Expressão de quimiocinas regulatórias das células Natural Killer e T-reguladoras em pacientes com endometriose profunda

Endometriosis is a highly prevalent inflammatory condition associated with an altered immune response in the peritoneal cavity and uterus. Evidence suggests a participation of inflammatory mediators such as natural killer (NK) and T -regulatory (T -reg) cells in the pathogenesis of this disease while the response of these cells may b e controlled by the activity of some chemokines. Patients and Methods : Gene expressions of the chemokines that regulate the activity of NK (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 and CX3CL1) and T -reg cells (CCL17 and CCL21) were evaluated using real time polymerase chain reaction (PCR) in the eutopic and ectopic endometrium of 22 patients with bowel endometriosis, 10 patients with retrocervical endometriosis and 32 controls.

Of the chemokin es associated with NK cells, the expression of CX3CL1 and CXCL12 was significantly greater in the foci of endometriosis (p<0.05). Of those associated with T -reg cells, significant differences between groups were found in CCL17. In addition, CCL17 was expressed to a higher degree in the eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid lesions when compared to the other groups (p<0.05).

Chemokines CX3CL1 and CXCL12 were more expressed in intestinal endometriosis and CCL17 expression was h igher in eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid lesions. These results suggest that those chemokines participate in the inflammatory response that occurs in pelvic endometriosis. Descriptors: endometriosis; N atural Killers cells; T regulatory limphocytes; chemokines; endometrium. 1 1. INTRODUÇÃO 2 Endometriose representa uma afecção ginecológica comum, que atinge de 10 a 15% das mulheres no período reprodutivo e até 50% das mulheres com dor pélvica crônica e/ou infertilidade (Viganò, et al., 2004; Bellelis, et al., 2010) . Estima -se que o número de mulheres com endometriose seja de 7 milhões nos Estados Unidos da América e de mais de 70 milhões no mundo . Em países industrializados, é uma das principais causas de hospitalização ginecológica (Vercellini, et al., 2007). Esta doença é definida como a implantação de estroma e/ou epitélio glandular endometrial em localização extrauterina (Gao, et al., 2006) , podendo comprometer diversos locais, entre eles ovários, peritôn io, ligamentos útero ssacros, região retrocervical, septo retovaginal, retossigmóide, íleo terminal, apêndice, bexiga e ureteres (Vinatier, et al., 2001; Abrao, et al., 2006; Vercellini, et al., 2007; Podgaec, et al., 2008). Nisole e Donnez, em 1997 , dividiram esta doença em três afecções distintas: peritoneal, ovariana e de septo retovaginal, sendo esta última chamada de endometriose inf iltrativa profunda (Cornille, et al., 1990) . No primeiro caso, estariam incluídas as pacientes com implantes superficiais; no segundo os cistos ovarianos típicos da doença e no terceiro caso, a endometriose infiltrativa com lesões com 5mm ou mais de espessura que podem acometer as regiões retro e paracervical, de fórnice vaginal e vagina, além dos tratos gastrointestinais e urinário. Apesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia (Ulukus, et al., 2009) , alguns aspectos continuam sendo alvo de pesquisa, destacando-se a busca pela etiopatogenia (Abrao, et al., 2006; Podgaec,et al., 2008 ; Ascien & Velasco, 2013 ). Duas correntes principais de hipóteses etiopatogênicas são citadas há quase um século: a t eoria da metaplasia celômica (Meyer, 1919) e a da menstruação retrógrada (Sampson, 1927) . Esta segunda teoria seria possível por influência de um ambiente hormonal favorável e de f atores imunológicos que não eliminariam as células endometriais da cavidade peritoneal (Harada, et al., 2001; Podgaec, et al., 2007; Berbic & Fraser, 2013). 3 Pacientes portadoras de endometriose podem ser assintomáticas ou apresentarem queixas clínicas em diferentes intensidades, sendo as principais dismenorr éia, dor pé lvica crônica, infertilidade, dispareunia de profundidade e sintomas intestinais e urinários cíclicos, como dor ou sangramento ao evacuar ou urinar durante o período menstrual. A demora do diagnóstico da endometriose pode ser explicada pela inespecificidad e do quadro clínico e, eventualmente, pela falta de correlação entre sintomas e gravidade da doença ( Arruda, et al., 2003; Hemmings, et al., 2004; Kashima, et al., 2004; Heilier, et al., 2007). Considerações gerais sobre os aspectos imunológicos Nos últimos anos, muito tem se estudado acerca dos fatores imunológicos na patogênese da endometriose e muitas anomalias foram encontradas (Berkkanoglu and Arici, 2003; Podgaec, et al., 2007; Fairbanks, et al., 2009 ; Berbic & Fraser, 2013 ), sendo que o principal mecanismo avaliado é complem entar à teoria da menstruação retrógrada. Por algum motivo, ainda indeterminado, as células endometriais que adentra ram à cavidade endometrial não seriam eliminadas e deste modo, seria permitido a elas se implantarem e desenvolverem a doença (Harada, et al., 2001; Berbic & Fraser, 2013). As células que caem na cavidade abdominal deveriam ser identificadas como antígenos e serem submetidas à resposta imune local. Algumas células, como os macrófagos, funcionam como apresentadoras de antígenos aos linfócitos T através do complexo de histocompatibilidade principal (CHP). O CHP pode s er classe I ou II, sendo que no primeiro caso atrai os linfócitos T citotóxicos e no segundo os lintócitos T helper (auxiliadores). Os citotóxicos secretam substâncias letais que provocam a morte da célula -alvo e os T -helper secretam citocinas que induzem mecanismos e fatores que podem levar à morte celular (Abbas, et al., 2011). Deste modo, existem dois tipos de resposta imune: a inata e a adaptativa ou adquirida. Em um dos mecanismos da resposta inata,q uando um antígeno invade o organismo, um grupo de células tenta destruí -lo po r 4 meio da fagocitose. Estas células podem ser monócitos, macrófagos, neutrófilos e/ou células Natural Killer . Este tipo de reconhecimento é inespecífico, pois as células fagocitam vários tipos de micro -organismos e fazem parte d a primeira linha de defesa do organismo . Já a adaptativa, é uma resposta específica e conta com a atuação dos linfócitos, que reconhecem o patógeno invasor (Abbas, et al., 2011). Existem vários tipos de linfócitos, dentre os quais destacam -se os linfócitos B, que produzem anticorp os que se ligam ao antígeno para eliminá- lo, os linfócitos T, que estão envolvidos na produção de linfócitos B, auxiliam na fagocitose, atuam na eliminação antigênica e na replicação da resposta imune e as células NK que não apresentam em sua superfície ma rcadores que são encontrados nas células B, nem os que caracterizam as células T. No sangue circulante, 10 -15% dos linfócitos são NK. Estas, por sua vez, atacam as células neoplásicas e células infectadas por vírus sem necessidade de estímulo prévio. (Robertson, 2002; Abbas, et al., 2011) . Nesse tópico, o balanço entre imunidade e tolerância é impo rtante para manter a homeostase imune, onde muitos mecanismos são utilizados para manter a resposta imune sob controle, incluindo -se a atividade das células Natural Killer (NK) e T-reguladoras (T-reg) (Ota, et al., 2002; Qin, et al., 2008; Engel and Kronenberg, 2012) e do importante papel de outros mediadores da resposta imune como as quimiocinas (Clore and Gronenborn, 1995; Rollins, 1997). Quimiocinas As quimiocinas são uma grande família de citocinas estruturalmente homólogas, de aproximadamente 8 a 12kD , que estimulam o movimento dos leucócitos (quimiocinese) e regulam a migração destes do sangue para os tecidos (quimiotaxia) sendo, portanto, citocinas quimiotáticas (Clore and Gronenborn, 1995; Rollins, 1997). As citocinas, por sua vez, são mensageiros do sist ema imunológico. Correspondem a um extenso grupo de moléculas que atuam emitindo sinais entre as células durante o desencadeamento da resposta imune, atuando em diferentes etapas desta resposta (Abbas, et al., 2011). As quimiocinas envolvidas em reações inflamatórias são produzidas 5 por leucócitos em resposta a estímulos externos e as quimiocinas que regulam o tráfego celular entre os tecidos são produzidas e constituídas por várias células, como endotélio, fibroblastos e megacariócitos (Moser and Loetscher, 2001; Abbas, et al., 2011). As moléculas da estrutura das quimiocinas possuem duas alça s internas de dissulfeto e são divididas em duas subfamílias dependendo da posição de seus resíduos de cisteína aminoterminais imediatamente adjacentes ( cys-cys) ou separados por um aminoácido ( cys-X-cys). Estas diferenças se correlacionam com a organizaçã o de duas subfamílias principais (CC e CXC) em aglomerados separados de genes. Cada subfamília possui seu próprio receptor e tem funções diferenciadas uma da outra. As quimiocinas CXC são quimiotáxicas para neutrófilos, enquanto a s CC não agem neste último grupo celular, mas atraem monócitos, basófilos e linfócitos. Uma terceira família tem como única representante a fractalquina (CX3CL1), em que a característica estrutural é a presença de duas cisteínas separadas por três aminoácidos (CX3C) e tem por funçã o a quimiotaxia de linfócitos T e monócitos, além de promover a adesão de leucócitos com células endoteliais. Finalmente, a quarta família, que tem dois representantes, a linfotactina  (XCL1) e linfotactina  (XCL2), possui uma única cisteína (família C) que promove a atração de células T. Esta classificação foi realizada pela International Union of Immunological Societies/World Health Organization Subcommittee on Chemokine Nomenclature (Bacon, et al., 2003). Quimiocinas atuam por meio de receptores trans -membranas de alta afinidade expostos na superfície de células circulantes. Onze receptores diferentes para quimiocinas CC (chamadas CCR1 a CCR11) e seis para quimiocinas CXC (chamadas CXCR1 a CXCR6) foram identificados (Moser and Loetscher, 2001; Raman, et al., 2011) . Os receptores de quimiocinas possuem sítios de ligação que podem ser específicos (CCR9, CXCR6), mas, comumente, o mesmo receptor pode ser alvo de ligação de várias quimiocinas do mesmo grupo (Tabela 1 -Gonçalves, et al., 2007). 6 Os receptores de quimiocinas são expressos em leucóci tos, com o maior número de receptores diferentes vistos em linfócitos T. A expressão dos receptores de quimiocinas pode definir subtipos de linfócitos T , como Th1, Th2, Th17 ou mesmo Treg (Ekman, et al., 2013). Além disso, linfócitos T periféricos maduros expressam diferentes receptores de quimiocinas dependendo do seu fenótipo funcional. Estas diferenças determinam, em parte, o tipo de resposta imune que irá se desenvolver em um sítio de inflamação (Sallusto, et al., 1998; Bacon, et al., 2003; Ekman, et al., 2013). 7 Tabela 1 - Quimiocinas humanas identificadas até o momento – modificado e atualizado de Gonçalves R, Teixeira A, Campos W and Orefice F. O papel das quimiocinas nas uveítes. 2007 Arq Bras Oftalmol pp. 363-370. Família Quimiocina Nome Original Receptores Localização no Gene CXC CXCL1 GRO / MIP-2 CXCR2 24q21 CXCL2 GRO  CXCR2 4q21 CXCL3 GRO  CXCR2 4q21 CXCL4 PF-4 CXCR3 4q21 CXCL5 ENA-78 CXCR2 4q21 CXCL6 GCP-2 CXCR2 24q21 CXCL7 NAP-2 CXCR2 4q21 CXCL8 IL-8 CXCR2+CXCR1 24q21 CXCL9 MIG CXCR3 4q21 CXCL10 IP-10 CXCR3 4q21 CXCL11 I-TAC CXCR3 4q21 CXCL12 SDF-1 CXCR4 10q11.21 CXCL13 BCA-1 CXCR5 4q21 CXCL14 BRAK Não determinado 5q31.1 CXCL15 Lungkine Não determinado Não determinado CXCL16 CXCL16 CXCR6 17p13 CC CCL1 I-309 CCR8 17q11 CCL2 MCP-1 CCR2 17q12 CCL3 MIP-1 CCR1, CCR5 17q12 CCL4 MIP-1 CCR5 17q12 CCL5 RANTES CCR5 17q12 CCL6 C10 Não determinado Não determinado CCL7 MCP-3 CCR1, CCR2, CCR3 17q11 CCL8 MCP-2 CCR3, CCR5 17q11 CCL9 MIP-1 Não determinado Não determinado CCL10 CCL10 Não determinado Não determinado CCL11 Eotaxin CCR3 17q11 CCL12 MCP-5 CCR2 Não determinado CCL13 MCP-4 CCR2, CCR3 17q11 CCL14 HCC-1 CCR1, CCR5 17q12 CCL15 HCC-2/MIP-1/Leotactin-1 CCR1, CCR3 17q12 CCL15 HCC-4/LEEC CCR1, CCR2 17q12 CCL17 TARC CCR4 16q13 CCL18 PARC/DC-CK1 Não determinado 17q12 CCL19 MIP-3/ELC CCR7 9p13.3 CCL20 LARC/MIP-3 CCR6 2q36.3 CCL21 SLC/6Ckine CCR7 9p13.3 CCL22 MDC CCR4 16q13 CCL23 MPIF-1 CCR1 17q12 CCL24 Eotaxin-2/MPIF-2 CCR3, CCR5 7q11 CCL25 TECK CCR9 19q13.3 CCL26 Eotaxin-3 CCR3 7q11 CCL27 ESkine/MCC/Ctack CCR10 9p13.3 CCL28 MEC CCR3, CCR10 5p12 XC XCL1 Linfotactina  XCR1 1q24 XCL2 Linfotactina  XCR1 1q24 CX3C CX3CL1 Fractalkine CX3CR1 16q13 8 Após serem ativados pelas quimiocinas, os receptores das quimiocinas iniciam uma complexa cascata de sinalização que leva à ativação de moléculas de integrina na superfície celular. As integrinas são moléculas essenciais para que ocorra a adesão das células de defesa aos tecidos envolvidos nos processos inflamatórios (Cameron and Kelvin, 2003). Além das funções como agente quimiotático de linfócitos, os estudos com as quimiocinas e seus receptores revelaram outros importantes papéis para estas moléculas, como a sua relação com metástases tumorais e, contraditoriamente, a inibição do crescimento de células tumorais, assim como infecções e doenças autoimunes, como artrite reumatóide e esclerose múltipla (Loetscher and Moser, 2002; Dong, et al., 2003; Raman, et al., 2011). As quimiocinas exercem um papel soberano na progressão tumoral. Processos inflamatórios crônicos promovem a formação tumoral e tanto as células tumorais como as células do estroma, produzem quimiocinas e citocinas. Estas atuam tanto por mecanismos autócr inos, como parácrinos para sustentar o crescimento da célula tumoral, induzir a angiogênese e facilitar a diminuição da vigilância imunológica (Raman, et al., 2007). As quimiocinas e seus receptores também têm papel importante no desenvolvimento e manutenção da imunidade inata e adaptativa (Raman, et al., 2007) Além disso, atuam no processo de cicatrização de feridas e angiogênese (Raman, et al., 2011) . Quando o papel fisiológico das quimiocinas é subvertido ou cronicamente ampliado, a doença pode se desenvolver. Como estão envolvidas na fisiopatolog ia da inflamação crônica, tumorigênese e metástase, assim como nas doenças autoimunes, tem sido avaliado o uso potencial de antagonistas de quimiocinas para terapia salvo apropriadas (Raman, et al., 2011) . Apesar da ação das quimiocinas na modulação da atividade de outras células do sistema imune ainda não ter sido completamente elucidado, algumas de suas ações em outros mediadores imunológicos como as células T -reguladoras e NK já são bastante conhecidas (Qin, et al., 2008; Robertson, 2002). 9 Células T-reguladoras O balanço entre imunidade e tolerância é importante para manter a homeostase imune. Muitos mecanismos são utilizados para manter a resposta imune sob controle, como a anergia de linfócitos T, a apoptose e a ignorância imunológica (Abbas, et al., 2011). Um quarto mecanismo de tolerância periférica é a supressão ativa por células reguladoras como células T CD4 +CD25high (T-reg) que expressam, constitutivamente, as moléculas CTLA-4, GITR e Foxp3 (Fontenot, et al., 2005) , células Th3 produtoras de TGF-beta, células Tr1 produtoras de IL-10 e células T CD8+CD28- (Maloy and Powrie, 2001 ; Askenasy, et al., 2008 ). As células T reguladoras foram primeiramente descritas no início dos anos 70, mas como fatores supressores solúveis hipotéticos não puderam ser identificados em nível molecular e marcadores celulares apropriados não eram conhecidos (Sakaguchi, et al., 1995) . O conceito de célula T supressora permaneceu esquecido por um longo tempo. A descoberta de Sakaguchi e colaboradores de que a transferência adotiva de uma população de células T depletadas da molécula CD25 induzia uma série de doenças autoimunes órgão -específicas em recipientes imunodeficientes, colocou o modelo de células T reguladoras novamente no foco da imunologia (Sakaguchi, et al., 1995) . As células T CD4+CD25high foram denominadas células T reguladoras (T -reg) e, desde então, as mesmas têm sido intensivamente estudadas (Long and Buckner, 2011; Filaci, et al., 2011; Selmi, 2011) Inicialmente, acreditava -se que eram células derivadas do timo (Seddon and Mason, 2000), entretanto, depois verificou-se que essas células também podem ser geradas na periferia (Waldmann and Cobbold, 2001) . As células T-reg podem ser ativadas por antígenos próprios ou não próprios e, uma vez ativadas, podem suprimir células T de maneira antígeno não específica (Jonuleit and Schmitt, 2003; Sakaguchi, et al., 2010) . Os efeitos supressivos dessas células não são restritos ao sistema imune adaptativo (células T e B), mas podem também influenciar a ativação e a função de células do sistema imune inato (monócitos, macrófagos, células dendríticas). Após a ativação do TcR (receptor de células T para antígeno de superfície), 10 as células T -reg naturais inibem respostas imunes in vivo e in vitro de maneira antígeno não específica, CHP não restrito e via um processo independente de células apresentadoras de antígenos (CAA). Células T -reg adaptativas são induzidas por antígenos, desenvolvem -se na perife ria e exercem sua função por meio da secreção de citocinas inibitórias (como IL-10 e TGF-β) ou tolerizando CAA por interações célula -célula (Maloy and Powrie, 2001; Selmi, 2011). O Foxp3 foi identificado como um marcador molecular específico para células T-reg e sua expressão é essencial para o desenvolvimento e a função desta célula. A expressão ectópica de Foxp3 em linfócitos T convencionais pode conferir atividade supressora aos mesmos e estes também passam a apresentar altos níveis de CD25. Aparentemente, o Foxp3 age estabelecendo e mantendo o programa genético da T -reg e funciona como um regulador negativo da ativação de células T e talvez como efetor transcricional de programas de citocinas anti-inflamatórias (Fontenot, et al., 2005; Filaci, et al., 2011; Josefowicz, et al., 2012). No entanto, a identificação das células T -reg permanece problemática porque não existe consenso acerca de seus marcadores. Algumas evidências sugerem que todos os marcadores atualmente utilizados (CD25, CTLA -4, GITR, LAG -3. CD127 e o próprio Foxp3) podem representar marcadores gerais de linfócitos T, ao invés de serem realment e específicos para as células T-reg. (Askenasy, et al., 2008; Corthay, et al., 2009). Apesar de que as evidências mais recentes, assim como uma grande revisão sistemática sobre o tema , demonstraram a especificidade de ação do Foxp3 como marcador específico e efetor transcricional das células T -reg (Josefowicz, et al., 2012; Peterson, et al., 2012) Sabe-se que em humanos, as células T -reg são reguladas pelas quimiocinas CCL17 e CCL21 (ligantes de CCR4 e CCR7) que podem modular e expressar a sua atividade nos tecidos (Qin, et al., 2008). 11 Células Natural Killer As células Natural Killer (NK) estão entre as principais células do sistema imune dos vertebrados. O papel das células NK é análogo ao de células T citotóxicas na resposta imune adaptativa. As células NK fornecem respostas rápidas para as células infectadas por vírus e respondem à formação de tumores, começando a atuar cerca de 3 dias após a infecção. Sendo assim, desempenham importante papel na resposta inata podendo diferenciar células infectadas por vírus, células neoplásicas e células normai s (Sikora, et al., 2011; Rudensky, 2011; Vivier, et al., 2011). As células NK são linfócitos e possuem a habilidade de eliminar células-alvo de acordo com o reconhecimento do complexo de histocompatibilidade principal (CHP) expresso em suas superfícies. Elas reconhecem as células que expressam o CHP classe I como própr ias, sendo destruídas aquelas células que não o apresentam. Foram nomeadas natural killers por causa da noção inicial de que não necessitam de ativação para eliminar as células sem marcadores self do CHP classe I. São definidas como linfócitos granulares grandes (LGG) e constituem o terceiro tipo de células diferenciadas do antepassado comum linf óide que gera linfócitos B e T. Elas podem também c ontribuir, po r meio da produção de citocinas, na resposta imune adaptativa contra patógenos intracelulares e células malignas (Robertson, 2002; Rudensky, 2011; Vivier, et al., 2011). Além do conhecimento que as células NK são efetores da imuni dade inata, uma pesquisa revelou informações sobre a atividad e tanto na ativação quanto na inibição dos receptores das células NK, os quais desempenh am importante papel, tanto na função de auto -tolerância quanto na sustentação da atividade das células NK (Arina, et al., 2007). Elas também desempenham um papel na resposta imune adaptativa. Numerosas experiências têm trabalhado para demonstrar a sua capa cidade de facilmente adaptar -se ao meio ambiente de forma quase que imediata e formular memória imunológica antígeno específica , fundamental para responder a infecções secundárias com o mesmo antígeno (Vivier, et al., 2011). A capacidade das células NK para atuar tanto na resposta imune inata quanto na adaptativa tem se tornado 12 objeto de pesquisa importante, na tentativa de se utilizar seus resultados em potenciais terapias (Arina, et al., 2007). Nos humanos células NK migram em resposta a ligantes conhecidos das quimiocinas CXCR3 (CXCL9, 10, 11) e CXCR4 (CXCL12) e a quimiotaxia de células NK é estimulada por XCL1 e CX3CL1 (Robertson, 2002). Considerações sobre endometriose, células NK e células T-reg Devido à função das células NK e T -reg, postula -se que elas desempenhem importante papel na gênese da endometriose. A primeira publicação em inglês avaliando a relação das células NK e endometriose vem da Bélgica, em 1991(Oosterlynck, et al., 1991). Este grupo avaliou o percentual de células NK em relação à subpopulação linfocitária em sangue periférico e sua citotoxicidade em relação ao endométrio tópico das mesmas pacientes. A atividade das células NK e a citotoxicidade contra o endométrio tópico autólogo estava diminuída nas pacientes com endometriose e, além disto, se correlacionava com a severidade da doença. Após avaliação in vitro puderam observar que a citotoxicidade das células NK era menor nas pacientes com endometriose quando comparadas às mulheres sem a doença e que esta diminuição era menor, quanto maior fosse o estadiamento da doença. O mes mo grupo ainda relatou uma diminuição da atividade das células NK no fluido peritoneal de pacientes com endometriose (Oosterlynck, et al., 1992). Da mesma forma, Kikuchi et al, (Kikuchi, et al., 1993) avaliaram o percentual de células NK em sangue periféricos de 10 mulheres com endometriose, 10 mulheres com miomas e 9 mulheres hígidas e encontraram uma diminuição do percentual de células NK nas po rtadoras de endometriose. Dias Jr et al., em 2012, realiz aram citometria de fluxo em sangue periférico de 155 mulheres, sendo 100 pacientes com endometriose e 55 mulheres submetidas à laqueadura tubária. Estas mulheres foram 13 submetidas à laparoscopia e encontraram diferenças nas concentrações de células NK em pacientes com endometriose profunda. Estas pacientes apresentaram uma maior concentração de células NK no sangue periférico (15,3%), em comparação às pacientes sem endometriose (9,8%). Ao avaliarem as pacientes com está dio avançado da doença (especialmente àquelas com doença de retossigmóide), esta diferença foi ainda maior (19,8% vs. 10,3%). Apesar de resultados díspares na literatura, sugere -se que as células NK efetivamente participam do clearance das células endometriais regurgitadas para a cavidade abdominal , durante o período menstrual (Maeda, et al., 2002; Berbic & Fraser, 2013). Em relação às células T-reguladoras, Berbic et al. (Berbic, et al., 2010) demonstraram um aumento da expressão de Foxp3, em avaliação imunoistoquímica, no endométrio tópico de pacientes com endometriose durante a fase secretora do ciclo menstrual. Os autores postularam haver diminuição da habilidade dos leucócitos em reconhecer e marcar efetivamente antígenos endometriais regurgitados pela menstruação, permitindo sua sobrevivência e, desta forma, a capacidade de se implantar em sítios ectópicos. Além disto, a variabilidade da e xpressão do Foxp3 nestes sítios ectópicos, te ve correlação com a fase do ciclo menstrual e com as características e estádios de cada lesão. Braundmeier et al. (Braundmeier, et al., 2012) , utilizaram um modelo animal de endometriose (Papio anubis) e avaliaram a expressão de Foxp3 no sangue periférico (imunoistoquímica) e endométrio tópico (RT -PCR) de animais controles e com endometriose induzida. A expressão de Foxp3 e células T-reg também estava reduzida no endométrio tópico comparad a com os animais controles , ao passo que estes parâmetros estavam aumentados no endométrio ectópico quando comparados com o endométrio tópico. Assim como na endometriose, no câncer parece haver um distúrbio da resposta imune e algumas pesquisas têm tentado demonstrar que a inibição das células T -reg poderia permitir uma melhor resposta às terapias 14 imunológicas contra a doenç a. Existem evidências de que certos regimes de quimioterapia são capazes de mediarem seus efeitos, pelo menos em parte, por meio da inibição das células T -reg. Já foi demonstrado que a ciclofosfamida e o paclitaxel acarretam uma diminuição da população de células T -reg maior do que outras células do sistema imune, diminuindo também seu papel inibitório e possibilitando assim uma resposta mais adequada das células do sistema imune (Menetrier-Caux, et al., 2012). Podgaec et al, 2012, avaliaram 98 mulheres, sendo 70 com endometriose e 28 sem a doença. Primeiramente, foram isolados os linfócitos do fluído peritoneal e as células CD4 +CD25high por meio da citometria de fluxo. A seguir, foi utilizado o RT -PCR para se v erificar a expressão de Foxp3 nestas células. De todos os linfócitos isolados no fluído peritoneal das mulheres com endometriose, 36,5% (mediana) foram CD4 +CD25high, ao passo que nas mulheres sem doença, somente 1,15% (mediana). O resultado da expressão do Foxp3 foi semelhante, sendo 50 (pacientes com endometriose) versus 5 (grupo controle). Assim, para a hipótese do presente estudo, salientamos que a atuação deste grupo de mediadores da resposta inflamatória parece ter importante papel na coordenação da re sposta imune contra as células endometriais. Como demonstrado por Dias et al., 2012, as células NK estão aumentadas no sangue periférico de pacientes com endometriose profunda e por Podgaec et al, 2012, mostraram que as células T -reg também estão aumentada s no fluido peritoneal das pacientes com endometriose, provavelmente, as células endometriais, quando presentes na cavidade peritoneal não seriam eliminadas desse local impróprio por ação deficiente em várias etapas da resposta imune. Talvez o aumento das células NK seja compensatório pela diminuição em sua citotoxicidade. Ou ainda que o aumento das células T -reg poderia bloquear a resposta imune e, desta forma, permitir a implantação das células endometriais. Este aumento poderia ainda ser compensatório, p ara bloquear a exacerbação da resposta imune contra a instalação da endometriose. 15 Sabemos que macrófagos e células dendríticas, que são células apresentadoras de antígenos , podem estar ativadas e aumentadas, porém, suprimidas pela ação das células T -reg aumentadas (Corthay, 2009 ; Peterson, 2012). Sabendo que as células NK são reguladas pelas quimiocinas CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1 e as T -reguladoras pelas quimiocinas CCL17 e CCL21, o estudo destes mediadores que modulam a atividade e migração destas células pode permitir uma melhor compreensão de mais uma etapa da resposta imune e ainda contribuir, no futuro, para eventuais tratamentos desta doença. Se estas células estão aumentadas, as quimiocinas que regulam sua migração devem ter um expressão diferenciada nas pacientes com endometriose. 16 2. OBJETIVOS 17 Objetivo principal  Avaliar a expressão gênica de quimiocinas reguladoras da atividade de células Natural Killer (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1) e T -reguladoras (CCL17 e CCL21) no tecido endometrial tópico e na lesão endometriótica de pacientes com endometriose profunda (retossigmóide e retrocervical). Objetivos específicos  Relacionar, em pacientes com endometriose profunda, a expressão gênica das quimiocinas reguladoras da atividade de células Natural Killer e T-reguladoras com: a. fase do ciclo menstrual; b. quadro clínico; c. estadiamento da endometriose (ASRM, 1996); d. localização da doença: retrocervical e retossigmóide. 18 3. PACIENTES E MÉTODOS 19 3.1 Pacientes 3.1.1 Local de estudo e pacientes O estudo foi realizado no Setor de Endometriose da Divisão de Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC -FMUSP). As pacientes foram divididas em três grupos: paciente s com endometriose de retossigmó ide confir mada histologicamente (grupo A), pacientes com endometriose retrocervical confirmada histologicamente (grupo B) e pacientes sem endometriose submetidas à cirurgia de laqueadura tubária como método de planejamento familiar (grupo C). O estudo foi aprovado p elo Comitê de Ética da instituição (nº0025/10). As pacientes foram previa mente informadas sobre o estudo e o

foi coletado após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, pelas mesmas. A coleta das amostras respeitou os princípios éticos, práticos e de biossegurança estipulados pelo Ministério da Saúde e pelas Comissões de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da instituição. 3.1.2 Número de paciente estudados Trata-se de estudo caso -controle prospectivo exploratório, com um n de 64 pacientes entre casos e controles, que foi o número de casos operados consecutivamente em um ano. 3.1.3 Critérios de inclusão/exclusão Determinou-se para os grupos A e B os seguintes critérios de inclusão:  Idade entre 18 e 40 anos;  Ciclos menstruais eumenorreicos com o intervalo entre os ciclos variando de 26 a 34 dias;  Endometriose comprovada histologicamente em região de retossigmóide (A) ou retrocervical (B); 20  Ausência de doenças autoimunes comprovadas por anamnese, exame físico e laboratoriais quando necessário;  Não utilização de terapêutica hormonal nos três meses que antecederam a cirurgia, incluindo análogos de GnRH, progestagênios e contraceptivos hormonais orais. Para o grupo C, foram selecionadas mulheres respeitando os mesmos critérios acima, com exceção da confirmação histológica de endometriose. 3.2 Métodos 3.2.1 Dinâmica do Estudo Todas as pacientes foram avaliadas do ponto de vista clínico pela história, exame físico e de imagem (ultrassonografia pélvica e/ou transvaginal e ressonância magnética, quando apropriado), de acordo com a indicação clínica para confirmação da suspeita de endometriose e posterior indicação cirúrgica. A decisão sobre a realização de tratamento clinico ou cirúrgico depende, de forma preponderante, do quadro clínic o, assim como do desejo reprodutivo, idade da paciente e das características das lesões. No grupo A, as pacientes foram submetidas à cirurgia quando da presença de lesão em retossigmóide à ultrassonografia e que não apresentaram melhora clínica após 6 a 12 meses de tratamento, ou ainda, quando havia quadro sugestivo de suboclusão intestinal. No grupo B, foram encaminhadas para cirurgia as pacientes com ultrassom sugestivo de lesões retrocervicais e que apresentavam falha do tratamento clínico após 6 a 12 meses de tentativa. Com relação ao grupo C, foram encaminhadas para cirurgia de laqueadura tubária, pacientes com prole constituída e sem desejo reprodutivo. Durante a cirurgia foi possível confirmar a ausência de lesões de endometriose. 21 No momento da v ídeo-laparoscopia foi anotado o dia do ciclo menstrual, sendo considerado como fase folicular do primeiro ao décimo quarto dia do ciclo e fase lútea do décimo quinto até o último dia do ciclo menstrual. Os fragmentos de endométrio das participantes do estud o foram coletados com cureta de Pipelle antes do início da vídeo -laparoscopia. Os fragmentos das lesões de endometriose foram coletados apos a exérese dos mesmos durante o procedimento terapêutico. Foi coletado aproximadamente 3cm2 de tecido por paciente. Cada fragmento coletado foi dividido em duas partes iguais: a primeira foi armazenada em tubo com RNAlatter ( Qiagen® -Ontario- CA code 76106 ) a -80ºC e a segunda encaminhada para o Departamento de Anatomia Patológica, para seguir os trâmites habituais do diagnóstico histológico da doença. 3.2.2 Quadro Clínico Todas as pacientes foram questionadas sobre os seis sintomas relacionados à endometriose: 1. Dismenorréia – dor em cólica durante o período menstrual; 2. Dispareunia de profundidade – dor pélvica durante o ato sexual; 3. Dor pélvica acíclica – dor pélvica sem relação com o período menstrual, constante, sem melhora com o uso de analgésicos; 4. Infertilidade – dificuldade para um casal, sem o uso de métodos contraceptivos, engravidar por pelo menos um ano de tenta tiva, com vida sexual ativa (duas ou mais relações por semana); 5. Alteração intestinal cíclica – dor e/ou sangramento à evacuação no período menstrual; 22 6. Alteração urinária cíclica – dor e/ou sangramento à micção no período menstrual. Todos os quadros álgicos tiveram sua intensidade avaliada de acordo com uma escala analógica de dor (anexo 1). Quadro 1 – Representação esquemática da dinâmica de estudo 3.2.3 Estadiamento da Endometriose As pacientes do grupo A foram estadiadas segundo a classificação da American Society for Reproductive Medicine (1996) (Figura 1). Para fins estatísticos, agrupamos os estádios I e II como “estádio inicial ” e os estádios III e IV como “estádio avançado”. 23 Figura 1: Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive Medicine (1996) 24 3.3 Detecção das quimiocinas por PCR em tempo real no endométrio tópico e nas lesões endometrióticas ● Extração de RNA Células do endométrio tópico e lesão endometriótica, obtidas durante o procedimento cirúrgico dos pacientes e dos indivíduos controle, foram descongeladas, pulverizadas em gral com nitrogênio líquido e submetidas à extração do RNA total, por meio da técnica descrita por Chomizinski and Sacchi em 1987, a qual utiliza solução de Trizol (Life Techn ologies, Grand Island, NY, USA) para isolamento de RNA total. O RNA obtido dos fragmentos de endométrio e das lesões endometrióticas foi extraído por meio da adição de 1ml de trizol, incubação à temperatura ambiente por 5 minutos e, após adição de 0,2 ml de clo rofórmio, agitação vigorosa por 15 segundos e incuba ção à temperatura ambiente, por 3 minutos. A separação de fases foi feita por centrifugação a 12.000g por 15 minutos a 4ºC. O RNA presente na fase aquosa (superior) foi transferido para outro tubo e preci pitado pela adição de 0,5 ml de isopropanol por 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, a amostra foi centrifugada a 12.000g por 10 minutos a 4ºC. O sedimento foi lavado com 1 ml de etanol a 75% (com o uso de vórtex), centrifugado a 7000g por 5 minutos, seco à temperatura ambiente e ressuspenso em água contendo DEPC (dietilpirocarbonato). Após este procedimento, o material foi mantido a – 80ºC, para manutenção da integridade das amostras. ● Quantificação de RNA Após a extração, o RNA obtido foi quantificado por meio de leitura em espectrofotômetro ( Nano Vue plus , GE – New Jersey , USA) nos comprimentos de onda (λ) de 260 e 280 nm. O grau de pureza da amostra foi verificado por meio da análise da relação entre 260 e 280nm, sendo considerados valores entre 1,7 e 2,0 (Sambrook, 1989). 25 As amostras de RNA foram tratadas com DNAse I (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) para descartar possível contaminação com DNA. Além disto, uma alíquota de RNA foi submetida à eletroforese em gel de agaro se 1% , corado com brometo de etídio para visualização da integridade das amostras. ● Reação de PCR em tempo real (RT-PCR) A expressão dos genes foi avaliada por PCR em tempo real utilizando 100ng de RNA em equipamento Step One (Applied Biosystems – Foster City, CA – USA) com o kit Super Script III Platinum SYBR® Green One -Step qRT.PCR (11736-051- Invitrogen Carlsbad, CA - USA) que contem SYBR® Green I como fluoróforo. A quantificação da expressão gênica foi realizada por 2-ΔΔCT (Livak et AL, 2001), usando o gene da Beta2 -microglobulina como controle interno. As seqüências dos primers específicos que foram utilizados, assim como as temperaturas de hibridização e tamanhos dos fragmentos encontram-se na Tabela 2. Tabela 2 : Lista de Primers das qu imiocinas CCL17, CCL21, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1 utilizados no presente estudo. GENE GENE BANK SENSE REVERSE PB CCL17 NM_002987 ACTGAAGATGCTGGCCCTGGTC AAACGATGGCATCCCTGGAGC 182 CCL21 NM_002989 CCCAGCTATCCTGTTCTTGC TCAGTCCTCTTGCAGCCTTT 201 CXCL9 NM_002416.1 TGCTGGTTCTGATTGGAGTG TTTGGCTGACCTGTTTCTCC 246 CXCL10 NM_001565 CTGTACGCTGTACCTGCATCA TTCTTGATGGCCTTCGATTC 172 CXCL11 NM_005409 AGAGGACGCTGTCTTTGCAT TGGGATTTAGGCATCGTTGT 154 CXCL12 AY802782 GTCAGCCTGAGCTACAGATGC CTTTAGCTTCGGGTCAATGC 162 XCL1 NM_002995 TGGCATCTGCTCTCTCACTG ATTTCCTGTCCATGCTCCTG 236 CX3CL1 NM002996 TCTGCCATCTGACTGTCCTG CTGTGCTGTCTCGTCTCCAA 169 A representação esquemática de todo o processo da detecção da expressão gênica das quimiocinas pelo PCR em tempo real no endométrio tópico e nas lesões endometrióticas se encontra no quadro 2. 26 Quadro 2 – Representação esquemática da detecção das quimiocinas por PCR em tempo real no endométrio tópico e nas lesões de endometriose. 3.4 – Método Estatístico Para responder aos objetivos do estudo, as características quantitativas foram descritas segundo grupos com uso de medidas resumo (média, desvio padrão, mediana, mínimo e máximo). A idade foi comparada entre os grupos com uso d o teste ANOVA (Neter, et. al., 1996). Para comparação das queixas clínicas entre os grupos foi aplicado o teste Kruskal- Wallis, seguido de comparações múltiplas não paramétr icas (Neter, et. al., 1996), para identificar entre quais grupos ocorre a diferença. As características qualitativas das mulheres foram descritas segundo grupos com uso de freqü ências absolutas e relativas, verificada a existência de associação entre as medidas e os grupos, com uso de testes da razão de verossimilhanças (Kirkwood e Sterne, 2006). 27 As quimiocinas foram descritas segundo grupos e locais de avaliação com uso de medidas resumo e comparadas entre os grupos e locais, uso do teste ANOVA com medidas repetidas, sendo o fator local hierárquico ao fator grupo (Singer e Andrade, 2000). As análises foram seguidas de comparações múltiplas de Tukey (Neter, et. al., 1996) para verificar entre quais grupos e locais ocorreram as diferenças. Todos os resultados foram padronizados pelo valor do grupo controle, sendo este considerado como 1 e os demais como uma comparação com relação a este valor. Os resultados das qu imiocinas foram descritos no endométrio tópico segundo grupo de pacientes e segundo fase do ciclo menstrual, com uso de medidas resumo e comparados os valores de quimiocinas, segundo grupos e fase com uso de ANOVA com dois fatores (Neter, et. al., 1996). Os resultados foram ilustrados com gráficos de barras representando as médias c om os respectivos e rros padrões e os testes foram realizados com nível de significância de 5%. 28 4. RESULTADOS 29 Cento e vinte e duas pacientes foram submet idas a tratamento cirúrgico no Setor de endometriose do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo, sendo que 64 foram incluídas em nosso estudo quando avaliadas, por cumprirem os critérios para participação do mesmo . A seguir, foram divididas nos seguintes grupos: A: 22 pacientes com endometriose intestinal, B: 10 pacientes com endometrios e retrocervical e C: 32 pacientes submetidas a laqueadura tubária para contracepção definitiva. A média etária no grupo A foi de 34,14 (DP=4,87), no grupo B de 34,70 (DP=5,66) e no grupo C de 31,97 (DP=3,46), o que não mostrou dife rença significativa (p = 0,102) na comparação entre os grupos. Como exposto na tabela 3, todas as queixas clínicas avaliadas apresentaram diferenças estatísticas significativas entre os grupos (p<0,001), sendo o valor no grupo controle estatisticamente menor que nos grupos de pacientes. 30 Tabela 3 – Descrição das características referentes ao quadro clínico das pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide e mulheres sem endometriose (grupo controle). Grupo % de pacientes acometidas Média (EVA) DP N p Dismenorréia Controle 37,50% 1,38 2 32 <0,001 EDT RS 86,36% 7,55 3,26 22 EDT RC 80% 6,9 3,93 10 Dispareunia Controle 0 0 0 32 <0,001 EDT RS 54,54% 3,5 3,67 22 EDT RC 60% 2,3 2,75 10 DPC Controle 0 0 0 32 <0,001 EDT RS 36,36% 2,59 3,57 22 EDT RC 50% 2,2 3,19 10 Alterações intestinais cíclicas Controle 0 0 0 32 <0,001 EDT RS 40,90% 2,82 3,71 22 EDT RC 40% 2,1 3,45 10 Alterações urinárias cíclicas Controle 0 0 0 32 <0,001 EDT RS 18,18% 1,36 3,06 22 EDT RC 0 0 0 10 DP = desvio padrão EVA = escala visual analógica de dor EDT RS = pacientes com endometriose de retossigmóide EDT RC = pacientes com endometriose retrocervical Conforme demonstrado pelos gráficos 1 a 4, as quimiocinas CX3CL1, CXCL12 e CCL17 apresentaram médias estatisticamente diferentes entre os grupos ou locais de avaliação (p<0,05). Quando as quimiocinas com diferenças estatísticas significativas foram avaliadas isoladamente, pudemos observar que duas delas (CX3CL1 e CXCL12) eram reguladoras da atividade das células NK. 31 Considerando as quimiocinas relacionadas à atividade das células NK, a CX3CL1 (Fraktalkine) apresentou maior expressão n a lesão endometriótica da doença retrocervical quando comparado aos demais gr upos (p<0,05) . (Gráfico1). Gráfico 1 – Expressão relativa da quimiocina CX3CL1 em endométrio tópico e lesão endometriótica de pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose. Tanto as pacientes com endometriose retrocervical, como aquelas com doença de retossigm óide, possuíam uma expressão da CXCL12 maior no foco de doença do que no endométrio tópico das mulheres com endometriose e daquelas submetidas à laqueadura tubária (p < 0,05) (Gráfico 2). 32 Gráfico 2– Expressão relativa da quimiocina CXCL12 em endométrio tópico e lesão endometriótica de pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose. Nas demais quimiocinas r elacionadas com a atividade e/ou migração das células NK, não foram encontradas diferenças significativas na comparação entre os grupos e/ou locais avaliados, apesar de verificarmos uma certa tendência em alguns casos, como a XCL1, que parece ser menos expressa na endometriose de retossigmóide e a CXCL9, que parece estar diminuída na lesão endometriótica das pacientes com endometriose de retossigmóide, porém, as duas sem confirmação estatística. 33 Quadro 3– Expressão relativa da quimiocina CXCL9, CXCL10, CXCL11 e XCL1 em endométrio tópico e lesão endometriótica de pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose. Das quimiocinas relacionadas à atividade das células T-reg, a CCL17 apresentou resultado significativo. Ela foi mais expressa no endométrio tópico de p acientes com lesão em retossigmó ide quando comparada aos demais grupos (p<0,05) (Gráfico 3). 34 Gráfico 3– Expressão relativa da quimiocina CCL17 em endométrio tópico e lesão endometriótica de pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose. Quando avaliamos a CCL21, não encontramos diferenças significativas na expressão gênica entre os grupos (Gráfico 4). 35 Gráfico 4– Expressão relativa da quimiocina CCL21 em endométrio tópico e lesão endometriótica de pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide e tópico de pacientes sem endometriose Nenhuma das duas f ases do ciclo menstrual teve predominância significativa em nenhum dos 3 grupos, não mostrando diferenças significativas nas expressões gênicas das quimiocinas quando comparadas as fases do ciclo menstrual (Tabela 4). 36 Tabela 4 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com e sem endometriose segundo as fases do ciclo menstrual, folicular e lútea. Fase do ciclo menstrual Quimiocina Folicular Lútea p Média DP N Média DP N XCL1 1,335 1,487 29 0,998 1,147 35 0,189 CX3CL1 1,087 0,914 29 1,086 1,095 35 0,845 CXCL9 1,066 1,058 29 1,786 4,097 35 0,919 CXCL10 0,973 1,053 29 2,183 6,478 35 0,399 CXCL11 1,009 1,183 29 1,449 1,927 35 0,157 CXCL12 1,669 1,812 29 1,395 1,766 35 0,430 CCL17 2,414 1,919 29 3,374 4,631 35 0,751 CCL21 3,917 9,995 29 6,353 25,919 35 0,147 A tabela 5 mostra que pacientes com endometriose e com dismenorréia apresentam estatisticamente menor valor da quimiocina CXCL11 (NK) no endométrio tópico que pacientes sem dismenorréia (p = 0,019). 37 Tabela 5 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com endometriose de retossigmóide e retrocerv ical segundo a presença de dismenorréia. Dismenorréia Quimiocina Não Sim p Média DP N Média DP N XCL1 0,396 0,513 5 0,889 0,875 27 0,220 CX3CL1 0,498 0,250 5 0,945 0,637 27 0,087 CXCL9 0,685 0,395 5 0,878 1,134 27 0,880 CXCL10 1,698 1,520 5 0,665 0,398 27 0,060 CXCL11 2,273 1,661 5 0,700 0,524 27 0,019 CXCL12 0,592 0,636 5 1,796 2,353 27 0,511 CCL17 3,822 2,883 5 3,328 4,590 27 0,511 CCL21 2,336 2,399 5 2,405 2,920 27 0,725 A tabela 6 mostra que a presença de dispareunia não influencia estatisticamente nos valores das quimiocinas em pacientes com endometriose (p > 0,05). Tabela 6 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de dispareunia de profundidade. Dispareunia Quimiocina Não Sim p Média DP N Média DP N XCL1 1,012 0,949 14 0,657 0,739 18 0,301 CX3CL1 0,922 0,765 14 0,839 0,485 18 0,561 CXCL9 0,570 0,262 14 1,064 1,359 18 0,722 CXCL10 0,857 1,045 14 0,803 0,461 18 0,398 CXCL11 1,182 1,312 14 0,761 0,534 18 0,639 CXCL12 1,172 1,311 14 1,947 2,707 18 0,808 CCL17 3,826 5,660 14 3,078 3,080 18 0,985 CCL21 2,227 2,598 14 2,524 3,031 18 >0,999 Pela tabela 7, tem-se que pacientes com endometriose que possuem dor pélvica crônica apresentam estatisticamente menores valores de CCL17 e de CCL21 (T -reg) (p = 0,001 e p = 0,005 respectivamente) e apresentam 38 maiores valores de XCL1 e CXCL12 (NK) (p = 0,045 e p = 0,049 respectivamente). Tabela 7 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de dor pélvica crônica. Dor Pélvica Cronica Quimiocina Não Sim p Média DP N Média DP N XCL1 0,593 0,795 19 1,133 0,833 13 0,045 CX3CL1 0,900 0,699 19 0,838 0,485 13 0,734 CXCL9 0,986 1,326 19 0,647 0,369 13 0,970 CXCL10 0,888 0,940 19 0,738 0,383 13 0,880 CXCL11 1,139 1,155 19 0,663 0,488 13 0,209 CXCL12 1,005 1,423 19 2,489 2,861 13 0,049 CCL17 4,776 5,229 19 1,402 0,416 13 0,001 CCL21 3,369 3,273 19 0,969 0,786 13 0,005 A tabela 8 mostra que a presença de alterações intestinais não influencia estatisticamente nos valores das quimiocinas estudadas em pacientes com endometriose (p > 0,05). Tabela 8 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de alterações intestinais. Alterações intestinais cíclicas Quimiocina Não Sim p Média DP N Média DP N XCL1 0,703 0,765 19 0,972 0,952 13 0,650 CX3CL1 0,845 0,557 19 0,918 0,709 13 0,970 CXCL9 1,031 1,309 19 0,581 0,385 13 0,223 CXCL10 0,896 0,901 19 0,725 0,501 13 0,650 CXCL11 0,994 1,127 19 0,874 0,685 13 0,970 CXCL12 1,557 2,096 19 1,683 2,457 13 0,910 CCL17 4,330 5,431 19 2,055 0,966 13 0,448 CCL21 2,792 3,353 19 1,813 1,705 13 0,762 39 A tabela 9 mostra que pacientes com estadiamento avançado (ASRM, 1996) apresentam estatisticamente maior expressão de CCL21 (T -reg) quando comparas às pacientes com estadiamento inicial (p = 0,041). Tabela 9 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com endometriose de retossigmóide e retrocervical segundo estadiamento inicial (1 e 2) e avançado (3 e 4) – ASRM 1996. Estadiamento Quimiocina Inicial (1 e 2) Avançado (3 e 4) p Média DP N Média DP N XCL1 1,107 0,435 3 0,782 0,872 29 0,286 CX3CL1 0,429 0,092 3 0,921 0,626 29 0,082 CXCL9 0,405 0,225 3 0,894 1,093 29 0,207 CXCL10 0,528 0,450 3 0,858 0,783 29 0,457 CXCL11 1,512 1,563 3 0,887 0,900 29 0,580 CXCL12 0,728 0,668 3 1,699 2,300 29 >0,999 CCL17 1,638 0,714 3 3,589 4,515 29 0,457 CCL21 0,377 0,136 3 2,603 2,873 29 0,041 40 5. DISCUSSÃO 41 A tentativa de identificação da etiopatogenia da endometriose é um dos assuntos mais estudados nos últimos anos ( Ulukus et al., 2009) . Apesar de novas hipóteses terem sido levantadas, divers as pesquisas têm encontrado evidências de que a teoria da menstruação retrógrada complementada por fatores imunológicos parece ter importante papel na gênese desta doença (Podgaec et al., 2010; Herington et al., 2011; Fassbender et al., 2011). Levando em consideração as diversas alterações no sistema imunológico observadas até o momento e, considerando que as células T-reg e NK desempenhem importante papel nesta resposta imunológica (Podgaec, et al., 2012 e Dias Jr, et al., 2012), resolvemos estudar o que poderia modificar o comportamento destes dois importantes agentes do sistema imune, as quimiocinas. As quimiocinas são um grupo de, pelo menos, 47 proteínas correlatas, fazendo delas a maior família de citocinas conhecida (Robertson et al., 2002; Abbas et al., 2011) e são divididas em quatro subgrupos: CXC (ou a), CC (ou b), CX3C e subfamílias C. Cada quimiocina consegue se ligar a mais de um receptor e cada receptor interage com mais de uma quimiocina (Nishida et al., 2011). Conforme a própria nomenclatu ra, quimiocinas são citocinas quimiotáticas. Elas atuam se ligando a receptores de membrana e podem, desta forma, modular a atividade de algumas células mediadoras da resposta inflamatória, incluindo -se as células T -reg e NK. A migração e a atividade dessas células nos tecidos -alvo pode m ser influenciada s pela ação deste grupo de proteínas (Qin et al., 2008). A correlação entre a atividade das células T -reg e células NK na endometriose ainda é assunto pouco esclarecido. Se considerarmos ainda que suas açõe s podem ser moduladas por outros mediadores da resposta inflamatória como as quimiocinas, abrimos um leque ainda maior de perguntas. 42 Budiu et al (2009) avaliaram a presença da glicoproteína mucina 1, (MUC1) na endometriose. Estas são normalmente expressas no epitélio luminar e glandular em endométrio humano e pouco expressas nas células epiteliais do ovário. No entanto, são superexpressadas em carcinomas ovarianos de células claras e endometrióides. Além disto, alguns estudos visando uma terapia antígeno -específica contra o câncer foram desenvolvidos avaliando uma possível vacina contra a MUC1 (Cramer, et al., 2005 e Oei, et al., 2008) e, desta forma, os autores deste grupo resolveram avaliar o comportamento desta glicoproteína em um modelo animal de endometriose ovariana, além de avaliarem sua resposta inflamatória. Encontraram um aumento da expressão de MUC1 na superfície ovariana e uma predominância da subclasse IgG1, sugerindo uma resposta Th2 e um acúmulo de linfócitos Foxp3+ CD4 nos linfonodos nos estágios avançados de doença. Basta et al (2010) avaliaram 47 mulheres, sendo 16 submetidas à laparoscopia para tratamento de gestação ectópica tubárea, 16 mulheres submetidas à laparoscopia para tratamento de endometrioma ovaria no e 15 pacientes submetidas à laqueadura tubárea que foram denominadas grupo controle. Neste estudo, o percentual de Foxp3+ com a subpopulação de linfócitos T CD4+CD25high encontrados na decídua do grupo com gestação ectópica foi significativamente menor quando comparados tanto aos tecidos das pacientes com endometriomas ovarianos quanto ao endométrio do grupo controle. Os autores especularam que os distúrbios do equilíbrio do endometrioma e da decídua na gestação ectópica seriam devidos a alterações da população de células T-reg nestes locais. Berbic et al., em 2010, realizaram um estudo em que analisaram por imunoistoquimica a expressão de Foxp3 em amostras de 127 endométrios tópicos e 59 lesões endometrióticas peritoneais. Foi demonstrado que nas pacientes com endometriose, a expressão de células Foxp3+ CD4 +CD25high não tiveram o declí nio esperado na fase secretora do ciclo menstrual. Isto poderia contribuir para a diminuição na habilidade de recrutar novos leucócitos ou outras células do sistema imune para permitir uma resposta 43 imunológica efetiva contra os fragmentos endometriais que adentram à cavidade peritoneal, impedindo ou, ao menos, dificultando o desenvolvimento dos implantes endometrióticos. André et al., 2011, mostraram a presença de certos polimorfismos no Foxp3 em pacientes inférteis e com endometriose quando comparadas a mulheres normais. Utilizaram uma coorte de 419 mulheres, sendo 177 mulheres inférteis e com endometriose, 71 mulheres com infertilidade idiopática e 171 mulheres férteis como controle. Avaliaram amostras de sangue periférico e os polimorfismos foram identificados por meio do uso de PCR. Após análise estatís tica, encontraram que o polimosfismo rs3761549 estava fortemente associado à endometriose. Foi o primeiro estudo avaliando polimorfismos do Foxp3 com a endometriose e infertilidade, sugerindo uma relação entre os mesmos. Qin et al., 2008 mostraram que as células T -reg sofrem influência de algumas quimiocinas (CCL17 e 21) podendo fazer com que o desemp enho de sua função seja exacerbado ou mesmo comprometido, através da inibição de sua ação. Em nosso trabalho pudemos observar uma diferença estatística significativa n a avaliação da quimiocina CCL17, que foi mais expressa no endométrio tópico das pacientes com endometriose de retossigmóide. Sabemos que a quimiocina CCL17 pode modular a ação das células T-reg (Qin et al., 2008, Heiseke et al., 2012). Muitos estudos já demonstraram a ação desta quimiocina na gênese de doenças intestinais, como a doença de Crohn (Izcue et al., 2008; Park et al., 2010; Heiseke et al., 2012). Experimentos usando camundongos deficientes em C CL17 confirmaram que esses animais não são capazes de desenvolver sinais clínicos relevantes de doenças autoimunes intestinais, mesmo quando avaliados em diferentes espaços de tempo . Estes resultados sugerem que a inflamação é colocada em xeque e pode ser inibida por fatores imunes regulados em camundongos deficientes em CCL17 , já que esta quimiocina parece ser essencial para o desenvolvimento da inflamação no intestino de camundongos. A CCL17 tem um efeito autócrino nas células dendríticas que promove a produção de citocinas inflamatórias e a ativação das respostas 44 Th1 e Th17, que reduzem a expansão de células T-reg. Desta forma, Heiseke et al., em 2012, demonstraram que os camundon gos deficientes em CCL17 têm maior propensão à expansão clonal de células T-reg em comparação aos camundongos competentes em CCL17. Ou seja, a falta de CCL17 permite que as células T -reg tenham uma expansão de seu nú mero e, desta forma, uma maior ação na manutenção da resposta imune. Sendo assim, a sua concentra ção diminuída na lesão endometriótica de pacientes com endometriose de retossigmóide quando comparado ao endométrio tópico de pacientes controles, nos leva a pensar em uma possível associação com a gênese de outras doenças autoimunes intestinais. Esta diminuição de CCL17 encontrada na lesão de retossigmóide, permitiria a expansão clonal de células T -reg neste local. Isto ainda vai ao encontro do que já foi rela tado por outros autores (Budiu et al., 2009; Berbic et al., 2010; Basta et al., 2010; Prieto, 2011) e mesmo com o relatado por nosso grupo em 2012, quando Podgaec, et al., demonstraram um percentual maior de linfócitos CD4 +CD25high no fluído peritoneal de mulheres com endometriose . O aumento da concentração das células T -reg no fluído peritoneal de pacientes com endometriose e ainda, a sua maior concentração nos endometriomas ovarianos nos leva a uma hipótese de que esta maior concentração leve a um funcion amento defeituoso das outras células do sistema imune. Sendo assim, o encontrado em nosso estudo complementaria a descrição d e um ambiente propenso à maior concentração destas células que atuam de forma tão intensa na resposta imune. Além disto, a maior concentração de CCL17 n o endométrio tópico das paciente s com endometriose intestinal indica a baixa propensão das células T -reg em se concentrar nesta localização, permitindo um maior acúmulo na cavidade peritoneal e ocasionando algumas das modificações da resposta imune que poderiam ser parte da resposta para a instalação desta doença. As células NK, assim como outras células T e B, são um dos maiores subconjuntos de linfócitos que foram identificados em todas as espécies de vertebrados examinados (Linsen et al., 2005) . São linfócitos distintos das células T e B e que desempenham importante p apel nas respostas imunes 45 inata e adaptativa . O termo natural killer deriva do fato de que estas células são capazes de realizar sua função de morte sem a necessidade d e expansão clonal e/ou diferenciação, fato necessário por outras células assassinas do sistema imune, como os linfócitos T citotóxicos (CTL) (Robertson, 2002). Como as células NK participam do clearance das células endometriais regurgitadas para a cavidade abdominal, imagina -se que elas estejam subativadas na endometriose ou não reconheçam o tecido endometrial ectópico como sendo um material em apoptose e que deveria ser eliminado (Ota et al., 2002). Entretanto, o número de células NK é um tema um tanto quanto controverso. Diversos trabalhos são conflitantes, mostrando que este número pode estar diminuído (Ota et al., 2002), aumentado (Hill et al., 1988 e Masubayashi et al., 2001), inalterado (Oosterlynck et al., 1994) ou variável de acordo com o estádio (ASRM, 1986) da doença (Dias Jr et al., 2005). A atividade das células NK pode ser modulada pela presença de algumas quimiocinas (Robertson, 2002). Seja pelo aumento da migração destas células em resposta à presença de determinadas quimiocinas (CXCL 9, 10, 1 1 e 12, XCL1 e CX3CL1), como pelo aumento de sua atividade citolítica quando na presença de quimiocinas específicas (CXCL10 e CX3CL1) (Robertson, 2002; Moris and Ley, 2004; Groom and Luster, 2011). A presença diferenciada de algumas quimiocinas encontradas em nosso trabalho, como a CX3CL1 e a CXCL12, mostra exatamente esta ação deficitária de células NK em pacientes com endometriose. Apesar de não termos resultados estatisticamente significativos, a s quimiocinas XCL1, CXCL9, CXCL10 e CXCL11 foram mais expre ssas no grupo controle que em pacientes com endometriose. Principalmente se levarmos em consideração a XCL1 e a CXCL9 que tiveram resultados aparentemente mais expressivos e, como elas atuam de modo a estimular a migração das células NK, isto iria ao encontro do acima exposto, sugerindo uma migração deficitária de células NK para sítios de endometriose, permitindo, desta forma um comprometimento da resposta imune local e o posterior desenvolvimento da doença. 46 A CX3CL1 ( Fraktalkine) é uma das quimiocinas mai s estudadas em endometriose (Zhang et al., 2004; Shimoya et al., 2005; Watanabe et al., 2006; Nishida et al., 2011). Watanabe et al., 2006 avaliando mulheres sem endometriose, demonstraram que a CX3CL1 é mais presente no endométrio tópico na fase secretora, quando comparada à proliferativa, exemplificando ainda que a presença dela poderia ser uma das responsáveis pela regulação do ambiente imunológico, atraindo células NK. Nosso estudo encontrou uma diferença estatística significativa no que diz respeito à presença de CX3CL1 no endométrio ectópico de pacientes com endometriose retrocervical. Q uando comparadas ao endométrio tópico das pacientes dos demais grupos, apresentavam uma expressão aumentada. Isto talvez mostre uma tentativa do organismo em aumentar a quimiotaxia para células de defesa, como as NK e, desta forma tentar diminuir os danos causados por esta doença. CXCL12 (SDF-1a - Stromal cell -derived factor -1) foi identificado com um produto d e gene que é regulado de uma maneira consistente pelo estrogênio, além de também estar relacionada com a migração de células NK (Glace et al., 2009). Neste grupo encontramos uma concentração menor no endométrio tópico de pacientes e controles, quando compa rado às lesões das pacientes com endometriose . Também nos estranha o fato da sua concentração ser maior n a lesão de endometriose , mas usando da mesma hipótese levantada para a CX3CL1, acreditamos ser uma resposta do organismo, na tentativa de tentar aument ar a concentração de células de defesa contra a endometriose. Utilizando um modelo animal com camundongos, Glace et al., em 2009, também demonstraram um aumento na expressão de CXCL12 nas lesões em casos de endometriose ovariana em comparação ao endométrio tópico, mostrando ainda que este aumento pode ser reprimido pelo raloxifeno e pela progesterona. Da mesma maneira, Furuya et al., em 2007, mostrou diferenças no comportamento das quimiocinas CXC em pacientes com endometriose ovariana e com carcinomas ovar ianos, quando comparados a pacientes livres de doença . Encontraram também um aumento da expressão 47 de CXCL12 nas lesões ovarianas quando comparados aos endométrios tópicos (Furuya et a., 2007). Em 2009, Al -Jefout et al., publicaram interessante estudo dupl o cego que trouxe novas perspectivas para o diagnóstico não invasivo da endometriose. Neste estudo, os autores utilizaram a detecção de fibras nervosas no endométrio de pacientes com endometriose, através da biópsia endometrial e imunoistoquímica. Os resul tados mostraram que, em 64 mulheres com diagnóstico laparoscópico de endometriose, a média de densidade de fibras nervosas na biópsia endometrial foi de 2,7 fibras nervosas por milímetro quadrado. Apenas uma mulher com endometriose não teve fibras nervosas detectáveis. Seis mulheres tiveram fibras nervosas detectadas, mas não tinham endometriose ativa vista na laparoscopia. Com altas sensibilidade e especificidade, a densidade das fibras nervosas não variou nas diferentes fases do ciclo menstrual. Além disto, as mulheres com endometriose e sintomas de dor têm maior densidade de fibras nervosas em comparação com mulheres inférteis, mas sem dor. Utilizando esta mesma prerrogativa de um diagnóstico não invasivo para endometriose e, também pensando na biópsia endometrial como alternativa, avaliamos a expressão das quimiocinas estudadas de acordo com os sintomas apresentados. Desta forma, pudemos observar diferenças estatísticas significativas quando avaliamos a dismenorréia e a dor pélvica crônica. No primeiro caso, tivemos uma maior expressão de CXCL11 no endométrio tópico das mulheres que não apresentavam dismenorréia. No caso da dor pélvica crônica, tivemos uma maior expressão de CXCL12 no endométrio tópico das mulheres que apresentavam a queixa e uma maior expressão de CCL17 e CCL21 naquelas que não apresentavam a queixa clínica. Quando avaliamos alterações intestinais cíclicas e dispareunia, não encontramos diferenças significativas. As alterações urinárias cíclicas não foram avaliadas pois eram pacientes sem endometriose do trato urinário e também não avaliamos o aspecto infertilidade visto que em nosso grupo controle, todas as pacientes eram multíparas. 48 Não foi encontrado nenhum estudo na literatura para que pudéssemos discutir sobre o fat o de termos encontrado uma maior expressão de CCL21 no endométrio tópico de pacientes com estádios avançados da doença. A endometriose é uma entidade em estudo e que muitas dúvidas ainda pairam no ar. A te oria imunológica é alvo de muita s pesquisas atualmente. Diversos estudos têm tratado a endometriose como uma doença imunológica (Agic et al., 2006; Podgaec et al., 2007; Barrier, 2010) e, provavelmente, a busca por um diagnóstico não invasivo e mesmo por um tratamen to ou profilaxia definitivos poderão vir desta teoria. A ação de células mediadoras da resposta inflamatória como as células T-reg e NK, parece ter papel fundamental na gênese desta doença. Além disto, como visto pela primeira vez em nosso estudo, o papel de algumas quimiocinas, como a CCL17, CX3 CL1 e CXCL12, na modulação desta resposta inflamatória fará parte do quebra -cabeças para a resposta inflamatória da endometriose. 49 6. CONCLUSÕES 50 1. Com relação às quimiocinas relacionadas à atividade das células NK, as pacientes com endometriose profunda apresentam:  expressão de CX3CL1 e CXCL12 aumentadas de forma significativa no foco de endometriose, quando comparadas ao endométrio tópico das pacientes com e sem endometriose.  as quimiocinas CXCL9, CXCL10, CXCL11 e XCL1 não tiveram diferenças estatísticas significativas nos grupos estudados. 2. Com relação às quimiocinas relacionadas à atividade das células T - reg, as pacientes com endometriose profunda apresentam:  expressão de C CL17 aumentada no endométrio tópico das pacientes com endometriose de retossigmóide em comparação ao endométrio tópico das pacientes com endometriose retrocervical e sem endometriose e, quando comparada ao foco de endometriose nas pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide.  a expressão da quimiocinas CCL21 não apresentou diferenças estatísticas significativas nos grupos estudados. 3. Com relação à fase do ciclo menstrual, não se observou diferenças significativas na expressão das quimiocinas. 4. Em relação ao quadro clínico, encontramos que as pacientes com dismenorréia e endometriose apresentam menor valor de CXCL11 no endométrio tópico. Aquelas com dor pélvica crônica apresentam valores menores de CCL17 e CCL21 e maiores de XCL1 e CXCL12 no endométrio tópico. Os demais sintomas não tem correlação com a expressão das quimiocinas. 5. Pacientes com estadiamento avançado (ASRM, 1996) da doença apresentam maior valor de CCL21 no endométrio tópico. 51 6. ANEXOS 52 Anexo 1 ESCALA VISUAL ANALÓGICA – EVA A Escala Visual Analógica – EVA auxilia na aferição da intensidade da dor no paciente, é um instrumento importante para verificarmos a evolução do paciente durante o tratamento e mesmo a cada atendimento, de maneira mais fidedigna. Também é útil para analisarmos se o tratamento está sendo efetivo, quais procedimentos têm surtido melhores resultados, assim como se há alguma deficiência no tratamento, de acordo com o grau de melhora ou piora da dor. A EVA pode ser utilizada no início e no final de cada atendimento, registrando o resultado sempre na evolução. Para utilizar a EVA o atendente deve questionar o paciente quanto ao seu grau de dor, sendo que 0 significa ausência total de dor e 10 o nível de dor máxima suportável pelo paciente. Dicas sobre como interrogar o paciente:  Você tem dor?  Como você classifica sua dor? (deixe ele falar livremente, faça observações na pasta sobre o que ele falar) Questione-o: a) Se não tiver dor, a classificação é zero. b) Se a dor for moderada, seu nível de referência é cinco. c) Se for intensa, seu nível de referência é dez. OBS.: Procure estabelecer variações de melhora e piora na escala acima tomando cuidado para não sugestionar o paciente. 53 Anexo 2 – Aprovação Comitê de Ética e Pesquisa - HCFMUSP 54 Anexo 3 – Termo de consentimento livre e esclarecido (pacientes) 55 56 57 Anexo 4 – Termo de consentimento livre e esclarecido (controles) 58 59 60 Anexo 5 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 do endométrio tópico das pacientes submetidas à laqueadura tubária. Iniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 VDR 0,643361 0,921856149 0,197470211 0,599773761 0,298133084 3,910586949 0,00128226 0,189582597 MHS 0,335341 1,225706489 2,301711376 0,659063926 0,717986383 0,181543246 2,211315689 11,95795215 MEGC 0,971778 1,846269999 1,386749243 0,591106632 0,90627977 1,223814724 0,009936166 1,287790969 AS 1,837443 4,716162891 1,699024831 0,538676231 1,112672014 1,132401183 6,671009057 1,878913222 MAJF 0,489948 2,833555673 0,584675052 0,6006058 1,09052919 2,456127001 2,102207385 0,55783039 CAAS 0,486901 0,535743204 0,722318456 38,78670489 10,35336895 0,441469343 0,513310971 0,182364705 MLO 0,39576 0,57618881 0,364428309 0,439974042 1,022448649 0,200320943 1,08065424 0,135644122 VMS 0,442485 0,59526895 0,379114867 5,196320126 0,931113141 1,737948294 1,374498183 0,183124717 CSA 0,531706 1,230814674 3,783461954 0,271399565 1,615553343 0,261047665 3,221884999 54,2630576 PGOS 0,225891 0,513919232 0,266592285 1,058110511 0,229573558 0,506763724 1,384058574 0,442239084 COJ 1,418828 1,145211092 0,745203801 2,792370378 0,497589652 3,578574864 3,084218551 0,044283051 NMAB 5,932743 6,47829223 11,29574044 0,186272979 1,680660574 1,791769631 13,70760861 154,4395491 SMS 1,051683 0,858335485 0,318796333 1,309022879 0,368319169 1,112176039 1,413140587 0,121995382 MJSL 1,321979 2,16237022 1,355388971 1,172420673 0,806098692 5,312478735 0,010130892 6,82532828 SRS 0,777384 1,48618483 0,749867155 0,768698795 1,039599891 0,592293912 7,594236878 0,944025959 SMK 0,260021 1,149186977 0,268818985 1,120770053 0,638619445 0,937821436 1,084405999 2,373306514 SDF 0,526206 1,409920238 0,459681636 0,874475768 0,638176941 0,855230471 6,385966568 0,725425034 MLS 7,157617 0,483696347 1,080336641 0,584996668 0,381813068 1,419630191 2,296337985 0,666182073 LLS 0,438822 0,98046195 1,178716638 6,261031296 5,600743613 0,45387759 0,622814743 0,722920265 IASQ 2,716463 1,057321078 3,655495403 1,071535994 1,154284127 2,758062522 6,08874545 1,978940776 CMS 0,412424 0,293020509 0,537311618 0,812652408 1,109037684 1,789808409 0,722107234 0,553071704 SRS 1,8757 1,173919555 1,189791633 0,54242302 0,544139471 1,326059179 2,366614954 1,494163927 VAF 1,343726 0,547649041 1,713386869 0,303561411 1,346914606 0,175764444 0,031207465 0,033773335 EMD 1,495667 0,885806537 0,726452784 0,577198843 0,766627889 0,392802267 2,598654797 6,162895966 61 SDM 0,560326 0,933397526 1,28136451 2,353797669 4,342989266 0,830311832 1,849909892 3,482826094 EMS 1 1 22,4589245 1,29635452 0,897807708 1 0,608257876 0,658268669 EUR 2,779893 0,382261961 0,799130453 0,552019185 0,710934419 1,776016717 1,678142235 0,526176396 JUJ 1,427588 0,540697484 0,85341001 0,767543442 1 1,502052419 2,545192896 1,033277985 LOM 1,833715 1,054700623 1,521085172 0,858315712 1,010660456 3,561179513 1,44086483 2,149481119 MLB 1,477706 0,731993909 0,456714006 0,681157493 0,475810293 0,775777673 1,34089382 0,630220434 PZF 1,206167 0,657195063 0,918763175 1,104972383 0,9881544 0,491187299 2,075264176 0,540654344 LHJM 4,31102 1,136370707 1,014623821 3,41165157 5,45216184 1,292035009 1,005612857 2,170516572 62 Anexo 6 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas lesões de endometriose das pacientes com endometriose de retossigmóide. Iniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 GHM 0,461275111 0,752421797 0,284737998 1,91386665 0,266097781 6,535896607 0,001586326 4,819549963 FFB 0,185269764 2,487356934 0,034284658 0,099890432 0,180995833 12,12897021 0,00816068 1,776328538 MEGC 0,097645634 0,194469195 0,095305741 0,354164205 0,092527652 9,430832708 0,340070319 0,486630428 ASS 0,152904138 2,522079143 0,052874171 0,177327761 0,138795085 11,48266143 0,530308949 1,553905142 MDM 0,016777823 0,961003472 0,328441182 0,829601445 3,931359749 4,294187427 0,030520132 0,608740154 MFD 0,014414847 2,093059825 0,027369387 0,082898529 0,126835314 23,67652031 0,042715545 1,104886701 ACC 0,345725604 0,3873242 0,094581835 0,571763453 0,163688899 3,571141159 0,032015292 0,61000731 MLB 1 0,843589795 0,039437364 0,29351178 0,301457888 8,860481874 0,112726999 0,699258813 MFD 0,183735124 1,164421634 0,124801479 0,297196764 0,369085864 1,717589362 0,027165229 1,308485954 AAS 0,045588993 2,938935197 0,731534057 2,701611663 6,401404113 7,418436515 0,151772783 1,715725124 MFD 0,528043744 1,3995117 1,073749111 0,405768932 0,804072998 9,222099051 0,009024827 2,541162153 DRB 1 3,093764857 0,232389524 0,424671828 0,433786899 33,91696471 0,183043062 1,685572214 SFR 0,472180168 3,294303668 0,505922721 0,536909305 1,490801718 10,05474899 0,005412703 5,059302275 MFE 0,079171739 5,32954935 0,750430795 0,676860444 0,941457835 23,88222192 0,07875662 0,085231967 ASD 0,09040832 3,096596806 0,589973041 0,321892376 1,287032413 35,9556145 0,049797772 2,77821536 PLS 0,036184091 0,425261911 1,550675632 0,23724183 0,047584924 4,971375788 0,014381171 0,707978983 SET 0,017138437 1,251730125 1,319847219 0,422144936 0,992355115 7,860086347 0,079732129 1,835277777 SDF 0,114259764 1,412943276 0,618746746 0,333764013 2,030279551 11,38825787 0,094003938 1,767007836 FF 0,10787402 0,891695813 0,63891811 0,219356644 0,388322818 9,002496673 0,081856171 2,180982868 IA 0,208523134 4,866564069 0,289196688 0,452475102 1,283024204 15,9867543 0,111033352 2,563257538 MS 0,225869183 1,294732042 1,620506646 0,869911362 1,287433922 10,01989275 0,099977343 2,855668349 PBB 0,142977432 2,342426124 0,735869037 0,857923142 1,519628197 13,7314794 0,010655152 1,994667722 63 Anexo 7 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CX CL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 no endométrio tópico das pacientes com endometriose de retossigmóide. Iniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 GHM 0,01861616 0,257673048 0,406606994 1,009394627 1,097353529 0,055030878 3,149024539 1,845355072 FFB 0,040015406 0,893545778 0,360658902 1,89669843 2,06197721 0,126165132 7,371228086 6,399230519 MEGC 0,022292456 0,341892232 0,32257509 0,464738256 0,505235664 0,028903443 1,172757722 2,44850041 ASS 0,015535359 0,420627054 0,418618199 0,60814629 0,661140311 0,104776361 4,181165066 3,012368862 MDM 0,014758597 0,88246658 0,263286771 0,381959165 0,415243182 0,03630684 2,063230493 6,319885573 MFD 0,044492296 1,631968882 0,668827901 1,182213264 1,285231626 0,088718892 5,486571857 11,68753222 ACC 0,006231086 0,309200284 0,783881204 4,241252315 4,610836111 0,23822309 6,267564769 2,214373277 MLB 0,461275111 1,422682319 0,6393629 0,641486279 0,697385555 0,037822412 22,78330282 10,18870252 MFD 0,036694289 0,479503599 0,425640382 1,050801607 1,142368724 0,086832875 2,707394273 3,43401999 AAS 0,018652843 0,74026491 5,339027343 0,785389553 0,853828596 0,079790741 13,03153387 5,30149201 MFD 0,017712226 0,200140293 3,81482516 0,617037601 0,670806413 0,130327656 5,545528659 1,433327649 DRB 0,046132566 0,589593918 1,259470157 0,079307456 0,086218328 0,015252031 2,29969893 4,222444433 SFR 2,953937609 1,782650089 0,221732006 0,226063552 0,304176033 1,336273353 0,891270339 1,386904489 MFE 2,63914269 0,679777044 0,682115021 0,424177591 0,367327392 1,235414494 1,101649278 0,423486662 ASD 1,41969336 2,34302695 0,552510175 0,460655554 0,704620516 3,860894576 1,794528704 1,581801357 PLS 1,244261184 1,068964208 1,347062638 1,702565513 1,94001578 8,748557515 1,456893077 2,077946395 SET 2,523470734 1,915782192 0,623188682 0,742730286 0,599606691 1,190299941 1,647107823 0,39973573 SDF 2,142268565 1,690644757 0,5769279 0,72107954 0,502441796 1,262816627 1,828049327 0,914565522 FF 1,011509139 1,051955406 0,758889078 0,653083929 0,48771099 7,839682139 2,121059365 1,688437103 IA 1,355109426 2,508410647 0,598794526 1,47553722 2,295484017 2,892456297 1,953139507 1,721956189 MS 0,764829118 0,441539236 0,520377662 0,599765446 1,335785526 0,607924961 1,513433201 0,44876076 PBB 0,76678252 0,572426969 0,39506582 0,299241114 0,414170983 4,846136903 1,392449494 0,401187466 64 Anexo 8 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas lesões de endometriose das pacientes com endometriose retrocervical. Iniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 PPD 0,991510087 1,183954426 1,769947953 1,007297831 0,754204878 5,405339228 1,628907861 0,589228222 MFC 0,325944753 4,001701479 0,64113805 0,210587296 0,434680833 23,26977186 0,038926731 2,281366823 MJS 0,079422928 4,508393833 0,239103464 0,312188719 0,313606722 16,92853428 0,174936713 2,371662033 FV 0,367215626 1,504843594 0,433380738 1 0,871775393 8,909751295 0,007779564 2,058935217 CI 0,138763434 5,016264942 0,132742931 0,368181824 0,175924508 17,72096375 0,030946177 1,134375625 CP 0,245334045 2,563639757 0,689985016 2,307867363 1,19413702 14,9504309 0,133220222 1,825306121 CC 0,972061404 3,506625953 1,609861904 0,662269495 0,866323878 12,04619123 0,605851028 2,741049606 ADV 1,901739125 4,619682008 3,75212252 0,917939078 0,575476287 10,90120084 7,121716469 5,150556923 EDT 1,964264697 4,519626483 2,986875155 1,175252144 0,882726483 17,67728933 2,517069409 3,93100565 MGS 0,086662962 1,824515678 0,293492784 0,228701909 0,343596772 10,23000653 0,125930967 1,84543182 65 Anexo 9 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 n o endométrio tópico das pacientes com endometriose retrocervical. Iniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 PPD 0,825705577 0,564206199 1,2515422 1 1 0,569348995 1,063562636 0,084079531 MFC 0,504420689 0,704943389 1 0,279998366 0,136032982 2,147093713 0,924602392 1,809885509 MJS 0,957071992 0,515101272 1,326575639 0,403737728 0,439223876 1,093827441 1,329519558 1 FV 0,959729241 0,514153398 0,548934887 0,937239922 3,155849459 1,448324785 0,993715656 0,220354526 CI 0,252035586 0,83971078 0,272193956 0,912243147 0,413519821 0,333182645 2,07039351 0,102870301 CP 0,513832253 0,700359589 0,627517213 0,513996454 0,724430095 3,364996866 3,736441669 1,01389513 CC 0,636317787 0,643352895 0,095963324 1,094680845 0,489434731 2,486635696 1 0,957569056 ADV 0,781733818 0,58166733 0,333948361 0,307355523 0,386906907 3,975772377 2,75743141 0,561885641 EDT 1,395468303 0,38012128 0,561273923 0,693472372 0,423750915 1,056992516 0,939662774 0,842716009 MGS 1,596817409 0,330605491 0,144914809 0,045905802 0,044090095 0,128800952 2,406147359 0,461204482 66 Anexo 10 – Idade, raça, paridade, prática de exercícios fís icos e fase do ciclo menstrual das pacientes submetidas à laqueadura tubária. Iniciais Idade Fase do Ciclo Menstrual VDR 31 Folicular MHS 26 Folicular MEGC 29 Folicular AS 39 Folicular MAJF 32 Lútea CAAS 24 Lútea MLO 30 Lútea VMS 31 Folicular CSA 36 Folicular PGOS 29 Folicular COJ 28 Lútea NMAB 27 Lútea SMS 34 Lútea MJSL 33 Folicular SRS 31 Folicular SMK 34 Lútea SDF 34 Lútea MLS 32 Folicular LLS 34 Lútea IASQ 33 Folicular CMS 38 Lútea SRS 29 Lútea VAF 35 Lútea EMD 30 Folicular SDM 29 Folicular EMS 35 Lútea EUR 33 Lútea JUJ 33 Folicular LOM 29 Lútea MLB 33 Folicular PZF 37 Lútea LHJM 35 Folicular 67 Anexo 11 – Idade, raça, paridade, prática de exercícios fís icos e fase do ciclo menstrual das pacientes com endometriose de retossigmóide. Iniciais Idade Fase do Ciclo Menstrual GHM 30 Folicular FFB 36 Lútea MEGC 41 Folicular ASS 30 Lútea MDM 29 Lútea MFD 35 Lútea ACC 37 Lútea MLB 40 Lútea MFD 25 Lútea AAS 38 Lútea MFD 33 Folicular DRB 34 Folicular SFR 39 Folicular MFE 30 Lútea ASD 32 Lútea PLS 33 Lútea SET 37 Lútea SDF 36 Folicular FF 45 Folicular IA 27 Folicular MS 30 Lútea PBB 34 Lútea 68 Anexo 12 – Idade, raça, paridade, prática de exercícios físicos e fase do ciclo menstrual das pacientes com endometriose retrocervical. Iniciais Idade Fase do Ciclo Menstrual PPD 34 Lútea MFC 36 Lútea MJS 47 Lútea FV 35 Lútea CI 32 Lútea CP 31 Folicular CC 38 Folicular ADV 27 Folicular EDT 29 Folicular MGS 38 Folicular 69 Anexo 13 – Queixas clínicas das pacientes submetidas à laqueadura tubária (notas atribuídas por meio da aplicação da escala visual analógica de dor) Iniciais Dismenorréia Dispareunia de profundidade Dor pélvica crônica Alteração Intestinal Alteração Urinária VDR 0 0 0 0 0 MHS 0 0 0 0 0 MEGC 5 0 0 0 0 AS 0 0 0 0 0 MAJF 6 0 0 0 0 CAAS 4 0 0 0 0 MLO 2 0 0 0 0 VMS 0 0 0 0 0 CSA 4 0 0 0 0 PGOS 5 0 0 0 0 COJ 0 0 0 0 0 NMAB 0 0 0 0 0 SMS 0 0 0 0 0 MJSL 0 0 0 0 0 SRS 0 0 0 0 0 SMK 0 0 0 0 0 SDF 2 0 0 0 0 MLS 0 0 0 0 0 LLS 0 0 0 0 0 IASQ 0 0 0 0 0 CMS 0 0 0 0 0 SRS 0 0 0 0 0 VAF 0 0 0 0 0 EMD 0 0 0 0 0 SDM 0 0 0 0 0 EMS 2 0 0 0 0 EUR 3 0 0 0 0 JUJ 2 0 0 0 0 LOM 4 0 0 0 0 MLB 5 0 0 0 0 PZF 0 0 0 0 0 LHJM 0 0 0 0 0 70 Anexo 14 – Queixas clínicas das pacientes com endometriose de retossigmóide (notas atribuídas por meio da aplicação da escala visual analógica de dor) Iniciais Dismenorréia Dispareunia de profundidade Dor pélvica crônica Alteração Intestinal Alteração Urinária GHM 0 0 0 0 0 FFB 0 0 0 0 0 MEGC 5 0 0 0 0 ASS 0 0 0 0 0 MDM 6 0 0 0 0 MFD 4 0 0 0 0 ACC 2 0 0 0 0 MLB 0 0 0 0 0 MFD 4 0 0 0 0 AAS 5 0 0 0 0 MFD 0 0 0 0 0 DRB 0 0 0 0 0 SFR 0 0 0 0 0 MFE 0 0 0 0 0 ASD 0 0 0 0 0 PLS 0 0 0 0 0 SET 2 0 0 0 0 SDF 0 0 0 0 0 FF 0 0 0 0 0 IA 0 0 0 0 0 MS 0 0 0 0 0 PBB 0 0 0 0 0 71 Anexo 15 – Queixas clínicas das pacientes com endometriose retrocervical (notas atribuídas através da aplicação da escala visual analógica de dor) Iniciais Dismenorréia Dispareunia de profundidade Dor pélvica crônica Alteração Intestinal Alteração Urinária PPD 8 6 2 5 0 MFC 10 1 2 1 0 MJS 0 1 0 0 0 FV 0 0 0 0 0 CI 9 3 2 0 0 CP 5 0 0 0 0 CC 9 5 8 0 0 ADV 10 7 0 10 0 EDT 8 0 8 0 0 MGS 10 0 0 5 0 72 6 – REFERÊNCIAS 73 Abbas A, Lichtman A and Pillai S. Imunidade inata In Imunologia celular e molecular. 2011. Elsevier, Rio de Janeiro, pp. 55-88. Abrao MS, Podgaec S, Dias JA, Jr., Averbach M, Garry R, Silva LFF and Carvalho FM. Deeply infiltrating endometriosis affecting the rectum and lymph nodes. Fertility and Sterility 2006; 86:543-547. Acién P , Velasco I . Endometriosis: a disease that remains enigmatic. ISRN Obstet Gynecol. 2013 Jul 17;2013:242149. Agic A, Xu H, Finas D, Banz C, Diedrich K, Hornung D. Is endometriosis associated with systemic subclinical inflammat ion? Gynecol Obstet Invest 2006;62:139-47. Al-Jefout M, Dezarnaulds G, Cooper M, Tokushige N, Luscombe GM, Markham R, Fraser IS. Diagnosis of endometriosis by detection of nerve fibres in an endometrial biopsy: a double blind study. Hum Reprod. 2009 Dec;24(12):3019-24. André GM, Barbosa CP, Teles JS, Vilarino FL, Christofolini DM, Bianco B. Analysis of FOXP3 polymorphisms in infertile women with and without endometriosis. Fertil Steril 2011;95:2223-7. Arina A, Murillo O, Dubrot J, Azpilikueta A, Alfaro C, Perez -Gracia JL, Bendandi M, Palencia B, Hervas -Stubbs S and Melero I. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert Opinion on Biological Therapy 2007; 7:599-615. Arruda MS, Petta CA, Abrao MS and Benetti -Pinto CL. Time elapsed from onset of symptoms to diagnosis of endometriosis in a cohort study of Brazilian women. Human Reproduction 2003; 18:756-759. Askenasy N, Kaminitz A, Yarkoni S. Mechanisms of T regulatory cell function. Autoimmun Rev. 2008 May;7(5):370-5. 74 Bacon K, Baggiolini M, Broxmeyer H, Horuk R, Lindley I, Mantovani A, Matsushima K, Murphy P, Nomiyama H, Oppenheim J et al. Chemokine/chemokine receptor nomenclature. Cytokine 2003; 21:48-49. Barrier BF. Immunology of endometriosis. Clin Obstet Gynecol 2010;53:397- 402. Basta P, Majka M, Jozwicki W, Lukaszewska E, Knafel A, Grabiec M, et al. The frequency of CD25+CD4+ and FOXP3+ regulatory T cells in ectopic endometrium and ectopic decidua. Reprod Biol Endocrinol 2010;8:116. Bellelis P, Dias JA, Podgaec S, Gonzales M, Baracat EC and Abrão MS. Epidemiological and clinical a spects of pelvic endometriosis –a case series. Rev Assoc Med Bras 2010; 56:467-471. Berbic M, Hey -Cunningham AJ, Ng C, Tokushige N, Ganewatta S, Markham R, Russell P and Fraser IS. The role of Foxp3+regulatory T -cells in endometriosis: a potential controlli ng mechanism for a complex, chronic immunological condition. Human Reproduction 2010; 25:900-907. Berbic M, Fraser IS. Regulatory T cells and other leukocytes in the pathogenesis of endometriosis. J Reprod Immunol 2011;88:149-55. Berbic M , Fraser IS . Immunology of normal and abnormal menstruation. Womens Health (Lond Engl). 2013 Jul;9(4):387-95. Berkkanoglu M and Arici A. Immunology and endometriosis. American Journal of Reproductive Immunology 2003; 50:48-59. Boyman O, Krieg C, Homann D and Sprent J. Homeostatic maintenance of T cells and natural killer cells. Cellular and Molecular Life Sciences 2012; 69:1597-1608. Braundmeier A, Jackson K, Hastings J, Koehler J, Nowak R and Fazleabas A. Induction of endometriosis alters the peripheral and endometrial regulatory T 75 cell population in the non -human primate. Human Reproduction 2012; 27:1712-1722. Bulun SE. Mechanisms of Disease Endometriosis. New England Journal of Medicine 2009; 360:268-279. Budiu RA, Diaconu I, Chrissluis R, Dricu A, Edwards RP, Vlad AM. A conditional mouse model for human MUC1 -positive endometriosis shows the presence of anti -MUC1 antibodies and Foxp3+ regulatory T cells. Dis Model Mech 2009;2:593-603. Cameron MJ and Kelvin DJ. Cytokines and chemokines - Their receptors and their genes: An overview. Cytokines and Chemokines in Autoimmune Disease 2003; 520:8-32. Campbell JJ, Bowman EP, Murphy K,Youngman KR, Siani MA, Thompson DA, et al. 6 -C-kine (SLC), a lymphocyte adhesion -triggering chemokine expressed by high endothelium, is an agonist for the MIP -3beta receptor CCR7. J Cell Biol 1998;141:1053–9. Campbell JJ, Qin S, Unutmaz D, Soler D, Murphy KE, Hodge MR, et al. Unique subpopulations of CD56+ NK and NK -T peripheral blood lymphocytes identified by chemokine receptor expression repertoire. J Immunol 2001;166:6477–82. Clore GM and Gronenborn AM. 3 -Dimensional structures of alpha - chemokines and beta-chemokines. Faseb Journal 1995; 9:57-62. Corthay A. How do regulatory T cells work? Scand J Immunol. 2009 Oct;70(4):326-36. Cramer DW, Titus-Ernstoff L, McKolanis JR, Welch WR, Vitonis AF, Berkowitz RS and Finn OJ. Conditions associated with antibodiesagainst the tumor - associated antigen MUC1 and their relationship to risk for ovarian cancer. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2005;14:1125-1131. 76 Dias Jr JA, Oliveira RM, Podgaec S, Abrao MS. Endometriosis and immunology: is the dosage of the natural killer cells relevant? Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2005;123:S14-5. Dias JA, Jr., Podgaec S, de Oliveira RM, Carnevale Marin ML, Baracat EC and Abrao MS. Patients With Endometriosis of the Rect osigmoid Have a Higher Percentage of Natural Killer Cells in Peripheral Blood. Journal of Minimally Invasive Gynecology 2012; 19:317-324. Dong VM, McDermott DH and Abdi R. Chemokines and diseases. European Journal of Dermatology 2003; 13:224-230. Ekman AK , Sigurdardottir G , Carlström M, Kartul N , Jenmalm MC, Enerbäck C. Systemically elevated Th1-, Th2- and Th17-associated chemokines in psoriasis vulgaris before and after ultraviolet B treatment. Acta Derm Venereol. 2013 Sep 4;93(5):527-31. Engel I and Kronenberg M. Making memory at birth: understanding the differentiation of natural killer T cells. Current Opinion in Immunology 2012; 24:184-190. Fairbanks F, Abrao MS, Podgaec S, Dias JA, Jr., de Oliveira RM and Rizzo LV. Inte rleukin-12 but not interieukin -18 is associated with severe endometriosis. Fertility and Sterility 2009; 91:320-324. Fassbender A, Overbergh L, Verdrengh E, Kyama CM, Vodolazakaia A, Bokor A, et al. How can macroscopically normal peritoneum contribute to t he pathogenesis of endometriosis? Fertil Steril 2011;96:697-9. Filaci G, Fenoglio D and Indiveri F. CD8(+) T regulatory/suppressor cells and their relationships with autoreactivity and autoimmunity. Autoimmunity 2011; 44:51-57. Fontenot JD, Rasmussen JP, Williams LM, Dooley JL, Farr AG and Rudensky AY. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor FoxP3. Immunity 2005; 22:329-341. 77 Furuya M, Suyama T, Usui H, Kasuya Y, Nishiyama M, Tanaka N, et al. Up - regulation of CXC chemokin es and their receptors: implications for proinflammatory microenvironments of ovarian carcinomas and endometriosis. Hum Pathol 2007;38:1676–87. Gao X, Yeh YC, Outley J, Simon J, Botteman M and Spalding J. Health - related quality of life burden of women with endometriosis: a literature review. Curr Med Res Opin 2006; 22:1787-1797. Glace L, Grygielko ET, Boyle R, Wang Q, Laping NJ, Sulpizio AC, et al. Estrogen-induced stromal cell -derived factor -1 (SDF -1/Cxcl12) expression is repressed by progesterone and by S elective Estrogen Receptor Modulators via estrogen receptor alpha in rat uterine cells and tissues. Steroids 2009;74:1015-24. Gonçalves R, Teixeira A, Campos W and Orefice F. O papel das quimiocinas nas uveítes. . 2007 Arq Bras Oftalmol pp. 363-370. Groom JR , Luster AD . CXCR3 ligands: redundant, collaborative and antagonistic functions. Immunol Cell Biol. 2011 Feb;89(2):207-15. Harada T, Iwabe T and Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis . Fertility and Sterility 2001; 76:1-10. Heilier J-F, Donnez J, Nackers F, Rousseau R, Verougstraete V, Rosenkranz K, Donnez O, Grandjean F, Lison D and Tonglet R. Environmental and host - associated risk factors in endometriosis and deep endometriotic nodules: A matched case-control study. Environmental Research 2007; 103:121-129. Heiseke AF, Faul AC, Lehr HA, Förster I, Schmid RM, Krug AB, et al. CCL17 promotes intestinal inflammation in mice and counteracts regulatory T cell - mediated protection from colitis. Gastroenterology 2012;142:335-45. Hemmings R, Rivard M, Olive DL, Poliquin -Fleury J, Gagne D, Hugo P and Gosselin D. Evaluation of risk factors associated with endometriosis. Fertility and Sterility 2004; 81:1513-1521. 78 Herington JL, Bruner-Tran KL, Lucas JA, Osteen KG. Immune interactions in endometriosis. Expert Rev Clin Immunol 2011;7:611-26. Hill JA, Faris HM, Schiff I, Anderson DJ. Characterization of leukocyte subpopulations in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril 1988;50:216-22. Inngjerdingen M, Damaj B, Maghazachi AA. Expression and regulation of chemokine receptors in human natural killer cells. Blood 2001;97:367–75. Iwasaki K, Makino T, Maruyama T, Matsubayashi H, Nozawa S and Yokokura T. Leukocyte subpopulations and natural -killer activity in endometriosis. International Journal of Fertility 1993; 38:229-234. Izcue A, Hue S, Buonocore S, Arancibia -Cárcamo CV, Ahern PP, Iwakura Y, et al. Interleukin-23 restrains regulatory T cell activity to drive T cell - dependent colitis. Immunity 2008;28:559–70. Jonuleit H and Schmitt E. The regulatory T cell family: Distinct subsets and their interrelations. Journal of Immunology 2003; 171:6323-6327. Josefowicz SZ, Lu LF, Rudensky AY. Regulatory T cells: mechanisms of differentiation and function. Annu Rev Immunol. 2012;30:531-64. Kashima K, Ishimaru T, Okamura H, Suginami H, Ikuma K, Murakami T, Iwashita M and Tanaka K. Familial risk among Japanese patients wi th endometriosis. International Journal of Gynecology & Obstetrics 2004; 84:61 - 64. Kikuchi Y, Ishikawa N, Hirata J, Imaizumi E, Sasa H and Nagata I. Changes of peripheral-blood lymphocyte subsets before and after operation of patients with endometriosis. Acta Obstetricia Et Gynecologica Scandinavica 1993; 72:157-161. Kim CH, Pelus LM, Appelbaum E, Johanson K, Anzai N, Broxmeyer HE. CCR7 ligands, SLC/6Ckine/Exodus2/TCA4 and CKbeta -11/MIP-3beta/ELC, 79 are chemoattractants for CD56(+)CD16( -) NK cells and late s tage lymphoid progenitors. Cell Immunol 1999;193:226 –35. Kirkwood BR and Sterne JAC. Essential medical statistics. 2006. Blackwell Science: Massachusetts, USA. p.502. Koninckx PR and Martin DC. Deep endometriosis - a consequence of infiltration or retraction or possibly adenomyosis externa. Fertility and Sterility 1992; 58:924-928. Linsen L, Somers V , Stinissen P . Immunoregulation of autoimmunity by natural killer T cells. Hum Immunol. 2005 Dec;66(12):1193-202. Loetscher P and Moser B. Homing chemokines in rheumatoid arthritis. Arthritis Research 2002; 4:233-236. Long SA and Buckner JH. CD4(+)FOXP3(+) T Regulatory Cells in Human Autoimmunity: More Than a Numbers Game. Journal of Immunology 2011; 187:2061-2066. Maeda N, Izumiya C, Yamamoto Y, Oguri H, Kusume T and Fukaya T. Increased killer inhibitory receptor KIR2DL1 expression among natural killer cells in women with pelvic endometriosis. Fertility and Sterility 2002; 77:297 - 302. Maloy KJ and Powrie F. Regulatory T cells in the control of immune pathology. Nature Immunology 2001; 2:816-822. Matsubayashi H, Hosaka T, Sugiyama Y, Suzuki T, Arai T, Kondo A, et al. Increased natural killer -cell activity is associated with infertile women. Am J Reprod Immunol 2001;46:318-22. Menetrier-Caux C, Curiel T, Faget J, Manuel M, Caux C and Zou W. Targeting regulatory T cells. Targeted Oncology 2012; 7:15-28. 80 Meyer R. Uber den staude der frage der adenomyosites adenomyoma in allgemeinen und adenomyonetitis sarcomatosa. 1919. Zentralbl Gynakol, German, pp. 745-759. Morris MA , Ley K . Trafficking of natural killer cells . Curr Mol Med. 2004 Jun;4(4):431-8. Moser B and Loetscher P. Lymphocyte traffic control by chemokines. Nature Immunology 2001; 2:123-128. Neter J, Kutner MH, Nachtsheim CJ and Wasserman W. Applied Linear Statistical Models. 1996. Ilinois: Richard D. Irwing. p1408. Nishida M, Nasu K, Narahara H. Role of chemokines in the pathogenesis of endometriosis. Front Biosci 2011;3:1196-204. Oei AL, Moreno M, Verheijen RH, Sweep FC, Thomas CM, Massuger LF and von Mensdorff-Pouilly S. Induction of IgG antibodies to MUC1 and survival in patients with epithelial ovarian cancer. Int. J. Cancer 2008;123:1848-1853. Oosterlynck DJ, Cornillie FJ, Waer M, Vandeputte M and Koninckx PR. Women with endometriosis show a defect in natural-killer activity resulting in a decreased cytotoxicity to autologous endometrium. Fertility and Sterility 1991; 56:45-51. Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Vandeputte M an d Koninckx PR. The natural-killer activity of peritoneal -fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertility and Sterility 1992; 58:290-295. Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Koninckx PR. Transforming growth factor-beta activity is incr eased in peritoneal fluid from women with endometriosis. Obstet Gynecol 1994;83:287-92. Ota H, Rong H, Igarashi S and Tanaka T. Suppression of natural killer cell activity by splenocyte transplantation in a rat model of endometriosis. Human Reproduction 2002; 17:1453-1458. 81 Park SG, Mathur R, Long M, Hosh N, Hao L, Hayden MS, et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity 2010;33:791–803. Peterson RA. Regulatory T-cells: diverse phenotypes integral to immune homeostasis and suppression. Toxicol Pathol. 2012;40(2):186-204. Podgaec S, Abrao MS, Dias JA, Jr., Rizzo LV, de Oliveira RM and Baracat EC. Endometriosis: an inflammatory disease with a Th2 immune response component. Human Reproduction 2007; 22:1373-1379. Podgaec S, Dias Junior JA, Chapron C, de Oliveira RM, Baracat EC and Abrao MS. TH1 and TH2 immune responses related to pelvic endometriosis. Revista Da Associacao Medica Brasileira 2010; 56:92-98. Podgaec S, Goncalves MO, Klajner S and Abrao MS. Epigastric pain relating to menses can be a symptom of bowel endometriosis . Sao Paulo Medical Journal 2008; 126:242-244. Podgaec S, Rizzo LV, Fernandes LFC, Baracat EC, Abrao MS. CD4+CD25highFoxp3+ Cells Increased in the Peritoneal Fluid of Patients with Endometriosis. American Journal of Reproductive Immunology 2012; 68: 301 - 308. Prieto GA. Progression of endometriosis to cancer: too MUCh FoxP3+ regulatory T-cell response? Dis Model Mech 2011;4:139-40. Qin S, Sui Y, Soloff AC, Junecko BAF, Kirschner DE, Murphey -Corb MA, Watkins SC, Tarwater PM, Pease JE, Barratt-Boyes SM et al. Chemokine and cytokine mediated loss of regulatory T cells in lymph nodes during pathogenic simian immunodeficiency virus infection. Journal of Immunology 2008; 180:5530-5536. Raman D, Baugher PJ, Thu YM and Richmond A. Role of chemokines in tumor growth. Cancer Letters 2007; 256:137-165. 82 Raman D, Sobolik -Delmaire T and Richmond A. Chemokines in health and disease. Experimental Cell Research 2011; 317:575-589. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 1997;67:817-21. Robertson MJ. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. Journal of Leukocyte Biology 2002; 71:173-183. Rollins BJ. Chemokines. Blood 1997; 90:909-928. Romagnani P, Annunziato F, Lazzeri E, Cosmi L, Beltrame C, Lasagni L, et al. Interferon -inducible protein 10, monokine induced by interferon gamma, and interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant are produced by thymic epithelial cells and attract T -cell receptor (TCR) alphabeta+ CD8+ single - positive T cells, TCR g ammadelta+ T cells, and natural killer -type cells in human thymus. Blood 2001;97:601–7. Rudensky AY. Regulatory T cells and Foxp3. Immunological Reviews 2011; 241:260-268. Sakaguchi S, Miyara M, Costantino CM and Hafler DA. FOXP3(+) regulatory T cells in t he human immune system. Nature Reviews Immunology 2010; 10:490-500. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M and Toda M. Immunological self - tolerance maintained by activated T -cells expressing IL -2 receptor alpha - chains (CD25) - breakdown of a single mech anism of self -tolerance causes various autoimmune-diseases. Journal of Immunology 1995; 155:1151-1164. Sallusto F, Lenig D, Mackay CR and Lanzavecchia A. Flexible programs of chemokine receptor expression on human polarized T helper 1 and 2 lymphocytes. Journal of Experimental Medicine 1998; 187:875-883. 83 Sampson JA. Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity. American Journal of Obstetrics and Gynecology 1927; 14:422-469. Seddon B and Mason D. The third function of the thymus. Immunology Today 2000; 21:95-99. Selmi C. Autoimmunity in 2010. Autoimmunity Reviews 2011; 10:725-732. Sikora J, Mielczarek -Palacz A and Kondera -Anasz Z. Role of Natural Killer Cell Activity in the Pathogenesis of Endom etriosis. Current Medicinal Chemistry 2011; 18:200-208. Shimoya K, Zhang Q, Temma -Asano K, Hayashi S, Kimura T, Murata Y. Fractalkine in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Int J Gynaecol Obstet 2005;91:36-41. Singer JM and Andrade DF. Analys is of longitudinal data. In Handbook of Statistics. 2000. Bio-Environmental and Public Health Statistics. P.K. Sen and C.R. Rao. Amsterdam: North Holland. pp115-160. Stefanson H, Geirsson RT, Steinthorsdottir V, Jonsson H, Manolescu A, Kong A, Ingadottir G, Gulcher J and Stefansson K. Genetic factors contribute to the risk of developing endometriosis. Human Reproduction 2002; 17:555-559. Tanaka E, Sendo F, Kawagoe S and Hiroi M. Decreased natural -killer-cell activity in women with endometriosis. Gynecologic and Obstetric Investigation 1992; 34:27-30. Taub DD, Sayers TJ, Carter CR, Ortaldo JR. Alpha and beta chemokines induce NK cell migration and enhance NK -mediated cytolysis. J Immunol 1995;155:3877–88. Ulukus M, Ulukus EC, Goker ENT, Tavmergen E, Zheng W a nd Arici A. Expression of interleukin -8 and monocyte chemotactic protein 1 in women with endometriosis. Fertility and Sterility 2009; 91:687-693. 84 Vercellini P, Fedele L, Aimi G, Pietropaolo G, Consonni D and Crosignani PG. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Hum Reprod 2007; 22:266-271. Vicari AP and Caux C. Chemokines in cancer. Cytokine & Growth Factor Reviews 2002; 13:143-154. Viganò P, Parazzini F, Somigliana E and Vercellini P. Endometriosis: epidemiology and aetiological factors. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2004; 18:177-200. Vinatier D, Orazi G, Cosson M and Dufour P. Theories of endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2001; 96:21-34. Vivier E, Raulet DH, Moretta A, Caligiuri MA, Zitvogel L, Lanier LL, Yokoyama WM and Ugolini S. Innate or Adaptive Immunity? The Example of Natural Killer Cells. Science 2011; 331:44-49. Waldmann H and Cobbold S. Regulating the immune response to transplants: A role for CD4(+) regulatory cells? Immunity 2001; 14:399-406. Watanabe M, Shimoya K, Zhang Q, Temma -Asano K, Kimura T, Murata Y. The expression of fractalkine in the endometrium during the menstrual cycle. Int J Gynaecol Obstet 2006;92:242-7. Yoneda O, Imai T, Goda S, Inoue H, Yamauchi A, Okazaki T, et al. Fractalkine-mediated endothelial cell injury by NK cells. J Immunol 2000;164:4055-62. Zhang Q, Shimoya K, Temma K, Kimura T, Tsujie T, Shioji M, et al. Expression of fractalkine in the Fallopian tube and of CX3CR1 in sperm. Hum Reprod 2004;19:409-14. 85 9. ARTIGO PUBLICADO Transcriptional changes in the expression of chemokines related to natural killer and T-regulatory cells in patients with deep infiltrative endometriosis Patrick Bellelis, M.D., a Denise Frediani Barbeiro, M.D., b Luiz Vicente Rizzo, M.D., Ph.D., c Edmund Chada Baracat, M.D., Ph.D., a Mauricio Sim~oes Abr~ao, M.D., Ph.D.,a and Sergio Podgaec, M.D., Ph.D. a a Department of Obstetrics and Gynecology, University of S~ao Paulo, b Medical Investigation Laboratory (LIM 51), School of Medicine, University of S ~ao Paulo, and c Albert Einstein Israeli Hospital, S ~ao Paulo, Brazil

To evaluate the expression of chemokines that regulate natural killer (NK) and T-regulatory (T-reg) cell activity in eutopic and ectopic endometrial tissue samples from endometriosis patients. Design: Case-control study (Canadian Task Force classifi cation II-2). Setting: Tertiary referral hospital. Patient(s): Sixty-four consecutive patients with and without endometriosis. Intervention(s): After videolaparoscopy, patients were divided into three groups: bowel endometriosis (n ¼ 22), retrocervical endome- triosis (n ¼ 10), and endometriosis-free women (n ¼ 32). Main Outcome Measure(s): Gene expression of the chemokines that regulate NK (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1, and CX3CL1) and T-reg cell activity (CCL17 and CCL21) evaluated by real-time polymerase chain reaction. Result(s): Of the chemokines associated with NK cells, CX3CL1 and CXCL12 expression was statistically signi ficantly greater in the foci of endometriosis compared with the eutopic endometrium in patients and controls. From the chemokines associated with T-reg cells, CCL17 expression was statistically signi ficantly greater in the eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid endome- triosis compared with the foci of endometriosis or eutopic endometrium of the patients with retrocervical endometriosis or the disease-free women. Conclusion(s): Both T-reg and NK cells mediate infl ammatory response and may play a fundamental role in endometriosis by causing an impaired clearing of endometrial cells. Establishing how CCL17, CXCL12, and CX3CL1 mod- ulate this response is essential to understanding inflammatory responses in endometriosis. (Fer- til Steril /C2102013;99:1987–93. /C2112013 by American Society for Reproductive Medicine.) Key Words: Chemokines, endometriosis, endometrium, NK cells, T-regulatory cells Discuss: You can discuss this article with its authors and with other ASRM members at http:// fertstertforum.com/bellelisp-chemokines-nk-t-regulatory-cells-endometriosis/ Use your smartphone to scan this QR code and connect to the

forum for this article now.* * Download a free QR code scanner by searching for “QR scanner” in your smartphone ’s app store or app marketplace. I n recent years, a number of studies have been published on the role of im- munologic factors in the pathogenesis of endometriosis. Endometriotic lesions have been associated with the presence of various cytokines and with various types of in flammatory response (1–3). In this respect, the balance between immunity and tolerance is important to maintain immune homeostasis, thus justifying the many mechanisms i n v o l v e di nk e e p i n gt h ei m m u n e response under control, including the activity of the natural killer (NK) and T-regulatory (T-reg) cells(4–6). Natural killer cells play a major role in the immune system of vertebrates, and they constitute an important part of the innate immune response. These lymphocytes are capable of differenti- ating between virus-infected cells, neo- plastic cells, and normal cells (7). Natural killer cells can recognize the major histocompatibility complex (MHC) expressed on the surface of po- tential target cells and can eliminate Received September 24, 2012; revised February 18, 2013; accepted February 20, 2013; published online March 18, 2013. P.B. has nothing to disclose. D.F.B. has nothing to disclose. L.V.R. has nothing to disclose. E.C.B. has nothing to disclose. M.S.A. has nothing to disclose. S.P. has nothing to disclose. Supported by Fundac¸ ~ao de Apoio /C18a Pesquisa do Estado de S ~ao Paulo. Grant # 2010/00475-0. Reprint requests: Patrick Bellelis, M.D., Rua Dr. Homem de Mello, 1020, Perdizes, 05007–002 S~ao Paulo, Brazil (E-mail: [email protected]). Fertility and Sterility® Vol. 99, No. 7, June 2013 0015-0282/$36.00 Copyright ©2013 American Society for Reproductive Medicine, Published by Elsevier Inc. http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2013.02.038 VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 1987 these targets accordingly. Cells expressing MHC class I mole- cules are identi fied as normal self-cells, but cells that do not express MHC class I molecules are destroyed. Expression of MHC class I has been extensively studied in pregnancy, cancer, and in immune response in general. It is well known that all normal human body cells express MHC class I on their cell surface, as endometrial cells do (8, 9) . Therefore, in endometriosis, it is reasonable to assume that NK cells participate in the immune response against the endometrial cells that are regurgitated through the tubes into the abdominal cavity during menstruation (10). T-regulatory cells, first described by Sakaguchi et al. (11) in 1995, can be activated by self or non-self antigens; once they are activated, they can suppress T cells in a non- antigen-specific manner (12, 13) . Berbic et al. (14) found an increase in Foxp3, the most speci fic marker of T-reg cells, in the eutopic endometrium of patients with endometriosis during the secretory phase of the menstrual cycle. The role played by these cells in the in flammation process appears to be important in coordinating the immune response against ectopic endometrial cells. Consequently, cells such as T-reg and NK cells that mediate in flammatory response appear to play a fundamental role in endometriosis by causing an impaired clearance of endometrial cells. Because T-reg cells exert their function by producing in- hibitory cytokines, it has been speculated that the endometrial cells present in the peritoneal cavity fail to be eliminated be- cause of a defective immune response. This defective response would be due to a decrease in the activity of NK cells, macro- phages, dendritic cells, or CD4 and CD8 lymphocytes that may be suppressed by the action of the T-reg cells (15, 16) . However, studies have reported con flicting results, with some reporting that the number of NK cells decrease (4), increase (17, 18) ,r e m a i n e du n c h a n g e d(19), or vary in accordance with the stage (20) of the disease (21).A sr e p o r t e db yo u r group, in patients with endometriosis, particularly those with advanced stages of the disease such as rectosigmoid endometriosis, the concentration of NK cells in peripheral blood is higher (16). Furthermore, the concentration of T-reg cells in the peritoneal fluid of patients with endometriosis has also been found to be higher compared with that of women without endometriosis (22). It has been well established that T-reg cells in humans are regulated by the CCL17 and CCL21 chemokines (ligands of CCR4 and CCR7), which can modulate the activity of T-reg cells in the tissues by, respectively, hampering or exacerbating these responses. It is also understood that the migration of NK cells increases in response to the presence of certain chemo- kines such as CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1, and CX3CL1. The cytolytic activity of NK cells may increase in re- sponse to CXCL10 and CX3CL1 as well (5, 23). Therefore, we evaluated the expression of the chemokines that regulate the activity of the NK and T-reg cells in eutopic and ectopic endometrial tissue samples from patients with endometriosis.

This study was conducted in the endometriosis division of the Department of Gynecology at the University of S ~ao Paulo School of Medicine's Teaching Hospital, between August 2010 and May 2011. The study was approved by the institu- tion's internal review board under reference 0025/10, and all the patients read and signed an informed consent form. Sixty-four patients consecutively attending the endome- triosis clinic were admitted to the study. Women with pelvic pain and a suspicion of endometriosis were evaluated based on clinical symptoms, a physical examination, and a transva- ginal ultrasonography during which a speci fic protocol was used to map the disease (24). Surgical treatment by laparos- copy was indicated whenever the patient's clinical condition failed to improve with hormone therapy and/or when the im- aging exam suggested severe lesions of deep endometriosis affecting the rectosigmoid and retrocervical region. Biopsies were performed during the surgical procedure to obtain histo- logic confirmation of the disease. The total number of patients was determined by the number of procedures expected to be performed in this department within the referred time frame. The inclusion criteria for the patients with endometriosis were age 18 to 40 years, bowel/retrocervical endometriosis confirmed by histology, and no autoimmune diseases as con- firmed by anamnesis, a physical examination, and laboratory tests, requested whenever necessary. In addition, patients had to have normal menstrual cycles at intervals of 26 to 34 days, and should not have used hormone therapy, including GnRH analogues, progestogens, or oral contraceptives, in the 3 months preceding surgery. Accordingly, all endometriosis pa- tients who were undergoing hormone treatment (such as pro- gesterone or combined oral contraceptives) interrupted their treatment at least 3 months before surgery. The inclusion criteria for the group of women without en- dometriosis were the same as those applied to the previous group with the exception of the requirement for histologic confirmation of endometriosis. These women were undergo- ing tubal ligation as a permanent method of contraception. In both groups, the day of the menstrual cycle on the day of surgery was recorded, thus determining the phase of the cycle (luteal or follicular). The patients were then divided into three groups: bowel endometriosis (group A, n ¼ 22 patients), retrocervical endo- metriosis (group B, n ¼ 10 patients), and women without the disease (group C, control, n ¼ 32 patients). After anesthesia and with the patient placed in position, a sample of the eu- topic endometrium was collected using a Pipelle curette (groups A, B, and C). During surgery, tissue samples were ob- tained from the ectopic endometrium (groups A and B). The tissue samples from the eutopic and ectopic endometrium were divided into two equal parts and sent to the laboratory to be stored until analysis. Gene expression was determined by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis using the B2m gene as a housekeeping gene. The total RNA was isolated from the eutopic and ectopic endometrium in the biopsy samples according to a standard Trizol RNA isolation protocol (Invitrogen). Samples of total RNA were quanti fied by measuring the optical density at 260 nm (Nano Vue Plus Spectrophotometer; GE). All RT-PCR reaction mixtures were prepared using Superscript Platinum III One-Step kits with incorporated SYBR Green (11736-051; Invitrogen). 1988 VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 ORIGINAL ARTICLE: ENDOMETRIOSIS The production of complementary DNA (cDNA) and DNA amplification were performed on a Step One thermocycler (Applied Biosystems), and the ampli fication products were confirmed on a 1.5% agarose gel. The primers used were as follows: CCL17 sense, 5 0-ACTGAAGATGCTGGCCCTGGTC-30; CCL17 reverse, 5 0-AAACGATGGCATCCCTGGAGC-30;C C L 2 1 sense, 5 0-CCCAGCTATCCTGTTCTTGC-30; CCL21 reverse, 5 0- TCAGTCCTCTTGCAGCCTTT-30; CXCL9 sense, 5 0-TGCTGGT TCTGATTGGAGTG-30; CXCL9 reverse, 5 0-TTTGGCTGACCT GTTTCTCC-30;C X C L 1 0s e n s e ,5 0-CTGTACGCTGTACCTGC ATCA-30;C X C L 1 0r e v e r s e ,50-TTCTTGATGGCCTTCGATTC-30; CXCL11 sense, 5 0-AGAGGACGCTGTCTTTGCAT-30;C X C L 1 1 reverse, 5 0-TGGGATTTAGGCATCGTTGT-30;C X C L 1 2s e n s e , 50-GTCAGCCTGAGCTACAGATGC-30;C X C L 1 2r e v e r s e ,50-CT TTAGCTTCGGGTCAATGC-30;X C L 1s e n s e ,5 0-TGGCATCT GCTCTCTCACTG-30; XCL1 reverse, 5 0-ATTTCCTGTCCATG CTCCTG-30;C X 3 C L 1s e n s e ,50-TCTGCCATCTGACTGTCCTG- 30; and CX3CL1 reverse, 5 0-CTGTGCTGTCTCGTCTCCAA-30. Reverse transcription was performed at 45 /C14 C for 30 minutes, 95/C14 C for 5 minutes, and 5 /C14 C for 5 minutes. After reverse tran- scription, PCR was performed under the following conditions: 95/C14 C for 30 seconds, 60/C14 C for 30 seconds, and 72/C14 C for 1 minute for 35 cycles. The fold change was represented as 2/C0 DDCT. Analysis of variance (ANOVA) and Tukey's post hoc test were used to compare the results of the chemokines, and the Mann-Whitney nonparametric test was used to compare clin- ical characteristics. The tests were performed using the SAS software program, version 8.0 (SAS Inc.) and the SPSS statis- tical software package, version 15.0 (SPSS Inc.). P< .05 was considered statistically signi ficant.

The mean age of the patients in group A was 34.14 /C6 4.87 years compared with 34.70 /C6 5.66 years for the patients in group B and 31.97 /C6 3.46 years for those in group C. The groups were not statistically signi ficantly different with re- spect to age or parity (Table 1 ). In addition, the phases of the menstrual cycle at the time of surgery were similar in the group of patients with endometriosis and the group without endometriosis, with a similar number of patients and controls in the follicular and luteal phases of the menstrual cycle. Regarding the chemokines related to NK cell activity (Fig. 1 ), statistically signi ficant differences were found be- tween the groups or sites of evaluation with respect to the mean levels of CX3CL1 and CXCL12 (P< .05). Of those related to T-reg cell activity (Fig. 2 ), statistically signi ficant differ- ences were found only for CCL17 (P < .05). When chemokine expression in the eutopic endometrium was compared accord- ing to the phase of the menstrual cycle, no statistically signif- icant differences were found between the follicular and luteal phases ( Table 2 ). CX3CL1 (fractalkine) was expressed to a greater extent in the eutopic endometrium of women with retrocervical lesions compared with the other groups (P.05); although there did ap- pear to be some trends, the high standard error did not permit this hypothesis to be con firmed. Both in the patients with ret- rocervical endometriosis and in those with rectosigmoid le- sions, CXCL12 (SDF-1a) expression was greater in the foci of endometriosis compared with the eutopic endometrium (P< .05). Of the chemokines associated with T-reg cell activ- ity, CCL17 (TARC) was expressed to a greater extent in the eu- topic endometrium of patients with lesions of endometriosis in the rectosigmoid compared with the other groups (P < .05).

In recent years, research in endometriosis has focused on the etiopathogenesis of the disease (25). Although new hypothe- ses have been raised, studies have found evidence that the theory of retrograde menstruation, taken together with im- munologic factors, appears to play a signi ficant role in the genesis of this disease (15, 16, 26, 27) . Chemokines are a group of at least 47 correlated proteins, making them the largest family of cytokines known (23, 28). Depending on the number and spacing of their conserved cysteine residues, chemokines are classi fied into four groups: CXC (or a), CC (or b), CX 3C, and the C subfamilies. Each chemokine can bind to more than one receptor, and each receptor interacts with more than one chemokine (29). The correlation between T-reg and NK cell activity in en- dometriosis remains poorly understood. If we further consider that their effects can be modulated by other mediators of the inflammatory response such as the chemokines, then the range of questions that remains to be answered is even larger. Basta et al. (30) found differences in Foxp3 þ CD4 levels when tissue samples from ectopic pregnancy, eutopic secre- tory endometrium, and ovarian endometriomas were com- pared. Those investigators speculated that the disturbances in the equilibrium of the last two might be due to alterations in the population of T-reg cells at these sites. Reviewing the role of T-reg cells in the pathogenesis of endometriosis, Berbic and Fraser (31) showed that in patients with endometriosis Foxp3 þ CD4 levels did not decrease as ex- pected in the secretory phase, which may contribute toward reducing the ability of newly recruited leukocytes to initiate effective immune responses against the endometrial frag- ments that invade the peritoneal cavity. Despite those findings published in the literature, our study found no differences in chemokine expression when it was evaluated in accordance with the phase of the men- strual cycle. Moreover, although the phase of the menstrual cycle at the time of surgery was not controlled, there were a similar number of patients and controls in the follicular and luteal phases of the menstrual cycle and no statistically significant differences between the groups. Andr/C19e et al. (32) reported the presence of certain polymor- phisms in Foxp3 in infertile patients with endometriosis com- pared with healthy women. Therefore, the genetic aspect certainly appears to play an important part in the genesis of endometriosis; however, much still remains to be investigated with respect to the immunologic theory. Qin et al. (5) showed that T-reg cells and their principal marker Foxp3 are affected by some chemokines (CCL17 and CCL21), which may exacerbate or hamper their function. In VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 1989 Fertility and Sterility® our study, a statistically signi ficant difference was found in CCL17 chemokine expression. CCL17 is known to be able to modulate the effect of the T-reg cells (5, 33) . Numerous studies have shown the effect of this chemokine on the genesis of bowel conditions such as Crohn disease (33–35). Experiments in CCL17-deficient rats confirmed that these an- imals failed to develop relevant clinical signs of autoimmune bowel disease, even when evaluated at different time points. Those results suggest that immune factors regulated in CCL17-deficient rats inhibit in flammation. Furthermore, in 2012, Heiseke et al. (33) showed that the clonal expansion of T-reg cells is more likely to be present in CCL17-de ficient rats than in CCL17-competent rats; that is, a lack of CCL17 al- lows T-reg cells to expand in number, thus enhancing im- mune response. Consequently, a reduction in CCL17 concentration in the ectopic endometrium of patients with endometriosis affecting the rectosigmoid or in those with retrocervical lesions leads us to speculate on a possible association with the genesis of other autoimmune diseases. This reduction in CCL17 found in the ectopic endometrium of patients with rectosigmoid and retro- cervical lesions permits the clonal expansion of T-reg cells at this site. This hypothesis is in agreement with reports by other investigators (14, 30, 36, 37) ; although these findings were not statistically signi ficant, there was a clear tendency toward a decrease. The increased concentration of T-reg cells in the peritoneal fluid of patients with endometriosis and, furthermore, the increase in the number of these cells in ovarian endometriomas has led us to believe that this greater concentration results in a malfunction of the other cells of the immune system. Therefore, our findings complement the description of an environment that TABLE 1 Clinical characteristics related to ethnicity, parity, and the practice of physical exercise in the patients with endometriosis and controls. Controls Rectosigmoid patients Retrocervical patients Total P valuen% n % n % n% Ethnicity .001 Caucasian 15 46.9 17 77.3 8 80.0 40 62.5 African descent 17 53.1 2 9.1 2 20.0 21 32.8 Asian descent 0 0.0 3 13.6 0 0.0 3 4.7 Parity .694 None 17 77.3 7 70.0 24 75.0 1 3 13.6 1 10.0 4 12.5 >1 2 9.1 2 20.0 4 12.5 Regular physical exercise < .001 Yes 0 0.0 13 59.1 4 40.0 17 26.6 No 32 100.0 9 40.9 6 60.0 47 73.4 Total 32 100.0 22 100.0 10 100.0 64 100.0 Bellelis. Chemokines in deep endometriosis. Fertil Steril 2013. FIGURE 1 Relative expression of CXCL12 and CX3CL1. * P <.05 when compared to other groups. Bellelis. Chemokines in deep endometriosis. Fertil Steril 2013. FIGURE 2 Relative expression of CCL17. * P <.05 when compared to other groups. Bellelis. Chemokines in deep endometriosis. Fertil Steril 2013. 1990 VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 ORIGINAL ARTICLE: ENDOMETRIOSIS encourages a greater concentration of these cells, which act so intensely on immune response. Moreover, the greater expression of CCL17 in the eutopic endometrium of patients with endometriosis of the rectosigmoid indicates the lower propensity for T-reg cells to concentrate at this location, allowing them to focus on the peritoneal cavity. Together with other T and B cells, NK cells represent one of the major subsets of lymphocytes and have been identi fied in all species of vertebrates examined. These lymphocytes are different from the T and B cells and play an important role in innate immune response. The term ‘‘natural killer’’ originates from the fact that these cells can perform their function of killing without any requirement for the clonal expansion and/or differentiation required by other killer cells of the im- mune system such as the cytotoxic T lymphocytes (CTL) (23). Because NK cells participate in the clearance of the endome- trial cells regurgitated into the peritoneal cavity, it is reason- able to speculate that they would be underactivated in endometriosis or would not recognize the ectopic endometrial tissue as being material in apoptosis that should be eliminated (4). The migration of NK cells may increase in response to the presence of certain chemokines such as CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1, and CX3CL1. Additionally, an in- crease in their cytolytic activity may take place when NK cells are exposed to speci fic chemokines such as CXCL10 and CX3CL1 (38–44). The differences in the levels of some of the chemokines found in our study highlights the defective action of NK cells in patients with endometriosis. CX3CL1 (fractalkine) is one of the most studied chemokines in endometriosis (29, 45 –47). Watanabe et al. (47) evaluated healthy women and showed that CX3CL1 is present to a greater extent in eutopic endometrium in the secretory phase of the cycle compared with the proliferative phase. Furthermore, those investigators suggested that its presence could be one of the factors responsible for regulating the immunologic milieu, attracting cells such as the NK cells. Our study found a statistically signi ficant difference with respect to the presence of CX3CL1 in the ectopic endometrium of the women with retrocervical lesions, where it was ex- pressed to a greater extent compared with the eutopic endo- metrium of the women in the other groups. This may indicate an attempt by the organism to induce chemotaxis of defense cells such as the NK cells in an effort to reduce the damage caused by this disease. CXCL12 (SDF-1a, stromal cell-derived factor-1) was identified as a gene product that is consistently regulated by estrogen and has also been associated with NK cell migration (48). Our study found lower levels in the eutopic endometrium of patients and controls compared with the ectopic endome- trium. The fact that its levels are higher in the ectopic endo- metrium is surprising; however, using the same line of reasoning applied to CX3CL1, we believe this to be a response of the organism attempting to increase the concentration of defense cells against endometriosis. In 2009, Glace et al. (48) also showed an increase in CXCL12 levels in the ectopic endometrium when evaluating an animal model of ovarian endometriosis, and Furuya et al. (49) reported similar findings TABLE 2 Description of the chemokines in the eutopic endometrium according to the phase of the menstrual cycle. Variable Group Phase of the menstrual cycle Follicular phase Luteal phase Mean Standard deviation n Mean Standard deviation n XCL1 Control 1.640 1.802 16 1.341 1.409 16 Patient (rectosigmoid) 0.946 1.135 8 0.714 0.926 14 Patient (retrocervical) 0.985 0.482 5 0.700 0.312 5 CX3CL1 Control 1.279 1.032 16 1.317 1.497 16 Patient (rectosigmoid) 1.053 0.857 8 0.986 0.620 14 Patient (retrocervical) 0.527 0.163 5 0.628 0.142 5 CXCL9 Control 1.324 1.086 16 2.817 5.869 16 Patient (rectosigmoid) 0.995 1.184 8 0.930 1.296 14 Patient (retrocervical) 0.353 0.239 5 0.880 0.456 5 CXCL10 Control 1.269 1.314 16 3.615 9.493 16 Patient (rectosigmoid) 0.656 0.440 8 1.073 1.031 14 Patient (retrocervical) 0.531 0.397 5 0.707 0.337 5 CXCL11 Control 1.327 1.452 16 1.781 2.591 16 Patient (rectosigmoid) 0.744 0.691 8 1.221 1.114 14 Patient (retrocervical) 0.414 0.245 5 1.029 1.230 5 CXCL12 Control 1.489 1.403 16 1.372 1.074 16 Patient (rectosigmoid) 1.695 2.679 8 1.521 2.572 14 Patient (retrocervical) 2.203 1.596 5 1.118 0.722 5 CXCL17 Control 2.513 2.339 16 2.432 3.353 16 Patient (rectosigmoid) 2.370 1.456 8 5.200 6.055 14 Patient (retrocervical) 2.168 1.198 5 1.276 0.470 5 CCL21 Control 5.881 13.286 16 10.329 38.436 16 Patient (rectosigmoid) 1.958 1.014 8 3.849 3.672 14 Patient (retrocervical) 0.767 0.244 5 0.643 0.754 5 Bellelis. Chemokines in deep endometriosis. Fertil Steril 2013. VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 1991 Fertility and Sterility® in patients with ovarian endometriosis compared with disease-free patients. Endometriosis is a condition that continues to be evalu- ated, and many questions remain to be clarified. The immuno- logic theory is currently the target of much research. A number of studies have approached endometriosis as an im- munologic disease (1, 50, 51) , and identi fication of a noninvasive diagnosis and a de finitive or prophylactic treatment may well result from this theory. The action of cells that mediate in flammatory response, such as the T-reg and NK cells, when they are inactive, underactive, or even when functioning normally appears to play a fundamental role in the genesis and/or maintenance of this disease. Furthermore, as seen for the first time in our study, the role of certain chemokines in modulating this in flammatory response represents a fundamental key to understanding the inflammatory response in endometriosis. We measured mRNA levels to identify chemokine ligands and changes in receptors in cases of deep endometriosis, but it should be taken into consideration that posttranscriptional changes may also interfere in immune cascade processes.

1. Podgaec S, Abr ~ao MS, Dias JA Jr, Rizzo LV, de Oliveira RM, Baracat EC. En- dometriosis: an in flammatory disease with a T H2 immune response compo- nent. Hum Reprod 2007;22:1373 –9. 2. Berkkanoglu M, Arici A. Immunology and endometriosis. Am J Reprod Im- munol 2003;50:48–59. 3. Fairbanks F, Abr ~ao MS, Podgaec S, Dias JA Jr, de Oliveira RM, Rizzo LV. In- terleukin-12 but not interleukin-18 is associated with severe endometriosis. Fertil Steril 2009;91:320 –4. 4. Ota H, Rong H, Igarashi S, Tanaka T. Suppression of natural killer cell activity by splenocyte transplantation in a rat model of endometriosis. Hum Reprod 2002;17:1453–8. 5. Qin S, Sui Y, Soloff AC, Junecko BA, Kirschner DE, Murphey-Corb MA, et al. Chemokine and cytokine mediated loss of regulatory T cells in lymph nodes during pathogenic simian immunode ficiency virus infection. J Immunol 2008;180:5530–6. 6. Engel I, Kronenberg M. Making memory at birth: understanding the differ- entiation of natural killer T cells. Curr Opin Immunol 2012;24:184 –90. 7. Sikora J, Mielczarek-Palacz A, Kondera-Anasz Z. Role of natural killer cell activity in the pathogenesis of endometriosis. Curr Med Chem 2011;18: 200–8. 8. Bijen CB, Bantema-Joppe EJ, de Jong RA, Leffers N, Mourits MJ, Eggink HF, et al. The prognostic role of classical and nonclassical MHC class I expression in endometrial cancer. Int J Cancer 2010;126:1417 –27. 9. Wira CR, Fahey JV, Sentman CL, Pioli PA, Shen L. Innate and adaptive immu- nity in female genital tract: cellular responses and interactions. Immunol Rev 2005;206:306–35. 10. Maeda N, Izumiya C, Yamamoto Y, Oguri H, Kusume T, Fukaya T. Increased killer inhibitory receptor KIR2DL1 expression among natural killer cells in women with pelvic endometriosis. Fertil Steril 2002;77:297 –302. 11. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic self- tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha- chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 1995;155:1151 –64. 12. Jonuleit H, Schmitt E. The regulatory T cell family: distinct subsets and their interrelations. J Immunol 2003;171:6323 –7. 13. Sakaguchi S, Miyara M, Costantino CM, Ha fler DA. FOXP3 þ regulatory T cells in the human immune system. Nat Rev Immunol 2010;10:490– 500. 14. Berbic M, Hey-Cunningham AJ, Ng C, Tokushige N, Ganewatta S, Markham R, et al. The role of Foxp3 þ regulatory T-cells in endometriosis: a potential controlling mechanism for a complex, chronic immunological condition. Hum Reprod 2010;25:900 –7. 15. Podgaec S, Dias Junior JA, Chapron C, Oliveira RM, Baracat EC, Abr ~ao MS. T H1 and T H2 immune responses related to pelvic endometriosis. Rev Assoc Med Bras 2010;56:92 –8. 16. Dias JA Jr, Podgaec S, de Oliveira RM, Carnevale Marin ML, Baracat EC, Abr~ao MS. Patients with endometriosis of the rectosigmoid have a higher percentage of natural killer cells in peripheral blood. J Minim Invasive Gyne- col 2012;19:317–24. 17. Hill JA, Faris HM, Schiff I, Anderson DJ. Characterization of leukocyte sub- populations in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril 1988;50:216–22. 18. Matsubayashi H, Hosaka T, Sugiyama Y, Suzuki T, Arai T, Kondo A, et al. In- creased natural killer-cell activity is associated with infertile women. Am J Re- prod Immunol 2001;46:318 –22. 19. Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Koninckx PR. Transforming growth factor-beta activity is increased in peritoneal fluid from women with endo- metriosis. Obstet Gynecol 1994;83:287– 92. 20. Revised American Society for Reproductive Medicine classi fication of endo- metriosis: 1996. Fertil Steril 1997;67:817 –21. 21. Dias JA Jr, Oliveira RM, Podgaec S, Abrao MS. Endometriosis and immunol- ogy: is the dosage of the natural killer cells relevant? Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2005;123(Suppl):S14 –5. 22. Podgaec S, Rizzo LV, Fernandes LFC, Baracat EC, Abrao MS. CD4 þCD25highFoxp3þ cells increased in the peritoneal fluid of patients with endometriosis. Am J Reprod Immunol 2012;68:301– 8. 23. Robertson MJ. Role of chemokines in the biology of natural killers cells. J Leu- koc Biol 2002;71:173 –83. 24. Goncalves MO, Dias JA Jr, Podgaec S, Averbach M, Abr ~ao MS. Transvaginal ultrasound for diagnosis of deeply in filtrating endometriosis. Int J Gynaecol Obstet 2009;104:156–60. 25. Ulukus M, Ulukus EC, Tavmergen Goker EN, Tavmergen E, Zheng W, Arici A. Expression of interleukin-8 and monocyte chemotactic protein 1 in women with endometriosis. Fertil Steril 2009;91:687 –93. 26. Herington JL, Bruner-Tran KL, Lucas JA, Osteen KG. Immune interactions in endometriosis. Expert Rev Clin Immunol 2011;7:611 –26. 27. Fassbender A, Overbergh L, Verdrengh E, Kyama CM, Vodolazakaia A, Bokor A, et al. How can macroscopically normal peritoneum contribute to the pathogenesis of endometriosis? Fertil Steril 2011;96:697 –9. 28. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Imunidade inata. In: Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S, editors. Imunologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Elsevier; 2011:55–88. 29. Nishida M, Nasu K, Narahara H. Role of chemokines in the pathogenesis of endometriosis. Front Biosci 2011;3:1196 –204. 30. Basta P, Majka M, Jozwicki W, Lukaszewska E, Knafel A, Grabiec M, et al. The frequency of CD25 þCD4þ and FOXP3þ regulatory T cells in ectopic en- dometrium and ectopic decidua. Reprod Biol Endocrinol 2010;8:116. 31. Berbic M, Fraser IS. Regulatory T cells and other leukocytes in the pathogen- esis of endometriosis. J Reprod Immunol 2011;88:149 –55. 32. Andr /C19e GM, Barbosa CP, Teles JS, Vilarino FL, Christofolini DM, Bianco B. Analysis of FOXP3 polymorphisms in infertile women with and without en- dometriosis. Fertil Steril 2011;95:2223 –7. 33. Heiseke AF, Faul AC, Lehr HA, F €orster I, Schmid RM, Krug AB, et al. CCL17 promotes intestinal in flammation in mice and counteracts regulatory T cell- mediated protection from colitis. Gastroenterology 2012;142:335– 45. 34. Izcue A, Hue S, Buonocore S, Arancibia-C /C19arcamo CV, Ahern PP, Iwakura Y, et al. Interleukin-23 restrains regulatory T cell activity to drive T cell- dependent colitis. Immunity 2008;28:559 –70. 35. Park SG, Mathur R, Long M, Hosh N, Hao L, Hayden MS, et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gd T cells. Immunity 2010;33:791–803. 36. Budiu RA, Diaconu I, Chrissluis R, Dricu A, Edwards RP, Vlad AM. A condi- tional mouse model for human MUC1-positive endometriosis shows the presence of anti-MUC1 antibodies and Foxp3þ regulatory T cells. Dis Model Mech 2009;2:593–603. 37. Prieto GA. Progression of endometriosis to cancer: too MUCh FoxP3 þ regu- latory T-cell response? Dis Model Mech 2011;4:139 –40. 1992 VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 ORIGINAL ARTICLE: ENDOMETRIOSIS 38. Taub DD, Sayers TJ, Carter CR, Ortaldo JR. Alpha and beta chemokines in- duce NK cell migration and enhance NK-mediated cytolysis. J Immunol 1995;155:3877–88. 39. Campbell JJ, Bowman EP, Murphy K, Youngman KR, Siani MA, Thompson DA, et al. 6-C-kine (SLC), a lymphocyte adhesion-triggering che- mokine expressed by high endothelium, is an agonist for the MIP-3 b recep- tor CCR7. J Cell Biol 1998;141:1053 –9. 40. Kim CH, Pelus LM, Appelbaum E, Johanson K, Anzai N, Broxmeyer HE. CCR7 ligands, SLC/6Ckine/Exodus2/TCA4 and CK b-11/MIP-3b/ELC, are chemoat- tractants for CD56 þCD16/C0 NK cells and late stage lymphoid progenitors. Cell Immunol 1999;193:226 –35. 41. Yoneda O, Imai T, Goda S, Inoue H, Yamauchi A, Okazaki T, et al. Fractal- kine-mediated endothelial cell injury by NK cells. J Immunol 2000;164: 4055–62. 42. Campbell JJ, Qin S, Unutmaz D, Soler D, Murphy KE, Hodge MR, et al. Unique subpopulations of CD56 þ NK and NK-T peripheral blood lympho- cytes identi fied by chemokine receptor expression repertoire. J Immunol 2001;166:6477–82. 43. Inngjerdingen M, Damaj B, Maghazachi AA. Expression and regulation of chemokine receptors in human natural killer cells. Blood 2001;97: 367–75. 44. Romagnani P, Annunziato F, Lazzeri E, Cosmi L, Beltrame C, Lasagni L, et al. Interferon-inducible protein 10, monokine induced by interferon gamma, and interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant are produced by thy- mic epithelial cells and attract T-cell receptor (TCR) ab þ CD8þ single-positive T cells, TCR gdþ T cells, and natural killer-type cells in human thymus. Blood 2001;97:601–7. 45. Zhang Q, Shimoya K, Temma K, Kimura T, Tsujie T, Shioji M, et al. Expression of fractalkine in the fallopian tube and of CX3CR1 in sperm. Hum Reprod 2004;19:409–14. 46. Shimoya K, Zhang Q, Temma-Asano K, Hayashi S, Kimura T, Murata Y. Frac- talkine in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Int J Gynaecol Obstet 2005;91:36–41. 47. Watanabe M, Shimoya K, Zhang Q, Temma-Asano K, Kimura T, Murata Y. The expression of fractalkine in the endometrium during the menstrual cy- cle. Int J Gynaecol Obstet 2006;92:242– 7. 48. Glace L, Grygielko ET, Boyle R, Wang Q, Laping NJ, Sulpizio AC, et al. Estro- gen-induced stromal cell-derived factor-1 (SDF-1/Cxcl12) expression is re- pressed by progesterone and by selective estrogen receptor modulators via estrogen receptor alpha in rat uterine cells and tissues. Steroids 2009; 74:1015–24. 49. Furuya M, Suyama T, Usui H, Kasuya Y, Nishiyama M, Tanaka N, et al. Up- regulation of CXC chemokines and their receptors: implications for proin- flammatory microenvironments of ovarian carcinomas and endometriosis. Hum Pathol 2007;38:1676 –87. 50. Agic A, Xu H, Finas D, Banz C, Diedrich K, Hornung D. Is endometriosis as- sociated with systemic subclinical in flammation? Gynecol Obstet Invest 2006;62:139–47. 51. Barrier BF. Immunology of endometriosis. Clin Obstet Gynecol 2010;53: 397–402. VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 1993 Fertility and Sterility®