Influência de agentes antiangiogênicos (propranolol) em endometriose experimentalmente induzida em ratas

ZANARDI, J. V. C. Effect of anti -angiogenics drugs (propranolol) in experimentally induced endometriosis in rats. 2016. 83 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2016. Since endometrial implants rely on neovascularization to proliferate, in a similar way to metastatic tumors, it is proposed that angiogenesis represents an important step in the process of ad hesion, implantation, invasion and growth of ectopic endometrial cells. Th ese findings suggest that the suppression of the development of blood vessels by inhibition of specific angiogenic factors may be a new therapeutic opportunity in endometriosis appro ach. Studies demonstrate an antiangiogenic anticancer effect of propranolol in different types of tumors. This drug can play a role in the inhibition of neoangiogenesis, which could interfere on the growth of endometriotic lesions. The effect of propranolo l on markers of differentiation ( Metallothionein, MT1 and MT2), invasion (MMP9 and TIMP2), cell proliferation (PCNA) and apoptosis (CASP8 - caspase 8) was evaluated by immunohistochemical staining, a s well as the influence of propranolol on adhesion, motility and angiogenesis of both endometriotic lesions and endometrial tissue through quantification of relative expression (RQ) by real -time PCR o f the genes Vegf, Cald1 , Pcna, Tnf and Sparc. Thirty Wistar adult rats, females, virgins who underwent laparotomy for induction of endometriosis lesions were used. The rats were divided into three groups, and sacrificed after 14 days of low (BP, n = 10) and high dose treatment (AP, n = 10) of propranolol; and the control group (C, n = 10) , untreated. The lesions were excised for histological analysis with the contralateral uterine horn, with confirmation of the presence of glandular tissue and endometrial stroma. In the present study we observed a reduction in immunostaining for Metallothioneins, with 60% positive in the control group, in comparison to 10% and 11.1% for PA and PB, respectively (p <0.05). Furthermore, there was a decrease in expression of Pcna gene ( C = 1.04; PA = 0.32; PB = 0.69) which was statistically significant (p<0.05) . However, quantification of gene expression regarding other immunohistochemical markers evaluated both in the endometriotic lesions and uterine tissue showed no statistically significant difference. In conclusion, anti- angiogenic drugs like propranolol may offer new perspectives for the therapeutic approach of patients with endometriosis.

Endometriosis. Angiogenesis. cell proliferation. Apoptosis. Propranolol. Rats. LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Avaliação do Kappa de Cohen............................................................... 36 Tabela 2 - Comparações entre as variáveis relacionadas a imunohistoquímica..... 39 Tabela 3 - Concordância entre as variáveis da lesão e do útero em cada grupo..................................................................................................... 41 Tabela 4 - Comparação da expressão gênica de Pcna (Lesão) entre os grupos.................................................................................................... 43 Tabela 5 - Comparação da expressão gênica de Sparc (Lesão) entre os grupos.................................................................................................... 43 Tabela 6 - Comparação da expressão gênica de Cald1 (Lesão) entre os grupos.................................................................................................... 43 Tabela 7 - Comparação da expressão gênica de Tnf (Lesão) entre os grupos.................................................................................................... 44 Tabela 8 - Comparação da expressão gênica de Vegfa (Lesão) entre os grupos.................................................................................................... 44 Tabela 9 - Comparação da expressão gênica de Vegfa (Útero) entre os grupos.................................................................................................... 44 Tabela 10 - Comparação da expressão gênica de Tnf (Útero) entre os grupos.................................................................................................... 45 Tabela 11 Comparação da expressão gênica de Pcna (Útero) entre os - grupos.................................................................................................... 45 Tabela 12 - Comparação da expressão gênica de Sparc (Útero) entre os grupos.................................................................................................... 45 Tabela 13 - Comparação da expressão gênica de Cald1 (Útero) entre os grupos.................................................................................................... 46 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Rata submetida a laparotomia............................................................. 30 Figura 2 - Técnica de indução de lesão de endometrios e. Ressecado cerca de 4 cm do corno uterino direito seguido de sutura do coto proximal...... 31 Figura 3 - Corno uterino ressecado submetendo-se a preparo........................... 31 Figura 4 - Fragmento de corno uterino................................................................ 32 LISTA DE ABREVIATURAS ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas ACTB: Beta cytoskeletal actin ARS: Prof. Dr. Alfredo Arruda e Silva B2M: Beta-2-microglobulin BM: Membrana basal C2: grupo de ratas controle PA: grupo de ratas que receberam alta dose da droga propranolol CALD1: Caldesmon CALM2: Calmodulin 2(phosporilase kinase, delta) CASPASE 8: caspase 8 PB: grupo de ratas que receberam baixa dose da droga propranolol Cd; Cádimo cDNA: Ácido desóxi-ribonucléico CU: Cobre DAB: 3,3 diaminobenzina FMRP-USP: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo HE: Hematoxilina-eosina Hg: Mercúrio JZ: Mestre em Patologia Juliana Zanetti KDa: Kilodalton- unidade de massa molecular L: lesão MEC: Matriz extracelular MMPs: Metaloproteínases MT1 e MT2: Metalotioneinas ON: Osteonectina PBS: Tampão de solução salina PCNA: Antígeno nuclear celular proliferativo PCR: Reação em cadeia da polimerase PH: Potencial hidrogeniônico PPIA: Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase RNA: Ácido ribonucleico SPARC: Secreted protein acidic and rich in cysteine SNP: Polimorfismo nucleotídeo individual TBS: Tris buffered saline TIMPs: Inibidor tecidual de Metaloproteínases TNF: Fator de necrose tumoral TNFR: Receptor Fator de necrose tumoral-Receptor U: útero USP: Universidade de São Paulo UK: United Kingdom VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular Zn: Zinco LISTA DE SÍMBOLOS %: porcentagem g/L: grama por litro g: grama M: molar mg: miligrama mg/kg: miligrama por kilograma mL: mililitro mM: milimolar ng: nanograma ºC: graus Celsius µg: micrograma µL: microlitro SUMÁRIO 1 Introdução…………………………………………………………………..………… 18 2Justificativa..…………………………………………..…………………………... 24 3 Objetivos.....………………………………………………………………………….. 26 3.1 Objetivo geral................................................................................................... 27 3.2 Objetivos específicos…………………………………………………………….. 27 4 Metodologia…..................…………………………………………………………... 28 4.1 Aspectos éticos.................……………………………………………………….... 29 4.2 Técnica de indução das lesões de endometriose..………………………….... 30 4.3 Obtenção das lesões para análise histológica e molecular............................. 32 4.4 Protocolo de imunohistoquímica.........…………….……………………………... 33 4.5 Expressão gênica (extração do RNA total, síntese do cDNA, quantificação por PCR em tempo real..............................................…………………..…………. 34 4.6 Análise estatística.......……………………………………………………………... 35 5 Resultados..........................................………..………………………………..... 37 5.1 Caracterização dos grupos e perdas...........……………………………..……… 38 5.2 Imunohistoquímica..........................……………………………………………. 38 5.3 Expressão gênica............................................................................................. 42 6 Discussão………………………………………………………………………...…... 47 7 Conclusões..................……………………………………………………………… 55 Referências bibliográficas…………………………………………………........... 57 Anexo.................................................................................................................... 76 Apêndice............................................................................................................... 78 18 1. Introdução 19 A endometriose é definida pela presença de tecido endometrial, seja ele glandular ou estromal, fora da cavidade uterina, denominado endométrio ectópico (Farquhar, 2007). Afeta 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva (Dabrosin et al., 2002). A endometriose é considerada atua lmente um problema de saúde pública devido ao seu impacto na saúde física e psicológica, bem como ao impacto socioeconômico diante dos custos para o seu diagnóstico, tratamento e monitoramento (Gao et al., 2006; Signorile e Baldi, 2010; Nnoaham et al., 2012). A patogenia da endometriose ainda não pode ser compreendida por apenas uma hipótese. A presença de células epiteliais endometriais com características de adesão, implantação, crescimento e angiogênese no fluid o peritoneal (Kruitwagen et al., 1991), bem como a associação entre fluxo menstrual obstruído e o diagnóstico de endometriose corroboram para que a hipótese da menstruação retrógrada de Sampson seja a mais aceita . Entretanto, é importante salientar que apenas o refluxo tubário não é suficiente para estabelecer a doença, pois, 90% das mulheres possuem menstruação retrógrada e apenas 10 a 15% destas desenvolvem endometriose (Sampson, 1927; Olive e Henderson, 1987). Outras conjecturas são ampla mente discutidas, como a imunológica e metaplasia celômica. O aparecimento de endometriose em homens, mulheres que nunca menstruaram e pré -puberes, bem como em locais como as meninges e a cavidade pleural pode ser explicado pela metaplasia de células da li nhagem peritoneal. O surgimento de lesões de endometriose na pleura, cicatriz umbilical, espaço retroperitoneal, vagina e colo do útero pode ser explicado pela disseminação linfática e hematogênica de células endometriais (Ridley, 1968; Suginami, 1991; Braun et al., 2002; Chung, H. W. et al., 2002; Witz et al., 2002). O sistema imunológico também é de suma importância no desenvolvimento de endometriose, pois acredita -se que o endométrio ectópico possui a capacidade de promover uma resposta autoimune patológica devido a supressão de células do sistema imune e a imunovigilância debilitada de pacientes que desenvolveram endometriose (Lebovic et al., 2001; Siristatidis et al., 2006) A proliferação das células endometria is e a adesão ao peritônio podem ocorrer pela produção de citocinas inflamatórias por essas células endometriais ectópicas. As células endometriais, após a adesão, são induzidas principalmente 20 pelas enzimas metalopr oteinases de matriz (MMPs) a invadirem a matriz extracelular. Macrófagos locais produzem as interleucinas 1 e 8 (IL -1 e IL -8), que estimulam a produção de MMPs, facilitando o desenvolvimento de endometriose (Liu et al., 2015; Xin et al., 2015; Yang et al., 2015). Em seguida, o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de transformação do crescimento beta (TGF -β) produzidos por macrófagos, juntamente com IL -8 e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) estimulam a angiogênese, possibilitando o cresci mento de células endometriais e contribuindo para a manutenção do endométrio ectópico (Dela Cruz e Reis, 2015). A interleucina (IL) 1β, a IL -1 dominante secretada por macrófagos peritoneais ativados, desempenha um importante papel na neovascularização de lesões endometrióticas (Lebovic et al., 2000). Foi evidenciada a secreç ão de IL-6 e IL-8 de forma robusta por culturas de células do estroma endometrial humano de mulheres com endometriose (Rocha et al., 2012). IL-6 é uma proteína multifuncional potente, que promove a proliferação de células do endométrio e a angiogênese (Giudice et al., 1994; Cohen et al. , 1996) ; a sua secreção é elevada no tecido endometrial ectópico e as suas concentrações são elevadas no fluido peritoneal de pacientes com e ndometriose (Keenan et al. , 1994) . IL -8 é uma citocina pró -inflamatória q ue induz a quimiotaxia de neutrófilos e tem um efeito estimulador potente da angiogênese (Koch et al., 2001; Arici, 2002). A expressão e a secreção de IL -8 e VEGF, a partir de células estromais do endométrio humano é modulada pela Activina A. O endométrio humano é uma fonte e destino de Activina A, que é um membro da superfamília de fator de crescimento transformante β, com efeitos sobre a inflamação e a angiogênese (Florio et al. , 2007). VEGF é um dos fatores angio gênicos mais potentes e específicos. Os seus efeitos incluem a proliferação celular endotelial, migração, organização em túbulos, e permeabilidade melhorada, os quais participam na cascata angiogênica (Muller e Griesmacher, 2000). A expressão endometrial de VEGF é aumentada pelo estradiol e as suas concentrações estão correlacionados com a neovascularização e aumento da permeabilidade vascular durante a fase proliferativa tardia (Charnock-Jones et al., 2000). Alterações cíclicas na expressão de VEGF ao longo do ciclo menstrual são observados com expressão máxima durante a fase secretora e menstruação (Shifren et al. , 19 96; Charnock -Jones et al. , 2000; Mclaren, 2000) ; VEGF foi 21 observada no epitélio e em células do estroma de implantes de endometriose, sendo mais expresso no epitélio. Além disso, as células de endometriose podem sintetizar e secretar o VEGF (Shifren et al., 1996; Gargett e Masuda, 2010). Portanto a angiogênese também representa um importante passo nesse processo. Visto que, semelhante aos tumores metastáticos, implantes endometrióticos dependem de neovascularização para se estabelecerem, implantarem e invadirem (Fujishita et al., 1999; Taylor et al., 2002; Gescher et al., 2003). De fato, uma peculiar característica dos implantes endometrióticos são suas vascularizações densa s (Nisolle et al. , 1993) . Isso nos traz a ideia de que a supressão do desenvolvimento de vasos sanguíneos por meio da inibição de fatores angiogênicos específicos pode ser uma nova opo rtunidade terapêutica no tratamento da endometriose (Hull et al., 2003; Nap et al., 2004; Olive et al., 2004). O padrão ouro no diagnóstico de endometriose é a visualização direta de lesões por via laparoscópica, a companhada de confirmação histológica da presença de pelo menos duas das seguintes características: macrófagos contendo hemossiderina ou epitélio endometrial, glândulas ou estroma (Bulletins--Gynecology, 2000). As opções terapêuticas vigentes para o tratamento de endometriose in cluem cirurgia, tratamentos clínicos, e a associação de ambos. A opção a ser adotada depende de fatores como o estadiamento da doença, sintomatologia, a idade da paciente e desejo de concepção (Petta et al., 2009). As abordagens, no entanto, têm limitações significativas. Os tratamentos clínicos que atuam por meio de modulações hormonais (contraceptivos hormonais, progestágenos, anti-progestágenos, análogos e antagonistas do GnRH, e inibidores da aromatase) podem bl oquear a ovulação e culminam com um microambiente hipoestrogênico (Brown e Farquhar, 2014) . Logo, essa opção é inadequada para pacientes que possuem infertilidade associada à endometriose e que pretendam conceber normalmente (Dunselman et al. , 2014) . Além disso, pode haver significativa recidiva dos sintomas (Streuli et al. , 2013) e até 25% das pacientes terão efeitos secundários intoleráveis, ou resposta clínica insuficiente (Vercellini et al., 2009) . Possivelmente, lesões com fibrose extensa e eventuais distorções anatômicas s ão menos susceptíveis à modulação hormonal (Remorgida et al. , 2005). A intervenção cirúrgica é o tratamento de escolha para formas graves de 22 endometriose refratárias ao tratamento clínico, como endometriose profund a infiltrativa com acometimento intestinal sintomático, eventuais estenoses de ureter e grandes massas anexiais sintomáticas (Vercellini et al., 2009; Meuleman et al., 2011; Abrao et al., 2015). A remoção cirúrgica das lesões de endometriose profunda infiltrativa pode ser complexa e os resultados são altamente dependentes das habilidades e experiência da equipe cirúrgica. Uma recente meta -análise revelou que as taxas de complicações para a anastomose do intestino e m ressecção de lesões de endometriose foram de 2,7% de fístula reto -vaginal, de 1,5% para deiscência de anastomose e 0,34% para os abscessos pélvicos. As técnicas menos agressivas apresentaram taxas ligeiramente mais baixas, mas foram associadas com um aumento da recorrência, entre 5,8-17,6% (Meuleman et al., 2011). Portanto, em virtude da ausência de um tratamento que contemple melhora clínica significativa associada à possibilidade de gestação espontânea, sem que aumente os riscos ou a morbidade da paciente, compreende -se haver uma lacuna no tratamento de endometriose, e, por conseguinte, novas opções terapêuticas deverão ser aventadas. O propranolol é um antagonista competitivo dos receptores adrenérgicos beta-1 e beta -2. Foi um dos primeiros β -bloqueadores desenvolvidos para uso na clínica (Mak e Weglicki, 2004). O bloqueio competitivo do recep tor beta-adrenérgico foi demonstrado no homem através de um deslocamento paralelo para a direita da curva de resposta da frequência cardíaca aos beta -agonistas versus dose, tal como a isoprenalina (Black et al., 1965). Cloridrato de propranolol é uma mistura racêmica cuja forma ativa é o isômero S( -)-propranolol. Com exceção da inibição da conversão da tiroxina à triiodotironina , é improvável que qualquer propriedade adicional inerente ao isômero R(+) do propranolol desencadeie efeitos terapêuticos diferentes, em comparação com a mistura racêmica (Silber e Riegelman, 1980) . O propranolol é completamente absorvido após administração oral, e as concentrações plasmáticas máximas ocorrem entre 1 e 2 horas após a administração em pacientes em jejum (Routledge e Shand, 1979) . O fígado remove até 90% de uma dose oral, com uma meia -vida de eliminação de 3 a 6 horas. O propranolol é ampla e rapidamente distribuído pelo corpo, sendo que concentrações mais altas ocorrem 23 nos pulmões, fígado, rins, cérebro e coração. O propranolol apresenta um alto índice de ligação às proteínas plasmáticas (90-95%) (Shand, 1976). Há relatos de que β -bloqueadores como o propranolol possuem efeitos anticancerígeno em diferentes tipos de tumores (Glasner et al., 2010; Storch e Hoeger, 2010; Ji et al. , 2012; Xu et al. , 2013) . Também se observou o efeito antitumoral dos β-bloqueadores em sarcomas in vivo e in vitro (Ji et al., 2012; Stiles et al. , 2013) , diversos tumo res vasculares possuem receptores β -adrenérgicos (Chisholm et al., 2012). Por fim, Pasquier e colaboradores relataram a existência de um sinergismo entre quimioterapia e β -bloqueadores em câncer de mama e neuroblastoma, por mecanismos ainda não totalmente elucidados (Pasquier et al. , 2011; Pasquier et al., 2013). Em conjunto, tais a chados sugerem que o propranolol pode contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese, e tal efeito resultar em um impacto sobre as lesões de endometriose. A condução de estudos em endometriose que versem sobre a resposta clínica frente à intervenção medicamentosa requer métodos invasivos. E, portanto, para que novas opções terapêuticas sejam testadas lança -se mão de modelos animais definidos (Rosa-E-Silva et al. , 2010) . Modelos experimentais têm sido produzidos cirurgicamente em animais de pequeno porte, como coelhos, ratos e camundongos (Vernon e Wilson, 1985; Sharpe -Timms, 2002; Rosa-E-Silva et al., 2010). O modelo em roedores proposto por Jones é amplamente aceito (Jones, 1984). Com técnica cirúrgica simples, permite implantação com sucesso das lesões o que torna a indução de endometriose efetiva e reprodutível (Schor et al., 1999). Em face à sugestão de que o propranolol possa contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese e tal efeito resultar em um impacto sobre as lesões de endometriose, foi proposto o uso dessa droga em um modelo experimental consagrado (Jones, 1984; Vernon e Wilson, 1985; Schor et al., 1999; Sharpe -Timms, 2002; Rosa -E-Silva et al. , 2010) para a observação do comportamento de lesões de endometriose in vivo, com e sem tratamento, e aventar uma nova opção terapêutica clínica no tratamento de pacientes com endometriose. 24 2. Justificativa 25 A patogênese da endometriose necessita de atividade de neoangiogênese. A cascata angiogênica inclue a proliferação celular endotelial, migração, organizaçã o em túbulos, e permeabilidade melhorada, regulada por fatores de crescimento e citocinas, e regulação metabólica em que intervém agentes estimuladores e inibidores da matriz intersticial tumoral. Drogas com ação de inibição angiogênica devem ter efeito sobre as lesões endometrióticas experimentalmente induzidas. 26 3. Objetivos 27 3.1 Objetivo geral Avaliar o efeito do propranolol sobre endometriose experimentalmente induzida em ratas. 3.2 Objetivos específicos Avaliar a influência do propranolol e seu efeito antiangiogênico sobre o útero e lesões de endometriose experimentalmente induzidas: 1) Investigar o comportamento de marcadores de diferenciação (MT1 e MT2 – Metalotioneínas 1 e 2 ), invasão (MMP9 – matrix metallopeptidase 9 e TIMP2 – metallopeptidase inhibitor 2 ), proliferação (PCNA- proliferating cell nuclear antigen ) e apoptose celular (CASP8 – caspase 8 ) por imunohistoquímica; 2) Avaliar a expressão de genes envolvidos em adesão e motilidade (Cald1 – caldesmon 1), angiogênese (Vegfa – vascular endothelial growth factor A e Sparc – secreted protein acidic and cysteine rich ), regulação da proliferação celular, indução de apoptose e resposta inflamatória ( Tnf – tumor necrosis factor ) nas lesões de endometr iose e útero por PCR em tempo real de ratas submetidas ao tratamento. 28 4. Metodologia 29 4.1 Aspectos éticos Após uma vasta revisão da literatura sobre o tema e aprovações pela Comissão de Pesquisa do Departamento de Gineco logia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (protocolo nº 339/2011) e pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (protocolo 183/2011), foram solicitadas as ratas e aplicado o modelo técnico -cirúrgico para indução de lesões de endom etriose (Jones, 1984; Vernon e Wilson, 1985; Schor et al., 1999; Sharpe-Timms, 2002; Rosa-E-Silva et al., 2010). O estudo foi realizado no Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Departamento de Patologia e Med icina Legal e Setor de Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP - USP). Foram utilizadas trinta ratas Wistar, virgens, da mesma ninhada, de aproximadamente 250 g no início do experimento, idade de qu arenta e nove dias, provenientes do Serviço de Biotério do Campus Universitário de Ribeirão Preto. Tais ratas, mantidas em ad libitum (livre acesso à água e ração Nuvilab CR1 autoclavável), inicialmente permaneceram por sete dias para ambientarem -se em gaiolas metabólicas (41 cm x 32 cm x 17 cm) sob controle de umidade e temperatura (22º a 25°C) e regime de luz com ciclo claro -escuro de 12/12 horas. Após este período, os grupos, descritos abaixo, foram submetidos à laparotomia para indução da lesão de endometriose. Os animais foram alocados em 3 grupos de 10 animais divididos da seguinte forma: Grupo C (controle, n=10): ratas com endometriose induzida experimentalmente e sem tratamento da droga no pós-operatório. Grupo PB (propranolol baixa dose, n=10): rata s que receberam diariamente droga propranolol em baixa dose (0,05 mg/Kg) por 2 semanas após 4 semanas da cirurgia para indução das lesões. Grupo PA (propranolol alta dose, n=10): ratas que receberam diariamente droga propranolol em alta dose (0,1 mg/kg) po r 2 semanas após 4 semanas da cirurgia para indução das lesões. 4.2 Técnica de indução das lesões de endometriose 30 A indução da lesão de endometriose foi realizada após injeção intramuscular com 1 ml de Xilazina 2 mg/mL (Dopaser, Hertape Calier), e 1 ml cloridrato de cetamina 10% (Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional AS, Uso veterinário), sendo 0,15 unidades para cada 100 g de peso do animal. A figura 1 representa as estruturas observadas no momento da laparotomia. Figura 1 – Rata subme tida a laparotomia. Identificação de estruturas. A: ovário; B: trompa uterina; C: útero (lobo esquerdo); D: cérvix uterino; E: gordura abdominal: F: fígado; G: cécum; H: intestino delgado. Após anestesia, foi realizado tricotomia pélvica, seguida dos cuid ados de antissepsia com lavagem das luvas de látex com soro fisiológico para redução da formação de aderências. Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo pesquisador. A cavidade pélvica foi aberta com incisão longitudinal mediana de aproximadamente 2 cm, sendo a 2 cm do púbis do animal. Posteriormente, ressecado cerca de 4 cm do corno uterino direito seguido de sutura do coto proximal. A porção uterina dissecada foi imersa em soro fisiológico 0,9% a 4°C por cerca de 2 minutos e então incisada longi tudinalmente, sendo retirado dois fragmentos de 5 x 5mm. Estes fragmentos de tecido endometrial foram suturados ao peritônio próximo ao trato reprodutivo da rata utilizando fio Vicryl 6.0 com a face endometrial livre voltada para a cavidade abdominal, send o um fragmento suturado 31 a direita e outro a esquerda, com posterior fechamento da incisão cirúrgica. Nenhuma suplementação hormonal ou antimicrobiana foi administrada antes ou após a laparotomia. Figura 2 – Técnica de indução de lesão de endometriose. Re ssecado cerca de 4 cm do corno uterino direito seguido de sutura do coto proximal. 32 Figura 3 – Corno uterino ressecado submetendo -se a preparo. Corno uterino ressecado submetido a incisão longitudinal e 2 fragmentos de 5mm x 5mm são suturados ao peritôni o em cada lado da parede abdominal com a face endometrial voltada para a cavidade Figura 4 – Fragmento de corno uterino. Fragmento de corno uterino que será suturado ao peritônio pélvico com a face endometrial voltada para a cavidade peritoneal. 33 4.3 Obtenção das lesões para análise histológica e molecular Quatro semanas após a cirurgia, tempo necessário para a implantação da lesão (Rosa E Silva, 2004; Rodriguez -Romaguera et al., 2009), os grupos de estudo receberam diariamente a injeção intraperitoneal de propranolol ( PB = 0,05mg/Kg ou PA = 0,1mg/kg) por 2 semanas, sendo então eutanasiadas. O grupo controle foi eutanasiado após estas quatro semanas de seguimento inicial. Ao término do protocolo, as ratas foram e utanasiadas e realizado o inventário da cavidade abomino -pélvica, identificando e documentando as lesões. Após esta etapa, as lesões de endometriose foram excisadas para análise histológica e molecular. As ratas foram pesadas após 4 semanas, e a cada seman a de droga administrada, fizemos o ajuste de dose da medicação conforme estabelecido previamente pelo protocolo dose/peso. Os tecidos retirados foram divididos ao meio, sendo que metade seguiu o protocolo para técnicas de Imunohistoquímica e a outra metade foi incluída em RNA later Solution (Ambion, par number AM7020) e após 24hs à 4 C, o tecido foi armazenado à -80C para posteriores análises de expressão gênica. 4.4 Protocolo de Imunohistoquímica A parte extraída destinada à avaliação imunohistoquímica foi fixada em formol 10%, processada para inclusão em parafina e corada por hematoxilina e eosina (HE) com objetivo de identificar a presença de lesões compatíveis com endometriose e posterior realização de Imunohistoquímica. Foram realizados cortes histológicos com 4 a 5µm. Os cortes foram desparafinizados em xileno e desidratados em uma série de álcoois. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada em uma solução contendo 0,3% de peróxido de hidrogênio por 30 minutos. Os cortes foram submetidos à recup eração antigênica com tampão de citrato a 10 mM e colocados em panela a vapor por 40 minutos e, logo após, as amostras foram resfriadas por 30 minutos em temperatura ambiente e incubadas a 4º C overnight com o anticorpo primário. Aplicado o protocolo de sequências conforme o Kit Mach 4: - Primeiro dia: recuperação antigênica: Tampão citrato pH 6.0, 35 minutos, lavagem com Tris Buffered Saline -TBS, bloqueio da peroxidase endógena 10 34 minutos, lavagem com TBS por 5 minutos, bloqueio da proteína BSA 2% por 1 0 minutos, lavagem com TBS e incubação com anticorpo primário overnight; - Segundo dia: lavagem, incubação no pós primário por 30 minutos, lavagem com TBS por 3 minutos, incubação no polímero por 30 minutos, lavagem com TBS e aplicação de DAB (3,3 diaminobenzina). Os anticorpos utilizados neste estudo, suas diluições e respectivas marcas foram: PCNA (1:500, PC10:SC -56, Santa Cruz Biotechnology, INC), CASP8 (1:100, clone 11B6, Novacastra Laboratories, United Kingdom), MTs (1:100, clone E9, Dako, USA), TIMP -2 (1:100, 3A4, Novacastra Laboratories, United Kingdom), MMP -9 (1:100, 15W2, Leica Biosystem, United Kingdom). O tecido coletado foi analisado por Imunohistoquímica quanto aos seguintes marcadores:  Índice de proliferação celular através da marcação do PCNA (proliferative cell nuclear antigen), marcação de núcleo;  Índice de apoptose através da marcação da Caspase -8, marcação de citoplasma e núcleo;  Expressão de moléculas envolvidas na diferenciação celular como Metalotioneínas (Monoclonal Mouse Anti-Metallothionein Clone E9), marcação de citoplasma.  Marcadores de invasão tecidual como MMP -9 (Mouse Monoclonal Antibody Matrix Metaloproteínases 9) e TIMP -2 (Tissue Inhibitor of Matrix Metaloproteínases 2), marcação de citoplasma. As lâminas foram analisadas por dois médicos (ARS e JVCZ). As células foram marcadas positiva ou negativamente, para cada marcador, segundo critérios utilizados na literatura - Imuno Reactive Score (Weigel et al., 2012). Assim, para os marcadores MMP-9, MTs, TIMP-2 e CASP8: 1) a ausência de marcação (0%) foi definida como “1+”; 2) marcações entre 1 e 10% foram definidas como “2+”; 3) marcações entre 10 e 50%, conferiram o score de “3+”; 4) marcações entre 51 e 80% foram definidas como “4+”; 5) E, por f im, marcações superiores a 80% foram associadas ao score de “5+”. Em relação às marcações de PCNA: 35 1) marcações inferiores a 20% definiu-se o score “1+”; 2) marcações entre 20 e 70% conferiram o status de “2+”; 3) marcações superiores a 70% estabeleceram o score de “3+”. 4.5 Expressão gênica (extração do RNA total, síntese do cDNA, quant ificação da expressão por PCR em tempo real) As amostras de tecido congeladas em RNA later à -80ºC foram descongeladas e lavadas em PBS 1X. O RNA total foi extraído a partir de 50 mg de tecido utilizando Trizol Plus RNA Purification Kit (Ambion, part number 12183 -555) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA genômico foi removido usando DNA -free Kit (Ambion, part number AM1906). Após o tratamento com DNase, o RNA total fo i quantificado por espectrofotometria à OD 260/280 (NanoDrop2000c, Thermo Scientific). Em seguida, o cDNA foi sintetizado a partir de 1000 ηg de RNA total utilizando High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (Applied Biosystems, par t number 4374966) que faz uso de primers randômicos. A PCR em tempo real foi realizada utilizando o equipamento 7500 Fast Real -time PCR System (Applied Biosystems). As seguintes sondas de hidrólise do tipo TaqMan (Applied Biosystems) foram utilizadas neste estudo: Rn00582935_m1 ( Vegfa), Rn00565719_m1 ( Cald1), Rn01514538_g1 (Pcna), Rn99999017_m1 (Tnf), Rn01644671_m1 (Sparc). Os ciclos de PCR foram os seguintes: um ciclo de 95ºC durante 20 segundos, 40 ciclos de 95ºC por 3 segundos e a 60ºC por 30 minutos. Ca da reação de PCR foi realizada em triplicata. Os genes Actb (Rn00667869_m1) e B2m (Rn 00560865_m1) foram utilizados como gene s de referência para normalizar as reações. As eficiências das sondas e primers foram testadas na reação de amplificação dos genes selecionados. Para esse estudo, foram consideradas ideais as eficiências na faixa de 90 a 110%. A expressão relativa p ara os genes analisados foi calculada para cada amostra de acordo com o método de 2-ΔΔCT. 4.6 Análise estatística Primeiramente realizou -se análise exploratória dos dados. Esta metodologia tem como objetivo sintetizar uma série de valores de mesma natur eza, permitindo que se tenha uma visão global da variação de tais valores organizando e 36 descrevendo os dados de duas maneiras: PROC FREQ por meio de tabelas com medidas descritivas e por gráficos. A análise descritiva foi realizada com o software SAS® 9.0, utilizando o PROC MEANS e os gráficos (Apêndice A) foram plotados utilizando-se o software R. Parte 1: Para verificar a associação entre os grupos e os marcadores foi utilizado o teste exato de Fisher. Os cálculos foram realizados através do software SAS® 9.0, utilizando o PROC FREQ. Parte 2.1 – Para comparar os grupos em cada local, propusemos a análise de variância (ANOVA). Esta análise tem como pressuposto que seus resíduos tenham distribuição normal com média 0 de variância 02 constantes. Para as var iáveis que não atingiram esse pressuposto utilizou -se uma transformação logarítmica na variável resposta. Esse procedimento foi realizado através do software SAS® 9.0, utilizando-se o PROC GLM. Parte 2.2 e 3 - Para a comparação o modelo de regressão com e feitos mistos (efeitos aleatórios e fixos). Os modelos lineares de efeito misto são utilizados na análise de dados em que as respostas estão agrupadas e a suposição de independência entre as observações num mesmo grupo não é adequada. Esses modelos têm co mo pressuposto que seus resíduos tenham distribuição normal com média 0 de variância 02 constantes. Para as variáveis que não atingiram esse pressuposto usou-se a transformação logarítmica na variável resposta. Este procedimento foi realizado através do s oftware SAS® 9.0, utilizando o PROC MIXED. Para a comparação foi utilizado o pós-teste por contrastes ortogonais (Team, 2011). É possível representar os resultados das análises de marcações Imunohistoquímica em uma tabela de contingência. Na qual nas linhas são representados os scores de marc ação para as proteínas em tecidos obtidos a partir de endométrio eutópico (útero). Enquanto nas colunas são representados os scores das análises de tecido obtido a partir das lesões, para as mesmas proteínas. As frequências em que há concordância de scores entre os diferentes tecidos se encontram na diagonal da tabela. A proporção de concordância será o número de casos em que os dois tecidos estão em concordância em relação ao score para a mesma proteína (soma das frequências da diagonal) sobre o número total de casos. 37 O Kappa de Cohen é uma medida de concordância que pondera a proporção de concordância observada para a concordância obtida pelo acaso, ou seja, é o quociente entre a proporção de concordância observada menos a proporção de concordância esperada pelo acaso e a concordância máxima, ou seja 1, menos a concordância esperada pelo acaso(Borkowf e Gail, 1997; Borkowf et al., 1997). Embora não haja muitos critérios para avaliar os valores de Kappa entre 0 e 1, Landis e Koch em 1977 sugeriram a seguinte escala (Koch et al., 1977; Landis e Koch, 1977a; b): Tabela 1 - Avaliação do Kappa de Cohen. Kappa entre: Concordância: 0.00 e 0.20 Pobre 0.21 e 0.40 Razoável 0.41 e 0.60 Moderada 0.61 e 0.80 Substancial 0.80 e 1.00 Alta 38 5. Resultados 39 5.1 Caracterização dos grupos e perdas Foram utilizadas 30 ratas da rasta Wistar. Dessas, 10 foram utilizadas em cada grupo conforme descrito na metodologia. Não houve perda de animais, não foram observados processos infecciosos ou desprezo de material por qualquer motivo . Observou-se em todos os grupos eutanasiados a presença de lesões bilateralmente localizadas na parede abdominal dos animais, visíveis macroscopicamente com tamanho aproximado de 1cm de comprimento. À análise imunohistoquímica, observamos que não houve material satisfatório para análise nas lâminas confeccionadas para o estudo dos tecidos obtidos do animal de número 10 do grupo PB para os marcadores MTs, CASP8 e TIMP-2. Para a análise de expressão gênica também observamos perdas no estudo por material apresentando quantidade insuficiente de cDNA em algumas amostras, a saber: Cald1 do tecido obtido da lesão ectópica do animal 9, do grupo P A; Vegf, Tnf, Pcna, e Sparc do tecido obtido da lesão ectópica dos animais 8, do grupo PB e 1, do grupo C. 5.2 Imunohistoquímica Na análise Imunohistoquímica dos tecidos obtidos a partir das lesões de endometriose induzidas e endométrio eutópico (útero) a s marcações foram quantificadas e realizada análise comparativa entre as diferentes variáveis. Não foram observadas diferenças significativas para os marcadores MMP -9, TIMP-2, CASP8 e PCNA. Entretanto, para a s MTs, houve redução significativa de marcação após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como em ectópico (Tabela 2). 40 Tabela 2 - Comparações entre as variáveis relacionadas a imunohistoquímica. Variáveis Grupos MMP_9_UTERO C (n=10) PA (n=10) PB (n=10) Total p-valor 3+ 1 (10) 1 (10) 1 (10) 3 0,8638 4+ 2 (20) 3 (30) 1 (10) 6 5+ 7 (70) 6 (60) 8 (80) 21 MMP_9_LESAO 1+ 6 (60) 4 (40) 9 (90) 19 0,3423 2+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 3+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 5+ 2 (20) 4 (40) 1 (10) 7 MTs_UTERO 1+ 0 (0) 9 (90) 8 (88,89) 17 0,0001 3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 5+ 9 (90) 0 (0) 0 (0) 9 MTs_LESAO 1+ 2 (20) 9 (90) 8 (88,89) 19 0,0018 3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 5+ 7 (70) 0 (0) 0 (0) 7 CASP8_UTERO 1+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 0,6202 2+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 3+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 4+ 1 (10) 2 (20) 1 (11,11) 4 41 5+ 8 (80) 5 (50) 8 (88,89) 21 CASP8_LESAO 1+ 4 (40) 6 (60) 6 (66,67) 16 0,0806 2+ 0 (0) 2 (20) 3 (33,33) 5 3+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 5+ 5 (50) 1 (10) 0 (0) 6 TIMP2_UTERO 1+ 0 (0) 4 (40) 0 (0) 4 0,0848 3+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 5+ 8 (80) 6 (60) 8 (88,89) 22 TIMP2_LESAO 1+ 4 (40) 5 (50) 6 (66,67) 15 0,1266 2+ 0 (0) 2 (20) 3 (33,33) 5 3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 5+ 5 (50) 2 (20) 0 (0) 7 PCNA_UTERO 2+ 1 (10) 5 (50) 1 (10) 7 0,0507 3+ 9 (90) 5 (50) 9 (90) 23 PCNA_LESAO 1+ 4 (40) 4 (40) 8 (80) 16 0,2968 2+ 1 (10) 1 (10) 1 (10) 3 3+ 5 (50) 5 (50) 1 (10) 11 42 Segundo a avaliação de proporção de concordância (kappa de Cohen) obtida entre os scores de marcação do tecido uterino e tecido ectópico, observamos uma correlação de 1 (alta) para a análise Imunohistoquímica da s proteínas MTs, nos diferentes grupos. Para as demais proteínas as corr elações são baixas (<0,20) (Tabela 3). Tabela 3 - Concordância entre as variáveis da lesão e do útero em cada grupo. Variáveis Grupos MMP_9_UTERO C (n=10) PA (n=10) PB (n=10) Total p-valor 3+ 1 (10) 1 (10) 1 (10) 3 0,8638 4+ 2 (20) 3 (30) 1 (10) 6 5+ 7 (70) 6 (60) 8 (80) 21 MMP_9_LESAO 1+ 6 (60) 4 (40) 9 (90) 19 0,3423 2+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 3+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 5+ 2 (20) 4 (40) 1 (10) 7 METALOTIONEINA_UTERO 1+ 0 (0) 9 (90) 8 (88,89) 17 0,0001 3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 5+ 9 (90) 0 (0) 0 (0) 9 METALOTIONEINA_LESAO 1+ 2 (20) 9 (90) 8 (88,89) 19 0,0018 3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 5+ 7 (70) 0 (0) 0 (0) 7 43 CASPASE8_UTERO 1+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 0,6202 2+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 3+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 4+ 1 (10) 2 (20) 1 (11,11) 4 5+ 8 (80) 5 (50) 8 (88,89) 21 CASPASE8_LESAO 1+ 4 (40) 6 (60) 6 (66,67) 16 0,0806 2+ 0 (0) 2 (20) 3 (33,33) 5 3+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 5+ 5 (50) 1 (10) 0 (0) 6 TIMP2_UTERO 1+ 0 (0) 4 (40) 0 (0) 4 0,0848 3+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 5+ 8 (80) 6 (60) 8 (88,89) 22 TIMP2_LESAO 1+ 4 (40) 5 (50) 6 (66,67) 15 0,1266 2+ 0 (0) 2 (20) 3 (33,33) 5 3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 5+ 5 (50) 2 (20) 0 (0) 7 PCNA_UTERO 2+ 1 (10) 5 (50) 1 (10) 7 0,0507 3+ 9 (90) 5 (50) 9 (90) 23 44 PCNA_LESAO 1+ 4 (40) 4 (40) 8 (80) 16 0,2968 2+ 1 (10) 1 (10) 1 (10) 3 3+ 5 (50) 5 (50) 1 (10) 11 5.3 Expressão gênica Detectamos diferenças significativas entre os níveis de expressão de Pcna obtidos na lesão e ntre os grupos c ontrole e os grupos tratados . No presente estudo não fora m observadas diferenças significativas em relação à expressão de Cald1, Sparc, Vegfa e Tnf, nas lesões, nos três grupos analisados. Os resultados são apresentados nas tabelas que seguem. Tabela 4 - Comparação da expressão gênica de Pcna (Lesão) entre os grupos. Pcna (Lesão) Grupo N Média Desvio Padrão p-valor Pós teste de Dunn* C 9 1,21 0,77 0,02 a PA 10 0,48 0,4 b PB 9 0,73 0,27 ab *Letras diferentes representam diferenças significativas ao nível de significância de 0,05. Expressão gêni ca em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. Tabela 5 - Comparação da expressão gênica de Sparc (Lesão) entre os grupos. Sparc (Lesão) Grupo n Média Desvio Padrão p-valor C 9 1,29 1,08 0,09 PA 10 0,6 0,37 PB 9 1,06 0,7 Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. 45 Tabela 6 - Comparação da expressão gênica de Cald1 (Lesão) entre os grupos. Cald1 (Lesão) Grupo n Média Desvio Padrão p-valor C 9 1,49 1,51 0,08 PA 9 0,57 0,53 PB 9 0,36 0,31 Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. Tabela 7 - Comparação da expressão gênica de Tnf (Lesão) entre os grupos. Tnf (Lesão) Grupo n Média Desvio Padrão p-valor C 9 1,24 0,86 0,15 PA 10 1,16 0,5 PB 9 1,9 1,3 Expressão gênica em unidad es arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. Tabela 8 - Comparação da expressão gênica de Vegfa (Lesão) entre os grupos. Vegfa (Lesão) Grupo n Média Desvio Padrão p-valor C 9 1,2 0,64 0,77 PA 10 1,42 1,91 PB 9 1,29 1,12 Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. 46 A análise de expressão gênica no fragmento ute rino entre os grupos Controle e grupos que receberam a medicação não revelou diferenças estatísticas significantes para Pcna, Sparc, Vegfa, Tnf e Cald1. Os resultados são apresentados abaixo: Tabela 9 - Comparação da expressão gênica de Vegfa (Útero) entre os grupos. Vegfa (Útero) Grupo n Média Desvio Padrão p-valor C 10 1,08 0,46 0,49 PA 10 1,19 0,56 PB 10 1,69 1,14 Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. Tabela 10 - Comparação da expressão gênica de Tnf (Útero) entre os grupos. Tnf (Útero) Grupo n Média Desvio Padrão Valor p C 10 1,23 0,73 0,16 PA 10 2,42 1,71 PB 10 1,7 1,13 Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo co ntrole; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. Tabela 11 - Comparação da expressão gênica de Pcna (Útero) entre os grupos. Pcna (Útero) Grupo n Média Desvio Padrão Valor p C 10 1,09 0,5 0,41 PA 10 1,32 0,52 PB 10 1,68 1,31 Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. 47 Tabela 12. Comparação da expressão gênica de Sparc (Útero) entre os grupos. Sparc Grupo n Média Desvio Padrão Valor p C 10 1,04 0,3 0,42 PA 10 0,95 0,39 PB 10 0,88 0,65 Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. Tabela 13 - Comparação da expressão gênica de Cald1 (Útero) entre os grupos. Cald1 Grupo n Média Desvio Padrão Valor p C 10 1,69 1,28 0,09 PA 10 2,08 1,81 PB 10 4,17 3,34 Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Gr upo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. 48 49 6. Discussão 50 A capacidade de adesão, invasão e desenvolvimento das lesões de endometriose estão rel acionadas ao desequilíbrio entre as enzimas que degradam os componentes da matriz extracelular (como a MMP 9), e seus reguladores endógenos – os inibidores de tecidos de metaloproteinases (como o TIMP-2). A viabilidade do tecido ectópico é atribuída em partes à ocorrência de neoangiogênese estimulada pelo fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e citocinas. O uso de inibidores de neoangiogênese têm sido amplamente estudados no tratamento de endometriose (Hsiao et al., 2014; Pittatore et al., 2014; Arosh et al., 2015; Ozcan Cenksoy et al. , 2015) . β -bloqueadores como o propranolol, devido à sua ação em inibição de neoangiogênese, possuem efeitos antitumorais em diferentes tipos de tumores, e principalmente tumores vasculares (Koch et al., 1977; Ji et al., 2012; Stiles et al., 2013; Xu et al., 2013). Por meio de análises imunohistoquímicas e estudos de biologia molecular foi possível analisar a resposta das lesões experimentalmente induzidas, bem como dos tecidos obtidos a partir de endométrio eutópico. A presença de lesões de endometriose no modelo experimental utilizado foi comprovada macroscopicamente pela presença de implantes típicos na face peritoneal das ratas, e também microscopicamente, por meio de estudo imunohistoquímico com hematoxilina -eosina e observação de glândula e estroma endometrial nos tecidos excisados, confirmando o sucesso da técnica empregada no estudo. Com o intuito de avaliar os efeitos do propranolol nas lesões endometrióticas induzidas, em vários aspectos, alguns marcadores foram selecionados afim de que alguns mecanismos como neoangiogênese, apoptose, proliferação celular, motilidade e invasão celular fossem avaliados. Para tanto, os marcadores MTs, PCNA, C ASP8, MMP -9 e TIMP-2 foram analisados por imunohistoquímica, e por biologia molecular foram analisadas as expressões dos genes Vegfa, Tnf, Sparc e Cald1. A MT é uma proteína de baixo peso molecular com papéis funcionais no crescimento celular, diferenciação e reparação, inversamente correlacionada com o índice de apoptose. A lo calização perinuclear da metalotioneína é importante para a função de proteção contra danos no DNA e apoptose induzida por estímulos 51 externos de estresse (Tsangaris e Tzortzatou -Stathopoulou, 1998; Levadoux -Martin et al., 2001; Cherian et al., 2003; Theocharis et al., 2004). As MTs têm diversas funções que continuam a ser descobertas como armazenamento, transporte e metabolismo de metais, proteção contra radicais livres, controle da concentração de traços de element os livres como zinco e cobre, proteção contra condições de estresse e proteção contra danos cerebrais (Jacob et al., 1998) O estudo de Tapiero e Tew (Tapiero e Tew, 2003) sugere que altos níveis de MTs podem estar presentes em te cidos com rápido crescimento e desenvolvimento. As MTs fornecem zinco e cobre para o metabolismo de ácidos nucléicos, síntese de proteínas e outros processos metabólicos, portanto pode haver uma ligação entre MTs e tumores cancerosos. De acordo com o estudo de Wicherek e colaboradores (Wicherek et al., 2005) a superexpressão de MT pode proteger as células tumorais da apoptose e, assim, contribuir para a expansão do tumor. A expressão de MT foi aumentada em casos de carcinoma endometrial quando comparado com lesões endometriais hiperplásicas benignas. Em adenocarcinoma endometrial, o conteúdo elevado de MT foi associado com alto grau de câncer e estágio da doença (Mccluggage et al., 1999). No presente estudo houve uma redução significativa de marcação desta proteína após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como em ectópico, sugerindo que o tratamento com propranol foi eficaz. O PCNA (antígeno de proliferação celular ) é uma proteína nuclear e sua expressão se relaciona com o estado proliferativo das células (Yu et al., 1991). O antígeno é expresso no núcleo das células, durante a fase de síntese do DNA. Ele pode ser usado para a classificação de diferentes lesões neoplásicas e benignas com comportamento proliferativo. O PCNA é um marcador de proliferação específica validado que é resistente à fixação (Theile e Muller, 1996) O estudo de Fujishita e colaboradores (Fujishita et al., 1999) avaliou o PCNA em endometriose e mostrou maiores níveis proteicos em lesões vermelhas, quando comparadas a lesões brancas e negras. Há diferenças relevantes no padrão proteico de PCNA em diferentes estadios de endometriose e em câncer de endométrio. Estes marcadores podem ser úteis para avaliar a agressividade e a invasão endometriótica 52 em diferentes localizações. A expressão de PCNA foi significativamente maior em endometriose colorretal que em endometriose peritoneal e carcinoma endometrial (Korbel et al., 2010; Weigel et al., 2012), sugerindo uma maior atividade mitótica nas lesões de endometriose. Estudos demonstram que drogas antiestrogênicas usadas no tratamento da endometriose diminuem a expressão do PCNA, provavelmente por diminuírem a proliferação de células mediadas por estrogênio e consequentemente diminuir as lesões ectópicas (Kulak et al. , 2011) . A avaliação de pacientes tratadas com agonistas de GnRH e com Sistema Intrauterino liberador de Levonorgestrel (SIU - LNG) mostrou uma redução na proliferação celular avaliada por uma menor expressão de PCNA em células estromais e glandulares do endométrio eutópico e ectópico (Gomes et al., 2009). Esses resultados corroboram o nosso estudo, pois observamos uma menor expressão significativa de Pcna em ratas tratadas com propranolol. Portanto a redução de proliferação celular, devido a uma menor expressão de Pcna poderia sugerir uma provável resposta terapêutica. Tanto a apoptose e a proliferação de células são alvos de tratamentos habitualmente utilizados para controlar a dor em pacientes com endometriose (Gomes et al., 2009). Durante o ciclo menstrual a apoptose auxilia a manutenção da homeostasia celular, pois, durante a fase secretora tardia, ocorre a eliminação de células envelhecidas presentes na camada funcional do endométrio uterino (Suganuma et al., 1997) . As células mais resistentes à apoptose são as células endometriais ectópicas obtidas de sítios da endometriose (Gebel et al., 1998). Um estudo de Dmowsk (Dmowski et al., 2001) reportou um baixo índice de apoptose celular em mulheres com endometriose na fase secretora tardia e proliferativa precoce do ciclo menstrual. Esse baixo índice de apoptose pode levar a um aumento de células endometriais viáveis regurgitadas na cavidade pélvica durante a menstruação. Dessa forma há uma maior facilidade de sobrevivência e implantação ectópica. A apoptose, portanto pode ser apenas um mecanismo de controle do desenvolvimento e evolução da endometriose. As Caspases são um grupo de proteases baseadas em cisteína. São importantes para a apoptose celular e algumas caspases são essenciais para o 53 sistema imunológico, pois são responsáveis pela maturação de citocinas. Existem dois tipos de caspases: caspases iniciadoras e caspases efetoras . Caspases iniciadoras ( CASP8, CASP9) clivam pro -formas inativas de caspases efetoras e assim as ativam. As caspases efetoras ( CASP3, CASP7) c livam outros substratos protéicos da célula levando ao processo apoptótico. O início da reação em cascata é regulada por inibidores de caspases (Lavrik et al., 2005; Mcilwain et al., 2013) No entanto, algumas evid ências estão emergindo que suportam a existência de muitas outras funções não-apoptóticos destas caspases, que são essenciais para a homeostase do tecido e recuperação pós -lesão. As caspases apoptóticas em células que morrem induzidas pelo estresse podem ativar os sinais mitogênicos que conduzem à proliferação de células vizinhas, um fenómeno denominado proliferação induzida por apoptose. Aparentemente, estas funções não apoptóticas das caspases precisam ser controladas e contidas durante o desenvolvimento para evitar os seus efeitos prejudiciais. Os estudos de acumulação sugerem que a célula cancerígena é capaz de utilizar estas funções de caspases para permitir a sua sobrevivência, proliferação e metástase, a fim de crescer e progredir (Dabrowska et al., 2016). Entretanto, e m nosso estudo não houve diferen ças significativas para a marcação de CASP8 nos grupos tratados e controle. As metaloproteinases de matriz ( MMPs) são uma família de endopep tidases zinco-dependente que estão envolvidas na degradação de matriz extracelular (Woessner, 1991; Raza e Cornelius, 2000; Di Nezza et al. , 2002) . Elas são de grande importância em processos fisiológicos e patológ icos, tais como angiogênese, infiltração e propagação de tumores malignos. Além disso, elas estão presentes em endométrio eutópico e ectópico (Osteen et al., 2003; Uzan et al., 2004; Kim et al., 2007) As MMPs t êm e xpressão multigênica e quando estão associadas ao seus inibidores tissulares de metaloproteinases ( TIMPs) são possíveis mediadores da remodelagem da matriz extracelular (Page-Mccaw et al., 2007). A MMP -2 (gelatinase A) é uma colagenase tipo IV, que é especialmente importante para o a degradação da membrana basal (Stetler-Stevenson, 1994). Uma sobre expressão tem sido encontrada em muitos tumores malignos e também no endométrio de pacientes com endometriose (Chung, M. K. et al. , 2002) . A MMP -9 (gelatinase B) também processa o colagénio tipo IV e além disso divide colágeno tipo II e V. A sua presença, em muitos tipos de câncer, incluindo células malignas e 54 estroma circundante tem sido demonstrada. MMP -9 pode ser encontrada em endometriose infiltrante (Xin et al., 2015; Liu et al., 2016) As MMP-2 e MMP -9 estão prese ntes não só no endométrio normal na fase proliferativa, mas também em endométrio hiperplásico e carcinoma do endométrio (Graesslin et al. , 2006). Por conseguinte, a MMP -2 e MMP -9, entre outras MMPs, parecem ser fatores importantes para a progressão de tumores e invasão de câncer do endométrio. Os padrões de expressão destas MMPs também são de interesse em diferentes tipos de endometriose também (Amalinei et al., 2011). Em mulheres com endometriose, foram observados elevados níveis de MMPs em endométrio ectópico em relação ao endométrio tópico. A superexpressão de MMPs pode auxiliar o desenvolvimento da endometriose (Kokorine et al., 1997; Di Carlo et al., 2009). O estudo de Weigel (Weigel et al., 2012) mostrou que a expressão de MMP-2 e MMP-9 em carcinoma maligno é mais alta que em endometriose. MMP-2 foi mais expressa em endometriose colorretal invasiva que em endometriose peritoneal superficial, portanto é possível sugerir que a MMP-2 é um forte fator de promoção da proliferação em tecido endometrial. O TIMP-2 ( Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase) é um membro da família de genes TIMPs. Os TIMPs são uma família de inibidores naturais e específicos das MMPs. Esses dois fatores têm importante papéis na manutenção da estabilidade e integridade estrutural dos componentes da matriz extracelular (Taylor et al., 2002; Loffek et al., 2011). Estudos têm mostrado que a desordem das MMPs / TIMPs pode promover a destruição e degradação da matriz extracelular do peritônio, provocando o desenvolvimento de endometriose (Gottschalk et al., 2000; Chung, H. W. et al., 2002). Mulheres com endometri ose expressam baixos níveis de TIMP-2, levando a uma alta atividade proteolítica da MMP e favorecendo a invasão de células endometrióticas. O equilíbrio entre MMPs e TIMPs é importante para manter a atividade adequada de MMP. A incapacidade de manter esse equilíbrio pode auxiliar a degradação da matriz e invasão celular. O estrogênio pode aumentar a expressão de MMP-2 e promover a implantação de tecido en dometrial ectópico, entretanto a progesterona pode inibir a expressão de TIMP-2 e melhorar a invasão de endométrio ectópico promovendo sua implantação (Hulboy et al., 1997; Londero et al., 2012). 55 Em nosso estudo nã o houve diferença significativamente estatística para os grupos controle e tratados em relação à marcação de MMP-9 e TIMP-2. Quanto aos resultados de biologia molecular demonstrados neste trabalho, ao analisar a expressão dos genes Vegfa, Tnf, Sparc e Cald1 no grupo controle e nos grupos de lesões tratadas com baixa e alta dose de propranolol, bem como no endométrio tópico desses animais, observamos que não houve diferença significativa da expressão gênica. O Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) colabora com a patogênese e progressão da endometriose pela indução da proliferação celular endotelial, migração, diferenciação, organização em t úbulos e formação de capilares. Ademais, alguns trabalhos observaram aumentos tanto dos níveis proteicos quanto nos transcritos de VEGF no fluido peritoneal e soro de pacientes com endometriose (Mclaren et al., 1996; Pupo -Nogueira et al., 2007). Esses dados demonstram a importância do VEGF na patogênese da endometriose. Avaliando o resultado obtido em nosso estudo, como não houve diferença significativamente estatística entre os grupos estudados, provavelmente o propranolol nas doses administradas não foi capaz de inibir a angiogênese e diminuir a expressão de Vegf. O fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina secretada principalmente por macrófagos. Em resposta ao estímulo inflamatório, o TNFα é secretado e pode induzir a morte celular por apoptose ou necrose de algumas linhas de células tumorais. O TNF também pode ind uzir a proliferação e diferenciação celulares em muitos tipos de células (Ihlenfeld, 2008). A meta -análise de Lu e colaboradores (Lu et al. , 2013) não encontrou nenhuma evidência de benefício clínico quando administraram medicamentos anti - TNF-α (infliximab) ao analisar estudos que versavam sobre a lesão de endometriose, dismenorreia, dispareunia e sensibilidade pélvica. Um aumento de expressão de citocinas pró -inflamatórias, IL -1, 6, 8, TNF e HGF foi observada em tecido endometrial ectópico e tópico de mulheres com endometriose (Berbic et al., 2009). Em nosso estudo não houve diferença significativa entre os grupos estudados, sugerindo que não houve diminuição de expressão de Tnf nas ratas tratadas com propranolol. 56 Osteonectina (ON), também conhecida como proteína secretada ácida e rica em cisteína (SPARC) ou proteína de membrana basal -40 (BM-40) (Swaroop et al., 1988). Ela a presenta várias funções biológicas e está relacionada com a angiogênese, proliferação e migração de células tumorais (Maillard et al., 1992). Estudos recentes demonstram que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP pode ser responsável pela perda da homeostase celular em lesões endometrióticas, consequentemente pode auxiliar a impl antação e sobrevivência do tecido endometrial ectópico (Meola et al., 2010) Em nossa amostra, não detectamos diferença significativa nos níveis de expressão de Sparc entre os grupos tratados com alta e baixa dose e o grupo controle de lesões induzidas. Caldesmon (CALD1) é uma proteína de ligação a calmodulina. A CALD1 inibe tonicamente a atividade ATPase da miosina no músculo liso (Hayashi et al., 1992). Alguns estudos demonstram que o gene CALD1 é superexpresso em lesões endometrióticas de pacientes com endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual (Meola et al. , 2010) e em endometrioma ovariano por CGH -array (Zafrakas et al., 2008). CALD1 auxilia a predição de desregulação endometrial em pacientes com endometriose (Meola et al., 2009). Não foram encontradas diferenças significativas de expressão de Cald1 entre os grupos controle e tratados com propranolol. Uzunlar e colaboradores (Uzunlar et al. , 2014) sugerem que o propranolol possa suprimir o desenvolvimento da lesão endometrióticas devido a sua atividade antiangiogênica pela inibição de VEGF, MMP -2 e MMP -9. O presente estudo não observou essa inibição, entretanto observou uma redução nos níveis proteicos de MTs sugerindo que o propranolol possa apresentar uma provável resposta terapêutica. Também observamos uma redução na expressão de Pcna, não corroborada pela redução de marcação imunohistoquímica d a p roteína PCNA nos grupos estudados. Uma análise in silico revelou uma discordância entre os níveis de expressão do transcriptoma e proteínas associada com o processo da endometriose (Wren et al., 2007). Isto sugere que a expressão gênica não é somente regulada em 57 nível de transcriptoma, mas que mecanismos regulatórios pós -transcricionais possam atuar na endometriose. Um exemplo deste tipo de regulação atualmente muito estudado na doença é a regulação por microRNAs (Pan et al., 2007; Burney et al., 2009; Ohlsson Teague et al., 2009; Filigheddu et al., 2010). A pesquisa experimental é uma maneira de se obter conclusões causais, com relação a intervenções ou tratamentos e estabelecer se um ou mais fatores causam uma mudança em um resultado . N o presente estudo observamos, de maneira reprodutível, a ação do propranolol sob diferentes regimes de dose diária sobre a marcação proteica e expressão gêni ca de proteínas e genes envolvidos na patogenia da endometriose. É conveniente abordar que a pesquisa experimental pode criar situações artificiais que não são extrapoláveis para a prática clínica. Isto é em grande parte devido ao fato de que todas as outr as variáveis são rigorosamente controladas que podem não criar uma situação totalmente r eal. As principais limitações desse estudo são a não utilização dos mesmos marcadores na análise imunohistoquímica e na quantificação de expressão gênica, reduzindo n osso poder de análise da interferência da medicação estudada sobre o comportamento da doença à observação das lesões. 58 7. Conclusões 59 No presente estudo de lesões endometrióticas experimentalmente induzidas em ratas e tratadas com propranolol observou-se que houve redução significativa de marcação de Metalotioneína após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como em ectópico, sugerindo que o tratamento com propranol ol foi eficaz. Tais achados nos permitem crer em futuras abordagens no tratamento clínico da endometriose que podem incluir inibidores de neoangiogênese. Poderíamos aventar um estudo randomizado duplo -cego em humanos, com o uso adjuvante do propranolol às terapêuticas já existentes, ou outras medicações com conhecida ação de inibição sobre a cascata de angiogênese. A descoberta de novas drogas seguras com alvo sobre essa etapa do estabelecimento da lesão de endometriose poderia beneficiar milhões de mulheres acometidas, que diariamente sofrem com redução da qualidade de vida, dor e/ou dificuldade em conceber. 60 Referências Bibliográficas 61 ABRAO, M. S. et al. Deep endometriosis infiltrating the recto-sigmoid: critical factors to consider before management. Hum Reprod Update, v. 21, n. 3, p. 329-39, May-Jun 2015. ISSN 1460-2369 (Electronic) 1355-4786 (Linking). Disponível em: . AMALINEI, C. et al. Immunohistochemical analysis of steroid receptors, proliferation markers, apoptosis related molecules, and gelatinases in non-neoplastic and neoplastic endometrium. Ann Anat, v. 193, n. 1, p. 43-55, Feb 20 2011. 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Tal constatação sugere qu e a supressão do desenvolvimento de vasos sanguíneos por meio da inibição de fatores angiogênicos específicos pode ser uma nova oportunidade terapêutica na abordagem da endometriose. Estudos demonstram um efeito antiangiogênico do propranolol anticanceríge no em diferentes tipos de tumores. Tal achado sugere que o propranolol pode contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese, e tal efeito resultar em um impacto sobre as lesões de endometriose. Foi estudado o efeito do propranolo l sobre marcadores de diferenciação (Metalotioneínas MT1 e MT2), invasão (MMP9 e TIMP2), proliferação celular (PCNA) e apoptose (CASP8 – caspase 8) por coloração imunohistoquímica, e também a influência sobre a adesão, motilidade e angiogênese das lesões d e endometriose por quantificação da expressão relativa (RQ) por PCR em tempo real dos genes Vegf, Cald1, Pcna, Tnf e Sparc. Foram utilizadas 30 ratas adultas Wistar, fêmeas, virgens que foram submetidas a laparotomia para indução de lesões de endometriose. As ratas foram separadas em três grupos, e sacrificados após 14 dias de tratamento de dose baixa (PB, n = 10) e dose elevada (PA, n = 10) de propranolol; e o grupo de controlo (C, n = 10) sem tratamento. As lesões foram excisadas para análise histológica com o corno uterino contralateral, com confirmação da presença de tecido glandular e estroma endometrial. No presente estudo foi observada uma redução na marcação imunohistoquímica para Metalotioneínas, com 60% de positividade no grupo controle, 10% e 11,1% para o PA, PB, respectivamente (p <0,05). Também observamos uma diminuição na expressão do gene de Pcna (C = 1,04; PA = 0,32; PB = 0,69). Em outros marcadores de imunohistoquímica e quantificação da expressão gênica nas lesões e no tecido uterino não for am observadas diferenças significativas. O tratamento com drogas antiangiogênicas como propranolol oferece novas perspectivas de abordagem terapêutica para pacientes com endometriose. Palavras-chave: Endometriose. Angiogênese. Proliferação celular. Apoptose. Propranolol. Ratas. 1. Introdução A endometriose é definida pela presença de tecido endometrial, seja ele glandular ou estromal, fora da cavidade uterina, denominado endométrio ectópico 1. Afeta 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva 2. Semelhante aos tumores metastáticos, implantes endometrióticos dependem de neovascularização para se estabelecerem, implantarem e invadirem 3-5. A supressão do desenvolvimento de vasos sanguíneos por meio da inibição de fatores angiogênicos específicos pode ser uma nova oportunidade terapêutica no tratamento da endometriose 6-8. A ação anticancerígena do propranolol em diferentes tipos de tumores 9-12, além de efeito antitumoral dos β - bloqueadores em sarcomas in vivo e in vitro 11,13, e por fim, pelo sinergismo entre quimioterapia e β-bloqueadores em câncer de mama e neuroblastoma, por mecanismos ainda não totalmente elucidados 14,15 é sugerido que o propranolol possa contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese, e tal efeito resultar em um impacto sobre as lesões de endometriose. Foi proposto o uso dessa droga em um modelo experimen tal consagrado 16-20 para a observação do comportamento de lesões de endometriose in vivo, com e sem tratamento, e aventar uma nova opção terapêutica clínic a no tratamento de pacientes com endometriose. 2. Materiais e métodos Após uma vasta revisão da literatura sobre o tema e aprovações pela Comissão de Pesquisa do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (protoco lo nº 339/2011) e pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (protocolo 183/2011), foram solicitadas as ratas e aplicado o modelo técnico -cirúrgico para indução de 84 lesões de endometriose 16-20. Foram utilizadas trinta ratas Wistar, virgens, da mesma ninhada, de aproximadamente 250 g no início do experimento, idade de quarenta e nove dias, Tais ratas, mantidas em ad libitum (livre acesso à água e ração Nu vilab CR1 autoclavável), inicialmente permaneceram por sete dias para ambientarem -se em gaiolas metabólicas (41 cm x 32 cm x 17 cm) sob controle de umidade e temperatura (22º a 25°C) e regime de luz com ciclo claro -escuro de 12/12 horas. Após este período, os grupos, descritos abaixo, foram submetidos à laparotomia para indução da lesão de endometriose. Os animais foram alocados em 3 grupos de 10 animais divididos da seguinte forma: Grupo C (controle, n=10): ratas com endometriose induzida experimentalmente e sem tratamento da droga no pós - operatório. Grupo PB (propranolol baixa dose, n=10): ratas que receberam diariamente droga propranolol em baixa dose (0,05 mg/Kg) por 2 semanas após 4 semanas da cirurgia para indução das lesões. Grupo PA (propranolol alta dose, n=10): ratas que receberam diariamente droga propranolol em alta dose (0,1 mg/kg) por 2 semanas após 4 semanas da cirurgia para indução das lesões. A indução da lesão de endometriose foi realizada após injeção intramuscular com 1 ml de Xilazina 2 mg /mL (Dopaser, Hertape Calier), e 1 ml cloridrato de cetamina 10% (Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional AS, Uso veterinário), sendo 0,15 unidades para cada 100 g de peso do animal. Após anestesia, foi realizado tricotomia pélvica, seguida dos cuidados de antissepsia com lavagem das luvas de látex com soro fisiológico para redução da formação de aderências. Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo pesquisador. A cavidade pélvica foi aberta com incisão longitudinal mediana de aproximadamente 2 cm, sendo a 2 cm do púbis do animal. Posteriormente, ressecado cerca de 4 cm do corno uterino direito seguido de sutura do coto proximal. A porção uterina dissecada foi imersa em soro fisiológico 0,9% a 4°C por cerca de 2 minutos e então incisada longitudinalmente, sendo retirado dois fragmentos de 5 x 5mm. Estes fragmentos de tecido endometrial foram suturados ao peritônio próximo ao trato reprodutivo da rata utilizando fio Vicryl 6.0 com a face endometrial livre voltada para a cavidade abdominal , sendo um fragmento suturado a direita e outro a esquerda, com posterior fechamento da incisão cirúrgica. Nenhuma suplementação hormonal ou antimicrobiana foi administrada antes ou após a laparotomia. Quatro semanas após a cirurgia, tempo necessário para a implantação da lesão 21,22, os grupos de estudo receberam diariamente a injeção intraperi toneal de propranolol (0.05mg/Kg ou 0.1mg/kg) por 2 semanas, sendo então eutanasiadas. O grupo controle foi eutanasiado após estas quatro semanas de seguimento inicial. Ao término do protocolo, as ratas foram eutanasiadas e realizado o inventário da cavida de abomino -pélvica, identificando e documentando as lesões. Observou -se em todos os grupos eutanasiados a presença de lesões bilateralmente localizadas na parede abdominal dos animais, visíveis macroscopicamente com tamanho aproximado de 1cm de comprimento. Após esta etapa, as lesões de endometriose foram excisadas para análise histológica e molecular. As ratas foram pesadas após 4 semanas, e a cada semana de droga administrada, fizemos o ajuste de dose da medicação conforme estabelecido previamente pelo protocolo dose/peso. Os tecidos retirados foram divididos ao meio, sendo que metade seguiu o protocolo para técnicas de Imunohistoquímica e a outra metade foi incluída em RNA later Solution (Ambion, par number AM7020) e após 24hs à 4 C, o tecido foi armazenado à -80C para posteriores análises de expressão gênica. 85 Os tecidos retirados foram divididos ao meio, sendo uma parte fixada em formol 10%, processada para inclusão em parafina e corada por hematoxilina e eosina (HE) com objetivo de identificar a presen ça de lesões compatíveis com endometriose e posterior realização de Imunohistoquímica. Foram realizados cortes histológicos com 4 a 5µm. Os cortes foram desparafinizados em xileno e desidratados em uma série de álcoois. A atividade da peroxidase endógena f oi bloqueada em uma solução contendo 0,3% de peróxido de hidrogênio por 30 minutos. Os cortes foram submetidos à recuperação antigênica com tampão de citrato a 10 mM e colocados em panela a vapor por 40 minutos e, logo após, as amostras foram resfriadas po r 30 minutos em temperatura ambiente e incubadas a 4º C overnight com o anticorpo primário. Aplicado o protocolo de sequências conforme o Kit Mach 4: - Primeiro dia: recuperação antigênica: Tampão citrato pH 6.0, 35 minutos, lavagem com Tris Buffered Sa line-TBS, bloqueio da peroxidase endógena 10 minutos, lavagem com TBS por 5 minutos, bloqueio da proteína BSA 2% por 10 minutos, lavagem com TBS e incubação com anticorpo primário overnight; - Segundo dia: lavagem, incubação no pós primário por 30 minutos , lavagem com TBS por 3 minutos, incubação no polímero por 30 minutos, lavagem com TBS e aplicação de DAB (3,3 diaminobenzina). Os anticorpos utilizados neste estudo, suas diluições e respectivas marcas foram: PCNA (1:500, PC10:SC -56, Santa Cruz Biotechno logy, INC), CASPASE - 8 (1:100, clone 11B6, Novacastra Laboratories, United Kingdom), METALOTIONEINA(1:100, clone E9, Dako, USA), TIMP -2 (1:100, 3A4, Novacastra Laboratories, United Kingdom), MMP -9 (1:100, 15W2, Leica Biosystem, United Kingdom). O tecido coletado foi analisado por Imunohistoquímica quanto aos seguintes marcadores:  Índice de proliferação celular através da marcação do PCNA (proliferative cell nuclear antigen), marcação de núcleo;  Índice de apoptose através da marcação da Caspase-8, marcação de citoplasma e núcleo;  Expressão de moléculas envolvidas na diferenciação celular como Metalotioneína (Monoclonal Mouse Anti - Metallothionein Clone E9);  Marcadores de invasão tecidual como MMP -9 (Mouse Monoclonal Antibody Matrix Metaloproteínases 9) e TIMP-2 (Tissue Inhibitor of Matrix Metaloproteínases 2), marcação de citoplasma. As lâminas foram analisadas por dois médicos (ARS e JVCZ). As células foram marcadas positiva ou negativamente, para cada marcador, segundo critérios utilizados na literatura - Imuno Reactive Score 23. Para MMP-9, Metalotioneína, TIMP-2 e Caspase-8 a ausência de marcação (0%) foi definida como “1+”. Marcações entre 1 e 10% foram defi nidas como “2+”. Por sua vez, marcações avaliadas entre 10 e 50%, conferiram o score de “3+”. Já para as observações que continham entre 51 e 80% das células marcadas foram definidas como “4+”. E, por fim, marcações superiores a 80% foram associadas ao sco re de “5+”. Em relação às marcações de PCNA definiu -se o score “1+” para marcações inferiores a 20% das células. Marcações entre 20 e 70% conferiram o status de “2+”. Da mesma maneira, marcações superiores a 70% estabeleceram o score de “3+”. As amostras de tecido congeladas em RNA later à -80ºC foram descongeladas e lavadas em PBS 1X. O RNA total foi extraído a partir de 50 mg de tecido utilizando Trizol Plus RNA Purification Kit (Ambion, part number 12183-555) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total foi quantificado por espectrofotometria à OD 260/280 (NanoDrop2000c, Thermo Scientific). O DNA genômico foi removido usando DNA -free Kit (Ambion, part number AM1906). Em seguida, o cDNA foi sintetizado a partir de 1000 ηg de RNA total utilizando High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (Applied Biosystems, part number 4374966). A PCR em tempo real foi realizada utilizando o equipamento 7500 Fast Real -time PCR System (Applied Biosystems). As seguintes sondas de hidrólise d o tipo TaqMan (Applied Biosystems) 86 foram utilizadas neste estudo: Rn00582935_m1 ( Vegfa), Rn00565719_m1 (Cald1), Rn01514538_g1 (Pcna), Rn99999017_m1 (Tnf), Rn01644671_m1 ( Sparc). Os ciclos de PCR foram os seguintes: um ciclo de 95ºC durante 20 segundos, 40 ciclos de 95ºC por 3 segundos e a 60ºC por 30 minutos. Cada reação de PCR foi realizada em triplicata. Os genes Actb (Rn00667869_m1) e B2m (Rn 00560865_m1) foram utilizados como gene de referência para normalizar as reações. As eficiências das sondas e pri mers foram testadas na reação de amplificação dos genes selecionados. Para esse estudo, foram consideradas ideais as eficiências na faixa de 90 a 110%. A expressão relativa para os genes analisados foi calculada para cada amostra de acordo com o método de 2-ΔΔCT. 3. Resultados Foram utilizadas 30 ratas da rasta Wistar. Dessas, 10 foram utilizadas em cada grupo conforme descrito na metodologia. Não houve perda de animais, não foram observados processos infecciosos ou desprezo de material por qualquer motivo. À análise imunohistoquímica, observamos que não houve material satisfatório para análise nas lâminas confeccionadas para o estudo dos tecidos obtidos do animal de número 10 do grupo PB para os marcadores Metalotioneína, Caspase-8 e Timp-2. Para a análi se de expressão gênica também observamos perdas no estudo por material apresentando quantidade insuficiente de cDNA em algumas amostras, a saber: CALD1 do tecido obtido da lesão ectópica do animal 9, do grupo PA; VEGF, TNF, PCNA, e SPARC do tecido obtido da lesão ectópica dos animais 8, do grupo PB e 1, do grupo C. Imunohistoquímica Na análise Imunohistoquímica dos tecidos obtidos a partir das lesões de endometriose induzidas e endométrio eutópico (útero) as marcações foram quantificadas e realizada análise comparativa entre as diferentes variáveis. Não foram observadas diferenças significativas para os marcadores MMP-9, TIMP-2, Caspase-8 e PCNA. Entretanto, para a Metalotioneína, houve redução significativa de marcação após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como em ectópico (Tabela 1). Tabela 1 - Comparações entre as variáveis relacionadas à imunohistoquímica. Variáveis Grupos C (n=10) PA (n=10) PB (n=10) Total p-valor METALOTIONEINA_UTERO 1+ 0 (0) 9 (90) 8 (88,89) 17 0,0001 3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 5+ 9 (90) 0 (0) 0 (0) 9 METALOTIONEINA_LESAO 1+ 2 (20) 9 (90) 8 (88,89) 19 0,0018 3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 4+ 1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 5+ 7 (70) 0 (0) 0 (0) 7 87 Expressão gênica Detectamos diferenças significativas entre os níveis de expressão de PCNA obtidos na lesão entre os grupos controle e os grupos tratados. No presente estudo não foram observadas diferenças significativas em relação à expressão de CALD1, SPARC, VEGFA e TNF, nas lesões, nos três grupos analisados, conforme é observado na tabela 2. Tabela 2 - Comparação da expressão gênica de PCNA (Lesão) entre os grupos. PCNA (Lesão) Grupo N Média Desvio Padrão p-valor Pós teste de Dunn* C 9 1,21 0,77 0,02 a PA 10 0,48 0,4 b PB 9 0,73 0,27 ab *Letras diferen tes representam diferenças significativas ao nível de significância de 0,05. Expressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. 88 Discussão A capacidade de adesão, invasão e desenvolvimento das lesões de endometriose estão relacionadas ao desequilíbrio entre as enzimas que degradam os componentes da matriz extracelular (como a Metaloproteínase 9 ), e seus reguladores endógenos – os inibidores de tecidos de metaloproteinases (como o Timp -2). A viabilidade do tecido ectópico é atribuída em partes à ocorrência de neoangiogênese estimulada pelo fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e citocinas. O uso de inibidores de neoangiogênese têm sido amplamente estudados no tratamento de endometriose 24-27. β-bloqueadores como o propranolol, devido à sua ação em inibição de neoangiogênese, possuem efeitos antitumorais em diferentes tipos de tumores, e principalmente tumores vasculares 10,11,13,28. Por meio de análises imunohistoquímicas e estudos de biologia molecular foi possível analisar a resposta das lesões experimentalmente induzidas, bem como dos tecidos obtidos a partir de endométrio eutópico. Os anticorpos empregados nas análises imunohistoquímica e em biologia molecular foram Metalotioneína (MT), PCNA, Caspase-8, MMP-9, TIMP-2, VEGFA, TNF, SPARC, CALD1. A MT é uma proteína de baixo peso molecular com papéis funcionais no crescimento celular, diferenciação e reparação, inversamente correlacionada com o índice de apoptose 29-32. Altos níveis de MTs podem estar presentes em tecidos com rápido crescimento e desenvolvimento. As MTs fornecem zinco e cobre para o metabolismo de ácidos nucléicos, síntese de proteínas e outr os processos metabólicos, portanto pode haver uma ligação entre MTs e tumores cancerosos 33. A superexpressão de MT pode proteger as células tumorais da apoptose e, assim, contribuir para a expansão do tumor 34. Para essa proteína houve redução significativa de marcação após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como em ectópico, sugerindo que o tratamento com propranol foi eficaz. O antígeno de proliferação celular ( PCNA) é uma proteína nuclear e sua expressão se relaciona com o estado proliferativo das células 35. O antígeno é expresso no núcleo das células, durante a fase de síntese do DNA. Ele pode ser usado para a classificação de diferentes lesões neoplásicas e benignas com comportamento proliferativo. O PCNA é um marcador de proliferação específica validado que é resistente à fixação 36 Observa-se maior expressão de PCNA entre lesões vermelhas, quando comparadas a lesões brancas e negras 3. Há diferenças relevantes no padrão de expressão de PCNA em diferentes estadios de endometriose e em câncer de endométrio. Demonstrou-se previamente que drogas antiestrogênicas usadas no tratamento da endometriose diminuem a expressão do PCNA, provavelmente por diminuírem a proliferação de células mediadas por estrogênio e consequentemente diminuir as lesões ectópicas 37. A avaliação de paciente s tratadas com agonistas de GnRH e com Sistema Intrauterino liberador de Levonorgestrel (SIU -LNG) mostrou uma redução na proliferação celular avaliada por uma menor expressão de PCNA em células estromais e glandulares do endométrio eutópico e ectópico 38. Esses resultados corroboram o nosso estudo, pois observamos uma menor expressão significativa de PCNA em ratas tratadas com propranolol. Portanto a redução de proliferação celular, devido a uma menor expressão de PCNA sugere uma provável resposta terapêutica. As Caspases são importantes para a apoptose celular e algumas caspases são essenciais para o sistema imunológico, algumas evidências estão emergindo que suportam a existência de muitas outras funções não-apoptóticos destas caspases, que são essenciais para a homeostase do tecido e recuperação pós-lesão. As caspases apoptóticas em células que morrem induzidas pelo stress podem ativar os sinais mitogênicos que cond uzem à proliferação de células vizinhas, um 89 fenómeno denominado “Proliferação Induzida Por Apoptose”. Entretanto, em nosso estudo não houve diferen ça estatísticas significante para a marcação de caspases nos grupos tratados e controle. As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco -dependente que estão envolvidas na degradação de matriz extracelular 39-41. Elas são de grande importân cia em processos fisiológicos e patológicos, tais como angiogênese, infiltração e propagação de tumores malignos. Além disso, elas estão presentes em endométrio eutópico e ectópico 42-44 As MMPs, tem expressão multigênica e quando estão associadas aos seus inibidores tissulares e metaloproteinases (TIMPs) são possíveis mediadores da remodelagem da matriz extracelular 45. Observa-se que a expressão de MMP-2 e MMP-9 em carcinoma maligno é mais elevada que a ob servada em endometriose. MMP-2 foi mais expressa em endometriose colorretal invasiva que em endometriose peritoneal superficial, portanto é possível sugerir que a MMP-2 é um forte fator de promoção da proliferação em tecido endometrial 23. O TIMP-2 (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase) é um membro da família de genes TIMPs. Os TIMPs são uma família de inibidores naturais e específicos das MMPs. Esses dois fatores têm importante papéis na manutenção da estabilidade e integridade estrutural dos componentes da matriz extracelular Mulheres com endometriose expressam baixos níveis de TIMP-2, levando a uma alta atividade proteolítica da MMP e favorecendo a inva são de células endometrióticas. O equilíbrio entre MMPs e TIMPs é importante para manter a atividade adequada de MMP. A incapacidade de manter esse equilíbrio pode auxiliar a degradação da matriz e invasão celular. O estrogênio pode aumentar a expressão de MMP-2 e promover a implantação de tecido endometrial ectópico, entretanto a progesterona pode inibir a expressão de TIMP-2 e melhorar a invasão de endométrio ectópico promovendo sua implantação 46,47. Em nosso estudo não houve diferença significativamente estatística para os grupos controle e tratados em relação à marcação de MMP-9 e TIMP-2. Quanto aos result ados de biologia molecular demonstrados neste trabalho, ao analisar a expressão dos genes: VEGFA, TNF, PCNA, SPARC, CALD1 no grupo controle e nos grupos de lesões tratadas com baixa e alta dose de propranolol, bem como no endométrio tópico desses animais, observamos que não houve diferença significativa da expressão gênica. O Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) colabora com a patogênese e progressão da endometriose pela indução da proliferação celular endotelial, migração, diferenciação, organização em túbulos e formação de capilares. Ademais, alguns trabalhos observaram altos níveis de VEGF no fluido peritoneal, soro, expressão de RNAm e proteínas em pacientes com endometriose 48,49. Esses dados demonstram a importância do VEGF na patogênese da endometriose. Avaliando o resultado obtido em nosso estudo, como não houve diferença significativamen te estatística entre os grupos estudados, provavelmente o propranolol nas doses administradas não foi capaz de inibir a angiogênese e diminuir a expressão de VEGF. O fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina secretada principalmente por macrófagos. Em resposta ao estímulo inflamatório, o TNFα é secretado e pode induzir a morte celular por apoptose ou necrose de algumas linhas de células tumorais. O TNF também pode induzir a proliferação e diferenciação celulares em muitos tipos de células 50. Em nosso estudo não houve diferença significativa entre os grupos estudados, sugerindo que não houve diminuição de expressão de TNF nas ratas tratadas com propranolol. Osteonectina (ON), também co nhecida como proteína secretada ácida e rica em cisteína (SPARC) ou proteína de membrana basal-40 (BM-40) 51. Ela apresenta várias funções biológicas e está relacionada com a angiogênese, proliferação e migração de células tumorais 52. 90 Estudos recentes demonstram que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP pode ser responsável pela perda da homeostase celular em l esões endometrióticas, consequentemente pode auxiliar a implantação e sobrevivência do tecido endometrial ectópico 53. Em nossa amostra, não detectamos diferença significativa nos níveis de expressão de SPARC entre os grupos tratados com alta e baixa dose e o grupo controle de lesões induzidas. Caldesmona (CALD1) é uma proteína de ligação a calmodulina. A CALD1 inibe tonicamente a atividade ATPase da miosina no músculo liso 54. Alguns estudos demonstram que o gene CALD1 é superexpresso em lesões endometrióticas de pacientes com endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual. e em endometrioma ovariano por CGH -array 55,56. CALD1 auxilia a predição de desregulação endometrial em pacientes com endometriose 53. Não foram encontradas diferenças significativas de expressão de CALD1 entre os grupos controle e tratados com propranolol. Uzunlar e colaboradores 57 sugerem que o propranolol possa suprimir o desenvolvimento da lesão endometrióticas devido a sua atividade antiangiogênica pela inibição de VEGF, MMP -2 e MMP -9. O presente estudo não observou essa inibição, entretanto observou uma redução da expressão de MTs, sugerindo que o propranolol possa apresentar uma provável resposta terapêutica. Também observamos uma redução na expressão de Pcna, não corroborada pela redução de marcação imunohistoquímica da proteína PCNA nos grupos estudados. Uma análise in silico revelou uma discordância entre os níveis de expressão do transcriptoma e proteínas associada com o processo da endometriose (Wren et al., 2007). Isto sugere que a expressão gênica não é somente regulada em nível de transcriptoma, mas que mecanismos regulatórios pós -transcricionais possam atuar na endometriose. 5. Conclusões No presente estudo de lesões endometrióticas experimentalment e induzidas em ratas e tratadas com propranolol observou-se redução significativa de marcação de Metalotioneína após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como em ectópico, sugerindo que o tratamento com propranol foi eficaz. Tais achados nos permitem crer em futuras abordagens no tratamento clínico da endometriose que podem incluir inibidores de neoangiogênese. 6. Referências Bibliográficas 1. Farquhar C. Endometriosis. Bmj 2007;334:249-53. 2. Dabrosin C, Gyorffy S, Margetts P, Ross C, Gauldie J. Therapeutic effect of angiostatin gene transfer in a murine model of endometriosis. The American journal of pathology 2002;161:909-18. 3. Fujishita A, Hasuo A, Khan KN, Masuzaki H, Nakashima H, Ishimaru T. 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