Avaliação das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal de pacientes com endometriose pélvica

FLÁVIA FAIRBANKS LIMA DE OLIVEIRA MARINO Avaliação das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal de pacientes com endometriose pélvica Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Área de concentração: Obstetrícia e Ginecologia Orientador: Prof. Dr . Mauricio Simões Abrão São Paulo 2006 Dedico este trabalho Ao meu pai, pelo eterno incentivo, apoio e amizade. À minha mãe, pelo amor e carinho que sempre me dedicou. À Letícia, minha filha querida, pela compreensão. Ao Miguel, pelo companheirismo destes anos juntos. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Mauricio Simões Abrão pela excelente dedicação e orientação; Aos colegas Sergio Podgaec e João Antonio Dias Jr., pelas contribuições, sugestões e análises; Ao meu marido, Miguel, pelo auxílio e contribuições; Ao meu irmão, Rafael, pelo auxílio na elaboração do trabalho; À minha sogra, Maria Tereza, pela correção em Língua Portuguesa; À Profa. Ângela Maggio da Fonseca, pelo apoio e contribuições; Ao Prof. Edmund Chada Baracat, pelas sugestões e oportunidade de realizar esse trabalho; Ao Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo pelas sugestões e contribuições; Ao Dr. Ricardo de Oliveira pelas sugestões e contribuições; À Srta. Júlia Fukushima, pela análise estatística; À Srta. Cláudia, secretária da Pós-Graduação da Ginecologia do Hospital das Clínicas, pelo auxílio; À Srta. Ana Cristina, pelo auxílio com o material de laboratório; Ao RDO Diagnósticos Médicos pelo uso do laboratório; A todos os colegas do Setor da Endometriose do Hospital das Clínicas da FMUSP, pelo auxílio com a coleta do material; À FAPESP pelo apoio financeiro; Às pacientes pela possibilidade de realização deste trabalho. SUMÁRIO Lista de abreviaturas Lista de tabelas Resumo Summary 1.INTRODUÇÃO................................................................................1 1.1 A imunologia e a endometriose....................................................7 1.2 Papel das citocinas na etiopatogenia da endometriose.............10 1.3 Interleucina 12............................................................................12 1.4 Interleucina 18............................................................................16 2.PACIENTES E MÉTODOS...........................................................22 2.1Critérios de inclusão....................................................................23 2.2 Dinâmica do estudo....................................................................24 2.3 Estadiamento da endometriose..................................................26 2.4 Método laboratorial.....................................................................28 3.ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................29 4.RESULTADOS..............................................................................30 5.DISCUSSÃO.................................................................................36 6.CONCLUSÕES.............................................................................49 7.ANEXOS.......................................................................................51 7.1 Artigo..........................................................................................64 8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................77 Marino FFLO. Avaliação das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal de pacientes com endometriose pélvica [dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo; 2006. O objetivo deste trabalho foi analisar o comportamento das interleucinas 12 (IL- 12) e 18 (IL-18) em pacientes com endometriose pélvica comparando-as a pacientes de um grupo controle com sintomas sugestivos de endometriose e ausência comprovada da doença. Av aliamos, também, as dosagens das referidas interleucinas em relação à fase do ciclo menstrual, quadro clínico, local da doença, estadiamento e classificação histológica. PACIENTES E MÉTODOS: Foram avaliadas 105 pacientes entre 18 e 40 anos submetidas à videolaparoscopia, ; divididas em 2 grupos: 72 pacientes com endometriose e 33 controles. Colheu-se sangue periférico e fluido peritoneal no intra-operatório e procedeu-se a avaliação das inte rleucinas, relacionando-se as dosagens entre o grupo controle e o grupo com endometriose e também entre os parâmetros já mencionados. Dividimos as pacientes segundo a fase do ciclo menstrual, o quadro clínico, o local de maior gravidade da doença (peritoneal, ovariana ou profunda), o estadiamento e a classificação histológica. As dosagens das interleucinas foram feitas através do método de ELISA e a análise estatística pela aplicação dos testes Kruskal-Wallis e Dunn. RESULTADOS: A média das dosagens da IL-12 no fluido peritoneal foi significativamente maior nas pacientes com endometriose (82,37 +/- 16,61 pg/mL) que no grupo controle (29,20 +/- 10,21pg/mL), p < 0,001. Não houve diferenças significativas na comparação das dosagens séricas de IL-12 entre pacientes e grupo controle. As médi as das dosagens da IL-12 no sangue de pacientes com endometriose avançada foi significativamente mais elevada (196,74 +/- 33,71 pg/mL) que aquela de pacientes com doença inicial (82,04 +/- 16,63 pg/mL), p = 0,007. Não houve diferenças significativas entre as dosagens de IL-18 no sangue e no fluido peritoneal de pacientes e grupo controle, nem em relação à comparação entre doença inicial e doença avançada. As médias das dosagens de IL -12 no fluido peritoneal foram mais elevadas em pacientes com endometriose com dismenorréia severa/incapacitante (82,21 +/- 20,54 pg/mL; p = 0,02), dispareunia de profundidade (101,62 +/- 29,25 pg/mL; p = 0,02) e dor acíclica (101,93 +/- 26,14 pg/mL; p = 0,02). As médias das dos agens de IL-18 no sangue foram mais elevadas em pacientes com endometriose com dismenorréia severa/incapacitante (77,59 +/- 16,50 pg/mL; p = 0,01) e dispareunia de profundidade (61,34 +/- 14,05 pg/mL; p = 0,03). Não houve diferenças significativas entre as dosagens de IL-12 e IL-18, no sangue ou no fluido peritoneal, de acordo com a localização da doença (peritônio, ovário ou doença profunda). Não houve diferenças significativas entre as dosagens de IL-12 e IL- 18, no sangue ou no fluido peritoneal, de acordo com a classificação histológica da doença (estromal, bem-diferenciada, padrão misto de diferenciação e indiferenciada). CONCLUSÕES: A interleucina 12 esteve aumentada no fluido peritoneal de pacientes com endometri ose, e no sangue nos estádios avançados da doença. Não houve difer enças nas dosagens da interleucina 18 no sangue ou fluido peritoneal na endomet riose em relação a mulheres sem a doença. Descritores: endometriose/imunologia, interleucina 12, interleucina 18, ciclo menstrual, local, estadiamento, histologia/classificação. Marino FFLO. Evaluation of the levels of interleukines 12 and 18 in blood and peritoneal fluid of patients with pelvic endometriosis [ dissertation ]. São Paulo: College of Medicine of the University of São Paulo; 2006. The aim of this work was to evaluate the behavior of interleukines 12 (IL-12) and 18 (IL-18) in patients with pelvic endometriosis comparing them with a control group that presented suggestive symptoms of endometriosis and proven absence of the disease, evaluating, also , the levels of the interleukines in relation to the phase of menstrual cycle, clinical symptoms, primary location, disease stage and histological classification. PATIENTS AND METHODS: 105 patients aging from 18 to 40 years have been submitted to the laparoscopic surgery and classified in 2 groups: 72 patients with endometriosis and 33 controls. Peripheral blood and peritoneal fluid were extracted and interleukins were evaluated, correlating the levels between the control group and the group with endometriosis, and also between the parameters previously mentioned. Patients were grouped according to the phase of the menstrual cycle, clinical symptoms, primary location, disease stage and histological classification. Interleukin levels have been measured by ELISA . Statistical analysis was performed by the application of Kruskal-Wallis and Dunn tests. RESULTS: Average levels of IL-12 in the peritoneal fluid was significantly higher in patients with endometriosis (82,37 +/- 16.61 pg/mL) when compared to the control group (29,20 +/- 10,21pg/mL), p < 0,001. No significant differences were found in the comparison of the serum levels of IL-12 between patients and control group.) Average levels of IL-12 in blood of patients with advanced endometriosis were significantly increased (196,74 +/- 33.71 pg/mL) when compared to patients with initial disease (82,04 +/- 16,63 pg/mL), p = 0,007. There were no significant differences between the levels of IL-18 in blood and in peritoneal fluid of patients and control group, nor between patients with initial disease and advanced disease. Average levels of IL-12 in peritoneal fluid were higher in patients with endometriosis with complaints of severe / incapacitating dysmenorrhea (82.21 +/- 20,54 pg/mL; p = 0,02), deep dyspareunia (101,62 +/- 29,25 pg/mL; p = 0,02) and acyclic pain (101,93 +/- 26,14 pg/mL; p = 0,02). Average levels of IL-18 in the blood were higher in patients with endometriosis and severe /incapacitating dysmenorrhea (77,59 +/- 16,50 pg/mL; p = 0,01) and deep dyspareunia (61,34 +/- 14,05 pg/mL; p = 0,03). There were no significant differences between the levels of IL-12 and IL-18, in blood or in peritoneal fluid, according to the primary location of the disease (peritoneal, ovarian or deep infiltrative disease). No significant differences were found between the levels of IL-12 and IL-18, in blood or peritoneal fluid, in accordance to the histological classification of the disease (estromal, well-differentiated, combined standard of differentiation and undifferentiated). CONCLUSIONS: Interleukin 12 wss increased in peritoneal fluid of patients with endometriosis, and in blood in advanced stages of the disease. There were no differences in the levels of interleukin 18 in blood or peritoneal fluid in endometriosis compared to women without the disease. Desciptors: endometriosis/immunology; interleukin-12; interleukin-18; menstrual cycle; neoplasm staging; histology/classification. _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 1 INTRODUÇÃO _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 2 Introdução Endometriose caracteriza-se pelo implante, crescimento e desenvolvimento de glândula e/ou es troma endometriais em localização extra-uterina (D’Hooghe et al., 2003). Estima-se que 10% da população fe minina na menacme apresentam essa doença (Missmer e Cramer,2003) e, quando são estudadas populações específicas de mulheres com dor pélvi ca, dismenorréia ou infertilidade, a prevalência varia de 6 a 58% dos casos (Matorras et al.,1995; Izzo et al., 2000). Os impactos econômico e social c ausados pela endometriose são significativos. Nos Estados Unidos da América, análises demostraram que um terço das internações hospitalare s por causas ginecológicas foram devidas à endometriose (Dmowski et al ., 1997). Outrossim, essas mulheres devem ser acompanhadas cuidadosam ente do ponto de vista ginecológico ao longo de toda sua vida, pois podem apr esentar maior risco de câncer de ovário, mama, pele, além de risco elev ado de outras doenças imunológicas (Giudice e Kao, 2004). Estudos mais recentes defendem que o enfoque multidisciplinar é fundamental na abordagem da paciente com endometriose, priorizando, além de aspectos médico s, o acompanhamento psicológico das mesmas, pois têm risco elevado de sí ndromes depressivas, provavelmente devido às dores crônicas que apresentaram (Belaisch e Allart, 2006). Do ponto de vista da et iopatogenia, Meyer, em 1919, descreveu a teoria da metaplasia celômica. Seg undo essa teoria, células do epitélio celômico transformar-se-iam em cé lulas endometriais em localizações anômalas. Esse raciocínio explicava coerentemente a ocorrência da doença em sítios longínquos da pelve, como a pleura e os pulmões, e também a endometriose em homens; mais tarde ta mbém se atribuiu à metaplasia celômica a explicação da endometriose em mulheres sem menstruação retrógrada e nos endometriomas profundos do ovário (Witz, 2002). _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 3 Em 1927, Sampson propôs a teoria da menstruação retrógrada, segundo a qual células endometriais co m capacidade de proliferação e implantação refluiriam pelas tubas ut erinas, pérvias no período menstrual, alojando-se, principalmente, na superfície dos ovários, no peritônio pélvico e no fundo-de-saco posterior. Essa teoria pôde ser comprovada por diversos estudos que permitiram a visualiz ação do refluxo menstrual por via videolaparoscópica em mais de 90% das mulheres (Koninckx et al., 1999), por obtenção de tecido endometrial viáv el no fluido perit oneal e ainda por outros estudos que conseguiram desenvolver experimentalmente a endometriose em modelos animais, tr ansplantando endométrio humano (Wu e Ho, 2003). Em tempos recentes, após a avaliação de que a menstruação retrógrada era um fenômeno quase univers al entre as mulheres e de que somente parte delas desenv olvia endometriose, algun s autores cogitaram a existência de fatores imunológicos na etiopatogenia da doença (Nothnick, 2001). Pensou-se que, provavelment e, a alteração do mecanismo imunológico fosse restrita ao am biente peritoneal, mas que pudesse envolver as duas facetas da resposta imune, a celular e a humoral. Assim, passou a vigorar o conceito de que a endometriose seria um processo inflamatório pélvico local com al terações nas funções das células imunológicas do ambiente peritoneal (Harada et al., 2001; Wu e Ho, 2003). A base fundamental do processo seria um a alteração da resposta imunológica ao tecido endometrial refluído pelas tr ompas, o que explicaria, assim, a origem e a manutenção da lesão endometrial, havendo fundamentalmente redução da capacidade de depuração dos debris menstruais da cavidade peritoneal (Lebovic et al., 2001). Os estudos para avaliação das funç ões imunológicas em pacientes com endometriose são numerosos, of erecendo resultados promissores no sentido de um entendimento mais cl aro da doença (Berkkanoglu e Arici, 2003). Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 4 Conceitos básicos de imunologia O sistema imune do ser humano é complexo. Seus principais constituintes são as células, que tê m funções diversas, sempre com um objetivo comum: destruir o antígeno resp onsável pela ativação inicial da resposta imunológica. Os principais grupos celulares envolvidos são os leucócitos, divididos em linfócitos, fagócitos e células auxiliares e outras células diversas teciduais, espalhadas nos diferentes sistemas do organismo (Roitt et al., 2003) Ao iniciar sua participação na resposta imunológica, as células produzem e secretam diferentes substâncias responsáveis pela comunicação intercelular e pelo mec anismo final de destruição do antígeno, sendo elas, respectivamente, as citocinas e os anticorpos (Benjamini et al., 2002). Dentre os tipos celulares acima mencionados as células fagocíticas, os linfócitos T e B têm papel de desta que. Os fagócitos reconhecem os antígenos e os interiorizam para proce ssá-los no ambiente intracelular. São representados pelos monóc itos sangüíneos, células de Kupffer no fígado, células sinoviais nas articulações e macrófagos teciduais. A função básica das células fagocíticas é proce ssar os antígenos quebrando-os em pequenos fragmentos para posterior apres entação aos linfócitos T (Roitt et al., 2003). Os linfócitos são as células re sponsáveis pelo reconhecimento específico dos antígenos. Há dois tipos de linfócitos: T e B, com atividades distintas na resposta imune. De ac ordo com o linfócito envolvido e com a função por ele desempenhada, modula-se o tipo de resposta imune, celular (relacionada com o linfócito T) ou humor al (relacionada com o linfócito B) (Roitt et al, 2003). Os linfócitos T, por sua vez, s ão subdivididos em três grupos: T auxiliares tipo 1 ou Th1, T auxiliares tipo 2 ou Th2 e T citotóxicos. Os linfócitos Th1 interagem diretamente com os fagócitos, reconhecendo os Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 5 antígenos por eles apresentados e desencadeando mecanismos celulares de destruição antigênica. Os linfócitos Th2, por outro lado, interagem com os linfócitos B, transformando-os em pl asmócitos, após reconhecer os antígenos por eles apresentados, det erminando a secreção de anticorpos específicos contra esses antígenos. Já os linfócitos T citotóxicos reconhecem e destroem células infecta das por parasitas intracelulares, como, por exemplo, os vírus (Roitt et al., 2003). O reconhecimento dos antígenos, seja pelas células T ou B, exige a participação de moléculas especiais lo calizadas na superfície celular onde esses antígenos se fixam, chamadas de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (CPH). Ambos os tipos de linfócitos possuem receptores específicos, que são atraídos pelo CPH para iniciar o processo de reconhecimento antigênico. Há duas cl asses de moléculas do CPH, (1 e 2) , sendo as de classe 1 responsáve is pelo reconhecimento de antígenos endógenos intracelulares – tendo relação direta com as células T citotóxicas – e as de classe 2 responsáveis pelo reconhecimento de antígenos exógenos, portanto diretamente envolvi das com a função das células T auxiliares (Benjamini et al, 2002). Após todas as etapas acima descr itas terem sido cumpridas, e estabelecido o reconhecimento adequado dos antígenos, os linfócitos ativados iniciam a produção de mediador es solúveis denominados citocinas, responsáveis pela comunicação entre as células do sistema imune, controlando a resposta imune em divers os níveis, como inflamação, defesa infecciosa e proliferação dos clones celulares T e B (Ulukus e Arici, 2005). A estrutura molecular das citocinas aproxima-se daquela de pequenas proteínas com peso molecular inferior a 80 KDa. Normalmente, as citocinas têm ação autócrina ( sobre as própria s células que as produziram) ou parácrina ( sobre células próximas às de sua produção), sendo consideradas “mensageiras” solúveis (Barcz et al., 2000). O termo citocina engloba várias s ubstâncias com funções diversas e altamente específicas, como as interl eucinas, interferons, fatores de Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 6 necrose tumoral, fatores de crescimento, fatores estimuladores de colônias e quimioscinas. Há mais de duzentos tipos de citocinas isoladas em laboratório que, para fa cilidade de estudo e pesquisa, são agrupadas em famílias de acordo com a semelhança de estrutura molecular (D’Hooghe et al., 2001). O padrão local de secreção das citocinas é responsável pela seleção dos mecanismos efetores dos linfócit os nas respostas polarizadas Th1 e Th2. Na resposta Th1, estão envol vidos, fundamentalment e, o interferon gama, o fator de necrose tumoral beta e a interleucina 2, que promovem a fixação dos fatores do complemento, a ativação dos macrófagos e a citotoxicidade celular. Já na resposta Th2, as principais citocinas envolvidas são as interleucinas 4, 5 e 10 , que determinam o padrão de resposta humoral dependente dos anticorpos. A ssim, de um modo simplificado, assume-se que a resposta imune Th1 esteja mais associada às reações inflamatórias mediadas por células, enquanto a resposta Th2, às respostas mediadas por anticorpos e alérgicas (Abbas et al., 1996). Para que haja uma definição por um ou outro tipo de resposta – Th1 ou Th2 -, as células Th primordiais indiferenciadas sofrem a influência de alguns fatores, como o sítio de apres entação do antígeno, os tipos de moléculas co-estimuladoras, as afinid ades com as moléculas CPH classe 2 (afinidade elevada favorece resposta T h1 e baixa Th2) e, principalmente, o perfil e o equilíbrio das citocinas provocadas pelo antígeno (Abbas et al, 1996). Merece destaque em todo esse me canismo o papel exercido pelas interleucinas 12 e 18 no desencadear do processo. Essas citocinas são de fundamental importância na ativação dos linfócitos T helper e, conseqüentemente, nas etapas sucessoras. (Mazzeo et al., 1998). Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 7 A imunologia e a endometriose Quando o tecido endometrial reflui pelas tubas e atinge a cavidade pélvica, ocorre uma resposta imune celular (Th1) e humoral (Th2). A resposta Th1 envolve os macrófagos peritoneais que fagocitam o tecido, neste caso representando o antí geno, processam-no no ambiente intracelular, exteriorizando fragmentos desse tecido através do complexo principal de histocompatibilidade classe 2 ativando os linfócitos T helper que , por sua vez, estimulam as células ex terminadoras naturais (“natural killer”) a destruírem o macrófago e, conseqüentem ente, o antígeno nele contido. A resposta Th2 participa com a secreção de anticorpos específicos. Esse é o mecanismo de funcionamento normal do sistema imunológico que ocorre em mulheres hígidas, lembrando que o re fluxo menstrual é um fenômeno universal (Berkkanoglu e Arici, 2003). Desde a proposição inicial da teoria imunológica, no início da década de 1980, aceitou-se que, na mul her portadora de endometriose, o mecanismo fisiológico apresentava def iciências. Nessa ocasião, Weed e Arquembourg observaram que a freqüênc ia de endometriose associada à infertilidade era muito elevada, princi palmente relacionada à infertilidade secundária na qual cerca de 18 a 38% dos casos por eles estudados, mesmo quando não havia grandes dist orções anatômicas, podiam ser atribuídos à doença em ques tão. Questionou-se, naquela ocasião, a razão pela qual a endometriose, me smo em estádios inic iais, poderia determinar infertilidade e também como a infertilidade podia permanecer naquelas pacientes mesmo após a remoção dos focos da doença. Como resposta, postulou-se que, talvez, a endometriose causasse uma reação auto-imune com secreção de proteínas pelos focos ectópicos, que não conseguiriam ser removidas e, então, desencadeariam um sinal para que os mecanismos imunológicos de fagocitose e remoç ão de debris as depurassem como elementos antigênicos. A velocidade e capacidade de remoção de tais proteínas, características individuai s de cada paciente, poderiam explicar como algumas delas conseguiam conceber, mesmo com endometriose Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 8 avançada, e outras não o faziam, apesar de doença leve. Afirmou-se que, como a reação auto-imune podia ser revertida pela remoção cirúrgica dos endometriomas ou pela supressão prolongada da função ovariana, o sistema imune deveria estar envolvido na endometriose. Essa foi a primeira proposta da teoria imunológica na etiopatogenia da endometriose. O fato de a endometriose promover at ivação policlonal dos linfócitos B, o padrão familiar de ocorrência, o dano tecidual causado e o envolvimento de diversos órgãos, além do predomínio em mulheres e coexistência de outras doenças auto-imunes permitiram levantar a hipótese de a endometriose também poder ser consi derada doença auto-imune (Nothnick, 2001). Auto-anticorpos podem estar pres entes e imunoglobulinas podem estar alteradas na endometriose, demonstrando o envolvimento da imunidade humoral na et iopatogenia do processo (Badawy et al., 1989). O anticorpo antinuclear, anticoagulante lúpico e anticorpo anti-IgG podem estar aumentados em pacientes com endometriose (Gleicher et al., 1987) e estudo mais recente, realizado em nosso meio por Pasoto et al. (2005), também mostrou aumento dos anticorpos ant inucleares na endometriose, corroborando a hipótese de que o sistema imune apresente alguma falha em seus mecanismos reguladores nessa s pacientes. Ainda em nosso meio, Podgaec (2006) estudou as resposta s Th1 e Th2 em pacientes com endometriose e encontrou aumento das dos agens de interferon-gama, da interleucina-10 e alteração nas relações entre as citocinas do braço Th1 e Th2 apontando a ativação das duas vias na doença. Além das alterações dos mecanismos imunológicos humorais, os mecanismos celulares também se m odificam na endometriose. Dmowski et al., em 1981, apresentaram o primeiro trabalho afirmando que as mulheres com endometriose tinham imunidade celula r deficiente. A partir de então, foram demonstradas diferenças nos números absoluto e relativo de linfócitos T auxiliar (Th) e T supressor na circulaç ão periférica e no fluido peritoneal (Badawy et al., 1987), redução significat iva na capacidade citotóxica das Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 9 células natural-killer (Oosterlynck et al., 1991) , aumento dos níveis das interleucinas 6 e 10 no fluido peritoneal (Punnonen et al, 1996) , redução da função ativadora das células T auxiliares tipo 1 (Th1) do ambiente peritoneal, facilitando o implante e o crescimento do tecido endometrial ectópico (Wu e Ho, 2003), aumento do número e da conc entração de macrófagos ativados no fluido peritoneal e também dos produtos destes macrófagos, como o fator de necrose tumoral alfa (TNF- α), a interleucina 6 (I L-6) , o fator de crescimento transformador beta 1 (TGF β1) (D’Hooghe et al., 2001; Pizzo et al., 2002) e o fator de crescimento dos hepatócitos (Khan et al., 2006) . Observou-se que, na endometriose, os macrófagos infiltravam o tecido endometrial ectópico, desencadeando a resposta imunológica, que resultava num acúmulo de fluido peritoneal com níveis elevados de citocinas pró- inflamatórias do braço Th1 (resposta imune celular), como IL-6, IL-1 fração β e TNF-α (Punnonen et al., 1996). Os macrófagos peritoneais são ativ ados e estimulam linfócitos, culminando com a secreção de citoci nas, que modulam o crescimento e o comportamento inflamatório dos implant es endometriais (Roitt et al., 2003). A secreção de proteínas mitogênicas pelas lesões endometrióticas contribui significativamente com os fenôm enos de adesão, proliferação, neoangiogênese e quimioatra ção celular aos focos de endometriose recém- implantados (Lebovic et al, 2001). As células “natural killer” têm sua capacidade citotóxica reduzida, contribuindo para pior desempenho do sistema dependente das células para a defesa contra o implante endometrial ectópico (Berkkanoglu e Arici, 2003). Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 10 Papel das citocinas na etiopatogenia da endometriose Em 1997, Nisolle e Donnez propuseram que a endometriose ovariana, peritoneal e de septo retovaginal se riam doenças distintas, englobadas numa única entidade. Apesar dessa diferença, já aceita atualmente por parte dos estudiosos no assunto, também se postula que tais doenças se desenvolvem por existir alteração imuno lógica basal prévia na paciente, sendo que a função das citocinas tem papel de relevância no quadro em questão. Para que um fragmento de tecido endom etrial refluído pelas trompas consiga se implantar e desenvolver no sítio ectópico, uma sucessão de eventos se faz necessária. As etapas mais importantes são a adesão, implantação, angiogênese, pr ogressão e infiltração. Em todos os processos anteriores, as citocinas estão envolvidas (Harada et al., 2001). Em 1999, Koninckx et al. propuseram uma nova teoria etiopatogênica, por eles chamada teoria da doença endometriótica, que considera a endometriose uma doença semelhante a um tumor benigno. Seu embasamento, para tal, fundamentou-se nas evidências de que na endometriose havia redução da imunidade ce lular, redução da atividade das células “natural-killer”, favorecimento hereditário à aquisição da doença e aspectos genéticos alterados. Destacou o envolvimento de algumas citocinas, comprovando o aumento das concentrações do fator transformador de crescimento beta (T GF-beta) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) no fluido peritoneal, o que favoreceria a neovascularização necessária para o crescimento do foco endometriótico. O fluido peritoneal é o principal fa tor de controle do microambiente peritoneal. Seu volume varia com a époc a do ciclo menstrual, atingindo um máximo no período ovulatório. Dent re seus componentes, encontram-se diversas células imunológicas, co mo macrófagos, células mesoteliais, linfócitos e eosinófilos (Harada et al., 2001). Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 11 O possível processo inflamatório pélvico local que existe na endometriose determina alterações nas células contidas no líquido peritoneal, bem como em outros elemen tos, incluindo até o volume de líquido que, conforme dem onstrado por Syrop e Halm e, em 1987, é menor nas pacientes com endometriose quando comparadas às pacientes inférteis sem endometriose. A resposta inflamatória associada à endometriose, o reparo tecidual e a neovascularização dependem dos macróf agos do fluido peritoneal e de seus produtos de secreção, particula rmente das citocinas. Os macrófagos teciduais na endometriose estão mais ativados e, por isso, secretam maiores quantidades de citocinas (Halme et al., 1984). Diversos estudos propuseram- se a analisar as diferentes citoci nas conhecidas e seu comportamento na endometriose. Foi comprovada a maior se creção de IL-1, IL-6 , IL-8 , TNF- alfa , TGF-beta e VEGF no fluido peritonea l de pacientes com endometriose ( Barcz et al., 2000; Iwabe, 2002; K han et al., 2002; Wu e Ho, 2003). Em outros estudos, foram encontradas menores concentrações de outras citocinas, como o interferon-gama, sendo que as mesmas sofreram elevação quando as pacientes foram tratadas com análogos do GnRH (Ho et al., 1996). Há ainda pesquisadores que não encontraram diferenças significativas nas concentrações de determinadas citocinas no fluido peritoneal comparando mulheres hígidas e portadoras de endometriose, bem como entre pacientes com outras doenças pélvicas e pacientes com endometriose, como o estudo das c oncentrações de IL-6 nesses dois grupos, realizado por Buyalos et al. em 1992. Uma visão mais geral do processo permite enquadrar a endometriose num processo inflamatório com fenômenos locais de reparação, envolvendo a ativação de polimorfonucleares e cé lulas mononucleares que, quando ativadas, secretam citocinas de uma m aneira peculiar que permite a criação de um microambiente favo rável à implantação das células endometriais refluídas ou metaplásicas (Pizzo et al., 2002). Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 12 A necessidade da busca de mét odos pouco ou minimamente invasivos para o diagnóstico da endometri ose motiva estudiosos há anos. O padrão-ouro atualmente aceito é a abor dagem cirúrgica com obtenção de amostras para confirmação anatomopat ológica (Giudice e Kao, 2004). Isso envolve custos pessoais e econômic os elevados, afastamento do trabalho e atividades cotidianas, além dos riscos decorrentes da internação hospitalar, anestesia e cirurgia. A interleucina 12 A identificação e purificação da in terleucina 12 (IL-12) foi feita por Kobayashi et al (1989), quando buscavam uma explicação para a proliferação de células natural-killer (NK). Evidências prévias mostravam a nece ssidade de linfócit os B, células CD4 e altas concentrações de inte rleucina 2 para que se obtivesse a proliferação do clone NK. O mecanismo exato para que os eventos ocorressem era desconhecido, mas rec onhecia-se um papel importante do interferon-gama no início do processo. K obayashi et al. (1989) estimularam os clones de células B linfoblastoíticas infectadas com o vírus Epstein-Barr e então encontraram uma nova citoci na por elas secretada, que era diretamente envolvida na produção de interferon-gama, na citotoxicidade das células NK e também aumentava a resposta das células T a agentes específicos. Essa citocina foi cham ada inicialmente de “N atural Killer Stimulatory Factor (N KSF)”, devido às suas propriedades biológicas. Recentemente, passou a ser denominada interleucina 12. Sua estrutura molecular é composta de um dímero glicoproteico de peso 70 KDa, dividida em duas cadeias, leve e pesada, com respectivamente 35 e 40 KDa (Barcz et al., 2000). A expressão das duas cadeias é necessária para que a IL-12 se ja funcionalmente ativa; a cadeia leve pode ser codificada pela maio ria das células do organismo, mas a cadeia pesada só é produzida pelas célula s ligadas à função biológica desta Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 13 citocina, principalmente as células mielomonocíticas representadas pelos macrófagos (Mazzeo et al., 1998). O conhecimento da necessidade da expressão das duas cadeias para a ação da IL-12 foi demonstrado no estudo de D’Andrea et al. em 1992. Esses autores verificaram que se células periféricas monocíticas eram estimuladas com cepas de Staphylococcus aureus Cowan I, cujo controle infeccioso dependia da resposta imune celular tipo Th1, havia grande liberação do comp lexo dimérico de 70 KDa; por outro lado, quando se administrava apenas um a das cadeias, leve (35KDa) ou pesada (40KDa), às células previam ente infectadas, a resposta imune era extremamente deficitária permitindo o alastramento da infecção. Além da informação da necessidade das duas cadeias para a função imune adequada, sabe-se que a cadeia pes ada, isoladamente, atua como antagonista natural da própria IL-12, conforme demonstraram Somigliana et al., em 1999. A IL-12 é considerada uma molécu la-chave do sistema imune. Suas atividades primordiais ex ercem-se sobre as células T e NK(D’Andrea et al, 1992) , a saber: • indução da transcrição e secreção de outras citocinas, principalmente interferon-gama; • aumento da citotoxicidade das células NK; • indução da proliferação das células NK. Essas ações têm início a partir do estímulo que ocorre quando a IL-12 induz a produção de interferon-gama s obre as células T e NK, controlando, portanto, a diferenciação das célu las T primordiais para o padrão Th1 (Somigliana et al., 1999). A IL-12 é um elemento de grande impor tância no equilíbrio entre as respostas imunes Th1/Th2. O recept or para IL-12 é composto de duas cadeias, ditas beta-1 e beta-2, expre ssas conjuntamente apenas nas células do padrão Th1. As células do padrão Th2 podem expressar a cadeia beta-1, Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 14 mas a cadeia beta-2 é induzida pelo interferon-gama e inibida pela IL-4 (Gazvani et al., 2001). A expressão do receptor incompleto torna-o não- funcional. Em 2004, Ledée-Bataille et al. estudaram o papel das interleucinas 12 e 18 em pacientes com falhas repeti das de implantação após fertilização assistida. Estudos anteriores mostrava m que, em altas concentrações, tanto a IL-12 isolada quanto em sinergismo com IL-18 favoreciam abortamentos, mas em doses baixas ou fisiológicas eram necessárias nos estágios iniciais da implantação para a ocorrência da remodelação vascular e estabelecimento das relações materno-feta is iniciais (Yoshi no et al, 2001; Chaouat et al, 2002). Confirmaram, ne sse estudo, o envolvimento da IL-12 em altas concentrações nos abortament os precoces e falhas repetidas de implantação, atribuindo esse fato à ativação das células NK e ao excesso de produção de interferon-gama. Ainda em estudos relaciona dos à reprodução humana, outros pesquisadores investigaram o padrão de resposta imune predominante em abortamentos de repetição e a possibi lidade de alguma ação atribuível às interleucinas. Wilson et al. (2004) estudaram 75 mulheres, sendo 25 não- gestantes sem antecedentes de abortamentos sucessivos e 50 com antecedentes de pelo menos 3 abortamentos prévios; encontraram níveis significativamente mais elevados de IL-12 e interferon-gama nas pacientes com abortamentos de repetição. Visto já haver diversos trabalhos com IL-12 em vasta gama de doenças, grupos de pesquis adores aplicaram à end ometriose raciocínios semelhantes, estudando o papel da citocina na mesma. Talvez a IL-12 pudesse ser um dos fatores responsáveis pela falha do controle das células NK no combate ao foco ectópico (Barcz et al., 2000). Mazzeo et al, em 1998, realizaram um estudo com a dosagem da IL- 12 e da subunidade de 40 KDa (p40) no fluido peritoneal de 33 pacientes com endometriose comprovada por vi deolaparoscopia e 40 pacientes sem endometriose e encontraram concentraçõ es semelhantes da IL-12 total em Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 15 ambos os grupos, porém concentrações mais elevadas da subunidade p40 no grupo com endometriose. A razão IL-12 + p40/ IL-12 revelou-se diretamente proporcional à severidade da endometriose, mostrando haver um desequilíbrio nas portadoras da doença quanto à produção de IL-12, com aumento da proporção da cadei a pesada que compete em nível de receptor com a IL-12 clássica, inibindo suas funções. Em 1999, Somigliana et al. propuseram o uso de modelos experimentais animais para o es tudo da endometriose e citocinas. Inicialmente, estudaram ratos imunol ogicamente competentes, que foram submetidos à inoculação de impl antes peritoneais de endometriose e sacrificados após 3 semanas da interv enção, quando os implantes eram analisados quanto à área e ao peso. Posteriormente, o mesmo modelo foi usado e nos animais previamente inoc ulados foi administrada IL-12; quando sacrificados no mesmo tempo para obser vação constatou-se que a adição de IL-12 foi capaz de prevenir os impl antes e de reduzir o peso e a área dos tecidos em que conseguiram se implantar, corroborando a teoria de que a IL- 12 atuava como molécula fundamental no estímulo inicial da resposta imune celular contra o endométrio ectópico. Em análise do fluido peritoneal de pacientes com e sem endometriose, Gazvani et al. (2001) es tudaram as concentrações de IL-12 e encontraram distribuição similar nos dois grupos, sem diferenças nos diversos estádios da doença, nas fa ses do ciclo menstrual ou quanto às queixas de dismenorréia, infertilidade ou dor pélvica crônica. Somigliana et al., também em 2001, estudaram em modelos animais os mecanismos imunológicos envolv idos na endometriose e a participação específica da IL-12. Inocularam tecido endometrial na cavidade peritoneal de ratos modificados geneticamente, divididos em dois grupos, sendo o primeiro deficiente em beta2-microglobulina (o que sabidamente os deixava com o número absoluto e relativo de linfócit os T reduzido) e o segundo deficiente na cadeia pesada da IL-12 (também comprometendo a resposta imune celular). Seus resultados não só apontaram que nos animais do grupo Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 16 deficiente na cadeia p40 da IL-12 houve maior facilidade no crescimento e desenvolvimento dos implantes inoculados, mas também que em ambos os grupos a progressão da endometriose foi maior do que quando comparados a um terceiro grupo imunologicamente competente. Em 2004, Gallinelli et al. estudaram o comportamento da IL-12 e IL-13 em 80 pacientes submeti das à videolaparoscopia por diferentes causas, como endometriose, dor pélvica, infertilidade, reanastomose ou laqueadura tubárea. A IL-13 é uma interleucina envolvida no estímulo da secreção de IL- 4 no fenótipo Th2. Os resultados mostra ram aumento dos níveis de IL-12 no fluido peritoneal das pacientes com endo metriose estádios III ou IV, quando comparadas às demais pacientes e, com relação à IL-13, revelaram o contrário, sendo as dosagens peritoneai s maiores nas portadoras de outras doenças quando comparadas às pacientes com endometriose, independentemente da severidade da mesma. A interleucina 18 A interleucina 18 (IL-18) foi inic ialmente denominada Fator Indutor do Interferon Gama. Trata-se de uma glic oproteína membro da superfamília da interleucina 1, sendo secretada por dive rsos tipos celulares. No sangue periférico, é liberada como pró-IL- 18, molécula com peso molecular de 24KDa, e posteriormente passa por pr ocesso de clivagem extracelular pela enzima conversora da IL-1, transfo rmando-se na IL-18 ativa, agora com peso de 18KDa (Arici et al., 2003). Em sua produção, estão envolvidos, principalmente, os macrófagos ativados. A IL-18 tem participação nos dois braços da resposta imune (Th1 e Th2). Isoladamente, a IL-18 é uma cito cina promotora da resposta Th2 com estímulo à produção de angiopoetina 2, aumentando os fatores vasculares locais, além de favorecer a liberação de IL-4, IL-5 , IL-10 e IL-13 (Zhang et al, 2004). Pode, também, comportar-se como uma citocina Th1, agindo sinergicamente com a IL-12, co-est imulando a produção de interferon-gama Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 17 e, conseqüentemente, participando da ativação de células T e NK. Experimento realizado em 2001, por Esf andiari et al., mostrou que, em ratas com lúpus eritematoso sistêmico induzi do, a adição de IL-12 associada a IL- 18 exacerbava o “rash” cutâneo em asa de borboleta, mas a adição isolada de IL-18 resultava na remissão do “rash” facial e aumentava os níveis de auto-anticorpos, mostrando a participação da IL-18 ora na resposta Th1, ora na Th2. Conforme já mencionado anteriorm ente, a IL-18 é necessária em doses fisiológicas para o processo de implantação da gestação inicial, mas em doses elevadas tem participação nos abortamentos de repetição (Chaouat et al., 2002). A resposta básic a Th1 é fundament al no processo inicial de implantação para haver esti mulação e ativação das células NK uterinas, que, por sua vez, seriam essenciais no estabelecimento da angiogênese endometrial (Ledée-Bataille et al, 2005). Assume-se, atualmente, que a IL-18 tem as seguintes funções biológicas ( Gracie et al., 2003): • é o mais potente indutor da produç ão e secreção do interferon-gama; • induz a produção de IL-12 e TNF-alfa; • favorece a liberação de IL -4, IL-5, IL-10 e IL-13; • participa dos dois braços de resposta imune Th1 e Th2. Arici et al., em 2003, coletaram o fluido peritoneal de 74 pacientes durante a videolaparoscopia, sendo 50 portadoras de endometriose não- tratada, 8 com endometriose tratada co m análogos do GnRH previamente e 18 sem endometriose, e nelas dosaram a concentração de IL-18 no fluido peritoneal. Seus resultados mostraram que a concentração de IL-18 no grupo das pacientes com endometriose era significativamente maior que naquelas sem a doença, salientando, ai nda, que, na fase secretora, as concentrações eram sempre mais el evadas em todos os grupos. Houve ainda relação estatisticamente signifi cativa quando a endometriose era Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 18 peritoneal (maiores concentrações) e comparada à das pacientes com endometriomas ovarianos. Em 2004, Oku et al. compararam as concentrações sérica e no fluido peritoneal de IL-18 de 39 pac ientes com endometriose e 19 sem a doença. As concentrações no fluido peritoneal das portadoras de endometriose foram significativamente superiores às das pacientes sem a doença, mas em relação às concentrações séricas não se encontraram diferenças estatísticas nem quando se considerou o estadiamento segundo a Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva. Em outro estudo, Zhang et al., em 2004, estudaram 44 pacientes submetidas à videolaparoscopia, sendo 22 delas com endometriose e 22 controles. Enc ontraram concentrações mais baixas da IL-18 no fluido peritoneal das portadoras de endometriose do que no grupo controle e também não observara m diferenças estatisticamente significativas nas concentrações séricas dos dois grupos estudados, mesmo considerando o estadiamento da doença ou as diferentes fases do ciclo. Interpretaram seus resultados defendend o a hipótese de que a redução da concentração da IL-18 determinaria prejuízo globa l nas funções imunológicas celulares, favorecendo o implante e o crescimento dos focos endometriais ectópicos. Em nosso meio, Glitz (2006) não encontrou diferenças nas dosagens sérica e peritoneal de IL-18 entre um grupo de mulheres férteis sem endometriose comparado a outro grupo de pacientes com infertilidade e endometriose mínima ou leve, sugerindo que não seria a alteração da IL-18 a possível causa da associação de infertilidade e endometriose inicial. Luo et al. (2006) estudaram a ex pressão do RNA m ensageiro da IL- 18 no endométrio tópico e em foco s de endometriose de um grupo de mulheres hígidas, comparando-as co m pacientes com endometriose. Observaram que nas pacientes co m a doença a expressão do RNA mensageiro da IL-18 estava signifi cativamente diminuída tanto no endométrio tópico quanto ectópico, o que fortaleceria a hipótese da participação da IL-18 na etiopatogenia do processo. Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 19 Conforme salientado, há incertez as sobre a etiopatogenia da endometriose, principalmente no âmbito da imunidade. Nesse quesito, as interleucinas 12 e 18 têm papel importante por atuarem como desencadeadoras das respostas imunes Th1 e Th2 a partir de estímulos sobre os linfócitos T primordiais (D’Andrea et al., 1992; Gazvani et al., 2002). Adicionalmente, são c onflitantes os dados sobre a participação dessas interleucinas na endometriose pélvica. Esse estudo foi realizado visando a aprofundar os conhecimentos de modo a dirimir algumas dúvidas acerca da participação das interleucinas 12 e 18 em pacientes nesta doença, ressaltando a inexistência de outros estudos em que t enha sido feita a correlação das referidas citocinas com a fase do ciclo menstrual de coleta das amostras, o estadiamento, o loca l e a classificação histológica da doença. Introdução _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 20 PROPOSIÇÃO _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 21 Proposição Propusemo-nos neste estudo a: 1. avaliar o comportamento das interleucinas 12 e 18 em pacientes com endometriose pélvica através de suas dosagens no sangue e no fluido peritoneal; 2. relacionar em pacientes com endometriose, as dosagens séricas e no fluido peritoneal das interleucinas 12 e 18 com: • a fase do ciclo menstrual; • o quadro clínico; • os locais de acometimento: peritônio, ovário e doença profunda; • o estadiamento da endometriose • a classificação histológica da endometriose. _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 22 PACIENTES E MÉTODOS _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 23 Pacientes e Métodos Avaliamos 105 pacientes do sexo fe minino que foram submetidas à videolaparoscopia no Setor de Endometri ose do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo durante o período de abril de 2004 a dezembro de 2005. Fora m subdivididas em dois grupos, casos e controles, após a realização do procedimento cirúrgico, de acordo com a presença ou ausência da endomet riose. No grupo dos casos com endometriose foram incluídas 72 pacientes e no grupo controle 33. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesqui sa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medi cina da Universidade de São Paulo (anexo A). Todas as pacientes leram e assinaram o termo de consentimento pós- informação (anexo B). A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) auxiliou a realização deste es tudo com a aprovação de verba no processo 05/01218-3 Critérios de inclusão Os critérios de inclusão para o grupo de pacientes com endometriose (anexos C, D e E) foram: • idade entre 18 e 40 anos; • endometriose confirm ada histologicamente; • ausência de doenças auto-im unes, confirmada através de anamnese e exames laboratoriais quando necessário; • ciclos menstruais regulares; _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 24 • não utilização de terapêutica horm onal nos 3 meses antecedentes ao procedimento cirúrgico, inclui ndo análogos do GnRH, derivados progestogênicos e contraceptivos hormonais; • ausência de contaminação hemática no fluido peritoneal. Para o grupo controle (anexos C, D e E), foram selecionadas pacientes com quadro clínico sugestivo de endometriose, com indicação de videolaparoscopia, com os mesmos cr itérios de inclusão citados para o grupo dos casos, exceto pela confirmação da ausência de endometriose durante a cirurgia. Dinâmica do estudo As pacientes encaminhadas ao Seto r de Endometriose do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo eram inicialmente submetidas à consulta gi necológica com avaliação das queixas clínicas, exame físico e exames subs idiários pertinentes, como a dosagem sérica do marcador tumoral CA-125 nos três primeiros dias do ciclo menstrual, ultra-sonografia pélvica e/ ou transvaginal e, quando havia necessidade, ressonância nuclear magnética da pelve. Nos casos em que a suspeita clínica, laboratorial (CA-125 maior ou igual a 100 µg/mL) e/ou por imagem (cistos anexiais ou sinais de doença profunda) sugeriram endom etriose, ou se houvesse normalidade nos exames, mas ausência de melhora com tratamento clínico com analgésicos e/ou anti-inflamatórios por 6 meses a 1 ano, a pa ciente era submetida à videolaparoscopia. Durante o procedi mento, na dependência de terem sido observadas lesões compatíveis com endometriose, eram realizadas biópsias com posterior confirmação anatom opatológica. Quando confirmada a endometriose, a paciente er a incluída no grupo de caso s. Na ausência de lesões visíveis no intraoperatório, ela era incluída no grupo controle. Pacientes e Métodos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 25 Anotamos o dia do ciclo menstrual em que a paciente se encontrava no momento do procedimento cirúrgico. Dessa forma, subdividimos as pacientes em fase folicular e fase lú tea e nelas avaliamos o comportamento das interleucinas 12 e 18. Antes da anestesia geral para a vi deolaparoscopia, colheram-se 5mL de sangue periférico em tubo seco. A pacie nte foi submetida à laparoscopia, seguindo a rotina habitual do serviço. Pela punção secundária, realizou-se a coleta de líquido peritoneal depositado em fundo de saco anterior e/ou posterior, variando de volume entre 2 e 10mL, e armazenado em tubo seco. O material foi encaminhado ao laboratór io para ser centrifugado, aliquotado e congelado em freezer a -20ºC. Depo is de estocado, o mesmo somente foi descongelado com a coleta completa de todos os dados, para realização das dosagens das interleucinas 12 e 18. Ainda durante o ato cirúrgico, foi observado o local dos implantes da endometriose. Foram consideradas três localizações para a classificação: doença peritoneal, ovariana e doença prof unda (regiões retro-cervical, para- cervical, septo reto-vaginal, reto-sigmóide, ureteres e bexiga). Para a análise estatística foi considerado como critér io de gravidade a ordem crescente: doença peritoneal, doença ovar iana e doença prof unda infiltrativa, conforme postulado por Nisolle e Donnez (1997). Em relação à avaliação das dosagens das interleucinas segundo a classificação histológica, agrupamos as pacientes em duas categorias histológicas (sem indiferenciação e com indiferenciação). O critério para tal divisão baseou-se na classificação hist ológica proposta por Abrão et al. (2003), com quatro tipos histológicos de apresentação da doença (estromal, bem-diferenciada, padrão misto de dife renciação e indiferenciada). As pacientes do grupo com endometriose foram subdivididas em dois subgrupos (sem indiferenciação e co m indiferenciação). As classes histológicas estromal e bem-diferenc iada foram categorizadas como “sem indiferenciação” (n = 28), enquanto as formas mista e indiferenciadas foram categorizadas como “com indifer enciação” (n = 44), considerando o Pacientes e Métodos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 26 comportamento da doença estromal e bem-diferenciada menos agressivo e o comportamento da doença com padr ões misto de diferenciação e indiferenciada mais agressivo. Estadiamento da Endometriose As pacientes com endometriose tiveram sua doença classificada durante o procedimento cirúrgico pelo critério da American Society for Reproductive Medicine (1996) em estádios de I a IV (Figura 1). Para melhor análise estatística, os estádios I e II foram agrupados como estádio inicial e os estádios III e IV foram agrupados como estádio avançado. Pacientes e Métodos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 27 FIGURA 1 - Classificação da endometriose proposta pela American Society for Reproductive Medicine (revisada em 1996). Estádio I (mínima): 1-5 Estádio II (leve): 6-15 Estádio III (moderada): 16-40 Estádio IV (severa): > 40 ENDOMETRIOSE 3 cm Superficial Profunda D superficial Profunda E superficial Profunda OBLITERAÇÃO DO FUNDO DE SACO POSTERIOR 1 2 1 4 1 4 2 4 2 16 2 16 4 6 4 20 4 20 Parcial Completa 4 40 OVÁRI O PERI TÔNIO ADERÊNCIAS 2/3 Envolvidos D Velamentosa Densa E Velamentosa Densa 1 4 1 4 1 4* 2 8 2 8 2 8* 4 16 4 16 4 16 TROM PA OVÁRIO D Velamentosa Densa E Velamentosa Densa 1 4* 2 8* 4 16 * Se as fímbrias tubáreas estiverem totalmente envolvidas por aderências, mude o escore para 16. Usar em caso de trompas e ovários anormaisED Usar em caso de trompas e ovários normaisED Pacientes e Métodos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 28 Método laboratorial O método laboratorial utilizado para as dosagens das interleucinas 12 e 18 foi o ELISA, téni ca de ensaio imunoenzimát ico quantitativo tipo sanduíche: anticorpos monoclonais específicos para as referidas interleucinas são pré-fixados em uma placa de ELISA. Padrões, amostras e os conjugados (anticorpos policlonais c ontra IL-12 e contra IL-18 ligados à enzima peroxidase) foram pipetados. Quaisquer IL-12 ou IL-18 presentes nas amostras ligaram-se aos antic orpos imobilizados e aos conjugados, formando um complexo anticorpo-antí geno-anticorpo conjugado. Após uma etapa de lavagem, para remover quaisquer substâncias não ligadas, uma solução contendo o substrato (tetrame tilbenzidina + peróxido de hidrogênio) foi adicionada, observando-se o desenvol vimento de cor proporcionalmente à quantidade das interleucin as ligadas. A reação fo i então estabilizada por meio da adição de uma solução de ácido sulfúrico 2N e a intensidade da cor foi medida por um leitor de ELISA. Como padrões, foram usadas 6 soluções de concentrações diferentes e conheci das de IL-12 e IL-18 recombinantes. Utilizamos os kits IL-12 (p70) Humana (Human IL-12 p70 Kit, BD Biosciences, San Diego, USA) para a IL-12 e IL-18 ELISA (IL-18 ELISA, IBL, Hamburg, Alemanha). O limite de dete cção do kit de IL-12 preconizado pelo laboratório foi de 4 pg/mL e o do kit de IL-18 foi de 9,2 pg/mL. Para o cálculo dos resultados, foram criadas curvas-padrão com base nos resultados dos padrões (média dos conjuntos de padrões ensaiados em duplicata), utilizando-se um programa de computador específico (SPSS versão 10.0). Pacientes e Métodos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 29 Análise Estatística Para cada interleucina, fora m comparadas as concentrações verificadas no sangue e no líquido peritoneal nos casos e nos controles. Foram avaliadas as médias (teste t de Student) e as proporções por faixa de dispersão (testes chi-quadrado e Fisher). As variáveis quantitativas foram apresentadas descritivamente em gráficos. Os grupos foram comparados com o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis; quando significante, co mplementou-se com o teste de Dunn para discriminar a(s) diferença(s). Os valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Os casos foram categorizados para avaliação estatística segundo a fase do ciclo, sintomas, local da d oença, estadiamento e classificação histológica . Pacientes e Métodos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 30 RESULTADOS _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 31 Resultados Os dados do estudo foram obtidos at ravés de comparações entre os resultados do grupo de pacientes com endometriose e do grupo controle em relação a diversos parâmetros. Na tabela 1 está a distribuição das pacientes conforme sintomas, localização da doença, estadiamento e classificação histológica da endometriose . Tabela 1 - Comparação entre os grupos controle e com endometriose em relação aos sintomas, locais de doença, estadiamento e classificação histológica CARACTERÍSTICA GRUPO COM ENDOMETRIOSE GRUPO CONTROLE p N % N % DISMENORRÉIA SEVERA OU INCAPACITANTE 47 83,9% 9 16,0% 0,001* DISPAREUNIA DE PROFUNDIDADE 36 51,4% 12 36,3% 0,153 ALGIA PÉLVICA ACÍCLICA 44 62,8% 13 39,3% 0,025* INFERTILIDADE 26 37,1% 8 25,0% 0,227 ALTERAÇÃO INTESTINAL CÍCLICA 37 52,8% 2 6,0% 0,001* ALTERAÇÃO URINÁRIA CÍCLICA 2 2,8% 0 0% 1 DOENÇA PERITONEAL 33 47,1% DOENÇA OVARIANA 41 58,5% DOENÇA PROFUNDA 36 51,4% ENDOMETRIOSE INICIAL (ESTÁDIOS I E II) 28 38,9% ENDOMETRIOSE AVANÇADA (ESTÁDIOS III E IV) 44 61,1% ENDOMETRIOSE MISTA E/OU INDIFERENCIADA 44 61,1% ENDOMETRIOSE ESTROMAL E/OU BEM DIFERENCIADA 28 38,9% * : p<0,05 A avaliação das dosagens das interl eucinas 12 e 18, comparando o grupo com endometriose em geral (n=72) em relação ao grupo controle foi analisada, e os resultados estão apresentados na tabela 2. _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 32 Tabela 2 – Comparação das dosagens das interleucinas 12 e 18 entre o grupo controle e o grupo de pacientes com endometriose (pg/mL) IL 12 IL18 sangue Fluido peritoneal sangue Fluido peritoneal Controle 97,13+/-19,02 29,20+/-10,21 62,07+/-8,08 112,51+/-29,24 EDT 152,14+/-22,59 82,37+/-16,61 70,52+/-0,00 142,54+/-23,39 p 0,16 <0,001* 0,39 0,22 Também procedemos à análise das dos agens das interleucinas 12 e 18 em relação à fase do ciclo mens trual em que as pacientes foram submetidas ao procedimento videolapar oscópico. Os resultados estão apresentados na tabela 3. Tabela 3 – Comparação das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal entre o grupo controle e pacientes com endometriose em relação à fase do ciclo menstrual (média +/- erro padrão em pg/mL) Controle ENDOMETRIOSE sangue Fluido peritoneal sangue Fluido peritoneal IL12 Fase folicular 101.98 + 24.21 36.04 + 13.2 125.25 + 19.46 82.54 + 16.58 IL12 Fase lútea 81.98 + 22.32 7.83 + 3.83 152.69 + 45.98 40.56 + 14.2 p 0,753 0,176 0,644 0,231 IL18 Fase folicular 56.29 + 7.67 126.62 + 37.05 57.57 + 10.17 159.98 + 29.94 IL18 Fase lútea 80.12 + 23.25 68.38 + 32.34 56.49 + 26.09 91.2 + 33.28 p 0,542 0,444 0,542 0,479 Comparamos as dosagens das interl eucinas 12 e 18 entre o grupo controle e as pacientes com endometriose segundo os sintomas apresentados, conforme demonstrado na tabela 4. Resultados _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 33 Tabela 4 – Comparação das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal entr e o grupo controle e o grupo com endometriose, segundo os sintomas apresentados. n sangue FP n sangue FP sangue FP Dismenorréia severa 12 9 86.92 + 23.68 35.94 + 23.17 47 151.87 + 27.54 82.21 + 20.54 0,77 0,02* 18 9 97.16 + 13.19 199.79 + 86.79 47 77.59 + 16.5 158.68 + 30.03 0,01* 0,86 Dispareunia de profundidade 12 12 158.81 + 41.77 44.83 + 23.39 38 132.27 + 30.59 101.62 + 29.25 0,26 0,02* 18 12 82.45 + 13.81 161.81 + 69.81 38 61.34 + 14.05 162.19 + 38.09 0,03* 0,36 Dor acíclica 12 13 126.64 + 31.82 40.08 + 19.91 44 165.67 + 29.2 101.93 + 26.14 0,89 0,02* 18 13 49.86 + 11.05 146 + 65.34 46 86.45 + 17.32 147.85 + 32.07 0,46 0,47 Infertilidade 12 8 97.03 + 22.53 44.53 + 25.55 28 167.63 + 40.4 122.76 + 41.61 0,70 0,27 18 8 84.45 + 22.16 173.65 + 90.26 28 50.3 + 7.37 103.22 + 25.09 0,30 0,42 Alterações intestinais cíclicas 12 2 75.27 + 12.17 11.28 + 7.28 39 162.18 + 31.34 105.59 + 29.56 1,00 0,11 18 2 26.3 + 15.07 59.99 + 20.98 39 63.16 + 13.14 161.87 + 30.5 0,36 0,73 Alterações urinárias cíclicas 12 0 2 134.92 + 56.03 380.86 + 300.85 18 0 2 32.24 + 10.75 210.65 + 77.38 pVariável IL Controle Endometriose *: p<0,05 Realizamos a avaliação das dosagens das interleucinas 12 e 18 entre o grupo de pacientes com endometrio se segundo o local da doença e os resultados estão representados na tabela 5. Tabela 5 – Comparação entre as dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal em relação à localização da doença, segundo critério de gravidade (pg/mL). Média Erro padrão Média Erro padrão Média Erro padrão IL - 12 sg 146,43 43,86 96,86 28,00 178,50 35,24 0,31 FP 53,02 15,20 71,59 19,32 103,98 30,83 0,62 IL - 18 sg 68,91 17,32 103,56 38,08 57,70 13,43 0,42 FP 142,26 56,52 109,89 37,86 156,30 29,95 0,31 Variável p Ovário (n=21) Peritônio (n=15) Profunda (n=36) Resultados _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 34 De acordo com o estadiamento pr oposto pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva dividimo s as pacientes do grupo com endometriose. Realizamos a comparação das dosagens das interleucinas 12 e 18 entre o grupo controle e o grupo com endometriose que também foi subdividido segundo o estadiamento. Os resultados estão apresentados nas tabelas 6 e 7. Tabela 6 – Comparação das dosagens da interleucina 12 no sangue e no fluido peritoneal entre o gr upo controle e pacientes com endometriose subdivididas segundo o estadiamento (ASRM, 1996; média +/- erro padrão em pg/mL) IL-12 estádios I/II(n=28) estádios III/IV(n=44) sangue FP sangue FP média 82,04 62,54 196,74 94,98 erro padrão 16,63 14,13 33,91 25,61 p-value 0,007* 0,71 * : p<0,05 Tabela 7 - Comparação das dosagens da interleucina 18 no sangue e no fluido peritoneal entre o gr upo controle e pacientes com endometriose subdivididas segundo o estadiamento (ASRM, 1996; média +/- erro padrão em pg/mL) IL-18 estádios I/II(n=28) estádios III/IV(n=44) sangue FP sangue FP média 51,28 97,21 82,77 171,38 erro padrão 10,56 27,21 17,49 33,65 p-value 0,63 0,05 Resultados _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 35 De acordo com a classificação histológica da endometriose realizamos a comparação das dosagens de IL-12 e IL-18 no sangue e no fluido peritoneal. Verificamos que não houve diferença estatisticamente significante entre as categorias hist ológicas e as dosagens das referidas interleucinas, mas houve uma tendência ao aumento da IL-12 sérica em pacientes com formas mais indiferenc iadas da endometriose. Os resultados estão demonstrados nas tabelas 8 e 9. Tabela 8 – Comparação das dosagens da interleucina 12 no sangue e no fluido peritoneal no grupo de pacientes com endometriose, de acordo com a categoria histológica . IL12 Fluido peritoneal IL12 Sérica nm é d i a erro padrão nm é d i a erro padrão Sem indiferenciação 28 63,21 13,77 28 104,04 21,01 Com indiferenciação 44 94,56 25,70 44 182,74 33,86 p 0,9120 0,1149 Categoria Histológica Tabela 9 – Comparação das dosagen s da interleucina 18 no sangue e no fluido peritoneal no grupo de pacientes com endometriose, de acordo com a categoria histológica. IL18 Fluido peritoneal IL18 Sérica nm é d i a erro padrão n média erro padrão Sem indiferenciação 28 123,39 29,30 28 80,17 22,89 Com indiferenciação 44 154,72 33,55 44 64,39 12,16 p 0,8524 0,7859 Categoria Histológica Resultados _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 36 DISCUSSÃO _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 37 Discussão Nosso trabalho avaliou o comportamento das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal em um grupo controle composto por 33 pacientes com quadro clínico sugestivo e ausência comprovada de endometriose e em 72 pacientes com endometriose com diferentes características. Até o presente mom ento inexiste na literatura trabalho semelhante que correlacione essas duas citocinas com a fase do ciclo menstrual, sintomas, estadiamento, lo cal e classificação histológica da doença, o que apresenta um panorama global dos di versos aspectos da endometriose, todos envolvidos no ent endimento completo da mesma. O estudo desses parâmetros correlaci onados às dosagens das referidas interleucinas poderia representar um a nova proposta no entendimento mais claro da fisiopatologia da endometriose. Sabidamente, a IL-12 e a IL- 18 participam ativamente da base imunológica, fundamentalmente da reposta Th1 (Gazvani et al., 2001; Gracie et al., 2003). Reconhecemos ser esse um dos principais mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento da doença, daí a importância do conhecimento mais profundo acerca do comportamento de cada elemento dele constituinte nos eventos rela cionados ao processo etiopatogênico (Podgaec et al., 2007). Quando o tecido endometrial refluído pelas tubas uterinas atinge a cavidade pélvica, inicia-se uma res posta imune. Os macrófagos peritoneais são as primeiras células recrutadas , reconhecem o tecido endometrial como antigênico e fagocitam-no para proce ssá-lo no ambiente intracelular. Partículas do tecido fagocitado são expostas na superfície dos macrófagos e reconhecidas por linfócitos Th pr imordial. Nesse momento, com a participação das interleucinas 12 e 18, há a transformação desses linfócitos Th primordial em Th1, determinando a via de resposta imune celular. _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 38 A IL-12 atua nesse processo aumentando a citotoxicidade das células NK e estimulando a secreção de outra s citocinas, principalmente o interferon-gama. A IL-18 igualmente atua de modo signific ativo, induzindo a produção e secreção do interferon-gama, além de estimular a própria produção da IL-12, do TNF-alfa e de ci tocinas do braço Th2. Portanto, sob estímulo das interleucinas 12 e 18 sintetizadas por células NK e macrófagos, os linfócitos Th primordial diferenciam-se em Th1 (Podgaec & Abrão, 2005). Assumindo-se que a ocorrência da resposta imune Th1 seja de fundamental importância para o controle do ambiente peritoneal com limpeza das células refluídas, inferimos que o mecanismo fisiológico anteriormente descrito apresente alterações na en dometriose, propici ando o implante e crescimento dos focos ectópicos. Hsu et al. (1997) creditaram ao desequilíbrio entre as respostas Th1 e Th2, pendendo para a resposta Th2, a explicação para as alterações imunológicas encontradas em mulheres com endometriose. A importância de tal desequi líbrio já havia sido demonstrada em outros processos fisiológicos, como nas falhas de implantação e abortamentos de repetição (Chaouat et al., 2002; Lédée-Bataillle et al., 2004). Podgaec (2006) encontrou aumento das citocinas Th2 nas pacientes com endometriose. Apesar do melhor conhecimento dos mecanismos envolvidos na etiopatogenia da endometriose dive rsos aspectos ainda permanecem obscuros, sendo vasto o campo de pesquisa nesta área. Trabalhos recentes em imunologia têm trazido esclarecim entos da base fisiopatológica do processo explicando-nos os passos fundamentais que culminam na permissão para o implante, crescim ento e desenvolvimento do tecido endometrial em sítio extra-uterino. Além disso, as terapias atualmente disponíveis para o trat amento da doença baseiam-se na citorredução e citossupressão das células ectópi cas, logo, quando suspensas, não conseguem impedir a recidiva ou o avanç o da mesma (Lebovic et al., 2001). Por outro lado as terapias mais eficaz es existentes em nossos dias apóiam- se na interrupção com bloqueio do fluxo menstrual (Petta et al.,2005, de Sa Rosa e Silva et al., 2006; Hansen e Eyster, 2006); salie ntando que muitas Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 39 das pacientes têm desejo reprodutivo, e ssas técnicas tornam-se dificultosas à obtenção da gestação. O entendiment o mais profundo dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na gênes e da endometriose poderia permitir o desenvolvimento de terapias mais adequadas ao combate das causas fundamentais do processo com ações mais duradouras e efetivas. A fase do ciclo menstrual pode ser entendida como relevante para o entendimento do comportamento das in terleucinas na endometriose. Sabendo que o estímulo à resposta oco rre durante a fase menstrual, que é justamente quando acontece a chegada do tecido endometrial à cavidade pélvica, poderíamos inferir que as dosagens das interleucinas relacionadas a essa resposta deveriam ser mais elev adas nessa época. Esse, no entanto, não foi o resultado observado por Gazvani et al. (2001) que não encontraram diferenças nas dosagens de IL-12 nas fa ses folicular e lút ea. Arici et. al (2003) encontraram elevação das dosag ens peritoneais de IL-18 na fase lútea em comparação com a fase folic ular. Luo et al. (2006) também avaliaram as diferentes fases do ciclo em relação à secreção de IL-18 e verificaram que, em mulheres hígidas, a secreção dessa citocina estava bastante elevada na fase secretór ia quando comparada à fase folicular, entretanto tal diferença não era observada entre as pacientes com endometriose. Podgaec et al. (2007), estudando outra citocinas envolvidas nas respostas Th1 e Th2 em pacie ntes com endometriose, encontrou aumento das dosagens de IL-10 na fase folicular em mulheres com a doença quando comparadas a um grupo controle sem a doença. Nossos resultados em relação à fase do ciclo não most raram diferenças nas dosagens sérica ou no fluido peritoneal das interleucinas 12 e 18. Estudamos os dois grupos (casos e controles) em relação aos sintomas apresentados. Ressaltamos que nosso grupo controle era composto por mulheres com quadro cl ínico sugestivo de endometriose, motivo pelo qual foram submetidas à videolaparoscopia. Os sintomas clássicos mais relacionados à presenç a de endometriose foram analisados (dismenorréia severa ou incapacitante, dispareunia, algia pélvica acíclica, infertilidade, alterações intestinais e alterações urinárias cíclicas). Os Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 40 sintomas da mulher com endometriose podem ser ricos, mas trabalhos anteriores já demonstraram que a in tensidade dos sintomas não se correlaciona, necessariamente, com a severidade da doença (Zeyneloglu et al., 1998). Em nossa casuística, três sintomas mostraram-se relevantes e com diferença do ponto de vista estatístico: a dismenorréia severa/incapacitante, a dispareunia de profundidad e e a dor acíclica. A interleucina 12 estava aumentada no fluido peritoneal de pacientes com endometriose que apresentavam as três queixas; a interleucina 18, por outro lado, apresentou-se significativament e aumentada, no sangue, na presença de dispareunia de profundidade. Avalia mos, em ambos os casos, o comportamento destes sintomas em relação à doença profunda que estava presente em 65,3% das pacientes com dismenorréia severa/incapacitante, 62,5% das pacientes com dispar eunia de profundidade e 75,8% das pacientes com dor acíclica. Estabel ecemos, assim, um raciocínio: na presença de doença profunda, os sintom as anteriormente mencionados são mais prevalentes; como a doença pr ofunda desencadeia resposta imune mais intensa, as interleucinas da via Th1 estão mais elevadas. Até o presente momento inexistem, na literatura, estudos semelhantes. Esta foi uma vantagem em avalia rmos um grupo controle onde os sintomas de dor pélvica em suas diferentes apresentações (dismenorréia, dispareunia ou dor acíclica) ou infert ilidade, considerados primordiais em mulheres com endometriose, também estivessem presentes. Desta forma, quando a análise estatística em relação aos sintomas mostrou diferença, podemos relacionar tais diferenças devido à presença da endometriose. Estudo anterior realizado em nosso meio avaliando 244 pacientes do Ambulatório de Endometriose da Clíni ca Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo encontrou prevalência de dismenorréia em 86% dos casos, representando a queixa mais importante; em relação às altera ções intestinais, apesar de não terem sido tão freqüentes (29,1% dos casos), apresentaram forte correlação com o acometimento intestinal nas formas de doença profunda (Neme e Abrão, 2000). Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 41 A análise do local da doenç a foi realizada respei tando o critério de gravidade onde a doença pr ofunda é considerada a mais agressiva e a forma peritoneal a mais branda. Inicialmente avaliamos se as interleucinas 12 e 18, tanto no sangue quanto no fluido periton eal, sofriam alguma alteração na presença isolada da doença peritoneal , mas não encontramos diferenças significativas. Sendo assim, aplicamos o mesmo raciocínio para avaliar a doença profunda isoladamente e também não encontramos diferenças estatisticamente significativas. A classificação atualmente aceita para a endometriose foi proposta em 1985 pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva e revisada pela mesma entidade em 1996. Baseia-s e, fundamentalmente, no tamanho dos implantes, em sua profundidade e na presença de aderências em relação ao peritônio, ov ários e fundo-de-saco de D ouglas. Determina quatro estadiamentos diferentes, de I a IV, co m severidade crescente, baseado na somatória de pontos de achados intraoperatór ios. Essa classificação é falha em não avaliar e separar formas mais graves da doença como o comprometimento dos tratos urinário e intestinal, o que foi melhor abordado por Nisolle & Donnez, em 1997, com a pr oposta de dividir a endometriose em três entidades distintas (ovário, peritônio e septo-retovaginal). Realizamos a divisão do grupo de pacientes com endometriose em relação ao estadiamento da doença agrupando-as em doença inicial (estádios I e II) e doença avançada (estádi os III e IV). Em nossa casuística 28 pacientes tinham doença inicial ( 38,9%) e 44 pacientes tinham doença avançada (61,1%). A anális e das dosagens de IL-12 mostrou que, no fluido peritoneal, a mesma se encontrava significativamente aumentada em pacientes com endometriose em relaç ão ao grupo controle; no sangue esta citocina estava mais elevada em pac ientes com endometriose avançada do que nas pacientes com doença inic ial. Portanto, quando subdivididas segundo o estadiamento, as pacientes com endometriose avançada apresentavam dosagens séricas de IL- 12 significativamente maiores que na endometriose inicial. Isso pode reflet ir que nas pacientes com a doença há Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 42 realmente uma ativação imunológica visando à via de resposta celular inicial em combate ao antígeno representado pelo tecido endometrial. Assim encontramos nesse resultado de elevação de IL-12 no fluido peritoneal um primeiro im portante indício da ativ ação imunológica do microambiente peritoneal na doença. Entendemos que a chegada de células endometriais à cavidade pélvica desencadeia, de imediato, a resposta imune Th1. Estudos semelhantes ao nosso fora m realizados em outros meios. Zeyneloglu et al., em 1998, compararam as dosagens de IL-12 no fluido peritoneal de mulheres hígidas que seriam submetidas à laqueadura tubárea e pacientes com endometriose e não encontraram diferenças estatisticamente significantes entre os grupos estudados. Mazzeo et al. (1998) mostraram que a principal al teração relacionada à IL-12 em pacientes com endometriose era o aume nto da secreção da cadeia pesada (p40) em relação à cadeia leve ( p35), ressaltando que a cadeia pesada funcionaria como inibidor da própria f unção da IL-12, por competição direta no receptor específico, prejudicando, a ssim, a ativação secundária do clone NK e, conseqüentemente, a resposta Th1. Em ambos os estudos mencionados, o grupo controle era co mposto de pacientes que seriam submetidas à laqueadura tubárea, ou seja, sem queixas clínicas sugestivas de endometriose, como ocorria no nosso grupo controle, o que talvez possa explicar as diferenças nos resultados encontrados. Gazvani et al. (2001) também não encontraram diferenças nas dosagens de IL-12 no fluido peritoneal de pacientes com endometri ose e grupo controle, nem mesmo quando comparadas as diferentes fases do ciclo menstrual. Neste estudo, diferentemente dos anterio res, o grupo controle assemelhava-se ao nosso, com pacientes submetidas à cirurg ia videolaparoscópica por doenças benignas, incluindo dor abdominal, infe rtilidade e indicação de laqueadura tubárea; o kit de dosagem de IL-12 ut ilizado é que diferia do nosso (R&D Systems, Abingdon, UK), com limite de detecção in ferior ao limite que usamos (2 pg/mL). Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 43 Nossos resultados também mostraram que as dosagens de IL-12 mostraram-se significativamente mais el evadas nos estádios avançados (III e IV) da endometriose, quando comparadas aos estádios iniciais (I e II). Associando esses achados com o mecani smo fisiopatológico da resposta imune Th1, poderíamos inferir que, quanto mais agressiva e profunda a doença, mais intenso seria o processo imunológico desencadeado por ela, de modo que isso explicaria, em parte , a elevação da IL-12. A dosagem peritoneal aumentada da IL- 12 nas pacientes com endometriose em relação àquela do grupo controle, bem como ní veis mais avançados da referida interleucina quanto mais agressiva a doença, demonstra-nos, claramente, que, em pacientes sem endometriose, não há a ativação imunológica da via Th1 e também que essa ativação é tão mais intensa quanto mais severo for o estímulo antigênico representado pelos focos ectópicos da doença. A IL-18 está envolvida em ambas as respostas imunes, Th1 e Th2. Seu papel mais relevante na etiopat ogenia da endometriose é o estímulo à resposta Th1; dependendo do micr oambiente encontrado, pode haver supressão ou inibição da resposta Th2 (Lewkowich et al., 2002). Antes de ser caracterizada como uma citocina específica, era conhecida como fator indutor do interferon-gama. Integra a superfamília da IL-1 e é secretada como pró-IL-18, sofrendo clivagem posterior na forma madura IL-18 no ambiente extracelular (Nakanishi et al., 2001). O reconhecimento inicial caracterizou-a como uma citocina pr ó-inflamatória, mas posteriormente foram ressaltadas diversas outras funções como a secreção de outras citocinas e angiogênese (Park et al., 2001). Trabalhos foram publicados sobre o comportamento da IL-18 nas mulheres com endometriose. Seus resultados são conflitantes, de modo que, até o momento, não há consenso na liter atura sobre a relação da IL-18 com a doença, o que nos motivou a averiguar ta l situação em pacientes de nosso meio. O trabalho de Zhang et al. (2004) encontrou menores dosagens da IL-18 peritoneal em mulheres com endometriose; por outro lado, não Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 44 encontrou correlação entre as dosagens sérica e peritoneal desta citocina. Em outros dois trabalhos (Arici et al ., 2003; Oku et al., 2004), as dosagens peritoneais de IL-18 na endometriose estavam aumentadas. Em nosso meio, Glitz (2006) não encontrou diferenças ent re as dosagens sérica e peritoneal de IL-18 em pacientes com endomet riose mínima. Nosso trabalho não encontrou diferenças estatisticamente si gnificantes nas dosagens sérica ou peritoneal da IL-18 na comparação de pac ientes com endometriose e grupo controle, mas tendência ao aumento de IL-18 peritoneal nos estádios avançados da doença. Os trabalhos analisados têm algumas semelhanças e muitas diferenças, o que poderia explicar a divergência nos resultados encontrados. Novamente observamos que os grupos de pacientes estudados, quer seja o de casos ou de controles, não eram uniformes, prejudicando a comparação entre os mesmos. Arici et al. (2003) estudaram 50 pacientes com endometriose não tratada e 8 pacientes tratadas com análogos do GnRH, comparando-as com 18 pacientes que seriam submetidas à laqueadura tubárea por via laparoscópica. Esses critérios diferiam dos nossos em relação ao uso de medicação no moment o da cirurgia pelas 8 mulheres e também em relação ao grupo cont role sem queixas sugestivas de endometriose. Questionamos se o uso de análogo do GnRH no momento da cirurgia não teria alterado os resultados encontrados por diminuir o processo inflamatório pélvico nessas pacientes. Zhang et al. (2004) estudaram 44 pacientes submetidas à videolaparoscopia por doenças ginecol ógicas benignas, comparando-as a um grupo controle de 22 pacientes que seriam submetidas à laqueadura tubárea. Dentre as 44 pacientes do gr upo de casos foram selecionadas 22 em que a endometriose foi confirmada. Esses critérios assemelharam-se aos nossos em relação ao grupo de casos, mas diferiram em relação ao grupo controle, mais uma vez assintomático em relação à endomet riose. Essa, no nosso ponto de vista, seria a maior diferença entre nosso trabalho e o de Zhang et al., além da diferença no kit utilizado, podendo estar implicada na divergência dos resultados encontrados. Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 45 Oku et al. (2004) utilizaram critér ios para a inclusão nos grupos de casos e controles muito semelhantes aos nossos, sendo 39 pacientes com endometriose comprovada e 19 paci entes com outras condições ginecológicas benignas; no entanto a diferença encontrada foi que nesse estudo todas as amostras foram colhidas na fase folicular do ciclo menstrual. Dessa forma, utilizando critérios semelhantes, seus resultados diferiram dos nossos com dosagens mais elevadas de IL-18 no fluido peritoneal de pacientes com endometriose. No estudo de Glitz (2006) fora m avaliadas 34 mulheres com infertilidade e endometriose inicial no grupo de casos e 22 mulheres hígidas submetidas à laqueadura tubárea. Co mo os grupos eram diferentes daqueles por nós estudados, os resultados também puderam ser interpretados de maneira diferente. A via comumente envolvida na secreção da IL-12 passa, inicialmente, pela secreção de IL-18 que, como vimos, é cofator importante para sua liberação. Nossos resultados mostraram, na avaliação das dosagens da IL- 18, que houve tendência ao aumento da me sma em estádios avançados da doença, não existindo diferenças nos estádios iniciais, nos quais foi encontrada a diferença anteriormente mencionada em relação à IL-12 peritoneal. Como interpretar tal discor dância entre as dosagens peritoneais de IL-12 e IL-18 se assumíssemos ser um processo encadeado? Deparamo-nos, aqui, com um conceito recente, de que nem sempre a produção de IL-12 seja dependente do estím ulo de IL-18. Já se acredita que exista uma outra via de produção de IL-12, que independe do estímulo de IL- 18 (Morita et al., 2005). Essa, talv ez, seja a via predominantemente envolvida na endometriose, explicando o porquê do aumento das dosagens de IL-12 sem modificação significativa das dosagens de IL-18. Outra classificação baseada nos difere ntes aspectos histológicos da doença foi proposta por Abrão et al. em 2003. Nela a doença foi agrupada em quatro categorias (estromal, be m-diferenciada, padrão misto de diferenciação e indiferenciada), de acordo com sua maior ou menor Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 46 semelhança com o endométrio tópico. Tal proposta mostrou-se útil na possibilidade de pr edizer o padrão de compor tamento da doença, sendo o padrão indiferenciado considerado como o de pior prognóstico e também o que diferenciava a evolução mais agr essiva da doença. Fizemos a análise dos 72 casos em relação ao tipo histológico, sendo que 28 pacientes foram categorizadas como sem indiferencia ção, ou seja, só apresentavam as formas estromal e/ou bem-difer enciada da doença, e 44 pacientes categorizadas como com indiferencia ção por apresentarem as formas mista ou indiferenciada da endometriose. Após a avaliação dos dados, verificamos que, em nossa amostra, quando o es tadiamento da endometriose foi correlacionado com o tipo histológico da doença, a forma avançada (estádios III e IV) apresentou maior prevalência de tipos mais indiferenciados (formas mista e indiferenciada). Consideramos que, na doença mais agressiva, tanto a evolução para estádios mais avançados é mais rápida quanto o tipo histológico já é, por natur eza, mais indiferenciado e agressivo. O contrário também se revelou ver dadeiro, pois a avaliação das pacientes com estádios iniciais (I e II) mostrou maiores prevalências das formas menos agressivas (estromal e bem-diferenciada). Ao realizarmos a análise estatística da comparação das dosagens sérica e no fluido peritoneal das in terleucinas 12 e 18 em relação à classificação histológica não observamos diferenças significativas. Houve, no entanto, tendência a maiores dosagens de IL-12 sérica nas pacientes com formas mais indiferenciadas da doença (p = 0,11). Ressaltamos, novamente, a proposta mais recente da via independente de produção da IL- 12. Provavelmente na doença mais agre ssiva e indiferenciada, possamos assumir que a ativação imunológica já seja mais intensa desde o início do processo. Isso posto, acreditamos que a elevação da IL-12 nesta forma mais agressiva pode demonstrar esse recr utamento do sistem a imune tentando controlar o avanço da mesma. De modo geral, nossos resultados mostram que a resposta Th1 (celular) está mais ativada em pacientes com endometriose e em mulheres com quadro clínico sugestivo, mas sem a doença. Algumas críticas podem Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 47 ser feitas, fundamentalmente a respei to do tipo de grup o controle que utilizamos, que difere de outros trabalhos publicados, nos quais o que mais se encontra são mulheres que es tão sendo submetidas à laqueadura tubárea por via laparoscópica. Defen demos a utilização de um grupo controle com quadro clínico semelhant e e comprovadamente sem a doença, pois esta é um forma eficaz de evitarmos o viés que somente a dor crônica poderia dar na secreção das citocinas inflamatórias. Quando ambos os grupos apresentam queixas clínicas seme lhantes, e os resultados mostram que a dosagem da IL-12 peritoneal é maior no grupo com endometriose, que a dosagem de IL-12 sérica eleva-se conforme o avanço da doença (estádios III e IV) e que a dosagem de IL-18 per itoneal sofre tendência a aumentar também com o avanço da doença, podemos inferir que tal diferença é decorrente da presença da própria endometriose. Nosso trabalho pôde avaliar o comportamento da doença e da secreção das interleucinas 12 e 18 em pacientes de um grupo controle com quadro clínico sugestivo e comprovação de ausência de endometriose e nos diferentes estádios da doença. Pudemos também estudar as localizações da doença e o estadiamento da endometri ose, correlacionando-os com o comportamento das citocinas referi das e em relação à fase do ciclo estudada. Incluímos, ainda, em nossa aná lise, a classificação histológica da endometriose, demonstrando tendência ao aumento da IL-12 sérica em pacientes com formas mais indiferenciadas da doença . Entendemos, também, pelas di ferenças de comportamento apresentadas em relação às dosagens de IL-12 e IL-18, que na endometriose a via alternativa de se creção de IL-12 independente de IL-18 possa estar fortemente ativada. Nenhum outro trabalho analisado fe z estudo semelhante, de modo que apresentamos resultados que podem contribuir no entendimento da fisiopatologia da endometriose e auxiliar no desenvolvimento de novas técnicas diagnósticas e terapêuticas. Outros estudos se fazem necessários para que consigamos compreender, de modo definitivo, o papel imunológico, Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 48 histológico e outros diferentes par âmetros envolvidos nesta complexa entidade globalmente conhecida como endometriose. Discussão _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 49 CONCLUSÕES _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 50 Conclusões Nossos resultados permitiram concluir que: • pacientes com endometriose apresent aram dosagens mais elevadas de Interleucina 12 no fluido peritoneal em relação às pacientes do grupo controle; • não houve diferenças nas dosagens sérica da Interleucina 12, nem nas dosagens sérica ou no fluido peritoneal da interleucina 18 em pacientes com endometriose comparadas ao grupo controle; • não houve diferenças em relação às dosagens de Interleucina 12 e 18 no sangue ou no fluido peritoneal em relação à fase do ciclo menstrual nas pacientes com endometriose; • a interleucina 12 esteve aumentada no fluido peritoneal de pacientes com dismenorréia severa/incapacitante, di spareunia de profundidade e dor acíclica; • a interleucina 18 esteve aument ada, no sangue, em pacientes com dispareunia de profundidade; • não houve diferenças nas dosagens das interleucinas 12 e 18 ao compararmos a doença de peritônio, ovário e profunda; • pacientes com endometriose em es tádios avançados apresentaram dosagens séricas de Interleucina 12 mais elevadas em relação aos estádios iniciais da doença; • não houve diferença em relação às dosagens de Interleucina 18 entre os estádios da doença; • não houve diferença nas dosagens de Interleucina 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal em relação à clas sificação histológica nas pacientes com endometriose. _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 51 ANEXOS _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 52 Anexo A – Aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa do HCFMUSP Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 53 Anexo B: Termo de Consentimento pós-informação. HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO TERMO DE CONSENTIMENTO PÓS -INFORMAÇÃO (Obrigatório Para Pesquisas Científicas em Seres Humanos - Resolução Nº 01 de 13.6.1988 - CNS) I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME DO PACIENTE: ____________________________________________________________________________________ DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº: _________________________SEXO: M  F X DATA NASCIMENTO:___/___/___ ENDEREÇO: _________________________________________________________________Nº_____APTO_____ BAIRRO: __________________________________________________CIDADE: _______________________________________ CEP: _____________ TELEFONE: (___) _________________________ 2. RESPONSÁVEL LEGAL: ___________________________________________________________________________________ NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.): _________________________________ DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº: _________________________SEXO: M  F X DATA NASCIMENTO:___/___/___ ENDEREÇO: _________________________________________________________________Nº_____APTO_____ BAIRRO: __________________________________________________CIDADE: _______________________________________ CEP: _____________ TELEFONE: (___) _________________________ II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: Avaliação das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal de pacientes com endometriose pélvica 2. PESQUISADOR: Flávia Fairbanks Lima de Oliveira Marino CARGO/FUNÇÃO: Médico Pós-Graduando INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº: 93879 UNIDADE DO HCFMUSP: Departamento de Ginecologia 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: SEM RISCO  RISCO MÍNIMO  (probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano RISCO MÉDIO X RISCO MAIOR  como consequência imediata ou tardia do estudo) 4. APROVAÇÃO DO PROTOCOLO DE PESQUISA PELA COMISSÃO DE ÉTICA PARA ANÁLISE DE PROJETOS DE PESQUISA- CAPPESQ/HC. 5. DURAÇÃO DA PESQUISA: .2 anos III - EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU REPRESENTANTE LEGAL 1. Justificativa e objetivos da pesquisa: para o tratamento da sua doença, a senhora terá que ser submetida a uma cirurgia. O objetivo deste estudo é avaliar se a coleta de sangue de seu braço e de líquido que existe em seu abdome no início da cirurgia pode ajudar no diagnóstico e tratamento da sua doença que se chama endometriose. 2. Procedimentos que serão utilizados e propósitos, incluindo a identificação dos procedimentos que são experimentais: conforme comentado acima, a senhora será submetida a cirurgia e também a coleta de sangue do braço e de líquido do abdômen durante esta cirurgia. Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 54 3. Desconfortos e riscos esperados: durante a ciru rgia podem ocorrer complicações, já que a senhora estará anestesiada, mas, conforme comentado, sua do ença exige esta cirurgia. Todo o procedimento da pesquisa será realizado enquanto a senhora estiver an estesiada. Os desconfortos podem ocorre depois, como: dor no local da cirurgia, fraqueza, vômito (pela anestesia), infecção no corte e hematoma (mancha roxa na pele). 4. Benefícios que poderão ser obtidos: com esta pesqui sa da qual a senhora está participando, tentamos descobrir se com os exames de sangue e do líquido de seu abdome poderíamos evitar a cirurgia nos casos de endometriose. 5. Procedimentos alternativos que possam ser vantajosos para o indivíduo: não há. 6. Esclarecimento sobre a garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento, a qualquer dúvida acerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a pesquisa e o tratamento do indivíduo: X Sim  Não 7. Esclarecimento sobre a liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e deixar de participar no estudo, sem que isto traga prejuízo à continuação do seu cuidado e tratamento: X Sim  Não 8. Compromisso sobre a segurança de que não se id entificará o indivíduo e que se manterá o caráter confidencial da informação relacionada com a sua privacidade: X Sim  Não 9. Compromisso de proporcionar informação atuali zada obtida durante o estudo, ainda que esta possa afetar a vontade do indivíduo em continuar participando: X Sim  Não 10. Disponibilidade de assistência no HCFMUSP: X Sim  Não 11. OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES: ___________________________________________________________ IV - CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO Declaro que, após ter sido convenientemente esclarecido pelo pesquisador, conforme registro nos itens 1 a 11, do inciso III, consinto em participar, na qualidade de paciente, do Projeto de Pesquisa referido no inciso II São Paulo, ____de ____________de 20___. ___________________________________________ ________________________________________ assinatura do paciente ou responsável legal assinatura do pesquisador que obteve o c o n s e n t i m e n t o (carimbo ou nome Legível) NOTA: Este termo deverá ser elaborado em duas vias, ficando uma via em poder do paciente ou seu representante legal e outra deverá ser juntada ao prontuário pelo paciente. Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 55 Anexo C - Idade, dia do ciclo menstrual (relativo às coletas de sangue e fluido peritoneal) e quadro clínico das pacientes e controles GRUPO Iniciais idade dia ciclo dism dispar dor ac infert alt. intest alt urin ENDOMETRIOSE CFO 37 5 sim não sim não não não ENDOMETRIOSE SMM 32 3 sim não sim não sim não ENDOMETRIOSE FMO 18 4 sim não sim não não não ENDOMETRIOSE COM 34 2 não não não sim não não ENDOMETRIOSE MSQM 26 9 sim sim não não não não ENDOMETRIOSE AR 23 3 não sim não não não não ENDOMETRIOSE MLOC 40 13 sim sim sim não sim não ENDOMETRIOSE CAC 27 10 não sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE SVFB 39 7 não não sim sim sim não ENDOMETRIOSE RCA 30 5 sim não não não não não ENDOMETRIOSE DRD 33 27 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE ST 30 1 não não sim não não não ENDOMETRIOSE LPM 28 5 sim não não não sim não ENDOMETRIOSE FCSSD 25 3 sim sim não não sim não ENDOMETRIOSE SAW 29 16 sim não sim não não não ENDOMETRIOSE MIRCB 30 1 não sim sim não não não ENDOMETRIOSE JCP 25 13 sim sim não não não não ENDOMETRIOSE FAG 30 14 não sim não não não não ENDOMETRIOSE IGS 26 2 não não sim não não não ENDOMETRIOSE CRNB 39 9 sim sim sim não sim não ENDOMETRIOSE VMF 36 8 não não não sim não não ENDOMETRIOSE APMJM 31 5 sim sim não não não não ENDOMETRIOSE FBF 31 4 não sim não não não não ENDOMETRIOSE PRGL 38 8 não não não sim não não ENDOMETRIOSE RCSS 39 2 não não sim sim não não ENDOMETRIOSE VCPS 28 5 sim não não sim não não ENDOMETRIOSE VIS 23 4 não não sim não não não ENDOMETRIOSE DFSR 26 4 sim não sim não sim não ENDOMETRIOSE TJ 33 6 não não não sim não não ENDOMETRIOSE BEM 29 11 sim não não não sim sim ENDOMETRIOSE TCB 22 3 sim sim sim não não não ENDOMETRIOSE MASS 34 24 sim não sim não não não ENDOMETRIOSE AESF 37 2 sim sim sim não sim não ENDOMETRIOSE RGP 31 3 sim não não não não não ENDOMETRIOSE CEM 33 10 sim sim sim não sim não ENDOMETRIOSE HMBV 40 11 não sim sim não sim não ENDOMETRIOSE MCCS 38 2 não não sim não não não ENDOMETRIOSE JJ 20 24 sim não não não não não ENDOMETRIOSE MNNS 35 3 sim sim não sim sim não ENDOMETRIOSE CMPG 40 3 sim sim não sim sim não ENDOMETRIOSE ITPS 40 8 sim não sim não não não ENDOMETRIOSE HOC 37 26 sim não não não sim não ENDOMETRIOSE ASF 27 7 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE ASS 36 2 sim não não não sim não ENDOMETRIOSE CN 35 19 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE LMJ 37 17 não sim não sim não não ENDOMETRIOSE JZP 40 17 sim não não sim sim não Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 56 GRUPO Iniciais idade dia ciclo dism dispar dor ac infert alt. intest alt urin ENDOMETRIOSE STK 34 3 não sim não sim não não ENDOMETRIOSE LGRC 30 9 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE CK 33 6 não sim não não sim não ENDOMETRIOSE SF 33 1 sim sim sim não sim não ENDOMETRIOSE MHTS 39 9 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE JGD 36 3 sim não sim não sim não ENDOMETRIOSE AAS 31 6 não não sim não sim não ENDOMETRIOSE ECMH 36 2 sim sim sim sim não não ENDOMETRIOSE EAS 32 8 sim não sim não sim não ENDOMETRIOSE NJM 37 3 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE CR 31 6 não não não sim não não ENDOMETRIOSE MSV 33 22 não não sim não não não ENDOMETRIOSE TG 29 9 sim sim sim não sim não ENDOMETRIOSE MAT 35 1 não sim sim sim sim sim ENDOMETRIOSE KNML 29 4 sim não sim sim sim não ENDOMETRIOSE SEVG 37 3 sim sim sim não sim não ENDOMETRIOSE VPSC 24 5 sim não sim não não não ENDOMETRIOSE MLRM 36 8 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE GF 30 9 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE EPAS 35 8 sim sim sim não não não ENDOMETRIOSE SSS 28 25 não não não sim sim não ENDOMETRIOSE AS 29 2 sim sim sim sim sim não ENDOMETRIOSE LQPA 33 7 sim não sim não sim sim ENDOMETRIOSE ICM 30 7 não sim não não não não ENDOMETRIOSE MPBL 35 6 sim sim sim não não não CONTROLE MELS 33 9 não não não sim não não CONTROLE EBMM 27 4 não não sim não não não CONTROLE LMMC 28 12 não não não não não não CONTROLE AAP 33 10 não não não não não não CONTROLE SCM 30 4 sim sim não não não não CONTROLE ETS 29 8 não não não sim não não CONTROLE PSS 24 19 não não sim sim sim não CONTROLE MPMF 37 7 não sim sim não não não CONTROLE LFM 38 26 não não sim não não não CONTROLE MHBC 40 9 não não não não não não CONTROLE FGBM 36 4 não sim sim não não não CONTROLE LAS 36 5 não não sim não sim não CONTROLE NQM 34 2 não não sim não não não CONTROLE SRRBS 36 26 não não não não não não CONTROLE VHS 28 5 não não não não não não CONTROLE RGC 38 5 não não não não não não CONTROLE MLC 28 3 não não não não não não CONTROLE RSA 37 1 não não sim não não não CONTROLE LRSC 40 9 sim sim sim não não não CONTROLE JMX 36 21 não não não sim não não CONTROLE ACVB 32 10 não não não não não não CONTROLE PLS 27 10 não sim não não não não CONTROLE MSM 40 2 sim sim sim não não não CONTROLE CARS 37 27 não não não sim não não CONTROLE AMSS 32 15 sim sim não não não não Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 57 GRUPO Iniciais idade dia ciclo dism dispar dor ac infert alt. intest alt urin CONTROLE MSS 39 28 sim sim não não não não CONTROLE DPS 21 17 sim sim não sim não não CONTROLE MBA 26 6 sim não não não não não CONTROLE TRCJ 34 5 não não sim não não não CONTROLE YT 38 3 sim sim sim sim não não CONTROLE JAS 29 3 não sim não não não não CONTROLE MAS 34 8 sim sim sim sim não não CONTROLE EGMA 27 5 não não não sim não não Legenda: dism – dismenorréia severa/incapacitante, dispar – dispareunia de profundidade, dor ac – dor acíclica, infert – infertilidade, alt. instest – alterações intestinais cíclicas, alt. urin – alterações urinárias cíclicas Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 58 Anexo D – Estadiamento, local da doença e classificação histológica GRUPO Iniciais estadio peritônio ovário profunda tipo histol ENDOMETRIOSE CFO 1 sim não não E ENDOMETRIOSE SMM 1 sim não não E + M ENDOMETRIOSE FMO 1 não sim não E + BD ENDOMETRIOSE COM 1 sim não não BD ENDOMETRIOSE MSQM 1 sim não não E + BD ENDOMETRIOSE AR 1 sim não não E + BD ENDOMETRIOSE MLOC 1 sim não não E + M ENDOMETRIOSE CAC 1 sim não não E + M ENDOMETRIOSE SVFB 1 sim não não E + M ENDOMETRIOSE RCA 2 não sim não E + I ENDOMETRIOSE DRD 2 sim sim não E + M ENDOMETRIOSE ST 2 não sim não E + BD ENDOMETRIOSE LPM 2 sim sim não E + M ENDOMETRIOSE FCSSD 2 não sim não E + BD ENDOMETRIOSE SAW 2 não sim não E ENDOMETRIOSE MIRCB 2 sim não sim E + I ENDOMETRIOSE JCP 2 não sim não E + BD ENDOMETRIOSE FAG 2 sim não não E ENDOMETRIOSE IGS 2 não sim não E + BD ENDOMETRIOSE CRNB 2 não sim não E ENDOMETRIOSE VMF 2 sim não não E + BD ENDOMETRIOSE APMJM 2 sim não não E + BD ENDOMETRIOSE FBF 2 sim sim não E + BD ENDOMETRIOSE PRGL 2 não sim não E + BD ENDOMETRIOSE RCSS 2 não sim não E + M ENDOMETRIOSE VCPS 2 não sim não E + BD ENDOMETRIOSE VIS 2 não sim não E + M ENDOMETRIOSE DFSR 2 sim não sim E + BD ENDOMETRIOSE TJ 3 sim não sim E + M ENDOMETRIOSE BEM 3 não sim não E + M ENDOMETRIOSE TCB 3 não sim não E + M ENDOMETRIOSE MASS 3 sim sim não E + M ENDOMETRIOSE AESF 3 sim sim sim E + BD ENDOMETRIOSE RGP 4 sim sim sim E + M ENDOMETRIOSE CEM 4 não sim sim E + BD ENDOMETRIOSE HMBV 4 não sim sim E + I ENDOMETRIOSE MCCS 4 não sim sim E + M ENDOMETRIOSE JJ 4 sim sim sim E + I ENDOMETRIOSE MNNS 4 não não sim E + M ENDOMETRIOSE CMPG 4 não sim sim E + M ENDOMETRIOSE ITPS 4 não sim sim E + BD ENDOMETRIOSE HOC 4 não não sim E + BD ENDOMETRIOSE ASF 4 não sim sim E + M ENDOMETRIOSE ASS 4 sim sim não E + M ENDOMETRIOSE CN 4 não sim sim E + M ENDOMETRIOSE LMJ 4 sim sim sim E + M ENDOMETRIOSE JZP 4 sim sim sim E + M ENDOMETRIOSE STK 4 não sim sim E+ M ENDOMETRIOSE LGRC 4 sim sim sim E + M Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 59 GRUPO Iniciais estadio peritônio ovário profunda tipo histol ENDOMETRIOSE CK 4 não não sim E + M ENDOMETRIOSE SF 4 sim sim sim E + M ENDOMETRIOSE MHTS 4 não não sim E + M ENDOMETRIOSE JGD 4 não não sim E + M ENDOMETRIOSE AAS 4 não não sim E + M ENDOMETRIOSE ECMH 4 não sim sim E + M ENDOMETRIOSE EAS 4 não sim sim E + BD ENDOMETRIOSE NJM 4 sim sim sim E + M ENDOMETRIOSE CR 4 não não sim E + M ENDOMETRIOSE MSV 4 sim sim sim E + BD ENDOMETRIOSE TG 4 sim não sim E + M ENDOMETRIOSE MAT 4 não não sim E + M ENDOMETRIOSE KNML 4 não sim sim E + M ENDOMETRIOSE SEVG 4 não não sim E + M ENDOMETRIOSE VPSC 2 sim não não E + BD ENDOMETRIOSE MLRM 2 sim não não E + BD ENDOMETRIOSE GF 2 não sim não E + M ENDOMETRIOSE EPAS 2 não não sim E + M ENDOMETRIOSE SSS 2 sim não não E + BD ENDOMETRIOSE AS 2 não não sim E + M ENDOMETRIOSE LQPA 2 não sim não E + BD ENDOMETRIOSE ICM 2 não não sim E + M ENDOMETRIOSE MPBL 2 sim não não BD CONTROLE MELS na na na na na CONTROLE EBMM na na na na na CONTROLE LMMC na na na na na CONTROLE AAP na na na na na C O N T R O L E S C M n an an an a n a C O N T R O L E E T S n an an an a n a CONTROLE PSS na na na na na CONTROLE MPMF na na na na na C O N T R O L E L F M n an an an a n a CONTROLE MHBC na na na na na CONTROLE FGBM na na na na na C O N T R O L E L A S n an an an a n a CONTROLE NQM na na na na na CONTROLE SRRBS na na na na na C O N T R O L E V H S n an an an a n a CONTROLE RGC na na na na na C O N T R O L E M L C n an an an a n a CONTROLE RSA na na na na na CONTROLE LRSC na na na na na C O N T R O L E J M X n an an an a n a CONTROLE ACVB na na na na na C O N T R O L E P L S n an an an a n a C O N T R O L E M S M n an an an a n a CONTROLE CARS na na na na na CONTROLE AMSS na na na na na C O N T R O L E M S S n an an an a n a CONTROLE DPS na na na na na Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 60 GRUPO Iniciais estadio peritônio ovário profunda tipo histol C O N T R O L E M B A n an an an a n a CONTROLE TRCJ na na na na na CONTROLE YT na na na na na C O N T R O L E J A S n an an an a n a CONTROLE MAS na na na na na CONTROLE EGMA na na na na na Legenda: tipo histol – tipo histológico, E – padrão estromal, BD – padrão bem diferenciado, M – padrão misto, I – padrão indiferenciado (classificação descrita na seção Pacientes e Métodos), na – não se aplica Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 61 Anexo E – Dosagens das IL 12 e IL 18 no sangue e fluido peritoneal GRUPO Iniciais IL12 FP IL18 FP IL12 sg IL18 sg ENDOMETRIOSE CFO 25,503 73,284 41 17,139 ENDOMETRIOSE SMM 93,744 31,914 63,01 19,503 ENDOMETRIOSE FMO 44,443 30,732 36,82 8,274 ENDOMETRIOSE COM 138,032 15,366 31,8 12,411 ENDOMETRIOSE MSQM 25,781 254,13 204 30,732 ENDOMETRIOSE AR 35,251 85,104 100,6 23,049 ENDOMETRIOSE MLOC 70,531 412,704 24,755 51,588 ENDOMETRIOSE CAC 195,076 101,891 79,604 114,64 ENDOMETRIOSE SVFB aus aus 57,747 78,587 ENDOMETRIOSE RCA 61,155 53,781 61,89 23,049 ENDOMETRIOSE DRD aus aus 31,08 39,096 ENDOMETRIOSE ST 299,027 33,096 56,32 27,186 ENDOMETRIOSE LPM 26,617 43,143 32,64 33,687 ENDOMETRIOSE FCSSD 42,772 27,186 31,52 11,82 ENDOMETRIOSE SAW 50,97 46,566 25,39 18,321 ENDOMETRIOSE MIRCB 56,977 26,595 30,69 73,875 ENDOMETRIOSE JCP 38,594 61,464 29,29 28,959 ENDOMETRIOSE FAG 114,635 72,693 63,56 23,64 ENDOMETRIOSE IGS 30,795 43,143 61,34 34,869 ENDOMETRIOSE CRNB 28,845 105,198 39,05 36,642 ENDOMETRIOSE VMF 33,21 39,098 79,45 25,413 ENDOMETRIOSE APMJM 236,729 461,426 39,601 103,176 ENDOMETRIOSE FBF 107,88 91,97 85,79 279,435 ENDOMETRIOSE PRGL 49,499 454,261 112,184 51,588 ENDOMETRIOSE RCSS aus aus 109,709 51,588 ENDOMETRIOSE VCPS 105,173 353,951 41,663 38,691 ENDOMETRIOSE VIS 119,67 156,89 357,149 93,145 ENDOMETRIOSE DFSR 176,84 97,06 369,522 143,3 ENDOMETRIOSE TJ 52,799 18,321 118,2 11,229 ENDOMETRIOSE BEM 80,016 288,033 78,89 42,99 ENDOMETRIOSE TCB 28,879 1114,874 101,874 103,176 ENDOMETRIOSE MASS 199,05 201,4 358,387 279,435 ENDOMETRIOSE AESF aus aus 104,76 37,258 ENDOMETRIOSE RGP 24,945 56,736 70,53 20,094 ENDOMETRIOSE CEM 132,461 33,687 51,86 2,955 ENDOMETRIOSE HMBV 32,466 43,734 33,47 7,092 ENDOMETRIOSE MCCS 36,366 30,141 161,4 4,728 ENDOMETRIOSE JJ 34,416 80,967 78,33 27,186 ENDOMETRIOSE MNNS aus aus 25,39 23,049 ENDOMETRIOSE CMPG 20,489 24,231 37,1 17,139 ENDOMETRIOSE ITPS 33,302 26,595 24,56 9,456 ENDOMETRIOSE HOC 36,505 269,496 185,6 16,548 ENDOMETRIOSE ASF 29,681 41,961 55,48 4,137 ENDOMETRIOSE ASS 85,388 24,822 204,5 17,73 ENDOMETRIOSE CN 28,566 106,38 182 26,595 ENDOMETRIOSE LMJ 98,45 79,26 108,75 21,9 ENDOMETRIOSE JZP 51,685 81,558 136,7 26,595 ENDOMETRIOSE STK 32,745 151,887 234,6 15,366 Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 62 GRUPO Iniciais IL12 FP IL18 FP IL12 sg IL18 sg ENDOMETRIOSE LGRC 51,964 63,828 42,95 13,002 ENDOMETRIOSE CK 16,507 717,933 46,2 38,691 ENDOMETRIOSE SF 18,981 133,269 28,466 21,495 ENDOMETRIOSE MHTS 75,068 217,816 87,44 77,382 ENDOMETRIOSE JGD aus aus 81,666 471,457 ENDOMETRIOSE AAS 24,342 502,983 185,178 98,877 ENDOMETRIOSE ECMH aus aus 419,834 81,681 ENDOMETRIOSE EAS 75,48 505,849 376,532 98,877 ENDOMETRIOSE NJM 65,17 103,176 68,882 53,021 ENDOMETRIOSE CR aus aus 104,348 140,434 ENDOMETRIOSE MSV 126,618 288,033 85,378 42,99 ENDOMETRIOSE TG 97,337 454,261 32,59 51,588 ENDOMETRIOSE MAT 681,709 133,269 190,952 21,495 ENDOMETRIOSE KNML 493,242 342,487 619,436 110,341 ENDOMETRIOSE SEVG 143,938 217,816 472,29 77,382 ENDOMETRIOSE VPSC 10,733 90,279 21,455 455,694 ENDOMETRIOSE MLRM 17,59 83,29 171,569 75,949 ENDOMETRIOSE GF 164,146 289,466 882,135 80,248 ENDOMETRIOSE EPAS 299,413 181,991 581,495 30,093 ENDOMETRIOSE SSS 111,771 48,722 440,042 100,31 ENDOMETRIOSE AS 823,987 163,362 112,184 73,083 ENDOMETRIOSE LQPA 501,23 324,82 337,354 167,661 ENDOMETRIOSE ICM 67,99 65,918 986,06 81,681 ENDOMETRIOSE MPBL 93,74 65,918 34,652 458,56 CONTROLE MELS 12,383 32,505 46,2 10,047 CONTROLE EBMM 3,722 112,29 12,27 13,002 CONTROLE LMMC 20,51 72,102 32,89 20,094 CONTROLE AAP 94,75 67,965 53,72 13,002 CONTROLE SCM 97,45 137,703 24,62 59,1 CONTROLE ETS 65,88 63,237 51,561 134,157 CONTROLE PSS 19,36 39,006 63,108 11,229 CONTROLE MPMF 38,9 96,43 232,605 7,092 CONTROLE LFM 0 41,37 48,674 11,229 CONTROLE MHBC 83,05 67,53 8,671 26,595 CONTROLE FGBM 212,98 398,06 427,258 18,321 CONTROLE LAS 18,569 80,967 87,44 41,37 CONTROLE NQM 18,94 33,97 23,517 23,64 CONTROLE SRRBS 73,82 50,48 56,097 19,503 CONTROLE VHS 6,609 65,01 65,89 24,231 CONTROLE RGC 48,93 78,52 37,539 74,516 CONTROLE MLC 67,1 52,85 7,021 37,258 CONTROLE RSA 179,405 342,487 225,181 110,341 CONTROLE LRSC 62,95 454,261 86,202 93,145 CONTROLE JMX 257 312,97 107,235 143,3 CONTROLE ACVB 26,404 349,652 37,127 114,64 CONTROLE PLS 214,871 298,064 101,049 41,557 CONTROLE MSM 23,76 0 114,246 68,784 CONTROLE CARS 34,652 214,95 81,666 50,155 CONTROLE AMSS 67,9 65,99 226,419 108,908 CONTROLE MSS 76,34 89,03 29,703 116,073 CONTROLE DPS 3,31 214,95 42,9 180,558 Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 63 GRUPO Iniciais IL12 FP IL18 FP IL12 sg IL18 sg CONTROLE MBA 12,383 181,991 63,933 54,454 CONTROLE TRCJ 89,01 104,57 119,194 54,454 CONTROLE YT 77,13 197,13 49,499 118,939 CONTROLE JAS 123,31 208,93 426,433 100,31 CONTROLE MAS 209,923 772,387 165,383 74,516 CONTROLE EGMA 83,316 42,99 218,171 71,65 Legenda: FP – fluido peritoneal, sg – sangue, aus – fluido peritoneal ausente Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 64 “A concentração da interleucina 12 está aumentada em pacientes com endometriose e se correlaciona com a severidade da doença” INTRODUÇÃO A endometriose caracteriza-se pelo implante, crescimento e desenvolvimento de tecido endometrial em localização extra-uterina (D’Hooghe et al., 2003). Acomete cerca de 10% da população feminina na menacme (Missmer & Cramer, 2003) e sua a etiopatogenia exata permanece desconhecida (Berkanoglu & Arici, 2003). Com o conhecimento mais profundo dos mecanismos imunológicos envolvidos no reconhecimento de antígenos e sabendo que o tecido endom etrial na cavidade peritoneal funcionava como tal, houve espaço para a investigação de diversos aspectos envolvidos no processo, principalmente o papel das diversas citocinas, fatores de crescimento e angiogênicos e também papel de células diretamente relacionadas como as células natural-killer e macrófagos peritoneais (Harada et al., 2001; Pasoto et al., 2005; Dias Jr et al., 2006). Aceita-se, atualmente, que as interleuc inas 1, 4, 5, 6, 8, 10, fator de necrose tumoral alfa (TNF- α) e fator endotelial de crescimento vascular (VEGF) estejam aumentadas na endometriose (Harada et al., 2001; Podgaec et al., 2007). A interleucina 12 (I L-12) tem como principais funções biológicas a indução da transcrição e secreção de outras citocinas, principalmente o interferon-gama (IFN- γ); aumento da citotoxicidade bem como indução da proliferação das célu las natural-killer (D’Andrea et al., 1992). Por todas essas características e funções é considerada uma _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 65 molécula-chave do sistema imune det erminando a conversão das células T primordiais para o padrão Th1 (Gazvani et al., 2001). Gallinelli et al. (2004) demonstraram aumento dos níveis de IL-12 no fluido peritoneal das pacientes com endo metriose estádios III ou IV, mas Gazvani et al. (2001) não encontraram diferenças na comparação das dosagens de IL-12 nos diversos estádios da doença, nas diferentes fases do ciclo menstrual ou em relação às queixas de dismenorréia, infertilidade ou dor pélvica crônica. A interleucina 18 (IL-18) parti cipa ativamente na a produção do interferon-gama e, conseqüentemente, at ivando a proliferação dos clones celulares de linfócitos T e células NK , além de estimular a liberação de diversas citocinas como IL-4, 5, 10 e 13, além de estimular a produção de angiopoetina 2 e fatores vasculares locais (Zhang et al., 2004). É necessária em doses fisiológicas para os pr ocessos de implantação embrionária (Chaouat et al., 2002), mas, em doses elevadas está implicada nos abortamentos de repetição (Lédée-Bata ille et al., 2005). Suas funções biológicas principais s ão a indução da produção e secreção do interferon- gama, indução da produção de IL-12 e TNF-alfa e liberação das citocinas do braço Th2 (Gracie et al, 2003). Inicialmente demonstrou-se que a IL-1 8 do fluido peritoneal estaria mais elevada em pacientes com endometriose do que em mulheres saudáveis (Arici et al., 2003), no entant o outro estudo mostrou resultados bastante discordantes com os anterior es com dosagens inferiores da IL-18 peritoneal em pacientes com endometriose (Zhang et al., 2004). Conforme salientado, há incertez as sobre a etiopatogenia da endometriose, principalmente no âmbi to da imunidade. Neste quesito as interleucinas 12 e 18 têm papel importante por atuarem como desencadeadoras da resposta imune Th1 a partir de estímulos sobre os linfócitos Th0 (D’Andrea et al., 1992; Gazvani et al., 2001). Adicionalmente os dados são conflitantes sobre a par ticipação destas interleucinas na endometriose pélvica. Este estudo fo i realizado visando aprofundar os Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 66 conhecimentos sobre algumas dúvi das acerca da participação das interleucinas 12 e 18 em pacientes com endometriose pélvica. PACIENTES E MÉTODOS Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, onde foram avaliadas 105 pacientes no Setor de Endometriose da Clínica Ginecológica deste hospital no período de fevereiro de 2004 a dezembro de 2005. Todas apresentavam quadro clínico sugestivo de endometriose, representado pelas queixas clínicas de dismenorréia severa ou incapacitante, dispareunia de prof undidade, algia pélvica crônica, infertilidade, alterações urinárias ( dor e/ou sangramento) ou intestinais cíclicas (dor e/ou sangram ento) e, por esse motivo, foram submetidas à videolaparoscopia. Foram adotados como critério de inclusão idade entre 18 e 40 anos, ciclos menstruais eumenorreicos, aus ência de doenças auto-imunes e não- utilização de medicamentos hormonai s nos 3 meses que antecederam a cirurgia. Os critérios de exclusão foram ausência de líquido peritoneal durante o procedimento laparoscópico e co-existência de outros fatores causadores de infertilidade. Avaliamos ainda a fase do ciclo em que se encontrava a paciente no momento da videolaparoscopia (fases folicular e lútea). As pacientes do grupo com endomet riose foram estadiadas segundo a classificação da American Societ y for Reproductive Medicine (1996). Agrupamos os estádios I e II como “est ádios iniciais” e os estádios III e IV como “estádios avançados”; 28 pacientes foram classificadas como estádios iniciais e 44 pacientes como estádios avançados. Estudamos também a localização mais importante da doença, usando um critério de severidade do órgão acometido. Estabelecemos três categorias : doença peritoneal, ovar iana e doença profunda, a qual englobava o acometimento retrocervica l (lesões profundas, com mais que Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 67 5mm de profundidade) , intestinal e de trato urinário (ambas quando atingiam camadas musculares). Utilizando a classificação histológic a da endometriose (Abrão et al., 2003) que subdivide a doença em quatro apresentações histológicas de acordo com sua maior ou menor semelhança com o endométrio tópico (estromal, bem-diferenciada, padr ão misto de diferenciação e doença indiferenciada) agrupamos as pac ientes com endometriose em duas categorias, sem indiferenciação (fo rmas estromal ou bem-diferenciada, n = 28) e com indiferenciação (formas mista e indiferenciada, n = 44). Antes da anestesia geral foram co lhidos 5 mL de sangue periférico e também foi anotado o dia do cicl o menstrual em que a paciente se encontrava. Foi realizado o preparo habitual para a videolaparoscopia com punção umbilical e pneumoperitôneo sem instilação de soro fisiológico na cavidade. Após a punção auxiliar foi colhido o fluido peritoneal depositado nos fundos-de-saco anterior e posteri or quando estava presente, cujo volume variou entre 2 e 10mL O material foi armazenado em tubo seco e encaminhado ao laboratório para ser centrifugado, ali quotado e congelado em freezer à -20ºC. Depois de estocado, o mesmo somente foi descongelado com a coleta completa de todos os dados, para realização das dosagens das interleucinas 12 e 18. Utiliz amos os kits IL-12 (p70) Humana (Human IL-12 p70 Kit, BD Biosciences, Sa n Diego, USA) para a IL-12 e IL- 18 ELISA (IL-18 ELISA, IB L, Hamburg, Alemanha). Os limites de detecção do kit de IL-12 preconizado pelo laboratório foi de 4 pg/mL e do kit de IL-18 foi de 9,2 pg/mL. A análise estatística dos dados obtidos foi realizada através da comparação das dosagens das interleucinas 12 e 18, no sangue e no fluido peritoneal, em relação aos diversos parâmetros anteriormente mencionados. As variáveis estudadas tinham com portamento não-paramétrico e foram analisadas através da aplicação do teste de Kruskal-Wallis quando significante, complementou-se com o teste de Dunn para discriminar a(s) diferença(s). Utilizou-se, para tanto, o “software” SPSS versão 10.0. Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 68 RESULTADOS Das 105 pacientes submetidas à videolaparoscopia com quadro clínico sugestivo de endometriose dia gnosticou-se a doença em 72; foram, portanto, subdivididas em dois grupos: pacientes com endometriose (n = 72) e grupo controle (n = 33). A média das dosagens de IL-12, dosada no fluido peritoneal, mostrou- se aumentada nas pacientes com endom etriose em relação ao grupo controle (p < 0,001).As concentrações séricas de IL-12 não apresentaram diferenças estatísticas na avaliação gl obal entre casos e controles, mas houve aumento significativo da mesma na comparação dos estádios mais avançados em relação aos estádios in iciais ( p = 0,007). Em relação à dosagem de IL-18 não houve diferença estatística nas amostras sérica ou no fluido peritoneal (tabelas 1 e 2) Tabela 1 – Comparação das médias das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal entre o grupo controle e o grupo com endometriose. IL 12 IL18 sangue Fluido peritoneal sangue Fluido peritoneal Controle 97,13+/-19,02 29,20+/-10,21 62,07+/-8,08 112,51+/-29,24 EDT 152,14+/-22,59 82,37+/-16,61 70,52+/-0,00 142,54+/-23,39 p 0,16 <0,001* 0,39 0,22 Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 69 Tabela 2 – Comparação das médias das dosagens das interleucinas 12 e 18 sérica e no fl uido peritoneal entre o grupo com endometriose subdivididos segundo o estadiamento (pg/mL) Interleucina IL-12 IL-18 estádios I/II estádios III/IV estádios I/II estádios III/IV sangue FP sangue FP sangue FP sangue FP média 82,04 62,54 196,74 94,98 51,28 97,21 82,77 171,38 erro padrão 16,63 14,13 33,91 25,61 10,56 27,21 17,49 33,65 p-value 0,007* 0,71 0,63 0,05 A análise das dosagens das interl eucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal em relação à fase do ciclo de coleta das amostras não apresentou diferença esta tisticamente significativ a, conforme demonstrado na tabela 3 . Tabela 3 – Comparação das dosagens das interleucinas 12 e 18 sérica e no fluido peritoneal entre as paci entes com endometriose e o grupo controle nas fases folicular e lútea do ciclo menstrual (pg/mL) Controle ENDOMETRIOSE sangue Fluido peritoneal sangue Fluido peritoneal IL12 Fase folicular 101.98 + 24.21 36.04 + 13.2 125.25 + 19.46 82.54 + 16.58 IL12 Fase lútea 81.98 + 22.32 7.83 + 3.83 152.69 + 45.98 40.56 + 14.2 p 0,753 0,176 0,644 0,231 IL18 Fase folicular 56.29 + 7.67 126.62 + 37.05 57.57 + 10.17 159.98 + 29.94 IL18 Fase lútea 80.12 + 23.25 68.38 + 32.34 56.49 + 26.09 91.2 + 33.28 p 0,542 0,444 0,542 0,479 Também foram analisadas as concentra ções de interleucinas 12 e 18 sérica e no fluido pe ritoneal em relação à localização da doença e à Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 70 classificação histológica da endometriose (Abrão et al., 2003). Neste quesito 15 pacientes apresentavam a doença exclusivamente peritoneal, 21 pacientes doença ovariana e 36 pacientes doença profunda, ressaltando que mais de uma forma poderia coexistir na paciente sendo sempre considerada a forma mais grave. Não houve difer ença estatisticamente significativa em relação a esses dois parâmetros estudados para nenhuma das interleucinas, conforme demonstrado nas tabelas 4 e 5. Tabela 4 – Comparação das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal de pacientes com endometriose em relação ao local de doença Média Erro padrão Média Erro padrão Média Erro padrão IL - 12 sg 146,43 43,86 96,86 28,00 178,50 35,24 0,31 FP 53,02 15,20 71,59 19,32 103,98 30,83 0,62 IL - 18 sg 68,91 17,32 103,56 38,08 57,70 13,43 0,42 FP 142,26 56,52 109,89 37,86 156,30 29,95 0,31 Variável p Ovário (n=21) Peritônio (n=15) Profunda (n=36) Tabela 5 – Comparação das dosagens das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal de pacientes com endometriose em relação à classificação histológica IL12 Fluido peritoneal IL12 Sérica IL18 Fluido peritoneal IL18 Sérica nm é d i a erro padrão média erro padrão média erro padrão média erro padrão Sem indiferenciação 28 63,21 13,77 104,04 21,01 123,39 29,30 80,17 22,89 Com indiferenciação 44 94,56 25,70 182,74 33,86 154,72 33,55 64,39 12,16 p 0,9120 0,1149 0,8524 0,7859 Categoria Histológica Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 71 DISCUSSÃO O presente estudo avaliou o comportamento das interleucinas 12 e 18 no sangue e no fluido peritoneal em um grupo controle composto por 33 pacientes com quadro clínico sugestivo e ausência comprovada de endometriose e em 72 pacientes com endometriose com diferentes estádios, locais de doença, subtipos histológicos e coletas nas duas fases do ciclo menstrual. A análise destes parâmetros correlacionados às dosagens das referidas interleucinas representa uma nova proposta no entendimento da fisiopatologia da endometriose. Sabidamente, a IL-12 e a IL-18 participam da resposta imunológica, em especial da reposta Th1. Reconhecemos ser este um dos prováveis mecanismos envolvidos na etiopatogenia da doença, daí a importância do conhecim ento mais profundo acerca do comportamento das duas citocinas estudadas. A fase do ciclo menstrual pode ser entendida como de relevância para o entendimento do comporta mento das interleucinas na endometriose. Entendemos que o refluxo de células endometriais para a cavidade pélvica desencadeie a resposta imunológica e inflamatória agudamente, esperando, portanto, aumento das dos agens de citocinas inflamatórias nessas circunstâncias. Nossos resultados, no entanto, não mostraram diferenças significativas nas comparações das dosagens de IL-12 e IL-18 nas fases folicular e lútea do ciclo menstrual independente de a pac iente ter ou não endometriose. Outros trabalhos da literatura também não haviam demonstrado tal diferença (Gazvani et al., 2001) e alguns mostraram diferenças com elevação das dosagens peritoneais de IL-18 na fase lútea em comparação com a fase secretória em pacientes com endometriose (Arici et al., 2003). A análise das dosagens de IL-12 mo strou que, no flui do peritoneal, a mesma se encontrava significativ amente aumentada de pacientes com endometriose em relação ao grupo contro le; no sangue esta citocina estava Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 72 mais elevada em pacientes com endometriose avançada do que nas pacientes com doença in icial. Portanto, quando subdivididas segundo o estadiamento, as pacientes com endometriose avançada apresentavam dosagens séricas de IL-12 significativa mente maiores que na endometriose inicial. Outros estudos, com metodologia semelhante, encontraram resultados diferentes, apontando não haver diferenças nas dosagens de IL- 12, quer tenha sido feita análise no sangue ou fluido peritoneal (Mazzeo et al., 1998; Zeyneloglu et al., 1998; Gazvani et al., 2001). Nossos resultados podem refletir que nas pacientes co m a doença há realmente uma ativação imunológica visando à via de resposta celular inicial em combate ao antígeno representado pelo tecido endom etrial, desencadeada rapidamente quando o mesmo chega à cavidade pélvica. Como a diferença estatística marcante também foi encontrada entre as pacientes do grupo controle e os estádios I e II da endometriose, é possí vel desenhar um raciocínio que a chegada de células endometriais à ca vidade pélvica desencadeia, de imediato, a resposta imune Th1. A interleucina 18 não mostrou diferenças estatisticamente significativas quando realizada a aval iação segundo o estadiamento, mas notamos uma tendência de elevação das dosagens de IL-18 no fluido peritoneal em estádios av ançados da doença (p = 0,08). Três trabalhos foram publicados sobre o comportame nto da IL-18 nas mulheres com endometriose. Seus resultados são conflitantes de modo que até o momento não há consenso na literatura sobre a relação da IL-18 na doença, o que nos motivou a averiguar tal situação em pac ientes de nosso meio (Arici et al., 2003; Oku et al., 2004; Zhang et al ., 2004). Nosso trabalho não encontrou diferenças estatisticamente significant es nas dosagens sérica ou peritoneal da IL-18 na comparação de pacientes com endometriose e grupo controle, mas uma tendência ao aumento de IL-18 peritoneal nos estádios avançados da doença. A via comumente envolvida na secreção da IL-12 passa, inicialmente, pela secreção de IL-18 que, como vimos, é cofator importante para sua liberação. Nossos resultados mostraram, na avaliação das dosagens da IL- Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 73 18 houve tendência ao aum ento da mesma em estádios avançados da doença, não tendo diferenças nos estádios iniciais , onde foi encontrada a diferença anteriormente mencionada em relação à IL-12 peritoneal. Como interpretar tal discordância entre as dosagens peritoneais de IL-12 e IL-18 se assumíssemos ser um processo encadeado? Deparamo-nos, aqui, com um conceito recente, de que nem sempre a produção de IL-12 seja dependente do estím ulo da IL-18. Já se acredita que exista uma outra via de produção de IL-12 que independe do estímulo de IL- 18 (Morita et al., 2005). Esta, talvez, seja a via predominantemente envolvida na endometriose, explicando o porquê do aumento das dosagens de IL-12 sem modificação significativa das dosagens de IL-18. A análise do local da doença foi real izada respeitando o critério de gravidade onde a doença pr ofunda é considerada a mais agressiva e a forma peritoneal a mais branda. Inicialmente avaliamos se as interleucinas 12 e 18, tanto no sangue quanto no fluido periton eal, sofriam alguma alteração na presença isolada da doença peritoneal , mas não encontramos diferenças significativas. Sendo assim, aplicamos o mesmo raciocínio para avaliar a doença profunda isoladamente e também não encontramos diferenças estatisticamente significativas. Em relação à classificação hist ológica (Abrão etal., 2003) útil na possibilidade de predizer o padrão de comportamento da doença, não encontramos diferenças estatisticamente significativas. Houve, no entanto, uma tendência a maiores dosagens de IL-12 sérica nas pacientes com formas mais indiferenciadas da doença. Novamente ressaltamos a proposta mais recente da via independ ente de produção da IL- 12. Provavelmente na doença mais agressiva e indiferenciada possamos assumir que a ativação imunológica seja mais intensa já desde o início do processo; sendo assim acreditamos que a elevação da IL-12 nesta forma mais agressiva pode demonstrar esse recrutamento do si stema imune tentando controlar o avanço da mesma. Entendemos, também, pelas diferenças de comportamento apresentadas em relação às dosagens de IL-12 e IL-18 que na endometriose Anexos _________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 74 a via alternativa de secreção de IL- 12 independente de IL-18 possa estar fortemente ativada. Nenhum outro trabalho analisado fez estudo semelhante, de modo que apresentamos resultados que podem contribuir no entendimento da fisiopatologia da endometriose e auxiliar no desenvolvimento de novas técnicas diagnósticas e terapêuticas. Fu turos estudos se fazem necessários para que consigamos compreender, de modo definitivo, o papel imunológico, histológico e outros diferentes par âmetros envolvidos nesta complexa entidade globalmente conhecida como endometriose. Agradecimentos: FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio financeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 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