O fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve pode comprometer o fuso meiótico de oócitos em metáfase II

DA BROI, MG. Follicular fluid fro m infertile women with mild endometriosis may compromise the meiotic spindle of methaphase II oocytes. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with endometriosis have not been fully elucidated. The i nfertility presented by patients with moderate and severe disease (stages III and IV, respectively) would be partly due to anatomical pelvic changes associated with endometriosis. However, there are evidences that subtle lesions or endometriosis implants in the early stages (stages I and II) might also contribute to the etiophatogenesis of infertility. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation rates after in vitro fertilization in these patients . We question if alterations in the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and compromise the natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes in women with this disease. It is known that to be competent and capable of fertilizing, the oocyte must be mature and have a morpholog ically functional spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential impact of different concentrations of follicular fluid (FF) of infertile women with and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment and actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. We performed an experimental study, where FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility ) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were submitted to in vitro maturation (IVM) without FF and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of 2 samples of FF (1 from a woman with endometriosis and one from a woman without endometriosis). We performed 11 IV M and each FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin microfilaments , and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48 .84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19 .15%, 5%: 23 .44%, 10%: 25%, 15%: 23 .81%) and those matured without FF (23.53%), with no differences among the tested concentrations in each group. We can conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women with mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal damage. Key words: mild endometriosis; female infertility; in vitro maturation; follicular fluid; meiotic spindle, oocyte quality. Lista de figuras Figura 1. Esquema de preparo das diluições a fim de manter a suplementação adequada do meio de maturação. ..................................................................................................... pág. 38 Figura 2. Microscopia Confocal: oócitos em Metáfase I (normal e normal ................... pág. 41 Figura 3. Microscopia Confocal: oócitos em Telófase I (normal e normal). ................ pág. 42 Figura 4. Microscopia Confocal: o ócitos em Metáfase II normais, visão sagital e polar. ................................ ................................ ................................ ................. pág. 43 Figura 5. Microscopia Confocal: oócitos em Metáfase II anormais visão sagital........... pág. 44 Figura 6. Microscopia Confocal: o ócitos em Metáfase II anormais visão sagital e polar. ................................ ................................ ................................ ................. pág. 45 Figura 7. Microscopia Confocal: o ócitos em Metáfase II anormais visão sagital e polar. ................................ ................................ ................................ ................. pág. 46 Lista de tabelas Tabela 1 - Estágios de maturação nuclear (metáfase I, telófase I e metáfase II) oocitária nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. .......................................................... pág.50 Tabela 2 – Porcentagens de oócitos em metáfase II normais e anormais nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. ..................................................................................... pág.51 Lista de siglas AI – Anáfase I ASRM – American Society for Reproductive Medicine BSA(V) – Albumina sérica bovina fração V CA – cromossomos alinhados CD – Cromossomos desalinhados CG – células da granulosa COC – Complexo cumulus-oócito DNA – Ácido desoxirribonucléico DTT – Ditiotreitol FACA – Fuso anormal e cromossomos alinhados FACD – Fuso anormal e cromossomos desalinhados FF – Fluido folicular FITC – Fluorocromo isotiocianato FIV – Fertilização in vitro FMRP – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto FNCA – Fuso normal e cromossomos alinhados FNCD – Fuso normal e cromossomos desalinhados FP – Fluido peritoneal FSH – Hormônio folículo estimulante FSHr – Hormônio folículo estimulante recombinante GnRHa – Análogo do hormônio liberador de gonadotrofinas hCG – Gonadotrofina coriônica humana HIV – Vírus da imunodeficiência humana ICSI – Injeção intracitoplasmática de espermatozóide IL-1 – Interleucina-1 IL-1β – Interleucina-1 beta IL-6 – Interleucina-6 IL-10 – Interleucina-10 IMC – Índice de massa corporal LH – Hormônio luteinizante MgCl2 – Cloreto de magnésio MHz – Mega hertz MI – Metáfase I MII – Metáfase II MIV – Maturação in vitro MTSB XF – Fixador tampão estabilizador de microtúbulos NaCl – Cloreto de sódio NaN3 – Azida sódica PBS – Tampão Fosfato- salino RA – Reprodução assistida SFB – Soro fetal bovino TFM – Taxa de fecundidade mensal TI – Telófase I TNF-α –Fator de necrose tumoral alfa TRA – Técnicas de reprodução assistida UI – Unidade internacional USP – Universidade de São Paulo USTV – Ultrassonografia transvaginal VEGF – Fator de crescimento de endotélio vascular Sumário 1. Introdução ........................................................................................................................... 19 Endometriose .....................................................................................................................................20 Endometriose e Infertilidade ..............................................................................................................21 Endometriose e Técnicas de Reprodução Assistida ...........................................................................23 Microambiente folicular.....................................................................................................................23 Competência oocitária .......................................................................................................................25 2. Justificativa ......................................................................................................................... 28 3. Objetivos .............................................................................................................................. 31 Objetivo Geral ....................................................................................................................................32 Objetivos Específicos ........................................................................................................................32 4. Casuística e Métodos .......................................................................................................... 33 Critérios de Inclusão ..........................................................................................................................34 Critérios de exclusão ..........................................................................................................................34 Protocolo de Estimulação ..................................................................................................................35 Coleta e processamento do fluido folicular........................................................................................36 Coleta dos complexos cumulus-oócito de bovinos ............................................................................36 Maturação in vitro ..............................................................................................................................37 Fixação dos oócitos ............................................................................................................................38 Imunofluorescência ............................................................................................................................39 Avaliação dos oócitos ........................................................................................................................39 Análise estatística ..............................................................................................................................40 5. Resultados ........................................................................................................................... 47 6. Discussão ............................................................................................................................. 52 7. Conclusões ........................................................................................................................... 59 Referências Bibliográficas ..................................................................................................... 61 ANEXOS .................................................................................................................................. 66 Anexo 1- Termos de Consentimento Livre e Esclarecido ........................................................ 67 Anexo 2- Manuscrito ................................................................................................................ 74 1. Introdução Introdução | 20 Endometriose A endometriose é uma doença caracterizada por implante e crescimento de tecido endometrial (glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina (GUPTA et al., 2006). Embora assintomática em alguns casos, esta doença pode também se manifestar clinicamente, sendo que os d iferentes sintomas apresentados variam de intensidade conforme a paciente (BELLELIS et al., 2010). Os implantes endometriais ectópicos podem induzir à ocorrência de reação inflamatória crônica, cicatrizes e adesões (SIGNORILE; BALDI, 2010), distorcendo a anatomia pélvica e promovendo a ocorrência de dor, dismenorréia e dispaurenia, o que tende a afetar o bem-estar físico, psicológico e social dessas mulheres. Além diss o, a endometriose é freqüentemente associada à infertilidade, sendo que 30 a 50% das suas portadoras são inférteis (BULLETTI et al., 2010). É importante salientar que a endometriose possui alta prevalência, acometendo de 6 a 10% da população feminina geral (BULLETTI et al., 2010) , além de se r uma das maiores causas ginecológicas de admissões hospitalares nos países industrializados. Estima-se que, em todo o mundo, o número de mulheres com endometriose ultrapasse os 70 milhões (BELLELIS et al., 2010) . Dessa forma, tanto por seu impacto na saúde física e psicológica das pacientes (BULLETTI et al., 2010) , como pelo impacto sócio -econômico diante dos custos de diagnóstico e tratamento, esta doença pode ser considerada um problema atual de saúde pública (SIGNORILE; BALDI, 2010) e merece maior atenção. A Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva ( ASRM) classifica a endometriose em 4 estágios, conforme a severidade da doença. A presença de focos endometrióticos isolados e ausência de aderências significativas caracterizam o estágio I ou endometriose mínima, sendo esta a sua forma mais branda. Lesões ectó picas superficiais, com menos de 5 cm e ausência de aderências significativas são características do estágio II ou endometriose leve, não havendo alterações anatômicas da pelve. Presença de múltiplos implantes Introdução | 21 endometrióticos, com aderências peritubárias e periovarianas evidentes são características do estágio III ou endometriose moderada. Já a presença de múltiplos implantes superficiais e profundos, incluindo endometriomas, aderências densas e firmes caracterizam o estágio IV ou endometriose grave. (Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996, 1997). Endometriose e Infertilidade Um aspecto muito interessante em portadoras de endometriose é a sua enigmática associação com a infertilidade, observada em grande parte das pacientes (AGARWAL;GUPTA; SHARMA, 2005; AGARWAL;GUPTA; SIKKA, 2006; MINJAREZ; SCHLAFF, 2000). A literatura afirma que a taxa de fecundidade mensal (TFM) para casais normais em idade reprodu tiva corresponde a cerca de 30% nos primeiros 3 ciclos e decai a 4% após 1 ano de tentativas de gestação. Entretanto, a TFM para casais inférteis com endometriose varia de 2 a 10% por mês, podendo mesmo a endometriose mínima estar associada à infertilidade (GUPTA et al., 2008). Embora estudos apoiem o conceito de diminuição de fecundidade nas portadoras desta doença (BULLETTI et al., 2010; GARRIDO et al., 2002) e muitos mecanismos tenham sido propostos para explicar a presença de infertilidade nestas pacientes, entre eles , defeitos imunológicos e características al teradas do fluido peritoneal envolvendo citocinas e macrófagos (SUZUKI et al., 2005) , os exatos mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese, principalmente nos casos de endometriose mínima (estágio I) e leve (estágio II), em que não se observa alteração mecânica do trato reprodutivo, ainda não foram precisamente elucidados (HOLOCH; LESSEY, 2010). A infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave de endometriose (estágios III e IV, respectivamente) poderia ser explicada pela presença de Introdução | 22 alterações anatômicas, como adesões pélvicas ou peritubárias que perturbariam a comunicação entre ovário e tuba uterina e, assim, prejudicariam a liberação, captação ou transporte do óvulo (BULLETTI et al., 2010) . Entretanto, há crescentes evidências de que lesões sutis ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (est ágios I e II ) também poderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade , apesar da ausência de danos anatômicos pélvicos. (HOLOCH; LESSEY, 2010). De acordo c om D’Hooghe et al (2003) , parece haver uma relação causal entre a presença de endometriose nas formas leves e a ocorrência de subfertilidade nas suas portadoras. Alguns autores relatam uma tendência à taxa de fecundidade mensal estar diminuída em mulheres inférteis com endometriose mínima e leve, em comparação com mulheres com infertilidade sem causa aparente. Além disso, há evidências de menor TFM após a inseminação uterina de mulheres com endometriose mínima e leve em comparação com aquelas sem a doença, bem como, de um aumento na TFM e taxa cumulativa de gravidez após remoção cirúrgica dos focos de endometriose mínima e leve (D'HOOGHE et al., 2003) . Entretanto, há controvérsias a respeito da associação entre endometriose mínima (estágio I) e infertilidade. Segundo Matorras et al (2010), as taxas de gestação são semelhantes quando comparadas mulheres normais e mulheres com endometriose mínima (MATORRAS et al., 2010). Além disso, alguns autores sugerem que a forma mínima da doença possa estar presente em grande parte das mulheres, porém, sem a maioria delas apresentar efeitos sobre a fertilidade (HOLOCH; LESSEY, 2010) . Diante destes dados, poderia -se conferir maior atenção à endometriose leve, a fim de se elucidar os mecanismos envolvidos na sua relação com a infertilidade. Introdução | 23 Endometriose e Técnicas de Reprodução Assistida Novas abordagens para o tratamento da infertilidade relacionada à endometriose têm surgido, destacando -se a aplicação cada vez mais rotineira das técnicas de reprodução assistida (TRA) de alta complexidade, sendo que seus resultados podem ser utilizados como importante ferramenta para o entendimento da etiopatogênese envolvida nesta doença. A literatura apresenta dados contraditórios acerca dos resultados da fertilização in vitro (FIV) em pacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos e hipóteses nos últimos anos (GARCIA-VELASCO; ARICI, 1999; GARRIDO et al., 2000; KUMBAK et al., 2008). Trabalhos sugerem a ocorrência de menores taxas de fertilização, implanta ção e de gestação em portadoras dessa afecção (AL-FADHLI et al., 2006; BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002) , o que poderia ser decorrente do comprometimento da qualidade oocitária e, conseqüentemente, embrionária e/ou de defeitos endometriais ou da interação entre o endométrio e o embrião (BRIZEK et al., 1995; KUMBAK et al., 2008; PELLICER et al., 1995) . Assim, o comprometimento da qualidade embrionária poderia ser decorrente tanto de defeitos relacionados à foliculogênese e qualidade oocitária, como de eventos posteriores à fertilização (GUERIN;EL MOUATASSIM; MENEZO, 2001). Microambiente folicular Os fluidos peritoneal, folicular e de hidrossalpinge são microambientes reprodutivos que abrigam gametas, zigotos e embriões por tempo variável, de modo que alterações em sua composição química podem ter efeitos adversos nos processos reprodutivos. (AGARWAL;GUPTA; SHARMA, 2005) O microambiente folicular pode ter um papel crítico na qualidade oocitária, fertilização e desenvolvimento embrionário. Sabe -se que o fluido folicular, que mantém Introdução | 24 íntima relação com o oócito durante a fase de crescimento e matur ação celular, constitui um microambiente metabolicamente ativo, contendo hormônios esteróides, fatores de crescimento, citocinas, espécies reativas, antioxidantes, entre outros, produzidos pelas células da granulosa, células endoteliais e leucócitos (ATTARAN et al., 2000; PASQUALOTTO et al., 2004). Diferentes estudos avaliando os níveis de constituintes dos fluidos peritoneal (BERBIC et al., 2009; GUPTA et al. , 2008; MANSOUR et al., 2009; MANSOUR et al., 2010) e f olicular (ANDRADE et al., 2010; JO ZWIK;WOLCZYNSKI; SZAMATOWICZ, 1999; PELLICER et al., 1998; PELLICER et al., 1998) apontam à existência de alterações em pacientes com endometriose. Segundo Bulletti et al (2010), mulheres com a doença possuem um maior volume de fluido peritoneal, com altas concentrações de macrófagos ativados, prostaglandinas, interleucina-1 ( IL-1), Fator de necrose tumoral alfa ( TNF-α) e proteases, podendo ter efeito adverso na função oocitária, do espermatozóide, embrião, ou trompa de falópio (BULLETTI et al., 2010). Outros estudos evidenciaram diferenças em constituintes do fluido folicular, como aumento dos níveis de interleucina-6 ( IL-6), interleucina-10 ( IL-10), interleucina-1 beta (IL-1β), TNF-α e diminuição de fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF) quando comparadas portadoras de endometriose e controles (GARRIDO et al., 2000; GUPTA et al., 2008; PASQUALOTTO et al., 2004; WUND ER et al., 2005) . Entretanto, a maioria dos autores não faz distinção entre os estágios de endometriose, o que impossibilita uma avaliação precisa do papel da progressão da doença sobre a infertilidade. Questionamos a possibilidade de ocorrência de alguma alteração no microambiente folicular de pacientes inférteis com endometriose, que poderia afetar a aquisição de competência oocitária (AGARWAL;GUPTA; SIKKA, 2006; BARCELOS et al., 2009; FERREIRA et al., 2009) e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e os resultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença Introdução | 25 (AGARWAL;SALEH; BEDAIWY, 2003; A L-FADHLI et al., 2006; BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002). Competência oocitária O fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II (MII) é uma estrutura temporária e dinâmica, em forma de barril, composta por microtúbulos formados por dímeros de tubulina que se polimerizam e despolimeriz am nos diversos estágios do ciclo celular (CHOI et al., 2007) e está associada ao córtex oocitário e s ua rede de microfilamentos subcorticais (KIM et al., 1998; MANDELBAUM et al., 2004; WANG; KEEFE, 2002) , sendo essencial para garantir a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose (DE SANTIS et al., 2005; VAN BLERKOM; DAVIS, 2001; VOLARCIK et al., 1998) . Desta forma, a fecundação e o desenvolvimento embrionário depe ndem da integridade morfológica e funcional desta estrutura celular. Além disso, o fuso é extremamente sensível à ação de diversos fatores (EICHENLAUB-RITTER;SHEN; TINNEBERG, 2002; HU et al., 2001; MULLEN et al., 2004), entre os quais o estresse oxidativo, passível de promover anomalias meióticas, instabilidade cromossômica, aumento da apoptose e comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação (LIU et al., 2003; NAVARRO et al., 2006; NAVARRO;LIU; KEEFE, 2004) . Estudos avaliando os potenciais mecanismos envolvidos na gênese das alterações do fuso celular relacionadas ao estresse oxidativo, evidenciaram que o mesmo pode danificar diversas prot eínas intracelulares (BERLETT; STADTMAN, 1997; STADTMAN, 1992), algumas das quais, importantes para a organização do fuso celular (ABRIEU et al., 2001; ANTONIO et al., 2000; FUNABIKI; MURRAY, 2000) podendo promover lesões no DNA e induzir o inadequado alinhamento cromossômico (BECKMAN; AMES, 1998; LIMOLI et al., 1998). Introdução | 26 As anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência do desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do oócito em completar a maturação, tornando -se incapaz de ser fertilizado, até a ocorrência de erros que não impossibilitem a fertilização, mas comprometam o desenvolvimento embrionário pré e/ou pós -implantação, bem como a viabilidade futura do concepto (ARMSTRONG, 2001; LONERGAN et al., 1994; PAVLOK;LUCAS-HAHN; NIEMANN, 1992). Um estudo de Mansour et al (2009) demonstrou que o fluido peritoneal de mulheres com endometriose pode promover anomalias nos microtúbulos e cromossomos de oócitos de camundongos, além de aumento da apoptose embrionária n este modelo animal. Estas anomalias foram reduzidas após suplementação do meio de cultivo com L-carnitina, um antioxidante, sugerindo que substâncias presentes no fluido peritoneal de portadoras desta doença promovem comprometimento da qualidade oocitária e embrionária, tendo o estresse oxidativo como provável mediador (MANSOUR et al., 2009). Recentemente, o mesmo grupo publicou novo trabalho avaliando o efeito do FP de mulheres com endometriose sobre o citoesqueleto de oócitos de camundongos em MII, sendo novamente encontrada uma maior freqüência de fuso meiótico anormal e cromossomos de salinhados em oócitos incubados com fluido destas pacientes, quando comparadas a controles. Além disso, o dano ao citoesqueleto oocitário foi positivamente correlacionado com a duração da infertilidade e o estágio da doença (MANSOUR et al., 2010) . Estes achados sugerem haver alterações no FP de portadoras de endometriose, as quais estariam comprometendo a qualidade oocitária, podendo o estresse oxidativo ter participação neste processo. Embora haja trabalhos avaliando o efeito do FP de mulheres com endometriose sobre a qualidade oocitária (MANSOUR et al., 2009; MANSOUR et al., 2010) e dosando diferentes componentes em soro, FF ou FP de pacientes com a doença, não encontramos nenhum estudo que tenha avaliado o efeito do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve na Introdução | 27 gênese de anomalias meióticas oocitárias. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose sobre a gênese de anomalias meióticas oocitárias, durante maturação in vitro (MIV), utilizando modelo experimental bovino. 2. Justificativa Justificativa | 29 A endometriose, doença caracterizada por implante e cr escimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina (GUPTA et al., 2006) , apresenta elevada prevalência populacional (BULLETTI et al., 2010) . Entre suas manifestações clínicas mais freqüentemente relacionadas, destaca -se a infertilidade, presente em 30 a 50% das su as portadoras (BULLETTI et al., 2010) , as quais parecem ter uma menor taxa de fecundidade mensal em ciclos naturais (GUPTA et al., 2008) e piores resultados de FIV em tratamentos de reprodução assistida (AL-FADHLI et al., 2006; BARNHART;DUNSMOOR -SU; COUTIFARIS, 2002) quando comparadas a mulheres sem a doença. Alterações anatômicas parecem estar relacionadas à infertilidade em pacientes com as formas graves de endometriose (BULLETTI et al., 2010) , porém, em casos de doença leve, sem alterações anatômicas pélvicas , os mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese ainda não foram precisamente elucidados (HOLOCH; LESSEY, 2010). Embora haja trabalhos avaliando o efeito do FP de mulheres com endometriose sobre a qualidade oocitária (MANSOUR et al., 2009; MANSOUR et al., 2010) e dosando diferentes componentes em soro, FF ou FP de pacientes com a doença, n ão encontramos nenhum estudo que tenha avaliado o potencial impacto do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve na gênese de anomalias meióticas oocitárias. A observação de maior incidência de anomalias meióticas em oócitos incubados com fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve poderia colaborar com a elucidação dos mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infert ilidade relacionada a este estágio da doença, assim como, sugerir uma possível justificativa, ao menos parcial, para as menores taxas de implantação observadas neste grupo de mulheres , abrindo perspectivas para novas abordagens terapêuticas. Diante do número reduzido de oócitos huma nos destinados à pesquisa, a experimentação com animais torna -se relevante em estudos de maturação in vitro. Dessa Justificativa | 30 forma, o uso de modelo experimental bovino neste estudo se justifica pela similaridade no tamanho e morfologia dos ovários humano e bovino, por ambas as espécies serem monovulatórias e policíclicas e por ser um material abundante, barato, de fácil manipulação (MALHI;ADAMS; SINGH, 2005). 3. Objetivos Objetivos | 32 Objetivo Geral Avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações (15%, 10%, 5%, 1%) de fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve e sem endometriose submetidas à estimulação ovariana controlada para a realização de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) sobre a integridade do fuso celular , a distribuição cromossômica e a organização dos microfilamentos de actina oocitários, em modelo experimental bovino. Objetivos Específicos 1. Comparar o grau de maturidade nuclear oocitária (estágios da Meiose) entre as diferentes concentrações de fluido folicular dentro de cada grupo (endometriose leve e controle). 2. Comparar o grau de maturidade nuclear oocitária (estágios da Meiose) de cada concentração de fluido folicular entre os grupos endometriose, controle e sem fluido. 3. Comparar a integridade do fuso celular, o alinhamento cromossômico e a organização dos microfilamentos de actina oocitários entre as diferentes concentrações de fluido folicular dentro de cada grupo (endometriose leve e controle). 4. Comparar a integridade do fuso celular, o alinhamento cromossômico e a organização dos microfilamentos de actina oocitários de cada concentração de fluido f olicular entre os grupos endometriose leve, controle e sem fluido. 4. Casuística e Métodos Casuística e Métodos | 34 Realizou-se um estudo prospectivo de fevereiro de 2009 a fevereiro de 2011 junto ao Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP -USP. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP) e pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP). As pacientes que preencheram os critérios de inclusão e manifestaram o desejo de participar do projeto e concordaram em ceder amostras de fluido folicular, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1) previamente à inclusão no estudo. Critérios de Inclusão No grupo endometriose, foram selecionadas pacientes com infertilidade associada à endometriose diagnosticada e classificada por videolaparoscopia (segundo os critérios da American Society for Reproductive Medicine, 1997), com estadiamento da doença definid o como grau II (endometriose leve). No grupo controle, incluíram-se pacientes apenas com infertilidade por fator masculino e/ou tubário. Todas as pacientes do grupo controle foram submetidas à videolaparoscopia diagnóstica como procedimento de rotina para investigação da infertilidade conjugal, sendo excluída a presença de endometriose. Critérios de exclusão Foram critérios de exclusão: idade maior ou igual a 38 anos, índice de massa corporal (IMC) maior que 30 Kg/m², nível sérico de hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro dia do ciclo menstrual maior ou igual a 10mUI/ml, anovulação crônica, presença de hidrossalpinge e doenças crônicas como diabetes m ellitus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, Casuística e Métodos | 35 dislipidemia, lupus eritematoso sistêmico e outras doenças reumatológicas, infecção pelo vírus HIV, qualquer infecção ativa, tabagismo, uso constante de medicações hormonais e de antiinflamatórios hormonais e não-hormonais nos seis meses anteriores à inclusão no estudo. Protocolo de Estimulação Com o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de estimulação ovariana controlada utilizou-se a programação da menstruação, que consiste em se administrar diariamente anticoncepcionais orais combinados, iniciados no período menstrual do ciclo precedente até cinco dias antes do previsto para o início da estimulação ovariana, suspendendo sua administração de tal forma que o início do sangramento menstrual coincida com a realização da ultrassonografia transvaginal (USTV) basal para se observar o padrão endometrial e afastar a presença de cistos ovarianos que pudessem interferir na resposta à administração das gonadotrofinas exógenas e na monitorização ultrassonográfica do crescimento folicular. O bloqueio hipofisário com análogo do hormônio libera dor de gonadotrofinas (GnRHa) foi iniciado 10 dias antes do dia de realização da USTV basal (protocolo longo), no período vespertino, por meio da administração de acetato de leuprolide (Lupron®, Abott, Brasil; Reliser®, Serono, Brasil) na dose de 0,5mg/di a (10 UI), por via subcutânea, mantida durante todo o período de estimulação ovariana controlada até o dia da administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Ovidrel®, Serono, Brasil). A hiperestimulação ovariana controlada foi iniciada entre o segu ndo e o quarto dia do ciclo menstrual. As pacientes receberam 150 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSHr) (Gonal-F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil), via intramuscular, nos primeiros 6 dias da indução. A partir do sétimo dia da indução da ov ulação, a dose foi ajustada de acordo com o crescimento folicular e a espessura endometrial, monitorados com USTV diariamente ou em dias alternados. Casuística e Métodos | 36 Na presença de, pelo menos, dois folículos com 18 mm de diâmetro médio, foram administrados 250 µg de hCG r ecombinante (Ovidrel®, Serono, Brasil) às 22:00. A captação dos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante. Coleta e processamento do fluido folicular Cerca de 34 a 36 horas após a administração do hCG, as pacientes foram submetidas à captação oocitária, sob sedação endovenosa com propofol. A aspiração folicular foi realizada por meio de ultra-sonografia com transdutor transvaginal de 5 MHz, acoplado a guia de punção. Para a coleta de fluido folicular, utilizaram -se tubos estéreis, individuais, aquecidos a 37°C, sem meio de cultura. Foi aspirado todo o conteúdo do primeiro folículo com diâmetro médio ≥ 15 mm do primeiro ovário puncionado de cada paciente. Apenas os f luidos foliculares livres de contaminação sanguínea à inspeção visual e que apresentaram células da granulosa (CG) ou células da granulosa e um oócito maduro foram selecionados para o trabalho. Desta forma, não foram incluídas no estudo amostras de fluido folicular contaminadas com sangue ou meio de cultivo, ou que não continham CG e/ou oócitos maduros. As amostras de fluido foram centrifugadas a 1500 rpm por 7 minutos e armazenadas a - 80°C, em tubo individual, para posterior utilização nos experimentos. Coleta dos complexos cumulus-oócito de bovinos Os ovários, provenientes de vacas abatidas em frigorífico, foram imediatamente transportados ao laboratório, mantidos em solução fisiológica (0,9% NaCl) acrescida de 0,05 g/L de sulfato de estreptomicina, a u ma temperatura de 35 -38,5°C. Posteriormente, foram borrifados com álcool 70%, lavados em solução fisiológica pré -aquecida a 38,5ºC e mantidos nesta mesma solução, em banho-maria, até o final da aspiração. Os complexos cumulus-oócito Casuística e Métodos | 37 (COC) imaturos foram aspirados de folículos de 2 a 8 mm de diâmetro, utilizando -se agulhas 25 x 7 acopladas a seringas de 20ml e, então, sele cionados sob estereomicroscópio em placas de Petri de 100 mm contendo o meio de lavagem Talp Hepes. Para o cultivo in vitro, somente os COCs morfologicamente saudáveis foram selecionados, ou seja, aqueles com citoplasma homogêneo e pelo menos três camadas de células do cumulus-oophorus. Maturação in vitro Utilizou-se o meio de maturação padrão TCM -199 com sais Earle e bicarbonato (Invitrogen, Gibco Laboratories Life Techonogies Inc., Grand Island, NY), suplementado com 0,2 µM de piruvato, 100 UI/ml de Penicilina, 0,1 mg/ml de Estreptomicina, 0,5 µg/ml de FSH, 5,0 µg/ml de LH e 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (FERREIRA et al., 2009). A fim de manter a concentração adequada de suplementação após a adição de fluido folicular, eliminando-se, assim, o efeito da diluição d os suplementos, optou-se por preparar um TCM 15% mais concentrado, ao qual, de acordo com cada diluição, foi adicionado fluido folicular e/ou meio TCM filtrado não suplementado, conforme esquema apresentado na figura 1. Imediatamente após a seleção, os COCs foram randomicamente divididos em 9 grupos: 1) COC s cultivados em meio padrão (sem suplementação de fluido folicular); 2) COCs cultivados em meio padrão + fluido folicular de mulheres com endometriose leve nas concentrações 15%, 10%, 5% e 1%; 3) COC s cultivados em meio padrão + fluido folicular das pacientes controle nas c oncentrações 15%, 10%, 5% e 1%. O cultivo foi feito em placas Nunc de 24 poços , em um volume total de 200 µl de meio ou meio acrescido de fluido folicular, sem óleo mineral, a 38,5°C, 95% de umidade, 5% de CO 2 em ar, por um período de 22 a 24 horas. Após a maturação, os oócitos foram desnudados por agitação mecânica, em meio tamponado Talp Hepes. Casuística e Métodos | 38 Figura 1. Esquema de preparo das diluições a fim de manter a concentração adequada de suplementação após a adição de fluido folicular. Fixação dos oócitos Ocorrido o desnudamento, os oócitos foram colocados em solução fixadora MTSB XF, composta por 1X de Tampão E stabilizador (0,1M de Pipes, 5mM de MgCl 2 e 2,5mM de EGTA), 50% de Óxido de Deutério, 0,01% de Aprotinina de pulmão bovino, 1 mM de DTT, 1 μM de Taxol, 0,5% de Triton -X, 2% de Formaldeído e água de MilliQ, aquecida previamente por 30 minutos em estufa a 37°C, permanecendo nesta solução a 4°C até o processamento da imunofluorescência e confecção das lâminas. Casuística e Métodos | 39 Imunofluorescência Os oócitos previamente fixados foram lavados em solução tampão composta por 0,02% de NaN3, 0,01% de Triton -X, 0,2% de leite desnatado, 2% de Soro Normal de Cabra, 0,1M de Glicina, 2% de BSA(V) e tampão PBS, onde permaneceram a 4°C overnight. Passado esse período, foram novamente lavados em solução tampão e incubados overnight, a 4°C, com o anticorpo primário anti-β-tubulina de camundongo (diluição 1:1000). Após nova lavagem em solução tampão, foram incubados com o anticorpo secundário imunoglobulina de cabra a nti- camundongo conjugada com Fluoresceína isotiocianato (FITC) (Zymed Laboratories, Invitrogen Corporation, Calsbad, CA, USA, diluição 1:500) por 2 horas a 37°C. Depois de lavadas, as amostras foram marcadas para os filamentos de actina com faloidina conj ugada a rodamina (1:1000), lavadas novamente e, então, os cromossomos foram marcados com Hoechst 33342 (10 µg/ml), em meio de montagem composto por 50% de glicerol e 25 mg/ml de NaN3, durante 10 minutos, à temperatura ambiente e montados entre lâmina e lamínula. As lâminas foram estocadas a 4°C até observação em Microscópio Confocal Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Mannheim, Germany), sendo 7 dias o intervalo máximo entre a confecção e a leitura das mesmas. Avaliação dos oócitos Os oócitos visualizados foram, primeiramente, classificados quanto à fase da divisão meiótica em que se encontravam : metáfase I (MI - Figura 2), anáfase I (AI), telófase I ( TI - Figura 3) ou metáfase II (MII – Figuras 4, 5, 6 e 7). Posteriormente, aqueles em MII foram classificados quanto à posição de visualização do fuso meiótico, sendo considerados fusos analisáveis apenas aqueles em visão sagital, permitindo avaliação global de fuso , cromossomos e microfilamentos de actina (Figura 4A e 4B). Aqueles em visão polar foram considerados não analisáveis devido à impossibilidade de avaliação dos microtúbulos, tendo Casuística e Métodos | 40 apenas os cromossomos e microfilamentos de actina analisados (Figura 4C e 4D). Os oócitos considerados analisáveis foram avaliados quan to à integridade do fuso (microtúbulos), alinhamento e condensação dos cromossomos e organização dos microfilamentos de actina , enquanto os não analisáveis foram avaliados apenas quanto ao alinhamento e condensação dos cromossomos e organização dos microfilamentos de actina. Considerou-se o fuso como normal quando em forma de barril, com pólos definidos e tamanho adequado (Figura 4A e 4B), e anormal quando desorganizado, com tamanho e forma anormais, integridade comprometida e/ou pólos não -definidos (Figuras 5, 6 e 7 ). Os cromossomos foram considerados normais quando alinhados na placa metafásica (Figura 4) e anormais quando desalinhados ( Figuras 5, 6 e 7 ). Os microfilamentos de actina foram considerados normais quando distribuídos homogeneamente no citoplasma oocitário (Figura 4) e anormais, quando superconcentrados na região do fuso (Figuras 7A e 7D). Os fluidos foliculares utilizados nas maturações in vitro foram provenientes de 22 pacientes inférteis, sendo 11 com endometriose leve e 11 com fator masculino e/ou tubário. Análise estatística As análises foram realizadas pelo procedimento GENMOD do programa estatístico SAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Para comparação inter e intra -grupos das variáveis de contagem (oócitos em MI, TI e MII, actina normal) considerou-se a Distribuição de Poisson. Para comparação inter e intra-grupos das variáveis de porcentagem (proporção de fuso normal e cromossomos alinhados, fuso normal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados, cromossomos alinhados, cromossomos desalinhados, total de normais e total de anormais) utilizou-se a Distribuição Gama. Foi considerado significativo p<0,05. Casuística e Métodos | 41 Figura 2. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e microfilamentos de actina (ver melho), em oócitos bovinos em Metáfase I. A - Metáfase I normal (visão polar). B - Metáfase I anormal (visão polar). C - Metáfase I normal (visão sagital). D- Metáfase I anormal (visão sagital). Casuística e Métodos | 42 Figura 3. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e microfilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Telófase I. A e C - Telófase I normal . B e D- Telófase I anormal. Casuística e Métodos | 43 Figura 4. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e microfilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II normal.A e B: Fuso normal e cromossomos alinhados (visão sagital). C e D: Cromossomos alinhados (visão polar). A e C: Telófase I normal. B e D: Telófase I anormal. Casuística e Métodos | 44 Figura 5. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e microfilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II anormal. A-D: Fuso anormal e cromossomos desalinhados (visão sagital). Casuística e Métodos | 45 Figura 6. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e microfilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II anormal. A e C: Cromossomos desalinhados / anormais (visão polar). B: Fuso anormal e cromossomos alinhados (visão sagital). D: Fuso anormal e cromossomos desalinhados (visão sagital). B Casuística e Métodos | 46 Figura 7. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e microfilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II anormal. A: Fuso anormal, cromossomos desalinhados e actina anormal (visão sagital). B: Fuso an ormal, cromossomos alinhados (visão sagital). C: Cromossomos anormais (visão polar). D: actina anormal, cromossomos anormais (visão polar). 5. Resultados Resultados | 48 Os resultados obtidos são apresentados nas tabelas 1 e 2. Um total de 1324 complexos cummulus-oócito foram maturados in vitro, randomicamente divididos entre os 9 grupos ( sem fluido, FF controle nas concentrações 1%, 5%, 10% e 15% e FF endometriose nas concentrações 1%, 5%, 10% e 15%). Deste total, 1128 foram fixados e 1038 visualizados em microscopia confocal. Um total de 921 oócitos foi classificado em MII, sendo 466 considerados com fuso analisável (visão sagital) e 455 com fuso não-analisável (visão polar, apenas avaliação de cromossomos e actina). Não houve diferença significativa para nenhuma das variáveis analisadas quando comparadas as concentrações de fluido folicular de mulheres com endometriose entre si. Da mesma forma, não se encontrou diferença significativa para nenhuma das variáveis analisadas quando comparadas as concentrações de fluido folicular de pacientes controles entre si (Tabelas 1 e 2). Com relação ao estágio de maturação, não foi observada diferença significativa no total de oócitos em TI, MI e MII entre os grupos endometriose, controle e sem fluido, bem como, não houve diferença significativa entre os grupos quanto à porcentagem de oócitos normais nos estágios MI e TI (Tabela 1). Não se encontrou oócitos em AI em nenhum dos grupos estudados. Daqueles em estágio de MII, quando considerados conjuntamente os oócitos analisáveis e não analisáveis ( em visão sagital e visão polar, respectivamente), não houve diferença significativa na s porcentagens de normalidade (fuso normal + cromossomos alinhados e cromossomos alinhados) entre os grupos endometriose, controle e sem fluido (Tabela 2). Quando considerados apenas os oócitos MII analisáveis (visão sagital), foi encontrado maior percentual de anormalidades meióticas (fuso anormal + cromossomos alinhado s, fuso anormal + cromossomos desalinhados, fuso normal + cromossomos desalinhados) nos oócitos Resultados | 49 maturados em meio padrão acrescido de fluido folicular de mulheres com endometriose leve quando comparados aos maturados em meio padrão acrescido de fluido foli cular de mulheres controle e àqueles maturados sem adição de fluido (p<0,01). Consequentemente, houve uma maior porcentagem de fuso + distribuição cromossômica normais entre os oócitos do grupo controle com relação aos do grupo endometriose , entretanto, se m apresentar diferença significativa para o grupo sem fluido (p<0,01). Da mesma forma, encontrou-se significativamente maior porcentagem de oócitos com fuso e distribuição cromossômica normais entre os maturados em meio padrão (sem fluido) quando comparado s aos maturados em meio padrão acrescido de fluido folicular de mulheres com endometriose leve (p<0,01). (Tabela 2) Não foi encontrada diferença significativa na distribuição cromossômica normal de oócitos em visão polar entre nenhum dos grupos estudados ( Tabela 2) . A análise das anormalidades dos oócitos em visão polar (CD) não convergiu devido ao pequeno número de ocorrências. Não foi encontrada diferença significativa para a organização dos microfilamentos de actina entre os grupos. Resultados | 50 Tabela1 – Estágios de maturação nuclear (metáfase I, telófase I e metáfase II) oocitária nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. Concentração FF (%) Total Oócitos fixados (n) Total oócitos visualizados (n) Metáfase I Telófase I Metáfase II Total Normal n (%) Total Normal n (%) Total Sem Fluido 0 119 115 9 (7,82) 7 (77,78) 6 (5,22) 5 (83,34) 100 (86,96) FF Controle 1 129 117 6 (5,12) 6 (100) 4 (3,42) 2 (50) 107 (91,46) 5 133 118 4 (3,38) 4 (100) 1 (0,85) 1 (100) 113 (95,77) 10 126 119 13 (10,92) 8 (61,54) 5 (4,20) 4 (80) 101 (84,88) 15 124 111 6 (5,40) 4 (66,67) 4 (3,60) 2 (50) 101 (91) FF Endometriose 1 125 115 12 (10,43) 8 (66,67) 2 (1,74) 1 (50) 101 (87,83) 5 124 113 16 (14,16) 8 (50) 1 (0,088) 0 96 (84,96) 10 125 118 13 (11,01) 11 (84,62) 2 (1,70) 2 (100) 103 (87,29) 15 123 112 9 (8,03) 6 (66,67) 4 (3,58) 3 (75) 99 (88,39) Nota. Não houve diferença significativa entre os grupos. Nível de significância de 5%. Resultados | 51 Tabela 2 – Porcentagens de oócitos em metáfase II normais e anormais nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. Concentração FF (%) Total de MII Analisáveis Não Analisáveis Total n (%) Normais Anormais n (%) Total n (%) Normais Anormais FNCA n (%) Total n (%) FACA n (%) FACD n (%) FNCD n (%) CA n (%) CD n (%) Sem Fluido 0 100 51 (51) 39 (76,47) 12 (23,53) 3 (25) 6 (50) 3 (25) 49 (49) 49 (100) 0 FF Controle 1 107 47 (43,93) 38 (80,85) 9 (19,15) 3 (33,33) 6 (66,67) 0 60 (56,07) 59 (98,33) 1 (1,67) 5 113 64 (56,64) 49 (76,56) 15 (23,44) 6 (40) 8 (53,34) 1 (6,66) 49 (43,36) 48 (97,96) 1 (2,04) 10 101 60 (59,40) 45 (75) 15 (25) 6 (40) 7 (46,67) 2 (13,33) 41 (40,60) 40 (97,56) 1 (2,44) 15 101 63 (62,38) 48 (76,19) 15 (23,81) 8 (53,34) 6 (40) 1 (6,66) 38 (37,62) 38 (100) 0 FF Endometriose 1 101 45 (44,55) 20 (44,44) 25 (55,56) 9 (36) 15(60) 1 (4) 56 (55,45) 52 (92,56) 4 (7,14) 5 96 49 (51,04) 18 (36,74) 31 (63,26) 17 (54,84) 14 (45,16) 0 47 (48,96) 45 (95,75) 2 (4,25) 10 103 44 (42,72) 20 (45,46) 24 (54,54) 12 (50) 12(50) 0 59 (57,28) 59 (100) 0 15 99 43 (43,43) 22 (51,16) 21 (48,84) 11 (52,38) 9 (42,85) 1 (4,77) 56 (56,57) 55 (98,21) 1 (1,79) Nota. Analisáveis: oócitos com fuso em visão sagital. Não analisáveis: oócitos com fuso em visão polar. FNCA: fuso normal e cromossomos alinhados. FACA: fuso anormal e cromossomos alinhados. FACD: fuso anormal e cromossomos desalinhados. FNCD: fuso normal e cromossomos de salinhados. CA: cromossomos alinhados. CD: cromossomos desalinhados. p<0,01 quando comparados FNCA e total de anormais entre os grupos Controle e Endometriose e entre os grupos Sem Fluido e Endo metriose nas concentrações 1%, 5%, 10% e 15%. A análise dos CD não convergiu. 6. Discussão Discussão | 53 A endometriose é uma doença caracterizada por implante e crescimento de tecido endometrial ectópico (GUPTA et al., 2006) , destacando-se a infertilidade como uma de suas manifestações clínicas mais freqüentes (BULLETTI et al., 2010) . Entretanto, os mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese, principalmente nos casos de doença mínima e leve , ainda não foram precisamente elucidados (HOLOCH; LESSEY, 2010). Sendo o ambiente folicular extremamente importante para o processo de ma turação oocitária, possíveis alterações nos componentes do fluido folicular podem ter influência sobre maturidade e qualidade oocitárias e, assim, afetar fertilização, desenvolvimento embrionário inicial e taxas de gestação (MA et al., 2010), o que poderia explicar, parcialmente, a infertilidade e os piores resultados nos TRA apresentados por mulheres com endometriose. Embora haja trabalhos reportando o efeito do fluido peritoneal de mulheres com endometriose sobre a qualidade oocitária (MANSOUR et al., 2009; MANSOUR et al., 2010) e diferenças nos níveis de componentes em soro (ANDRADE et al., 2010; CAMPOS PETEAN et al., 2008; JACKSON et al., 2005) , fluido folicular (ATTARAN et al., 2000; BEDAIWY et al., 2007; CAMPOS PETEAN et al., 2008; GARRIDO et al., 2000; PASQUALOTTO et al., 2004; WIENER -MEGNAZI et al., 2004) ou fluido peritoneal (BULLETTI et al., 2010; FUJII;NAKAYAMA; NAKAGAWA, 2008; GUPTA et al., 2008; MINICI et al., 2008) de pacientes com a doença, não se encontrou nenhum estudo que tenha avaliado o efeito do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sobre fuso , cromossomos e microfilamentos de actina oocitários. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose sobre a gênese de anomalias meióticas oocitárias, durante maturação in vitro (MIV), utilizando modelo experimenta l bovino. Diante da inconsistência dos dados relacionando endometriose mínima e infertilidade (HOLOCH; LESSEY, 2010; Discussão | 54 MATORRAS et al., 2010) , o presente estudo restringiu -se a apenas avaliar o efeito do fluido folicular de mulheres com endometriose leve sobre qualidade oocitária. É importante salientar que, idealmente, para correlacionar a presença de anormalidades meióticas oocitárias com o ambiente folicular na endometriose , o fuso celular, a distribuição cromossômica e os microfilamentos de actina deveriam ser analisad os em oócitos humanos maturados in vivo (BARCELOS et a l., 2009) . Entretanto, d iante da baixa quantidade de oócitos captados em MII, do número reduzido de oócitos humanos destinados à pesquisa, e, sendo a análise por imunofluorescência um método invasivo que necessita de fixação da amostra, a utilização de modelo animal tornou-se importante alternativa neste estudo. O uso d e oócitos bovinos pode ser justificado pela similaridade no tamanho e morfologia dos ovários humanos e bovinos, por ambas as espécies serem monovulatórias e policíclicas e por ser um material abundante, barato, de fácil manipulação (MALHI;ADAMS; SINGH, 2005) . Sabe-se, também, que a maturação in vitro , por si só , pode promover aumento significativo da ocorrência de anormalidades meióticas oocitárias (BARCELOS et al., 2009). Todavia, a mesma metodologia de MIV foi aplicada para os três diferentes grupos, de modo que as diferenças encontradas provavelmente são decorrentes de diferenças nos constituintes do fluido folicular (obtidos das mulheres inférteis c om endometriose leve e controles: fatores masculino e/ou tubário) e não devido ao processo de maturação in vitro. De acordo com os resultados obtidos, não foi observad a diferença significativa no número de o ócitos em estágio de MI, TI e MII entre os grupos, o que demonstra não haver comprometimento da maturação nuclear dos oócitos cultivados com adição de FF de mulheres com endometriose leve. Estes achados discordam de outro estudo anteriormente realizado no mesmo serviço de RA , que av aliou maturação, integridade do fuso meiótico e distribuição cromossômica de oócitos de mulheres inférteis com endometriose e controles maturados in vitro e encontrou uma tendência a maior proporção de oócitos em telófase I no grupo Discussão | 55 endometriose, apesar de não ter evidenciado anomalias meióticas, o que sugere possível retardo no processo de meiose I (BARCELOS et al., 2009) . Entretanto, Barcelos et al (2009) não analisaram separadamente os diferentes est ágios de endometriose . No referido estudo foram incluídos na análise oócitos maturados in vitro oriundos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com endometriose mínima, leve, moderada e grave, de modo que a severidade da doença pode ter sido responsáv el pelo atraso na maturação, o que explicaria esta divergência. Quando avaliada a estrutura de divisão celular de oócitos em MII com visão sagital, observou-se maior porcentagem de anormalidades meióticas entre aqueles maturados com FF de pacientes com endometriose leve quando comparados aos maturados com FF de mulheres sem a doença ou em meio de cultivo padrão apenas. A hipótese de que a qualidade oocitária pode ser prejudicada em mulheres com endometriose não é nova, mas não há um consenso geral a resp eito. De acordo com Gianaroli et al (2010) , o tipo de infertilidade tem efeito significativo sobre erros meióticos oocitários, sendo estes com maior incidência na presença de endometriose ou fator ovulatório (GIANAROLI et al., 2010) , o que foi confirmado pelo presente estudo com relação à endometriose. Um estudo de Mansour et al (2009) demonstrou que o fluido peritoneal de mulheres com endometriose pode promover anomalias nos microtúbulos e cromossomos de oócitos de camundongos maturados in vivo, as quais foram reduzidas após suplementação do meio de cultivo com o antioxidante L-carnitina, sugerindo que componentes presentes no fluido peritoneal de portadoras desta doença promove riam comprometimento da qualidade oocitária e embrionária, tendo o estresse oxidativo como provável mediador. Recentemente, o mesmo grupo publicou novo trabalho avaliando o efeito do FP de mulheres com endometriose sobre o citoesqueleto de oócitos de camundongos em MII, sendo novamente encontrada uma maior freqüência de fuso meiótico anormal e cromossomos desalinhados em oócitos incubados com fluido desta s pacientes quando Discussão | 56 comparadas a controles (MANSOUR et al., 2010) . Como o o ócito permanece no microambiente folicular durante o processo de maturação, em íntim a relação com o fluido folicular e mantém contato com FP após a ovulação e durante o trajeto inicial pela tuba uterina (MA et al., 2010) , os efeitos destes dois microambientes poderiam se somar e promover possível efeito cumulativo sobre a estrutura de divisão meiótica. Assim, os achados do presente estudo , evidenciando que oócitos bovinos imaturos submetidos à maturação in vitro na presença de fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve apresentam maior freqüência de anomalias meióticas do que os maturados na ausência de fluido folicular ou na presença de fluido folicular de mulheres inférteis sem a doença, corroboram os de Mansour et al (2009, 2010) e agregam mais evidências à literatura acerca do potencial efeito deletério destes dois microambientes reprodutivos de mulh eres inférteis com endometriose sobre a gênese de anomalias meióticas oocitárias, contribuindo para o entendimento de mais um possível mecanismo da infertilidade relacionada à endometriose. Por outro lado, os resultados do presente estudo contrariam os obtidos por Barcelos et al (2009), os quais não demonstraram diferenças significativas na freqüência de anormalidades meióticas entre oócitos em MII de pacientes com endometriose versus controles. Porém, estes autores utilizaram oócitos humanos maturados in vitro, oriundos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com diferentes estágios de endometriose, incluindo uma pequena casuística, não sendo passível extrapolarmos os dados obtidos em virtude destas diferenças metodológicas e potenciais viéses. É importante salientar que os efeitos deletérios sobre a estrutura de divisão meiótica oocitária encontrados foram promovidos diante da incubação com fluidos foliculares apenas de pacientes com endometriose leve, indicando haver possível relação entre este estágio da doença e infertilidade, de modo que estes achados poderiam justificar os piores resultados de RA em portadora s da doença, como conseqüência de um comprometimento da aquisição de Discussão | 57 competência e, assim, piora da qualidade oocitárias. Dessa forma, o presente estudo corrobora a hipótese de D’Hooghe et al (2003), que afirma haver evidências de uma relação causal entre a presença de endometriose nas formas leves e a ocorrên cia de subfertilidade nas suas portadoras (D'HOOGHE et al., 2003). Sendo o fuso celular essencial para garantir a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose (DE SANTIS et al., 2005; VAN BLERKOM; DAVIS, 2001; VOLARCIK et al., 1998) e podendo as anomalias meióticas contribuir para a inabilidade do oócito em completar a maturação tornando-se incapaz de ser fertilizado, assim como, para a ocorrência de erros que não impossibilitem a fertilização, mas comprometam o desenvolvimento embrionário pré e/ou pós -implantação ou a viabilidade futura do concepto (ARMSTRONG, 2001; LONERGAN et al., 1994; PAVLOK;LUCAS -HAHN; NIEMANN, 1992) , as anormalidades meióticas encontradas neste estudo podem ser a explicação para os relatados piores resultados de RA em pacientes com a doença (AL-FADHLI et al., 2006; BARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002). O fato de não ter se encontrado diferença significativa para a frequência de distribuição cromossômica normal quando avaliados os oócitos em MII com visão polar pode ser explicado pela impossibilidade de análise fidedigna do fuso e cromossomos nesta posição. Por outro lado, os danos cromossômicos podem não aparecer necessariamente n este estágio da meiose e só se tornarem evidentes nos estágios seguintes, com segregação inadequada das cromátides-irmãs (FRAGOULI et al., 2011) . Como não se encontrou diferença para porcentagem de normalidade quando avaliados conjuntamente os oócitos em visão polar e sagital, apenas havendo diferença significativa desta variável para os oócitos em visão sagital, sugere-se que a posição do fuso seja extremamente importante para a avaliação da divisão celular, de modo que a visão polar parece mascarar os danos aos microtúbulos e/ou cromossomos possivelmente observados em visão sagital. Discussão | 58 Com relação às concentrações de fluido folicular testadas, não foi observada diferença significativa na freqüência de normalidade do fuso em MII entre 1%, 5%, 10% e 15% de fluido folicular no grupo endometriose, ass im como, no grupo controle, evidenciando que as concentrações não interferiram nos resultados e podendo-se inferir que 1% de FF de pacientes com endometriose é a menor concentração testada capaz de promover dano meiótico e, possivelmente, comprometer a qualidade oocitária em mulheres com endometriose leve. 7. Conclusões Conclusões | 60 A adição de fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à estimulação da ovulação, nas quatro con centrações utilizadas, não promo veu atraso ou bloqueio no processo de maturação oocitária em modelo experimental bovino. Observou-se um efeito deletério do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve sobre o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de oócitos bovinos em MII, submetidos à MIV na presença de FF. Não se observou diferença significativa nas freqüências de anomalias meióticas encontradas nas quatro concentrações de fluido folicular (1%, 5%, 10% e 15%) adicionadas ao meio de cultivo padrão, de modo que o efeito não foi dependente da concentração utilizada. Assim, 1% de fluido folicular apresentou -se como a menor concentração testada capaz de promover aumento significativo na freqüência de danos meióticos oocitários. O fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à estimulação ovariana, adicionado ao meio de maturação in vitro de oócitos bovinos, é capaz de promover anomalias meióticas, o que pode ocasionar potencial piora da qualidade oocitária. Sugerimos que este mecanismo possa estar envolvido tanto na redução da fecundidade, como na piora dos resultados dos procedimentos de reprodução assistida em portadoras de infertilidade relacionada à endometriose leve, o que precisa ser avaliado com metodologias pertinentes. Futuros estudos, com maior casuística, que analisem possíveis componentes alterados no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose, correlacionem esses dados com os resultados de RA dessas pacientes, dosem diferentes marcadores de estresse oxidativo no FF e proponham a adição de antioxidantes às MIVs , são imprescindíveis para se tentar elucidar potenciais fatores promotores dos danos meióticos oocitários encontrados no presente estudo, em decorrência da adição de FF de mulheres com a doença ao meio de maturação. . Referências Bibliográficas Referências Bibliográficas | 62 ABRIEU, A. et al. Mps1 is a kinetochore-associated kinase essential for the vertebrate mitotic checkpoint. 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Temos suspeita de que o estresse oxidativo possa comprometer também a fertilidade feminina, porém até o presente momento encontramos poucos dados sobre este assunto, os quais, muitas vezes, são cont raditórios. A endometriose é uma causa bastante comum de dificuldade para engravidar (denominada infertilidade) e estuda -se a possibilidade do estresse oxidativo participar da ocorrência desta freqüente doença, podendo, inclusive, contribuir para a infertilidade associada à mesma. Temos indícios de que o estresse oxidativo possa prejudicar a qualidade dos óvulos, levando à redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam procedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometriose , questiona-se se um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar seja a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade e, conseqüentemente, gerar uma gestação menos viável. Assim, a aval iação do efeito do fluido folicular (fluido contido no folículo onde os óvulos se desenvolvem) de mulheres inférteis com endometriose sobre a qualidade dos óvulos e embriões poderia auxiliar a descoberta de alguns dos mecanismos envolvidos na causa da infertilidade, o que ajudaria na identificação de tratamentos futuros. Contudo, para podermos dizer se o efeito do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose é diferente daquele Anexos | 69 de mulheres inférteis sem a doença, precisamos de um grupo tido como controle, composto por fluido folicular de mulheres com outra causa de infertilidade, onde você estaria incluída. Para estudarmos o possível efeito prejudicial do fluido folicular de mulheres com endometriose e compará-lo com o que ocorre em mulheres sem a doença, propomos avaliar o efeito da adição de fluido folicular no cultivo in vitro de óvulos e embriões bovinos (de vacas). Assim, para a realização dessa pesquisa, será necessária uma amostra de fluido folicular coletada no dia da captação dos óvulos, sem necessidade de intervenções complementares, já que este é um procedimento padrão, sem riscos adicionais à paciente. O fluido folicular colhido junto com o oócito é normalmente descartado, não tendo utilidade no procedimento de reprodução assistida, de modo que seu uso neste estudo não prejudicará o tratamento, pois os óvulos obtidos serão normalmente utilizados no seu tratamento da infertilidade. Desta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de paciente do grupo control e, ou seja, cujo fluido folicular seja considerado como padrão de normalidade, para fins de comparação com os fluidos das pacientes com endometriose. Sua colaboração, portanto, no fornecimento de amostra de fluido folicular será imprescindível para um melh or conhecimento do efeito do fluido folicular de pacientes com dificuldade para engravidar mas sem endometriose, sobre os oócitos e embriões (utilizando um modelo animal para esta avaliação, ou seja, utilizando óvulos e embriões de vaca). Estes dados serão comparados aos de mulheres com dificuldade para engravidar devido à endometriose. Este conhecimento no futuro poderá ser usado no sentido de facilitar a identificação de um tratamento mais eficaz da infertilidade associada a esta doença. Contudo, ressalta mos que você não terá nenhum tipo de benefício imediato participando do presente estudo. É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu companheiro. Todo o material obtido será utilizado exclusivamente para cultivo de óvulos e embriões bovinos. Também devemos ressaltar que a sua participação no presente estudo não implicará na realização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para tentar engravidar. Fui informada de que, após o isolamento dos óv ulos, o fluido folicular é desprezado, uma vez que não apresenta qualquer utilidade para o procedimento de reprodução ao qual serei submetida. Fui informada, também, de que o fluido será utilizado para cultivo de óvulos e embriões bovinos. Desta forma, aut orizo a utilização do fluido folicular obtido durante o procedimento de captação dos óvulos, após a identificação e separação dos óvulos pela bióloga Anexos | 70 responsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução, exclusivamente no presente estudo. 3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todas as dúvidas com relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente esclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você tem a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes dos integrantes deste estudo, bem como garantimos que se rá mantido o caráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso de que serão prestadas informações atualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa afetar a sua vontade de continuar dele participando. Assegura mos o compromisso de que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste projeto, bem como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa. Eu, _________________ ____________________________, RG nº:___________ abaixo assinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e aceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras de fluido folicular. Autorizo a pesquis adora abaixo mencionada a utilizá -las para a pesquisa: “Avaliação do potencial impacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese de anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando modelo experimental bovino”, estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu consentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. Ribeirão Preto _______ / _______ / _________ _______________________________ ___________________________ Assinatura- Paciente Assinatura do Pesquisador 4. PESQUISADORAS RESPONSÁVEIS: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP Michele Gomes Da Broi Pós-graduanda do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP Anexos | 71 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (Fluido Folicular - GRUPO ENDOMETRIOSE) 1. NOME DA PESQUISA: “Avaliação do potencial impacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese de anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando modelo experimental bovino” 2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada “Avaliação do potencial impacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese de an omalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando modelo experimental bovino” Sabemos que o estresse oxidativo (que aparece quando ocorre um desequilíbrio entre as defesas antioxidantes e a produção de espécies reativas) compromete a fertilidade masculina. Temos suspeita de que o estresse oxidativo possa comprometer também a fertilidade feminina, porém até o presente momento encontramos poucos dados sobre este assunto, os quais, muitas vezes, são contraditórios. A endometriose é uma causa bastante comum de dificuldade para engravidar (denominada infertilidade) e estuda -se a possibilidade do estresse oxidativo participar da ocorrência desta freqüente doença, podendo, inclusive, contribuir para a infertilidade associada à mesma. Temos indícios de que o estresse oxidativo possa prejudicar a qualidade dos óvulos, levando à redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam procedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometriose, questiona -se se um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar seja a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade e, conseqüentemente, gerar uma gestação menos viável. Desta forma, a avaliação do efeito do fluido folicular (fluido contido no folículo onde os óvulos se desenvolvem) de mulheres inférteis com endometriose sobre a qualidade dos óvulos e embriões poderia auxiliar a descoberta de alguns dos mecanismos envolvidos na causa da infertilidade, o que ajudaria na identificação de tratamentos futuros. Para estudarmos o possível efeito prejudicial do fluido folicular de mulheres com endometriose e compará-lo com o que ocorre em mulheres sem a doença, propomos avaliar o efeito da adição de fluido folicular no cult ivo in vitro de óvulos e embriões bovinos (de vacas). Assim, para a realização dessa pesquisa, será necessária uma amostra de fluido Anexos | 72 folicular coletada no dia da captação dos óvulos, sem necessidade de intervenções complementares, já que este é um procedim ento padrão, sem riscos adicionais à paciente. O fluido folicular colhido junto com o oócito é normalmente descartado, não tendo utilidade no procedimento de reprodução assistida, de modo que seu uso neste estudo não prejudicará o tratamento, pois os óvulo s obtidos serão normalmente utilizados no seu tratamento da infertilidade. Desta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de paciente do grupo endometriose, para fins de comparação com os fluidos das pacientes controle, ou s eja, consideradas como padrão de normalidade. Sua colaboração, portanto, no fornecimento de amostra de fluido folicular será imprescindível para um melhor conhecimento do efeito do fluido folicular de mulheres com endometriose sobre os oócitos e embriões ( utilizando um modelo animal para esta avaliação, ou seja, utilizando óvulos e embriões de vaca, cultivados com o seu fluido folicular). Este conhecimento no futuro poderá ser usado no sentido de propiciar um tratamento mais eficaz da infertilidade associa da a esta doença. Contudo, ressaltamos que você não terá nenhum tipo de benefício imediato participando do presente estudo. É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu companheiro. Todo o material obtido será utiliz ado exclusivamente para cultivo de óvulos e embriões bovinos. Também devemos ressaltar que a sua participação no presente estudo não implicará na realização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para tentar engravidar. Fui informada de que, após o isolamento dos óvulos, o fluido folicular é desprezado, uma vez que não apresenta qualquer utilidade para o procedimento de reprodução ao qual serei submetida. Fui informada, também, de que o fluido será utilizado para cultivo de óvulos e embriões bovinos. Desta forma, autorizo a utilização do fluido folicular obtido durante o procedimento de captação dos óvulos, após a identificação e separação dos óvulos pela bióloga responsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução, ex clusivamente no presente estudo. 3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todas as dúvidas com relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente esclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estu do. Você tem a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes dos integrantes deste e studo, bem como garantimos que será mantido o Anexos | 73 caráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso de que serão prestadas informações atualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa afetar a vossa vontade de co ntinuar dele participando. Asseguramos o compromisso de que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste projeto, bem como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa. Eu, _______________________________ ______________, RG nº:___________ abaixo assinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e aceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras flu ido folicular. Autorizo a pesquisadora abaixo mencionada a utilizá -las para a pesquisa : “Avaliação do potencial impacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese de anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvim ento embrionário, utilizando modelo experimental bovino”, estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu consentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. Ribeirão Preto _______ / _______ / _________ _______________________________ ___________________________ Assinatura- Paciente Assinatura do Pesquisador 4. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP Telefone de contato: 16-3602-2231 Endereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínicas - Setor de Reprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. Michele Gomes Da Broi Pós-graduanda do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP Telefone de contato: 16-3602-2231 Endereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínicas - Setor de Reprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. Anexos | 74 Anexo 2- Manuscrito Follicular fluid from infertile women with mild endometriosis may compromise the meiotic spindle of methaphase II oocytes Michele Gomes Da Broia, Helena Malvezzi a, Rui Alberto Ferriani a,b, MD, PhD, Claudia Paro de Pazc, PhD, Paula Andrea Navarro a,b*, MD, PhD. a Human Reproduction Division, Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil. b National Institute of Hormones and Woman’s Health, CNPq, Brazil c Department of Genetics , Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of S ão Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil. Institution: Faculty of Medicine of R ibeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil. *Corresponding author: Paula A. Navarro Avenida Bandeirantes, 3900 - Ribeirão Preto, SP, Brazil. CEP: 14049-900 Tel.: +55 16 3602 28 21 Fax: +55 16 3633 1028 E-mail: [email protected] FINANCIAL SUPPORT This study received financial support from the National C ouncil for Scientific and Technological Development (CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). Anexos | 75

Objective: The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with endometriosis have not been fully elucidated. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation rates after in vitro fertilization in these patients. We question if alterations in the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and compromise natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes in women with this disease. It is known that t o be competent and capable of fertilizing, the oocyte must be mature and have a morphologically functional spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis. Thus, th is study aimed to evaluate the potential impact of different con centrations of follicular fluid (FF) from infertile women with and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment and actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. Design: Experimental study. Material and Me thods: FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were submi tted to in vitro maturation (IVM) without FF (control) and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of 2 samples of FF ( 1 from a woman with endometriosis and one from a woman without endometriosis ). We performed 11 IVM and each FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin microfilaments, and, then, analyzed by confocal microscopy. Results: The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48. 84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19.15%, 5%: 23. 44%, Anexos | 76 10%: 25%, 15%: 23. 81%) and those matured without FF (23. 53%), with no differences among the tested concentrations in each group . Conclusions: We can conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women with mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal damage. Key words: mild endometriosis; female infertility; in vitro maturation; follicular fluid; meiotic spindle, oocyte quality. Support: CNPq, Brasil Anexos | 77 INTRODUÇÃO A endometriose é caracterizada por implante e crescimento de tecido endometrial (glândulas e/ou estroma) for a da cavidade uterina (1). Esta doença possui alta prevalência, chegando a acometer de 6 a 10% da população feminina geral (2). Além disso, é freqüentemente associada à infertilidade, sendo que 30 a 50% das suas portadoras são inférteis (2). Entretanto, os exatos mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade associada à endometriose, principalmente nos casos de endometriose mínima (estágio I) e leve (estágio II), em que não se observa alteração mecânica do trato reprodutivo, ainda não foram precisamente elucidados (3). A literatura apresenta dados contraditórios acerca dos resultados da fertilização in vitro (FIV) em pacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos e hipóteses nos últimos anos (4-6). Trabalhos sugerem a ocorrência de menores taxas de fertilização, implantação e de gestação em portadoras dessa afecção (7-8), o que poderia ser decorrente do comprometimento da qualidade oocitária e, conseqüentemente, embrionária e/ou de defeitos endometriais ou da interação entre o endométrio e o embrião (6, 9 -10). Entretanto, o achado de taxas de implantação em pacientes com endometriose semelhantes às do grupo controle em ciclos de doação de oócitos, reforça o papel crucial da qualidade embrionária no comprometimento da implantação verificado neste gru po de pacientes (4, 11- 12). A infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave de endometriose (estágios III e IV, respectivamente) poderia ser explicada pela presença de alterações anatômicas, como adesões pélvicas ou peritubárias que perturbariam a comunicação entre ovário e tuba uterina e, assim, prejudicariam a liberação, captação ou transporte do óvulo (2). Entretanto, há crescentes evidências de que lesões sutis, ou m esmo Anexos | 78 implantes endometrióticos iniciais poderiam contribuir com a infertilidade nos estágios I e II , apesar da ausência de danos anatômicos pélvicos. (3, 13). Diferentes estudos apontam à existência de alterações nos níveis de constituintes dos fluidos peritoneal (14-17) e folicular (18-21) de pacientes com endometriose, o que poderia ter efeitos adversos nos processos reprodutivos (22). Segundo Mansour et al (2009), o fluido peritoneal de mulheres com a doença promove anomalias meióticas oocitárias e apoptose embrionária, tendo sido encontrada maior freqüência de fuso meiótico anormal e cromossomos desalinhados em oócitos incubados com fluido peritoneal de pacientes com endometriose (16-17). Sendo o ambiente folicular extremamente importante para o processo de maturação oocitária, possíveis alterações nos componentes do fluido folicular podem ter influência sobre a maturidade e qualidade a oocitárias e, assim, afetar a fertilização, o desenvolvimento embrionário inicial e as taxas de gestação (23). O fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II (MII) é uma estrutura temporária e dinâmica, associada ao córtex oocitário e sua rede de microfilamentos subcorticais (24-26), sendo essencial para garantir a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose (27- 29). Além disso, é extremamente sensível à ação de diversos fatores (30-32), que podem promover anomalias meióticas, instabilidade cromossômica, aumento da apoptose e comprometimento do desenvolvimento embrionário pré -implantação (33-35). Assim, danos estruturais do fuso meiótico poderiam estar relacionados com possível piora da qualidade oocitária de pacientes com endometriose. Não se encontrou nenhum estudo que tenha avaliado o efeito do fluido folicular de mulheres inférteis com estágios iniciais de endometriose sobre a integridade do fuso, os microfilamentos de actina e a distribuição cromossômica oocitários . Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular de Anexos | 79 mulheres inférteis com e sem endometriose leve sobre a gênese de anomalias meióticas oocitárias, durante maturação in vitro (MIV), utilizando modelo experimental bovino. METODOLOGIA Realizou-se um estudo prospectivo de fevereiro de 2009 a fevereiro de 2011 junto ao Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP -USP. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP) e pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP). As pacientes que preencheram os critérios de inclusão e manifestaram o desejo de participar do projeto assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido previamente à inclusão no estudo. No grupo endometriose, foram selecionadas pacientes com infertilidade associada à endometriose diagnosticada e classificada por videolaparoscopia (segundo os critérios da American Society for Reproductive Medicine, 1997), com estadiamento da doença definido como grau II (endometriose leve). No grupo controle, incluíram-se pacientes apenas com infertilidade por fator masculino e/ou tubário. Todas as pacientes do grupo controle foram submetidas à videolaparoscopia diagnóstica como procedimento de rotina para investigação da infertilidade conjugal, sendo excluída a presença de endometriose. Foram critérios de exclusão: idade maior ou igual a 38 anos, índice de massa corporal (IMC) maior que 30 Kg/m², nível sérico de hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro dia do ciclo menstrual maior ou igual a 10mUI/ml, an ovulação crônica, presença de hidrossalpinge e doenças crônicas como diabetes m ellitus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, dislipidemia, lupus eritematoso sistêmico e outras doenças reumatológicas, infecção pelo vírus Anexos | 80 HIV, qualquer infecção a tiva, tabagismo, uso constante de medicações hormonais e de antiinflamatórios hormonais e não-hormonais nos seis meses anteriores à inclusão no estudo. Protocolo de estimulação ovariana controlada O bloqueio hipofisário foi iniciado usando análogo do hor mônio liberador de gonadotrofinas (GnRHa) 10 dias antes do dia de realização da USTV basal (protocolo longo), por meio da administração de acetato de leuprolide (Lupron®, Abott, Brasil). As pacientes receberam 150 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSH r) (Gonal -F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil), nos primeiros 6 dias da indução. Quando pelo menos dois folículos atingiram 18 mm de diâmetro médio, foi administrada gonadotrofina coriônica humana (hCG) recombinante (Ovidrel®, Serono, Brasil). A captação dos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante. Coleta e processamento das amostras de fluido folicular Para a coleta de fluido folicular, utilizaram -se tubos estéreis, individuais, aquecidos a 37°C, sem meio de cultura. Foi aspirado individualmente todo o conteúdo do primeiro folículo com diâmetro médio ≥ 15 mm do primeiro ovário puncionado de cada paciente. Apenas os fluidos foliculares livres de contaminação sanguínea à inspeção visual e que apres entaram células da granulosa (CG) ou células da granulosa e um oócito maduro foram processados para dosagem dos marcadores de estresse oxidativo. As amostras de fluido foram centrifugadas a 1500 rpm por 7 minutos e armazenadas a - 80°C, em duas alíquotas, para posterior análise. Coleta dos complexos cumulus-oócito de bovinos Os ovários, provenientes de vacas abatidas em frigorífico, foram imediatamente transportados ao laboratório, mantidos em solução fisiológica (0,9% NaCl) acrescida de 0,05 Anexos | 81 g/L de sulfa to de estreptomicina, a uma temperatura de 35 -38,5°C. Posteriormente, foram borrifados com álcool 70% e lavados em solução fisiológica pré -aquecida 38,5ºC e mantidos nesta mesma solução, em banho-maria, até o final da aspiração. Os complexos cumulus-oócito (COCs) imaturos foram aspirados de folículos de 2 a 8 mm de diâmetro, utilizando -se agulhas 25 x 7 acopladas a seringas de 20ml e, então, selecionados sob estereomicroscópio, em placas de Petri de 100 mm contendo o meio de lavagem T alp Hepes. Para o cultivo in vitro, somente os COCs morfologicamente saudáveis foram selecionados, ou seja, aqueles com citoplasma homogêneo e, pelo menos, três camadas de células do cumulus-oophorus. Maturação in vitro Utilizou-se o meio de maturação padrão TCM -199 com sais Earle e bicarbonato (Invitrogen, Gibco Laboratories Life Techonogies Inc., Grand Island, NY), suplementado com 0,2 µM de piruvato, 100 UI/ml de Penicilina, 0,1 mg/ml de Estreptomicina, 0,5 µg/ml de FSH, 5,0 µg/ml de LH e 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (36). A fim de manter a concentração ade quada de suplementação após a adição de fluido folicular, eliminando-se, assim, o efeito da diluição dos suplementos, optou -se por preparar um TCM 15% mais concentrado, ao qual, de acordo com cada diluição, foi adicionado fluido folicular e/ou meio TCM filtrado não suplementado. Imediatamente após a seleção, os COCs foram randomicamente divididos em 9 grupos: 1) COC s cultivados em meio padrão (sem suplementação de fluido folicular); 2) COCs cultivados em meio padrão + fluido folicular de mulheres com end ometriose leve nas concentrações 15%, 10%, 5% e 1%; 3) COC s cultivados em meio padrão + fluido folicular das pacientes controle nas c oncentrações 15%, 10%, 5% e 1%. O cultivo foi feito em placas Nunc de 24 poços , em um volume total de 200 µl de meio ou mei o acrescido de fluido folicular, sem óleo mineral, a 38,5°C, 95% de umidade, 5% de CO 2 em ar, por um período de Anexos | 82 22 a 24 horas. Após a maturação, os oócitos foram desnudados por agitação mecânica, em meio tamponado Talp Hepes. Fixação dos oócitos Ocorrido o desnudamento, os oócitos foram colocados em solução fixadora MTSB XF, composta por 1X de Tampão Estabilizador (0,1M de Pipes, 5mM de MgCl 2 e 2,5mM de EGTA), 50% de Óxido de Deutério, 0,01% de Aprotinina de pulmão bovino, 1 mM de DTT, 1 μM de Taxol, 0,5% de Triton -X, 2% de Formaldeído e água de MilliQ, aquecida previamente por 30 minutos em estufa a 37°C, permanecendo nesta solução a 4°C até o processamento da imunofluorescência e confecção das lâminas. Imunofluorescência Os oócitos previamente fixados f oram lavados em solução tampão composta por 0,02% de NaN 3, 0,01% de Triton -X, 0,2% de leite desnatado, 2% de Soro Normal de Cabra, 0,1M de Glicina, 2% de BSA(V) e tampão PBS, onde permaneceram a 4°C overnight. Passado esse período, foram novamente lavados em solução tampão e incubados overnight, a 4°C, com o anticorpo primário anti -β-tubulina de camundongo (diluição 1:1000). Após nova lavagem em solução tampão, foram incubados com o anticorpo secundário imunoglobulina de cabra anti -camundongo conjugada com Fluoresceína isotiocianato ( FITC) (Zymed Laboratories, Invitrogen Corporation, Calsbad, CA, USA, diluição 1:500) por 2 horas a 37°C. Depois de lavadas, as amostras foram marcadas para os filamentos de actina com faloidina conjugada a rodamina (1:1000), la vadas novamente e, então, os cromossomos foram marcados com Hoechst 33342 (10 µg/ml), em meio de montagem composto por 50% de glicerol e 25 mg/ml de NaN 3, durante 10 minutos, à temperatura ambiente e montados entre lâmina e lamínula. Anexos | 83 As lâminas foram estoc adas a 4°C até observação em Microscópio Confocal Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Mannheim, Germany), sendo 7 dias o intervalo máximo entre a confecção e a leitura das mesmas. Avaliação dos oócitos Os oócitos visualizados foram, primeiramente, classificados quanto à fase da divisão meiótica em que se encontravam : metáfase I (MI) , anáfase I (AI), telófase I ( TI) ou metáfase II (MII) . P osteriormente, aqueles em MII foram classificados quanto à posição de visualização do fuso meiótico, sendo considerados fusos analisáveis apenas aqueles em visão sagital, permitindo avaliação global de fuso , cromossomos e microfilamentos de actina (Figura 1A e B ). Aqueles em visão polar foram considerados não analisáveis devido à impossibilidade de avaliação dos microtúbulos, tendo apenas os cromossomos e microfilamentos de actina analisados (Figura 1C e D ). Os oócitos considerados analisáveis foram avaliados quanto à integridade do fuso (microtúbulos), alinhamento e condensação dos cromossomos e organização dos microfilamentos de actina , enquanto os não analisáveis foram avaliados apenas quanto ao alinhamento e condensação dos cromossomos e organização dos microfilamentos de actina. Considerou-se o fuso como normal quando em forma de barril, com pólos definidos e tamanho normal. Os cromossomos foram considerados normais quando alinhados na placa metafásica. Os microfilamentos de actina foram considerados normais quando distribuídos homogeneamente no citoplasma oocitário (Figura 1). Fuso, cromosso mos e actina com características diferentes das acima citadas foram considerados anormais (Figura 2). Os fluidos foliculares utilizados nas maturações in vitro foram provenientes de 22 pacientes inférteis, sendo 11 com endometriose leve e 11 com fator masculino e/ou tubário. Anexos | 84 Análise estatística As análises foram realizadas pelo procedimento GENMOD do programa estatístico SAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Para comparação inter e intra -grupos das variáveis de contagem (oócitos em MI, TI e MII, actina normal) considerou-se a Distribuição de Poisson. Para comparação inter e intra-grupos das variáveis de porcentagem (proporção de fuso normal e cromossomos alinhados, fuso normal e cromossomos desalinh ados, fuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados, cromossomos alinhados, cromossomos desalinhados, total de normais e total de anormais ) utilizou -se a Distribuição Gama. Foi considerado significativo p<0,05. RESULTADOS Os resultados obtidos são apresentados nas tabelas 1 e 2. Um total de 1324 complexos cummulus -oócito (COC) foram maturados in vitro, randomicamente divididos entre os 9 grupos (TCM -199 puro, FF controle e FF endometriose nas concentrações 1%, 5%, 10% e 15 %). Deste total, 1128 foram fixados e 1038 visualizados em microscopia confocal. Um total de 921 oócitos foram classificados em MII, sendo 466 considerados com fuso analisável (visão sagital) e 455 com fuso não -analisável (visão polar, apenas avaliação de cromossomos e actina). Não houve diferença significativa para nenhuma das variáveis analisadas quando comparadas as concentrações de fluido folicular de mulheres com endometriose entre si. Da mesma forma, não se encontrou diferença significativa para nenh uma das variáveis analisadas quando comparadas as concentrações de fluido folicular de pacientes controle s entre si (Tabelas 1 e 2). Anexos | 85 Com relação ao estágio de maturação, não foi observada diferença significativa no total de oócitos em TI, MI e MII entre os grupos endometriose, controle e sem fluido, bem como, não houve diferença significativa entre os grupos quanto à porcentagem de oócitos normais nos estágios MI e TI (Tabela 1). Não se encontrou oócitos em AI em nenhum dos grupos estudados. Daqueles em est ágio de MII, quando considerados apenas os oócitos MII analisáveis (visão sagital), foi encontrado maior percentual de anormalidades meióticas (fuso anormal + cromossomos alinhados, fuso anormal + cromossomos desalinhados, fuso normal + cromossomos desalinhados) nos oócitos maturados em meio padrão acrescido de fluido folicular de mulhere s com endometriose leve quando comparados aos maturados em meio padrão acrescido de fluido folicular de mulheres controle e àqueles maturados sem adição de fluido (p<0,01). Não foi encontrada diferença significativa na distribuição cromossômica normal de oócitos em visão polar entre nenhum dos grupos estudados (Tabela 2). A análise das anormalidades dos oócitos em visão polar (CD) não convergiu devido ao pequeno número de ocorrências. Quando considerados conjuntamente os oócitos analisáveis e não analisáv eis ( em visão sagital e visão polar, respectivamente), não houve diferença significativa na s porcentagens de normalidade (fuso normal + cromossomos alinhados e cromossomos alinhados) entre os grupos endometriose, controle e sem fluido (Tabela 2). Não foi encontrada diferença significativa para a organização dos microfilamentos de actina entre os grupos. Anexos | 86 DISCUSSÃO Embora haja trabalhos reportando o efeito do fluido peritoneal de mulheres com endometriose sobre a qualidade oocitária (16-17) e diferenças nos níveis de componentes em soro (21, 37 -38), fluido fo licular (4, 37, 39 -42) ou fluido peritoneal (2, 14, 43 -44) de pacientes com a doença, não se encontrou nenhum estudo que tenha avaliado o efeito do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sobre fuso e cromossomos oocitários. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o pot encial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular de mulheres inférteis com e sem endometriose sobre a gênese de anomalias meióticas oocitárias, durante maturação in vitro (MIV), utilizando modelo experimental bovino. Diante da inconsistência dos dados relacionando endometriose mínima e infertilidade (3, 45) , o presente estudo restringiu -se a apenas avaliar o efeito do fluido folicular de mulheres com endometriose leve sobre qualidade oocitária. É importante salientar que, idealmente, para correlacionar a presença de anormalidades meióticas oocitárias com o ambiente folicular na endometriose, o fuso celular e a distribuição cromossômica deveria m ser analisados em oócitos humanos maturados in vivo (46). Entretanto, diante da baixa quantidade de oócitos captados em MII, do número reduzido de oócitos humanos destinados à pesquisa, e, sendo a análise por imunofluorescência um método invasivo, que necessita de fixação da amostra, a utilização de modelo animal tornou - se importante alternativa neste estudo. O uso de oócit os bovinos pode ser justificado pela similaridade no tamanho e morfologia dos ovários humanos e bovinos, por ambas as espécies serem monovulatórias e policíclicas e por ser um material abundante, barato, de fácil manipulação (47). Sabe-se, também, que a maturação in vitr o, por si só, pode promover aumento significativo da ocorrência de anormalidades meióticas oocitárias (46). Todavia, a mesma metodologia de MIV foi aplicada para os três diferentes grupos, de modo que as diferenças encontradas provavelmente são decorrentes de diferenças nos constituintes do Anexos | 87 fluido folicular (obtidos das mulheres inférteis com endometriose leve e controles: fatores masculino e/ou tubário) e não devido ao processo de maturação in vitro. De acordo com os resultados obtidos, não foi observada diferença significativa no número de oócitos em estágio de MI e MII entre os grupos, o que demonstra não haver comprometimento da maturação nuclear dos oócitos cultivados com adição de FF de mulheres com endometriose leve. Estes achados discordam de outro estudo anteriormente realizado no mesmo serviço de RA , que avaliou maturação, integridade do fuso meiótico e distribuição cromossômica de oócitos de mulheres inférteis com endometriose e co ntroles maturados in vitro e encontrou uma tendência a maior proporção de oócitos em telófase I no grupo endometriose, apesar de não ter evidenciado anomalias meióticas, sugerindo possível retardo no processo de meiose I (46). Entretanto, Barcelos et al (2009) não analisaram separadamente os diferentes estágios de endometriose. No referido estudo foram incluídos na análise oóc itos maturados in vitro oriundos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com endometriose mínima, leve, moderada e grave, de modo que a severidade da doença pode ter sido responsável pelo atraso na maturação, o que explicaria esta divergência. Quando avaliada a estrutura de divisão celular de oócitos em MII com visão sagital, observou-se maior freqüência de anormalidades meióticas entre aqueles maturados com FF de pacientes com endometriose leve quando comparados aos maturados com FF de mulheres sem a doença ou em meio de cultivo padrão apenas. A hipótese de que a qualidade oocitária pode ser prejudicada em mulheres com endometriose não é nova, mas não há um consenso geral a respeito. De acordo com Gianaroli et al (2010) , o tipo de infertilidade tem efe ito significativo sobre erros meióticos oocitários, sendo estes com maior incidência na presença de endometriose ou fator ovulatório (48), o que foi confirmado pelo presente estudo com relação à endometriose. Um estudo de Mansour et al (2009) demonstrou que o fluido peritoneal de mulheres com endometriose pode promover anomalias nos microtúbulos e Anexos | 88 cromossomos de oócitos de camundongos maturados in vivo, as quais foram reduzidas após suplementação do meio de cultivo com o antioxidante L-carnitina, sugerindo que componentes presentes no fluido peritoneal de portadoras desta doença promove riam comprometimento d a qualidade oocitária e embrionária, tendo o estresse oxidativo como provável mediador. Recentemente, o mesmo grupo publicou novo trabalho avaliando o efeito do FP de mulheres com endometriose sobre o citoesqueleto de oócitos de camundongos em MII, sendo n ovamente encontrada uma maior freqüência de fuso meiótico anormal e cromossomos desalinhados em oócitos incubados com fluido desta s pacientes quando comparadas a controles (17). Como o oócito permanece no microambiente folicular durante o processo de maturação, em íntima relação com o fluido folicular e mantém contato com FP após a ovulação e durante o trajeto inicial pela tuba uterina (23), os efeitos destes dois microambientes poderiam se somar e promover possível efeito cumulativo sobre a estrutura de divisão meiótica. Assim, os achados do presente estudo corroboram os de Mansour et al (2009, 2010) e agregam mais evidências à literatura acerca do potencial efeito deletério destes dois microambientes reprodutivos de mulheres inférteis com endometriose sobre a gênese de anomalias meióticas oocitárias, contribuindo para o entendimento de mais um possível mecanismo da infertilidade relacionada à endometriose. Por outro lado, os resultados d o presente estudo contrariam os obtidos por Barcelos et al (2009), os quais não demonstraram diferenças significativas na freqüência de anormalidades meióticas entre oócitos em MII de pacientes com endometriose versus controles. Porém, estes autores utiliz aram oócitos humanos maturados in vitro , oriundos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com diferentes estágios de endometriose, incluindo uma pequena casuística, não sendo passível extrapolarmos os dados obtidos em virtude destas diferenças metodoló gicas e potenciais viéses. Anexos | 89 É importante salientar que os efeitos deletérios sobre a estrutura de divisão meiótica oocitária encontrados foram promovidos diante da incubação com fluidos foliculares apenas de pacientes com endometriose leve, indicando haver possível relação entre este estágio da doença e infertilidade, de modo que estes achados poderiam justificar os piores resultados de RA em portadora s da doença, como conseqüência de comprometimento da aquisição de competência e, assim, piora da qualidade oocitárias. Dessa forma, o presente estudo corrobora a hipótese de D’Hooghe et al (2003), que afirma haver evidências de uma relação causal entre a presença de endometriose nas formas leves e a ocorrência de subfertilidade nas suas portadoras (13). Sendo o fuso celular essencial para garantir a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose (27-29) e podendo as anomalias meióticas contribuir para a inabilidade do oócito em completar a maturação tornando-se incapaz de ser fertilizado, assim como, para a ocorrência de erros que não impossibilitem a fertilização, mas comprometam o desenvolvimento embrionário pré e/ou pós -implantação ou a viabilidade futura do concepto (49-51), as anormalidades meióticas encontradas neste estudo podem ser a explicação para os relatados piores resultados de RA em pacientes com a doença (7-8). O fato de não ter se encontrado diferença significativa para a frequência de distribuição cromossômica normal quando avaliados os oócitos em MII com visão polar pode ser explicado pela impossibilidade de análise fidedigna do fuso e cromossomos nesta posição. Como não se encontrou diferença para porcentagem de normalidade quando avaliados conjuntamente os oócitos em visão polar e sagital, apenas havendo diferença significativa desta variável para os oócitos em visão sagital, sugere -se que a posição do fuso seja extremamente importante para a avaliação da divisão celular, de modo que a visão polar parece mascarar os danos aos microtúbulos e/ou cromossomos possivelmente observados em visão sagital. Anexos | 90 Com relação às concentrações de fluido folicular testadas, não foi observada diferença significativa na freqüência de anormalidade do fuso em MII entre 1%, 5%, 10% e 15% de fluido folicular no grupo endometriose, assim como, no grupo controle, evidenciando que as concentrações não interferiram nos resultados e podendo-se inferir que 1% de FF de pacientes com endometriose é a menor concentração testada capaz de promover dano meiótico e, possivelmente, comprometer a qualidade oocitária em mulheres com endometriose leve. CONCLUSÕES A adição de fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à estimulação da ovulação, nas quatro concentrações utilizadas, não promoveu atraso ou bloqueio no processo de maturação oocitária em modelo experimental bovino. Observou-se haver um efeito deletério do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve sobre o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de oócitos bovinos em MII, submetidos à MIV na presença de FF. Não se observou diferença significativa nas freqüências de anomalias meióticas encontradas nas quatro concentrações de fluido folicular (1%, 5%, 10% e 15%) adicionadas ao meio de cultivo padrão, de modo que o efeito não foi dependente da concentração utilizada. Assim, 1% de fluido folicular ap resentou-se como a menor concentração testada capaz de promover aumento significativo na freqüência de danos meióticos oocitários. O fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à estimulação ovariana, adicionado ao meio de mat uração in vitro de oócitos bovinos, é capaz de promover anomalias meióticas, o que pode ocasionar potencial piora da qualidade oocitária. Sugerimos que este mecanismo possa estar envolvido tanto na redução da fecundidade, como na piora dos resultados dos p rocedimentos de reprodução assistida em Anexos | 91 portadoras de infertilidade relacionada à endometriose leve, o que precisa ser avaliado com metodologias pertinentes. Futuros estudos, com maior casuística, que analisem possíveis componentes alterados no fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose, correlacionem esses dados com os resultados de RA dessas pacientes, dosem diferentes marcadores de estresse oxidativo no FF e proponham a adição de antioxidantes às MIVs, são imprescindíveis para se tentar el ucidar potenciais fatores promotores dos danos meióticos oocitários encontrados no presente estudo, em decorrência da adição de FF de mulheres com a doença ao meio de maturação. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Gupta S, Agarwal A, Krajcir N, Alvarez JG. Role of oxidative stress in endometriosis. Reprod Biomed Online. 2006 Jul;13(1):126-34. 2. Bulletti C, Coccia ME, Battistoni S, Borini A. Endometriosis and infertility. J Assist Reprod Genet. 2010 Aug;27(8):441-7. 3. Holoch KJ, Lessey BA. Endometriosis and infertility. Clin Obstet Gynecol. 2010 Jun;53(2):429-38. 4. Garrido N, Navarro J, Remohi J, Simon C, Pellicer A. 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Concentração FF (%) Total Oócitos fixados (n) Total oócitos visualizados (n) Metáfase I Telófase I Metáfase II Total Normal n (%) Total Normal n (%) Total Sem Fluido 0 119 115 9 (7,82) 7 (77,78) 6 (5,22) 5 (83,34) 100 (86,96) FF Controle 1 129 117 6 (5,12) 6 (100) 4 (3,42) 2 (50) 107 (91,46) 5 133 118 4 (3,38) 4 (100) 1 (0,85) 1 (100) 113 (95,77) 10 126 119 13 (10,92) 8 (61,54) 5 (4,20) 4 (80) 101 (84,88) 15 124 111 6 (5,40) 4 (66,67) 4 (3,60) 2 (50) 101 (91) FF Endometriose 1 125 115 12 (10,43) 8 (66,67) 2 (1,74) 1 (50) 101 (87,83) 5 124 113 16 (14,16) 8 (50) 1 (0,088) 0 96 (84,96) 10 125 118 13 (11,01) 11 (84,62) 2 (1,70) 2 (100) 103 (87,29) 15 123 112 9 (8,03) 6 (66,67) 4 (3,58) 3 (75) 99 (88,39) Anexos | 96 Tabela 2. Porcentagens de oócitos em metáfase II normais e anormais nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. Concentração FF (%) Total de MII Analisáveis Não Analisáveis Total n (%) Normais Anormais n (%) Total n (%) Normais Anormais FNCA n (%) Total n (%) FACA n (%) FACD n (%) FNCD n (%) CA n (%) CD n (%) Sem Fluido 0 100 51 (51) 39 (76,47) 12 (23,53) 3 (25) 6 (50) 3 (25) 49 (49) 49 (100) 0 FF Controle 1 107 47 (43,93) 38 (80,85) 9 (19,15) 3 (33,33) 6 (66,67) 0 60 (56,07) 59 (98,33) 1 (1,67) 5 113 64 (56,64) 49 (76,56) 15 (23,44) 6 (40) 8 (53,34) 1 (6,66) 49 (43,36) 48 (97,96) 1 (2,04) 10 101 60 (59,40) 45 (75) 15 (25) 6 (40) 7 (46,67) 2 (13,33) 41 (40,60) 40 (97,56) 1 (2,44) 15 101 63 (62,38) 48 (76,19) 15 (23,81) 8 (53,34) 6 (40) 1 (6,66) 38 (37,62) 38 (100) 0 FF Endometriose 1 101 45 (44,55) 20 (44,44) 25 (55,56) 9 (36) 15(60) 1 (4) 56 (55,45) 52 (92,56) 4 (7,14) 5 96 49 (51,04) 18 (36,74) 31 (63,26) 17 (54,84) 14 (45,16) 0 47 (48,96) 45 (95,75) 2 (4,25) 10 103 44 (42,72) 20 (45,46) 24 (54,54) 12 (50) 12(50) 0 59 (57,28) 59 (100) 0 15 99 43 (43,43) 22 (51,16) 21 (48,84) 11 (52,38) 9 (42,85) 1 (4,77) 56 (56,57) 55 (98,21) 1 (1,79) Anexos | 97 Legenda Tabela 1. Nota. Não houve diferença significativa entre os grupos. Nível de significância de 5%. Anexos | 98 Legenda Tabela 2. Nota. Analisáveis: oócitos com fuso em visão sagital. Não analisáveis: oócitos com fuso em visão polar. FNCA: fuso normal e cromossomos alinhados. FACA: fuso anormal e cromossomos alinhados. FACD: fuso anormal e cromossomos desalinhados. FNCD: fuso normal e cromossomos desalinhados. CA: cromossomos alinhados. CD: cromossomos desalinhados. p<0,01 quando comparados FNCA e total de anormais entre os grupos Controle e Endometriose e entre os grupos Sem Fluido e Endometriose nas concentrações 1%, 5%, 10% e 15%. A análise dos CD não convergiu. Anexos | 99 Figura 1. A B C D Anexos | 100 Título Figura 1. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e microfilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II normal. Legenda Figura 1. A-B: Fuso normal e cromossomos alinhados (visão sagital). C-D: Cromossomos alinhados (visão polar). Anexos | 101 Figura 2. A Anexos | 102 Título Figura 2. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e microfilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II anormal. Legenda Figura 2. A-E: Fuso anormal e cromossomos desalinhados (visão sagital). F: Fuso anormal e cromossomos alinhados.