivo feminino, como a foliculogênese e maturação oocitária, a função do corpo lúteo, a interação gamética, a fertilização, o desenvolvimento e a implantação embrionária, bem como o declínio da fertilidade relacionado à idade (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; SHKOLNIK et ai., 2011; AGARWAL et ai., 2012). Quando há um desequilíbrio entre os agentes pró-oxidantes (radicais livres) e os mecanismos antioxidantes de defesa do organismo, pode ocorrer o estresse oxidativo (EO), que tem sido envolvido na etiopatogênese da infertilidade de causa tubária, sem causa aparente e tubo-peritoneral, com destaque para a endometriose (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; GUPTA et ai., 2008; AGARWAL et ai., 2012). Os fluidos peritoneais, foliculares e das hidrossalpinges são microambientes reprodutivos, que abrigam gametas, zigotos e embriões por tempo variável. Alterações em sua composição química podem ter efeitos adversos nos processos reprodutivos, sendo que a presença de ROS e antioxidantes já foi demonstrada nestes microambientes reprodutivos (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; AGARWAL et ai., 2008; AGARWAL et ai., 2012). Os mecanismos que envolvem a produção e ação dos radicais livres, bem como a prevenção da gênese do estresse oxidativo por antioxidantes endógenos, Introdução 1 28 em processos fisiológicos e patológicos do sistema reprodutivo feminino, ainda necessitam de maior elucidação. O equilíbrio oxidativo do trato reprodutivo depende de alguns tipos de radicais livres e dos diferentes mecanismos antioxidantes que os neutralizam. Existem dois grandes grupos de radicais livres: as espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS). Devido a sua instabilidade e sua alta reatividade, precisam adquirir elétrons de algum substrato, levando à oxidação de componentes como áddos nucléicos, lipídios, proteínas, carboidratos, tióis, cofatores enzimáticos ou qualquer molécula em sua volta para se tornarem estáveis, causando uma reação em cadeia que pode culminar em dano celular e tecidual dalla(LIMA, 2001; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005). As ROS são geradas a partir de reações orgânicas enzimáticas ou não­ enzimáticas. As reações biológicas via transferência de elétrons ou via oxigenase, que utilizam moléculas de oxigênio (02) como substrato, geram grande quantidade de ROS. Como a cadeia respiratória mitocondrial é o principal sistema de consumo de 02 celular, a maior parte de ROS é produzida por este sistema sob condições fisiológicas (FUJll;IUCHI; OKADA, 2005). O radical superóxido (02-) é produzido quando há vazamento da cadeia de transporte de elétrons por redução-(O 2 + e - -+ 02) (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005). A dismutação de superóxidos e algumas enzimas oxidases podem gerar diretamente peróxido de hidrogênio (H2O2) (2 02-+ 2 H + -+ H2O2 + 0 2) (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005), que também pode ser gerado pela redução do 02- (02-+e-+ 2 H + -+ H2O2)(BABIOR, 1997). O íon hidroxila (OH-) é formado da aquisição de um elétron pelo H2O2 (H2O2 + e-+ H + -+ OH + H 2O) (BABIOR, 1997) e este radical é altamente reativo e pode modificar purinas e pirimidinas causando quebras no feixe de ácido desoxiribonucleico (DNA) (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005). Introdução 1 29 As ROS estão envolvidas em eventos bioquímicos como a peroxidação lipídica, onde cascatas de reações podem levar a dano oxidativo nos lipídios insaturados em membranas, levando à destruição de sua estrutura, falência dos mecanismos de troca de metabólitos e, em condições extremas, à morte celular (LIMA, 2001 ). Nos sistemas biológicos a peroxidação lipídica consiste na incorporação de oxigênio molecular a um ácido graxo poliinsaturado para produzir um hidroperóxido lipídico (LOOH) como produto primário inicial, e pode ocorrer principalmente por duas vias: uma via enzimática envolvendo as ciclooxigenases e lipoxigenases; e a peroxidação não enzimática, que envolve a participação de ROS, RNS, metais de transição e outros radicais livres (AL-MEHDI et ai., 1993; PORTER;CALDWELL; MILLS, 1995; LIMA, 2001). Este processo pode ser dividido em três etapas: iniciação, propagação e terminação (Figura 1 ). A fase de iniciação representa o início da peroxidação, em que o ácido graxo poliinsaturado sofre ataque de uma espécie que é suficientemente reativa para abstrair um átomo de hidrogênio a partir de um grupo metileno (-CH2-), formando um radical de carbono. Este radical é estabilizado por um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado, ou seja, duas duplas ligações intercaladas por uma ligação simples (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989). Em meio aeróbio, o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigênio formando o radical peroxila, o qual pode abstrair um hidrogênio alílico de outro ácido graxo, gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa de propagação. A reação do radical peroxila com o átomo de hidrogênio abstraído gera um hidroperóxido lipídico (LOOH). Estes hidroperóxidos formados são prejudiciais para a estrutura e função das membranas celulares, como para estruturas protéicas, como receptores e enzimas (KATSIKI; MANES, 2009). Peróxidos cíclicos também podem ser formados, quando o radical peroxila reage com uma dupla ligação na mesma cadeia de ácido graxo, o que também pode propagar a peroxidação lipídica (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989). R�' LH l �H, > .. ·�Propagaçl!o. ··• . ·. • R � R'. · ·•· .. . R.� • Introdução 1 30 • °'; +- · · ••·· · •··/ .. :·. •·. •· .. ··· ·�. · ·.•·.· .•., ... · .. ·. · • · •-?- . ·•.L.• · .. · ·•.• ··• •• • ··. • ... · · .• .• .... ·x• .. . . . . ... · · • · · · •. · . ;;_� · ·.H.>� LOO · H· •-"-J. � • • ¼R 1 _ . · .. . . ·· �• . • . R . � � R' e>e>" LOO• • ·· • . Figura 1. Esquema das principais reações ocorridas durante o processo de peroxidação lipídica (LIMA, 2001) A terceira e última etapa da reação, a fase de terminação, dá-se pela aniquilação dos radicais formados originando produtos não radiculares (GARDNER, 1989; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989). Os radicais peroxila e alcoxila também podem sofrer dismutação ou clivagem formando aldeídos, como o malondialdeído (MOA) (Figura 2). Figura 2. Esquema representativo da peroxidação lipídica, enfocando as principais substâncias formadas durante o processo e as metodologias disponíveis para a sua avaliação (LIMA, 2001 ). Introdução 1 31 As ROS, além de gerarem dano a lipídios, podem levar a dano protéico com extensas lesões tissulares e alterações no DNA. Proteínas oxidadas são mais sensíveis à proteólise e o aumento destas proteínas oxidadas e dos produtos de sua oxidação pode ser responsável pela perda de funções bioquímicas e fisiológicas (ZADAK et ai., 2009). O processo de estresse oxidativo que leva a formação de produtos avançados de oxidação protéica (AOPP) envolve a ação de oxidantes cloradas, principalmente ácido hipocloroso e cloraminas, produzidas por mieloperoxidases em neutrófilos ativados. Acredita-se que os AOPP possam induzir citocinas inflamatórias e moléculas adesivas (KALOUSOVA;SKRHA; ZIMA, 2002), de modo que seus níveis estão relacionados com marcadores de ativação de monócitos e resposta inflamatória (WITKO-SARSAT et ai., 1998a; WITKO-SARSAT et ai., 1998b; KELL Y et ai., 2002). Em condições normais, todos os organismos têm mecanismos enzimáticos e não enzimáticos capazes de neutralizar as espéeies pró-oxidantes e/ou reparar os danos causados pelas espécies reativas, convertendo-as em H2O, para prevenir a sua superprodução. Muitos antioxidantes de baixo peso molecular como vitaminas e polifenóis estão normalmente presentes em nutrientes, embora a neutralização enzimática das espécies reativas seja o mecanismo mais eficiente (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; FUJll;IUCHI; OKADA, 2005). Os antioxidantes não-enzimáticos também são conhecidos como antioxidantes sintéticos ou suplementos dietéticos, este grupo influencia de maneira exógena o sistema de defesa antioxidante do organismo. Os mais comuns são: Vitaminas C e E, selênio, zinco, taurina, hipotaurina, glutationa, beta-caroteno e caroteno. A vitamina C é um antioxidante que tanto interrompe a propagação do processo peroxidativo, como ajuda a reciclar a vitamina E e a glutationa oxidada (GSSG). A vitamina E (Vit E) pode tanto bloquear o início da peroxidação lipídica, Introdução 1 32 como inibir, primariamente a sua etapa de propagação (ZINGG, 2007). Estudos mostram que a depleção nutricional de vitamina E é responsável pela diminuição da capacidade de combater as espécies reativas de oxigênio (ZADAK et ai., 2009). A glutationa (GSH) está presente no oócito e no fluido tubário. Após a fertilização, a glutationa participa no processo de descondensação espermática paralelamente ao processo de ativação oocitária, bem como na transformação da cabeça espermatozóide no pronúcleo masculino (PERREAULT;BARBEE; SLOTT, 1988; YOSHIDA, 1993). A GSH também desempenha importante função permissiva para o desenvolvimento do zigoto além do estágio de duas células, até os estágios de mórula e de blastocisto (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005). A GSH é o principal componente sulfidril não protéico em células de mamíferos e tem papel importante na proteção celular ao estresse oxidativo, atuando na neutralização de peróxidos (MEISTER, 1983), além de participar na reciclagem e manutenção dos níveis fisiológicos da Vit E, auxiliando na eliminação indireta do tocoferol oxidado (NWOSE et ai., 2008). As células do cumulus (CC) participam da neutralização de ROS aumentando o conteúdo de GSH no ovário, que agiria juntamente com as enzimas antioxidantes, na inibição de apoptose (TATEMOTO et ai., 2004). Os oócitos, células da granulosa, células luteínicas e epitélio tubário expressam altos níveis de glutationa redutase (GR), responsável pela conversão da glutationa oxidada (GSSG) em reduzida. A GSH gerada protegeria os oócitos contra a produção excessiva de ROS durante a maturação oocitária e a ovulação, preservando o potencial de fertilização oocitário (KANEKO et ai., 2001). As defesas enzimáticas responsáveis pela neutralização de espécies reativas do oxigênio são representadas, principalmente, pela superóxido dismutase (SOO), Introdução 1 33 catalase, glutationa peroxidase (GPx), dependente e independente de selênio, e glutationa redutase (GR) (FUJll;IUCHI; OKAOA, 2005). O ânion superóxido é produzido pela redução de um elétron de uma molécula de oxigênio, o que inicia a reação em cadeia. Acredita-:se que o papel da SOO na conversão do ânion superóxido em peróxido de hidrogênio (2 0 2- + 2 H+ ---+ H 20 2 + 02) seja fundamental nas reações antioxidativas (VALENTI et ai., 2004). Três isoenzimas são produzidas em mamíferos (FUJll;IUCHI; OKAOA, 2005): a CuZn­ SOO, a Mn-SOO e a EC-SOO (codificada pelo gene SOD3), que é a forma extracelular, estruturalmente similar a CuZn-SOO. Há evidências de que os níveis proteicos da Mn-SOO (S0O2) e da CuZn­ SOO (SOO1) nas células da teca e da granulosa estejam intimamente correlacionados com a esteroidogênese ovariana humana (SUZUKI et ai., 1999; SUGINO et ai., 2000). A atividade de SOO está presente no fluido folicular pré­ ovulatório em níveis mais altos que no soro. Esses altos níveis parecem conferir proteção contra o dano oxidativo oocitário (TATEMOTO et ai., 2004). Um das conseqüências observadas em camundongos com deficiência de S0O1 é a infertilidade, sugerindo um potencial papel desta enzima na fertilidade feminina. A SOD2 é induzida sob várias condições de estresse oxidativo em processos inflamatórios (FUJll;IUCHI; OKADA, 2005). Endometriose e Estresse Oxidativo A endometriose é uma doença ginecológica dependente de estrogênio que afeta 6-10% das mulheres em idade reprodutiva (ESKENAZI; WARNER, 1997). Caracteriza-se por implante e crescimento de tecido endometrial (glândulas e/ou Introdução 1 34 estroma) fora -da cavidade uterina, principalmente no peritônio pélvico, ovários e septo reto-vaginal. Pode apresentar quadro clínico bastante diversificado, variando desde assintomático, até caracterizado pela presença de dor pélvica crônica, dismenorréia, dispareunia, sangramento uterino anormal e infertilidade (GIUDICE; KAO, 2004; BULUN, 2009). Tanto por seu impacto na saúde física e psicológica, como pelo impacto sócio-econômico diante dos custos para o seu diagnóstico e tratamento, a endometriose tem sido considerada um problema atual de saúde pública (SIGNORILE; BALDI, 201 O). A etiologia e a patogênese da endometriose são ainda desconhecidas, havendo diversas teorias e hipóteses tentando justificar a origem desta enigmática doença. De modo geral, há teorias propondo que os implantes se originam do endométrio uterino e outras sugerindo que os implantes surgem de tecidos extrauterinos (BURNEY; GIUDICE, 2012). lntrinsicamente a estas teorias têm sido estudados fatores desencadeadores e potencial susceptibilidade genética, cujos papéis estão começando a ser delineados, apesar de, até o presente, estarem insuficientemente estabelecidos para confirmar uma relação causa-efeito no desenvolvimento da doença. Estudos correlacionando desreguladores endócrinos com endometriose (CRAIN et ai., 2008), sugerem que estes, juntamente com estrogênios endógenos/exógenos, possam ser potenciais candidatos a propiciar transformação, indução e estimulação envolvidos na patogênese da endometriose. A ação destes agentes e suas influências em outros sistemas que predispõem a endometriose, como endócrinos, células tronco progenitoras, sistema imune e modificações epigenéticas, devem ser considerados em contextos tanto de antecedentes genéticos, assim como de estímulos responsáveis pela reprogramação do trato reprodutivo feminino (BULUN, 2009). Introdução 1 35 Associadamente a isto, sabe-se que a endometriose está associada com inflamação crônica, e ROS são mediadores inflamatórios que modulam a proliferação celular (NGÔ et ai., 2009). NGÔ et ai. (2009) mostraram que células endometrióticas podem sofrer maior EO endógeno devido ao aumento na produção de ROS, alteração das vias de detoxificação de ROS, e uma queda nos níveis de catalase, como observado nas células tumorais. Por outro lado há evidências de que a ocorrência de alterações genômicas no endométrio eutópico, passíveis de predispor à endometriose, pode ser conseqüente a fatores epigenéticos ou ao estresse oxidativo (GUO et ai., 2004). Neste contexto, alguns autores sugeriram a possibilidade da endometriose ser uma patologia originada ou associada ao EO (MURPHY;SANTANAM; PARTHASARATHY, 1998; AGARWAL;SALEH; BEDAIWY, 2003; SZCZEPANSKA et ai., 2003; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; GUPTA et ai., 2006; AGARWAL et ai., 2008; RUDER et ai., 2008; NGO et ai., 2009; AGARWAL et ai., 2012). Na vigência de endometriose pélvica, haveria a ativação dos macrófagos na cavidade peritoneal, o que poderia promover aumento da produção de ROS e RNS, citocinas,prostaglandinas-e-fatores de crescimento e, conseqüentemente, EO gerando peroxidação dos lipídeos, de seus produtos de degradação e dos produtos formados pela sua interação com as lipoproteínas de baixa densidade e outras proteínas. O estresse oxidativo também pode danificar células mesoteliais e pode induzir o aparecimento de sítios de adesão para células endometriais, favorecendo o desenvolvimento e a progressão dos focos de endometriose (ALPAY;SAED; DIAMOND, 2006). Alguns autores evidenciaram maiores níveis de Manganês-superóxido dismutase (Mn-S00) e Cobre-Zinco-superóxido dismutase (CuZn-S00) no fluido peritoneal de mulheres inférteis com adenomiose quando comparadas a mulheres inférteis com Introdução 1 36 endometriose e sem a doença (ISHIKAWA et ai., 1993). Estes mesmos autores (ISHIKAWA et ai., 1993) detectaram a Mn-SOD no endométrio ectópico de mulheres inférteis com adenomiose, além de evidenciarem maior expressão do gene que codifica a Mn-S00 no endométrio ectópico de mulheres inférteis com endometriose, sugerindo que o estresse oxidativo participe da etiopatogênese da endometriose. Em mulheres com endometriose e adenomiose foi evidenciada, por meio de imunohistoquímica, uma maior expressão da Mn-S00 e CuZn-S00, no endométrio eutópico durante todo o ciclo menstrual, além de níveis aberrantes de glutationa peroxidase (GPx) e de xantina oxidase (XO), tanto em endométrio eutópico quanto ectópico (OTA et ai., 1999). A atividade da superóxido dismutase (SOO) parece estar significativamente mais alta no endométrio ectópico de endometriomas do que no endométrio eutópico (ONER-IYIDOGAN et ai., 2004; ALPAY;SAED; DIAMOND, 2006). Todavia, este aumento dos níveis de enzimas antioxidantes, tanto no endométrio eutópico, como ectópico, de mulheres com endometriose, poderia ser tanto um evento primário, como ser secundário ao aumento da produção de espécies reativas, como uma tentativa de prevenir o dano oxidativo. Os dados acima sugerem uma tendência a maior produção de radicais livres nas- porta0oras de- endometriose, associada a uma potencial alteração da sua capacidade antioxidante, o que, supostamente, poderia contribuir para a ocorrência de estresse oxidativo, que, por sua vez, poderia estar relacionado à etiopatogênese da doença e à sua progressão. Endometriose, infertilidade e qualidade oocitária Outro aspecto muito interessante em portadoras de endometriose é a sua enigmática associação com a inferti lidade (OZKAN;MURK; ARICI, 2008). A doença Introdução 1 37 está presente em 25 a 40% das mulheres inférteis, sendo que 30 a 50% das portadoras de endometriose têm dificuldade em ter filhos (HOLOCH; LESSEY, 201 O). Até o presente momento, pouco é conhecido acerca dos mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade relacionada a esta doença, especialmente nos casos de endometriose mínima e leve, em que não se observam alterações significativas da anatomia pélvica. Novas abordagens terapêuticas ao problema da infertilidade relacionadas a esta afecção têm surgido, destacando-se a aplicação, cada vez mais rotineira, das técnicas de reprodução assistida (TRA) de alta complexidade. A introdução da fertilização in vitro (FIV) no tratamento da infertilidade secundária à endometriose tornou-se uma importante ferramenta para o estudo dos efeitos potenciais da endometriose em alguns estágios específicos do processo reprodutivo, incluindo a foliculogênese, a fertilização, o desenvolvimento embrionário e a implantação. Se por um lado há evidências de associação entre endometriose e infertilidade, por outro, encontramos resultados controversos acerca dos resultados da FIV em pacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos e hipóteses-nos--últimos anos�(GARCIA-VELASCO; ARICI, 1999; GARRIDO et ai., 2000; BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002; AL-FADHLI et ai., 2006; OPOIEN et ai., 2012; HARB et ai., 2013). Resultados conflitantes de alguns estudos têm sugerido a ocorrência de menores taxas de fertilização, implantação e/ou gestação em portadoras de endometriose (BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002; AL-FADHLI et ai., 2006; LIN et ai., 2012; HARB et ai., 2013), que poderiam ser decorrentes do comprometimento da qualidade oocitária e, conseqüentemente, embrionária, de defeitos endometriais e/ou anomalias da interação entre o endométrio e o embrião. Contudo, o achado de taxas de Introdução 1 38 implantação semelhantes as do grupo controle em ciclos de doação de oócitos de pacientes saudáveis para pacientes com endometriose (SUNG et ai., 1997; DIAZ et ai., 2000), tem reforçado o potencial papel crucial da piora da qualidade oocitária e, consequentemente embrionária, no comprometimento da implantação verificado neste grupo de pacientes (BRIZEK et ai., 1995; PELLICER et ai., 1995; GARRIDO et ai., 2000; PELLICER et ai., 2001; KATSOFF et ai., 2006). Alguns autores sugeriram alterações na qualidade do oócito como responsáveis pelo comprometimento (BRIZEK et ai., 1995; SUNG et ai., 1997; DIAZ et ai., 2000) ou completo bloqueio do desenvolvimento embrionário (PELLICER et ai., 1995), em mulheres com endometriose, quando comparadas a controles saudáveis, reforçando o papel da piora da qualidade oocitária nos resultados dos procedimentos de reprodução assistida nestas pacientes. Todavia, a maioria dos estudos que objetivaram avaliar a qualidade oocitária em pacientes com endometriose, utilizaram _apenas parâmetros indiretos, como a análise de fatores parácrinos múltiplos presentes no fluido folicular, avaliação de apoptose nas células da granulosa, análise do número e atividade dos leucócitos circunjacentes, entre outros (GARRIDO et ai., 2000; GARRIDO et ai., 2002). Estudos que--tenham avaliado a qualidade oocitária em portadoras de endometriose por meio da análise de critérios morfológicos mais objetivos são bastante escassos (BARCELOS et ai., 2008; BARCELOS et ai., 2009). Sabemos que embriões com habilidade para implantar e desenvolver adequadamente originam-se de oócitos de boa qualidade, que, por sua vez, são provenientes de folículos com um adequado meio ambiente, condicionado tanto pelo conteúdo do fluido folicular, como pela influência das células vizinhas, ressaltando­ se o papel crucial das células da granulosa murais e do Cumu/us oophorus (CC) na aquisição da competência oocitária (CANIPARI, 2000; FERREIRA et ai., 2009). O Introdução 1 39 microambiente folicular, que circunda os oócitos, pode ter um papel crítico na qualidade oocitária, fertilização e desenvolvimento embrionário. Há alguns dados associando hipoxigenação de folículos pré-ovulatórios com altas freqüências de defeitos citoplasmáticos oocitários, clivagem prejudicada e anormalidades na segregação cromossômica (VAN BLERKOM;ANTCZAK; SCHRADER, 1997). Como a redução do suprimento de oxigênio modifica diversas vias metabólicas, a peroxidação intensa poderia ser um dos processos envolvidos na geração desses danos (BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002; KUIVASAARI et ai., 2005), o que precisa ser mais extensamente investigado. O microambiente folicular tem um papel crucial na determinação da qualidade oocitária, que se reflete nas taxas de fertilização e na qualidade embrionária (WIENER-MEGNAZI et ai., 2004). Convém ressaltarmos que não dispomos de estudos que tenham avaliado os níveis fisiológicos de espécies reativas do oxigênio e de antioxidantes no fluido folicular de mulheres normais férteis em ciclos não estimulados com gonadotrofinas exógenas. Desta forma, não dispomos de dados acerca da potencial influência de níveis fisiológicos de ROS e antioxidantes no fluido folicular sobre a qualidade oocitária e, conseqüentemente, sobre a qualidade embrionária e o sucesso da gestação subseqüente. Os dados disponíveis acerca dos efeitos deletérios e/ ou benéficos das ROS sobre a qualidade oocitária, taxa de fertilização, qualidade embrionária e outros marcadores do sucesso das TRA são inconsistentes e conflitantes. Apesar de alguns autores terem recentemente demonstrado que elevados níveis de ROS no fluido folicular de mulheres inférteis submetidas a FIV/ TE associaram-se a redução do potencial de fertilização oocitário e aumento da produção de embriões de pior qualidade, existem dados controversos (DAS et ai., 2006; JANA et ai., 2010). Diversas variáveis podem justificar as Introdução 1 40 diferenças encontradas na literatura, entre elas os diferentes critérios de seleção das pacientes, os protocolos de estimulação ovariana utilizados, os diferentes marcadores e métodos utilizados para sua mensuração, características particulares dos diferentes laboratórios de FIV, entre tantos outros. Assim, certamente estudos com maiores casuísticas, metodologicamente bem delineados, serão cruciais para elucidarem o papel das ROS no fluido folicular na fisiologia reprodutiva e na etiopatogênese da infertilidade (PASQUALOTTO et ai., 2004; APPASAMY et ai., 2008; PASQUALOTTO et ai., 2009). A qualidade oocitária é decorrente de fatores correlacionados às competências citoplasmática e nuclear (ALBERTINI, 1992; FERREIRA et ai., 2009). Há evidências de que o estresse oxidativo possa promover comprometimento da qualidade oocitária, anomalias na meiose e no desenvolvimento embrionário pré­ implantação (LIU et ai., 2003; NAVARRO;LIU; KEEFE, 2004; AGARWAL et ai., 2006; NAVARRO et ai., 2006; MANSOUR et ai., 2009). Assim, hipotetizamos que a ocorrência de estresse oxidativo sistêmico e/ou no microambiente folicular de mulheres inférteis com endometriose submetidas a estimulação ovariana para procedimentos de reprodução assistida promova comprometimento da qualidade gamética e, consequentemente, do sucesso gestacional, estimulando a realização do presente estudo. Associadamente a isto, questionamos se o EO poderia favorecer o comprometimento da qualidade gamética também em ciclos naturais, participando da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. Questionamos, assim, a ocorrência de um possível papel do estresse oxidativo na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, particularmente associado à piora da qualidade oocitária, e, conseqüentemente, envolvido nas menores taxas de implantação e gestação observadas em portadoras Introdução 1 41 desta afecção submetidas a procedimentos de RA (BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002; LIN et ai., 2012; HARB et ai., 2013). Todavia, não encontramos estudos avaliando conjuntamente diferentes marcadores pró e antioxidantes no soro e fluido folicular (FF) de mulheres com infertilidade relacionada à endometriose e correlacionando-os aos resultados dos. procedimentos de reprodução assistida. Se confirmada a presença de estresse oxidativo, sistemicamente e/ou no microambiente folicular de mulheres inférteis com endometriose submetidas a estimulação ovariana para a realização de fertilização in vitro, este achado justificaria, pelo menos parcialmente, a piora da qualidade oocitária, contribuindo para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose e dos piores resultados de TRA nestas pacientes. Associadamente a isto, a avaliação do valor preditivo de diferentes marcadores de EO no sucesso das TRA, seria de grande valia para a determinação do prognóstico gestacional e para a fundamentação de novas estratégias terapêuticas a serem testadas em grupos selecionados de pacientes. 2. Justificativa Justificativa 1 43 Os mecanismos da infertilidade associada à endometriose permanecem pouco elucidados. Associadamente a isto, resultados conflitantes de alguns estudos têm sugerido a ocorrência de menores taxas de implantação e gestação em portadoras de endometriose submetidas à estimulação ovariana para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade, o que, poderia ser secundário, pelo menos parcialmente, à piora da qualidade oocitária. O EO parece participar da etiopatogênese da endometriose. Dados provenientes de estudos com diferentes modelos animais tem evidenciado que, por meio de mecanismos até o momento não completamente estabelecidos, o EO pode promover anomalias meióticas, comprometimento da qualidade oocitária e do desenvolvimento embrionário pré e pós-implantação. Questionamos assim um potencial papel do EO na etiopatogênese da infert1lidade relacionada à doença, relacionado ao comprometimento da qualidade oocitária. Todavia, não dispomos de estudos analisando conjuntamente diferentes marcadores estresse oxidativo no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose submetidas a EOC para procedimentos de reprodução assistida. Assim, com a finalidade de avaliar, de uma maneira conjunta, os principais marcadores pró-oxidantes (indicadores de produção de ROS e de dano oxidativo), propomos a análise do total de hidroperóxidos (FOX1), considerado um marcador de produção de ROS, além de produtos finais do dano oxidativo aos lipídios, proteínas e DNA, importantes alvos celulares da ação do estresse oxidativo, que, quando lesados, podem levar a comprometimento da função e viabilidade celulares. O MOA é um dos produtos finais da peroxidação lipídica e, por ser um produto estável, pode ser utilizado como medida cumulativa deste processo (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989; CAMPOS PETEAN et ai., 2008). A determinação dos grupos carbonil ou dos Justificativa 1 44 produtos avançados de oxidação proteica (AOPP) permite uma estimativa da oxidação protéica (WITKO-SARSAT et ai., 1996). A quantificação da 8-hydroxi-2'­ deoxiguanosina (8hOG), um nucleosídio modificado, possibilita a análise do dano oxidativo ao ONA (EVANS;DIZDAROGLU; COOKE, 2004). Ao mesmo tempo, propomos avaliar antioxidantes não enzimáticos (GSH e vitamina E), um importante antioxidante enzimático (SOO), além da capacidade antioxidante total (CAT). A glutationa é um importante antioxidante não enzimático, potencialmente envolvido na aquisição de competência oocitária para o desenvolvimento. Em contrapartida, a vitamina E, sobretudo na forma de a-tocoferol, pode tanto bloquear o início da peroxidação lipídica (PL), como inibir, primariamente, a etapa de propagação da PL, sendo conhecida como um eficiente antioxidante (BORNODEN, 1994). A atividade de SOO está presente no fluido folicular pré-ovulatório em níveis mais altos que no soro e parece conferir proteção contra o dano oxidativo oocitário (TATEMOTO et ai., 2004). Uma das conseqüências observadas em camundongos com deficiência de SOD1 é a infertilidade, sugerindo um potencial papel desta enzima na fertilidade feminina. A SOD2 é induzida sob várias condições de estresse oxidativo em processos inflamatórios (FUJll;IUCHI; OKAOA, 2005). A CAT, por sua vez, tem sido utilizada com a finalidade de se avaliar o balanço antioxidante total, que é resultante das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, permitindo uma avaliação global deste processo (EREL, 2004; COSTA;SANTOS; LIMA, 2006). A análise conjunta de todos estes marcadores permitirá uma avaliação global do balanço oxidante-antioxidante, tanto no soro no dia da captação oocitária, como no fluido folicular, de pacientes com infertilidade relacionada à endometriose submetidas à EOC para ICSI, possibilitando identificarmos a ocorrência ou não de estresse oxidativo relacionado à infertilidade em portadoras de endometriose, assim Justificativa 1 45 como a determinação de quais seriam os principais alvos do dano oxidativo nestas mulheres. Assim, se confirmada a presença de estresse oxidativo, sistemicamente e/ou no microambiente folicular de mulheres inférteis com endometriose submetidas a estimulação ovariana para a reatização de fertilização in vitro, este achado justificaria, pelo menos parcialmente, a piora da qualidade oocitária, contribuindo para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. Associadamente a isto, a avaliação do valor preditivo destes diferentes marcadores de EO na ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após a ICSI, seria de grande valia para a determinação do prognóstico gestacional e para a fundamentação de novas estratégias terapêuticas a serem testadas em grupos selecionados de pacientes. 3. Objetivos Objetivos 1 47 OBJETIVOS GERAIS 1. Comparar oito marcadores de estresse oxidativo, no soro do dia da captação oocitária e no fluido folicular, entre mulheres inférteis com e sem endometriose (infertilidade de causa tubária e/ou masculina) submetidas a EOC para ICSI. 2. Comparar oito marcadores de estresse oxidativo entre soro do dia da captação oocitária e fluido folicular intra-grupos (com endometriose e sem endometriose). 3. Avaliar o valor preditivo dos marcadores de estresse oxidativo analisados, no soro e no fluido folicular, na ocorrência de gestação clínica e de nascidos vivos de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à EOC para ICSI. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Comparar as concentrações séricas e foliculares de total de hidroperóxidos (FOX1), malondialdeído (MOA), produtos avançados de oxidação proteica (AOPPs), 8-hydroxi-2'-deoxiguanosina (8hOG), glutationa (GSH), vitamina E (Vit E), SOO (superóxido dismutase) e capacidade antioxidante total (CAT) de pacientes inférteis com e sem endometriose. 3. Comparar as concentrações séricas e foliculares de total de hidroperóxidos (FOX1), malondialdeído (MOA), produtos avançados de oxidação proteica (AOPPs), 8-hydroxi-2'-deoxiguanosina (8hOG), glutationa (GSH), vitamina E (Vit E), SOO (superóxido dismutase) e capacidade antioxidante total (CAT) entre soro do dia da Objetivos 1 48 captação oocitária e fluido folicular intra-grupos ( com endometriose e sem endometriose). 4. Avaliar o valor preditivo de total de hidroperóxidos (FOX1), malondialdeído (MOA), produtos avançados de oxidação proteica (AOPPs), 8-hydroxi-2'-deoxiguanosina (8hDG), glutationa (GSH), vitamina E (Vit E), SOO (superóxido dismutase) e capacidade antioxidante total (CAT) no soro e no fluido folicular, na ocorrência de gestação clínica de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à EOC para ICSI. 4. Pacientes e Métodos Pacientes e Métodos 1 50 Foi realizado um estudo transversal prospectivo que foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP)-SP, processo número 10187/2007. O estudo foi realizado junto ao Laboratório de Ginecologia - Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia - FMRP-USP, Laboratório de Nutrição e Metabolismo - Laboratório Multiusuário de Pesquisas da FMRP-USP e Laboratório de Biologia Molecular - Laboratório Multiusuário de Pesquisas da FMRP-USP, de outubro de 2009 a outubro de 2010. Pacientes a) Critérios de elegibilidade GRUPO CONTROLE: • Pacientes submetidas à estimulação ovariana para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide, indicada pela presença exclusivamente de fator masculino e/ou fator tubário (excluindo-se a presença de hidrossalpinge); • Ausência de quaisquer doenças pélvicas associadas à infertilidade, quando da realização da laparoscopia diagnóstica, utilizada como parte da propedêutica da investigação de infertilidade. GRUPO DE ESTUDO- Endometriose • Pacientes submetidas à estimulação ovariana para realização de ICSI, indicada pela presença exclusivamente de endometriose; • Diagnóstico de endometriose por videolaparoscopia realizada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, segundo os critérios definidos pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996, 1997); Pacientes e Métodos 1 51 • Ausência de tratamento clínico ou cirúrgico para a endometriose nos últimos seis meses. b) Critérios de elegibilidade para ambos os grupos • Idade < 38 anos; • FSH do terceiro dia do ciclo menstrual < 1 O mUl/mL; • IMC < 30 kg/m2 ; • Ausência de doenças como diabetes mellitus ou quaisquer outras endocrinopatias, doença cardiovascular, dislipidemia, lupus eritematoso sistêmico e outras doenças reumatológicas; • Ausência de infecção pelo vírus HIV ou qualquer infecção ativa; • Ausência de tabagismo ou o uso de medicações hormonais e antiinflamatórios hormonais e não hormonais e suplementos vitamínicos de qualquer natureza, nos últimos seis meses, previamente à programação para o procedimento de reprodução assistida. Casuística e Fluxograma do Estudo Como não dispúnhamos de dados na literatura relativos ao desvio padrão das diferentes variáveis a serem estudadas, não foi possível a determinação do dimensionamento amostral previamente ao início do estudo. Desta forma, realizamos inicialmente um estudo piloto, incluindo todas as pacientes elegíveis para o estudo que aceitaram participar do mesmo, no período compreendido entre outubro de 2009 a outubro de 201 O. Pacientes e Métodos 1 52 De outubro de 2009 a outubro de 201 O, 275 pacientes participaram do Programa de Reprodução Assistida do Hospital Universitário da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e foram submetidas à estimulação ovariana para ICSI. Destas, 124 não foram elegíveis para o estudo. As 151 pacientes elegíveis (76 do grupo controle e 75 do grupo endometriose) foram entrevistadas e 132 assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (65 do grupo controle e 67 do grupo endometriose). Trinta e três das 132 pacientes não foram submetidas à captação de oócitos. Das 99 que captaram oócitos, foram obtidas amostras de sangue de 50 pacientes sem endometriose e 49 com endometriose e FF de 32 pacientes sem endometriose e 35 com endometriose. Oitenta e sete amostras de soro (43 com E e 44 sem E) e 61 amostras (FF 29 com E e 32 sem E) tiveram dados analisados no presente estudo (Figura 3). o ... e (IJ u (IJ a:: o'"' "' ::::, u e e (IJ E ::::, (IJ VI (IJ .!!! Avaliados para elegibilidade (n= 275) -1r- Não elegíveis (n= 124) Elegíveis (n= 151) Incluídos (n= 132) Incluídos no grupo endometriose (n= 67) Incluídos no grupo controle (n= 65) Soros doados 1(n= 49) 1 Analisados (n= 43) FF doados (n= 35) l Analisados (n= 29) Soros doados (n= 50) l Analisados (n=44) Figura 3. Fluxograma do Estudo FF doados (n= 32) Analisados (n= 32) Pacientes e Métodos 1 53 Protocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea Com o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de estimulação ovariana controlada utilizamos a programação da menstruação, que consiste em se administrar anticoncepcionais orais combinados diariamente, iniciados no período menstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto para o início da estimulação ovariana, suspendendo sua administração de tal forma que o início do sangramento menstrual coincida com a realização da ultrassonografia transvaginal (USTV) basal para se observar o padrão endometrial e afastar a presença de cistos ovarianos que possam interferir na resposta à administração das gonadotrofinas exógenas e na monitorização ultrassonográfica do crescimento folicular. O bloqueio hipofisário com GnRHa foi iniciado dez .dias antes do dia de realização da ultrassonografia transvaginal (USTV) basal (protocolo longo), no período vespertino, por meio da administração de acetato de leuprolide (Lupron®, Abott, Brasil; Reliser®, Serona, Brasil) na dose de 0,5mg/dia (1 O UI), por via subcutânea, que foi mantida durante todo o período de estimulação ovariana controlada até o dia da administração do hCGr (Ovidrel®, Serona, Brasil). A hiperestimulação ovariana controlada foi iniciada entre o segundo e o terceiro dia do ciclo menstrual. As pacientes receberam 150 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSHr) (Gonal-F®, Serona, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil), via intramuscular (IM), nos primeiros 6 dias da indução. A partir do sétimo dia da indução da ovulação, a dose foi ajustada de acordo com o crescimento folicular e a espessura endometrial, monitorados com USTV diariamente ou em dias alternados. Quando pelo menos dois folículos atingiram 18 mm de diâmetro médio, foi administrada 250 µg de hCGr (Ovidrel®, Serona, Brasil) às 22:00. A captação dos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCGr. Pacientes e Métodos 1 54 A suplementação da fase lútea foi realizada com progesterona natural micronizada (Utrogestan®, Enila, Brasil) por via oral na dose de 200mg, três vezes ao dia, a partir do dia da captação oocitária e mantida até a décima segunda semana da gestação, nas pacientes que engravidaram. Captação Oocitária e Denudamento Oocitário A captação dos oócitos foi realizada mediante prévia anestesia geral endovenosa com propofol (Diprivan®, Astra-Zeneca, Brasil), associado ao citrato de fentanil (Fentanil®, Janssen-Cilag, Brasil). A aspiração dos folículos por via endovaginal guiada por transdutor ultrassonográfico transvaginal, foi realizada utilizando-se uma agulha de lúmen simples padrão, com 300 mm de comprimento, 1, 1 mm de diâmetro interno, duplo bizel cortante, ranhurado nos dois centímetros terminais para uma maior ecogenicidade (Laboratório CCD, França), com pressão aspirativa artificial constante de 100 mmHg, por meio de bomba de sucção com controle eletrônico (Craft® Suction Pump, Rocket Medical, Inglaterra). Cada folículo, cujo FF foi utilizado neste estudo (critérios descritos a seguir), foi aspirado individualmente em tubos Falcon, previamente aquecidos a 37 ° C, não contendo meio de cultivo. Os demais folículos foram aspirados em pool, ou seja, foi realizada a aspiração do maior número possível de folículos em cada punção, observando-se o esvaziamento completo de cada folículo e puncionando-se o ovário o menor número de vezes possível. A punção foi realizada sob aspiração contínua, tomando­ se o cuidado de tirar a pressão durante a entrada e retirada da agulha na parede vaginal, para evitar aspiração de células vaginais. Os fluidos aspirados destes folículos (cujos FF não foram usados no presente estudo) foram coletados em tubos Pacientes e Métodos 1 55 de ensaio, previamente aquecidos a 37°C, contendo 1 mi de meio de cultivo HTF­ HEPES. Para a identificação e o isolamento dos coe, o material aspirado foi transferido para placas de Petri com 1 O cm de diâmetro, previamente aquecidas em platina térmica a 37ºC, não contendo meio de cultivo. Depois de identificados, os coe foram isolados do FF e colocados em placa separada. Os coe foram lavados cuidadosamente em meio de cultura HTF-HEPES (HTF, lrvine Scientific), para a remoção de sangue e debris. A seguir foram colocados em placas NUNC (Multidish 4 wells Nuclon, Delta SI), preenchidas com o meio de cultura HTF e cobertas com óleo mineral, e levados à incubadora em mistura gasosa de CO2 a 5%, sob condições ideais de temperatura (37ºC) e umidade (95%) por um período de 3 a 4 horas. Após este período, para realizarmos a remoção do cumulus oophorus e da carona radiata, os coe foram colocados em micro-gotas de 25µL de hialuronidase (H4272 tipo IV-S, Sigma), na diluição de 80 Ul/ml de HTF/HEPES (lrvine Scientific), por no máximo 30 segundos e, então, lavados 2 ou 3 vezes com o meio HTF modificado (HTF/HEPES, lrvine Scientific) suplementado com Soro Sintético Substituto (SSS) a 10%. A remoção mecânica dos-restos- celulares foi feita com o auxílio de uma pipeta de desnudação (stripper pipette 130 µm denuding pipette, Cook, Melbourne, Australia). Após a realização do desnudamento oocitário (remoção do cumu/us oophorus), realizamos a identificação do grau de maturidade dos oócitos, sob visualização ao estereomicroscópio invertido. Os oócitos imaturos (em estágio de vesícula germinativa ou metáfase 1) foram descartados e os oócitos maduros (caracterizados morfologicamente pela presença de um corpúsculo polar extruso) foram injetados como descrito a seguir. Pacientes e Métodos 1 56 ICSI, Taxas de Fertilização, Implantação, Gestação Clínica e Nascido Vivo Os oócitos maduros, caracterizados pela extrusão do CP, foram submetidos à ICSI 3 a 4 horas após a captação oocitária. Cerca de 16 a 18 horas após a ICSI foi avaliada a fertilização, caracterizada pela presença de 2 pró-nucleos e 2 corpúsculos polares (a taxa de fertilização corresponde ao número de oócitos fertilizados, divididos pelo número de oócitos injetados X 100). Cerca de 43 a 45 horas após a ICSI (segundo dia de desenvolvimento embrionário - D2) foi avaliada a qualidade embrionária (quanto ao número e simetria de blastõmeros, percentagem de fragmentação e presença ou não de multinucleação). Para os casos em que a transferência embrionária não ocorreu no DII, cerca de 67 a 69 horas após a ICSI (D3) foi realizada novamente a análise da qualidade embrionária. Foram considerados como embriões de boa qualidade em D2 os que apresentaram 4 blastômeros, simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação (The lstanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting, 2011). Foram considerados de boa qualidade no D3 os embriões com 8 blastõmeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação (The lstanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting, 2011). Realizou-se a transferência embrionária em D2 ou D3, de acordo com a individualização de cada caso. Quatorze dias após a transferência embrionária realizou-se a análise do 13-hCG sanguíneo, sendo considerada como gravidez química a presença de 13-hCG positivo (maior ou igual a 25 UI/mi). Avaliou-se a taxa de implantação, caracterizada pelo número de sacos gestacionais divididos pelo número de embriões transferidos X100 e a taxa de gravidez clínica por ciclo com Pacientes e Métodos 1 57 transferência, caracterizada pelo número de pacientes com embrião com batimento cardíaco visualizado ao USTV realizado 4 a 5 semanas após a transferência embrionária dividido pelo número de ciclos com transferência embrionária X 100. Foram avaliados também a quantidade total de FSH usado para estimulação ovariana, o número de dias de estimulação ovariana, a espessura endometrial no dia da captação, o número total de oócitos captados e maduros (com extrusão do primeiro CP), de embriões de boa qualidade e total de embriões produzidos e nascidos vivos. Amostras Obtidas e Processamento Sangue Para a coleta sanguínea foram utilizados tubos estéreis, a vácuo, com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), para coleta de 5 ml de sangue venoso das pacientes no dia da captação oocitária. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 1 O minutos e o soro foi armazenado a - 80ºC, dividido em quatro alíquotas, para posterior análise. As amostras de soro armazenadas foram posteriormente encaminhadas para o Laboratório de Nutrição da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, onde foram dosados os marcadores de estresse oxidativo descritos a seguir. Todas as dosagens foram realizadas em duplicata, no mesmo momento, pelo mesmo técnico, com experiência comprovada nas metodologias empregadas. O responsável técnico pelas dosagens não teve acesso aos dados clínicos das pacientes, não conhecendo o grupo ao qual pertenciam as mesmas. Pacientes e Métodos 1 58 Fluido Folicular Cerca de 34 a 36 horas após a administração do hCG, as pacientes foram submetidas à captação oocitária, sob sedação endovenosa com propofol e fentanil. A aspiração folicular foi reàlizada por meio de USTV com transdutor transvaginal de 5 MHz, acoplado a guia de punção. Foi aspirado todo o conteúdo do primeiro folículo com diâmetro médio ;;;:: 15 mm do primeiro ovário puncionado, em um tubo previamente aquecido a 37ºC. Apenas os FF livres de contaminação sanguínea à inspeção visual (LEVAY et ai., 1997) e que apresentaram células da granulosa (CG) ou células da granulosa e um oócito maduro captado foram considerados adequados para análise. Cada amostra de FF adequado foi centrifugada a 300 g por 7 minutos, para remover os componentes celulares, e estocada a - B0ºC, aliquotada em 2 ou 3 criotubos, para posterior análise. As amostras dos FF armazenadas foram posteriormente encaminhadas para o Laboratório de Nutrição da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, onde foram dosados os marcadores de estresse oxidativo descritos a seguir. Todas as dosagens foram realizadas em duplicata, no mesmo momento, pelo mesmo técnico, com experiência comprovada nas metodologias empregadas. O responsável técnico pelas dosagens não teve acesso aos dados clínicos das pacientes, não conhecendo o grupo ao qual pertenciam as mesmas. Metodologias 1. Determinação da concentração total de hidroperóxidos (FOX1} A concentração total de peróxidos foi determinada pelo método FOX1 (GALLI et ai., 2005). O sistema de teste FOX1 é baseado na oxidação do Fe+2 (íon ferroso) a Pacientes e Métodos 1 59 Fe+3 (íon férrico) por vários tipos de peróxidos contidos nas amostras analisadas. Na presença de xylenol orange forma-se um complexo colorido (xylenol orange-férrico) de cor azul púrpura, cuja absorbância pode ser medida (COSTA;SANTOS; LIMA, 2006). Neste método utiliza-se uma substância preparada no dia da leitura (o reagente FOX1). A solução 1 é preparada com 7,6mg de xylenol orange e 88mg de BHT (butil-hidroxitolueno ) em 90ml de metanol . A solução 2 é preparada com 9,8mg de sulfato ferroso em 10 ml de ácido sulfúrico 250mM (O, 13ml de ácido sulfúrico em 10ml de água). As duas soluções devem ser misturadas em concentração 9:1 somente no dia da leitura. Para a análise são necessários 100µL de soro ou fluido, 1 00µL de água (para o branco) e 1 ml da solução, que reagem por 30 minutos ao abrigo da luz à temperatura ambiente. Após este período, centrifuga-se por 5 minutos a 3500 rpm e a absorbância do sobrenadante é medida em 560nm. A curva foi realizada com H202 em concentrações de 1 O a 200µM. O resultado foi expresso em µmol/g proteína. 2. Mensuração da concentração de malondialdeído (MDA) O soro e o fluido folicular, previamente estocados, foram descongelados até atingir 37°C. Cerca de 1 ml de cada amostra foi misturado com 2 mi de TCA-TBA­ HCL (15% de ácido tricloracético, 0,375 % de ácido tiobarbitúrico e 0,25 N de ácido clorídrico) e aquecido em banho-maria por 15 minutos. Após resfriamento, o precipitado foi centrifugado em 1.000g por 10 min. A absorbância do produto foi medida em espectofotômetro (Spectronic 601-Milto Roy) com comprimento de onda de 535 nm. O cálculo da concentração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi realizado considerando-se o coeficiente de absortividade Pacientes e Métodos 1 60 molar do produto (E535=1,56 x 1 O -5 M - 1 cm -1), sendo os resultados expressos em nmol de malondialdeído /litro. Uma curva padrão foi realizada, utilizando-se uma solução estoque de malondialdeído a 1 O mM, preparada a partir do tetrametoxipropano (SIGMA), sendo que as concentrações encontradas nas amostras apresentaram-se dentro desta curva, mostrando uma boa linearidade com o padrão. O resultado foi expresso em nmol MDA/g proteína. 3. Determinação da concentração dos produtos avançados de oxidação protéica (AOPPs) Os produtos de oxidação protéica presentes no soro e FF foram determinados pelo método descrito por WITKO-SARSAT et ai. (1996), conforme sumarizado a seguir. Uma amostra de 40 µL de soro ou FF foi misturada a 160 µL de PBS (tampão fosfato salino) e 20 µL de ácido acético glacial (ultra puro). A leitura da absorbância foi realizada com comprimento de onda de 340 DM. A curva para a realização desta leitura foi feita com o uso de cloramina T (curva de 10 a 100 mM) e iodeto de potássio (1,16 M), misturando-se 200 µL dos padrões a 10 µL de iodeto de potássio e 20 µL de ácido acético e agitando a placa por 6 minutos antes da leitura. O resultado final foi expresso em µmol/L. 4. Determinação da 8-Hidroxi 2 deoxiguanosina (8-0HdG) A determinação e a quantificação da 8-hidroxi- 2- deoxiguanosina (8-OHdG) será realizada pelo método de ELISA (Stressgen® DNA Damage ELISA Kit, Ann Arbor, MI), seguindo as recomendações do fabricante, sumarizadas a seguir. Pacientes e Métodos 1 61 Previamente à detecção, as amostras de soro ou fluido devem ser diluídas em um diluente específico do Kit em concen tração 1 :20 (v/v), devendo ser preparado no mínimo 150 µL desta solução (amostra diluída) para que a detecção possa ser realizada em duplicata. Durante a preparação dos reagentes, a amostra diluída permanece em temperatura ambiente. A curva de calibração é feita com padrão conhecido de 8-OHdG nas concentrações de 0,94 ng/ml a 1 O ng/ml. Para o procedimento, em uma placa previamente sensibilizada com anticorpos anti-8- OHdG, adiciona-se 50µL das amostras e dos padrões em cada poço, realiza-se uma primeira lavagem da placa e a seguir adiciona-se 50 µL de anticorpo anti-8OHdG previamente diluído em cada poço, exceto no branco. Após incubação à temperatura ambiente por 1 hora, realizam-se 6 lavagens da placa com solução tampão. Adiciona-se 100 µL do conjugado HRP - anti-lgG de camundongo a cada poço, exceto no branco e incuba-se por mais 1 hora à temperatura ambiente. Após mais uma lavagem, adiciona-se 100µL do substrato TMB em cada poço, incuba-se por 10 minutos no escuro e adiciona-se 1 00µL da solução de parada. A cor obtida é estável por 30 minutos e a absorbância é medida em 450 nm. A intensidade da cor amarela é inversamente proporcional a concentração de 8-OHdG expressa em ng/ml. 5. Determinação da concentração de vitamina E (Vit E) A determinação da concentração de Vit E ( a.-tocoferol) no soro e no FF foi realizada segundo o método descrito por ARNAUD et ai. (1991), como detalhado a seguir. Uma amostra de 0,5 ml de soro ou FF foi homogeneizada em 2,0 ml de etanol. Em seguida foi colocada em 1,0 ml de n-hexano e agitada por 2 min. Uma alíquota de 0,5 ml do sobrenadante (n-hexano) foi pipetada, cuidadosamente, em tubo de ensaio seco Pacientes e Métodos 1 62 em nitrogênio, ressuspensa em 0,5 ml de fase móvel, composta por acetonitrila/ diclorometanol/ metanol (70:10:20, v/v/v) e filtrada. Uma quantidade de 100 µL foi injetada na HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e a leitura efetuada como descrito a seguir. Para a determinação das concentrações da Vit E foi utilizado um HPLC modelo Shimadzu LC-9\ usando uma coluna tipo C-18 (Simpack CLC-O0S 4,6 x 25 cm), uma pré-coluna de 4 mm x 1 cm, com fluxo de 2 mUmin. A leitura foi realizada por espectofotometria com um detector UVNis a 292 nm. O equipamento foi calibrado com soluções padrões de a-tocoferol (SIGMA), nas concentrações de 1 O, 20 e 200 µmol/L. Antes de cada leitura foi injetada uma solução padrão de a-tocoferol na concentração de 20 µmol/L. O equipamento foi programado para que os resultados fossem expressos em µmol/L para o soro e FF. 6. Determinação da concentração de glutationa (GSH) - concentração total de grupos tióis ou sulfidrilas A GSH do soro e FF foi medida por um método descrito originalmente por ELLMAN (1959) e modificado por HU (1994), no qual os grupos tióis interagem com o ácido ditionitrobenzóico (DTNB) formando um ânion altamente colorido com um pico máximo a 412 DM (e412 = 13,600M-1cm-1)_ Nesse ensaio, uma alíquota de 25 µL de soro ou fluido é misturada a 1 ml de tris-EDTA buffer (25 nmol/L Tris-base, 20 mmol/L EDTA, pH 8,2) e a leitura da absorbância é realizada em um comprimento de onda de 412 DM. Após esta leitura, uma alíquota de 25 µL de solução estoque de DTNB (10 nmol/L em etanol absoluto) é adicionada à solução, que é mantida a temperatura ambiente durante 15 minutos. Após este período, nova leitura é realizada utilizando como branco o DTNB (COSTA;SANTOS; LIMA, 2006). A Pacientes e Métodos 1 63 concentração de grupos sulfidril foi calculada utilizando-se a glutationa reduzida e o resultado foi expresso em nmol/g proteína. 7. Determinação da Superóxido Dismutase (SOD) A SOO foi avaliada seguindo o protocolo do Kit Frutosamina da Labtest Diagnóstica S.A. modificado. Para a dosagem com inibição foram preparados dois tubos eppendorfs, no primeiro tubo foi colocado 50 µI de fluido, 50 µI de HCL a 2N e incubado por dois minutos a temperatura de 37°C, em seguida adicionou-se 100 µI de Na OH 1 M. No segundo tubo foi colocado 500 µI de reagente do kit e incubado por dois minutos a temperatura de 37 °C, depois foi adicionado 100 µI da solução do primeiro tubo e incubada por to minutos a temperatura de 37 °. Os dois tubos foram lidos separadamente em 530nm, sendo lido o primeiro e cinco minutos depois o segundo tubo. Para a dosagem sem inibição foi feito um tubo eppendorf onde foi colocado 500 µI de reagente do kit e incubado por dois minutos a temperatura de 37C, logo em seguida foi adicionado 25 µI da amostra, mais 25 µIde HCL a 2N e 50 µ! de NaOH a 1 M, essa mistura foi homogeneizada e incubada a temperatura de 37°C por dez minutos e foi realizada a leitura. Os cálculos foram: sem inibição=A2-A 1 (S); com inibição=A2-A 1 (C); %inibição=(CX100)/S; U/mL =(%inibiçãoX500)/(%inibição do padrão). 8. Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) A CAT do soro e fluido folicular foi medida por um método baseado na 2, 2- azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato (ABTS) (EREL, 2004; COSTA;SANTOS; LIMA, Pacientes e Métodos 1 64 2006). Nesse ensaio, ATBS é incubada com potássio persulfato para produzir a oxidação do ATBS. Em resumo, uma amostra de 10 mg de ATBS será dissolvida em 1 O ml de uma solução aquosa contendo 2,5 mmol/L de persulfato de potássio. Esta solução será deixada no escuro em temperatura ambiente, de uma a quatro horas, antes de ser usada. Para o estudo das amostras, a solução de estoque ATBS oxidada será diluída em água deionizada em absorvância de 0,70 a 734 m. Cerca de 1 O minutos após a adição de 1 ml de ABTS oxidado diluído em 1 O µL de soro ou fluido folicular, será realizada a leitura da absorvância. A CAT foi calculada utilizando Trolox® (OXIS lnternational lnc., USA) como padrão e o resultado será expresso em mEq Trolox® /L. 9. Determinação de Proteínas Totais (MDA, GSH e FOX são expressos por g proteína) As determinações de proteínas nas amostras de soro e FF foram realizadas pelo kit Proteínas Totais Labtest®. O princípio dessa metodologia está na reação entre- o íon cobre do reagente biureto, que reage em contato com as ligações peptídicas da proteína, produzindo uma cor púrpura, que deve ser lida a 540rim no espectrofotômetro. Análise Estatística Foi realizada uma análise descritiva a fim de caracterizar a amostra estudada. Para comparação das variáveis idade, peso, estatura, IMC, FSH basal, total de FSH usado, número de dias de indução, endométrio e número de oócitos captados entre Pacientes e Métodos 1 65 os grupos foi aplicado o Teste t. As variáveis número de oócitos maduros, taxa de fertilização, número de embriões de boa qualidade, total de embriões formados, número de embriões transferidos e taxa de implantação foram comparadas entre os grupos através do teste de Mann-Whitney. O teste Exato de Fisher foi utilizado para comparar as taxas de gestação clínica e de nascidos vivos entre os grupos. Para as comparações dos marcadores entre os grupos e os compartimentos sérico e folicular, foi aplicado o modelo de regressão linear com efeitos mistos (efeitos aleatórios e fixos) e o pós-teste por contrastes ortogonais. Para estas análises foram utilizados a PROC MEANS e PROC MIXED do programa estatístico SAS® 9.0. Para as análises de valor de corte, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia, foram realizadas Curvas ROC, através do software R. Para definir os marcadores adequados para predição de gestação clínica e nascidos vivos, foram selecionados aqueles com área sob a curva (AUC) maior ou igual a 70% e, para estes, foram determinados os valores de corte que apresentaram maior sensibilidade e acurácia para predizer gestação clínica e nascidos vivos. Foi considerado o nível de significância de 5% (p<0,05). 5. Resultados Resultados 1 67 5.1. Variáveis clínicas, resposta à estimulação ovariana e resultados de ICSI em pacientes inférteis com e sem endometriose Não observamos diferença significativa entre os grupos avaliados com relação à média de idade, peso, estatura, FSH basal, dose total de FSH usada, duração da EOC, espessura endometrial no dia da transferência embrionária, número de oócitos captados e maduros, número de embriões de boa qualidade, total de embriões formados e número de embriões transferidos (Tabela 1 ). Tambem não se evidenciou diferença entre as taxas de fertilização, implantação, gestação clínica e nascidos vivos entre os grupos (Tabela 1 ). Tabela 1. Variáveis clínicas, resposta à estimulação ovariana e resultados de ICSI em pacientes inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada. Variável Com Endometriose n = 43 DP Sem Endometriose N =45 DP p Idade 32,91 3,33 33,04 4,49 0,87 Peso 62,01 9,76 63,64 11,26 0,53 Estatura 1,62 0,07 1,62 0,07 0,92 IMC 23,75 3, 18 24, 11 3,51 0,66 FSH basal 5,83 2,71 5,41 1,92 0,41 Total de FSH usado 2070,51 714,85 2092,21 838,73 0,90 Número de dias de indução 8,98 1,75 8,53 1,98 0,28 Endométrio (mm) 10,53 1,67 1 O, 73 2,57 0,67 Número de oócitos captados 7,53 5,28 5,82 3,6 0,08 Número de oócitos maduros 5,52 3,58 4,44 3,08 O, 13 Taxa de Fertilização (%) 7 4,49 24,32 80,9 23,08 O, 15 Número de embriões boa qualidade 1,71 1,03 1,57 1,05 0,75 Número total de embriões formados 2,64 1,23 2,38 1,09 0,39 Número de embriões transferidos 1,88 0,63 1,89 0,75 0,99 Taxa de implantação(%) 68,62 24,21 79,51 23,71 0,20 Taxa de gestação clínica(%)* 18/40 (45%) 13/42 (30,95%) 0,26 Taxa de nascidos vivos* 11 /40 (27,5%) 10/42 (23,8%) 0,81 Nota: Dados apresentados como média ± desvio padrão (DP). Taxa de fertilização: número de oócitos fertilizados dividido pelo número de oócitos injetados X 100; taxa de implantação: número de sacos gestacionais dividido pelo número de embriões transferidos X100; taxa de gestação clínica: número de ciclos com presença de pelo menos 1 embrião com batimento cardíaco visível ao US realizado 4 a 5 semanas após a transferência embrionária X100; taxa de nascidos vivos: número de ciclos com nascidos vivos dividido pelo número de ciclos com transferência embrionária X 100. Dados analisados pelo Test t ou teste de Mann­ Whitney. *Dados analisados pelo Teste exato de Fisher. Nível de significância de 5% (p<0,05). Resultados 1 68 5.2. Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de pacientes inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada para ICSI, no dia da captação oocitária No soro, o grupo com endometriose apresentou maiores concentrações de GSH (p=0,03) e SOO (p=0,02) e menores de CAT (p<0,01) comparado ao sem endometriose. Além disso, foi observada uma tendência a maiores concentrações de FOX1 no grupo endometriose, comparado ao sem endometriose (p=0,05; Tabela 2). No fluido folicular, o grupo com endometriose apresentou maiores concentrações de 8OHdG (p<0,01) e Vit E (p=0,03) comparado ao grupo sem endometriose (Tabela 2). As comparações entre as concentrações séricas e foliculares dos oito marcadores de estresse oxidativo intra-grupos também estão apresentadas na Tabela 2. No grupo com endometriose, observaram-se maiores concentrações de FOX1 (p<0,01), AOPP (p=0,03), Vit E (p<0,01) e SOO (p<0,01) e menores concentrações de 8OHdG, GSH e CAT (p<0,01) no soro do que no FF. Já no grupo sem endometriose, foram encontradas-maiores-concentrações de FOX1 (p<0,01), Vit E (p<0,01) e SOO (p=0,02) e menores concentrações de GSH (p<0,01) no soro do que no FF (Tabela 2). Resultados 1 69 Tabela 2. Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada com gonadotrofinas no dia da captação oocitária. Marcador FOX1 MOA AOPP Soro 80HdG FF GSH Vit E soo CAT MOA AOPP 80HdG GSH Vit E soo CAT Com Endometriose 8,30ª 18,55 133,50b 17,00C 220,32d 23,77e 677,9d 0,34g 5,72ª 20,44 97,19b 23,19c 276,9i 13,10· 504,931 Sem DP DP p Endometriose 12,66 17,97 11,25 0,05 0,75 0,50 0,14 0,03 7�68 12L69 6�24 4,62 43,2 6,93 282,21 0,17 1,11 4,86 47,04 6,8 70,94 5,33 108,39 0,08 18,98 193,92b 21,18c 563,04d 0,46 5,85ª 20,64 104,61 17,22 265,66b 8,71c 435,44d 0,48 6,74 43,25 7,01 0,06 169,82 0,02 0,15 <0,01 0,74 0,71 4,81 0,93 39,43 0,35 5,6 71,66 2,51 181,07 0,11 <0,01 0,47 0,03 0,27 0,55 Poder do teste 0,37 0,06 0,05 0,26 0,81 0,37 0,44 0,88 0,05 0,05 0,05 0,69 0,09 0,68 0,24 0,10 Nota: Grupo com endometriose: soro n=43; fluido folicular (FF) n=29. Grupo sem endometriose: soro n=44; FF n = 32. FOX 1 : total de hidroperóxidos, expresso em µmol/g proteína; MOA: malondialdeído, expresso em nmol/g proteína; AOPP: produtos avançados de oxidação proteica, expressos em µmol/L; 8OHdG: 8-hidroxideoxiguanosina, expresso em ng/ml; GSH: glutationa reduzida, expressa em nmol/g proteína; Vit E: vitamina E, expressa em µmol/L; SOO: superóxido dismutase, expressa em U/ml; CAT: capacidade antioxidante total, expressa em mEq Trolox/L. Dados apresentados como média ± desvio padrão (DP). p: valores de p para as comparações inter-grupos. Mesmos superescritos na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre soro e fluido folicular em cada grupo. Dados analisados com o modelo de regressão linear com efeitos mistos (efeitos aleatórios e fixos) e pós-teste por contrastes ortogonais. Nível de significância de 5% (p<0,05). Resultados 1 70 5.3. Análise das curvas ROC Foram realizadas curvas ROC e calculadas a área sob a curva (AUC) para todos os marcadores analisados no soro e FF nos grupos com e sem endometriose. Consideramos como marcadores adequados para discriminação de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos aqueles AUC ;:: 70%. Na tabela 3 estão apresentados a AUC, valores de corte, sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo e acurácia apenas dos marcadores de EO considerados adequados preditores de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI nos grupos com e sem endometriose. No grupo com endometriose, nenhum marcador de EO foi identificado como bom preditor sérico de ocorrência de gestação clínica e de nascidos vivos. No FF deste grupo, a 8OHdG foi o único marcador que se apresentou como adequado preditor de ocorrência de gestação clínica (AUC = 87,5%) (Figura 4A; Tabela 3). Concentrações foliculares de 8OHdG de 28,02 ng/ml apresentaram discriminação máxima de ocorrência de gestação clínica (sensibilidade de 87,5%, especificidade de 100% e acurácia de 89%) (Figura 4A; Tabela 3). O único marcador no FF que apresentou área sob a curva 2:: 70% para discriminar a ocorrência de nascidos vivos foi a CAT (AUC = 74,26%). Níveis foliculares de CAT de 0,53 mEq Trolox/L apresentaram discriminação máxima de ocorrência de nascidos vivos, com sensibilidade de 100%, especificidade de 52,94% e acurácia de 62%. (Figura 4B; Tabela 3). No grupo sem endometriose, a 8OHdG foi o único marcador considerado adequado preditor sérico de ocorrência de gestação clínica (AUC = 74,03%; Figura 4C; Tabela 3) e de nascidos vivos (AUC = 81,82%; Figura 4D; Tabela 3). Para Resultados 1 71 predizer gestação clínica, valores séricos de 8OHdG de 15,59 ng/ml apresentaram sensibilidade de 78,57%, especificidade de 54,55% e acurácia de 72% (Figura 4C; Tabela 3). Já para predizer nascidos vivos, valores séricos de 8OHdG de 18, 11 ng/ml apresentaram sensibilidade de 81,82%, especificidade de 67,86% e acurácia de 72% (Figura 4D; Tabela 3). Dos marcadores avaliados no FF do grupo sem endometriose, a GSH foi o único considerado adequado preditor de ocorrência de gestação clínica (AUC = 72,05; Figura 4E; Tabela 3) e de nascidos vivos (AUC = 72,05; Figura 4F; Tabela 3). Concentrações foliculares de GSH de 277,25 nmol/g proteína apresentaram discriminação máxima de ocorrência de gestação clínica (sensibilidade de 73,91%, especificidade de 85,71% e acurácia de 77%) e de nascidos vivos (sensibilidade de 85,71 %, especificidade de 73,91 % e acurácia de 77%) (Figuras 4E e 4F; Tabela 3). Resultadas 1 72 Tabela 3. Área sob a curva (AUC), valores de corte, sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo e acurac1a dos marcadores de estresse oxidativo dosados no soro do dia da captação oocitária e fluido folicular de pacientes inférteis sem endometriose e com endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada, considerados adequados preditores de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI. Variável Cut Acurácia Grupo Amostra Marcador AUC Sensibilidade Especificidade VPP VPN analisada off Gestação Clínica 8OHdG 87,50 28,02 87,50 100,00 100,00 50,00 0,89 Endometriose FF Nascidos CAT 74,26 0,53 vivos 100,00 52,94 33,33 100,00 0,62 - Gestação Clínica 8OHdG 74,03 15,59 78,57 54,55 81,48 50,00 0,72 Soro Nascidos 0,72 8OHdG 74,03 18,11 81,82 67,86 50,00 90,48 Vivos Controle Gestação Clínica GSH 72,05 277,25 73,91 85,71 94,44 50,00 0,77 FF Nascidos GSH 72,05 277,25 Vivos 85,71 73,91 50,00 94,44 0,77 Nota: 8OHdG: 8-hidroxideoxiguanosina, expressa em ng/ml; GSH: glutationa reduzida, expressa em nmol/g proteína; CAT: capacidade antioxidante total, expressa em mEq Trolox/L; FF: fluido folicular; AUC: área sob a curva; VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo. Considerou-se como adequado preditor de gestação clínica e nascidos vivos o marcador com AUC;;: 70. Resultados 1 73 Figura 4. Curvas ROC das medidas das concentrações de marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular (FF) considerados adequados discriminadores (Área sob a curva - AUC � 70) de ocorrência de gestação clínica (GC) e nascidos vivos (NV) após ICSI para pacientes com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana. 8OHdG: 8-hidroxideoxiguanosina, expressa em ng/ml; GSH: glutationa reduzida, expressa em nmol/g proteína; CAT: capacidade antioxidante total, expressa em mEq Trolox/L. A) e B): grupo com endometriose; C), D), E) e F): grupo sem endometriose. A) 8OHdG no FF como preditor de GC 100 80 Sensibilidade: 87,5% Especificidade: 100% Cut off: 28,02 1 ASC(IC95%)= 87.5 {NaN; NaN) 60 40 20 Especificidade(%) C) 8OHdG no soro como preditor de GC o o 100 �---' Sensibilidade: 78,57% Especificidade: 54,55% Cut off: 15,59 ASC(IC95%)= 74.03 (58 .73; 89.32) 80 60 40 20 Especificidade(%) E) GSH no FF como preditor de GC 100 ..----� Sensibilidade: 73,91% Especificidade: 85, 71% Cut off: 277,25 ASC (IC 95%) = 72.05 ( 48.53 : 95.57) 80 60 40 20 Especificidade(%) B) CAT no soro como preditor de NV. o N 100 80 60 Sensibilidade: 100% Especificidade: 52,94% Cut off: 0,53 ASC OC 95%)= 7426 ('7 .35: 100) 40 20 Especlflctdade (%) D) 8OHdG no soro como preditor de NV. 100 80 Sensibilidade: 81,82% Especificidade: 67,86% Cut off: 18,11 ASC OC 95%) = 7'.03 ( 58.73 : 89 32) 60 'º 20 Especificidade(%) F) GSH no FF como preditor de NV. o o 100 80 Sensibilidade: 85, 71% Especificidade: 73,91% Cut off: 277,25 ASC (IC 95%) = 72.05 ( 48.53 ; 95.57) 60 'º 20 Especincidade (%) 6. Discussão Discussão 1 75 Os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose ainda não foram completamente elucidados (HOLOCH; LESSEY, 201 O). Entretanto, alguns autores apontam a possibilidade da endometriose ser uma doença relacionada ao EO (AGARWAL;SALEH; BEDAIWY, 2003; SZCZEPANSKA et ai., 2003; GUPTA et ai., 2008). Questionamos, assim, o papel do EO na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, particularmente associado à piora da qualidade oocitária, o que poderia estar envolvido no comprometimento da fertilidade natural e, também, nas controversas menores taxas de implantação e/ou gestação observadas em portadoras desta afecção submetidas a FIV (BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002; HARB et ai., 2013). Todavia, não encontramos estudos avaliando conjuntamente diferentes marcadores pró e antioxidantes no soro e FF de mulheres com infertilidade relacionada à endometriose, e avaliando seu papel nos resultados da FIV e ICSI. Diante disso e da importância em se fundamentar novas abordagens passíveis de melhorar a fertilidade natural e otimizar os resultados dos procedimentos de reprodução assistida nestas pacientes, o presente estudo comparou os níveis de oito marcadores de EO (FOX 1, MOA, AOPP, 8OHdG, GSH, Vit E, SOO e CAT) no soro do dia da captação oocitária e no FF de mulheres inférteis com e sem endometriose (infertilidade de causa tubária e/ou masculina) submetidas à EOC para ICSI. Além disso, foi avaliado o possível papel destes marcadores no soro e no FF nos dois principais resultados da ICSI (gestação clínica e nascidos vivos) nos dois grupos. Demonstramos maiores níveis de GSH e SOO e menores níveis da CAT no soro do grupo com endometriose, sugerindo a ocorrência de EO sistêmico em pacientes inférteis com a doença, corroborando estudos de LAMBRINOUOAKI et ai. (2009), BORDIN et ai. (201 O) e ANDRADE et ai. (201 O) que associam a Discussão 1 76 endometriose ao EO sistêmico, analisando outros marcadores de EO distintos dos aqui avaliados. O aumento de GSH e SOO sugere haver uma mobilização do sistema antioxidante sérico na tentativa de neutralizar o prévio aumento de agentes pro-oxidantes, sugerido _neste estudo pela tendência a maiores níveis de FOX1 circulantes, uma vez que este marcador, quando elevado, é indicador de maior produção de espécies reativas (MIER-CABRERA et ai., 2008). O único estudo na literatura que analisou o total de hidroperóxidos no soro de portadoras de infertilidade relacionada à endometriose foi publicado pelo nosso grupo (ANDRADE et ai., 2010), analisando este marcador na fase folicular precoce do ciclo natural, com achados similares aos aqui apresentados analisando amostras séricas obtidas após EOC, no dia da captação oocitária. Os menores níveis da CAT indicam consumo de outros antioxidantes presentes, culminando com diminuição da capacidade antioxidante total no compartimento sérico. A GSH, por ter importante papel na neutralização do peróxido de hidrogênio e dos peróxidos orgânicos, estes produzidos abundantemente em processos inflamatórios (EL-SHAHAT; KANDIL, 2012), pode indicar uma resposta antioxidante sistêmica frente às reações inflamatórias provocadas pelos implantes endometriais ectópicos (GUPTA et ai., 2008). Entretanto, contrariamente aos presentes achados, JANA et ai. (2013) encontraram menores níveis de GSH em soro de mulheres com endometriose comparadas a controles. Da mesma forma, os maiores níveis de SOO no soro de mulheres com endometriose evidenciados no presente estudo contrariam os resultados de JANA et ai. (2013) e também os de PRIETO et ai. (2012), que observaram menores níveis deste marcador no grupo com endometriose. No entanto, o trabalho de Jana e colaboradores foi realizado com amostras coletadas na fase folicular precoce do ciclo menstrual (JANA et ai., 2013), diferentemente do Discussão 1 77 presente estudo, em que as amostras sanguíneas foram coletadas no dia da captação oocitária, o que dificulta a comparação dos dados e pode justificar as discrepâncias encontradas, uma vez que a EOC parece promover aumento da SOO em mulheres submetidas a FIV ou IUJ (YOUNIS et ai., 2012). PRIETO et ai. (2012), por sua vez, avaliaram apenas pacientes com endometriose moderada e grave, sendo que o avanço no estadiamento da doença pode estar relacionado à ocorrência de estresse oxidativo mais pronunciado (JACKSON et ai., 2005), com maior consumo de antioxidantes. Os menores níveis da CAT encontrados no presente estudo corroboram os achados de JANA et ai. (2013) e de SZCZEPANSKA et ai. (2003), os quais evidenciaram menores níveis deste marcador, respectivamente, no soro e fluido peritoneal de mulheres com a doença, sugerindo, também, que o compartimento sérico esteja refletindo o status redox do microambiente peritoneal. Com relação ao compartimento folicular, o grupo com endometriose apresentou maiores níveis de 8OHdG e Vit E no FF comparado ao grupo sem endometriose, sugerindo ocorrência de estresse oxidativo também neste microambiente reprodutivo de pacientes inférteis com a doença submetidas a EOC. Esta é a primeira vez em que a 8OHdG é avaliada no FF de mulheres com endometriose, sendo este um achado de grande importância para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à doença. A presença de elevados níveis da 8OHdG no FF de mulheres inférteis com endometriose sugere a ocorrência de dano oxidativo ao DNA neste microambiente reprodutivo, que pode promover comprometimento da qualidade gamética, como sugerido pelos estudos que serão apresentados a seguir. Segundo SEINO et ai. (2002), níveis elevados da 8OHdG nas células da granulosa de mulheres inférteis submetidas a FIV têm correlação Discussão 1 78 negativa com taxa de fertilização e formação de embriões de boa qualidade. Corroborando estes achados, TAMURA et ai. (2008) demonstraram que elevados níveis da 8OHdG no FF de mulheres submetidas a FIV foram correlacionados com maiores taxas de oócitos degenerados, sugerindo que a elevação deste marcador de EO a nível folicular tenha efeito tóxico sobre a maturação oocitária. Com base na análise imunohistoquimica da 8OHdG, MATSUZAKI; SCHUBERT (2010) sugerem que o córtex ovariano saudável adjacente a um endometrioma é afetado mais severamente pelo EO do que o córtex adjacente a cistos ovarianos benignos de outra origem, indicando maior dano ao DNA no ovário de mulheres com a doença. Somado a isso, um estudo recente POLAK et ai. (2013) aponta haver maiores níveis de 8OHdG no FP de mulheres com endometriose comparadas a pacientes com cistos serosas e dermóides, sugerindo que o FP dessas pacientes pode ter efeito na infertilidade relacionada a endometriose. Estudo publicado por nosso grupo (BARCELOS et ai., 2009) sugeriu comprometimento e/ou retardo na conclusão da meiose de oócitos maturados in vitro, provenientes de ciclos estimulados de mulheres inférteis com endometriose. Um outro interessante estudo realizado pelo nosso grupo demonstrou que o fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à EOC para ICSI promove anomalias meióticas oocitárias em modelo bovino (DA BROI et ai., 2014). Analisando conjuntamente estes achados e os do presente estudo, hipotetizamos que a presença de estresse oxidativo no compartimento folicular de mulheres inférteis com endometriose, representada pela maior concentração de 8OHdG, esteja relacionada a ocorrência de dano oxidativo e anomalias oocitárias oocitárias, participando da etiopatogênese da infertilidade relacionada à doença nestas mulheres, corroborando os achados em células da granulosa e fluido peritoneal apresentados na literatura. Discussão 1 79 Os maiores níveis de Vit E encontrados no FF de mulheres com a doença, por sua vez, indicam uma mobilização do sistema antioxidante folicular na tentativa de neutralizar espécies reativas e evitar danos oxidativos oocitários. Entretanto, essa mobilização não teria sido capaz de prevenir o dano oxidafüm, como evidenciado pelos maiores níveis da 8OHdG. Este achado contraria tanto um estudo recente de SINGH et ai. (2013), que encontrou menores níveis de Vit E no FF de mulheres com a doença, como os estudos de CAMPOS PETEAN et ai. (2008) e PRIETO et ai. (2012), nos quais não foi evidenciada diferença nos níveis de Vit E entre o FF de pacientes inférteis com endometriose e controles. Todavia, os critérios de elegibilidade dos sujeitos dos referidos estudos são heterogêneos, assim como os protocolos de estimulação ovariana, dificultando a comparação dos resultados. Associadamente a isto, nestes estudos não foi apresentado o poder de teste das análises realizadas. Com base nos presentes achados e considerando ljm estudo de TAMURA et ai. (2008), no qual, a administração de vitamina E (a-tocoferol, 600 mg/dia), do quinto dia do ciclo anterior ao tratamento até o dia da captação oocitária de pacientes inférteis submetidas a FIV reduziu as concentrações intrafoliculares da 8OHdG com relação ao ciclo prévio, questionamos a importância de terapias antioxidantes adicionais, especificamente, da administração de Vit E, visando à prevenção de danos oxidativos ao DNA em pacientes inférteis com endometriose, o que necessita de estudos pertinentes. Quando comparados os marcadores entre soro e FF no grupo endometriose, evidenciou-se que no soro há maiores níveis de FOX 1, AOPP, Vit E e SOO do que no FF e no FF há maiores níveis de 8OHdG, GSH e CAT do que no soro. Maiores níveis séricos de FOX 1 e AOPP sugerem, respectivamente, maior produção de espécies reativas e maior dano oxidativo proteico a nível sistêmico, não prevenidos Discussão 1 80 pela maior mobilização dos antioxidantes SOO e Vit E. Os maiores níveis de 80HdG no FF sugerem dano preferencial ao ONA no microambiente folicular de mulheres com endometriose, o que poderia estar relacionado a dano oxidativo oocitário nessas pacientes como previamente mencionado; ao passo que, maiores níveis foliculares de GSH e CAT em relação ao soro indicam haver uma maior mobilização do sistema antioxidante no microambiente folicular destas mulheres, que habitualmente apresenta forte defesa antioxidante para proteção do folículo contra o EO (ANGELUCCI et ai., 2006). Já no grupo sem endometriose, encontrou-se maiores níveis de FOX1, Vit E e SOO no soro do que no FF e maiores níveis de GSH no FF comparado ao soro. Estes achados diferem dos apresentados por SABATINI et ai. (1999) que afirmam haver maior atividade da SOO no FF comparado ao soro de mulheres submetidas a EOC para FIV. CAMPOS PETEAN et ai. (2008) compararam Vit E e MOA entre soro e FF de mulheres com e sem a doença, tendo encontrado maiores níveis de Vit E no soro tanto no grupo com como no sem endometriose, corroborando nossos achados. No entanto, os níveis de MOA foram menores no FF do que no soro do grupo controle, sendo que, no presente estudo, não evidenciamos-- diferença para este marcador em nenhum dos grupos. Diferentemente do grupo com endometriose, no grupo sem endometriose não se observou maiores níveis de AOPP no soro do que no FF, e nem maiores concentrações de 8OHdG no FF comparado ao soro, sugerindo não haver evidências de dano oxidativo sistêmico a proteínas e ao ONA em nível folicular em mulheres inférteis sem a doença. Com a evidência de EO sistêmico e folicular em pacientes com endometriose submetidas à EOC e, sabendo-se que baixas concentrações de espécies reativas têm importância na modulação fisiológica de vários fenômenos do trato reprodutivo Discussão 1 81 feminino, como a maturação oocitária, a atresia folicular, a função do corpo lúteo, a interação gamética, a fertilização, o desenvolvimento e a implantação embrionária (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; FUJll; IUCHI; OKADA, 2005), avaliamos o papel dos marcadores de estresse oxidativo analisados no soro e no FF nos dois principais resultados da ICSI, gestação clínica e nascidos vivos, nos grupos com e sem endometriose. Foram realizadas curvas ROC e considerados como marcadores adequados para discriminação de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos aqueles com AUC ;:: 70%, para os quais foram determinados os valores de corte com máximo poder discriminatório para estes dois endpoints, sendo calculados suas respectivas sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo e acurácia, sendo estes dados inéditos na literatura. Dispomos de um estudo que avaliou marcadores de estresse oxidativo no FF para predição de viabilidade embrionária, tendo identificado valor de corte apenas para os níveis de espécies reativas de oxigênio, acima do qual, a formação de embriões viáveis não é favorável (JANA et ai., 201 O). Temos um outro estudo recentemente publicado (SINGH et ai., 2013) que avaliou se os níveis de espécies reativas de oxigênio no FF de-mulheres inférteis com e sem endometriose são capazes de discriminar entre oócitos maduros e imaturos, evidenciando que valores de ERO :;; 105,36 cps apresentaram máximo poder discriminatório para oócitos maduros (73,68% de sensibilidade e 89,74% de especificidade) no grupo com endometriose. No presente estudo, no grupo sem endometriose, o marcador 8OHdG foi identificado como o melhor preditor sérico e a GSH como o melhor preditor folicular tanto de gestação clínica como de nascidos vivos. No grupo com endometriose, no entanto, nenhum marcador foi identificado como bom preditor sérico para os endpoínts avaliados, assim como, não houve bom preditor folicular de nascidos vivos. A 8OHdG, por sua Discussão 1 82 vez, foi o melhor preditor folicular de ocorrência de gestação clínica no grupo endometriose, tendo apresentado a melhor área sob a curva de todos os marcadores avaliados nos diferentes microambientes e grupos, assim como, alta acurácia, sensibilidade e especificidade. Estudos com maiores casuísticas são necessários para confirmar a acurácia dos marcadores identificados no presente estudo para discriminação de gestação clínica e nascidos vivos, no soro e FF de mulheres inférteis com e sem endometriose, o que seria de grande valia na determinação do prognóstico gestacional destas pacientes e no delineamento de estudos de intervenção avaliando o papel de antioxidantes específicos nos subgrupos indentificados. É importante ressaltar que, no presente estudo, foram adotados critérios de elegibilidade bastante seletivos para os sujeitos da pesquisa, evitando-se a interferência de outros fatores associados ao estresse oxidativo e piora de qualidade oocitária e resultados da ICSI, minimizando, assim, possíveis vieses de seleção amostral. Neste sentido, foram elegíveis para o estudo apenas pacientes submetidas a videolaparoscopia e que não apresentavam outras condições potencialmente associadas ao EO e-piorade qualidade oocitária; como idade avançada, aumento do FSH basal, obesidade, doenças associadas ao EO, uso de medicações e suplementos vitamínicos. No grupo de estudo o único fator relacionado à infertilidade identificado era a endometriose, o que também torna este grupo bastante homogêneo. Além disso, adotou-se um protocolo rígido para a coleta das amostras, tendo-se optado pela obtenção do sangue previamente à aplicação do anestésico e pela obtenção e análise do fluido folicular aspirado apenas do primeiro folículo do primeiro ovário puncionado de cada paciente, com 15 mm ou mais de diâmetro (pela maior possibilidade de conter um oócito maduro), com ausência de contaminação Discussão 1 83 sanguínea à inspeção visual e um oócito captado, a fim de evitar possíveis vieses decorrentes do estresse anestésico e da própria punção ovariana, que pudessem influenciar os níveis de marcadores de EO analisados no FF. Entretanto, como principais limitações deste estudo, podemos considerar a pequena casuística avaliada, decorrente dos critérios de seleção extremamente rigorosos, assim como, a EOC a que todas as pacientes foram submetidas, persistindo a dúvida se os presentes achados relativos aos marcadores de EO no soro e FF podem ser extrapolados para os ciclos naturais de mulheres com e sem a doença. Tem sido muito pouco estudado se a EOC interfere com o balanço oxidante/antioxidante sérico e folicular. Em um estudo com pequena casuística foi demonstrado que o produção de ERO pelas células da granulosa não difere em ciclos estimulados e não estimulados (JANCAR et ai., 2008), mas persiste a lacuna no conhecimento sobre a investigação de marcadores locais e sistêmicos de EO em ciclos não estimulados. Resumidamente, os resultados do presente estudo indicam ocorrência de estresse oxidativo sistêmico, representado sobretudo pela menor CAT, e folicular, evidenciado principalmente pelas maiores concentrações de 8OHdG, marcador de dano oxidativo-ao DNA,-em pacientes-inférteis com endometriose submetidas à EOC para ICSI. Sendo o folículo ovariano uma estrutura altamente vascularizada durante os estágios finais da foliculogênese, hipotetizamos que tanto o estresse oxidativo sistêmico, como o EO no microambiente folicular possam favorecer o comprometimento da qualidade oocitária, participando da etiopatogênese da infertilidade em mulheres com endometriose. Evidenciamos diferenças nas comparações entre os níveis séricos e foliculares dos oito marcadores estudados dentro dos grupos com e sem endometriose, sugerindo haver diferenças no balanço oxidante/antioxidante sistêmico e folicular relacionadas à doença. Demonstramos Discussão 1 84 que alguns dos marcadores de EO estudados mostraram-se bons preditores de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI, abrindo perspectivas de utilização dos mesmos na determinação do prognóstico gestacional após-lCSI e fundamentação de novas abordagens terapêuticas. Dessa forma, estudos futuros com casuística ampliada, avaliando a aplicabilidade destes marcadores na predição de sucesso de ICSI e o delineamento de estudos que visem abordagens terapêuticas mais específicas são de grande importância para o manejamento adequado destas pacientes e o melhor entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. 7. Conclusões Conclusões 1 86 Demonstramos que mulheres inférteis com endometriose submetidas à EOC apresentam estresse oxidativo sistêmico no dia da captação oocitária, representado pela menor CAT, indicativa do comprometimento da sua capacidade antioxidante sistêmica global. Nesta mulheres, demonstramos também a presença de EO no microambiente folicular, evidenciado principalmente pelas maiores concentrações de 80HdG, marcador de dano oxidativo ao DNA. Sendo o folículo ovariano uma estrutura altamente vascularizada durante os estágios finais da foliculogênese, hipotetizamos que tanto o EO sistêmico, como do microambiente folicular possam favorecer o comprometimento da qualidade oocitária, participando da etiopatogênese da infertilidade em mulheres com endometriose. Evidenciamos diferenças nas comparações entre os níveis séricos e foliculares dos oito marcadores estudados dentro dos grupos com e sem endometriose, sugerindo haver diferenças no balanço oxidante/antioxidante entre os compartimentos sistêmico e folicular específicas de cada uma destas condições. Demonstramos que alguns dos marcadores de EO estudados, com destaque para a 80HdG no soro e a GSH no FF do grupo sem endometriose e a 80HdG no FF do grupo com endometriose, mostraram-se-bons-preditores-de gestação clínica e/ou nascidos vivos após ICSI, abrindo perspectivas de utilização dos mesmos na determinação do prognóstico gestacional após-lCSI. Dessa forma, estudos futuros com casuística ampliada, avaliando a aplicabilidade destes marcadores na predição do sucesso da ICSI e o delineamento de estudos de intervenção testando o impacto da suplementação de antioxidantes a subgrupos selecionados, são de grande importância para a otimização do sucesso da ICSI e o melhor entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose 8. Referências Referências 1 88 AGARWAL, A. et ai. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review. Reprod Biol Endocrinol, v.1 O, p.49. 2012. AGARWAL, A. et ai. 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Michele Gomes Da Broi\MSc, Felipe Oliveira de Albuquerque MD\ Aline Zyman de Andrade\ Rafaela Lopes Cardoso\ Alceu Afonso Jordão Junior\ Paula Andrea Navarro a,c•, MD, PhD. ª Human Reproduction Division, Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil. b Nutrition and Metabolism Laboratory, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of Sao Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil cNational Institute ofHormones and Woman's Health, CNPq, Brazil Institution: Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, .Ribeirao Preto, SP, Brazil. *Corresponding author: Michele Gomes Da Broi Avenida Bandeirantes, 3 900 - Ribeirao Preto, SP, Brazil. CEP: 14049-900; Tel: +55 16 3602 28 21; Fax: +55 16 3633 1028 E-mail: [email protected] FINANCIAL SUPPORT This study received financial support from the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico; 474858/2009-0; 309056/2009-8; 503867/2010-1) and FAPESP (2008/58197-6). Manuscrito 1 100

Study question: Is there systemic and follicular oxidative stress (OS) in infertile women with endometriosis (E) undergoing ovarian stimulation and what its role in the prediction of successful pregnancy after intracytoplasmic sperm injection (ICSI)? Summary answer: We demonstrated the occurrence of systemic and follicular OS in infertile patients with endometriosis, and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8OHdG) in FF was the best predictor of clinicai pregnancy in these patients. What is known already: Controversial studies have suggested that impaired oocyte quality and OS may be involved in the pathogenesis of endometriosis-related infertility. Moreover, some studies have demonstrated alterations in constituents of the FF from infertile women with endometriosis. However, no study to date has evaluated jointly different pro-and antioxidant markers in serum and FF of women with endometriosis-related infertility undergoing ovarian stimulation for ICSI and determined its accuracy in predicting clinica! pregnancy and live birth. Study design, size, duration: Cross-sectional study. From October 2009 to October 2010, 275 patients started COS: 151 were eligible for the study, 132 si gn ed the informed consent form, 99 underwent oocyte retrieval, and 87 serum samples (43 with E and 44 without E) and 61 FF sam_ples (29 with E and 32 without E) had data analyzed. Participants/materials, setting, methods: Total hydroperoxides (FOX 1), malondialdehyde (MDA), advanced oxidation protein products (AOPP), 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8OHdG), glutathione (GSH), vitamin E (Vit E), superoxide dismutase (SOD) and total antioxidant capacity (TAC) concentrations were measured and compared among serum and FF from infertile women with and without E and the accuracy of these markers to predict clinicai pregnancy and live bom was determined by ROC curve analysis. Main results and the role of chance: The patients with endometriosis had higher serum leveis of GSH (p = 0.03) and SOD (p = 0.02), lower serum levels of TAC (p < O.OI) and higher follicular 8OHdG leveis (p < O, 01) and Vit E leveis (p = 0.03) compared to those without endometriosis. ln the endometriosis group, the serum presented higher leveis of FOX 1 (p < O.OI), AOPP (p = 0.03), Vit E (p <O.OI) and SOD (P <O.OI) and lower leveis of 8OHdG, TAC and GSH (p < O.OI) compared to FF. ln the group without endometriosis, the serum had higher levels of FOX 1 (p < O.OI), Vit E (p <0.01) and SOD (p = 0.02) and lower leveis of GSH (p < 0.01) compared to FF. The 8OHdG was presented as the best serum predictor and the GSH was the best follicular predictor of clinicai pregnancy and live birth in patients without the disease. The 8OHdG was identified as the best follicular predictor of clinicai pregnancy in the group with endometriosis. Limitations, reasons for caution: This study had a small sample size, and thus further investigations using a large cohort of patients are needed to confirrn these results. ln addition, data obtained from Manuscrito 1 101 stimulated cycles may not necessarily reflect what occurs in natural cycles of infertile women with and without endometriosis. Wider implications of the findings: we evidenced the occurrence of systemic and follicular OS in infertile patients with endometriosis undergoing controlled ovarian stimulation for ICSI and we suggest that the OS may be involved in the genesis of infertility-related disease. Some of the studied OS markers proved to be good predictors of clinica! pregnancy and live birth after ICSI, opening prospects for their use in determining the gestational prognosis after ICSI. Study funding/competing interest(s): This study received financial support from National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) and F APESP (2008/58197-6). Key words: endometriosis; infertility; serum; follicular fluid; oxidative stress. Manuscrito 1 102 Introdução A endometriose, caracterizada pela presença de implantes endometriais (glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina (Gupta et al., 2006), é uma doença ginecológica com alta prevalência (10 a 15%) entre mulheres em idade reprodutiva (Augoulea et al., 2012). Esta doença está frequentemente associada à infertilidade, acomete de 25 a 40% das mulheres inférteis e estima-se que 30 a 50% das mulheres com endometriose apresentam dificuldade para engravidar (Holoch and Lessey, 2010). Entretanto, até o presente momento, pouco é conhecido acerca dos mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, cujo melhor entendimento permitiria o delineamento de estudos de intervenção específicos visando promover a melhora da fertilidade natural destas mulheres. Se por um lado há evidências de comprometimento da fertilidade natural em mulheres com endometriose, por outro é controverso seu impacto sobre os resultados das técnicas de reprodução assistida (TRA), cada vez mais utilizadas no tratamento da infertilidade de portadoras da doença (Garcia-Velasco and Arici, 1999, Garrido et al., 2000, Barnhart et al., 2002, Al-Fadhli et al., 2006, Opoien et al., 2012, Harb et al., 2013). Resultados conflitantes de alguns estudos têm sugerido a ocorrência de menores taxas de fertilização, implantação e/ou gestação em portadoras de endometriose (Barnhart et al., 2002, Al-Fadhli et al., 2006, Lin et al., 2012, Harb et al., 2013), que poderiam ser decorrentes do comprometimento da qualidade oocitária, de defeitos endometriais e/ou anomalias da interação entre o endométrio e o embrião. Contudo, uma recente metanálise evidenciou que apenas a endometriose em estágio avançado (ill e IV) teve impacto negativo sobre as taxas de implantação e gestação, sem ter, entretanto, efeito sobre a ocorrência de nascidos vivos (Harb et al., 2013 ). Desta forma, continua controverso se a presença da endometriose está ou não associada a potencial comprometimento do sucesso das TRA, e em caso afirmativo, quais seriam os mecanismos envolvidos. O estresse oxidativo (EO) tem sido associado a diversas doenças reprodutivas e tem se questionado seu papel na etiopatogênese da endometriose (Agarwal et al., 2003, Szczepanska et al., 2003, Gupta et al., 2008), estando sua ocorrência, possivelmente, associada a uma resposta inflamatória aos implantes endometriais ectópicos (Murphy et al., 1998). Em mulheres com a doença, uma tendência a maior produção de agentes pró-oxidantes, associada a uma potencial alteração da sua capacidade antioxidante, poderiam promover a perda do equilíbrio redox do trato reprodutivo, induzindo à ocorrência do EO (Agarwal et al., 2003, Szczepanska et al., 2003, Gupta et al., 2006, Ruder et al., 2008), que, por sua vez, poderia estar envolvido também no comprometimento da fertilidade (Gupta et al., 2008, Agarwal et al., 2012). O microambiente folicular tem um papel crítico na qualidade oocitária, fertilização e desenvolvimento embrionário (Attaran et al., 2000). A ocorrência de EO neste microambiente pode ter impacto na foliculogênese ovariana (Prieto et al., 2012) e promover comprometimento da qualidade oocitária, anomalias na meiose e no desenvolvimento Manuscrito 1 103 embrionário pré-implantação (Liu et al., 2003, Navarro et al., 2004, Agarwal et al., 2006, Navarro et al., 2006, Mansour et al., 2009). Até o presente, poucos estudos investigaram a presença de EO no FF de mulheres inférteis com endometriose (Prieto et al., 2012, Liu et al., 2013, Singh et al., 2013). Em recente estudo de nosso grupo, foi evidenciado um efeito deletério do fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com endometriose leve sobre fuso e distribuição cromossômica de oócitos bovinos maturados in vitro, indicando a presença de fatores nocivos à qualidade oocitária no FF de mulheres com a doença e questionando o papel do EO na piora da qualidade gamética (Da Broi et al., 2014). Dessa forma, questionamos a ocorrência de EO no microambiente folicular de pacientes inférteis com a doença, que poderia afetar a qualidade oocitária e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural destas pacientes, de modo que sua identificação poderia ajudar na elucidação de mecanismos da infertilidade relacionada à endometriose. Também questionamos se o EO seria detectado em nível sistêmico no dia da captação oocitária de pacientes submetidas à estimulação ovariana controlada (EOC) para a realização de ICSL uma vez que sua presença em mulheres com endometriose poderia não estar restrita à cavidade pélvica, atingindo também a circulação sistêmica (Lambrinoudaki et al., 2009, Andrade et al., 2010). Apesar de existirem evidências sugerindo presença de EO nos sítios dos implantes pélvicos endometriais (Gupta et al., 2008), dispomos de dados inconclusivos acerca do balanço oxidante­ antioxidante em portadoras de endometriose e não encontramos estudos avaliando conjuntamente diferentes marcadores pró e antioxidantes no soro e FF de mulheres com infertilidade relacionada à endometriose, cuja análise conjunta permitiria um melhor entendimento deste complexo processo. Podemos considerar didaticamente que o EO é um processo que ocorre por meio de três etapas distintas, sendo que na primeira, observa-se o aumento da produção de espécies reativas, na segunda, há a mobilização de antioxidantes na tentativa de prevenir os danos oxidativos aos seus principais alvos e, na terceira, ocorre o dano oxidativo a proteínas, lipídeos, DNA, entre outros alvos (Fujii et al., 2005, Agarwal et al., 2006). Neste estudo, a primeira etapa foi avaliada por meio da mensuração do total de hidroperóxidos (FOX1), considerado um marcador de produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) (Mier-Cabrera et al., 2008). A segunda etapa foi analisada por meio da medida da glutationa reduzida (GSH), importante antioxidante na proteção celular ao estresse oxidativo que atua na neutralização de peróxidos (Meister, 1983), da vitamina E (Vit E), que pode tanto bloquear o início da peroxidação lipídica como inibir primariamente a sua etapa de propagação (Nwose et al., 2008), da enzima superóxido dismutase (SOD), que está presente no fluido folicular pré-ovulatório em níveis mais altos que no soro e parece conferir proteção contra o dano oxidativo oocitário (Tatemoto et al., 2004) e da capacidade antioxidante total (CAT), que reflete o balanço antioxidante total da amostra, sendo resultante das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, o que permite uma avaliação global deste processo (Erel, 2004, Costa et al., 2006). A terceira etapa, por sua vez, foi avaliada por meio da análise do malondialdeído (MDA), um dos produtos finais da peroxidação lipídica e que pode ser utilizado como medida cumulativa deste processo (Campos Petean et al., 2008), dos produtos Manuscrito 1 104 avançados da oxidação proteica (AOPP), que permite uma estimativa da oxidação protéica (Witko­ Sarsat et al., 1996) e da 8-hydroxi-2' -deoxiguanosina (8OHdG), que possibilita a análise do dano oxidativo ao DNA (Evans et al., 2004). Desta forma, os objetivos deste estudo foram avaliar a presença de EO a nível folicular e sistêmico em mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à EOC para realização de ICSI, por meio da análise conjunta dos oito marcadores de EO acima mencionados, comparar o status redox entre os compartimentos sérico e folicular em cada grupo e definir a acurácia dos marcadores avaliados como preditores de gestação clínica e nascidos vivos após realização de ICSI. Materiais e Métodos Realizou-se um estudo transversal prospectivo junto ao Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP e Laboratório de Nutrição e Metabolismo, Departamento de Clínica Médica - FMRP-USP. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP). As pacientes que preencheram os critérios de inclusão e manifestaram o desejo de participar do projeto e concordaram em ceder amostras de fluido folicular, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido previamente à inclusão no estudo. Fluxograma do estudo De outubro de 2009 a outubro de 2010, 275 pacientes participaram do Programa de Reprodução Assistida do Hospital Universitário da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e foram submetidas à estimulação ovariana para ICSI. Destas, 124 não foram elegíveis para o estudo. As 151 pacientes elegíveis (76 do grupo controle e 75 do grupo endometriose) foram entrevistadas e 132 assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (65 do grupo controle e 67 do grupo endometriose). Trinta e três das 132 pacientes não foram submetidas à captação de oócitos. Das 99 que captaram oócitos, foram obtidas amostras de sangue de 50 pacientes sem endometriose e 49 com endometriose e FF de 32 pacientes sem endometriose e 35 com endometriose. Oitenta e sete amostras de soro (43 com E e 44 sem E) e 61 amostras (FF 29 com E e 32 sem E) tiveram dados analisados no presente estudo (Figura 1 ). Critérios de Seleção No grupo endometriose, foram selecionadas pacientes com infertilidade associada exclusivamente à endometriose diagnosticada e classificada por videolaparoscopia segundo os critérios da American Society for Reproductive Medicine (1997). No grupo controle, foram incluídas Manuscrito 1 105 pacientes apenas com infertilidade por fator masculino e/ou tubário. Todas as pacientes do grupo controle foram submetidas à videolaparoscopia diagnóstica como procedimento de rotina para investigação da infertilidade conjugal, sendo descartada a presença de endometriose. Foram critérios de elegibilidade para os dois grupos idade menor que 3 8 anos, índice de massa corporal (IMC) menor que 30 Kg/m2, nível sérico de hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro dia do ciclo menstrual < 1 0mUI/ml e ausência de anovulação crônica, hidrossalpinge e doenças crônicas como diabetes mellítus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, dislipidemia, lupus eritematoso sistémico e outras doenças reumatológicas, infecção pelo vírus HIV, qualquer infecção ativa, tabagismo, uso de medicações hormonais e de antiinflamatórios hormonais e não-hormonais e suplementos vitamínicos nos seis meses anteriores à inclusão no estudo (os quais poderiam ser vieses do estudo, já que estão relacionados a produção de espécies reativas e estresse oxidativo ). Protocolo de Estimulação Com o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de estimulação ovariana controlada utilizou-se a programação da menstruação, que consiste em se administrar diariamente anticoncepcionais orais combinados, iniciados no período menstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto para o início da estimulação ovariana, suspendendo sua administração de tal forma que o início do sangramento menstrual coincida com a realização da ultrassonografia transvaginal (USTV) basal para se observar o padrão endometrial e afastar a presença de cistos ovarianos que pudessem interferir na resposta à administração das gonadotrofinas exógenas e na monitorização ultrassonográfica do crescimento folicular. O bloqueio hipofisário com análogo do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRHa) foi iniciado 10 dias antes do dia de realização da USTV basal (protocolo longo), no período vespertino, por meio da administração de acetato de leuprolide (Lupron®, Abott, Brasil; Reliser®, Serono, Brasil) na dose de 0,5mg/dia (10 UI), por via subcutânea, mantida durante todo o período de estimulação ovariana controlada até o dia da administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Ovidrel®, Serono, Brasil). A hiperestimulação ovariana controlada foi iniciada entre o segundo e o quarto dia do ciclo menstrual. As pacientes receberam 150 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSHr) (Gonal-F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil), via intramuscular, nos primeiros 6 dias da indução. A partir do sétimo dia da indução da ovulação, a dose foi ajustada de acordo com o crescimento folicular e a espessura endometrial, monitorados com USTV diariamente ou em dias alternados. Na presença de, pelo menos, dois folículos com 18 mm de diâmetro médio, foram administrados 250 µg de hCG recombinante (Ovidrel®, Serono, Brasil) às 22:00. A captação dos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante. Manuscrito 1 106 Captação Oocitária e Denudamento Oocitário A captação dos oócitos foi realizada mediante prévia anestesia geral endovenosa com propofol (Diprivan®, Astra-Zeneca, Brasil), associado ao citrato de fentanil (Fentanil®, Janssen-Cilag, Brasil). A aspiração dos folículos por via endovaginal guiada por transdutor ultrassonográfico transvaginal, foi realizada utilizando-se uma agulha de lúmen simples padrão, (Laboratório CCD, França), com pressão aspirativa artificial constante de 100 mmHg, por meio de bomba de sucção com controle eletrônico (Craft® Suction Pump, Rocket Medical, Inglaterra). Cada folículo, cujo FF foi utilizado neste estudo ( critérios descritos a seguir), foi aspirado individualmente em tubos Falcon, previamente aquecidos a 37° C, não contendo meio de cultivo. Os demais folículos foram aspirados em pool, em tubos de ensaio, previamente aquecidos a 37ºC, contendo 1 ml de meio de cultivo HTF-HEPES. Para a identificação e o isolamento dos COC, o material aspirado foi transferido para placas de Petri com 1 O cm de diâmetro, previamente aquecidas em platina térmica a 3 7ºC, não contendo meio de cultivo. Depois de identificados, os COC foram isolados do FF e colocados em placa separada. Os COC foram lavados cuidadosamente em meio de cultura HTF-HEPES (HTF, Irvine Scientific), para a remoção de sangue e debris. A seguir foram colocados em placas NUNC (Multidish 4 wells Nuclon, Delta SI), preenchidas com o meio de cultura HTF e cobertas com óleo mineral, e levados à incubadora em mistura gasosa de CO2 a 5%, sob condições ideais de temperatura (37°C) e umidade (95%) por um período de 3 a 4 horas. Após este período, os COC foram colocados em micro-gotas de 25µL de hialuronidase (H4272 tipo IV-S, Sigma), na diluição de 80 UI/mL de HTF/HEPES (Irvine Scientific), por no máximo 30 segundos e, então, lavados 2 ou 3 vezes com o meio HTF modificado (HTF/HEPES, Irvine Scientific) suplementado com Soro Sintético Substituto (SSS) a 10%. A remoção mecânica dos restos celulares foi feita com o auxílio de uma pipeta de desnudação (stripper pipette 130 µm denuding pipette, Cook, Melboume, Australia). Após a realização do desnudamento oocitário (remoção do cumulus oophorus), realizamos a identificação do grau de maturidade dos oócitos, sob visualização ao estereomicroscópio invertido. Os oócitos imaturos ( em estágio de vesícula germinativa ou metáfase I) foram descartados e os oócitos maduros (caracterizados morfologicamente pela presença de um corpúsculo polar extruso) foram injetados como descrito a seguir. ICSI, Taxas de Fertilização, Implantação, Gestação Clínica e Nascido Vivo Os oócitos maduros, caracterizados pela extrusão do CP, foram submetidos à ICSI 3 a 4 horas após a captação oocitária. Cerca de 16 a 18 horas após a ICSI foi avaliada a fertilização, caracterizada pela presença de 2 pró-nucleos e 2 corpúsculos polares (a taxa de fertilização corresponde ao número de oócitos fertilizados, divididos pelo número de oócitos injetados X 100). Cerca de 43 a 45 horas após a ICSI (segundo dia de desenvolvimento embrionário - D2) foi avaliada a qualidade embrionária Manuscrito 1 107 ( quanto ao número e simetria de blastômeros, percentagem de fragmentação e presença ou não de multinucleação). Para os casos em que a transferência embrionária não ocorreu no DII, cerca de 67 a 69 horas após a ICSI (D3) foi realizada novamente a análise da qualidade embrionária. Foram considerados como embriões de boa qualidade em D2 os que apresentaram 4 blastômeros, simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação (2011). Foram considerados de boa qualidade no D3 os embriões com 8 blastômeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação (2011). Realizou-se a transferência embrionária em D2 ou D3, de acordo com a individualização de cada caso. Quatorze dias após a transferência embrionária realizou-se a análise do �-hCG sanguíneo, sendo considerada como gravidez química a presença de �-hCG positivo (maior ou igual a 25 UI/ml). Avaliou-se a taxa de implantação, caracterizada pelo número de sacos gestacionais divididos pelo número de embriões transferidos Xl 00 e a taxa de gravidez clínica por ciclo com transferência, caracterizada pelo número de pacientes com embrião com batimento cardíaco visualizado ao USTV realizado 4 a 5 semanas após a transferência embrionária dividido pelo número de ciclos com transferência embrionária X 100. Foram avaliados também a quantidade total de FSH usado para estimulação ovariana, o número de dias de estimulação ovariana, a espessura endometrial no dia da captação, o número total de oócitos captados e maduros ( com extrusão do primeiro CP), de embriões de boa qualidade e total de embriões produzidos e nascidos vivos. Coleta e processamento das amostras Sangue Para a coleta sanguínea foram utilizados tubos estéreis, a vácuo, com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), para coleta de 5 mL de sangue venoso das pacientes no dia da captação oocitária. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos e o soro foi armazenado a - 80°C, dividido em quatro alíquotas, para posterior análise. Fluido Folicular Cerca de 34 a 36 horas após a administração do hCG, as pacientes foram submetidas à captação oocitária, sob sedação endovenosa com propofol e fentanil. A aspiração folicular foi realizada por meio de USTV com transdutor transvaginal de 5 MHz, acoplado a guia de punção. Foi aspirado um folículo do primeiro ovário puncionado, com diâmetro médio� 15 mm (pela chance elevada de conter um oócito maduro), em um tubo previamente aquecido a 3 7ºC. Apenas os FF livres de contaminação sanguínea à inspeção visual (Levay et al., 1997) e que apresentaram células da Manuscrito 1 108 granulosa (CG) ou células da granulosa e um oócito maduro captado foram considerados adequados para análise. Cada amostra de FF adequado foi centrifugada a 3 00 g por 7 minutos, para remover os componentes celulares, e estocada a - 80ºC, aliquotada em 2 ou 3 criotubos, para posterior análise. As amostras de sangue e FF armazenadas foram posteriormente encaminhadas para o Laboratório de Nutrição da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, onde foram dosados os marcadores de estresse oxidativo descritos a seguir. Todas as dosagens foram realizadas em duplicata, no mesmo momento, pelo mesmo técnico, com experiência comprovada nas metodologias empregadas. O responsável técnico pelas dosagens não teve acesso aos dados clínicos das pacientes, não conhecendo o grupo ao qual pertenciam as mesmas. Metodologias 1. Determinação da concentração total de hidroperóxidos (FOX1) A concentração total de peróxidos foi determinada pelo método FOX1 (Galli et al., 2005). O sistema de teste FOX1 é baseado na oxidação do Fe+2 (íon ferroso) a Fe+3 (íon férrico) por vários tipos de peróxidos contidos nas amostras analisadas. Na presença de xylenol orange forma-se um complexo colorido (xylenol orange-férrico) de cor azul púrpura, cuja absorbância pode ser medida (Costa et al., 2006). Neste método utiliza-se uma substância preparada no dia da leitura (o reagente FOX1). A solução 1 é preparada com 7,6mg de xylenol orange e 88mg de BHT (butil-hidroxitolueno ) em 90mL de metanol . A solução 2 é preparada com 9,8mg de sulfato ferroso em 10 mL de ácido sulfúrico 250mM (O, 13mL de ácido sulfúrico em 1 0mL de água). As duas soluções devem ser misturadas em concentração 9: 1 somente no dia da leitura. Para a análise são necessários 1 00µL de soro ou fluido, l00µL de água (para o branco) e 1 mL da solução, que reagem por 30 minutos ao abrigo da luz à temperatura ambiente. Após este período, centrifuga-se por 5 minutos a 3500 rpm e a absorbância do sobrenadante é medida em 560nm. A curva foi realizada com H202 em concentrações de 10 a 200µM. O resultado foi expresso em µmol/g proteína. 2. Mensuração da concentração de malondialdeído (MDA) O soro e o fluido folicular, previamente estocados, foram descongelados até atingir 37ºC. Cerca de 1 mL de cada amostra foi misturado com 2 ml de TCA-TBA-HCL (15% de ácido tricloracético, 0,375 % de ácido tiobarbitúrico e 0,25 N de ácido clorídrico) e aquecido em banho-maria por 15 minutos. Após resfriamento, o precipitado foi centrifugado em 1.000g por 1 O min. A absorbância do produto foi medida em espectofotômetro (Spectronic 601-Milto Roy) com comprimento de onda de 535 nm. O cálculo da concentração das substâ ncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi realizado considerando-se o coeficiente de absortividade molar do produto (E535=1,56 x 10 -s M -J cm -1), Manuscrito 1 109 sendo os resultados expressos em nmol de malondialdeído /litro. Uma curva padrão foi realizada, utilizando-se uma solução estoque de malondialdeído a 1 O mM, preparada a partir do tetrametoxipropano (SIGMA), sendo que as concentrações encontradas nas amostras apresentaram-se dentro desta curva, mostrando uma boa linearidade com o padrão. O resultado foi expresso em nmol MDA/g proteína 3. Determinação da concentração dos produtos avançados de oxidação protéica (AOPPs) Os produtos de oxidação protéica presentes no soro e FF foram determinados pelo método descrito por Witko-Sarsat et al. (1996), conforme sumarizado a segu ir. Uma amostra de 40 µL de soro ou FF foi misturada a 160 µL de PBS (tampão fosfato salino) e 20 µL de ácido acético glacial (ultra puro). A leitura da absorbância foi realizada com comprimento de onda de 340 □M. A curva para a realização desta leitura foi feita com o uso de cloramina T ( curva de 1 O a 100 mM) e iodeto de potássio (1, 16 M), misturando-se 200 µL dos padrões a 1 O µL de iodeto de potássio e 20 µL de ácido acético e agitando a placa por 6 minutos antes da leitura. O resultado final foi expresso em µmol/L. 4. Determinação da 8-Hidroxi 2 deoxiguanosina (8-OHdG) A determinação e a quantificação da 8-hidroxi- 2- deoxi gu anosina (8-OHdG) será realizada pelo método de ELISA (Stressgen® DNA Damage ELISA Kit, Ann Arbor, MI), seguindo as recomendações do fabricante, sumarizadas a seguir. Previamente à detecção, as amostras de soro ou fluido devem ser diluídas em um diluente específico do Kit em concentração 1:20 (v/v), devendo ser preparado no mínimo 150 µL desta solução (amostra diluída) para que a detecção possa ser realizada em duplicata. Durante a preparação dos reagentes, a amostra diluída permanece em temperatura ambiente. A curva de calibração é feita com padrão conhecido de 8-OHdG nas concentrações de 0,94 ng/mL a 1 O ng/mL. Para o procedimento, em uma placa previamente sensibilizada com anticorpos anti-8-OHdG, adiciona-se 50µL das amostras e dos padrões em cada poço, realiza-se uma primeira lavagem da placa e a segu ir adiciona-se 50 µL de anticorpo anti-8OHdG previamente diluído em cada poço, exceto no branco. Após incubação à temperatura ambiente por 1 hora, realizam-se 6 lavagens da placa com solução tampão. Adiciona-se 100 µL do conjugado HRP - anti-IgG de camundongo a cada poço, exceto no branco e incuba-se por mais 1 hora à temperatura ambiente. Após mais uma lavagem, adiciona-se 1 00µL do substrato TMB em cada poço, incuba-se por 1 O minutos no escuro e adiciona-se I00µL da solução de parada. A cor obtida é estável por 30 minutos e a absorbância é medida em 450 nm. A intensidade da cor amarela é inversamente proporcional a concentração de 8-OHdG expressa em ng/mL. Manuscrito 1 110 5. Determinação da concentração de vitamina E (Vit E) A determinação da concentração de Vit E ( a-tocoferol) no soro e no FF foi realizada segundo o método descrito por Arnaud et al. (1991), como detalhado a seguir. Uma amostra de 0,5 mL de soro ou FF foi homogeneizada em 2,0 mL de etanol. Em seguida foi colocada em 1,0 mL de n-hexano e agitada por 2 min. Uma alíquota de 0,5 mL do sobrenadante (n-hexano) foi pipetada, cuidadosamente, em tubo de ensaio seco em nitrogênio, ressuspensa em 0,5 mL de fase móvel, composta por acetonitrila/ diclorometanol/ metanol (70:10:20, v/v/v) e filtrada. Uma quantidade de 100 µL foi injetada na HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e a leitura efetuada como descrito a seguir. Para a determinação das concentrações da Vit E foi utilizado um HPLC modelo Shimadzu LC­ �' usando uma coluna tipo C-18 (Simpack CLC-ODS 4,6 x 25 cm), uma pré-coluna de 4 mm x 1 cm, com fluxo de 2 mL/min. A leitura foi realizada por espectofotometria com um detector UV Nis a 292 nm. O equipamento foi calibrado com soluções padrões de a-tocoferol (SIGMA), nas concentrações de 1 O, 20 e 200 µmol/L. Antes de cada leitura foi injetada uma solução padrão de a-tocoferol na concentração de 20 µmol/L. O equipamento foi programado para que os resultados fossem expressos em µmol/L para o soro e FF. 6. Determinação da concentração de glutationa (GSH) - concentração total de grupos tióis ou sulfidrilas A GSH do soro e FF foi medida por um método descrito originalmente por ELLMAN (1959) e modificado por HU (1994), no qual os grupos tióis interagem com o ácido ditionitrobenzóico (DTNB) formando um ânion altamente colorido com um pico máximo a 412 □M (e412 = 13,600M-1cm·1). Nesse ensaio, uma alíquota de 25 µL de soro ou fluido é misturada a 1 mL de tris-EDTA buffer (25 nmol/L Tris-base, 20 mmol/L EDTA, pH 8,2) e a leitura da absorbância é realizada em um comprimento de onda de 412 □M. Após esta leitura, uma alíquota de 25 µL de solução estoque de DTNB (1 O nmol/L em etanol absoluto) é adicionada à solução, que é mantida a temperatura ambiente durante 15 minutos. Após este período, nova leitura é realizada utilizando como branco o DTNB (Costa et al., 2006). A concentração de grupos sulfidril foi calculada utilizando-se a glutationa reduzida e o resultado foi expresso em nmol/g proteína. 7. Determinação da Superóxido Dismutase (SOD) A SOD foi avaliada seguindo o protocolo do Kit Frutosamina da Labtest Diagnóstica S.A. modificado. Para a dosagem com inibição foram preparados dois tubos eppendorfs, no primeiro tubo foi colocado 50 µl de fluido, 50 µl de HCL a 2N e incubado por dois minutos a temperatura de 37ºC, em seguida adicionou-se 100 µl de NaOH IM. No segundo tubo foi colocado 500 µl de reagente do kit e incubado por dois minutos a temperatura de 3 7ºC, depois foi adicionado 100 µl da solução do primeiro tubo e incubada por 1 O minutos a temperatura de 3 7°. Os dois tubos foram lidos separadamente em 530nm, sendo lido o primeiro e cinco minutos depois o segundo tubo. Para a Manuscrito 1 111 dosagem sem inibição foi feito um tubo eppendorf onde foi colocado 500 µI de reagente do kit e incubado por dois minutos a temperatura de 37C, logo em seguida foi adicionado 25 µI da amostra, mais 25 µIde HCL a 2N e 50 µI de NaOH a IM, essa mistura foi homogeneizada e incubada a temperatura de 3 7ºC por dez minutos e foi realizada a leitura. Os cálculos foram: sem inibição=A2-Al (S); com inibição=A2-Al (C); %inibição=(CX100)/S; U/mL=(%inibiçãoX500)/(%inibição do padrão). 8. Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) A CAT do soro e fluido folicular foi medida por um método baseado na 2, 2-azinobis-3- etilbenzotiazolina-6-sulfonato (ABTS) (Erel, 2004, Costa et al., 2006). Nesse ensaio, ATBS é incubada com potássio persulfato para produzir a oxidação do ATBS. Em resumo, uma amostra de 10 mg de ATBS será dissolvida em 1 O mL de uma solução aquosa contendo 2,5 mmol/L de persulfato de potássio. Esta solução será deixada no escuro em temperatura ambiente, de uma a quatro horas, antes de ser usada. Para o estudo das amostras, a solução de estoque ATBS oxidada será diluída em águ a deionizada em absorvância de O, 70 a 734 m. Cerca de 1 O minutos após a adição de lmL de ABTS oxidado diluído em 1 O µL de soro ou fluido folicular, será realizada a leitura da absorvância. A CA T foi calculada utilizando Trolox® (OXIS Intemational Inc., USA) como padrão e o resultado será expresso em mEq Trolox® /L. 9. Determinação de Proteínas Totais (FOX, MDA e GSH são expressos por g proteína) As determinações de proteínas nas amostras de soro e FF foram realizadas pelo kit Proteínas Totais Labtest®. O princípio dessa metodologia está na reação entre o íon cobre do reagente biureto, que reage em contato com as ligações peptídicas da proteína, produzindo uma cor púrp ura, que deve ser lida a 54011m no espectrofotômetro. Análise estatística Foi realizada uma análise descritiva a fim de caracterizar a amostra estudada. Para as comparações dos marcadores entre os grupos e os compartimentos sérico e folicular, foi aplicado o modelo de regressão linear com efeitos mistos ( efeitos aleatórios e fixos) e o pós-teste por contrastes ortogonais. Para estas análises foram utilizados a PROC MEANS e PROC MIXED do programa estatístico SAS® 9.0. Para as análises de valor de corte, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia, foram realizadas Curvas ROC, através do software R. Para definir os marcadores adequados para predição de gestação clínica e nascidos vivos, foram selecionados aqueles Manuscrito 1 112 com área sob a curva (AUC) maior ou igual a 70% e, para estes, foram determinados os valores de corte que apresentaram maior sensibilidade e acurácia para predizer gestação clínica e nascidos vivos. Foi considerado o nível de significância de 5% (p<0,05). Resultados Variáveis clínicas, resposta à estimulação ovariana e resultados de ICSI em pacientes inférteis com e sem endometriose. Não observamos diferença significativa entre os grupos avaliados com relação à média de idade, peso, estatura, FSH basal, dose total de FSH usada, duração da EOC, espessura endometrial no dia da transferência embrionária, número de oócitos captados e maduros, número de embriões de boa qualidade, total de embriões formados e número de embriões transferidos (Tabela 1). Também não se evidenciou diferença entre as taxas de fertilização, implantação, gestação clínica e nascidos vivos entre os grupos (Tabela 1). Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de pacientes inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada para ICSI, no dia da captação oocitária No soro, o grupo com endometriose apresentou maiores concentrações de GSH (p=0,03) e SOD (p=0,02) e menores de CAT (p<0,01) comparado ao sem endometriose. Além disso, foi observada uma tendência a maiores concentrações de FOX1 no grupo endometriose, comparado ao sem endometriose (p=0,05; Tabela 2). No fluido folicular, o grupo com endometriose apresentou maiores concentrações de 8OHdG (p<0,01) e Vit E (p=0,03) comparado ao grupo sem endometriose (Tabela 2). As comparações entre as concentrações séricas e foliculares dos oito marcadores de estresse oxidativo intra-grupos também estão apresentadas na Tabela 2. No grupo com endometriose, observaram-se maiores concentrações de FOXI (p<0,01), AOPP (p=0,03), Vit E (p<0,01) e SOD (p<0,01) e menores concentrações de 8OHdG, GSH e CAT (p<0,01) no soro do que no FF. Já no grupo sem endometriose, foram encontradas maiores concentrações de FOXI (p<0,01), Vit E (p<0,01) e SOD (p=0,02) e menores concentrações de GSH (p<0,01) no soro do que no FF (Tabela 2). Análise das curvas ROC Foram realizadas curvas ROC e calculadas a área sob a curva (AUC) para todos os marcadores analisados no soro e FF nos grupos com e sem endometriose. Consideramos como marcadores adequados para discriminação de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos aqueles AUC � 70%. Na tabela 3 estão apresentados a AUC, valores de corte, sensibilidade, especificidade, valores Manuscrito 1 113 preditivo positivo e negativo e acurácia apenas dos marcadores de EO considerados adequados preditores de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI nos grupos com e sem endometriose. No grupo com endometriose, nenhum marcador de EO foi identificado como bom preditor sérico de ocorrência de gestação clínica e de nascidos vivos. No FF deste grupo, a 8OHdG foi o único marcador que se apresentou como adequado preditor de ocorrência de gestação clínica (AUC = 87,5%) (Figu ra 2A; Tabela 3). Concentrações foliculares de 8OHdG de 28,02 ng/mL apresentaram discriminação máxima de ocorrência de gestação clínica (sensibilidade de 87,5%, especificidade de 100% e acurácia de 89%) (Figu ra 2A; Tabela 3). O único marcador no FF que apresentou área sob a curva 2: 70% para discriminar a ocorrência de nascidos vivos foi a CAT (AUC = 74,26%). Níveis foliculares de CAT de 0,53 mEq Trolox/L apresentaram discriminação máxima de ocorrência de nascidos vivos, com sensibilidade de 100%, especificidade de 52,94% e acurácia de 62%. (Figura 2B; Tabela 3). No grupo sem endometriose, a 8OHdG foi o único marcador considerado adequado preditor sérico de ocorrência de gestação clínica (AUC = 74,03%; Figu ra 2C; Tabela 3) e de nascidos vivos (AUC = 81,82%; Figu ra 2D; Tabela 3). Para predizer gestação clínica, valores séricos de 8OHdG de 15,59 ng/mL apresentaram sensibilidade de 78,57%, especificidade de 54,55% e acurácia de 72% (Figu ra 2C; Tabela 3). Já para predizer nascidos vivos, valores séricos de 8OHdG de 18,11 ng/mL apresentaram sensibilidade de 81,82%, especificidade de 67,86% e acurácia de 72% (Figu ra 2D; Tabela 3). Dos marcadores avaliados no FF do grupo sem endometriose, a GSH foi o único considerado adequado preditor de ocorrência de gestação clínica (AUC = 72,05; Figu ra 2E; Tabela 3) e de nascidos vivos (AUC = 72,05; Figu ra 2F; Tabela 3). Concentrações foliculares de GSH de 277,25 nmol/g proteína apresentaram discriminação máxima de ocorrência de gestação clínica (sensibilidade de 73 ,91 %, especificidade de 85, 71 % e acurácia de 77%) e de nascidos vivos ( sensibilidade de 85, 71 %, especificidade de 73,91 % e acurácia de 77%) (Figuras 2E e 2F; Tabela 3). Discussão Os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose ainda não foram completamente elucidados (Holoch and Lessey, 2010). Entretanto, algu ns autores apontam a possibilidade da endometriose ser uma doença relacionada ao EO (Agarwal et al., 2003, Szczepanska et al., 2003, Gupta et al., 2008). Questionamos, assim, o papel do EO na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, particularmente associado à piora da qualidade oocitária, o que poderia estar envolvido no comprometimento da fertilidade natural e, também, nas controversas menores taxas de implantação e/ou gestação observadas em portadoras desta afecção submetidas à FN (Barnhart et al., 2002, Harb et al., 2013). Todavia, não encontramos estudos avaliando conjuntamente diferentes marcadores pró e antioxidantes no soro e FF de mulheres com infertilidade Manuscrito 1 114 relacionada à endometriose, e avaliando seu papel nos resultados da FIV e ICSI. Diante disso e da importância em se fundamentar novas abordagens passíveis de melhorar a fertilidade natural e otimizar os resultados dos procedimentos de reprodução assistida nestas pacientes, o presente estudo comparou os níveis de oito marcadores de EO (FOX1, MOA, AOPP, 8OHdG, GSH, Vit E, SOD e CA T) no soro do dia da captação oocitária e no FF de mulheres inférteis com e sem endometriose (infertilidade de causa tubária e/ou masculina) submetidas à EOC para ICSI. Além disso, foi avaliado o possível papel destes marcadores no soro e no FF nos dois principais resultados da ICSI (gestação clínica e nascidos vivos) nos dois grupos. Demonstramos maiores níveis de GSH e SOD e menores níveis da CAT no soro do grupo com endometriose, sugerindo a ocorrência de EO sistêmico em pacientes inférteis com a doença, corroborando estudos de Lambrinoudaki et al. (2009), Bordin et al. (2010) e Andrade et al. (2010) que associam a endometriose ao EO sistêmico, analisando outros marcadores de EO distintos dos aqui avaliados. O aumento de GSH e SOD sugere haver uma mobilização do sistema antioxidante sérico na tentativa de neutralizar o prévio aumento de agentes pro-oxidantes, sugerido neste estudo pela tendência a maiores níveis de FOX1 circulantes, uma vez que este marcador, quando elevado, é indicador de maior produção de espécies reativas (Mier-Cabrera et al., 2008). O único estudo na literatura que analisou o total de hidroperóxidos no soro de portadoras de infertilidade relacionada à endometriose foi publicado pelo nosso grupo (Andrade et al., 2010), analisando este marcador na fase folicular precoce do ciclo natural, com achados similares aos aqui apresentados analisando amostras séricas obtidas após EOC, no dia da captação oocitária. Os menores níveis da CA T indicam consumo de outros antioxidantes presentes, culminando com diminuição da capacidade antioxidante total no compartimento sérico. A GSH, por ter importante papel na neutralização do peróxido de hidrogênio e dos peróxidos orgânicos, estes produzidos abundantemente em processos inflamatórios (El-Shahat and Kandil, 2012), pode indicar uma resposta antioxidante sistêmica frente às reações inflamatórias provocadas pelos implantes endometriais ectópicos (Gupta et al., 2008). Entretanto, contrariamente aos presentes achados, Jana et al. (2013) encontraram menores níveis de GSH em soro de mulheres com endometriose comparadas a controles. Da mesma forma, os maiores níveis de SOD no soro de mulheres com endometriose evidenciados no presente estudo contrariam os resultados de Jana et al. (2013) e também os de Prieto et al. (2012), que observaram menores níveis deste marcador no grupo com endometriose. No entanto, o trabalho de Jana e colaboradores foi realizado com amostras coletadas na fase folicular precoce do ciclo menstrual (Jana et al., 2013), diferentemente do presente estudo, em que as amostras sanguíneas foram coletadas no dia da captação oocitária, o que dificulta a comparação dos dados e pode justificar as discrepâncias encontradas, uma vez que a EOC parece promover aumento da SOD em mulheres submetidas a FIV ou illl (Younis et al., 2012). Prieto et al. (2012), por sua vez, avaliaram apenas pacientes com endometriose moderada e grave, sendo que o avanço no estadiamento da doença pode estar relacionado à ocorrência de estresse oxidativo mais pronunciado (Jackson et al., 2005), com maior consumo de antioxidantes. Os menores níveis da CAT encontrados no presente estudo corroboram os Manuscrito 1 115 achados de Jana et al. (2013) e de Szczepanska et al. (2003), os quais evidenciaram menores níveis deste marcador, respectivamente, no soro e fluido peritoneal de mulheres com a doença, sugerindo, também, que o compartimento sérico esteja refletindo o status redox do microambiente peritoneal. Com relação ao compartimento folicular, o grupo com endometriose apresentou maiores níveis de 8OHdG e Vit E no FF comparado ao grupo sem endometriose, sugerindo ocorrência de estresse oxidativo também neste microambiente reprodutivo de pacientes inférteis com a doença submetidas a EOC. Esta é a primeira vez em que a 8OHdG é avaliada no FF de mulheres com endometriose, sendo este um achado de grande importância para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à doença. A presença de elevados níveis da 8OHdG no FF de mulheres inférteis com endometriose sugere a ocorrência de dano oxidativo ao DNA neste microambiente reprodutivo, que pode promover comprometimento da qualidade gamética, como sugerido pelos estudos que serão apresentados a seguir. Segundo Seino et ai. (2002), níveis elevados da 8OHdG nas células da granulosa de mulheres inférteis submetidas a FIV têm correlação negativa com taxa de fertilização e formação de embriões de boa qualidade. Corroborando estes achados, Tamura et ai. (2008) demonstraram que elevados níveis da 8OHdG no FF de mulheres submetidas a FIV foram correlacionados com maiores taxas de oócitos degenerados, sugerindo que a elevação deste marcador de EO a nível folicular tenha efeito tóxico sobre a maturação oocitária. Com base na análise imunohistoquimica da 8OHdG, Matsuzaki and Schubert (2010) sugerem que o córtex ovariano saudável adjacente a um endometrioma é afetado mais severamente pelo EO do que o córtex adjacente a cistos ovarianos benignos de outra origem, indicando maior dano ao DNA no ovário de mulheres com a doença. Somado a isso, um estudo recente Polak et al. (2013) aponta haver maiores níveis de 8OHdG no FP de mulheres com endometriose comparadas a pacientes com cistos serosas e dermóides, sugerindo que o FP dessas pacientes pode ter efeito na infertilidade relacionada a endometriose. Estudo publicado por nosso grupo (Barcelos et al., 2009) sugeriu comprometimento e/ou retardo na conclusão da meiose de oócitos maturados in vitro, provenientes de ciclos estimulados de mulheres inférteis com endometriose. Um outro interessante estudo realizado pelo nosso grupo demonstrou que o fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à EOC para ICSI promove anomalias meióticas oocitárias em modelo bovino (Da Broi et ai., 2014). Analisando conjuntamente estes achados e os do presente estudo, hipotetizamos que a presença de estresse oxidativo no compartimento folicular de mulheres inférteis com endometriose, representada pela maior concentração de 8OHdG, esteja relacionada a ocorrência de dano oxidativo e anomalias oocitárias oocitárias, participando da etiopatogênese da infertilidade relacionada à doença nestas mulheres, corroborando os achados em células da granulosa e fluido peritoneal apresentados na literatura. Os maiores níveis de Vit E encontrados no FF de mulheres com a doença, por sua vez, indicam uma mobilização do sistema antioxidante folicular na tentativa de neutralizar espécies reativas e evitar danos oxidativos oocitários. Entretanto, essa mobilização não teria sido capaz de prevenir o dano oxidativo, como evidenciado pelos maiores níveis da 8OHdG. Este achado contraria tanto um estudo Manuscrito 1 116 recente de Singh et ai. (2013), que encontrou menores níveis de Vit E no FF de mulheres com a doença, como os estudos de Campos Petean et ai. (2008) e Prieto et ai. (2012), nos quais não foi evidenciada diferença nos níveis de Vit E entre o FF de pacientes inférteis com endometriose e controles. Todavia, os critérios de elegibilidade dos sujeitos dos referidos estudos são heterogêneos, assim como os protocolos de estimulação ovariana, dificultando a comparação dos resultados. Associadamente a isto, nestes estudos não foi apresentado o poder de teste das análises realizadas. Com base nos presentes achados e considerando um estudo de Tamura et al. (2008), no qual, a administração de vitamina E ( a­ tocoferol, 600 mg/dia), do quinto dia do ciclo anterior ao tratamento até o dia da captação oocitária de pacientes inférteis submetidas a FN reduziu as concentrações intrafoliculares da 8OHdG com relação ao ciclo prévio, questionamos a importância de terapias antioxidantes adicionais, especificamente, da administração de Vit E, visando à prevenção de danos oxidativos ao DNA em pacientes inférteis com endometriose, o que necessita de estudos pertinentes. Quando comparados os marcadores entre soro e FF no grupo endometriose, evidenciou-se que no soro há maiores níveis de FOX1, AOPP, Vit E e SOD do que no FF e no FF há maiores níveis de 8OHdG, GSH e CAT do que no soro. Maiores níveis séricos de FOX1 e AOPP sugerem, respectivamente, maior produção de espécies reativas e maior dano oxidativo proteico a nível sistêmico, não prevenidos pela maior mobilização dos antioxidantes SOD e Vit E. Os maiores níveis de 8OHdG no FF sugerem dano preferencial ao DNA no microambiente folicular de mulheres com endometriose, o que poderia estar relacionado a dano oxidativo oocitário nessas pacientes como previamente mencionado; ao passo que, maiores níveis foliculares de GSH e CAT em relação ao soro indicam haver uma maior mobilização do sistema antioxidante no microambiente folicular destas mulheres, que habitualmente apresenta forte defesa antioxidante para proteção do folículo contra o EO (Angelucci et al., 2006). Já no grupo sem endometriose, encontrou-se maiores níveis de FOX1, Vit E e SOD no soro do que no FF e maiores níveis de GSH no FF comparado ao soro. Estes achados diferem dos apresentados por Sabatini et ai. (1999) que afirmam haver maior atividade da SOD no FF comparado ao soro de mulheres submetidas a EOC para FN. Campos Petean et ai. (2008) compararam Vit E e MDA entre soro e FF de mulheres com e sem a doença, tendo encontrado maiores níveis de Vit E no soro tanto no grupo com como no sem endometriose, corroborando nossos achados. No entanto, os níveis de MDA foram menores no FF do que no soro do grupo controle, sendo que, no presente estudo, não evidenciamos diferença para este marcador em nenhum dos grupos. Diferentemente do grupo com endometriose, no grupo sem endometriose não se observou maiores níveis de AOPP no soro do que no FF, e nem maiores concentrações de 8OHdG no FF comparado ao soro, sugerindo não haver evidências de dano oxidativo sistêmico a proteínas e ao DNA em nível folicular em mulheres inférteis sem a doença. Com a evidência de EO sistêmico e folicular em pacientes com endometriose submetidas à EOC e, sabendo-se que baixas concentrações de espécies reativas têm importância na modulação fisiológica de vários fenômenos do trato reprodutivo feminino, como a maturação oocitária, a atresia Manuscrito 1 117 folicular, a função do corpo lúteo, a interação gamética, a fertilização, o desenvolvimento e a implantação embrionária (Agarwal et al., 2005, Fujii et al., 2005), avaliamos o papel dos marcadores de estresse oxidativo analisados no soro e no FF nos dois principais resultados da ICSI, gestação clínica e nascidos vivos, nos grupos com e sem endometriose. Foram realizadas curvas ROC e considerados como marcadores adequados para discriminação de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos aqueles com AVC� 70%, para os quais foram determinados os valores de corte com máximo poder discriminatório para estes dois endpoints, sendo calculados suas respectivas sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo e acurácia, sendo estes dados inéditos na literatura. Dispomos de um estudo que avaliou marcadores de estresse oxidativo no FF para predição de viabilidade embrionária, tendo identificado valor de corte apenas para os níveis de espécies reativas de oxigênio, acima do qual, a formação de embriões viáveis não é favorável (Jana et al., 2010). Temos um outro estudo recentemente publicado (Singh et al., 2013) que avaliou se os níveis de espécies reativas de oxigênio no FF de mulheres inférteis com e sem endometriose são capazes de discriminar entre oócitos maduros e imaturos, evidenciando que valores de ERO::; 105,36 cps apresentaram máximo poder discriminatório para oócitos maduros (73,68% de sensibilidade e 89,74% de especificidade) no grupo com endometriose. No presente estudo, no grupo sem endometriose, o marcador 8OHdG foi identificado como o melhor preditor sérico e a GSH como o melhor preditor folicular tanto de gestação clínica como de nascidos vivos. No grupo com endometriose, no entanto, nenhum marcador foi identificado como bom preditor sérico para os endpoints avaliados, assim como, não houve bom preditor folicular de nascidos vivos. A 8OHdG, por sua vez, foi o melhor preditor folicular de ocorrência de gestação clínica no grupo endometriose, tendo apresentado a melhor área sob a curva de todos os marcadores avaliados nos diferentes microambientes e grupos, assim como, alta acurácia, sensibilidade e especificidade. Estudos com maiores casuísticas são necessários para confirmar a acurácia dos marcadores identificados no presente estudo para discriminação de gestação clínica e nascidos vivos, no soro e FF de mulheres inférteis com e sem endometriose, o que seria de grande valia na determinação do prognóstico gestacional destas pacientes e no delineamento de estudos de intervenção avaliando o papel de antioxidantes específicos nos subgrupos indentificados. É importante ressaltar que, no presente estudo, foram adotados critérios de elegibilidade bastante seletivos para os sujeitos da pesquisa, evitando-se a interferência de outros fatores associados ao estresse oxidativo e piora de qualidade oocitária e resultados da ICSI, minimizando, assim, possíveis vieses de seleção amostral. Neste sentido, foram elegíveis para o estudo apenas pacientes submetidas a videolaparoscopia e que não apresentavam outras condições potencialmente associadas ao EO e piora de qualidade oocitária, como idade avançada, aumento do FSH basal, obesidade, doenças associadas ao EO, uso de medicações e suplementos vitamínicos. No grupo de estudo o único fator relacionado à infertilidade identificado era a endometriose, o que também toma este grupo bastante homogêneo. Além disso, adotou-se um protocolo rígido para a coleta das amostras, tendo-se optado pela obtenção do Manuscrito 1 118 sangue previamente à aplicação do anestésico e pela obtenção e análise do fluido folicular aspirado apenas do primeiro folículo do primeiro ovário puncionado de cada paciente, com 15 mm ou mais de diâmetro (pela maior possibilidade de conter um oócito maduro), com ausência de contaminação sanguínea à inspeção visual e um oócito captado, a fim de evitar possíveis vieses decorrentes do estresse anestésico e da própria punção ovariana, que pudessem influenciar os níveis de marcadores de EO analisados no FF. Entretanto, como principais limitações deste estudo, podemos considerar a pequena casuística avaliada, decorrente dos critérios de seleção extremamente rigorosos, assim como, a EOC a que todas as pacientes foram submetidas, persistindo a dúvida se os presentes achados relativos aos marcadores de EO no soro e FF podem ser extrapolados para os ciclos naturais de mulheres com e sem a doença. Tem sido muito pouco estudado se a EOC interfere com o balanço oxidante/antioxidante sérico e folicular. Em um estudo com pequena casuística foi demonstrado que o produção de ERO pelas células da granulosa não difere em ciclos estimulados e não estimulados (Jancar et ai., 2008), mas persiste a lacuna no conhecimento sobre a investigação de marcadores locais e sistêmicos de EO em ciclos não estimulados. Resumidamente, os resultados do presente estudo indicam ocorrência de estresse oxidativo sistêmico, representado sobretudo pela menor CAT, e folicular, evidenciado principalmente pelas maiores concentrações de 8OHdG, marcador de dano oxidativo ao DNA, em pacientes inférteis com endometriose submetidas à EOC para ICSI. Sendo o folículo ovariano uma estrutura altamente vascularizada durante os estágios finais da foliculogênese, hipotetizamos que tanto o estresse oxidativo sistêmico, como o EO no microambiente folicular possam favorecer o comprometimento da qualidade oocitária, participando da etiopatogênese da infertilidade em mulheres com endometriose. Evidenciamos diferenças nas comparações entre os níveis séricos e foliculares dos oito marcadores estudados dentro dos grupos com e sem endometriose, sugerindo haver diferenças no balanço oxidante/antioxidante sistémico e folicular relacionadas à doença. Demonstramos que alguns dos marcadores de EO estudados mostraram-se bons preditores de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI, abrindo perspectivas de utilização dos mesmos na determinação do prognóstico gestacional após-ICSI e fundamentação de novas abordagens terapêuticas. Dessa forma, estudos futuros com casuística ampliada, avaliando a aplicabilidade destes marcadores na predição de sucesso de ICSI e o delineamento de estudos que visem abordagens terapêuticas mais específicas são de grande importância para o manejamento adequado destas pacientes e o melhor entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. AUTHOR'S ROLES MG Da Broi was responsible for selection of the patients, acquisition of data, methodology, interpretation of data and manuscript writing. FO Albuquerque gave substantial contributions to acquisition and interpretation of data and manuscript writing. AZ Andrade gave substantial contributions to selection of the patients and acquisition of data. RL Cardoso contributed to the Manuscrito 1 119 selection of the patients and acquisition of data. AA Jordão Junior contributed to interpretation of data and revising critically the manuscript. PA Navarro contributed to conception and design, interpretation of data, revising critically the manuscript, final approval of the version to be published and was the coordinator ofthe project. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank the staff of the Human Reproduction Laboratory, University Hospital, Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo (FMRP-USP), especially Maria Cristina Picinato and Roberta Cristina Giorgenon for collection of FF, the Nutrition and Metabolism Laboratory, FMRP-USP, especially Paula Payão and Virginia Li poli for technical support, and Jhenifer Klienchen Rodrigues for collection of FF and for assisting in quantification of some OE markers. FUNDING This study received financial support from the Nati onal Council for Scientific and Technological Development (CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico; 474858/2009-0; 309056/2009-8; 503867/2010-1) and FAPESP (2008/58197-6). CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflicts of interest. Referências 1. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. 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