Expressão do gene da aromatase (CYP19A1) nas células da granulosa murais luteinizadas de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida

Abreu LG. Aromatase gene expression (C YP19A1) in mural lutein- granulosa cells of women with e ndometriosis undergoing assisted reproduction techniques. 2009. 90 p. Tese de Doutorado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Un iversidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP.

Up to 60% of women with endometriosis have infertility symptoms. However, mechanisms rema in unclear, mainly when there is no distortion of pelvic anatomy. The mu ltifactorial etiology and polygenic involvement of this disease have been widely accepted. Aromatase is one of the most studied molecules and t here are evidences of increased expression of its gene (CYP19A1) on eutopic and ectopic endometrium in endometriosis. This enzyme, codifi ed by the CYP19A1 gene, converts androgens to estrogens and is normally pr esent in granulosa cells, where it plays an essential role for the intrafollicle steroidogenic production. In vitro studies by granulosa cells culture have demonstrated reduced aromatase activity in women with endom etriosis. The scarcity of studies assessing expression of the aromatase gene (CYP19A1) on these target cells stimulated the proposal of this research. The aim of this study is to quantify aromatase gene expression, by real-time PCR, in mural lutein- granulose cells of women with en dometriosis undergoing assisted reproduction techniques. Patients and Methods: a case-control study was conducted on 11 wome n with endometriosis and 11 with male or tubal causes of infertility submitted to ovarian hyperstimulation (HOC), with a total of 12 cycles for endometriosis and 11 for the control group. There was no difference between the groups regarding age or HOC xii parameters. Mural lutein-granulosa cells were harvested from pre- ovulatory follicles during oocyte retr ieval and properly isolated. Later, RNA extraction (clorophorm/isopropanol) and reverse transcription were performed. Real-time PC R was run to quantify RNAm products of aromatase gene normalized to those fr om the control gene, beta-actin (relative expression). Al l experiments were carri ed out in duplicate.

there was no difference betw een the groups regarding the gene expression of CYP19A1 (aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells (p>0.05, Mann Whitney), even if we consider separately the different stages of endometriosis (control vs. minimal/mild vs. moderate/severe, p>0.05, Kruskall Wallis). Conclusion: These results suggest that aromatase may have a complex cont rol of its gene expression on granulosa cells and, despite of prev ious evidences showing its reduced activity on these target cells in endometriosis, the gene expression seems not affected by the disease, according to this study. Key-words: Aromatase; CYP19A1; Real -time PCR, Endometriosis; Granulosa cells; Assisted reproduction; Infertility. xiii LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Mecanismo proposto de inativação defeituosa de estradiol na endometriose. Estradiol (E2), estrona (E1) e androstenediona (A) chegam às lesões endometrióticas pela corrente sanguínea, a aromatase (P450 arom) na célula estromal endometriótica catalisa a transformação de A para E1, que, por sua vez, é convertida à E2 pela ação da enzima 17 beta- hidroxiesteroide-desidrogenase1 (17 βHSD-1). E2 normalmente é inativado para E1 pela 17 beta-hidroxi-desidrogenase2 (17 βHSD-2) na célula epitelial glandular. Na célula endometriótica, no entanto, a 17 βHSD-2 apresenta-se defeituosa, mantendo E2 em elevados níveis locais. E2 promove crescimento do tecido endometriótico e produção de prostaglandinas (PGE2) que, por sua vez, estimulam a aromatase, completando um ciclo de feedback positivo. (Adaptado de Zeitoun & Bulun, 1999)................................................................ 27 Figura 2 – Eletroforese em gel de agarose de amostras de RNA de células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. Bandas 18S e 28S referentes às subunidades ribossomais intactas ..................................................................... 42 Figura 3 – Gráfico de amplificação por PCR em tempo real de cDNA obtido de amostras de células da granaulosa murais de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida. As sequências de interesse para os genes da aromatase e da β-actina foram amplficadas, para análise da expressão gênica relativa. Delta RN = Variação da fluorescência detectada. “Cycle number” = número do ciclo de amplificação ........................................... 50 Figura 4 - Gráfico da curva de dissociação para o gene da β-actina, obtida por PCR em tempo real (SYBR Green), de amostras de cDNA de células da granulosa de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida................. 51 Figura 5 - Gráfico da curva de dissociação para o gene da aromatase, obtida por PCR em tempo real (SYBR Green), de amostras de cDNA de células da granulosa de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida................. 52 Gráfico 1 – Expressão gênica relativa, por PCR em tempo real, da aromatase (gene CYP19A1) em células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose (todos estádios, N=12) vs. mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino de infertilidade (N=11), submetidas a técnicas de reprodução assistida. (p>0,05, Mann Whitney). Gráficos representam cálculos quando foram usadas como amostra de referência: a) placenta e b) média do Ct absoluto do grupo controle. Ct=”Threshold cycle” ........................ 56 Gráfico 2 – Expressão gênica relativa, por PCR em tempo real, da aromatase (CYP19A1) em células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose vs. controle submetidas a técnicas de reprodução assistida. A comparação foi realizada entre os grupos (1) controle (fator tubáreo/masculino; N=11); (2) endometriose leve e mínima (N=5); (3) endometriose moderada e severa (N=7). (p>0.05, Kruskal-Wallis com correlação de Dunn). Gráficos representam cálculos quando foram usadas como amostra de referência a) placenta e b) b) média do Ct absoluto do grupo controle. Ct=”Threshold cycle” ........................................................... 57 xiv LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Características do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI de mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino de infertilidade (grupo controle; N=11) quanto à idade, número de dias de indução ovariana, quantidade de gonadotrofina usada, número de folículos puncionados e oócitos captados. DP=desvio-padrão ........................................48 Tabela 2 – Características do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI de mulheres com endometriose (todos os estádios, N=12) quanto à idade, número de dias de indução ovariana, quantidade de gonadotrofina usada, número de folículos puncionados e oócitos captados. C1= primeiro ciclo e C2 = segundo ciclo de estimulação ovariana da paciente n 0 08; DP=desvio-padrão.....................................................................49 Tabela 3 – Níveis absolutos de “Threshold Cycle” (Ct), em duplicata, obtidos por PCR em tempo real (SYBR Green), para a análise de expressão relativa do gene da aromatase (CYP19A1), normalizada ao da β-actina, em células da granulosa luteinizadas murais de mulheres inférteis por fator tubáreo e/ou masculino (grupo controle) em comparação à mulheres com endometriose (todos os estádios, ASRM) submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV ou ICSI). Placenta como amostra de referência.........................................53 Tabela 4 – Valores de expressão gênica relativa obtidos por PCR em tempo real para o gene da aromatase (CYP19A1) após normalização ao da β- actina, em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino, N=11 vs mulheres com endometrios nos graus mínimo/leve (N=5) e moderado/grave (N=7) submetidas à reprodução assistida (FIV ou ICSI). Placenta como amostra de referência. Ct= “Threshold cycle”. C1=1º e C2=2º ciclos de HOC da paciente 02 (endometriose moderada/severa) ......................................................................54 Tabela 5 – Valores de expressão gênica relativa obtidos por PCR em tempo real para o gene da aromatase (CYP19A1) após normalização ao da β- actina, em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino; (grupo controle, N=11) vs endometriose nos graus mínimo/leve (N=5) e moderado/grave (N=7) submetidas à reprodução assistida (FIV ou ICSI). Como amostra de referência, aqui representado o próprio grupo controle (média do Ct absoluto). Ct= “Threshold cycle”. C1=1º e C2=2º ciclos de HOC da paciente 02 (endometriose moderada/severa) ......................................................................55 xv LISTA DE ABREVIATURAS A → androstenediona aGnRH→ análogos do GnRH BMP-15 → proteína óssea morfogenética 15 CC → citrato de clomifeno C18 → esteróides que contêm 18 carbonos em sua composição química C19 → esteróides que contêm 19 carbonos em sua composição química C21 → esteróides que contêm 21 carbonos em sua composição química Ct → “Threshold cycle”. E1 → estrona E2 → estradiol FIV → fertilização in vitro FMRP → Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto FSH → hormônio folículo-estimulante GnRH → hormônio liberador de gonadotrofinas GDF-9 → fator de diferenciação de crescimento 9 hCG → gonadotrofina coriônica humana hMG ou HMG → gonadotrofinas menopausais humanas ICSI → Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide IGF-1 → fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 IL→ interleucina IUI → Inseminação Intra uterina LH → hormônio luteinizante M → concentração molar xvi NK → células de citotoxidade natural PCR → reação em cadeia da polimerase P450 → termo genérico para denominar a família de enzimas oxidativas contendo o pigmento 450 cuja absorbância muda enquanto é reduzido RNAm → ácido ribonucléico mensageiro ROS → espécies reativas de oxigênio RT-PCR → PCR em tempo real Th1→ subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo 1 Th2 → subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo2 TGF → fator de crescimento tumoral TNF → fator de necrose tumoral USG → ultrassonografia UI → unidades internacionais VEGF → fator de crescimento vascular endotelial xvii SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO .................................................................................... 18 1.1. Etiopatogenia da Endometriose ................................................... 18 1.2. Endometriose e infertilidade......................................................... 23 1.3. Aromatase e Endometriose.......................................................... 24 2. OBJETIVO.......................................................................................... 33 3. JUSTIFICATIVA ................................................................................. 34 4. PACIENTES E MÉTODOS................................................................. 35 4.1. Delineamento e amostra .............................................................. 35 4.2. Local de realização do estudo...................................................... 35 4.3. Comitê de Ética em Pesquisa ...................................................... 35 4.4. Seleção de Pacientes................................................................... 36 4.4.1 Critérios de inclusão para os dois grupos............................... 36 4.4.2. Critérios de inclusão para o grupo-estudo ............................. 36 4.4.3. Critérios de inclusão para o grupo-controle ........................... 37 4.4.4. Critérios de exclusão para os dois grupos............................. 37 4.4.5. Processo de seleção das mulheres incluídas no estudo ....... 37 4.5. Protocolo de Hiperestimulação Ovariana Controlada................... 37 4.6. Captação de Oócitos.................................................................... 38 4.7. Coleta e Técnica de Isol amento das Células da Granulosa Murais (Anexo II)................................................................................. 39 4.8. Expressão do gene da aromatase................................................ 41 4.8.1. Extração de RNA................................................................... 41 4.8.2. Síntese de cDNA ................................................................... 42 4.8.3. PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) ......................... 43 4.8.4. Amostras de referência.......................................................... 44 4.9. Análise Estatística........................................................................ 45 5. RESULTADOS ................................................................................... 46 6. DISCUSSÃO ...................................................................................... 58 7. CONCLUSÃO..................................................................................... 63 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 64 ANEXOS................................................................................................. 73 ANEXO I.............................................................................................. 74 ANEXO II............................................................................................. 80 ANEXO III............................................................................................ 82 ANEXO IV ........................................................................................... 84 ANEXO V ............................................................................................ 88 PAPER 18 1.INTRODUÇÃO 1.1. Etiopatogenia da Endometriose Endometriose significa presenç a de endométrio (com glândula e estroma) fora da cavidade uterina (NOBLE et al., 1996; SPEROFF; FRITZ, 2005; CROSIGNANI et al ., 2006). Representa uma doença crônica e de elevada morbidade, que acomete cerca de 10% das mulheres em idade reprodutiva (WHEELER, 1989; SCHENKEN, 1996; MOURA et al., 1999; D´HOOGHE et al., 2003; KENNEDY et al., 2005; CROSIGNANI et al., 2006). Porém, a prevalência da endometriose depende do método empregado para seu diagnóstico e população estudada. Wheeler (1989) demonstrou prevalência de aproximadamente 10% em achados cirúrgicos em mu lheres de idade reprodutiva com outros diagnósticos. Hess et al. ( 1998), por sua vez, encontraram 9,4% de endometriose em mulheres submet idas à laparoscopia por algia pélvica crônica. Quando se analisa mulheres com infertilidade e dor pélvica associadas, pode-se encont rar até 50% de prevalência de endometriose (CORNILLIE et al., 1990) , contra 1-2% em mulheres assintomáticas (MOURA et al., 1999). A endometriose, por sua comp lexidade e heter ogeneidade em todos os seus aspectos, desde eti opatogenia, apresentação clínica, classificação e abordagem, apresenta inúmeras controvérsias e admite- se que sua etiologia seja multif atorial (PELLICER et al., 1998 A,B ; BULUN 19 et al., 2002; GARRIDO et al., 2002; D’HOOGHE et al., 2003; CROSIGNANI et al., 2006; ABREU et al., 2008). Porém, a maioria dos pesquisadores concorda que o f enômeno da menstruação retrógrada seja o ponto de partida para seu estabelecimento, partindo-se das observações de que esta doença oc orre mais frequentemente em mulheres no menacme; naquelas com anomalias müllerianas obstrutivas para o fluxo menstrual, e em mulheres com ciclos menstruais mais curtos ou de maior duração (CROSIGNANI et al., 2006). De acordo com a teoria de Sampson (1927), ainda a mais aceita, os debris mestruais que refluem para a cavidade peritoneal possuem células endometriais viáveis que têm o potencial de formar um implante endometriótico. Entretanto, questiona-se por q ue existe refluxo em 90% das mulheres e somente 10% delas têm endometriose (GARRIDO et al., 2002; D’HOOGHE et al., 2003; GUPTA et al., 2008). Acredita-se que esta doença complexa represente uma interação também complexa entre fatores etiopatogênicos: genéticos, imunológicos, hormonais e até ambientais (GARRIDO et al., 2002; D’HOOGHE et al., 2003; CROSGINANI et al., 2006). Todos esses fatores possivelmente conferem às células endometriais de determi nadas mulheres características singulares que possam aumentar sua probabilidade de implantar-se, bem como a existência de um mecani smo imunológico ab errante que possa aumentar a sobrevida destas células e favorecer a formação do implante endometriótico (ZEITOUN et al., 1999; BULUN et al., 2002; D’HOOGHE et al., 2003). 20 Outras teorias tentam exp licar a presença de lesões de endometriose fora da cavidade pél vica. Em 1924, Meyer propôs que a endometriose seria resultado de uma metaplasia das células da linhagem peritoneal; esta teoria explica a endometriose em homens, em pré- púberes, mulheres que nunca menstruaram e lesões em sítios atípicos, como cavidade pleural e meninges. A constatação da presença de células endometriais viáveis na luz de vasos sanguíneos e linfáticos por Halban e Sampson (1925) levou-os a especular que focos distantes de endom etriose poderiam surgir a partir da disseminação de células endometri ais por via hematogênica ou linfática. Esta teoria explicaria lesões na pleura, cicatriz umbilical, espaço retroperitoneal, vagina e colo do útero. Acredita-se que a endometriose também represente uma doença de herança poligênica com envolviment o principalmente das citocinas (GARRIDO et al., 2002; D’H OOGHE et al., 2003; WU; HO, 2003; AGUIAR et al., 2005; GUPTA et al ., 2008); enzimas relacionadas à esteroidogênese (ZEITOUN et al., 1999; BULUN et al., 2002) e moléculas envolvidas com o estresse oxidativ o celular (LANGENDONCKT et al., 2002; SZCZEPANSKA et al., 2003). Quanto ao sistema imune, encont ram-se alterações tanto na imunidade celular quanto humoral na endometriose, proporcionando um ambiente peritoneal favorável à maior sobrevida das células endometriais após o fluxo retrógrado (WITZ, 2000; GALLOVÁ et al., 2002; WU; HO, 2003). O fluido peritoneal de mulheres com endometriose apresenta maior número e maior atividade de macrócitos; que, no entanto, 21 apresentam atividade fagocítica reduzida (OLIVE et al., 1985; ZELLER et al., 1987; DUNSELMAN et al., 1988; AGUIAR et al., 2005; GOMES et al., 2007). As células Natural Killer (N K) também apresentam atividade reduzida na endometriose (OOSTERLYNCK et al., 1991; WILSON et al., 1994). Entre os linfócitos, há evid ências da dominância da subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo 2 (Th2) em relação aos T auxiliares tipo 1 (Th1) (GALLOVÀ et al., 2002). Além di sso, níveis elevados de citocinas no fluido peritoneal e também no flui do folicular de mulheres com endometriose foram relatados em dive rsos estudos, segundo a revisão de Gupta et al. (2008). A interleuci na 6 (IL-6), que corresponde a uma interleucina das mais importantes na etiopatogenia da endometriose, encontra-se também envolvida com a produção esteroidogênica ovariana, foliculogênese e implantaç ão embrionária (WITZ et al., 2000), além de induzir a expressão do VEGF (WU; HO, 2003). Essa interleucina também estimula a produção da arom atase em células adiposas (WITZ et al., 2000). O mecanismo de apoptose nas células endometriais refluídas seria outro foco de defeito nas mulher es que apresentam endometriose, segundo estudos esse seria um dos mecanismos responsáveis pela maior sobrevida das células endom etriais na cavidade peritoneal, que favorece a formação dos implantes de endometriose. (FUJISHITA et al., 1999; DMOWSKI et al., 2000; BRAUN et al., 2002; TOYA et al., 2002). Acredita-se ainda que a cavida de peritoneal de pacientes com endometriose represente um ambient e pró-oxidante (LANGENDONCKT et al., 2002; GUPTA et al., 2008). Na endo metriose já foram relatados: o 22 aumento da enzima óxido nítrico-sint etase, que acarreta maior produção de óxido nítrico (substância pr ó-oxidante); aumento da peroxidação lipídica com produção de produtos r eativos como o malonaldeído e lisofosfatidilcolina; aumento de enzimas antioxidantes no endométrio em resposta à maior quantidade de espécie s reativas de oxigênio (ROS) e níveis reduzidos de vitamina E no fluido peritoneal (LANGENDONCKT et al., 2002; SZCZEPANSKA et al., 2003). Os efeitos sobre a fertilidade consistem na toxicidade do fluido peritoneal sobre espermatozóides, ovulação, desenvolvimento embrionár io pré e durante a implantação (LANGENDONCKT et al., 2002). Além da etiopatogenia, também ex istem controvérsias sobre o comportamento clínico da endometriose e sua classificação. Nisolle e Donnez (1997) defendem a hipótese das três doenças, ou seja, que, a endometriose peritoneal, a ovariana e a infiltrativa profunda representariam três doenças distinta s com comportamentos clínicos e histopatológicos diferentes. Brosens e Brosens (2000), por sua vez, classificam a endometriose de acordo com sua topografia, em superficial e profunda: a forma superficial ou ade nomiose seguiria o trajeto dos ductos mullerianos incluindo útero, fó rnices vaginais, septo retovaginal e ligamentos uterinos; as lesões prof undas seriam aquelas localizadas fora da extensão dos ductos de Muller e incluiriam lesões peritoneais e ovarianas. A classificação mais ut ilizada é da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM, 1997), porém a falta de correspondência entre quadro clínico e severidade da doença é um dos fatores mais intrigantes na endometriose (D’HOOGHE et al., 2003). 23 1.2. Endometriose e infertilidade Quanto à associação infertilidade-endometriose, esta é inequívoca (D’HOOGHE et al., 2003), e o quadro de infertilidade é presente em quase 60% das mulheres com essa doença (CORNILLIE et al., 1990; D’HOOGHE et al., 2003; MATALLIOTAKIS et al., 2007). A interferência mecânica, ou seja, a presença de def eito anatômico pélvico associado à endometriose, é o fenômeno mais acei to, entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos, especialmente nos estágios míni mo e leve da doença (SCHENKEN, 1996; FERRIANI et al., 2000; CROSIGN ANI et al., 2006; GUPTA et al, 2008). Neste caso, os mecanismos im unológicos, genéticos e hormonais têm sido estudados e incluem possíve is alterações no microambiente folicular ou no oócito (SCHENKEN , 1996; PELLICER et al., 1998 A ; GARRIDO et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2005; ABREU et al., 2006); bem como nas células da granulosa (HARLO W et al., 1996; OLIVEIRA et al., 2005; ABREU et al., 2005; GOMES et al., 2007, TOYA et al., 2002). Sem dúvida o advento das técnicas de reprodução assistida representou um import ante passo no tratam ento da infertilidade associada à endometriose (NEME et al., 2001; CROSIGNANI et al., 2006). Numerosos estudos foram realizados para avaliar se a endometriose afeta os resultados da fertilização in vitro (FIV) e seus achados foram controversos (TEMPLET ON et al., 1996; RINESI et al., 2002; WRIGHT et al., 2007). Entretanto, Barnhart et al. (2002) realizaram uma metanálise de 22 estudos sobre o assunto e verificaram que todos 24 os parâmetros encontravam-se alterados nas pacientes com endometriose quando comparadas àquel as com outras causas de infertilidade, com redução na taxa de fertilização, número de oócitos captados, taxas de implantação e gestação. O clássico modelo de estudo com mulheres doadoras de oócitos proporcionou uma compreensão fu ndamental quanto à questão “qualidade oocitária” vs. “receptividade endometrial” em mulheres com endometriose, pois apontou o comprome timento da qualidade oocitária como o principal fator alterado nas mulheres inférteis com endometriose submetidas à FIV em detriment o da receptividade endometrial (PELLICER et al., 1998 B ; GARCIA-VELASCO; ARICI, 1999; DIAZ et al., 2000; BARNHART et al., 2002; GARRIDO et al., 2002). 1.3. Aromatase e Endometriose Como já foi relatado, emer ge a teoria de que a endometriose represente uma doença poligênica hereditária com expressão aberrante de citocinas e enzimas relacionadas à esteroidogênese como a aromatase (BULUN et al., 1995; HARLOW et al., 1996; NOBLE et al., 1996; ZEITOUN; BULUN, 1999; ATTIA et al., 2001; NEME et al., 2001; BULUN et al., 2002; GURATES et al., 2003; ABREU et al., 2005; HEILIER et al., 2006). De fato, evidências apontam neste sentido. Arvanitis et al. (2003) encontraram a presença de um po limorfismo no gene da aromatase 25 associado com a endometriose. Kao et al. (2003), através da análise de microarrays em amostras de endométrio de mulheres com endometriose, encontraram 91 genes com expressão aumentada e 115 reduzidos significativamente nestas mulheres; genes como os envolvidos com resposta imune e apoptose celular, fatores angiogênicos e também o gene da aromatase. A aromatase é uma enzima c odificada pelo gene CYP19A1 localizado no cromossomo 15 ( 15q21.1; Sequência do GeneBank NM_000103) (MEINHART; MULLIS, 2002) e corresponde a um complexo enzimático do citocromo P450 respons ável por catalisar a transformação de androgênios (testosterona, andr ostenediona) em estrogênios (estradiol, estrona, respectivamente) (ZEITOUN; BULUN, 1999; NEME et al., 2001; BULUN et al., 2002; FANG et al., 2002; KARAER et al., 2004; SPEROFF; FRITZ, 2005). É uma enz ima-chave para a formação de estrogênio nos tecidos humanos (F ANG et al., 2002; MEINHART; MULLIS, 2002) e está presente em vários tecidos: ovários (células da granulosa), testículo, tecido adipos o, placenta, cérebro, músculo, fibroblastos da pele e do tecido ósseo (KARAER et al., 2004). Vários promotores tecido-específicos permite m a regulação local da enzima, porém a proteína expressa é a mesma (MEINHART; MULLIS, 2002; KARAER et al., 2004). Uma vez que a endometriose é considerada uma doença estrogênio-dependente, a expressão da enzima aromatase torna-se essencial para sua etiopatogenia. O estrógeno é um potente mitógeno para os tecidos mullerianos (BULUN et al., 2002) e a possível ação 26 autócrina deste hormônio, ou seja, s ua ação local sobre o endométrio de mulheres com endometriose pode ser um fator facilitador para o desenvolvimento de implantes na cavi dade peritoneal (NOBLE et al., 1996; FANG et al., 2002; GURATES et al., 2003) (Vide FIGURA 1). O envolvimento da aromatase e produção esteroidogênica, bem como sua importância para o est abelecimento da endometriose têm sido alvos de numerosos estudos, principalmente nos endométrios tópico e ectópico (BULUN et al., 1995; NOBL E et al., 1996; ZEITOUN; BULUN, 1999; ATTIA et al., 2001; NEME et al., 2001; BULUN et al., 2002; GURATES et al., 2003; ISHIHARA et al., 2003; HEILIER et al., 2006; BUKULMEZ et al., 2008; KYAMA et al., 2008). Níveis muito elevados da aromatase foram detectados em im plantes peritoneais e endometriomas (NOBLE et al., 1996; KITAWAKI et al., 2002; BUKULMEZ et al., 2008) e também no endométrio tópico de mulheres com endometriose (BULUN et al., 1995; ZEITOUN; BULU N, 1999; BULUN et al., 2002; KYAMA et al., 2008), mas não em mulheres sem a doença (BULUN et al., 2005). 27 Figura 1 – Mecanismo proposto de inativação defectiva de estradiol na endometriose. Estradiol (E2), estrona (E1) e androstenediona (A) chegam às lesões endometrióticas pela corrente sanguínea, a ar omatase (P450 arom) na célula estromal endometriótica catalisa a transformação de A para E1, que, por sua vez, é convertida à E2 pela ação da enzima 17 beta-hidroxiesteroide-desidrogenase1 (17 βHSD-1). E2 normalmente é inativado para E1 pela 17 beta-hidroxi-desidrogenase2 (17 βHSD-2) na célula epitelial glandular. Na célula endometriótica, no entanto, a 17 βHSD-2 apresenta-se defeituosa, mantendo E2 em elevados níveis locais. E2 promove crescimento do tecido endometriótico e produção de prostaglandina s (PGE2) que, por sua vez, estimulam a aromatase, completando um ciclo de feedback positivo. (Adaptado de Zeitoun & Bulun, 1999) Porém, sabe-se que esta enzim a também está presente nas células da granulosa e, de fato, exerce um papel fundamental para o processo de maturação folicular e estabelecimento da qualidade oocitária (ERICKSON et al., 1989; FOLDESI et al., 1998; LAMBERT et al., 2000; SPEROFF; FRITZ, 2005). Ora, se existe funcionamento aberrante da aromatase em lesões de endometriose, por que não ocorreria o mesmo na célula da granulosa com comprometimento da foliculogênese e qualidade oocitária? Célula epitelial Célula estromal A E1 E2 E1 E2 PgE2 P450 arom + + + 17β HSD-1 17β HSD-2 A E1 E2 Vaso sanguíneo 28 Além disso, como já descrito previamente, os dados derivados dos estudos com doadoras apontaram a má qualidade oocitária como o principal fator alterado nas mul heres inférteis com endometriose submetidas à FIV (PELLICER et al., 1998; BARNHART et al., 2002; DIAZ et al., 2000). Qual o papel da aromatase para o desenvolvimento de oócitos de boa qualidade? Sabe-se que o clímax ovulatório e a quali dade do oócito a ser ovulado são resultados de um processo complexo e orquestrado que tem duração de 85 dias desde a fase de folí culo primordial até a fase de folículo pré-ovulatório. Os folículos que iniciam essa “corrida” o fazem primeiramente em uma manei ra gonadotrofina-independente e posteriormente, gonadotrofina-dependente. Nessa última, oócito, células da granulosa e FSH interagem de manei ra sinérgica e a multiplicação das células da granulosa e a maneira como respondem ao FSH e posteriormente ao LH para a produção de esteróides intrafoliculares são eventos fundamentais desse proce sso (SPEROFF; FRITZ, 2005). Sabe- se que existem “gap-junctions” entre as células da granulosa, evidência de que há interação molecular entre el as e possivelmente com o próprio oócito, através de molé culas sinalizadoras como o GDF-9 (fator de diferenciação de crescimento 9) e o BMP-15 (proteína óssea morfogenética 15) (ALBERTINI; BARRE TT, 2003; COMBELLES et al., 2004; THOMAS; VANDERHYDEN, 200 6; HUTT; ALBERTINI, 2007), contudo, muito pouco se conhece sobre essa comunicação entre células da granulosa e oócito. 29 As células da granulosa se dife renciam em células da granulosa murais e do cumullus durante o proce sso de foliculogênese, fato que tem estimulado o estudo de seu potencial como células-tronco mesenquimais (GEYTER et al., 2006). No momento em que se atingem o estágio de folículo pré-antral, portanto, as cé lulas da granulosa são capazes de sintetizar todas as três cla sses de esteróides (androgênios, progestagênios e estrogênios) (SPEROFF; FRITZ, 2005). Porém, as proporções e o mo mento nos quais estes são produzidos são fundamentais. Sabe-se que o FSH e posteriormente o LH apresentam receptores hormonais na s células da granulosa e existe um sinergismo entre estes receptores e a produção hormonal intrafolicular para a produção de um folículo que carregue um oócito maduro (COSTA et al., 2004; SPEROFF; FRITZ, 2005; SILVA et al., 2008). Os andrógenos, por exemplo, são nece ssários em pequenas concentrações no início do desenvolvimento folicular como substrato para a produção de estradiol. Segundo a teoria das duas células, as células da teca transformam os componentes C21 (c olesterol) até andrógenos, que por sua vez são substratos para a arom atase nas células da granulosa que convertem os andrógenos (C19) a estrógenos (C18). A transformação de um ambiente androgênico para estrogênico é fundamental para que se tenha um oócito apto para ovular (SPEROFF; FRITZ, 2005). Na célula da granulosa, a aromatase apresenta um papel essencial na foliculogênese e produção de estradiol: sua expressão aumenta à medida que o desenvolvimento folicular progride (TETSUKA; HILLIER, 1997; GUET et al., 1999), sob influência do FSH, segundo a teoria das duas células-duas 30 gonadotrofinas (SPEROFF; FRITZ, 2005). Portanto, a aromatase é uma enzima de primordial im portância na célula da gr anulosa e responsável por produzir um microambiente estrogênico folicular, essencial ao seu processo de desenvolvimento e ma turação (SPEROFF; FRITZ, 2005). Além disso, é necessário ressaltar que a aromatase é o ponto final de toda a cascata esteroidogênicia ovar iana, e a única enzima ovariana capaz de converter andrógenos para estrógenos. Ou seja, se houver um defeito em sua atividade, aquele folículo terá dificuldade em adquirir um status pré-ovulatório normal. Tanto nos ciclos naturais, bem co mo nos ciclos estimulados para reprodução assistida, as relações hormonais intrafoliculares são essenciais para o sucesso de todo o pr ocesso ovulatório. Em termos de maturação, Costa et al. (2004) analis aram os ciclos estimulados com gonadotrofinas exógenas sem uso de análogo do GnRH e constataram que os folículos que continham oóc itos maduros apresentavam um aumento da relação P/T, P/E2 e E2/T no fluido fo licular em relação aos imaturos, o que sugere uma diminuiç ão da conversão C21 a C19, mas não na atividade da arom atase. Silva et al. (2008) analisaram essas mesmas relações em folículos de mu lheres submetidas também a ciclos estimulados com uso análogo do GnRH e observaram que sua ação se mantém intacta e o efeito mais importante do GnRH foi a redução de andrógenos intrafoliculares, com maiores taxas de fertilização e de maturação. 31 Portanto, os dados da literatur a apontam para a importância da aromatase no processo de maturação e estabelecimento da qualidade oocitária. Estudos in vitro, por cultivo de células da granulosa de mulheres com endometriose submetidas a cicl os de hiperestimulação ovariana controlada demonstraram que e ssas apresentam um mecanismo defeituoso da atividade da aromatase. Harlow et al. (1996) pesquisaram a atividade da aromatase em pacient es com endometriose de graus leve e mínimo através de cultura de célula s da granulosa na qual avaliaram a produção de estrógeno frent e à adição de testoste rona ao meio de cultura. Encontraram redução da at ividade da aromatase nas pacientes com endometriose em comparação ao controle. Pesquisadores do mesmo grupo (CAHILL et al., 2003) tam bém através de cultivo de células da granulosa, constataram uma menor sensibilidade ao LH nas células da granulosa de mulheres com endometriose. Em estudo prévio de nosso la boratório (ABREU et al., 2006) encontramos redução na produção de estr adiol nas células da granulosa murais luiteinizadas in vitro , obtidas de mulheres com endometriose, após 24 horas de cultivo celular. Em condições basais ou quando foi suplementado ao meio de cultivo m enor concentração de testosterona (2x10 -6M), a produção de estradiol foi menor no grupo com endometriose. Entretanto, quando se aumentou a concentração da testosterona (precursor da aromatase) adici onada ao cultivo celular (2x10 -5 M), não houve diferença entre os grupos c ontrole e endometriose quanto à produção de estradiol. 32 Diante deste achado, emerge a seguinte pergunta: se esse fenômeno ocorreu devido a um comprometimento da atividade da aromatase ou se devido à menor disponibilidade de seu substrato. Com o intuito de esclarecer esta questão, bem devido à presença de vários estudos descritos anterio rmente que associam a endometriose à defeitos nos mecanismos de controle de seu gene, hipotetizamos que a redução da atividade da aromatase seja resultado de um defeito na expressão de seu gene, CYP19A1. 33 2. OBJETIVO O objetivo deste trabalho é: 9 Verificar a expressão do gene da aromatase (CYP19A1) nas células da granulosa murais lu teinizadas de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV ou ICSI). A hipótese a ser validada é que: 9 Mulheres com endometriose apresentam redução da expressão do gene da aromatase (CYP19A1) nesse tecido-alvo. 34 3. JUSTIFICATIVA Estudos prévios, conforme descr ito previamente, verificaram a redução da atividade da ar omatase na célula da granulosa de mulheres com endometriose através de cultivo celu lar. Alterações da expressão de seu gene, CYP19A1, tamém fora m demonstradas nos endométrios eutópico e ectópico. A inexistênc ia de estudos que avaliem a sua expressão gênica, especificamente nas células da granulosa de mulheres com endometriose estimulou a realização deste estudo. 35 4. PACIENTES E MÉTODOS 4.1. Delineamento e amostra: Estudo caso-controle. O grupo- estudo foi composto de 11 mul heres com endometriose e o grupo- controle de 11 mulheres, com fatores masculino ou tubáreo de infertilidade, submetidas à técnicas de reprodução assistida (FIV ou ICSI). O número amostral para este estudo refere-se ao número de ciclos de Hiperestimulação Ovariana Cont rolada (HOC), no grupo controle foram incluídos 11 ciclos de HOC, e no grupo com endometirose foram 12 ciclos, ou seja, uma das mulheres com endometriose foi submetida a dois ciclos de HOC no período do estudo, ambos incluídos no mesmo. 4.2. Local de realização do estudo: Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ri beirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. 4.3. Comitê de Ética em Pesquisa: o presente estudo foi aprovado pela Comissão Nacional de Ét ica em Pesquisa (CONEP) de acordo com o parecer número 15346/ 2005. Cada paciente assinou um termo de consentimento antes da r ealização do procedimento de reprodução assistida e da realização da pesquisa, após os devidos esclarecimentos (vide Anexos III, IV e IV). 36 4.4. Seleção de Pacientes: Foram selecionadas 22 mulheres inférteis com indicação para FIV ou ICSI, com um total de 11 para o grupo controle e 11 para o grupo com endometriose (uma delas com dois ciclos de estimulação inclusos no estudo), as quais foram entrevistadas e examinadas pelo mesmo observador. Cinco mulheres apresentaram o grau mínimo/leve e seis o grau m oderado/grave de endometriose de acordo com a classificação da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva. Os critérios para seleç ão de pacientes de ambos os grupos estão descritos abaixo: 4.4.1 Critérios de inclusão para os dois grupos: estar cadastrada no Programa de Repr odução Assistida do Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto; ter idade igual ou inferior a 40 anos, apresent ar ciclos menstruais regulares e dosagem de FSH normal para o menacme. 4.4.2. Critérios de inclusão para o grupo-estudo: presença de endometriose em qualquer estadio de acordo com a classificação da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (F ertil Steril 1997;67: 817–821), diagnosticada por laparoscopi a realizada nos seis meses anteriores à realização do estudo. 37 4.4.3. Critérios de inclusão para o grupo-controle: ausência de endometriose confirmada por laparo scopia prévia. Fatores tubáreo ou masculino de infertilidade. 4.4.4. Critérios de exclusão para os dois grupos: presença de doenças endócrinas associadas, mulheres ooforectomizadas. 4.4.5. Processo de seleção das mulheres incluídas no estudo: No período do presente estudo, foram atendidas 50 mulheres com diagnóstico de endometriose subm etidas à FIV ou ICSI. Destas, 24 cumpriam os critérios de inclusão para o estudo e foram selecionadas de maneira consecutiva, porém 12 não concordaram em participar do estudo. Portanto, o total foi de 12 mulheres com endometriose incluídas no estudo. Para o grupo controle, a seleção também ocorreu de maneira consecutiva. 4.5. Protocolo de Hiperestimulação Ovariana Controlada Primeiramente, realizou-se a programação do período menstrual através de uso de anticoncepcionais or ais combinados no ciclo prévio àquele da indução da ovulação. Para dessensibilização hipofisária, foi utilizado o agonista do Gn RH acetato de leupr olide (Lupron®, Abbott; Reliser®, Serono, Brasil) 10 UI/dia via subcutânea ou nafarelina via nasal 400 µg/dia (Synarel®, Pharmacia, Bras il) conforme protocolo longo. Do 38 1º-3º dia do ciclo de estimulaç ão ovariana, foi realizada uma ultrassonografia (USG) transvaginal para excluir cistos ovarianos e então iniciada a estimulação ovariana c ontrolada com gonadotrofinas: hMG (Menogon®, Ferring, Brasil; Pergonal®, Serono, Brasil) na dose de 200 a 400 UI/dia e a partir do 6 o dia a dose da gonadotrofina foi ajustada de acordo com o crescimento folicular monitorizado por USG. Quando houve pelo menos 2 folículos com 17 mm de diâmetro, foi administrado hCG intramuscular (Profasi®, Serono, Brasil) 10.000 UI ou hCG recombinante 250µg via subcutânea (Ovidr el®, Serono, Brasil) e após 34 a 36 horas, realizada a captação de oócitos. 4.6. Captação de Oócitos A captação oocitária foi realizada sob anestesia geral tipo endovenosa com uso de prop ofol (Diprivan®, Astra Zeneca, Brasil) associado ao fentanil (Fentanil®, Jan ssen Cilag, Brasil) , administrados por via endovenosa. O procedimento fo i feito via vaginal através de punção de fundo de saco e guiado por ultrassonografia. O conteúdo de cada folículo foi aspirado em tubos de Falcon sob pr essão de 120-130 mmHg e mantido a 37 o e os oócitos manuseados em capela de fluxo de ar laminar com temperatura controlada a 37oC e concentração de CO2 de 5%, após separação do flui do folicular, o qual c ontinha as células da granulosa luteinizadas murais, utilizadas no presente estudo. 39 4.7. Coleta e Técnica de Is olamento das Células da Granulosa Murais (Anexo II) O método utilizado para a técnica de isolamento das células da granulosa murais luteinizadas de mulh eres submetidas a técnicas de reprodução assistida foi baseado no método utilizado pelos autores Chang et. al. (2005), com algumas modificações. O procedimento está descrito a seguir: Para a realização do estudo, foi utilizado pelo menos um aspirado folicular de cada ovário de cada mulher incluída no estudo, ou seja, o aspirado correspondente a 2 folículo s maduros (>17mm diâmetro), sem contaminação visual por célula s sanguíneas. Depois de separado o complexo cumulus-oócito, sob fl uxo laminar e temperatura a 37 oC, o restante do conteúdo presente no t ubo de Falcon (15ml), que continha o fluido folicular e as células da granulosa murais, foi então transferido para placas de Petri e lavado com meio HT F Modificado (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA). Após lav agem, todo este material foi então transferido para um novo tubo de 15 ml e centrifugado por 10 minutos a 2500 rpm a 40 C. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” ressuspenso em 0,6 ml de meio HTF Modificado e cuidadosamente transferido sobre a superfície de 4 ml de Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA) previamente preparado em um novo tubo. Este conteúdo foi então centrifugado por 10 min a 1700 rpm e 4 0C, com o objetivo de separar as células sanguíneas das células da gr anulosa murais. As células da granulosa formaram uma fina camada entre o Histopaque e o meio de 40 cultivo, enquanto que as célula s sanguíneas que ainda estavam presentes ficaram coletadas no f undo do tubo. A interface meio- histopaque contendo, portanto, as célu las da granulosa murais, foi então cuidadosamente aspirada com pipeta Pasteur e a seguir transferida a um novo tubo contendo 2 ml de HTF-M para lavagem do material. Este

foi também centrif ugado por 10 minutos a 2500 rpm e 4 0C. A seguir, descartou-se o sobrenadante e o pellet foi então ressuspenso em 500 µl de meio de cult ivo PBS (Irvine Scientif ic) para finalmente ser dividido e estocado em 2 microtubos de 1.5 ml cada, contendo cada um dos tubos 250 µl da suspensão celula r e 750 µl de Trizol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), resu ltando em um volume total de 1 ml em cada tubo. Por meio de agitação ma nual, foi realizada a lise celular do material contido em cada microtubo e rapidamente armazenado a -800 C, até a realização da extração de RNA. A presença e isolamento das células da granulosa foram confirmados através de visualização por microscópio ótico invertido (Coleman® ST-302L, Brasil), e veri ficada sua vitalidade através da coloração por Trypan Blue (Trypanblau®, Merck, Whitehouse Station, NJ, USA). É importante ressaltar também que todos os cuidados foram tomados para evitar c ontaminação no material estudado. Toda a equipe utilizou luvas estéreis e o material de consumo como tubos e pipetas eram livres de RNAse e estéreis. O ma terial foi sempre mantido sobre gelo para que se pudesse evitar a degradação do RNA durante os passos descritos anteriormente. 41 4.8. Expressão do gene da aromatase A expressão quantitativa do gene da aromatase (CYP19A1), ou seja, a quantificação da expressão dos níveis de RNA mensageiro da aromatase em relação ao gene da ß-actina, nas células da granulosa luteinizadas murais das mulheres in cluídas no estudo foi analisada pelo método de PCR em tempo real quantitativo, como descrito a seguir. 4.8.1. Extração de RNA O RNA total das células da granul osa foi extraído utilizando-se o Trizol LS Reagent® (Invitrogen). O pr ocedimento foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Br evemente, depois do descongelamento, as amostras, que já haviam sido previamente armazenadas em Trizol LS Reagent, foram então homogeneizadas e mantidas à temperatura ambiente por 5 minutos. A cada t ubo foi então adicionad o 0,2 ml de clorofórmio (Merck, Whitehouse Station, NJ, U SA). Após homogenização e incubação à temperatura ambiente por 3 minutos, o material foi centrifugado a 13.000 rpm por 15 minutos a 4 0C. O sobrenadante foi aspirado e transferido a um novo t ubo contendo 0,5 ml de isopropanol (Merck). Após homogenização, o mate rial foi incubado “overnight” a - 200C. No próximo dia, após descongelam ento, o material de cada tubo foi submetido à centrifugação por 30 minutos a 13.000 rpm e 4 0C, o 42 sobrenadante foi então descartado e ao “pellet” foi adicionado 1 ml de etanol 75% (Merck) para lavagem e após secagem completa do etanol, ao pellet em cada tubo foi adicionada 20 µl de água livre de RNAse e estocado a -800C. A integridade do RNA foi verificada através de eletroforese em gel de agarose a 1% corada com brometo de etídio. (Figura 2) Figura 2 – Eletroforese em gel de agarose de amostras de RNA de células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. Banda s 18S e 28S referentes às subunidades ribossomais intactas. 4.8.2. Síntese de cDNA Para a síntese de cDNA foi usado o kit High capacity cDNA archive kit (Applied Biosystems, Los Angeles, CA) associado à enzima enzima inibidora de RNAse (RNasin Plus®, Promega, Wisconsin, MD, USA). O procedimento realizado para cada amostra conforme as instruções e orientações contidas no kit. Após a síntese de cDNA, que resultou em um volume final de 20 µl de cDNA, o mesmo foi aliquotado (5 µl cada) e estocado a -200C. 18S 28S 43 4.8.3. PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) A reação de qRT-PCR foi realiz ado com as amostras de cDNA de células da granulosa murais das mulher es incluídas no presente estudo, previamente armazenadas a -800C. Foram utilizados os reagentes do tipo SYBR Green PCR Core reagents (Applie d Bio-systems, Foster City, CA) com análise de curva de dissociação e o sistema de detecção ABI Sequence Detection System 5000 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Los Angeles, CA). Todos os experimentos referentes a cada paciente foram realizados em duplicata e os dados normalizados em relação ao gene endógeno da β-actina. As sequênc ias de interesse fo ram amplificadas utilizando-se os seguintes “primers” (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA): Para o gene da aromatase CYP19A1: - (Forward) (FW): 5’CCTTgCCAATAgTgTCATCC3’ - (Reverse) (RV) 5’TAgCCTggTTCTCTggTgTg 3’ Para o gene endógeno β-actina: - (Forward) (FW):5’ TCgTgATggACTCCggTgAC3’ - (Reverse) (RV): 5’CgTggTggTgAAgCTgTAg3’ A sequência dos primers foi defin ida através do software Gene Runner (Hastings softwares Inc, Ne w York, NY, USA), seguindo-se as recomendações para a PCR em tempo real. 44 4.8.4. Amostras de referência Diluições seriadas de uma am ostra de placenta humana de uma mulher hígida com gestação a termo foram utilizadas para a realização da curva padrão e essa amostra ta mbém foi usada como amostra de referência. A escolha da placenta como amostra de referência foi pelo fato de ser um órgão conhecido pela ex pressão da aromatase e pelo fato de já ter sido usada previamente por outros pesquisadores (ACIÈN et al., 2007). Houve porém a necessidade de se utilizar uma outra amostra de referência, que foi o própr io grupo controle do pr esente estudo, pois a placenta apresentou uma expressão da aromatase muito elevada em comparação com as células da granulosa murais, que representaram portanto uma amostra de referência mais fidedigna. O cálculo da normalização da expre ssão gênica ao gene endógeno e cálculo da expressão gênica relati va foi realizado pelo método 2 -∆∆Ct conforme fórmula a seguir: (Ct=threshold cycle) ∆Ct= Ct (CYP19A1) - Ct β-actina; ∆∆Ct= ∆Ct amostra de interesse - ∆Ct amostra de referência. 2 -∆∆Ct = formula utilizada para quantificação da expressão relativa do gene da aromatase em realação ao gene da β-actina, usando como amostra de referência a placenta ou as células da granulosa do grupo controle do presente estudo (LIVAK et al., 2001). 45 Os cálculos estão representados detalhadamente em cada amostra do estudo no ANEXO I. 4.9. Análise Estatística Para o cálculo amostral, foi usado o programa encontrado no website: http://www.lee.dante.br/ pesquisa/amostragem/amostra.html O valor considerado para o cálculo amostral foi a média do desvio-padrão do Ct em ambos os grupos, a qual foi 2,884 (controle 2,836 e endometriose 2,933). Para uma difer ença de 15% entre os grupos e nível de significância de 5%, seriam necessárias 09 pacientes para cada grupo. O programa usado para cálculo dos dados das pacientes e da RT- PCR (PCR em tempo real) foi o GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Para a análise dos dados do HOC, foi utilizado o teste T não pareado em todas as comparações. Com relação à análise dos dados da RT-PCR, quando foram comparados dois grupos, foi usado o teste de Mann-Whitney e, quando realizada a comparação simultânea ent re os três grupos, o teste de Kruskal-Wallis com correlação de D unn. Em todos os casos, considerou- se um nível de significância de 5%(p < 0.05). 46 5. RESULTADOS A idade das mulheres incluídas no estudo variou de 27 a 40 anos de idade. Não houve diferença entre os grupos quanto à idade ou parâmetros do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada para reprodução assistida (Tabelas 1 e 2). A média de idade das mulheres do grupo controle e endometriose foi 34,73 e 32,64, respectivamente (p=0,17). Para os outros parâmetro s do ciclo de hiperestimulação ovariana, as médias encontradas para os grupos controle e endometriose foram respectivamente: dias de indução, 9,00 vs. 9,08 (p=0,90); quantidade de gonadotrofinas us adas em unidades, 2502 vs. 2354 (p=0,65); n 0 de folículos puncionados, 11, 18 vs. 11,50 (p=0,87) e n o oócitos captados, 5,82 vs. 6,83 (p=0,39). Quanto aos resultados da RT-PCR, as curvas de amplificação e de dissociação estão representadas nas figuras 4, 5 e 6, respectivamente. O “Threshold” usado foi de 0,2 e foram realizadas curvas-padrão para ambos os genes. A análise do Ct absoluto, ou seja, sem a normalização para o gene endógeno da β-actina, demonstrou uma dist ribuição gaussiana de seus valores (com exceção da aná lise da aromatas e no grupo com endometriose). As médias e medi ana do grupo que não apresentou distribuição normal, bem como os respectivos desvio-padrões estão representados na Tabela 3. Quanto aos valores de Ct para o gene da aromatase após normalização para o gene endógeno beta-actina, os dados estão 47 representados nas Tabelas 4 e 5. Os valores da tabela 4 representam os dados calculados utilizando-se a placent a como amostra de referência. Na tabela 5, no entanto, são demonstrados os dados quando foi utilizada a média do Ct absoluto do grupo contro le como amostra de referência. O cálculo da expressão gênica relati va foi calculada pelo método 2 -∆∆ Ct, conforme descrito na seção Métodos e no ANEXO I. Não houve diferença entre os grupos controle e endometriose no que diz respeito à análise quantitativa relativa da expressão do gene da aromatase (CYP19A1) nas células da granulosa luteinizadas murais (p=0,5254 e 0,3099, Mann Whitney, quando normalizados à placenta e grupo controle, respectivamente; vi de Gráfico 1). Na comparação entre os três grupos (controle, endometri ose mínima/leve e moderada/grave), também não foi encontrada diferença segundo o teste Kruskal-Wallis com correlação de Dunn (p=0,4254 quando normalizados à placenta e ao grupo controle, respectivamente; vide Gráfico 2). A análise comparativa entre os grupos endometriose leve/m ínima vs. modera da/grave também foi efetuada e novamente não foi encontrada nenhuma diferença siginificante entre os grupos (p=0,4318, Mann Whitney, quando normalizados à placenta e também ao grupo controle). 48 Tabela 1 – Características do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI de mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino de infertilidade (grupo controle; N=11) quanto à idade, número de dias de indução ovariana, quantidade de gonadotrofina usada, número de folículos puncionados e oócitos captados. DP=desvio-padrão. IDADE No DIAS DE INDUÇÃO QUANTIDADE GONADOTROFI NA USADA N0 FOLÍCULOS PUNCIONADOS N0 OÓCITOS CAPTADOS 01 37 07 4175UI 8 4 02 31 09 2595UI 17 8 03 36 11 3000UI 14 8 04 39 08 2800UI 5 2 05 27 09 2200UI 6 2 06 33 09 1750UI 15 7 07 33 10 1400UI 20 7 08 40 08 2250UI 15 10 09 10 32 36 09 12 1950UI 3300UI 13 5 9 4 11 38 07 2100UI 5 3 Média± DP 34,73±3,90 9,00± 1,55 2502± 786,3 11,18±5,51 5,82±2,892 49 Tabela 2 – Características do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada para FIV ou ICSI de mulheres com endometriose (todos os estádios, N=12) quanto à idade, número de dias de indução ovariana, quantidade de gonadotrofina usada, número de folículos puncionados e oócitos captados. IDADE No DIAS DE INDUÇÃO QUANTIDADE GONADOTROFI NA USADA N0 FOLÍCULOS CAPTADOS N0 OÓCITOS CAPTADOS 01 35 08 2400UI 10 7 02 34 09 1675UI 13 9 03 30 10 3000UI 7 4 04 36 10 2850UI 13 7 05 28 08 1200UI 10 7 06 37 08 3000UI 21 11 07 34 09 2700UI 8 6 08 C1 C2 32 09 12 2700UI 3450UI 13 12 10 1 09 32 06 1150UI 10 7 10 11 32 29 09 11 2475UI 1650UI 10 11 6 7 Média± DP 32,64±2,87 9,08± 1,56 2354± 755,3 11,50±3,55 6,83± 2,62 Legenda: C1= primeiro ciclo e C2 = segundo ciclo de estimulação ovariana da paciente n0 08; DP=desvio-padrão. 50 Figura 3 – Gráfico de amplificação por PCR em tempo real de cDNA obtido de amostras de células da granaulosa murais de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida. As sequências de interesse para os genes da aromatase e da β-actina foram amplificadas, para análise da expressão gênica relativa. Legenda: Delta RN = Variação da fluorescência detectada. “Cycle number” = número do ciclo de amplificação. 51 Figura 4 - Gráfico da curva de dissociação para o gene da β-actina, obtida por PCR em tempo real (SYBR Green), de amostras de cDNA de células da granulosa de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida. 52 Figura 5 - Gráfico da curva de dissociação para o gene da aromatase, obtida por PCR em tempo real (SYBR Green), de amostras de cDNA de células da granulosa de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida. 53 Tabela 3 – Níveis absolutos de “Threshold Cycle” (Ct), em duplicata, obtidos por PCR em tempo real (SYBR Green), para a análise de expressão relativa do gene da aromatase (CYP19A1), normalizada ao da β-actina, em células da granulosa luteinizadas murais de mulheres inférteis por fator tubáreo e/ou masculino (grupo controle) em comparação à mulheres com endometriose (todos os estádios, ASRM) submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV ou ICSI). Placenta como amostra de referência. GRUPO CONTROLE Ct Aromatase (CYP19A1) Ct β-actina GRUPO ENDOMETRIOSE Ct Aromatase (CYP19A1) Ct β-actina 01 27,6026 27,5947 22,5086 22,5086 01 27,1022 27,3753 24,5945 24,6631 02 26,0095 26,2485 19,9746 20,1802 02 26,6939 26,6903 20,9338 20,9338 03 23,9989 23,9763 20,2362 20,4424 03 30,1604 29,4138 24,6380 24,8973 04 20,8751 20,8211 18,0222 17,6097 04 32,6201 32,5394 24,4042 24,4951 05 26,4174 25,9648 21,5941 21,7820 05 29,7922 30,8459 26,5925 26,3038 06 27,0075 26,6059 21,4559 21,5778 06 30,0930 31,0035 24,3469 23,6951 07 26,2209 26,1272 20,2611 20,3337 07 21,5139 21,7205 19,0755 18,8909 08 29,5236 29,9585 23,6901 24,1536 08 C1 C2 26,5984 26,2491 31,0822 31,1929 21,4029 21,3561 24,0759 24,0364 09 10 30,1310 30,9116 23,3947 23,2563 26,2150 26,1182 21,1645 21,0101 09 10 0 0 28,1726 28,7905 32,9751 33,1153 23,0111 23,6560 11 29,0394 29,4491 23,1049 23,1579 11 27,8934 28,0277 18,5017 18,3280 Média ± DP 26,42± 2,836 21,69± 2,175 Média ± DP Mediana±DP 26,07 ± 8,503 28,10± 8,503 23,71 ±3,745 PLACENTA 17,209 17,041 20,0306 20,5047 54 Tabela 4 – Valores de expressão gênica relativa obtidos por PCR em tempo real para o gene da aromatase (CYP19A1) após normalização ao da β-actina, em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino, N=11 vs mulheres com endometrios nos graus mínimo/leve (N=5) e moderado/grave (N=7) submetidas à r eprodução assistida (FIV ou ICSI). Placenta como amostra de referência. Ct Aromatase CYP19 (Normalizado β- actina) Pacientes N0 Grupo Controle Endometriose Mínima/Leve Endometriose Moderada/Severa Endometriose Todos Estadios 01 0,003324 0,003491106 0,003193491 0,003491106 02 0,001705 0,007739467 0,003431607 (C1) 0,000836092 (C2) 0,003431607(C1) 0,000836092(C2) 03 0,009031 0,001227637 0,000151505 0,001227637 04 0,013842 0,00040417 0,00209193 0,00040417 05 0,004994 0,01824127 0,018547904 0,01824127 06 0,002894 0,000000000 0,003193491 07 0,001927 0,007739467 08 0,002005 0,000151505 09 0,005534 0,00209193 10 0,02400 0,018547904 11 0,001636 0,003193491 12 0,000000000 Média ±DP 0,006445± 0,006932 0,006221± 0,007298 0,004709± 0,006900 0,005396± 0,006762 Mediana 0,003324 0,003491 0,002643 0,003193 Legenda: Ct= “Threshold cycle”. C1=1º e C2=2º ciclos de HOC da paciente 02 (endometriose moderada/severa). 55 Tabela 5 – Valores de expressão gênica relativa obtidos por PCR em tempo real para o gene da aromatase (CYP19A1) após normalização ao da β-actina, em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino; (grupo controle, N=11) vs endometriose nos graus mínimo/leve (N=5) e moderado/grave (N=7) submetidas à reprodução assistida (FIV ou ICSI). Como amostra de referência, aqui representado o próprio grupo controle (média do Ct absoluto). Ct Aromatase CYP19 (Normalizado β- actina) Pacientes N0 Grupo Controle Endometriose Mínima/Leve Endometriose Moderada/Severa Endometriose Todos Estadios 01 0,7791 0,8182 4,3471 4,3471 02 0,3997 0,0947 0,8043 (C1) 0,1960 (C2) 0,8043(C1) 0,1960(C2) 03 2,1165 1,8139 0,4903 0,4903 04 3,2442 0,2877 0,7485 0,7485 05 1,1704 4,2752 0,0355 0,0355 06 0,6784 0,0000 0,0000 07 0,4517 0,8182 08 0,4700 0,0947 09 1,2971 1,8139 10 5,6248 0,2877 11 0,3835 4,2752 12 Média ±DP 1,385± 1,609 1,458± 1,710 0,9460±1,534 1,159±1,555 Mediana 0,7288 0,8182 0,4903 0,6194 Legenda: Ct= “Threshold cycle”. C1=1º e C2=2º ciclos de HOC da paciente 02 (endometriose moderada/severa). 56 Gráfico 1 – Expressão gênica relativa, por PCR em tempo real, da aromatase (gene CYP19A1) em células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose (todos estádios, N=12) vs. mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino de infertilidade (N=11), submetidas a técnicas de reprodução assistida. (p>0,05, Mann Whitney). Gráficos representam cálculos quando foram usadas como amostra de referência: a) placenta e b) média do Ct absoluto do grupo controle. Ct=”Threshold cycle” a) Controle Endometr iose 0.00 0.01 0.02 0.03 Expressão Relativa (cDNA) CYP19 b) Cont role End ometr iose 0.0 2.5 5.0 7.5 Expressão Relativa (cDNA) CYP19 57 Gráfico 2 – Expressão gênica relativa, por PCR em tempo real, da aromatase (CYP19A1) em células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose vs. controle submetidas a técnicas de reprodução assistida. A comparação foi realizada entre os grupos (1) controle (fator tubáreo/masculino; N=11); (2) endometriose leve e mínima (N=5); (3) endometriose moderada e severa (N=7). (p>0.05, Kruskal-Wallis com correlação de Dunn). Gráficos representam cálculos quando foram usadas como amostra de referência a) placenta e b) b) média do Ct absoluto do grupo controle. Ct=”Threshold cycle”. Controle Endom etrio se min /lev e End om etr iose mod/sev 0.00 0.01 0.02 0.03 Expressão Relativa (cDNA) CYP19 b) Contro le End om mi n/lev Endom mod/s ev 0.0 2.5 5.0 7.5 Expressão Relativa (cDNA) CYP19 a) 58 6. DISCUSSÃO O foco do presente estudo foi a análise da atividade esteroidogênica nas células da granulosa em mulheres com endometriose. A análise da enzima ar omatase para esse propósito é pertinente pelos motivos já descritos: 1) a importância dessa enzima na célula da granulosa como ponto final da esteroidogênese intrafolicular, pois é a responsável por converte r os andrógenos a estrógenos, sem os quais não se conquista a maturação fo licular. E a maturidade folicular é um dos principais determinantes da qualidade oocitária, já que é resultado de um complexo processo de sinergismo entre oócito e célula da granulosa em resposta às gonadotrofinas e ao IGF-1(MITWALLY; CASPER, 2002; 2004); 2) vários pes quisadores já apontaram defeitos especificamente na aromatase, na s ua atividade e na expressão de seu gene, CYP19A1, principalmente nas lesões de endometriose e no endométrio tópico de mulheres co m endometriose (BULUN et al., 1995; NOBLE et al., 1996; ZEITOUN; BULUN, 1999; NEME et al., 2001; BULUN et al., 2002; GURATES et al., 2003; HEILIER et al., 2006). Nas células da granulosa, um grupo de pesquisadores (HARLOW et al., 1996), através de estudos in vitro por meio de cultivo de células da granulosa luteinizadas coletadas em procedimentos de reprodução assistida, encontraram redução da at ividade da aromatase em mulheres com endometriose mínima e leve e, posteriormente, encontraram uma menor sensibilidade dessas células ao LH (CAHILL et al., 2003). Abreu et al., 2005, como já descrito previament e, através de estudo que usou o 59 mesmo modelo de cultivo de célula s da granulosa em mulheres com endometriose, também encontrou r edução na atividade da aromatase quando em níveis basais do cultiv o e no grupo onde foi adicionada testosterona em sua menor concentração (2 x 10 -6M), mesma usada por Harlow et al. (1996). Estes achados associados às evidências de que a endometriose é uma doença com herança poligênica (D’HOOGHE et al., 2003; CROSIGNANI et al., 2006), nos estimulou a estudar a expressão do gene da aromatase no mesmo tecido e pop ulação-alvo, as células da granulosa luteinizadas murais, aqui não cultivadas, em mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida, por técnica de PCR em tempo real qua ntitativo. Porém, de acordo com os resultados obtidos, não foi encontrada diferença ent re os grupos (Gráficos 1,2). Estes achados podem ter ocorrido devi do a três principais razões: 1) a alteração da qualidade oocitária nas mulheres com endometriose pode ocorrer em algum dos pontos da ca scata esteroidogênica ovariana, porém antes da aromatase (sítio de conversão do C21 a C19). De fato, estudos in vivo e in vitro sobre as relações hormonais intrafoliculares em fluido folicular e células da granulosa cultivadas de mulheres submetidas com ciclos estimulados, apontam par a o fato de que a aromatase é uma enzima cuja ação se perpetua, me smo quando se têm os efeitos bloqueadores dos agonistas do GnRH (DOR et al ., 2000; COSTA et al. 2004; SILVA et al., 2008). Em segundo lugar, exatamente a ação do análogo do GnRH em ciclos de hiperestimulação ovariana controlada leva à redução dos 60 andrógenos intrafoliculares tanto in vitro quanto in vivo (SILVA et al., 2008). Esta redução androgênica, que na verdade corresponde à diminuição do substrato da aromatase, pode induzir a um mecanismo de “feedback” negativo ou “down-regulatio n” de seus receptors nessas células, e talvez modificar a maneira como ocorre a expressão de seu gene nesse tecido e 3) a aromatase par ece sofrer um controle refinado, provavelmente por via de sinaliz adores moleculares, mecanismo ainda não compreendido, porém muito pertinente, tendo em vista a importância fundamental dessa enzim a na determinação de um ambiente pró- estrogênico intrafolicular. A existência das “gap-junctions” entre as células da granulosa (SPEROFF; FRITZ, 2005) e a existência de interação entre células da granulosa e oócito, recent emente sinalizados através da identificação de moléculas como o GDF-9 e o BM P-15 (HUTT; ALBERTINI, 2007) são pistas de que o mecanismo e o processo de foliculogênese pode ser ainda muito mais complexo e orques trado do que imaginamo s. E, ainda, que o oócito pode interferir nesse processo. Os mecanismos de modificaçõ es pós-transcricionais e epigenéticas são dois outros potentes c andidatos para se tentar explicar por que a atividade da aromatase pode estar reduzida, mas não sua expressão gênica, neste tecido-alvo, as células da granulosa em mulheres com endometriose. Os mecanismo epigenéticos, através das ligações proteínas-ácidos nucléicos representam um mecanismo de “liga- desliga” da expressão gênica (NIEMANN et al., 2008) e a endometriose pode ter um mecanismo epigenético de inibição da expressão gênica nas 61 células da granulosa que ainda se desconhece. As alterações pós- transcricionais como alterações do re ceptor da aromatase nas células da granulosa ou alterações bioquímica s em sua molécula que possam alterar a sua atividade, mas não s ua expressão gênica, é outra hipótese que precisa ser investigada. O próximo passo surgirá possive lmente a partir de possíveis contribuições provenientes dos “micr oarrays” em oócitos e células da granulosa, bem como o entendim ento do papel de cada subpopulação (célula da granulosa mural e do cumulus) na tentativa de esclarecer qual(is) via(s) se encontram mais afetadas nessa enigmática doença. Obviamente, a endometriose semp re precisará de uma avaliação particularizada, pois apresenta uma ampla variedade de quadro clínico (VERCELLINI et al., 2007) e possi velmente um determinado fator ou via etiopatogência envolvida em um a apresentação da doença pode não ocorrer em outra. Especialmente s obre a questão da qualidade oocitária, os graus mínimo e leve parecem ter um comportamento completamente diferente dos graus moderado e grav e (classificação ASRM), já que apresentam taxas de infertilidade e de gestação espontânea também diferentes (D’HOOGHE et al., 2003). Portanto, na endometriose, por seu aspecto tão heterogêneo e complexo e também por ser uma das mais onerosas doenças em medicina repr odutiva, o auxílio da biologia molecular, com uso dos recursos e avanços dos campos de estudo da genômica e proteômica, se faz fundamental. O presente estudo, devido às suas limitações, principalmente em termos de tamanho amostral reduzido e vieses de seleção, não permite 62 que se possa chegar a uma conclusã o consistente s obre o assunto: “expressão gênica da aromatase nas cé lulas da granulos a em mulheres com endometriose”, pelo contrário, apenas inicia este capítulo já que não se tem na literatura pesquisas sobre o tema, e estimula questionamentos que podem ser respondidos nos próximos estudos. Como próximos passos ainda , além dos “microarrays”, a endometriose necessita de estudos compartimentalizados porém com amostras maiores do que a utilizada no presente estudo. Ainda o estudo genético populacional através dos polimorfismos de genes-alvo estratégicos como a aromatase tam bém é uma estrat égia fundamental para que avancemos em termos de compreensão da doença e intervenção terapêutica, que no caso da infertilidade e ednometriose, apesar do importante passo com o adv ento das técnicas de reprodução assistida, os resultados apres entados ainda são insatisfatórios (BARNHART et al., 2002). 63 7. CONCLUSÃO No presente estudo, não foi obse rvada diferença significativa na expressão do gene da aromatase (C YP19A1) nas células da granulosa murais luteinizadas de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV ou ICSI), analisada através de PCR real-time quantitativo, quando co mparadas com mulheres sem a doença. 64 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abdalla H, Thum MY. An elevated basal FS H reflects a quantitative rather than qualitative decline of the ovarian reserve. Hum Reprod;19(4):893-8, 2004. 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Am J Reprod Immunol; 13:78-82, 1987. 73 ANEXOS 74 ANEXO I 75 CÁLCULO DA EXPRESSÃO GÊNICA RELATIVA (MÉTODO 2 -∆∆Ct; LIVAK ET AL., 2001) O cálculo da normalização da expressão gênica ao gene endógeno e à amostra de referência foi realizada utilizando-se as fórmulas: ∆Ct= Ct (CYP19A1) - Ct β-actina; ∆∆Ct= ∆Ct amostra de interesse - ∆Ct amostra de referência. 2-∆∆Ct = formula utilizada para quantificação da expressão relativa do gene da aromatase em realação ao gene da β-actina, usando como amostra de referência a placenta (Tabelas 1 e 2) ou as células da granulosa do grupo controle (Tabelas 3 e 4). 76 Ct Comparativo Paciente N0 AROMATASE (CYP19) Média DP β-ACTINA Média DP ∆Ct DP (∆Ct) ∆∆Ct 2-∆∆Ct 01 27,6026 27,599 0,006 22,5086 2,.509 0,000 5,090 0,0000 8,2327 0,0033 27,5947 22,5086 02 26,0095 26,129 0,169 19,9716 20,076 0,148 6,053 0,0252 9,1958 0,0017 26,2485 20,1802 03 23,9989 23,988 0,016 20,2362 20,339 0,146 3,648 0,0108 6,7910 0,0090 23,9763 20,4424 04 20,8751 20,848 0,038 18,0222 17,816 0,292 3,032 0,0433 6,1748 0,0138 20,8211 17,6097 05 26,4174 26,191 0,320 21,5941 21,688 0,133 4,503 0,0600 7,6457 0,0050 25,9648 21,782 06 27,0075 26,807 0,284 21,4559 21,517 0,086 5,290 0,0440 8,4325 0,0029 26,6059 21,5778 07 26,2209 26,174 0,066 20,2611 20,297 0,051 5,877 0,0035 9,0193 0,0019 26,1272 20,3337 08 29,5236 29,741 0,308 23,6901 23,922 0,328 5,819 0,1010 8,9619 0,0020 29,9585 24,1536 09 30,131 30,521 0,552 26,215 26,167 0,068 4,355 0,1547 7,4974 0,0055 30,9116 26,1182 10 23,3947 23,326 0,098 21,1645 21,087 0,109 2,238 0,0107 5,3809 0,0240 23,2563 21,0101 11 29,0394 29,244 0,290 23,1049 23,131 0,037 6,113 0,0427 9,2555 0,0016 29,4491 23,1579 Placenta 17,209 17,125 0,119 20,0306 20,268 0,335 -3,143 0,0632 0,0000 1,000 17,041 20,5047 Tabela 1 – Níveis de Ct (threshold cycle) comparativos entre os genes aroamtase (CYP19A1) e β-actina obtidos por PCR em tempo real , para análise da expressão gênica relativa em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo ou masculino submetidas a técnicas de reprodução assistida. Placenta como amostra de referência. 77 Ct Comparativo Paciente N0 AROMATASE (CYP19) Média DP β-ACTINA Média DP ∆Ct DP (∆Ct) ∆∆Ct 2-∆∆Ct 01 27,1022 27,239 0,193 24,5945 24,629 0,049 2,610 0,0198 5,7526 0,0185 27,3753 24,6631 02 26,6939 26,692 0,003 20,9338 20,934 0,000 5,758 0,0000 8,9010 0,0021 26,6903 20,9338 03 30,1604 29,787 0,528 24,638 24,768 0,183 5,019 0,1562 8,1621 0,0035 29,4138 24,8973 04 32,6201 32,580 0,057 24,4042 24,450 0,064 8,130 0,0037 11,2728 0,0004 32,5394 24,4951 05 29,7922 30,319 0,745 26,5925 26,448 0,204 3,871 0,2984 7,0136 0,0077 30,8459 26,3038 06 30,093 30,548 0,644 24,3469 24,021 0,461 6,527 0,3135 9,6699 0,0012 31,0035 23,6951 07 21,5139 21,617 0,146 19,0755 18,983 0,131 2,634 0,0192 5,7767 0,0182 21,7205 18,8909 08 C1 26,5984 26,424 0,247 21,4029 21,380 0,033 5,044 0,0311 8,1869 0,0034 26,2491 21,3561 C2 31,0822 31,138 0,078 24,0759 24,056 0,028 7,081 0,0035 10,2241 0,0008 31,1929 24,0364 09 0 0 0 32,9751 33,045 0,099 NA NA NA NA 0 0 0 33,1153 10 28,1726 28,482 0,437 23,0111 23,334 0,456 5,148 0,1994 8,2907 0,0032 28,7905 23,656 11 27,8934 27,961 0,095 18,5017 18,415 0,123 9,546 0,0121 12,6884 0,0002 28,0277 18,328 Placenta 17,209 17,125 0,119 20,0306 20,268 0,335 -3,143 0,0632 0,0000 1,0000 17,041 20,5047 Tabela 2 – Níveis de Ct (threshold cycle) comparativos entre os genes aromatase (CYP19A1) e β-actina obtidos por PCR em tempo real , para análise da expressão gênica relativa em células da granulosa murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assis tida. Placenta como amostra de referência. NA= não se aplica (amplificação nula para o gene da aromatase). C1=1º e C2=2º ciclos de HOC paciente 08. 78 Ct Comparativo Paciente N0 AROMATASE (CYP19) Média DP β-ACTINA Média DP ∆Ct DP (∆Ct) ∆∆Ct 2-∆∆Ct 01 27,6026 27,599 0,006 22,5086 22,509 0,000 5,090 0,0000 0,3600 0,7791 27,5947 22,5086 02 26,0095 26,129 0,169 19,9716 20,076 0,148 6,053 0,0252 1,3231 0,3997 26,2485 20,1802 03 23,9989 23,988 0,016 20,2362 20,339 0,146 3,648 0,0108 -1,0817 2,1165 23,9763 20,4424 04 20,8751 20,848 0,038 18,0222 17,816 0,292 3,032 0,0433 -1,6979 3,2442 20,8211 17,6097 05 26,4174 26,191 0,320 21,5941 21,688 0,133 4,503 0,0600 -0,2270 1,1704 25,9648 21,782 06 27,0075 26,807 0,284 21,4559 21,517 0,086 5,290 0,0440 0,5599 0,6784 26,6059 21,5778 07 26,2209 26,174 0,066 20,2611 20,297 0,051 5,877 0,0035 1,1467 0,4517 26,1272 20,3337 08 29,5236 29,741 0,308 23,6901 23,922 0,328 5,819 0,1010 1,0892 0,4700 29,9585 24,1536 09 30,131 30,521 0,552 26,215 26,167 0,068 4,355 0,1547 -0,3753 1,2971 30,9116 26,1182 10 23,3947 23,326 0,098 21,1645 21,087 0,109 2,238 0,0107 -2,4918 5,6248 23,2563 21,0101 11 29,0394 29,244 0,290 23,1049 23,131 0,037 6,113 0,0427 1,3829 0,3835 29,4491 23,1579 Amostra referência media Ct grupo controle 26,42 2,836 21,69 2,175 4,730 6,3868 0,0000 1,0000 Tabela 3 – Níveis de Ct (threshold cycle) comparativos entre os genes aromatase (CYP19A1) e β-actina obtidos por PCR em tempo real , para análise da expressão gênica relativa em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo ou masculine de Infertilidade (grupo c ontrole) submetidas a técnicas de reprodução assistida. Amostra de referência = média do Ct do próprio grupo controle (valor absoluto). 79 Ct Comparativo Paciente N0 AROMATASE (CYP19) Média DP β-ACTINA Média DP ∆Ct DP (∆Ct) ∆∆Ct 2-∆∆Ct 01 27,1022 27,239 0,193 24,5945 24,629 0,049 2,610 0,0198 -2,1201 4,3471 27,3753 24,6631 02 26,6939 26,692 0,003 20,9338 20,934 0,000 5,758 0,0000 1,0283 0,4903 26,6903 20,9338 03 30,1604 29,787 0,528 24,638 24,768 0,183 5,019 0,1562 0,2894 0,8182 29,4138 24,8973 04 32,6201 32,580 0,057 24,4042 24,450 0,064 8,130 0,0037 3,4001 0,0947 32,5394 24,4951 05 29,7922 30,319 0,745 26,5925 26,448 0,204 3,871 0,2984 -0,8591 1,8139 30,8459 26,3038 06 30,093 30,548 0,644 24,3469 24,021 0,461 6,527 0,3135 1,7973 0,2877 31,0035 23,6951 07 21,5139 21,617 0,146 19,0755 18,983 0,131 2,634 0,0192 -2,0960 4,2752 21,7205 18,8909 08 C1 26,5984 26,424 0,247 21,4029 21,380 0,033 5,044 0,0311 0,3142 0,8043 26,2491 21,3561 C2 31,0822 31,138 0,078 24,0759 24,056 0,028 7,081 0,0035 2,3514 0,1960 31,1929 24,0364 09 0 0 0 32,9751 33,045 0,099 NA NA NA NA 0 33,1153 10 28,1726 28,482 0,437 23,0111 23,334 0,456 5,148 0,1994 0,4180 0,7485 28,7905 23,656 11 27,8934 27,961 0,095 18,5017 18,415 0,123 9,546 0,0121 4,8157 0,0355 28,0277 18,328 Amostra referência media Ct grupo controle 26,42 2,836 21,69 2,175 4,730 6,3868 0,0000 1,0000 Tabela 4 – Níveis de Ct (threshold cycle) comparativos entre os genes aromatase (CYP19A1) e β-actina obtidos por PCR em tempo real , para análise da expressão gênica relativa em células da granulosa murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assis tida. Amostra de referência = média do Ct do próprio grupo controle (valor absoluto). NA= não se aplica (amplificação nula para o gene da aromat ase). C1=1º e C2=2º ciclos de HOC paciente 08. 80 ANEXO II 81 82 ANEXO III 83 84 ANEXO IV 85 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Eu,__________________________________________________________ _____ abaixo assinado, tendo sido devidamente informada, através do documento “ESCLARECIMENTO AO SU JEITO DA PESQUISA” (anexo 2), sobre todas as condições da pesquisa chamada “EXPRESSÃO DO GENE DA AROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE MULHERES COM ENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA”, que tem como pesquis adora responsável a pós-graduanda Lauriane Giselle de Abreu e como orientador o Prof. Dr. Marcos Felipe Silva de Sá, docente deste serviço; e conhecendo principalmente o objetivo da pesquisa, os procedimentos a que serei submetida por causa desta pesquisa, seus riscos e benefícios, a forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem como a forma de indenização por danos decorrentes do estudo, declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições descritas abaixo: 1. A garantia de obter resposta a qualquer dúvida sobre os procedimentos que farei durante a pesquisa, sobre os possíveis riscos que poderei sofrer pela participação na pesquisa, bem como os benefícios que este estudo poderá trazer; 2. A liberdade de retirar o meu consentime nto e deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isso traga prejuízo nenhum ao meu tratamento de reprodução assistida ou à sua continuidade; 3. A segurança de que não serei identificada e que toda a informação sobre mim e meu prontuário médico, bem como sobre a minha participação nesta pesquisa serão confidenciais; 4. O compromisso dos pesquisadores de que serei informada sobre o andamento da pesquisa, ainda que estes dados possam afetar a minha vontade de continuar participando do estudo; 5. O compromisso de que serei devidamente acompanhada e que será prestada toda a assistência necessária a mim durante o tempo em que estiver participando do estudo, bem como de que será garantida a continuidade do meu tratamento mesmo após o término da pesquisa. Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que foram apresentadas e que, livremente, manifesto a vontade de participar do referido projeto. Ribeirão Preto, ____ de _______________ de _______. Assinatura da paciente 86 ESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA 1. TÍTULO DA PESQUISA: “ Expressão do Gene da Aromatase em Células da Granulosa de Mulheres Com Endometriose Submetidas a Técnicas de Reprodução Assistida” 2. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: LAURIANE GISELLE DE ABREU, CRM/SP NO 111.248 (Doutoranda USP/ RIBEIRÃO PRETO) Endereço: Av. Bandeirantes no 3900; laboratório de GO 1º. Andar; Hospital das Clínicas/ FMRP/USP. Ribeirão Preto/SP;Telefones: (16) 3911- 6840;8121-3017. 3. ORIENTADOR: PROFESSOR DOUTOR MARCOS FELIPE SILVA DE SÁ Contato: Av. Bandeirantes no. 3900; laboratório de GO 1º. Andar Hospital das Clínicas/ FMRP/USP. Ribeirão Preto/SP. Telefone: (16)3602- 2231 4. PROMOTORA DA PESQUISA: FMRP/USP. Departamento de Ginecologia e Obstetrícia. Av. Bandeirantes 3.900; HC 8o andar.Telefone: (16) 3602-2583 Vimos, por meio deste documento, solicitar sua participação neste estudo. A endometriose é uma doença causada pela presença de células da camada interna do útero (endométrio) fora deste local. É uma causa freqüente de infertilidade em mulheres. Ainda não se sabe exatamente por que a endometriose causa infertilidade. Parece que as células da endometriose podem interferir no amadurecimento do óvulo, dificultando sua fertilização. Tudo indica que esta interferência ocorre porque a endometriose atrapalha a função do óvulo prejudicando uma enzima chamada aromat ase. Esta enzima é uma substância que as células do ovário chamadas células da granulosa produzem para ajudar na formação dos hormônios que os ovários necessitam. Sem estes hormônios o óvulo não amadurece. Este trabalho vai pesquisar se as células da granulosa dos ovários das mulheres que têm endometriose estão realmente comprometidas e, portanto, produziriam pouca aromatase. Existe um gene que é responsável por comandar a produção da aromatase e é este gene que pode estar com defeito na endometriose. 87 Assim, o objetivo principal deste estudo é saber se existe alguma alteração na produção da aromatase comandada pelo seu gene nas células da granulosa das mulheres que têm a doença endometriose. Desta maneira, estamos propondo este estudo que constará de 2 grupos: (1) grupo de pacientes sem endometriose e (2) grupo de pacientes com endometriose, todas submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV - Fertilização in Vitro e ICSI – Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide, ou seja, técnica em que se injeta o espermatozóide dentro do óvulo). No final do estudo, realizaremos a comparação entre estes dois grupos e checaremos se há diferença na maneira como a aromatase é produzida pelo seu gene nas células da granulosa. Participando deste projeto, você receberá o tratamento da mesma forma que as pacientes que não participam, com todos os exames e recursos disponíveis para melhor atendê-la. A participação no estudo não causará nenhuma interferência no seu procedimento de reprodução assistida e, inclusive, você não precisará realizar nenhum procedimento além daqueles que serão normalmente programados para o seu processo de reprodução assistida. Isto porque o material que utilizaremos no estudo é um material que normalmente é desprezado após a coleta e separação do óvulo. Desta maneira, pretendemos, com o seu consentimento, usar este material contendo as células da granulosa para pesquisar sua produção de aromatase, como já foi exposto previamente. Reforçamos que a importância deste estudo será tentar desvendar um dos possíveis motivos da infertilidade na endometriose, que é a análise do funcionamento do óvulo nestas mulheres, através do estudo da aromatase. Os resultados desta pesquisa poderão no futuro propiciar o desenvolvimento de procedimentos ou medicamentos que melhorem o tratamento de mulheres inférteis que têm endometriose. Informamos que seu nome e seus dados pessoais não aparecerão no trabalho ou em outro meio de informação, ou seja, o sigilo será mantido. Além disso, a qualquer momento você poderá solicitar sua saída do trabalho, se assim desejar, sem nenhum prejuízo à continuação de seu tratamento neste serviço. Ficamos à disposição para esclarecer todas as dúvidas que surgirem, inclusive sobre o andamento da pesquisa e seus resultados. Atenciosamente, Os pesquisadores. 88 ANEXO V 89 90 1 PAPER 2 Quantitative aromatase gene expression (CYP19A1) is not altered in mural lutein-granulosa cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques – pilot study Authors: Lauriane Giselle de Abreu 1 Vanessa da Silva Silveira 2 Carlos Alberto Scrideli3 Ester Silveira Ramos3 Rosana Maria dos Reis3 Rui Alberto Ferriani3 Marcos Felipe Silva de Sa’ 3 1 MD; 2 BS; 3 MD, PhD Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP, Brazil. Adress: Avenida Bandeirantes n o 3.900, Hospital das Clínicas 1st floor, Laboratório de GO.Monte Alegre, Ribeirão Preto, SP, Brazil. Zip code: 14.149-900. Corresponding author: Lauriane Giselle de Abreu, MS, MD. Email: [email protected]; [email protected] 3

Most of women diagnosed with endometriosis present fertility disturbances. However, mechanisms remain unclear, leading suspicion of a multifactor and genetic-based character of this disease. Compromised oocyte quality and aromatase rise as major candidates. Aromatase is the endpoint of follicle steroidogenesis cascade and undoubtedly, essential to reach an adequate egg quality. Studies have showed disruption of its gene (CYP19A1) on topic and ectopic endometrium in endometriosis and al so a reduction of its activity by in vitro studies on granulosa cells of women with this disease. Scarcity of molecular studies assessing aromatase on these target cells in endometriosis stimulated this research. The aim of this study was to quantify aromatase gene expression in mural lutein-granulosa cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques (ART, IVF or ICSI). Methods: a case-control study was conducted on 11 women with endometriosis (all stages, ASRM criteria) and 11 women with male or tubal causes of infertility undergoing ART. There was no difference between the groups regarding age, amount of gonadotrophins used, days of induction, follicles and eggs collected. Mural lutein-granulosa cells were harvested from pre-ovulatory follicles during oocyte retrieval and properly isolated. After cells lyses and storage into Trizol LS Reagent®, RNA extraction and cDNA synthesis were performed. Quantification of relative gene expression for CYP19A1 (aromatase) was performed by real time PCR, using SYBR Green reagents. All experiments were carried out in duplicates. Results: there was no difference between the groups in the quantitative gene expression of CYP19A1 (aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells (p>0.05, Mann Whitney), even if we consider separately the different grades of endometriosis (control vs. minimal/mild vs. moderate/severe, p>0.05, Kruskall Wallis). These results suggest that this enzyme, aromatase, may have a complex and refined control of its gene expression on this population of granulosa cells, and despite of previous evidences showing its reduced activity on them in endometriosis, the gene expression per se may not be affected by the disease. Key-words: aromatase, CYP19A1, lutein-g ranulosa cells, edometriosis, assisted reproduction techniques, gene expression, real-time PCR. 4

Fertility disturbances occur in up to 60% of women with endometriosis, (Wheeler JM, 1989; Cornill ie et al., 1990; Schenken et al., 1996; D’Hooghe et al., 2003), one of t he most costly diseases in reproductive medicine (Gao et al., 2006). Undoubtedly, infertility treatment for endometriosis reached an impor tant step forward through establishment of assisted reproduction techniques; but outcomes are still unsatisfactory, revealing impaired pregnancy and lowe r implantation and fertilization rates in comparison to tubal and male factors of infertility (Barnhart et al., 2002). This observation strongly suggests an ethyopatogenic mechanism still unknow n which interferes in the reproductive process. A strong candida te is compromised oocyte quality (Simon et al., 1994; Harlow et al., 1996; Pellicer et al., 1998a,b; Garcia- Velasco et al., 1999; Garrido et al, 2002; Cahill et al, 2003). Studies using women oocyte donation model provided important clinical evidence when pointed out impairm ent of oocyte and embryo’s quality in association wit h endometriosis (Simon et al., 1994; Garcia-Velasco et al., 1999; Diaz et al., 2000; Garrido et al., 2002). But poor embryos are derived from poor oocytes, possibly derived from inappropriate folliclegenesis (Garrido et al., 2002). Achieving a successful folliculogenesis involves not only a complex cross-talk between granulosa cells and the oocyte, as well as a favorable esteroidogenic environment inside the follicle (Alb ertini & Barrett, 2003; Cost a et al., 2004; Combelles et al., 2004; Hutt & Albertini; 2007). 5 Aromatase plays an essential role on both tasks, this enzyme has a known synergistic action to gonadotrophins and also it is the endpoint of the whole intrafollicle steroidogeni c cascade (Speroff & Fritz, 2005). Actually it is the only one inside it which is capable to convert an unwanted androgenic follicle to the idea lly estrogenic follicle, ready to ovulate (Simpson et al., 2002; Cost a et al., 2004; Bulun et al, 2004; Speroff & Fritz, 2005). Aromatase has showed an erratic behavior in endometriosis: its elevated gene expression have been detected mainly in endometriosis’ lesions and also in topic endometrium of women diagnosed with the disease (Noble et al., 1996; Zeitoun & Bulun, 1999; Kitawaki et al., 2002; Brosens et al., 2004; Bulun et al., 2002, 2004, 2005; Heilier et al., 2006; Matsuzaki et al., 2006). In granulosa cells, in vitro studies pointed out an impairment of aromatase activity on these cells in women with endometriosis (Harlow et al., 1996; Abreu et al, 2006). Also, higher apoptosis (Toya et al., 2000) and impaired progesterone function (Cahill et al., 2003) have been det ected on them. Moreover, endometriosis has been accepted as a genetic-based disorder (Fang et al., 2002; Attar & Bulun, 2006) and polymorphisms of its gene (CYP19A1) have been associated with increased risk of this disease (Arvanitis et al., 2003). Association between aromat ase gene disturbances and endometriosis discussed above and the importance of aromatase per se over oocyte quality establishment, bes ides the fact that its gene (CYP19A1) has a complex tissue spec ific regulation (Meinhart & Mullis, 2002; Simpson et al., 2002; Shozu et al, 2003; Bulun et al., 2004; 2007), 6 rise the importance of a quantitative study of aromatase gene expression of granulosa cells for this disorder. The aim of the present study was to measure quantitatively t he aromatase gene (CYP19A1) expression by real-time PCR in mural lutein-g ranulosa cells of women with endometriosis in comparison to those without the disease, submitted to assisted reproduction techniques (In Vitro Fertilization, IVF or Intracytoplasmic Sperm injection, ICSI).

The study was conducted on 22 patients, 11 with endometriosis (12 ovarian hyperstimulation (HOC ) cycles) and 11 with male or tubal factors of infertility (11 HOC cycles), submitted to IVF or ICSI from august 2006 to march 2007 in a tertiary center for infertility treatment (Clinics Hospital at Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil). It was approved by the hospital’s ethics committee and by the Brazilian Nati onal Commission for Research Ethics and each patient signed an inform consent. All women had regular menstrual cycles and normal follicle- stimulating hormone (FSH) levels for the reproductive period (3rd day of the cycle) <15 IU/l). There was no difference between the groups with regards to age: (34.73 ± 3.90) for control group vs. 32.64 ± 2.87 for endometriosis; amount of gonadotrophi ns administered (2502 ± 786.30 vs. 2354 ± 755.3), days of ovarian inducti on (9.00 ± 1.55 vs. 9.08 ± 1.56), number of follicles punctioned (11.18 ± 5.51 vs. 11.50 ± 3.55 and oocytes retrieved (5.82 ± 2.90 vs. 6.83 ± 2.62), p>0.05, unpaired t test. Women 7 with endocrine diseases (including polycystic ovarian syndrome) and those older than 40 years were excluded. In endometriosis group, 5 pati ents had minimal/mild and 6 had moderate/severe grades of the disease (one submitted twice to ovarian stimulation for ICSI), according to American Society of Reproductive Medicine criteria (Fertil Steril 67:817–21, 1997). .All women were submitted to controlled ovarian hyperstimulation with hMG, 150 to 400 IU/day, during th e first 6 days; a fter that, daily doses were adjusted in an individual basis, according to follicular growth. Hypophysis desensitization was done through long protocol using leuprolide acetate 10 IU /day, administered subcut aneously, or nafareline 400 mg/day, by nasal administration. When at least two follicles reached 17 mm in diameter, recombinant hCG (250 mg, subcutaneous) was administered and oocytes were retrie ved 34–36 h later by vaginal route with ultrasound guidance. Human mural granulosa-lutein cells Isolation protocol Isolation procedure of granulosa ce lls was based on Chang et al. (2005) protocol, with few modifications as described below: Mural lutein-granulosa cells were collected from pre-ovulatory follicles during oocyte retrieval for IVF or ICSI. We used at least one follicle aspirate (i.e. material fr om one single 15 ml aspiration tube containing follicular fluid + mural lutein-granulosa cells + at least 1 cumulus-oocytes complexes derived from 1 to 2 mature follicles ( ≥17 mm diameter), without visual blood contamination. Afte r follicular aspiration, 8 the cumulus-oocytes complexes from the tube were separated and mural granulosa cells were flushed and wa shed in HTF-M medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA), and centrifuged for 10 min at 2500 rpm at 40C. The supernatant was discharged, the pellet was resuspended in 0.6 ml of HTF-M and transferred to new tube over surface of 4 ml of Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA) and centrifuged for 10 min at 1700 rpm at 4 0C, to separate red blood cells from human granulosa cells. Granulosa cells then formed a thin layer between Histopaque and medium and these cells were collect ed carefully, flushed and centrifuged again (10 min, 2500 rpm, 40C) in a new tube with 2 ml of HTF-M medium. After the supernatant was discharged, pellet now was resuspended in 500 ml of PBS medium (Irvi ne Scientific) and divided in to 1,5 ml tubes, each one containing 250 ml of cell sus pension and 750 ml of Trizol LS Reagent (Invitrogen, Carl sbad, CA, USA). After cell lyses, these tubes were stored at -80 0C until RNA extraction. All steps were performed on ice and we followed care fully all the specificat ions for handling RNA and nucleic acid material. RNA Extration and cDNA synthesis Total RNA was isolated with Triz ol LS Reagent (Invitrogen) according to kit instru ctions and the RNA quality was confirmed by gel electrophoresis. Total RNA was revers ely transcribed to to cDNA using the High capacity cDNA archive kit (Applied Biosystems, Los Angeles, CA, USA).Quantitative Real-time PCR: 9 Quantitative real-tim e polymerase chain reaction (qPCR) was performed on total cDNA from human mural lutein-granulosa cells specimens. qPCR was performed using SYBR Green PCR Core reagents (Applied Bio-systems, Foster City, CA) and melting curve analysis, on an ABI 7500 sequence detector (Applied Bi osystems, Los Angeles, CA). All experiments were run in duplicate and data were normalized to β-actin (ACTB) expression levels. Sequences of interest were amplified using the following primers: for aromatase CYP19A1 gene (F): 5’CCTTgCCAATAgTgTCATCC3’ and (R) 5’TAgCCTggTTCTCTggTgTg 3’; for housekeeping gene β-actin (F):5’ TCgTgATggACTCCggTgAC3’ and (R): 5’CgTggTggTgAAgCTgTAg3’ (Invitrogen). Statistical analysis For Real-time PCR data, analysis was done by the 2 -∆∆ Ct method, using the GraphPad Prism 5.0 softw are (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). The Mann-Whitney test was performed to compare differences between two groups. For simultaneous comparison of 3 groups, Kruskal-Wallis test with D unn's Multiple Comparison Test was used. In all cases, the level of significance was set as 5% (p < 0.05).

We found no difference with regards to quantitative expression of aromatase gene (CYP19A1) on mural lutein-granulosa cells of women with endometriosis in comparison with women presenting male or tubal causes of infertility, submitted to assisted reproduction techniques (Table 1; Figures 1, 2). 10 Table 1 - Ct values from real time PCR (SYBR Green) for aromatase gene (CYP19A1) expression analysis normalized to β-actin on mural lutein-granulosa cells of women with male or tubal factors of infertility (N=11); endometriosis grades minimal/mild (N=5) and endometriosis moderate/severe (N=7); undergoing assi sted reproduction (IVF or ICSI). Endometriosis classified by ASRM cr iteria. Data showed as relative expression (2 -∆∆Ct). Ct= Threshold cycle. C1= 1 st and C2 = 2 nd ovarian stimulation cycle (HOC) of women 02 from the moderate/severe endometriosis group. N refers to ovarian hyperstimulation cycles. Aromatase Ct (normalized to β-actin) Control group Minimal/Mild Endometriosis Moderate/ Severe Endometriosis Endometriosis All stages 01 0.7791 0.8182 4.3471 4.3471 02 0.3997 0.0947 0.8043 (C1) 0.1960 (C2) 0.8043(C1) 0.1960(C2) 03 2.1165 1.8139 0.4903 0.4903 04 3.2442 0.2877 0.7485 0.7485 05 1.1704 4.2752 0.0355 0.0355 06 0.6784 0.0000 0.0000 07 0.4517 0.8182 08 0.4700 0.0947 09 1.2971 1.8139 10 5.6248 0.2877 11 0.3835 4.2752 12 Mediana 0.7288 0.8182 0.4903 0.6194 11 Fig 1 - Aromatase gene (CYP 19A1) expression by real time PCR on mural lutein-granulosa cells of wo men with endometriosis vs. controls undergoing assisted reproduction te chniques. Comparison between the groups: Control (tubal or male ca uses of infertility, N=11); (B) endometriosis minimal/mild (N=5); (C) endometriosis moderate/severe (N=7). No difference was found betw een the groups (p>0.05, Kruskal Wallis with Dunn’s multiple comparison test). Data are showed as relative expression, normalized to β-actin. N refers to ovarian hyperstimulation cycles. Co ntro l B C 0.0 2.5 5.0 7.5 Relative Gene Expression for Aromatase (CYP19A1) 12 Fig 2 - Fig 1 –Aromatase gene expre ssion by real time PCR on mural lutein-granulosa cells of wom en with endometriosis (all stages, N=12) vs. controls (tubal or male c auses of infertility, N=11) undergoing assisted reproduction techniques. No difference was found between the groups (p>0.05, Mann Whitney test). Data are showed as relative expression, normalized to β-actin. N refers to ovarian hyperstimulation number. Control En dome triosis 0.0 2.5 5.0 7.5 Relative Gene Expression for Aromatase (CYP19A1) 13

Assessment of oocyte quality is still one of the major challenges in reproductive medicine, even though it is determinant factor to success rates of assisted reproduction tec hniques (Abdalla & Thum, 2004). The aging process and diseases as is the case of endometriosis clearly affects egg quality (Garrido et al., 2002; Abdalla & Thum, 2004), but how? Which mechanism (s)? For endometriosis, the scenario of controversies is even worse, which begins in the ethiopathogeny of the disease and goes through its classification and treatment. The focus of this study was to investigate the oocyte quality as one ethyopathogenic me chanism of infertility associated to endometriosis. Oocyte quality is gu ided by folliclegenesis, and poor oocytes are in fact derived from inappr opriate folliclegenesis (Erickson et al., 1989; Garrido et al., 2002; Speroff & Fritz, 2005). Aromatase, as already discussed above, is a key en zyme for the folliclegenesis process and its steroidogenic cascade, wh ich converts and unfavorable androgenic environment to an estrogenic pre-ovulatory follicle, even in stimulated cycles under influence of GnRH analogues (Erickson et al., 1989; Dor et al. 2000; Costa et al., 2004; Speroff & Fritz, 2005; Silva et al., 2008). In this study, if we consider the whole group of endometriosis (all stages), no difference was observed with regards to aromatase gene (CYP19A1) expression on mural lute in-granulosa cells of women with endometriosis in comparison to controls. In a previous study (Abreu et al., 2006), we’ve found reduced in vitro aromatase activity (estradiol 14 production under in vitro testosterone supplementation) in the same target cells and women. Both basal produc tion of estradiol and also its production after testosterone supplement ation on its lowest concentration used in the study (2x10 -6M), showed an impairment of aromatase activity in endometriosis women in comparis on to control group. When we added higher concentration of testosterone, this phenomenon didn’t occur. Costa et al (2004) also have showed, through granulosa cells culture from women submitted to stimulated cycles for ART, without GnRH analogues; that follicles containing mature eggs had higher Progesterone/Testosterone (P/T), Progesterone/Estradiol (P/E) and Estradiol/Testosterone (E/T) ratios in the follicular fluid than the immature ones. This finding suggests a defect on immature eggs located mainly in the conversion C21 to C19 steroids, but not in the aromatase. Silva et al. (2008) analyzed the same relations between steroids in follicular fluid of infertile women submitted to stimul ated cycles for ART, but now using GnRH analogues, an agent that would primarily affect aromatase activity. Actually aromatase function was kept intact in this study, despite of GnRH analogues. The main effect of GnRH observed on these steroids relations was a beneficial reduction of androgens , which is compatible with the better results for ART in stimulated cycles when these agents are administered. From the background of these st udies assessing granulosa cells biology, we can observe that aromat ase function was always kept intact, understandable fact considering its critical role on follicle steroidogenesis. However, this evidence also lead us to hypothesize how complex and 15 refined the control mechanisms of th is enzyme, aromatase, can be, probably involving molecular signals we still don’t know. This refined control of aromat ase may be the main reason we didn’t find difference in the present study regarding its gene (CYP19A1) expression on mural lutein-granulosa cells of women with endometriosis. Even in this disease, where we do kn ow there is an oocyte compromised quality (Garrido et al., 2002), control of aromatase s eems to be still efficient for its gene expression. Ther efore, the mechanism of poor egg quality in endometriosis could be placed in other pathway or even in other points of the steroidogenic cascade of the follicle, but is not related to aromatase gene expression, according to the results of the present study. Post-transcription modifications and the epigenetic mechanism also rise as strong candidate s for aromatase gene expression`s controlling pathways and need to be explored. Some other points need to be discussed about endometriosis. Especially for egg quality, minimal/m ild grades may have a completely different behavior from moderate/severe grades. In this study, normalized aromatase Ct mean from wom en with moderate and severe grades showed a lower value than minimal/mild , but no statistic significance. In our previous study (Abreu et al., 2006) when we studied in vitro aromatase activity through granulosa ce lls culture of the same target women, we’ve found similar result s. Harlow et al. (1996) have demonstrated reduced aromatase acti vity in granulosa cells studying minimal/mild grades of the disease. Considering these findings, the division of endometriosis into perit oneal, ovarian and deep endometriosis 16 could be particularly interesting to understand if they have different pathways affecting egg qua lity, since they have diffe rent clinical behavior and management (Kennedy et al., 2005). Since there is a scarcity of stud ies looking at granulosa biology, researchers should rely on molecular bi ology technologies, to clarify how the signaling between granulosa mural cells-granulosa cumulus cells- oocyte happens. For endometriosis, based on results from our research, the next step would be larger and co mpartmentalized studies focusing on different endometriosis presentati ons as endometrioma, peritoneal and deep endometriosis. Also, new res earch strategies as genetic populational studies of polymorphisms (SNPs) in target genes could bring new insights about this enigmatic disease, since management of endometriosis with regards to infertilit y is still unsatisfactory (Barnhart et al., 2002).

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