{"paper_id":"ac5c77a9-8ab4-4543-b573-ca9837573bff","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nO fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve \npode comprometer o fuso meiótico de oócitos em metáfase II \n \n \n \nMichele Gomes Da Broi \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2011 \n\nMichele Gomes Da Broi \n \n \n \n \nO fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve pode \ncomprometer o fuso meiótico de oócitos em metáfase II \n \n \n \nDissertação apresentada ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto como para obtenção \ndo Título de Mestre em Ciências Médicas. \nÁrea de concentração: Ginecologia e Obstetrícia \n \nOrientador (a): Professora Doutora Paula Andrea \nde Albuquerque Salles Navarro \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2011\n\nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n  \n     Da Broi, Michele Gomes. \n \nO f luido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve pode \ncomprometer o fuso meiótico de oócitos em metáfase II /Michele Gomes \nDa Broi; Ribeirão Preto, 2011.  \n \n \n102 p. il: 30cm.  \n \n     Dissertação para título de Mestre apresentada à Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.  Área de \nconcentração: Ginecologia e Obstetrícia. \n \n        Orientadora: Navarro, Paula Andrea de Albuquerque Salles. \n \n        1. Endometriose leve. 2. Infertilidade feminina. 3. Maturação in vitro. 4. \nFluido folicular. 5.  Fuso meiótico. 6. Qualidade oocitária. \n\nFOLHA DE APROVAÇÃO \n \nMichele Gomes Da Broi \n \nO fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve pode \ncomprometer o fuso meiótico de oócitos em metáfase II \n \nDissertação apresentada ao Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina \nde Ribeirão Preto para obtenção do Título de Mestre \nem Ciências Médicas. \nÁrea de concentração: Ginecologia e Obstetrícia \n \nOrientador (a): Professora Doutora Paula Andrea de \nAlbuquerque Salles Navarro \n \n \nBanca examinadora: \n \nProf. Dr. Flávio Vieira Meirelles \nFaculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos de Pirassununga – USP \nAssinatura_____________________________________________________________ \nProf. Dr. Rui Alberto Ferriani  \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP  \nAssinatura_____________________________________________________________ \nProfa. Dra. Paula Andrea de  Albuquerque Salles Navarro  \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP  \nAssinatura_____________________________________________________________ \n \n\nDedicatória \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedico este trabalho aos meus pais, Gildo e Maria do Carmo, as pessoas mais \nimportantes da minha vida, eternamente merecedores de meu respeito e \nadmiração, a quem devo tudo que sou e que conquistei. Esta vitória é para \nvocês.  \n \n \nÀs minhas irmãs, Eveline e Laura, exemplos de determinação, superação e \ngarra.  \n \nÀ minha orientadora, Paula, um anjo que surgiu no meu caminho. \n\nAgradecimentos \n \nAgradeço a Deus, por iluminar meus caminhos e apontar a direção certa. Pela \nproteção, pelo amparo e pela força sempre concedidos. \n \nÀ minha família linda, meu porto seguro. Obrigada pelo amor inesgotável, pelo \napoio incondicional, pelo incentivo nas dificuldades, fundamentais para que eu \nchegasse até aqui. Amo vocês! \nÀs minhas irmãs Eveline e Laura, que me ensinaram que, por mais árduo que \nseja o caminho, um sonho é sempre passível de realização.  \nEve, eu sei que tu me amas e torces por mim!  \nLaurinha, obrigada pelas conversas, gargalhadas, conselhos, pelo apoio, pela \ncumplicidade, essenciais para que eu superasse toda e qualquer adversidade. \nSerás, para sempre, meu bebê! \n \nEm especial, aos meus pais, Gildo e Maria do Carmo, pessoas maravilhosas, \nexemplos de vida que, certamente, são também responsáveis por esta conquista. \nSempre me encorajando a superar desafios, a acreditar em mim, amparando \nnos momentos difíceis, comemorando cada conquista, sonhando junto comigo. \nObrigada pela dedicação e confiança. Vocês são minha maior inspiração! \n \n\nAo meu dindo amado, José Pedro, grande incentivador, a quem agradeço por \ntoda a ajuda e dedicação sempre a mim prestadas. \n \nÀ minha querida e exemplar orientadora, Profa. Dra. Paula Navarro, por ter \nme proporcionado tamanho crescimento pessoal, intelectual, científico e \nprofissional. Obrigada pela oportunidade, pelo suporte, pela amizade, atenção, \nconfiança e preocupação sempre a mim dedicadas. Terás sempre minha \nadmiração e carinho! \n \nA meus colegas de pós-graduação, Alessandra, Camila, Carolina, Caroline, \nDaiana, Daiane, Daniel, Elisa, Fernanda, Franciele, Gabriela, Helena, Jacira, \nJhenifer, Juliana, Lucia, Luciana Dib, Luciana R., Marcelo, Mary e Tânia pelo \nacolhimento, companheirismo e colaboração nesta jornada. Por fazerem parte \ndo melhor momento da minha vida, seja conversando nos corredores do \nlaboratório, ajudando diretamente nos meus experimentos, dividindo \nproblemas, compartilhando risadas. Cada um de vocês tem um lugar guardado \nno meu coração. \n \nEm especial, às minhas amigas Carolina , Daiane e Helena, sem as quais esta \netapa não teria sido tão especial. Obrigada pelo colo nos momentos difíceis e \npor me fazerem sorrir todos os dias desta longa jornada. Levo comigo as \nlembranças dos momentos que passamos juntas e a certeza de que nossa \n\namizade não foi um acaso. Juntas, fizemos desse período um dos melhores de \nnossas vidas! \nÀ Helena Malvezzi, amiga e companheira de projeto, minha filhota-mãe, \nverdadeira, prática e sincera, sempre mostrando outro ponto de vista e trazendo \nleveza aos meus dias. Agradeço pela ajuda neste trabalho, pela amizade, pelas \nconversas, pelo carinho, pela paciência e por todos os momentos de apoio, \nrisadas, diversão e cumplicidade.  \nÀ Daiane Bulgarelli por ser, simplesmente, um exemplo de garra. Por me \nacolher, entender, escutar, por me dar ânimo e força, me fazer gargalhar nos \nmomentos em que nada parecia dar certo, por ter se tornado uma pessoa \nimprescindível em minha vida.  Obrigada pelos ensinamenntos, pela amizade, \nsinceridade, atenção e carinho de sempre. \nÀ Carolina Campos, vizinha e amiga sempre presente. Agradeço pelo \ncompanheirismo, pela cumplicidade, pelo apoio, pelas gargalhadas estridentes. \nPor sempre me ouvir e aconselhar. Por se tornar uma irmã quase gêmea e \ndividir tantos momentos felizes. \n   \nÀ Jacira Campos, minha primeira amiga aqui, que me acolheu, aconselhou, \nensinou, auxiliou e esteve presente sempre que precisei. Obrigada pela força, \npelas risadas, pela amizade e pelo carinho, fiiia! \n \n\nÀ Jhenifer Rodrigues, amiga e companheira que me recebeu carinhosamente e \nme orientou nos primeiros passos. Obrigada pela amizade e torcida em todos os \nmomentos. \n \nÀ doce amiga Lu Dib, pelas boas conversas, pelos conselhos dados, pelos \nsorrisos, pelas palavras de alento, pelo incentivo e pela paz transmitida.  \n   \nÀ Alessandra Vireque, que me acolheu, instruiu, ensinou e acompanhou meu \ncrescimento no laboratório desde o início. Obrigada pela receptividade, \ndedicação e pelo suporte técnico que possibilitou a realização deste trabalho. \n \nÀ Elisa Melo Ferreira, pela atenção, prestatividade e pelo treinamento a mim \nconcedidos, fundamentais para a realização dos experimentos.  \n \nÀs funcionárias do Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia – Setor de \nReprodução Humana – HC-FMRP-USP, Camila, Cristina , Cristiana, Débora, \nMaria Albina, Maria Aparecida, Maria Balbino, Maria Cristina, Maria \nAuxiliadora, Marilda, Marisa, Océlia, Roberta e Sandra, que, direta ou \nindiretamente, contribuíram com este projeto. Obrigada pela ajuda, pelas \nconversas, pelo apoio e acolhimento. \n \n\nÀs secretárias Ilza e Suelen, por estarem me auxiliando desde meu primeiro dia \naqui. Agradeço pela receptividade, generosidade, dedicação e amizade, \nessenciais para a conclusão desta etapa.  \n \nÀ Profa. Dra. Claudia Paro de Paz, pela prestatividade, dedicação e paciência \ndurante o auxílio estatístico. \n \nAo Laboratório de Microscopia Confocal da FMRP-USP, pela disponibilização \ndo microscópio para leitura das lâminas. \n \nAo Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani, por me proporcionar esta oportunidade, \ntendo me recebido neste laboratório e acreditado em minha capacidade. \nAgradeço pela confiança, pelo apoio e pelo suporte para a realização deste \ntrabalho, assim como, por ter se disponibilizado a participar desta banca \nexaminadora. \n \nAo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, pelo suporte oferecido à \nrealização deste projeto. \n \nAo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), \npela bolsa de Mestrado concedida. \n \n\nAo Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles, pela disponibilidade em participar da \nbanca examinadora desta dissertação. \n \nA todos que torceram por mim e que, direta ou indiretamente, contribuíram \npara a realização deste trabalho. \n\nEpígrafe \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n     \n  \n \n \n \n \n \n \n \n “Se as coisas são inatingíveis \nOra! Não é motivo para não querê-las! \nQue tristes os caminhos \nSe não fora a presença distante das estrelas” \n \nMario Quintana \n \n\nResumo \nDA BROI, MG. O f luido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve pode \ncomprometer o fuso meiótico de oócitos em metáfase II . Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. \n \nOs mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose \nnão foram totalmente elucidados. A infertilidade apresentada por pacientes com as formas \nmoderada e grave (estadios III e IV, respectivamente) seria, parcialmente, decorrente de \nalterações anatômicas pélvicas associadas à endometriose. Entretanto, há  evidências de que \nlesões sutis  ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (estágio mínimo e leve) \ntambém poderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade . Uma pior qualidade \noocitária pode estar envolvida nas menores taxas de implantação após fertilização in vitro \nencontradas nessas pacientes. Questionamos a possibilidade de haver alterações no \nmicroambiente folicular de pacientes inférteis com endometriose, as quais poderiam afetar a \naquisição de competência oocitária  e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e \nos resultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença. Sabe -se \nque, para ser competente e poder ser fertilizado, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso \nmorfologicamente funcional, que garanta a fidelidade da segregação cromossômica durante a \nmeiose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes \nconcentrações de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com e sem endometriose leve \nsobre a integridade do fuso, alinhamento cromossômico e organização dos microfilamentos de \nactina de oócitos bovinos maturados in vitro . Realizou -se um estudo experimental, onde \namostras de fluido follicular foram consecutivamente obtidas de 22 pacientes i nférteis (11 \ncom endometriose leve e 11 com infertilidade por fator tubário e/ou masculino) submetidas à \nestimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide. Oócitos bovinos \nimaturos foram submetidos à maturação in vitro (MIV) sem adiçã o de fluido follicular (sem \nfluido) e com 4 concentrações (1%, 5%, 10%, e 15%) de duas amostras de fluido folicular \n(uma de paciente com endometriose e outra de paciente sem endometriose). Foram realizadas \n11 MIVs e cada amostra de fluido follicular foi us ada apenas uma vez. Os oócitos foram \nfixados, marcados por imunofluorescência para visualização morfológica de microtúbulos , \ncromatina e microfilamentos de actina  e, então, analisados por microscopia confocal. A \nporcentagem de anormalidade de oócitos em  MII (fuso normal e cromossomos desalinhados, \nfuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados ) foi \nsignificativamente maior naqueles maturados com FF de pacientes com endometriose (1%: \n55,56%, 5%: 63,26%, 10%: 54,54%, 15%: 48,84%) quando comparad os com oócitos \nmaturados com FF de pacientes controles ( 1%: 19,15%, 5%: 23,44%, 10%: 25%, 15%: \n23,81%) e oócitos maturados sem fluido ( 23,53%), sem haver diferença entre as \nconcentrações testadas  em cada grupo . Pode -se concluir que oócitos bovinos maturados in \nvitro na presença de FF de mulheres inférteis com endometriose leve têm maior freqüência de \nanormalidade meiótica. Estes dados sugerem que o FF de mulheres com endometriose pode \ncomprometer a qualidade oocitária por promover danos ao fuso e/ou cromossomos.  \n \nPalavras-chave: endometriose leve; infertilidade feminina; maturação in vitro ; fluido \nfolicular; fuso meiótico, qualidade oocitária. \n \n\nAbstract \nDA BROI, MG. Follicular fluid fro m infertile women with mild endometriosis may \ncompromise the meiotic spindle of methaphase II oocytes.  Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. \n \nThe mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility  in patients with endometriosis \nhave not been fully elucidated. The i nfertility presented by patients with moderate and severe \ndisease (stages III and IV, respectively) would be partly due to anatomical pelvic changes \nassociated with endometriosis.  However, there are evidences that subtle lesions or \nendometriosis implants  in the early stages  (stages I and II) might also contribute to the \netiophatogenesis of infertility. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation \nrates after in vitro  fertilization in these patients . We question if alterations in the follicular \nmicroenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence \nacquisition and compromise the natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes \nin women with this disease.  It is known that to be competent and capable of fertilizing, the \noocyte must be mature and have a morpholog ically functional spindle, which ensure the \nfidelity of chromosome segregation during meiosis.  Thus, the aim of  this study was to \nevaluate the potential impact of different concentrations of follicular fluid (FF) of infertile \nwomen with and without mild endometriosis on spindle  integrity, chromosomes alignment \nand actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. We performed an \nexperimental study, where FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients \n(11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility ) submitted to \novarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were \nsubmitted to in vitro maturation (IVM) without FF and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, \nand 15%) of 2 samples of FF (1  from a woman with endometriosis and one from a woman \nwithout endometriosis). We performed 11 IV M and each FF sample was used only once. The \noocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of \nmicrotubules, chromatin and actin microfilaments , and  then, analyzed by confocal \nmicroscopy. The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those \nmatured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, \n15%: 48 .84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without \nendometriosis (1%: 19 .15%, 5%: 23 .44%, 10%: 25%, 15%: 23 .81%) and those matured \nwithout FF (23.53%), with no differences among the tested concentrations in each group. We \ncan conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women \nwith mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest \nthat FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting \nspindle and/or chromosomal damage.  \n \nKey words:  mild endometriosis; female infertility; in vitro maturation; follicular fluid;  \nmeiotic spindle, oocyte quality. \n \n \n \n\nLista de figuras \n \n \nFigura 1. Esquema de preparo das diluições a fim de manter a suplementação adequada \ndo meio de maturação.  ..................................................................................................... pág. 38 \n \nFigura 2.  Microscopia Confocal: oócitos em Metáfase I (normal e normal ................... pág. 41 \n \nFigura 3.  Microscopia Confocal: oócitos em Telófase I (normal e normal).  ................ pág. 42 \n \nFigura 4. Microscopia Confocal: o ócitos em Metáfase II  normais, visão sagital e \npolar.  ................................ ................................ ................................ .................   pág. 43 \n \nFigura 5. Microscopia Confocal: oócitos em Metáfase II anormais visão sagital........... pág. 44 \n \nFigura 6.  Microscopia Confocal: o ócitos em Metáfase II anormais visão sagital e \npolar.  ................................ ................................ ................................ .................  pág. 45 \n \nFigura 7.  Microscopia Confocal: o ócitos em Metáfase II anormais visão sagital e \npolar.  ................................ ................................ ................................ .................  pág. 46 \n \n \n \n \n \n\nLista de tabelas \n \n \nTabela 1 - Estágios de maturação nuclear (metáfase I, telófase I e metáfase II) oocitária \nnos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose.  .......................................................... pág.50 \n \nTabela 2 – Porcentagens de oócitos em metáfase II normais e anormais nos grupos Sem \nFluido, Controle e Endometriose.  ..................................................................................... pág.51 \n \n\n \nLista de siglas \nAI – Anáfase I \nASRM – American Society for Reproductive Medicine \nBSA(V) – Albumina sérica bovina fração V \nCA – cromossomos alinhados \nCD – Cromossomos desalinhados \nCG – células da granulosa \nCOC – Complexo cumulus-oócito \nDNA – Ácido desoxirribonucléico \nDTT – Ditiotreitol \nFACA – Fuso anormal e cromossomos alinhados \nFACD – Fuso anormal e cromossomos desalinhados FF – Fluido folicular \nFITC – Fluorocromo isotiocianato \nFIV – Fertilização in vitro \nFMRP – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nFNCA – Fuso normal e cromossomos alinhados \nFNCD – Fuso normal e cromossomos desalinhados \nFP – Fluido peritoneal \nFSH – Hormônio folículo estimulante \nFSHr – Hormônio folículo estimulante recombinante \nGnRHa – Análogo do hormônio liberador de gonadotrofinas \nhCG – Gonadotrofina coriônica humana \nHIV – Vírus da imunodeficiência humana \nICSI – Injeção intracitoplasmática de espermatozóide \n\n \nIL-1 – Interleucina-1  \nIL-1β – Interleucina-1 beta \nIL-6 – Interleucina-6 \nIL-10 – Interleucina-10 \nIMC – Índice de massa corporal \nLH – Hormônio luteinizante \nMgCl2 – Cloreto de magnésio \nMHz – Mega hertz \nMI – Metáfase I \nMII – Metáfase II \nMIV – Maturação in vitro \nMTSB XF – Fixador tampão estabilizador de microtúbulos \nNaCl – Cloreto de sódio \nNaN3 – Azida sódica \nPBS – Tampão Fosfato- salino \nRA – Reprodução assistida \nSFB – Soro fetal bovino \nTFM – Taxa de fecundidade mensal \nTI – Telófase I \nTNF-α –Fator de necrose tumoral alfa \nTRA – Técnicas de reprodução assistida \nUI – Unidade internacional \nUSP – Universidade de São Paulo \nUSTV – Ultrassonografia transvaginal \nVEGF – Fator de crescimento de endotélio vascular \n\n \nSumário \n1. Introdução ........................................................................................................................... 19 \nEndometriose .....................................................................................................................................20 \nEndometriose e Infertilidade ..............................................................................................................21 \nEndometriose e Técnicas de Reprodução Assistida ...........................................................................23 \nMicroambiente folicular.....................................................................................................................23 \nCompetência oocitária .......................................................................................................................25 \n \n2. Justificativa ......................................................................................................................... 28 \n \n3. Objetivos .............................................................................................................................. 31 \n \nObjetivo Geral ....................................................................................................................................32 \nObjetivos Específicos ........................................................................................................................32 \n \n4. Casuística e Métodos .......................................................................................................... 33 \nCritérios de Inclusão ..........................................................................................................................34 \nCritérios de exclusão ..........................................................................................................................34 \nProtocolo de Estimulação ..................................................................................................................35 \nColeta e processamento do fluido folicular........................................................................................36 \nColeta dos complexos cumulus-oócito de bovinos ............................................................................36 \nMaturação in vitro ..............................................................................................................................37 \nFixação dos oócitos ............................................................................................................................38 \nImunofluorescência ............................................................................................................................39 \nAvaliação dos oócitos ........................................................................................................................39 \nAnálise estatística ..............................................................................................................................40 \n \n5. Resultados ........................................................................................................................... 47 \n \n6. Discussão ............................................................................................................................. 52 \n \n7. Conclusões ........................................................................................................................... 59 \n \nReferências Bibliográficas ..................................................................................................... 61 \n \nANEXOS .................................................................................................................................. 66 \nAnexo 1- Termos de Consentimento Livre e Esclarecido ........................................................ 67 \nAnexo 2- Manuscrito ................................................................................................................ 74 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1. Introdução \n \n\nIntrodução  |  20 \nEndometriose \n \nA endometriose é uma doença caracterizada por implante e crescimento de tecido \nendometrial (glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina  (GUPTA et al., 2006). Embora \nassintomática em alguns casos, esta doença pode também se manifestar clinicamente, sendo \nque os d iferentes sintomas apresentados variam de intensidade conforme a paciente \n(BELLELIS et al., 2010). Os implantes endometriais ectópicos podem induzir à ocorrência de \nreação inflamatória crônica, cicatrizes e adesões (SIGNORILE; BALDI, 2010), distorcendo a \nanatomia pélvica e promovendo a ocorrência de dor, dismenorréia e dispaurenia, o que tende \na afetar o bem-estar físico, psicológico e social dessas mulheres.  Além diss o, a endometriose \né freqüentemente associada à infertilidade, sendo que 30 a 50% das suas portadoras são \ninférteis (BULLETTI et al., 2010). \nÉ importante salientar que a endometriose possui alta prevalência, acometendo de 6 a \n10% da população feminina geral (BULLETTI et al., 2010) , além de se r uma das maiores \ncausas ginecológicas de admissões hospitalares nos países industrializados. Estima-se que, em \ntodo o mundo, o número de mulheres com endometriose ultrapasse os 70 milhões \n(BELLELIS et al., 2010) . Dessa forma, tanto por seu impacto na saúde física e psicológica \ndas pacientes (BULLETTI et al., 2010) , como pelo impacto sócio -econômico diante dos \ncustos de diagnóstico e tratamento, esta doença pode ser considerada um problema atual de \nsaúde pública (SIGNORILE; BALDI, 2010) e merece maior atenção.  \nA Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva ( ASRM) classifica a endometriose \nem 4 estágios, conforme a severidade da doença. A presença de focos endometrióticos \nisolados e ausência de aderências significativas caracterizam o estágio I ou endometriose \nmínima, sendo esta a sua forma mais branda. Lesões ectó picas superficiais, com menos de 5 \ncm e ausência de aderências significativas são características do estágio II ou endometriose \nleve, não havendo alterações anatômicas da pelve. Presença de múltiplos implantes \n\nIntrodução  |  21 \nendometrióticos, com aderências peritubárias e  periovarianas evidentes são características do \nestágio III ou endometriose moderada. Já a presença de múltiplos implantes superficiais e \nprofundos, incluindo endometriomas, aderências densas e firmes caracterizam o estágio IV ou \nendometriose grave. (Revised American Society for Reproductive Medicine classification of \nendometriosis: 1996, 1997).  \n \nEndometriose e Infertilidade \n \nUm aspecto muito interessante em portadoras de endometriose é a sua enigmática \nassociação com a infertilidade, observada em grande parte das pacientes  \n(AGARWAL;GUPTA; SHARMA, 2005; AGARWAL;GUPTA; SIKKA, 2006; MINJAREZ; \nSCHLAFF, 2000). A literatura afirma que a taxa de fecundidade mensal (TFM) para casais \nnormais em idade reprodu tiva corresponde a cerca de 30% nos primeiros 3 ciclos e decai a \n4% após 1 ano de tentativas de gestação. Entretanto, a TFM para casais inférteis com \nendometriose varia de 2 a 10% por mês, podendo mesmo a endometriose mínima estar \nassociada à infertilidade (GUPTA et al., 2008).  \nEmbora estudos apoiem o conceito de diminuição de fecundidade nas portadoras desta \ndoença (BULLETTI et al., 2010; GARRIDO et al.,  2002) e muitos mecanismos tenham sido \npropostos para explicar a presença de infertilidade nestas pacientes, entre eles , defeitos \nimunológicos e características al teradas do fluido peritoneal envolvendo citocinas e \nmacrófagos (SUZUKI et al., 2005) , os exatos mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese, \nprincipalmente nos casos de endometriose mínima (estágio I) e leve (estágio II), em que não \nse observa alteração mecânica do trato reprodutivo, ainda não foram precisamente elucidados \n(HOLOCH; LESSEY, 2010).  \nA infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave de \nendometriose (estágios III e IV, respectivamente) poderia ser explicada pela presença de \n\nIntrodução  |  22 \nalterações anatômicas, como adesões pélvicas ou peritubárias que perturbariam a \ncomunicação entre ovário e tuba uterina e, assim, prejudicariam a liberação, captação ou \ntransporte do óvulo (BULLETTI et al., 2010) .  Entretanto, há  crescentes evidências de que \nlesões sutis  ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (est ágios I e II ) também \npoderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade , apesar da ausência de danos \nanatômicos pélvicos. (HOLOCH; LESSEY, 2010).  \nDe acordo c om D’Hooghe et al (2003) , parece haver uma relação causal entre a \npresença de endometriose nas formas leves e a ocorrência de subfertilidade nas suas \nportadoras. Alguns autores relatam uma tendência à  taxa de fecundidade mensal estar  \ndiminuída em mulheres inférteis com  endometriose mínima e leve, em comparação  com \nmulheres com infertilidade sem causa aparente.  Além disso, há evidências de menor  TFM \napós a inseminação  uterina de mulheres com endometriose mínima e leve em comparação \ncom aquelas sem a doença, bem como, de um aumento na TFM e taxa cumulativa de gravidez \napós remoção cirúrgica dos focos de endometriose mínima e leve (D'HOOGHE et al., 2003) . \nEntretanto, há controvérsias a respeito da associação entre endometriose mínima (estágio I) e \ninfertilidade. Segundo Matorras et al (2010), as taxas de gestação são semelhantes quando \ncomparadas mulheres normais e mulheres com endometriose mínima (MATORRAS et al., \n2010). Além disso, alguns autores sugerem que a forma mínima da doença possa estar \npresente em grande parte das mulheres, porém, sem a maioria delas apresentar efeitos sobre a \nfertilidade (HOLOCH; LESSEY, 2010) . Diante destes dados, poderia -se conferir maior \natenção à endometriose leve, a fim de se elucidar os mecanismos envolvidos na sua relação \ncom a infertilidade. \n \n \n\nIntrodução  |  23 \nEndometriose e Técnicas de Reprodução Assistida \n \nNovas abordagens para o tratamento da infertilidade relacionada à endometriose têm \nsurgido, destacando -se a aplicação cada vez mais rotineira das técnicas de reprodução \nassistida (TRA) de alta complexidade, sendo que seus resultados podem ser utilizados como \nimportante ferramenta para o entendimento da etiopatogênese envolvida nesta doença. A \nliteratura apresenta dados contraditórios acerca dos resultados da fertilização in vitro  (FIV) \nem pacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos e hipóteses nos \núltimos anos (GARCIA-VELASCO; ARICI, 1999; GARRIDO et al., 2000; KUMBAK et al., \n2008). Trabalhos sugerem a ocorrência de menores taxas de fertilização, implanta ção e de \ngestação em portadoras dessa afecção (AL-FADHLI et al., 2006; \nBARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002) , o que poderia ser decorrente do \ncomprometimento da qualidade oocitária e, conseqüentemente, embrionária e/ou de defeitos \nendometriais ou da interação entre o endométrio e o embrião (BRIZEK et al., 1995; \nKUMBAK et al., 2008; PELLICER et al., 1995) .  Assim, o comprometimento da qualidade \nembrionária poderia ser decorrente tanto de defeitos relacionados à foliculogênese e qualidade \noocitária, como de eventos posteriores à fertilização (GUERIN;EL MOUATASSIM; \nMENEZO, 2001). \n \nMicroambiente folicular \n \nOs fluidos peritoneal, folicular e de hidrossalpinge são microambientes reprodutivos \nque abrigam gametas, zigotos e embriões por tempo variável, de modo que alterações em sua \ncomposição química podem ter efeitos adversos nos processos reprodutivos. \n(AGARWAL;GUPTA; SHARMA, 2005) \nO microambiente folicular pode ter um papel crítico na qualidade oocitária, \nfertilização e desenvolvimento embrionário. Sabe -se que o fluido folicular, que mantém \n\nIntrodução  |  24 \níntima relação com o oócito durante a fase de crescimento e matur ação celular, constitui um \nmicroambiente metabolicamente ativo, contendo hormônios esteróides, fatores de \ncrescimento, citocinas, espécies reativas, antioxidantes, entre outros, produzidos pelas células \nda granulosa, células endoteliais e leucócitos (ATTARAN et al., 2000; PASQUALOTTO et \nal., 2004).  \nDiferentes estudos avaliando os níveis de constituintes dos fluidos peritoneal  \n(BERBIC et al., 2009; GUPTA et al. , 2008; MANSOUR et al., 2009; MANSOUR et al., \n2010) e f olicular (ANDRADE et al., 2010; JO ZWIK;WOLCZYNSKI; SZAMATOWICZ, \n1999; PELLICER et al., 1998; PELLICER et al., 1998) apontam à existência de alterações em \npacientes com endometriose. Segundo Bulletti et al (2010), mulheres com a doença possuem \num maior volume de fluido peritoneal, com altas concentrações de macrófagos ativados, \nprostaglandinas, interleucina-1 ( IL-1), Fator de necrose tumoral alfa ( TNF-α) e proteases, \npodendo ter efeito adverso na função oocitária, do espermatozóide, embrião, ou trompa de \nfalópio (BULLETTI et al., 2010). Outros estudos evidenciaram diferenças em constituintes do \nfluido folicular, como aumento dos níveis de interleucina-6 ( IL-6), interleucina-10 ( IL-10), \ninterleucina-1 beta (IL-1β), TNF-α e diminuição de fator de crescimento de endotélio vascular \n(VEGF) quando comparadas portadoras de endometriose e controles  (GARRIDO et al., 2000; \nGUPTA et al., 2008; PASQUALOTTO et al., 2004; WUND ER et al., 2005) .  Entretanto, a \nmaioria dos autores não faz distinção entre os estágios de endometriose, o que impossibilita \numa avaliação precisa do papel da progressão da doença sobre a infertilidade.  \nQuestionamos a possibilidade de ocorrência de alguma alteração no microambiente \nfolicular de pacientes inférteis com endometriose, que poderia afetar a aquisição de \ncompetência oocitária  (AGARWAL;GUPTA; SIKKA, 2006; BARCELOS et al., 2009; \nFERREIRA et al., 2009)  e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e os \nresultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença  \n\nIntrodução  |  25 \n(AGARWAL;SALEH; BEDAIWY, 2003; A L-FADHLI et al., 2006; \nBARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002).  \n \nCompetência oocitária \n \nO fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II (MII) é uma estrutura temporária \ne dinâmica, em forma de barril, composta por microtúbulos formados por dímeros de tubulina \nque se polimerizam e despolimeriz am nos diversos estágios do ciclo celular  (CHOI et al., \n2007) e está associada ao córtex oocitário e s ua rede de microfilamentos subcorticais (KIM et \nal., 1998; MANDELBAUM et al., 2004; WANG; KEEFE, 2002) , sendo essencial para \ngarantir a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose (DE SANTIS et al., 2005; \nVAN BLERKOM; DAVIS, 2001; VOLARCIK et al., 1998) . Desta forma, a fecundação e o \ndesenvolvimento embrionário depe ndem da integridade morfológica e funcional desta \nestrutura celular. \nAlém disso, o fuso é  extremamente sensível à ação de diversos fatores \n(EICHENLAUB-RITTER;SHEN; TINNEBERG, 2002; HU et al., 2001; MULLEN et al., \n2004), entre os quais o estresse oxidativo, passível de promover anomalias meióticas, \ninstabilidade cromossômica, aumento da apoptose e comprometimento do desenvolvimento \nembrionário pré-implantação (LIU et al.,  2003; NAVARRO et al., 2006; NAVARRO;LIU; \nKEEFE, 2004) . Estudos avaliando os potenciais mecanismos envolvidos na gênese das \nalterações do fuso celular relacionadas ao estresse oxidativo, evidenciaram que o mesmo pode \ndanificar diversas prot eínas intracelulares  (BERLETT; STADTMAN, 1997; STADTMAN, \n1992), algumas das quais, importantes para a organização do fuso celular (ABRIEU et al., \n2001; ANTONIO et al., 2000; FUNABIKI; MURRAY, 2000)  podendo promover lesões no \nDNA e induzir o inadequado alinhamento cromossômico (BECKMAN; AMES, 1998; \nLIMOLI et al., 1998). \n\nIntrodução  |  26 \nAs anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência do \ndesenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do oócito \nem completar a maturação, tornando -se incapaz de ser fertilizado, até a ocorrência de erros \nque não impossibilitem a fertilização, mas comprometam o desenvolvimento embrionário pré \ne/ou pós -implantação, bem como a viabilidade futura do concepto (ARMSTRONG, 2001; \nLONERGAN et al., 1994; PAVLOK;LUCAS-HAHN; NIEMANN, 1992). \nUm estudo de Mansour et al  (2009) demonstrou que o fluido peritoneal de mulheres \ncom endometriose pode promover anomalias nos microtúbulos e cromossomos de oócitos de \ncamundongos, além de aumento da apoptose embrionária n este modelo animal. Estas \nanomalias foram reduzidas após suplementação do meio de cultivo com L-carnitina, um \nantioxidante, sugerindo que substâncias presentes no fluido peritoneal de portadoras desta \ndoença promovem comprometimento da qualidade oocitária e embrionária, tendo o estresse \noxidativo como provável mediador (MANSOUR et al., 2009). Recentemente, o mesmo grupo \npublicou novo trabalho avaliando o efeito do FP de mulheres com endometriose sobre o \ncitoesqueleto de oócitos de camundongos em MII, sendo novamente encontrada uma maior \nfreqüência de fuso meiótico anormal e cromossomos de salinhados em oócitos incubados com \nfluido destas pacientes, quando comparadas a controles. Além disso, o dano ao citoesqueleto \noocitário foi positivamente correlacionado com a duração da infertilidade e o estágio da \ndoença (MANSOUR et al., 2010) . Estes achados sugerem haver alterações no FP de \nportadoras de endometriose, as quais estariam comprometendo a qualidade oocitária, podendo \no estresse oxidativo ter participação neste processo.  \nEmbora haja trabalhos avaliando o efeito do FP de mulheres com  endometriose sobre \na qualidade oocitária (MANSOUR et al., 2009; MANSOUR et al., 2010) e dosando diferentes \ncomponentes em soro, FF ou FP de pacientes com a doença, não encontramos nenhum estudo \nque tenha avaliado o efeito do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve na \n\nIntrodução  |  27 \ngênese de anomalias meióticas oocitárias. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o \npotencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular de mulheres inférteis com  e \nsem endometriose sobre a gênese de anomalias  meióticas oocitárias, durante maturação in \nvitro (MIV), utilizando modelo experimental bovino. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2. Justificativa \n \n\nJustificativa  |  29 \nA endometriose, doença caracterizada por implante e cr escimento de tecido \nendometrial fora da cavidade uterina  (GUPTA et al., 2006) , apresenta  elevada prevalência \npopulacional (BULLETTI et al., 2010) . Entre suas manifestações clínicas mais \nfreqüentemente relacionadas, destaca -se a infertilidade, presente em 30 a 50% das su as \nportadoras (BULLETTI et al., 2010) , as quais parecem ter uma menor taxa de  fecundidade \nmensal em ciclos naturais (GUPTA et al., 2008) e piores resultados de FIV em tratamentos de \nreprodução assistida  (AL-FADHLI et al., 2006; BARNHART;DUNSMOOR -SU; \nCOUTIFARIS, 2002) quando comparadas a mulheres sem a doença.  \nAlterações anatômicas parecem estar relacionadas à infertilidade em pacientes com as \nformas graves de endometriose (BULLETTI et al., 2010) , porém, em casos de doença leve, \nsem alterações anatômicas pélvicas , os mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese ainda \nnão foram precisamente elucidados (HOLOCH; LESSEY, 2010). \nEmbora haja trabalhos avaliando o efeito do FP de mulheres com endometriose sobre \na qualidade oocitária (MANSOUR et al., 2009; MANSOUR et al., 2010) e dosando diferentes \ncomponentes em soro, FF ou FP de pacientes com a doença, n ão encontramos nenhum estudo \nque tenha avaliado o potencial impacto do fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose leve na gênese de anomalias meióticas oocitárias.  \nA observação de maior incidência de anomalias meióticas em oócitos incubados com \nfluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve poderia colaborar com a \nelucidação dos mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infert ilidade relacionada a este \nestágio da doença, assim como, sugerir uma possível justificativa, ao menos parcial, para as \nmenores taxas de implantação observadas neste grupo de mulheres , abrindo perspectivas para \nnovas abordagens terapêuticas. \nDiante do número reduzido de oócitos huma nos destinados à pesquisa, a \nexperimentação com animais torna -se relevante em estudos de maturação in vitro. Dessa \n\nJustificativa  |  30 \nforma, o uso de modelo experimental bovino neste estudo se justifica pela similaridade no \ntamanho e morfologia dos ovários  humano e bovino, por ambas as espécies serem \nmonovulatórias e policíclicas e por ser um material abundante, barato, de fácil manipulação  \n(MALHI;ADAMS; SINGH, 2005).  \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3. Objetivos \n \n \n\nObjetivos  |  32 \nObjetivo Geral \n \nAvaliar o potencial impacto de diferentes concentrações (15%, 10%, 5%, 1%) de fluido \nfolicular de mulheres inférteis com  endometriose leve  e sem  endometriose submetidas à \nestimulação ovariana controlada para a realização de injeção intracitoplasmática de \nespermatozóide (ICSI) sobre a integridade do fuso celular , a distribuição cromossômica e a \norganização dos microfilamentos de actina oocitários, em modelo experimental bovino. \n \nObjetivos Específicos \n \n1. Comparar o grau de maturidade nuclear oocitária (estágios da Meiose) entre as diferentes \nconcentrações de fluido folicular dentro de cada grupo (endometriose leve e controle). \n2. Comparar o grau de maturidade nuclear oocitária (estágios da Meiose)  de cada \nconcentração de fluido folicular entre os grupos endometriose, controle e sem fluido. \n3. Comparar a integridade do fuso celular, o alinhamento cromossômico e a organização dos \nmicrofilamentos de actina oocitários entre as diferentes concentrações de fluido folicular \ndentro de cada grupo (endometriose leve e controle). \n4. Comparar a integridade do fuso celular, o alinhamento cromossômico e a organização dos \nmicrofilamentos de actina oocitários de cada concentração de fluido f olicular entre os  \ngrupos endometriose leve, controle e sem fluido. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4. Casuística e Métodos \n \n\nCasuística e Métodos  |  34 \nRealizou-se um estudo prospectivo de fevereiro de 2009 a fevereiro de 2011 junto  ao \nSetor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP -USP. \nEste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP) e pela \nComissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \n(FMRP), Universidade de São Paulo (USP).  As pacientes que preencheram os critérios de \ninclusão e manifestaram o desejo de participar do projeto  e concordaram em ceder amostras de \nfluido folicular, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1) previamente \nà inclusão no estudo. \n \nCritérios de Inclusão \nNo grupo endometriose, foram selecionadas pacientes com infertilidade associada à \nendometriose diagnosticada e classificada por videolaparoscopia (segundo os critérios da \nAmerican Society for Reproductive Medicine, 1997), com estadiamento da doença definid o \ncomo grau II (endometriose leve). No grupo controle, incluíram-se pacientes apenas com \ninfertilidade por fator masculino e/ou tubário. Todas as pacientes do grupo controle foram \nsubmetidas à videolaparoscopia diagnóstica como procedimento de rotina para investigação da \ninfertilidade conjugal, sendo excluída a presença de endometriose. \n \nCritérios de exclusão \nForam critérios de exclusão: idade maior ou igual a 38 anos, índice de massa corporal \n(IMC) maior que 30 Kg/m², nível sérico de hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro dia \ndo ciclo menstrual maior ou igual a 10mUI/ml, anovulação crônica, presença de hidrossalpinge \ne doenças crônicas como diabetes m ellitus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, \n\nCasuística e Métodos  |  35 \ndislipidemia, lupus eritematoso sistêmico  e outras doenças reumatológicas, infecção pelo vírus \nHIV, qualquer infecção ativa, tabagismo, uso constante de medicações hormonais e de \nantiinflamatórios hormonais e não-hormonais nos seis meses anteriores à inclusão no estudo.  \n \nProtocolo de Estimulação \nCom o objetivo de sincronizar e programar o início do ciclo de estimulação ovariana \ncontrolada utilizou-se a programação da menstruação, que consiste em se administrar diariamente \nanticoncepcionais orais combinados, iniciados no período menstrual do ciclo precedente até cinco \ndias antes do previsto para o início da estimulação ovariana, suspendendo sua administração de tal \nforma que o início do sangramento menstrual coincida com a realização da ultrassonografia \ntransvaginal (USTV) basal para se observar o padrão endometrial e afastar a presença de cistos \novarianos que pudessem interferir na resposta à administração das gonadotrofinas exógenas e na \nmonitorização ultrassonográfica do crescimento folicular. \nO bloqueio hipofisário com análogo do hormônio libera dor de gonadotrofinas \n(GnRHa) foi iniciado 10 dias antes do dia de realização da USTV basal (protocolo longo), no \nperíodo vespertino, por meio da  administração de acetato de leuprolide (Lupron®, Abott, \nBrasil; Reliser®, Serono, Brasil) na dose de 0,5mg/di a (10 UI), por via subcutânea, mantida \ndurante todo o período de estimulação ovariana controlada até o dia da administração da \ngonadotrofina coriônica humana (hCG) (Ovidrel®, Serono, Brasil). \nA hiperestimulação ovariana controlada foi iniciada entre o segu ndo e o quarto dia do \nciclo menstrual. As pacientes receberam 150 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSHr) \n(Gonal-F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Brasil), via intramuscular, nos primeiros 6 \ndias da indução. A partir do sétimo dia da indução da ov ulação, a dose foi ajustada de acordo \ncom o crescimento folicular e a espessura endometrial, monitorados com USTV diariamente \nou em dias alternados. \n\nCasuística e Métodos  |  36 \nNa presença de, pelo menos, dois folículos com 18 mm de diâmetro médio, foram \nadministrados 250 µg de hCG r ecombinante (Ovidrel®, Serono, Brasil) às 22:00. A captação \ndos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante.  \n \nColeta e processamento do fluido folicular \nCerca de 34 a 36 horas após a administração do hCG, as pacientes foram submetidas à \ncaptação oocitária, sob sedação endovenosa com propofol. A aspiração folicular foi realizada por \nmeio de ultra-sonografia com transdutor transvaginal de 5 MHz, acoplado a guia de punção.  \nPara a coleta de fluido folicular, utilizaram -se tubos estéreis, individuais, aquecidos a \n37°C, sem meio de cultura. Foi aspirado todo o conteúdo do primeiro folículo com diâmetro \nmédio ≥ 15 mm do primeiro ovário puncionado de cada paciente. Apenas os f luidos \nfoliculares livres de contaminação sanguínea à inspeção visual e que apresentaram células da \ngranulosa (CG) ou células da granulosa e um oócito maduro foram selecionados para o \ntrabalho. Desta forma, não foram incluídas no estudo amostras de fluido folicular contaminadas com \nsangue ou meio de cultivo, ou que não continham CG e/ou oócitos maduros. \nAs amostras de fluido foram centrifugadas a 1500 rpm por 7 minutos e armazenadas a - \n80°C, em tubo individual, para posterior utilização nos experimentos.  \n \nColeta dos complexos cumulus-oócito de bovinos \nOs ovários, provenientes de vacas abatidas em frigorífico, foram imediatamente \ntransportados ao laboratório, mantidos em solução fisiológica (0,9% NaCl) acrescida de 0,05 \ng/L de sulfato de estreptomicina, a u ma temperatura de  35 -38,5°C. Posteriormente, foram \nborrifados com álcool 70%, lavados em solução fisiológica pré -aquecida a 38,5ºC e mantidos \nnesta mesma solução, em banho-maria, até o final da aspiração. Os complexos cumulus-oócito \n\nCasuística e Métodos  |  37 \n(COC) imaturos foram aspirados de folículos de 2 a 8 mm de diâmetro, utilizando -se agulhas \n25 x 7 acopladas a seringas de 20ml e, então, sele cionados sob estereomicroscópio em placas \nde Petri de 100 mm contendo o meio de lavagem Talp Hepes. Para o cultivo in vitro, somente \nos COCs morfologicamente saudáveis foram selecionados, ou seja, aqueles com citoplasma \nhomogêneo e pelo menos três camadas de células do cumulus-oophorus.  \n \nMaturação in vitro \nUtilizou-se o meio de maturação padrão TCM -199 com sais Earle e bicarbonato \n(Invitrogen, Gibco Laboratories Life Techonogies Inc., Grand Island, NY), suplementado com \n0,2 µM de piruvato, 100 UI/ml de Penicilina, 0,1 mg/ml de Estreptomicina, 0,5 µg/ml de \nFSH, 5,0 µg/ml de LH e 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (FERREIRA et al., 2009).  \nA fim de  manter a concentração adequada de suplementação após a adição de fluido \nfolicular, eliminando-se, assim, o efeito da diluição d os suplementos, optou-se por preparar \num TCM 15% mais concentrado, ao qual, de acordo com cada diluição, foi adicionado fluido \nfolicular e/ou meio TCM filtrado não suplementado, conforme esquema apresentado na figura \n1.   \nImediatamente após a seleção, os COCs foram randomicamente divididos em 9 \ngrupos: 1) COC s cultivados em meio padrão (sem suplementação de fluido folicular); 2) \nCOCs cultivados em meio padrão + fluido folicular de mulheres com endometriose  leve nas \nconcentrações 15%, 10%, 5% e 1%; 3) COC s cultivados em meio padrão + fluido folicular \ndas pacientes controle nas c oncentrações 15%, 10%, 5% e 1%. O cultivo foi feito em  placas \nNunc de 24 poços , em um volume total de 200 µl de meio ou meio acrescido de fluido \nfolicular, sem óleo mineral, a 38,5°C, 95% de umidade, 5% de CO 2 em ar, por um período de \n22 a 24 horas. Após a maturação, os oócitos foram desnudados por agitação mecânica, em \nmeio tamponado Talp Hepes. \n\nCasuística e Métodos  |  38 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFigura 1.  Esquema de preparo das diluições a fim de manter a concentração adequada de \nsuplementação após a adição de fluido folicular. \n \n \nFixação dos oócitos \nOcorrido o desnudamento, os oócitos foram colocados em solução fixadora MTSB  \nXF, composta por 1X de Tampão E stabilizador (0,1M de Pipes, 5mM de MgCl 2 e 2,5mM de \nEGTA), 50% de Óxido de Deutério, 0,01% de Aprotinina de pulmão bovino, 1 mM  de DTT, \n1 μM de Taxol, 0,5% de Triton -X, 2% de Formaldeído e água de MilliQ, aquecida \npreviamente por 30 minutos em estufa a 37°C, permanecendo nesta solução a 4°C até  o \nprocessamento da imunofluorescência e confecção das lâminas. \n \n\nCasuística e Métodos  |  39 \nImunofluorescência \nOs oócitos previamente fixados foram lavados em solução tampão composta por 0,02% de \nNaN3, 0,01% de Triton -X, 0,2% de leite desnatado, 2% de Soro Normal de Cabra, 0,1M de \nGlicina, 2% de BSA(V) e tampão PBS, onde permaneceram a 4°C overnight. Passado esse \nperíodo, foram novamente lavados em solução tampão e incubados overnight, a 4°C, com o \nanticorpo primário anti-β-tubulina de camundongo (diluição 1:1000). Após nova lavagem em \nsolução tampão, foram incubados com o anticorpo secundário imunoglobulina de cabra a nti-\ncamundongo conjugada com Fluoresceína isotiocianato (FITC) (Zymed Laboratories, Invitrogen \nCorporation, Calsbad, CA, USA, diluição 1:500) por 2 horas a 37°C.  Depois de lavadas, as \namostras foram marcadas para os filamentos de actina com faloidina conj ugada a rodamina \n(1:1000), lavadas novamente e, então, os cromossomos foram marcados com Hoechst 33342 (10 \nµg/ml), em meio de montagem composto por 50% de glicerol e 25 mg/ml de NaN3, durante 10 \nminutos, à temperatura ambiente e montados entre lâmina e lamínula. \nAs lâminas foram estocadas a 4°C até observação em Microscópio Confocal Leica \nTCS SP5 (Leica Microsystems, Mannheim, Germany), sendo 7 dias o intervalo máximo entre \na confecção e a leitura das  mesmas. \n \nAvaliação dos oócitos  \nOs oócitos visualizados foram, primeiramente, classificados quanto à fase da divisão \nmeiótica em que se encontravam : metáfase I (MI - Figura 2), anáfase I (AI), telófase I ( TI - \nFigura 3) ou metáfase II (MII  – Figuras 4, 5, 6 e 7). Posteriormente, aqueles em MII  foram \nclassificados quanto à posição de visualização do fuso meiótico, sendo considerados fusos \nanalisáveis apenas aqueles em visão sagital, permitindo avaliação global de fuso , \ncromossomos e microfilamentos de actina  (Figura 4A e 4B). Aqueles em visão polar foram \nconsiderados não analisáveis devido à impossibilidade de avaliação dos microtúbulos, tendo \n\nCasuística e Métodos  |  40 \napenas os cromossomos e microfilamentos de actina analisados (Figura 4C e 4D). Os oócitos \nconsiderados analisáveis foram avaliados quan to à integridade do fuso (microtúbulos), \nalinhamento e condensação dos cromossomos e organização dos microfilamentos de actina , \nenquanto os não analisáveis foram avaliados apenas quanto ao alinhamento e condensação \ndos cromossomos e organização dos microfilamentos de actina. \nConsiderou-se o fuso como normal quando em forma de barril, com pólos definidos e \ntamanho adequado (Figura 4A e 4B), e anormal quando desorganizado, com tamanho e forma \nanormais, integridade comprometida  e/ou pólos não -definidos (Figuras 5, 6 e 7 ). Os \ncromossomos foram considerados normais quando alinhados na placa metafásica  (Figura 4) e \nanormais quando desalinhados ( Figuras 5, 6 e 7 ). Os microfilamentos de actina foram \nconsiderados normais quando distribuídos homogeneamente no citoplasma oocitário  (Figura \n4) e anormais, quando superconcentrados na região do fuso (Figuras 7A e 7D). \nOs fluidos foliculares utilizados nas maturações in vitro  foram provenientes de 22 \npacientes inférteis, sendo 11 com endometriose leve e 11 com fator masculino e/ou tubário.  \n \nAnálise estatística \nAs análises foram realizadas pelo procedimento GENMOD do programa estatístico \nSAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). \nPara comparação inter e intra -grupos das variáveis de contagem (oócitos em MI, TI e \nMII, actina normal) considerou-se a Distribuição de Poisson. \nPara comparação inter e intra-grupos das variáveis de porcentagem (proporção de fuso \nnormal e cromossomos alinhados, fuso normal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e \ncromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados, cromossomos alinhados, \ncromossomos desalinhados, total de normais e total de anormais) utilizou-se a Distribuição Gama.  \nFoi considerado significativo p<0,05. \n\nCasuística e Métodos  |  41 \n \nFigura 2. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos \n(azul) e microfilamentos de actina (ver melho), em oócitos bovinos em Metáfase  I. A - \nMetáfase I normal (visão polar). B - Metáfase I anormal  (visão polar). C - Metáfase I normal (visão \nsagital). D- Metáfase I anormal (visão sagital). \n \n\n\nCasuística e Métodos  |  42 \n \nFigura 3. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e \nmicrofilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Telófase I. A e C - Telófase I normal . \nB e D- Telófase I anormal. \n\n\nCasuística e Métodos  |  43 \n \nFigura 4. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e \nmicrofilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II normal.A e B: Fuso normal \ne cromossomos alinhados (visão sagital). C e D: Cromossomos alinhados (visão polar). \n \n \n \nA e C: Telófase I normal. B e D: Telófase I anormal.  \n\nCasuística e Métodos  |  44 \n \nFigura 5. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e \nmicrofilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II  anormal. A-D: Fuso \nanormal e cromossomos desalinhados (visão sagital).  \n \n \n \n \n \n \n \n\n\nCasuística e Métodos  |  45 \n \nFigura 6. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e \nmicrofilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II anormal.  A e C: \nCromossomos desalinhados / anormais (visão  polar). B: Fuso anormal e cromossomos alinhados \n(visão sagital).  D: Fuso anormal e cromossomos desalinhados (visão sagital).  \n \n \n \n \nB \n\nCasuística e Métodos  |  46 \n \nFigura 7. Imagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e \nmicrofilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II anormal.  A: Fuso anormal, \ncromossomos desalinhados e actina anormal (visão sagital). B: Fuso an ormal, cromossomos alinhados \n(visão sagital).  C: Cromossomos anormais (visão polar). D: actina anormal, cromossomos anormais \n(visão polar).   \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5. Resultados \n \n\nResultados  |  48 \nOs resultados obtidos são apresentados nas tabelas 1 e 2. \nUm total de  1324 complexos cummulus-oócito foram maturados in vitro, \nrandomicamente divididos entre os 9 grupos ( sem fluido, FF controle nas concentrações 1%, \n5%, 10% e 15% e FF endometriose nas concentrações 1%, 5%, 10% e 15%). Deste total, 1128 \nforam fixados e 1038 visualizados em microscopia confocal. Um total de 921 oócitos foi \nclassificado em MII, sendo 466 considerados com fuso analisável (visão sagital) e 455 com \nfuso não-analisável (visão polar, apenas avaliação de cromossomos e actina).  \nNão houve diferença significativa para nenhuma das variáveis analisadas quando \ncomparadas as concentrações de fluido folicular de mulheres com endometriose  entre si. Da \nmesma forma, não se encontrou diferença significativa para nenhuma das variáveis analisadas \nquando comparadas as concentrações de fluido folicular de pacientes controles  entre si  \n(Tabelas 1 e 2). \nCom relação ao estágio de maturação, não foi observada diferença significativa no  \ntotal de oócitos em TI,  MI e MII entre os grupos endometriose, controle e sem fluido, bem \ncomo, não houve diferença significativa entre os grupos quanto à porcentagem de oócitos \nnormais nos estágios MI e TI (Tabela 1). \nNão se encontrou oócitos em AI em nenhum dos grupos estudados. \nDaqueles em estágio de MII, quando considerados conjuntamente os oócitos  \nanalisáveis e não analisáveis ( em visão sagital e visão polar, respectivamente), não houve \ndiferença significativa na s porcentagens de normalidade (fuso normal + cromossomos \nalinhados e cromossomos alinhados) entre os grupos  endometriose, controle e sem fluido \n(Tabela 2). \nQuando considerados apenas os oócitos MII analisáveis (visão sagital), foi encontrado \nmaior percentual de anormalidades meióticas (fuso anormal + cromossomos alinhado s, fuso \nanormal + cromossomos desalinhados, fuso normal + cromossomos desalinhados) nos oócitos \n\nResultados  |  49 \nmaturados em meio padrão acrescido de fluido folicular de mulheres com endometriose  leve \nquando comparados aos maturados em meio padrão acrescido de fluido foli cular de mulheres \ncontrole e àqueles maturados sem adição de fluido (p<0,01). Consequentemente, houve uma \nmaior porcentagem de fuso + distribuição cromossômica normais entre os oócitos do grupo \ncontrole com relação aos do grupo endometriose , entretanto, se m apresentar diferença \nsignificativa para o grupo sem fluido (p<0,01). Da mesma forma, encontrou-se \nsignificativamente maior porcentagem de  oócitos com fuso e distribuição cromossômica \nnormais entre os maturados em meio padrão (sem fluido) quando comparado s aos maturados \nem meio padrão acrescido de fluido folicular de mulheres com endometriose  leve (p<0,01). \n(Tabela 2) \nNão foi encontrada diferença significativa na distribuição cromossômica normal de \noócitos em visão polar entre nenhum dos grupos estudados ( Tabela 2) . A análise das \nanormalidades dos oócitos em visão polar (CD) não convergiu devido ao pequeno número de \nocorrências.  \nNão foi encontrada diferença significativa para a organização dos microfilamentos de \nactina entre os grupos. \n\nResultados  |  50 \nTabela1 – Estágios de maturação nuclear (metáfase I, telófase I e metáfase II) oocitária nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. \n Concentração FF (%) Total Oócitos fixados (n) Total oócitos \nvisualizados (n) \nMetáfase I Telófase I Metáfase II \nTotal  Normal n (%) Total  Normal \nn (%) Total \nSem \nFluido  \n0 119 115 9 (7,82) 7 (77,78) 6 (5,22) 5 (83,34) 100 (86,96) \nFF Controle \n1 129 117 6 (5,12) 6 (100) 4 (3,42) 2 (50) 107 (91,46) \n5 133 118 4 (3,38) 4 (100) 1 (0,85) 1 (100) 113 (95,77) \n10 126 119 13 (10,92) 8 (61,54) 5 (4,20) 4 (80) 101 (84,88) \n15 124 111 6 (5,40) 4 (66,67) 4 (3,60) 2 (50) 101 (91) \nFF Endometriose \n1 125 115 12 (10,43) 8 (66,67) 2 (1,74) 1 (50) 101 (87,83) \n5 124 113 16 (14,16) 8 (50) 1 (0,088) 0 96 (84,96) \n10 125 118 13 (11,01) 11 (84,62) 2 (1,70) 2 (100) 103 (87,29) \n15 123 112 9 (8,03) 6 (66,67) 4 (3,58) 3 (75) 99 (88,39) \nNota. Não houve diferença significativa entre os grupos. Nível de significância de 5%. \n\nResultados  |  51 \nTabela 2 – Porcentagens de oócitos em metáfase II normais e anormais nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. \n \nConcentração FF (%) Total de MII \nAnalisáveis Não Analisáveis \nTotal \nn (%) \nNormais Anormais n (%) \nTotal \nn (%) \nNormais Anormais \n FNCA \nn (%) \nTotal \nn (%) \nFACA \nn (%) \nFACD \nn (%) \nFNCD \nn (%) \nCA \nn (%) \nCD \nn (%) \nSem \nFluido \n0 100 51 (51) 39 (76,47) 12 (23,53) 3 (25) 6 (50) 3 (25) 49 (49) 49 (100) 0 \nFF Controle 1 107 47 (43,93) 38 (80,85) 9 (19,15) 3 (33,33) 6 (66,67) 0 60 (56,07) 59 (98,33) 1 (1,67) \n5 113 64 (56,64) 49 (76,56) 15 (23,44) 6 (40) 8 (53,34) 1 (6,66) 49 (43,36) 48 (97,96) 1 (2,04) \n10 101 60 (59,40) 45 (75) 15 (25) 6 (40) 7 (46,67) 2 (13,33) 41 (40,60) 40 (97,56) 1 (2,44) \n15 101 63 (62,38) 48 (76,19) 15 (23,81) 8 (53,34) 6  (40) 1 (6,66) 38 (37,62) 38 (100) 0 \nFF Endometriose \n1 101 45 (44,55) 20 (44,44) 25 (55,56) 9 (36) 15(60) 1 (4) 56 (55,45) 52 (92,56) 4 (7,14) \n5 96 49 (51,04) 18 (36,74) 31 (63,26) 17 (54,84) 14 (45,16) 0 47 (48,96) 45 (95,75) 2 (4,25) \n10 103 44 (42,72) 20 (45,46) 24 (54,54) 12 (50) 12(50) 0 59 (57,28) 59 (100) 0 \n15 99 43 (43,43) 22 (51,16) 21 (48,84) 11 (52,38) 9 (42,85) 1 (4,77) 56 (56,57) 55 (98,21) 1 (1,79) \n \nNota. Analisáveis: oócitos com fuso em visão sagital. Não analisáveis: oócitos com fuso em visão polar. FNCA: fuso normal e cromossomos alinhados. \nFACA: fuso anormal e cromossomos alinhados. FACD: fuso anormal e cromossomos desalinhados. FNCD: fuso normal e cromossomos de salinhados. CA: \ncromossomos alinhados. CD: cromossomos desalinhados. \n p<0,01 quando comparados FNCA e total de anormais entre os grupos Controle e Endometriose e entre os grupos Sem Fluido e Endo metriose nas \nconcentrações 1%, 5%, 10% e 15%. A análise dos CD não convergiu. \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6. Discussão \n \n\nDiscussão  |  53 \nA endometriose  é uma  doença caracterizada por implante e crescimento de tecido \nendometrial ectópico (GUPTA et al., 2006) , destacando-se a infertilidade  como uma de suas \nmanifestações clínicas mais freqüentes (BULLETTI et al., 2010) . Entretanto, os mecanismos \nenvolvidos na sua etiopatogênese, principalmente  nos casos de doença mínima e leve , ainda \nnão foram precisamente elucidados (HOLOCH; LESSEY, 2010). Sendo o ambiente folicular \nextremamente importante para o processo de ma turação oocitária, possíveis alterações nos \ncomponentes do fluido folicular podem ter influência sobre maturidade e qualidade oocitárias \ne, assim, afetar fertilização, desenvolvimento embrionário inicial e taxas de gestação  (MA et \nal., 2010), o que poderia explicar, parcialmente, a infertilidade e os piores resultados nos TRA \napresentados por mulheres com endometriose.  \n Embora haja trabalhos reportando o efeito do fluido peritoneal  de mulheres com \nendometriose sobre a qualidade oocitária  (MANSOUR et al., 2009; MANSOUR et al., 2010)  \ne diferenças nos níveis de  componentes em soro  (ANDRADE et al., 2010; CAMPOS \nPETEAN et al., 2008; JACKSON et al., 2005) , fluido folicular  (ATTARAN et al., 2000; \nBEDAIWY et al., 2007; CAMPOS PETEAN et al., 2008; GARRIDO et al., 2000; \nPASQUALOTTO et al., 2004; WIENER -MEGNAZI et al., 2004)  ou fluido peritoneal  \n(BULLETTI et al., 2010; FUJII;NAKAYAMA; NAKAGAWA, 2008; GUPTA et al., 2008; \nMINICI et al., 2008)  de pacientes com a doença, não se encontrou nenhum estudo que tenha \navaliado o efeito do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sobre fuso , \ncromossomos e microfilamentos de actina oocitários. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi \navaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular de mulheres \ninférteis com e sem endometriose sobre a gênese de anomalias meióticas oocitárias, durante \nmaturação in vitro (MIV), utilizando modelo experimenta l bovino. Diante da inconsistência \ndos dados relacionando endometriose mínima e infertilidade  (HOLOCH; LESSEY, 2010; \n\nDiscussão  |  54 \nMATORRAS et al., 2010) , o presente estudo restringiu -se a apenas avaliar o efeito do fluido \nfolicular de mulheres com endometriose leve sobre qualidade oocitária. \nÉ importante salientar que, idealmente, para correlacionar a presença de \nanormalidades meióticas oocitárias com o ambiente folicular na endometriose , o fuso celular, \na distribuição cromossômica  e os microfilamentos de actina  deveriam ser analisad os em \noócitos humanos maturados in vivo  (BARCELOS et a l., 2009) . Entretanto, d iante da baixa \nquantidade de oócitos captados em MII, do número reduzido de oócitos humanos destinados à \npesquisa, e, sendo a análise por imunofluorescência um método invasivo que necessita de \nfixação da amostra, a utilização de modelo animal  tornou-se importante alternativa  neste \nestudo. O uso d e oócitos  bovinos pode ser justificado  pela similaridade no tamanho e \nmorfologia dos ovários humanos e bovinos, por ambas as espécies serem monovulatórias e \npolicíclicas e por ser um material abundante, barato, de fácil manipulação  (MALHI;ADAMS; \nSINGH, 2005) .  Sabe-se, também, que a  maturação in vitro , por si só , pode promover \naumento significativo da ocorrência de anormalidades meióticas oocitárias  (BARCELOS et \nal., 2009). Todavia, a mesma metodologia de MIV foi aplicada para os três diferentes grupos, \nde modo que as diferenças encontradas provavelmente são decorrentes de diferenças nos \nconstituintes do fluido folicular (obtidos das mulheres inférteis c om endometriose leve e \ncontroles: fatores masculino e/ou tubário) e não devido ao processo de maturação in vitro. \n De acordo com os resultados obtidos, não foi observad a diferença significativa no \nnúmero de o ócitos em estágio de MI, TI e MII entre os grupos,  o que demonstra não haver \ncomprometimento da maturação nuclear dos oócitos cultivados com adição de FF de mulheres \ncom endometriose leve. Estes achados discordam de outro estudo anteriormente realizado no \nmesmo serviço de RA , que av aliou maturação, integridade do fuso meiótico e distribuição \ncromossômica de oócitos de mulheres inférteis com endometriose e controles maturados in \nvitro e encontrou uma tendência a maior proporção de oócitos em telófase I no grupo \n\nDiscussão  |  55 \nendometriose, apesar de  não ter evidenciado anomalias meióticas, o que sugere  possível \nretardo no processo de meiose  I (BARCELOS et al., 2009) . Entretanto, Barcelos et al (2009) \nnão analisaram separadamente os diferentes est ágios de endometriose . No referido estudo \nforam incluídos na análise oócitos maturados in vitro  oriundos de ciclos estimulados de \nmulheres inférteis com endometriose mínima, leve, moderada e grave, de modo que  a \nseveridade da doença pode ter sido responsáv el pelo atraso na maturação, o que explicaria \nesta divergência.  \n Quando avaliada a estrutura de divisão celular de oócitos em MII com visão sagital, \nobservou-se maior porcentagem de anormalidades meióticas entre aqueles maturados com FF \nde pacientes com endometriose leve quando comparados aos maturados com FF de mulheres \nsem a doença ou em meio de cultivo padrão apenas. A hipótese de que a qualidade oocitária \npode ser prejudicada em mulheres com endometriose não é nova, mas não há um consenso \ngeral a resp eito. De acordo com  Gianaroli et al (2010) , o tipo de infertilidade tem efeito \nsignificativo sobre erros meióticos oocitários, sendo estes com maior incidência na presença \nde endometriose ou fator ovulatório  (GIANAROLI et al., 2010) , o que foi confirmado pelo \npresente estudo com relação à endometriose.  Um estudo de Mansour et al (2009) demonstrou \nque o fluido peritoneal de mulheres com endometriose pode promover anomalias nos \nmicrotúbulos e cromossomos de oócitos de camundongos  maturados in vivo, as quais foram \nreduzidas após suplementação do meio de cultivo com o antioxidante L-carnitina, sugerindo \nque componentes presentes no fluido peritoneal de portadoras desta doença promove riam \ncomprometimento da qualidade oocitária e embrionária, tendo o estresse oxidativo como \nprovável mediador. Recentemente, o mesmo grupo publicou novo trabalho avaliando o efeito \ndo FP de mulheres com endometriose sobre o citoesqueleto de oócitos de camundongos em \nMII, sendo novamente encontrada uma maior freqüência de fuso meiótico anormal e \ncromossomos desalinhados em oócitos incubados com fluido desta s pacientes  quando \n\nDiscussão  |  56 \ncomparadas a controles  (MANSOUR et al., 2010) . Como o o ócito permanece no \nmicroambiente folicular durante o processo de maturação, em íntim a relação com o fluido \nfolicular e mantém contato com FP após a ovulação e durante o trajeto inicial pela tuba \nuterina (MA et al., 2010) , os efeitos destes dois microambientes poderiam se somar e \npromover possível efeito cumulativo sobre a estrutura de divisão meiótica.  Assim, os achados \ndo presente estudo , evidenciando que oócitos bovinos imaturos submetidos à maturação in \nvitro na presença de fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve apresentam \nmaior freqüência de anomalias meióticas  do que os maturados na ausência de  fluido folicular \nou na presença de fluido folicular de mulheres inférteis sem a doença,  corroboram os de \nMansour et al (2009, 2010) e agregam mais evidências à literatura acerca do potencial efeito \ndeletério destes dois microambientes reprodutivos de mulh eres inférteis com endometriose \nsobre a gênese de anomalias meióticas oocitárias, contribuindo para o entendimento de mais \num possível mecanismo da infertilidade relacionada à endometriose. Por outro lado, os \nresultados do presente estudo contrariam os obtidos por Barcelos et al  (2009), os quais não \ndemonstraram diferenças significativas na freqüência de anormalidades meióticas entre \noócitos em MII de pacientes com endometriose versus controles. Porém, estes autores \nutilizaram oócitos humanos maturados in vitro, oriundos de ciclos estimulados de mulheres \ninférteis com diferentes estágios de endometriose, incluindo uma pequena casuística, não \nsendo passível extrapolarmos os dados obtidos em virtude destas diferenças metodológicas e \npotenciais viéses. \nÉ importante salientar que os efeitos deletérios sobre a estrutura de divisão meiótica \noocitária encontrados foram promovidos diante da incubação com fluidos foliculares  apenas \nde pacientes com endometriose leve, indicando haver possível relação entre este estágio da \ndoença e infertilidade, de modo que estes achados poderiam justificar os piores resultados de \nRA em portadora s da doença, como conseqüência de um comprometimento da aquisição de \n\nDiscussão  |  57 \ncompetência e, assim, piora da qualidade oocitárias. Dessa forma, o presente estudo corrobora \na hipótese de D’Hooghe et al (2003), que afirma haver evidências de uma relação causal entre \na presença de endometriose nas formas leves e a ocorrên cia de subfertilidade nas suas \nportadoras (D'HOOGHE et al., 2003). \nSendo o fuso celular essencial para garantir a fidelidade da segregação cromossômica \ndurante a meiose (DE SANTIS et al., 2005; VAN BLERKOM; DAVIS, 2001; VOLARCIK et \nal., 1998)  e podendo as anomalias meióticas contribuir para a inabilidade do oócito em \ncompletar a maturação tornando-se incapaz de ser fertilizado,  assim como, para a ocorrência \nde erros  que não impossibilitem a fertilização, mas comprometam o desenvolvimento \nembrionário pré e/ou pós -implantação ou a viabilidade futura do concepto (ARMSTRONG, \n2001; LONERGAN et al., 1994; PAVLOK;LUCAS -HAHN; NIEMANN, 1992) , as \nanormalidades meióticas encontradas neste estudo podem ser a explicação para os  relatados \npiores resultados de RA em pacientes com a doença (AL-FADHLI et al., 2006; \nBARNHART;DUNSMOOR-SU; COUTIFARIS, 2002).  \nO fato de não ter se encontrado diferença significativa para a frequência de  \ndistribuição cromossômica normal quando avaliados os oócitos em MII com visão polar pode \nser explicado pela impossibilidade de análise fidedigna do fuso e cromossomos nesta posição. \nPor outro lado, os danos cromossômicos podem não aparecer necessariamente n este estágio \nda meiose e só se tornarem evidentes nos estágios seguintes, com segregação inadequada das \ncromátides-irmãs (FRAGOULI et al., 2011) . Como não se encontrou diferença para \nporcentagem de normalidade quando avaliados conjuntamente os oócitos em visão polar e \nsagital, apenas havendo diferença significativa desta variável para os oócitos em visão sagital, \nsugere-se que a posição do fuso seja extremamente importante para a avaliação da divisão \ncelular, de modo que a visão polar parece mascarar os danos aos microtúbulos e/ou \ncromossomos possivelmente observados em visão sagital.  \n\nDiscussão  |  58 \nCom relação às concentrações de fluido folicular testadas, não foi observada diferença \nsignificativa na freqüência de normalidade do fuso em MII entre 1%, 5%, 10% e 15% de \nfluido folicular no grupo endometriose, ass im como, no grupo controle, evidenciando que as \nconcentrações não interferiram nos resultados e podendo-se inferir que 1% de FF de pacientes \ncom endometriose é a menor concentração testada capaz de promover dano meiótico e, \npossivelmente, comprometer a qualidade oocitária em mulheres com endometriose leve.  \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n7. Conclusões \n  \n \n\nConclusões  |  60 \n A adição de fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à \nestimulação da ovulação, nas quatro con centrações utilizadas, não promo veu atraso ou \nbloqueio no processo de maturação oocitária em modelo experimental bovino. \n Observou-se um efeito deletério do fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose leve sobre o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de oócitos bovinos em \nMII, submetidos à MIV na presença de FF. Não se observou diferença significativa nas \nfreqüências de anomalias meióticas encontradas nas quatro concentrações de fluido folicular \n(1%, 5%, 10% e 15%) adicionadas ao meio de cultivo padrão, de modo que o efeito não foi \ndependente da concentração utilizada. Assim, 1% de fluido folicular apresentou -se como a \nmenor concentração testada capaz de promover aumento significativo na freqüência de danos \nmeióticos oocitários.  \n O fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à \nestimulação ovariana, adicionado ao meio de maturação in vitro de oócitos bovinos, é capaz \nde promover anomalias meióticas, o que pode ocasionar potencial piora da qualidade \noocitária. Sugerimos que este mecanismo possa estar envolvido tanto na redução da \nfecundidade, como na piora dos resultados dos procedimentos de  reprodução assistida em \nportadoras de infertilidade relacionada à endometriose leve, o que precisa ser avaliado com \nmetodologias pertinentes.  \nFuturos estudos, com maior casuística, que analisem possíveis componentes alterados  \nno fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose, correlacionem esses dados com os \nresultados de RA dessas pacientes, dosem diferentes marcadores de estresse oxidativo no FF e \nproponham a  adição de antioxidantes às MIVs , são imprescindíveis para se tentar elucidar \npotenciais fatores promotores dos danos meióticos  oocitários encontrados no presente estudo, \nem decorrência da adição de FF de mulheres com a doença ao meio de maturação.  \n.  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n Referências Bibliográficas \n \n\nReferências Bibliográficas  |  62 \nABRIEU, A. et al. 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Salles Navarro \n \n Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada “Avaliação do potencial \nimpacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese \nde anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando modelo \nexperimental bovino” \n Sabemos que o estresse oxidativo (que aparece quando ocorre um desequilíbrio entre as \ndefesas antioxidantes e a produção de espécies reativas) compromete a fertilidade masculina. \nTemos suspeita de que o estresse oxidativo possa comprometer também a fertilidade feminina, \nporém até o presente momento encontramos poucos dados sobre este assunto, os quais, muitas \nvezes, são cont raditórios. A endometriose é uma causa bastante comum de dificuldade para \nengravidar (denominada infertilidade) e estuda -se a possibilidade do estresse oxidativo \nparticipar da ocorrência desta freqüente doença, podendo, inclusive, contribuir para a \ninfertilidade associada à mesma. Temos indícios de que o estresse oxidativo possa prejudicar a \nqualidade dos óvulos, levando à redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam \nprocedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometriose , questiona-se \nse um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar seja a inadequada \nqualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade e, \nconseqüentemente, gerar uma gestação menos viável.  \n  Assim, a aval iação do efeito do fluido folicular (fluido contido no folículo onde os \nóvulos se desenvolvem) de mulheres inférteis com endometriose sobre a qualidade dos óvulos \ne embriões poderia auxiliar a descoberta de alguns dos mecanismos envolvidos na causa da \ninfertilidade, o que ajudaria na identificação de tratamentos futuros. Contudo, para podermos \ndizer se o efeito do fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose é diferente daquele \n\nAnexos  |  69 \nde mulheres inférteis sem a doença, precisamos de um grupo tido como controle, composto por \nfluido folicular de mulheres com outra causa de infertilidade, onde você estaria incluída.  \nPara estudarmos o possível efeito prejudicial do fluido folicular de mulheres com \nendometriose e compará-lo com o que ocorre em mulheres sem a doença, propomos avaliar o \nefeito da adição de fluido folicular no cultivo in vitro de óvulos e embriões bovinos (de \nvacas). Assim, para a realização dessa pesquisa, será necessária uma amostra de fluido \nfolicular coletada no dia da captação dos óvulos, sem necessidade de intervenções \ncomplementares, já que este é um procedimento padrão, sem riscos adicionais à paciente. O \nfluido folicular colhido junto com o oócito é normalmente descartado, não tendo utilidade no \nprocedimento de reprodução assistida, de modo que seu uso neste estudo não prejudicará o \ntratamento, pois os óvulos obtidos serão normalmente utilizados no seu tratamento da \ninfertilidade. \n Desta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de \npaciente do grupo control e, ou seja, cujo fluido folicular seja considerado como padrão de \nnormalidade, para fins de comparação com os fluidos das pacientes com endometriose. Sua \ncolaboração, portanto, no fornecimento de amostra de fluido folicular será imprescindível para \num melh or conhecimento do efeito do fluido folicular de pacientes com dificuldade para \nengravidar mas sem endometriose, sobre os oócitos e embriões (utilizando um modelo animal \npara esta avaliação, ou seja, utilizando óvulos e embriões de vaca). Estes dados serão  \ncomparados aos de mulheres com dificuldade para engravidar devido à endometriose. Este \nconhecimento no futuro poderá ser usado no sentido de facilitar a identificação de um \ntratamento mais eficaz da infertilidade associada a esta doença. Contudo, ressalta mos que você \nnão terá nenhum tipo de benefício imediato participando do presente estudo. \n É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu \ncompanheiro. Todo o material obtido será utilizado exclusivamente para cultivo de óvulos e \nembriões bovinos. Também devemos ressaltar que a sua participação no presente estudo não \nimplicará na realização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para \ntentar engravidar.  \n  Fui informada de que, após o isolamento dos óv ulos, o fluido folicular é desprezado, \numa vez que não apresenta qualquer utilidade para o procedimento de reprodução ao qual serei \nsubmetida. Fui informada, também, de que o fluido será utilizado para cultivo de óvulos e \nembriões bovinos. Desta forma, aut orizo a utilização do fluido folicular obtido durante o \nprocedimento de captação dos óvulos, após a identificação e separação dos óvulos pela bióloga \n\nAnexos  |  70 \nresponsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução, exclusivamente no \npresente estudo.    \n3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todas as dúvidas com relação ao estudo que, \nporventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente \nesclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você tem a liberdade de \nretirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que \nisto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento.  Asseguramos o total sigilo em \nrelação aos nomes dos integrantes deste estudo, bem como garantimos que se rá mantido o \ncaráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso \nde que serão prestadas informações atualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa \nafetar a sua vontade de continuar dele participando. Assegura mos o compromisso de que você \nserá devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste \nprojeto, bem como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão \ndos trabalhos da pesquisa. \n \nEu, _________________ ____________________________, RG nº:___________ abaixo \nassinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e \naceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras de fluido folicular. \nAutorizo a pesquis adora abaixo mencionada a utilizá -las para a pesquisa: “Avaliação do \npotencial impacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na \ngênese de anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando \nmodelo experimental bovino”, estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu \nconsentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga \nqualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. \n \n \nRibeirão Preto _______ / _______ / _________ \n \n \n_______________________________           ___________________________ \nAssinatura- Paciente    Assinatura do Pesquisador \n \n \n4. PESQUISADORAS RESPONSÁVEIS: \nProf. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP \n  Michele Gomes Da Broi  \n  Pós-graduanda do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP \n  \n\nAnexos  |  71 \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n(Fluido Folicular - GRUPO ENDOMETRIOSE) \n \n1. NOME DA PESQUISA: “Avaliação do potencial impacto dos fluidos folicular e \nperitoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese de anomalias meióticas \noocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando modelo experimental bovino” \n \n2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro \n \n Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada “Avaliação do potencial \nimpacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na gênese \nde an omalias meióticas oocitárias e no desenvolvimento embrionário, utilizando modelo \nexperimental bovino” \n Sabemos que o estresse oxidativo (que aparece quando ocorre um desequilíbrio entre as \ndefesas antioxidantes e a produção de espécies reativas) compromete  a fertilidade masculina. \nTemos suspeita de que o estresse oxidativo possa comprometer também a fertilidade feminina, \nporém até o presente momento encontramos poucos dados sobre este assunto, os quais, muitas \nvezes, são contraditórios. A endometriose é uma  causa bastante comum de dificuldade para \nengravidar (denominada infertilidade) e estuda -se a possibilidade do estresse oxidativo \nparticipar da ocorrência desta freqüente doença, podendo, inclusive, contribuir para a \ninfertilidade associada à mesma. Temos indícios de que o estresse oxidativo possa prejudicar a \nqualidade dos óvulos, levando à redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam \nprocedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometriose, questiona -se \nse um dos motivos  responsáveis pela maior dificuldade em engravidar seja a inadequada \nqualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualidade e, \nconseqüentemente, gerar uma gestação menos viável.  \n  Desta forma, a avaliação do efeito do fluido folicular (fluido contido no folículo onde \nos óvulos se desenvolvem) de mulheres inférteis com endometriose sobre a qualidade dos \nóvulos e embriões poderia auxiliar a descoberta de alguns dos mecanismos envolvidos na causa \nda infertilidade, o que ajudaria na identificação de tratamentos futuros.  \nPara estudarmos o possível efeito prejudicial do fluido folicular de mulheres com \nendometriose e compará-lo com o que ocorre em mulheres sem a doença, propomos avaliar o \nefeito da adição de fluido folicular no cult ivo in vitro de óvulos e embriões bovinos (de \nvacas). Assim, para a realização dessa pesquisa, será necessária uma amostra de fluido \n\nAnexos  |  72 \nfolicular coletada no dia da captação dos óvulos, sem necessidade de intervenções \ncomplementares, já que este é um procedim ento padrão, sem riscos adicionais à paciente. O \nfluido folicular colhido junto com o oócito é normalmente descartado, não tendo utilidade no \nprocedimento de reprodução assistida, de modo que seu uso neste estudo não prejudicará o \ntratamento, pois os óvulo s obtidos serão normalmente utilizados no seu tratamento da \ninfertilidade. \nDesta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de \npaciente do grupo endometriose, para fins de comparação com os fluidos das pacientes \ncontrole, ou s eja, consideradas como padrão de normalidade. Sua colaboração, portanto, no \nfornecimento de amostra de fluido folicular será imprescindível para um melhor \nconhecimento do efeito do fluido folicular de mulheres com endometriose sobre os oócitos e \nembriões ( utilizando um modelo animal para esta avaliação, ou seja, utilizando óvulos e \nembriões de vaca, cultivados com o seu fluido folicular).  Este conhecimento no futuro poderá \nser usado no sentido de propiciar um tratamento mais eficaz da infertilidade associa da a esta \ndoença. Contudo, ressaltamos que você não terá nenhum tipo de benefício imediato \nparticipando do presente estudo. \n É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu \ncompanheiro. Todo o material obtido será utiliz ado exclusivamente para cultivo de óvulos e \nembriões bovinos. Também devemos ressaltar que a sua participação no presente estudo não \nimplicará na realização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para \ntentar engravidar.  \n  Fui informada de que, após o isolamento dos óvulos, o fluido folicular é desprezado, \numa vez que não apresenta qualquer utilidade para o procedimento de reprodução ao qual serei \nsubmetida. Fui informada, também, de que o fluido será utilizado para cultivo de óvulos e  \nembriões bovinos. Desta forma, autorizo a utilização do fluido folicular obtido durante o \nprocedimento de captação dos óvulos, após a identificação e separação dos óvulos pela bióloga \nresponsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução, ex clusivamente no \npresente estudo.  \n3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todas as dúvidas com relação ao estudo que, \nporventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente \nesclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estu do. Você tem a liberdade de \nretirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que \nisto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento.  Asseguramos o total sigilo em \nrelação aos nomes dos integrantes deste e studo, bem como garantimos que será mantido o \n\nAnexos  |  73 \ncaráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso \nde que serão prestadas informações atualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa \nafetar a vossa vontade de co ntinuar dele participando. Asseguramos o compromisso de que \nvocê será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste \nprojeto, bem como de que será garantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão \ndos trabalhos da pesquisa. \n \n \nEu, _______________________________ ______________, RG nº:___________ abaixo \nassinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e \naceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras flu ido folicular. \nAutorizo a pesquisadora abaixo mencionada a utilizá -las para a pesquisa : “Avaliação do \npotencial impacto dos fluidos folicular e peritoneal de pacientes inférteis com endometriose na \ngênese de anomalias meióticas oocitárias e no desenvolvim ento embrionário, utilizando \nmodelo experimental bovino”, estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu \nconsentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga \nqualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. \n \n \nRibeirão Preto _______ / _______ / _________ \n \n \n_______________________________           ___________________________ \nAssinatura- Paciente    Assinatura do Pesquisador \n \n \n4. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: \n Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP \n Telefone de contato: 16-3602-2231 \nEndereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínicas - Setor de \nReprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. \n   \n  Michele Gomes Da Broi  \n  Pós-graduanda do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP \n Telefone de contato: 16-3602-2231 \nEndereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º andar (Hospital das Clínicas - Setor de \nReprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. \n  \n  \n \n\nAnexos  |  74 \nAnexo 2- Manuscrito \nFollicular fluid from infertile women with mild endometriosis may compromise the \nmeiotic spindle of methaphase II oocytes \n \nMichele Gomes Da Broia, Helena Malvezzi a, Rui Alberto Ferriani a,b, MD, PhD, Claudia Paro \nde Pazc, PhD, Paula Andrea Navarro a,b*, MD, PhD. \n \na Human Reproduction Division, Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of \nMedicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil. \nb National Institute of Hormones and Woman’s Health, CNPq, Brazil  \nc Department of Genetics , Faculty of Medicine of Ribeirão Preto,  University of S ão Paulo, \nRibeirão Preto, SP, Brazil. \n \nInstitution: Faculty of Medicine of R ibeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, \nSP, Brazil. \n \n*Corresponding author: \nPaula A. Navarro \nAvenida Bandeirantes, 3900 - Ribeirão Preto, SP, Brazil.  \nCEP: 14049-900 \nTel.: +55 16 3602 28 21 \nFax: +55 16 3633 1028 \nE-mail: pnavarro@fmrp.usp.br \n \nFINANCIAL SUPPORT \nThis study received financial support from the National C ouncil for Scientific and \nTechnological Development (CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e \nTecnológico).\n\nAnexos  |  75 \n \nABSTRACT \n \nObjective: The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with \nendometriosis have not been fully elucidated. Impaired oocyte quality may be involved in \nlower implantation rates after in vitro fertilization in these patients. We question if alterations \nin the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte \ncompetence acquisition and compromise natural fertility and assisted reproduction treatment \noutcomes in women with this disease. It is known that t o be competent and capable of \nfertilizing, the oocyte must be mature and have a morphologically functional spindle, which \nensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis.  Thus, th is study aimed to \nevaluate the potential impact of different con centrations of follicular fluid (FF) from infertile \nwomen with  and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment \nand actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. Design: \nExperimental study. Material and Me thods: FF samples were consecutively obtained from \n22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of \ninfertility) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature \nbovine oocytes were submi tted to in vitro maturation (IVM) without FF (control) and with 4 \nconcentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of  2 samples of FF ( 1 from a woman with \nendometriosis and one from a woman without endometriosis ). We performed 11 IVM and \neach FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by \nimmunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin \nmicrofilaments, and, then, analyzed by confocal  microscopy. Results: The percentage of \nabnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with \nendometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48. 84%) when compared with \noocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19.15%, 5%: 23. 44%, \n\nAnexos  |  76 \n \n10%: 25%, 15%: 23. 81%) and those matured without FF (23. 53%), with no differences \namong the tested concentrations in each group . Conclusions: We can conclude that bovine \noocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile  women with mild endometriosis \nhave higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with \nendometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal \ndamage. \n \nKey words: mild endometriosis; female infertility; in vitro maturation; follicular fluid; meiotic \nspindle, oocyte quality. \nSupport: CNPq, Brasil \n  \n\nAnexos  |  77 \n \nINTRODUÇÃO \nA endometriose é caracterizada por implante e crescimento de tecido endometrial \n(glândulas e/ou estroma) for a da cavidade uterina  (1). Esta doença possui alta prevalência, \nchegando a acometer de 6 a 10% da população feminina geral (2). Além disso, é \nfreqüentemente associada à infertilidade, sendo que 30 a 50% das suas portadoras são \ninférteis (2). Entretanto, os exatos mecanismos envolvidos na etiopatogênese  da infertilidade \nassociada à endometriose, principalmente nos casos de endometriose mínima (estágio I) e leve \n(estágio II), em que não se observa alteração mecânica  do trato reprodutivo, ainda não foram \nprecisamente elucidados (3). \nA literatura apresenta dados contraditórios acerca dos resultados da fertilização in \nvitro (FIV) em pacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos e \nhipóteses nos últimos anos  (4-6). Trabalhos sugerem a ocorrência de menores taxas de \nfertilização, implantação e de gestação em portadoras dessa afecção (7-8), o que poderia ser \ndecorrente do comprometimento da qualidade oocitária e, conseqüentemente, embrionária \ne/ou de defeitos endometriais ou da interação entre o endométrio e o embrião (6, 9 -10). \nEntretanto, o achado de taxas de implantação em pacientes com endometriose semelhantes às \ndo grupo controle em ciclos de doação de oócitos, reforça o papel crucial da qualidade \nembrionária no comprometimento da implantação verificado neste gru po de pacientes (4, 11-\n12). \nA infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave de \nendometriose (estágios III e IV, respectivamente) poderia ser explicada pela presença de \nalterações anatômicas, como adesões pélvicas ou peritubárias que perturbariam a \ncomunicação entre ovário e tuba uterina e, assim, prejudicariam a liberação, captação ou \ntransporte do óvulo (2).  Entretanto, há  crescentes evidências de que lesões sutis, ou m esmo \n\nAnexos  |  78 \n \nimplantes endometrióticos iniciais poderiam contribuir com a infertilidade  nos estágios I e II , \napesar da ausência de danos anatômicos pélvicos. (3, 13).  \nDiferentes estudos apontam à existência de alterações  nos níveis de constituintes dos \nfluidos peritoneal (14-17) e folicular (18-21) de pacientes com endometriose, o que poderia \nter efeitos adversos nos processos reprodutivos  (22). Segundo Mansour et al (2009),  o fluido \nperitoneal de mulheres com a doença  promove anomalias meióticas oocitárias e apoptose \nembrionária, tendo sido encontrada  maior freqüência de fuso meiótico anormal  e \ncromossomos desalinhados em oócitos incubados com fluido peritoneal de pacientes com \nendometriose (16-17).  Sendo o ambiente folicular extremamente importante para o processo \nde maturação oocitária, possíveis alterações nos componentes do fluido folicular podem ter \ninfluência sobre  a maturidade e qualidade a oocitárias e, assim, afetar  a fertilização, o \ndesenvolvimento embrionário inicial e as taxas de gestação (23). \nO fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II (MII) é uma estrutura temporária \ne dinâmica, associada ao córtex oocitário e sua rede de microfilamentos subcorticais (24-26), \nsendo essencial para garantir a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose (27-\n29). Além disso, é  extremamente sensível à ação de diversos fatores (30-32), que podem \npromover anomalias meióticas, instabilidade cromossômica, aumento da apoptose e \ncomprometimento do desenvolvimento embrionário pré -implantação (33-35).  Assim, danos \nestruturais do fuso meiótico poderiam estar relacionados com possível piora da qualidade \noocitária de pacientes com endometriose. \nNão se encontrou nenhum estudo que tenha avaliado o efeito do fluido folicular de \nmulheres inférteis com estágios iniciais de endometriose sobre a integridade do fuso, os \nmicrofilamentos de actina e a distribuição cromossômica oocitários . Dessa forma, o objetivo \ndeste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular de \n\nAnexos  |  79 \n \nmulheres inférteis com  e sem  endometriose leve sobre a gênese de anomalias meióticas \noocitárias, durante maturação in vitro (MIV), utilizando modelo experimental bovino.  \n \nMETODOLOGIA \n \nRealizou-se um estudo prospectivo de fevereiro de 2009 a fevereiro de 2011  junto ao \nSetor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP -USP. \nEste estudo foi aprovado pelo Comitê  de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP) e pela \nComissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \n(FMRP), Universidade de São Paulo  (USP).  As pacientes que preencheram os critérios de \ninclusão e manifestaram o desejo de participar do projeto assinaram o termo de consentimento \nlivre e esclarecido previamente à inclusão no estudo. \nNo grupo endometriose, foram selecionadas pacientes com  infertilidade associada à \nendometriose diagnosticada e classificada por videolaparoscopia (segundo os critérios da \nAmerican Society for Reproductive Medicine, 1997), com estadiamento da doença definido \ncomo grau II (endometriose leve). No grupo controle, incluíram-se pacientes apenas com \ninfertilidade por fator masculino e/ou tubário. Todas as pacientes do grupo controle foram \nsubmetidas à videolaparoscopia diagnóstica como procedimento de rotina para investigação da \ninfertilidade conjugal, sendo excluída a presença de endometriose. \nForam critérios de exclusão: idade maior ou igual a 38 anos, índice de massa corporal \n(IMC) maior que 30 Kg/m², nível sérico de hormônio folículo estimulante (FSH) no terceiro dia \ndo ciclo menstrual maior ou igual a 10mUI/ml, an ovulação crônica, presença de hidrossalpinge \ne doenças crônicas como diabetes m ellitus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, \ndislipidemia, lupus eritematoso sistêmico e outras doenças reumatológicas, infecção pelo vírus \n\nAnexos  |  80 \n \nHIV, qualquer infecção a tiva, tabagismo, uso constante de medicações hormonais e de \nantiinflamatórios hormonais e não-hormonais nos seis meses anteriores à inclusão no estudo.  \n \nProtocolo de estimulação ovariana controlada \nO bloqueio hipofisário foi iniciado usando análogo do hor mônio liberador de \ngonadotrofinas (GnRHa) 10 dias antes do dia de realização da USTV basal (protocolo longo), \npor meio da  administração de acetato de leuprolide (Lupron®, Abott, Brasil). As pacientes \nreceberam 150 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSH r) (Gonal -F®, Serono, Brasil; \nPuregon®, Organon, Brasil), nos primeiros 6 dias da indução. Quando pelo menos dois \nfolículos atingiram 18 mm de diâmetro médio, foi administrada gonadotrofina coriônica \nhumana (hCG) recombinante (Ovidrel®, Serono, Brasil). A captação dos oócitos foi realizada \n34 a 36h após a administração do hCG recombinante. \n \nColeta e processamento das amostras de fluido folicular \nPara a coleta de fluido folicular, utilizaram -se tubos estéreis, individuais, aquecidos a \n37°C, sem meio de cultura. Foi aspirado individualmente todo o conteúdo do primeiro folículo \ncom diâmetro médio ≥ 15 mm do primeiro ovário puncionado de cada paciente. Apenas os \nfluidos foliculares livres de contaminação sanguínea à inspeção visual e que apres entaram \ncélulas da granulosa (CG) ou células da granulosa e um oócito maduro foram processados para \ndosagem dos marcadores de estresse oxidativo. As amostras de fluido foram centrifugadas a \n1500 rpm por 7 minutos e armazenadas a - 80°C, em duas alíquotas, para posterior análise.  \n \nColeta dos complexos cumulus-oócito de bovinos \nOs ovários, provenientes de vacas abatidas em frigorífico, foram imediatamente \ntransportados ao laboratório, mantidos em solução fisiológica (0,9% NaCl) acrescida de 0,05 \n\nAnexos  |  81 \n \ng/L de sulfa to de estreptomicina, a uma temperatura de  35 -38,5°C. Posteriormente, foram \nborrifados com álcool 70% e lavados em solução fisiológica pré -aquecida 38,5ºC e mantidos \nnesta mesma solução, em banho-maria, até o final da aspiração. Os complexos cumulus-oócito \n(COCs) imaturos foram aspirados de folículos de 2 a 8 mm de diâmetro, utilizando -se agulhas \n25 x 7 acopladas a seringas de 20ml e, então, selecionados sob estereomicroscópio, em placas \nde Petri de 100 mm contendo o meio de lavagem T alp Hepes. Para o cultivo in vitro, somente \nos COCs morfologicamente saudáveis foram selecionados, ou seja, aqueles com citoplasma \nhomogêneo e, pelo menos, três camadas de células do cumulus-oophorus.  \n \nMaturação in vitro \nUtilizou-se o meio de maturação padrão TCM -199 com sais Earle e bicarbonato \n(Invitrogen, Gibco Laboratories Life Techonogies Inc., Grand Island, NY), suplementado com \n0,2 µM de piruvato, 100 UI/ml de Penicilina, 0,1 mg/ml de Estreptomicina, 0,5 µg/ml de \nFSH, 5,0 µg/ml de LH e 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (36).  \nA fim de manter a concentração ade quada de suplementação após a adição de fluido \nfolicular, eliminando-se, assim, o efeito da diluição dos suplementos, optou -se por preparar \num TCM 15% mais concentrado, ao qual, de acordo com cada diluição,  foi adicionado fluido \nfolicular e/ou meio TCM filtrado não suplementado. \nImediatamente após a seleção, os COCs foram randomicamente divididos em 9 \ngrupos: 1) COC s cultivados em meio padrão (sem suplementação de fluido folicular); 2) \nCOCs cultivados em meio padrão + fluido folicular de mulheres com end ometriose leve nas \nconcentrações 15%, 10%, 5% e 1%; 3) COC s cultivados em meio padrão + fluido folicular \ndas pacientes controle nas c oncentrações 15%, 10%, 5% e 1%. O cultivo foi feito em  placas \nNunc de 24 poços , em um volume total de 200 µl de meio ou mei o acrescido de fluido \nfolicular, sem óleo mineral, a 38,5°C, 95% de umidade, 5% de CO 2 em ar, por um período de \n\nAnexos  |  82 \n \n22 a 24 horas. Após a maturação, os oócitos foram desnudados por agitação mecânica, em \nmeio tamponado Talp Hepes. \n \nFixação dos oócitos \nOcorrido o desnudamento, os oócitos foram colocados em solução fixadora MTSB \nXF, composta por 1X de Tampão Estabilizador (0,1M de Pipes, 5mM de MgCl 2 e 2,5mM de \nEGTA), 50% de Óxido de Deutério, 0,01% de Aprotinina de pulmão bovino, 1 mM de DTT, \n1 μM de Taxol, 0,5% de Triton -X, 2% de Formaldeído e água de MilliQ, aquecida \npreviamente por 30 minutos em estufa a 37°C, permanecendo nesta solução a 4°C até  o \nprocessamento da imunofluorescência e confecção das lâminas. \n \nImunofluorescência \nOs oócitos previamente fixados f oram lavados em solução tampão composta por \n0,02% de NaN 3, 0,01% de Triton -X, 0,2% de leite desnatado, 2% de Soro Normal de Cabra, \n0,1M de Glicina, 2% de BSA(V) e tampão PBS, onde permaneceram a 4°C overnight. \nPassado esse período, foram novamente lavados em solução tampão e incubados overnight, a \n4°C, com o anticorpo primário anti -β-tubulina de camundongo (diluição 1:1000). Após nova \nlavagem em solução tampão, foram incubados com o anticorpo secundário imunoglobulina de \ncabra anti -camundongo conjugada com Fluoresceína isotiocianato ( FITC) (Zymed \nLaboratories, Invitrogen Corporation, Calsbad, CA, USA, diluição 1:500) por 2 horas a 37°C.  \nDepois de lavadas, as amostras foram marcadas para os filamentos de actina com faloidina \nconjugada a rodamina (1:1000), la vadas novamente e, então, os cromossomos foram \nmarcados com Hoechst 33342 (10 µg/ml), em meio de montagem composto por 50% de \nglicerol e 25 mg/ml de NaN 3, durante 10 minutos, à temperatura ambiente e montados entre \nlâmina e lamínula. \n\nAnexos  |  83 \n \nAs lâminas foram estoc adas a 4°C até observação em Microscópio Confocal Leica \nTCS SP5 (Leica Microsystems, Mannheim, Germany), sendo 7 dias o intervalo máximo entre \na confecção e a leitura das  mesmas. \n \nAvaliação dos oócitos  \nOs oócitos visualizados foram, primeiramente, classificados quanto à fase da divisão \nmeiótica em que se encontravam : metáfase I (MI) , anáfase I (AI), telófase I ( TI) ou metáfase \nII (MII) . P osteriormente, aqueles em MII  foram classificados quanto à posição de \nvisualização do fuso meiótico, sendo considerados fusos analisáveis apenas aqueles em visão \nsagital, permitindo avaliação global de fuso , cromossomos e microfilamentos de actina  \n(Figura 1A e B ). Aqueles em visão polar foram considerados não analisáveis devido à \nimpossibilidade de avaliação dos microtúbulos, tendo apenas os  cromossomos e \nmicrofilamentos de actina analisados (Figura 1C e D ). Os oócitos considerados analisáveis \nforam avaliados quanto à integridade do fuso (microtúbulos), alinhamento e condensação dos \ncromossomos e organização dos microfilamentos de actina , enquanto os não analisáveis \nforam avaliados apenas quanto ao alinhamento e condensação dos cromossomos e \norganização dos microfilamentos de actina. \nConsiderou-se o fuso como normal quando em forma de barril, com  pólos definidos e \ntamanho normal. Os cromossomos foram considerados normais quando alinhados na placa \nmetafásica. Os microfilamentos de actina foram considerados normais quando distribuídos \nhomogeneamente no citoplasma oocitário (Figura 1). Fuso, cromosso mos e actina com \ncaracterísticas diferentes das acima citadas foram considerados anormais (Figura 2). \nOs fluidos foliculares utilizados nas maturações in vitro  foram provenientes de 22 \npacientes inférteis, sendo 11 com endometriose leve e 11 com fator masculino e/ou tubário.  \n  \n\nAnexos  |  84 \n \nAnálise estatística \nAs análises foram realizadas pelo procedimento GENMOD do programa estatístico \nSAS 2003 (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). \nPara comparação inter e intra -grupos das variáveis de contagem (oócitos em MI, TI e \nMII, actina normal) considerou-se a Distribuição de Poisson. \nPara comparação inter e intra-grupos das variáveis de porcentagem (proporção de fuso \nnormal e cromossomos alinhados, fuso normal e cromossomos desalinh ados, fuso anormal e \ncromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados, cromossomos alinhados, \ncromossomos desalinhados, total de normais e total de anormais ) utilizou -se a Distribuição \nGama.  \nFoi considerado significativo p<0,05.  \n \nRESULTADOS \nOs resultados obtidos são apresentados nas tabelas 1 e 2. \nUm total de 1324 complexos cummulus -oócito (COC) foram maturados in vitro, \nrandomicamente divididos entre os 9 grupos (TCM -199 puro, FF controle e FF endometriose \nnas concentrações 1%, 5%, 10% e 15 %). Deste total, 1128 foram fixados e 1038 visualizados \nem microscopia confocal. Um total de 921 oócitos foram classificados em MII, sendo 466 \nconsiderados com fuso analisável (visão sagital) e 455 com fuso não -analisável (visão polar, \napenas avaliação de cromossomos e actina).  \nNão houve diferença significativa para nenhuma das variáveis analisadas quando \ncomparadas as concentrações de fluido folicular de mulheres com endometriose  entre si. Da \nmesma forma, não se encontrou diferença significativa para nenh uma das variáveis analisadas \nquando comparadas as concentrações de fluido folicular de pacientes controle s entre si \n(Tabelas 1 e 2). \n\nAnexos  |  85 \n \nCom relação ao estágio de maturação, não foi observada diferença significativa no  \ntotal de oócitos em TI,  MI e MII entre os  grupos endometriose, controle e sem fluido, bem \ncomo, não houve diferença significativa entre os grupos quanto à porcentagem de oócitos \nnormais nos estágios MI e TI (Tabela 1). \nNão se encontrou oócitos em AI em nenhum dos grupos estudados. \nDaqueles em est ágio de MII, quando considerados apenas os oócitos MII analisáveis \n(visão sagital), foi encontrado maior percentual de anormalidades meióticas (fuso anormal + \ncromossomos alinhados, fuso anormal + cromossomos desalinhados, fuso normal + \ncromossomos desalinhados) nos oócitos maturados em meio padrão acrescido de fluido \nfolicular de mulhere s com endometriose  leve quando comparados aos maturados em meio \npadrão acrescido de fluido folicular de mulheres controle e àqueles maturados sem adição de \nfluido (p<0,01).  \nNão foi encontrada diferença significativa na distribuição cromossômica normal de \noócitos em visão polar entre nenhum dos grupos estudados (Tabela 2). A análise das \nanormalidades dos oócitos em visão polar (CD) não convergiu devido ao pequeno número de \nocorrências.  \nQuando considerados conjuntamente os oócitos  analisáveis e não analisáv eis ( em \nvisão sagital e visão polar, respectivamente), não houve diferença significativa na s \nporcentagens de normalidade (fuso normal + cromossomos alinhados e cromossomos \nalinhados) entre os grupos endometriose, controle e sem fluido (Tabela 2). \nNão foi encontrada diferença significativa para a organização dos microfilamentos de \nactina entre os grupos. \n  \n\nAnexos  |  86 \n \nDISCUSSÃO \nEmbora haja trabalhos reportando o efeito do fluido peritoneal de mulheres com \nendometriose sobre a qualidade oocitária  (16-17) e diferenças nos níveis de componentes em \nsoro (21, 37 -38), fluido fo licular (4, 37, 39 -42) ou fluido peritoneal  (2, 14, 43 -44) de \npacientes com a doença, não se encontrou nenhum estudo que tenha avaliado o efeito do \nfluido folicular de mulheres inférteis com endometriose sobre fuso e cromossomos oocitários. \nDessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o pot encial impacto de diferentes \nconcentrações de fluido folicular de mulheres inférteis com  e sem  endometriose sobre a \ngênese de anomalias meióticas oocitárias, durante maturação in vitro  (MIV), utilizando \nmodelo experimental bovino. Diante da inconsistência dos dados relacionando endometriose \nmínima e infertilidade  (3, 45) , o presente estudo restringiu -se a apenas avaliar o efeito do \nfluido folicular de mulheres com endometriose leve sobre qualidade oocitária. \nÉ importante salientar que, idealmente, para correlacionar a presença de \nanormalidades meióticas oocitárias com o ambiente folicular na endometriose, o fuso celular e \na distribuição cromossômica deveria m ser analisados em oócitos humanos maturados in vivo \n(46). Entretanto, diante da baixa quantidade de oócitos captados em MII, do número reduzido \nde oócitos humanos destinados à pesquisa, e, sendo a análise por imunofluorescência um \nmétodo invasivo, que necessita de fixação da amostra, a utilização de modelo animal tornou -\nse importante alternativa neste estudo. O uso de oócit os bovinos pode ser justificado pela \nsimilaridade no tamanho e morfologia dos ovários humanos e bovinos, por ambas as espécies \nserem monovulatórias e policíclicas e por ser um material abundante, barato, de fácil \nmanipulação (47).  Sabe-se, também, que a  maturação in vitr o, por si só, pode promover \naumento significativo da ocorrência de anormalidades meióticas oocitárias (46). Todavia, a \nmesma metodologia de MIV foi aplicada para os três diferentes grupos,  de modo que as \ndiferenças encontradas provavelmente são decorrentes de diferenças nos constituintes do \n\nAnexos  |  87 \n \nfluido folicular (obtidos das mulheres inférteis com endometriose leve e controles: fatores \nmasculino e/ou tubário) e não devido ao processo de maturação in vitro. \nDe acordo com os resultados obtidos, não foi observada diferença significativa no \nnúmero de oócitos em estágio de MI e MII entre os grupos,  o que demonstra não haver \ncomprometimento da maturação nuclear dos oócitos cultivados com adição de FF de mulheres \ncom endometriose leve. Estes achados discordam de outro estudo anteriormente realizado no \nmesmo serviço de RA , que avaliou maturação, integridade do fuso meiótico e distribuição \ncromossômica de oócitos de mulheres inférteis com endometriose e co ntroles maturados in \nvitro e encontrou uma tendência a maior proporção de oócitos em telófase I no grupo \nendometriose, apesar de não ter evidenciado anomalias meióticas, sugerindo  possível retardo \nno processo de meiose I (46). Entretanto, Barcelos et al (2009) não analisaram separadamente \nos diferentes estágios de endometriose. No referido estudo foram incluídos na análise oóc itos \nmaturados in vitro oriundos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com endometriose \nmínima, leve, moderada e grave, de modo que a severidade da doença pode ter sido \nresponsável pelo atraso na maturação, o que explicaria esta divergência. \n Quando avaliada a estrutura de divisão celular de oócitos em MII com visão sagital, \nobservou-se maior freqüência de anormalidades meióticas entre aqueles maturados com FF de \npacientes com endometriose leve quando comparados aos maturados com FF de mulheres \nsem a doença ou em meio de cultivo padrão apenas. A hipótese de que a qualidade oocitária \npode ser prejudicada em mulheres com endometriose não é nova, mas não há um consenso \ngeral a respeito. De acordo com  Gianaroli et al (2010) , o tipo de infertilidade tem efe ito \nsignificativo sobre erros meióticos oocitários, sendo estes com maior incidência na presença \nde endometriose ou fator ovulatório  (48), o que foi confirmado pelo presente estudo com \nrelação à endometriose.  Um estudo de Mansour et al  (2009) demonstrou que o fluido \nperitoneal de mulheres com endometriose pode promover anomalias nos microtúbulos e \n\nAnexos  |  88 \n \ncromossomos de oócitos de camundongos  maturados in vivo, as quais foram reduzidas após \nsuplementação do meio de cultivo com o antioxidante L-carnitina, sugerindo que \ncomponentes presentes no fluido peritoneal de portadoras desta doença promove riam \ncomprometimento d a qualidade oocitária e embrionária, tendo o estresse oxidativo como \nprovável mediador. Recentemente, o mesmo grupo publicou novo trabalho avaliando o efeito \ndo FP de mulheres com endometriose sobre o citoesqueleto de oócitos de camundongos em \nMII, sendo n ovamente encontrada uma maior freqüência de fuso meiótico anormal e \ncromossomos desalinhados em oócitos incubados com fluido desta s pacientes  quando \ncomparadas a controles (17). Como o oócito permanece no microambiente folicular durante o \nprocesso de maturação, em íntima relação com o fluido folicular e mantém contato com FP \napós a ovulação e durante o trajeto inicial pela tuba uterina (23), os efeitos destes dois \nmicroambientes poderiam se somar e promover possível efeito cumulativo sobre a estrutura \nde divisão meiótica. Assim, os achados do presente estudo corroboram os de Mansour et al \n(2009, 2010) e agregam mais evidências à literatura acerca do potencial efeito deletério destes \ndois microambientes reprodutivos de mulheres inférteis com endometriose sobre a gênese de \nanomalias meióticas oocitárias, contribuindo para o entendimento de mais um possível \nmecanismo da infertilidade relacionada à endometriose. Por outro lado, os resultados d o \npresente estudo contrariam os obtidos por Barcelos et al (2009), os quais não demonstraram \ndiferenças significativas na freqüência de anormalidades meióticas entre oócitos em MII de \npacientes com endometriose versus controles. Porém, estes autores utiliz aram oócitos \nhumanos maturados in vitro , oriundos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com \ndiferentes estágios de endometriose, incluindo uma pequena casuística, não sendo passível \nextrapolarmos os dados obtidos em virtude destas diferenças metodoló gicas e potenciais \nviéses. \n\nAnexos  |  89 \n \n É importante salientar que os efeitos deletérios sobre a estrutura de divisão meiótica \noocitária encontrados foram promovidos diante da incubação com fluidos foliculares  apenas \nde pacientes com endometriose leve, indicando haver  possível relação entre este estágio da \ndoença e infertilidade, de modo que estes achados poderiam justificar os piores resultados de \nRA em portadora s da doença, como conseqüência de comprometimento da aquisição de \ncompetência e, assim, piora da qualidade oocitárias. Dessa forma, o presente estudo corrobora \na hipótese de D’Hooghe et al (2003), que afirma haver evidências de uma relação causal entre \na presença de endometriose nas formas leves e a ocorrência de subfertilidade nas suas \nportadoras (13). \nSendo o fuso celular essencial para garantir a fidelidade da segregação cromossômica \ndurante a meiose (27-29) e podendo as anomalias meióticas contribuir para a inabilidade do \noócito em completar a maturação  tornando-se incapaz de ser fertilizado,  assim como, para a \nocorrência de erros que não impossibilitem a fertilização, mas comprometam o \ndesenvolvimento embrionário pré e/ou pós -implantação ou a viabilidade futura do concepto \n(49-51), as anormalidades meióticas encontradas neste estudo podem ser a explicação para os \nrelatados piores resultados de RA em pacientes com a doença (7-8).  \nO fato de não ter se encontrado diferença significativa para a frequência de  \ndistribuição cromossômica normal quando avaliados os oócitos em MII com visão polar pode \nser explicado pela impossibilidade de análise fidedigna do fuso e cromossomos nesta posição. \nComo não se encontrou diferença para porcentagem de normalidade quando avaliados \nconjuntamente os oócitos em visão polar e sagital, apenas havendo diferença significativa \ndesta variável para os oócitos em visão sagital, sugere -se que a posição do fuso seja \nextremamente importante para a avaliação da divisão celular, de modo que a visão polar \nparece mascarar os danos aos microtúbulos e/ou cromossomos possivelmente observados em \nvisão sagital.  \n\nAnexos  |  90 \n \nCom relação às concentrações de fluido folicular testadas, não foi observada diferença \nsignificativa na freqüência de anormalidade do fuso em MII entre 1%, 5%, 10% e 15% de \nfluido folicular no grupo endometriose, assim como, no grupo controle, evidenciando que as \nconcentrações não interferiram nos resultados e podendo-se inferir que 1% de FF de pacientes \ncom endometriose é a menor concentração testada capaz de promover dano meiótico e, \npossivelmente, comprometer a qualidade oocitária em mulheres com endometriose leve.  \n \nCONCLUSÕES \n A adição de fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à \nestimulação da ovulação, nas quatro concentrações utilizadas, não promoveu atraso ou \nbloqueio no processo de maturação oocitária em modelo experimental bovino. \n Observou-se haver um efeito deletério do fluido folicular de mulheres inférteis com \nendometriose leve sobre o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de oócitos bovinos em \nMII, submetidos à MIV na presença de FF. Não se observou diferença significativa  nas \nfreqüências de anomalias meióticas encontradas nas quatro concentrações de fluido folicular \n(1%, 5%, 10% e 15%) adicionadas ao meio de cultivo padrão, de modo que o efeito não foi \ndependente da concentração utilizada.  Assim, 1% de fluido folicular ap resentou-se como a \nmenor concentração testada capaz de promover aumento significativo na freqüência de danos \nmeióticos oocitários.  \n O fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose leve submetidas à \nestimulação ovariana, adicionado ao meio de mat uração in vitro de oócitos bovinos, é capaz \nde promover anomalias meióticas, o que pode ocasionar potencial piora da qualidade \noocitária. Sugerimos que este mecanismo possa estar envolvido tanto na redução da \nfecundidade, como na piora dos resultados dos p rocedimentos de reprodução assistida em \n\nAnexos  |  91 \n \nportadoras de infertilidade relacionada à endometriose leve, o que precisa ser avaliado com \nmetodologias pertinentes.  \n Futuros estudos, com maior casuística, que analisem possíveis componentes alterados \nno fluido folicular de mulheres inférteis com endometriose, correlacionem esses dados com os \nresultados de RA dessas pacientes, dosem diferentes marcadores de estresse oxidativo no FF e \nproponham a adição de antioxidantes às MIVs, são imprescindíveis para se tentar el ucidar \npotenciais fatores promotores dos danos meióticos oocitários encontrados no presente estudo, \nem decorrência da adição de FF de mulheres com a doença ao meio de maturação.  \n \nREFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS \n \n1. Gupta S, Agarwal A, Krajcir N, Alvarez JG. 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Estágios de maturação nuclear (metáfase I, telófase I e metáfase II) oocitária nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. \n Concentração FF (%) Total Oócitos fixados (n) Total oócitos \nvisualizados (n) \nMetáfase I Telófase I Metáfase II \nTotal  Normal n (%) Total  Normal \nn (%) Total \nSem \nFluido  \n0 119 115 9 (7,82) 7 (77,78) 6 (5,22) 5 (83,34) 100 (86,96) \nFF Controle \n1 129 117 6 (5,12) 6 (100) 4 (3,42) 2 (50) 107 (91,46) \n5 133 118 4 (3,38) 4 (100) 1 (0,85) 1 (100) 113 (95,77) \n10 126 119 13 (10,92) 8 (61,54) 5 (4,20) 4 (80) 101 (84,88) \n15 124 111 6 (5,40) 4 (66,67) 4 (3,60) 2 (50) 101 (91) \nFF Endometriose \n1 125 115 12 (10,43) 8 (66,67) 2 (1,74) 1 (50) 101 (87,83) \n5 124 113 16 (14,16) 8 (50) 1 (0,088) 0 96 (84,96) \n10 125 118 13 (11,01) 11 (84,62) 2 (1,70) 2 (100) 103 (87,29) \n15 123 112 9 (8,03) 6 (66,67) 4 (3,58) 3 (75) 99 (88,39) \n  \n\nAnexos  |  96 \n \nTabela 2. Porcentagens de oócitos em metáfase II normais e anormais nos grupos Sem Fluido, Controle e Endometriose. \n \nConcentração FF (%) Total de MII \nAnalisáveis Não Analisáveis \nTotal \nn (%) \nNormais Anormais n (%) \nTotal \nn (%) \nNormais Anormais \n FNCA \nn (%) \nTotal \nn (%) \nFACA \nn (%) \nFACD \nn (%) \nFNCD \nn (%) \nCA \nn (%) \nCD \nn (%) \nSem \nFluido \n0 100 51 (51) 39 (76,47) 12 (23,53) 3 (25) 6 (50) 3 (25) 49 (49) 49 (100) 0 \nFF Controle \n1 107 47 (43,93) 38 (80,85) 9 (19,15) 3 (33,33) 6 (66,67) 0 60 (56,07) 59 (98,33) 1 (1,67) \n5 113 64 (56,64) 49 (76,56) 15 (23,44) 6 (40) 8 (53,34) 1 (6,66) 49 (43,36) 48 (97,96) 1 (2,04) \n10 101 60 (59,40) 45 (75) 15 (25) 6 (40) 7 (46,67) 2 (13,33) 41 (40,60) 40 (97,56) 1 (2,44) \n15 101 63 (62,38) 48 (76,19) 15 (23,81) 8 (53,34) 6  (40) 1 (6,66) 38 (37,62) 38 (100) 0 \nFF Endometriose \n1 101 45 (44,55) 20 (44,44) 25 (55,56) 9 (36) 15(60) 1 (4) 56 (55,45) 52 (92,56) 4 (7,14) \n5 96 49 (51,04) 18 (36,74) 31 (63,26) 17 (54,84) 14 (45,16) 0 47 (48,96) 45 (95,75) 2 (4,25) \n10 103 44 (42,72) 20 (45,46) 24 (54,54) 12 (50) 12(50) 0 59 (57,28) 59 (100) 0 \n15 99 43 (43,43) 22 (51,16) 21 (48,84) 11 (52,38) 9 (42,85) 1 (4,77) 56 (56,57) 55 (98,21) 1 (1,79) \n \n\nAnexos  |  97 \n \nLegenda Tabela 1. \nNota. Não houve diferença significativa entre os grupos. Nível de significância de 5%. \n  \n\nAnexos  |  98 \n \nLegenda Tabela 2. \n \nNota. Analisáveis: oócitos com fuso em visão sagital. Não analisáveis: oócitos com  fuso em \nvisão polar. FNCA: fuso normal e cromossomos alinhados. FACA: fuso anormal e \ncromossomos alinhados. FACD: fuso anormal e cromossomos desalinhados. FNCD: fuso \nnormal e cromossomos desalinhados. CA: cromossomos alinhados. CD: cromossomos \ndesalinhados. \n p<0,01 quando comparados FNCA e total de anormais entre os grupos Controle e \nEndometriose e entre os grupos Sem Fluido e Endometriose nas concentrações 1%, 5%, 10% \ne 15%. A análise dos CD não convergiu. \n \n  \n\nAnexos  |  99 \n \nFigura 1.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n  \nA B \nC D \n\nAnexos  |  100 \n \nTítulo Figura 1. \nImagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e \nmicrofilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II normal. \n \nLegenda Figura 1. \nA-B: Fuso normal e cromossomos alinhados (visão sagital). C-D: Cromossomos alinhados \n(visão polar). \n \n  \n\nAnexos  |  101 \n \nFigura 2.  \n  \nA \n\nAnexos  |  102 \n \nTítulo Figura 2. \nImagens de microscopia confocal evidenciando microtúbulos (verde), cromossomos (azul) e \nmicrofilamentos de actina (vermelho), em oócitos bovinos em Metáfase II anormal. \n \nLegenda Figura 2. \nA-E: Fuso anormal e cromossomos desalinhados (visão sagital). F: Fuso anormal e \ncromossomos alinhados.","source_license":"CC0","license_restricted":false}