{"paper_id":"85830f9b-11e5-46bd-9b7b-3b73f655a4c7","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nEXPRESSÃO DO GENE DA AROMATASE (CYP19A1) NAS CÉLULAS \nDA GRANULOSA MURAIS LUTEINIZADAS DE MULHERES COM \nENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO \nASSISTIDA  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLauriane Giselle de Abreu \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto, SP \n2009 \n\nUNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nEXPRESSÃO DO GENE DA AROMATASE (CYP19A1) NAS CÉLULAS \nDA GRANULOSA MURAIS LUTEINIZADAS DE MULHERES COM \nENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO \nASSISTIDA  \n \n \n \n \n \n \nLauriane Giselle de Abreu \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nOrientador: Prof. Dr. Marcos Felipe Silva de Sá \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto, SP \n2009 \n Tese de Doutorado apresentada à \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da \nUniversidade de São Paulo, para obtenção do título \nde Doutor em Medicina na área de concentração: \nTocoginecologia \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFicha catalográfica \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbreu, Lauriane Giselle de \n \nExpressão do Gene Da Aromat ase (CYP19A1) nas Células da \nGranulosa Murais Luteinizadas de Mulheres com Endometriose \nSubmetidas a Técnicas De Repr odução Assistida/ Lauriane Giselle \nde Abreu. Ribeirão Preto, São Paulo, 2009. \n \nxvii, 90 p., il. 30cm. \n \nTese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto / Universidade de S ão Paulo, Departamento de \nTocoginecologia. \n \n1. Aromatase; 2. CYP19A1; PCR em tempo real, 3. Endometriose; \n4. Células da granulosa; 5. Reprodução assistida; 6. Infertilidade. \n\nData da defesa: 26/03/2009 \n \nBANCA EXAMINADORA \n \nProf. Dr.  Marcos Felipe Silva de Sá \nJulgamento: ___________________________________________ \nAssinatura: ____________________________________________ \n \nProf. Dra. Rosana Maria dos Reis \nJulgamento: ___________________________________________ \nAssinatura: ____________________________________________ \n \nProf. Dra. Ester Silveira Ramos \nJulgamento: ___________________________________________ \nAssinatura: ____________________________________________ \n \nProf. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva \nJulgamento: ___________________________________________ \nAssinatura: ____________________________________________ \n \nProf. Dr. Paulo Cesar Serafini \nJulgamento: ___________________________________________ \nAssinatura: ____________________________________________ \n \n \n\nDEDICATÓRIA \n \n \n \nAo meu pai, Luiz Antonio. \nÀ minha mãe, Rosemarie. \n \nDedico a vocês, com muito amor, este trabalho e todas as minhas \nrealizações. Minha gratidão pelo apoio sempre presente e por me \nproporcionarem a oportunidade de seguir os meus projetos e minha \nvocação. \n \nAos meus irmãos, Luciana e Junior, pelo carinho e apoio. \n \n \n \n \n \n\nAGRADECIMENTOS \n \n \nAo Prof Dr. Marcos Felipe Silva de Sá , agradecimento especial pela \nconfiança na realização deste trabal ho. Minha admiração como mestre, \nlíder, médico e pesquisador. Ob rigada pela oportunidade de sua \norientação, pelo estímulo e experiênc ia da bolsa sanduíche. Enfim, por \ntodo o aprendizado e oportunidades que me proporcionou durante esse \nperíodo.    \n \n \n \nA prof Dra Ester Silveira Ramos , agradecimento especial pela co-\norientação no presente trabalho, pela par ceria e contribuição científica à \nminha formação na área de Genética em Reprodução Humana. \n \n \n \nAo Prof Dr. Carlos Alberto Scrideli, agradecimento especial pelo auxílio \ne gentileza em disponibilizar seu laboratório e equipe para realização dos \nexperimentos de PCR em tempo real, bem como com os resultados.  \n \n\nAGRADECIMENTOS \n \n \n \nAo Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani , minha admiração e agradecimento \nespecial pela confiança e apoio cien tífico. Obrigada pelo imenso auxílio \npara o estágio no exterior e por  suas contribuições científicas \nfundamentais para minha formação em  Rreprodução Humana. Obrigada \npelas orientações e gentileza sempre presentes.  \n \n \n \n \nÀ Prof. Dra. Rosana Maria dos Reis , agradeço pela oportunidade junto \nao setor de Reprodução Humana da FMRP, USP. Minha admiração e \nagradecimento especial pelo  apoio científico, contribuições e constante \nauxílio durante estágio no exterior, além de orientações para a minha \ncarreira.  \n \n \n \n \nAo Prof. Dr. Antonio Alberto Nogueira , chefe da pós-graduação na \nárea de Tocoginecologia, minha gratidão pelo apoio científico e \nconfiança. \n\nAGRADECIMENTOS \n \nAo Prof Dr Marcos Dias de Moura,  minha admiração e gratidão pelo \nestímulo científico, amizade e gentileza sempre presentes. \nAo prof Dr Júlio César Rosa e Silva , pelas contribuições a esse \ntrabalho.   \nAos profs. Ricardo Pereira e Inacio Inoue, da Universidade Estadual de \nLondrina, pela estímulo à carreira científica e confiança.    \nA todos os docentes do Departament o de Ginecologia e Obstetrícia da \nFMRP, pela colaboração em minha formação. \nÀ Vanessa da Silva Silveira, do laboratório de Oncopediatria, pela ajuda \nna realização dos experimentos de PCR em tempo real, além de \ngentileza e amizade sempre presentes. À Rosane Queiroz , do \nlaboratório de Oncopediatria, pelo auxílio e gent ileza quanto à realização \ne análise dos dados de PCR em tempo real. \nA Álvaro Fabrício Lopes Rios , do Depto de Genética, pela contribuição \ne auxílio quanto ao design dos primers do estudo.  \nA Maria Cristina Picinato Araújo e Roberta Giorgenon , e aos Profs . \nRodrigo Alves Ferreira, Luiz Albert o Manetta e Stael Porto Leite  pelo \napoio e auxílio na coleta das amostras, gentileza e amizade.  \nÀ sra. Maria Albina Verceze Bortoliero, por sua ajuda e apoio em todas \nas etapas de realização dos experimentos. A Sandra Cavichiollo \nVianna, Maria Auxiliadora Pádua, Maria Aparecida C. Vasconcelos, \nMarilda H. Yamada Dantas , pelo auxílio prest ado neste trabalho, \ndisponibilidade e amizade.  \nA Suelen Bezerra Soares, Fátima Breda, Luci Pugin , Ilza Rezende \nMazzocato, pelo auxílio e gentileza.  \nAos meus colegas de pós-graduação, pela amizade e apoio. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n“Sejam quais forem os sentimentos e os interesses humanos, o intelecto é, \ntambém ele, uma força. Esta não consegue  prevalecer imediatamente, mas por \nfim os seus efeitos revelam-se ainda mais peremptórios. A verdade que mais \nfere acaba sempre por ser notada e por se impor, assim que os interesses que \nlesa e as emoções que suscita tenham esgotado a sua virulência.”  \n \nSigmund Freud\n, in 'As Palavras de Freud'  \n \n\nix \nRESUMO \n \nAbreu LG. Expressão do Gene da Arom atase (CYP19A1) nas células \nda granulosa murais luteinizadas de mulheres com endometriose \nsubmetidas a técnicas de re produção assistida. 2009.  90 p. Tese de \nDoutorado - Faculdade de Medicina de  Ribeirão Preto, Universidade de \nSão Paulo, Ribeirão Preto, SP. \n \nIntrodução: Até 60% das mulheres com endometriose apresentam como \nsintoma a infertilidade. Entretanto, os mecanismos envolvidos ainda \npermanecem não totalmente esclarecidos, especialmente quando não há \ndistorção da anatomia pélvica. A etiologia multifatorial e \ncomprometimento poligênico nesta doença têm sido amplamente aceitos. \nA aromatase é uma molécula das mais estudadas e há evidências de \naumento da expressão do seu gene no endométrio eutópico e ectópico \nna endometriose. Esta enzima, codifi cada pelo gene CYP19A1, converte \nandrógenos a estrógenos e está pres ente normalmente nas células da \ngranulosa, onde é fundamental para a produção esteroidogênica \nintrafolicular. Estudos in vitro  por cultivo de células da granulosa, \nmostraram redução da atividade da aromatase em mulheres com \nendometriose. Devido à escassez de estudos que analisem a expressão \ndo seu gene (CYP19A1) ne ssas células foi o que estimulou a proposta \ndeste estudo. Este trabalho tem por  objetivo medir a expressão do gene \nda aromatase por PCR em tempo real nas células da granulosa \nluteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a \ntécnicas de reprodução assistida. Pacientes e Métodos: Estudo caso-\ncontrole, com 11 mulheres com endometriose e 11 com os fatores \ntubáreo ou masculino de infertilidade,  submetidas à hiperestimulação \n\nx \novariana controlada (HOC) para repr odução assistida, num total de 12 \nciclos para o grupo com endometriose e 11 para o controle. Não houve \ndiferença entre as características clínicas dos dois grupos quanto à idade \ne parâmetros do ciclo de HOC. As células da granulosa murais foram \ncoletadas de folículos pré-ovulat órios maduros no dia da captação \noocitária e isoladas. Posteriorment e, procedeu-se à extração do RNA \n(clorofórmio/ isopropanol) e à transcrição reversa. A PCR em tempo real \nfoi realizada para quantificar os ní veis de RNA mensageiro produzidos \npara o gene da aromatase, no rmalizados aos produtos do gene \nendógeno, ß-actina (expressão relativa ). Todos os experimentos foram \nrealizados em duplicata. Resultados: não houve diferença na expressão \ndo gene CYP19A1 nas células da gr anulosa luteinizadas murais de \nmulheres com endometriose quando co mparadas ao grupo controle \n(p>0,05; Mann Whitney), me smo na comparação combinada \nconsiderando-se separadamente os diferentes graus de endometriose \n(controle vs. endometriose mínima/leve vs. endometriose \nmoderada/grave, p>0,05;  Kruskall Wallis). Conclusão: Os resultados \ndeste estudo sugerem que a aromat ase apresenta um mecanismo \ncomplexo de controle para sua ex pressão gênica nas células da \ngranulosa e, apesar de evidências pr évias de sua reduzida atividade \nnessas células na endometriose, a expressão de seu gene parece não \nestar afetada pela doeça, de acordo com o presente estudo. \n \nPalavras-chave: Aromatase; CYP19A1;  PCR em tempo real, \nEndometriose; Células da granulosa; Reprodução assistida; Infertilidade. \n\nxi \nABSTRACT \n \nAbreu LG.  Aromatase gene expression (C YP19A1) in mural lutein-\ngranulosa cells of women with e ndometriosis undergoing assisted \nreproduction techniques. 2009. 90 p. Tese de Doutorado - Faculdade \nde Medicina de Ribeirão Preto, Un iversidade de São Paulo, Ribeirão \nPreto, SP. \n \nBackground: Up to 60% of women with endometriosis have infertility \nsymptoms. However, mechanisms rema in unclear, mainly when there is \nno distortion of pelvic anatomy. The mu ltifactorial etiology and polygenic \ninvolvement of this disease have been widely accepted. Aromatase is one \nof the most studied molecules and t here are evidences of increased \nexpression of its gene (CYP19A1) on eutopic and ectopic endometrium in \nendometriosis. This enzyme, codifi ed by the CYP19A1 gene, converts \nandrogens to estrogens and is normally pr esent in granulosa cells, where \nit plays an essential role for the intrafollicle steroidogenic production. In \nvitro studies by granulosa cells culture have demonstrated reduced \naromatase activity in women with endom etriosis. The scarcity of studies \nassessing expression of the aromatase gene (CYP19A1) on these target \ncells stimulated the proposal of this research. The aim of this study is to \nquantify aromatase gene expression, by real-time PCR, in mural lutein-\ngranulose cells of women with en dometriosis undergoing assisted \nreproduction techniques. Patients and Methods: a case-control study \nwas conducted on 11 wome n with endometriosis and 11 with male or \ntubal causes of infertility submitted to ovarian hyperstimulation (HOC), \nwith a total of 12 cycles for endometriosis and 11 for the control group. \nThere was no difference between the groups regarding age or HOC \n\nxii \nparameters. Mural lutein-granulosa  cells were harvested from pre-\novulatory follicles during oocyte retr ieval and properly isolated. Later, \nRNA extraction (clorophorm/isopropanol) and reverse transcription were \nperformed. Real-time PC R was run to quantify RNAm products of \naromatase gene normalized to those fr om the control gene, beta-actin \n(relative expression). Al l experiments were carri ed out in duplicate. \nResults: there was no difference betw een the groups regarding the gene \nexpression of CYP19A1 (aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells \n(p>0.05, Mann Whitney), even if we consider separately the different \nstages of endometriosis (control vs. minimal/mild vs. moderate/severe, \np>0.05, Kruskall Wallis). Conclusion: These results suggest that \naromatase may have a complex cont rol of its gene expression on \ngranulosa cells and, despite of prev ious evidences showing its reduced \nactivity on these target cells in endometriosis, the gene expression seems \nnot affected by the disease, according to this study. \n \nKey-words: Aromatase; CYP19A1; Real -time PCR, Endometriosis; \nGranulosa cells; Assisted reproduction; Infertility. \n \n\nxiii \nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1  – Mecanismo proposto de inativação defeituosa de estradiol na \nendometriose. Estradiol (E2), estrona (E1)  e androstenediona (A) chegam às \nlesões endometrióticas pela corrente sanguínea, a aromatase (P450 arom) \nna célula estromal endometriótica catalisa a transformação de A para E1, \nque, por sua vez, é convertida à E2 pela ação da enzima 17 beta-\nhidroxiesteroide-desidrogenase1 (17 βHSD-1). E2 normalmente é inativado \npara E1 pela 17 beta-hidroxi-desidrogenase2 (17 βHSD-2) na célula epitelial \nglandular. Na célula endometriótica, no entanto, a 17 βHSD-2 apresenta-se \ndefeituosa, mantendo E2 em elevados níveis locais. E2 promove crescimento \ndo tecido endometriótico e produção de prostaglandinas (PGE2) que, por sua \nvez, estimulam a aromatase, completando um ciclo de feedback positivo. \n(Adaptado de Zeitoun & Bulun, 1999)................................................................ 27 \nFigura 2 – Eletroforese em gel de agarose de amostras de RNA de células \nda granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas \na técnicas de reprodução assistida. Bandas 18S e 28S referentes às \nsubunidades ribossomais intactas ..................................................................... 42 \nFigura 3 – Gráfico de amplificação por PCR em tempo real de cDNA obtido \nde amostras de células da granaulosa murais de mulheres inférteis \nsubmetidas à reprodução assistida. As sequências de interesse para os \ngenes da aromatase e da β-actina foram amplficadas, para análise da \nexpressão gênica relativa. Delta RN = Variação da fluorescência detectada. \n“Cycle number” = número do ciclo de amplificação ........................................... 50 \nFigura 4 - Gráfico da curva de dissociação para o gene da β-actina, obtida \npor PCR em tempo real (SYBR Green), de amostras de cDNA de células da \ngranulosa de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida................. 51 \nFigura 5 - Gráfico da curva de dissociação para o gene da aromatase, obtida \npor PCR em tempo real (SYBR Green), de amostras de cDNA de células da \ngranulosa de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida................. 52 \n \nGráfico 1  – Expressão gênica relativa,  por PCR em tempo real, da \naromatase (gene CYP19A1) em células da granulosa luteinizadas murais de \nmulheres com endometriose (todos estádios, N=12) vs. mulheres com fatores \ntubáreo e/ou masculino de infertilidade (N=11), submetidas a técnicas de \nreprodução assistida. (p>0,05, Mann Whitney). Gráficos representam \ncálculos quando foram usadas como amostra de referência: a) placenta e b) \nmédia do Ct absoluto do grupo controle.  Ct=”Threshold cycle” ........................ 56 \nGráfico 2  – Expressão gênica relativa, por PCR em tempo real, da \naromatase (CYP19A1) em células da granulosa luteinizadas murais de \nmulheres com endometriose vs. controle submetidas a técnicas de \nreprodução assistida. A comparação foi realizada entre os grupos (1) \ncontrole (fator tubáreo/masculino; N=11); (2) endometriose leve e mínima \n(N=5); (3) endometriose moderada e severa (N=7). (p>0.05, Kruskal-Wallis \ncom correlação de Dunn). Gráficos representam cálculos quando foram \nusadas como amostra de referência a) placenta e b) b) média do Ct absoluto \ndo grupo controle.  Ct=”Threshold cycle” ........................................................... 57 \n\nxiv \nLISTA DE TABELAS \n \nTabela 1 – Características do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada \npara FIV ou ICSI de mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino de \ninfertilidade (grupo controle; N=11) quanto à idade, número de dias de \nindução ovariana, quantidade de gonadotrofina usada, número de folículos \npuncionados e oócitos captados. DP=desvio-padrão ........................................48 \nTabela 2 – Características do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada \npara FIV ou ICSI de mulheres com endometriose (todos os estádios, N=12) \nquanto à idade, número de dias de indução ovariana, quantidade de \ngonadotrofina usada, número de folículos puncionados e oócitos captados. \nC1= primeiro ciclo e C2 = segundo ciclo de estimulação ovariana da \npaciente n\n0 08; DP=desvio-padrão.....................................................................49 \nTabela 3 – Níveis absolutos de “Threshold Cycle” (Ct), em duplicata, obtidos \npor PCR em tempo real (SYBR Green), para a análise de expressão relativa \ndo gene da aromatase (CYP19A1), normalizada ao da β-actina, em células \nda granulosa luteinizadas murais de mulheres inférteis por fator tubáreo e/ou \nmasculino (grupo controle) em comparação à mulheres com endometriose \n(todos os estádios, ASRM) submetidas a técnicas de reprodução assistida \n(FIV ou ICSI). Placenta como amostra de referência.........................................53 \nTabela 4 – Valores de expressão gênica relativa obtidos por PCR em tempo \nreal para o gene da aromatase (CYP19A1) após normalização ao da β-\nactina, em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo \ne/ou masculino, N=11 vs mulheres com endometrios nos graus mínimo/leve \n(N=5) e moderado/grave (N=7) submetidas à reprodução assistida (FIV ou \nICSI). Placenta como amostra de referência.  \nCt= “Threshold cycle”. C1=1º e C2=2º ciclos de HOC da paciente 02 \n(endometriose moderada/severa) ......................................................................54 \nTabela 5 – Valores de expressão gênica relativa obtidos por PCR em tempo \nreal para o gene da aromatase (CYP19A1) após normalização ao da β-\nactina, em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo \ne/ou masculino; (grupo controle, N=11) vs endometriose nos graus \nmínimo/leve (N=5) e moderado/grave (N=7) submetidas à reprodução \nassistida (FIV ou ICSI). Como amostra de referência, aqui representado o \npróprio grupo controle (média do Ct absoluto).  \nCt= “Threshold cycle”. C1=1º e C2=2º ciclos de HOC da paciente 02 \n(endometriose moderada/severa) ......................................................................55 \n \n \n\nxv \nLISTA DE ABREVIATURAS \n \nA → androstenediona \naGnRH→ análogos do GnRH \nBMP-15 → proteína óssea morfogenética 15 \nCC → citrato de clomifeno \nC18 → esteróides que contêm 18 carbonos em sua composição química \nC19 → esteróides que contêm 19 carbonos em sua composição química \nC21 → esteróides que contêm 21 carbonos em sua composição química \nCt → “Threshold cycle”. \nE1 → estrona \nE2 → estradiol \nFIV → fertilização in vitro \nFMRP → Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto \nFSH → hormônio folículo-estimulante \nGnRH → hormônio liberador de gonadotrofinas \nGDF-9 → fator de diferenciação de crescimento 9  \nhCG → gonadotrofina coriônica humana \nhMG ou HMG → gonadotrofinas menopausais humanas \nICSI → Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide \nIGF-1 → fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 \nIL→ interleucina  \nIUI → Inseminação Intra uterina \nLH → hormônio luteinizante \nM → concentração molar \n\nxvi \n \nNK →  células de citotoxidade natural  \nPCR → reação em cadeia da polimerase \nP450 → termo genérico para denominar a família de enzimas oxidativas \ncontendo o pigmento 450 cuja absorbância muda enquanto é reduzido  \nRNAm → ácido ribonucléico mensageiro \nROS → espécies reativas de oxigênio \nRT-PCR → PCR em tempo real \nTh1→ subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo 1 \nTh2   → subpopulação de linfócitos T auxiliares tipo2 \nTGF → fator de crescimento tumoral \nTNF → fator de necrose tumoral \nUSG → ultrassonografia \nUI → unidades internacionais \nVEGF → fator de crescimento vascular endotelial  \n \n \n \n\nxvii \nSUMÁRIO \n1.INTRODUÇÃO .................................................................................... 18 \n1.1. Etiopatogenia da Endometriose ................................................... 18 \n1.2. Endometriose e infertilidade......................................................... 23 \n1.3. Aromatase e Endometriose.......................................................... 24 \n \n2. OBJETIVO.......................................................................................... 33 \n \n3. JUSTIFICATIVA ................................................................................. 34 \n \n4. PACIENTES E MÉTODOS................................................................. 35 \n4.1. Delineamento e amostra .............................................................. 35 \n4.2. Local de realização do estudo...................................................... 35 \n4.3. Comitê de Ética em Pesquisa ...................................................... 35 \n4.4. Seleção de Pacientes................................................................... 36 \n4.4.1 Critérios de inclusão para os dois grupos............................... 36 \n4.4.2. Critérios de inclusão para o grupo-estudo ............................. 36 \n4.4.3. Critérios de inclusão para o grupo-controle ........................... 37 \n4.4.4. Critérios de exclusão para os dois grupos............................. 37 \n4.4.5. Processo de seleção das mulheres incluídas no estudo ....... 37 \n4.5. Protocolo de Hiperestimulação Ovariana Controlada................... 37 \n4.6. Captação de Oócitos.................................................................... 38 \n4.7. Coleta e Técnica de Isol amento das Células da Granulosa \nMurais (Anexo II)................................................................................. 39 \n4.8. Expressão do gene da aromatase................................................ 41 \n4.8.1. Extração de RNA................................................................... 41 \n4.8.2. Síntese de cDNA ................................................................... 42 \n4.8.3. PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) ......................... 43 \n4.8.4. Amostras de referência.......................................................... 44 \n4.9. Análise Estatística........................................................................ 45 \n \n5. RESULTADOS ................................................................................... 46 \n \n6. DISCUSSÃO ...................................................................................... 58 \n \n7. CONCLUSÃO..................................................................................... 63 \n \n8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 64 \n \nANEXOS................................................................................................. 73 \nANEXO I.............................................................................................. 74 \nANEXO II............................................................................................. 80 \nANEXO III............................................................................................ 82 \nANEXO IV ........................................................................................... 84 \nANEXO V ............................................................................................ 88 \n \nPAPER \n \n\n18 \n1.INTRODUÇÃO  \n \n \n1.1. Etiopatogenia da Endometriose \n \nEndometriose significa presenç a de endométrio (com glândula e \nestroma) fora da cavidade uterina (NOBLE et al., 1996; SPEROFF; \nFRITZ, 2005; CROSIGNANI et al ., 2006). Representa uma doença \ncrônica e de elevada morbidade,  que acomete cerca de 10% das \nmulheres em idade reprodutiva (WHEELER, 1989; SCHENKEN, 1996; \nMOURA et al., 1999; D´HOOGHE et  al., 2003; KENNEDY et al., 2005; \nCROSIGNANI et al., 2006). Porém,  a prevalência da endometriose \ndepende do método empregado para seu diagnóstico e população \nestudada. Wheeler (1989) demonstrou prevalência de aproximadamente \n10% em achados cirúrgicos em mu lheres de idade reprodutiva com \noutros diagnósticos. Hess et al. ( 1998), por sua vez, encontraram 9,4% \nde endometriose em mulheres submet idas à laparoscopia por algia \npélvica crônica. Quando se analisa mulheres com infertilidade e dor \npélvica associadas, pode-se encont rar até 50% de prevalência de \nendometriose (CORNILLIE et al., 1990) , contra 1-2% em mulheres \nassintomáticas (MOURA et al., 1999).  \n A endometriose, por sua comp lexidade e heter ogeneidade em \ntodos os seus aspectos, desde eti opatogenia, apresentação clínica, \nclassificação e abordagem, apresenta inúmeras controvérsias e admite-\nse que sua etiologia seja multif atorial (PELLICER et al., 1998\nA,B ; BULUN \n\n19 \net al., 2002; GARRIDO et al., 2002; D’HOOGHE et al., 2003; \nCROSIGNANI et al., 2006; ABREU et al., 2008). Porém, a maioria dos \npesquisadores concorda que o f enômeno da menstruação retrógrada \nseja o ponto de partida para seu estabelecimento, partindo-se das \nobservações de que esta doença oc orre mais frequentemente em \nmulheres no menacme; naquelas com anomalias müllerianas obstrutivas \npara o fluxo menstrual, e em mulheres com ciclos menstruais mais curtos \nou de maior duração (CROSIGNANI et al., 2006). De acordo com a teoria \nde Sampson (1927), ainda a mais aceita, os debris mestruais que refluem \npara a cavidade peritoneal possuem células endometriais viáveis que têm \no potencial de formar um implante endometriótico.  \nEntretanto, questiona-se por q ue existe refluxo em 90% das \nmulheres e somente 10% delas têm endometriose (GARRIDO et al., \n2002; D’HOOGHE et al., 2003; GUPTA et al., 2008).  Acredita-se que \nesta doença complexa represente uma interação também complexa entre \nfatores etiopatogênicos: genéticos, imunológicos, hormonais e até \nambientais (GARRIDO et al., 2002; D’HOOGHE et al., 2003; \nCROSGINANI et al., 2006). Todos esses fatores possivelmente conferem \nàs células endometriais de determi nadas mulheres características \nsingulares que possam aumentar sua probabilidade de implantar-se, bem \ncomo a existência de um mecani smo imunológico ab errante que possa \naumentar a sobrevida destas células e favorecer a formação do implante \nendometriótico (ZEITOUN et al., 1999;  BULUN et al., 2002; D’HOOGHE \net al., 2003). \n\n20 \n Outras teorias tentam exp licar a presença de lesões de \nendometriose fora da cavidade pél vica. Em 1924, Meyer propôs que a \nendometriose seria resultado de uma metaplasia das células da linhagem \nperitoneal; esta teoria explica a endometriose em homens, em pré-\npúberes, mulheres que nunca menstruaram e lesões em sítios atípicos, \ncomo cavidade pleural e meninges. \n A constatação da presença de células endometriais viáveis na luz \nde vasos sanguíneos e linfáticos por Halban e Sampson (1925) levou-os \na especular que focos distantes de endom etriose poderiam surgir a partir \nda disseminação de células endometri ais por via hematogênica ou \nlinfática. Esta teoria explicaria lesões na pleura, cicatriz umbilical, espaço \nretroperitoneal, vagina e colo do útero.  \nAcredita-se que a endometriose também represente uma doença \nde herança poligênica com envolviment o principalmente das citocinas \n(GARRIDO et al., 2002; D’H OOGHE et al., 2003; WU; HO, 2003; \nAGUIAR et al., 2005; GUPTA et al ., 2008); enzimas relacionadas à \nesteroidogênese (ZEITOUN et al., 1999; BULUN et al., 2002)\n e moléculas \nenvolvidas com o estresse oxidativ o celular (LANGENDONCKT et al., \n2002; SZCZEPANSKA et al., 2003). \n Quanto ao sistema imune, encont ram-se alterações tanto na \nimunidade celular quanto humoral na  endometriose, proporcionando um \nambiente peritoneal favorável à maior sobrevida das células endometriais \napós o fluxo retrógrado (WITZ, 2000; GALLOVÁ et al., 2002; WU; HO, \n2003). O fluido peritoneal de mulheres com endometriose apresenta \nmaior número e maior atividade de macrócitos; que, no entanto, \n\n21 \napresentam atividade fagocítica reduzida (OLIVE et al., 1985; ZELLER et \nal., 1987; DUNSELMAN et al., 1988; AGUIAR et al., 2005; GOMES et al., \n2007). As células Natural Killer (N K) também apresentam atividade \nreduzida na endometriose (OOSTERLYNCK  et al., 1991; WILSON et al., \n1994). Entre os linfócitos, há evid ências da dominância da subpopulação \nde linfócitos T auxiliares tipo 2 (Th2)  em relação aos T auxiliares tipo 1 \n(Th1) (GALLOVÀ et al., 2002). Além di sso, níveis elevados de citocinas \nno fluido peritoneal e também no flui do folicular de mulheres com \nendometriose foram relatados em dive rsos estudos, segundo a revisão \nde Gupta et al. (2008). A interleuci na 6 (IL-6), que corresponde a uma \ninterleucina das mais importantes  na etiopatogenia da endometriose, \nencontra-se também envolvida com a produção esteroidogênica \novariana, foliculogênese e implantaç ão embrionária (WITZ et al., 2000), \nalém de induzir a expressão do VEGF (WU; HO, 2003). Essa interleucina \ntambém estimula a produção da arom atase em células adiposas (WITZ \net al., 2000). \nO mecanismo de apoptose nas células endometriais refluídas seria \noutro foco de defeito nas mulher es que apresentam endometriose, \nsegundo estudos esse seria um dos mecanismos responsáveis pela \nmaior sobrevida das células endom etriais na cavidade peritoneal, que \nfavorece a formação dos implantes de endometriose. (FUJISHITA et al., \n1999; DMOWSKI et al., 2000; BRAUN et al., 2002; TOYA et al., 2002). \n Acredita-se ainda que a cavida de peritoneal de pacientes com \nendometriose represente um ambient e pró-oxidante (LANGENDONCKT \net al., 2002; GUPTA et al., 2008). Na endo metriose já foram relatados: o \n\n22 \naumento da enzima óxido nítrico-sint etase, que acarreta maior produção \nde óxido nítrico (substância pr ó-oxidante); aumento da peroxidação \nlipídica com produção de produtos r eativos como o malonaldeído e \nlisofosfatidilcolina; aumento de enzimas antioxidantes no endométrio em \nresposta à maior quantidade de espécie s reativas de oxigênio (ROS) e \nníveis reduzidos de vitamina E no fluido peritoneal (LANGENDONCKT et \nal., 2002; SZCZEPANSKA et al., 2003). Os efeitos sobre a fertilidade \nconsistem na toxicidade do fluido peritoneal sobre espermatozóides, \novulação, desenvolvimento embrionár io pré e durante a implantação \n(LANGENDONCKT et al., 2002).  \n Além da etiopatogenia, também ex istem controvérsias sobre o \ncomportamento clínico da endometriose e sua classificação. Nisolle e \nDonnez (1997) defendem a hipótese das três doenças, ou seja, que, a \nendometriose peritoneal, a ovariana e a infiltrativa profunda \nrepresentariam três doenças distinta s com comportamentos clínicos e \nhistopatológicos diferentes. Brosens  e Brosens (2000), por sua vez, \nclassificam a endometriose de acordo com sua topografia, em superficial \ne profunda: a forma superficial ou ade nomiose seguiria o trajeto dos \nductos mullerianos incluindo útero, fó rnices vaginais, septo retovaginal e \nligamentos uterinos; as lesões prof undas seriam aquelas localizadas fora \nda extensão dos ductos de Muller e incluiriam lesões peritoneais e \novarianas. A classificação mais ut ilizada é da Sociedade Americana de \nMedicina Reprodutiva (ASRM, 1997), porém a falta de correspondência \nentre quadro clínico e severidade da doença é um dos fatores mais \nintrigantes na endometriose (D’HOOGHE et al., 2003). \n\n23 \n1.2. Endometriose e infertilidade   \n \nQuanto à associação infertilidade-endometriose, esta é inequívoca \n(D’HOOGHE et al., 2003), e o quadro de infertilidade é presente em \nquase 60% das mulheres com essa  doença (CORNILLIE et al., 1990; \nD’HOOGHE et al., 2003; MATALLIOTAKIS et al., 2007). A interferência \nmecânica, ou seja, a presença de def eito anatômico pélvico associado à \nendometriose, é o fenômeno mais acei to, entretanto, os mecanismos \nenvolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos, \nespecialmente nos estágios míni mo e leve da doença (SCHENKEN, \n1996; FERRIANI et al., 2000; CROSIGN ANI et al., 2006; GUPTA et al, \n2008). Neste caso, os mecanismos im unológicos, genéticos e hormonais \ntêm sido estudados e incluem possíve is alterações no microambiente \nfolicular ou no oócito (SCHENKEN , 1996; PELLICER et al., 1998\nA ; \nGARRIDO et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2005; ABREU et al., 2006); bem \ncomo nas células da granulosa (HARLO W et al., 1996; OLIVEIRA et al., \n2005; ABREU et al., 2005; GOMES et al., 2007, TOYA et al., 2002). \n Sem dúvida o advento das técnicas de reprodução assistida \nrepresentou um import ante passo no tratam ento da infertilidade \nassociada à endometriose (NEME et al., 2001; CROSIGNANI et al., \n2006). Numerosos estudos foram realizados para avaliar se a \nendometriose afeta os resultados da fertilização  in vitro  (FIV) e seus \nachados foram controversos (TEMPLET ON et al., 1996; RINESI et al., \n2002; WRIGHT et al., 2007). Entretanto, Barnhart et al. (2002) realizaram \numa metanálise de 22 estudos sobre o assunto e verificaram que todos \n\n24 \nos parâmetros encontravam-se alterados nas pacientes com \nendometriose quando comparadas àquel as com outras causas de \ninfertilidade, com redução na taxa de fertilização, número de oócitos \ncaptados, taxas de implantação e gestação.          \n O clássico modelo de estudo com mulheres doadoras de oócitos \nproporcionou uma compreensão fu ndamental quanto à questão \n“qualidade oocitária” vs. “receptividade endometrial” em mulheres com \nendometriose, pois apontou o comprome timento da qualidade oocitária \ncomo o principal fator alterado nas mulheres inférteis com endometriose \nsubmetidas à FIV em detriment o da receptividade endometrial \n(PELLICER et al., 1998 B ; GARCIA-VELASCO; ARICI, 1999; DIAZ et al., \n2000; BARNHART et al., 2002; GARRIDO et al., 2002). \n \n \n1.3. Aromatase e Endometriose \n \nComo já foi relatado, emer ge a teoria de que a endometriose \nrepresente uma doença poligênica hereditária com expressão aberrante \nde citocinas e enzimas relacionadas à esteroidogênese como a \naromatase (BULUN et al., 1995; HARLOW et al., 1996; NOBLE et al., \n1996; ZEITOUN; BULUN, 1999; ATTIA et al., 2001; NEME et al., 2001; \nBULUN et al., 2002; GURATES et al., 2003; ABREU et al., 2005;  \nHEILIER et al., 2006). \nDe fato, evidências apontam neste sentido. Arvanitis et al. (2003) \nencontraram a presença de um po limorfismo no gene da aromatase \n\n25 \nassociado com a endometriose. Kao et al. (2003), através da análise de \nmicroarrays em amostras de endométrio de mulheres com endometriose, \nencontraram  91 genes com expressão aumentada e 115 reduzidos \nsignificativamente nestas mulheres; genes como os envolvidos com \nresposta imune e apoptose celular,  fatores angiogênicos e também o \ngene da aromatase.  \nA aromatase é uma enzima c odificada pelo gene CYP19A1 \nlocalizado no cromossomo 15 ( 15q21.1; Sequência do GeneBank  \nNM_000103) (MEINHART; MULLIS, 2002) e corresponde a um complexo \nenzimático do citocromo P450 respons ável por catalisar a transformação \nde androgênios (testosterona, andr ostenediona) em estrogênios \n(estradiol, estrona, respectivamente) (ZEITOUN; BULUN, 1999; NEME et \nal., 2001; BULUN et al., 2002; FANG et al., 2002; KARAER\n et al., 2004; \nSPEROFF; FRITZ, 2005). É uma enz ima-chave para a formação de \nestrogênio nos tecidos humanos (F ANG et al., 2002; MEINHART; \nMULLIS, 2002) e está presente em vários tecidos: ovários (células da \ngranulosa), testículo, tecido adipos o, placenta, cérebro, músculo, \nfibroblastos da pele e do tecido ósseo (KARAER\n et al., 2004). Vários \npromotores tecido-específicos permite m a regulação local da enzima, \nporém a proteína expressa é a mesma (MEINHART; MULLIS, 2002; \nKARAER et al., 2004). \nUma vez que a endometriose é considerada uma doença \nestrogênio-dependente, a expressão da enzima aromatase torna-se \nessencial para sua etiopatogenia. O estrógeno é um potente mitógeno \npara os tecidos mullerianos (BULUN  et al., 2002) e a possível ação \n\n26 \nautócrina deste hormônio, ou seja, s ua ação local sobre o endométrio de \nmulheres com endometriose pode ser um fator facilitador para o \ndesenvolvimento de implantes na cavi dade peritoneal (NOBLE et al., \n1996; FANG et al., 2002; GURATES et al., 2003) (Vide FIGURA 1).  \nO envolvimento da aromatase e produção esteroidogênica, bem \ncomo  sua importância para o est abelecimento da endometriose têm sido \nalvos de numerosos estudos, principalmente nos endométrios tópico e \nectópico (BULUN et al., 1995; NOBL E et al., 1996; ZEITOUN; BULUN, \n1999; ATTIA et al., 2001; NEME et al., 2001; BULUN et al., 2002; \nGURATES et al., 2003; ISHIHARA et al., 2003; HEILIER et al., 2006; \nBUKULMEZ et al., 2008; KYAMA et al., 2008). Níveis muito elevados da \naromatase foram detectados em im plantes peritoneais e endometriomas \n(NOBLE et al., 1996;\n KITAWAKI et al., 2002; BUKULMEZ et al., 2008) e \ntambém no endométrio tópico de mulheres com endometriose (BULUN et \nal., 1995; ZEITOUN; BULU N, 1999; BULUN et al., 2002; KYAMA et al., \n2008), mas não em mulheres sem a doença (BULUN et al., 2005).  \n \n \n \n\n27 \n \nFigura 1 – Mecanismo proposto de inativação defectiva de estradiol na endometriose. \nEstradiol (E2), estrona (E1)  e androstenediona (A) chegam às lesões endometrióticas \npela corrente sanguínea, a ar omatase (P450 arom) na célula  estromal endometriótica \ncatalisa a transformação de A para E1, que, por sua vez, é convertida à E2 pela ação da \nenzima 17 beta-hidroxiesteroide-desidrogenase1 (17 βHSD-1). E2 normalmente é \ninativado para E1 pela 17 beta-hidroxi-desidrogenase2 (17 βHSD-2) na célula epitelial \nglandular. Na célula endometriótica, no entanto, a 17 βHSD-2 apresenta-se defeituosa, \nmantendo E2 em elevados níveis locais. E2 promove crescimento do tecido \nendometriótico e produção de prostaglandina s (PGE2) que, por sua vez, estimulam a \naromatase, completando um ciclo de feedback positivo. (Adaptado de Zeitoun & Bulun, \n1999) \n \n \nPorém, sabe-se que esta enzim a também está presente nas \ncélulas da granulosa e, de fato, exerce um papel fundamental para o \nprocesso de maturação folicular e estabelecimento da qualidade oocitária \n(ERICKSON et al., 1989; FOLDESI et  al., 1998; LAMBERT et al., 2000; \nSPEROFF; FRITZ, 2005).  \nOra, se existe funcionamento aberrante da aromatase em lesões \nde endometriose, por que não ocorreria o mesmo na célula da granulosa \ncom comprometimento da foliculogênese e qualidade oocitária?  \n  \nCélula epitelial \nCélula estromal \nA \nE1 \nE2\nE1 E2 \nPgE2 \nP450 arom \n+\n+\n+\n17β HSD-1 \n17β HSD-2 \nA \n E1 \n E2 \nVaso sanguíneo\n\n28 \nAlém disso, como já descrito previamente, os dados derivados dos \nestudos com doadoras apontaram a má  qualidade oocitária como o \nprincipal fator alterado nas mul heres inférteis com endometriose \nsubmetidas à FIV (PELLICER et al., 1998; BARNHART et al., 2002; DIAZ \net al., 2000). Qual o papel da aromatase para o desenvolvimento de \noócitos de boa qualidade? \nSabe-se que o clímax ovulatório e a quali dade do oócito a ser \novulado são resultados de um processo complexo e orquestrado que tem \nduração de 85 dias desde a fase de folí culo primordial até a fase de \nfolículo pré-ovulatório. Os folículos que iniciam essa “corrida” o fazem \nprimeiramente em uma manei ra gonadotrofina-independente e \nposteriormente, gonadotrofina-dependente. Nessa última, oócito, células \nda granulosa e FSH interagem de manei ra sinérgica e a multiplicação \ndas células da granulosa e a maneira como respondem ao FSH e \nposteriormente ao LH para a produção de esteróides intrafoliculares são \neventos fundamentais desse proce sso (SPEROFF; FRITZ, 2005). Sabe-\nse que existem “gap-junctions” entre as células da granulosa, evidência \nde que há interação molecular entre el as e possivelmente com o próprio \noócito, através de molé culas sinalizadoras como  o GDF-9 (fator de \ndiferenciação de crescimento 9) e o BMP-15 (proteína óssea \nmorfogenética 15) (ALBERTINI; BARRE TT, 2003; COMBELLES et al., \n2004; THOMAS; VANDERHYDEN, 200 6; HUTT; ALBERTINI, 2007), \ncontudo, muito pouco se conhece sobre essa comunicação entre células \nda granulosa e oócito.  \n\n29 \nAs células da granulosa se dife renciam em células da granulosa \nmurais e do cumullus durante o proce sso de foliculogênese, fato que tem \nestimulado o estudo de seu potencial  como células-tronco mesenquimais \n(GEYTER et al., 2006). No momento em que se atingem o estágio de \nfolículo pré-antral, portanto, as cé lulas da granulosa são capazes de \nsintetizar todas as três cla sses de esteróides (androgênios, \nprogestagênios e estrogênios) (SPEROFF; FRITZ, 2005). \nPorém, as proporções e o mo mento nos quais estes são \nproduzidos são fundamentais. Sabe-se que o FSH e posteriormente o LH \napresentam receptores hormonais na s células da granulosa e existe um \nsinergismo entre estes receptores e a produção hormonal intrafolicular \npara a produção de um folículo que carregue um oócito maduro (COSTA \net al., 2004; SPEROFF; FRITZ,  2005; SILVA et al., 2008). Os \nandrógenos, por exemplo, são nece ssários em pequenas concentrações \nno início do desenvolvimento folicular como substrato para a produção de \nestradiol. Segundo a teoria das duas  células, as células da teca \ntransformam os componentes C21 (c olesterol) até andrógenos, que por \nsua vez são substratos para a arom atase nas células da granulosa que \nconvertem os andrógenos (C19) a estrógenos (C18). A transformação de \num ambiente androgênico  para estrogênico é fundamental para que se \ntenha um oócito apto para ovular (SPEROFF; FRITZ, 2005). Na célula da \ngranulosa, a aromatase apresenta um papel essencial na foliculogênese \ne produção de estradiol: sua expressão aumenta à medida que o \ndesenvolvimento folicular progride (TETSUKA; HILLIER, 1997; GUET et \nal., 1999), sob influência do FSH, segundo a teoria das duas células-duas \n\n30 \ngonadotrofinas (SPEROFF; FRITZ, 2005). Portanto,  a aromatase é uma \nenzima de primordial im portância na célula da gr anulosa e responsável \npor produzir um microambiente estrogênico folicular, essencial ao seu \nprocesso de desenvolvimento e ma turação (SPEROFF; FRITZ, 2005). \nAlém disso, é necessário ressaltar que a aromatase é o ponto final de \ntoda a cascata esteroidogênicia ovar iana, e a única enzima ovariana \ncapaz de converter andrógenos para estrógenos. Ou seja, se houver um \ndefeito em sua atividade, aquele folículo terá dificuldade em adquirir um \nstatus pré-ovulatório normal.  \nTanto nos ciclos naturais, bem co mo nos ciclos estimulados para \nreprodução assistida, as relações  hormonais intrafoliculares são \nessenciais para o sucesso de todo o pr ocesso ovulatório. Em termos de \nmaturação, Costa et al. (2004) analis aram os ciclos estimulados com \ngonadotrofinas exógenas sem uso de análogo do GnRH e constataram \nque os folículos que continham oóc itos maduros apresentavam um \naumento da relação P/T, P/E2 e E2/T no fluido fo licular em relação aos \nimaturos, o que sugere uma diminuiç ão da conversão C21 a C19, mas \nnão na atividade da arom atase. Silva et al. (2008) analisaram essas \nmesmas relações em folículos de mu lheres submetidas também a ciclos \nestimulados com uso análogo do GnRH e observaram que sua ação se \nmantém intacta e o efeito mais importante do GnRH foi a redução de \nandrógenos intrafoliculares, com maiores taxas de fertilização e de \nmaturação. \n\n31 \nPortanto, os dados da literatur a apontam para a importância da \naromatase no processo de maturação e estabelecimento da qualidade \noocitária.  \nEstudos in vitro, por cultivo de células da granulosa de mulheres \ncom endometriose submetidas a cicl os de hiperestimulação ovariana \ncontrolada demonstraram que e ssas apresentam um mecanismo \ndefeituoso da atividade da  aromatase. Harlow et  al. (1996) pesquisaram \na atividade da aromatase em pacient es com endometriose de graus leve \ne mínimo através de cultura de célula s da granulosa na qual avaliaram a \nprodução de estrógeno frent e à adição de testoste rona ao meio de \ncultura. Encontraram redução da at ividade da aromatase nas pacientes \ncom endometriose em comparação ao controle. Pesquisadores do \nmesmo grupo (CAHILL et al., 2003) tam bém através de cultivo de células \nda granulosa, constataram uma menor sensibilidade ao LH nas células \nda granulosa de mulheres com endometriose.  \nEm estudo prévio de nosso la boratório (ABREU et al., 2006) \nencontramos redução na produção de estr adiol nas células da granulosa \nmurais luiteinizadas in vitro , obtidas  de mulheres com endometriose, \napós 24 horas de cultivo celular. Em condições basais ou quando foi \nsuplementado ao meio de cultivo m enor concentração de testosterona \n(2x10\n-6M), a produção de estradiol foi menor no grupo com endometriose. \nEntretanto, quando se aumentou a concentração da testosterona \n(precursor da aromatase) adici onada ao cultivo celular (2x10 -5 M), não \nhouve diferença entre os grupos c ontrole e endometriose quanto à \nprodução de estradiol.  \n\n32 \nDiante deste achado, emerge a seguinte pergunta: se esse \nfenômeno ocorreu devido a um comprometimento da atividade da \naromatase ou se devido à menor disponibilidade de seu substrato.  \nCom o intuito de esclarecer esta  questão, bem devido à presença \nde vários estudos descritos anterio rmente que associam a endometriose \nà defeitos nos mecanismos de controle de seu gene, hipotetizamos que a \nredução da atividade da aromatase seja resultado de um defeito na \nexpressão de seu gene, CYP19A1. \n \n \n \n \n  \n \n \n \n\n33 \n2. OBJETIVO  \n \n \nO objetivo deste trabalho é: \n \n9 Verificar a expressão do gene  da aromatase (CYP19A1) nas \ncélulas da granulosa murais lu teinizadas de mulheres com \nendometriose  submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV \nou ICSI). \n \n \nA hipótese a ser validada é que: \n \n9 Mulheres com endometriose apresentam redução da expressão do \ngene da aromatase (CYP19A1) nesse tecido-alvo. \n \n \n \n \n \n \n\n34 \n3. JUSTIFICATIVA \n \n \n Estudos prévios, conforme descr ito previamente, verificaram a \nredução da atividade da ar omatase na célula da granulosa de mulheres \ncom endometriose através de cultivo celu lar. Alterações da expressão de \nseu gene, CYP19A1, tamém fora m demonstradas nos endométrios \neutópico e ectópico. A inexistênc ia de estudos que avaliem a sua \nexpressão gênica, especificamente nas células da granulosa de mulheres \ncom endometriose estimulou a realização deste estudo.  \n \n \n \n \n \n \n\n35 \n4. PACIENTES E MÉTODOS \n \n4.1. Delineamento e amostra:  Estudo caso-controle. O grupo-\nestudo foi composto de 11 mul heres com endometriose e o grupo-\ncontrole de 11 mulheres, com fatores masculino ou tubáreo de \ninfertilidade, submetidas à técnicas de reprodução assistida (FIV ou \nICSI). O número amostral para este estudo refere-se ao número de ciclos \nde Hiperestimulação Ovariana Cont rolada (HOC), no grupo controle \nforam incluídos 11 ciclos de HOC, e no grupo com endometirose foram \n12 ciclos, ou seja, uma das mulheres  com endometriose foi submetida a \ndois ciclos de HOC no período do estudo, ambos incluídos no mesmo. \n \n4.2. Local de realização do estudo:  Setor de Reprodução \nHumana do Departamento de Ginecologia  e Obstetrícia do Hospital das \nClínicas da Faculdade de Medicina de Ri beirão Preto, Universidade de \nSão Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil.  \n \n4.3. Comitê de Ética em Pesquisa:  o presente estudo foi \naprovado pela Comissão Nacional de Ét ica em Pesquisa (CONEP) de \nacordo com o parecer número 15346/ 2005. Cada paciente assinou um \ntermo de consentimento antes da r ealização do procedimento de \nreprodução assistida e da realização  da pesquisa, após os devidos \nesclarecimentos (vide Anexos III, IV e IV). \n\n36 \n4.4. Seleção de Pacientes:  Foram selecionadas 22 mulheres \ninférteis com indicação para FIV ou ICSI, com um total de 11 para o \ngrupo controle e 11 para o grupo com endometriose (uma delas com dois \nciclos de estimulação inclusos no estudo), as quais foram entrevistadas e \nexaminadas pelo mesmo observador. Cinco mulheres apresentaram o \ngrau mínimo/leve e seis o grau m oderado/grave de endometriose de \nacordo com a classificação da Sociedade Americana de Medicina \nReprodutiva. Os critérios para seleç ão de pacientes de ambos os grupos \nestão descritos abaixo: \n \n4.4.1 Critérios de inclusão para os dois grupos:  estar \ncadastrada no Programa de Repr odução Assistida do Setor de \nReprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do \nHospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto; ter \nidade igual ou inferior a 40 anos, apresent ar ciclos menstruais regulares \ne dosagem de FSH normal para o menacme. \n  \n4.4.2. Critérios de inclusão para o grupo-estudo: presença de \nendometriose em qualquer estadio de acordo com a classificação da \nSociedade Americana de Medicina Reprodutiva (F ertil Steril 1997;67: \n817–821), diagnosticada por laparoscopi a realizada nos seis meses \nanteriores à realização do estudo. \n \n\n37 \n4.4.3. Critérios de inclusão para o grupo-controle:  ausência \nde endometriose confirmada por laparo scopia prévia. Fatores tubáreo ou \nmasculino de infertilidade. \n \n4.4.4. Critérios de exclusão para os dois grupos: presença de \ndoenças endócrinas associadas, mulheres ooforectomizadas. \n \n4.4.5. Processo de seleção das mulheres incluídas no \nestudo: No período do presente estudo, foram atendidas 50 mulheres \ncom diagnóstico de endometriose subm etidas à FIV ou ICSI. Destas, 24 \ncumpriam os critérios de inclusão para o estudo e foram selecionadas de \nmaneira consecutiva, porém 12 não concordaram em participar do \nestudo. Portanto, o total foi de 12 mulheres com endometriose incluídas \nno estudo. Para o grupo controle, a seleção também ocorreu de maneira \nconsecutiva.  \n \n \n4.5. Protocolo de Hiperestimulação Ovariana Controlada   \n \nPrimeiramente, realizou-se a programação do período menstrual \natravés de uso de anticoncepcionais or ais combinados no ciclo prévio \nàquele da indução da ovulação. Para dessensibilização hipofisária, foi \nutilizado o agonista do Gn RH acetato de leupr olide (Lupron®, Abbott; \nReliser®, Serono, Brasil) 10 UI/dia via subcutânea ou nafarelina via nasal \n400 µg/dia (Synarel®, Pharmacia, Bras il) conforme protocolo longo. Do \n\n38 \n1º-3º dia do ciclo de estimulaç ão ovariana, foi realizada uma \nultrassonografia (USG) transvaginal para excluir cistos ovarianos e então \niniciada a estimulação ovariana c ontrolada com gonadotrofinas: hMG \n(Menogon®, Ferring, Brasil; Pergonal®, Serono, Brasil) na dose de 200 a \n400 UI/dia e a partir do 6 o dia a dose da gonadotrofina foi ajustada de \nacordo com o crescimento folicular monitorizado por USG. Quando houve \npelo menos 2 folículos com 17 mm de diâmetro, foi administrado hCG \nintramuscular (Profasi®, Serono, Brasil) 10.000 UI ou hCG recombinante \n250µg via subcutânea (Ovidr el®, Serono, Brasil) e após 34 a 36 horas, \nrealizada a captação de oócitos.  \n \n \n4.6. Captação de Oócitos   \n \nA captação oocitária foi realizada sob anestesia geral tipo \nendovenosa com uso de prop ofol (Diprivan®, Astra Zeneca, Brasil) \nassociado ao fentanil (Fentanil®, Jan ssen Cilag, Brasil) , administrados \npor via endovenosa. O procedimento fo i feito via vaginal através de \npunção de fundo de saco e guiado por ultrassonografia. O conteúdo de \ncada folículo foi aspirado em tubos  de Falcon sob pr essão de 120-130 \nmmHg e mantido a 37\no e os oócitos manuseados em capela de fluxo de \nar laminar com temperatura controlada a 37oC e concentração de CO2  de \n5%, após separação do flui do folicular, o qual c ontinha as células da \ngranulosa luteinizadas murais, utilizadas no presente estudo.  \n\n39 \n4.7. Coleta e Técnica de Is olamento das Células da \nGranulosa Murais  (Anexo II) \n \n O método utilizado para a técnica de isolamento das células da \ngranulosa murais luteinizadas de mulh eres submetidas a técnicas de \nreprodução assistida foi baseado no método utilizado pelos autores \nChang et. al. (2005), com algumas modificações. O procedimento está \ndescrito a seguir: \nPara a realização do estudo, foi utilizado pelo menos um aspirado \nfolicular de cada ovário de cada mulher incluída no estudo, ou seja, o \naspirado correspondente a 2 folículo s maduros (>17mm diâmetro), sem \ncontaminação visual por célula s sanguíneas. Depois de separado o \ncomplexo cumulus-oócito, sob fl uxo laminar e temperatura a 37\noC, o \nrestante do conteúdo presente no t ubo de Falcon (15ml), que continha o \nfluido folicular e as células da granulosa murais, foi então transferido para \nplacas de Petri e lavado com meio HT F Modificado (Irvine Scientific, \nSanta Ana, CA, USA). Após lav agem, todo este material foi então \ntransferido para um novo tubo de 15 ml e centrifugado por 10 minutos a \n2500 rpm a 40 C. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” ressuspenso \nem 0,6 ml de meio HTF Modificado e cuidadosamente transferido sobre a \nsuperfície de 4 ml de Histopaque 1077  (Sigma, St. Louis, MO, USA) \npreviamente preparado em um novo tubo. Este conteúdo foi então \ncentrifugado por 10 min a 1700 rpm e 4 0C, com o objetivo de separar as \ncélulas sanguíneas das células da gr anulosa murais. As células da \ngranulosa formaram uma fina camada entre o Histopaque e o meio de \n\n40 \ncultivo, enquanto que as célula s sanguíneas que ainda estavam \npresentes ficaram coletadas no f undo do tubo. A interface meio-\nhistopaque contendo, portanto, as célu las da granulosa murais, foi então \ncuidadosamente aspirada com pipeta Pasteur e a seguir transferida a um \nnovo tubo contendo 2 ml de HTF-M para lavagem do material. Este \nmaterial foi também centrif ugado por 10 minutos a 2500 rpm e 4 0C. A \nseguir, descartou-se o sobrenadante e o pellet foi então ressuspenso em \n500 µl de meio de cult ivo PBS (Irvine Scientif ic) para finalmente ser \ndividido e estocado em 2 microtubos de 1.5 ml cada, contendo cada um \ndos tubos 250 µl da suspensão celula r e 750 µl de Trizol LS Reagent \n(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), resu ltando em um volume total de 1 ml \nem cada tubo. Por meio de agitação ma nual, foi realizada a lise celular \ndo material contido em cada microtubo e rapidamente armazenado a -800 \nC, até a realização da extração de RNA.  \nA presença e isolamento das células da granulosa foram \nconfirmados através de visualização por microscópio ótico invertido \n(Coleman® ST-302L, Brasil),  e veri ficada sua vitalidade através da \ncoloração por Trypan Blue (Trypanblau®, Merck, Whitehouse Station, NJ, \nUSA). \nÉ importante ressaltar também  que todos os cuidados foram \ntomados para evitar c ontaminação no material estudado. Toda a equipe \nutilizou luvas estéreis e o material  de consumo como tubos e pipetas \neram livres de RNAse e estéreis. O ma terial foi sempre mantido sobre \ngelo para que se pudesse evitar  a degradação do RNA durante os \npassos descritos anteriormente.  \n\n41 \n4.8. Expressão do gene da aromatase  \n \nA expressão quantitativa do gene da aromatase (CYP19A1), ou \nseja, a quantificação da expressão dos níveis de RNA mensageiro da \naromatase em relação ao gene da ß-actina, nas  células da granulosa \nluteinizadas murais das mulheres in cluídas no estudo foi analisada pelo \nmétodo de PCR em tempo real quantitativo, como descrito a seguir.  \n \n \n4.8.1. Extração de RNA \n \nO RNA total das células da granul osa foi extraído utilizando-se o \nTrizol LS Reagent® (Invitrogen). O pr ocedimento foi realizado de acordo \ncom o protocolo do fabricante. Br evemente, depois do descongelamento, \nas amostras, que já haviam sido previamente armazenadas em Trizol LS \nReagent, foram então homogeneizadas  e mantidas à temperatura \nambiente por 5 minutos. A cada t ubo foi então adicionad o 0,2 ml de \nclorofórmio (Merck, Whitehouse Station, NJ, U SA). Após homogenização \ne incubação à temperatura ambiente por 3 minutos, o material foi \ncentrifugado a 13.000 rpm por 15 minutos a 4\n0C.  O sobrenadante foi \naspirado e transferido a um novo t ubo contendo 0,5 ml de isopropanol \n(Merck). Após homogenização, o mate rial foi incubado “overnight” a -\n200C. \nNo próximo dia, após descongelam ento, o material de cada tubo \nfoi submetido à centrifugação por 30 minutos a 13.000 rpm e 4 0C, o \n\n42 \nsobrenadante foi então descartado e ao “pellet” foi adicionado 1 ml de \netanol 75% (Merck) para lavagem e após secagem completa do etanol, \nao pellet em cada tubo foi adicionada 20 µl de água  livre de RNAse e \nestocado a -800C. \nA integridade do RNA foi verificada através de eletroforese em gel \nde agarose a 1% corada com brometo de etídio. (Figura 2) \n \n \n \n \nFigura 2  – Eletroforese em gel de agarose de amostras de RNA de células da \ngranulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de \nreprodução assistida. Banda s 18S e 28S referentes às subunidades ribossomais \nintactas. \n  \n \n4.8.2. Síntese de cDNA \n \nPara a síntese de cDNA foi usado o kit High capacity cDNA \narchive kit (Applied Biosystems, Los  Angeles, CA) associado à enzima \nenzima inibidora de RNAse (RNasin Plus®, Promega, Wisconsin, MD, \nUSA). O procedimento realizado para cada amostra conforme as \ninstruções e orientações contidas no kit. \nApós a síntese de cDNA, que resultou em um volume final de 20 µl \nde cDNA, o mesmo foi aliquotado (5 µl cada) e estocado a -200C.  \n18S \n28S \n\n43 \n4.8.3. PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) \n   \nA reação de qRT-PCR foi realiz ado com as amostras de cDNA de \ncélulas da granulosa murais das mulher es incluídas no presente estudo, \npreviamente armazenadas a -800C. Foram utilizados os reagentes do tipo \nSYBR Green PCR Core reagents (Applie d Bio-systems, Foster City, CA) \ncom análise de curva de dissociação e o sistema de detecção ABI \nSequence Detection System 5000 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Los \nAngeles, CA). Todos os experimentos  referentes a cada paciente foram \nrealizados em duplicata e os dados  normalizados em relação ao gene \nendógeno da β-actina. As sequênc ias de interesse fo ram amplificadas \nutilizando-se os seguintes “primers” (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA):  \n \nPara o gene da aromatase CYP19A1:  \n- (Forward) (FW): 5’CCTTgCCAATAgTgTCATCC3’  \n- (Reverse) (RV) 5’TAgCCTggTTCTCTggTgTg 3’ \n \nPara o gene endógeno β-actina: \n- (Forward) (FW):5’ TCgTgATggACTCCggTgAC3’  \n- (Reverse) (RV): 5’CgTggTggTgAAgCTgTAg3’   \n \nA sequência dos primers foi defin ida através do software Gene \nRunner (Hastings softwares Inc, Ne w York, NY, USA), seguindo-se as \nrecomendações para a PCR em tempo real.   \n\n44 \n4.8.4. Amostras de referência \n \nDiluições seriadas de uma am ostra de placenta humana de uma \nmulher hígida com gestação a termo foram utilizadas para a realização \nda curva padrão e essa amostra ta mbém foi usada como amostra de \nreferência. A escolha da placenta como  amostra de referência foi pelo \nfato de ser um órgão conhecido pela ex pressão da aromatase e pelo fato \nde já ter sido usada previamente por outros pesquisadores (ACIÈN et al., \n2007).  \nHouve porém a necessidade  de se utilizar uma outra amostra de \nreferência, que foi o própr io grupo controle do pr esente estudo, pois a \nplacenta apresentou uma expressão da aromatase muito elevada em \ncomparação com as células da granulosa murais, que representaram \nportanto uma amostra de referência mais fidedigna. \nO cálculo da normalização da expre ssão gênica ao gene endógeno \ne cálculo da expressão gênica relati va foi realizado pelo método 2\n-∆∆Ct \nconforme fórmula a seguir: (Ct=threshold cycle)  \n \n∆Ct= Ct (CYP19A1) - Ct β-actina;   \n∆∆Ct= ∆Ct amostra de interesse - ∆Ct amostra de referência.  \n2\n-∆∆Ct = formula utilizada para quantificação da expressão relativa do \ngene da aromatase em realação ao gene da β-actina, usando como \namostra de referência a placenta ou as células da granulosa do grupo \ncontrole do presente estudo (LIVAK et al., 2001).   \n\n45 \nOs cálculos estão representados  detalhadamente em  cada amostra \ndo estudo no ANEXO I. \n \n \n4.9. Análise Estatística \n  \nPara o cálculo amostral, foi usado o programa encontrado no \nwebsite: http://www.lee.dante.br/ pesquisa/amostragem/amostra.html O \nvalor considerado para o cálculo amostral foi a média do desvio-padrão \ndo Ct em ambos os grupos, a qual  foi 2,884 (controle 2,836 e \nendometriose 2,933).  Para uma difer ença de 15% entre os grupos e \nnível de significância de 5%, seriam necessárias 09 pacientes para cada \ngrupo.  \nO programa usado para cálculo dos dados das pacientes e da RT-\nPCR (PCR em tempo real) foi o GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software \nInc., San Diego, CA, USA). Para a análise dos dados do HOC, foi \nutilizado o teste T não pareado em todas as comparações.  \nCom relação à análise dos dados da RT-PCR, quando foram \ncomparados dois grupos, foi usado o teste de Mann-Whitney e, quando \nrealizada a comparação simultânea ent re os três grupos, o teste de \nKruskal-Wallis com correlação de D unn. Em todos os casos, considerou-\nse um nível de significância de 5%(p < 0.05). \n \n\n46 \n5. RESULTADOS \n \nA idade das mulheres incluídas no estudo variou de 27 a 40 anos de \nidade. Não houve diferença entre  os grupos quanto à idade ou \nparâmetros do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada para \nreprodução assistida (Tabelas 1 e 2). A média de idade das mulheres do \ngrupo controle e endometriose foi 34,73 e 32,64, respectivamente \n(p=0,17). Para os outros parâmetro s do ciclo de hiperestimulação \novariana, as médias encontradas para os grupos controle e endometriose \nforam respectivamente: dias de indução, 9,00 vs. 9,08 (p=0,90); \nquantidade de gonadotrofinas us adas em unidades, 2502 vs. 2354 \n(p=0,65); n\n0 de folículos puncionados, 11, 18 vs. 11,50 (p=0,87) e n o \noócitos captados, 5,82 vs. 6,83 (p=0,39).  \nQuanto aos resultados da RT-PCR, as curvas de amplificação e de \ndissociação estão representadas nas figuras 4, 5 e 6, respectivamente. O \n“Threshold” usado foi de 0,2 e foram realizadas curvas-padrão para \nambos os genes.    \nA análise do Ct absoluto, ou seja, sem a normalização para o gene \nendógeno da β-actina, demonstrou uma dist ribuição gaussiana de seus \nvalores (com exceção da aná lise da aromatas e no grupo com \nendometriose). As médias e medi ana do grupo que não apresentou \ndistribuição normal, bem como os respectivos desvio-padrões estão \nrepresentados na Tabela 3. \nQuanto aos valores de Ct para o gene da aromatase após \nnormalização para o gene endógeno beta-actina, os dados estão \n\n47 \nrepresentados nas Tabelas 4 e 5. Os valores da tabela 4 representam os \ndados calculados utilizando-se a placent a como amostra de referência. \nNa tabela 5, no entanto, são demonstrados os dados  quando foi utilizada \na média do Ct absoluto do grupo contro le como amostra de referência. O \ncálculo da expressão gênica relati va foi calculada pelo método 2 -∆∆ Ct, \nconforme descrito na seção Métodos e no ANEXO I.   \nNão houve diferença entre os grupos controle e endometriose no \nque diz respeito à análise quantitativa relativa da expressão do gene da \naromatase (CYP19A1) nas células da granulosa luteinizadas murais \n(p=0,5254 e 0,3099, Mann Whitney, quando normalizados à placenta e \ngrupo controle, respectivamente; vi de Gráfico 1). Na comparação entre \nos três grupos (controle, endometri ose mínima/leve e moderada/grave), \ntambém não foi encontrada diferença segundo o teste Kruskal-Wallis com \ncorrelação de Dunn (p=0,4254 quando normalizados à placenta e ao \ngrupo controle, respectivamente; vide Gráfico 2). A análise comparativa \nentre os grupos endometriose leve/m ínima vs. modera da/grave também \nfoi efetuada e novamente não foi encontrada nenhuma diferença \nsiginificante entre os grupos (p=0,4318, Mann Whitney, quando \nnormalizados à placenta e também ao grupo controle). \n \n \n \n \n\n48 \n \n \n \n \nTabela 1 – Características do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada \npara FIV ou ICSI de mulheres com fatores tubáreo e/ou masculino de \ninfertilidade (grupo controle; N=11) quanto à idade, número de dias de indução \novariana, quantidade de gonadotrofina usada, número de folículos puncionados \ne oócitos captados. DP=desvio-padrão.  \n \n  \n \n \nIDADE \nNo DIAS DE \nINDUÇÃO \nQUANTIDADE \nGONADOTROFI\nNA USADA \nN0  FOLÍCULOS \nPUNCIONADOS \nN0  OÓCITOS \nCAPTADOS \n      \n01 37 07 4175UI 8 4 \n02 31 09 2595UI 17 8 \n03 36 11 3000UI 14 8 \n04 39 08 2800UI 5 2 \n05 27 09 2200UI 6 2 \n06 33 09 1750UI 15 7 \n07 33 10 1400UI 20 7 \n08 40 08 2250UI 15 10 \n09 \n10 \n32 \n36 \n09 \n12 \n1950UI \n3300UI \n13 \n5 \n9 \n4 \n11 38 07 2100UI 5 3 \n \nMédia± \nDP \n \n34,73±3,90 \n \n9,00± \n1,55 \n \n2502± 786,3 \n \n11,18±5,51 \n \n5,82±2,892 \n \n \n \n \n \n\n49 \n \nTabela 2 – Características do ciclo de hiperestimulação ovariana controlada \npara FIV ou ICSI de mulheres com endometriose (todos os estádios, N=12) \nquanto à idade, número de dias de indução ovariana, quantidade de \ngonadotrofina usada, número de folículos puncionados e oócitos captados.  \n \n \n \n \n \n \n \nIDADE \nNo DIAS DE \nINDUÇÃO \nQUANTIDADE \nGONADOTROFI\nNA USADA \nN0  FOLÍCULOS \nCAPTADOS \nN0  OÓCITOS \nCAPTADOS \n      \n01 35 08 2400UI 10 7 \n02 34 09 1675UI 13 9 \n03 30 10 3000UI 7 4 \n04 36 10 2850UI 13 7 \n05 28 08 1200UI 10 7 \n06 37 08 3000UI 21 11 \n07 34 09 2700UI 8 6 \n08 \n       C1 \n      C2 \n32  \n09 \n12 \n \n2700UI \n3450UI \n \n13 \n12 \n \n10 \n1 \n09 32 06 1150UI 10 7 \n10 \n11 \n32 \n29 \n \n09 \n11 \n2475UI \n1650UI \n10 \n11 \n \n6 \n7 \n \n \nMédia± DP \n \n32,64±2,87 \n \n9,08± \n \n1,56 \n \n2354± 755,3 \n \n11,50±3,55 \n \n6,83± 2,62 \nLegenda: C1= primeiro ciclo e C2 = segundo ciclo de estimulação ovariana da \npaciente n0 08; DP=desvio-padrão. \n \n \n \n \n\n50 \n \n \n \n \n \nFigura 3 – Gráfico de amplificação por PCR em tempo real de cDNA obtido de \namostras de células da granaulosa murais de mulheres inférteis submetidas à \nreprodução assistida. As sequências de interesse para os genes da aromatase \ne da β-actina foram amplificadas, para análise da expressão gênica relativa.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLegenda: Delta RN = Variação da fluorescência detectada. \n“Cycle number” = número do ciclo de amplificação. \n \n \n\n51 \n \n \n \n \n \n \nFigura 4 -  Gráfico da curva de dissociação para o gene da β-actina, obtida por \nPCR em tempo real (SYBR Green), de amostras de cDNA de células da \ngranulosa de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n52 \n \n \n \n \n \n \nFigura 5 -  Gráfico da curva de dissociação para o gene da aromatase, obtida \npor PCR em tempo real (SYBR Green), de amostras de cDNA de células da \ngranulosa de mulheres inférteis submetidas à reprodução assistida.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n53 \nTabela 3 – Níveis absolutos de “Threshold Cycle” (Ct), em duplicata, obtidos por \nPCR em tempo real (SYBR Green), para a análise de expressão relativa do \ngene da aromatase (CYP19A1), normalizada ao da β-actina, em células da \ngranulosa luteinizadas murais de mulheres inférteis por fator tubáreo e/ou \nmasculino (grupo controle) em comparação à mulheres com endometriose \n(todos os estádios, ASRM) submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV \nou ICSI). Placenta como amostra de referência.  \nGRUPO \nCONTROLE \nCt                    \nAromatase \n(CYP19A1) \nCt                   \nβ-actina \nGRUPO \nENDOMETRIOSE \nCt \nAromatase \n(CYP19A1)  \nCt                     \nβ-actina \n01 27,6026 \n27,5947 \n22,5086 \n22,5086 \n01 27,1022 \n27,3753 \n24,5945 \n24,6631 \n02 26,0095 \n26,2485 \n19,9746 \n20,1802 \n02 26,6939 \n26,6903 \n20,9338 \n20,9338 \n03 23,9989 \n23,9763 \n20,2362 \n20,4424 \n03 30,1604 \n29,4138 \n24,6380 \n24,8973 \n04 20,8751 \n20,8211 \n18,0222 \n17,6097 \n04 32,6201 \n32,5394 \n24,4042 \n24,4951 \n05 26,4174 \n25,9648 \n21,5941 \n21,7820 \n05 29,7922 \n30,8459 \n26,5925 \n26,3038 \n06 27,0075 \n26,6059 \n21,4559 \n21,5778 \n06 30,0930 \n31,0035 \n24,3469 \n23,6951 \n07 26,2209 \n26,1272 \n20,2611 \n20,3337 \n07 21,5139 \n21,7205 \n19,0755 \n18,8909 \n08 29,5236 \n29,9585 \n23,6901 \n24,1536 \n08 \nC1 \n \nC2 \n \n26,5984 \n26,2491 \n31,0822 \n31,1929 \n \n21,4029 \n21,3561 \n24,0759 \n24,0364 \n \n09 \n \n10 \n \n30,1310 \n30,9116 \n23,3947 \n23,2563 \n \n26,2150 \n26,1182 \n21,1645 \n21,0101 \n \n09 \n \n10 \n \n0 \n0 \n28,1726 \n28,7905 \n \n32,9751 \n33,1153 \n23,0111 \n23,6560 \n \n11 29,0394 \n29,4491 \n23,1049 \n23,1579 \n11 27,8934 \n28,0277 \n18,5017 \n18,3280 \n \nMédia ± DP \n \n \n \n26,42± 2,836 \n \n \n \n21,69± 2,175 \n \nMédia ± DP \n \n \nMediana±DP\n \n \n26,07 ± 8,503 \n \n \n28,10± 8,503 \n \n23,71 ±3,745 \n \nPLACENTA \n \n \n17,209 \n17,041 \n \n20,0306 \n20,5047 \n   \n\n54 \n \nTabela 4  – Valores de expressão gênica relativa obtidos por PCR em tempo \nreal para o gene da aromatase (CYP19A1) após normalização ao da β-actina, \nem células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo e/ou \nmasculino, N=11 vs mulheres com endometrios nos graus mínimo/leve (N=5) e \nmoderado/grave (N=7) submetidas à r eprodução assistida (FIV ou ICSI). \nPlacenta como amostra de referência.  \n \n \nCt Aromatase \nCYP19          \n(Normalizado β-\nactina) \nPacientes N0 \n \nGrupo \nControle \n \nEndometriose \nMínima/Leve \n \nEndometriose \nModerada/Severa \n \nEndometriose \nTodos Estadios \n \n01 \n \n0,003324 \n \n0,003491106 \n \n0,003193491 \n \n0,003491106 \n02 0,001705 0,007739467 0,003431607 (C1) \n0,000836092 (C2) \n \n0,003431607(C1) \n0,000836092(C2) \n03 0,009031 0,001227637 0,000151505 0,001227637 \n04 0,013842 0,00040417 0,00209193 0,00040417 \n05 0,004994 0,01824127 0,018547904 0,01824127 \n06 0,002894  0,000000000 0,003193491 \n07 0,001927   0,007739467 \n08 0,002005   0,000151505 \n09 0,005534   0,00209193 \n10 0,02400   0,018547904 \n11 0,001636   0,003193491 \n12    0,000000000 \nMédia ±DP 0,006445± \n0,006932 \n0,006221± \n0,007298 \n0,004709± \n0,006900 \n0,005396± \n0,006762 \nMediana 0,003324 0,003491 0,002643 0,003193 \n \n Legenda: Ct= “Threshold cycle”. C1=1º e C2=2º ciclos de HOC da paciente 02 (endometriose \nmoderada/severa). \n \n\n55 \n \nTabela 5  – Valores de expressão gênica relativa obtidos por PCR em tempo \nreal para o gene da aromatase (CYP19A1) após normalização ao da β-actina, \nem células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo e/ou \nmasculino; (grupo controle, N=11) vs endometriose nos graus mínimo/leve \n(N=5) e moderado/grave (N=7) submetidas à reprodução assistida (FIV ou \nICSI). Como amostra de referência, aqui representado o próprio grupo controle \n(média do Ct absoluto).  \n \n \nCt Aromatase \nCYP19          \n(Normalizado β-\nactina) \nPacientes N0 \n \nGrupo \nControle \n \nEndometriose \nMínima/Leve \n \nEndometriose \nModerada/Severa \n \nEndometriose \nTodos Estadios \n \n01 \n \n \n0,7791 \n \n0,8182 \n \n4,3471 \n \n4,3471 \n02 0,3997 0,0947 0,8043 (C1) \n0,1960 (C2) \n \n0,8043(C1) \n0,1960(C2) \n03 2,1165 1,8139 0,4903 0,4903 \n04 3,2442 0,2877 0,7485 0,7485 \n05 1,1704 4,2752 0,0355 0,0355 \n06 0,6784  0,0000 0,0000 \n07 0,4517   0,8182 \n08 0,4700   0,0947 \n09 1,2971   1,8139 \n10 5,6248   0,2877 \n11 0,3835   4,2752 \n12     \nMédia ±DP 1,385± 1,609 1,458± 1,710 0,9460±1,534 1,159±1,555 \nMediana 0,7288 0,8182 0,4903 0,6194 \n \n \n \n \nLegenda: Ct= “Threshold cycle”. C1=1º e C2=2º ciclos de HOC da paciente 02 \n(endometriose moderada/severa).  \n \n \n \n\n56 \nGráfico 1 – Expressão gênica relativa,  por PCR em tempo real, da aromatase \n(gene CYP19A1) em células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com \nendometriose (todos estádios, N=12) vs. mulheres com fatores tubáreo e/ou \nmasculino de infertilidade (N=11), submetidas a técnicas de reprodução \nassistida. (p>0,05, Mann Whitney). Gráficos representam cálculos quando foram \nusadas como amostra de referência: a) placenta e b) média do Ct absoluto do \ngrupo controle.  Ct=”Threshold cycle” \n \na) \nControle\nEndometr\niose\n0.00\n0.01\n0.02\n0.03\nExpressão Relativa (cDNA) CYP19\n \n   b) \nCont\nrole\nEnd\nometr\niose\n0.0\n2.5\n5.0\n7.5\nExpressão Relativa (cDNA)\nCYP19\n \n\n57 \nGráfico 2 – Expressão gênica relativa, por PCR em tempo real, da aromatase \n(CYP19A1) em células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com \nendometriose vs. controle submetidas a técnicas de reprodução assistida. A \ncomparação foi realizada entre os grupos (1) controle (fator tubáreo/masculino; \nN=11); (2) endometriose leve e mínima (N=5); (3) endometriose moderada e \nsevera (N=7). (p>0.05, Kruskal-Wallis com correlação de Dunn). Gráficos \nrepresentam cálculos quando foram usadas como amostra de referência a) \nplacenta e b) b) média do Ct absoluto do grupo controle.  Ct=”Threshold cycle”.   \n \nControle\nEndom\netrio\nse min\n/lev\ne\nEnd\nom\netr\niose mod/sev\n0.00\n0.01\n0.02\n0.03\nExpressão Relativa (cDNA) CYP19\n \nb)\nContro\nle\nEnd\nom mi\nn/lev\nEndom mod/s\nev\n0.0\n2.5\n5.0\n7.5\nExpressão Relativa (cDNA)\nCYP19\n \na) \n\n58 \n6. DISCUSSÃO \n \nO foco do presente estudo foi a análise da atividade \nesteroidogênica nas células da granulosa em mulheres com \nendometriose. A análise da enzima ar omatase para esse propósito é \npertinente pelos motivos já descritos: 1) a importância dessa enzima na \ncélula da granulosa como ponto final  da esteroidogênese intrafolicular, \npois é a responsável por converte r os andrógenos a estrógenos, sem os \nquais não se conquista a maturação fo licular. E a maturidade folicular é \num dos principais determinantes da qualidade oocitária, já que é \nresultado de um complexo processo de sinergismo entre oócito e célula \nda granulosa em resposta às gonadotrofinas e ao IGF-1(MITWALLY; \nCASPER, 2002; 2004); 2) vários pes quisadores já apontaram defeitos \nespecificamente na aromatase, na s ua atividade e na expressão de seu \ngene, CYP19A1, principalmente nas  lesões de endometriose e no \nendométrio tópico de mulheres co m endometriose (BULUN et al., 1995; \nNOBLE et al., 1996; ZEITOUN; BULUN, 1999; NEME et al., 2001; \nBULUN et al., 2002; GURATES et al., 2003;  HEILIER et al., 2006). Nas \ncélulas da granulosa,  um grupo de pesquisadores (HARLOW et al., \n1996), através de estudos in vitro  por meio de cultivo de células da \ngranulosa luteinizadas coletadas em procedimentos de reprodução \nassistida, encontraram redução da at ividade da aromatase em mulheres \ncom endometriose mínima e leve e,  posteriormente, encontraram uma \nmenor sensibilidade dessas células ao LH (CAHILL et al., 2003). Abreu et \nal., 2005, como já descrito previament e, através de estudo que usou o \n\n59 \nmesmo modelo de cultivo de célula s da granulosa em mulheres com \nendometriose, também encontrou r edução na atividade da aromatase \nquando em níveis basais do cultiv o e no grupo onde foi adicionada \ntestosterona em sua menor concentração (2 x 10 -6M), mesma usada por \nHarlow et al. (1996).   \nEstes achados associados às evidências de que a endometriose é \numa doença com herança poligênica  (D’HOOGHE et al., 2003; \nCROSIGNANI et al., 2006), nos estimulou a estudar a expressão do gene \nda aromatase no mesmo tecido e pop ulação-alvo, as células da \ngranulosa luteinizadas murais, aqui não cultivadas, em mulheres com \nendometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida, por técnica \nde PCR em tempo real qua ntitativo. Porém, de acordo com os resultados \nobtidos, não foi encontrada diferença ent re os grupos (Gráficos 1,2).  \nEstes achados podem ter ocorrido devi do a três principais razões: 1) a \nalteração da qualidade oocitária nas mulheres com endometriose pode \nocorrer em algum dos pontos da ca scata esteroidogênica ovariana, \nporém antes da aromatase (sítio de conversão do  C21 a C19). De fato, \nestudos in vivo e in vitro sobre as relações hormonais intrafoliculares em \nfluido folicular e células da granulosa cultivadas de mulheres submetidas \ncom ciclos estimulados, apontam par a o fato de que a aromatase é uma \nenzima cuja ação se perpetua, me smo quando se têm os efeitos \nbloqueadores dos agonistas  do GnRH (DOR et al ., 2000; COSTA et al. \n2004; SILVA et al., 2008).  \nEm segundo lugar, exatamente a ação do análogo do GnRH em \nciclos de hiperestimulação ovariana controlada leva à redução dos \n\n60 \nandrógenos intrafoliculares tanto in vitro  quanto in vivo  (SILVA et al., \n2008). Esta redução androgênica,  que na verdade corresponde à \ndiminuição do substrato da aromatase, pode induzir a um mecanismo de \n“feedback” negativo ou “down-regulatio n” de seus receptors nessas \ncélulas, e talvez modificar a maneira  como ocorre a expressão de seu \ngene nesse tecido e 3) a aromatase par ece sofrer um controle refinado, \nprovavelmente por via de sinaliz adores moleculares, mecanismo ainda \nnão compreendido, porém muito pertinente, tendo em vista a importância \nfundamental dessa enzim a na determinação de um ambiente pró-\nestrogênico intrafolicular.  \nA existência das “gap-junctions” entre as células da granulosa \n(SPEROFF; FRITZ, 2005) e a existência de interação entre células da \ngranulosa e oócito, recent emente sinalizados através da identificação de \nmoléculas como o GDF-9 e o BM P-15 (HUTT; ALBERTINI, 2007) são \npistas de que o mecanismo e o processo de foliculogênese pode ser \nainda muito mais complexo e orques trado do que imaginamo s. E, ainda, \nque o oócito pode interferir nesse processo. \nOs mecanismos de modificaçõ es pós-transcricionais e \nepigenéticas são dois outros potentes c andidatos para se tentar explicar \npor que a atividade da aromatase pode estar reduzida, mas não sua \nexpressão gênica, neste tecido-alvo, as células da granulosa em \nmulheres com endometriose. Os mecanismo epigenéticos, através das \nligações proteínas-ácidos nucléicos representam um mecanismo de “liga-\ndesliga” da expressão gênica (NIEMANN et al., 2008) e a endometriose \npode ter um mecanismo epigenético de inibição da expressão gênica nas \n\n61 \ncélulas da granulosa que ainda se desconhece. As alterações pós-\ntranscricionais como alterações do re ceptor da aromatase nas células da \ngranulosa ou alterações bioquímica s em sua molécula que possam \nalterar a sua atividade, mas não s ua expressão gênica, é outra hipótese \nque precisa ser investigada. \nO próximo passo surgirá possive lmente a partir de possíveis \ncontribuições provenientes dos “micr oarrays” em oócitos e células da \ngranulosa, bem como o entendim ento do papel de cada subpopulação \n(célula da granulosa mural e do cumulus) na tentativa de esclarecer \nqual(is) via(s) se encontram mais afetadas nessa enigmática doença.  \nObviamente, a endometriose semp re precisará de uma avaliação \nparticularizada, pois apresenta uma ampla variedade de quadro clínico \n(VERCELLINI et al., 2007) e possi velmente um determinado fator ou via \netiopatogência envolvida em um a apresentação da doença pode não \nocorrer em outra. Especialmente s obre a questão da qualidade oocitária, \nos graus mínimo e leve parecem ter um comportamento completamente \ndiferente dos graus moderado e grav e (classificação ASRM), já que \napresentam taxas de infertilidade e de gestação espontânea também \ndiferentes (D’HOOGHE et al., 2003). Portanto, na endometriose, por seu \naspecto tão heterogêneo e complexo e também por ser uma das mais \nonerosas doenças em medicina repr odutiva, o auxílio da biologia \nmolecular, com uso dos recursos e avanços dos campos de estudo da \ngenômica e proteômica, se faz fundamental.   \nO presente estudo, devido às suas  limitações, principalmente em \ntermos de tamanho amostral reduzido e vieses de seleção, não permite \n\n62 \nque se possa chegar a uma conclusã o consistente s obre o assunto: \n“expressão gênica da aromatase nas cé lulas da granulos a em mulheres \ncom endometriose”, pelo contrário, apenas inicia este capítulo já que não \nse tem na literatura pesquisas sobre o tema, e estimula questionamentos \nque podem ser respondidos nos próximos estudos.        \nComo próximos passos ainda , além dos “microarrays”, a \nendometriose necessita de estudos compartimentalizados porém com \namostras maiores do que a utilizada no presente estudo. Ainda o estudo \ngenético populacional através dos polimorfismos de genes-alvo \nestratégicos como a aromatase tam bém é uma estrat égia fundamental \npara que avancemos em termos de compreensão da doença e \nintervenção terapêutica, que no caso da infertilidade e ednometriose, \napesar do importante passo com o adv ento das técnicas de reprodução \nassistida, os resultados apres entados ainda são insatisfatórios \n(BARNHART et al., 2002). \n \n \n \n \n \n \n\n63 \n7. CONCLUSÃO \n \nNo presente estudo, não foi obse rvada diferença significativa na \nexpressão do gene da aromatase (C YP19A1) nas células da granulosa \nmurais luteinizadas de mulheres com endometriose submetidas a \ntécnicas de reprodução assistida (FIV  ou ICSI), analisada através de \nPCR real-time quantitativo, quando co mparadas com mulheres sem a \ndoença.  \n \n \n \n \n \n \n\n64 \n8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS \n \nAbdalla H, Thum MY. 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Placenta como \namostra de referência. NA= não se aplica (amplificação nula para o gene da aromatase). C1=1º e C2=2º ciclos de HOC paciente 08.  \n \n\n78 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n Ct Comparativo          \n \nPaciente \nN0 \n \n \n \nAROMATASE \n(CYP19) \n \n \n \nMédia \n \n  \nDP \n \n \nβ-ACTINA \n \n \nMédia \n \n \nDP \n \n \n∆Ct \n \n  \nDP (∆Ct) \n \n \n∆∆Ct \n \n \n2-∆∆Ct \n01 27,6026 27,599 0,006 22,5086 22,509 0,000 5,090 0,0000 0,3600 0,7791 \n 27,5947   22,5086       \n02 26,0095 26,129 0,169 19,9716 20,076 0,148 6,053 0,0252 1,3231 0,3997 \n 26,2485   20,1802       \n03 23,9989 23,988 0,016 20,2362 20,339 0,146 3,648 0,0108 -1,0817 2,1165 \n 23,9763   20,4424       \n04 20,8751 20,848 0,038 18,0222 17,816 0,292 3,032 0,0433 -1,6979 3,2442 \n 20,8211   17,6097       \n05 26,4174 26,191 0,320 21,5941 21,688 0,133 4,503 0,0600 -0,2270 1,1704 \n 25,9648   21,782       \n06 27,0075 26,807 0,284 21,4559 21,517 0,086 5,290 0,0440 0,5599 0,6784 \n 26,6059   21,5778       \n07 26,2209 26,174 0,066 20,2611 20,297 0,051 5,877 0,0035 1,1467 0,4517 \n 26,1272   20,3337       \n08 29,5236 29,741 0,308 23,6901 23,922 0,328 5,819 0,1010 1,0892 0,4700 \n 29,9585   24,1536       \n09 30,131 30,521 0,552 26,215 26,167 0,068 4,355 0,1547 -0,3753 1,2971 \n 30,9116   26,1182       \n10 23,3947 23,326 0,098 21,1645 21,087 0,109 2,238 0,0107 -2,4918 5,6248 \n 23,2563   21,0101       \n11 29,0394 29,244 0,290 23,1049 23,131 0,037 6,113 0,0427 1,3829 0,3835 \n 29,4491   23,1579       \n        \nAmostra referência \nmedia Ct grupo controle 26,42 2,836  21,69 2,175 4,730 6,3868 0,0000 1,0000 \n           \n \n \nTabela 3 – Níveis de Ct (threshold cycle) comparativos entre os genes aromatase (CYP19A1) e β-actina obtidos por PCR em tempo real , para análise da \nexpressão gênica relativa em células da granulosa murais de mulheres com fatores tubáreo ou masculine de Infertilidade (grupo c ontrole) submetidas a \ntécnicas de reprodução assistida. Amostra de referência = média do Ct do próprio grupo controle (valor absoluto). \n\n79 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n Ct Comparativo          \nPaciente \nN0 \n \nAROMATASE \n(CYP19) \n \nMédia \n \n DP \n \nβ-ACTINA \n \nMédia \n \nDP \n \n∆Ct \n  \nDP (∆Ct) \n \n∆∆Ct \n \n2-∆∆Ct \n01 27,1022 27,239 0,193 24,5945 24,629 0,049 2,610 0,0198 -2,1201 4,3471 \n 27,3753   24,6631       \n02 26,6939 26,692 0,003 20,9338 20,934 0,000 5,758 0,0000 1,0283 0,4903 \n 26,6903   20,9338       \n03 30,1604 29,787 0,528 24,638 24,768 0,183 5,019 0,1562 0,2894 0,8182 \n 29,4138   24,8973       \n04 32,6201 32,580 0,057 24,4042 24,450 0,064 8,130 0,0037 3,4001 0,0947 \n 32,5394   24,4951       \n05 29,7922 30,319 0,745 26,5925 26,448 0,204 3,871 0,2984 -0,8591 1,8139 \n 30,8459   26,3038       \n06 30,093 30,548 0,644 24,3469 24,021 0,461 6,527 0,3135 1,7973 0,2877 \n 31,0035   23,6951       \n07 21,5139 21,617 0,146 19,0755 18,983 0,131 2,634 0,0192 -2,0960 4,2752 \n 21,7205   18,8909       \n08 \n     C1 26,5984 26,424 0,247 21,4029 21,380 0,033 5,044 0,0311 0,3142 0,8043 \n 26,2491   21,3561       \n     C2 31,0822 31,138 0,078 24,0759 24,056 0,028 7,081 0,0035 2,3514 0,1960 \n 31,1929   24,0364       \n09 0 0 0 32,9751 33,045 0,099 NA NA NA NA \n 0   33,1153       \n10 28,1726 28,482 0,437 23,0111 23,334 0,456 5,148 0,1994 0,4180 0,7485 \n 28,7905   23,656       \n11 27,8934 27,961 0,095 18,5017 18,415 0,123 9,546 0,0121 4,8157 0,0355 \n 28,0277   18,328       \n        \nAmostra referência \nmedia Ct grupo controle 26,42 2,836  21,69 2,175 4,730 6,3868 0,0000 1,0000 \n           \nTabela 4 – Níveis de Ct (threshold cycle) comparativos entre os genes aromatase (CYP19A1) e β-actina obtidos por PCR em tempo real , para análise da \nexpressão gênica relativa em células da granulosa murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assis tida. Amostra de \nreferência = média do Ct do próprio grupo controle (valor absoluto). NA= não se aplica (amplificação nula para o gene da aromat ase). C1=1º e C2=2º ciclos \nde HOC paciente 08.\n\n80 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nANEXO II \n \n \n \n \n \n \n\n81 \n \n \n\n\n82 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nANEXO III \n \n \n \n \n \n \n \n\n83 \n \n\n\n84 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nANEXO IV \n \n \n \n \n\n85 \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n \nEu,__________________________________________________________\n_____ abaixo assinado, tendo sido devidamente informada, através do \ndocumento “ESCLARECIMENTO AO SU JEITO DA PESQUISA” (anexo 2), \nsobre todas as condições da pesquisa  chamada “EXPRESSÃO DO GENE DA \nAROMATASE EM CÉLULAS DA GRANULOSA DE MULHERES COM \nENDOMETRIOSE SUBMETIDAS A TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO \nASSISTIDA”, que tem como pesquis adora responsável a pós-graduanda \nLauriane Giselle de Abreu e como orientador o Prof. Dr. Marcos Felipe Silva de \nSá, docente deste serviço; e conhecendo principalmente o objetivo da pesquisa, \nos procedimentos a que serei submetida por causa desta pesquisa, seus riscos \ne benefícios, a forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem \ncomo a forma de indenização por danos decorrentes do estudo, declaro que \ntenho pleno conhecimento dos direitos e das condições descritas abaixo:   \n \n1. A garantia de obter resposta a qualquer dúvida sobre os procedimentos que farei \ndurante a pesquisa, sobre os possíveis riscos que poderei sofrer pela participação \nna pesquisa, bem como os benefícios que este estudo poderá trazer; \n2. A liberdade de retirar o meu consentime nto e deixar de participar do estudo a \nqualquer momento, sem que isso traga prejuízo nenhum ao meu tratamento de \nreprodução assistida ou à sua continuidade; \n3. A segurança de que não serei identificada e que toda a informação sobre mim e \nmeu prontuário médico, bem como sobre a minha participação nesta pesquisa \nserão confidenciais; \n4. O compromisso dos pesquisadores de que serei informada sobre o andamento da \npesquisa, ainda que estes dados possam afetar a minha vontade de continuar \nparticipando do estudo; \n5. O compromisso de que serei devidamente acompanhada e que será prestada toda \na assistência necessária a mim durante o tempo em que estiver participando do \nestudo, bem como de que será garantida a continuidade do meu tratamento \nmesmo após o término da pesquisa. \n \nDeclaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que foram \napresentadas e que, livremente, manifesto a vontade de participar do referido \nprojeto. \n \nRibeirão Preto, ____ de _______________ de _______. \n \n \nAssinatura da paciente \n \n\n86 \nESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA \n \n1. TÍTULO DA PESQUISA:  \n“ Expressão do Gene da Aromatase em Células da Granulosa de Mulheres \nCom Endometriose Submetidas a Técnicas de Reprodução Assistida” \n \n2. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: LAURIANE GISELLE DE ABREU, \nCRM/SP NO 111.248 (Doutoranda USP/ RIBEIRÃO PRETO) \nEndereço: Av. Bandeirantes no 3900; laboratório de GO 1º. Andar; Hospital \ndas Clínicas/ FMRP/USP. Ribeirão Preto/SP;Telefones: (16) 3911-\n6840;8121-3017. \n \n3. ORIENTADOR: PROFESSOR DOUTOR MARCOS FELIPE SILVA DE \nSÁ \nContato: Av. Bandeirantes no. 3900; laboratório de GO 1º. Andar \nHospital das Clínicas/ FMRP/USP. Ribeirão Preto/SP. Telefone: (16)3602-\n2231 \n \n4. PROMOTORA DA PESQUISA: FMRP/USP. Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia. Av. Bandeirantes 3.900; HC 8o \nandar.Telefone: (16) 3602-2583  \n \nVimos, por meio deste documento, solicitar sua participação neste estudo.  \nA endometriose é uma doença causada pela presença de células da \ncamada interna do útero (endométrio) fora deste local. É uma causa freqüente \nde infertilidade em mulheres. \nAinda não se sabe exatamente por que a endometriose causa \ninfertilidade. Parece que as células da endometriose podem interferir no \namadurecimento do óvulo, dificultando sua fertilização. Tudo indica que esta \ninterferência ocorre porque a endometriose atrapalha a função do óvulo \nprejudicando uma enzima chamada aromat ase. Esta enzima é uma substância \nque as células do ovário chamadas células da granulosa produzem para ajudar \nna formação dos hormônios que os ovários necessitam. Sem estes hormônios o \nóvulo não amadurece.  \nEste trabalho vai pesquisar se as células da granulosa dos ovários das \nmulheres que têm endometriose estão realmente comprometidas e, portanto, \nproduziriam pouca aromatase.  \nExiste um gene que é responsável por comandar a produção da \naromatase e é este gene que pode estar com defeito na endometriose. \n\n87 \nAssim, o objetivo principal deste estudo é saber se existe alguma \nalteração na produção da aromatase comandada pelo seu gene nas células da \ngranulosa das mulheres que têm a doença endometriose.   \nDesta maneira, estamos propondo este estudo que constará de 2 grupos: (1) \ngrupo de pacientes sem endometriose e (2) grupo de pacientes com endometriose, \ntodas submetidas a técnicas de reprodução assistida (FIV - Fertilização in Vitro e \nICSI – Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide, ou seja, técnica em que se \ninjeta o espermatozóide dentro do óvulo). No final do estudo, realizaremos a \ncomparação entre estes dois grupos e checaremos se há diferença na maneira como \na aromatase é produzida pelo seu gene nas células da granulosa. \nParticipando deste projeto, você receberá o tratamento da mesma forma que \nas pacientes que não participam, com todos os exames e recursos disponíveis para \nmelhor atendê-la. A participação no estudo não causará nenhuma interferência no \nseu procedimento de reprodução assistida e, inclusive, você não precisará realizar \nnenhum procedimento além daqueles que serão normalmente programados para o \nseu processo de reprodução assistida. Isto porque o material que utilizaremos no \nestudo é um material que normalmente é desprezado após a coleta e separação do \nóvulo.  Desta maneira, pretendemos, com o seu consentimento, usar este material \ncontendo as células da granulosa para pesquisar sua produção de aromatase, como \njá foi exposto previamente. \nReforçamos que a importância deste estudo será tentar desvendar um \ndos possíveis motivos da infertilidade na endometriose, que é a análise do \nfuncionamento do óvulo nestas mulheres, através do estudo da aromatase. Os \nresultados desta pesquisa poderão no futuro propiciar o desenvolvimento de \nprocedimentos ou medicamentos que melhorem o tratamento de mulheres \ninférteis que têm endometriose.  \n Informamos que seu nome e seus dados pessoais não aparecerão no \ntrabalho ou em outro meio de informação, ou seja, o sigilo será mantido. \nAlém disso, a qualquer momento você poderá solicitar sua saída do \ntrabalho, se assim desejar, sem nenhum prejuízo à continuação de seu \ntratamento neste serviço. Ficamos à disposição para esclarecer todas as \ndúvidas que surgirem, inclusive sobre o andamento da pesquisa e seus \nresultados.          \n           \n Atenciosamente,  \n        Os pesquisadores. \n\n88 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nANEXO V \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n89 \n \n\n90 \n \n\n1 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nPAPER \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n2 \n \n \n \n \n \n \n Quantitative aromatase gene expression (CYP19A1) is not altered in \nmural lutein-granulosa cells of women with endometriosis \nundergoing assisted reproduction techniques – pilot study \n \n \n \n \nAuthors: \nLauriane Giselle de Abreu\n1 \nVanessa da Silva Silveira 2 \nCarlos Alberto Scrideli3 \nEster Silveira Ramos3 \nRosana  Maria dos Reis3 \nRui Alberto Ferriani3 \nMarcos Felipe Silva de Sa’ 3 \n \n1 MD; 2 BS; 3 MD, PhD \n \nDepartment of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of \nRibeirão Preto, University of São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP, Brazil. \nAdress: Avenida Bandeirantes n\no 3.900, Hospital das Clínicas 1st floor, \nLaboratório de GO.Monte Alegre, Ribeirão Preto, SP, Brazil. Zip code: \n14.149-900.  \n \nCorresponding author: \n \nLauriane Giselle de Abreu, MS, MD. \nEmail: laurianegiselle@yahoo.com.br; lauriane@usp.br \n \n \n\n3 \nAbstract \n \nMost of women diagnosed with endometriosis present fertility disturbances. \nHowever, mechanisms remain unclear, leading suspicion of a multifactor and \ngenetic-based character of this disease. Compromised oocyte quality and \naromatase rise as major candidates. Aromatase is the endpoint of follicle \nsteroidogenesis cascade and undoubtedly, essential to reach an adequate egg \nquality. Studies have showed disruption of its gene (CYP19A1) on topic and \nectopic endometrium in endometriosis and al so a reduction of its activity by in \nvitro studies on granulosa cells of women with this disease. Scarcity of molecular \nstudies assessing aromatase on these target cells in endometriosis stimulated \nthis research. The aim of this study was to quantify aromatase gene expression \nin mural lutein-granulosa cells of women with endometriosis undergoing assisted \nreproduction techniques (ART, IVF or ICSI). Methods: a case-control study was \nconducted on 11 women with endometriosis (all stages, ASRM criteria) and 11 \nwomen with male or tubal causes of infertility undergoing ART. There was no \ndifference between the groups regarding age, amount of gonadotrophins used, \ndays of induction, follicles and eggs collected. Mural lutein-granulosa cells were \nharvested from pre-ovulatory follicles during oocyte retrieval and properly \nisolated. After cells lyses and storage into Trizol LS Reagent®, RNA extraction \nand cDNA synthesis were performed. Quantification of relative gene expression \nfor CYP19A1 (aromatase) was performed by real time PCR, using SYBR Green \nreagents. All experiments were carried out in duplicates. Results: there was no \ndifference between the groups in the quantitative gene expression of CYP19A1 \n(aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells (p>0.05, Mann Whitney), even \nif we consider separately the different grades of endometriosis (control vs. \nminimal/mild vs. moderate/severe, p>0.05, Kruskall Wallis). These results \nsuggest that this enzyme, aromatase, may have a complex and refined control of \nits gene expression on this population of granulosa cells, and despite of previous \nevidences showing its reduced activity  on them in endometriosis, the gene \nexpression per se may not be affected by the disease. \n \nKey-words: aromatase, CYP19A1, lutein-g ranulosa cells, edometriosis, \nassisted reproduction techniques, gene expression, real-time PCR. \n \n \n \n\n4 \nIntroduction \n \nFertility disturbances occur in up to 60% of women with \nendometriosis, (Wheeler JM, 1989; Cornill ie et al., 1990; Schenken et al., \n1996; D’Hooghe et al., 2003), one of t he most costly diseases in \nreproductive medicine (Gao et al., 2006). Undoubtedly, infertility treatment \nfor endometriosis reached an impor tant step forward through \nestablishment of assisted reproduction techniques; but outcomes are still \nunsatisfactory, revealing impaired  pregnancy and lowe r implantation and \nfertilization rates in comparison to tubal and male factors of infertility \n(Barnhart et al., 2002). This observation strongly suggests an \nethyopatogenic mechanism still unknow n which interferes in the \nreproductive process. A strong candida te is compromised oocyte quality \n(Simon et al., 1994; Harlow  et al., 1996; Pellicer et al., 1998a,b; Garcia-\nVelasco et al., 1999; Garrido et al, 2002; Cahill et al, 2003).   \n Studies using women oocyte donation model provided \nimportant clinical evidence when pointed out impairm ent of oocyte and \nembryo’s quality in association wit h endometriosis (Simon et al., 1994; \nGarcia-Velasco et al., 1999; Diaz et  al., 2000; Garrido et al., 2002). But \npoor embryos are derived from poor  oocytes, possibly derived from \ninappropriate folliclegenesis (Garrido et al., 2002). Achieving a successful \nfolliculogenesis involves not only a complex cross-talk between granulosa \ncells and the oocyte, as well as a favorable esteroidogenic environment \ninside the follicle (Alb ertini & Barrett, 2003; Cost a et al., 2004; Combelles \net al., 2004; Hutt & Albertini; 2007).   \n\n5 \nAromatase plays an essential role  on both tasks, this enzyme has \na known synergistic action to gonadotrophins and also it is the endpoint of \nthe whole intrafollicle steroidogeni c cascade (Speroff & Fritz, 2005). \nActually it is the only one inside it which is capable to convert an \nunwanted androgenic follicle to the idea lly estrogenic follicle, ready to \novulate (Simpson et al., 2002; Cost a et al., 2004; Bulun et al, 2004; \nSperoff & Fritz, 2005).  Aromatase has showed an erratic behavior in \nendometriosis: its elevated gene expression have been detected mainly in \nendometriosis’ lesions and also in topic endometrium of women \ndiagnosed with the disease (Noble et  al., 1996; Zeitoun & Bulun, 1999; \nKitawaki et al., 2002; Brosens et al., 2004; Bulun et al., 2002, 2004, 2005; \nHeilier et al., 2006; Matsuzaki et al., 2006). In granulosa cells, in vitro  \nstudies pointed out an impairment of aromatase activity on these cells in \nwomen with endometriosis (Harlow et al., 1996; Abreu et al, 2006). Also, \nhigher apoptosis (Toya et al., 2000)  and impaired progesterone function \n(Cahill et al., 2003) have been det ected on them. Moreover, \nendometriosis has been accepted as a genetic-based disorder (Fang et \nal., 2002; Attar & Bulun, 2006) and polymorphisms of its gene (CYP19A1) \nhave been associated with increased risk of this disease (Arvanitis et al., \n2003).  \nAssociation between aromat ase gene disturbances and \nendometriosis discussed above and the importance of aromatase per se \nover oocyte quality establishment, bes ides the fact that its gene \n(CYP19A1) has a complex tissue spec ific regulation (Meinhart & Mullis, \n2002; Simpson et al., 2002; Shozu et al, 2003; Bulun et al., 2004; 2007), \n\n6 \nrise the importance of a quantitative study of aromatase gene expression \nof granulosa cells for this disorder. The aim of the present study was to \nmeasure quantitatively t he aromatase gene (CYP19A1) expression by \nreal-time PCR in mural lutein-g ranulosa cells of women with \nendometriosis in comparison to those without the disease, submitted to \nassisted reproduction techniques (In Vitro Fertilization, IVF or \nIntracytoplasmic Sperm injection, ICSI). \n \nMaterials and Methods \nThe study was conducted on 22 patients, 11 with endometriosis \n(12 ovarian hyperstimulation (HOC ) cycles) and 11 with male or tubal \nfactors of infertility (11 HOC cycles), submitted to IVF or ICSI from august \n2006 to march 2007 in a tertiary center  for infertility treatment (Clinics \nHospital at Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, \nRibeirão Preto, SP, Brazil). It was approved by the hospital’s ethics \ncommittee and by the Brazilian Nati onal Commission for Research Ethics \nand each patient signed an inform consent. \nAll women had regular menstrual cycles and normal follicle-\nstimulating hormone (FSH) levels for the reproductive period (3rd day of \nthe cycle) <15 IU/l). There was no difference between the groups with \nregards to age: (34.73 ± 3.90) for control group vs. 32.64 ± 2.87 for \nendometriosis; amount of gonadotrophi ns administered (2502 ± 786.30 \nvs. 2354 ± 755.3), days of ovarian inducti on (9.00 ± 1.55 vs. 9.08 ± 1.56), \nnumber of follicles punctioned (11.18 ± 5.51 vs. 11.50 ± 3.55 and oocytes \nretrieved (5.82 ± 2.90 vs. 6.83 ± 2.62), p>0.05, unpaired t test. Women \n\n7 \nwith endocrine diseases (including polycystic ovarian syndrome) and \nthose older than 40 years were excluded. \nIn endometriosis group, 5 pati ents had minimal/mild and 6 had \nmoderate/severe grades of  the disease (one submitted twice to ovarian \nstimulation for ICSI), according to American Society of Reproductive \nMedicine criteria (Fertil Steril 67:817–21, 1997). \n.All women were submitted to controlled ovarian hyperstimulation \nwith hMG, 150 to 400 IU/day, during th e first 6 days; a fter that, daily \ndoses were adjusted in an individual basis, according to follicular growth. \nHypophysis desensitization was done through long protocol using \nleuprolide acetate 10 IU /day, administered subcut aneously, or nafareline \n400 mg/day, by nasal administration. When at least two follicles reached \n17 mm in diameter, recombinant hCG (250 mg, subcutaneous) was \nadministered and oocytes were retrie ved 34–36 h later by vaginal route \nwith ultrasound guidance. \n \nHuman mural granulosa-lutein cells Isolation protocol \nIsolation procedure of granulosa ce lls was based on Chang et al. \n(2005) protocol, with few modifications as described below: \nMural lutein-granulosa cells were collected from pre-ovulatory \nfollicles during oocyte retrieval for IVF or ICSI. We used at least one \nfollicle aspirate (i.e. material fr om one single 15 ml aspiration  tube \ncontaining follicular fluid + mural lutein-granulosa cells + at least 1 \ncumulus-oocytes complexes derived from 1 to 2 mature follicles ( ≥17 mm \ndiameter), without visual blood contamination. Afte r follicular aspiration, \n\n8 \nthe cumulus-oocytes complexes from  the tube were separated and mural \ngranulosa cells were flushed and wa shed in HTF-M medium (Irvine \nScientific, Santa Ana, CA, USA), and centrifuged  for 10 min at 2500 rpm \nat 40C. The supernatant was discharged, the pellet was resuspended  in \n0.6 ml of HTF-M and transferred to new tube over surface of 4 ml of \nHistopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA) and centrifuged for 10 min \nat 1700 rpm at 4 0C, to separate red blood cells from human granulosa \ncells. Granulosa cells then formed a thin layer between Histopaque and \nmedium and these cells were collect ed carefully, flushed and centrifuged \nagain (10 min, 2500 rpm, 40C) in a new tube with 2 ml of HTF-M medium.  \nAfter the supernatant was discharged, pellet now was resuspended in 500 \nml of PBS medium (Irvi ne Scientific) and divided in to 1,5 ml tubes, each \none containing  250 ml of cell sus pension and 750 ml of Trizol LS \nReagent (Invitrogen, Carl sbad, CA, USA). After cell lyses, these tubes \nwere stored at -80 0C until RNA extraction. All steps were performed on \nice and we followed care fully all the specificat ions for handling RNA and \nnucleic acid material. \n \nRNA Extration and cDNA synthesis \nTotal RNA was isolated with Triz ol LS Reagent (Invitrogen) \naccording to kit instru ctions and the RNA quality was confirmed by gel \nelectrophoresis. Total RNA was revers ely transcribed to to cDNA using \nthe High capacity cDNA archive kit (Applied Biosystems, Los Angeles, \nCA, USA).Quantitative Real-time PCR:  \n\n9 \nQuantitative real-tim e polymerase chain reaction (qPCR) was \nperformed on total cDNA from human mural lutein-granulosa cells \nspecimens. qPCR was performed using SYBR Green PCR Core reagents \n(Applied Bio-systems, Foster City, CA) and melting curve analysis, on an \nABI 7500 sequence detector (Applied Bi osystems, Los Angeles, CA). All \nexperiments were run in duplicate and data were normalized to β-actin \n(ACTB) expression levels. Sequences of interest were amplified using the \nfollowing primers: for aromatase CYP19A1 gene (F): \n5’CCTTgCCAATAgTgTCATCC3’ and (R) 5’TAgCCTggTTCTCTggTgTg \n3’; for housekeeping gene β-actin (F):5’ TCgTgATggACTCCggTgAC3’ \nand (R): 5’CgTggTggTgAAgCTgTAg3’ (Invitrogen).   \n \nStatistical analysis  \nFor Real-time PCR data, analysis was done by the 2\n-∆∆ Ct method, \nusing the GraphPad Prism 5.0 softw are (GraphPad Software Inc., San \nDiego, CA, USA). The Mann-Whitney test was performed to compare \ndifferences between two groups. For simultaneous comparison of 3 \ngroups, Kruskal-Wallis test with D unn's Multiple Comparison Test was \nused.  In all cases, the level of significance was set as 5% (p < 0.05).  \n \nResults \nWe found no difference  with regards to quantitative expression of \naromatase gene (CYP19A1) on mural lutein-granulosa cells of women with \nendometriosis in comparison with women presenting male or tubal causes of \ninfertility, submitted to assisted reproduction techniques (Table 1; Figures 1, 2). \n\n10 \n \nTable 1 - Ct values from real time PCR (SYBR Green) for aromatase \ngene (CYP19A1) expression analysis normalized to β-actin on mural \nlutein-granulosa cells of women with male or tubal factors of infertility \n(N=11); endometriosis grades minimal/mild (N=5) and endometriosis \nmoderate/severe (N=7); undergoing assi sted reproduction (IVF or ICSI). \nEndometriosis classified by ASRM cr iteria. Data showed as relative \nexpression (2 -∆∆Ct). Ct= Threshold cycle. C1= 1 st and C2 = 2 nd ovarian \nstimulation cycle (HOC) of women 02 from the moderate/severe \nendometriosis group. N refers to ovarian hyperstimulation cycles. \n \nAromatase Ct \n(normalized to       \nβ-actin) \n \nControl \ngroup \n \nMinimal/Mild \nEndometriosis \n \nModerate/ \nSevere \nEndometriosis \n \nEndometriosis\nAll stages \n \n01 \n \n \n0.7791 \n \n0.8182 \n \n4.3471 \n \n4.3471 \n02 0.3997 0.0947 0.8043 (C1) \n0.1960 (C2) \n \n0.8043(C1) \n0.1960(C2) \n03 2.1165 1.8139 0.4903 0.4903 \n04 3.2442 0.2877 0.7485 0.7485 \n05 1.1704 4.2752 0.0355 0.0355 \n06 0.6784  0.0000 0.0000 \n07 0.4517   0.8182 \n08 0.4700   0.0947 \n09 1.2971   1.8139 \n10 5.6248   0.2877 \n11 0.3835   4.2752 \n12     \nMediana 0.7288 0.8182 0.4903 0.6194 \n\n11 \n \nFig 1 - Aromatase gene (CYP 19A1) expression by real time PCR on \nmural lutein-granulosa cells of wo men with endometriosis vs. controls \nundergoing assisted reproduction te chniques. Comparison between the \ngroups: Control (tubal or male ca uses of infertility, N=11); (B) \nendometriosis minimal/mild (N=5); (C) endometriosis moderate/severe \n(N=7). No difference was found betw een the groups (p>0.05, Kruskal \nWallis with Dunn’s multiple comparison test). Data are showed as relative \nexpression, normalized to β-actin. N refers to ovarian hyperstimulation \ncycles. \n \n \nCo\nntro\nl B C\n0.0\n2.5\n5.0\n7.5\nRelative Gene Expression for\nAromatase (CYP19A1)\n \n \n \n\n12 \n \n \nFig 2 - Fig 1 –Aromatase gene expre ssion by real time PCR on \nmural lutein-granulosa cells of wom en with endometriosis (all stages, \nN=12) vs. controls (tubal or male c auses of infertility, N=11) undergoing \nassisted reproduction techniques. No difference was found between the \ngroups (p>0.05, Mann Whitney test).  Data are showed as relative \nexpression, normalized to β-actin. N refers to ovarian hyperstimulation \nnumber. \n \nControl\nEn\ndome\ntriosis\n0.0\n2.5\n5.0\n7.5\nRelative Gene Expression for\nAromatase (CYP19A1)\n \n \n \n\n13 \nDiscussion \nAssessment of oocyte quality is still one of the major challenges in \nreproductive medicine, even though it is determinant factor to success \nrates of assisted reproduction tec hniques (Abdalla & Thum, 2004). The \naging process and diseases as is the case of endometriosis clearly \naffects egg quality (Garrido et al., 2002; Abdalla & Thum, 2004), but how? \nWhich mechanism (s)? \n  For endometriosis, the scenario of controversies is even worse, \nwhich begins in the ethiopathogeny of  the disease and goes through its \nclassification and treatment. The focus of this study was to investigate the \noocyte quality as one ethyopathogenic me chanism of infertility associated \nto endometriosis. Oocyte quality is gu ided by folliclegenesis, and poor \noocytes are in fact derived from inappr opriate folliclegenesis (Erickson et \nal., 1989; Garrido et al., 2002; Speroff & Fritz, 2005). Aromatase, as \nalready discussed above, is a key en zyme for the folliclegenesis process \nand its steroidogenic cascade, wh ich converts and unfavorable \nandrogenic environment to an estrogenic pre-ovulatory follicle, even in \nstimulated cycles under influence of  GnRH analogues (Erickson et al., \n1989; Dor et al. 2000; Costa et al., 2004;  Speroff & Fritz, 2005; Silva et \nal., 2008).  \n  In this study, if we consider the whole group of endometriosis (all \nstages), no difference was observed with regards to aromatase gene \n(CYP19A1) expression on mural lute in-granulosa cells of women with \nendometriosis in comparison to controls. In a previous study (Abreu et al., \n2006), we’ve found reduced in vitro aromatase activity (estradiol \n\n14 \nproduction under in vitro testosterone supplementation) in the same target \ncells and women. Both basal produc tion of estradiol and also its \nproduction after testosterone supplement ation on its lowest  concentration \nused in the study (2x10 -6M), showed an impairment of aromatase activity \nin endometriosis women in comparis on to control group. When we added \nhigher concentration of testosterone, this phenomenon didn’t occur. Costa \net al (2004) also have showed, through granulosa cells  culture from \nwomen submitted to stimulated cycles for ART, without GnRH analogues; \nthat follicles containing mature eggs had higher \nProgesterone/Testosterone (P/T), Progesterone/Estradiol (P/E) and \nEstradiol/Testosterone (E/T) ratios in the follicular fluid than the immature \nones. This finding suggests a defect on immature eggs located mainly in \nthe conversion C21 to C19 steroids, but not in the aromatase. Silva et al. \n(2008) analyzed the same relations between  steroids in follicular fluid of \ninfertile women submitted to stimul ated cycles for ART, but now using \nGnRH analogues, an agent that would primarily affect aromatase activity. \nActually aromatase function was kept intact in this study, despite of GnRH \nanalogues. The main effect of GnRH observed on these steroids relations \nwas a beneficial reduction of androgens , which is compatible with the \nbetter results for ART in stimulated cycles when these agents are \nadministered.  \nFrom the background of these st udies assessing granulosa cells \nbiology, we can observe that aromat ase function was always kept intact, \nunderstandable fact considering its critical role on follicle steroidogenesis. \nHowever, this evidence also lead us to hypothesize how complex and \n\n15 \nrefined the control mechanisms of th is enzyme, aromatase, can be, \nprobably involving molecular signals we still don’t know.  \nThis refined control of aromat ase may be the main reason we \ndidn’t find difference in the present  study regarding its gene (CYP19A1) \nexpression on mural lutein-granulosa  cells of women with endometriosis. \nEven in this disease, where we do kn ow there is an oocyte compromised \nquality (Garrido et al., 2002), control of aromatase s eems to be still \nefficient for its gene expression. Ther efore, the mechanism of poor egg \nquality in endometriosis could be placed in other pathway or even in other \npoints of the steroidogenic cascade of the follicle, but is not related to \naromatase gene expression, according to the results of the present study.  \nPost-transcription modifications  and the epigenetic mechanism \nalso rise as strong candidate s for aromatase gene expression`s \ncontrolling pathways and need to be explored.   \nSome other points need to be discussed about endometriosis. \nEspecially for egg quality, minimal/m ild grades may have a completely \ndifferent behavior from moderate/severe grades. In this study, normalized \naromatase Ct mean from wom en with moderate and severe grades \nshowed a lower value than minimal/mild , but no statistic significance. In \nour previous study (Abreu et  al., 2006) when we studied in vitro  \naromatase activity through granulosa ce lls culture of the same target \nwomen, we’ve found similar result s. Harlow et al. (1996) have \ndemonstrated reduced aromatase acti vity in granulosa cells studying \nminimal/mild grades of the disease.  Considering these findings, the \ndivision of endometriosis into perit oneal, ovarian and deep endometriosis \n\n16 \ncould be particularly interesting to  understand if they have different \npathways affecting egg qua lity, since they have diffe rent clinical behavior \nand management (Kennedy et al., 2005).   \nSince there is a scarcity of stud ies looking at granulosa biology, \nresearchers should rely on molecular bi ology technologies, to clarify how \nthe signaling between granulosa mural cells-granulosa cumulus cells- \noocyte happens. For endometriosis, based  on results from our research, \nthe next step would be larger and co mpartmentalized studies focusing on \ndifferent endometriosis presentati ons as endometrioma, peritoneal and \ndeep endometriosis. Also, new res earch strategies as genetic \npopulational studies of polymorphisms (SNPs) in target genes could bring \nnew insights about this enigmatic  disease, since management of \nendometriosis with regards to infertilit y is still unsatisfactory (Barnhart et \nal., 2002).   \n \n \nReferences \n \nAbdalla H, Thum MY. An elevated basal FSH reflects a quantitative rather \nthan qualitative decline of the ovari an reserve. Hum Reprod;19(4):893-8, \n2004.  \n \nAbreu LG, Romão GS, Ferriani RA, Reis RM, Silva de Sá, MF, Moura \nMD. Reduced aromatase activity in granulosa cells of women with \nendometriosis undergoing assisted reproduction techniques. Gynecol \nEndocrinol; 22(8): 432–36, 2006. \n \nAlbertini DF, Barrett SL. Oocyt e-somatic cell communication. \nReproduction; 61:49-54, 2003. \n \nArvanitis DA, Koumantakis GE , Goumenou AG, Matalliotakis IM, \nKoumantakis, EE, Spandidos DA. CYP1A1, CYP19, and \nGSTM1polymorphisms increase the risk of endometriosis. 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