{"paper_id":"df411376-4d13-4629-8dd5-723485073ce3","body_text":"PATRICK BELLELIS \n \n \n \n \n \n \n \nExpressão de quimiocinas regulatórias das células Natural Killer e T-\nreguladoras em pacientes com endometriose profunda \n \n \nTese apresentada à Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo, para a obtenção do  \ntítulo de Doutor em Ciências \n \nPrograma de: Obstetrícia e Ginecologia \nOrientador: Prof. Dr. Sérgio Podgaec \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSÃO PAULO \n2013 \n\n \n \n \n \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) \nPreparada pela Biblioteca da \nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo \n \nreprodução autorizada pelo autor \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n   \n                       Bellelis, Patrick \n      Expressão de quimiocinas regulatórias de células Natural Killer e T-reguladoras \nem pacientes com endometriose profunda  /  Patrick Bellelis.  --  São Paulo, 2013. \n \n Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.  \nPrograma de Obstetrícia e Ginecologia.  \n \n Orientador: Sérgio Podgaec.   \n      \n   \n Descritores:  1.Endometriose  2.Células matadoras naturais  3.Linfócitos T \nreguladores  4.Quimiocinas  5.Endométrio  \n \n \n  \nUSP/FM/DBD-407/13 \n \n   \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAos meus pais, Samy e Lourdes, meus exemplos, meu porto-seguro. \n \nAo meu irmão e melhor amigo, Michel. \n \nÀ Vanessa, pelo companheirismo destes anos juntos. \n \n \n \n \n \nA todos, obrigado por todo amor, apoio e compreensão! \n \n\nAGRADECIMENTOS \n \nAo Professor Doutor Sé rgio Podgaec, obrigado pela dedicação, orientação e \namizade. \nAo Professor Doutor Maurício Simões Abrão, um exemplo de dedicação, \nobrigado pelos conselhos e amizade. \nÀ Doutora Denise Frediani Barbeiro, obrigado por toda ajuda e dedicação. \nAo Professor Doutor Edmund Chada Baracat, pela importante colaboração e \nrevisão deste trabalho. \nAo Professor  Doutor Luiz Vicente Rizzo, pela disponibilidade de ensinar e \ncultivar o estudo da imunologia. \nAo Doutor Luciano Gibran, pela amizade, sugestões e contribuições. \nAo Doutor João Antônio Dias Júnior, pela amizade, sugestões e \ncontribuições. \nAo Doutor Luiz Fl ávio Cordeiro Fernandes, pela amizade, sugestões e \ncontribuições. \nÀs Doutoras Paula Zulian Fagundes e Lídia Hyun Joo Myung, pela amizade, \ncarinho e ajuda. \nAos Doutores Luiz Fernando de Oliveira Henrique e Daniel Bier Caraça, pela \namizade e companheirismo. \nAos Doutores Luiz Fernando Pina de Carvalho, Marco Antônio Bassi, Nicolau \nD´Amico Filho, Manoel Orlando Gonçalves, Leandro Accardo de Mattos, \nCláudio Severino Junior , Rogério Gomes e Flávia Fairbanks  por toda \namizade e ajuda. \nÀ bióloga Ana Carolina Poppe, pela amizade e ajuda. \nÀ FAPESP, pelo apoio financeiro. \nÀs pacientes. Sem elas, nada seria possível.  \n \n \n \n \n \n \n \n\nSUMÁRIO \n \nLista de abreviaturas \nLista de figuras e gráficos \nLista de tabelas \nResumo \nSummary \n1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 1 \n2. OBJETIVOS ............................................................................................. 16 \n3. PACIENTES E MÉTODOS ....................................................................... 18 \n4. RESULTADOS ......................................................................................... 28 \n5. DISCUSSÃO.............................................................................................. 40 \n6. CONCLUSÕES ......................................................................................... 49  \n7. ANEXOS ................................................................................................... 51 \n8. REFERÊNCIAS ........................................................................................ 72 \n9. ARTIGO PUBLICADO .............................................................................. 85 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nLISTA DE ABREVIATURAS \n \nCAA – Células Apresentadoras de Antígeno \nCélulas NK – Células Natural Killer  \nCélulas T-reg – Células T-reguladoras = Células T CD4+CD25high \nCHP – Complexo de histocompatibilidade principal \nDPC – Dor Pélvica Crônica \nEUA – Estados Unidos da América \nEVA – Escala Visual Analógica de dor \nHC-FMUSP – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo \nIL-10 – Interleucina 10 \nIL-15 – Interleucina 15 \nLGG – Linfócitos Granulares Grandes \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nLISTA DE FIGURAS, GRÁFICOS E QUADROS \nFigura 1 – Estadiamento da endometriose proposto pela American Society \nfor Reproductive Medicine (1996). \nGráfico 1 – Expressão gênica relativa da quimiocina CX3CL1 em endométrio \ntópico e lesão endometrióide de pacientes com endometriose retrocervical e \nde retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose \nGráfico 2 – Expressão gênica relativa da quimiocina CXCL12 em endométrio \ntópico e lesão endometrióide de pacientes com endometriose retrocervical e \nde retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose \nGráfico 3 – Expressão gênica relativa da quimiocina CCL17 em endométrio \ntópico e lesão endometrióide de pacientes com endometriose re trocervical e \nde retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose \nGráfico 4 – Expressão gênica relativa da quimiocina CCL21 em endométrio \ntópico e lesão endometrióide de pacientes com endometriose retrocervical e \nde retossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose. \nQuadro 1 – Representação esquemática da dinâmica de estudo. \nQuadro 2  – Representação esquemática da detecção das quimiocinas por \nPCR em tempo real no endométrio tópico e nas lesões de endometriose. \nQuadro 3 – Expressão gênica relativa da quimiocina CXCL9, CXCL10, \nCXCL11 E XCL1 em endométrio tópico e lesão endometrióide de pacientes \ncom endometriose retrocervical e de retossigmóide e endométrio tópico de  \npacientes sem endometriose. \n \n \n \n\nLISTA DE TABELAS \nTabela 1 -  Quimiocinas humanas identificadas até o momento – modificado \ne atualizado de Gonçalves R, Teixeira A, Campos W and Orefice F. O papel \ndas quimiocinas nas uveítes. 2007 Arq Bras Oftalmol pp. 363-370. \nTabela 2 : Lista de Primers  das quimiocinas  CCL17, CCL21, CXCL9, \nCXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1 utilizados no presente estudo. \nTabela 3 – Descrição das características referentes ao quadro clínico das \npacientes com  endometriose retrocervical e de retossigmóide  e mulheres \nsem endometriose (grupo controle). \nTabela 4 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com e \nsem endometriose segundo as fases do ciclo menstrual, folicular e lútea \nTabela 5 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21  nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical seg undo a presença de \ndismenorréia. \nTabela 6 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21  nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical se gundo a presença de \ndispareunia de profundidade. \nTabela 7 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21  nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presen ça de dor \npélvica crônica. \nTabela 8 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21  nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a pre sença de \nalterações intestinais. \n\nTabela 9 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21  nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical segundo estadiamento inicial \n(1 e 2) e avançado (3 e 4) – ASRM 1996. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\nRESUMO \n \nIntrodução: A endometriose , condição inflamatória prevalente, associa -se a \nalterações da reposta imune na cavidade peritoneal e  no útero. Evidências \nsugerem participação de mediadores inflamatórios , como as células Natural \nKiller e T -reguladoras na patogênese desta doença . A resposta destas \ncélulas pode ser controlada pela atividade de alg umas quimiocinas . O \nobjetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica das quimiocinas \nreguladoras das células Natural Killer e T-reguladoras em endométrio tópico \nem lesões endometrióticas de pacientes com endometriose.  \nPacientes e Métodos : A expressão gênica das quimiocinas reguladoras da \natividade das células Natural Killer  (CXCL9, 10,  11, CXCL12, XCL1 e \nCX3CL1) e T reguladoras (CCL17 e CCL21)  foi avaliada  por meio d e RT-\nPCR no endométrio tópico e lesão endometriótica  de 22 pacientes com \nendometriose de retossigmóide; 10 pacientes com endometriose retrocervical \ne no endométrio tópico de  32 mulheres sem endometriose comprovada  por \nlaparoscopia para laqueadura tubária.  \nResultados: Dentre as quimiocinas relacionadas às células Natural Killer , \nencontramos diferença estatística significativa na CX3CL1 e CXCL12, as \nquais foram mais expressas no foco de endometriose intestinal e \nretrocervical, quando comparadas ao endométrio tópico das pacientes e \ncontroles (p<0,05). Das relacionadas às células T -reguladoras, a CCL17 foi \nmais expressa no endométrio tópico de pacientes com lesão em \nretossigmóide quando comparada aos demais grupos (p<0,05). \nConclusões: As quimiocinas CX3CL1 e CXCL12 foram mais expressas nos \nfocos de endometriose intestinal e a CCL17 foi mais expressa no endométrio \ntópico de pacientes com lesão de retossigmóide. Estes resultados sugerem \nque as quimiocinas CX3CL1, CXCL12 e CXCL17  participam da resposta \ninflamatória que ocorre na endometriose pélvica. \n \nDescritores: endometriose, células matadoras naturais , linfócitos T \nreguladores, quimiocinas, endométrio \n \n\nSUMMARY \n \nObjective: Endometriosis is a highly prevalent inflammatory condition \nassociated with an altered immune response in the peritoneal cavity and \nuterus.  Evidence suggests a participation of inflammatory mediators such as \nnatural killer (NK) and T -regulatory (T -reg) cells in the pathogenesis of this \ndisease while the response of these cells may b e controlled by the activity of \nsome chemokines.  \nPatients and Methods :  Gene expressions of the chemokines that regulate \nthe activity of NK (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 and CX3CL1) \nand T -reg cells (CCL17 and CCL21) were evaluated using real time \npolymerase chain reaction (PCR) in the eutopic and ectopic endometrium of \n22 patients with bowel endometriosis, 10 patients with retrocervical \nendometriosis and 32 controls.   \nResults: Of the chemokin es associated with NK cells, the expression of \nCX3CL1 and CXCL12 was significantly greater in the foci of endometriosis \n(p<0.05).  Of those associated with T -reg cells, significant differences \nbetween groups were found in CCL17. In addition, CCL17 was expressed to a \nhigher degree in the eutopic endometrium  of the  patients with  rectosigmoid \nlesions when compared to the other groups (p<0.05).  \nConclusions:  Chemokines CX3CL1 and CXCL12 were more expressed in \nintestinal endometriosis and CCL17 expression was h igher in eutopic \nendometrium of the patients with rectosigmoid lesions. These results suggest \nthat those chemokines participate in the inflammatory response that occurs in \npelvic endometriosis. \n \nDescriptors:  endometriosis; N atural Killers cells; T  regulatory limphocytes; \nchemokines; endometrium. \n \n \n \n \n \n\n \n \n1 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1. INTRODUÇÃO \n \n\n \n \n2 \nEndometriose representa uma afecção ginecológica comum, que \natinge de 10 a 15% das mulheres no período reprodutivo e até 50% das \nmulheres com dor pélvica crônica e/ou infertilidade (Viganò, et al., 2004; \nBellelis, et al., 2010) . Estima -se que o número de mulheres com \nendometriose seja de 7 milhões nos Estados Unidos da América  e de mais \nde 70 milhões no mundo . Em países industrializados, é uma das principais \ncausas de hospitalização ginecológica (Vercellini, et al., 2007). \nEsta doença é definida  como a implantação de estroma e/ou epitélio \nglandular endometrial em localização extrauterina (Gao, et al., 2006) , \npodendo comprometer diversos locais, entre eles ovários, peritôn io, \nligamentos útero ssacros, região retrocervical, septo retovaginal, \nretossigmóide, íleo terminal, apêndice, bexiga e ureteres (Vinatier, et al., \n2001; Abrao, et al., 2006; Vercellini, et al., 2007; Podgaec, et al., 2008).  \nNisole e Donnez, em 1997 , dividiram esta doença em três afecções \ndistintas: peritoneal, ovariana e de septo retovaginal, sendo esta última \nchamada de endometriose inf iltrativa profunda (Cornille, et al., 1990) . No \nprimeiro caso, estariam incluídas as pacientes com implantes superficiais; no \nsegundo os cistos ovarianos típicos da doença e no terceiro caso, a \nendometriose infiltrativa com lesões com 5mm ou mais  de espessura  que \npodem acometer as regiões retro e paracervical, de fórnice vaginal e vagina, \nalém dos tratos gastrointestinais e urinário. \nApesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia \n(Ulukus, et al., 2009) , alguns aspectos continuam sendo alvo de pesquisa, \ndestacando-se a  busca pela etiopatogenia (Abrao, et al., 2006;  Podgaec,et \nal., 2008 ; Ascien & Velasco, 2013 ). Duas correntes principais de hipóteses \netiopatogênicas são citadas há quase um século: a t eoria da metaplasia \ncelômica (Meyer, 1919)  e a da menstruação retrógrada (Sampson, 1927) . \nEsta segunda teoria seria possível por influência de um ambiente hormonal \nfavorável e de f atores imunológicos que não eliminariam as células \nendometriais da cavidade peritoneal (Harada, et al., 2001; Podgaec, et al., \n2007; Berbic & Fraser, 2013). \n\n \n \n3 \nPacientes portadoras de endometriose podem ser assintomáticas ou \napresentarem queixas clínicas em diferentes intensidades, sendo as \nprincipais dismenorr éia, dor pé lvica crônica, infertilidade, dispareunia de \nprofundidade e sintomas intestinais e urinários cíclicos, como dor ou \nsangramento ao evacuar ou urinar durante o período menstrual. A demora do \ndiagnóstico da endometriose pode ser explicada pela inespecificidad e do \nquadro clínico e, eventualmente,  pela falta de correlação entre  sintomas e \ngravidade da doença ( Arruda, et al., 2003; Hemmings, et al., 2004; Kashima, \net al., 2004; Heilier, et al., 2007). \nConsiderações gerais sobre os aspectos imunológicos \n Nos últimos anos, muito tem se estudado acerca dos fatores \nimunológicos na patogênese da endometriose e muitas anomalias foram \nencontradas (Berkkanoglu and Arici, 2003;  Podgaec, et al., 2007;  Fairbanks, \net al., 2009 ; Berbic & Fraser, 2013 ), sendo que o principal mecanismo \navaliado é complem entar à teoria da menstruação retrógrada. Por algum \nmotivo, ainda indeterminado, as células endometriais que adentra ram à \ncavidade endometrial não seriam eliminadas e deste modo, seria permitido a \nelas se implantarem e desenvolverem a doença (Harada, et al., 2001; Berbic \n& Fraser, 2013). \n As células que caem na cavidade abdominal deveriam ser \nidentificadas como antígenos e serem submetidas à resposta imune local. \nAlgumas células, como os macrófagos, funcionam como apresentadoras de \nantígenos aos linfócitos T através do complexo de histocompatibilidade \nprincipal (CHP). O CHP pode s er classe I ou II, sendo que no primeiro caso \natrai os linfócitos T citotóxicos e no segundo os lintócitos T helper \n(auxiliadores). Os citotóxicos secretam substâncias letais que provocam a \nmorte da célula -alvo e os T -helper secretam citocinas que induzem \nmecanismos e fatores que podem levar à morte celular (Abbas, et al., 2011).  \n Deste modo, existem dois tipos de resposta imune: a inata e a \nadaptativa ou adquirida. Em um dos mecanismos da resposta inata,q uando \num antígeno invade o organismo, um grupo de células tenta destruí -lo po r \n\n \n \n4 \nmeio da fagocitose. Estas células podem ser monócitos, macrófagos, \nneutrófilos e/ou células Natural Killer . Este tipo de reconhecimento é \ninespecífico, pois as células fagocitam vários tipos de micro -organismos e \nfazem parte d a primeira linha de defesa  do organismo . Já a adaptativa, é \numa resposta específica e conta com a atuação dos linfócitos, que \nreconhecem o patógeno invasor (Abbas, et al., 2011).  \nExistem vários tipos de linfócitos, dentre os quais destacam -se os \nlinfócitos B, que produzem anticorp os que se ligam ao antígeno para eliminá-\nlo, os linfócitos T, que estão envolvidos na produção de linfócitos B, auxiliam \nna fagocitose, atuam na eliminação antigênica e na replicação da resposta \nimune e as células NK que  não apresentam em sua superfície ma rcadores \nque são encontrados nas células B, nem os que caracterizam as células T. \nNo sangue circulante, 10 -15% dos linfócitos são NK. Estas, por sua vez, \natacam as células neoplásicas e células infectadas por vírus sem \nnecessidade de estímulo prévio.  (Robertson, 2002;  Abbas, et al., 2011) . \nNesse tópico, o balanço entre imunidade e tolerância é impo rtante para \nmanter a homeostase imune, onde muitos mecanismos são utilizados para \nmanter a resposta imune sob controle, incluindo -se a atividade das células \nNatural Killer (NK) e T-reguladoras (T-reg) (Ota, et al., 2002; Qin, et al., 2008; \nEngel and Kronenberg, 2012) e do importante papel de outros mediadores da \nresposta imune como as quimiocinas  (Clore and Gronenborn, 1995;  Rollins, \n1997).  \nQuimiocinas \n As quimiocinas são uma grande família de citocinas estruturalmente \nhomólogas, de aproximadamente 8 a 12kD , que estimulam o movimento dos \nleucócitos (quimiocinese) e regulam a migração destes do sangue para os \ntecidos (quimiotaxia) sendo, portanto, citocinas quimiotáticas (Clore and \nGronenborn, 1995; Rollins, 1997). As citocinas, por sua vez, são mensageiros \ndo sist ema imunológico. Correspondem a um extenso grupo de moléculas \nque atuam emitindo sinais entre as células durante o desencadeamento da \nresposta imune, atuando em diferentes etapas desta resposta  (Abbas, et al., \n2011). As quimiocinas envolvidas em reações inflamatórias são produzidas  \n\n \n \n5 \npor leucócitos em resposta a estímulos externos e as quimiocinas que \nregulam o tráfego celular entre os tecidos são produzidas e constituídas por \nvárias células, como endotélio, fibroblastos e megacariócitos (Moser and \nLoetscher, 2001; Abbas, et al., 2011). \nAs moléculas da estrutura das quimiocinas possuem duas alça s \ninternas de dissulfeto e são divididas em duas subfamílias dependendo da \nposição de seus resíduos de cisteína aminoterminais imediatamente \nadjacentes ( cys-cys) ou separados por um aminoácido ( cys-X-cys). Estas \ndiferenças se correlacionam com a organizaçã o de duas subfamílias \nprincipais (CC e CXC) em aglomerados separados de genes. Cada \nsubfamília possui seu próprio receptor e tem funções diferenciadas uma da \noutra. As quimiocinas CXC são quimiotáxicas para neutrófilos, enquanto a s \nCC não agem neste último  grupo celular, mas atraem monócitos, basófilos e \nlinfócitos. Uma terceira família tem como única representante a fractalquina \n(CX3CL1), em que a característica estrutural é a presença de duas cisteínas \nseparadas por três aminoácidos (CX3C) e tem por funçã o a quimiotaxia de \nlinfócitos T e monócitos, além de promover a adesão de leucócitos com \ncélulas endoteliais. Finalmente, a quarta família, que tem dois \nrepresentantes, a linfotactina  (XCL1) e linfotactina  (XCL2), possui uma \núnica cisteína  (família C) que promove a atração de células T. Esta \nclassificação foi realizada pela International Union of Immunological \nSocieties/World Health Organization Subcommittee on Chemokine \nNomenclature (Bacon, et al., 2003). \nQuimiocinas atuam por meio de  receptores trans -membranas de alta \nafinidade expostos na superfície de células circulantes. Onze receptores \ndiferentes para quimiocinas CC (chamadas CCR1 a CCR11) e seis para \nquimiocinas CXC (chamadas CXCR1 a CXCR6) foram identificados (Moser \nand Loetscher, 2001;  Raman, et al., 2011) . Os receptores de quimiocinas \npossuem sítios de ligação que podem ser específicos (CCR9, CXCR6), mas, \ncomumente, o mesmo receptor pode ser alvo de ligação de várias \nquimiocinas do mesmo grupo (Tabela 1 -Gonçalves, et al., 2007). \n\n \n \n6 \nOs receptores de quimiocinas são expressos em leucóci tos, com o \nmaior número de receptores diferentes vistos em linfócitos T. A expressão \ndos receptores de quimiocinas pode definir subtipos de linfócitos T , como \nTh1, Th2, Th17 ou mesmo Treg (Ekman, et al., 2013). Além disso, linfócitos T \nperiféricos maduros expressam diferentes receptores de quimiocinas \ndependendo do seu fenótipo funcional. Estas diferenças determinam, em \nparte, o tipo de resposta imune que irá se desenvolver em um sítio de \ninflamação (Sallusto, et al., 1998; Bacon, et al., 2003; Ekman, et al., 2013).  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n7 \nTabela 1 -  Quimiocinas humanas identificadas até o momento – modificado \ne atualizado de Gonçalves R, Teixeira A, Campos W and Orefice F. O papel \ndas quimiocinas nas uveítes. 2007 Arq Bras Oftalmol pp. 363-370. \nFamília Quimiocina Nome Original Receptores Localização no  Gene \nCXC CXCL1 GRO / MIP-2 CXCR2 24q21 \n \nCXCL2 GRO  CXCR2 4q21 \n \nCXCL3 GRO  CXCR2 4q21 \n \nCXCL4 PF-4 CXCR3 4q21 \n \nCXCL5 ENA-78 CXCR2 4q21 \n \nCXCL6 GCP-2 CXCR2 24q21 \n \nCXCL7 NAP-2 CXCR2 4q21 \n \nCXCL8 IL-8 CXCR2+CXCR1 24q21 \n \nCXCL9 MIG CXCR3 4q21 \n \nCXCL10 IP-10 CXCR3 4q21 \n \nCXCL11 I-TAC CXCR3 4q21 \n \nCXCL12 SDF-1 CXCR4 10q11.21 \n \nCXCL13 BCA-1 CXCR5 4q21 \n \nCXCL14 BRAK Não determinado 5q31.1 \n \nCXCL15 Lungkine Não determinado Não determinado \n \nCXCL16 CXCL16 CXCR6 17p13 \nCC CCL1  I-309  CCR8  17q11 \n  CCL2  MCP-1  CCR2  17q12 \n  CCL3  MIP-1  CCR1, CCR5  17q12 \n  CCL4  MIP-1  CCR5  17q12 \n  CCL5  RANTES  CCR5  17q12 \n  CCL6  C10   Não determinado  Não determinado \n  CCL7  MCP-3  CCR1, CCR2, CCR3  17q11 \n  CCL8  MCP-2  CCR3, CCR5  17q11 \n  CCL9  MIP-1   Não determinado  Não determinado \n  CCL10  CCL10   Não determinado  Não determinado \n  CCL11  Eotaxin  CCR3  17q11 \n  CCL12  MCP-5  CCR2  Não determinado \n  CCL13  MCP-4  CCR2, CCR3  17q11 \n  CCL14  HCC-1  CCR1, CCR5  17q12 \n  CCL15  HCC-2/MIP-1/Leotactin-1  CCR1, CCR3  17q12 \n  CCL15  HCC-4/LEEC  CCR1, CCR2  17q12 \n  CCL17  TARC  CCR4  16q13 \n  CCL18  PARC/DC-CK1   Não determinado  17q12 \n  CCL19  MIP-3/ELC  CCR7  9p13.3 \n  CCL20  LARC/MIP-3  CCR6  2q36.3 \n  CCL21  SLC/6Ckine  CCR7  9p13.3 \n  CCL22  MDC  CCR4  16q13 \n  CCL23  MPIF-1  CCR1  17q12 \n  CCL24  Eotaxin-2/MPIF-2  CCR3, CCR5  7q11 \n  CCL25  TECK  CCR9  19q13.3 \n  CCL26  Eotaxin-3  CCR3  7q11 \n  CCL27  ESkine/MCC/Ctack  CCR10  9p13.3 \n  CCL28  MEC  CCR3, CCR10  5p12 \nXC XCL1 Linfotactina  XCR1 1q24 \n \nXCL2 Linfotactina   XCR1 1q24 \nCX3C CX3CL1  Fractalkine CX3CR1  16q13  \n\n \n \n8 \nApós serem ativados pelas quimiocinas, os receptores das quimiocinas \niniciam uma complexa cascata de sinalização que leva à ativação de \nmoléculas de integrina na superfície celular. As integrinas  são moléculas \nessenciais para que ocorra a adesão das células de defesa aos tecidos \nenvolvidos nos processos inflamatórios (Cameron and Kelvin, 2003). \nAlém das funções como agente quimiotático de linfócitos, os estudos \ncom as quimiocinas  e seus receptores revelaram outros importantes papéis \npara estas moléculas, como a sua relação com metástases tumorais e, \ncontraditoriamente, a inibição do crescimento de células tumorais, assim \ncomo infecções e doenças autoimunes, como artrite reumatóide e esclerose \nmúltipla (Loetscher and Moser, 2002; Dong, et al., 2003; Raman, et al., 2011). \nAs quimiocinas exercem um papel soberano na progressão tumoral. \nProcessos inflamatórios crônicos promovem a formação tumoral e tanto as \ncélulas tumorais como as células do estroma, produzem quimiocinas e \ncitocinas. Estas atuam tanto por mecanismos autócr inos, como parácrinos \npara sustentar o crescimento da célula tumoral, induzir a angiogênese e \nfacilitar a diminuição da vigilância imunológica (Raman, et al., 2007). \nAs quimiocinas  e seus receptores também têm papel importante no \ndesenvolvimento e manutenção da imunidade inata e adaptativa (Raman, et \nal., 2007)  Além disso, atuam no processo de cicatrização de feridas e \nangiogênese (Raman, et al., 2011) . Quando o papel fisiológico das \nquimiocinas é subvertido ou cronicamente ampliado, a doença pode se \ndesenvolver. Como estão envolvidas na fisiopatolog ia da inflamação crônica, \ntumorigênese e metástase, assim como nas doenças autoimunes, tem sido \navaliado o uso potencial de antagonistas de quimiocinas para terapia  salvo \napropriadas (Raman, et al., 2011) . Apesar da ação das quimiocinas  na \nmodulação da atividade de outras células do sistema imune ainda não ter \nsido completamente elucidado, algumas de suas ações em outros \nmediadores imunológicos como as células T -reguladoras e NK já são \nbastante conhecidas (Qin, et al., 2008; Robertson, 2002). \n \n\n \n \n9 \nCélulas T-reguladoras \n O balanço entre imunidade e tolerância é importante para manter a \nhomeostase imune. Muitos mecanismos são utilizados para manter a \nresposta imune sob controle, como a anergia  de linfócitos T, a apoptose e a \nignorância imunológica (Abbas, et al., 2011). Um quarto mecanismo de \ntolerância periférica é a supressão ativa por células reguladoras como células \nT CD4 +CD25high (T-reg) que expressam, constitutivamente, as moléculas \nCTLA-4, GITR e Foxp3 (Fontenot, et al., 2005) , células Th3 produtoras de \nTGF-beta, células Tr1 produtoras de IL-10 e células T CD8+CD28- (Maloy and \nPowrie, 2001 ; Askenasy, et al., 2008 ). As células T reguladoras foram \nprimeiramente descritas no início dos anos 70, mas como fatores \nsupressores solúveis hipotéticos não puderam ser identificados em nível \nmolecular e marcadores celulares apropriados não eram conhecidos \n(Sakaguchi, et al., 1995) . O conceito de célula T supressora permaneceu \nesquecido por um longo tempo. A descoberta de Sakaguchi e colaboradores \nde que a transferência adotiva de uma população de células T depletadas da \nmolécula CD25 induzia uma série de doenças autoimunes órgão -específicas \nem recipientes imunodeficientes, colocou o modelo de células T reguladoras \nnovamente no foco da imunologia (Sakaguchi, et al., 1995) . As células T \nCD4+CD25high foram denominadas células T reguladoras (T -reg) e, desde \nentão, as mesmas têm sido intensivamente estudadas  (Long and Buckner, \n2011; Filaci, et al., 2011; Selmi, 2011) \nInicialmente, acreditava -se que eram células derivadas do timo \n(Seddon and Mason, 2000), entretanto, depois verificou-se que essas células \ntambém podem ser geradas na periferia (Waldmann and Cobbold, 2001) . As \ncélulas T-reg podem ser ativadas por antígenos próprios ou não próprios e, \numa vez ativadas, podem suprimir células T de maneira antígeno não  \nespecífica (Jonuleit and Schmitt, 2003;  Sakaguchi, et al., 2010) . Os efeitos \nsupressivos dessas células não são restritos ao sistema imune adaptativo \n(células T e B), mas podem também influenciar a ativação e a função de \ncélulas do sistema imune inato (monócitos, macrófagos, células dendríticas). \nApós a ativação do TcR (receptor de células T para antígeno de superfície), \n\n \n \n10 \nas células T -reg naturais inibem respostas imunes  in vivo  e in vitro de \nmaneira antígeno não  específica, CHP não  restrito e via um processo \nindependente de células apresentadoras de antígenos (CAA). Células T -reg \nadaptativas são induzidas por antígenos, desenvolvem -se na perife ria e \nexercem sua função por meio da secreção de citocinas inibitórias (como IL-10 \ne TGF-β) ou tolerizando CAA por interações célula -célula (Maloy and Powrie, \n2001; Selmi, 2011). \nO Foxp3 foi identificado como um marcador molecular específico para \ncélulas T-reg e sua expressão é essencial para o desenvolvimento e a função \ndesta célula. A expressão ectópica de Foxp3 em linfócitos T convencionais \npode conferir atividade supressora aos mesmos e estes também passam a \napresentar altos níveis de CD25. Aparentemente, o Foxp3 age estabelecendo \ne mantendo o programa genético da T -reg e funciona como um regulador \nnegativo da ativação de células T e talvez como efetor transcricional de \nprogramas de citocinas anti-inflamatórias (Fontenot, et al., 2005; Filaci, et al., \n2011; Josefowicz, et al., 2012).  \nNo entanto, a identificação das células T -reg permanece problemática \nporque não existe consenso acerca de seus marcadores. Algumas evidências \nsugerem que todos os marcadores atualmente utilizados (CD25, CTLA -4, \nGITR, LAG -3. CD127 e o próprio Foxp3) podem representar marcadores \ngerais de linfócitos T, ao invés de serem realment e específicos para as \ncélulas T-reg. (Askenasy, et al., 2008; Corthay, et al., 2009).  Apesar de que \nas evidências mais recentes, assim como uma grande revisão sistemática \nsobre o tema , demonstraram  a especificidade de ação do Foxp3 como \nmarcador específico e efetor transcricional das células T -reg (Josefowicz, et \nal., 2012; Peterson, et al., 2012) \nSabe-se que em humanos, as células T -reg são reguladas pelas \nquimiocinas CCL17 e CCL21 (ligantes de CCR4 e CCR7) que podem \nmodular e expressar a sua atividade nos tecidos (Qin, et al., 2008). \n \n\n \n \n11 \nCélulas Natural Killer \nAs células Natural Killer (NK) estão entre as principais células do \nsistema imune dos vertebrados. O papel das células NK é análogo ao de \ncélulas T citotóxicas na resposta imune adaptativa. As células NK fornecem \nrespostas rápidas para as células infectadas por vírus e respondem à \nformação de tumores, começando a atuar cerca de 3 dias após a infecção. \nSendo assim, desempenham importante papel na resposta inata podendo \ndiferenciar células infectadas por vírus, células neoplásicas e células normai s \n(Sikora, et al., 2011; Rudensky, 2011; Vivier, et al., 2011). \nAs células NK são linfócitos e possuem a habilidade de eliminar \ncélulas-alvo de acordo com o reconhecimento do complexo de \nhistocompatibilidade principal (CHP) expresso em suas superfícies. Elas \nreconhecem as células que expressam o CHP classe I como própr ias, sendo \ndestruídas aquelas células que não o apresentam.  Foram nomeadas natural \nkillers por causa da noção inicial  de que não necessitam de ativação para \neliminar as células sem marcadores self do CHP classe I. São definidas como \nlinfócitos granulares grandes (LGG) e constituem o terceiro tipo de células \ndiferenciadas do antepassado comum linf óide que gera linfócitos B e T. Elas \npodem também c ontribuir, po r meio da produção de citocinas,  na resposta \nimune adaptativa contra patógenos intracelulares e células malignas \n(Robertson, 2002; Rudensky, 2011; Vivier, et al., 2011). \nAlém do conhecimento que as células NK são efetores da imuni dade \ninata, uma pesquisa revelou informações sobre a atividad e tanto na ativação \nquanto na inibição dos receptores das células NK, os quais desempenh am \nimportante papel, tanto na função de auto -tolerância quanto na sustentação \nda atividade das células NK (Arina, et al., 2007). Elas também desempenham \num papel na resposta imune adaptativa. Numerosas experiências têm \ntrabalhado para demonstrar a sua capa cidade de facilmente adaptar -se ao \nmeio ambiente de forma quase que imediata e formular  memória imunológica \nantígeno específica , fundamental para responder a infecções secundárias \ncom o mesmo antígeno (Vivier, et al., 2011). A capacidade das células NK \npara atuar tanto na resposta imune inata quanto na adaptativa tem se tornado \n\n \n \n12 \nobjeto de pesquisa importante, na tentativa de se utilizar seus resultados em \npotenciais terapias (Arina, et al., 2007). \nNos humanos células NK migram em resposta a ligantes conhecidos \ndas quimiocinas CXCR3 (CXCL9, 10, 11) e CXCR4 (CXCL12) e a quimiotaxia \nde células NK é estimulada por XCL1 e CX3CL1 (Robertson, 2002).  \nConsiderações sobre endometriose, células NK e células T-reg \nDevido à função das células NK  e T -reg, postula -se que elas \ndesempenhem importante papel na gênese da endometriose. \nA primeira publicação em inglês avaliando a relação das células NK e \nendometriose vem da Bélgica, em 1991(Oosterlynck, et al., 1991). Este grupo \navaliou o percentual de células NK em relação à subpopulação linfocitária em \nsangue periférico e sua citotoxicidade em relação ao endométrio tópico das \nmesmas pacientes. A atividade das células NK e a citotoxicidade contra o \nendométrio tópico autólogo estava diminuída nas pacientes com \nendometriose e, além disto, se correlacionava com a severidade da doença. \nApós  avaliação in vitro puderam observar que a citotoxicidade das células \nNK era menor nas pacientes com endometriose quando comparadas às \nmulheres sem a doença e que esta diminuição era menor, quanto maior fosse \no estadiamento da doença. O mes mo grupo ainda relatou uma diminuição da \natividade das células NK no fluido peritoneal de pacientes com endometriose \n(Oosterlynck, et al., 1992). \nDa mesma forma, Kikuchi et al, (Kikuchi, et al., 1993)  avaliaram o \npercentual de células NK em sangue periféricos de 10 mulheres com \nendometriose, 10 mulheres com miomas e 9 mulheres hígidas e  encontraram \numa diminuição do percentual de células NK nas po rtadoras de \nendometriose. \nDias Jr et al., em  2012, realiz aram citometria de fluxo em sangue \nperiférico de 155 mulheres, sendo 100 pacientes com endometriose e 55 \nmulheres submetidas à laqueadura tubária. Estas mulheres  foram \n\n \n \n13 \nsubmetidas à laparoscopia e  encontraram diferenças nas concentrações de \ncélulas NK em pacientes com endometriose profunda. Estas pacientes \napresentaram uma maior concentração de células NK no sangue periférico \n(15,3%), em comparação às pacientes sem endometriose (9,8%). Ao \navaliarem as pacientes com está dio avançado da doença (especialmente  \nàquelas com doença de retossigmóide), esta diferença foi ainda maior (19,8% \nvs. 10,3%). \nApesar de resultados díspares na literatura, sugere -se que as células \nNK efetivamente participam do clearance das células endometriais \nregurgitadas para a cavidade abdominal , durante o período menstrual \n(Maeda, et al., 2002; Berbic & Fraser, 2013).  \nEm relação às células T-reguladoras, Berbic et al. (Berbic, et al., 2010) \ndemonstraram um aumento da expressão de Foxp3, em avaliação \nimunoistoquímica, no endométrio tópico de pacientes com endometriose \ndurante a fase secretora do ciclo menstrual. Os autores postularam haver \ndiminuição da habilidade dos leucócitos em reconhecer e marcar \nefetivamente antígenos endometriais regurgitados pela menstruação, \npermitindo sua sobrevivência e, desta forma, a capacidade de se implantar \nem sítios ectópicos. Além disto, a variabilidade da e xpressão do Foxp3 \nnestes sítios ectópicos, te ve correlação com a fase do ciclo menstrual  e com \nas características e estádios de cada lesão.  \nBraundmeier et al. (Braundmeier, et al., 2012) , utilizaram um modelo \nanimal de endometriose (Papio anubis) e avaliaram a expressão de Foxp3 no \nsangue periférico (imunoistoquímica) e endométrio tópico (RT -PCR) de \nanimais controles e com endometriose induzida. A expressão de Foxp3 e \ncélulas T-reg também estava reduzida no endométrio tópico comparad a com \nos animais controles , ao passo que estes parâmetros estavam aumentados \nno endométrio ectópico quando comparados com o endométrio tópico. \nAssim como na endometriose, no câncer  parece haver um distúrbio da \nresposta imune e algumas pesquisas têm tentado demonstrar que a inibição \ndas células T -reg poderia permitir uma melhor resposta às terapias \n\n \n \n14 \nimunológicas contra a doenç a. Existem evidências de que certos regimes de \nquimioterapia são capazes  de mediarem seus efeitos,  pelo menos em parte, \npor meio  da inibição das células T -reg. Já foi demonstrado que a \nciclofosfamida e o paclitaxel acarretam uma diminuição da população de \ncélulas T -reg maior do que outras células do sistema imune, diminuindo \ntambém seu papel inibitório e possibilitando assim uma resposta mais \nadequada das células do sistema imune (Menetrier-Caux, et al., 2012). \nPodgaec et al, 2012, avaliaram 98 mulheres, sendo 70 com \nendometriose e 28 sem a doença. Primeiramente, foram isolados os linfócitos \ndo fluído peritoneal e as células CD4 +CD25high por meio da citometria de \nfluxo. A seguir,  foi utilizado o RT -PCR para se v erificar a expressão de \nFoxp3 nestas células. De todos os linfócitos isolados no fluído peritoneal das \nmulheres com endometriose, 36,5% (mediana) foram CD4 +CD25high, ao \npasso que nas mulheres sem doença, somente 1,15% (mediana). O \nresultado da expressão do  Foxp3 foi semelhante, sendo 50 (pacientes com \nendometriose) versus 5 (grupo controle). \nAssim, para a hipótese do presente estudo, salientamos que a atuação \ndeste grupo de mediadores da resposta inflamatória parece ter importante \npapel na coordenação da re sposta imune contra as células endometriais. \nComo demonstrado por Dias et al., 2012, as células NK estão aumentadas no \nsangue periférico de pacientes com endometriose profunda e por Podgaec et \nal, 2012, mostraram que as células T -reg também estão aumentada s no \nfluido peritoneal das pacientes com endometriose, provavelmente, as células \nendometriais, quando presentes na cavidade peritoneal não seriam \neliminadas desse local impróprio por ação deficiente em várias etapas da \nresposta imune. Talvez o aumento das células NK seja compensatório pela \ndiminuição em sua citotoxicidade. Ou ainda que o aumento das células T -reg \npoderia bloquear a resposta imune e, desta forma, permitir a implantação das \ncélulas endometriais. Este aumento poderia ainda ser compensatório, p ara \nbloquear a exacerbação da resposta imune contra a instalação da \nendometriose.  \n\n \n \n15 \nSabemos que  macrófagos e células dendríticas, que são células \napresentadoras de antígenos , podem estar ativadas e aumentadas, porém, \nsuprimidas pela ação das células T -reg aumentadas (Corthay, 2009 ; \nPeterson, 2012). \nSabendo que as células NK são reguladas pelas quimiocinas CXCL9, \nCXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1 e as T -reguladoras pelas \nquimiocinas CCL17 e CCL21, o estudo destes mediadores que modulam a \natividade e migração destas células pode permitir uma melhor compreensão \nde mais uma etapa da resposta imune e ainda contribuir, no futuro, para \neventuais tratamentos desta doença. Se estas células estão aumentadas, as \nquimiocinas que regulam sua migração devem ter um expressão diferenciada \nnas pacientes com endometriose. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n16 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2. OBJETIVOS \n \n\n \n \n17 \nObjetivo principal \n Avaliar a expressão gênica de quimiocinas reguladoras da \natividade de células Natural Killer  (CXCL9, CXCL10, CXCL11, \nCXCL12, XCL1 e CX3CL1) e T -reguladoras (CCL17 e CCL21) no \ntecido endometrial tópico e na lesão endometriótica  de pacientes \ncom endometriose profunda (retossigmóide e retrocervical). \nObjetivos específicos \n Relacionar, em pacientes com endometriose profunda, a expressão \ngênica das quimiocinas reguladoras da atividade de células Natural \nKiller e T-reguladoras com: \na. fase do ciclo menstrual; \nb. quadro clínico; \nc. estadiamento da endometriose (ASRM, 1996); \nd. localização da doença: retrocervical e retossigmóide. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n18 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3. PACIENTES E MÉTODOS \n \n\n \n \n19 \n3.1 Pacientes  \n3.1.1 Local de estudo e pacientes \nO estudo foi realizado no Setor de Endometriose da Divisão de Clínica \nGinecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo (HC -FMUSP). As pacientes foram divididas em \ntrês grupos: paciente s com endometriose de retossigmó ide confir mada \nhistologicamente (grupo A), pacientes com endometriose retrocervical \nconfirmada histologicamente (grupo B) e pacientes sem endometriose \nsubmetidas à cirurgia de laqueadura tubária como método de planejamento \nfamiliar (grupo C). O estudo foi aprovado p elo Comitê de Ética da instituição \n(nº0025/10). As pacientes foram previa mente informadas sobre o estudo e  o \nmaterial foi coletado após a assinatura do termo de consentimento livre e \nesclarecido, pelas mesmas. A coleta das amostras respeitou os princípios \néticos, práticos e de biossegurança estipulados pelo Ministério da Saúde e \npelas Comissões de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da instituição. \n3.1.2 Número de paciente estudados \n  Trata-se de estudo caso -controle prospectivo exploratório, com \num n  de 64 pacientes entre casos e controles, que foi o número de casos \noperados consecutivamente em um ano. \n3.1.3 Critérios de inclusão/exclusão  \n Determinou-se para os grupos A e B os seguintes critérios de inclusão: \n Idade entre 18 e 40 anos; \n Ciclos menstruais eumenorreicos com o intervalo entre os ciclos \nvariando de 26 a 34 dias; \n Endometriose comprovada histologicamente em região de \nretossigmóide (A) ou retrocervical (B); \n\n \n \n20 \n Ausência de doenças autoimunes comprovadas por anamnese, \nexame físico e laboratoriais quando necessário; \n Não utilização de terapêutica hormonal nos três meses que \nantecederam a cirurgia, incluindo análogos de GnRH, \nprogestagênios e contraceptivos hormonais orais. \nPara o grupo C, foram selecionadas mulheres respeitando os mesmos \ncritérios acima, com exceção da confirmação histológica de endometriose. \n \n3.2 Métodos \n3.2.1 Dinâmica do Estudo \n Todas as pacientes foram avaliadas do ponto de vista clínico pela \nhistória, exame físico e de imagem (ultrassonografia pélvica e/ou transvaginal \ne ressonância magnética, quando apropriado), de acordo com a indicação \nclínica para confirmação da suspeita de endometriose e posterior indicação \ncirúrgica. \nA decisão sobre a realização de tratamento clinico ou cirúrgico \ndepende, de forma preponderante, do quadro clínic o, assim como do desejo \nreprodutivo, idade da paciente e das características das lesões. No grupo A, \nas pacientes foram submetidas à cirurgia quando da presença de lesão em \nretossigmóide à ultrassonografia  e que não apresentaram melhora clínica \napós 6 a 12  meses de tratamento, ou ainda, quando havia quadro sugestivo \nde suboclusão intestinal. No grupo B, foram encaminhadas para cirurgia as \npacientes com ultrassom sugestivo de lesões retrocervicais e que \napresentavam falha do tratamento clínico após 6 a 12 meses de tentativa. \nCom relação ao grupo C, foram encaminhadas para cirurgia de \nlaqueadura tubária, pacientes com prole constituída e sem desejo \nreprodutivo. Durante a cirurgia foi possível confirmar a ausência de lesões de \nendometriose.  \n\n \n \n21 \n No momento da v ídeo-laparoscopia foi anotado o dia do ciclo \nmenstrual, sendo considerado como fase folicular do primeiro ao décimo \nquarto dia do ciclo e fase lútea do décimo quinto até o último dia do ciclo \nmenstrual.  \n Os fragmentos de endométrio das participantes do estud o foram \ncoletados com cureta de Pipelle antes do início da vídeo -laparoscopia. Os \nfragmentos das lesões de endometriose foram coletados apos a exérese dos \nmesmos durante o procedimento terapêutico. Foi coletado aproximadamente \n3cm2 de tecido por paciente.  \nCada fragmento coletado foi dividido em duas partes iguais: a primeira \nfoi armazenada em tubo com RNAlatter ( Qiagen® -Ontario- CA code 76106 ) \na -80ºC e a segunda encaminhada para o Departamento de Anatomia \nPatológica, para seguir os trâmites habituais do diagnóstico histológico da \ndoença.  \n3.2.2 Quadro Clínico \n Todas as pacientes foram questionadas sobre os seis sintomas \nrelacionados à endometriose: \n1. Dismenorréia – dor em cólica durante o período menstrual; \n2. Dispareunia de profundidade – dor pélvica durante o ato sexual; \n3. Dor pélvica acíclica – dor pélvica sem relação com o período \nmenstrual, constante, sem melhora com o uso de analgésicos; \n4. Infertilidade – dificuldade para um casal, sem o uso de métodos \ncontraceptivos, engravidar por pelo menos um ano de tenta tiva, com \nvida sexual ativa (duas ou mais relações por semana); \n5. Alteração intestinal cíclica – dor e/ou sangramento à evacuação no \nperíodo menstrual; \n\n \n \n22 \n6. Alteração urinária cíclica – dor e/ou sangramento à micção no período \nmenstrual. \nTodos os quadros álgicos tiveram sua intensidade avaliada de acordo com \numa escala analógica de dor (anexo 1). \n \n \nQuadro 1 – Representação esquemática da dinâmica de estudo \n3.2.3 Estadiamento da Endometriose \nAs pacientes do grupo A foram estadiadas segundo a classificação da \nAmerican Society for Reproductive Medicine (1996) (Figura 1). Para fins \nestatísticos, agrupamos os estádios I e II como “estádio inicial ” e os estádios \nIII e IV como “estádio avançado”. \n\n\n \n \n23 \nFigura 1: Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for \nReproductive Medicine (1996) \n\n\n \n \n24 \n3.3 Detecção das quimiocinas por PCR  em tempo real no endométrio \ntópico e nas lesões endometrióticas \n● Extração de RNA \nCélulas do endométrio tópico e lesão endometriótica, obtidas durante o \nprocedimento cirúrgico dos pacientes e dos indivíduos controle, foram \ndescongeladas, pulverizadas em gral com nitrogênio líquido  e submetidas à \nextração do RNA total, por meio  da técnica descrita por Chomizinski and \nSacchi em 1987, a qual utiliza solução de Trizol (Life Techn ologies, Grand \nIsland, NY, USA) para isolamento de RNA total.   \nO RNA obtido dos fragmentos de endométrio e das lesões \nendometrióticas foi extraído por meio da adição de 1ml de trizol,  incubação à \ntemperatura ambiente por 5 minutos e, após adição de 0,2 ml de clo rofórmio, \nagitação vigorosa por 15 segundos e incuba ção à temperatura ambiente, por \n3 minutos. A separação de fases foi feita por centrifugação a 12.000g por 15 \nminutos a 4ºC. O RNA presente na fase aquosa (superior) foi transferido para \noutro tubo e preci pitado pela adição de 0,5 ml de isopropanol por 10 minutos \nà temperatura ambiente. Posteriormente, a amostra foi centrifugada a \n12.000g por 10 minutos a 4ºC. O sedimento foi lavado com 1 ml de etanol a \n75% (com o uso de vórtex), centrifugado a 7000g por 5 minutos, seco à \ntemperatura ambiente e ressuspenso em água contendo DEPC \n(dietilpirocarbonato). Após este procedimento, o  material foi mantido a – \n80ºC, para manutenção da integridade das amostras. \n● Quantificação de RNA \n Após a extração, o RNA obtido foi quantificado por meio de leitura em \nespectrofotômetro ( Nano Vue plus , GE – New Jersey , USA) nos \ncomprimentos de onda (λ) de 260 e 280 nm. O grau de pureza da amostra foi \nverificado por meio  da análise da  relação entre 260 e 280nm,  sendo \nconsiderados valores entre 1,7 e 2,0 (Sambrook, 1989).  \n\n \n \n25 \n As amostras de RNA foram tratadas com DNAse I (Life Technologies, \nGrand Island, NY, USA) para descartar possível contaminação com DNA. \n Além disto, uma alíquota de RNA foi submetida à eletroforese em gel \nde agaro se 1% , corado com brometo de etídio  para visualização da \nintegridade das amostras. \n● Reação de PCR em tempo real (RT-PCR) \n A expressão dos genes foi avaliada por PCR em tempo real utilizando  \n100ng de RNA em equipamento Step One (Applied Biosystems – Foster City, \nCA – USA) com o kit Super Script III Platinum SYBR® Green One -Step \nqRT.PCR (11736-051- Invitrogen Carlsbad, CA - USA) que contem SYBR® \nGreen I como fluoróforo. A quantificação da expressão gênica foi realizada \npor 2-ΔΔCT\n (Livak et AL, 2001), usando o gene da Beta2 -microglobulina como \ncontrole interno. As seqüências dos primers específicos que foram utilizados, \nassim como as temperaturas de hibridização e tamanhos dos fragmentos \nencontram-se na Tabela 2. \nTabela 2 : Lista de Primers  das qu imiocinas CCL17, CCL21, CXCL9, \nCXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1 utilizados no presente estudo. \nGENE GENE BANK SENSE REVERSE PB \nCCL17 NM_002987 ACTGAAGATGCTGGCCCTGGTC AAACGATGGCATCCCTGGAGC 182 \nCCL21 NM_002989 CCCAGCTATCCTGTTCTTGC TCAGTCCTCTTGCAGCCTTT 201 \nCXCL9 NM_002416.1 TGCTGGTTCTGATTGGAGTG TTTGGCTGACCTGTTTCTCC 246 \nCXCL10 NM_001565 CTGTACGCTGTACCTGCATCA TTCTTGATGGCCTTCGATTC 172 \nCXCL11 NM_005409 AGAGGACGCTGTCTTTGCAT TGGGATTTAGGCATCGTTGT 154 \nCXCL12 AY802782 GTCAGCCTGAGCTACAGATGC CTTTAGCTTCGGGTCAATGC 162 \nXCL1 NM_002995 TGGCATCTGCTCTCTCACTG ATTTCCTGTCCATGCTCCTG 236 \nCX3CL1 NM002996 TCTGCCATCTGACTGTCCTG CTGTGCTGTCTCGTCTCCAA 169 \n A representação esquemática de todo o processo da detecção da \nexpressão gênica das quimiocinas pelo PCR em tempo real no endométrio \ntópico e nas lesões endometrióticas se encontra no quadro 2. \n \n \n\n \n \n26 \n \nQuadro 2  – Representação esquemática da detecção das quimiocinas por \nPCR em tempo real no endométrio tópico e nas lesões de endometriose. \n3.4 – Método Estatístico \nPara responder aos objetivos do estudo, as características \nquantitativas foram descritas segundo grupos com uso de medidas resumo \n(média, desvio padrão, mediana, mínimo e máximo). A idade foi comparada \nentre os grupos com uso d o teste  ANOVA (Neter, et. al., 1996). Para \ncomparação das queixas clínicas entre os grupos foi aplicado o teste Kruskal-\nWallis, seguido de comparações múltiplas não paramétr icas (Neter, et. al., \n1996), para identificar entre quais grupos ocorre a diferença.  \nAs características qualitativas das mulheres foram descritas  segundo \ngrupos com uso de freqü ências absolutas e relativas, verificada a existência \nde associação entre as medidas e os grupos, com uso de testes da razão de \nverossimilhanças (Kirkwood e Sterne, 2006). \n\n\n \n \n27 \nAs quimiocinas foram descritas segundo grupos e locais de avaliação \ncom uso de medidas resumo e comparadas entre os grupos e locais, uso do \nteste ANOVA com medidas repetidas, sendo o fator local hierárquico ao fator \ngrupo (Singer e Andrade, 2000). As análises foram seguidas de comparações \nmúltiplas de Tukey (Neter, et. al., 1996) para verificar entre quais grupos e \nlocais ocorreram as diferenças. Todos os resultados foram padronizados pelo \nvalor do grupo controle, sendo este considerado como 1 e os demais como \numa comparação com relação a este valor. \nOs resultados das qu imiocinas foram descritos  no endométrio tópico \nsegundo grupo de pacientes e segundo fase do ciclo  menstrual, com uso de \nmedidas resumo e comparados os valores de quimiocinas, segundo grupos e \nfase com uso de ANOVA com dois fatores (Neter, et. al., 1996). \nOs resultados foram ilustrados com gráficos de barras representando \nas médias c om os respectivos e rros padrões  e os testes foram realizados \ncom nível de significância de 5%. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n28 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4. RESULTADOS \n \n\n \n \n29 \nCento e vinte e duas pacientes foram submet idas a tratamento \ncirúrgico no Setor de endometriose do Hospital das Clínicas da Universidade \nde São Paulo, sendo que 64  foram incluídas em nosso estudo  quando \navaliadas, por cumprirem os critérios para participação do mesmo . A seguir,  \nforam divididas nos seguintes grupos: A: 22 pacientes com endometriose \nintestinal, B: 10 pacientes com endometrios e retrocervical e C: 32 pacientes \nsubmetidas a laqueadura tubária para contracepção definitiva. A média etária \nno grupo A foi de 34,14 (DP=4,87), no grupo B de 34,70 (DP=5,66) e no \ngrupo C de 31,97 (DP=3,46), o que não mostrou dife rença significativa (p = \n0,102) na comparação entre os grupos.  \nComo exposto na tabela 3, todas as queixas clínicas avaliadas \napresentaram diferenças estatísticas significativas entre os grupos \n(p<0,001), sendo o valor no grupo controle estatisticamente menor que nos \ngrupos de pacientes. \n  \n\n \n \n30 \nTabela 3 – Descrição das características referentes ao quadro clínico das \npacientes com  endometriose retrocervical e de retossigmóide  e mulheres \nsem endometriose (grupo controle).  \n  Grupo \n% de \npacientes \nacometidas  \nMédia \n(EVA) DP N p \nDismenorréia \nControle 37,50% 1,38 2 32 \n<0,001 EDT RS 86,36% 7,55 3,26 22 \nEDT RC 80% 6,9 3,93 10 \nDispareunia \nControle 0 0 0 32 \n<0,001 EDT RS 54,54% 3,5 3,67 22 \nEDT RC 60% 2,3 2,75 10 \nDPC \nControle 0 0 0 32 \n<0,001 EDT RS 36,36% 2,59 3,57 22 \nEDT RC 50% 2,2 3,19 10 \nAlterações \nintestinais \ncíclicas \nControle 0 0 0 32 \n<0,001 EDT RS 40,90% 2,82 3,71 22 \nEDT RC 40% 2,1 3,45 10 \nAlterações \nurinárias \ncíclicas \nControle 0 0 0 32 \n<0,001 EDT RS 18,18% 1,36 3,06 22 \nEDT RC 0 0 0 10 \nDP = desvio padrão \nEVA = escala visual analógica de dor \nEDT RS = pacientes com endometriose de retossigmóide \nEDT RC = pacientes com endometriose retrocervical \n Conforme demonstrado pelos gráficos 1 a 4, as quimiocinas  CX3CL1, \nCXCL12 e CCL17 apresentaram médias estatisticamente diferentes entre os \ngrupos ou locais de avaliação (p<0,05). Quando as quimiocinas com \ndiferenças estatísticas significativas foram avaliadas isoladamente, pudemos \nobservar que duas delas (CX3CL1 e CXCL12) eram reguladoras da atividade \ndas células NK.  \n  \n\n \n \n31 \nConsiderando as quimiocinas relacionadas à atividade das células NK, \na CX3CL1 (Fraktalkine) apresentou maior expressão n a lesão endometriótica \nda doença retrocervical quando comparado aos demais gr upos (p<0,05) . \n(Gráfico1).  \n \nGráfico 1 – Expressão relativa da quimiocina CX3CL1 em endométrio tópico \ne lesão endometriótica  de pacientes com endometriose retrocervical e de \nretossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose. \nTanto as pacientes com endometriose retrocervical, como aquelas com \ndoença de retossigm óide, possuíam uma expressão da CXCL12 maior no \nfoco de doença do que no endométrio tópico das mulheres com endometriose \ne daquelas submetidas à laqueadura tubária (p < 0,05) (Gráfico 2).  \n \n\n\n \n \n32 \n \nGráfico 2– Expressão relativa da quimiocina CXCL12 em endométrio tópico \ne lesão endometriótica  de pacientes com endometriose retrocervical e de \nretossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose. \nNas demais quimiocinas r elacionadas com a atividade e/ou migração \ndas células NK, não foram encontradas diferenças significativas na \ncomparação entre os grupos e/ou locais avaliados, apesar de verificarmos \numa certa tendência em alguns casos, como a XCL1, que parece ser menos \nexpressa na endometriose de retossigmóide e a CXCL9, que parece estar \ndiminuída na lesão endometriótica das pacientes com endometriose de \nretossigmóide, porém, as duas sem confirmação estatística. \n \n \n \n \n \n\n\n \n \n33 \n \nQuadro 3– Expressão relativa da quimiocina CXCL9, CXCL10, CXCL11 e \nXCL1 em endométrio tópico e lesão endometriótica de pacientes com \nendometriose retrocervical e de retossigmóide e endométrio tópico de \npacientes sem endometriose. \nDas quimiocinas relacionadas à atividade das  células T-reg, a CCL17 \napresentou resultado significativo. Ela foi mais expressa no endométrio tópico \nde p acientes com lesão em retossigmó ide quando comparada aos demais \ngrupos (p<0,05) (Gráfico 3). \n \n\n\n \n \n34 \n \nGráfico 3– Expressão relativa da quimiocina CCL17 em endométrio tópico e \nlesão endometriótica de pacientes com endometriose retrocervical e de \nretossigmóide e endométrio tópico de pacientes sem endometriose. \nQuando avaliamos a CCL21, não encontramos diferenças \nsignificativas na expressão gênica entre os grupos (Gráfico 4).  \n \n \n\n\n \n \n35 \n \nGráfico 4– Expressão relativa da quimiocina CCL21 em endométrio tópico e \nlesão endometriótica de pacientes com endometriose retrocervical e de \nretossigmóide e tópico de pacientes sem endometriose \nNenhuma das duas f ases do ciclo menstrual teve  predominância \nsignificativa em nenhum dos 3 grupos, não mostrando diferenças \nsignificativas nas expressões gênicas das quimiocinas quando comparadas \nas fases do ciclo menstrual (Tabela 4). \n  \n\n\n \n \n36 \nTabela 4 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com e \nsem endometriose segundo as fases do ciclo menstrual, folicular e lútea. \n  Fase do ciclo menstrual   \nQuimiocina Folicular Lútea p \n  Média DP N Média DP N   \nXCL1 1,335 1,487 29 0,998 1,147 35 0,189 \nCX3CL1 1,087 0,914 29 1,086 1,095 35 0,845 \nCXCL9 1,066 1,058 29 1,786 4,097 35 0,919 \nCXCL10 0,973 1,053 29 2,183 6,478 35 0,399 \nCXCL11 1,009 1,183 29 1,449 1,927 35 0,157 \nCXCL12 1,669 1,812 29 1,395 1,766 35 0,430 \nCCL17 2,414 1,919 29 3,374 4,631 35 0,751 \nCCL21 3,917 9,995 29 6,353 25,919 35 0,147 \n \nA tabela 5 mostra que pacientes com endometriose e com \ndismenorréia apresentam estatisticamente menor valor da quimiocina  \nCXCL11 (NK) no endométrio tópico que pacientes sem dismenorréia (p = \n0,019). \n  \n\n \n \n37 \nTabela 5 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocerv ical segundo a presença de \ndismenorréia. \n  Dismenorréia   \nQuimiocina Não Sim p \n Média DP N Média DP N   \nXCL1 0,396 0,513 5 0,889 0,875 27 0,220 \nCX3CL1 0,498 0,250 5 0,945 0,637 27 0,087 \nCXCL9 0,685 0,395 5 0,878 1,134 27 0,880 \nCXCL10 1,698 1,520 5 0,665 0,398 27 0,060 \nCXCL11 2,273 1,661 5 0,700 0,524 27 0,019 \nCXCL12 0,592 0,636 5 1,796 2,353 27 0,511 \nCCL17 3,822 2,883 5 3,328 4,590 27 0,511 \nCCL21 2,336 2,399 5 2,405 2,920 27 0,725 \n \nA tabela 6 mostra que a presença de dispareunia não influencia \nestatisticamente nos valores das quimiocinas em pacientes com \nendometriose (p > 0,05). \nTabela 6 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas  XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de \ndispareunia de profundidade. \n  Dispareunia   \nQuimiocina Não Sim p \n  Média DP N Média DP N   \nXCL1 1,012 0,949 14 0,657 0,739 18 0,301 \nCX3CL1 0,922 0,765 14 0,839 0,485 18 0,561 \nCXCL9 0,570 0,262 14 1,064 1,359 18 0,722 \nCXCL10 0,857 1,045 14 0,803 0,461 18 0,398 \nCXCL11 1,182 1,312 14 0,761 0,534 18 0,639 \nCXCL12 1,172 1,311 14 1,947 2,707 18 0,808 \nCCL17 3,826 5,660 14 3,078 3,080 18 0,985 \nCCL21 2,227 2,598 14 2,524 3,031 18 >0,999 \nPela tabela 7, tem-se que pacientes com endometriose que possuem \ndor pélvica crônica apresentam estatisticamente menores valores de CCL17 \ne de CCL21 (T -reg) (p = 0,001 e p = 0,005 respectivamente) e apresentam \n\n \n \n38 \nmaiores valores de XCL1 e CXCL12  (NK) (p = 0,045 e p = 0,049 \nrespectivamente). \nTabela 7 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de dor \npélvica crônica. \n  Dor Pélvica Cronica   \nQuimiocina Não Sim p \n  Média DP N Média DP N   \nXCL1 0,593 0,795 19 1,133 0,833 13 0,045 \nCX3CL1 0,900 0,699 19 0,838 0,485 13 0,734 \nCXCL9 0,986 1,326 19 0,647 0,369 13 0,970 \nCXCL10 0,888 0,940 19 0,738 0,383 13 0,880 \nCXCL11 1,139 1,155 19 0,663 0,488 13 0,209 \nCXCL12 1,005 1,423 19 2,489 2,861 13 0,049 \nCCL17 4,776 5,229 19 1,402 0,416 13 0,001 \nCCL21 3,369 3,273 19 0,969 0,786 13 0,005 \n  \nA tabela 8 mostra que a presença de alterações intestinais não \ninfluencia estatisticamente nos valores das quimiocinas estudadas em \npacientes com endometriose (p > 0,05). \nTabela 8 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas  XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical segundo a presença de \nalterações intestinais. \n  Alterações intestinais cíclicas   \nQuimiocina Não Sim p \n  Média DP N Média DP N   \nXCL1 0,703 0,765 19 0,972 0,952 13 0,650 \nCX3CL1 0,845 0,557 19 0,918 0,709 13 0,970 \nCXCL9 1,031 1,309 19 0,581 0,385 13 0,223 \nCXCL10 0,896 0,901 19 0,725 0,501 13 0,650 \nCXCL11 0,994 1,127 19 0,874 0,685 13 0,970 \nCXCL12 1,557 2,096 19 1,683 2,457 13 0,910 \nCCL17 4,330 5,431 19 2,055 0,966 13 0,448 \nCCL21 2,792 3,353 19 1,813 1,705 13 0,762 \n \n\n \n \n39 \nA tabela 9 mostra que pacientes com estadiamento avançado (ASRM, \n1996) apresentam estatisticamente maior expressão de CCL21 (T -reg) \nquando comparas às pacientes com estadiamento inicial (p = 0,041). \nTabela 9 – Descrição da expressão gênica das quimiocinas XCL1, CX3CL1, \nCXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas pacientes com \nendometriose de retossigmóide e retrocervical segundo estadiamento inicial \n(1 e 2) e avançado (3 e 4) – ASRM 1996. \n  Estadiamento   \nQuimiocina Inicial (1 e 2) Avançado (3 e 4) p \n  Média DP N Média DP N   \nXCL1 1,107 0,435 3 0,782 0,872 29 0,286 \nCX3CL1 0,429 0,092 3 0,921 0,626 29 0,082 \nCXCL9 0,405 0,225 3 0,894 1,093 29 0,207 \nCXCL10 0,528 0,450 3 0,858 0,783 29 0,457 \nCXCL11 1,512 1,563 3 0,887 0,900 29 0,580 \nCXCL12 0,728 0,668 3 1,699 2,300 29 >0,999 \nCCL17 1,638 0,714 3 3,589 4,515 29 0,457 \nCCL21 0,377 0,136 3 2,603 2,873 29 0,041 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n40 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5. DISCUSSÃO \n \n\n \n \n41 \n A tentativa de identificação da etiopatogenia da endometriose é um \ndos assuntos mais estudados nos últimos anos ( Ulukus et al., 2009) . Apesar \nde novas hipóteses terem sido levantadas, divers as pesquisas têm \nencontrado evidências de que a teoria da menstruação retrógrada \ncomplementada por fatores imunológicos parece ter importante papel na \ngênese desta doença (Podgaec et al., 2010; Herington et al., 2011; \nFassbender et al., 2011). \n Levando em consideração  as diversas alterações no sistema \nimunológico observadas até o momento e, considerando que as células T-reg \ne NK desempenhem importante papel nesta resposta imunológica (Podgaec, \net al., 2012 e Dias Jr, et al., 2012), resolvemos estudar o que poderia \nmodificar o comportamento destes dois importantes agentes do sistema \nimune, as quimiocinas.  \nAs quimiocinas são um grupo de, pelo menos, 47 proteínas correlatas, \nfazendo delas a maior família de citocinas conhecida (Robertson et al., 2002; \nAbbas et al., 2011) e são divididas em quatro subgrupos: CXC (ou a), CC (ou \nb), CX3C e subfamílias C. Cada quimiocina consegue se ligar a mais de um \nreceptor e cada receptor interage com mais de uma quimiocina (Nishida et \nal., 2011). \n Conforme a própria nomenclatu ra, quimiocinas são citocinas \nquimiotáticas. Elas atuam se ligando a receptores de membrana e podem, \ndesta forma, modular a atividade de algumas células mediadoras da resposta \ninflamatória, incluindo -se as células T -reg e NK. A migração e a atividade \ndessas células nos tecidos -alvo pode m ser influenciada s pela ação deste \ngrupo de proteínas (Qin et al., 2008). \n A correlação entre a atividade das células T -reg e células NK na \nendometriose ainda é assunto pouco esclarecido. Se considerarmos ainda \nque suas açõe s podem ser moduladas por outros mediadores da resposta \ninflamatória como as quimiocinas, abrimos um leque ainda maior de \nperguntas. \n\n \n \n42 \nBudiu et al (2009) avaliaram a presença da glicoproteína mucina 1, \n(MUC1) na endometriose. Estas  são normalmente expressas  no epitélio \nluminar e glandular  em endométrio humano e pouco expressas nas células \nepiteliais do ovário. No entanto, são  superexpressadas em carcinomas \novarianos de células claras e endometrióides. Além disto, alguns estudos \nvisando uma terapia antígeno -específica contra o câncer foram \ndesenvolvidos avaliando uma possível vacina contra a MUC1 (Cramer, et al., \n2005 e Oei, et al., 2008) e, desta forma, os autores deste grupo resolveram \navaliar o comportamento desta glicoproteína  em um modelo animal de \nendometriose ovariana, além de avaliarem  sua resposta inflamatória. \nEncontraram um aumento da expressão de MUC1 na superfície ovariana e \numa predominância da subclasse IgG1, sugerindo uma resposta Th2 e um \nacúmulo de linfócitos Foxp3+ CD4 nos linfonodos nos estágios avançados de \ndoença. \n Basta et al (2010) avaliaram 47 mulheres, sendo 16 submetidas à \nlaparoscopia para tratamento de gestação ectópica tubárea, 16 mulheres \nsubmetidas à laparoscopia para tratamento de endometrioma ovaria no e 15 \npacientes submetidas à laqueadura tubárea que foram denominadas grupo \ncontrole. Neste estudo, o percentual de  Foxp3+ com a subpopulação de \nlinfócitos T CD4+CD25high encontrados na decídua do grupo com gestação \nectópica foi significativamente menor quando comparados tanto aos tecidos \ndas pacientes com endometriomas ovarianos quanto ao endométrio do grupo \ncontrole. Os autores especularam que os distúrbios do equilíbrio do \nendometrioma e da decídua na gestação ectópica seriam devidos a  \nalterações da população de células T-reg nestes locais. \n Berbic et al., em 2010, realizaram um estudo em que analisaram  por \nimunoistoquimica a expressão de  Foxp3 em amostras de 127 endométrios \ntópicos e 59 lesões endometrióticas peritoneais. Foi demonstrado  que nas \npacientes com endometriose, a expressão de células Foxp3+ CD4 +CD25high \nnão tiveram o declí nio esperado na fase secretora do ciclo menstrual. Isto  \npoderia contribuir para a diminuição na habilidade de recrutar novos \nleucócitos ou outras células do sistema imune  para permitir uma resposta \n\n \n \n43 \nimunológica efetiva contra os fragmentos endometriais que adentram à \ncavidade peritoneal, impedindo ou, ao menos, dificultando o desenvolvimento \ndos implantes endometrióticos. \n André et al., 2011, mostraram  a presença de certos polimorfismos no \nFoxp3 em pacientes inférteis e com endometriose quando comparadas a \nmulheres normais.  Utilizaram uma coorte de 419 mulheres, sendo 177 \nmulheres inférteis e com endometriose, 71  mulheres com infertilidade \nidiopática e 171 mulheres férteis como controle. Avaliaram amostras de \nsangue periférico e os polimorfismos foram identificados por meio do uso de  \nPCR. Após análise estatís tica, encontraram que o polimosfismo rs3761549 \nestava fortemente associado à endometriose. Foi o primeiro estudo avaliando \npolimorfismos do Foxp3 com a endometriose e infertilidade, sugerindo uma \nrelação entre os mesmos. \nQin et al., 2008 mostraram que as células T -reg sofrem influência de \nalgumas quimiocinas (CCL17 e 21) podendo fazer com que o desemp enho \nde sua função seja exacerbado ou mesmo comprometido, através da inibição \nde sua ação. Em nosso trabalho pudemos observar uma diferença estatística \nsignificativa n a avaliação da quimiocina CCL17, que foi mais expressa no \nendométrio tópico das pacientes com endometriose de retossigmóide. \n Sabemos que a quimiocina CCL17 pode modular a ação das células \nT-reg (Qin et al., 2008, Heiseke et al., 2012).  Muitos estudos já \ndemonstraram a ação desta quimiocina na gênese de doenças intestinais, \ncomo a doença de Crohn (Izcue et al., 2008; Park et al., 2010; Heiseke et al., \n2012). Experimentos usando camundongos deficientes em C CL17 \nconfirmaram que esses animais  não são capazes de desenvolver sinais \nclínicos relevantes de doenças autoimunes intestinais, mesmo quando \navaliados em diferentes espaços de tempo . Estes resultados sugerem que a \ninflamação é colocada em xeque  e pode ser  inibida por fatores imunes \nregulados em camundongos deficientes em CCL17 , já que esta quimiocina \nparece ser essencial para o desenvolvimento  da inflamação no intestino de \ncamundongos. A CCL17 tem um efeito autócrino nas células dendríticas que \npromove a produção de citocinas inflamatórias e a ativação das respostas \n\n \n \n44 \nTh1 e Th17, que reduzem a expansão de células T-reg. Desta forma, Heiseke \net al., em 2012, demonstraram que os camundon gos deficientes em CCL17 \ntêm maior propensão à expansão clonal de células T-reg em comparação aos \ncamundongos competentes em CCL17. Ou seja, a falta de CCL17 permite \nque as células T -reg tenham uma expansão de seu nú mero e, desta forma, \numa maior ação na manutenção da resposta imune.  \nSendo assim, a sua concentra ção diminuída na lesão endometriótica  \nde pacientes com endometriose de retossigmóide quando comparado ao \nendométrio tópico de pacientes controles, nos leva a pensar em uma possível \nassociação com a gênese de outras doenças autoimunes intestinais. Esta \ndiminuição de CCL17 encontrada na  lesão de retossigmóide, permitiria a \nexpansão clonal de células T -reg neste local. Isto ainda vai ao encontro do \nque já foi rela tado por outros autores (Budiu et al., 2009; Berbic et al., 2010; \nBasta et al., 2010; Prieto, 2011) e mesmo com o relatado por nosso grupo em \n2012, quando Podgaec, et al., demonstraram um percentual maior de \nlinfócitos CD4 +CD25high no fluído peritoneal de mulheres com endometriose . \nO aumento da concentração das células T -reg no fluído peritoneal de \npacientes com endometriose e ainda, a sua maior concentração nos \nendometriomas ovarianos nos leva a uma hipótese de que esta maior \nconcentração leve a um funcion amento defeituoso das outras células do \nsistema imune. Sendo assim, o encontrado em nosso estudo complementaria \na descrição d e um ambiente propenso à maior concentração destas células \nque atuam de forma tão intensa na resposta imune. Além disto, a maior \nconcentração de CCL17 n o endométrio tópico  das paciente s com \nendometriose intestinal  indica a baixa propensão das células T -reg em se \nconcentrar nesta localização, permitindo  um maior acúmulo  na cavidade \nperitoneal e ocasionando algumas das modificações da resposta imune que \npoderiam ser parte da resposta para a instalação desta doença. \n As células NK, assim como outras células T e B, são um dos maiores \nsubconjuntos de linfócitos que foram identificados em todas as espécies de \nvertebrados examinados  (Linsen et al., 2005) . São linfócitos distintos das \ncélulas T e B e que desempenham importante p apel nas respostas imunes \n\n \n \n45 \ninata e adaptativa . O termo natural killer deriva do fato de que estas células \nsão capazes de realizar sua função de morte sem a necessidade d e \nexpansão clonal e/ou diferenciação, fato necessário por outras células \nassassinas do sistema imune, como os linfócitos T citotóxicos (CTL) \n(Robertson, 2002). \nComo as células NK participam do clearance das células endometriais \nregurgitadas para a cavidade  abdominal, imagina -se que elas estejam \nsubativadas na endometriose ou não reconheçam o tecido endometrial \nectópico como sendo um material em apoptose e que deveria ser eliminado \n(Ota et al., 2002). Entretanto, o número de células NK é um tema um tanto \nquanto controverso. Diversos trabalhos são conflitantes, mostrando que este \nnúmero pode estar diminuído (Ota et al., 2002), aumentado (Hill et al., 1988 e \nMasubayashi et al., 2001), inalterado (Oosterlynck et al., 1994) ou variável de \nacordo com o estádio (ASRM, 1986) da doença (Dias Jr et al., 2005).  \nA atividade das células NK pode ser modulada pela presença de  \nalgumas quimiocinas (Robertson, 2002). Seja pelo aumento da migração \ndestas células em resposta à presença de determinadas quimiocinas (CXCL \n9, 10, 1 1 e 12, XCL1 e CX3CL1), como pelo aumento de sua atividade \ncitolítica quando na presença de quimiocinas específicas (CXCL10 e \nCX3CL1) (Robertson, 2002; Moris and Ley, 2004; Groom and Luster, 2011). \nA presença diferenciada de algumas quimiocinas encontradas  em \nnosso trabalho, como a CX3CL1 e a CXCL12,  mostra exatamente esta ação \ndeficitária de células NK em pacientes com endometriose. Apesar de não \ntermos resultados estatisticamente significativos, a s quimiocinas XCL1, \nCXCL9, CXCL10 e CXCL11 foram mais expre ssas no grupo controle que em \npacientes com endometriose. Principalmente se levarmos em consideração a \nXCL1 e a CXCL9 que tiveram resultados aparentemente mais expressivos e, \ncomo elas atuam de modo a estimular a migração das células NK,  isto iria ao \nencontro do acima exposto, sugerindo uma migração deficitária de células NK \npara sítios de endometriose, permitindo, desta forma  um comprometimento \nda resposta imune local e o posterior desenvolvimento da doença. \n\n \n \n46 \nA CX3CL1 ( Fraktalkine) é uma das quimiocinas mai s estudadas em \nendometriose (Zhang et al., 2004; Shimoya et al., 2005; Watanabe et al., \n2006; Nishida et al., 2011). Watanabe et al., 2006 avaliando mulheres sem \nendometriose, demonstraram que a CX3CL1 é mais presente no endométrio \ntópico na fase secretora, quando comparada à proliferativa, exemplificando \nainda que a presença dela poderia ser uma das responsáveis pela regulação \ndo ambiente imunológico, atraindo células NK. \nNosso estudo encontrou uma diferença estatística significativa no que \ndiz respeito à presença de CX3CL1 no endométrio ectópico de pacientes com \nendometriose retrocervical. Q uando comparadas ao endométrio tópico das \npacientes dos demais grupos, apresentavam uma expressão aumentada. Isto \ntalvez mostre uma tentativa do organismo em aumentar a quimiotaxia para \ncélulas de defesa, como as NK e, desta forma tentar diminuir os danos \ncausados por esta doença. \nCXCL12 (SDF-1a - Stromal cell -derived factor -1) foi identificado com \num produto d e gene que é regulado de uma maneira consistente pelo \nestrogênio, além de também estar relacionada com a migração de células NK \n(Glace et al., 2009). Neste grupo encontramos uma concentração menor no \nendométrio tópico de pacientes e controles, quando compa rado às lesões \ndas pacientes com endometriose . Também nos estranha o fato da sua \nconcentração ser maior n a lesão de endometriose , mas usando da mesma \nhipótese levantada para a CX3CL1, acreditamos ser uma resposta do \norganismo, na tentativa de tentar aument ar a concentração de células de \ndefesa contra a endometriose. \nUtilizando um modelo animal com camundongos, Glace et al., em \n2009, também demonstraram um aumento na expressão de CXCL12 nas \nlesões em casos de endometriose ovariana  em comparação ao endométrio  \ntópico, mostrando ainda que este aumento pode ser reprimido pelo raloxifeno \ne pela progesterona.  Da mesma maneira,  Furuya et al.,  em 2007,  mostrou \ndiferenças no comportamento das quimiocinas CXC em pacientes com \nendometriose ovariana e com carcinomas ovar ianos, quando comparados a \npacientes livres de doença . Encontraram também um aumento da expressão \n\n \n \n47 \nde CXCL12 nas lesões ovarianas quando comparados aos endométrios \ntópicos (Furuya et a., 2007).  \nEm 2009, Al -Jefout et al., publicaram interessante estudo dupl o cego \nque trouxe novas perspectivas para o diagnóstico não invasivo da \nendometriose. Neste estudo, os autores utilizaram a detecção de fibras \nnervosas no endométrio de pacientes com endometriose, através da biópsia \nendometrial e imunoistoquímica. Os resul tados mostraram que, em 64 \nmulheres com  diagnóstico laparoscópico de  endometriose, a média de \ndensidade de fibras nervosas na  biópsia endometrial foi de 2,7 fibras \nnervosas por milímetro quadrado. Apenas uma mulher com \nendometriose não teve fibras nervosas  detectáveis. Seis mulheres tiveram \nfibras nervosas detectadas, mas não tinham  endometriose ativa vista \nna laparoscopia. Com altas sensibilidade e especificidade, a densidade das \nfibras nervosas não variou nas diferentes fases do ciclo menstrual. Além \ndisto, as mulheres com endometriose e sintomas de dor têm maior densidade \nde fibras nervosas em comparação com mulheres inférteis, mas sem dor. \nUtilizando esta mesma prerrogativa de um diagnóstico não invasivo \npara endometriose e, também pensando na biópsia endometrial como \nalternativa, avaliamos a expressão das quimiocinas estudadas de acordo \ncom os sintomas apresentados. Desta forma, pudemos observar diferenças \nestatísticas significativas quando avaliamos a  dismenorréia e a dor pélvica \ncrônica. No primeiro caso, tivemos uma maior expressão de CXCL11 no \nendométrio tópico das mulheres que não apresentavam dismenorréia. No \ncaso da dor pélvica crônica, tivemos uma maior expressão de CXCL12 no \nendométrio tópico das mulheres que apresentavam a queixa e uma maior \nexpressão de CCL17 e CCL21 naquelas que não apresentavam a queixa \nclínica. \nQuando avaliamos alterações intestinais cíclicas e dispareunia, não \nencontramos diferenças significativas. As alterações urinárias cíclicas não \nforam avaliadas pois  eram pacientes sem endometriose do trato urinário e \ntambém não avaliamos o aspecto infertilidade visto que em nosso grupo \ncontrole, todas as pacientes eram multíparas. \n\n \n \n48 \nNão foi encontrado nenhum estudo na literatura para que pudéssemos \ndiscutir sobre o fat o de termos encontrado uma maior expressão de CCL21 \nno endométrio tópico de pacientes com estádios avançados da doença. \nA endometriose é uma entidade em estudo e que muitas dúvidas ainda \npairam no ar. A te oria imunológica é alvo de muita s pesquisas atualmente. \nDiversos estudos têm tratado a endometriose como uma doença imunológica \n(Agic et al., 2006; Podgaec et al., 2007; Barrier, 2010) e, provavelmente, a \nbusca por um diagnóstico não invasivo e mesmo por um tratamen to ou \nprofilaxia definitivos poderão vir desta teoria. \nA ação de células mediadoras da resposta inflamatória como as \ncélulas T-reg e NK, parece ter papel fundamental na gênese desta doença. \nAlém disto, como visto pela primeira vez em nosso estudo, o papel de \nalgumas quimiocinas, como a CCL17, CX3 CL1 e CXCL12,  na modulação \ndesta resposta inflamatória fará parte do quebra -cabeças para a resposta \ninflamatória da endometriose. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n49 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6. CONCLUSÕES \n \n\n \n \n50 \n1. Com relação às quimiocinas  relacionadas à atividade das células NK, \nas pacientes com endometriose profunda apresentam: \n expressão de CX3CL1 e CXCL12 aumentadas de forma \nsignificativa no foco de endometriose, quando comparadas ao \nendométrio tópico das pacientes com e sem endometriose. \n as quimiocinas CXCL9, CXCL10, CXCL11 e XCL1 não tiveram \ndiferenças estatísticas significativas nos grupos estudados.  \n2. Com relação às quimiocinas relacionadas à atividade das células T -\nreg, as pacientes com endometriose profunda apresentam: \n expressão de C CL17 aumentada no endométrio tópico das \npacientes com endometriose de retossigmóide em comparação ao \nendométrio tópico das pacientes com endometriose retrocervical e \nsem endometriose e, quando comparada ao foco de endometriose \nnas pacientes com endometriose retrocervical e de retossigmóide. \n a expressão da quimiocinas CCL21 não apresentou diferenças \nestatísticas significativas nos grupos estudados. \n3. Com relação à fase do ciclo menstrual, não se observou diferenças \nsignificativas na expressão das quimiocinas. \n4. Em relação ao quadro clínico, encontramos que as pacientes com \ndismenorréia e endometriose apresentam menor valor de CXCL11 no \nendométrio tópico. Aquelas com dor pélvica crônica apresentam \nvalores menores de CCL17 e CCL21 e maiores de XCL1 e CXCL12 no \nendométrio tópico. Os demais sintomas não tem correlação com a \nexpressão das quimiocinas. \n5. Pacientes com estadiamento avançado  (ASRM, 1996)  da doença \napresentam maior valor de CCL21 no endométrio tópico.  \n \n\n \n \n51 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6. ANEXOS \n \n\n \n \n52 \nAnexo 1 \nESCALA VISUAL ANALÓGICA – EVA \nA Escala Visual Analógica – EVA  auxilia na aferição da intensidade da dor \nno paciente, é um instrumento importante para verificarmos a evolução do \npaciente durante o tratamento e mesmo a cada atendimento, de maneira \nmais fidedigna. Também é útil para analisarmos se o tratamento está sendo \nefetivo, quais procedimentos têm surtido melhores resultados, assim como se \nhá alguma deficiência no tratamento, de acordo com o grau de melhora ou \npiora da dor. \nA EVA pode ser utilizada no início e no final de cada atendimento, registrando \no resultado sempre na evolução. Para utilizar a EVA o atendente deve \nquestionar o paciente quanto ao seu grau de dor, sendo que 0 significa \nausência total de dor e 10 o nível de dor máxima suportável pelo paciente. \nDicas sobre como interrogar o paciente: \n Você tem dor? \n Como você classifica sua dor? (deixe ele falar livremente, faça \nobservações na pasta sobre o que ele falar) \nQuestione-o: \na) Se não tiver dor, a classificação é zero. \nb) Se a dor for moderada, seu nível de referência é cinco. \nc) Se for intensa, seu nível de referência é dez. \n \nOBS.: Procure estabelecer variações de melhora e piora na escala acima \ntomando cuidado para não sugestionar o paciente. \n \n \n\n\n \n \n53 \nAnexo 2 – Aprovação Comitê de Ética e Pesquisa - HCFMUSP \n \n \n \n\n\n \n \n54 \nAnexo 3 – Termo de consentimento livre e esclarecido (pacientes) \n \n \n\n\n \n \n55 \n \n\n\n \n \n56 \n \n \n \n \n \n\n\n \n \n57 \nAnexo 4 – Termo de consentimento livre e esclarecido (controles) \n \n \n \n\n\n \n \n58 \n \n \n\n\n \n \n59 \n \n \n \n \n \n\n\n \n \n60 \nAnexo 5 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 do \nendométrio tópico das pacientes submetidas à laqueadura tubária. \nIniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 \nVDR 0,643361 0,921856149 0,197470211 0,599773761 0,298133084 3,910586949 0,00128226 0,189582597 \nMHS 0,335341 1,225706489 2,301711376 0,659063926 0,717986383 0,181543246 2,211315689 11,95795215 \nMEGC 0,971778 1,846269999 1,386749243 0,591106632 0,90627977 1,223814724 0,009936166 1,287790969 \nAS 1,837443 4,716162891 1,699024831 0,538676231 1,112672014 1,132401183 6,671009057 1,878913222 \nMAJF 0,489948 2,833555673 0,584675052 0,6006058 1,09052919 2,456127001 2,102207385 0,55783039 \nCAAS 0,486901 0,535743204 0,722318456 38,78670489 10,35336895 0,441469343 0,513310971 0,182364705 \nMLO 0,39576 0,57618881 0,364428309 0,439974042 1,022448649 0,200320943 1,08065424 0,135644122 \nVMS 0,442485 0,59526895 0,379114867 5,196320126 0,931113141 1,737948294 1,374498183 0,183124717 \nCSA 0,531706 1,230814674 3,783461954 0,271399565 1,615553343 0,261047665 3,221884999 54,2630576 \nPGOS 0,225891 0,513919232 0,266592285 1,058110511 0,229573558 0,506763724 1,384058574 0,442239084 \nCOJ 1,418828 1,145211092 0,745203801 2,792370378 0,497589652 3,578574864 3,084218551 0,044283051 \nNMAB 5,932743 6,47829223 11,29574044 0,186272979 1,680660574 1,791769631 13,70760861 154,4395491 \nSMS 1,051683 0,858335485 0,318796333 1,309022879 0,368319169 1,112176039 1,413140587 0,121995382 \nMJSL 1,321979 2,16237022 1,355388971 1,172420673 0,806098692 5,312478735 0,010130892 6,82532828 \nSRS 0,777384 1,48618483 0,749867155 0,768698795 1,039599891 0,592293912 7,594236878 0,944025959 \nSMK 0,260021 1,149186977 0,268818985 1,120770053 0,638619445 0,937821436 1,084405999 2,373306514 \nSDF 0,526206 1,409920238 0,459681636 0,874475768 0,638176941 0,855230471 6,385966568 0,725425034 \nMLS 7,157617 0,483696347 1,080336641 0,584996668 0,381813068 1,419630191 2,296337985 0,666182073 \nLLS 0,438822 0,98046195 1,178716638 6,261031296 5,600743613 0,45387759 0,622814743 0,722920265 \nIASQ 2,716463 1,057321078 3,655495403 1,071535994 1,154284127 2,758062522 6,08874545 1,978940776 \nCMS 0,412424 0,293020509 0,537311618 0,812652408 1,109037684 1,789808409 0,722107234 0,553071704 \nSRS 1,8757 1,173919555 1,189791633 0,54242302 0,544139471 1,326059179 2,366614954 1,494163927 \nVAF 1,343726 0,547649041 1,713386869 0,303561411 1,346914606 0,175764444 0,031207465 0,033773335 \nEMD 1,495667 0,885806537 0,726452784 0,577198843 0,766627889 0,392802267 2,598654797 6,162895966 \n\n \n \n61 \nSDM 0,560326 0,933397526 1,28136451 2,353797669 4,342989266 0,830311832 1,849909892 3,482826094 \nEMS 1 1 22,4589245 1,29635452 0,897807708 1 0,608257876 0,658268669 \nEUR 2,779893 0,382261961 0,799130453 0,552019185 0,710934419 1,776016717 1,678142235 0,526176396 \nJUJ 1,427588 0,540697484 0,85341001 0,767543442 1 1,502052419 2,545192896 1,033277985 \nLOM 1,833715 1,054700623 1,521085172 0,858315712 1,010660456 3,561179513 1,44086483 2,149481119 \nMLB 1,477706 0,731993909 0,456714006 0,681157493 0,475810293 0,775777673 1,34089382 0,630220434 \nPZF 1,206167 0,657195063 0,918763175 1,104972383 0,9881544 0,491187299 2,075264176 0,540654344 \nLHJM 4,31102 1,136370707 1,014623821 3,41165157 5,45216184 1,292035009 1,005612857 2,170516572 \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n62 \nAnexo 6 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas  lesões de \nendometriose das pacientes com endometriose de retossigmóide. \nIniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 \nGHM 0,461275111 0,752421797 0,284737998 1,91386665 0,266097781 6,535896607 0,001586326 4,819549963 \nFFB 0,185269764 2,487356934 0,034284658 0,099890432 0,180995833 12,12897021 0,00816068 1,776328538 \nMEGC 0,097645634 0,194469195 0,095305741 0,354164205 0,092527652 9,430832708 0,340070319 0,486630428 \nASS 0,152904138 2,522079143 0,052874171 0,177327761 0,138795085 11,48266143 0,530308949 1,553905142 \nMDM 0,016777823 0,961003472 0,328441182 0,829601445 3,931359749 4,294187427 0,030520132 0,608740154 \nMFD 0,014414847 2,093059825 0,027369387 0,082898529 0,126835314 23,67652031 0,042715545 1,104886701 \nACC 0,345725604 0,3873242 0,094581835 0,571763453 0,163688899 3,571141159 0,032015292 0,61000731 \nMLB 1 0,843589795 0,039437364 0,29351178 0,301457888 8,860481874 0,112726999 0,699258813 \nMFD 0,183735124 1,164421634 0,124801479 0,297196764 0,369085864 1,717589362 0,027165229 1,308485954 \nAAS 0,045588993 2,938935197 0,731534057 2,701611663 6,401404113 7,418436515 0,151772783 1,715725124 \nMFD 0,528043744 1,3995117 1,073749111 0,405768932 0,804072998 9,222099051 0,009024827 2,541162153 \nDRB 1 3,093764857 0,232389524 0,424671828 0,433786899 33,91696471 0,183043062 1,685572214 \nSFR 0,472180168 3,294303668 0,505922721 0,536909305 1,490801718 10,05474899 0,005412703 5,059302275 \nMFE 0,079171739 5,32954935 0,750430795 0,676860444 0,941457835 23,88222192 0,07875662 0,085231967 \nASD 0,09040832 3,096596806 0,589973041 0,321892376 1,287032413 35,9556145 0,049797772 2,77821536 \nPLS 0,036184091 0,425261911 1,550675632 0,23724183 0,047584924 4,971375788 0,014381171 0,707978983 \nSET 0,017138437 1,251730125 1,319847219 0,422144936 0,992355115 7,860086347 0,079732129 1,835277777 \nSDF 0,114259764 1,412943276 0,618746746 0,333764013 2,030279551 11,38825787 0,094003938 1,767007836 \nFF 0,10787402 0,891695813 0,63891811 0,219356644 0,388322818 9,002496673 0,081856171 2,180982868 \nIA 0,208523134 4,866564069 0,289196688 0,452475102 1,283024204 15,9867543 0,111033352 2,563257538 \nMS 0,225869183 1,294732042 1,620506646 0,869911362 1,287433922 10,01989275 0,099977343 2,855668349 \nPBB 0,142977432 2,342426124 0,735869037 0,857923142 1,519628197 13,7314794 0,010655152 1,994667722 \n \n\n \n \n63 \nAnexo 7 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CX CL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 no \nendométrio tópico das pacientes com endometriose de retossigmóide. \nIniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 \nGHM 0,01861616 0,257673048 0,406606994 1,009394627 1,097353529 0,055030878 3,149024539 1,845355072 \nFFB 0,040015406 0,893545778 0,360658902 1,89669843 2,06197721 0,126165132 7,371228086 6,399230519 \nMEGC 0,022292456 0,341892232 0,32257509 0,464738256 0,505235664 0,028903443 1,172757722 2,44850041 \nASS 0,015535359 0,420627054 0,418618199 0,60814629 0,661140311 0,104776361 4,181165066 3,012368862 \nMDM 0,014758597 0,88246658 0,263286771 0,381959165 0,415243182 0,03630684 2,063230493 6,319885573 \nMFD 0,044492296 1,631968882 0,668827901 1,182213264 1,285231626 0,088718892 5,486571857 11,68753222 \nACC 0,006231086 0,309200284 0,783881204 4,241252315 4,610836111 0,23822309 6,267564769 2,214373277 \nMLB 0,461275111 1,422682319 0,6393629 0,641486279 0,697385555 0,037822412 22,78330282 10,18870252 \nMFD 0,036694289 0,479503599 0,425640382 1,050801607 1,142368724 0,086832875 2,707394273 3,43401999 \nAAS 0,018652843 0,74026491 5,339027343 0,785389553 0,853828596 0,079790741 13,03153387 5,30149201 \nMFD 0,017712226 0,200140293 3,81482516 0,617037601 0,670806413 0,130327656 5,545528659 1,433327649 \nDRB 0,046132566 0,589593918 1,259470157 0,079307456 0,086218328 0,015252031 2,29969893 4,222444433 \nSFR 2,953937609 1,782650089 0,221732006 0,226063552 0,304176033 1,336273353 0,891270339 1,386904489 \nMFE 2,63914269 0,679777044 0,682115021 0,424177591 0,367327392 1,235414494 1,101649278 0,423486662 \nASD 1,41969336 2,34302695 0,552510175 0,460655554 0,704620516 3,860894576 1,794528704 1,581801357 \nPLS 1,244261184 1,068964208 1,347062638 1,702565513 1,94001578 8,748557515 1,456893077 2,077946395 \nSET 2,523470734 1,915782192 0,623188682 0,742730286 0,599606691 1,190299941 1,647107823 0,39973573 \nSDF 2,142268565 1,690644757 0,5769279 0,72107954 0,502441796 1,262816627 1,828049327 0,914565522 \nFF 1,011509139 1,051955406 0,758889078 0,653083929 0,48771099 7,839682139 2,121059365 1,688437103 \nIA 1,355109426 2,508410647 0,598794526 1,47553722 2,295484017 2,892456297 1,953139507 1,721956189 \nMS 0,764829118 0,441539236 0,520377662 0,599765446 1,335785526 0,607924961 1,513433201 0,44876076 \nPBB 0,76678252 0,572426969 0,39506582 0,299241114 0,414170983 4,846136903 1,392449494 0,401187466 \n \n\n \n \n64 \nAnexo 8 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 nas lesões de \nendometriose das pacientes com endometriose retrocervical. \nIniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 \nPPD 0,991510087 1,183954426 1,769947953 1,007297831 0,754204878 5,405339228 1,628907861 0,589228222 \nMFC 0,325944753 4,001701479 0,64113805 0,210587296 0,434680833 23,26977186 0,038926731 2,281366823 \nMJS 0,079422928 4,508393833 0,239103464 0,312188719 0,313606722 16,92853428 0,174936713 2,371662033 \nFV 0,367215626 1,504843594 0,433380738 1 0,871775393 8,909751295 0,007779564 2,058935217 \nCI 0,138763434 5,016264942 0,132742931 0,368181824 0,175924508 17,72096375 0,030946177 1,134375625 \nCP 0,245334045 2,563639757 0,689985016 2,307867363 1,19413702 14,9504309 0,133220222 1,825306121 \nCC 0,972061404 3,506625953 1,609861904 0,662269495 0,866323878 12,04619123 0,605851028 2,741049606 \nADV 1,901739125 4,619682008 3,75212252 0,917939078 0,575476287 10,90120084 7,121716469 5,150556923 \nEDT 1,964264697 4,519626483 2,986875155 1,175252144 0,882726483 17,67728933 2,517069409 3,93100565 \nMGS 0,086662962 1,824515678 0,293492784 0,228701909 0,343596772 10,23000653 0,125930967 1,84543182 \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n65 \nAnexo 9 – Expressão das quimiocinas XCL1, CX3CL1, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL17 e CCL21 n o \nendométrio tópico das pacientes com endometriose retrocervical. \nIniciais XCL1 CX3CL1 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL17 CCL21 \nPPD 0,825705577 0,564206199 1,2515422 1 1 0,569348995 1,063562636 0,084079531 \nMFC 0,504420689 0,704943389 1 0,279998366 0,136032982 2,147093713 0,924602392 1,809885509 \nMJS 0,957071992 0,515101272 1,326575639 0,403737728 0,439223876 1,093827441 1,329519558 1 \nFV 0,959729241 0,514153398 0,548934887 0,937239922 3,155849459 1,448324785 0,993715656 0,220354526 \nCI 0,252035586 0,83971078 0,272193956 0,912243147 0,413519821 0,333182645 2,07039351 0,102870301 \nCP 0,513832253 0,700359589 0,627517213 0,513996454 0,724430095 3,364996866 3,736441669 1,01389513 \nCC 0,636317787 0,643352895 0,095963324 1,094680845 0,489434731 2,486635696 1 0,957569056 \nADV 0,781733818 0,58166733 0,333948361 0,307355523 0,386906907 3,975772377 2,75743141 0,561885641 \nEDT 1,395468303 0,38012128 0,561273923 0,693472372 0,423750915 1,056992516 0,939662774 0,842716009 \nMGS 1,596817409 0,330605491 0,144914809 0,045905802 0,044090095 0,128800952 2,406147359 0,461204482 \n \n \n \n \n\n \n \n66 \nAnexo 10 – Idade, raça, paridade, prática de exercícios fís icos e fase do \nciclo menstrual das pacientes submetidas à laqueadura tubária. \nIniciais Idade Fase do \nCiclo \nMenstrual \nVDR 31 Folicular \nMHS 26 Folicular \nMEGC 29 Folicular \nAS 39 Folicular \nMAJF 32 Lútea \nCAAS 24 Lútea \nMLO 30 Lútea \nVMS 31 Folicular \nCSA 36 Folicular \nPGOS 29 Folicular \nCOJ 28 Lútea \nNMAB 27 Lútea \nSMS 34 Lútea \nMJSL 33 Folicular \nSRS 31 Folicular \nSMK 34 Lútea \nSDF 34 Lútea \nMLS 32 Folicular \nLLS 34 Lútea \nIASQ 33 Folicular \nCMS 38 Lútea \nSRS 29 Lútea \nVAF 35 Lútea \nEMD 30 Folicular \nSDM 29 Folicular \nEMS 35 Lútea \nEUR 33 Lútea \nJUJ 33 Folicular \nLOM 29 Lútea \nMLB 33 Folicular \nPZF 37 Lútea \nLHJM 35 Folicular \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n67 \nAnexo 11 – Idade, raça, paridade, prática de exercícios fís icos e fase do \nciclo menstrual das pacientes com endometriose de retossigmóide. \nIniciais Idade Fase do \nCiclo \nMenstrual \nGHM 30 Folicular \nFFB 36 Lútea \nMEGC 41 Folicular \nASS 30 Lútea \nMDM 29 Lútea \nMFD 35 Lútea \nACC 37 Lútea \nMLB 40 Lútea \nMFD 25 Lútea \nAAS 38 Lútea \nMFD 33 Folicular \nDRB 34 Folicular \nSFR 39 Folicular \nMFE 30 Lútea \nASD 32 Lútea \nPLS 33 Lútea \nSET 37 Lútea \nSDF 36 Folicular \nFF 45 Folicular \nIA 27 Folicular \nMS 30 Lútea \nPBB 34 Lútea \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n68 \nAnexo 12 – Idade, raça, paridade, prática de exercícios físicos e fase do \nciclo menstrual das pacientes com endometriose retrocervical. \nIniciais Idade Fase do \nCiclo \nMenstrual \nPPD 34 Lútea \nMFC 36 Lútea \nMJS 47 Lútea \nFV 35 Lútea \nCI 32 Lútea \nCP 31 Folicular \nCC 38 Folicular \nADV 27 Folicular \nEDT 29 Folicular \nMGS 38 Folicular \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n69 \nAnexo 13 – Queixas clínicas das pacientes submetidas à laqueadura \ntubária (notas atribuídas por meio  da aplicação da escala visual \nanalógica de dor) \nIniciais Dismenorréia Dispareunia \nde \nprofundidade \nDor  \npélvica \ncrônica \nAlteração \nIntestinal \nAlteração \nUrinária \nVDR 0 0 0 0 0 \nMHS 0 0 0 0 0 \nMEGC 5 0 0 0 0 \nAS 0 0 0 0 0 \nMAJF 6 0 0 0 0 \nCAAS 4 0 0 0 0 \nMLO 2 0 0 0 0 \nVMS 0 0 0 0 0 \nCSA 4 0 0 0 0 \nPGOS 5 0 0 0 0 \nCOJ 0 0 0 0 0 \nNMAB 0 0 0 0 0 \nSMS 0 0 0 0 0 \nMJSL 0 0 0 0 0 \nSRS 0 0 0 0 0 \nSMK 0 0 0 0 0 \nSDF 2 0 0 0 0 \nMLS 0 0 0 0 0 \nLLS 0 0 0 0 0 \nIASQ 0 0 0 0 0 \nCMS 0 0 0 0 0 \nSRS 0 0 0 0 0 \nVAF 0 0 0 0 0 \nEMD 0 0 0 0 0 \nSDM 0 0 0 0 0 \nEMS 2 0 0 0 0 \nEUR 3 0 0 0 0 \nJUJ 2 0 0 0 0 \nLOM 4 0 0 0 0 \nMLB 5 0 0 0 0 \nPZF 0 0 0 0 0 \nLHJM 0 0 0 0 0 \n \n \n \n \n\n \n \n70 \nAnexo 14 – Queixas clínicas das pacientes com endometriose de \nretossigmóide (notas atribuídas por meio da aplicação da escala visual \nanalógica de dor) \nIniciais Dismenorréia Dispareunia \nde \nprofundidade \nDor \npélvica \ncrônica \nAlteração \nIntestinal \nAlteração \nUrinária \nGHM 0 0 0 0 0 \nFFB 0 0 0 0 0 \nMEGC 5 0 0 0 0 \nASS 0 0 0 0 0 \nMDM 6 0 0 0 0 \nMFD 4 0 0 0 0 \nACC 2 0 0 0 0 \nMLB 0 0 0 0 0 \nMFD 4 0 0 0 0 \nAAS 5 0 0 0 0 \nMFD 0 0 0 0 0 \nDRB 0 0 0 0 0 \nSFR 0 0 0 0 0 \nMFE 0 0 0 0 0 \nASD 0 0 0 0 0 \nPLS 0 0 0 0 0 \nSET 2 0 0 0 0 \nSDF 0 0 0 0 0 \nFF 0 0 0 0 0 \nIA 0 0 0 0 0 \nMS 0 0 0 0 0 \nPBB 0 0 0 0 0 \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n71 \nAnexo 15 – Queixas clínicas das pacientes com endometriose \nretrocervical (notas atribuídas através da aplicação da escala visual \nanalógica de dor) \nIniciais Dismenorréia Dispareunia \nde \nprofundidade \nDor \npélvica \ncrônica \nAlteração \nIntestinal \nAlteração \nUrinária \nPPD 8 6 2 5 0 \nMFC 10 1 2 1 0 \nMJS 0 1 0 0 0 \nFV 0 0 0 0 0 \nCI 9 3 2 0 0 \nCP 5 0 0 0 0 \nCC 9 5 8 0 0 \nADV 10 7 0 10 0 \nEDT 8 0 8 0 0 \nMGS 10 0 0 5 0 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n72 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6 – REFERÊNCIAS \n\n \n \n73 \nAbbas A, Lichtman A and Pillai S. 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ARTIGO PUBLICADO \n \n\nTranscriptional changes in the\nexpression of chemokines related\nto natural killer and T-regulatory\ncells in patients with deep\ninfiltrative endometriosis\nPatrick Bellelis, M.D., a Denise Frediani Barbeiro, M.D., b Luiz Vicente Rizzo, M.D., Ph.D., c\nEdmund Chada Baracat, M.D., Ph.D., a Mauricio Sim~oes Abr~ao, M.D., Ph.D.,a and Sergio Podgaec, M.D., Ph.D. a\na Department of Obstetrics and Gynecology, University of S~ao Paulo, b Medical Investigation Laboratory (LIM 51), School of\nMedicine, University of S ~ao Paulo, and c Albert Einstein Israeli Hospital, S ~ao Paulo, Brazil\nObjective: To evaluate the expression of chemokines that regulate natural killer (NK) and T-regulatory (T-reg) cell activity in eutopic\nand ectopic endometrial tissue samples from endometriosis patients.\nDesign: Case-control study (Canadian Task Force classifi cation II-2).\nSetting: Tertiary referral hospital.\nPatient(s): Sixty-four consecutive patients with and without endometriosis.\nIntervention(s): After videolaparoscopy, patients were divided into three groups: bowel endometriosis (n ¼ 22), retrocervical endome-\ntriosis (n ¼ 10), and endometriosis-free women (n ¼ 32).\nMain Outcome Measure(s): Gene expression of the chemokines that regulate NK (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1, and\nCX3CL1) and T-reg cell activity (CCL17 and CCL21) evaluated by real-time polymerase chain reaction.\nResult(s): Of the chemokines associated with NK cells, CX3CL1 and CXCL12 expression was statistically signi ficantly greater in the\nfoci of endometriosis compared with the eutopic endometrium in patients and controls. From the chemokines associated with T-reg\ncells, CCL17 expression was statistically signi ficantly greater in the eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid endome-\ntriosis compared with the foci of endometriosis or eutopic endometrium of the patients with retrocervical endometriosis or the\ndisease-free women.\nConclusion(s): Both T-reg and NK cells mediate infl ammatory response and may play a fundamental role in endometriosis by causing\nan impaired clearing of endometrial cells. Establishing how CCL17, CXCL12, and CX3CL1 mod-\nulate this response is essential to understanding inflammatory responses in endometriosis. (Fer-\ntil Steril\n/C2102013;99:1987–93. /C2112013 by American Society for Reproductive Medicine.)\nKey Words: Chemokines, endometriosis, endometrium, NK cells, T-regulatory cells\nDiscuss: You can discuss this article with its authors and with other ASRM members at http://\nfertstertforum.com/bellelisp-chemokines-nk-t-regulatory-cells-endometriosis/\nUse your smartphone\nto scan this QR code\nand connect to the\ndiscussion forum for\nthis article now.*\n* Download a free QR code scanner by searching for “QR\nscanner” in your smartphone ’s app store or app marketplace.\nI\nn recent years, a number of studies\nhave been published on the role of im-\nmunologic factors in the pathogenesis\nof endometriosis. Endometriotic lesions\nhave been associated with the presence\nof various cytokines and with various\ntypes of in flammatory response (1–3).\nIn this respect, the balance between\nimmunity and tolerance is important to\nmaintain immune homeostasis, thus\njustifying the many mechanisms\ni n v o l v e di nk e e p i n gt h ei m m u n e\nresponse under control, including the\nactivity of the natural killer (NK) and\nT-regulatory (T-reg) cells(4–6).\nNatural killer cells play a major role\nin the immune system of vertebrates,\nand they constitute an important part\nof the innate immune response. These\nlymphocytes are capable of differenti-\nating between virus-infected cells, neo-\nplastic cells, and normal cells (7).\nNatural killer cells can recognize the\nmajor histocompatibility complex\n(MHC) expressed on the surface of po-\ntential target cells and can eliminate\nReceived September 24, 2012; revised February 18, 2013; accepted February 20, 2013; published\nonline March 18, 2013.\nP.B. has nothing to disclose. D.F.B. has nothing to disclose. L.V.R. has nothing to disclose. E.C.B. has\nnothing to disclose. M.S.A. has nothing to disclose. S.P. has nothing to disclose.\nSupported by Fundac¸ ~ao de Apoio /C18a Pesquisa do Estado de S ~ao Paulo. Grant # 2010/00475-0.\nReprint requests: Patrick Bellelis, M.D., Rua Dr. Homem de Mello, 1020, Perdizes, 05007–002 S~ao Paulo,\nBrazil (E-mail: pbellelis@gmail.com).\nFertility and Sterility® Vol. 99, No. 7, June 2013 0015-0282/$36.00\nCopyright ©2013 American Society for Reproductive Medicine, Published by Elsevier Inc.\nhttp://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2013.02.038\nVOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 1987\n\nthese targets accordingly. Cells expressing MHC class I mole-\ncules are identi fied as normal self-cells, but cells that do not\nexpress MHC class I molecules are destroyed.\nExpression of MHC class I has been extensively studied in\npregnancy, cancer, and in immune response in general. It is\nwell known that all normal human body cells express MHC\nclass I on their cell surface, as endometrial cells do (8, 9) .\nTherefore, in endometriosis, it is reasonable to assume that\nNK cells participate in the immune response against the\nendometrial cells that are regurgitated through the tubes\ninto the abdominal cavity during menstruation (10).\nT-regulatory cells, first described by Sakaguchi et al. (11)\nin 1995, can be activated by self or non-self antigens; once\nthey are activated, they can suppress T cells in a non-\nantigen-specific manner (12, 13) . Berbic et al. (14) found an\nincrease in Foxp3, the most speci fic marker of T-reg cells,\nin the eutopic endometrium of patients with endometriosis\nduring the secretory phase of the menstrual cycle. The role\nplayed by these cells in the in flammation process appears to\nbe important in coordinating the immune response against\nectopic endometrial cells. Consequently, cells such as T-reg\nand NK cells that mediate in flammatory response appear to\nplay a fundamental role in endometriosis by causing an\nimpaired clearance of endometrial cells.\nBecause T-reg cells exert their function by producing in-\nhibitory cytokines, it has been speculated that the endometrial\ncells present in the peritoneal cavity fail to be eliminated be-\ncause of a defective immune response. This defective response\nwould be due to a decrease in the activity of NK cells, macro-\nphages, dendritic cells, or CD4 and CD8 lymphocytes that\nmay be suppressed by the action of the T-reg cells (15, 16) .\nHowever, studies have reported con flicting results, with some\nreporting that the number of NK cells decrease (4), increase\n(17, 18) ,r e m a i n e du n c h a n g e d(19), or vary in accordance\nwith the stage (20) of the disease (21).A sr e p o r t e db yo u r\ngroup, in patients with endometriosis, particularly those with\nadvanced stages of the disease such as rectosigmoid\nendometriosis, the concentration of NK cells in peripheral\nblood is higher (16). Furthermore, the concentration of T-reg\ncells in the peritoneal fluid of patients with endometriosis has\nalso been found to be higher compared with that of women\nwithout endometriosis (22).\nIt has been well established that T-reg cells in humans are\nregulated by the CCL17 and CCL21 chemokines (ligands of\nCCR4 and CCR7), which can modulate the activity of T-reg\ncells in the tissues by, respectively, hampering or exacerbating\nthese responses. It is also understood that the migration of NK\ncells increases in response to the presence of certain chemo-\nkines such as CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1, and\nCX3CL1. The cytolytic activity of NK cells may increase in re-\nsponse to CXCL10 and CX3CL1 as well (5, 23). Therefore, we\nevaluated the expression of the chemokines that regulate the\nactivity of the NK and T-reg cells in eutopic and ectopic\nendometrial tissue samples from patients with endometriosis.\nMATERIALS AND METHODS\nThis study was conducted in the endometriosis division of the\nDepartment of Gynecology at the University of S ~ao Paulo\nSchool of Medicine's Teaching Hospital, between August\n2010 and May 2011. The study was approved by the institu-\ntion's internal review board under reference 0025/10, and\nall the patients read and signed an informed consent form.\nSixty-four patients consecutively attending the endome-\ntriosis clinic were admitted to the study. Women with pelvic\npain and a suspicion of endometriosis were evaluated based\non clinical symptoms, a physical examination, and a transva-\nginal ultrasonography during which a speci fic protocol was\nused to map the disease (24). Surgical treatment by laparos-\ncopy was indicated whenever the patient's clinical condition\nfailed to improve with hormone therapy and/or when the im-\naging exam suggested severe lesions of deep endometriosis\naffecting the rectosigmoid and retrocervical region. Biopsies\nwere performed during the surgical procedure to obtain histo-\nlogic confirmation of the disease. The total number of patients\nwas determined by the number of procedures expected to be\nperformed in this department within the referred time frame.\nThe inclusion criteria for the patients with endometriosis\nwere age 18 to 40 years, bowel/retrocervical endometriosis\nconfirmed by histology, and no autoimmune diseases as con-\nfirmed by anamnesis, a physical examination, and laboratory\ntests, requested whenever necessary. In addition, patients had\nto have normal menstrual cycles at intervals of 26 to 34 days,\nand should not have used hormone therapy, including GnRH\nanalogues, progestogens, or oral contraceptives, in the 3\nmonths preceding surgery. Accordingly, all endometriosis pa-\ntients who were undergoing hormone treatment (such as pro-\ngesterone or combined oral contraceptives) interrupted their\ntreatment at least 3 months before surgery.\nThe inclusion criteria for the group of women without en-\ndometriosis were the same as those applied to the previous\ngroup with the exception of the requirement for histologic\nconfirmation of endometriosis. These women were undergo-\ning tubal ligation as a permanent method of contraception.\nIn both groups, the day of the menstrual cycle on the day of\nsurgery was recorded, thus determining the phase of the cycle\n(luteal or follicular).\nThe patients were then divided into three groups: bowel\nendometriosis (group A, n ¼ 22 patients), retrocervical endo-\nmetriosis (group B, n ¼ 10 patients), and women without the\ndisease (group C, control, n ¼ 32 patients). After anesthesia\nand with the patient placed in position, a sample of the eu-\ntopic endometrium was collected using a Pipelle curette\n(groups A, B, and C). During surgery, tissue samples were ob-\ntained from the ectopic endometrium (groups A and B). The\ntissue samples from the eutopic and ectopic endometrium\nwere divided into two equal parts and sent to the laboratory\nto be stored until analysis.\nGene expression was determined by reverse-transcriptase\npolymerase chain reaction (RT-PCR) analysis using the B2m\ngene as a housekeeping gene. The total RNA was isolated\nfrom the eutopic and ectopic endometrium in the biopsy\nsamples according to a standard Trizol RNA isolation protocol\n(Invitrogen). Samples of total RNA were quanti fied by\nmeasuring the optical density at 260 nm (Nano Vue Plus\nSpectrophotometer; GE). All RT-PCR reaction mixtures\nwere prepared using Superscript Platinum III One-Step\nkits with incorporated SYBR Green (11736-051; Invitrogen).\n1988 VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013\nORIGINAL ARTICLE: ENDOMETRIOSIS\n\nThe production of complementary DNA (cDNA) and DNA\namplification were performed on a Step One thermocycler\n(Applied Biosystems), and the ampli fication products were\nconfirmed on a 1.5% agarose gel. The primers used were as\nfollows: CCL17 sense, 5 0-ACTGAAGATGCTGGCCCTGGTC-30;\nCCL17 reverse, 5 0-AAACGATGGCATCCCTGGAGC-30;C C L 2 1\nsense, 5 0-CCCAGCTATCCTGTTCTTGC-30; CCL21 reverse, 5 0-\nTCAGTCCTCTTGCAGCCTTT-30; CXCL9 sense, 5 0-TGCTGGT\nTCTGATTGGAGTG-30; CXCL9 reverse, 5 0-TTTGGCTGACCT\nGTTTCTCC-30;C X C L 1 0s e n s e ,5 0-CTGTACGCTGTACCTGC\nATCA-30;C X C L 1 0r e v e r s e ,50-TTCTTGATGGCCTTCGATTC-30;\nCXCL11 sense, 5 0-AGAGGACGCTGTCTTTGCAT-30;C X C L 1 1\nreverse, 5 0-TGGGATTTAGGCATCGTTGT-30;C X C L 1 2s e n s e ,\n50-GTCAGCCTGAGCTACAGATGC-30;C X C L 1 2r e v e r s e ,50-CT\nTTAGCTTCGGGTCAATGC-30;X C L 1s e n s e ,5 0-TGGCATCT\nGCTCTCTCACTG-30; XCL1 reverse, 5 0-ATTTCCTGTCCATG\nCTCCTG-30;C X 3 C L 1s e n s e ,50-TCTGCCATCTGACTGTCCTG-\n30; and CX3CL1 reverse, 5 0-CTGTGCTGTCTCGTCTCCAA-30.\nReverse transcription was performed at 45 /C14 C for 30 minutes,\n95/C14 C for 5 minutes, and 5 /C14 C for 5 minutes. After reverse tran-\nscription, PCR was performed under the following conditions:\n95/C14 C for 30 seconds, 60/C14 C for 30 seconds, and 72/C14 C for 1 minute\nfor 35 cycles. The fold change was represented as 2/C0 DDCT.\nAnalysis of variance (ANOVA) and Tukey's post hoc test\nwere used to compare the results of the chemokines, and the\nMann-Whitney nonparametric test was used to compare clin-\nical characteristics. The tests were performed using the SAS\nsoftware program, version 8.0 (SAS Inc.) and the SPSS statis-\ntical software package, version 15.0 (SPSS Inc.). P< .05 was\nconsidered statistically signi ficant.\nRESULTS\nThe mean age of the patients in group A was 34.14 /C6 4.87\nyears compared with 34.70 /C6 5.66 years for the patients in\ngroup B and 31.97 /C6 3.46 years for those in group C. The\ngroups were not statistically signi ficantly different with re-\nspect to age or parity (Table 1 ). In addition, the phases of\nthe menstrual cycle at the time of surgery were similar in\nthe group of patients with endometriosis and the group\nwithout endometriosis, with a similar number of patients\nand controls in the follicular and luteal phases of the\nmenstrual cycle.\nRegarding the chemokines related to NK cell activity\n(Fig. 1 ), statistically signi ficant differences were found be-\ntween the groups or sites of evaluation with respect to the\nmean levels of CX3CL1 and CXCL12 (P< .05). Of those related\nto T-reg cell activity (Fig. 2 ), statistically signi ficant differ-\nences were found only for CCL17 (P < .05). When chemokine\nexpression in the eutopic endometrium was compared accord-\ning to the phase of the menstrual cycle, no statistically signif-\nicant differences were found between the follicular and luteal\nphases ( Table 2 ). CX3CL1 (fractalkine) was expressed to\na greater extent in the eutopic endometrium of women with\nretrocervical lesions compared with the other groups (P< .05).\nWith respect to CXCL9 (MIG), CXCL10, CXCL11, and\nXCL1, no statistically signi ficant differences were identi fied\nbetween the groups or sites (P >.05); although there did ap-\npear to be some trends, the high standard error did not permit\nthis hypothesis to be con firmed. Both in the patients with ret-\nrocervical endometriosis and in those with rectosigmoid le-\nsions, CXCL12 (SDF-1a) expression was greater in the foci\nof endometriosis compared with the eutopic endometrium\n(P< .05). Of the chemokines associated with T-reg cell activ-\nity, CCL17 (TARC) was expressed to a greater extent in the eu-\ntopic endometrium of patients with lesions of endometriosis\nin the rectosigmoid compared with the other groups (P < .05).\nDISCUSSION\nIn recent years, research in endometriosis has focused on the\netiopathogenesis of the disease (25). Although new hypothe-\nses have been raised, studies have found evidence that the\ntheory of retrograde menstruation, taken together with im-\nmunologic factors, appears to play a signi ficant role in the\ngenesis of this disease (15, 16, 26, 27) .\nChemokines are a group of at least 47 correlated proteins,\nmaking them the largest family of cytokines known (23, 28).\nDepending on the number and spacing of their conserved\ncysteine residues, chemokines are classi fied into four\ngroups: CXC (or a), CC (or b), CX\n3C, and the C subfamilies.\nEach chemokine can bind to more than one receptor, and\neach receptor interacts with more than one chemokine (29).\nThe correlation between T-reg and NK cell activity in en-\ndometriosis remains poorly understood. If we further consider\nthat their effects can be modulated by other mediators of the\ninflammatory response such as the chemokines, then the\nrange of questions that remains to be answered is even larger.\nBasta et al. (30) found differences in Foxp3\nþ CD4 levels\nwhen tissue samples from ectopic pregnancy, eutopic secre-\ntory endometrium, and ovarian endometriomas were com-\npared. Those investigators speculated that the disturbances\nin the equilibrium of the last two might be due to alterations\nin the population of T-reg cells at these sites.\nReviewing the role of T-reg cells in the pathogenesis of\nendometriosis, Berbic and Fraser (31) showed that in patients\nwith endometriosis Foxp3\nþ CD4 levels did not decrease as ex-\npected in the secretory phase, which may contribute toward\nreducing the ability of newly recruited leukocytes to initiate\neffective immune responses against the endometrial frag-\nments that invade the peritoneal cavity.\nDespite those findings published in the literature, our\nstudy found no differences in chemokine expression when\nit was evaluated in accordance with the phase of the men-\nstrual cycle. Moreover, although the phase of the menstrual\ncycle at the time of surgery was not controlled, there were\na similar number of patients and controls in the follicular\nand luteal phases of the menstrual cycle and no statistically\nsignificant differences between the groups.\nAndr/C19e et al. (32) reported the presence of certain polymor-\nphisms in Foxp3 in infertile patients with endometriosis com-\npared with healthy women. Therefore, the genetic aspect\ncertainly appears to play an important part in the genesis of\nendometriosis; however, much still remains to be investigated\nwith respect to the immunologic theory.\nQin et al. (5) showed that T-reg cells and their principal\nmarker Foxp3 are affected by some chemokines (CCL17 and\nCCL21), which may exacerbate or hamper their function. In\nVOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 1989\nFertility and Sterility®\n\nour study, a statistically signi ficant difference was found in\nCCL17 chemokine expression. CCL17 is known to be able to\nmodulate the effect of the T-reg cells (5, 33) . Numerous\nstudies have shown the effect of this chemokine on the\ngenesis of bowel conditions such as Crohn disease (33–35).\nExperiments in CCL17-deficient rats confirmed that these an-\nimals failed to develop relevant clinical signs of autoimmune\nbowel disease, even when evaluated at different time points.\nThose results suggest that immune factors regulated in\nCCL17-deficient rats inhibit in flammation. Furthermore, in\n2012, Heiseke et al. (33) showed that the clonal expansion\nof T-reg cells is more likely to be present in CCL17-de ficient\nrats than in CCL17-competent rats; that is, a lack of CCL17 al-\nlows T-reg cells to expand in number, thus enhancing im-\nmune response.\nConsequently, a reduction in CCL17 concentration in the\nectopic endometrium of patients with endometriosis affecting\nthe rectosigmoid or in those with retrocervical lesions leads us\nto speculate on a possible association with the genesis of other\nautoimmune diseases. This reduction in CCL17 found in the\nectopic endometrium of patients with rectosigmoid and retro-\ncervical lesions permits the clonal expansion of T-reg cells at\nthis site. This hypothesis is in agreement with reports by other\ninvestigators (14, 30, 36, 37) ; although these findings were\nnot statistically signi ficant, there was a clear tendency\ntoward a decrease. The increased concentration of T-reg\ncells in the peritoneal fluid of patients with endometriosis\nand, furthermore, the increase in the number of these cells\nin ovarian endometriomas has led us to believe that this\ngreater concentration results in a malfunction of the other\ncells of the immune system. Therefore, our findings\ncomplement the description of an environment that\nTABLE 1\nClinical characteristics related to ethnicity, parity, and the practice of physical exercise in the patients with endometriosis and controls.\nControls Rectosigmoid patients Retrocervical patients Total\nP valuen% n % n % n%\nEthnicity .001\nCaucasian 15 46.9 17 77.3 8 80.0 40 62.5\nAfrican descent 17 53.1 2 9.1 2 20.0 21 32.8\nAsian descent 0 0.0 3 13.6 0 0.0 3 4.7\nParity .694\nNone 17 77.3 7 70.0 24 75.0\n1 3 13.6 1 10.0 4 12.5\n>1 2 9.1 2 20.0 4 12.5\nRegular physical exercise < .001\nYes 0 0.0 13 59.1 4 40.0 17 26.6\nNo 32 100.0 9 40.9 6 60.0 47 73.4\nTotal 32 100.0 22 100.0 10 100.0 64 100.0\nBellelis. Chemokines in deep endometriosis. Fertil Steril 2013.\nFIGURE 1\nRelative expression of CXCL12 and CX3CL1. * P <.05 when\ncompared to other groups.\nBellelis. Chemokines in deep endometriosis. Fertil Steril 2013.\nFIGURE 2\nRelative expression of CCL17. * P <.05 when compared to other\ngroups.\nBellelis. Chemokines in deep endometriosis. Fertil Steril 2013.\n1990 VOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013\nORIGINAL ARTICLE: ENDOMETRIOSIS\n\nencourages a greater concentration of these cells, which act so\nintensely on immune response. Moreover, the greater\nexpression of CCL17 in the eutopic endometrium of patients\nwith endometriosis of the rectosigmoid indicates the lower\npropensity for T-reg cells to concentrate at this location,\nallowing them to focus on the peritoneal cavity.\nTogether with other T and B cells, NK cells represent one\nof the major subsets of lymphocytes and have been identi fied\nin all species of vertebrates examined. These lymphocytes are\ndifferent from the T and B cells and play an important role in\ninnate immune response. The term ‘‘natural killer’’ originates\nfrom the fact that these cells can perform their function of\nkilling without any requirement for the clonal expansion\nand/or differentiation required by other killer cells of the im-\nmune system such as the cytotoxic T lymphocytes (CTL) (23).\nBecause NK cells participate in the clearance of the endome-\ntrial cells regurgitated into the peritoneal cavity, it is reason-\nable to speculate that they would be underactivated in\nendometriosis or would not recognize the ectopic endometrial\ntissue as being material in apoptosis that should be\neliminated (4).\nThe migration of NK cells may increase in response to the\npresence of certain chemokines such as CXCL9, CXCL10,\nCXCL11, CXCL12, XCL1, and CX3CL1. Additionally, an in-\ncrease in their cytolytic activity may take place when NK cells\nare exposed to speci fic chemokines such as CXCL10 and\nCX3CL1 (38–44). The differences in the levels of some of\nthe chemokines found in our study highlights the defective\naction of NK cells in patients with endometriosis. CX3CL1\n(fractalkine) is one of the most studied chemokines in\nendometriosis (29, 45 –47). Watanabe et al. (47) evaluated\nhealthy women and showed that CX3CL1 is present to\na greater extent in eutopic endometrium in the secretory\nphase of the cycle compared with the proliferative phase.\nFurthermore, those investigators suggested that its presence\ncould be one of the factors responsible for regulating the\nimmunologic milieu, attracting cells such as the NK cells.\nOur study found a statistically signi ficant difference with\nrespect to the presence of CX3CL1 in the ectopic endometrium\nof the women with retrocervical lesions, where it was ex-\npressed to a greater extent compared with the eutopic endo-\nmetrium of the women in the other groups. This may\nindicate an attempt by the organism to induce chemotaxis\nof defense cells such as the NK cells in an effort to reduce\nthe damage caused by this disease.\nCXCL12 (SDF-1a, stromal cell-derived factor-1) was\nidentified as a gene product that is consistently regulated by\nestrogen and has also been associated with NK cell migration\n(48). Our study found lower levels in the eutopic endometrium\nof patients and controls compared with the ectopic endome-\ntrium. The fact that its levels are higher in the ectopic endo-\nmetrium is surprising; however, using the same line of\nreasoning applied to CX3CL1, we believe this to be a response\nof the organism attempting to increase the concentration of\ndefense cells against endometriosis. In 2009, Glace et al.\n(48) also showed an increase in CXCL12 levels in the ectopic\nendometrium when evaluating an animal model of ovarian\nendometriosis, and Furuya et al. (49) reported similar findings\nTABLE 2\nDescription of the chemokines in the eutopic endometrium according to the phase of the menstrual cycle.\nVariable Group\nPhase of the menstrual cycle\nFollicular phase Luteal phase\nMean Standard deviation n Mean Standard deviation n\nXCL1 Control 1.640 1.802 16 1.341 1.409 16\nPatient (rectosigmoid) 0.946 1.135 8 0.714 0.926 14\nPatient (retrocervical) 0.985 0.482 5 0.700 0.312 5\nCX3CL1 Control 1.279 1.032 16 1.317 1.497 16\nPatient (rectosigmoid) 1.053 0.857 8 0.986 0.620 14\nPatient (retrocervical) 0.527 0.163 5 0.628 0.142 5\nCXCL9 Control 1.324 1.086 16 2.817 5.869 16\nPatient (rectosigmoid) 0.995 1.184 8 0.930 1.296 14\nPatient (retrocervical) 0.353 0.239 5 0.880 0.456 5\nCXCL10 Control 1.269 1.314 16 3.615 9.493 16\nPatient (rectosigmoid) 0.656 0.440 8 1.073 1.031 14\nPatient (retrocervical) 0.531 0.397 5 0.707 0.337 5\nCXCL11 Control 1.327 1.452 16 1.781 2.591 16\nPatient (rectosigmoid) 0.744 0.691 8 1.221 1.114 14\nPatient (retrocervical) 0.414 0.245 5 1.029 1.230 5\nCXCL12 Control 1.489 1.403 16 1.372 1.074 16\nPatient (rectosigmoid) 1.695 2.679 8 1.521 2.572 14\nPatient (retrocervical) 2.203 1.596 5 1.118 0.722 5\nCXCL17 Control 2.513 2.339 16 2.432 3.353 16\nPatient (rectosigmoid) 2.370 1.456 8 5.200 6.055 14\nPatient (retrocervical) 2.168 1.198 5 1.276 0.470 5\nCCL21 Control 5.881 13.286 16 10.329 38.436 16\nPatient (rectosigmoid) 1.958 1.014 8 3.849 3.672 14\nPatient (retrocervical) 0.767 0.244 5 0.643 0.754 5\nBellelis. Chemokines in deep endometriosis. Fertil Steril 2013.\nVOL. 99 NO. 7 / JUNE 2013 1991\nFertility and Sterility®\n\nin patients with ovarian endometriosis compared with\ndisease-free patients.\nEndometriosis is a condition that continues to be evalu-\nated, and many questions remain to be clarified. The immuno-\nlogic theory is currently the target of much research. A\nnumber of studies have approached endometriosis as an im-\nmunologic disease (1, 50, 51) , and identi fication of\na noninvasive diagnosis and a de finitive or prophylactic\ntreatment may well result from this theory. The action of\ncells that mediate in flammatory response, such as the T-reg\nand NK cells, when they are inactive, underactive, or even\nwhen functioning normally appears to play a fundamental\nrole in the genesis and/or maintenance of this disease.\nFurthermore, as seen for the first time in our study, the role\nof certain chemokines in modulating this in flammatory\nresponse represents a fundamental key to understanding the\ninflammatory response in endometriosis. We measured\nmRNA levels to identify chemokine ligands and changes in\nreceptors in cases of deep endometriosis, but it should be\ntaken into consideration that posttranscriptional changes\nmay also interfere in immune cascade processes.\nREFERENCES\n1. Podgaec S, Abr ~ao MS, Dias JA Jr, Rizzo LV, de Oliveira RM, Baracat EC. En-\ndometriosis: an in flammatory disease with a T H2 immune response compo-\nnent. Hum Reprod 2007;22:1373 –9.\n2. Berkkanoglu M, Arici A. Immunology and endometriosis. 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