{"paper_id":"2886a184-e52c-4d7c-a8d8-ba91f10ebab3","body_text":"Felipe Oliveira de Albuquerque \nMarcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de \nmulheres com infertilidade relacionada à endometriose como \npreditores de sucesso gestacional após ICSI \nDissertação apresentada à Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto da \nUniversidade de São Paulo para obtenção \ndo título de Mestre em Medicina. \nÁrea de concentração: Ginecologia e \nObstetrícia \nOrientadora: Profa. Ora. Paula Andrea de \nAlbuquerque Salles Navarro \n2014 \n\nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional \nou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. \nFICHA CATALOGRÁFICA \nAlbuquerque, Felipe Oliveira de. \nMarcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de \nmulheres com infertilidade relacionada à endometriose como preditores de \nsucesso gestacional após ICSI \n122 p. il: 30cm. \nDissertação para título de Mestre apresentada à Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Área de \nconcentração: Ginecologia e Obstetrícia. \nOrientadora: Navarro, Paula Andrea de Albuquerque Salles. \n1. Endometriose. 2. Infertilidade feminina. 3. Fluido folicular .\n4. Fluido sérico. 5. Estresse oxidativo.\n\nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \nFelipe Oliveira de Albuquerque \nMarcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de \nmulheres com infertilidade relacionada à endometriose como \npreditores de sucesso gestacional após ICSI \nRibeirão Preto \n2014 \n\nFOLHA DE APROVAÇÃO \nMarcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de mulheres com \ninfertilidade relacionada à endometriose como preditores de sucesso \ngestacional após ICSI \nBanca examinadora: \nProf. Dr. Rodrigo Alves Ferreira \nDisserta ção apresentada ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto para obten ção do Título de Mestre em \nCiências Médicas. \nÁrea de concentra ção: Ginecologia e Obstetrícia \nOrientador (a): Professora Doutora Paula Andrea de \nAlbu querque Salles Navarro \nAssinatura: ..................................................................... . \nProf. Dr. Wellington da Paula Martins \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP Assinatura: ..................................................... . \nProfa. Dra. Paula A. A. Sales Navarro \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP Assinatura: ..................................................... . \n\nDedicatória \n\nÀ minha família, razão da minha vida, por \nme incentivar e apoiar em todos momentos \ndeste estudo e a minha orientadora \nprofessora Paula pela entrega profissional \nestando sempre disposta a ajudar e \nenriquecer meus conhecimentos. \n\nAgradecimentos \n\nÀ minha orientadora, Professora Paula, minha profunda admiração e \nrespeito pela pessoa, profissional e pelo impecável trabalho que realiza \ncomo orientadora; \nAo programa de Pós-Graduação do Departamento Ginecologia e \nObstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto\\ USP, pela \noportunidade de ampliar meus conhecimentos em um centro de \nexcelência; \nAos colegas pós-graduandos, em especial, a Michelle por ter contribuído \npara construção deste estudo; \nA todos funcionários desta Pós-Graduação, e em especial a Suelen, \ncujos trabalhos são muito importantes para o bom funcionamento do \ncurso; \nAos meus avós, pais e irmão que sempre estiveram ao meu lado; \nÀ minha esposa e às minhas filhas; nelas encontro incentivo e \ninspiração necessários para enfretar as dificuldades e não desistir dos \nmeus sonhos. \n\nEpígrafe \n\nComo olhar, a razão \nDeus me deu, para ver \nPara além da visão-\nOlhar de conhecer. \nFernando Pessoa \n\nResumo \n\nALBUQUERQUE, FO. Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido \nfolicular de mulheres com infertilidade relacionada à endometriose como \npreditores de sucesso gestacional após ICSI. Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. \nINTRODUÇÃO. Os mecanismos etiopatogênicos responsáveis pela redução da \nfertilidade natural em portadoras de endometriose permanecem pouco elucidados, \ncom alguns achados sugerindo a participação do estresse oxidativo (EO). Todavia, \nnão dispomos de estudos avaliando conjuntamente diferentes marcadores de EO no \nsoro e fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com endometriose, importantes para \no entendimento global deste complexo processo. Por outro lado, não dispomos de\nestudos analisando o potencial papel preditor de marcadores de EO no soro e fluido\nfolicular (FF) na ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após estimulação\novariana controlada (EOC) para injeção intracitoplasmática de espermatozoide\n(ICSI) em mulheres inférteis com e sem endometriose. OBJETIVOS. Comparar oito\nmarcadores de estresse oxidativo, no soro do dia da captação oocitária e no FF de\nmulheres inférteis com e sem endometriose submetidas a EOC para ICSI e avaliar\nsua acurácia para predizer a ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após\nICSI. PACIENTES E MÉTODOS. Foi realizado um estudo transversal de outubro de\n2009 a outubro de 2010. As 151 pacientes elegíveis foram entrevistadas e 132\nassinaram o consentimento informado (sendo 65 do grupo controle, constituído por\ninfertilidade por fator tubário e/ou masculino e 67 do grupo endometriose, com\ninfertilidade relacionada exclusivamente à doença). Trinta e três das 132 pacientes\nnão foram submetidas à captação de oócitos. Das 99 que captaram oócitos, foram\nobtidas amostras de sangue de 50 pacientes sem endometriose e 49 com\nendometriose e FF de 32 pacientes sem endometriose e 35 com endometriose.\nOitenta e sete amostras de soro (43 com E e 44 sem E) e 61 amostras de FF (FF 29\ncom E e 32 sem E) tiveram dados analisados. No dia da captação oocitária foi\ncoletado sangue periférico e FF para análise das concentrações de total de\nhidroperóxidos (FOX1), malondialdeído (MOA), produtos avançados de oxidação\nprotéica (AOPP), 8-Hidroxi 2 deoxiguanosina (80HdG), vitamina E (Vit E), glutationa\n(GSH), superóxido dismutase (SOO) e Capacidade Antioxidante Total (CAT). O nível\ntotal de proteínas-foi-deteR11inado utilizand0-seKits Labtest- Osresultados obtidos\nforam comparados inter e intra-grupos. Em todas as análises foi considerado o nível\nde significância de 5% (p<0,05). Para a avaliação do poder discriminatório de cada\nmarcador de EO para a ocorrência de gestação clínica (GC) e nascidos vivos (NV)\napós ICSI foram construídas curvas ROC. Para os marcadores considerados\nadequados preditores (área sob a curva ?: 70%) foram determinados os valores de\ncorte com melhor sensibilidade, especificidade e acurácia para discriminar GC e NV\nnos dois grupos estudados. RESULTADOS. O grupo com endometriose apresentou\nmaiores níveis séricos de GSH (p=0,03) e SOO (p=0,02), menores níveis séricos da\nCAT (p<0,01) e maiores níveis foliculares de 80HdG (p<0,01) e Vit E (p=0,03)\ncomparado ao sem endometriose. No grupo com endometriose, o soro apresentou\nmaiores níveis de FOX1 (p<0,01), AOPP (p=0,03), Vit E (p<0,01) e SOO (p<0,01) e\nmenores níveis de SOHdG, GSH e CAT (p<0,01) comparado ao FF. No grupo sem\nendometriose, o soro apresentou maiores níveis de FOX1 (p<0,01), Vit E (p<0,01) e\nSOO (p=0,02) e menores níveis de GSH (p<0,01) comparado ao FF. No grupo com\nendometriose, nenhum marcador de EO foi identificado como bom preditor sérico de\nocorrência de CG e NV. No FF deste grupo, a 80HdG foi o único marcador que se\napresentou como adequado preditor de ocorrência de GC (valor de corte (VC): 28,02\n\nng/ml, sensibilidade (S): 87,5%, especificidade (E): 100% e acurácia (A): 89%). No \ngrupo sem endometriose, a 8OHdG apresentou-se como o melhor preditor sérico de \nGC (valor de corte: 15,59 ng/ml, sensibilidade (S): 78,57%, especificidade (E): \n54,55% e acurácia (A): 72%) e de NV (valor de corte: 18, 11 ng/ml, S: 81,82%, E: \n67,86% e A: 72%). Neste grupo, a GSH foi o único marcador folicular considerado \nadequado preditor de ocorrência de GC (VC: 277,25 nmol/g proteína, S: 73,91 %, E: \n85,71% e A: 77%) e de NV (VC: 277,25 nmol/g proteína, S: 85,71%, E: 73,91% e A: \n77%). CONCLUSÕES. Os resultados do presente estudo indicam a ocorrência de \nestresse oxidativo sistêmico e folicular em pacientes inférteis com endometriose \nsubmetidas à EOC para ICSI. Alguns dos marcadores estudados mostram-se bons \npreditores de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI, abrindo perspectivas de \nutilização dos mesmos na determinação do prognóstico gestacional após-lCSI. \nPalavras-chave: endometriose; infertilidade; estresse oxidativo; soro; líquido \nfolicular; ICSI; preditor de gravidez. \n\nAbstract \n\nALBUQUERQUE, FO. Oxidative stress markers in serum and follicular fluid of \nwomen with endometriosis-related infertility as predictors of successful \npregnancy after ICSI. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de \nSão Paulo, Ribeirão Preto, 2014. \nINTRODUCTION. The pathogenic mechanisms responsible for the reduction of \nfertility in women with endometriosis (E) remain poorly understood. Some evidence \nsuggests the involvement of oxidative stress (OS) in the genesis of infertility-related \ndisease . However, we have no studies evaluating different markers of oxidative \nstress in both serum and follicular fluid (FF) of infertile women with endometriosis, \nwhich is important to the overall understanding of this complex process. On the other \nhand, we have no studies examining the potential predictive role of OS markers in \nserum and FF in the occurrence of clinicai pregnancy (CP) and live bom (LB) after \ncontrolled ovarian stimulation (COS) for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in \ninfertile women with and without endometriosis. OBJECTIVES. To compare eight \nmarkers of oxidative stress in serum on the day of oocyte retrieval and in FF of \ninfertile women with and without endometriosis undergoing COS and ICSI to assess \ntheir accuracy in predicting the occurrence of CP and LB after ICSI. PATIENTS ANO \nMETHODS. We performed a Cross-Sectional study from October 2009 to October \n201 O. The 151 eligible patients were interviewed and 132 signed informed consent \n(with 65 in the contrai group, consisting of infertility due to tubal and / or male factor \nand 67 of the endometriosis group with infertility related exclusively to the disease). \nThirty-three of the 132 patients did not undergo oocyte retrieval. Of the 99 patier:its \nwhich have had captured oocytes, we obtained blood samples from 50 women \nwithout endometriosis and 49 with endometriosis and FF samples from 32 patients \nwithout endometriosis and 35 with endometriosis. Eighty-seven serum samples (43 \nwith and 44 without E) and 61 FF samples (29 with and 32 without E) were analyzed. \nOn the day of oocyte retrieval, peripheral blood and FF samples were collected for \nanalysis of total hydroperoxides (FOX1), malondialdehyde (MOA), advanced \noxidation protein products (AOPP), 8 -hydroxy 2 deoxyguanosine (8OHdG), vitamin \nE (Vit E), glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOO) and total antioxidant \ncapacity (TAC) concentrations. The total protein levei was determined using Labtest \nkits. The results obtained within and between groups were-compared.-ln-all0analyzes \nwe considered the level of significance of 5 % (p < 0.05). For assessing the \ndiscriminatory power of each OS marker for the occurrence of CP and LB after ICSI, \nROC curves were constructed. For markers considered adequate predictors (area \nunder the curve ;::: 70 %), we determined cutoff values with better sensitivity, \nspecificity and accuracy for discriminating CP and LB in both groups. RESUL TS. The \npatients with endometriosis had higher serum leveis of GSH (p = 0.03) and SOO (p = \n0.02), lower serum leveis of TAC (p < 0.01) and higher follicular 8OHdG leveis (p < O, \n01) and Vit E levels (p = 0.03) compared to those without endometriosis. ln the\nendometriosis group, the serum presented higher leveis of FOX1 (p < 0.01 ), AOPP\n(p = 0.03), Vit E (p <0.01) and SOO (P <0.01) and lower leveis of 8OHdG, TAC and\nGSH (p < 0.01) compareci to FF. ln the group without endometriosis, the serum had\nhigher leveis of FOX1 (p < 0.01 ), Vit E (p <0.01) and SOO (p = 0.02) and lower leveis\nof GSH (p < 0.01) compareci to FF. ln the endometriosis group, no OS marker was\nidentified as good serum predictor of CP and LB. ln the FF of this group, 8OHdG was\nthe only marker that was presented as an appropriate predictor of CP (cutoff value\n(CV) : 28.02 ng / ml, sensitivity (S): 87.5 % , specificity (Sp): 100 % and accuracy\n(A): 89%). ln the group without endometriosis, 8OHdG was presented as the best\n\nserum predictor of CP (cutoff : 15.59 ng / ml, sensitivity (S): 78.57 % , specificity \n(Sp): 54.55 % and accuracy (A): 72 %) and LB (cutoff value: 18.11 ng / ml, S: \n81.82% , Sp: 67.86 % and A: 72%). ln this group, GSH was the only marker \nconsidered adequate follicular predictor of CP 0/C : 277.25 nmol / g protein , S \n73.91 % , E: 85.71 % and A : 77 % ) and LB 0/C : 277.25 nmol / g protein , S : \n85.71 % , Sp: 73.91 % and A: 77%). CONCLUSIONS. The results indicate the \noccurrence of systemic and follicular oxidative stress in infertile patients with \nendometriosis undergoing COS for ICSI. Some of the studied markers showed to be \ngood predictors of clinicai pregnancy and live birth after ICSI, opening prospects for \ntheir use in determining gestational prognosis after ICSI. \nKeywords: endometriosis; infertility; oxidative stress; serum; follicular fluid; ICSI; \npredictor of pregnancy. \n\nLista de Figuras \n\nFigura 1. Esquema das pnnc1pais reações ocorridas durante o processo de \nperoxidação lipídica (LIMA, 2001) ............................................................................. 30 \nFigura 2. Esquema representativo da peroxidação lipídica, enfocando as \nprincipais substâncias formadas durante o processo e as metodologias \ndisponíveis para a sua avaliação (LIMA, 2001) . ....................................................... 30 \nFigura 3. Fluxograma do Estudo ............................................................................... 52 \nFigura 4. Curvas ROC das medidas das concentrações de marcadores de \nestresse oxidativo no soro e fluido folicular (FF) considerados adequados \ndiscriminadores (Área sob a curva -AUC ;;;: 70) de ocorrência de gestação clínica \n(GC) e nascidos vivos (NV) após ICSI para pacientes com e sem endometriose \nsubmetidas à estimulação ovariana. 8OHdG: 8-hidroxideoxiguanosina, expressa \nem ng/ml; GSH: glutationa reduzida, expressa em nmol/g proteína; CAT: \ncapacidade antioxidante total, expressa em mEq Trolox/L. A) e B): grupo com \nendometriose; C), D), E) e F): grupo sem endometriose . ......................................... 73 \n\nlista de Tabelas \n\nTabela 1. Variáveis clínicas, resposta à estimulação ovariana e resultados de \nICSI em pacientes inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação \novariana controlada . ................................................................................................. 67 \nTabela 2. Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de mulheres \ninférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada \ncom gonadotrofinas no dia da captação oocitária ..................................................... 69 \nTabela 3. Área sob a curva (AUC), valores de corte, sensibilidade, especificidade, \nvalores preditivo positivo e negativo e acurácia dos marcadores de estresse \noxidativo dosados no soro do dia da captação oocitária e fluido folicular de \npacientes inférteis sem endometriose e com endometriose submetidas à \nestimulação ovariana controlada, considerados adequados preditores de \nocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI.. .................................... 72 \n\nlista de Abreviaturas \n\nAOPP \nCAT \nCC \ncoe \nCP \nCuZn-S0D \nDEPC­\nD11-\nDI11-\nDNA­\nDTNB­\nEDCs­\nEDTA­\nEO -\nESCA \nFIV \nFMRP \nFOX1 \nFSH \nFSHr \nGnRH \nGnRHa \nGR \nGSH \nGSSG \nH202 \nhCG \nProdutos Avançados de Oxidação Protéica \nCapacidade Antioxidante Total \nCélulas do Cumu/us oophorus \nComplexo Cumulus oophorus \nCorpúsculo Polar \nCobre-Zinco Superóxido Dismutase \nDietilpirocarbonato \nSegundo dia de desenvolvimento embrionário \nTerceiro dia de desenvolvimento embrionário \nÁcido Desoxirribonucleico \nÁcido Ditionitrobenzóico \nDesreguladores Endócrinos (Endocrine Disrupting Chemicals) \nÁcido Etilenodiamino Tetra-Acético \nEstresse Oxidativo \nEsterilidade Sem Causa Aparente \nFertilização in vitro \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nTotal de Hidroperóxidos \nHormônio Folículo Estimulante \nHormônio Folículo Estimulante recombinante \nHormônio Liberador de Gonadotrofinas \nAgonista do Hormônio Liberador de Gonadotrofinas \nGlutationa Redutase \nGlutationa (Reduzida) \nGlutationa Oxidada \nPeróxido de Hidrogênio \nGonadotrofina Coriônica Humana \n\nhCGr \nHEPES \nHPLC \nHTF­\nICSI \nIM \nIMC \nIVM \nLOOH \nMOA \nMIi \nMn-SO0 \nNOS \nRNA \nRNS \nROS \nSHO \nsoo \nTBARS \nTCLE \nTNF-a \nTRA \nUSP \nUSTV \nVIT E \n13-hCG\nGonadotrofina Coriônica Humana recombinante \nÁcido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfónico \nCromatografia Líquida de Alta Eficiência \nMeio de Cultura Fluido Tubário Humano (Human Tuba/ Fluid) \nInjeção lntracitoplasmática de Espermatozóide \nlntramuscular \nÍndice de Massa Corporal \nMaturação in vitro \nHidroperóxido Lipídico \nMalondialdeído \nMetáfase li \nManganês Superóxido Dismutase \nÓxido Nítrico Sintetase \nÁcido Ribonucleico \nEspécies Reativas de Nitrogênio \nEspécies Reativas de Oxigênio \nSíndrome da Hiperestimulação Ovariana \nSuperóxido Dismutase \nSubstâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (Thiobarbituric acid \nreactive substances) \nTermo de Consentimento Livre e Esclarecido \nFator de Necrose Tumoral Alfa \nTécnicas de Reprodução Assistida \nUniversidade de São Paulo \nUltrassonografia Transvaginal \nVitamina E \nSubunidade Beta da Gonadotrofina Coriônica Humana \n\nSumário \n\n1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 26 \nEspécies reativas do oxigênio, antioxidantes, estresse oxidativo e trato \nreprodutivo feminino .............................................................................................. 27 \nEndometriose e Estresse Oxidativo ...................................................................... 33 \nE d t • • f rtld d I·d d • , • n orne nose, In e 1 1 a e e qua I a e ooc1tana .................................................. 36 \n2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 42 \n3. OBJETIVOS ......................................................................................................... 46 \nOBJETIVOS GERAIS ............................................................................................ 47 \nOBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 47 \n4. PACIENTES E MÉTODOS ................................................................................... 49 \nPacientes ............................................................................................................... 50 \nCasuística e Fluxograma do Estudo ...................................................................... 51 \nProtocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea .................. 53 \nCaptação Oocitária e Denudamento Oocitário ...................................................... 54 \nICSI, Taxas de Fertilização, Implantação, Gestação Clínica e Nascido Vivo ........ 56 \nAmostras Obtidas e Processamento ..................................................................... 57 \nSangue ............................................................................................................... 57 \nFluido Folicular ................................................................................................... 58 \nMetodologias ......................................................................................................... 58 \n1. Determinação da concentração total de hidroperóxidos (FOX1) .................... 58 \n2. Mensuração da concentração de malondialdeído (MOA) ............................... 59 \n3. Determinação da concentração dos produtos avançados de oxidação\nprotéica (AOPPs) ............................................................................................... 60 \n4. Determinação da 8-Hidroxi 2 deoxiguanosina (8-OHdG) ............................... 60 \n5. Determinação da concentração de vitamina E (Vit E) .................................... 61 \n6. Determinação da concentração de glutationa (GSH) - concentração total\nde grupos tióis ou sulfidrilas ............................................................................... 62 \n7. Determinação da Superóxido Dismutase (SOO) ............................................ 63 \n8. Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) ................................ 63 \n9. Determinação de Proteínas Totais (MOA, GSH e FOX são expressos por g\nproteína) ............................................................................................................. 64 \nAnálise Estatística ................................................................................................. 64 \n\n5. RESULTADOS ..................................................................................................... 66 \n6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 74 \n7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 85 \n8. REFERÊNCIAS ····························································································••N••·· 87 \nMANUSCRITO .......................................................................................................... 98 \n\n1. Introdução\n\nIntrodução 1 27 \nEspécies reativas do oxigênio, antioxidantes, estresse oxidativo e trato \nreprodutivo feminino \nAs espécies reativas, substâncias que possuem elétrons desemparelhados e \nalta capacidade de reagir com outros substratos, são formadas como produtos \nintermediários da metabolização celular e em concentrações fisiológicas parecem ter \nimportância na modulação de inúmeros processos fisiológicos do trato reprodutivo \nfeminino, como a foliculogênese e maturação oocitária, a função do corpo lúteo, a \ninteração gamética, a fertilização, o desenvolvimento e a implantação embrionária, \nbem como o declínio da fertilidade relacionado à idade (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; \nSHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; SHKOLNIK \net ai., 2011; AGARWAL et ai., 2012). \nQuando há um desequilíbrio entre os agentes pró-oxidantes (radicais livres) e os \nmecanismos antioxidantes de defesa do organismo, pode ocorrer o estresse oxidativo \n(EO), que tem sido envolvido na etiopatogênese da infertilidade de causa tubária, sem \ncausa aparente e tubo-peritoneral, com destaque para a endometriose (AGARWAL, \nA.;GUPTA, S.; SHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; \nGUPTA et ai., 2008; AGARWAL et ai., 2012). Os fluidos peritoneais, foliculares e das \nhidrossalpinges são microambientes reprodutivos, que abrigam gametas, zigotos e \nembriões por tempo variável. Alterações em sua composição química podem ter efeitos \nadversos nos processos reprodutivos, sendo que a presença de ROS e antioxidantes já \nfoi demonstrada nestes microambientes reprodutivos (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; \nSHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; AGARWAL et \nai., 2008; AGARWAL et ai., 2012). \nOs mecanismos que envolvem a produção e ação dos radicais livres, bem \ncomo a prevenção da gênese do estresse oxidativo por antioxidantes endógenos, \n\nIntrodução 1 28 \nem processos fisiológicos e patológicos do sistema reprodutivo feminino, ainda \nnecessitam de maior elucidação. O equilíbrio oxidativo do trato reprodutivo depende \nde alguns tipos de radicais livres e dos diferentes mecanismos antioxidantes que os \nneutralizam. Existem dois grandes grupos de radicais livres: as espécies reativas de \noxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS). Devido a sua instabilidade \ne sua alta reatividade, precisam adquirir elétrons de algum substrato, levando à \noxidação de componentes como áddos nucléicos, lipídios, proteínas, carboidratos, \ntióis, cofatores enzimáticos ou qualquer molécula em sua volta para se tornarem \nestáveis, causando uma reação em cadeia que pode culminar em dano celular e \ntecidual dalla(LIMA, 2001; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005). \nAs ROS são geradas a partir de reações orgânicas enzimáticas ou não­\nenzimáticas. As reações biológicas via transferência de elétrons ou via oxigenase, \nque utilizam moléculas de oxigênio (02) como substrato, geram grande quantidade \nde ROS. Como a cadeia respiratória mitocondrial é o principal sistema de consumo \nde 02 celular, a maior parte de ROS é produzida por este sistema sob condições \nfisiológicas (FUJll;IUCHI; OKADA, 2005). O radical superóxido (02-) é produzido \nquando há vazamento da cadeia de transporte de elétrons por redução-(O 2 + e - -+\n02) (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005). A dismutação de \nsuperóxidos e algumas enzimas oxidases podem gerar diretamente peróxido de \nhidrogênio (H2O2) (2 02-+ 2 H\n+ -+ H2O2 + 0 2) (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, \nR. K., 2005), que também pode ser gerado pela redução do 02- (02-+e-+ 2 H\n+\n-+\nH2O2)(BABIOR, 1997). O íon hidroxila (OH-) é formado da aquisição de um elétron \npelo H2O2 (H2O2 + e-+ H + \n-+ OH + H 2O) (BABIOR, 1997) e este radical é altamente \nreativo e pode modificar purinas e pirimidinas causando quebras no feixe de ácido \ndesoxiribonucleico (DNA) (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005). \n\nIntrodução 1 29 \nAs ROS estão envolvidas em eventos bioquímicos como a peroxidação \nlipídica, onde cascatas de reações podem levar a dano oxidativo nos lipídios \ninsaturados em membranas, levando à destruição de sua estrutura, falência dos \nmecanismos de troca de metabólitos e, em condições extremas, à morte celular \n(LIMA, 2001 ). Nos sistemas biológicos a peroxidação lipídica consiste na \nincorporação de oxigênio molecular a um ácido graxo poliinsaturado para produzir \num hidroperóxido lipídico (LOOH) como produto primário inicial, e pode ocorrer \nprincipalmente por duas vias: uma via enzimática envolvendo as ciclooxigenases e \nlipoxigenases; e a peroxidação não enzimática, que envolve a participação de ROS, \nRNS, metais de transição e outros radicais livres (AL-MEHDI et ai., 1993; \nPORTER;CALDWELL; MILLS, 1995; LIMA, 2001). Este processo pode ser dividido \nem três etapas: iniciação, propagação e terminação (Figura 1 ). A fase de iniciação \nrepresenta o início da peroxidação, em que o ácido graxo poliinsaturado sofre \nataque de uma espécie que é suficientemente reativa para abstrair um átomo de \nhidrogênio a partir de um grupo metileno (-CH2-), formando um radical de carbono. \nEste radical é estabilizado por um rearranjo molecular para formar um dieno \nconjugado, ou seja, duas duplas ligações intercaladas por uma ligação simples \n(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989). Em meio aeróbio, o radical alquila inicialmente \nformado se combina com o oxigênio formando o radical peroxila, o qual pode \nabstrair um hidrogênio alílico de outro ácido graxo, gerando outro radical de carbono \ne promovendo a etapa de propagação. A reação do radical peroxila com o átomo de \nhidrogênio abstraído gera um hidroperóxido lipídico (LOOH). Estes hidroperóxidos \nformados são prejudiciais para a estrutura e função das membranas celulares, como \npara estruturas protéicas, como receptores e enzimas (KATSIKI; MANES, 2009). \nPeróxidos cíclicos também podem ser formados, quando o radical peroxila reage \ncom uma dupla ligação na mesma cadeia de ácido graxo, o que também pode \npropagar a peroxidação lipídica (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989). \n\nR�' LH \nl �H, \n> .. ·�Propagaçl!o. ··• . ·. • R � R'. · ·•· .. . R.� •\nIntrodução 1 30 \n• °';\n+-\n·\n·\n••··\n·\n•··/ .. :·. •·. •· .. \n···\n·�.\n·\n·.•·.· .•., ... · .. ·.\n·\n• · •-?-\n.\n·•.L.• · .. · ·•.• ··• •• • ··. • ... · · .• .• .... ·x• ..\n.\n.\n.\n.\n... \n· ·\n•\n·\n·\n·\n•.\n·\n. ;;_�\n·\n·.H.>� LOO\n·\nH· •-\"-J. � • \n• ¼R 1 _ . · .. . . ·· �• . • . R . � � R' \ne>e>\" LOO• • ·· • . \nFigura 1. Esquema das principais reações ocorridas durante o processo de peroxidação \nlipídica (LIMA, 2001) \nA terceira e última etapa da reação, a fase de terminação, dá-se pela aniquilação \ndos radicais formados originando produtos não radiculares (GARDNER, 1989; \nHALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989). Os radicais peroxila e alcoxila também podem sofrer \ndismutação ou clivagem formando aldeídos, como o malondialdeído (MOA) (Figura 2). \nFigura 2. Esquema representativo da peroxidação lipídica, enfocando as principais \nsubstâncias formadas durante o processo e as metodologias disponíveis para a sua \navaliação (LIMA, 2001 ). \n\nIntrodução 1 31 \nAs ROS, além de gerarem dano a lipídios, podem levar a dano protéico com \nextensas lesões tissulares e alterações no DNA. Proteínas oxidadas são mais sensíveis à \nproteólise e o aumento destas proteínas oxidadas e dos produtos de sua oxidação pode \nser responsável pela perda de funções bioquímicas e fisiológicas (ZADAK et ai., 2009). O \nprocesso de estresse oxidativo que leva a formação de produtos avançados de oxidação \nprotéica (AOPP) envolve a ação de oxidantes cloradas, principalmente ácido hipocloroso \ne cloraminas, produzidas por mieloperoxidases em neutrófilos ativados. Acredita-se que \nos AOPP possam induzir citocinas inflamatórias e moléculas adesivas \n(KALOUSOVA;SKRHA; ZIMA, 2002), de modo que seus níveis estão relacionados com \nmarcadores de ativação de monócitos e resposta inflamatória (WITKO-SARSAT et ai., \n1998a; WITKO-SARSAT et ai., 1998b; KELL Y et ai., 2002). \nEm condições normais, todos os organismos têm mecanismos enzimáticos e não \nenzimáticos capazes de neutralizar as espéeies pró-oxidantes e/ou reparar os danos \ncausados pelas espécies reativas, convertendo-as em H2O, para prevenir a sua \nsuperprodução. Muitos antioxidantes de baixo peso molecular como vitaminas e \npolifenóis estão normalmente presentes em nutrientes, embora a neutralização \nenzimática das espécies reativas seja o mecanismo mais eficiente (AGARWAL, \nA.;GUPTA, S.; SHARMA, R., 2005; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; \nFUJll;IUCHI; OKADA, 2005). Os antioxidantes não-enzimáticos também são conhecidos \ncomo antioxidantes sintéticos ou suplementos dietéticos, este grupo influencia de maneira \nexógena o sistema de defesa antioxidante do organismo. Os mais comuns são: \nVitaminas C e E, selênio, zinco, taurina, hipotaurina, glutationa, beta-caroteno e caroteno. \nA vitamina C é um antioxidante que tanto interrompe a propagação do \nprocesso peroxidativo, como ajuda a reciclar a vitamina E e a glutationa oxidada \n(GSSG). A vitamina E (Vit E) pode tanto bloquear o início da peroxidação lipídica, \n\nIntrodução 1 32 \ncomo inibir, primariamente a sua etapa de propagação (ZINGG, 2007). Estudos \nmostram que a depleção nutricional de vitamina E é responsável pela diminuição da \ncapacidade de combater as espécies reativas de oxigênio (ZADAK et ai., 2009). \nA glutationa (GSH) está presente no oócito e no fluido tubário. Após a \nfertilização, a glutationa participa no processo de descondensação espermática \nparalelamente ao processo de ativação oocitária, bem como na transformação da \ncabeça espermatozóide no pronúcleo masculino (PERREAULT;BARBEE; SLOTT, \n1988; YOSHIDA, 1993). A GSH também desempenha importante função permissiva \npara o desenvolvimento do zigoto além do estágio de duas células, até os estágios \nde mórula e de blastocisto (AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R., 2005; \nAGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005). A GSH é o principal componente \nsulfidril não protéico em células de mamíferos e tem papel importante na proteção \ncelular ao estresse oxidativo, atuando na neutralização de peróxidos (MEISTER, \n1983), além de participar na reciclagem e manutenção dos níveis fisiológicos da Vit \nE, auxiliando na eliminação indireta do tocoferol oxidado (NWOSE et ai., 2008). \nAs células do cumulus (CC) participam da neutralização de ROS aumentando \no conteúdo de GSH no ovário, que agiria juntamente com as enzimas antioxidantes,\nna inibição de apoptose (TATEMOTO et ai., 2004). Os oócitos, células da granulosa, \ncélulas luteínicas e epitélio tubário expressam altos níveis de glutationa redutase \n(GR), responsável pela conversão da glutationa oxidada (GSSG) em reduzida. A \nGSH gerada protegeria os oócitos contra a produção excessiva de ROS durante a \nmaturação oocitária e a ovulação, preservando o potencial de fertilização oocitário \n(KANEKO et ai., 2001). \nAs defesas enzimáticas responsáveis pela neutralização de espécies reativas \ndo oxigênio são representadas, principalmente, pela superóxido dismutase (SOO), \n\nIntrodução 1 33 \ncatalase, glutationa peroxidase (GPx), dependente e independente de selênio, e \nglutationa redutase (GR) (FUJll;IUCHI; OKAOA, 2005). \nO ânion superóxido é produzido pela redução de um elétron de uma molécula \nde oxigênio, o que inicia a reação em cadeia. Acredita-:se que o papel da SOO na \nconversão do ânion superóxido em peróxido de hidrogênio (2 0 2- + 2 H+ ---+ H 20 2 + \n02) seja fundamental nas reações antioxidativas (VALENTI et ai., 2004). Três\nisoenzimas são produzidas em mamíferos (FUJll;IUCHI; OKAOA, 2005): a CuZn­\nSOO, a Mn-SOO e a EC-SOO (codificada pelo gene SOD3), que é a forma \nextracelular, estruturalmente similar a CuZn-SOO. \nHá evidências de que os níveis proteicos da Mn-SOO (S0O2) e da CuZn­\nSOO (SOO1) nas células da teca e da granulosa estejam intimamente \ncorrelacionados com a esteroidogênese ovariana humana (SUZUKI et ai., 1999; \nSUGINO et ai., 2000). A atividade de SOO está presente no fluido folicular pré­\novulatório em níveis mais altos que no soro. Esses altos níveis parecem conferir \nproteção contra o dano oxidativo oocitário (TATEMOTO et ai., 2004). Um das \nconseqüências observadas em camundongos com deficiência de S0O1 é a \ninfertilidade, sugerindo um potencial papel desta enzima na fertilidade feminina. A \nSOD2 é induzida sob várias condições de estresse oxidativo em processos \ninflamatórios (FUJll;IUCHI; OKADA, 2005). \nEndometriose e Estresse Oxidativo \nA endometriose é uma doença ginecológica dependente de estrogênio que \nafeta 6-10% das mulheres em idade reprodutiva (ESKENAZI; WARNER, 1997). \nCaracteriza-se por implante e crescimento de tecido endometrial (glândulas e/ou \n\nIntrodução 1 34 \nestroma) fora -da cavidade uterina, principalmente no peritônio pélvico, ovários e \nsepto reto-vaginal. Pode apresentar quadro clínico bastante diversificado, variando \ndesde assintomático, até caracterizado pela presença de dor pélvica crônica, \ndismenorréia, dispareunia, sangramento uterino anormal e infertilidade (GIUDICE; \nKAO, 2004; BULUN, 2009). Tanto por seu impacto na saúde física e psicológica, \ncomo pelo impacto sócio-econômico diante dos custos para o seu diagnóstico e \ntratamento, a endometriose tem sido considerada um problema atual de saúde \npública (SIGNORILE; BALDI, 201 O). \nA etiologia e a patogênese da endometriose são ainda desconhecidas, \nhavendo diversas teorias e hipóteses tentando justificar a origem desta enigmática \ndoença. De modo geral, há teorias propondo que os implantes se originam do \nendométrio uterino e outras sugerindo que os implantes surgem de tecidos \nextrauterinos (BURNEY; GIUDICE, 2012). lntrinsicamente a estas teorias têm sido \nestudados fatores desencadeadores e potencial susceptibilidade genética, cujos \npapéis estão começando a ser delineados, apesar de, até o presente, estarem \ninsuficientemente estabelecidos para confirmar uma relação causa-efeito no \ndesenvolvimento da doença. Estudos correlacionando desreguladores endócrinos \ncom endometriose (CRAIN et ai., 2008), sugerem que estes, juntamente com \nestrogênios endógenos/exógenos, possam ser potenciais candidatos a propiciar \ntransformação, indução e estimulação envolvidos na patogênese da endometriose. A \nação destes agentes e suas influências em outros sistemas que predispõem a \nendometriose, como endócrinos, células tronco progenitoras, sistema imune e \nmodificações epigenéticas, devem ser considerados em contextos tanto de \nantecedentes genéticos, assim como de estímulos responsáveis pela \nreprogramação do trato reprodutivo feminino (BULUN, 2009). \n\nIntrodução 1 35 \nAssociadamente a isto, sabe-se que a endometriose está associada com \ninflamação crônica, e ROS são mediadores inflamatórios que modulam a \nproliferação celular (NGÔ et ai., 2009). NGÔ et ai. (2009) mostraram que células \nendometrióticas podem sofrer maior EO endógeno devido ao aumento na produção \nde ROS, alteração das vias de detoxificação de ROS, e uma queda nos níveis de \ncatalase, como observado nas células tumorais. Por outro lado há evidências de que \na ocorrência de alterações genômicas no endométrio eutópico, passíveis de \npredispor à endometriose, pode ser conseqüente a fatores epigenéticos ou ao \nestresse oxidativo (GUO et ai., 2004). Neste contexto, alguns autores sugeriram a \npossibilidade da endometriose ser uma patologia originada ou associada ao EO \n(MURPHY;SANTANAM; PARTHASARATHY, 1998; AGARWAL;SALEH; BEDAIWY, \n2003; SZCZEPANSKA et ai., 2003; AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., \n2005; GUPTA et ai., 2006; AGARWAL et ai., 2008; RUDER et ai., 2008; NGO et ai., \n2009; AGARWAL et ai., 2012). \nNa vigência de endometriose pélvica, haveria a ativação dos macrófagos na \ncavidade peritoneal, o que poderia promover aumento da produção de ROS e RNS, \ncitocinas,prostaglandinas-e-fatores de crescimento e, conseqüentemente, EO gerando \nperoxidação dos lipídeos, de seus produtos de degradação e dos produtos formados pela \nsua interação com as lipoproteínas de baixa densidade e outras proteínas. O estresse \noxidativo também pode danificar células mesoteliais e pode induzir o aparecimento de \nsítios de adesão para células endometriais, favorecendo o desenvolvimento e a \nprogressão dos focos de endometriose (ALPAY;SAED; DIAMOND, 2006). \nAlguns autores evidenciaram maiores níveis de Manganês-superóxido dismutase \n(Mn-S00) e Cobre-Zinco-superóxido dismutase (CuZn-S00) no fluido peritoneal de \nmulheres inférteis com adenomiose quando comparadas a mulheres inférteis com \n\nIntrodução 1 36 \nendometriose e sem a doença (ISHIKAWA et ai., 1993). Estes mesmos autores \n(ISHIKAWA et ai., 1993) detectaram a Mn-SOD no endométrio ectópico de mulheres \ninférteis com adenomiose, além de evidenciarem maior expressão do gene que codifica a \nMn-S00 no endométrio ectópico de mulheres inférteis com endometriose, sugerindo que \no estresse oxidativo participe da etiopatogênese da endometriose. Em mulheres com\nendometriose e adenomiose foi evidenciada, por meio de imunohistoquímica, uma maior \nexpressão da Mn-S00 e CuZn-S00, no endométrio eutópico durante todo o ciclo \nmenstrual, além de níveis aberrantes de glutationa peroxidase (GPx) e de xantina oxidase \n(XO), tanto em endométrio eutópico quanto ectópico (OTA et ai., 1999). A atividade da \nsuperóxido dismutase (SOO) parece estar significativamente mais alta no endométrio \nectópico de endometriomas do que no endométrio eutópico (ONER-IYIDOGAN et ai., \n2004; ALPAY;SAED; DIAMOND, 2006). Todavia, este aumento dos níveis de enzimas \nantioxidantes, tanto no endométrio eutópico, como ectópico, de mulheres com \nendometriose, poderia ser tanto um evento primário, como ser secundário ao aumento da \nprodução de espécies reativas, como uma tentativa de prevenir o dano oxidativo. \nOs dados acima sugerem uma tendência a maior produção de radicais livres \nnas- porta0oras de- endometriose, associada a uma potencial alteração da sua \ncapacidade antioxidante, o que, supostamente, poderia contribuir para a ocorrência \nde estresse oxidativo, que, por sua vez, poderia estar relacionado à etiopatogênese \nda doença e à sua progressão. \nEndometriose, infertilidade e qualidade oocitária \nOutro aspecto muito interessante em portadoras de endometriose é a sua \nenigmática associação com a inferti lidade (OZKAN;MURK; ARICI, 2008). A doença \n\nIntrodução 1 37 \nestá presente em 25 a 40% das mulheres inférteis, sendo que 30 a 50% das \nportadoras de endometriose têm dificuldade em ter filhos (HOLOCH; LESSEY, \n201 O). Até o presente momento, pouco é conhecido acerca dos mecanismos \nenvolvidos na etiopatogênese da infertilidade relacionada a esta doença, \nespecialmente nos casos de endometriose mínima e leve, em que não se observam \nalterações significativas da anatomia pélvica. \nNovas abordagens terapêuticas ao problema da infertilidade relacionadas a \nesta afecção têm surgido, destacando-se a aplicação, cada vez mais rotineira, das \ntécnicas de reprodução assistida (TRA) de alta complexidade. A introdução da \nfertilização in vitro (FIV) no tratamento da infertilidade secundária à endometriose \ntornou-se uma importante ferramenta para o estudo dos efeitos potenciais da \nendometriose em alguns estágios específicos do processo reprodutivo, incluindo a \nfoliculogênese, a fertilização, o desenvolvimento embrionário e a implantação. \nSe por um lado há evidências de associação entre endometriose e \ninfertilidade, por outro, encontramos resultados controversos acerca dos resultados \nda FIV em pacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos \ne hipóteses-nos--últimos anos�(GARCIA-VELASCO; ARICI, 1999; GARRIDO et ai., \n2000; BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002; AL-FADHLI et ai., 2006; \nOPOIEN et ai., 2012; HARB et ai., 2013). Resultados conflitantes de alguns estudos \ntêm sugerido a ocorrência de menores taxas de fertilização, implantação e/ou \ngestação em portadoras de endometriose (BARNHART;DUNSMOOR-SU; \nCOUTIFARIS, 2002; AL-FADHLI et ai., 2006; LIN et ai., 2012; HARB et ai., 2013), \nque poderiam ser decorrentes do comprometimento da qualidade oocitária e, \nconseqüentemente, embrionária, de defeitos endometriais e/ou anomalias da \ninteração entre o endométrio e o embrião. Contudo, o achado de taxas de \n\nIntrodução 1 38 \nimplantação semelhantes as do grupo controle em ciclos de doação de oócitos de \npacientes saudáveis para pacientes com endometriose (SUNG et ai., 1997; DIAZ et \nai., 2000), tem reforçado o potencial papel crucial da piora da qualidade oocitária e, \nconsequentemente embrionária, no comprometimento da implantação verificado \nneste grupo de pacientes (BRIZEK et ai., 1995; PELLICER et ai., 1995; GARRIDO et \nai., 2000; PELLICER et ai., 2001; KATSOFF et ai., 2006). Alguns autores sugeriram \nalterações na qualidade do oócito como responsáveis pelo comprometimento \n(BRIZEK et ai., 1995; SUNG et ai., 1997; DIAZ et ai., 2000) ou completo bloqueio do \ndesenvolvimento embrionário (PELLICER et ai., 1995), em mulheres com \nendometriose, quando comparadas a controles saudáveis, reforçando o papel da \npiora da qualidade oocitária nos resultados dos procedimentos de reprodução \nassistida nestas pacientes. Todavia, a maioria dos estudos que objetivaram avaliar a \nqualidade oocitária em pacientes com endometriose, utilizaram _apenas parâmetros \nindiretos, como a análise de fatores parácrinos múltiplos presentes no fluido folicular, \navaliação de apoptose nas células da granulosa, análise do número e atividade dos \nleucócitos circunjacentes, entre outros (GARRIDO et ai., 2000; GARRIDO et ai., \n2002). Estudos que--tenham avaliado a qualidade oocitária em portadoras de \nendometriose por meio da análise de critérios morfológicos mais objetivos são \nbastante escassos (BARCELOS et ai., 2008; BARCELOS et ai., 2009). \nSabemos que embriões com habilidade para implantar e desenvolver \nadequadamente originam-se de oócitos de boa qualidade, que, por sua vez, são \nprovenientes de folículos com um adequado meio ambiente, condicionado tanto pelo \nconteúdo do fluido folicular, como pela influência das células vizinhas, ressaltando­\nse o papel crucial das células da granulosa murais e do Cumu/us oophorus (CC) na \naquisição da competência oocitária (CANIPARI, 2000; FERREIRA et ai., 2009). O \n\nIntrodução 1 39 \nmicroambiente folicular, que circunda os oócitos, pode ter um papel crítico na \nqualidade oocitária, fertilização e desenvolvimento embrionário. Há alguns dados \nassociando hipoxigenação de folículos pré-ovulatórios com altas freqüências de \ndefeitos citoplasmáticos oocitários, clivagem prejudicada e anormalidades na \nsegregação cromossômica (VAN BLERKOM;ANTCZAK; SCHRADER, 1997). Como \na redução do suprimento de oxigênio modifica diversas vias metabólicas, a \nperoxidação intensa poderia ser um dos processos envolvidos na geração desses \ndanos (BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002; KUIVASAARI et ai., \n2005), o que precisa ser mais extensamente investigado. \nO microambiente folicular tem um papel crucial na determinação da qualidade \noocitária, que se reflete nas taxas de fertilização e na qualidade embrionária \n(WIENER-MEGNAZI et ai., 2004). Convém ressaltarmos que não dispomos de \nestudos que tenham avaliado os níveis fisiológicos de espécies reativas do oxigênio \ne de antioxidantes no fluido folicular de mulheres normais férteis em ciclos não \nestimulados com gonadotrofinas exógenas. Desta forma, não dispomos de dados \nacerca da potencial influência de níveis fisiológicos de ROS e antioxidantes no fluido \nfolicular sobre a qualidade oocitária e, conseqüentemente, sobre a qualidade \nembrionária e o sucesso da gestação subseqüente. Os dados disponíveis acerca \ndos efeitos deletérios e/ ou benéficos das ROS sobre a qualidade oocitária, taxa de \nfertilização, qualidade embrionária e outros marcadores do sucesso das TRA são \ninconsistentes e conflitantes. Apesar de alguns autores terem recentemente \ndemonstrado que elevados níveis de ROS no fluido folicular de mulheres inférteis \nsubmetidas a FIV/ TE associaram-se a redução do potencial de fertilização oocitário \ne aumento da produção de embriões de pior qualidade, existem dados controversos \n(DAS et ai., 2006; JANA et ai., 2010). Diversas variáveis podem justificar as \n\nIntrodução 1 40 \ndiferenças encontradas na literatura, entre elas os diferentes critérios de seleção das \npacientes, os protocolos de estimulação ovariana utilizados, os diferentes \nmarcadores e métodos utilizados para sua mensuração, características particulares \ndos diferentes laboratórios de FIV, entre tantos outros. Assim, certamente estudos \ncom maiores casuísticas, metodologicamente bem delineados, serão cruciais para \nelucidarem o papel das ROS no fluido folicular na fisiologia reprodutiva e na \netiopatogênese da infertilidade (PASQUALOTTO et ai., 2004; APPASAMY et ai., \n2008; PASQUALOTTO et ai., 2009). \nA qualidade oocitária é decorrente de fatores correlacionados às \ncompetências citoplasmática e nuclear (ALBERTINI, 1992; FERREIRA et ai., 2009). \nHá evidências de que o estresse oxidativo possa promover comprometimento da \nqualidade oocitária, anomalias na meiose e no desenvolvimento embrionário pré­\nimplantação (LIU et ai., 2003; NAVARRO;LIU; KEEFE, 2004; AGARWAL et ai., 2006; \nNAVARRO et ai., 2006; MANSOUR et ai., 2009). Assim, hipotetizamos que a \nocorrência de estresse oxidativo sistêmico e/ou no microambiente folicular de \nmulheres inférteis com endometriose submetidas a estimulação ovariana para \nprocedimentos de reprodução assistida promova comprometimento da qualidade \ngamética e, consequentemente, do sucesso gestacional, estimulando a realização \ndo presente estudo. Associadamente a isto, questionamos se o EO poderia \nfavorecer o comprometimento da qualidade gamética também em ciclos naturais, \nparticipando da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. \nQuestionamos, assim, a ocorrência de um possível papel do estresse \noxidativo na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, \nparticularmente associado à piora da qualidade oocitária, e, conseqüentemente, \nenvolvido nas menores taxas de implantação e gestação observadas em portadoras \n\nIntrodução 1 41 \ndesta afecção submetidas a procedimentos de RA (BARNHART;DUNSMOOR-SU; \nCOUTIFARIS, 2002; LIN et ai., 2012; HARB et ai., 2013). Todavia, não encontramos \nestudos avaliando conjuntamente diferentes marcadores pró e antioxidantes no soro \ne fluido folicular (FF) de mulheres com infertilidade relacionada à endometriose e \ncorrelacionando-os aos resultados dos. procedimentos de reprodução assistida. \nSe confirmada a presença de estresse oxidativo, sistemicamente e/ou no \nmicroambiente folicular de mulheres inférteis com endometriose submetidas a \nestimulação ovariana para a realização de fertilização in vitro, este achado \njustificaria, pelo menos parcialmente, a piora da qualidade oocitária, contribuindo \npara o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose \ne dos piores resultados de TRA nestas pacientes. Associadamente a isto, a \navaliação do valor preditivo de diferentes marcadores de EO no sucesso das TRA, \nseria de grande valia para a determinação do prognóstico gestacional e para a \nfundamentação de novas estratégias terapêuticas a serem testadas em grupos \nselecionados de pacientes. \n\n2. Justificativa\n\nJustificativa 1 43 \nOs mecanismos da infertilidade associada à endometriose permanecem \npouco elucidados. Associadamente a isto, resultados conflitantes de alguns estudos \ntêm sugerido a ocorrência de menores taxas de implantação e gestação em \nportadoras de endometriose submetidas à estimulação ovariana para a realização \nde procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade, o que, poderia ser \nsecundário, pelo menos parcialmente, à piora da qualidade oocitária. \nO EO parece participar da etiopatogênese da endometriose. Dados \nprovenientes de estudos com diferentes modelos animais tem evidenciado que, por \nmeio de mecanismos até o momento não completamente estabelecidos, o EO pode \npromover anomalias meióticas, comprometimento da qualidade oocitária e do \ndesenvolvimento embrionário pré e pós-implantação. Questionamos assim um \npotencial papel do EO na etiopatogênese da infert1lidade relacionada à doença, \nrelacionado ao comprometimento da qualidade oocitária. \nTodavia, não dispomos de estudos analisando conjuntamente diferentes \nmarcadores estresse oxidativo no soro e fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose submetidas a EOC para procedimentos de reprodução assistida. \nAssim, com a finalidade de avaliar, de uma maneira conjunta, os principais \nmarcadores pró-oxidantes (indicadores de produção de ROS e de dano oxidativo), \npropomos a análise do total de hidroperóxidos (FOX1), considerado um marcador de \nprodução de ROS, além de produtos finais do dano oxidativo aos lipídios, proteínas \ne DNA, importantes alvos celulares da ação do estresse oxidativo, que, quando \nlesados, podem levar a comprometimento da função e viabilidade celulares. O MOA \né um dos produtos finais da peroxidação lipídica e, por ser um produto estável, pode \nser utilizado como medida cumulativa deste processo (HALLIWELL; GUTTERIDGE, \n1989; CAMPOS PETEAN et ai., 2008). A determinação dos grupos carbonil ou dos \n\nJustificativa 1 44 \nprodutos avançados de oxidação proteica (AOPP) permite uma estimativa da \noxidação protéica (WITKO-SARSAT et ai., 1996). A quantificação da 8-hydroxi-2'­\ndeoxiguanosina (8hOG), um nucleosídio modificado, possibilita a análise do dano \noxidativo ao ONA (EVANS;DIZDAROGLU; COOKE, 2004). Ao mesmo tempo, \npropomos avaliar antioxidantes não enzimáticos (GSH e vitamina E), um importante \nantioxidante enzimático (SOO), além da capacidade antioxidante total (CAT). A \nglutationa é um importante antioxidante não enzimático, potencialmente envolvido na \naquisição de competência oocitária para o desenvolvimento. Em contrapartida, a \nvitamina E, sobretudo na forma de a-tocoferol, pode tanto bloquear o início da \nperoxidação lipídica (PL), como inibir, primariamente, a etapa de propagação da PL, \nsendo conhecida como um eficiente antioxidante (BORNODEN, 1994). A atividade \nde SOO está presente no fluido folicular pré-ovulatório em níveis mais altos que no \nsoro e parece conferir proteção contra o dano oxidativo oocitário (TATEMOTO et ai., \n2004). Uma das conseqüências observadas em camundongos com deficiência de \nSOD1 é a infertilidade, sugerindo um potencial papel desta enzima na fertilidade \nfeminina. A SOD2 é induzida sob várias condições de estresse oxidativo em \nprocessos inflamatórios (FUJll;IUCHI; OKAOA, 2005). A CAT, por sua vez, tem sido \nutilizada com a finalidade de se avaliar o balanço antioxidante total, que é resultante \ndas defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, permitindo uma avaliação \nglobal deste processo (EREL, 2004; COSTA;SANTOS; LIMA, 2006). \nA análise conjunta de todos estes marcadores permitirá uma avaliação global \ndo balanço oxidante-antioxidante, tanto no soro no dia da captação oocitária, como \nno fluido folicular, de pacientes com infertilidade relacionada à endometriose \nsubmetidas à EOC para ICSI, possibilitando identificarmos a ocorrência ou não de \nestresse oxidativo relacionado à infertilidade em portadoras de endometriose, assim \n\nJustificativa 1 45 \ncomo a determinação de quais seriam os principais alvos do dano oxidativo nestas \nmulheres. Assim, se confirmada a presença de estresse oxidativo, sistemicamente \ne/ou no microambiente folicular de mulheres inférteis com endometriose submetidas \na estimulação ovariana para a reatização de fertilização in vitro, este achado \njustificaria, pelo menos parcialmente, a piora da qualidade oocitária, contribuindo \npara o entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. \nAssociadamente a isto, a avaliação do valor preditivo destes diferentes marcadores \nde EO na ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após a ICSI, seria de \ngrande valia para a determinação do prognóstico gestacional e para a \nfundamentação de novas estratégias terapêuticas a serem testadas em grupos \nselecionados de pacientes. \n\n3. Objetivos\n\nObjetivos 1 47 \nOBJETIVOS GERAIS \n1. Comparar oito marcadores de estresse oxidativo, no soro do dia da captação\noocitária e no fluido folicular, entre mulheres inférteis com e sem endometriose \n(infertilidade de causa tubária e/ou masculina) submetidas a EOC para ICSI. \n2. Comparar oito marcadores de estresse oxidativo entre soro do dia da captação\noocitária e fluido folicular intra-grupos (com endometriose e sem endometriose). \n3. Avaliar o valor preditivo dos marcadores de estresse oxidativo analisados, no\nsoro e no fluido folicular, na ocorrência de gestação clínica e de nascidos vivos de \nmulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à EOC para ICSI. \nOBJETIVOS ESPECÍFICOS \n1. Comparar as concentrações séricas e foliculares de total de hidroperóxidos\n(FOX1), malondialdeído (MOA), produtos avançados de oxidação proteica (AOPPs), \n8-hydroxi-2'-deoxiguanosina (8hOG), glutationa (GSH), vitamina E (Vit E), SOO\n(superóxido dismutase) e capacidade antioxidante total (CAT) de pacientes inférteis \ncom e sem endometriose. \n3. Comparar as concentrações séricas e foliculares de total de hidroperóxidos\n(FOX1), malondialdeído (MOA), produtos avançados de oxidação proteica (AOPPs), \n8-hydroxi-2'-deoxiguanosina (8hOG), glutationa (GSH), vitamina E (Vit E), SOO\n(superóxido dismutase) e capacidade antioxidante total (CAT) entre soro do dia da \n\nObjetivos 1 48 \ncaptação oocitária e fluido folicular intra-grupos ( com endometriose e sem \nendometriose). \n4. Avaliar o valor preditivo de total de hidroperóxidos (FOX1), malondialdeído (MOA),\nprodutos avançados de oxidação proteica (AOPPs), 8-hydroxi-2'-deoxiguanosina \n(8hDG), glutationa (GSH), vitamina E (Vit E), SOO (superóxido dismutase) e \ncapacidade antioxidante total (CAT) no soro e no fluido folicular, na ocorrência de \ngestação clínica de mulheres inférteis com e sem endometriose submetidas à EOC \npara ICSI. \n\n4. Pacientes e Métodos\n\nPacientes e Métodos 1 50\nFoi realizado um estudo transversal prospectivo que foi submetido e aprovado \npelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP)-SP, processo \nnúmero 10187/2007. \nO estudo foi realizado junto ao Laboratório de Ginecologia - Setor de \nReprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia - FMRP-USP, \nLaboratório de Nutrição e Metabolismo - Laboratório Multiusuário de Pesquisas da \nFMRP-USP e Laboratório de Biologia Molecular - Laboratório Multiusuário de \nPesquisas da FMRP-USP, de outubro de 2009 a outubro de 2010. \nPacientes \na) Critérios de elegibilidade\nGRUPO CONTROLE: \n• Pacientes submetidas à estimulação ovariana para realização de injeção\nintracitoplasmática de espermatozoide, indicada pela presença exclusivamente de \nfator masculino e/ou fator tubário (excluindo-se a presença de hidrossalpinge); \n• Ausência de quaisquer doenças pélvicas associadas à infertilidade, quando\nda realização da laparoscopia diagnóstica, utilizada como parte da propedêutica da \ninvestigação de infertilidade. \nGRUPO DE ESTUDO- Endometriose \n• Pacientes submetidas à estimulação ovariana para realização de ICSI,\nindicada pela presença exclusivamente de endometriose; \n• Diagnóstico de endometriose por videolaparoscopia realizada no Hospital das\nClínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, segundo os critérios definidos \npela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (Revised American Society for \nReproductive Medicine classification of endometriosis: 1996, 1997); \n\nPacientes e Métodos 1 51\n• Ausência de tratamento clínico ou cirúrgico para a endometriose nos últimos\nseis meses. \nb) Critérios de elegibilidade para ambos os grupos\n• Idade < 38 anos;\n• FSH do terceiro dia do ciclo menstrual < 1 O mUl/mL;\n• IMC < 30 kg/m2 ; \n• Ausência de doenças como diabetes mellitus ou quaisquer outras\nendocrinopatias, doença cardiovascular, dislipidemia, lupus eritematoso sistêmico e \noutras doenças reumatológicas; \n• Ausência de infecção pelo vírus HIV ou qualquer infecção ativa;\n• Ausência de tabagismo ou o uso de medicações hormonais e\nantiinflamatórios hormonais e não hormonais e suplementos vitamínicos de qualquer \nnatureza, nos últimos seis meses, previamente à programação para o procedimento \nde reprodução assistida. \nCasuística e Fluxograma do Estudo \nComo não dispúnhamos de dados na literatura relativos ao desvio padrão das \ndiferentes variáveis a serem estudadas, não foi possível a determinação do \ndimensionamento amostral previamente ao início do estudo. Desta forma, \nrealizamos inicialmente um estudo piloto, incluindo todas as pacientes elegíveis para \no estudo que aceitaram participar do mesmo, no período compreendido entre\noutubro de 2009 a outubro de 201 O. \n\nPacientes e Métodos 1 52\nDe outubro de 2009 a outubro de 201 O, 275 pacientes participaram do \nPrograma de Reprodução Assistida do Hospital Universitário da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto e foram submetidas à estimulação ovariana para ICSI. \nDestas, 124 não foram elegíveis para o estudo. As 151 pacientes elegíveis (76 do \ngrupo controle e 75 do grupo endometriose) foram entrevistadas e 132 assinaram o \ntermo de consentimento livre e esclarecido (65 do grupo controle e 67 do grupo \nendometriose). Trinta e três das 132 pacientes não foram submetidas à captação de \noócitos. Das 99 que captaram oócitos, foram obtidas amostras de sangue de 50 \npacientes sem endometriose e 49 com endometriose e FF de 32 pacientes sem \nendometriose e 35 com endometriose. Oitenta e sete amostras de soro (43 com E e \n44 sem E) e 61 amostras (FF 29 com E e 32 sem E) tiveram dados analisados no \npresente estudo (Figura 3). \no ... e \n(IJ \nu \n(IJ \na:: \no'\"' \"'\n::::, \nu e \ne \n(IJ \nE \n::::, \n(IJ \nVI \n(IJ \n.!!! \nAvaliados para \nelegibilidade (n= 275) \n-1r-\nNão elegíveis (n= 124) \nElegíveis (n= 151) \nIncluídos (n= 132) \nIncluídos no grupo \nendometriose (n= 67) \nIncluídos no grupo \ncontrole (n= 65) \nSoros doados 1(n= 49) \n1 \nAnalisados \n(n= 43) \nFF doados \n(n= 35) \nl \nAnalisados \n(n= 29) \nSoros doados \n(n= 50) \nl \nAnalisados \n(n=44) \nFigura 3. Fluxograma do Estudo \nFF doados \n(n= 32) \nAnalisados \n(n= 32) \n\nPacientes e Métodos 1 53 \nProtocolo de Estimulação Ovariana e Suplementação de Fase Lútea \nCom o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de estimulação \novariana controlada utilizamos a programação da menstruação, que consiste em se \nadministrar anticoncepcionais orais combinados diariamente, iniciados no período \nmenstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto para o início da \nestimulação ovariana, suspendendo sua administração de tal forma que o início do \nsangramento menstrual coincida com a realização da ultrassonografia transvaginal \n(USTV) basal para se observar o padrão endometrial e afastar a presença de cistos \novarianos que possam interferir na resposta à administração das gonadotrofinas \nexógenas e na monitorização ultrassonográfica do crescimento folicular. \nO bloqueio hipofisário com GnRHa foi iniciado dez .dias antes do dia de \nrealização da ultrassonografia transvaginal (USTV) basal (protocolo longo), no \nperíodo vespertino, por meio da administração de acetato de leuprolide (Lupron®, \nAbott, Brasil; Reliser®, Serona, Brasil) na dose de 0,5mg/dia (1 O UI), por via \nsubcutânea, que foi mantida durante todo o período de estimulação ovariana \ncontrolada até o dia da administração do hCGr (Ovidrel®, Serona, Brasil). \nA hiperestimulação ovariana controlada foi iniciada entre o segundo e o \nterceiro dia do ciclo menstrual. As pacientes receberam 150 a 300 UI por dia de FSH \nrecombinante (FSHr) (Gonal-F®, Serona, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil), via \nintramuscular (IM), nos primeiros 6 dias da indução. A partir do sétimo dia da \nindução da ovulação, a dose foi ajustada de acordo com o crescimento folicular e a \nespessura endometrial, monitorados com USTV diariamente ou em dias alternados. \nQuando pelo menos dois folículos atingiram 18 mm de diâmetro médio, foi \nadministrada 250 µg de hCGr (Ovidrel®, Serona, Brasil) às 22:00. A captação dos \noócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCGr. \n\nPacientes e Métodos 1 54\nA suplementação da fase lútea foi realizada com progesterona natural \nmicronizada (Utrogestan®, Enila, Brasil) por via oral na dose de 200mg, três vezes \nao dia, a partir do dia da captação oocitária e mantida até a décima segunda \nsemana da gestação, nas pacientes que engravidaram. \nCaptação Oocitária e Denudamento Oocitário \nA captação dos oócitos foi realizada mediante prévia anestesia geral \nendovenosa com propofol (Diprivan®, Astra-Zeneca, Brasil), associado ao citrato de \nfentanil (Fentanil®, Janssen-Cilag, Brasil). A aspiração dos folículos por via \nendovaginal guiada por transdutor ultrassonográfico transvaginal, foi realizada \nutilizando-se uma agulha de lúmen simples padrão, com 300 mm de comprimento, \n1, 1 mm de diâmetro interno, duplo bizel cortante, ranhurado nos dois centímetros \nterminais para uma maior ecogenicidade (Laboratório CCD, França), com pressão \naspirativa artificial constante de 100 mmHg, por meio de bomba de sucção com \ncontrole eletrônico (Craft® Suction Pump, Rocket Medical, Inglaterra). Cada folículo, \ncujo FF foi utilizado neste estudo (critérios descritos a seguir), foi aspirado \nindividualmente em tubos Falcon, previamente aquecidos a 37 ° C, não contendo \nmeio de cultivo. Os demais folículos foram aspirados em pool, ou seja, foi realizada \na aspiração do maior número possível de folículos em cada punção, observando-se \no esvaziamento completo de cada folículo e puncionando-se o ovário o menor\nnúmero de vezes possível. A punção foi realizada sob aspiração contínua, tomando­\nse o cuidado de tirar a pressão durante a entrada e retirada da agulha na parede \nvaginal, para evitar aspiração de células vaginais. Os fluidos aspirados destes \nfolículos (cujos FF não foram usados no presente estudo) foram coletados em tubos \n\nPacientes e Métodos 1 55 \nde ensaio, previamente aquecidos a 37°C, contendo 1 mi de meio de cultivo HTF­\nHEPES. \nPara a identificação e o isolamento dos coe, o material aspirado foi \ntransferido para placas de Petri com 1 O cm de diâmetro, previamente aquecidas em \nplatina térmica a 37ºC, não contendo meio de cultivo. Depois de identificados, os \ncoe foram isolados do FF e colocados em placa separada. Os coe foram lavados \ncuidadosamente em meio de cultura HTF-HEPES (HTF, lrvine Scientific), para a \nremoção de sangue e debris. A seguir foram colocados em placas NUNC (Multidish \n4 wells Nuclon, Delta SI), preenchidas com o meio de cultura HTF e cobertas com \nóleo mineral, e levados à incubadora em mistura gasosa de CO2 a 5%, sob \ncondições ideais de temperatura (37ºC) e umidade (95%) por um período de 3 a 4 \nhoras. Após este período, para realizarmos a remoção do cumulus oophorus e da \ncarona radiata, os coe foram colocados em micro-gotas de 25µL de hialuronidase \n(H4272 tipo IV-S, Sigma), na diluição de 80 Ul/ml de HTF/HEPES (lrvine Scientific), \npor no máximo 30 segundos e, então, lavados 2 ou 3 vezes com o meio HTF \nmodificado (HTF/HEPES, lrvine Scientific) suplementado com Soro Sintético \nSubstituto (SSS) a 10%. A remoção mecânica dos-restos- celulares foi feita com o \nauxílio de uma pipeta de desnudação (stripper pipette 130 µm denuding pipette, \nCook, Melbourne, Australia). \nApós a realização do desnudamento oocitário (remoção do cumu/us \noophorus), realizamos a identificação do grau de maturidade dos oócitos, sob \nvisualização ao estereomicroscópio invertido. Os oócitos imaturos (em estágio de \nvesícula germinativa ou metáfase 1) foram descartados e os oócitos maduros \n(caracterizados morfologicamente pela presença de um corpúsculo polar extruso) \nforam injetados como descrito a seguir. \n\nPacientes e Métodos 1 56\nICSI, Taxas de Fertilização, Implantação, Gestação Clínica e Nascido Vivo \nOs oócitos maduros, caracterizados pela extrusão do CP, foram submetidos à \nICSI 3 a 4 horas após a captação oocitária. Cerca de 16 a 18 horas após a ICSI foi \navaliada a fertilização, caracterizada pela presença de 2 pró-nucleos e 2 corpúsculos \npolares (a taxa de fertilização corresponde ao número de oócitos fertilizados, \ndivididos pelo número de oócitos injetados X 100). Cerca de 43 a 45 horas após a \nICSI (segundo dia de desenvolvimento embrionário - D2) foi avaliada a qualidade \nembrionária (quanto ao número e simetria de blastõmeros, percentagem de \nfragmentação e presença ou não de multinucleação). Para os casos em que a \ntransferência embrionária não ocorreu no DII, cerca de 67 a 69 horas após a ICSI \n(D3) foi realizada novamente a análise da qualidade embrionária. \nForam considerados como embriões de boa qualidade em D2 os que \napresentaram 4 blastômeros, simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação \n(The lstanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert \nmeeting, 2011). Foram considerados de boa qualidade no D3 os embriões com 8 \nblastõmeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação (The lstanbul \nconsensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting, \n2011). \nRealizou-se a transferência embrionária em D2 ou D3, de acordo com a \nindividualização de cada caso. Quatorze dias após a transferência embrionária \nrealizou-se a análise do 13-hCG sanguíneo, sendo considerada como gravidez \nquímica a presença de 13-hCG positivo (maior ou igual a 25 UI/mi). Avaliou-se a taxa \nde implantação, caracterizada pelo número de sacos gestacionais divididos pelo \nnúmero de embriões transferidos X100 e a taxa de gravidez clínica por ciclo com \n\nPacientes e Métodos 1 57\ntransferência, caracterizada pelo número de pacientes com embrião com batimento \ncardíaco visualizado ao USTV realizado 4 a 5 semanas após a transferência \nembrionária dividido pelo número de ciclos com transferência embrionária X 100. \nForam avaliados também a quantidade total de FSH usado para estimulação \novariana, o número de dias de estimulação ovariana, a espessura endometrial no dia \nda captação, o número total de oócitos captados e maduros (com extrusão do \nprimeiro CP), de embriões de boa qualidade e total de embriões produzidos e \nnascidos vivos. \nAmostras Obtidas e Processamento \nSangue \nPara a coleta sanguínea foram utilizados tubos estéreis, a vácuo, com ácido \netilenodiamino tetra-acético (EDTA), para coleta de 5 ml de sangue venoso das \npacientes no dia da captação oocitária. \nAs amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 1 O minutos e o soro foi \narmazenado a - 80ºC, dividido em quatro alíquotas, para posterior análise. As \namostras de soro armazenadas foram posteriormente encaminhadas para o \nLaboratório de Nutrição da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, onde foram \ndosados os marcadores de estresse oxidativo descritos a seguir. Todas as dosagens \nforam realizadas em duplicata, no mesmo momento, pelo mesmo técnico, com \nexperiência comprovada nas metodologias empregadas. O responsável técnico \npelas dosagens não teve acesso aos dados clínicos das pacientes, não conhecendo \no grupo ao qual pertenciam as mesmas.\n\nPacientes e Métodos 1 58 \nFluido Folicular \nCerca de 34 a 36 horas após a administração do hCG, as pacientes foram \nsubmetidas à captação oocitária, sob sedação endovenosa com propofol e fentanil. \nA aspiração folicular foi reàlizada por meio de USTV com transdutor transvaginal de \n5 MHz, acoplado a guia de punção. \nFoi aspirado todo o conteúdo do primeiro folículo com diâmetro médio ;;;:: 15 mm \ndo primeiro ovário puncionado, em um tubo previamente aquecido a 37ºC. Apenas os \nFF livres de contaminação sanguínea à inspeção visual (LEVAY et ai., 1997) e que \napresentaram células da granulosa (CG) ou células da granulosa e um oócito maduro \ncaptado foram considerados adequados para análise. Cada amostra de FF adequado \nfoi centrifugada a 300 g por 7 minutos, para remover os componentes celulares, e \nestocada a - B0ºC, aliquotada em 2 ou 3 criotubos, para posterior análise. \nAs amostras dos FF armazenadas foram posteriormente encaminhadas para \no Laboratório de Nutrição da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, onde foram\ndosados os marcadores de estresse oxidativo descritos a seguir. Todas as dosagens \nforam realizadas em duplicata, no mesmo momento, pelo mesmo técnico, com \nexperiência comprovada nas metodologias empregadas. O responsável técnico \npelas dosagens não teve acesso aos dados clínicos das pacientes, não conhecendo \no grupo ao qual pertenciam as mesmas.\nMetodologias \n1. Determinação da concentração total de hidroperóxidos (FOX1}\nA concentração total de peróxidos foi determinada pelo método FOX1 (GALLI \net ai., 2005). O sistema de teste FOX1 é baseado na oxidação do Fe+2 (íon ferroso) a \n\nPacientes e Métodos 1 59\nFe+3 (íon férrico) por vários tipos de peróxidos contidos nas amostras analisadas. Na \npresença de xylenol orange forma-se um complexo colorido (xylenol orange-férrico) \nde cor azul púrpura, cuja absorbância pode ser medida (COSTA;SANTOS; LIMA, \n2006). Neste método utiliza-se uma substância preparada no dia da leitura (o \nreagente FOX1). A solução 1 é preparada com 7,6mg de xylenol orange e 88mg de \nBHT (butil-hidroxitolueno ) em 90ml de metanol . A solução 2 é preparada com \n9,8mg de sulfato ferroso em 10 ml de ácido sulfúrico 250mM (O, 13ml de ácido \nsulfúrico em 10ml de água). As duas soluções devem ser misturadas em \nconcentração 9:1 somente no dia da leitura. Para a análise são necessários 100µL \nde soro ou fluido, 1 00µL de água (para o branco) e 1 ml da solução, que reagem \npor 30 minutos ao abrigo da luz à temperatura ambiente. Após este período, \ncentrifuga-se por 5 minutos a 3500 rpm e a absorbância do sobrenadante é medida \nem 560nm. A curva foi realizada com H202 em concentrações de 1 O a 200µM. O \nresultado foi expresso em µmol/g proteína. \n2. Mensuração da concentração de malondialdeído (MDA)\nO soro e o fluido folicular, previamente estocados, foram descongelados até \natingir 37°C. Cerca de 1 ml de cada amostra foi misturado com 2 mi de TCA-TBA­\nHCL (15% de ácido tricloracético, 0,375 % de ácido tiobarbitúrico e 0,25 N de ácido \nclorídrico) e aquecido em banho-maria por 15 minutos. Após resfriamento, o \nprecipitado foi centrifugado em 1.000g por 10 min. A absorbância do produto foi \nmedida em espectofotômetro (Spectronic 601-Milto Roy) com comprimento de onda \nde 535 nm. O cálculo da concentração das substâncias reativas ao ácido \ntiobarbitúrico (TBARS) foi realizado considerando-se o coeficiente de absortividade \n\nPacientes e Métodos 1 60\nmolar do produto (E535=1,56 x 1 O -5 M - 1 cm -1), sendo os resultados expressos em \nnmol de malondialdeído /litro. Uma curva padrão foi realizada, utilizando-se uma \nsolução estoque de malondialdeído a 1 O mM, preparada a partir do \ntetrametoxipropano (SIGMA), sendo que as concentrações encontradas nas \namostras apresentaram-se dentro desta curva, mostrando uma boa linearidade com \no padrão. O resultado foi expresso em nmol MDA/g proteína.\n3. Determinação da concentração dos produtos avançados de oxidação\nprotéica (AOPPs) \nOs produtos de oxidação protéica presentes no soro e FF foram determinados \npelo método descrito por WITKO-SARSAT et ai. (1996), conforme sumarizado a seguir. \nUma amostra de 40 µL de soro ou FF foi misturada a 160 µL de PBS (tampão fosfato \nsalino) e 20 µL de ácido acético glacial (ultra puro). A leitura da absorbância foi \nrealizada com comprimento de onda de 340 DM. A curva para a realização desta \nleitura foi feita com o uso de cloramina T (curva de 10 a 100 mM) e iodeto de \npotássio (1,16 M), misturando-se 200 µL dos padrões a 10 µL de iodeto de potássio \ne 20 µL de ácido acético e agitando a placa por 6 minutos antes da leitura. O \nresultado final foi expresso em µmol/L. \n4. Determinação da 8-Hidroxi 2 deoxiguanosina (8-0HdG)\nA determinação e a quantificação da 8-hidroxi- 2- deoxiguanosina (8-OHdG) \nserá realizada pelo método de ELISA (Stressgen® DNA Damage ELISA Kit, Ann \nArbor, MI), seguindo as recomendações do fabricante, sumarizadas a seguir. \n\nPacientes e Métodos 1 61\nPreviamente à detecção, as amostras de soro ou fluido devem ser diluídas em um \ndiluente específico do Kit em concen tração 1 :20 (v/v), devendo ser preparado no \nmínimo 150 µL desta solução (amostra diluída) para que a detecção possa ser \nrealizada em duplicata. Durante a preparação dos reagentes, a amostra diluída \npermanece em temperatura ambiente. A curva de calibração é feita com padrão \nconhecido de 8-OHdG nas concentrações de 0,94 ng/ml a 1 O ng/ml. Para o \nprocedimento, em uma placa previamente sensibilizada com anticorpos anti-8-\nOHdG, adiciona-se 50µL das amostras e dos padrões em cada poço, realiza-se uma \nprimeira lavagem da placa e a seguir adiciona-se 50 µL de anticorpo anti-8OHdG \npreviamente diluído em cada poço, exceto no branco. Após incubação à temperatura \nambiente por 1 hora, realizam-se 6 lavagens da placa com solução tampão. \nAdiciona-se 100 µL do conjugado HRP - anti-lgG de camundongo a cada poço, \nexceto no branco e incuba-se por mais 1 hora à temperatura ambiente. Após mais \numa lavagem, adiciona-se 100µL do substrato TMB em cada poço, incuba-se por 10 \nminutos no escuro e adiciona-se 1 00µL da solução de parada. A cor obtida é estável \npor 30 minutos e a absorbância é medida em 450 nm. A intensidade da cor amarela \né inversamente proporcional a concentração de 8-OHdG expressa em ng/ml. \n5. Determinação da concentração de vitamina E (Vit E)\nA determinação da concentração de Vit E ( a.-tocoferol) no soro e no FF foi \nrealizada segundo o método descrito por ARNAUD et ai. (1991), como detalhado a seguir. \nUma amostra de 0,5 ml de soro ou FF foi homogeneizada em 2,0 ml de etanol. Em \nseguida foi colocada em 1,0 ml de n-hexano e agitada por 2 min. Uma alíquota de 0,5 \nml do sobrenadante (n-hexano) foi pipetada, cuidadosamente, em tubo de ensaio seco \n\nPacientes e Métodos 1 62\nem nitrogênio, ressuspensa em 0,5 ml de fase móvel, composta por acetonitrila/ \ndiclorometanol/ metanol (70:10:20, v/v/v) e filtrada. Uma quantidade de 100 µL foi \ninjetada na HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e a leitura efetuada como \ndescrito a seguir. Para a determinação das concentrações da Vit E foi utilizado um \nHPLC modelo Shimadzu LC-9\\ usando uma coluna tipo C-18 (Simpack CLC-O0S 4,6 \nx 25 cm), uma pré-coluna de 4 mm x 1 cm, com fluxo de 2 mUmin. A leitura foi realizada \npor espectofotometria com um detector UVNis a 292 nm. O equipamento foi calibrado \ncom soluções padrões de a-tocoferol (SIGMA), nas concentrações de 1 O, 20 e 200 \nµmol/L. Antes de cada leitura foi injetada uma solução padrão de a-tocoferol na \nconcentração de 20 µmol/L. O equipamento foi programado para que os resultados \nfossem expressos em µmol/L para o soro e FF. \n6. Determinação da concentração de glutationa (GSH) - concentração total de\ngrupos tióis ou sulfidrilas \nA GSH do soro e FF foi medida por um método descrito originalmente por \nELLMAN (1959) e modificado por HU (1994), no qual os grupos tióis interagem com o \nácido ditionitrobenzóico (DTNB) formando um ânion altamente colorido com um pico \nmáximo a 412 DM (e412 = 13,600M-1cm-1)_ Nesse ensaio, uma alíquota de 25 µL de \nsoro ou fluido é misturada a 1 ml de tris-EDTA buffer (25 nmol/L Tris-base, 20 \nmmol/L EDTA, pH 8,2) e a leitura da absorbância é realizada em um comprimento de \nonda de 412 DM. Após esta leitura, uma alíquota de 25 µL de solução estoque de \nDTNB (10 nmol/L em etanol absoluto) é adicionada à solução, que é mantida a \ntemperatura ambiente durante 15 minutos. Após este período, nova leitura é \nrealizada utilizando como branco o DTNB (COSTA;SANTOS; LIMA, 2006). A \n\nPacientes e Métodos 1 63\nconcentração de grupos sulfidril foi calculada utilizando-se a glutationa reduzida e o \nresultado foi expresso em nmol/g proteína. \n7. Determinação da Superóxido Dismutase (SOD)\nA SOO foi avaliada seguindo o protocolo do Kit Frutosamina da Labtest \nDiagnóstica S.A. modificado. Para a dosagem com inibição foram preparados dois \ntubos eppendorfs, no primeiro tubo foi colocado 50 µI de fluido, 50 µI de HCL a 2N e \nincubado por dois minutos a temperatura de 37°C, em seguida adicionou-se 100 µI \nde Na OH 1 M. No segundo tubo foi colocado 500 µI de reagente do kit e incubado \npor dois minutos a temperatura de 37 °C, depois foi adicionado 100 µI da solução do \nprimeiro tubo e incubada por to minutos a temperatura de 37 °. Os dois tubos foram \nlidos separadamente em 530nm, sendo lido o primeiro e cinco minutos depois o \nsegundo tubo. Para a dosagem sem inibição foi feito um tubo eppendorf onde foi \ncolocado 500 µI de reagente do kit e incubado por dois minutos a temperatura de \n37C, logo em seguida foi adicionado 25 µI da amostra, mais 25 µIde HCL a 2N e 50 \nµ! de NaOH a 1 M, essa mistura foi homogeneizada e incubada a temperatura de \n37°C por dez minutos e foi realizada a leitura. \nOs cálculos foram: sem inibição=A2-A 1 (S); com inibição=A2-A 1 (C); \n%inibição=(CX100)/S; U/mL =(%inibiçãoX500)/(%inibição do padrão). \n8. Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT)\nA CAT do soro e fluido folicular foi medida por um método baseado na 2, 2-\nazinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato (ABTS) (EREL, 2004; COSTA;SANTOS; LIMA, \n\nPacientes e Métodos 1 64\n2006). Nesse ensaio, ATBS é incubada com potássio persulfato para produzir a \noxidação do ATBS. Em resumo, uma amostra de 10 mg de ATBS será dissolvida em \n1 O ml de uma solução aquosa contendo 2,5 mmol/L de persulfato de potássio. Esta \nsolução será deixada no escuro em temperatura ambiente, de uma a quatro horas, \nantes de ser usada. Para o estudo das amostras, a solução de estoque ATBS \noxidada será diluída em água deionizada em absorvância de 0,70 a 734 m. Cerca de \n1 O minutos após a adição de 1 ml de ABTS oxidado diluído em 1 O µL de soro ou \nfluido folicular, será realizada a leitura da absorvância. A CAT foi calculada utilizando \nTrolox® (OXIS lnternational lnc., USA) como padrão e o resultado será expresso em \nmEq Trolox® /L. \n9. Determinação de Proteínas Totais (MDA, GSH e FOX são expressos por g\nproteína) \nAs determinações de proteínas nas amostras de soro e FF foram realizadas \npelo kit Proteínas Totais Labtest®. O princípio dessa metodologia está na reação \nentre- o íon cobre do reagente biureto, que reage em contato com as ligações \npeptídicas da proteína, produzindo uma cor púrpura, que deve ser lida a 540rim no \nespectrofotômetro. \nAnálise Estatística \nFoi realizada uma análise descritiva a fim de caracterizar a amostra estudada. \nPara comparação das variáveis idade, peso, estatura, IMC, FSH basal, total de FSH \nusado, número de dias de indução, endométrio e número de oócitos captados entre \n\nPacientes e Métodos 1 65\nos grupos foi aplicado o Teste t. As variáveis número de oócitos maduros, taxa de \nfertilização, número de embriões de boa qualidade, total de embriões formados, \nnúmero de embriões transferidos e taxa de implantação foram comparadas entre os \ngrupos através do teste de Mann-Whitney. O teste Exato de Fisher foi utilizado para \ncomparar as taxas de gestação clínica e de nascidos vivos entre os grupos. Para as \ncomparações dos marcadores entre os grupos e os compartimentos sérico e \nfolicular, foi aplicado o modelo de regressão linear com efeitos mistos (efeitos \naleatórios e fixos) e o pós-teste por contrastes ortogonais. Para estas análises foram \nutilizados a PROC MEANS e PROC MIXED do programa estatístico SAS® 9.0. \nPara as análises de valor de corte, sensibilidade, especificidade, valor \npreditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia, foram realizadas Curvas ROC, \natravés do software R. Para definir os marcadores adequados para predição de \ngestação clínica e nascidos vivos, foram selecionados aqueles com área sob a curva \n(AUC) maior ou igual a 70% e, para estes, foram determinados os valores de corte \nque apresentaram maior sensibilidade e acurácia para predizer gestação clínica e \nnascidos vivos. \nFoi considerado o nível de significância de 5% (p<0,05). \n\n5. Resultados\n\nResultados 1 67 \n5.1. Variáveis clínicas, resposta à estimulação ovariana e resultados de ICSI \nem pacientes inférteis com e sem endometriose \nNão observamos diferença significativa entre os grupos avaliados com \nrelação à média de idade, peso, estatura, FSH basal, dose total de FSH usada, \nduração da EOC, espessura endometrial no dia da transferência embrionária, \nnúmero de oócitos captados e maduros, número de embriões de boa qualidade, total \nde embriões formados e número de embriões transferidos (Tabela 1 ). Tambem não \nse evidenciou diferença entre as taxas de fertilização, implantação, gestação clínica \ne nascidos vivos entre os grupos (Tabela 1 ). \nTabela 1. Variáveis clínicas, resposta à estimulação ovariana e resultados de ICSI em \npacientes inférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada. \nVariável \nCom \nEndometriose \nn = 43 \nDP \nSem \nEndometriose \nN =45 \nDP p \nIdade 32,91 3,33 33,04 4,49 0,87 \nPeso 62,01 9,76 63,64 11,26 0,53 \nEstatura 1,62 0,07 1,62 0,07 0,92 \nIMC 23,75 3, 18 24, 11 3,51 0,66 \nFSH basal 5,83 2,71 5,41 1,92 0,41 \nTotal de FSH usado 2070,51 714,85 2092,21 838,73 0,90 \nNúmero de dias de indução 8,98 1,75 8,53 1,98 0,28 \nEndométrio (mm) 10,53 1,67 1 O, 73 2,57 0,67 \nNúmero de oócitos captados 7,53 5,28 5,82 3,6 0,08 \nNúmero de oócitos maduros 5,52 3,58 4,44 3,08 O, 13 \nTaxa de Fertilização (%) 7 4,49 24,32 80,9 23,08 O, 15 \nNúmero de embriões boa qualidade 1,71 1,03 1,57 1,05 0,75 \nNúmero total de embriões formados 2,64 1,23 2,38 1,09 0,39 \nNúmero de embriões transferidos 1,88 0,63 1,89 0,75 0,99 \nTaxa de implantação(%) 68,62 24,21 79,51 23,71 0,20 \nTaxa de gestação clínica(%)* 18/40 (45%) 13/42 (30,95%) 0,26 \nTaxa de nascidos vivos* 11 /40 (27,5%) 10/42 (23,8%) 0,81 \nNota: Dados apresentados como média ± desvio padrão (DP). Taxa de fertilização: número de oócitos \nfertilizados dividido pelo número de oócitos injetados X 100; taxa de implantação: número de sacos \ngestacionais dividido pelo número de embriões transferidos X100; taxa de gestação clínica: número de ciclos \ncom presença de pelo menos 1 embrião com batimento cardíaco visível ao US realizado 4 a 5 semanas após \na transferência embrionária X100; taxa de nascidos vivos: número de ciclos com nascidos vivos dividido pelo \nnúmero de ciclos com transferência embrionária X 100. Dados analisados pelo Test t ou teste de Mann­\nWhitney. *Dados analisados pelo Teste exato de Fisher. Nível de significância de 5% (p<0,05). \n\nResultados 1 68 \n5.2. Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de pacientes \ninférteis com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana \ncontrolada para ICSI, no dia da captação oocitária \nNo soro, o grupo com endometriose apresentou maiores concentrações de \nGSH (p=0,03) e SOO (p=0,02) e menores de CAT (p<0,01) comparado ao sem \nendometriose. Além disso, foi observada uma tendência a maiores concentrações de \nFOX1 no grupo endometriose, comparado ao sem endometriose (p=0,05; Tabela 2). \nNo fluido folicular, o grupo com endometriose apresentou maiores \nconcentrações de 8OHdG (p<0,01) e Vit E (p=0,03) comparado ao grupo sem \nendometriose (Tabela 2). \nAs comparações entre as concentrações séricas e foliculares dos oito \nmarcadores de estresse oxidativo intra-grupos também estão apresentadas na \nTabela 2. No grupo com endometriose, observaram-se maiores concentrações de \nFOX1 (p<0,01), AOPP (p=0,03), Vit E (p<0,01) e SOO (p<0,01) e menores \nconcentrações de 8OHdG, GSH e CAT (p<0,01) no soro do que no FF. Já no grupo \nsem endometriose, foram encontradas-maiores-concentrações de FOX1 (p<0,01), Vit \nE (p<0,01) e SOO (p=0,02) e menores concentrações de GSH (p<0,01) no soro do \nque no FF (Tabela 2). \n\nResultados 1 69 \nTabela 2. Marcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de mulheres inférteis \ncom e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada com gonadotrofinas \nno dia da captação oocitária. \nMarcador \nFOX1 \nMOA \nAOPP \nSoro 80HdG \nFF \nGSH \nVit E \nsoo \nCAT \nMOA \nAOPP \n80HdG \nGSH \nVit E \nsoo \nCAT \nCom \nEndometriose \n8,30ª \n18,55 \n133,50b \n17,00C \n220,32d \n23,77e \n677,9d \n0,34g \n5,72ª \n20,44 \n97,19b \n23,19c \n276,9i \n13,10· \n504,931 \nSem \nDP DP p Endometriose \n12,66 17,97 11,25 \n0,05 \n0,75 \n0,50 \n0,14 \n0,03 \n7�68 12L69 6�24 \n4,62 \n43,2 \n6,93 \n282,21 \n0,17 \n1,11 \n4,86 \n47,04 \n6,8 \n70,94 \n5,33 \n108,39 \n0,08 \n18,98 \n193,92b \n21,18c \n563,04d \n0,46 \n5,85ª \n20,64 \n104,61 \n17,22 \n265,66b \n8,71c \n435,44d \n0,48 \n6,74 \n43,25 \n7,01 0,06 \n169,82 0,02 \n0,15 <0,01 \n0,74 0,71 \n4,81 0,93 \n39,43 0,35 \n5,6 \n71,66 \n2,51 \n181,07 \n0,11 \n<0,01 \n0,47 \n0,03 \n0,27 \n0,55 \nPoder do teste \n0,37 \n0,06 \n0,05 \n0,26 \n0,81 \n0,37 \n0,44 \n0,88 \n0,05 \n0,05 \n0,05 \n0,69 \n0,09 \n0,68 \n0,24 \n0,10 \nNota: Grupo com endometriose: soro n=43; fluido folicular (FF) n=29. Grupo sem \nendometriose: soro n=44; FF n = 32. FOX 1 : total de hidroperóxidos, expresso em µmol/g \nproteína; MOA: malondialdeído, expresso em nmol/g proteína; AOPP: produtos avançados \nde oxidação proteica, expressos em µmol/L; 8OHdG: 8-hidroxideoxiguanosina, expresso \nem ng/ml; GSH: glutationa reduzida, expressa em nmol/g proteína; Vit E: vitamina E, \nexpressa em µmol/L; SOO: superóxido dismutase, expressa em U/ml; CAT: capacidade \nantioxidante total, expressa em mEq Trolox/L. Dados apresentados como média ± desvio \npadrão (DP). p: valores de p para as comparações inter-grupos. Mesmos superescritos na \nmesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre soro e fluido folicular em cada \ngrupo. Dados analisados com o modelo de regressão linear com efeitos mistos (efeitos \naleatórios e fixos) e pós-teste por contrastes ortogonais. Nível de significância de 5% \n(p<0,05). \n\nResultados 1 70 \n5.3. Análise das curvas ROC \nForam realizadas curvas ROC e calculadas a área sob a curva (AUC) para \ntodos os marcadores analisados no soro e FF nos grupos com e sem endometriose. \nConsideramos como marcadores adequados para discriminação de ocorrência de \ngestação clínica e nascidos vivos aqueles AUC ;:: 70%. Na tabela 3 estão \napresentados a AUC, valores de corte, sensibilidade, especificidade, valores \npreditivo positivo e negativo e acurácia apenas dos marcadores de EO considerados \nadequados preditores de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI \nnos grupos com e sem endometriose. \nNo grupo com endometriose, nenhum marcador de EO foi identificado como \nbom preditor sérico de ocorrência de gestação clínica e de nascidos vivos. No FF \ndeste grupo, a 8OHdG foi o único marcador que se apresentou como adequado \npreditor de ocorrência de gestação clínica (AUC = 87,5%) (Figura 4A; Tabela 3). \nConcentrações foliculares de 8OHdG de 28,02 ng/ml apresentaram discriminação \nmáxima de ocorrência de gestação clínica (sensibilidade de 87,5%, especificidade \nde 100% e acurácia de 89%) (Figura 4A; Tabela 3). O único marcador no FF que \napresentou área sob a curva 2:: 70% para discriminar a ocorrência de nascidos vivos \nfoi a CAT (AUC = 74,26%). Níveis foliculares de CAT de 0,53 mEq Trolox/L \napresentaram discriminação máxima de ocorrência de nascidos vivos, com \nsensibilidade de 100%, especificidade de 52,94% e acurácia de 62%. (Figura 4B; \nTabela 3). \nNo grupo sem endometriose, a 8OHdG foi o único marcador considerado \nadequado preditor sérico de ocorrência de gestação clínica (AUC = 74,03%; Figura \n4C; Tabela 3) e de nascidos vivos (AUC = 81,82%; Figura 4D; Tabela 3). Para \n\nResultados 1 71 \npredizer gestação clínica, valores séricos de 8OHdG de 15,59 ng/ml apresentaram \nsensibilidade de 78,57%, especificidade de 54,55% e acurácia de 72% (Figura 4C; \nTabela 3). Já para predizer nascidos vivos, valores séricos de 8OHdG de 18, 11 \nng/ml apresentaram sensibilidade de 81,82%, especificidade de 67,86% e acurácia \nde 72% (Figura 4D; Tabela 3). Dos marcadores avaliados no FF do grupo sem \nendometriose, a GSH foi o único considerado adequado preditor de ocorrência de \ngestação clínica (AUC = 72,05; Figura 4E; Tabela 3) e de nascidos vivos (AUC = \n72,05; Figura 4F; Tabela 3). Concentrações foliculares de GSH de 277,25 nmol/g \nproteína apresentaram discriminação máxima de ocorrência de gestação clínica \n(sensibilidade de 73,91%, especificidade de 85,71% e acurácia de 77%) e de \nnascidos vivos (sensibilidade de 85,71 %, especificidade de 73,91 % e acurácia de \n77%) (Figuras 4E e 4F; Tabela 3). \n\nResultadas 1 72 \nTabela 3. Área sob a curva (AUC), valores de corte, sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo e acurac1a dos \nmarcadores de estresse oxidativo dosados no soro do dia da captação oocitária e fluido folicular de pacientes inférteis sem endometriose e \ncom endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada, considerados adequados preditores de ocorrência de gestação clínica e \nnascidos vivos após ICSI. \nVariável Cut Acurácia Grupo Amostra Marcador AUC Sensibilidade Especificidade VPP VPN analisada off \nGestação \nClínica 8OHdG 87,50 28,02 87,50 100,00 100,00 50,00 0,89 \nEndometriose FF \nNascidos CAT 74,26 0,53 vivos 100,00 52,94 33,33 100,00 0,62 \n-\nGestação \nClínica 8OHdG 74,03 15,59 78,57 54,55 81,48 50,00 0,72 \nSoro \nNascidos 0,72 8OHdG 74,03 18,11 81,82 67,86 50,00 90,48 Vivos \nControle \nGestação \nClínica GSH 72,05 277,25 73,91 85,71 94,44 50,00 0,77 \nFF \nNascidos GSH 72,05 277,25 Vivos 85,71 73,91 50,00 94,44 0,77 \nNota: 8OHdG: 8-hidroxideoxiguanosina, expressa em ng/ml; GSH: glutationa reduzida, expressa em nmol/g proteína; CAT: capacidade \nantioxidante total, expressa em mEq Trolox/L; FF: fluido folicular; AUC: área sob a curva; VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo \nnegativo. Considerou-se como adequado preditor de gestação clínica e nascidos vivos o marcador com AUC;;: 70. \n\nResultados 1 73\nFigura 4. Curvas ROC das medidas das concentrações de marcadores de estresse \noxidativo no soro e fluido folicular (FF) considerados adequados discriminadores (Área sob \na curva - AUC � 70) de ocorrência de gestação clínica (GC) e nascidos vivos (NV) após \nICSI para pacientes com e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana. 8OHdG: \n8-hidroxideoxiguanosina, expressa em ng/ml; GSH: glutationa reduzida, expressa em\nnmol/g proteína; CAT: capacidade antioxidante total, expressa em mEq Trolox/L. A) e B):\ngrupo com endometriose; C), D), E) e F): grupo sem endometriose.\nA) 8OHdG no FF como preditor de GC \n100 80 \nSensibilidade: 87,5% \nEspecificidade: 100% \nCut off: 28,02 \n1 \nASC(IC95%)= 87.5 {NaN; NaN) \n60 40 20 \nEspecificidade(%) \nC) 8OHdG no soro como preditor de GC\no o \n100 \n�---' Sensibilidade: 78,57% \nEspecificidade: 54,55% \nCut off: 15,59 \nASC(IC95%)= 74.03 (58 .73; 89.32) \n80 60 40 20 \nEspecificidade(%) \nE) GSH no FF como preditor de GC \n100 \n..----� Sensibilidade: 73,91% \nEspecificidade: 85, 71% \nCut off: 277,25 \nASC (IC 95%) = 72.05 ( 48.53 : 95.57) \n80 60 40 20 \nEspecificidade(%) \nB) CAT no soro como preditor de NV.\no \nN \n100 80 60 \nSensibilidade: 100% \nEspecificidade: 52,94% \nCut off: 0,53 \nASC OC 95%)= 7426 ('7 .35: 100) \n40 20 \nEspeclflctdade (%) \nD) 8OHdG no soro como preditor de NV. \n100 80 \nSensibilidade: 81,82% \nEspecificidade: 67,86% \nCut off: 18,11 \nASC OC 95%) = 7'.03 ( 58.73 : 89 32) \n60 'º 20 \nEspecificidade(%) \nF) GSH no FF como preditor de NV. \no \no \n100 80 \nSensibilidade: 85, 71% \nEspecificidade: 73,91% \nCut off: 277,25 \nASC (IC 95%) = 72.05 ( 48.53 ; 95.57) \n60 'º 20 \nEspecincidade (%) \n\n6. Discussão\n\nDiscussão 1 75 \nOs mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes \ncom endometriose ainda não foram completamente elucidados (HOLOCH; LESSEY, \n201 O). Entretanto, alguns autores apontam a possibilidade da endometriose ser uma \ndoença relacionada ao EO (AGARWAL;SALEH; BEDAIWY, 2003; SZCZEPANSKA \net ai., 2003; GUPTA et ai., 2008). Questionamos, assim, o papel do EO na \netiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, particularmente \nassociado à piora da qualidade oocitária, o que poderia estar envolvido no \ncomprometimento da fertilidade natural e, também, nas controversas menores taxas \nde implantação e/ou gestação observadas em portadoras desta afecção submetidas \na FIV (BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002; HARB et ai., 2013). \nTodavia, não encontramos estudos avaliando conjuntamente diferentes marcadores \npró e antioxidantes no soro e FF de mulheres com infertilidade relacionada à \nendometriose, e avaliando seu papel nos resultados da FIV e ICSI. Diante disso e da \nimportância em se fundamentar novas abordagens passíveis de melhorar a \nfertilidade natural e otimizar os resultados dos procedimentos de reprodução \nassistida nestas pacientes, o presente estudo comparou os níveis de oito \nmarcadores de EO (FOX 1, MOA, AOPP, 8OHdG, GSH, Vit E, SOO e CAT) no soro \ndo dia da captação oocitária e no FF de mulheres inférteis com e sem endometriose \n(infertilidade de causa tubária e/ou masculina) submetidas à EOC para ICSI. Além \ndisso, foi avaliado o possível papel destes marcadores no soro e no FF nos dois \nprincipais resultados da ICSI (gestação clínica e nascidos vivos) nos dois grupos. \nDemonstramos maiores níveis de GSH e SOO e menores níveis da CAT no \nsoro do grupo com endometriose, sugerindo a ocorrência de EO sistêmico em \npacientes inférteis com a doença, corroborando estudos de LAMBRINOUOAKI et ai. \n(2009), BORDIN et ai. (201 O) e ANDRADE et ai. (201 O) que associam a \n\nDiscussão 1 76 \nendometriose ao EO sistêmico, analisando outros marcadores de EO distintos dos \naqui avaliados. O aumento de GSH e SOO sugere haver uma mobilização do \nsistema antioxidante sérico na tentativa de neutralizar o prévio aumento de agentes \npro-oxidantes, sugerido _neste estudo pela tendência a maiores níveis de FOX1 \ncirculantes, uma vez que este marcador, quando elevado, é indicador de maior \nprodução de espécies reativas (MIER-CABRERA et ai., 2008). O único estudo na \nliteratura que analisou o total de hidroperóxidos no soro de portadoras de \ninfertilidade relacionada à endometriose foi publicado pelo nosso grupo (ANDRADE \net ai., 2010), analisando este marcador na fase folicular precoce do ciclo natural, \ncom achados similares aos aqui apresentados analisando amostras séricas obtidas \napós EOC, no dia da captação oocitária. Os menores níveis da CAT indicam \nconsumo de outros antioxidantes presentes, culminando com diminuição da \ncapacidade antioxidante total no compartimento sérico. A GSH, por ter importante \npapel na neutralização do peróxido de hidrogênio e dos peróxidos orgânicos, estes \nproduzidos abundantemente em processos inflamatórios (EL-SHAHAT; KANDIL, \n2012), pode indicar uma resposta antioxidante sistêmica frente às reações \ninflamatórias provocadas pelos implantes endometriais ectópicos (GUPTA et ai., \n2008). Entretanto, contrariamente aos presentes achados, JANA et ai. (2013) \nencontraram menores níveis de GSH em soro de mulheres com endometriose \ncomparadas a controles. Da mesma forma, os maiores níveis de SOO no soro de \nmulheres com endometriose evidenciados no presente estudo contrariam os \nresultados de JANA et ai. (2013) e também os de PRIETO et ai. (2012), que \nobservaram menores níveis deste marcador no grupo com endometriose. No \nentanto, o trabalho de Jana e colaboradores foi realizado com amostras coletadas \nna fase folicular precoce do ciclo menstrual (JANA et ai., 2013), diferentemente do \n\nDiscussão 1 77 \npresente estudo, em que as amostras sanguíneas foram coletadas no dia da \ncaptação oocitária, o que dificulta a comparação dos dados e pode justificar as \ndiscrepâncias encontradas, uma vez que a EOC parece promover aumento da SOO \nem mulheres submetidas a FIV ou IUJ (YOUNIS et ai., 2012). PRIETO et ai. (2012), \npor sua vez, avaliaram apenas pacientes com endometriose moderada e grave, \nsendo que o avanço no estadiamento da doença pode estar relacionado à \nocorrência de estresse oxidativo mais pronunciado (JACKSON et ai., 2005), com \nmaior consumo de antioxidantes. Os menores níveis da CAT encontrados no \npresente estudo corroboram os achados de JANA et ai. (2013) e de SZCZEPANSKA \net ai. (2003), os quais evidenciaram menores níveis deste marcador, \nrespectivamente, no soro e fluido peritoneal de mulheres com a doença, sugerindo, \ntambém, que o compartimento sérico esteja refletindo o status redox do \nmicroambiente peritoneal. \nCom relação ao compartimento folicular, o grupo com endometriose \napresentou maiores níveis de 8OHdG e Vit E no FF comparado ao grupo sem \nendometriose, sugerindo ocorrência de estresse oxidativo também neste \nmicroambiente reprodutivo de pacientes inférteis com a doença submetidas a EOC. \nEsta é a primeira vez em que a 8OHdG é avaliada no FF de mulheres com \nendometriose, sendo este um achado de grande importância para o entendimento \nda etiopatogênese da infertilidade relacionada à doença. A presença de elevados \nníveis da 8OHdG no FF de mulheres inférteis com endometriose sugere a ocorrência \nde dano oxidativo ao DNA neste microambiente reprodutivo, que pode promover \ncomprometimento da qualidade gamética, como sugerido pelos estudos que serão \napresentados a seguir. Segundo SEINO et ai. (2002), níveis elevados da 8OHdG \nnas células da granulosa de mulheres inférteis submetidas a FIV têm correlação \n\nDiscussão 1 78 \nnegativa com taxa de fertilização e formação de embriões de boa qualidade. \nCorroborando estes achados, TAMURA et ai. (2008) demonstraram que elevados \nníveis da 8OHdG no FF de mulheres submetidas a FIV foram correlacionados com \nmaiores taxas de oócitos degenerados, sugerindo que a elevação deste marcador \nde EO a nível folicular tenha efeito tóxico sobre a maturação oocitária. Com base na \nanálise imunohistoquimica da 8OHdG, MATSUZAKI; SCHUBERT (2010) sugerem \nque o córtex ovariano saudável adjacente a um endometrioma é afetado mais \nseveramente pelo EO do que o córtex adjacente a cistos ovarianos benignos de \noutra origem, indicando maior dano ao DNA no ovário de mulheres com a doença. \nSomado a isso, um estudo recente POLAK et ai. (2013) aponta haver maiores níveis \nde 8OHdG no FP de mulheres com endometriose comparadas a pacientes com \ncistos serosas e dermóides, sugerindo que o FP dessas pacientes pode ter efeito na \ninfertilidade relacionada a endometriose. Estudo publicado por nosso grupo \n(BARCELOS et ai., 2009) sugeriu comprometimento e/ou retardo na conclusão da \nmeiose de oócitos maturados in vitro, provenientes de ciclos estimulados de \nmulheres inférteis com endometriose. Um outro interessante estudo realizado pelo \nnosso grupo demonstrou que o fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose leve submetidas à EOC para ICSI promove anomalias meióticas \noocitárias em modelo bovino (DA BROI et ai., 2014). Analisando conjuntamente \nestes achados e os do presente estudo, hipotetizamos que a presença de estresse \noxidativo no compartimento folicular de mulheres inférteis com endometriose, \nrepresentada pela maior concentração de 8OHdG, esteja relacionada a ocorrência \nde dano oxidativo e anomalias oocitárias oocitárias, participando da etiopatogênese \nda infertilidade relacionada à doença nestas mulheres, corroborando os achados em \ncélulas da granulosa e fluido peritoneal apresentados na literatura. \n\nDiscussão 1 79 \nOs maiores níveis de Vit E encontrados no FF de mulheres com a doença, por \nsua vez, indicam uma mobilização do sistema antioxidante folicular na tentativa de \nneutralizar espécies reativas e evitar danos oxidativos oocitários. Entretanto, essa \nmobilização não teria sido capaz de prevenir o dano oxidafüm, como evidenciado \npelos maiores níveis da 8OHdG. Este achado contraria tanto um estudo recente de \nSINGH et ai. (2013), que encontrou menores níveis de Vit E no FF de mulheres com \na doença, como os estudos de CAMPOS PETEAN et ai. (2008) e PRIETO et ai. \n(2012), nos quais não foi evidenciada diferença nos níveis de Vit E entre o FF de \npacientes inférteis com endometriose e controles. Todavia, os critérios de \nelegibilidade dos sujeitos dos referidos estudos são heterogêneos, assim como os \nprotocolos de estimulação ovariana, dificultando a comparação dos resultados. \nAssociadamente a isto, nestes estudos não foi apresentado o poder de teste das \nanálises realizadas. Com base nos presentes achados e considerando ljm estudo \nde TAMURA et ai. (2008), no qual, a administração de vitamina E (a-tocoferol, 600 \nmg/dia), do quinto dia do ciclo anterior ao tratamento até o dia da captação oocitária \nde pacientes inférteis submetidas a FIV reduziu as concentrações intrafoliculares da \n8OHdG com relação ao ciclo prévio, questionamos a importância de terapias \nantioxidantes adicionais, especificamente, da administração de Vit E, visando à \nprevenção de danos oxidativos ao DNA em pacientes inférteis com endometriose, o \nque necessita de estudos pertinentes. \nQuando comparados os marcadores entre soro e FF no grupo endometriose, \nevidenciou-se que no soro há maiores níveis de FOX 1, AOPP, Vit E e SOO do que \nno FF e no FF há maiores níveis de 8OHdG, GSH e CAT do que no soro. Maiores \nníveis séricos de FOX 1 e AOPP sugerem, respectivamente, maior produção de \nespécies reativas e maior dano oxidativo proteico a nível sistêmico, não prevenidos \n\nDiscussão 1 80 \npela maior mobilização dos antioxidantes SOO e Vit E. Os maiores níveis de 80HdG \nno FF sugerem dano preferencial ao ONA no microambiente folicular de mulheres \ncom endometriose, o que poderia estar relacionado a dano oxidativo oocitário \nnessas pacientes como previamente mencionado; ao passo que, maiores níveis \nfoliculares de GSH e CAT em relação ao soro indicam haver uma maior mobilização \ndo sistema antioxidante no microambiente folicular destas mulheres, que \nhabitualmente apresenta forte defesa antioxidante para proteção do folículo contra o \nEO (ANGELUCCI et ai., 2006). Já no grupo sem endometriose, encontrou-se \nmaiores níveis de FOX1, Vit E e SOO no soro do que no FF e maiores níveis de GSH \nno FF comparado ao soro. Estes achados diferem dos apresentados por SABATINI \net ai. (1999) que afirmam haver maior atividade da SOO no FF comparado ao soro \nde mulheres submetidas a EOC para FIV. CAMPOS PETEAN et ai. (2008) \ncompararam Vit E e MOA entre soro e FF de mulheres com e sem a doença, tendo \nencontrado maiores níveis de Vit E no soro tanto no grupo com como no sem \nendometriose, corroborando nossos achados. No entanto, os níveis de MOA foram \nmenores no FF do que no soro do grupo controle, sendo que, no presente estudo, \nnão evidenciamos-- diferença para este marcador em nenhum dos grupos. \nDiferentemente do grupo com endometriose, no grupo sem endometriose não se \nobservou maiores níveis de AOPP no soro do que no FF, e nem maiores \nconcentrações de 8OHdG no FF comparado ao soro, sugerindo não haver \nevidências de dano oxidativo sistêmico a proteínas e ao ONA em nível folicular em \nmulheres inférteis sem a doença. \nCom a evidência de EO sistêmico e folicular em pacientes com endometriose \nsubmetidas à EOC e, sabendo-se que baixas concentrações de espécies reativas \ntêm importância na modulação fisiológica de vários fenômenos do trato reprodutivo \n\nDiscussão 1 81 \nfeminino, como a maturação oocitária, a atresia folicular, a função do corpo lúteo, a \ninteração gamética, a fertilização, o desenvolvimento e a implantação embrionária \n(AGARWAL, A.;GUPTA, S.; SHARMA, R. K., 2005; FUJll; IUCHI; OKADA, 2005), \navaliamos o papel dos marcadores de estresse oxidativo analisados no soro e no FF \nnos dois principais resultados da ICSI, gestação clínica e nascidos vivos, nos grupos \ncom e sem endometriose. Foram realizadas curvas ROC e considerados como \nmarcadores adequados para discriminação de ocorrência de gestação clínica e \nnascidos vivos aqueles com AUC ;:: 70%, para os quais foram determinados os \nvalores de corte com máximo poder discriminatório para estes dois endpoints, sendo \ncalculados suas respectivas sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo \ne negativo e acurácia, sendo estes dados inéditos na literatura. Dispomos de um \nestudo que avaliou marcadores de estresse oxidativo no FF para predição de \nviabilidade embrionária, tendo identificado valor de corte apenas para os níveis de \nespécies reativas de oxigênio, acima do qual, a formação de embriões viáveis não é \nfavorável (JANA et ai., 201 O). Temos um outro estudo recentemente publicado \n(SINGH et ai., 2013) que avaliou se os níveis de espécies reativas de oxigênio no FF \nde-mulheres inférteis com e sem endometriose são capazes de discriminar entre \noócitos maduros e imaturos, evidenciando que valores de ERO :;; 105,36 cps \napresentaram máximo poder discriminatório para oócitos maduros (73,68% de \nsensibilidade e 89,74% de especificidade) no grupo com endometriose. No presente \nestudo, no grupo sem endometriose, o marcador 8OHdG foi identificado como o \nmelhor preditor sérico e a GSH como o melhor preditor folicular tanto de gestação \nclínica como de nascidos vivos. No grupo com endometriose, no entanto, nenhum \nmarcador foi identificado como bom preditor sérico para os endpoínts avaliados, \nassim como, não houve bom preditor folicular de nascidos vivos. A 8OHdG, por sua \n\nDiscussão 1 82 \nvez, foi o melhor preditor folicular de ocorrência de gestação clínica no grupo \nendometriose, tendo apresentado a melhor área sob a curva de todos os \nmarcadores avaliados nos diferentes microambientes e grupos, assim como, alta \nacurácia, sensibilidade e especificidade. Estudos com maiores casuísticas são \nnecessários para confirmar a acurácia dos marcadores identificados no presente \nestudo para discriminação de gestação clínica e nascidos vivos, no soro e FF de \nmulheres inférteis com e sem endometriose, o que seria de grande valia na \ndeterminação do prognóstico gestacional destas pacientes e no delineamento de \nestudos de intervenção avaliando o papel de antioxidantes específicos nos \nsubgrupos indentificados. \nÉ importante ressaltar que, no presente estudo, foram adotados critérios de \nelegibilidade bastante seletivos para os sujeitos da pesquisa, evitando-se a \ninterferência de outros fatores associados ao estresse oxidativo e piora de qualidade \noocitária e resultados da ICSI, minimizando, assim, possíveis vieses de seleção \namostral. Neste sentido, foram elegíveis para o estudo apenas pacientes submetidas \na videolaparoscopia e que não apresentavam outras condições potencialmente \nassociadas ao EO e-piorade qualidade oocitária; como idade avançada, aumento do \nFSH basal, obesidade, doenças associadas ao EO, uso de medicações e \nsuplementos vitamínicos. No grupo de estudo o único fator relacionado à infertilidade \nidentificado era a endometriose, o que também torna este grupo bastante \nhomogêneo. Além disso, adotou-se um protocolo rígido para a coleta das amostras, \ntendo-se optado pela obtenção do sangue previamente à aplicação do anestésico e \npela obtenção e análise do fluido folicular aspirado apenas do primeiro folículo do \nprimeiro ovário puncionado de cada paciente, com 15 mm ou mais de diâmetro (pela \nmaior possibilidade de conter um oócito maduro), com ausência de contaminação \n\nDiscussão 1 83 \nsanguínea à inspeção visual e um oócito captado, a fim de evitar possíveis vieses \ndecorrentes do estresse anestésico e da própria punção ovariana, que pudessem \ninfluenciar os níveis de marcadores de EO analisados no FF. Entretanto, como \nprincipais limitações deste estudo, podemos considerar a pequena casuística \navaliada, decorrente dos critérios de seleção extremamente rigorosos, assim como, \na EOC a que todas as pacientes foram submetidas, persistindo a dúvida se os \npresentes achados relativos aos marcadores de EO no soro e FF podem ser \nextrapolados para os ciclos naturais de mulheres com e sem a doença. Tem sido \nmuito pouco estudado se a EOC interfere com o balanço oxidante/antioxidante \nsérico e folicular. Em um estudo com pequena casuística foi demonstrado que o \nprodução de ERO pelas células da granulosa não difere em ciclos estimulados e não \nestimulados (JANCAR et ai., 2008), mas persiste a lacuna no conhecimento sobre a \ninvestigação de marcadores locais e sistêmicos de EO em ciclos não estimulados. \nResumidamente, os resultados do presente estudo indicam ocorrência de \nestresse oxidativo sistêmico, representado sobretudo pela menor CAT, e folicular, \nevidenciado principalmente pelas maiores concentrações de 8OHdG, marcador de \ndano oxidativo-ao DNA,-em pacientes-inférteis com endometriose submetidas à EOC \npara ICSI. Sendo o folículo ovariano uma estrutura altamente vascularizada durante \nos estágios finais da foliculogênese, hipotetizamos que tanto o estresse oxidativo \nsistêmico, como o EO no microambiente folicular possam favorecer o \ncomprometimento da qualidade oocitária, participando da etiopatogênese da \ninfertilidade em mulheres com endometriose. Evidenciamos diferenças nas \ncomparações entre os níveis séricos e foliculares dos oito marcadores estudados \ndentro dos grupos com e sem endometriose, sugerindo haver diferenças no balanço \noxidante/antioxidante sistêmico e folicular relacionadas à doença. Demonstramos \n\nDiscussão 1 84 \nque alguns dos marcadores de EO estudados mostraram-se bons preditores de \ngestação clínica e nascidos vivos após ICSI, abrindo perspectivas de utilização dos \nmesmos na determinação do prognóstico gestacional após-lCSI e fundamentação \nde novas abordagens terapêuticas. Dessa forma, estudos futuros com casuística \nampliada, avaliando a aplicabilidade destes marcadores na predição de sucesso de \nICSI e o delineamento de estudos que visem abordagens terapêuticas mais \nespecíficas são de grande importância para o manejamento adequado destas \npacientes e o melhor entendimento da etiopatogênese da infertilidade relacionada à \nendometriose. \n\n7. Conclusões\n\nConclusões 1 86 \nDemonstramos que mulheres inférteis com endometriose submetidas à EOC \napresentam estresse oxidativo sistêmico no dia da captação oocitária, representado \npela menor CAT, indicativa do comprometimento da sua capacidade antioxidante \nsistêmica global. Nesta mulheres, demonstramos também a presença de EO no \nmicroambiente folicular, evidenciado principalmente pelas maiores concentrações de \n80HdG, marcador de dano oxidativo ao DNA. Sendo o folículo ovariano uma \nestrutura altamente vascularizada durante os estágios finais da foliculogênese, \nhipotetizamos que tanto o EO sistêmico, como do microambiente folicular possam \nfavorecer o comprometimento da qualidade oocitária, participando da \netiopatogênese da infertilidade em mulheres com endometriose. \nEvidenciamos diferenças nas comparações entre os níveis séricos e \nfoliculares dos oito marcadores estudados dentro dos grupos com e sem \nendometriose, sugerindo haver diferenças no balanço oxidante/antioxidante entre os \ncompartimentos sistêmico e folicular específicas de cada uma destas condições. \nDemonstramos que alguns dos marcadores de EO estudados, com destaque \npara a 80HdG no soro e a GSH no FF do grupo sem endometriose e a 80HdG no \nFF do grupo com endometriose, mostraram-se-bons-preditores-de gestação clínica \ne/ou nascidos vivos após ICSI, abrindo perspectivas de utilização dos mesmos na \ndeterminação do prognóstico gestacional após-lCSI. Dessa forma, estudos futuros \ncom casuística ampliada, avaliando a aplicabilidade destes marcadores na predição \ndo sucesso da ICSI e o delineamento de estudos de intervenção testando o impacto \nda suplementação de antioxidantes a subgrupos selecionados, são de grande \nimportância para a otimização do sucesso da ICSI e o melhor entendimento da \netiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose \n\n8. Referências\n\nReferências 1 88 \nAGARWAL, A. et ai. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review. \nReprod Biol Endocrinol, v.1 O, p.49. 2012. \nAGARWAL, A. et ai. Redox considerations in female reproductive function and \nassisted reproduction: from molecular mechanisms to health implications. Antioxid \nRedox Signal, v.1 O, n.8, Aug, p.1375-403. 2008. \nAGARWAL, A.; GUPTA, S.; SHARMA, R. Oxidative stress and its implications in \nfemale infertility - a clinician's perspective. 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Moreover, some studies have \ndemonstrated alterations in constituents of the FF from infertile women with endometriosis. However, \nno study to date has evaluated jointly different pro-and antioxidant markers in serum and FF of women \nwith endometriosis-related infertility undergoing ovarian stimulation for ICSI and determined its \naccuracy in predicting clinica! pregnancy and live birth. \nStudy design, size, duration: Cross-sectional study. From October 2009 to October 2010, 275 \npatients started COS: 151 were eligible for the study, 132 si gn ed the informed consent form, 99 \nunderwent oocyte retrieval, and 87 serum samples (43 with E and 44 without E) and 61 FF sam_ples \n(29 with E and 32 without E) had data analyzed. \nParticipants/materials, setting, methods: Total hydroperoxides (FOX 1), malondialdehyde (MDA), \nadvanced oxidation protein products (AOPP), 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8OHdG), glutathione \n(GSH), vitamin E (Vit E), superoxide dismutase (SOD) and total antioxidant capacity (TAC) \nconcentrations were measured and compared among serum and FF from infertile women with and \nwithout E and the accuracy of these markers to predict clinicai pregnancy and live bom was \ndetermined by ROC curve analysis. \nMain results and the role of chance: The patients with endometriosis had higher serum leveis of \nGSH (p = 0.03) and SOD (p = 0.02), lower serum levels of TAC (p < O.OI) and higher follicular \n8OHdG leveis (p < O, 01) and Vit E leveis (p = 0.03) compared to those without endometriosis. ln the \nendometriosis group, the serum presented higher leveis of FOX 1 (p < O.OI), AOPP (p = 0.03), Vit E (p \n<O.OI) and SOD (P <O.OI) and lower leveis of 8OHdG, TAC and GSH (p < O.OI) compared to FF. ln \nthe group without endometriosis, the serum had higher levels of FOX 1 (p < O.OI), Vit E (p <0.01) and \nSOD (p = 0.02) and lower leveis of GSH (p < 0.01) compared to FF. The 8OHdG was presented as the \nbest serum predictor and the GSH was the best follicular predictor of clinicai pregnancy and live birth \nin patients without the disease. The 8OHdG was identified as the best follicular predictor of clinicai \npregnancy in the group with endometriosis. \nLimitations, reasons for caution: This study had a small sample size, and thus further investigations \nusing a large cohort of patients are needed to confirrn these results. ln addition, data obtained from \n\nManuscrito 1 101 \nstimulated cycles may not necessarily reflect what occurs in natural cycles of infertile women with and \nwithout endometriosis. \nWider implications of the findings: we evidenced the occurrence of systemic and follicular OS in \ninfertile patients with endometriosis undergoing controlled ovarian stimulation for ICSI and we \nsuggest that the OS may be involved in the genesis of infertility-related disease. Some of the studied \nOS markers proved to be good predictors of clinica! pregnancy and live birth after ICSI, opening \nprospects for their use in determining the gestational prognosis after ICSI. \nStudy funding/competing interest(s): This study received financial support from National Council \nfor Scientific and Technological Development (CNPq) and F APESP (2008/58197-6). \nKey words: endometriosis; infertility; serum; follicular fluid; oxidative stress. \n\nManuscrito 1 102 \nIntrodução \nA endometriose, caracterizada pela presença de implantes endometriais (glândulas e/ou \nestroma) fora da cavidade uterina (Gupta et al., 2006), é uma doença ginecológica com alta \nprevalência (10 a 15%) entre mulheres em idade reprodutiva (Augoulea et al., 2012). Esta doença está \nfrequentemente associada à infertilidade, acomete de 25 a 40% das mulheres inférteis e estima-se que \n30 a 50% das mulheres com endometriose apresentam dificuldade para engravidar (Holoch and \nLessey, 2010). Entretanto, até o presente momento, pouco é conhecido acerca dos mecanismos \nenvolvidos na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, cujo melhor entendimento \npermitiria o delineamento de estudos de intervenção específicos visando promover a melhora da \nfertilidade natural destas mulheres. \nSe por um lado há evidências de comprometimento da fertilidade natural em mulheres com \nendometriose, por outro é controverso seu impacto sobre os resultados das técnicas de reprodução \nassistida (TRA), cada vez mais utilizadas no tratamento da infertilidade de portadoras da doença \n(Garcia-Velasco and Arici, 1999, Garrido et al., 2000, Barnhart et al., 2002, Al-Fadhli et al., 2006, \nOpoien et al., 2012, Harb et al., 2013). Resultados conflitantes de alguns estudos têm sugerido a \nocorrência de menores taxas de fertilização, implantação e/ou gestação em portadoras de endometriose \n(Barnhart et al., 2002, Al-Fadhli et al., 2006, Lin et al., 2012, Harb et al., 2013), que poderiam ser \ndecorrentes do comprometimento da qualidade oocitária, de defeitos endometriais e/ou anomalias da \ninteração entre o endométrio e o embrião. Contudo, uma recente metanálise evidenciou que apenas a \nendometriose em estágio avançado (ill e IV) teve impacto negativo sobre as taxas de implantação e \ngestação, sem ter, entretanto, efeito sobre a ocorrência de nascidos vivos (Harb et al., 2013 ). Desta \nforma, continua controverso se a presença da endometriose está ou não associada a potencial \ncomprometimento do sucesso das TRA, e em caso afirmativo, quais seriam os mecanismos \nenvolvidos. \nO estresse oxidativo (EO) tem sido associado a diversas doenças reprodutivas e tem se \nquestionado seu papel na etiopatogênese da endometriose (Agarwal et al., 2003, Szczepanska et al., \n2003, Gupta et al., 2008), estando sua ocorrência, possivelmente, associada a uma resposta \ninflamatória aos implantes endometriais ectópicos (Murphy et al., 1998). Em mulheres com a doença, \numa tendência a maior produção de agentes pró-oxidantes, associada a uma potencial alteração da sua \ncapacidade antioxidante, poderiam promover a perda do equilíbrio redox do trato reprodutivo, \ninduzindo à ocorrência do EO (Agarwal et al., 2003, Szczepanska et al., 2003, Gupta et al., 2006, \nRuder et al., 2008), que, por sua vez, poderia estar envolvido também no comprometimento da \nfertilidade (Gupta et al., 2008, Agarwal et al., 2012). O microambiente folicular tem um papel crítico \nna qualidade oocitária, fertilização e desenvolvimento embrionário (Attaran et al., 2000). A ocorrência \nde EO neste microambiente pode ter impacto na foliculogênese ovariana (Prieto et al., 2012) e \npromover comprometimento da qualidade oocitária, anomalias na meiose e no desenvolvimento \n\nManuscrito 1 103 \nembrionário pré-implantação (Liu et al., 2003, Navarro et al., 2004, Agarwal et al., 2006, Navarro et \nal., 2006, Mansour et al., 2009). Até o presente, poucos estudos investigaram a presença de EO no FF \nde mulheres inférteis com endometriose (Prieto et al., 2012, Liu et al., 2013, Singh et al., 2013). Em \nrecente estudo de nosso grupo, foi evidenciado um efeito deletério do fluido folicular (FF) de mulheres \ninférteis com endometriose leve sobre fuso e distribuição cromossômica de oócitos bovinos maturados \nin vitro, indicando a presença de fatores nocivos à qualidade oocitária no FF de mulheres com a \ndoença e questionando o papel do EO na piora da qualidade gamética (Da Broi et al., 2014). Dessa \nforma, questionamos a ocorrência de EO no microambiente folicular de pacientes inférteis com a \ndoença, que poderia afetar a qualidade oocitária e, consequentemente, comprometer a fertilidade \nnatural destas pacientes, de modo que sua identificação poderia ajudar na elucidação de mecanismos \nda infertilidade relacionada à endometriose. Também questionamos se o EO seria detectado em nível \nsistêmico no dia da captação oocitária de pacientes submetidas à estimulação ovariana controlada \n(EOC) para a realização de ICSL uma vez que sua presença em mulheres com endometriose poderia \nnão estar restrita à cavidade pélvica, atingindo também a circulação sistêmica (Lambrinoudaki et al., \n2009, Andrade et al., 2010). \nApesar de existirem evidências sugerindo presença de EO nos sítios dos implantes pélvicos \nendometriais (Gupta et al., 2008), dispomos de dados inconclusivos acerca do balanço oxidante­\nantioxidante em portadoras de endometriose e não encontramos estudos avaliando conjuntamente \ndiferentes marcadores pró e antioxidantes no soro e FF de mulheres com infertilidade relacionada à \nendometriose, cuja análise conjunta permitiria um melhor entendimento deste complexo processo. \nPodemos considerar didaticamente que o EO é um processo que ocorre por meio de três etapas \ndistintas, sendo que na primeira, observa-se o aumento da produção de espécies reativas, na segunda, \nhá a mobilização de antioxidantes na tentativa de prevenir os danos oxidativos aos seus principais \nalvos e, na terceira, ocorre o dano oxidativo a proteínas, lipídeos, DNA, entre outros alvos (Fujii et al., \n2005, Agarwal et al., 2006). Neste estudo, a primeira etapa foi avaliada por meio da mensuração do \ntotal de hidroperóxidos (FOX1), considerado um marcador de produção de espécies reativas de \noxigênio (EROS) (Mier-Cabrera et al., 2008). A segunda etapa foi analisada por meio da medida da \nglutationa reduzida (GSH), importante antioxidante na proteção celular ao estresse oxidativo que atua \nna neutralização de peróxidos (Meister, 1983), da vitamina E (Vit E), que pode tanto bloquear o início \nda peroxidação lipídica como inibir primariamente a sua etapa de propagação (Nwose et al., 2008), da \nenzima superóxido dismutase (SOD), que está presente no fluido folicular pré-ovulatório em níveis \nmais altos que no soro e parece conferir proteção contra o dano oxidativo oocitário (Tatemoto et al., \n2004) e da capacidade antioxidante total (CAT), que reflete o balanço antioxidante total da amostra, \nsendo resultante das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, o que permite uma avaliação \nglobal deste processo (Erel, 2004, Costa et al., 2006). A terceira etapa, por sua vez, foi avaliada por \nmeio da análise do malondialdeído (MDA), um dos produtos finais da peroxidação lipídica e que pode \nser utilizado como medida cumulativa deste processo (Campos Petean et al., 2008), dos produtos \n\nManuscrito 1 104 \navançados da oxidação proteica (AOPP), que permite uma estimativa da oxidação protéica (Witko­\nSarsat et al., 1996) e da 8-hydroxi-2' -deoxiguanosina (8OHdG), que possibilita a análise do dano \noxidativo ao DNA (Evans et al., 2004). Desta forma, os objetivos deste estudo foram avaliar a \npresença de EO a nível folicular e sistêmico em mulheres inférteis com e sem endometriose \nsubmetidas à EOC para realização de ICSI, por meio da análise conjunta dos oito marcadores de EO \nacima mencionados, comparar o status redox entre os compartimentos sérico e folicular em cada grupo \ne definir a acurácia dos marcadores avaliados como preditores de gestação clínica e nascidos vivos \napós realização de ICSI. \nMateriais e Métodos \nRealizou-se um estudo transversal prospectivo junto ao Setor de Reprodução Humana do \nDepartamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP e Laboratório de Nutrição e Metabolismo, \nDepartamento de Clínica Médica - FMRP-USP. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em \nPesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade \nde São Paulo (USP). As pacientes que preencheram os critérios de inclusão e manifestaram o desejo \nde participar do projeto e concordaram em ceder amostras de fluido folicular, assinaram o termo de \nconsentimento livre e esclarecido previamente à inclusão no estudo. \nFluxograma do estudo \nDe outubro de 2009 a outubro de 2010, 275 pacientes participaram do Programa de \nReprodução Assistida do Hospital Universitário da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e foram \nsubmetidas à estimulação ovariana para ICSI. Destas, 124 não foram elegíveis para o estudo. As 151 \npacientes elegíveis (76 do grupo controle e 75 do grupo endometriose) foram entrevistadas e 132 \nassinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (65 do grupo controle e 67 do grupo \nendometriose). Trinta e três das 132 pacientes não foram submetidas à captação de oócitos. Das 99 que \ncaptaram oócitos, foram obtidas amostras de sangue de 50 pacientes sem endometriose e 49 com \nendometriose e FF de 32 pacientes sem endometriose e 35 com endometriose. Oitenta e sete amostras \nde soro (43 com E e 44 sem E) e 61 amostras (FF 29 com E e 32 sem E) tiveram dados analisados no \npresente estudo (Figura 1 ). \nCritérios de Seleção \nNo grupo endometriose, foram selecionadas pacientes com infertilidade associada \nexclusivamente à endometriose diagnosticada e classificada por videolaparoscopia segundo os \ncritérios da American Society for Reproductive Medicine (1997). No grupo controle, foram incluídas \n\nManuscrito 1 105 \npacientes apenas com infertilidade por fator masculino e/ou tubário. Todas as pacientes do grupo \ncontrole foram submetidas à videolaparoscopia diagnóstica como procedimento de rotina para \ninvestigação da infertilidade conjugal, sendo descartada a presença de endometriose. Foram critérios \nde elegibilidade para os dois grupos idade menor que 3 8 anos, índice de massa corporal (IMC) menor \nque 30 Kg/m2, nível sérico de hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro dia do ciclo menstrual \n< 1 0mUI/ml e ausência de anovulação crônica, hidrossalpinge e doenças crônicas como diabetes\nmellítus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, dislipidemia, lupus eritematoso sistémico e \noutras doenças reumatológicas, infecção pelo vírus HIV, qualquer infecção ativa, tabagismo, uso de \nmedicações hormonais e de antiinflamatórios hormonais e não-hormonais e suplementos vitamínicos \nnos seis meses anteriores à inclusão no estudo (os quais poderiam ser vieses do estudo, já que estão \nrelacionados a produção de espécies reativas e estresse oxidativo ). \nProtocolo de Estimulação \nCom o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de estimulação ovariana controlada \nutilizou-se a programação da menstruação, que consiste em se administrar diariamente anticoncepcionais \norais combinados, iniciados no período menstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto para \no início da estimulação ovariana, suspendendo sua administração de tal forma que o início do sangramento\nmenstrual coincida com a realização da ultrassonografia transvaginal (USTV) basal para se observar o \npadrão endometrial e afastar a presença de cistos ovarianos que pudessem interferir na resposta à \nadministração das gonadotrofinas exógenas e na monitorização ultrassonográfica do crescimento folicular. \nO bloqueio hipofisário com análogo do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRHa) foi \niniciado 10 dias antes do dia de realização da USTV basal (protocolo longo), no período vespertino, \npor meio da administração de acetato de leuprolide (Lupron®, Abott, Brasil; Reliser®, Serono, \nBrasil) na dose de 0,5mg/dia (10 UI), por via subcutânea, mantida durante todo o período de \nestimulação ovariana controlada até o dia da administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) \n(Ovidrel®, Serono, Brasil). \nA hiperestimulação ovariana controlada foi iniciada entre o segundo e o quarto dia do ciclo \nmenstrual. As pacientes receberam 150 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSHr) (Gonal-F®, \nSerono, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil), via intramuscular, nos primeiros 6 dias da indução. A \npartir do sétimo dia da indução da ovulação, a dose foi ajustada de acordo com o crescimento folicular \ne a espessura endometrial, monitorados com USTV diariamente ou em dias alternados. \nNa presença de, pelo menos, dois folículos com 18 mm de diâmetro médio, foram \nadministrados 250 µg de hCG recombinante (Ovidrel®, Serono, Brasil) às 22:00. A captação dos \noócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante. \n\nManuscrito 1 106 \nCaptação Oocitária e Denudamento Oocitário \nA captação dos oócitos foi realizada mediante prévia anestesia geral endovenosa com propofol \n(Diprivan®, Astra-Zeneca, Brasil), associado ao citrato de fentanil (Fentanil®, Janssen-Cilag, Brasil). \nA aspiração dos folículos por via endovaginal guiada por transdutor ultrassonográfico transvaginal, foi \nrealizada utilizando-se uma agulha de lúmen simples padrão, (Laboratório CCD, França), com pressão \naspirativa artificial constante de 100 mmHg, por meio de bomba de sucção com controle eletrônico \n(Craft® Suction Pump, Rocket Medical, Inglaterra). Cada folículo, cujo FF foi utilizado neste estudo \n( critérios descritos a seguir), foi aspirado individualmente em tubos Falcon, previamente aquecidos a \n37° C, não contendo meio de cultivo. Os demais folículos foram aspirados em pool, em tubos de \nensaio, previamente aquecidos a 37ºC, contendo 1 ml de meio de cultivo HTF-HEPES. \nPara a identificação e o isolamento dos COC, o material aspirado foi transferido para placas de \nPetri com 1 O cm de diâmetro, previamente aquecidas em platina térmica a 3 7ºC, não contendo meio de \ncultivo. Depois de identificados, os COC foram isolados do FF e colocados em placa separada. Os \nCOC foram lavados cuidadosamente em meio de cultura HTF-HEPES (HTF, Irvine Scientific), para a \nremoção de sangue e debris. A seguir foram colocados em placas NUNC (Multidish 4 wells Nuclon, \nDelta SI), preenchidas com o meio de cultura HTF e cobertas com óleo mineral, e levados à \nincubadora em mistura gasosa de CO2 a 5%, sob condições ideais de temperatura (37°C) e umidade \n(95%) por um período de 3 a 4 horas. Após este período, os COC foram colocados em micro-gotas de \n25µL de hialuronidase (H4272 tipo IV-S, Sigma), na diluição de 80 UI/mL de HTF/HEPES (Irvine \nScientific), por no máximo 30 segundos e, então, lavados 2 ou 3 vezes com o meio HTF modificado \n(HTF/HEPES, Irvine Scientific) suplementado com Soro Sintético Substituto (SSS) a 10%. A remoção \nmecânica dos restos celulares foi feita com o auxílio de uma pipeta de desnudação (stripper pipette \n130 µm denuding pipette, Cook, Melboume, Australia). \nApós a realização do desnudamento oocitário (remoção do cumulus oophorus), realizamos a \nidentificação do grau de maturidade dos oócitos, sob visualização ao estereomicroscópio invertido. Os \noócitos imaturos ( em estágio de vesícula germinativa ou metáfase I) foram descartados e os oócitos \nmaduros (caracterizados morfologicamente pela presença de um corpúsculo polar extruso) foram \ninjetados como descrito a seguir. \nICSI, Taxas de Fertilização, Implantação, Gestação Clínica e Nascido Vivo \nOs oócitos maduros, caracterizados pela extrusão do CP, foram submetidos à ICSI 3 a 4 horas \napós a captação oocitária. Cerca de 16 a 18 horas após a ICSI foi avaliada a fertilização, caracterizada \npela presença de 2 pró-nucleos e 2 corpúsculos polares (a taxa de fertilização corresponde ao número \nde oócitos fertilizados, divididos pelo número de oócitos injetados X 100). Cerca de 43 a 45 horas \napós a ICSI (segundo dia de desenvolvimento embrionário - D2) foi avaliada a qualidade embrionária \n\nManuscrito 1 107 \n( quanto ao número e simetria de blastômeros, percentagem de fragmentação e presença ou não de \nmultinucleação). Para os casos em que a transferência embrionária não ocorreu no DII, cerca de 67 a \n69 horas após a ICSI (D3) foi realizada novamente a análise da qualidade embrionária. \nForam considerados como embriões de boa qualidade em D2 os que apresentaram 4 \nblastômeros, simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação (2011). Foram considerados de boa \nqualidade no D3 os embriões com 8 blastômeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação \n(2011). \nRealizou-se a transferência embrionária em D2 ou D3, de acordo com a individualização de \ncada caso. Quatorze dias após a transferência embrionária realizou-se a análise do �-hCG sanguíneo, \nsendo considerada como gravidez química a presença de �-hCG positivo (maior ou igual a 25 UI/ml). \nAvaliou-se a taxa de implantação, caracterizada pelo número de sacos gestacionais divididos pelo \nnúmero de embriões transferidos Xl 00 e a taxa de gravidez clínica por ciclo com transferência, \ncaracterizada pelo número de pacientes com embrião com batimento cardíaco visualizado ao USTV \nrealizado 4 a 5 semanas após a transferência embrionária dividido pelo número de ciclos com \ntransferência embrionária X 100. \nForam avaliados também a quantidade total de FSH usado para estimulação ovariana, o número de \ndias de estimulação ovariana, a espessura endometrial no dia da captação, o número total de oócitos \ncaptados e maduros ( com extrusão do primeiro CP), de embriões de boa qualidade e total de embriões \nproduzidos e nascidos vivos. \nColeta e processamento das amostras \nSangue \nPara a coleta sanguínea foram utilizados tubos estéreis, a vácuo, com ácido etilenodiamino \ntetra-acético (EDTA), para coleta de 5 mL de sangue venoso das pacientes no dia da captação \noocitária. \nAs amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos e o soro foi armazenado a - 80°C, \ndividido em quatro alíquotas, para posterior análise. \nFluido Folicular \nCerca de 34 a 36 horas após a administração do hCG, as pacientes foram submetidas à \ncaptação oocitária, sob sedação endovenosa com propofol e fentanil. A aspiração folicular foi \nrealizada por meio de USTV com transdutor transvaginal de 5 MHz, acoplado a guia de punção. \nFoi aspirado um folículo do primeiro ovário puncionado, com diâmetro médio� 15 mm (pela \nchance elevada de conter um oócito maduro), em um tubo previamente aquecido a 3 7ºC. Apenas os FF \nlivres de contaminação sanguínea à inspeção visual (Levay et al., 1997) e que apresentaram células da \n\nManuscrito 1 108 \ngranulosa (CG) ou células da granulosa e um oócito maduro captado foram considerados adequados \npara análise. Cada amostra de FF adequado foi centrifugada a 3 00 g por 7 minutos, para remover os \ncomponentes celulares, e estocada a - 80ºC, aliquotada em 2 ou 3 criotubos, para posterior análise. \nAs amostras de sangue e FF armazenadas foram posteriormente encaminhadas para o \nLaboratório de Nutrição da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, onde foram dosados os \nmarcadores de estresse oxidativo descritos a seguir. Todas as dosagens foram realizadas em duplicata, \nno mesmo momento, pelo mesmo técnico, com experiência comprovada nas metodologias \nempregadas. O responsável técnico pelas dosagens não teve acesso aos dados clínicos das pacientes, \nnão conhecendo o grupo ao qual pertenciam as mesmas. \nMetodologias \n1. Determinação da concentração total de hidroperóxidos (FOX1)\nA concentração total de peróxidos foi determinada pelo método FOX1 (Galli et al., 2005). O\nsistema de teste FOX1 é baseado na oxidação do Fe+2 (íon ferroso) a Fe+3 (íon férrico) por vários tipos \nde peróxidos contidos nas amostras analisadas. Na presença de xylenol orange forma-se um complexo \ncolorido (xylenol orange-férrico) de cor azul púrpura, cuja absorbância pode ser medida (Costa et al., \n2006). Neste método utiliza-se uma substância preparada no dia da leitura (o reagente FOX1). A \nsolução 1 é preparada com 7,6mg de xylenol orange e 88mg de BHT (butil-hidroxitolueno ) em 90mL \nde metanol . A solução 2 é preparada com 9,8mg de sulfato ferroso em 10 mL de ácido sulfúrico \n250mM (O, 13mL de ácido sulfúrico em 1 0mL de água). As duas soluções devem ser misturadas em \nconcentração 9: 1 somente no dia da leitura. Para a análise são necessários 1 00µL de soro ou fluido, \nl00µL de água (para o branco) e 1 mL da solução, que reagem por 30 minutos ao abrigo da luz à \ntemperatura ambiente. Após este período, centrifuga-se por 5 minutos a 3500 rpm e a absorbância do \nsobrenadante é medida em 560nm. A curva foi realizada com H202 em concentrações de 10 a 200µM. \nO resultado foi expresso em µmol/g proteína. \n2. Mensuração da concentração de malondialdeído (MDA)\nO soro e o fluido folicular, previamente estocados, foram descongelados até atingir 37ºC. Cerca de\n1 mL de cada amostra foi misturado com 2 ml de TCA-TBA-HCL (15% de ácido tricloracético, 0,375 \n% de ácido tiobarbitúrico e 0,25 N de ácido clorídrico) e aquecido em banho-maria por 15 minutos. \nApós resfriamento, o precipitado foi centrifugado em 1.000g por 1 O min. A absorbância do produto foi \nmedida em espectofotômetro (Spectronic 601-Milto Roy) com comprimento de onda de 535 nm. O \ncálculo da concentração das substâ ncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi realizado \nconsiderando-se o coeficiente de absortividade molar do produto (E535=1,56 x 10 -s M -J cm -1), \n\nManuscrito 1 109 \nsendo os resultados expressos em nmol de malondialdeído /litro. Uma curva padrão foi realizada, \nutilizando-se uma solução estoque de malondialdeído a 1 O mM, preparada a partir do \ntetrametoxipropano (SIGMA), sendo que as concentrações encontradas nas amostras apresentaram-se \ndentro desta curva, mostrando uma boa linearidade com o padrão. O resultado foi expresso em nmol \nMDA/g proteína \n3. Determinação da concentração dos produtos avançados de oxidação protéica (AOPPs)\nOs produtos de oxidação protéica presentes no soro e FF foram determinados pelo método \ndescrito por Witko-Sarsat et al. (1996), conforme sumarizado a segu ir. Uma amostra de 40 µL de soro \nou FF foi misturada a 160 µL de PBS (tampão fosfato salino) e 20 µL de ácido acético glacial (ultra \npuro). A leitura da absorbância foi realizada com comprimento de onda de 340 □M. A curva para a \nrealização desta leitura foi feita com o uso de cloramina T ( curva de 1 O a 100 mM) e iodeto de \npotássio (1, 16 M), misturando-se 200 µL dos padrões a 1 O µL de iodeto de potássio e 20 µL de ácido \nacético e agitando a placa por 6 minutos antes da leitura. O resultado final foi expresso em µmol/L. \n4. Determinação da 8-Hidroxi 2 deoxiguanosina (8-OHdG)\nA determinação e a quantificação da 8-hidroxi- 2- deoxi gu anosina (8-OHdG) será realizada \npelo método de ELISA (Stressgen® DNA Damage ELISA Kit, Ann Arbor, MI), seguindo as \nrecomendações do fabricante, sumarizadas a seguir. Previamente à detecção, as amostras de soro ou \nfluido devem ser diluídas em um diluente específico do Kit em concentração 1:20 (v/v), devendo ser \npreparado no mínimo 150 µL desta solução (amostra diluída) para que a detecção possa ser realizada \nem duplicata. Durante a preparação dos reagentes, a amostra diluída permanece em temperatura \nambiente. A curva de calibração é feita com padrão conhecido de 8-OHdG nas concentrações de 0,94 \nng/mL a 1 O ng/mL. Para o procedimento, em uma placa previamente sensibilizada com anticorpos \nanti-8-OHdG, adiciona-se 50µL das amostras e dos padrões em cada poço, realiza-se uma primeira \nlavagem da placa e a segu ir adiciona-se 50 µL de anticorpo anti-8OHdG previamente diluído em cada \npoço, exceto no branco. Após incubação à temperatura ambiente por 1 hora, realizam-se 6 lavagens da \nplaca com solução tampão. Adiciona-se 100 µL do conjugado HRP - anti-IgG de camundongo a cada \npoço, exceto no branco e incuba-se por mais 1 hora à temperatura ambiente. Após mais uma lavagem, \nadiciona-se 1 00µL do substrato TMB em cada poço, incuba-se por 1 O minutos no escuro e adiciona-se \nI00µL da solução de parada. A cor obtida é estável por 30 minutos e a absorbância é medida em 450 \nnm. A intensidade da cor amarela é inversamente proporcional a concentração de 8-OHdG expressa \nem ng/mL. \n\nManuscrito 1 110 \n5. Determinação da concentração de vitamina E (Vit E)\nA determinação da concentração de Vit E ( a-tocoferol) no soro e no FF foi realizada segundo \no método descrito por Arnaud et al. (1991), como detalhado a seguir. Uma amostra de 0,5 mL de soro\nou FF foi homogeneizada em 2,0 mL de etanol. Em seguida foi colocada em 1,0 mL de n-hexano e\nagitada por 2 min. Uma alíquota de 0,5 mL do sobrenadante (n-hexano) foi pipetada, cuidadosamente,\nem tubo de ensaio seco em nitrogênio, ressuspensa em 0,5 mL de fase móvel, composta por\nacetonitrila/ diclorometanol/ metanol (70:10:20, v/v/v) e filtrada. Uma quantidade de 100 µL foi\ninjetada na HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e a leitura efetuada como descrito a\nseguir. Para a determinação das concentrações da Vit E foi utilizado um HPLC modelo Shimadzu LC­\n�' usando uma coluna tipo C-18 (Simpack CLC-ODS 4,6 x 25 cm), uma pré-coluna de 4 mm x 1 cm,\ncom fluxo de 2 mL/min. A leitura foi realizada por espectofotometria com um detector UV Nis a 292\nnm. O equipamento foi calibrado com soluções padrões de a-tocoferol (SIGMA), nas concentrações\nde 1 O, 20 e 200 µmol/L. Antes de cada leitura foi injetada uma solução padrão de a-tocoferol na\nconcentração de 20 µmol/L. O equipamento foi programado para que os resultados fossem expressos\nem µmol/L para o soro e FF.\n6. Determinação da concentração de glutationa (GSH) - concentração total de grupos tióis ou\nsulfidrilas\nA GSH do soro e FF foi medida por um método descrito originalmente por ELLMAN (1959) e \nmodificado por HU (1994), no qual os grupos tióis interagem com o ácido ditionitrobenzóico (DTNB) \nformando um ânion altamente colorido com um pico máximo a 412 □M (e412 = 13,600M-1cm·1).\nNesse ensaio, uma alíquota de 25 µL de soro ou fluido é misturada a 1 mL de tris-EDTA buffer (25 \nnmol/L Tris-base, 20 mmol/L EDTA, pH 8,2) e a leitura da absorbância é realizada em um \ncomprimento de onda de 412 □M. Após esta leitura, uma alíquota de 25 µL de solução estoque de \nDTNB (1 O nmol/L em etanol absoluto) é adicionada à solução, que é mantida a temperatura ambiente \ndurante 15 minutos. Após este período, nova leitura é realizada utilizando como branco o DTNB \n(Costa et al., 2006). A concentração de grupos sulfidril foi calculada utilizando-se a glutationa \nreduzida e o resultado foi expresso em nmol/g proteína. \n7. Determinação da Superóxido Dismutase (SOD)\nA SOD foi avaliada seguindo o protocolo do Kit Frutosamina da Labtest Diagnóstica S.A. \nmodificado. Para a dosagem com inibição foram preparados dois tubos eppendorfs, no primeiro tubo \nfoi colocado 50 µl de fluido, 50 µl de HCL a 2N e incubado por dois minutos a temperatura de 37ºC, \nem seguida adicionou-se 100 µl de NaOH IM. No segundo tubo foi colocado 500 µl de reagente do kit \ne incubado por dois minutos a temperatura de 3 7ºC, depois foi adicionado 100 µl da solução do \nprimeiro tubo e incubada por 1 O minutos a temperatura de 3 7°. Os dois tubos foram lidos \nseparadamente em 530nm, sendo lido o primeiro e cinco minutos depois o segundo tubo. Para a \n\nManuscrito 1 111 \ndosagem sem inibição foi feito um tubo eppendorf onde foi colocado 500 µI de reagente do kit e \nincubado por dois minutos a temperatura de 37C, logo em seguida foi adicionado 25 µI da amostra, \nmais 25 µIde HCL a 2N e 50 µI de NaOH a IM, essa mistura foi homogeneizada e incubada a \ntemperatura de 3 7ºC por dez minutos e foi realizada a leitura.\nOs cálculos foram: sem inibição=A2-Al (S); com inibição=A2-Al (C); \n%inibição=(CX100)/S; U/mL=(%inibiçãoX500)/(%inibição do padrão). \n8. Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT)\nA CAT do soro e fluido folicular foi medida por um método baseado na 2, 2-azinobis-3-\netilbenzotiazolina-6-sulfonato (ABTS) (Erel, 2004, Costa et al., 2006). Nesse ensaio, ATBS é \nincubada com potássio persulfato para produzir a oxidação do ATBS. Em resumo, uma amostra de 10 \nmg de ATBS será dissolvida em 1 O mL de uma solução aquosa contendo 2,5 mmol/L de persulfato de \npotássio. Esta solução será deixada no escuro em temperatura ambiente, de uma a quatro horas, antes \nde ser usada. Para o estudo das amostras, a solução de estoque ATBS oxidada será diluída em águ a \ndeionizada em absorvância de O, 70 a 734 m. Cerca de 1 O minutos após a adição de lmL de ABTS \noxidado diluído em 1 O µL de soro ou fluido folicular, será realizada a leitura da absorvância. A CA T \nfoi calculada utilizando Trolox® (OXIS Intemational Inc., USA) como padrão e o resultado será \nexpresso em mEq Trolox® /L. \n9. Determinação de Proteínas Totais (FOX, MDA e GSH são expressos por g proteína)\nAs determinações de proteínas nas amostras de soro e FF foram realizadas pelo kit Proteínas \nTotais Labtest®. O princípio dessa metodologia está na reação entre o íon cobre do reagente biureto, \nque reage em contato com as ligações peptídicas da proteína, produzindo uma cor púrp ura, que deve \nser lida a 54011m no espectrofotômetro. \nAnálise estatística \nFoi realizada uma análise descritiva a fim de caracterizar a amostra estudada. Para as \ncomparações dos marcadores entre os grupos e os compartimentos sérico e folicular, foi aplicado o \nmodelo de regressão linear com efeitos mistos ( efeitos aleatórios e fixos) e o pós-teste por contrastes \nortogonais. Para estas análises foram utilizados a PROC MEANS e PROC MIXED do programa \nestatístico SAS® 9.0. \nPara as análises de valor de corte, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor \npreditivo negativo e acurácia, foram realizadas Curvas ROC, através do software R. Para definir os \nmarcadores adequados para predição de gestação clínica e nascidos vivos, foram selecionados aqueles \n\nManuscrito 1 112 \ncom área sob a curva (AUC) maior ou igual a 70% e, para estes, foram determinados os valores de \ncorte que apresentaram maior sensibilidade e acurácia para predizer gestação clínica e nascidos vivos. \nFoi considerado o nível de significância de 5% (p<0,05). \nResultados \nVariáveis clínicas, resposta à estimulação ovariana e resultados de ICSI em pacientes inférteis \ncom e sem endometriose. \nNão observamos diferença significativa entre os grupos avaliados com relação à média de \nidade, peso, estatura, FSH basal, dose total de FSH usada, duração da EOC, espessura endometrial no \ndia da transferência embrionária, número de oócitos captados e maduros, número de embriões de boa \nqualidade, total de embriões formados e número de embriões transferidos (Tabela 1). Também não se \nevidenciou diferença entre as taxas de fertilização, implantação, gestação clínica e nascidos vivos entre \nos grupos (Tabela 1). \nMarcadores de estresse oxidativo no soro e fluido folicular de pacientes inférteis com e sem \nendometriose submetidas à estimulação ovariana controlada para ICSI, no dia da captação \noocitária \nNo soro, o grupo com endometriose apresentou maiores concentrações de GSH (p=0,03) e \nSOD (p=0,02) e menores de CAT (p<0,01) comparado ao sem endometriose. Além disso, foi \nobservada uma tendência a maiores concentrações de FOX1 no grupo endometriose, comparado ao \nsem endometriose (p=0,05; Tabela 2). \nNo fluido folicular, o grupo com endometriose apresentou maiores concentrações de 8OHdG \n(p<0,01) e Vit E (p=0,03) comparado ao grupo sem endometriose (Tabela 2). \nAs comparações entre as concentrações séricas e foliculares dos oito marcadores de estresse \noxidativo intra-grupos também estão apresentadas na Tabela 2. No grupo com endometriose, \nobservaram-se maiores concentrações de FOXI (p<0,01), AOPP (p=0,03), Vit E (p<0,01) e SOD \n(p<0,01) e menores concentrações de 8OHdG, GSH e CAT (p<0,01) no soro do que no FF. Já no \ngrupo sem endometriose, foram encontradas maiores concentrações de FOXI (p<0,01), Vit E (p<0,01) \ne SOD (p=0,02) e menores concentrações de GSH (p<0,01) no soro do que no FF (Tabela 2). \nAnálise das curvas ROC \nForam realizadas curvas ROC e calculadas a área sob a curva (AUC) para todos os marcadores \nanalisados no soro e FF nos grupos com e sem endometriose. Consideramos como marcadores \nadequados para discriminação de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos aqueles AUC � 70%. \nNa tabela 3 estão apresentados a AUC, valores de corte, sensibilidade, especificidade, valores \n\nManuscrito 1 113 \npreditivo positivo e negativo e acurácia apenas dos marcadores de EO considerados adequados \npreditores de ocorrência de gestação clínica e nascidos vivos após ICSI nos grupos com e sem \nendometriose. \nNo grupo com endometriose, nenhum marcador de EO foi identificado como bom preditor \nsérico de ocorrência de gestação clínica e de nascidos vivos. No FF deste grupo, a 8OHdG foi o único \nmarcador que se apresentou como adequado preditor de ocorrência de gestação clínica (AUC =\n87,5%) (Figu ra 2A; Tabela 3). Concentrações foliculares de 8OHdG de 28,02 ng/mL apresentaram \ndiscriminação máxima de ocorrência de gestação clínica (sensibilidade de 87,5%, especificidade de \n100% e acurácia de 89%) (Figu ra 2A; Tabela 3). O único marcador no FF que apresentou área sob a \ncurva 2: 70% para discriminar a ocorrência de nascidos vivos foi a CAT (AUC = 74,26%). Níveis \nfoliculares de CAT de 0,53 mEq Trolox/L apresentaram discriminação máxima de ocorrência de \nnascidos vivos, com sensibilidade de 100%, especificidade de 52,94% e acurácia de 62%. (Figura 2B; \nTabela 3). \nNo grupo sem endometriose, a 8OHdG foi o único marcador considerado adequado preditor \nsérico de ocorrência de gestação clínica (AUC = 74,03%; Figu ra 2C; Tabela 3) e de nascidos vivos \n(AUC = 81,82%; Figu ra 2D; Tabela 3). Para predizer gestação clínica, valores séricos de 8OHdG de \n15,59 ng/mL apresentaram sensibilidade de 78,57%, especificidade de 54,55% e acurácia de 72% \n(Figu ra 2C; Tabela 3). Já para predizer nascidos vivos, valores séricos de 8OHdG de 18,11 ng/mL \napresentaram sensibilidade de 81,82%, especificidade de 67,86% e acurácia de 72% (Figu ra 2D; \nTabela 3). Dos marcadores avaliados no FF do grupo sem endometriose, a GSH foi o único \nconsiderado adequado preditor de ocorrência de gestação clínica (AUC = 72,05; Figu ra 2E; Tabela 3) \ne de nascidos vivos (AUC = 72,05; Figu ra 2F; Tabela 3). Concentrações foliculares de GSH de 277,25 \nnmol/g proteína apresentaram discriminação máxima de ocorrência de gestação clínica (sensibilidade \nde 73 ,91 %, especificidade de 85, 71 % e acurácia de 77%) e de nascidos vivos ( sensibilidade de \n85, 71 %, especificidade de 73,91 % e acurácia de 77%) (Figuras 2E e 2F; Tabela 3). \nDiscussão \nOs mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose \nainda não foram completamente elucidados (Holoch and Lessey, 2010). Entretanto, algu ns autores \napontam a possibilidade da endometriose ser uma doença relacionada ao EO (Agarwal et al., 2003, \nSzczepanska et al., 2003, Gupta et al., 2008). Questionamos, assim, o papel do EO na etiopatogênese \nda infertilidade relacionada à endometriose, particularmente associado à piora da qualidade oocitária, \no que poderia estar envolvido no comprometimento da fertilidade natural e, também, nas controversas\nmenores taxas de implantação e/ou gestação observadas em portadoras desta afecção submetidas à \nFN (Barnhart et al., 2002, Harb et al., 2013). Todavia, não encontramos estudos avaliando \nconjuntamente diferentes marcadores pró e antioxidantes no soro e FF de mulheres com infertilidade \n\nManuscrito 1 114 \nrelacionada à endometriose, e avaliando seu papel nos resultados da FIV e ICSI. Diante disso e da \nimportância em se fundamentar novas abordagens passíveis de melhorar a fertilidade natural e \notimizar os resultados dos procedimentos de reprodução assistida nestas pacientes, o presente estudo \ncomparou os níveis de oito marcadores de EO (FOX1, MOA, AOPP, 8OHdG, GSH, Vit E, SOD e \nCA T) no soro do dia da captação oocitária e no FF de mulheres inférteis com e sem endometriose \n(infertilidade de causa tubária e/ou masculina) submetidas à EOC para ICSI. Além disso, foi avaliado \no possível papel destes marcadores no soro e no FF nos dois principais resultados da ICSI (gestação\nclínica e nascidos vivos) nos dois grupos. \nDemonstramos maiores níveis de GSH e SOD e menores níveis da CAT no soro do grupo com \nendometriose, sugerindo a ocorrência de EO sistêmico em pacientes inférteis com a doença, \ncorroborando estudos de Lambrinoudaki et al. (2009), Bordin et al. (2010) e Andrade et al. (2010) que \nassociam a endometriose ao EO sistêmico, analisando outros marcadores de EO distintos dos aqui \navaliados. O aumento de GSH e SOD sugere haver uma mobilização do sistema antioxidante sérico na \ntentativa de neutralizar o prévio aumento de agentes pro-oxidantes, sugerido neste estudo pela tendência \na maiores níveis de FOX1 circulantes, uma vez que este marcador, quando elevado, é indicador de maior \nprodução de espécies reativas (Mier-Cabrera et al., 2008). O único estudo na literatura que analisou o \ntotal de hidroperóxidos no soro de portadoras de infertilidade relacionada à endometriose foi publicado \npelo nosso grupo (Andrade et al., 2010), analisando este marcador na fase folicular precoce do ciclo \nnatural, com achados similares aos aqui apresentados analisando amostras séricas obtidas após EOC, no \ndia da captação oocitária. Os menores níveis da CA T indicam consumo de outros antioxidantes \npresentes, culminando com diminuição da capacidade antioxidante total no compartimento sérico. A \nGSH, por ter importante papel na neutralização do peróxido de hidrogênio e dos peróxidos orgânicos, \nestes produzidos abundantemente em processos inflamatórios (El-Shahat and Kandil, 2012), pode \nindicar uma resposta antioxidante sistêmica frente às reações inflamatórias provocadas pelos implantes \nendometriais ectópicos (Gupta et al., 2008). Entretanto, contrariamente aos presentes achados, Jana et \nal. (2013) encontraram menores níveis de GSH em soro de mulheres com endometriose comparadas a \ncontroles. Da mesma forma, os maiores níveis de SOD no soro de mulheres com endometriose \nevidenciados no presente estudo contrariam os resultados de Jana et al. (2013) e também os de Prieto et \nal. (2012), que observaram menores níveis deste marcador no grupo com endometriose. No entanto, o \ntrabalho de Jana e colaboradores foi realizado com amostras coletadas na fase folicular precoce do ciclo \nmenstrual (Jana et al., 2013), diferentemente do presente estudo, em que as amostras sanguíneas foram \ncoletadas no dia da captação oocitária, o que dificulta a comparação dos dados e pode justificar as \ndiscrepâncias encontradas, uma vez que a EOC parece promover aumento da SOD em mulheres \nsubmetidas a FIV ou illl (Younis et al., 2012). Prieto et al. (2012), por sua vez, avaliaram apenas \npacientes com endometriose moderada e grave, sendo que o avanço no estadiamento da doença pode \nestar relacionado à ocorrência de estresse oxidativo mais pronunciado (Jackson et al., 2005), com maior \nconsumo de antioxidantes. Os menores níveis da CAT encontrados no presente estudo corroboram os \n\nManuscrito 1 115 \nachados de Jana et al. (2013) e de Szczepanska et al. (2003), os quais evidenciaram menores níveis deste \nmarcador, respectivamente, no soro e fluido peritoneal de mulheres com a doença, sugerindo, também, \nque o compartimento sérico esteja refletindo o status redox do microambiente peritoneal. \nCom relação ao compartimento folicular, o grupo com endometriose apresentou maiores níveis \nde 8OHdG e Vit E no FF comparado ao grupo sem endometriose, sugerindo ocorrência de estresse \noxidativo também neste microambiente reprodutivo de pacientes inférteis com a doença submetidas a \nEOC. Esta é a primeira vez em que a 8OHdG é avaliada no FF de mulheres com endometriose, sendo \neste um achado de grande importância para o entendimento da etiopatogênese da infertilidade \nrelacionada à doença. A presença de elevados níveis da 8OHdG no FF de mulheres inférteis com \nendometriose sugere a ocorrência de dano oxidativo ao DNA neste microambiente reprodutivo, que \npode promover comprometimento da qualidade gamética, como sugerido pelos estudos que serão \napresentados a seguir. Segundo Seino et ai. (2002), níveis elevados da 8OHdG nas células da granulosa \nde mulheres inférteis submetidas a FIV têm correlação negativa com taxa de fertilização e formação de \nembriões de boa qualidade. Corroborando estes achados, Tamura et ai. (2008) demonstraram que \nelevados níveis da 8OHdG no FF de mulheres submetidas a FIV foram correlacionados com maiores \ntaxas de oócitos degenerados, sugerindo que a elevação deste marcador de EO a nível folicular tenha \nefeito tóxico sobre a maturação oocitária. Com base na análise imunohistoquimica da 8OHdG, \nMatsuzaki and Schubert (2010) sugerem que o córtex ovariano saudável adjacente a um endometrioma é \nafetado mais severamente pelo EO do que o córtex adjacente a cistos ovarianos benignos de outra \norigem, indicando maior dano ao DNA no ovário de mulheres com a doença. Somado a isso, um estudo \nrecente Polak et al. (2013) aponta haver maiores níveis de 8OHdG no FP de mulheres com \nendometriose comparadas a pacientes com cistos serosas e dermóides, sugerindo que o FP dessas \npacientes pode ter efeito na infertilidade relacionada a endometriose. Estudo publicado por nosso grupo \n(Barcelos et al., 2009) sugeriu comprometimento e/ou retardo na conclusão da meiose de oócitos \nmaturados in vitro, provenientes de ciclos estimulados de mulheres inférteis com endometriose. Um \noutro interessante estudo realizado pelo nosso grupo demonstrou que o fluido folicular de mulheres \ninférteis com endometriose leve submetidas à EOC para ICSI promove anomalias meióticas oocitárias \nem modelo bovino (Da Broi et ai., 2014). Analisando conjuntamente estes achados e os do presente \nestudo, hipotetizamos que a presença de estresse oxidativo no compartimento folicular de mulheres \ninférteis com endometriose, representada pela maior concentração de 8OHdG, esteja relacionada a \nocorrência de dano oxidativo e anomalias oocitárias oocitárias, participando da etiopatogênese da \ninfertilidade relacionada à doença nestas mulheres, corroborando os achados em células da granulosa e \nfluido peritoneal apresentados na literatura. \nOs maiores níveis de Vit E encontrados no FF de mulheres com a doença, por sua vez, indicam \numa mobilização do sistema antioxidante folicular na tentativa de neutralizar espécies reativas e evitar \ndanos oxidativos oocitários. Entretanto, essa mobilização não teria sido capaz de prevenir o dano \noxidativo, como evidenciado pelos maiores níveis da 8OHdG. Este achado contraria tanto um estudo \n\nManuscrito 1 116 \nrecente de Singh et ai. (2013), que encontrou menores níveis de Vit E no FF de mulheres com a doença, \ncomo os estudos de Campos Petean et ai. (2008) e Prieto et ai. (2012), nos quais não foi evidenciada \ndiferença nos níveis de Vit E entre o FF de pacientes inférteis com endometriose e controles. Todavia, \nos critérios de elegibilidade dos sujeitos dos referidos estudos são heterogêneos, assim como os \nprotocolos de estimulação ovariana, dificultando a comparação dos resultados. Associadamente a isto, \nnestes estudos não foi apresentado o poder de teste das análises realizadas. Com base nos presentes \nachados e considerando um estudo de Tamura et al. (2008), no qual, a administração de vitamina E ( a­\ntocoferol, 600 mg/dia), do quinto dia do ciclo anterior ao tratamento até o dia da captação oocitária de \npacientes inférteis submetidas a FN reduziu as concentrações intrafoliculares da 8OHdG com relação \nao ciclo prévio, questionamos a importância de terapias antioxidantes adicionais, especificamente, da \nadministração de Vit E, visando à prevenção de danos oxidativos ao DNA em pacientes inférteis com \nendometriose, o que necessita de estudos pertinentes. \nQuando comparados os marcadores entre soro e FF no grupo endometriose, evidenciou-se que \nno soro há maiores níveis de FOX1, AOPP, Vit E e SOD do que no FF e no FF há maiores níveis de \n8OHdG, GSH e CAT do que no soro. Maiores níveis séricos de FOX1 e AOPP sugerem, \nrespectivamente, maior produção de espécies reativas e maior dano oxidativo proteico a nível \nsistêmico, não prevenidos pela maior mobilização dos antioxidantes SOD e Vit E. Os maiores níveis \nde 8OHdG no FF sugerem dano preferencial ao DNA no microambiente folicular de mulheres com \nendometriose, o que poderia estar relacionado a dano oxidativo oocitário nessas pacientes como \npreviamente mencionado; ao passo que, maiores níveis foliculares de GSH e CAT em relação ao soro \nindicam haver uma maior mobilização do sistema antioxidante no microambiente folicular destas \nmulheres, que habitualmente apresenta forte defesa antioxidante para proteção do folículo contra o EO \n(Angelucci et al., 2006). Já no grupo sem endometriose, encontrou-se maiores níveis de FOX1, Vit E e \nSOD no soro do que no FF e maiores níveis de GSH no FF comparado ao soro. Estes achados diferem \ndos apresentados por Sabatini et ai. (1999) que afirmam haver maior atividade da SOD no FF \ncomparado ao soro de mulheres submetidas a EOC para FN. Campos Petean et ai. (2008) \ncompararam Vit E e MDA entre soro e FF de mulheres com e sem a doença, tendo encontrado maiores \nníveis de Vit E no soro tanto no grupo com como no sem endometriose, corroborando nossos achados. \nNo entanto, os níveis de MDA foram menores no FF do que no soro do grupo controle, sendo que, no \npresente estudo, não evidenciamos diferença para este marcador em nenhum dos grupos. \nDiferentemente do grupo com endometriose, no grupo sem endometriose não se observou maiores \nníveis de AOPP no soro do que no FF, e nem maiores concentrações de 8OHdG no FF comparado ao \nsoro, sugerindo não haver evidências de dano oxidativo sistêmico a proteínas e ao DNA em nível \nfolicular em mulheres inférteis sem a doença. \nCom a evidência de EO sistêmico e folicular em pacientes com endometriose submetidas à \nEOC e, sabendo-se que baixas concentrações de espécies reativas têm importância na modulação \nfisiológica de vários fenômenos do trato reprodutivo feminino, como a maturação oocitária, a atresia \n\nManuscrito 1 117 \nfolicular, a função do corpo lúteo, a interação gamética, a fertilização, o desenvolvimento e a \nimplantação embrionária (Agarwal et al., 2005, Fujii et al., 2005), avaliamos o papel dos marcadores \nde estresse oxidativo analisados no soro e no FF nos dois principais resultados da ICSI, gestação \nclínica e nascidos vivos, nos grupos com e sem endometriose. Foram realizadas curvas ROC e \nconsiderados como marcadores adequados para discriminação de ocorrência de gestação clínica e \nnascidos vivos aqueles com AVC� 70%, para os quais foram determinados os valores de corte com \nmáximo poder discriminatório para estes dois endpoints, sendo calculados suas respectivas \nsensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e negativo e acurácia, sendo estes dados \ninéditos na literatura. Dispomos de um estudo que avaliou marcadores de estresse oxidativo no FF \npara predição de viabilidade embrionária, tendo identificado valor de corte apenas para os níveis de \nespécies reativas de oxigênio, acima do qual, a formação de embriões viáveis não é favorável (Jana et \nal., 2010). Temos um outro estudo recentemente publicado (Singh et al., 2013) que avaliou se os \nníveis de espécies reativas de oxigênio no FF de mulheres inférteis com e sem endometriose são \ncapazes de discriminar entre oócitos maduros e imaturos, evidenciando que valores de ERO::; 105,36 \ncps apresentaram máximo poder discriminatório para oócitos maduros (73,68% de sensibilidade e \n89,74% de especificidade) no grupo com endometriose. No presente estudo, no grupo sem \nendometriose, o marcador 8OHdG foi identificado como o melhor preditor sérico e a GSH como o \nmelhor preditor folicular tanto de gestação clínica como de nascidos vivos. No grupo com \nendometriose, no entanto, nenhum marcador foi identificado como bom preditor sérico para os \nendpoints avaliados, assim como, não houve bom preditor folicular de nascidos vivos. A 8OHdG, por \nsua vez, foi o melhor preditor folicular de ocorrência de gestação clínica no grupo endometriose, tendo \napresentado a melhor área sob a curva de todos os marcadores avaliados nos diferentes \nmicroambientes e grupos, assim como, alta acurácia, sensibilidade e especificidade. Estudos com \nmaiores casuísticas são necessários para confirmar a acurácia dos marcadores identificados no \npresente estudo para discriminação de gestação clínica e nascidos vivos, no soro e FF de mulheres \ninférteis com e sem endometriose, o que seria de grande valia na determinação do prognóstico \ngestacional destas pacientes e no delineamento de estudos de intervenção avaliando o papel de \nantioxidantes específicos nos subgrupos indentificados. \nÉ importante ressaltar que, no presente estudo, foram adotados critérios de elegibilidade \nbastante seletivos para os sujeitos da pesquisa, evitando-se a interferência de outros fatores associados \nao estresse oxidativo e piora de qualidade oocitária e resultados da ICSI, minimizando, assim, possíveis \nvieses de seleção amostral. Neste sentido, foram elegíveis para o estudo apenas pacientes submetidas a \nvideolaparoscopia e que não apresentavam outras condições potencialmente associadas ao EO e piora de \nqualidade oocitária, como idade avançada, aumento do FSH basal, obesidade, doenças associadas ao \nEO, uso de medicações e suplementos vitamínicos. No grupo de estudo o único fator relacionado à \ninfertilidade identificado era a endometriose, o que também toma este grupo bastante homogêneo. Além \ndisso, adotou-se um protocolo rígido para a coleta das amostras, tendo-se optado pela obtenção do \n\nManuscrito 1 118 \nsangue previamente à aplicação do anestésico e pela obtenção e análise do fluido folicular aspirado \napenas do primeiro folículo do primeiro ovário puncionado de cada paciente, com 15 mm ou mais de \ndiâmetro (pela maior possibilidade de conter um oócito maduro), com ausência de contaminação \nsanguínea à inspeção visual e um oócito captado, a fim de evitar possíveis vieses decorrentes do estresse \nanestésico e da própria punção ovariana, que pudessem influenciar os níveis de marcadores de EO \nanalisados no FF. Entretanto, como principais limitações deste estudo, podemos considerar a pequena \ncasuística avaliada, decorrente dos critérios de seleção extremamente rigorosos, assim como, a EOC a \nque todas as pacientes foram submetidas, persistindo a dúvida se os presentes achados relativos aos \nmarcadores de EO no soro e FF podem ser extrapolados para os ciclos naturais de mulheres com e sem a \ndoença. Tem sido muito pouco estudado se a EOC interfere com o balanço oxidante/antioxidante sérico \ne folicular. Em um estudo com pequena casuística foi demonstrado que o produção de ERO pelas \ncélulas da granulosa não difere em ciclos estimulados e não estimulados (Jancar et ai., 2008), mas \npersiste a lacuna no conhecimento sobre a investigação de marcadores locais e sistêmicos de EO em \nciclos não estimulados. \nResumidamente, os resultados do presente estudo indicam ocorrência de estresse oxidativo \nsistêmico, representado sobretudo pela menor CAT, e folicular, evidenciado principalmente pelas \nmaiores concentrações de 8OHdG, marcador de dano oxidativo ao DNA, em pacientes inférteis com \nendometriose submetidas à EOC para ICSI. Sendo o folículo ovariano uma estrutura altamente \nvascularizada durante os estágios finais da foliculogênese, hipotetizamos que tanto o estresse \noxidativo sistêmico, como o EO no microambiente folicular possam favorecer o comprometimento da \nqualidade oocitária, participando da etiopatogênese da infertilidade em mulheres com endometriose. \nEvidenciamos diferenças nas comparações entre os níveis séricos e foliculares dos oito marcadores \nestudados dentro dos grupos com e sem endometriose, sugerindo haver diferenças no balanço \noxidante/antioxidante sistémico e folicular relacionadas à doença. Demonstramos que alguns dos \nmarcadores de EO estudados mostraram-se bons preditores de gestação clínica e nascidos vivos após \nICSI, abrindo perspectivas de utilização dos mesmos na determinação do prognóstico gestacional \napós-ICSI e fundamentação de novas abordagens terapêuticas. Dessa forma, estudos futuros com \ncasuística ampliada, avaliando a aplicabilidade destes marcadores na predição de sucesso de ICSI e o \ndelineamento de estudos que visem abordagens terapêuticas mais específicas são de grande \nimportância para o manejamento adequado destas pacientes e o melhor entendimento da \netiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose. \nAUTHOR'S ROLES \nMG Da Broi was responsible for selection of the patients, acquisition of data, methodology, \ninterpretation of data and manuscript writing. FO Albuquerque gave substantial contributions to \nacquisition and interpretation of data and manuscript writing. AZ Andrade gave substantial \ncontributions to selection of the patients and acquisition of data. RL Cardoso contributed to the \n\nManuscrito 1 119 \nselection of the patients and acquisition of data. AA Jordão Junior contributed to interpretation of data \nand revising critically the manuscript. PA Navarro contributed to conception and design, \ninterpretation of data, revising critically the manuscript, final approval of the version to be published \nand was the coordinator ofthe project. \nACKNOWLEDGMENTS \nThe authors thank the staff of the Human Reproduction Laboratory, University Hospital, \nDepartment of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São \nPaulo (FMRP-USP), especially Maria Cristina Picinato and Roberta Cristina Giorgenon for collection \nof FF, the Nutrition and Metabolism Laboratory, FMRP-USP, especially Paula Payão and Virginia \nLi poli for technical support, and Jhenifer Klienchen Rodrigues for collection of FF and for assisting in \nquantification of some OE markers. \nFUNDING \nThis study received financial support from the Nati onal Council for Scientific and \nTechnological Development (CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e \nTecnológico; 474858/2009-0; 309056/2009-8; 503867/2010-1) and FAPESP (2008/58197-6). \nCONFLICT OF INTEREST \nThe authors declare no conflicts of interest. \nReferências \n1. 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