Análise da expressão diferencial dos genes ID2, PRELP e SMOC2 em endométrio ectópico e eutópico de mulheres com e sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual

ARAUJO, F. M.. Differential expression analysis of ID2, PRELP and SMOC2 genes in ectopic and eutopic endometrium in women with and without endometriosis in the proliferative phase of the menstrual cycle . 2011. 94p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. Endometriosis is a complex dise ase and its etiology is multifa ctorial, characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity especially in the pelvic peritoneum and ovaries, involving geneti c predisposition, enviro nmental factors, anat omical, endocrine and immunological changes. It affects 10 to 15% of women of re productive age and 35 to 50% of women with infertility, pelvic pain or both. Despite being one of the most studied diseases in gynecology, its etiology remains unclear and there are several current theories to explain it. The study of genes that regulate the processes invo lved somehow with endometriosis as ID2 (cell proliferation), PRELP (extracellular matrix) and SMOC2 (angiog enesis) may help clarify its development. The aim of this study was to analyze the gene expression of these genes in tissue samples from 20 women paired with 10 endome trial tissue and 10 per itoneal endometriotic lesions 10 endometrial tissue and 10 ovarian endometriotic lesions in proliferative phase of the menstrual cycle. Sixteen samples of endometrium of women without endometriosis, in the same phase of the menstrual cycle we re collected to control (C). The study was conducted through molecular biology techni ques such as reverse transcripti on (RT-PCR) and quantitative gene expression analysis (real-time-time PCR). Statistical analysis showed no diffe rence in gene expression between the endometrium of women without endometriosis and endometrium from women with endometriosis. Showed a greater expression of the ID2 gene in advanced stage of endometriosis when compared to the initial stage and ovarian endometrioma compared to eutopic endometrium of women with endometriosis and PRELP in peritoneal lesion compared to eutopic endometrium of women with endo metriosis. In the analysis pe rformed with all lesions the SMOC2 was expressed more in the lesions (ovarian and peritoneal) compared to the eutopic endometrium of women with endometriosis. The results cited show that the expression of the genes studied may be influenced through th e peritoneal cavity, and may be modified depending on the implantation site (ovary or peritoneum).

endometriosis, gene expression, ID2, PRELP, SMOC2 and real-time PCR. LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 – Análise da expressão do gene ID2 entre o estadio I + II (fase inicial) x estádio III + IV (fase avançada)............................................................................................................ 37 Gráfico 2 – Análise da expressão do gene SMOC2 entre endométrio eutópico de mulheres com endometriose e endométrio ectópico de mulheres com endometriose ............................. 38 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Análise da expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 entre endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio eutópico de mulheres com endometriose......... 36 Figura 2 – Análise da expressão dos genes ID2 e PRELP entre endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose.................................................................................. 38 LISTA DE ABREVIATURAS bHLH – basic helix-loop-helix cDNA – ácido desoxiribonucleico complementar CONEP - Comitê Nacional de Ética em Pesquisa DNA - ácido deseoxiribonucleico dNTP - desoxinucleotideo trifosfato EDTA – ácido etilenodiaminotetraacético FGF – fibroblast growth factor HCFMRP- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto HLH – helix-loop-helix ID2 – inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein ILK – integrin linked kinase LRR – leucine-rich repeat Kb – kilobase KH 2PO4 – fosfato de potássio monobásico Mgcl2 – cloreto de magnésio NaCl – cloreto de sódio Na2HPO4 – fosfato de sódio monobásico p16 – proteína p16 p – braço curto do cromossomo pb – pares de bases PBS – phosphate-buffered saline PDGF – platelet-derived growth factor pRb – proteína do gene retinoblastoma PRELP – proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein PCR – do inglês Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) PROC FREQ – estatística de frequência q – braço longo do cromossomo RNA – ácido ribonucleico rpm – rotações por minuto SMAP - smooth muscle associated protein 2 SMOC2 – SPARC related modular calcium binding 2 SNP – polimorfismo nucleotídico individual SPARC – secreted protein, acidic, cysteine-rich SRLP – small LRR proteoglycans USP - Universidade de São Paulo VEGF – vascular endothelial growth factor LISTA DE SÍMBOLOS oC – graus Celsius g/L – grama por litro µg – micrograma mg – miligrama µL – microlitro mL – mililitro M – molar mM – milimolar nm - nanomolar % - porcentagem U - unidade SUMÁRIO 1-INTRODUÇÃO ...................................................................................................................16 1.1 Endometriose ..................................................................................................................17 1.2 Etiologia da endometriose...............................................................................................18 1.3 Genética e endometriose.................................................................................................19 1.4. O gene ID2 [(inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein)] ................................................................................................................................22 1.5. O gene PRELP [(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)] ...................24 1.6. O gene SMOC2 [(SPARC related modular calcium binding 2)]...................................25 2 - OBJETIVO ........................................................................................................................28 3 – CASUÍSTICA, MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................30 3.1. Aspectos Éticos do Projeto ............................................................................................31 3.2. Casuística .......................................................................................................................31 3.3. Amostras ........................................................................................................................32 3.4. Extração do RNA total...................................................................................................32 3.5. Síntese do cDNA ...........................................................................................................32 3.6. Quantificação por PCR em Tempos Real ......................................................................33 3.7. Análise Estatística dos resultados ..................................................................................33 4 - RESULTADOS..................................................................................................................35 5 - DISCUSSÃO......................................................................................................................39 6 - CONCLUSÃO ...................................................................................................................45 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................47 ANEXO....................................................................................................................................60 APÊNDICES ...........................................................................................................................62 MANUSCRITO ......................................................................................................................66 1-INTRODUÇÃO Introdução | 17 1.1 Endometriose Endometriose é uma doença de etiopatoge nia complexa e multifatorial, envolvendo predisposição genética, fatores ambientais, an atômicos, endócrinos e alterações imunológica. Muitas vezes é progressiva, caracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina - principalmente no peritônio pélvico e ovários, levando á processos inflamatórios, reação cicatricial e formação de aderências, associados à infertilidade e dor pélvica crônica. É uma patologia comum, de caráter benigno, estrógeno-dependente, que afeta de 10 a 15 % das mulheres em idade reprodutiva, 35 a 50% das mulheres com infertilidade, dor pélvica ou ambos (Cramer e Missmer, 2002; Giudice e Kao, 2004). Acredita-se primariamente que a endometriose ocorra devido à menstruação retrógada e implante de células endometriais na cav idade abdominal (Sampson, 1927). Entretanto, apesar da menstruação retrógada ocorrer na maioria das mulheres, a endometriose se desenvolve somente em 10% delas (Eskenazi e Warner, 1997), favorecendo a hipótese de etiopatogenia multifatorial da doença. É comum encontrarmos implantes endo metrióticos na cavidade pélvica, principalmente localizado no peritônio pélvic o e ovário. Entretanto, também podem ser encontrados no septo reto-vaginal, pericárdio, pleura, fígado, rim, bexiga, cérebro e raramente em homens (Giudice e Kao, 2004). Embora a história e exame clínicos possa m sugerir um diagnóstico presuntivo de endometriose o diagnóstico definitivo é cirúrgic o, através da laparoscopia ou laparotomia. Assim, a laparoscopia, apesar de onerosa e invasiva, é ainda o método mais confiável e o padrão “ouro” para o diagnóstico da doenç a. Na maioria dos casos, a endometriose é cirurgicamente estadiada com base na localizaç ão, extensão e tipo de lesão por laparoscopia (Brosens et al., 2004). A American Society for Reproductive Medicine (1997), organizou e propôs a classificação da endometriose em quatr o estadios: forma mínima (estádio I), leve Introdução | 18 (II), moderada (III) e severa (IV). Além de sta classificação, morfologicamente os implantes podem ser bastante variáveis, ter múltiplas formas e coloraçõ es, e em geral, observam-se lesões de cor vermelha, amarela, marrom ou preta (American Society for Reproductive Medicine, 1997; Kamergorodsky et al., 2007). 1.2 Etiologia da endometriose A etiologia da endometriose envolve fatores que influenciam no seu estabelecimento e progressão, incluindo hormonais (Nyholt et al., 2009), imunes (Weiss et al.,2009), alterações ambientais (Guo, 2009) e predisposição genética (Juo et al., 2006) e apesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia, sua et iologia ainda não está clara e várias são as teorias para explicá-la (Ulukus et al., 2009; Carvalho et al., 2011). A mais aceita é a teoria de Sampson ou fl uxo menstrual retrógrado (1927), que aponta a presença de células endometriais viáveis no fluxo menstrual retrógrado como causador das lesões. No entanto, praticamente 90% das mu lheres com tubas pérvias apresentam fluxo menstrual retrógrado e a maioria não apresent ará a endometriose (Halme et al., 1984). Descrita por Meyer, em 1919, a teoria da metapl asia celômica, sugere que o epitélio celômico possa se transformar, por metaplasia, em tecido tipo endométrio (Witz , 2003). E a teoria imunológica, que se baseia no conceito que a menstruação retrógada é um fenômeno universal nas mulheres e nem todas desenvolvem endo metriose. Assim, a implantação dos focos endometrióticos seria resultado de falha na limpeza destas células, decorrentes de anormalidades na função imunológica (Viganò et al., 1991; Oosterlynck et al., 1991). Hoje se acredita na confluência destas teorias para a explicação da etiopat ogenia da endometriose peritoneal e ovariana. Haveria realmente fluxo menstrual retrógrado associado à predisposição imunológica no microambiente peritoneal que facili taria o implante de células endometriais viáveis e com potencial para implantação? Introdução | 19 Estudos sugerem que a endometriose esteja associada a um processo inflamatório pélvico, ocasionado pelos implantes endometriais ectópicos (Lebovic et al., 2001; Lima et al., 2006) que sofrem sangramento cíclicos (A rya e Shaw, 2005) ocasionando disfunção de células do sistema imunológico e número au mentado de macrófagos ativados no fluído peritoneal, os quais secretam vários fatores locais tais como fatores de crescimento e citocinas (Lima et al., 2006). Assim, o desenvolvimento da endometriose parece ser um fenômeno complexo, facilitado por fatores múltiplos, incluindo: quan tidade e qualidade de células endometriais no fluído peritoneal, atividade inflamatória, e xpressão aumentada de moléculas de adesão, angiogênese, apoptose reduzida, escape do si stema imunológico e aumento da proliferação celular (Lima et al., 2006; Ulukus et al., 2006). 1.3 Genética e endometriose Endometriose tem sido comparativamente similar a doenças malignas do sistema reprodutivo em termos de predisposição familial, possibilidade de alcançar órgãos distantes, alterações genéticas identificadas em tecidos e a existência de um ambiente imunobiológico, angiogênico e hormonal alterado (Nezhat et al., 2008). Alguns estudos populacionais tem demonstrado que mulheres diagnosticadas com endometriose tem um aumento estatisticamente sign ificante no risco de dese nvolver vários tipos de câ ncer (Brinton et al., 1997; Olson et al., 2002; Melin et al., 2006). A genética da endometriose é complexa, no entanto, acredita-se que ela é herdada de um modo poligênico/multifatorial e há predis posição familial para o seu desenvolvimento. Endometriose que ocorre familialmente tende a ser mais severa quando comparada a casos esporádicos. Isto sugere que há mais prope nsão genética em indi víduos com doença grave (Kennedy, 1996). Introdução | 20 Estudos moleculares tem focado esforços consideráveis na expressão, regulação e herança de genes na endometriose. Um grande número de genes candidatos tem sido avaliado para sua associação com endometriose, como os genes envolvidos na inflamação, na síntese de esteróide, na desintoxicação, no metabolismo de estrógeno, na apoptose, na regulação do ciclo celular, além de fatores de cresciment o, moléculas de adesão, receptores de hormônios, oncogenes e sistemas metabólicos (Hansen e Eyster, 2010). Dentre as técnicas utilizadas para o estudo da endometriose, a tecnologia do microarray cDNA é uma poderosa ferramenta para quantificar níveis de expressão de centenas de genes simultaneamente. Com esta técnica, pode-se comparar modelos de expressão gênica entre endomét rio eutópico e ectópico da me sma paciente ou identificar genes diferencialmente expressos no endomét rio entre amostras com e sem endometriose (Eyster et al., 2007). Na literatura, há alguns trabalhos com análise comparativa global da expressão gênica de tecido endometrial de mulh eres com e sem endometriose (Matsuzaki et al., 2004; Wu et al., 2006; Eyst er et al., 2007; Sherwin et al ., 2008) . Estes estudos diferem principalmente na localização do tecido endome trial analisado (eutópico ou ectópico), na plataforma de microarray utilizada e na fa se do ciclo menstrual que a amostra foi obtida (Aghajanova; Velarde e Giudice, 2010). Mettler et al. (2007), utilizaram a técnica de microarray para analisar a expressão gênica de 1176 genes em tecido endometriótico ovariano de 5 pacientes e compará-la ao endométrio de 5 mulheres sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrua l. O resultado da análise de monstrou que 13 genes estavam diferencialmente expressos. Nos últimos anos, tem sido mostrado que pequenos microRNAs “ non-coding” (miRNAs) são importantes componentes de um a complexa rede de genes regulatórios (Reinhart e Bartel 2002; Aravin et al., 2007). Estudos recentes mostram que os miRNAs e seus alvos, os mRNAs, são diferencialmente ex pressos na endometriose e em outras doenças Introdução | 21 do sistema reprodutor feminino (Pan et al., 2007; Burney et al., 2009; Ohlsson Teague et al., 2009; Filigheddu et al., 2010; Ramón et al., 201 1). Sabe-se que os miRNAs controlam um amplo espectro de funções celulares normais e patológicas, tendo um importante papel na patogênese destas doenças e possivelmente possam ser usados como biomarcadores e ferramenta terapêutica na endometriose (Ohlsso n Teague et al., 2010). Além disso, vários trabalhos tem focado nas difere nças da expressão gênica entre lesão endometriótica e endométrio eutópico. Há também diferenças co nhecidas em expressão gênica no endométrio eutópico de mulheres com endometriose comp arada com endométrio c ontrole de mulheres sem a doença (Burney et al., 2007). Não é conhecido, entretan to, se a expressão gênica alterada no endométrio eutópico é devido a alguma diferença inerente a expressão gênica entre pacientes e controles, ou alternativamente, se a existência de lesões endometrióticas gera um ambiente peritoneal alterado que age no e ndométrio eutópico resultando em expressão gênica aberrante (Pelch et al., 2010). Assim estudos comparati vos entre o endométrio de mulheres sem endometriose (controle) e o endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose podem esclarecer alterações prec oces e necessárias ao desenvolvimento da doença. O estudo de genes que regulam de alguma fo rma os processos acima poderiam ajudar a esclarecer o desenvolvimento da endometriose. Os genes ID2, PRELP e SMOC2 fazem parte de uma lista de genes desregulados e previamente estudados pelo nosso grupo (Meola et al., 2010) e que podem estar envolvidos no proce sso da etiopatogenia da doença. A busca incessante por mecanismos relacionados à expressão de genes presentes em comportamentos biológicos envolvidos com a etiopatogenia da doença poderá, futuramente, indicar marcadores moleculares, permitindo um di agnóstico menos invasivo e com possíveis aplicações terapêuticas. Introdução | 22 1.4. O gene ID2 (inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein) O gene ID2 está mapeado na região 2p25 (Mathew et al., 1995) e sua proteína interage com os componentes do ciclo celular normalm ente envolvidos nos mecanismos regulatórios da progressão do ciclo, como por exemplo: pRb, p16. Sua superexpressão parece tornar células cancerosas imunes aos efeitos de inib ição do crescimento de várias proteínas supressoras de tumor (Lasorella, Iavarone e Israel, 1996). A proteína ID2 pertence a uma família de 4 proteínas (ID 1, 2, 3 e 4) relacionadas ao controle da diferenciação e pr ogressão do ciclo celular em vá rios organismos, desde moscas até o homem (Pesce and Benezra, 1993; Chen and Lim, 1997; Langlands et al., 1997; Yates et al., 1999). Todas as quatro proteínas ID pertencem a uma classe de fatores de transcrição conhecida como proteínas hélice-alça-hélice (HLH – helix-loop-helix), que são uma grande família de proteínas, principalmente ativadores transcricionais, que compartilham um motivo de ligação comum, composto de uma região de amino ácido básico e uma região hélice-alça- hélice (bHLH) (Benezra et al., 1990; Norton et al., 1998). As proteínas bHLH formam homo e heterodímeros através das regiões hélice-alça-h élice e se ligam a sequencias específicas de DNA por meio das regiões básicas (Davis et al., 1990; Voronova e Baltimore, 1990). A descoberta da proteína ID mostrou um a nova perspectiva pa ra considerar a regulação das proteínas bHLH (Benezra et al., 1990). As proteínas ID contem uma região HLH similar aquela das proteínas bHLH e pode m formar heterodímeros com algumas delas. Mas estes heterodímeros não podem se ligar ao DNA, porque a proteína ID perde a região básica responsável por esta ligação. Portant o, a proteína ID regula negativamente a capacidade de ligação ao DNA da s proteínas bHLH que controla m a expressão gênica de um tipo celular específico e a expressão dos genes que controlam o ciclo celular (Lassar et al., 1994). Introdução | 23 Vários processos celulares são regulados po r proteínas ID: inibi ção da diferenciação celular por interferência, extensão da vida celular (Alani et al., 1999; Nickoloff et al., 2000; Tang et al., 2002), regulação da angiogênese (Lyden et al., 2001), desenvolvimento cardíaco (Fraidenraich et al., 2004) e manutenção do fenótipo da célula tronco embrionária (Ying et al., 2003). A expressão de proteínas ID é anormal em muitos tumores, incluindo câncer pancreático (Maruyama et al., 1999), câncer cervical (Schindl et al., 2001), melanoma (Polsky et al., 2001), carcinoma de células escam osas do esôfago (Hu et al., 2001) e no câncer de tiróide (Kebebew, 2005). Em alguns tumores su a expressão está associada com prognóstico clínico ruim como no câncer de ovário, cervical, de próstata e no câncer de mama (Schindl et al., 2001; Schoppmann et al., 2003; Maw et al., 2008). Em conjunto, estes dados sugerem um papel oncogênico para as proteínas ID (Manthey et al., 2010). Estas tem sido implicadas em diferentes passos na tumorige nese, diferenciação e metástase (Benezra, Rafii e Lyden, 2001; Fong, Debs e Desprez, 2004; Hasskarl e Munger, 2002; Sikder et al., 2004). A re-expressão destas proteínas, que são marcadores fetais, em células tumorais e estroma do tumor indica a reversão de um estado “anterior”, semelhan te ao embrionário em que o potencial de proliferação e migração da célula e a rápida aquisição de suporte dos vasos sanguíneos facilitam o processo de transformação nas doenças humanas (Perk, Iavarone e Benezra, 2005). A endometriose exibe alguns aspectos de malignidade tais como aumento de crescimento, vascularização e invasão tecidual, mas características tumorais como expansão monoclonal e anomalias genéticas permanecem indefinidas (Viganò et al., 2006). Visto as similaridades entre endometriose e câncer, a mu dança na expressão de genes associados com adesão celular, glicolisação de proteínas, invasão celular e angiogênese talvez esteja envolvida na patologia da endometriose como estão no câncer (Eyster et al., 2007). Introdução | 24 1.5. O gene PRELP [(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)] Em humanos, o gene PRELP está mapeado no cromossomo 1q32 sendo codificado por três éxons (Grover et al., 1996). Tal gene codifica a proteína prolargina que é rica em leucina e apresenta uma região amino-terminal rica em resíduos de prolina e ar ginina (Bengtsson et al., 1995; Bengtsson et al., 2002). Originalmente, foi identificada como uma abundante proteína na matriz extracelular da cartilagem de bovinos funcionando como uma molécula de ligação da membrana basal ao tecido c onjuntivo subjacente (Heinegård et al., 1986; Grover et al. 1996). Em humanos, uma das principa is características desta proteína é sua localização relativamente restrita aos teci dos cartilaginosos, onde sua ex pressão é abundante no adulto e deficiente no feto e recém-nascido (Melching e Roughley, 1990; Grover et al., 1996). Além da cartilagem, a expressão do PRELP foi encontrada em outros tecidos tais como rim, pele e tendão (Heinegard et al., 1986). A função do PRELP ainda não está totalmente elucidada e, portanto não está claro porque ele deve exibir uma distribuição restri ta ao tecido, ou porque ele não deve ser necessário na cartilagem antes do nascimento (Bengtsson et al., 2000). O gene PRELP pertence a uma família de proteínas de repetição rica em leucina (LRR – leucine-reach repeat) (Kobe e Deisenhofer, 1994), que são caracterizadas por uma série de motivos ricos em leucina adjacentes (LXXLXLXXNXL) cercados por domínios ligados a disulfeto. As LRR dos tecidos conectivos prov avelmente agem na regulação da montagem da matriz e fornecem ligações entre as principais estruturas constituintes (Iozzo, 1997; Hocking, Shinomura e McQuillan, 1998). Várias das prot eínas LRR (biglican, decorin, lumican e fibromodulin) ligam-se ao colágeno e interferem na formação de fibrila (Vogel, Paulsson e Heinegard, 1984; Bidanset et al., 1992; Hedbomm e Heinegard, 1993). A presença de 10 repetições centrais ricas em leucina coloca a PRELP na mesma sub- família das pequenas proteoglicanas ricas em leucina (SLRPs – small LRR proteoglycans ) – decorin, biglican, fibromodulin, lumican e kerato can (Iozzo e Murdoch, 1996; Hocking et al., Introdução | 25 1998). O envolvimento dos membros desta família na fibrilogênese do colágeno, crescimento celular, diferenciação e migração revelam su a importância na modelagem da matriz extracelular (Tasheva, Klocke e Conrad, 2004). A maior diferença estrutural entre os memb ros da sub-família está na região amino terminal das suas proteínas do núcleo, onde decorin e biglican são substituídas por condroitino-sulfato ou dermatan-sulfato, no entanto, o mesmo não ocorre com PRELP, fibromodulin, lumican e keratocan. É nesta região que PRELP é rica em prolina e residuos de arginina. PRELP, entretanto, é a única que tem um domínio de base amino-terminal rico em arginina e resíduos de prolina (Bengtsson et al., 1995). Estes resíduos, provavelmente, dão à região uma ampla estrutura e os grupos de resí duos de arginina na região amino-terminal, talvez sejam um sítio de ligação à heparina (Cardin e Weintraub,1989). Baseado nesta estrutura, PRELP talvez func ione como uma molécula de ligação na matriz, interagindo com outras proteínas da matr iz extracelular através dos seus LRRs e com glicosaminoglicanos através de seu domínio amino-terminal. Desde que muitas células contem sulfato de heparina na sua superfíc ie, PRELP pode ligar as células à matriz. A localização de PRELP na cartilagem e sua cap acidade de se ligar a célula corroboram com esta hipótese (Heinegard et al., 1986; Sommarin e Heinegard, 1989). 1.6. O gene SMOC2 [(SPARC related modular calcium binding 2)] O gene SMOC2 humano foi descrito, em 2002, com o nome de Smap2 (smooth muscle associated protein 2 ) associado com músculo liso e supe r expresso durante a formação da neointima em rato (Nishimoto et al., 2002). Su a estrutura foi elucidada por análise de um contig (sequências sobrepostas de DNA) (NT 007302) originária de uma seqüência do cromossomo 6. Este gene está mapeado no 6q27 e abrange cerca de 226kb. Sua região Introdução | 26 codificadora consiste de 13 éxons. Cada domínio do SMOC2 é codificado por um ou mais éxons e os limites do domínio coincidem com locais de splicing (Vannahme et al., 2003). Este gene é expresso principalmente na matriz extracelular e codifica a proteína matricelular SMOC2 que pertence à família da proteína SPARC ( secreted protein, acidic, cysteine-rich), altamente expressa durante a embriogênese e na cicatrização (Sage et al., 2003; Vannahme et al., 2003; Rocnik et al., 2006; Maier et al., 2008). Também fazem parte desta família SPARCL1 (SPARC-like1, SC1/hevin), FSTL1 (Follistatin-like 1, TSC-36), SPOCK1, SPOCK2, e SPOCK3 (Sparc/osteonectin, cwcv , and kazallike domains proteoglycan 1-3, testican1-3). Proteínas matricelulares influenciam uma variedade de funções celulares incluindo sinalização de fator de crescimento, mi gração, adesão, cicatrização, angiogenese e proliferação celular (Bornstein e Sage, 2002). SMOC2 é expresso em quase todos os tecidos, sendo mais abundante no coração, músculo liso, baço e ovário (Vannahme et al., 2003). A proteína SMOC2 promove a montagem da matriz e pode estimular a prolif eração e a migração de cé lulas endoteliais, bem como atividade de angiogênese. Estes efeitos biológicos resultam de interações entre fatores matricelulares e de crescimento, integrinas e/ou outras proteínas da matriz extracelular (Sage et al., 2003; Rocnik et al., 2006). Estudos in vitro mostram que SMOC2 interage com integrinas αvβ1 e αvβ6 (Maier et al., 2008) e mantém a integrina ligada a quinase (ILK – integrin linked kinase) ativa durante a fase G1 do ciclo celular, contribuindo para a progressão do mesmo. Consistente com o papel para SMOC2 no controle do crescimento, ativação de ILK e expressão de ciclina D1 são dependentes de SMOC2 (Liu et al., 2008). Estudos de pe rfil de SNP (single-nucleotide polymorphism) tem identificado polimorfismos para o SMOC2 ligados a função pulmonar indicando um possível papel pa ra este gene no cresciment o normal e desenvolvimento (Wilk et al., 2007). Introdução | 27 Estes dados sugerem que SMOC2 pode mediar a interação entre integrinas e a matriz extracelular e contribuir para sinalização do se u efetor intracelular, ILK. Outros ensaios mostram que SMOC2 media os efeitos mitogênicos e angiogênicos de VEGF ( vascular endothelial growth factor) , PDGF ( platelet-derived growth factor) e FGF ( fibroblast growth factor), sugerindo assim que SMOC2 pode mediar interações entre estes fatores de crescimento e seus receptores, ou agir em paralelo, via sinérgica (Rocnik et al.,2006; Liu et al., 2008). A análise da expressão dos genes aqui aprese ntados ainda não foi realizada através da técnica de PCR em tempo real em lesões endometrióticas, bem como em endométrio eutópico de mulheres com e sem endometriose na fase pro liferativa do ciclo mens trual. A proliferação das células endometrióticas deve ocorrer para que as mesmas cresçam e se estabilizem, entretanto, não está claro se há diferenças na proliferação entre lesões endometrióticas e tecido eutópico (Wingfield et al., 1995; Jurg ensen et al., 1996; Nisolle, Casanas-Roux e Donnez, 1997). Estudos comparativos da expressão gênica entre o endométrio de mulheres sem endometriose (controle) e o endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose são importantes para identificar se o aument o da expressão gênica já está presente no endométrio dessas mulheres ou se essa expressã o só é alterada quando este tecido cai na cavidade peritoneal e adquiri um potencial para se transformar em lesões endometrióticas. 2 - OBJETIVO Objetivo | 29 O objetivo deste trabalho foi analisar a expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 em endométrio de mulheres sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual e compará- la a expressão gênica no endomét rio eutópico e nas lesões de mulheres com endometriose na mesma fase do ciclo menstrual. 3 - CASUÍSTICA, MATERIAL E MÉTODOS Casuística, Material e Métodos | 31 3.1. Aspectos Éticos do Projeto Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital das Clínicas da FMRP-USP, processo HCRP n o 2204/2010 e processo HCRP n o 9699/2006 (banco de tecidos de endometr iose). Todas as pacientes assi naram o termo de consentimento livre e esclarecido. As amostras de endométrio foram armazenadas em freezer a -80 0C após tratamento com criopreservador Tissue-Teck® O.C.T. Compound (Sakura Finetek USA. Inc., Torrance, CA). 3.2. CASUÍSTICA Neste estudo descritivo comparativo entre pa cientes com e sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual, foram avaliada s amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio eutópico e lesões endo metrióticas peritoneais e 10 de endométrio eutópico e endometrioma ovariano de mulh eres com idade entr e 18 e 40 anos, não menopausadas, sem uso de qualquer terapia horm onal há pelo menos seis meses antes da coleta, atendidas por infertilidade e/ou dor pé lvica nos ambulatórios de dor pélvica crônica (AGDP) e Infertilidade Conjugal (AEST) do Hospita l das Clínicas de Ribeirão Preto - USP, submetidas à laparoscopia com diagnóstico lapa roscópico e histológico de endometriose. O estadio da endometriose foi determinado de acordo com a classificação da American Society for Reproductive Medicine (American Society for Reproduc tive Medicine, 1997). Durante a laparoscopia foram colhidas biópsias de endomét rio eutópico através de Cureta de Novak e amostras de lesões endometrióticas peritoniais e ovarianas. O grupo controle foi formado por 16 amostr as de endométrio de mulheres sem endometriose, padronizadas de acordo com a fase do ciclo menstrual em fase proliferativa, confirmado por critérios de data ção histológica. Es te grupo foi composto por pacientes com idade entre 18 e 40 anos, no menacme, que foram submetidas à laparoscopia para laqueadura Casuística, Material e Métodos | 32 tubária pelo serviço de Endoscopia Ginecológica, com confirmação laparoscópica da ausência de lesões endometrióticas, que estavam sem uso de medicação hormonal há pelo menos seis meses antes da coleta. A biópsia endometrial foi colhida através de Cureta de Novak, durante o procedimento cirúrgico. 3.3. AMOSTRAS As biópsias de endométrio eutópico e ect ópico das pacientes com diagnóstico de endometriose foram coletadas por laparoscopia. Das 20 biópsias de endométrio ectópico 10 eram lesões peritoniais (seis vermelhas, quatro negras), sendo três em estádio I, quatro em estádio II, duas em estádio III e uma em estádio IV e 10 corresponderam a endometrioma ovariano quatro em estádio III e seis em estádio IV. 3.4. EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL As amostras foram lavadas em solução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na2HPO4 1,11g/L; Na2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH2PO4 0,20g/L pH7,0) para retirar o cr iopreservador dos tecidos. Em seguida, o RNA total (50mg de tecido) foi extraído com TRIZOL ® Reagent ( Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de RNA total foram medidas em espectrofo tômetro a densidade óptica de 260nm. O RNA permanece armazenado à -800C para procedimentos posteriores. 3.5. SÍNTESE DO CDNA Um micrograma de RNA total de cada amostr a foi transcrito reversamente usando o High Capacity cDNA Archive Kit (A pplied Biosystems, Warrington, UK) segundo as instruções do fabricante. Casuística, Material e Métodos | 33 3.6. QUANTIFICAÇÃO POR PCR EM TEMPOS REAL As sondas e os primers para os genes ID2 (Hs00747379_m1), PRELP (Hs00160431_m1), SMOC2 (Hs00405777_m1) e para os genes de re ferência da reação GAPDH (glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase) (Hs99999905_ml) e ACTB (actin, beta) (Hs99999903_ml) foram obtidos usando Assay-on-Demand™ Gene Expression Products (Applied Biosystems, Warrington, UK) , e as quantificações foram realizadas no aparelho ABI PRISMTM 7500FAST Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Warrington, UK ). O nível de expressão relativo para os genes an alisados foi calculado para cada amostra de acordo com o método de 2 -∆∆CT (ou 2-Ct), descrito previamente no Applied Biosystems User Bulletin # 2 (PN 4303859) ( Applied Biosystems, Warrington, UK ). Um pool de cDNA das amostras controles foi utilizado como calibrador nas análises. A PCR em tempo real foi realizada para cada amostra em duplicata seguindo as seguintes condições: 10 µL do TaqMan® Universal PCR Master Mix (2x) ( Applied Biosystems, Warrington, UK), 1 µL do TaqMan® Gene Expression Assay Mix (20X) (Applied Biosystems, Warrington, UK ) e 9 µL de cDNA diluído em volume final de 20µL reação. As condições da reação foram 50ºC por 2 minutos, então 95ºC por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. 3.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS As análises estatísticas foram realizadas no software SAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc ., Cary, NC, USA). Aplicamos o Test e Welch’s ANOVA não pareado para comparar: [1] endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio eutópico de mulheres com endometriose; [2] estádios das le sões de mulheres com endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual. Teste T pareado para comparar as médias de expressão dos genes obtidas entre: [3] endométrio eutópico e ectópico de 10 mulheres com endometriose Casuística, Material e Métodos | 34 peritoneal na fase proliferativa do ciclo me nstrual e 10 mulheres com endometriose ovariana na mesma fase do ciclo menstrua l; [4] endométrio eutópico de mulheres com endometriose e endométrio ectópico de mulheres com endometr iose (lesão peritoneal + endometrioma ovariano). Todos os testes foram realizados conforme os procedimentos GLM. Além disso, foram feitas análises de correlação de Spear man pelo PROC CORR entre os níveis de expressão gênica obtidos entre os três genes ( ID2, PRELP e SMOC2). Análises com P < 0,05 foram consideradas significativas. 4 - RESULTADOS Resultados | 36 A variável expressão gênica foi transformada pelo log 10. A transformação logarítmica foi necessária, pois não foi atendida uma das suposições (linearidade) feitas em análises empregando-se os modelos lineares. Estas anális es especificam que a média condicional E(y | x = x0 ) da variável resposta y dado o valor x 0 do vetor preditor x, é linear em x 0. A aplicação dos modelos lineares pode ser estendida supon do-se que uma transformação apropriada da variável resposta dada por t(y), em que E{t(y) | x}, sejam linear em x, na função t(y) = β0 + βT x + ε, para β0 e βT desconhecidos. O termo ε (erro aleatório) é independente de x e tem média zero (Cook e Weisberg, 1994). Não houve diferença significativa entre a expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 no endométrio de mulheres sem endometriose qu ando comparado ao endométrio de mulheres com endometriose (Figura 1). ID2 C EU 0 1 2 32-Ct Peritoneal + Ovariana *P=0,8824 X PRELP C EU 0 20 40 60 802-Ct Peritoneal + Ovariana *P=0,6607 X SMOC2 C EU 0 5 10 15 202-Ct Peritoneal + Ovariana *P=0,7956 X Figura 1 – Análise da expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 entre endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio eu tópico de mulheres com endometriose, sem diferença significativa pa ra P <0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. C= endométrio de mulheres sem endometriose; EU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Nas amostras não-pareadas analisadas foi encontrada diferença significativa (P<0,05) para o gene ID2 na comparação entre estadio I + II (fas e inicial) x estadi o III + IV (fase avançada) (Gráfico 1). Resultados | 37 ID2 Inicial Av anç ad a 0 10 20 30 40 50 *P=0,0324 2-Ct X Gráfico 1 – Análise da expressão do gene ID2 entre o estadio I + II (fase inicial) x estádio III + IV (fase avançada). 2-Ct = 2-∆∆Ct - método para quantificação relativa. A análise das amostras pareadas resultou em uma maior expressão dos genes ID2 e PRELP. O gene ID2 foi mais expresso no endometrioma ovariano comparado ao endométrio eutópico de mulheres com e ndometrioma ovariano e o gene PRELP na lesão peritoneal comparada ao endométrio eutópico de mulh eres com a lesão (Figura 2). O gene SMOC2 mostrou uma maior expressão na análise entre endométrio eutópico de mulheres com endometriose e a lesão (peritoneal + endometrioma) (Gráfico 2). Não foi encontrada diferença significativa na análise de correlação dos genes PRELP e SMOC2 com estadio, sendo os valores de P= 0,8491 e 0,3345, respectivamente. A correlação entre ID2 x estadio foi significativa para P<0,05 com P=0,0491.. Resultados | 38 ID2 EU EC EU EC 0 20 40 60 *P=0,0021 XX Peritoneal Ovariana 2-Ct PRELP EU EC EU EC 0 5000 10000 15000 * P=0,0033 Ovariana Peritoneal 2-Ct XX Figura 2– Análise da expressão dos genes ID2 e PRELP entre endométrio eutópico de mulheres com endometriose e o endométrio ectópico. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - método para quantificação relativa. EU= endométrio eutó pico de mulheres com endometriose; EC= endométrio ectópico de mulheres com endometriose. SMOC2 EU EC 0 20 40 60 Peritoneal + Ovariana Peritoneal + Ovariana 2-Ct X Gráfico 2 – Análise da expressão do gene SMOC2 entre endométrio eutópico de mulheres com endometriose e o endométrio ectópico de mulheres com endometriose. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - método para quantificação relativa. EU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose; EC= endométrio ectópico de mulheres com endometriose. 5 - DISCUSSÃO Discussão | 40 A análise da expressão gênica é fundamental para a pesquisa biológica, e a detecção da expressão diferencial de gene (s) entre diferentes tipos de tecido ou entre estado normal e a doença pode levar a novas terapêuticas para o tratamento da mesma. A técnica da PCR em tempo real é considerada a metodologia padrão para a quantificação da expressão gênica, ela permite a determinação exata dos níveis de ex pressão de genes alvos em células e tecidos (Thellin et al., 1999; Gorzelniak et al., 2001; Goodsaid et al., 2003). Vários estudos moleculares têm sido realizad os para elucidar o papel dos genes na etiologia da endometriose, no entanto, nenhu m deles estudou a relação dos genes aqui apresentados com a endometriose utilizando a técnica da PCR em tempo real. Sabemos da importância desta análise, já que o compor tamento dos genes no endométrio eutópico e ectópico de mulheres com e sem endometriose pode nos ajudar a entender a base biológica desta patologia. Em um trabalho prévio do nosso grupo (Meo la et al. 2010), obser vou-se, por meio de hibridação subtrativa, que os genes ID2, PRELP e SMOC2 encontravam-se “ up-regulated” quando comparada a expressão no endométrio ectópico com eutópico de mulheres com endometriose. Até o momento, não há outros trabalhos de screening, PCR em tempo real ou polimorfismos na literatura, relacionando o gene ID2 com a endometriose. Pelch et al . (2010) induziram endometriose em camundongos e an alisaram o perfil de expressão gênica empregando a técnica de microarray. A análise foi realizada 3 e 29 dias após a indução, e observou-se que o SMOC2 foi “down-regulated” e o PRELP “up-regulated”, respectivamente nas lesões endometrióticas. Não houve diferença significativa entre a expressão dos genes estudados no endométrio de mulheres sem endometriose co m o endométrio eutópico de mulheres com endometriose, este resultado é uma evidência da influência do meio pe ritoneal na expressão dos genes estudados em mulheres com endometriose. Discussão | 41 Neste trabalho foi encontrada diferença es tatisticamente significativa para o gene ID2, que mostrou uma maior expressão na fase avançada da doença quando comparado a fase inicial e também no endometrioma ovariano qua ndo comparado ao endométrio eutópico de pacientes com endometrioma. As proteínas ID alteram componentes do ciclo celular normalmente envolvidos no mecanismo que regula sua progressão (Lasorella et al., 1996; Arnold et al., 2001). Um dos genes também envolvidos na regulação do ci clo celular é o gene do retinoblastoma (RB) que foi o primeiro supressor tumoral a ser clonado, e regula negativamente o ciclo celular através da sua habilidade de se ligar ao fator de tr anscrição E2F e reprimir a transcrição de genes necessários para a fase S do ciclo celular (Hanahan e Weinberg, 2000). Super-expressão de ID2 inativa pRb e também anula a atividade inibitória do ciclo celular das proteínas p107 e p130 relaci onadas a pRb. A habilidade do gene ID2 de abolir os efeitos de supressão de crescimento da pRb, p107 e p130 sugere uma explicação para o modelo de expressão de ID2 no início e fim da fase G1 do ciclo celular após estimulação de fatores de crescimento celular (Bar one et al., 1994; Hara et al., 1994). ID2 talvez seja necessário para inativação seqüencial de alvos distintos representados por diferentes membros da família pRb, que de outra forma contem a progressão do ciclo celular através de associações reguladas com os fatores de transcrição E2F (Lasorella; Iavarone e Israel, 1996). Goumenou et al. (2006), util izando a técnica de imunohistoquímica analisaram se há diferença de expressão da s proteínas p16, pRb e ciclina D1 em endometriomas e adenomiomas. A proteína p16 estava presente em 77% dos adenomiomas e 15% dos endometriomas, enquanto a pRb foi detectada em 28% dos endometriomas analisados e não foi detectada nos adenomiomas e a ciclina D1 nã o foi encontrada nos te cidos avaliados. Este trabalho demonstrou que p16 e pRb tem um im portante papel na regulação do crescimento celular em adenomiomas e endometriomas, respectivamente. Os nossos resultados Discussão | 42 evidenciaram uma maior expressão do gene ID2 nos endometriomas ovarianos, e, como sua superexpressão pode inibir o pa pel de supressor tumoral da pRb em células cancerosas pode ser que na endometriose eles também atuem nessa mesma via. O proto-oncogene MYC ( v-myc avian myelocytomatos is viral oncogene homolog ) codifica um fator de ligação ao DNA que pode ativar e reprimir a transcrição. Por este mecanismo, MYC regula a expressão de numerosos ge nes alvos que controlam importantes funções celulares, incluindo crescimento e pr ogressão do ciclo celul ar. Desregulação da expressão de MYC resultante de vários tipos de alte rações genéticas leva a atividade constitutiva de MYC em uma variedade de cânceres e oncogenes promotores (Dominguez- Sola et al., 2007). O gene ID2 é um alvo do gene MYC (Lasorella et al., 2000) e em linhagens celulares de neuroblastomas sua expressão é induzida por N-MYC (Raetz et al., 2003; Wang et al., 2003). ID2, como todos os outros genes alvos de N-MYC, é também um alvo para MYC e estudos futuros indicarão uma correlação entre MYC e o mRNA do ID2 em neuroblastomas primários (Vandesompele et al., 2003). Meola et al.(2010), identificaram 291 gene s com expressão alterada em lesões endometrióticas, entre eles o MYC foi encontrado como “ dow-regulated” em endométrio ectópico comparado ao eutópico de mulheres com endometriose. Eles concluíram que essa alteração pode ser responsável pela perda de homeostase nas lesões endometrióticas. Johnson et al (2005) encontraram expressão mais alta de MYC no endométrio eutópico de mulheres com endometriose quando comparada ao endo métrio de mulheres normais. Os dados relacionados à regulação e função de MYC são controversos na literatura. Embora não tenhamos analisado a expressão do gene MYC, ele pode estar envolvido na regulação do gene ID2 nas lesões endometrióticas avaliadas. Discussão | 43 Para o gene PRELP a diferença estatisticamente significativa foi encontrada no aumento da sua expressão na lesão peritoneal comparada ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose peritoneal. As pequenas proteoglicanas ricas em leuc ina (SLRPs), das quais o gene PRELP faz parte, são uma família bem conhecia de pr oteoglicanas presente em muitos tecidos conectivos. Papéis cruciais para estas macrom oléculas na montagem da matriz e modulação do crescimento celular tem sido extensivamente mostrados na literatura (Hocking; Shinomura e McQuillan, 1998; Iozzo, 1999; Kresse e Schonherr, 2001; Ameye e Young, 2002). O principal papel da matriz extracelular é se r a base estrutural dos tecidos, criando o ambiente primordial para as mudanças das células do sistema imunológico (Shimizu e Shaw, 1991; Gorski e Kupiec-Weglinski, 1995; Cowin, 2000; Pupa et al., 2002). Proteínas da matriz (colágeno, fibronectina, laminina) são responsáveis pela sinalização relacionada à proliferação (Bates; Lincz e Burns, 1995), migração (Iivanain en et al., 2003), diferenciação(Watt, 2002) ou apoptose (Hock et al., 2001) de muitos tipos de células durante o processo fisiológico e patológico (Gorski e Kupiec-Weglinski, 1995 ; Pupa et al., 2002). Isto sugere que na endometriose proteínas da matriz talvez seja m responsáveis por atrapalhar tais funções fisiológicas do endométrio como secreção (Gottschalk et al., 2000), implantação (Selam et al., 2002) e menstruação (Koks et al., 2000; Abrahamson et al., 1986). Em 2009, Castells et al. demonstraram que o gene PRELP juntamente com GFAP (glial fibrillary acidic protein), PTPRZ1 (p rotein tyrosine phosphatase, receptor-type, Z polypeptide 1), GPM6B (glycoprotein M6B) , podem prever com 100% de sensibilidade e especificidade a diferença entre glioblastoma multiforme e meningioma meningotelial.. Estudos prévios identificaram 22 microR NAs diferencialmente expressos em endométrio ectópico e eutópico de amostras pa readas de mulheres com e sem endometriose (Ohlsson Teague et al., 2009). Zh ao et al. (2011) examinaram a presença de SNPs próximos Discussão | 44 aos alvos destes miRNAs, e, dentre os 102 SNPs analisados para diferentes genes em mulheres com endometriose e controle, o SNP, rs7542469, para o gene PRELP foi encontrado no grupo controle, não sendo relacionado com a endometriose. Embora na literatura prévia o gene PRELP não esteja relacionado a endometriose, nossos resultados da análise da expressão por PCR em tempo real demonstraram uma maior expressão deste gene em lesões peritoneais. O que pode estar relaci onado a alterações no ambiente peritoneal responsáveis pela transformação do endométrio em lesão endometriótica. Nas análises estatísticas realizadas com toda s as lesões endometrióticas juntas, o gene SMOC2 foi mais expresso na lesão (endometri oma e peritoneal) qu ando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endomet riose. Este resulta do corrobora com os achados por Eyster et al. (2007), que analisaram o mode lo de expressão gênica em endométrio ectópico e eutópico de 11 pacientes para identificar possíveis famílias de genes envolvidas na endometriose. Neste screening, que utilizou a técnica de microarray, dos 717 genes analisados, o gene SMOC2, dentre outros, foi encontra do como mais expresso nas lesões endometrióticas (endometrioma e peritoneal) em relação ao endométrio eutópico. Visto que a PCR em tempo real é o padrão ouro para quantific ação de expressão gênica é possível que o SMOC2 possa estar relacionado a vias de desenvolvimento da endometriose, participando diretamente do desenvolvimento da mesma. 6 - CONCLUSÃO Conclusão | 46 Nossos resultados sugerem que a expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 sofre influência do meio peritoneal, podendo ser alterada dependendo do local da implantação (ovário ou peritôneo). O gene ID2 foi mais expresso nos endometriom as ovarianos quando comparados ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. O gene PRELP foi mais expresso na lesão peritoneal quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. O gene SMOC2 foi mais expresso na lesão (endometrioma e peritoneal) quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. A expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 no endométrio de mulheres sem endometriose é igual à expressão gênica no endométrio eutópico de mulheres com endometriose. 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PRELP INICIAL AV AN ÇADA 0 5000 10000 150002-Ct *P=0,4036 X SMOC2 INICIAL AVANÇ ADA 0 20 40 602-Ct *P=0,3064 X Apêndices | 64 Apêndice B – Análise da expressão do gene SMOC2 entre endométrio eutópico de mulheres com lesão peritoneal e a lesão peritoneal e entre o e ndométrio eutópico de mulheres com endometrioma ovariano e o endometrioma ovariano sem diferença significativa para P<0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. EU= endom étrio eutópico de mulheres com endometriose; EC= endométrio ectópico de mulheres com endometriose. SMOC2 EU EC EU EC 0 20 40 60 80 Peritoneal Ovariana 2-Ct X X *P=0,8689 *P=0,3613 Apêndices | 65 Apêndice C – Análise da expressão do gene ID2 entre endométrio eutópico de mulheres com endometriose e o endométrio ectópico de mulheres com endometriose. Sem diferença significativa para P<0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. EU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose; EC= endométrio ectópico de mulheres com endometriose. ID2 EU EC 0 10 20 30 40 Peritoneal + Ovariana Peritoneal + Ovariana 2-Ct *P=0,1698 X PRELP EU EC 0 2000 4000 6000 8000 Peritoneal + Ovariana Peritoneal + Ovariana 2-Ct *P=0,1005 X MANUSCRITO Manuscrito | 67 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DIFERENCIAL DO GENE ID2 EM ENDOMÉTRIO ECTÓPICO E EUTÓPICO DE MULHERES COM E SEM ENDOM ETRIOSE NA FASE PROLIFERATIVA DO CICLO MENSTRUAL RESUMO: Endometriose é uma doença de et iopatogenia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina principalmente no peritônio pélvico e ovários. Nosso obje tivo foi analisar a expressão do gene ID2 em endométrio de mulheres sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual e compará- la a expressão gênica em endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose na mesma fase do ciclo menstrual. Foram avaliadas amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio e lesões endometrióticas peritoneais e 10 de en dométrio eutópico e endometriomas ovarianos na fase proliferativ a do ciclo menstrual. Como controle (C) foi coletado 16 amostras de endométrio de mulheres sem endometriose, na mesma fase do ciclo menstrual. A análise da expressão foi feita através da PCR em tempo real. A análise estatística mostrou que não houve diferença na expressão gênica entre o endométrio de mulheres sem endometriose e o endométrio eutópico de mulheres com endometriose. O gene ID2 foi mais expresso no endometrioma ovariano quando comp arado ao endométrio de mulheres com a lesão e na fase avançada quando comparada a fase inicial. No ssos resultados sugerem que a expressão deste gene sofre influência do meio peritoneal. Como o gene ID2 está envolvido em algumas vias de regulação do cr escimento e manutenção de tumores, que são características comuns a endometriose, pode ser que nesta, ele atue reprimindo o gene Rb que é um supressor tumoral. Manuscrito | 68 INTRODUÇÃO Endometriose é uma doença de etiopatoge nia complexa e multifatorial, envolvendo predisposição genética, fatores ambientais, an atômicos, endócrinos e alterações imunológica. Muitas vezes é progressiva, caracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina - principalmente no peritônio pélvico e ovários, levando á processos inflamatórios, reação cicatricial e formação de aderências, associados à infertilidade e dor pélvica crônica. É uma patologia comum, de caráter benigno, estrógeno-dependente, que afeta de 10 a 15 % das mulheres em idade reprodutiva, 35 a 50% das mulheres com infertilidade, dor pélvica ou ambos (Cramer e Missmer, 2002; Giudice e Kao, 2004). Apesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia, sua etiologia ainda não está clara e várias são as teor ias atuais para explicá-la (Ulu kus et al., 2009; Carvalho et al., 2011). A mais aceita é a teoria de Sampson ou fluxo menstrual retrógrado (1927), que aponta a presença de células endometriais viáveis no fluxo menstrual retrógra do como causador das lesões. O desenvolvimento da endometriose parece ser um fenômeno complexo, facilitado por fatores múltiplos, incluindo: quantidade e qualidade de células endometriais no fluído peritoneal, atividade inflamatória, expressão aumentada de moléculas de adesão, angiogênese, apoptose reduzida, escape do sistema imunológico e aumento da proliferação celular (Lima et al., 2006; Ulukus et al., 2006). A genética da e ndometriose é complexa, no entanto, acredita- se que ela é herdada de um modo poligênico/multif atorial e há predisposição familial para o seu desenvolvimento. Estudos moleculares tem focado esforços consideráveis na expressão, regulação e herança de genes na endometriose. Um grande número de genes candidatos tem sido avaliado para sua associação com endometriose, como os genes envolvidos na inflamação, síntese de esteróide, desintoxicação, receptores de hormônios, metabolismo de estrógeno, fatores de Manuscrito | 69 crescimento, moléculas de adesão, apoptose, re gulação do ciclo celular, oncogenes e sistemas metabólicos (Hansen e Eyster, 2010). Vários trabalhos tem focado nas difere nças da expressão gênica entre lesão endometriótica e endométrio eutópico. Há ta mbém diferenças conhecidas em expressão gênica no endométrio eutópico de mulheres com endometriose comparada com endométrio controle de mulheres se m a doença (Burney et al., 2007). Não é conhecido, entretanto, se a expressão gênica alterada no endométrio eutó pico é devido a alguma diferença inerente a expressão gênica entre pacientes e controles, ou alternativamente, se a existência de lesões endometrióticas gera um ambiente peritoneal alterado que age no endométrio eutópico e então resulta em expressão gênica aberrante (Pelch et al., 2010). Assim estudos comparativos entre o endométrio de mulheres sem endometriose (controle) e o endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose podem esclare cer alterações precoces e necessárias ao desenvolvimento da doença. O gene ID2 (inhibitor of DNA binding 2, do minant negative helix-loop-helix protein) está mapeado na região 2p25 (Mathew et al., 1995) e altera os componentes do ciclo celular normalmente envolvidos nos mecanismos que regulam sua progressão, e sua superexpressão parece tornar células cancer osas imunes aos efeito s de inibição do crescimento de várias proteína s supressoras de tumor (Lasore lla, Iavarone e Israel, 1996). A proteínas ID2 pertence a uma classe de fatore s de transcrição conhecida como proteínas HLH (hélice-alça-hélice) que são uma grande família de proteínas, principalmente ativadores transcricionais, que compartilham um motivo de ligação comum, composto de uma região de amino ácido básico e uma região hélice-alça-hé lice (bHLH) (Benezra et al., 1990; Norton et al., 1998). A expressão de proteínas ID é anormal em muitos tumores, em alguns sua expressão está associada com prognóstico clínico ruim como no câ ncer de ovário, cervical, de próstata e no Manuscrito | 70 câncer de mama (Schindl et al., 2001, Maw et al., 2008). As proteínas ID tem sido implicadas em diferentes passos na tumorigenese, diferenciação e metástase (Benez ra, Rafii e Lyden, 2001; Hasskarl e Munger, 2002; Sikder et al., 2004) e pode ser considerada um oncogene (Manthey et al., 2010) A endometriose ex ibe alguns aspectos de malign idade tais como aumento de crescimento, vascularização e invasão tecidual, mas, características tumorais como expansão monoclonal e anomalias genéticas, permanecem indefinidas (Vigan ò et al., 2006). Visto as similaridades entre endometriose e câncer, m udança na expressão de genes associados com adesão celular, glicolisação de proteínas, invasão celular e angiogênese talvez estejam envolvidos na patologia da endometriose como eles estão no câncer (Eyster et al., 2007). Nosso objetivo foi analisar a expr essão do gene ID2 em endométrio de mulheres sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual e compará-la a expressão gênica em endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose na mesma fase do ciclo menstrual.

E MÉTODOS Este trabalho foi realizado no Laborat ório de Biologia da Reprodução do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universi dade de São Paulo (HCFMRP-USP) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do mesmo hospital (n o 2204/2010) e processo HCRP n o 9699/2006 (banco de tecidos de endometriose) . Todas as pacientes as sinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. AMOSTRAS Foram coletadas amostras de endométrio e lesão endometriótica de 20 pacientes com idade entre 18 e 40 anos, não menopausadas, na fase proliferativa do ciclo menstrual, sem uso de qualquer terapia hormonal há pelo menos seis meses antes da coleta, atendidas por Manuscrito | 71 infertilidade e/ou dor pélvica no s ambulatórios de dor pélvica cr ônica (AGDP) e Infertilidade Conjugal (AEST) do HCFMRP submetidas à la paroscopia com diagnóstico laparoscópico e histológico de endometriose. As biópsias de endométrio e amostr as de lesões endometrióticas peritoneais e ovarianas foram colhidas durante a laparoscopia através de Cureta de Novak. Foram avaliadas amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio de mulheres com lesão peritoneal e lesões endomet rióticas peritoneais e 10 de endométrio de mulheres com endometrioma e lesões endometri óticas ovarianas. O esta dio da endometriose foi determinado de acordo com a classificação da American Society for Reproductive Medicine (American Society for Reproductive Medicine, 1997). Das 20 biópsias de endométrio ectópico 10 eram lesões peritoniais (s eis vermelhas, quatro negras), sendo três em estádio I, quatro em estádio II, duas em estádio III e uma em estádio IV e 10 corresponderam a lesões ovarianas (endometrioma ovariano) quatro em estádio III e seis em estádio IV. Como controle foi coletado 16 amostras de endométrio de mulheres sem endometriose, padronizadas de acordo com a fase do ciclo menstrual em fase proliferativa, confirmado por critérios de datação histológica. Este grupo foi composto por pacientes com idade entre 18 e 40 anos, no menacme, que foram submetidas à laparoscopia para laqueadura tubária pelo serviço de Endoscopia Ginecológica, com confirmação laparoscópica da ausência de lesões endometrióticas, que estavam sem uso de medicação hormonal há pelo menos seis meses antes da coleta. A biópsia endometrial foi colhida através de Cureta de Novak, durante o procedimento cirúrgico. EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL As amostras foram lavadas em so lução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na 2HPO4 1,11g/L; Na 2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH 2PO4 0,20g/L pH7,0) para retirar o criopreservador dos tecidos. Em seguida, o RNA total (50mg de tecido) foi extraído com TRIZOL ® Reagent (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) de acordo com as instruções do fabricante. As Manuscrito | 72 concentrações de RNA total foram medidas em espectrofotômetro a densidade óptica de 260nm. O RNA permanece armazenado à -800C para procedimentos posteriores. SÍNTESE DO CDNA Um micrograma de RNA total de cada amos tra foi transcrito reversamente usando o High Capacity cDNA Archive Kit (A pplied Biosystems, Warrington, UK) segundo as instruções do fabricante. Q UANTIFICAÇÃO POR PCR EM TEMPOS REAL As sondas e os primers para o gene ID2 (Hs00747379_m1) e para os genes de referência da reação GAPDH (glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase) (Hs99999905_ml) e ACTB ( actin, beta ) (Hs99999903_ml) foram obtidos usando Assay-on-Demand™ Gene Expression Products (Applied Biosystems, Warrington, UK) , e as quantificações foram realizadas no aparelho ABI PRISM TM 7500FAST Sequence Detection Systems ( Applied Biosystems, Warrington, UK ). O nível de expressão relativo foi calculado para cada amostra de acordo com o método de 2 -∆∆CT (ou 2-Ct), descrito previamente no Applied Biosystems User Bulletin # 2 (PN 4303859) ( Applied Biosystems, Warrington, UK ). Um pool de cDNA das amostras controles foi utilizado como calibrador nas análises. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS As análises estatísticas foram realizadas no software SAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc ., Cary, NC, USA). Aplicamos o Test e Welch’s ANOVA não pareado para comparar: [1] endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio de mulheres com endometriose; [2] estádios das lesões de mulher es com endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual. Teste T pareado para comparar as médias de expressão dos genes obtidas Manuscrito | 73 entre: [3] endométrio eutópico e ectópico de 10 mulheres com endometriose peritoneal na fase proliferativa do ciclo menstrual e 10 mulheres com endometriose ovariana na mesma fase do ciclo menstrual; [4] endométrio eutópico de mulheres com endometriose e endométrio ectópico de mulheres com endometriose (lesão peritoneal + endometrioma ovariano). RESULTADOS A expressão do gene ID2 no endométrio de mulheres sem endometriose é igual a expressão no endométrio eutópico de mulheres com endometriose (Figura 1). ID2 C EU 0 1 2 32-Ct Peritoneal + Ovariana X Figura 1 – Análise da expressão do gene ID2 entre endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio eutópico de mulheres com endo metriose, sem diferença significativa para P <0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. C= endomét rio de mulheres sem endometriose; EU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Nas amostras analisadas o gene ID2 foi mais expresso na fase avançada (estadio III + IV) quando comparada a inicial (estadio I + II) e no endometrioma ovariano quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com a lesão para P<0,05 (Figuras 2 e 3). Manuscrito | 74 ID2 Inicial Avanç ad a 0 10 20 30 40 50 *P=0,0324 2-Ct X Figura 2 – Análise da expressão do gene ID2 entre o estadio I + II (fase inicial) x estádio III + IV (fase avançada). 2-Ct = 2-∆∆Ct - método para quantificação relativa. ID2 EU EC EU EC 0 20 40 60 *P=0,0021 XX Peritoneal Ovariana 2-Ct Figura 3 – Análise da expressão do gene ID2 entre endométrio eutópico de mulheres com endometrioma ovariano e o endome trioma ovariano.. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - método para quantificação relativa. EU= endométrio eutó pico de mulheres com endometriose; EC= endométrio ectópico de mulheres com endometriose. Manuscrito | 75 DISCUSSÃO Vários estudos moleculares têm sido realizad os para elucidar o papel dos genes na etiologia da endometriose, no entanto, nenhum deles estudou a relação do gene ID2 com a endometriose utilizando a técn ica da PCR em tempo real. Sabemos da importância desta análise, já que o comportamento dos genes no endométrio eutópico e ec tópico de mulheres com e sem endometriose pode nos ajudar a entender a base biológica desta patologia. Não houve diferença significativa entre a expressão do gene ID2 no endométrio de mulheres sem endometriose com o endométrio de mulheres com endometriose, este resultado é uma evidência da influência do meio peritoneal na expressão deste gene. Em um trabalho prévio do nosso grupo que comparou endométrio eutópico com ectópico de mulheres com endometriose utilizan do a técnica de hibridação subtrativa (Meola et al., 2010) este gene foi encontrado como “up-regulated”. As proteínas ID alteram componentes do ciclo celular normalmente envolvidos no mecanismo que regula sua progressão (Lasorella et al., 1996; Arnold et al., 2001). Um dos genes também envolvidos na regulação do ci clo celular é o gene do retinoblastoma ( RB), um supressor tumoral que regula negativamente o ci clo celular através da sua habilidade de se ligar ao fator de transcrição E2F e reprimir a transcrição de genes necessários para a fase S do ciclo celular (Hanahan e Wei nberg, 2000). Super-expressão de ID2 inativa pRb e também anula a atividade inibitória do ciclo celular das p107 e p130 relacionadas a pRb (Barone et al., 1994). Goumenou et al. (2006), utilizando a técni ca de imunohistoquímica analisaram se há diferença de expressão da s proteínas p16, pRb e ciclina D1 em endometriomas e adenomiomas. Demonstraram que p16 e pRb te m um importante papel na regulação do crescimento celular em adenomiomas e e ndometriomas, respectivamente. Os nossos Manuscrito | 76 resultados evidenciaram uma maior expressão do gene ID2 nos endometriomas, e, como sua superexpressão pode inibir o pa pel de supressor tumoral do pR b em células cancerosas pode ser que na endometriose eles também atuem nessa mesma via. O protooncogene MYC ( v-myc avian myelocytomatos is viral oncogene homolog ) codifica um fator de ligação ao DNA que pode ativar e reprimir a transcrição. Por este mecanismo, MYC regula a expressão de numerosos ge nes alvos que controlam importantes funções celulares, incluindo crescimento e progressão do ciclo celular. O gene ID2 é um alvo do gene MYC (Lasorella et al., 2000), em linhagens celulares de neuroblastomas a expressão de ID2 é induzida por N-MYC (Wang et al., 2003). Meola et al.(2010), usando a técnica de bib lioteca subtrativa identificaram 291 genes desregulados em lesões endometrióticas, entre eles o gene MYC foi encontrado como “ dow- regulated” em endométrio ectópico comparado ao eu tópico de mulheres com endometriose. Eles concluíram que essa desregulação pode se r responsável pela perda de homeostase nas lesões endometrióticas. Johnson et al (2005) encontraram expressão mais alta de MYC no endométrio eutópico de mulher es com endometriose quando comparado ao endométrio de mulheres normais. Os dados relacionados à regulação e função de MYC são controversos na literatura. Embora não tenhamos analisado a expressão do gene MYC, ele pode estar envolvido na regulação do gene ID2 nas lesões endometrióticas avaliadas. Este gene pode sofrer influência do meio peritoneal. O gene ID2 está envolvido em algumas vias de regulação do cr escimento e manutenção de tumores, que são características comuns a endometriose. Na endometriose pode ser que ele atue reprimindo o gene Rb que é um supressor tumoral. A busca incessante por mecanismos relacionados à expressão de genes presentes em comportamentos biológicos envolv idos com a etiopatoge nia da doença, poderá futuramente indicar marcadores moleculares, permitindo um diagnóstico menos invasivo e com possíveis aplicações terapêuticas. Manuscrito | 77 AGRADECIMENTOS Os autores agradecem as pacientes pela participação neste estudo; a equipe multidisciplinar do Grupo de Reprodução Huma na do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP, pela coleta das amostras; e ao Laboratório de Oncologia Pediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura da FMRP-USP pelo suporte técnico. BIBLIOGRAFIA ARNOLD, J. M., MOK, S. C., PURDLE, D., CHENEVIX-TRENCH, G. Decreased expression of the ID3 gene at 1p36.1 in ovarian adenocarcinomas. Br. J. Cancer, 84:352–59, 2001. BARONE, M. V., PEPPERKOK, R ., PEVERALI, F. A., PHILIPSON, L. 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Nosso objetivo foi analisar a expressão dos genes PRELP e SMOC2 em endométrio de mulheres sem e ndometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual e compará-los a expressão gênica em endométr io eutópico e ectópico de mulheres com endometriose na mesma fase do ciclo menstrual. F oram avaliadas amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio e lesões endometrióticas peritoneais e 10 de endométrio eutópico e lesões endometr ióticas ovarianas na fase proliferativa do ciclo menstrual. Como controle (C) foi coleta do 16 amostras de endométrio de mulheres sem endometriose, na mesma fase do ciclo menstrual. A análise da expressão foi feita através da PCR em tempo real. Nas análises realizadas com todas as lesões endometrióticas juntas o SMOC2 foi mais expresso na lesão (peritônio e ovário) quando comparado ao endométrio de mulheres com e ndometriose. Já quando a análise foi realizada separando-se as lesões, o gene PRELP foi mais expresso na lesão peritoneal. Não houve diferença significativa na expressão dos genes PRELP e SMOC2 entre o endométrio de mulheres sem endometriose e o endométrio de mulheres com endometriose, e também quando se analisou os estádios da endometriose. Acredita-se que o ambiente peritoneal possa influenciar na expressão dest es genes na endometriose. É possível que a desregulação dos genes estudados permita o desenvolvimento e manutenção do tecido ectópico, pois estes genes participam de forma direta ou indireta em processos celulares relacionados à arquitetura do citoesqueleto, e que alterações na homeost ase celular podem levar a características de migração celular, angiogênese e invasão inapropriadas. Manuscrito | 81 INTRODUÇÃO Endometriose é uma doença benigna, estróge no-dependente associada com dor pélvica e infertilidade e é caracterizada pela distribuição ectópica de tecido endometrial, principalmente no peritôneo pélvico e ovário (Eskenazi e Warner, 1997). Ela afeta de 10 a 15 % das mulheres em idade reprodutiva e, 35 a 50% das mulheres com infertilidade, dor pélvica ou ambos (Cramer e Missmer, 2002; Giudice e Kao, 2004). Acredita-se primariamente que a endometriose ocorra devido à menstruação retrógada e implante de células endometriais na cav idade abdominal (Sampson, 1927). Entretanto, algumas características moleculares parecem fa vorecer o início e progr essão da implantação ectópica e talvez explique porque somente algum as mulheres desenvolvem a doença (Viganò et al., 2006). Na última década, vários estudos de perfil de expressão gência tem demonstrado que muitos genes são desregulados na e ndometriose (Guo, 2009). A identificação de diferenças molecular no endométrio eutópico de mulheres com endometriose é um importante passo no entendimento da patoge nese e para o desenvolvimento de novas estrat égias para o tratamento da infertilidade e dor associada (Burney et al., 2009). A etiologia da endometriose envolve fatores que influenciam no seu estabelecimento e progressão, incluindo hormonais (Nyholt et al., 2009), imunes (Weiss et al.,2009), alterações ambientais (Guo, 2009) e predisposição genética (Juo et al., 2006) e apesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia (Uluku s et al., 2009), sua etiologia ainda não está clara e várias são as teorias atuais para explicá-la (Carvalho et al., 2011). Vários trabalhos tem focado nas difere nças da expressão gênica entre lesão endometriótica e endométrio eutópico. Há ta mbém diferenças conhecidas em expressão gênica no endométrio eutópico de mulheres com endometriose comparada com endométrio controle de mulheres se m a doença (Burney et al., 2007). Não é conhecido, entretanto, se a Manuscrito | 82 expressão gênica alterada no endométrio eutó pico é devido a alguma diferença inerente a expressão gênica entre pacientes e controles, ou alternativamente, se a existência de lesões endometrióticas gera um ambiente peritoneal alterado que age no endométrio eutópico e então resulta em expressão gênica aberrante (Pelch et al., 2010). Assim estudos comparativos entre o endométrio de mulheres sem endometriose (controle) e o endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose podem esclare cer alterações precoces e necessárias ao desenvolvimento da doença. A busca incessante por mecanismos relacionados à expressão de genes presentes em comportamentos biológicos envolvidos com a etiopatogenia da doença, poderá futuramente indicar marcadores moleculares, permitindo um diagnóstico menos invasivo e com possíveis aplicações terapêuticas. Em humanos, o gene PRELP[(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)] está mapeado no cromossomo 1q32 sendo codi ficado por três éxons (Grover et al., 1996). Tal gene codifica a proteína prol argina que é rica em leucina e apresenta uma região amino- terminal rica em resíduos de prolin a e arginina (Bengtsson et al., 2002). Uma das principais características desta proteína é sua localização relativamen te restrita aos tecidos cartilaginosos, onde sua expressão é abundante no adulto e deficiente no feto e recém-nascido (Melching e Roughley, 1990; Grover et al., 1996). Além da cartilagem, o gene PRELP foi encontrado expresso em outros tecidos tais como rim, pele e tendão (Heinegard et al., 1986). Este gene pertence a uma família de proteínas de repetição rica em leucina (LRR) (Kobe e Deisenhofer, 1994). As LRR dos teci dos conectivos provavelmente agem na regulação da montagem da matriz e fornecem ligações entre as principais estruturas constituintes (Iozzo, 1997; Ho cking, Shinomura e McQuilla n, 1998). A presença de 10 repetições centrais ricas em leucina coloca o PRELP na mesma sub-família das pequenas proteoglicanas ricas em leucina (SLRPs) – decorin, biglican, fibromodulin, lumican e Manuscrito | 83 keratocan (Iozzo e Murdoch, 1996; Hocking et al., 1998). O envolvimento dos membros desta família na fibrilogênese do colágeno, crescime nto celular, diferenciação e migração revelam sua importância na modelagem da matriz extracelular (Tasheva, Klocke e Conrad, 2004). Baseado nesta estrutura, PRELP talvez func ione como uma molécula de ligação na matriz, interagindo com outras proteínas da matr iz extracelular através dos seus LRRs e com glicosaminoglicanos através de seu domínio amino-terminal. Desde que muitas células contem sulfato de heparina na sua superfíc ie, PRELP pode ligar as células à matriz (Heinegard et al., 1986; Sommarin e Heinegard, 1989). O gene SMOC2 [(SPARC related modular calcium binding 2)] humano foi descrito, em 2002, com o nome de Smap2 ( smooth muscle associated protein 2 ) associado com músculo liso e super expresso durante a formação da neointima em rato (Nishimoto et al., 2002). Sua estrutura foi elucidada por análise de um contig (sequências sobrepostas de DNA) (NT 007302) originária de uma seqüência do cromossomo 6. Este gene está mapeado no 6q27 e abrange cerca de 226kb. Sua região codificad ora consiste de 13 éxons. Cada domínio do SMOC2 é codificado por um ou mais éxons e os limites do domínio coincidem com locais de splicing (Vannahme et al., 2003). Este gene é expresso principalmente na matriz extracelular e codifica a proteína matricelular SMOC2 que pertence à família da proteína SPARC ( secreted protein, acidic, cysteine-rich), altamente expressa durante a embriogênese e na cicatrização SMOC2 é expresso em quase todos os tecidos, sendo mais expresso no coração, músculo liso, baço e ovário (Vannahme et al., 2003; Rocnik et al., 2006). Proteínas matricelulares influenciam uma variedade de funções celulares incluindo sinalização de fator de crescimento, mi gração, adesão, cicatrização, angiogenese e proliferação celular. A proteína SMOC2 promov e a montagem da matriz e pode estimular a Manuscrito | 84 proliferação e a migração de células endoteliais, bem como atividade de angiogênese (Sage et al., 2003; Rocnik et al., 2006). Estudos in vitro mostram que SMOC2 interage com integrinas αvβ1 e αvβ6 (Maier et al., 2008) e mantém a integrina ligada a quinase (ILK – integrin linked kinase) ativa durante a fase G1 do ciclo celular, contribuindo para a progressão do mesmo (Liu et al., 2008). Estes dados sugerem que SMOC2 pode mediar a interação entre integrinas e a matriz extracelular e contribuir para sinalização do se u efetor intracelular, ILK. Outros ensaios mostram que SMOC2 media os efeitos mitogênicos e a ngiogênicos de VEGF, PDGF e FGF, sugerindo assim que SMOC2 pode mediar interações entre estes fatores de crescimento e seus receptores, ou agir em paralelo, via sinérgica (Rocnik et al.,2006; Liu et al., 2008). A análise da expressão dos genes estudados ainda não foi realizada através da técnica de PCR em tempo real em lesões endometriót icas, bem como em endométrio eutópico de mulheres com e sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual. A proliferação das células endometrióticas deve ocorrer para que as mesmas cresçam e se estabilizem, entretanto, não está claro se há diferenças na proliferação entre lesões endometrióticas e tecido eutópico (Wingfield et al., 1995; Nisolle, Casanas-Roux e Donnez, 1997). O objetivo deste trabalho foi analisar a expressão dos genes PRELP e SMOC2 em endométrio de mulheres sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual e compará-la a expressão gênica em endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometrio se na mesma fase do ciclo menstrual.

E MÉTODOS Este trabalho foi realizado no Laborat ório de Biologia da Reprodução do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Manuscrito | 85 Medicina de Ribeirão Preto da Universi dade de São Paulo (HCFMRP-USP) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do mesmo hospital (n o 2204/2010) e processo HCRP n o 9699/2006 (banco de tecidos de endometriose) . Todas as pacientes as sinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. AMOSTRAS Foram coletadas amostras de endométrio e lesão endometriótica de 20 pacientes com idade entre 18 e 40 anos, não menopausadas, na fase proliferativa do ciclo menstrual, sem uso de qualquer terapia hormonal há pelo menos seis meses antes da coleta, atendidas por infertilidade e/ou dor pélvica no s ambulatórios de dor pélvica cr ônica (AGDP) e Infertilidade Conjugal (AEST) do HCFMRP submetidas à la paroscopia com diagnóstico laparoscópico e histológico de endometriose. As biópsias de endométrio e amostr as de lesões endometrióticas peritoneais e ovarianas foram colhidas durante a laparoscopia através de Cureta de Novak. Foram avaliadas amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio de mulheres com lesão peritoneal e lesões endomet rióticas peritoneais e 10 de endométrio de mulheres com endometrioma e lesões endometri óticas ovarianas. O esta dio da endometriose foi determinado de acordo com a classificação da American Society for Reproductive Medicine (American Society for Reproductive Medicine, 1997). Das 20 biópsias de endométrio ectópico 10 eram lesões peritoniais (s eis vermelhas, quatro negras), sendo três em estádio I, quatro em estádio II, duas em estádio III e uma em estádio IV e 10 corresponderam a lesões ovarianas (endometrioma ovariano) quatro em estádio III e seis em estádio IV. Como controle foi coletado 16 amostr as de endométrio de mulheres sem endometriose, padronizadas de acordo com a fase do ciclo menstrual em fase proliferativa, confirmado por critérios de data ção histológica. Es te grupo foi composto por pacientes com idade entre 18 e 40 anos, no menacme, que foram submetidas à laparoscopia para laqueadura tubária pelo serviço de Endoscopia Ginecológica, com confirmação laparoscópica da ausência Manuscrito | 86 de lesões endometrióticas, que estavam sem uso de medicação hormonal há pelo menos seis meses antes da coleta. A biópsia endometrial foi colhida através de Cureta de Novak, durante o procedimento cirúrgico. EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL As amostras foram lavadas em so lução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na 2HPO4 1,11g/L; Na 2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH 2PO4 0,20g/L pH7,0) para retirar o criopreservador dos tecidos. Em seguida, o RNA total (50mg de tecido) foi extraído com TRIZOL ® Reagent (Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de RNA total foram medidas em espectrofotômetro a densidade óptica de 260nm. O RNA permanece armazenado à -800C para procedimentos posteriores. SÍNTESE DO CDNA Um micrograma de RNA total de cada amos tra foi transcrito reversamente usando o High Capacity cDNA Archive Kit (A pplied Biosystems, Warrington, UK) segundo as instruções do fabricante. Q UANTIFICAÇÃO POR PCR EM TEMPOS REAL As sondas e os primers para os genes PRELP (Hs00160431_m1), SMOC2 (Hs00405777_m1) e para os genes de referência da reação GAPDH (g lyceraldehyde- 3phosphate dehydrogenase) (Hs99999905_ml) e ACTB (actin, beta) (Hs99999903_ml) foram obtidos usando Assay-on-Demand™ Gene Expression Products (Applied Biosystems, Warrington, UK), e as quantificações foram realizadas no aparelho ABI PRISMTM 7500FAST Sequence Detection Systems ( Applied Biosystems, Warrington, UK ). O nível de expressão relativo para os genes analisados foi calculado para cada amostra de acordo com o método de Manuscrito | 87 2-∆∆CT (ou 2-Ct), descrito previamente no Applied Biosystems User Bulletin # 2 (PN 4303859) (Applied Biosystems, Warrington, UK ). Um pool de cDNA das amostras controles foi utilizado como calibrador nas análises. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS As análises estatísticas foram realizadas no software SAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc ., Cary, NC, USA). Aplicamos o Test e Welch’s ANOVA não pareado para comparar: [1] endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio de mulheres com endometriose; [2] estádios das lesões de mulher es com endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual. Teste T pareado para comparar as médias de expressão dos genes obtidas entre: [3] endométrio eutópico e ectópico de 10 mulheres com endometriose peritoneal na fase proliferativa do ciclo menstrual e 10 mulheres com endometriose ovariana na mesma fase do ciclo menstrual; [4] endométrio eutópico de mulheres com endometriose e endométrio ectópico de mulheres com endo metriose (lesão peritoneal + endometrioma ovariano). Todos os testes foram realizados conforme os procedimentos GLM. RESULTADOS Não houve diferença significativa entre a expressão dos genes PRELP e SMOC2 no endométrio de mulheres sem endometriose co m o endométrio eutópico de mulheres com endometriose (Figura 1). Manuscrito | 88 PRELP C EU 0 20 40 60 802-Ct Peritoneal + Ovariana X *P=0,6607 SMOC2 C EU 0 5 10 15 202-Ct Peritoneal + Ovariana *P=0,7956 X Figura 1 – Análise da expressão dos genes PRELP e SMOC2 entre endométrio de mulheres sem endometriose com endométri o eutópico de mulheres com endometriose, sem diferença significativa para P <0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. C= endométrio de mulheres sem endometriose; EU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose. A análise das amostras pareadas resu ltou em uma maior expressão do gene PRELP na lesão peritoneal com P<0,05 comparada ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose peritoneal (Figura 2). PRELP EU EC EU EC 0 5000 10000 15000 * P=0,0033 Ovariana Peritoneal 2-Ct XX Figura 2 – Análise da expressão do gene PRELP entre endométrio eutópico de mulheres com endometriose peritoneal e o e ndométrio ectópico. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - método para quantificação relativa. EU= endométrio eutópico de mulher es com endometriose EC= endométrio ectópico de mulheres com endometriose. Manuscrito | 89 DISCUSSÃO Estudos comparativos da expressão gêni ca entre o endométrio de mulheres sem endometriose (controle) e o endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose são importantes para identificar se o aument o da expressão gênica já está presente no endométrio dessas mulheres ou se essa expressã o só é alterada quando este tecido cai na cavidade peritoneal e adquiri um potencial para se transformar em lesões endometrióticas. Não houve diferença significativa entre a expressão dos genes PRELP e SMOC2 no endométrio de mulheres sem endometriose co m o endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Este resultado é uma evidência da influência do meio pe ritoneal na expressão destes genes. O gene PRELP faz parte da família das pequenas proteoglicanas ricas em leucina e estas macromoléculas tem papéis cruciais na montagem da matriz extracelular (Hocking; Shinomura e McQuillan, 1998; Ameye e Young, 2002). Proteínas da matriz (colágeno, fibronectina, laminin) são responsáveis pela sinalização relacionada à proliferação (Bates; Lincz e Burns, 1995), migração (Iivanainen et al., 2003), diferenciação(Watt, 2002) ou apoptose (Hock et al., 2001) de muitos tipos de células duran te o processo fisiológico e patológico (Kupiec-Weglinski et al., 1993 Pupa et al., 2002). Isto sugere que na endometriose proteínas da matriz talvez seja m responsáveis por atrapalhar ta is funções fisiológicas do endométrio como secreção (Gottschalk et al ., 2000), implantação (Selam et al., 2002) e menstruação (Abrahamson et al., 1986; Koks et al., 2000). Zhao et al. (2011), examinaram a presença de SNPs próximos aos alvos de 22 miRNA, previamente estudados por Ohlsso n Teague et al (2009), dentre os 102 SNPs analisados em mulheres com endometriose e controle, o SNP para o gene PRELP (rs7542469) foi encontrado no grupo controle, não sendo rela cionado com a endometriose. Embora na Manuscrito | 90 literatura prévia o gene PRELP não esteja relacionado a endometriose, nossos resultados da análise da expressão por PCR em tempo real, demonstraram uma maior expressão deste gene em lesões peritoneais. Este resultado pode estar relacionado a alterações no ambiente peritoneal responsáveis pela transformação do endométrio em lesão endometriótica. Nas análises realizadas com todas as lesões endometrióticas juntas, o gene SMOC2 foi mais expresso na lesão (endometrioma e pe ritoneal) quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose Este resultado corrobora com os achados por Eyster e et al. (2007) que analisaram o modelo de expressão gênica em endométrio ectópico e eutópico de 11 pacientes para identificar possíveis famílias de genes envolvi das na endometriose. Neste screening, dos 717 genes analisados, o gene SMOC2, dentre outros, foi encontra do como mais expresso nas lesões endometrióticas (endometrioma e peritoneal) em relação ao endométrio eutópico. Visto que a PCR em tempo real é o padrão ouro para quantificação de expressão gênica é possível que o SMOC2 possa estar relacionado a vias de desenvolvimento da endometriose participando diretamente do desenvolvimento da mesma. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem as pacientes pela participação neste estudo; a equipe multidisciplinar do Grupo de Reprodução Huma na do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP, pelas coleta das amostras; e ao Laboratório de Oncologia Pediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura da FMRP-USP pelo suporte técnico. Manuscrito | 91 BIBLIOGRAFIA ABRAHAMSON, D. R. 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