{"paper_id":"e9035b9b-956e-4cca-ae89-9b5de4a31e61","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \nFrancielle Marques Araujo \n \n \n \n“Análise da expressão diferencial dos genes ID2, PRELP e SMOC2 \nem endométrio ectópico e eutópico de mulheres com e sem \nendometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual” \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2011\n\n \nFrancielle Marques Araujo \n \n \n \n \n \n“Análise da expressão diferencial dos genes ID2, PRELP e SMOC2 \nem endométrio ectópico e eutópico de mulheres com e sem \nendometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual”\n \n \n \n \nTese apresentada ao Departamento de Ginecologia e Obstetrícia \nda Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto como pré-requisito \npara obtenção do Título de Doutor em Biologia da Reprodução. \nÁrea de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia \n \nOrientador: Prof. Dr. Antônio Alberto Nogueira \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2011 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁIFCA \n \nAraujo, Francielle Marques. \n \nAnálise da expressão diferencial dos genes ID2, PRELP e SMOC2 em endométrio \nectópico e eutópico de mulheres com e sem endometriose na fase proliferativa do ciclo \nmenstrual / Francielle Marques Araujo; Orie ntador Prof Dr Antônio Alberto Nogueira. \nRibeirão Preto, 2011. \n \n94p. il.; 30cm \n \nTese (Doutorado – Programa de Pós-gr aduação em Biologia da Reprodução), \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. \nOrientador: Nogueira, Antônio Alberto \n \n\n \nFOLHA DE APROVAÇÃO \n \nFrancielle Marques Araujo \n \nAnálise da expressão diferencial dos genes ID2, PRELP e SMOC2 em \nendométrio ectópico e eutópico de mulheres com e sem endometriose na fase \nproliferativa do ciclo menstrual. \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto da Universi dade de São Paulo para \nobtenção do Título de Doutor. \nÁrea de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia \nAprovada em ____/____/_____  \nBanca examinadora \nProf. Dr. ___________________________________________________________________  \nInstituição___________________________ Assinatura ______________________________   \n \nProf. Dr. ___________________________________________________________________  \nInstituição___________________________ Assinatura ______________________________   \n \nProf. Dr. ___________________________________________________________________  \nInstituição___________________________ Assinatura ______________________________   \n \nProf. Dr. ___________________________________________________________________  \nInstituição___________________________ Assinatura ______________________________   \n \nProf. Dr. ___________________________________________________________________  \nInstituição___________________________ Assinatura ______________________________   \n  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Ando devagar \nPorque já tive pressa \nE levo esse sorriso \nPorque já chorei demais \nHoje me sinto mais forte, \nMais feliz, quem sabe \nSó levo a certeza \nDe que muito pouco sei, \nOu nada sei \n... \nPenso que cumprir a vida \nSeja simplesmente \nCompreender a marcha \nE ir tocando em frente \nComo um velho boiadeiro \nLevando a boiada \nEu vou tocando os dias \nPela longa estrada, eu vou \nEstrada eu sou \n... \nTodo mundo ama um dia, \nTodo mundo chora \nUm dia a gente chega \nE no outro vai embora \nCada um de nós compõe a sua história \nCada ser em si \nCarrega o dom de ser capaz \nE ser feliz \n...” \n \n(Tocando em Frente – Almir Sater) \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedico... \n à minha Mãe Maria José  \n(in memorian), \nMestre e Doutora na matéria VIDA! \n \n \n \n \n\n \nAGRADEÇO \n \nA DEUS, ‘por deixar apenas um par de pegadas na areia...’ \nAo Prof. Dr. Antônio Alberto Nogueira, pela orientação e confiança em mim acima de \ntudo. \nAos membros da banca pela disponibilidade e sugestões importantes. \nAo Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani e Dr. Júlio César Rosa e Silva pelas amostras cedidas, \natenção, sugestões e ensinamentos. \nAo Prof. Dr. Luiz Gonzaga Tone pelo suporte técnico. \nÀ Profa Dra Claudia Cristina Paro de Paz pela análise estatística e agradável convivência.  \nAos professores do Bloco C do Departamento de Genética da FMRP-USP: Profa Dra \nEster Silveira Ramos pelos ensinamentos cien tíficos, Profa Dra Lúcia Regina Martelli \npelo apoio e ao Prof. Dr. Raysildo Barbosa Lôbo pela convivência agradável. \nAo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP. \nAo Departamento de Genética da FMRP-USP. \nÀ amiga Juliana Meola pelas idéias, discussões e apoio incondicional. \nA todos os amigos, técnicos e funcionários do Departamento de Ginecologia e \nObstetrícia da FMRP-USP pelo incentivo e aj uda profissional e pessoal na realização \ndeste trabalho. \nAos amigos, técnicos e funcionários do Bloco C do Departamento de Genética da FMRP-\nUSP pelo carinho, amizade sincera e convivência sempre alegre. \nEm especial às amigas Fernanda P. Elias, Lisa ndra Cristina C. Silva, Patrícia Fonseca, por \nestarem sempre ali para me ouvir... \nÀs amigas Elda Silveira, Maralina A. Carv allho, Paula Cristina Nogueira, Paula L. \nTakeuchi, Raquel Dully, Simoni Valim pela torcida e momentos de descontração.   \nAo meu pai Vicente e aos meus irmãos Jeffe rson e Gisele, os responsáveis por cada \netapa alcançada na minha vida. A quem devo tudo que sou. Meu porto seguro. Minha força \npara continuar. Minha inspiração. Amo vocês! \nAos meus familiares que sempre torceram por mim. \n\n \nAo meu Amor, Laner, que mesmo distante sempre esteve presente com paciência, \ncompreensão, companheirismo e palavras de força. Obrigada por estar na minha vida, me \nfazendo crescer e acreditar cada vez mais em mim. \nAo Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico (CNPq) e à Fundação de \nAmparo ao Ensino, Pesquisa e Assistência do HCFMRP-USP (FAEPA) pelo apoio \nfinanceiro no desenvolvimento deste trabalho. \nA todos que participaram de uma forma ou de  outra para a realização desta pesquisa, \ncontribuindo para o meu crescimento profissional e pessoal. \n \n \n \n \n\n \nRESUMO \n \nARAUJO, F. M. Análise da expressão diferencial dos genes ID2, PRELP e SMOC2 em \nendométrio ectópico e eutópico de mulh eres com e sem endometriose na fase \nproliferativa do ciclo menstrual . 2011. 94p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina, \nUniversidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. \n \n \nEndometriose é uma doença de et iopatogenia complexa e multif atorial, caracterizada pela \npresença de tecido endometrial fora da cavidade uterina principalmente no peritônio pélvico e \novários, envolvendo predisposiçã o genética, fatores ambientais, anatômicos, endócrinos e \nalterações imunológicas. Afeta 10 a 15 % das mulheres em idad e reprodutiva e 35 a 50% das \nmulheres com infertilidade, dor pélvica ou ambos. Apesar de ser uma das doenças mais estudadas \nem ginecologia, sua etiologia ainda não está clara e várias são as teorias para explicá-la. O estudo \nde genes que regulam de alguma forma os processos envolvidos com a endometriose como o ID2 \n(proliferação celular), PRELP (matriz extracelular) e SMOC2 (angiogênese) pode ajudar a \nesclarecer o desenvolvimento da mesma. O objetivo desse trabalho foi analisar a expressão gênica \ndestes genes em amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio eutópico e \nlesões endometrióticas peritoneais e 10 de endométrio eutópi co e endometrioma ovariano com \nidade entre 18 e 40 anos e em 10 amostras  de endométrio de mulh eres sem endometriose \n(controle), padronizadas de acordo com a fase do ciclo menstrual em fase proliferativa. O estudo \nfoi realizado através de técnicas de Biologia Molecular como a Transcrição Reversa (RT-PCR) e \nanálise quantitativa da expressão gênica (PCR em tempo real). A análise estatística mostrou que \nnão houve diferença na expressão gênica entre o endométrio de mulheres sem endometriose e o \nendométrio eutópico de mulher es com endometriose. O gene ID2 foi mais expr esso na fase \navançada da endometriose quan do comparada a inicial e no endometrioma ovariano quando \ncomparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose e o PRELP na lesão peritoneal \nquando comparado ao endométrio eutópico de mulher es com endometriose. Nas análises \nrealizadas com todas as lesões endometrióticas juntas, o SMOC2 foi mais expresso na lesão \n(peritônio e ovário) quando comparado ao e ndométrio eutópico de mulheres com \nendometriose. Os resultados citados demonstram que a expressão dos genes estudados pode \nsofrer influência do meio peritoneal, podendo ser alterada dependendo do local da implantação \n(ovário ou peritôneo). \nPalavras-chaves: endometri ose, expressão gênica, ID2, PRELP, SMOC2 e PCR em tempo \nreal. \n\n \nABSTRACT \n \nARAUJO, F. M.. Differential expression analysis of ID2, PRELP  and SMOC2 genes in \nectopic and eutopic endometrium in women with and without endometriosis in the \nproliferative phase of the menstrual cycle . 2011. 94p. Tese (Doutorado) - Faculdade de \nMedicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. \n \nEndometriosis is a complex dise ase and its etiology is multifa ctorial, characterized by the \npresence of endometrial tissue outside the uterine cavity especially in the pelvic peritoneum and \novaries, involving geneti c predisposition, enviro nmental factors, anat omical, endocrine and \nimmunological changes. It affects 10 to 15% of women of re productive age and 35 to 50% of \nwomen with infertility, pelvic pain or both. Despite being one of  the most studied diseases in \ngynecology, its etiology remains unclear and there are several current theories to explain it. The \nstudy of genes that regulate the processes invo lved somehow with endometriosis as ID2 (cell \nproliferation), PRELP (extracellular matrix) and SMOC2 (angiog enesis) may help clarify its \ndevelopment. The aim of this study was to analyze the gene expression of these genes in tissue \nsamples from 20 women paired with 10 endome trial tissue and 10 per itoneal endometriotic \nlesions 10 endometrial tissue and 10 ovarian endometriotic lesions in proliferative phase of the \nmenstrual cycle. Sixteen samples of endometrium of women without endometriosis, in the same \nphase of the menstrual cycle we re collected to control (C). The study was conducted through \nmolecular biology techni ques such as reverse transcripti on (RT-PCR) and quantitative gene \nexpression analysis (real-time-time PCR). Statistical analysis showed no diffe rence in gene \nexpression between the endometrium of women without endometriosis and endometrium from \nwomen with endometriosis. Showed a greater expression of the ID2 gene in advanced stage of \nendometriosis when compared to the initial stage and ovarian endometrioma compared to eutopic \nendometrium of women with endometriosis and PRELP in peritoneal lesion compared to eutopic \nendometrium of women with endo metriosis. In the analysis pe rformed with all lesions the \nSMOC2 was expressed more in the lesions (ovarian  and peritoneal) compared to the eutopic \nendometrium of women with endometriosis. The results cited show that  the expression of the \ngenes studied may be influenced through th e peritoneal cavity, and may be modified \ndepending on the implantation site (ovary or peritoneum). \n \nKEYWORDS: endometriosis, gene expression, ID2, PRELP, SMOC2 and real-time PCR. \n \n\n \nLISTA DE GRÁFICOS \n \n \nGráfico 1 – Análise da expressão do gene ID2 entre o estadio I + II (fase inicial) x estádio \nIII + IV (fase avançada)............................................................................................................ 37 \n \nGráfico 2 – Análise da expressão do gene SMOC2 entre endométrio eutópico de mulheres \ncom endometriose e endométrio ectópico de mulheres com endometriose ............................. 38 \n \n \n\n \nLISTA DE FIGURAS \n \n \nFigura 1 – Análise da expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 entre endométrio de \nmulheres sem endometriose com endométrio eutópico de mulheres com endometriose......... 36 \n \nFigura 2 – Análise da expressão dos genes ID2 e PRELP entre endométrio eutópico e \nectópico de mulheres com endometriose.................................................................................. 38 \n \n\n \nLISTA DE ABREVIATURAS \n \n \nbHLH – basic helix-loop-helix \ncDNA – ácido desoxiribonucleico complementar \nCONEP - Comitê Nacional de Ética em Pesquisa  \nDNA - ácido deseoxiribonucleico \ndNTP - desoxinucleotideo trifosfato \nEDTA – ácido etilenodiaminotetraacético \nFGF – fibroblast growth factor \nHCFMRP- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto  \nHLH – helix-loop-helix \nID2 – inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein \nILK – integrin linked kinase \nLRR – leucine-rich repeat \nKb – kilobase \nKH\n2PO4 – fosfato de potássio monobásico \nMgcl2 – cloreto de magnésio \nNaCl – cloreto de sódio \nNa2HPO4 – fosfato de sódio monobásico \np16 – proteína p16 \np – braço curto do cromossomo \npb – pares de bases \nPBS – phosphate-buffered saline \nPDGF – platelet-derived growth factor \npRb – proteína do gene retinoblastoma \nPRELP – proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein \nPCR – do inglês Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) \nPROC FREQ – estatística de frequência \n\n \nq – braço longo do cromossomo \nRNA – ácido ribonucleico  \nrpm – rotações por minuto \nSMAP - smooth muscle associated protein 2 \nSMOC2 – SPARC related modular calcium binding 2 \nSNP – polimorfismo nucleotídico individual \nSPARC – secreted protein, acidic, cysteine-rich \nSRLP – small LRR proteoglycans \nUSP - Universidade de São Paulo \nVEGF – vascular endothelial growth factor \n \n\n \nLISTA DE SÍMBOLOS \n \n \noC – graus Celsius \ng/L – grama por litro \nµg – micrograma \nmg – miligrama \nµL – microlitro \nmL – mililitro \nM – molar \nmM – milimolar \nnm - nanomolar \n% - porcentagem \nU - unidade \n\n \nSUMÁRIO \n \n1-INTRODUÇÃO ...................................................................................................................16 \n1.1 Endometriose ..................................................................................................................17 \n1.2 Etiologia da endometriose...............................................................................................18 \n1.3 Genética e endometriose.................................................................................................19 \n1.4. O gene ID2 [(inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix \nprotein)] ................................................................................................................................22 \n1.5. O gene PRELP [(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)] ...................24 \n1.6. O gene SMOC2 [(SPARC related modular calcium binding 2)]...................................25 \n \n2 - OBJETIVO ........................................................................................................................28 \n \n3 – CASUÍSTICA, MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................30 \n3.1. Aspectos Éticos do Projeto ............................................................................................31 \n3.2. Casuística .......................................................................................................................31 \n3.3. Amostras ........................................................................................................................32 \n3.4. Extração do RNA total...................................................................................................32  \n3.5. Síntese do cDNA ...........................................................................................................32 \n3.6. Quantificação por PCR em Tempos Real ......................................................................33 \n3.7. Análise Estatística dos resultados ..................................................................................33 \n \n4 - RESULTADOS..................................................................................................................35 \n \n5 - DISCUSSÃO......................................................................................................................39 \n \n6 - CONCLUSÃO ...................................................................................................................45 \n \nBIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................47 \n \nANEXO....................................................................................................................................60 \n \nAPÊNDICES ...........................................................................................................................62 \n \nMANUSCRITO ......................................................................................................................66 \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1-INTRODUÇÃO \n \n\nIntrodução  |  17 \n1.1 Endometriose \nEndometriose é uma doença de etiopatoge nia complexa e multifatorial, envolvendo \npredisposição genética, fatores ambientais, an atômicos, endócrinos e alterações imunológica. \nMuitas vezes é progressiva, caracterizada pela  presença de tecido endometrial fora da \ncavidade uterina  - principalmente no peritônio pélvico e ovários, levando á  processos \ninflamatórios, reação cicatricial e formação de  aderências, associados à infertilidade e dor \npélvica crônica. É uma patologia comum, de caráter benigno, estrógeno-dependente, que afeta \nde 10 a 15 % das mulheres em idade reprodutiva, 35 a 50% das mulheres com infertilidade, \ndor pélvica ou ambos (Cramer e Missmer, 2002; Giudice e Kao, 2004). \nAcredita-se primariamente que a endometriose ocorra devido à menstruação retrógada \ne implante de células endometriais na cav idade abdominal (Sampson, 1927). Entretanto, \napesar da menstruação retrógada ocorrer na maioria das mulheres, a endometriose se \ndesenvolve somente em 10% delas (Eskenazi e Warner, 1997), favorecendo a hipótese de \netiopatogenia multifatorial da doença. \nÉ comum encontrarmos implantes endo metrióticos na cavidade pélvica, \nprincipalmente localizado no peritônio pélvic o e ovário. Entretanto, também podem ser \nencontrados no septo reto-vaginal, pericárdio, pleura, fígado, rim, bexiga, cérebro e raramente \nem homens (Giudice e Kao, 2004).  \nEmbora a história e exame clínicos possa m sugerir um diagnóstico presuntivo de \nendometriose o diagnóstico definitivo é cirúrgic o, através da laparoscopia ou laparotomia. \nAssim, a laparoscopia, apesar de onerosa e invasiva, é ainda o método mais confiável e o \npadrão “ouro” para o diagnóstico da doenç a. Na maioria dos casos, a endometriose é \ncirurgicamente estadiada com base na localizaç ão, extensão e tipo de lesão por laparoscopia \n(Brosens et al., 2004). A American Society for Reproductive Medicine (1997), organizou e \npropôs a classificação da endometriose em quatr o estadios: forma mínima (estádio I), leve \n\nIntrodução  |  18 \n(II), moderada (III) e severa (IV). Além de sta classificação, morfologicamente os implantes \npodem ser bastante variáveis, ter múltiplas formas e coloraçõ es, e em geral, observam-se \nlesões de cor vermelha, amarela, marrom ou  preta (American Society for Reproductive \nMedicine, 1997; Kamergorodsky et al., 2007). \n \n1.2 Etiologia da endometriose \nA etiologia da endometriose envolve fatores que influenciam no seu estabelecimento e \nprogressão, incluindo hormonais (Nyholt et al., 2009), imunes (Weiss et al.,2009), alterações \nambientais (Guo, 2009) e predisposição genética  (Juo et al., 2006) e apesar de ser uma das \ndoenças mais estudadas em ginecologia, sua et iologia ainda não está clara e várias são as \nteorias para explicá-la (Ulukus et al., 2009; Carvalho et al., 2011). \nA mais aceita é a teoria de Sampson ou fl uxo menstrual retrógrado (1927), que aponta \na presença de células endometriais viáveis no fluxo menstrual retrógrado como causador das \nlesões. No entanto, praticamente 90% das mu lheres com tubas pérvias apresentam fluxo \nmenstrual retrógrado e a maioria não apresent ará a endometriose (Halme et al., 1984). \nDescrita por Meyer, em 1919, a teoria da metapl asia celômica, sugere que o epitélio celômico \npossa se transformar, por metaplasia, em tecido tipo endométrio (Witz , 2003). E a teoria \nimunológica, que se baseia no conceito que a menstruação retrógada é um fenômeno universal \nnas mulheres e nem todas desenvolvem endo metriose. Assim, a implantação dos focos \nendometrióticos seria resultado de falha na  limpeza destas células, decorrentes de \nanormalidades na função imunológica (Viganò et al., 1991; Oosterlynck et al., 1991). Hoje se \nacredita na confluência destas teorias para a explicação da etiopat ogenia da endometriose \nperitoneal e ovariana. Haveria realmente fluxo menstrual retrógrado associado à predisposição \nimunológica no microambiente peritoneal que facili taria o implante de células endometriais \nviáveis e com potencial para implantação? \n\nIntrodução  |  19 \nEstudos sugerem que a endometriose esteja associada a um processo inflamatório \npélvico, ocasionado pelos implantes endometriais ectópicos (Lebovic et al., 2001; Lima et al., \n2006) que sofrem sangramento cíclicos (A rya e Shaw, 2005) ocasionando disfunção de \ncélulas do sistema imunológico e número au mentado de macrófagos  ativados no fluído \nperitoneal, os quais secretam vários fatores locais tais como fatores de crescimento e citocinas \n(Lima et al., 2006). \nAssim, o desenvolvimento da endometriose parece ser um fenômeno complexo, \nfacilitado por fatores múltiplos, incluindo: quan tidade e qualidade de células endometriais no \nfluído peritoneal, atividade inflamatória, e xpressão aumentada de moléculas de adesão, \nangiogênese, apoptose reduzida, escape do si stema imunológico e aumento da proliferação \ncelular (Lima et al., 2006; Ulukus et al., 2006). \n \n1.3 Genética e endometriose  \nEndometriose tem sido comparativamente similar a doenças malignas do sistema \nreprodutivo em termos de predisposição familial, possibilidade de  alcançar órgãos distantes, \nalterações genéticas identificadas em tecidos e a existência de um ambiente imunobiológico, \nangiogênico e hormonal alterado (Nezhat et  al., 2008). Alguns estudos populacionais tem \ndemonstrado que mulheres diagnosticadas  com endometriose tem um aumento \nestatisticamente sign ificante no risco de dese nvolver vários tipos de câ ncer (Brinton et al., \n1997; Olson et al., 2002; Melin et al., 2006). \nA genética da endometriose é complexa, no entanto, acredita-se que ela é herdada de \num modo poligênico/multifatorial e há predis posição familial para o seu desenvolvimento. \nEndometriose que ocorre familialmente tende a ser mais severa quando comparada a casos \nesporádicos. Isto sugere que há mais prope nsão genética em indi víduos com doença grave \n(Kennedy, 1996).  \n\nIntrodução  |  20 \nEstudos moleculares tem focado esforços consideráveis na expressão, regulação e \nherança de genes na endometriose. Um grande número de genes candidatos tem sido avaliado \npara sua associação com endometriose, como os genes envolvidos na inflamação, na síntese \nde esteróide, na desintoxicação, no metabolismo  de estrógeno, na apoptose, na regulação do \nciclo celular, além de fatores de cresciment o, moléculas de adesão, receptores de hormônios, \noncogenes e sistemas metabólicos (Hansen e Eyster, 2010). \nDentre as técnicas utilizadas para o estudo da endometriose, a tecnologia do \nmicroarray cDNA é uma poderosa ferramenta para  quantificar níveis de expressão de \ncentenas de genes simultaneamente. Com esta  técnica, pode-se comparar modelos de \nexpressão gênica entre endomét rio eutópico e ectópico da me sma paciente ou identificar \ngenes diferencialmente expressos no endomét rio entre amostras com e sem endometriose \n(Eyster et al., 2007). Na literatura, há alguns trabalhos com análise comparativa global da \nexpressão gênica de tecido endometrial de mulh eres com e sem endometriose (Matsuzaki et \nal., 2004; Wu et al., 2006; Eyst er et al., 2007; Sherwin et al ., 2008) . Estes estudos diferem \nprincipalmente na localização do tecido endome trial analisado (eutópico ou ectópico), na \nplataforma de microarray utilizada e na fa se do ciclo menstrual que  a amostra foi obtida \n(Aghajanova; Velarde e Giudice, 2010). Mettler et al. (2007), utilizaram a técnica de \nmicroarray para analisar a expressão gênica de 1176 genes em tecido endometriótico ovariano \nde 5 pacientes e compará-la ao endométrio de 5 mulheres sem endometriose na fase \nproliferativa do ciclo menstrua l. O resultado da análise de monstrou que 13 genes estavam \ndiferencialmente expressos. \nNos últimos anos, tem sido mostrado que pequenos microRNAs “ non-coding” \n(miRNAs) são importantes componentes de um a complexa rede de genes regulatórios \n(Reinhart e Bartel 2002; Aravin et al., 2007). Estudos recentes mostram que os miRNAs e \nseus alvos, os mRNAs, são diferencialmente ex pressos na endometriose e em outras doenças \n\nIntrodução  |  21 \ndo sistema reprodutor feminino (Pan et al., 2007; Burney et al., 2009; Ohlsson Teague et al., \n2009; Filigheddu et al., 2010; Ramón et al., 201 1). Sabe-se que os miRNAs controlam um \namplo espectro de funções celulares normais e patológicas, tendo um importante papel na \npatogênese destas doenças e possivelmente  possam ser usados como biomarcadores e \nferramenta terapêutica na endometriose (Ohlsso n Teague et al., 2010). Além disso, vários \ntrabalhos tem focado nas difere nças da expressão gênica entre lesão endometriótica e \nendométrio eutópico. Há também diferenças co nhecidas em expressão gênica no endométrio \neutópico de mulheres com endometriose comp arada com endométrio c ontrole de mulheres \nsem a doença (Burney et al.,  2007). Não é conhecido, entretan to, se a expressão gênica \nalterada no endométrio eutópico  é devido a alguma diferença inerente a expressão gênica \nentre pacientes e controles, ou alternativamente, se a existência de lesões endometrióticas gera \num ambiente peritoneal alterado que age no e ndométrio eutópico resultando em expressão \ngênica aberrante (Pelch et al.,  2010). Assim estudos comparati vos entre o endométrio de \nmulheres sem endometriose (controle) e o endométrio eutópico e ectópico de mulheres com \nendometriose podem esclarecer alterações prec oces e necessárias ao desenvolvimento da \ndoença. \nO estudo de genes que regulam de alguma fo rma os processos acima poderiam ajudar \na esclarecer o desenvolvimento da endometriose. Os genes ID2, PRELP e SMOC2 fazem \nparte de uma lista de genes desregulados e previamente estudados pelo nosso grupo (Meola et \nal., 2010) e que podem estar envolvidos no proce sso da etiopatogenia da doença. A busca \nincessante por mecanismos relacionados à expressão de genes presentes em comportamentos \nbiológicos envolvidos com a etiopatogenia da doença poderá, futuramente, indicar \nmarcadores moleculares, permitindo um di agnóstico menos invasivo e com possíveis \naplicações terapêuticas. \n \n\nIntrodução  |  22 \n1.4. O gene ID2 (inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein) \nO gene ID2 está mapeado na região 2p25 (Mathew et al., 1995) e sua proteína interage \ncom os componentes do ciclo celular normalm ente envolvidos nos mecanismos regulatórios \nda progressão do ciclo, como por exemplo:  pRb, p16. Sua superexpressão parece tornar \ncélulas cancerosas imunes aos efeitos de inib ição do crescimento de  várias proteínas \nsupressoras de tumor (Lasorella, Iavarone e Israel, 1996). \nA proteína ID2 pertence a uma família de 4 proteínas (ID 1, 2, 3 e 4) relacionadas ao \ncontrole da diferenciação e pr ogressão do ciclo celular em vá rios organismos, desde moscas \naté o homem (Pesce and Benezra, 1993; Chen and Lim, 1997; Langlands et al., 1997; Yates et \nal., 1999).  \nTodas as quatro proteínas ID pertencem a uma classe de fatores de transcrição \nconhecida como proteínas hélice-alça-hélice (HLH – helix-loop-helix), que são uma grande \nfamília de proteínas, principalmente ativadores transcricionais, que compartilham um motivo \nde ligação comum, composto de uma região de  amino ácido básico e uma região hélice-alça-\nhélice (bHLH) (Benezra et al., 1990; Norton et al., 1998). As proteínas bHLH formam homo e \nheterodímeros através das regiões hélice-alça-h élice e se ligam a sequencias específicas de \nDNA por meio das regiões básicas (Davis et al., 1990; Voronova e Baltimore, 1990).  \nA descoberta da proteína ID mostrou um a nova perspectiva pa ra considerar a \nregulação das proteínas bHLH (Benezra et al.,  1990). As proteínas ID contem uma região \nHLH similar aquela das proteínas bHLH e pode m formar heterodímeros com algumas delas. \nMas estes heterodímeros não podem se ligar ao DNA, porque a proteína ID perde a região \nbásica responsável por esta ligação. Portant o, a proteína ID regula negativamente a \ncapacidade de ligação ao DNA da s proteínas bHLH que controla m a expressão gênica de um \ntipo celular específico e a expressão dos genes que controlam o ciclo celular (Lassar et al., \n1994). \n\nIntrodução  |  23 \nVários processos celulares são regulados po r proteínas ID: inibi ção da diferenciação \ncelular por interferência,  extensão da vida celular (Alani et al., 1999; Nickoloff et al., 2000; \nTang et al., 2002), regulação da angiogênese (Lyden et al., 2001), desenvolvimento cardíaco \n(Fraidenraich et al., 2004) e manutenção do fenótipo da célula tronco embrionária (Ying et al., \n2003). \nA expressão de proteínas ID  é anormal em muitos tumores, incluindo câncer \npancreático (Maruyama et al., 1999), câncer cervical (Schindl et al., 2001), melanoma (Polsky \net al., 2001),  carcinoma de células escam osas do esôfago (Hu et al.,  2001) e no câncer de \ntiróide (Kebebew, 2005). Em alguns tumores su a expressão está associada com prognóstico \nclínico ruim como no câncer de ovário, cervical, de próstata e no câncer de mama (Schindl et \nal., 2001; Schoppmann et al., 2003; Maw et al., 2008). Em conjunto, estes dados sugerem um \npapel oncogênico para as proteínas ID (Manthey et al.,  2010). Estas tem sido implicadas em \ndiferentes passos na tumorige nese, diferenciação e metástase (Benezra, Rafii e Lyden, 2001; \nFong, Debs e Desprez, 2004; Hasskarl e Munger,  2002; Sikder et al., 2004). A re-expressão \ndestas proteínas, que são marcadores fetais, em células tumorais e estroma do tumor indica a \nreversão de um estado “anterior”, semelhan te ao embrionário em que o potencial de \nproliferação e migração da célula e a rápida aquisição de suporte dos vasos sanguíneos \nfacilitam o processo de transformação nas doenças humanas (Perk, Iavarone e Benezra, 2005).  \nA endometriose exibe alguns aspectos de  malignidade tais como aumento de \ncrescimento, vascularização e invasão tecidual,  mas características tumorais como expansão \nmonoclonal e anomalias genéticas permanecem indefinidas (Viganò et  al., 2006). Visto as \nsimilaridades entre endometriose e câncer, a mu dança na expressão de genes associados com \nadesão celular, glicolisação de proteínas, invasão celular e angiogênese talvez esteja \nenvolvida na patologia da endometriose como estão no câncer (Eyster et al., 2007). \n \n\nIntrodução  |  24 \n1.5. O gene PRELP [(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)] \nEm humanos, o gene PRELP está mapeado no cromossomo 1q32 sendo codificado por \ntrês éxons (Grover et al.,  1996). Tal gene codifica a proteína prolargina que é rica em leucina \ne apresenta uma região amino-terminal rica em resíduos de prolina e ar ginina (Bengtsson et \nal., 1995; Bengtsson et al., 2002).  Originalmente, foi identificada como uma abundante \nproteína na matriz extracelular da cartilagem de bovinos funcionando como uma molécula de \nligação da membrana basal ao tecido c onjuntivo subjacente (Heinegård et al., 1986;  Grover et \nal. 1996). Em humanos, uma das principa is características desta proteína  é sua localização \nrelativamente restrita aos teci dos cartilaginosos, onde sua ex pressão é abundante no adulto e \ndeficiente no feto e recém-nascido (Melching e Roughley, 1990; Grover et al., 1996). Além da \ncartilagem, a expressão do PRELP foi encontrada em outros tecidos tais como rim, pele e \ntendão (Heinegard et al., 1986). A função do PRELP ainda não está totalmente elucidada e, \nportanto não está claro porque ele deve exibir  uma distribuição restri ta ao tecido, ou porque \nele não deve ser necessário na cartilagem antes do nascimento (Bengtsson et al., 2000).  \nO gene PRELP pertence a uma família de proteínas de repetição rica em leucina (LRR \n– leucine-reach repeat) (Kobe e Deisenhofer, 1994), que são caracterizadas por uma série de \nmotivos ricos em leucina adjacentes (LXXLXLXXNXL) cercados por domínios ligados a \ndisulfeto. As LRR dos tecidos conectivos prov avelmente agem na regulação da montagem da \nmatriz e fornecem ligações entre as principais  estruturas constituintes (Iozzo, 1997; Hocking, \nShinomura e McQuillan, 1998). Várias das prot eínas LRR (biglican, decorin, lumican e \nfibromodulin) ligam-se ao colágeno e interferem  na formação de fibrila (Vogel, Paulsson e \nHeinegard, 1984; Bidanset et al., 1992; Hedbomm e Heinegard, 1993).  \nA presença de 10 repetições centrais ricas em leucina coloca a PRELP na mesma sub-\nfamília das pequenas proteoglicanas ricas em leucina (SLRPs – small LRR proteoglycans ) – \ndecorin, biglican, fibromodulin, lumican e kerato can (Iozzo e Murdoch, 1996; Hocking et al., \n\nIntrodução  |  25 \n1998). O envolvimento dos membros desta família  na fibrilogênese do colágeno, crescimento \ncelular, diferenciação e migração revelam su a importância na modelagem da matriz \nextracelular (Tasheva, Klocke e Conrad, 2004). \nA maior diferença estrutural entre os memb ros da sub-família está na região amino \nterminal das suas proteínas do núcleo, onde decorin e biglican são substituídas por \ncondroitino-sulfato ou dermatan-sulfato, no entanto, o mesmo não ocorre com PRELP, \nfibromodulin, lumican e keratocan. É nesta região  que PRELP é rica em prolina e residuos de \narginina. PRELP, entretanto, é a única que tem um  domínio de base amino-terminal rico em \narginina e resíduos de prolina (Bengtsson et  al., 1995). Estes resíduos, provavelmente, dão à \nregião uma ampla estrutura e os grupos de resí duos de arginina na região amino-terminal, \ntalvez sejam um sítio de ligação à heparina (Cardin e Weintraub,1989). \nBaseado nesta estrutura, PRELP talvez func ione como uma molécula de ligação na \nmatriz, interagindo com outras proteínas da matr iz extracelular através dos seus LRRs e com \nglicosaminoglicanos através de seu domínio  amino-terminal. Desde que muitas células \ncontem sulfato de heparina na sua superfíc ie, PRELP pode ligar as células à matriz. A \nlocalização de PRELP na cartilagem e sua cap acidade de se ligar a célula corroboram com \nesta hipótese (Heinegard et al., 1986; Sommarin e Heinegard, 1989).  \n \n1.6. O gene SMOC2 [(SPARC related modular calcium binding 2)]  \nO gene SMOC2 humano foi descrito, em 2002, com o nome de Smap2 (smooth muscle \nassociated protein 2 ) associado com músculo liso e supe r expresso durante a formação da \nneointima em rato (Nishimoto et al., 2002). Su a estrutura foi elucidada por análise de um \ncontig (sequências sobrepostas de DNA) (NT 007302) originária de uma seqüência do \ncromossomo 6. Este gene está mapeado no 6q27 e abrange cerca de 226kb. Sua região \n\nIntrodução  |  26 \ncodificadora consiste de 13 éxons. Cada domínio do SMOC2 é codificado por um ou mais \néxons e os limites do domínio coincidem com locais de splicing (Vannahme et al., 2003).  \nEste gene é expresso principalmente na matriz extracelular e codifica a proteína \nmatricelular SMOC2 que pertence à família da proteína SPARC ( secreted protein, acidic, \ncysteine-rich), altamente expressa durante a embriogênese e na cicatrização (Sage et al., 2003; \nVannahme et al., 2003; Rocnik et al.,  2006; Maier et al., 2008).  Também fazem parte desta \nfamília SPARCL1 (SPARC-like1, SC1/hevin), FSTL1  (Follistatin-like 1, TSC-36), SPOCK1, \nSPOCK2, e SPOCK3 (Sparc/osteonectin, cwcv , and kazallike domains proteoglycan 1-3, \ntestican1-3). Proteínas matricelulares influenciam uma variedade de funções celulares \nincluindo sinalização de fator de crescimento, mi gração, adesão, cicatrização, angiogenese e \nproliferação celular (Bornstein e  Sage, 2002).  \nSMOC2 é expresso em quase todos os tecidos, sendo mais abundante no coração, \nmúsculo liso, baço e ovário (Vannahme et al., 2003). A proteína SMOC2 promove a \nmontagem da matriz e pode estimular a prolif eração e a migração de cé lulas endoteliais, bem \ncomo atividade de angiogênese. Estes efeitos biológicos resultam de interações entre fatores \nmatricelulares e de crescimento, integrinas e/ou  outras proteínas da matriz extracelular (Sage \net al., 2003; Rocnik et al., 2006).  \nEstudos in vitro mostram que SMOC2 interage com integrinas αvβ1 e αvβ6 (Maier et \nal., 2008) e mantém a integrina ligada a quinase (ILK – integrin linked kinase) ativa durante a \nfase G1 do ciclo celular, contribuindo para a progressão do mesmo. Consistente com o papel \npara SMOC2 no controle do crescimento, ativação de ILK e expressão de ciclina D1 são \ndependentes de SMOC2 (Liu et al., 2008). Estudos de pe rfil de SNP (single-nucleotide \npolymorphism) tem identificado polimorfismos para o SMOC2 ligados a função pulmonar \nindicando um possível papel pa ra este gene no cresciment o normal e desenvolvimento (Wilk \net al., 2007). \n\nIntrodução  |  27 \nEstes dados sugerem que SMOC2 pode mediar a interação entre integrinas e a matriz \nextracelular e contribuir para sinalização do se u efetor intracelular, ILK. Outros ensaios \nmostram que SMOC2 media os efeitos mitogênicos e angiogênicos de VEGF ( vascular \nendothelial growth factor) , PDGF ( platelet-derived growth factor)  e FGF ( fibroblast growth \nfactor), sugerindo assim que SMOC2 pode mediar interações entre estes fatores de \ncrescimento e seus receptores, ou agir  em paralelo, via sinérgica (Rocnik et al.,2006; Liu et \nal., 2008). \nA análise da expressão dos genes aqui aprese ntados ainda não foi realizada através da \ntécnica de PCR em tempo real em lesões endometrióticas, bem como em endométrio eutópico \nde mulheres com e sem endometriose na fase pro liferativa do ciclo mens trual. A proliferação \ndas células endometrióticas deve ocorrer para  que as mesmas cresçam e se estabilizem, \nentretanto, não está claro se há diferenças na proliferação entre lesões endometrióticas e \ntecido eutópico (Wingfield et al., 1995; Jurg ensen et al., 1996; Nisolle, Casanas-Roux e \nDonnez, 1997).  \nEstudos comparativos da expressão gênica  entre o endométrio de mulheres sem \nendometriose (controle) e o endométrio eutópico  e ectópico de mulheres com endometriose \nsão importantes para identificar se o aument o da expressão gênica já está presente no \nendométrio dessas mulheres ou se essa expressã o só é alterada quando este tecido cai na \ncavidade peritoneal e adquiri um potencial para se transformar em lesões endometrióticas. \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2 - OBJETIVO \n\nObjetivo  |  29 \nO objetivo deste trabalho foi analisar a expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 em \nendométrio de mulheres sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual e compará-\nla a expressão gênica no endomét rio eutópico e nas lesões de mulheres com endometriose na \nmesma fase do ciclo menstrual. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3 - CASUÍSTICA, MATERIAL E MÉTODOS \n\nCasuística, Material e Métodos  |  31 \n3.1. Aspectos Éticos do Projeto  \nEste projeto foi aprovado pelo Comitê de  Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital das \nClínicas da FMRP-USP, processo HCRP n o 2204/2010 e processo HCRP n o 9699/2006 \n(banco de tecidos de endometr iose). Todas as pacientes assi naram o termo de consentimento \nlivre e esclarecido. As amostras de endométrio foram armazenadas em freezer a -80 0C após \ntratamento com criopreservador Tissue-Teck®  O.C.T. Compound  (Sakura Finetek USA. Inc., \nTorrance, CA).  \n \n3.2. CASUÍSTICA  \nNeste estudo descritivo comparativo entre pa cientes com e sem endometriose na fase \nproliferativa do ciclo menstrual, foram avaliada s amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, \nsendo 10 de endométrio eutópico e lesões endo metrióticas peritoneais e 10 de endométrio \neutópico e endometrioma ovariano de mulh eres com idade entr e 18 e 40 anos, não \nmenopausadas, sem uso de qualquer terapia horm onal há pelo menos seis meses antes da \ncoleta, atendidas por infertilidade e/ou dor pé lvica nos ambulatórios de dor pélvica crônica \n(AGDP) e Infertilidade Conjugal (AEST) do Hospita l das Clínicas de Ribeirão Preto - USP, \nsubmetidas à laparoscopia com diagnóstico lapa roscópico e histológico de endometriose. O \nestadio da endometriose foi determinado de acordo com a classificação da American Society \nfor Reproductive Medicine  (American Society for Reproduc tive Medicine, 1997). Durante a \nlaparoscopia foram colhidas biópsias de endomét rio eutópico através de  Cureta de Novak e \namostras de lesões endometrióticas peritoniais e ovarianas.  \nO grupo controle foi formado por 16 amostr as de endométrio de mulheres sem \nendometriose, padronizadas de acordo com a fase  do ciclo menstrual em fase proliferativa, \nconfirmado por critérios de data ção histológica. Es te grupo foi composto por pacientes com \nidade entre 18 e 40 anos, no menacme, que foram submetidas à laparoscopia para laqueadura \n\nCasuística, Material e Métodos  |  32 \ntubária pelo serviço de Endoscopia Ginecológica, com confirmação laparoscópica da ausência \nde lesões endometrióticas, que estavam sem uso de medicação hormonal há pelo menos seis \nmeses antes da coleta. A biópsia endometrial foi colhida através de Cureta de Novak, durante \no procedimento cirúrgico. \n \n3.3. AMOSTRAS \nAs biópsias de endométrio eutópico e ect ópico das pacientes com diagnóstico de \nendometriose foram coletadas por laparoscopia. Das 20 biópsias de endométrio ectópico 10 \neram lesões peritoniais (seis vermelhas, quatro negras), sendo três em estádio I, quatro em \nestádio II, duas em estádio III e uma em estádio IV e 10 corresponderam a endometrioma \novariano quatro em estádio III e seis em estádio IV. \n \n3.4.\n EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL \nAs amostras foram lavadas em solução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na2HPO4 1,11g/L; \nNa2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH2PO4 0,20g/L pH7,0) para retirar o cr iopreservador dos tecidos. \nEm seguida, o RNA total (50mg de  tecido) foi extraído com TRIZOL ®  Reagent ( Invitrogen \nLife Technologies, Paisley, UK) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações \nde RNA total foram medidas em espectrofo tômetro a densidade óptica de 260nm. O RNA \npermanece armazenado à -800C para procedimentos posteriores. \n \n3.5. SÍNTESE DO CDNA  \nUm micrograma de RNA total de cada amostr a foi transcrito reversamente usando o \nHigh Capacity cDNA Archive Kit (A pplied Biosystems, Warrington, UK)  segundo as \ninstruções do fabricante. \n \n\nCasuística, Material e Métodos  |  33 \n3.6. QUANTIFICAÇÃO POR PCR EM TEMPOS REAL \nAs sondas e os primers para os genes ID2 (Hs00747379_m1), PRELP  \n(Hs00160431_m1), SMOC2 (Hs00405777_m1) e para os genes de re ferência da reação \nGAPDH (glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase) (Hs99999905_ml) e ACTB (actin, beta) \n(Hs99999903_ml) foram obtidos usando Assay-on-Demand™ Gene Expression Products \n(Applied Biosystems, Warrington, UK) , e as quantificações foram realizadas no aparelho ABI \nPRISMTM 7500FAST Sequence Detection Systems  (Applied Biosystems, Warrington, UK ). O \nnível de expressão relativo para os genes an alisados foi calculado para cada amostra de \nacordo com o método de 2 -∆∆CT (ou 2-Ct), descrito previamente no Applied Biosystems User \nBulletin # 2  (PN 4303859) ( Applied Biosystems, Warrington, UK ). Um pool de cDNA das \namostras controles foi utilizado como calibrador nas análises. \nA PCR em tempo real foi realizada para cada amostra em duplicata seguindo as \nseguintes condições: 10 µL do TaqMan® Universal PCR Master Mix  (2x) ( Applied \nBiosystems, Warrington, UK), 1 µL do TaqMan® Gene Expression Assay Mix (20X) (Applied \nBiosystems, Warrington, UK ) e 9 µL de cDNA diluído em volume final de 20µL reação. As \ncondições da reação foram 50ºC por 2 minutos, então 95ºC por 10 minutos, seguidos de 40 \nciclos a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. \n \n3.7.\n ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS \nAs análises estatísticas foram realizadas no software SAS 2003 (2002-2003, SAS \nInstitute Inc ., Cary, NC, USA). Aplicamos o Test e Welch’s ANOVA não pareado para \ncomparar: [1] endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio eutópico de \nmulheres com endometriose; [2] estádios das le sões de mulheres com endometriose na fase \nproliferativa do ciclo menstrual.  Teste T pareado para comparar as médias de expressão dos \ngenes obtidas entre: [3] endométrio eutópico  e ectópico de 10 mulheres com endometriose \n\nCasuística, Material e Métodos  |  34 \nperitoneal na fase proliferativa do ciclo me nstrual e 10 mulheres com endometriose ovariana \nna mesma fase do ciclo menstrua l; [4] endométrio eutópico de  mulheres com endometriose e \nendométrio ectópico de mulheres com endometr iose (lesão peritoneal + endometrioma \novariano). Todos os testes foram realizados conforme os procedimentos GLM. Além disso, \nforam feitas análises de correlação de Spear man pelo PROC CORR entre os níveis de \nexpressão gênica obtidos entre os três genes ( ID2, PRELP e SMOC2). Análises com P < 0,05 \nforam consideradas significativas.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4 - RESULTADOS \n \n\nResultados  |  36 \nA variável expressão gênica foi transformada pelo log 10. A transformação logarítmica \nfoi necessária, pois não foi atendida uma das suposições (linearidade)  feitas em análises \nempregando-se os modelos lineares. Estas anális es especificam que a média condicional E(y | \nx = x0 ) da variável resposta y dado o valor x 0 do vetor preditor x, é linear em x 0. A aplicação \ndos modelos lineares pode ser estendida supon do-se que uma transformação apropriada da \nvariável resposta dada por t(y), em que E{t(y) | x}, sejam linear em x, na função t(y) = β0 + βT \nx + ε, para β0 e βT desconhecidos. O termo  ε (erro aleatório) é independente de x e tem média \nzero (Cook e Weisberg, 1994). \nNão houve diferença significativa entre a expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 \nno endométrio de mulheres sem endometriose qu ando comparado ao endométrio de mulheres \ncom endometriose (Figura 1). \n \nID2\nC EU\n0\n1\n2\n32-Ct\nPeritoneal + Ovariana\n*P=0,8824\nX\n   \nPRELP\nC EU\n0\n20\n40\n60\n802-Ct\nPeritoneal + Ovariana\n*P=0,6607\nX\n  \nSMOC2\nC EU\n0\n5\n10\n15\n202-Ct\nPeritoneal + Ovariana\n*P=0,7956\nX\n \nFigura 1 – Análise da expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2  entre endométrio de \nmulheres sem endometriose com endométrio eu tópico de mulheres com endometriose, sem \ndiferença significativa pa ra P <0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. C= endométrio de \nmulheres sem endometriose; EU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose. \n \nNas amostras não-pareadas analisadas foi encontrada diferença significativa (P<0,05) \npara o gene ID2 na comparação entre estadio I + II (fas e inicial) x estadi o III + IV (fase \navançada) (Gráfico 1). \n\nResultados  |  37 \nID2\nInicial\nAv\nanç\nad\na\n0\n10\n20\n30\n40\n50 *P=0,0324\n2-Ct\nX\n \nGráfico 1 – Análise da expressão do gene ID2 entre o estadio I + II (fase inicial) x estádio III \n+ IV (fase avançada). 2-Ct = 2-∆∆Ct - método para quantificação relativa. \n \nA análise das amostras pareadas resultou em uma maior expressão dos genes ID2 e \nPRELP. O gene ID2 foi mais expresso no endometrioma ovariano comparado ao endométrio \neutópico de mulheres com e ndometrioma ovariano e o gene PRELP na lesão peritoneal \ncomparada ao endométrio eutópico de mulh eres com a lesão  (Figura 2). O gene SMOC2 \nmostrou uma maior expressão na análise entre endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose e a lesão (peritoneal + endometrioma) (Gráfico 2).  \nNão foi encontrada diferença significativa na análise de correlação dos genes PRELP e \nSMOC2 com estadio, sendo os valores de P= 0,8491 e 0,3345, respectivamente. A correlação \nentre ID2 x estadio foi significativa para P<0,05 com P=0,0491..  \n\nResultados  |  38 \n \n \nID2\nEU EC EU EC\n0\n20\n40\n60\n*P=0,0021\nXX\nPeritoneal\nOvariana\n2-Ct\n     \nPRELP\nEU EC EU EC\n0\n5000\n10000\n15000\n* P=0,0033\nOvariana\nPeritoneal\n2-Ct\nXX\n \nFigura 2– Análise da expressão dos genes ID2 e PRELP  entre endométrio eutópico de \nmulheres com endometriose e o endométrio ectópico. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - método para \nquantificação relativa. EU= endométrio eutó pico de mulheres com endometriose; EC= \nendométrio ectópico de mulheres com endometriose. \n \nSMOC2\nEU EC\n \n0\n20\n40\n60\nPeritoneal + Ovariana\nPeritoneal + Ovariana\n2-Ct\nX\n \nGráfico 2 – Análise da expressão do gene SMOC2 entre endométrio eutópico de mulheres \ncom endometriose e o endométrio ectópico de  mulheres com endometriose. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - \nmétodo para quantificação relativa. EU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose; \nEC= endométrio ectópico de mulheres com endometriose.  \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5 - DISCUSSÃO \n\nDiscussão  |  40 \nA análise da expressão gênica é fundamental para a pesquisa biológica, e a detecção \nda expressão diferencial de gene (s) entre diferentes tipos de tecido ou entre estado normal e a \ndoença pode levar a novas terapêuticas para o tratamento da mesma. A técnica da PCR em \ntempo real é considerada a metodologia padrão para a quantificação da expressão gênica, ela \npermite a determinação exata dos níveis de ex pressão de genes alvos em células e tecidos \n(Thellin et al., 1999; Gorzelniak et al., 2001; Goodsaid et al., 2003). \nVários estudos moleculares têm sido realizad os para elucidar o papel dos genes na \netiologia da endometriose, no entanto, nenhu m deles estudou a relação dos genes aqui \napresentados com a endometriose utilizando a técnica da PCR em tempo real. Sabemos da \nimportância desta análise, já que o compor tamento dos genes no endométrio eutópico e \nectópico de mulheres com e sem endometriose  pode nos ajudar a entender a base biológica \ndesta patologia.  \nEm um trabalho prévio do nosso grupo (Meo la et al. 2010), obser vou-se, por meio de \nhibridação subtrativa, que os genes ID2, PRELP e SMOC2  encontravam-se “ up-regulated” \nquando comparada a expressão no endométrio ectópico com eutópico de mulheres com \nendometriose. Até o momento, não há outros trabalhos de screening, PCR em tempo real ou \npolimorfismos na literatura, relacionando o gene ID2 com a endometriose. Pelch et al . (2010) \ninduziram endometriose em camundongos e an alisaram o perfil de  expressão gênica \nempregando a técnica de microarray. A análise foi realizada 3 e 29 dias após a indução, e \nobservou-se que o SMOC2 foi “down-regulated” e o PRELP “up-regulated”, respectivamente \nnas lesões endometrióticas.  \nNão houve diferença significativa entre a expressão dos genes estudados no \nendométrio de mulheres sem endometriose co m o endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose, este resultado é uma evidência da  influência do meio pe ritoneal na expressão \ndos genes estudados em mulheres com endometriose. \n\nDiscussão  |  41 \nNeste trabalho foi encontrada diferença es tatisticamente significativa para o gene ID2, \nque mostrou uma maior expressão na fase avançada da doença quando comparado a fase \ninicial e também no endometrioma ovariano qua ndo comparado ao endométrio eutópico de \npacientes com endometrioma.  \nAs proteínas ID alteram componentes do ciclo celular normalmente envolvidos no \nmecanismo que regula sua progressão (Lasorella  et al., 1996; Arnold et al., 2001). Um dos \ngenes também envolvidos na regulação do ci clo celular é o gene do retinoblastoma (RB) que \nfoi o primeiro supressor tumoral a ser clonado, e regula negativamente o ciclo celular através \nda sua habilidade de se ligar ao fator de tr anscrição E2F e reprimir a transcrição de genes \nnecessários para a fase S do ciclo celular (Hanahan e Weinberg, 2000). \nSuper-expressão de ID2 inativa pRb e também anula a atividade inibitória do ciclo \ncelular das proteínas p107 e p130 relaci onadas a pRb. A habilidade do gene ID2 de abolir os \nefeitos de supressão de crescimento da pRb, p107 e p130 sugere uma explicação para o \nmodelo de expressão de ID2 no início e fim da fase G1 do ciclo celular após estimulação de \nfatores de crescimento celular (Bar one et al., 1994; Hara et al., 1994). ID2 talvez seja \nnecessário para inativação seqüencial de alvos distintos representados por diferentes membros \nda família pRb, que de outra forma contem a progressão do ciclo celular através de \nassociações reguladas com os fatores de transcrição E2F (Lasorella; Iavarone e Israel, 1996). \nGoumenou et al. (2006), util izando a técnica de imunohistoquímica analisaram se há \ndiferença de expressão da s proteínas p16, pRb e ciclina D1 em endometriomas e \nadenomiomas. A proteína p16 estava presente em 77% dos adenomiomas e 15% dos \nendometriomas, enquanto a pRb foi detectada em  28% dos endometriomas analisados e não \nfoi detectada nos adenomiomas e a ciclina D1 nã o foi encontrada nos te cidos avaliados. Este \ntrabalho demonstrou que p16 e pRb tem um im portante papel na regulação do crescimento \ncelular em adenomiomas e endometriomas,  respectivamente. Os nossos resultados \n\nDiscussão  |  42 \nevidenciaram uma maior expressão do gene ID2 nos endometriomas ovarianos, e, como sua \nsuperexpressão pode inibir o pa pel de supressor tumoral da pRb em células cancerosas pode \nser que na endometriose eles também atuem nessa mesma via. \nO proto-oncogene MYC ( v-myc avian myelocytomatos is viral oncogene homolog ) \ncodifica um fator de ligação ao DNA que pode ativar e reprimir a transcrição. Por este \nmecanismo, MYC regula a expressão de numerosos ge nes alvos que controlam importantes \nfunções celulares, incluindo crescimento e pr ogressão do ciclo celul ar. Desregulação da \nexpressão de MYC resultante de vários tipos de alte rações genéticas leva a atividade \nconstitutiva de MYC em uma variedade de cânceres e oncogenes promotores (Dominguez-\nSola et al., 2007). O gene ID2 é um alvo do gene MYC (Lasorella et al., 2000) e em linhagens \ncelulares de neuroblastomas sua expressão é induzida por N-MYC (Raetz et al., 2003; Wang \net al., 2003). ID2, como todos os outros genes alvos de N-MYC, é também um alvo para MYC \ne estudos futuros indicarão uma correlação entre MYC e o mRNA do ID2 em neuroblastomas \nprimários (Vandesompele et al., 2003).  \nMeola et al.(2010), identificaram 291 gene s com expressão alterada em lesões \nendometrióticas, entre eles o  MYC foi encontrado como “ dow-regulated” em endométrio \nectópico comparado ao eutópico de mulheres com endometriose. Eles concluíram que essa \nalteração pode ser responsável pela perda de homeostase nas lesões endometrióticas. Johnson \net al (2005) encontraram expressão mais alta de MYC no endométrio eutópico de mulheres \ncom endometriose quando comparada ao endo métrio de mulheres normais. Os dados \nrelacionados à regulação e função de MYC são controversos na literatura. Embora não \ntenhamos analisado a expressão do gene MYC, ele pode estar envolvido na regulação do gene \nID2 nas lesões endometrióticas avaliadas. \n\nDiscussão  |  43 \nPara o gene PRELP a diferença estatisticamente significativa foi encontrada no \naumento da sua expressão na lesão peritoneal comparada ao endométrio eutópico de mulheres \ncom endometriose peritoneal.  \nAs pequenas proteoglicanas ricas em leuc ina (SLRPs), das quais o gene PRELP faz \nparte, são uma família bem conhecia de pr oteoglicanas presente em muitos tecidos \nconectivos. Papéis cruciais para estas macrom oléculas na montagem da matriz e modulação \ndo crescimento celular tem sido extensivamente mostrados na literatura (Hocking; Shinomura \ne McQuillan, 1998; Iozzo, 1999; Kresse e Schonherr, 2001; Ameye e Young, 2002). \nO principal papel da matriz extracelular é se r a base estrutural dos tecidos, criando o \nambiente primordial para as mudanças das células do sistema imunológico (Shimizu e Shaw, \n1991; Gorski e Kupiec-Weglinski, 1995; Cowin, 2000; Pupa et al., 2002). Proteínas da matriz \n(colágeno, fibronectina, laminina) são responsáveis pela sinalização relacionada à proliferação \n(Bates; Lincz e Burns, 1995), migração (Iivanain en et al., 2003), diferenciação(Watt, 2002) \nou apoptose (Hock et al., 2001) de muitos tipos de  células durante o processo fisiológico e \npatológico (Gorski e Kupiec-Weglinski, 1995 ; Pupa et al., 2002). Isto sugere que na \nendometriose proteínas da matriz talvez seja m responsáveis por atrapalhar tais funções \nfisiológicas do endométrio como secreção (Gottschalk et al., 2000), implantação (Selam et al., \n2002) e menstruação (Koks et al., 2000; Abrahamson et al., 1986). \nEm 2009, Castells et al. demonstraram  que o gene PRELP juntamente com GFAP \n(glial fibrillary acidic protein), PTPRZ1 (p rotein tyrosine phosphatase, receptor-type, Z \npolypeptide 1), GPM6B (glycoprotein M6B) , podem prever com 100% de sensibilidade e \nespecificidade a diferença entre glioblastoma multiforme e meningioma meningotelial.. \nEstudos prévios identificaram 22 microR NAs diferencialmente expressos em \nendométrio ectópico e eutópico de amostras pa readas de mulheres com e sem endometriose \n(Ohlsson Teague et al., 2009). Zh ao et al. (2011) examinaram a presença de SNPs próximos \n\nDiscussão  |  44 \naos alvos destes miRNAs, e,  dentre os 102 SNPs analisados para diferentes genes em \nmulheres com endometriose e controle, o SNP, rs7542469, para o gene PRELP foi encontrado \nno grupo controle, não sendo relacionado com a endometriose.  \nEmbora na literatura prévia o gene PRELP não esteja relacionado a endometriose, \nnossos resultados da análise da expressão por  PCR em tempo real demonstraram uma maior \nexpressão deste gene em lesões peritoneais.  O que pode estar relaci onado a alterações no \nambiente peritoneal responsáveis pela transformação do endométrio em lesão endometriótica. \nNas análises estatísticas realizadas com toda s as lesões endometrióticas juntas, o gene \nSMOC2 foi mais expresso na lesão (endometri oma e peritoneal) qu ando comparado ao \nendométrio eutópico de mulheres com endomet riose. Este resulta do corrobora com os \nachados por Eyster  et al. (2007), que analisaram o mode lo de expressão gênica em \nendométrio ectópico e eutópico de 11 pacientes para identificar possíveis famílias de genes \nenvolvidas na endometriose. Neste screening, que  utilizou a técnica de  microarray, dos 717 \ngenes analisados, o gene SMOC2, dentre outros, foi encontra do como mais expresso nas \nlesões endometrióticas (endometrioma e peritoneal) em relação ao endométrio eutópico.  \nVisto que a PCR em tempo real é o padrão  ouro para quantific ação de expressão \ngênica é possível que o SMOC2 possa estar relacionado a vias de desenvolvimento da \nendometriose, participando diretamente do desenvolvimento da mesma.  \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6 - CONCLUSÃO \n\nConclusão  |  46 \nNossos resultados sugerem que a expressão dos genes ID2, PRELP e SMOC2 sofre \ninfluência do meio peritoneal, podendo ser alterada dependendo do local da implantação \n(ovário ou peritôneo). \nO gene ID2 foi mais expresso nos endometriom as ovarianos quando comparados ao \nendométrio eutópico de mulheres com endometriose. \nO gene PRELP foi mais expresso na lesão peritoneal quando comparado ao \nendométrio eutópico de mulheres com endometriose. \nO gene SMOC2 foi mais expresso na lesão (endometrioma e peritoneal) quando \ncomparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. \nA expressão dos genes ID2, PRELP  e SMOC2 no endométrio de mulheres sem \nendometriose é igual à expressão gênica no  endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose. \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nBIBLIOGRAFIA \n \n \n\nBibliografia  |  48 \nABRAHAMSON, D. 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EU= endom étrio eutópico de mulheres com \nendometriose; EC= endométrio ectópico de mulheres com endometriose. \nSMOC2\nEU EC EU EC\n0\n20\n40\n60\n80\nPeritoneal\nOvariana\n2-Ct\nX X\n*P=0,8689\n*P=0,3613\n \n \n \n\nApêndices  |  65 \nApêndice C  – Análise da expressão do gene ID2 entre endométrio eutópico de \nmulheres com endometriose e o endométrio ectópico de mulheres com endometriose. Sem \ndiferença significativa para P<0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. EU= endométrio \neutópico de mulheres com endometriose; EC= endométrio ectópico de mulheres com \nendometriose. \nID2\nEU EC \n0\n10\n20\n30\n40 Peritoneal + Ovariana\nPeritoneal + Ovariana\n2-Ct\n*P=0,1698\nX\nPRELP\nEU\n \nEC\n \n0\n2000\n4000\n6000\n8000 Peritoneal + Ovariana\nPeritoneal + Ovariana\n2-Ct\n*P=0,1005\nX\n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nMANUSCRITO \n \n \n\nManuscrito  |  67 \nANÁLISE DA EXPRESSÃO DIFERENCIAL DO GENE ID2 EM ENDOMÉTRIO \nECTÓPICO E EUTÓPICO DE MULHERES  COM E SEM ENDOM ETRIOSE NA FASE \nPROLIFERATIVA DO CICLO MENSTRUAL \n \nRESUMO: Endometriose é uma doença de et iopatogenia complexa e multifatorial, \ncaracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina principalmente no \nperitônio pélvico e ovários. Nosso obje tivo foi analisar a expressão do gene ID2 em \nendométrio de mulheres sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual e compará-\nla a expressão gênica em endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose na \nmesma fase do ciclo menstrual.  Foram avaliadas amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, \nsendo 10 de endométrio e lesões endometrióticas peritoneais e 10 de en dométrio eutópico e \nendometriomas ovarianos na fase proliferativ a do ciclo menstrual. Como controle (C) foi \ncoletado 16 amostras de endométrio de mulheres  sem endometriose, na mesma fase do ciclo \nmenstrual. A análise da expressão foi feita através da PCR em tempo real. A análise estatística \nmostrou que não houve diferença na expressão gênica entre o endométrio de mulheres sem \nendometriose e o endométrio eutópico de  mulheres com endometriose. O gene ID2 foi mais \nexpresso no endometrioma ovariano quando comp arado ao endométrio de mulheres com a \nlesão e na fase avançada quando comparada a fase inicial. No ssos resultados sugerem que a \nexpressão deste gene sofre influência do meio peritoneal. Como o gene ID2 está envolvido em \nalgumas vias de regulação do cr escimento e manutenção de tumores, que são características \ncomuns a endometriose, pode ser que nesta, ele atue reprimindo o gene Rb que é um supressor \ntumoral. \n \n \n\nManuscrito  |  68 \nINTRODUÇÃO \nEndometriose é uma doença de etiopatoge nia complexa e multifatorial, envolvendo \npredisposição genética, fatores ambientais, an atômicos, endócrinos e alterações imunológica. \nMuitas vezes é progressiva, caracterizada pela  presença de tecido endometrial fora da \ncavidade uterina  - principalmente no peritônio pélvico e ovários, levando á  processos \ninflamatórios, reação cicatricial e formação de  aderências, associados à infertilidade e dor \npélvica crônica. É uma patologia comum, de caráter benigno, estrógeno-dependente, que afeta \nde 10 a 15 % das mulheres em idade reprodutiva, 35 a 50% das mulheres com infertilidade, \ndor pélvica ou ambos (Cramer e Missmer, 2002; Giudice e Kao, 2004). \nApesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia, sua etiologia ainda não \nestá clara e várias são as teor ias atuais para explicá-la (Ulu kus et al., 2009; Carvalho et al.,  \n2011). A mais aceita é a teoria de Sampson ou fluxo menstrual retrógrado (1927), que aponta \na presença de células endometriais viáveis no fluxo menstrual retrógra do como causador das \nlesões. \nO desenvolvimento da endometriose parece ser um fenômeno complexo, facilitado por \nfatores múltiplos, incluindo: quantidade e qualidade de células endometriais no fluído \nperitoneal, atividade inflamatória, expressão aumentada de moléculas de adesão, angiogênese, \napoptose reduzida, escape do sistema imunológico e aumento da proliferação celular (Lima et \nal., 2006; Ulukus et al., 2006). A genética da e ndometriose é complexa, no entanto, acredita-\nse que ela é herdada de um modo poligênico/multif atorial e há predisposição familial para o \nseu desenvolvimento. \nEstudos moleculares tem focado esforços consideráveis na expressão, regulação e \nherança de genes na endometriose. Um grande número de genes candidatos tem sido avaliado \npara sua associação com endometriose, como os genes envolvidos na inflamação, síntese de \nesteróide, desintoxicação, receptores de hormônios, metabolismo de estrógeno, fatores de \n\nManuscrito  |  69 \ncrescimento, moléculas de adesão, apoptose, re gulação do ciclo celular, oncogenes e sistemas \nmetabólicos (Hansen e Eyster, 2010). \nVários trabalhos tem focado nas difere nças da expressão gênica entre lesão \nendometriótica e endométrio eutópico. Há ta mbém diferenças conhecidas em expressão \ngênica no endométrio eutópico de mulheres com endometriose comparada com endométrio \ncontrole de mulheres se m a doença (Burney et al.,  2007). Não é conhecido, entretanto, se a \nexpressão gênica alterada no endométrio eutó pico é devido a alguma diferença inerente a \nexpressão gênica entre pacientes e controles, ou alternativamente, se a existência de lesões \nendometrióticas gera um ambiente peritoneal alterado que age no endométrio eutópico e então \nresulta em expressão gênica aberrante (Pelch et al.,  2010). Assim estudos comparativos entre \no endométrio de mulheres sem endometriose (controle) e o endométrio eutópico e ectópico de \nmulheres com endometriose podem esclare cer alterações precoces e necessárias ao \ndesenvolvimento da doença. \nO gene ID2 (inhibitor of DNA binding 2, do minant negative helix-loop-helix \nprotein) está mapeado na região 2p25 (Mathew et al., 1995)\n e altera os componentes do ciclo \ncelular normalmente envolvidos nos mecanismos que regulam sua progressão, e sua \nsuperexpressão parece tornar células cancer osas imunes aos efeito s de inibição do \ncrescimento de várias proteína s supressoras de tumor (Lasore lla, Iavarone e Israel, 1996). A \nproteínas ID2 pertence a uma classe de fatore s de transcrição conhecida como proteínas HLH \n(hélice-alça-hélice) que são uma grande família de proteínas, principalmente ativadores \ntranscricionais, que compartilham um motivo de  ligação comum, composto de uma região de \namino ácido básico e uma região hélice-alça-hé lice (bHLH) (Benezra et al., 1990; Norton et \nal., 1998). \nA expressão de proteínas ID é anormal em muitos tumores, em alguns sua expressão está \nassociada com prognóstico clínico ruim como no câ ncer de ovário, cervical, de próstata e no \n\nManuscrito  |  70 \ncâncer de mama (Schindl et al., 2001, Maw et al., 2008). As proteínas ID tem sido implicadas em \ndiferentes passos na tumorigenese, diferenciação e metástase (Benez ra, Rafii e Lyden, 2001; \nHasskarl e Munger, 2002; Sikder et al., 2004) e pode ser considerada um oncogene (Manthey et \nal., 2010) A endometriose ex ibe alguns aspectos de malign idade tais como aumento de \ncrescimento, vascularização e invasão tecidual, mas, características tumorais como expansão \nmonoclonal e anomalias genéticas,  permanecem indefinidas (Vigan ò et al., 2006). Visto as \nsimilaridades entre endometriose e câncer, m udança na expressão de genes associados com \nadesão celular, glicolisação de proteínas, invasão celular e angiogênese talvez estejam envolvidos \nna patologia da endometriose como eles estão no câncer (Eyster et al., 2007). Nosso objetivo foi \nanalisar a expr essão do gene ID2 em endométrio de mulheres sem endometriose na fase \nproliferativa do ciclo menstrual e compará-la a expressão gênica em endométrio eutópico e \nectópico de mulheres com endometriose na mesma fase do ciclo menstrual. \n \nMATERIAL E MÉTODOS \nEste trabalho foi realizado no Laborat ório de Biologia  da Reprodução do \nDepartamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto da Universi dade de São Paulo (HCFMRP-USP) e foi aprovado \npelo Comitê de Ética em Pesquisa do mesmo hospital (n o 2204/2010) e processo HCRP n o \n9699/2006 (banco de tecidos  de endometriose) . Todas as pacientes as sinaram o termo de \nconsentimento livre e esclarecido.  \nAMOSTRAS \nForam coletadas amostras de endométrio e lesão endometriótica de 20 pacientes com \nidade entre 18 e 40 anos, não menopausadas, na fase proliferativa do ciclo menstrual, sem uso \nde qualquer terapia hormonal há pelo menos seis meses antes da coleta, atendidas por \n\nManuscrito  |  71 \ninfertilidade e/ou dor pélvica no s ambulatórios de dor pélvica cr ônica (AGDP) e Infertilidade \nConjugal (AEST) do HCFMRP submetidas à la paroscopia com diagnóstico laparoscópico e \nhistológico de endometriose. As biópsias de endométrio e amostr as de lesões endometrióticas \nperitoneais e ovarianas foram colhidas durante a laparoscopia através de Cureta de Novak. \nForam avaliadas amostras teciduais pareadas  de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio de \nmulheres com lesão peritoneal e lesões endomet rióticas peritoneais e 10 de endométrio de \nmulheres com endometrioma e lesões endometri óticas ovarianas. O esta dio da endometriose \nfoi determinado de acordo com a classificação da American Society for Reproductive \nMedicine (American Society for Reproductive  Medicine, 1997). Das 20 biópsias de \nendométrio ectópico 10 eram lesões peritoniais (s eis vermelhas, quatro negras), sendo três em \nestádio I, quatro em estádio II, duas em estádio III e uma em  estádio IV e 10 corresponderam \na lesões ovarianas (endometrioma ovariano) quatro em estádio III e seis em estádio IV. \nComo controle foi coletado 16 amostras de endométrio de mulheres sem endometriose, \npadronizadas de acordo com a fase  do ciclo menstrual em fase proliferativa, confirmado por \ncritérios de datação histológica. Este grupo foi composto por pacientes com idade entre 18 e 40 \nanos, no menacme, que foram submetidas à laparoscopia para laqueadura tubária pelo serviço de \nEndoscopia Ginecológica, com confirmação laparoscópica da ausência de lesões endometrióticas, \nque estavam sem uso de medicação hormonal há pelo menos seis meses antes da coleta. A biópsia \nendometrial foi colhida através de Cureta de Novak, durante o procedimento cirúrgico. \n \nEXTRAÇÃO DO RNA TOTAL \n As amostras foram lavadas em so lução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na 2HPO4 \n1,11g/L; Na 2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH 2PO4 0,20g/L pH7,0) para retirar o criopreservador \ndos tecidos. Em seguida, o RNA total (50mg de tecido) foi extraído com TRIZOL ®  Reagent \n(Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) de acordo com as instruções do fabricante. As \n\nManuscrito  |  72 \nconcentrações de RNA total foram medidas em  espectrofotômetro a densidade óptica de \n260nm. O RNA permanece armazenado à -800C para procedimentos posteriores. \n \nSÍNTESE DO CDNA  \n Um micrograma de RNA total de cada amos tra foi transcrito reversamente usando o \nHigh Capacity cDNA Archive Kit (A pplied Biosystems, Warrington, UK)  segundo as \ninstruções do fabricante. \n \nQ\nUANTIFICAÇÃO POR PCR EM TEMPOS REAL \nAs sondas e os primers para o gene ID2 (Hs00747379_m1) e para os genes de \nreferência da reação GAPDH (glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase) (Hs99999905_ml) \ne ACTB ( actin, beta ) (Hs99999903_ml) foram obtidos usando Assay-on-Demand™ Gene \nExpression Products (Applied Biosystems, Warrington, UK) , e as quantificações foram \nrealizadas no aparelho ABI PRISM TM 7500FAST Sequence Detection Systems  ( Applied \nBiosystems, Warrington, UK ). O nível de expressão relativo foi calculado para cada amostra \nde acordo com o método de 2 -∆∆CT (ou 2-Ct), descrito previamente no Applied Biosystems \nUser Bulletin # 2 (PN 4303859) ( Applied Biosystems, Warrington, UK ). Um pool de cDNA \ndas amostras controles foi utilizado como calibrador nas análises. \n \nANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS \nAs análises estatísticas foram realizadas no software SAS 2003 (2002-2003, SAS \nInstitute Inc ., Cary, NC, USA). Aplicamos o Test e Welch’s ANOVA não pareado para \ncomparar: [1] endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio de mulheres com \nendometriose; [2] estádios das lesões de mulher es com endometriose na fase proliferativa do \nciclo menstrual. Teste T pareado para comparar  as médias de expressão dos genes obtidas \n\nManuscrito  |  73 \nentre: [3] endométrio eutópico e ectópico de 10 mulheres com endometriose peritoneal na fase \nproliferativa do ciclo menstrual e 10 mulheres com endometriose ovariana na mesma fase do \nciclo menstrual; [4] endométrio eutópico de  mulheres com endometriose e endométrio \nectópico de mulheres com endometriose (lesão peritoneal + endometrioma ovariano). \n \nRESULTADOS \nA expressão do gene ID2 no endométrio de mulheres sem endometriose é igual a \nexpressão no endométrio eutópico de mulheres com endometriose (Figura 1). \n \nID2\nC EU\n0\n1\n2\n32-Ct\nPeritoneal + Ovariana\nX\n \nFigura 1 – Análise da expressão do gene ID2 entre endométrio de mulheres sem endometriose \ncom endométrio eutópico de mulheres com endo metriose, sem diferença significativa para P \n<0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. C= endomét rio de mulheres sem endometriose; \nEU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose. \n \nNas amostras analisadas o gene ID2 foi mais expresso na fase avançada (estadio III + \nIV) quando comparada a inicial (estadio I + II) e no endometrioma ovariano quando \ncomparado ao endométrio eutópico de mulheres com a lesão para P<0,05 (Figuras 2 e 3). \n\nManuscrito  |  74 \nID2\nInicial\nAvanç\nad\na\n0\n10\n20\n30\n40\n50 *P=0,0324\n2-Ct\nX\n \nFigura 2 – Análise da expressão do gene ID2 entre o estadio I + II (fase inicial) x estádio III + \nIV (fase avançada). 2-Ct = 2-∆∆Ct - método para quantificação relativa. \n \nID2\nEU EC EU EC\n0\n20\n40\n60\n*P=0,0021\nXX\nPeritoneal\nOvariana\n2-Ct\n \nFigura 3 – Análise da expressão do gene ID2 entre endométrio eutópico de mulheres com \nendometrioma ovariano e o endome trioma ovariano.. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - método para \nquantificação relativa. EU= endométrio eutó pico de mulheres com endometriose; EC= \nendométrio ectópico de mulheres com endometriose. \n \n\nManuscrito  |  75 \nDISCUSSÃO \nVários estudos moleculares têm sido realizad os para elucidar o papel dos genes na \netiologia da endometriose, no entanto, nenhum deles estudou a relação do gene ID2 com a \nendometriose utilizando a técn ica da PCR em tempo real. Sabemos da importância desta \nanálise, já que o comportamento dos genes no endométrio eutópico e ec tópico de mulheres \ncom e sem endometriose pode nos ajudar a entender a base biológica desta patologia.  \nNão houve diferença significativa entre a expressão do gene ID2 no endométrio de \nmulheres sem endometriose com o endométrio de  mulheres com endometriose, este resultado \né uma evidência da influência do meio peritoneal na expressão deste gene. \nEm um trabalho prévio do nosso grupo que comparou endométrio eutópico com \nectópico de mulheres com endometriose utilizan do a técnica de hibridação subtrativa (Meola \net al., 2010) este gene foi encontrado como “up-regulated”. \nAs proteínas ID alteram componentes do ciclo celular normalmente envolvidos no \nmecanismo que regula sua progressão (Lasorella  et al., 1996; Arnold et al., 2001). Um dos \ngenes também envolvidos na regulação do ci clo celular é o gene do retinoblastoma ( RB), um \nsupressor tumoral que regula negativamente o ci clo celular através da sua habilidade de se \nligar ao fator de transcrição E2F e reprimir a transcrição de genes necessários para a fase S do \nciclo celular (Hanahan e Wei nberg, 2000). Super-expressão de ID2 inativa pRb e também \nanula a atividade inibitória do ciclo celular das p107 e p130 relacionadas a pRb (Barone et al., \n1994). \nGoumenou et al. (2006), utilizando a técni ca de imunohistoquímica analisaram se há \ndiferença de expressão da s proteínas p16, pRb e ciclina D1 em endometriomas e \nadenomiomas. Demonstraram que p16 e pRb te m um importante papel na regulação do \ncrescimento celular em adenomiomas e e ndometriomas, respectivamente. Os nossos \n\nManuscrito  |  76 \nresultados evidenciaram uma maior expressão do gene ID2 nos endometriomas, e, como sua \nsuperexpressão pode inibir o pa pel de supressor tumoral do pR b em células cancerosas pode \nser que na endometriose eles também atuem nessa mesma via. \nO protooncogene MYC ( v-myc avian myelocytomatos is viral oncogene homolog ) \ncodifica um fator de ligação ao DNA que pode ativar e reprimir a transcrição. Por este \nmecanismo, MYC regula a expressão de numerosos ge nes alvos que controlam importantes \nfunções celulares, incluindo crescimento e progressão do ciclo celular. O gene ID2 é um alvo \ndo gene MYC (Lasorella et al., 2000), em linhagens celulares de neuroblastomas a expressão \nde ID2 é induzida por N-MYC (Wang et al., 2003). \nMeola et al.(2010), usando a técnica de bib lioteca subtrativa identificaram 291 genes \ndesregulados em lesões endometrióticas, entre eles o  gene MYC foi encontrado como “ dow-\nregulated” em endométrio ectópico comparado ao eu tópico de mulheres com endometriose. \nEles concluíram que essa desregulação pode se r responsável pela perda de homeostase nas \nlesões endometrióticas. Johnson et al (2005)  encontraram expressão mais alta de MYC no \nendométrio eutópico de mulher es com endometriose quando comparado ao endométrio de \nmulheres normais. Os dados relacionados à regulação e função de MYC são controversos na \nliteratura. Embora não tenhamos analisado a expressão do gene MYC, ele pode estar \nenvolvido na regulação do gene ID2 nas lesões endometrióticas avaliadas. \nEste gene pode sofrer influência  do meio peritoneal. O gene ID2 está envolvido em \nalgumas vias de regulação do cr escimento e manutenção de tumores, que são características \ncomuns a endometriose. Na endometriose pode ser que ele atue reprimindo o gene Rb que é \num supressor tumoral. A busca incessante por mecanismos relacionados à expressão de genes \npresentes em comportamentos biológicos envolv idos com a etiopatoge nia da doença, poderá \nfuturamente indicar marcadores moleculares,  permitindo um diagnóstico menos invasivo e \ncom possíveis aplicações terapêuticas.  \n\nManuscrito  |  77 \nAGRADECIMENTOS \nOs autores agradecem as pacientes pela participação neste estudo; a equipe \nmultidisciplinar do Grupo de Reprodução Huma na do Departamento de Ginecologia e \nObstetrícia da FMRP-USP, pela coleta das amostras; e ao Laboratório de Oncologia \nPediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura da FMRP-USP pelo suporte técnico. \n \nBIBLIOGRAFIA \nARNOLD, J. M., MOK, S. C., PURDLE, D., CHENEVIX-TRENCH, G. Decreased \nexpression of the ID3 gene at 1p36.1  in ovarian adenocarcinomas. Br. J. Cancer, 84:352–59, \n2001. \nBARONE, M. V., PEPPERKOK, R ., PEVERALI, F. A., PHILIPSON, L. Id proteins control \ngrowth induction in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. 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Como controle (C) foi coleta do 16 amostras de endométrio \nde mulheres sem endometriose, na mesma fase do ciclo menstrual. A análise da expressão foi \nfeita através da PCR em tempo real. Nas análises realizadas com todas as lesões \nendometrióticas juntas o SMOC2 foi mais expresso na lesão (peritônio e ovário) quando \ncomparado ao endométrio de mulheres com e ndometriose. Já quando a análise foi realizada \nseparando-se as lesões, o gene PRELP foi mais expresso na lesão peritoneal. Não houve \ndiferença significativa na  expressão dos genes PRELP e SMOC2  entre o endométrio de \nmulheres sem endometriose e o endométrio de mulheres com endometriose, e também quando \nse analisou os estádios da endometriose. Acredita-se que o ambiente peritoneal possa \ninfluenciar na expressão dest es genes na endometriose. É possível que a desregulação dos \ngenes estudados permita o desenvolvimento e manutenção do tecido ectópico, pois estes \ngenes participam de forma direta ou indireta em processos celulares relacionados à arquitetura \ndo citoesqueleto, e que alterações na homeost ase celular podem levar a características de \nmigração celular, angiogênese e invasão inapropriadas.  \n \n\nManuscrito  |  81 \nINTRODUÇÃO \nEndometriose é uma doença benigna, estróge no-dependente associada com dor pélvica e \ninfertilidade e é caracterizada pela distribuição ectópica de tecido endometrial, principalmente \nno peritôneo pélvico e ovário (Eskenazi e Warner, 1997). Ela afeta de 10 a 15 % das mulheres \nem idade reprodutiva e, 35 a 50% das mulheres  com infertilidade, dor pélvica ou ambos \n(Cramer e Missmer, 2002; Giudice e Kao, 2004). \nAcredita-se primariamente que a endometriose ocorra devido à menstruação retrógada \ne implante de células endometriais na cav idade abdominal (Sampson, 1927). Entretanto, \nalgumas características moleculares parecem fa vorecer o início e progr essão da implantação \nectópica e talvez explique porque somente algum as mulheres desenvolvem a doença (Viganò \net al., 2006). Na última década, vários estudos de perfil de expressão gência tem demonstrado \nque muitos genes são desregulados na e ndometriose (Guo, 2009). A identificação de \ndiferenças molecular no endométrio eutópico de mulheres com endometriose é um importante \npasso no entendimento da patoge nese e para o desenvolvimento de novas estrat égias para o \ntratamento da infertilidade e dor associada (Burney et al., 2009). \nA etiologia da endometriose envolve fatores que influenciam no seu estabelecimento e \nprogressão, incluindo hormonais (Nyholt et al., 2009), imunes (Weiss et al.,2009), alterações \nambientais (Guo, 2009) e predisposição genética  (Juo et al., 2006) e apesar de ser uma das \ndoenças mais estudadas em ginecologia (Uluku s et al., 2009), sua etiologia ainda não está \nclara e várias são as teorias atuais para explicá-la (Carvalho et al., 2011). \nVários trabalhos tem focado nas difere nças da expressão gênica entre lesão \nendometriótica e endométrio eutópico. Há ta mbém diferenças conhecidas em expressão \ngênica no endométrio eutópico de mulheres com endometriose comparada com endométrio \ncontrole de mulheres se m a doença (Burney et al.,  2007). Não é conhecido, entretanto, se a \n\nManuscrito  |  82 \nexpressão gênica alterada no endométrio eutó pico é devido a alguma diferença inerente a \nexpressão gênica entre pacientes e controles, ou alternativamente, se a existência de lesões \nendometrióticas gera um ambiente peritoneal alterado que age no endométrio eutópico e então \nresulta em expressão gênica aberrante (Pelch et al.,  2010). Assim estudos comparativos entre \no endométrio de mulheres sem endometriose (controle) e o endométrio eutópico e ectópico de \nmulheres com endometriose podem esclare cer alterações precoces e necessárias ao \ndesenvolvimento da doença. \nA busca incessante por mecanismos relacionados à expressão de genes presentes em \ncomportamentos biológicos envolvidos com a etiopatogenia da doença, poderá futuramente \nindicar marcadores moleculares, permitindo um  diagnóstico menos invasivo e com possíveis \naplicações terapêuticas. \nEm humanos, o gene PRELP[(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)] \nestá mapeado no cromossomo 1q32 sendo codi ficado por três éxons (Grover et al.,  1996). Tal \ngene codifica a proteína prol argina que é rica em leucina e apresenta uma região amino-\nterminal rica em resíduos de prolin a e arginina (Bengtsson et al., 2002).  Uma das principais \ncaracterísticas desta proteína  é sua localização relativamen te restrita aos tecidos \ncartilaginosos, onde sua expressão é abundante no adulto e deficiente no feto e recém-nascido \n(Melching e Roughley, 1990;  Grover et al., 1996).  Além da cartilagem, o gene PRELP foi \nencontrado expresso em outros tecidos tais como rim, pele e tendão (Heinegard et al., 1986).  \nEste gene pertence a uma família de proteínas de repetição rica em leucina (LRR) \n(Kobe e Deisenhofer, 1994). As LRR dos teci dos conectivos provavelmente agem na \nregulação da montagem da matriz e fornecem  ligações entre as principais estruturas \nconstituintes (Iozzo, 1997; Ho cking, Shinomura e McQuilla n, 1998). A presença de 10 \nrepetições centrais ricas em leucina coloca o PRELP na mesma sub-família das pequenas \nproteoglicanas ricas em leucina (SLRPs) – decorin, biglican, fibromodulin, lumican e \n\nManuscrito  |  83 \nkeratocan (Iozzo e Murdoch, 1996; Hocking et al., 1998). O envolvimento dos membros desta \nfamília na fibrilogênese do colágeno, crescime nto celular, diferenciação e migração revelam \nsua importância na modelagem da matriz extracelular (Tasheva, Klocke e Conrad, 2004). \nBaseado nesta estrutura, PRELP talvez func ione como uma molécula de ligação na \nmatriz, interagindo com outras proteínas da matr iz extracelular através dos seus LRRs e com \nglicosaminoglicanos através de seu domínio  amino-terminal. Desde que muitas células \ncontem sulfato de heparina na sua superfíc ie, PRELP pode ligar as células à matriz \n(Heinegard et al., 1986; Sommarin e Heinegard, 1989).  \nO gene SMOC2 [(SPARC related modular calcium binding 2)]  humano foi descrito, \nem 2002, com o nome de Smap2 ( smooth muscle associated protein 2 ) associado com \nmúsculo liso e super expresso durante a formação da neointima em rato (Nishimoto et al., \n2002). Sua estrutura foi elucidada por análise de um contig (sequências sobrepostas de DNA) \n(NT 007302) originária de uma seqüência do cromossomo 6. Este gene está mapeado no 6q27 \ne abrange cerca de 226kb. Sua região codificad ora consiste de 13 éxons. Cada domínio do \nSMOC2 é codificado por um ou mais éxons e os limites do domínio coincidem com locais de \nsplicing (Vannahme et al., 2003). \nEste gene é expresso principalmente na matriz extracelular e codifica a proteína \nmatricelular SMOC2 que pertence à família da proteína SPARC ( secreted protein, acidic, \ncysteine-rich), altamente expressa durante a embriogênese e na cicatrização SMOC2 é \nexpresso em quase todos os tecidos, sendo mais  expresso no coração, músculo liso, baço e \novário (Vannahme et al., 2003; Rocnik et al., 2006). \nProteínas matricelulares influenciam uma variedade de funções celulares incluindo \nsinalização de fator de crescimento, mi gração, adesão, cicatrização, angiogenese e \nproliferação celular. A proteína SMOC2 promov e a montagem da matriz e pode estimular a \n\nManuscrito  |  84 \nproliferação e a migração de células endoteliais, bem como atividade de angiogênese (Sage et \nal., 2003; Rocnik et al., 2006).  \nEstudos in vitro mostram que SMOC2 interage com integrinas αvβ1 e αvβ6 (Maier et \nal., 2008) e mantém a integrina ligada a quinase (ILK – integrin linked kinase) ativa durante a \nfase G1 do ciclo celular, contribuindo para a progressão do mesmo (Liu et al., 2008).  \nEstes dados sugerem que SMOC2 pode mediar a interação entre integrinas e a matriz \nextracelular e contribuir para sinalização do se u efetor intracelular, ILK. Outros ensaios \nmostram que SMOC2 media os efeitos mitogênicos e a ngiogênicos de VEGF, PDGF e FGF, \nsugerindo assim que SMOC2 pode mediar interações entre estes fatores de crescimento e seus \nreceptores, ou agir em paralelo, via sinérgica (Rocnik et al.,2006; Liu et al., 2008).  \nA análise da expressão dos genes estudados ainda não foi realizada através da técnica \nde PCR em tempo real em lesões endometriót icas, bem como em endométrio eutópico de \nmulheres com e sem endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual. A proliferação das \ncélulas endometrióticas deve ocorrer para que as mesmas cresçam e se estabilizem, entretanto, \nnão está claro se há diferenças na proliferação  entre lesões endometrióticas e tecido eutópico \n(Wingfield et al., 1995; Nisolle, Casanas-Roux e Donnez, 1997). O objetivo deste trabalho foi \nanalisar a expressão dos genes  PRELP  e SMOC2 em endométrio de mulheres sem \nendometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual e compará-la a expressão gênica em \nendométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometrio se na mesma fase do ciclo \nmenstrual. \n \nMATERIAL E MÉTODOS \nEste trabalho foi realizado no Laborat ório de Biologia da Reprodução do \nDepartamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de \n\nManuscrito  |  85 \nMedicina de Ribeirão Preto da Universi dade de São Paulo (HCFMRP-USP) e foi aprovado \npelo Comitê de Ética em Pesquisa do mesmo hospital (n o 2204/2010) e processo HCRP n o \n9699/2006 (banco de tecidos  de endometriose) . Todas as pacientes as sinaram o termo de \nconsentimento livre e esclarecido.  \nAMOSTRAS \nForam coletadas amostras de endométrio e lesão endometriótica de 20 pacientes com \nidade entre 18 e 40 anos, não menopausadas, na fase proliferativa do ciclo menstrual, sem uso \nde qualquer terapia hormonal há pelo menos seis meses antes da coleta, atendidas por \ninfertilidade e/ou dor pélvica no s ambulatórios de dor pélvica cr ônica (AGDP) e Infertilidade \nConjugal (AEST) do HCFMRP submetidas à la paroscopia com diagnóstico laparoscópico e \nhistológico de endometriose. As biópsias de endométrio e amostr as de lesões endometrióticas \nperitoneais e ovarianas foram colhidas durante a laparoscopia através de Cureta de Novak. \nForam avaliadas amostras teciduais pareadas  de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio de \nmulheres com lesão peritoneal e lesões endomet rióticas peritoneais e 10 de endométrio de \nmulheres com endometrioma e lesões endometri óticas ovarianas. O esta dio da endometriose \nfoi determinado de acordo com a classificação da American Society for Reproductive \nMedicine (American Society for Reproductive  Medicine, 1997). Das 20 biópsias de \nendométrio ectópico 10 eram lesões peritoniais (s eis vermelhas, quatro negras), sendo três em \nestádio I, quatro em estádio II, duas em estádio III e uma em  estádio IV e 10 corresponderam \na lesões ovarianas (endometrioma ovariano) quatro em estádio III e seis em estádio IV. \nComo controle foi coletado 16 amostr as de endométrio de mulheres sem \nendometriose, padronizadas de acordo com a fase  do ciclo menstrual em fase proliferativa, \nconfirmado por critérios de data ção histológica. Es te grupo foi composto por pacientes com \nidade entre 18 e 40 anos, no menacme, que foram submetidas à laparoscopia para laqueadura \ntubária pelo serviço de Endoscopia Ginecológica, com confirmação laparoscópica da ausência \n\nManuscrito  |  86 \nde lesões endometrióticas, que estavam sem uso de medicação hormonal há pelo menos seis \nmeses antes da coleta. A biópsia endometrial foi colhida através de Cureta de Novak, durante \no procedimento cirúrgico. \n \nEXTRAÇÃO DO RNA TOTAL \n As amostras foram lavadas em so lução de PBS (1x) (NaCl 8,50g/L; Na 2HPO4 \n1,11g/L; Na 2HPO4.12H2O 2,81g/L; KH 2PO4 0,20g/L pH7,0) para retirar o criopreservador \ndos tecidos. Em seguida, o RNA total (50mg de tecido) foi extraído com TRIZOL ®  Reagent \n(Invitrogen Life Technologies , Paisley, UK) de acordo com as instruções do fabricante. As \nconcentrações de RNA total foram medidas em  espectrofotômetro a densidade óptica de \n260nm. O RNA permanece armazenado à -800C para procedimentos posteriores. \n \nSÍNTESE DO CDNA  \n Um micrograma de RNA total de cada amos tra foi transcrito reversamente usando o \nHigh Capacity cDNA Archive Kit (A pplied Biosystems, Warrington, UK)  segundo as \ninstruções do fabricante. \n \nQ\nUANTIFICAÇÃO POR PCR EM TEMPOS REAL \nAs sondas e os primers para os genes PRELP (Hs00160431_m1), SMOC2 \n(Hs00405777_m1) e para os genes de referência da reação GAPDH (g lyceraldehyde-\n3phosphate dehydrogenase) (Hs99999905_ml) e ACTB (actin, beta) (Hs99999903_ml) foram \nobtidos usando Assay-on-Demand™ Gene Expression  Products (Applied Biosystems, \nWarrington, UK), e as quantificações foram realizadas no aparelho ABI PRISMTM 7500FAST \nSequence Detection Systems  ( Applied Biosystems, Warrington, UK ). O nível de expressão \nrelativo para os genes analisados foi calculado para cada amostra de acordo com o método de \n\nManuscrito  |  87 \n2-∆∆CT (ou 2-Ct), descrito previamente no Applied Biosystems User Bulletin # 2 (PN 4303859) \n(Applied Biosystems, Warrington, UK ). Um pool de cDNA das amostras controles foi \nutilizado como calibrador nas análises. \n \nANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS \nAs análises estatísticas foram realizadas no software SAS 2003 (2002-2003, SAS \nInstitute Inc ., Cary, NC, USA). Aplicamos o Test e Welch’s ANOVA não pareado para \ncomparar: [1] endométrio de mulheres sem endometriose com endométrio de mulheres com \nendometriose; [2] estádios das lesões de mulher es com endometriose na fase proliferativa do \nciclo menstrual. Teste T pareado para comparar  as médias de expressão dos genes obtidas \nentre: [3] endométrio eutópico e ectópico de 10 mulheres com endometriose peritoneal na fase \nproliferativa do ciclo menstrual e 10 mulheres com endometriose ovariana na mesma fase do \nciclo menstrual; [4] endométrio eutópico de  mulheres com endometriose e endométrio \nectópico de mulheres com endo metriose (lesão peritoneal + endometrioma ovariano). Todos \nos testes foram realizados conforme os procedimentos GLM. \n \nRESULTADOS \nNão houve diferença significativa entre a expressão dos genes PRELP e SMOC2 no \nendométrio de mulheres sem endometriose co m o endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose (Figura 1). \n\nManuscrito  |  88 \nPRELP\nC EU\n0\n20\n40\n60\n802-Ct\nPeritoneal + Ovariana\nX\n*P=0,6607\nSMOC2\nC EU\n0\n5\n10\n15\n202-Ct\nPeritoneal + Ovariana\n*P=0,7956\nX\n \nFigura 1 – Análise da expressão dos genes PRELP e SMOC2 entre endométrio de mulheres \nsem endometriose com endométri o eutópico de mulheres com endometriose, sem diferença \nsignificativa para P <0,05. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - quantificação relativa. C= endométrio de mulheres \nsem endometriose; EU= endométrio eutópico de mulheres com endometriose. \n \nA análise das amostras pareadas resu ltou em uma maior expressão do gene PRELP na \nlesão peritoneal com P<0,05 comparada ao endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose peritoneal (Figura 2).  \nPRELP\nEU EC EU EC\n0\n5000\n10000\n15000\n* P=0,0033\nOvariana\nPeritoneal\n2-Ct\nXX\n \nFigura 2 – Análise da  expressão do gene PRELP entre endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose peritoneal e o e ndométrio ectópico. 2-Ct = 2 -∆∆Ct - método para quantificação \nrelativa. EU= endométrio eutópico de mulher es com endometriose EC= endométrio ectópico \nde mulheres com endometriose. \n \n \n\nManuscrito  |  89 \nDISCUSSÃO \n \nEstudos comparativos da expressão gêni ca entre o endométrio de mulheres sem \nendometriose (controle) e o endométrio eutópico  e ectópico de mulheres com endometriose \nsão importantes para identificar se o aument o da expressão gênica já está presente no \nendométrio dessas mulheres ou se essa expressã o só é alterada quando este tecido cai na \ncavidade peritoneal e adquiri um potencial para se transformar em lesões endometrióticas. \nNão houve diferença significativa entre a expressão dos genes PRELP e SMOC2 no \nendométrio de mulheres sem endometriose co m o endométrio eutópico de mulheres com \nendometriose. Este resultado é uma evidência da  influência do meio pe ritoneal na expressão \ndestes genes. \nO gene PRELP faz parte da família das pequenas proteoglicanas ricas em leucina e \nestas macromoléculas tem papéis cruciais na montagem da matriz extracelular (Hocking; \nShinomura e McQuillan, 1998; Ameye e Young, 2002). Proteínas da matriz (colágeno, \nfibronectina, laminin) são responsáveis pela sinalização relacionada à proliferação (Bates; \nLincz e Burns, 1995), migração (Iivanainen et  al., 2003), diferenciação(Watt, 2002) ou \napoptose (Hock et al., 2001) de  muitos tipos de células duran te o processo fisiológico e \npatológico (Kupiec-Weglinski et al., 1993 Pupa et al., 2002). Isto  sugere que na endometriose \nproteínas da matriz talvez seja m responsáveis por atrapalhar ta is funções fisiológicas do \nendométrio como secreção (Gottschalk et al ., 2000), implantação (Selam et al., 2002) e \nmenstruação (Abrahamson et al., 1986; Koks et al., 2000). \nZhao et al. (2011), examinaram a presença de SNPs próximos aos alvos de 22 miRNA, \npreviamente estudados por Ohlsso n Teague et al (2009), dentre os 102 SNPs analisados em \nmulheres com endometriose e controle, o SNP para o gene PRELP (rs7542469) foi \nencontrado no grupo controle, não sendo rela cionado com a endometriose. Embora na \n\nManuscrito  |  90 \nliteratura prévia o gene PRELP não esteja relacionado a endometriose, nossos resultados da \nanálise da expressão por PCR em tempo real, demonstraram uma maior expressão deste gene \nem lesões peritoneais. Este resultado pode  estar relacionado a alterações no ambiente \nperitoneal responsáveis pela transformação do endométrio em lesão endometriótica. \nNas análises realizadas com todas as lesões endometrióticas juntas, o gene SMOC2 foi \nmais expresso na lesão (endometrioma e pe ritoneal) quando comparado ao endométrio \neutópico de mulheres com endometriose  \nEste resultado corrobora com os achados por Eyster e et al. (2007) que analisaram o \nmodelo de expressão gênica em endométrio ectópico e eutópico de 11 pacientes para \nidentificar possíveis famílias de genes envolvi das na endometriose. Neste screening, dos 717 \ngenes analisados, o gene SMOC2, dentre outros, foi encontra do como mais expresso nas \nlesões endometrióticas (endometrioma e peritoneal) em relação ao endométrio eutópico. Visto \nque a PCR em tempo real é o padrão ouro para quantificação de expressão gênica é possível \nque o SMOC2 possa estar relacionado a vias de  desenvolvimento da endometriose \nparticipando diretamente do desenvolvimento da mesma.  \n \nAGRADECIMENTOS \nOs autores agradecem as pacientes pela participação neste estudo; a equipe \nmultidisciplinar do Grupo de Reprodução Huma na do Departamento de Ginecologia e \nObstetrícia da FMRP-USP, pelas coleta das amostras; e ao Laboratório de Oncologia \nPediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura da FMRP-USP pelo suporte técnico. \n \n\nManuscrito  |  91 \nBIBLIOGRAFIA \nABRAHAMSON, D. R. Recent studies on th e structure and pathology of basement \nmembranes. J Pathol, 149:267–78, 1986. \nAMEYE, L. e YOUNG, M. F. Mice deficient in small leucine-rich pr oteoglycans: novel in \nvivo models for osteoporosis, osteoarthritis, Ehlers-Danlos syndrome, muscular dystrophy, \nand corneal diseases. 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