{"paper_id":"7ad68e4f-4cdd-48d7-a445-f2f552b72496","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \nJOSÉ VITOR CABRAL ZANARDI \n \n \n \n \n \nInfluência de agentes antiangiogênicos (propranolol) em endometriose \nexperimentalmente induzida em ratas \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão preto \n2017 \n\n    \n \n \n \nJOSÉ VITOR CABRAL ZANARDI \n \n \n \n \n \nInfluência de agentes antiangiogênicos (propranolol) em endometriose \nexperimentalmente induzida em ratas \n \n \n \n \n \nTese de doutorado apresentada ao \nDepartamento de Ginecologia e \nObstetrícia da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto - Universidade de São \nPaulo para obtenção do título de Doutor  \nem Ciências Médicas. \n \nÁrea de concentração: Tocoginecologia \n \nOrientador: Prof. Dr. Júlio César Rosa e Silva \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2017 \n\n    \n \n \n \nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por \nqualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e \npesquisa, desde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nZanardi, José Vitor Cabral.  \n \n Influência de agentes antiangiogênicos ( propranolol) em \nendometriose experimentalmente induzid a em ratas. / José Vitor \nCabral Zanardi:  orientador Júlio Cé sar Rosa e Silva. Ribeirão Preto, \n2017. \n 83f.: il.  \n \nTese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto  \nUniversidade de São Paulo, 2017. \n \n \n \n1.Endometriose. 2.Angiogênese.  3.Proliferação celular.  \n4.Apoptose. 5. Propranolol. 6. Ratas \n \n \n \n \n\n    \n \n \n \nZANARDI, José Vitor Cabral.  Influência de agentes antiangiogênicos \n(propranolol) em endometriose experimentalmente induzida em ratas . Tese \napresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São \nPaulo para a obtenção de título de Doutor em Tocoginecologia. \n  \nAprovado em:  \n \n \nBanca Examinadora \n \n \n \nProf. Dr. _____________________  Instituição: _____________________ \nJulgamento: __________________  Assinatura: \n_____________________  \n \nProf. Dr. _____________________  Instituição: _____________________ \nJulgamento: __________________  Assinatura: \n_____________________  \n \nProf. Dr. _____________________  Instituição: _____________________ \nJulgamento: __________________  Assinatura: \n_____________________  \n \nProf. Dr. _____________________  Instituição: _____________________ \nJulgamento: __________________  Assinatura: \n_____________________  \n \nProf. Dr. _____________________  Instituição: _____________________ \nJulgamento: __________________  Assinatura: \n_____________________  \n \n \n\n    \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedicatória \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n                                               \n \nAos meus pais , Alcinéia e José Vital , pelos primeiros e mais \nimportantes ensinamentos, e todas as oportunidades que me \nproporcionaram desde o meu nascimento. \n \nÀ Cecilia, esposa amada, amor da minha vida, companheira em \ntodas as horas, apoio incondicional a todos os meus sonhos. \n \nÀ Helena e à Alice , filhas lindas, maio res bens da vida, fontes \nde inspiração para tudo que eu faço e planejo fazer. \n \n\n    \n \n \n \nAos meus irmãos Janeliz e Luiz Marcel  pela torcida, mesmo à \ndistância, e carinho que mutuamente nos fortalece. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAgradecimento especial                                 \n \n                                                   \n \n \n \n \n \nAo meu orientador, professor Júlio Cé sar Rosa e Silva , mais \nque um professor, um amigo que me ensina diariamente. Dos \nmais básicos conceitos bioquímicos, passando por sofisticados \nproblemas estatístico s, aos mais complexos dilemas \nprofissionais. Agradeço por todos os ensinamentos, sobretudo a \nresiliência.  \n\n    \n \n \n \n \nAgradecimentos \n A toda minha família que sempre me apoiou e manifestou palavras de \nânimo. \nAo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMUSP - Ribeirão Preto \nque permitiu realizar e concluir este projeto \nÀ Comissão de Pós-graduação em Tocoginecologia pelo apoio e incentivo em \ntantas ocasiões e a todos que compõe o Departamento de Ginecologia e Obstetrícia \nda Faculdade de Ribeirão Preto, pelo contín uo aprendizado, indispensável à minha \nformação profissional.   \nAos funcionários Sra. Ilza Alves Rezende Mazzocato, Sr. Reinaldo Tavares, \nSra. Rosane  Casula, Gabriela Francisco Sicca e Suelen Soares,  incansáveis \ncolaboradores de minha jornada. \nÀ Dra. Julian a Meola pelo s inestimáveis conselhos, correções e co -\norientações.  \nÀs amigas Cristiana Carolina Padovan e Lilian Eslaine Costa Mendes da \nSilva, indispensáveis aos passos técnicos, e principalmente pela amizade que \ntornaram a caminhada mais amena e prazerosa.   \nA todos os funcionários do Setor de Cirurgia Experimental do Hospital, José \nCarlos Vanni, Paulo Alves Junior, Paulo Castilho, Danniely da Silva Barros, Wagner \nAndrade de Oliveira, Daniel Mazetto e Ariane Mirela Saranzo Sant’Ana,  por todos \nincontáveis momentos que me auxiliaram e se dedicaram para a conclusão do meu \nprojeto. \nAos amigos do Setor de Vídeo-endoscopia Ginecológica do Departamento em \nespecial os grandes colegas Dra. Ana Carolina Tagliatti Zani, Dra. Júlia K. Troncon, \nDr. Fenando Passador Val ério, Dr. Guilherme Augusto da Silva Moraes, e aos \nProfessores Drs. Omero Benedicto Poli -Neto e Antônio Alberto Nogueira , pela \nalegria que tem sido conviver com vocês, dentro e fora do trabalho. \n\n    \n \n \n \nÀ grande amiga Dra. Giovana da Gama Fortunato, que me apoiou, muito se \ndedicou, enormemente contribuiu, e foi indispensável à minha formação. \nÀ mestre e doutaranda em ciências Gabriela Campos de Oliveira Filgueira \npela inenarrável contribuição, dedicação e comprometimento. \nAo chefe do Departamento de Patologia Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto, Prof. Dr. Alfredo Ribeiro da Silva, pelo apoio, incentivo e conhecimento \nrepassados. \nAos roedores, animais do Laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade \nde Medicina de Ribeirão Preto que participaram deste estudo pela inestimável \nserventia.  \nA todos que direta ou indiretamente contribuíram  para realização deste \ntrabalho. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n    \n \n \n \n \nRESUMO \nZANARDI, J . V. C. Influência de agentes antiangiogênicos ( propranolol) em \nendometriose experimentalmente induzida em ratas . 2016. 83 f.  Tese \n(Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, \n2016. \n \nPropõe-se que a angiogênese represente um importante passo no processo \nde adesão, implantação, invasão e crescimento das células endometriais, visto que, \nsemelhante aos tumores metastáticos, implantes endometrióticos dependem de \nneovascularização para se proliferarem. Tal constatação sugere que a supressão do \ndesenvolvimento de vasos sanguíneos por meio da inibição de fatores angiogênicos \nespecíficos pode ser uma nova oportunidade terapêutica na abordagem da \nendometriose. Estudos d emonstram um efeito antiangiogênico do propranolol \nanticancerígeno em diferentes tipos de tumores. Tal achado sugere que o \npropranolol pode contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de \nneoangiogênese, e tal efeito resultar em um impacto s obre as lesões de \nendometriose. Foi estudado o efeito do propranolol sobre marcadores de \ndiferenciação (Metalotioneínas MT1 e MT2) , invasão (MMP9 e TIMP2) , proliferação \ncelular (PCNA) e apoptose (CASP8 – caspase 8) por coloração imunohistoquímica, \ne também a influência sobre a adesão, motilidade e angiogênese das lesões de \nendometriose por quantificação da expressão relativa (RQ) por PCR em tempo real \ndos genes Vegf, Cald1, Pcna, Tnf e Sparc. Foram utilizadas 30 ratas adultas Wistar, \nfêmeas, virgens que foram submetidas a laparotomia para indução de lesões de \nendometriose. As ratas foram separadas em três grupos, e sacrificados após 14 dias \nde tratamento de dose baixa (PB, n = 10) e dose elevada (PA, n = 10) de \npropranolol; e o grupo de controlo (C, n = 10) sem  tratamento. As lesões foram \nexcisadas para análise histológica com o corno uterino contralateral, com \nconfirmação da presença de tecido glandular e estroma endometrial . No presente \nestudo foi observada uma redução na marcação imunohistoquímica para \nMetalotioneínas, com 60% de positividade no grupo controle, 10% e 11,1% para o \nPA, PB, respectivamente ( p <0,05 ). Também observamos  uma diminuição na \nexpressão do gene de Pcna (C = 1,04; PA = 0,32; PB = 0,69). Em outros \nmarcadores de imunohistoquímica e quantificação da expressão gênica nas lesões e \nno tecido uterino não foram observadas diferenças significativas.  O tratamento com \ndrogas antiangiogê nicas como propranolol oferece novas perspectivas de \nabordagem terapêutica para pacientes com endometriose. \n \nPalavras-chave: Endometriose. Angiogênese. Proliferação celular. Apoptose. \nPropranolol. Ratas. \n \n \n \n\n    \n \n \n \nABSTRACT \n \nZANARDI, J. V. C.  Effect of anti -angiogenics drugs (propranolol) in \nexperimentally induced endometriosis in rats. 2016. 83 f.  Tese (Doutorado) - \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2016. \n \nSince endometrial implants rely on neovascularization to proliferate, in a \nsimilar way to metastatic tumors, it is proposed that angiogenesis represents an \nimportant step in the process  of ad hesion, implantation, invasion and growth of \nectopic endometrial cells. Th ese findings suggest that the suppression of the \ndevelopment of blood vessels by inhibition of specific angiogenic factors may be a \nnew therapeutic opportunity in endometriosis appro ach. Studies demonstrate an \nantiangiogenic anticancer effect of propranolol in different types of tumors. This drug \ncan play a role in the inhibition of neoangiogenesis, which could  interfere on the \ngrowth of endometriotic lesions. The effect of propranolo l on markers of \ndifferentiation ( Metallothionein, MT1 and MT2), invasion (MMP9 and TIMP2), cell \nproliferation (PCNA) and apoptosis (CASP8 - caspase 8) was evaluated by \nimmunohistochemical staining, a s well as  the influence of propranolol on adhesion, \nmotility and angiogenesis of  both endometriotic lesions and endometrial tissue \nthrough quantification of relative expression (RQ) by real -time PCR o f the genes \nVegf, Cald1 , Pcna, Tnf and Sparc. Thirty Wistar adult rats, females, virgins who \nunderwent laparotomy  for induction of endometriosis lesions were used. The rats \nwere divided into three groups, and sacrificed after 14 days of low (BP, n = 10) and \nhigh dose treatment (AP, n = 10) of propranolol; and the control group (C, n = 10) , \nuntreated. The lesions were  excised for histological analysis with the contralateral \nuterine horn, with confirmation of the presence of glandular tissue and endometrial \nstroma. In the present study we observed a reduction in immunostaining for \nMetallothioneins, with 60% positive in the control group, in comparison to 10% and \n11.1% for PA  and PB, respectively (p <0.05). Furthermore, there was a decrease in \nexpression of Pcna gene ( C = 1.04; PA  = 0.32; PB = 0.69)  which was statistically \nsignificant (p<0.05) . However, quantification of gene expression regarding other \nimmunohistochemical markers evaluated both in the endometriotic lesions and \nuterine tissue showed no statistically significant difference. In conclusion, anti-\nangiogenic drugs like propranolol may offer new perspectives for the therapeutic \napproach of patients with endometriosis. \n \nKeywords: Endometriosis. Angiogenesis. cell proliferation. Apoptosis. \nPropranolol. Rats. \n \n \n \n \n \n\n    \n \n \n \nLISTA DE TABELAS \n \nTabela 1 - Avaliação do Kappa de \nCohen............................................................... \n \n36 \nTabela 2 - Comparações entre as variáveis relacionadas a \nimunohistoquímica..... \n \n39 \nTabela 3 - Concordância entre as variáveis da lesão e do útero em cada \ngrupo..................................................................................................... \n \n \n41 \nTabela 4 - Comparação da expressão gênica de Pcna (Lesão) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n43 \nTabela 5 - Comparação da expressão gênica  de Sparc (Lesão) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n43 \nTabela 6 - Comparação da expressão gênica de Cald1 (Lesão) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n43 \nTabela 7 - Comparação da expressão gênica de Tnf (Lesão) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n44 \nTabela 8 - Comparação da expressão gênica de Vegfa (Lesão) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n44 \nTabela 9 - Comparação da expressão gênica de Vegfa (Útero) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n44 \nTabela 10 \n- \nComparação da expressão gênica de Tnf (Útero) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n45 \nTabela 11 Comparação da expressão gênica de Pcna (Útero) entre os  \n\n    \n \n \n \n- grupos.................................................................................................... \n \n45 \nTabela 12 \n- \nComparação da expressão gênica de Sparc (Útero) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n45 \nTabela 13 \n- \nComparação da expressão gênica de Cald1 (Útero) entre os \ngrupos.................................................................................................... \n \n \n46 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n    \n \n \n \n \n \nLISTA DE FIGURAS \n \nFigura 1 - Rata submetida a laparotomia............................................................. \n \n30 \nFigura 2 - Técnica de indução de lesão de endometrios e. Ressecado cerca de \n4 cm do corno uterino direito seguido de sutura do coto proximal...... \n \n \n31 \nFigura 3 - Corno uterino ressecado submetendo-se a preparo........................... \n \n31 \nFigura 4 - Fragmento de corno uterino................................................................ 32 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n    \n \n \n \n \nLISTA DE ABREVIATURAS \n \nABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas \nACTB: Beta cytoskeletal actin \nARS: Prof. Dr. Alfredo Arruda e Silva \nB2M: Beta-2-microglobulin  \nBM: Membrana basal \nC2: grupo de ratas controle \nPA: grupo de ratas que receberam alta dose da droga propranolol   \nCALD1: Caldesmon CALM2: Calmodulin 2(phosporilase kinase, delta)  \nCASPASE 8: caspase 8 \nPB: grupo de ratas que receberam baixa dose da droga propranolol \nCd; Cádimo \ncDNA: Ácido desóxi-ribonucléico \nCU: Cobre \nDAB: 3,3 diaminobenzina \nFMRP-USP: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo  \nHE: Hematoxilina-eosina \nHg: Mercúrio \nJZ: Mestre em Patologia Juliana Zanetti \nKDa: Kilodalton- unidade de massa molecular \nL: lesão  \nMEC: Matriz extracelular \nMMPs: Metaloproteínases \nMT1 e MT2: Metalotioneinas \nON: Osteonectina \nPBS: Tampão de solução salina \nPCNA: Antígeno nuclear celular proliferativo \nPCR: Reação em cadeia da polimerase \nPH: Potencial hidrogeniônico  \nPPIA: Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase \nRNA: Ácido ribonucleico \n\n    \n \n \n \nSPARC: Secreted protein acidic and rich in cysteine \nSNP: Polimorfismo nucleotídeo individual \nTBS: Tris buffered saline \nTIMPs: Inibidor tecidual de Metaloproteínases  \nTNF: Fator de necrose tumoral \nTNFR: Receptor Fator de necrose tumoral-Receptor \nU: útero  \nUSP: Universidade de São Paulo  \nUK: United Kingdom \nVEGF: Fator de crescimento endotelial vascular \nZn: Zinco \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n    \n \n \n \nLISTA DE SÍMBOLOS \n \n%: porcentagem \ng/L: grama por litro \ng: grama \nM: molar \nmg: miligrama \nmg/kg: miligrama por kilograma \nmL: mililitro \nmM: milimolar \nng: nanograma \nºC: graus Celsius \nµg: micrograma \nµL: microlitro  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \nSUMÁRIO \n \n1 Introdução…………………………………………………………………..………… 18 \n2Justificativa..…………………………………………..…………………………... 24 \n3 Objetivos.....………………………………………………………………………….. 26 \n3.1 Objetivo geral................................................................................................... 27 \n3.2 Objetivos específicos…………………………………………………………….. 27 \n4 Metodologia…..................…………………………………………………………... 28 \n4.1 Aspectos éticos.................……………………………………………………….... 29 \n4.2 Técnica de indução das lesões de endometriose..………………………….... 30 \n4.3 Obtenção das lesões para análise histológica e molecular............................. 32 \n4.4 Protocolo de imunohistoquímica.........…………….……………………………... 33 \n4.5 Expressão gênica (extração do RNA total, síntese do cDNA, quantificação \npor PCR em tempo real..............................................…………………..…………. \n \n34 \n4.6 Análise estatística.......……………………………………………………………... 35 \n5 Resultados..........................................………..………………………………..... 37 \n5.1 Caracterização dos grupos e perdas...........……………………………..……… 38 \n5.2 Imunohistoquímica..........................……………………………………………. 38 \n5.3 Expressão gênica............................................................................................. 42 \n6 Discussão………………………………………………………………………...…... 47 \n7 Conclusões..................……………………………………………………………… 55 \nReferências bibliográficas…………………………………………………........... 57 \nAnexo.................................................................................................................... 76 \nApêndice............................................................................................................... 78 \n \n \n \n \n \n \n \n\n18 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1. Introdução \n\n19 \n \n \n \nA endometriose é definida pela presença de tecido endometrial, seja ele \nglandular ou estromal, fora da cavidade uterina, denominado endométrio ectópico \n(Farquhar, 2007). Afeta 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva (Dabrosin et \nal., 2002). \nA endometriose é considerada atua lmente um problema de saúde pública \ndevido ao seu impacto na saúde física e psicológica, bem como ao impacto \nsocioeconômico diante dos custos para o seu diagnóstico, tratamento e \nmonitoramento (Gao et al., 2006; Signorile e Baldi, 2010; Nnoaham et al., 2012).  \nA patogenia da endometriose ainda não pode ser compreendida por apenas \numa hipótese. A presença de células epiteliais endometriais com características de \nadesão, implantação, crescimento e angiogênese no fluid o peritoneal (Kruitwagen et \nal., 1991), bem como a associação entre fluxo menstrual obstruído e o diagnóstico \nde endometriose corroboram para que a hipótese da menstruação retrógrada de \nSampson  seja a mais aceita .  Entretanto, é importante salientar que apenas o \nrefluxo tubário não é suficiente para estabelecer a doença, pois, 90% das mulheres \npossuem menstruação retrógrada e apenas 10 a 15% destas desenvolvem \nendometriose (Sampson, 1927; Olive e Henderson, 1987). \nOutras conjecturas são ampla mente discutidas, como a imunológica e \nmetaplasia celômica. O aparecimento de endometriose em homens, mulheres que \nnunca menstruaram e pré -puberes, bem como em locais como as meninges e a \ncavidade pleural pode ser explicado pela metaplasia de células da li nhagem \nperitoneal. O surgimento de lesões de endometriose na pleura, cicatriz umbilical, \nespaço retroperitoneal, vagina e colo do útero pode ser explicado pela disseminação \nlinfática e hematogênica de células endometriais (Ridley, 1968; Suginami, 1991; \nBraun et al., 2002; Chung, H. W. et al., 2002; Witz et al., 2002). \nO sistema imunológico também é de suma importância no desenvolvimento \nde endometriose, pois acredita -se que o endométrio ectópico possui a capacidade \nde promover uma resposta autoimune patológica devido a supressão de células do \nsistema imune e a imunovigilância debilitada de pacientes que desenvolveram \nendometriose (Lebovic et al., 2001; Siristatidis et al., 2006) \nA proliferação das células endometria is e a adesão ao peritônio podem \nocorrer pela produção de citocinas inflamatórias por essas células endometriais \nectópicas. As células endometriais, após a adesão, são induzidas principalmente \n\n20 \n \n \n \npelas enzimas metalopr oteinases de matriz (MMPs) a invadirem a matriz \nextracelular. Macrófagos locais produzem as interleucinas 1 e 8 (IL -1 e IL -8), que \nestimulam a produção de MMPs, facilitando o desenvolvimento de endometriose (Liu \net al., 2015; Xin et al., 2015; Yang et al., 2015). Em seguida, o fator de crescimento \nvascular endotelial (VEGF) e o fator de transformação do crescimento beta (TGF -β) \nproduzidos por macrófagos, juntamente com IL -8 e o fator de necrose tumoral alfa \n(TNF-α) estimulam a angiogênese, possibilitando o cresci mento de células \nendometriais e contribuindo para a manutenção do endométrio ectópico (Dela Cruz e \nReis, 2015). \nA interleucina (IL) 1β, a IL -1 dominante secretada por macrófagos peritoneais \nativados, desempenha um importante papel na neovascularização de lesões \nendometrióticas (Lebovic et al., 2000). Foi evidenciada a secreç ão de IL-6 e IL-8 de \nforma robusta por culturas de células do estroma endometrial humano de mulheres \ncom endometriose (Rocha et al., 2012). IL-6 é uma proteína multifuncional potente, \nque promove a proliferação de células do endométrio e a angiogênese (Giudice et \nal., 1994; Cohen  et al. , 1996) ; a sua secreção é elevada no tecido endometrial \nectópico e as suas concentrações são elevadas no fluido peritoneal de pacientes \ncom e ndometriose (Keenan et al. , 1994) . IL -8 é uma citocina pró -inflamatória q ue \ninduz a quimiotaxia de neutrófilos e tem um efeito estimulador potente da \nangiogênese (Koch et al., 2001; Arici, 2002). \nA expressão e a secreção de IL -8 e VEGF, a partir de células estromais do \nendométrio humano é modulada pela Activina A. O endométrio humano é uma fonte \ne destino de Activina A, que é um membro da superfamília de fator de crescimento \ntransformante β, com efeitos sobre a inflamação e a angiogênese (Florio et al. , \n2007). VEGF é um dos fatores angio gênicos mais potentes e específicos. Os seus \nefeitos incluem a proliferação celular endotelial, migração, organização em túbulos, e \npermeabilidade melhorada, os quais participam na cascata angiogênica (Muller e \nGriesmacher, 2000). A expressão endometrial de VEGF é aumentada pelo estradiol \ne as suas concentrações estão correlacionados com a neovascularização e aumento \nda permeabilidade vascular durante a fase proliferativa tardia (Charnock-Jones et al., \n2000). Alterações cíclicas na expressão de VEGF ao longo do ciclo menstrual são \nobservados com expressão máxima durante a fase secretora e menstruação \n(Shifren et al. , 19 96; Charnock -Jones et al. , 2000; Mclaren, 2000) ; VEGF foi \n\n21 \n \n \n \nobservada no epitélio e em células do estroma de implantes de endometriose, sendo \nmais expresso no epitélio. Além disso, as células de endometriose podem sintetizar \ne secretar o VEGF (Shifren et al., 1996; Gargett e Masuda, 2010). \nPortanto a angiogênese também representa um importante passo nesse \nprocesso. Visto que, semelhante aos tumores metastáticos, implantes \nendometrióticos dependem de neovascularização  para se estabelecerem, \nimplantarem e invadirem (Fujishita et al., 1999; Taylor  et al., 2002; Gescher  et al., \n2003). De fato, uma peculiar característica dos implantes endometrióticos são suas \nvascularizações densa s (Nisolle et al. , 1993) . Isso nos traz a ideia de que a \nsupressão do desenvolvimento de vasos sanguíneos por meio da inibição de fatores \nangiogênicos específicos pode ser uma nova opo rtunidade terapêutica no \ntratamento da endometriose (Hull et al., 2003; Nap et al., 2004; Olive et al., 2004). \nO padrão ouro no diagnóstico de endometriose é a visualização direta de \nlesões por via laparoscópica, a companhada de confirmação histológica da presença \nde pelo menos duas das seguintes características: macrófagos contendo \nhemossiderina ou epitélio endometrial, glândulas ou estroma (Bulletins--Gynecology, \n2000). \nAs opções terapêuticas vigentes para o tratamento de endometriose in cluem \ncirurgia, tratamentos clínicos, e a associação de ambos. A opção a ser adotada \ndepende de fatores como o estadiamento da doença, sintomatologia, a idade da \npaciente e desejo de concepção (Petta et al., 2009). \nAs abordagens, no entanto, têm limitações significativas. Os tratamentos \nclínicos que atuam por meio de modulações hormonais (contraceptivos hormonais, \nprogestágenos, anti-progestágenos, análogos e antagonistas do GnRH, e inibidores \nda aromatase) podem bl oquear a ovulação e culminam com um microambiente \nhipoestrogênico (Brown e Farquhar, 2014) . Logo, essa opção é inadequada para \npacientes que possuem infertilidade associada à endometriose e que pretendam \nconceber normalmente (Dunselman et al. , 2014) . Além disso, pode haver \nsignificativa recidiva dos sintomas (Streuli et al. , 2013)  e até 25% das pacientes \nterão efeitos secundários intoleráveis, ou resposta clínica insuficiente (Vercellini et \nal., 2009) . Possivelmente, lesões com fibrose extensa e eventuais distorções \nanatômicas s ão menos susceptíveis à modulação hormonal (Remorgida et al. , \n2005). A intervenção cirúrgica é o tratamento de escolha para formas graves de \n\n22 \n \n \n \nendometriose refratárias ao tratamento clínico, como endometriose profund a \ninfiltrativa com acometimento intestinal sintomático, eventuais estenoses de ureter e \ngrandes massas anexiais sintomáticas (Vercellini et al., 2009; Meuleman et al., 2011; \nAbrao et al., 2015).  \nA remoção cirúrgica das lesões de endometriose profunda infiltrativa pode ser \ncomplexa e os resultados são altamente dependentes das habilidades e experiência \nda equipe cirúrgica. Uma recente meta -análise revelou que as taxas de \ncomplicações para a anastomose do intestino e m ressecção de lesões de \nendometriose foram de 2,7% de fístula reto -vaginal, de 1,5% para deiscência de \nanastomose e 0,34% para os abscessos pélvicos. As técnicas menos agressivas \napresentaram taxas ligeiramente mais baixas, mas foram associadas com um \naumento da recorrência, entre 5,8-17,6% (Meuleman et al., 2011).  \nPortanto, em virtude da ausência de um tratamento  que contemple melhora \nclínica significativa associada à possibilidade de gestação espontânea, sem que \naumente os riscos ou a morbidade da paciente, compreende -se haver uma lacuna \nno tratamento de endometriose, e, por conseguinte, novas opções terapêuticas  \ndeverão ser aventadas. \nO propranolol é um antagonista competitivo dos receptores adrenérgicos \nbeta-1 e beta -2. Foi um dos primeiros β -bloqueadores desenvolvidos para uso na \nclínica (Mak e Weglicki, 2004).  O bloqueio competitivo do recep tor beta-adrenérgico \nfoi demonstrado no homem através de um deslocamento paralelo para a direita da \ncurva de resposta da frequência cardíaca aos beta -agonistas versus dose, tal como \na isoprenalina (Black et al., 1965). Cloridrato de propranolol é uma mistura racêmica \ncuja forma ativa é o isômero S( -)-propranolol. Com exceção da inibição da \nconversão da tiroxina à triiodotironina , é improvável que qualquer propriedade \nadicional inerente ao isômero R(+) do propranolol desencadeie efeitos terapêuticos \ndiferentes, em comparação com a mistura racêmica (Silber e Riegelman, 1980) . O \npropranolol é completamente absorvido após administração oral, e as concentrações \nplasmáticas máximas ocorrem entre 1 e 2 horas após a administração em pacientes \nem jejum (Routledge e Shand, 1979) . O fígado remove até 90% de uma dose oral, \ncom uma meia -vida de eliminação de 3 a 6 horas. O propranolol é ampla e \nrapidamente distribuído pelo corpo, sendo que  concentrações mais altas ocorrem \n\n23 \n \n \n \nnos pulmões, fígado, rins, cérebro e coração. O propranolol apresenta um alto índice \nde ligação às proteínas plasmáticas (90-95%) (Shand, 1976). \nHá relatos de que β -bloqueadores como o propranolol possuem efeitos \nanticancerígeno em diferentes tipos de tumores (Glasner et al., 2010; Storch e \nHoeger, 2010; Ji  et al. , 2012; Xu  et al. , 2013) . Também se observou o efeito \nantitumoral dos β-bloqueadores em sarcomas in vivo e in vitro (Ji et al., 2012; Stiles \net al. , 2013) , diversos tumo res vasculares possuem receptores β -adrenérgicos \n(Chisholm et al., 2012). Por fim, Pasquier  e colaboradores relataram a existência de \num sinergismo entre quimioterapia e β -bloqueadores em câncer de mama e \nneuroblastoma, por mecanismos ainda não totalmente elucidados (Pasquier et al. , \n2011; Pasquier et al., 2013). Em conjunto, tais a chados sugerem que o propranolol \npode contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese, e \ntal efeito resultar em um impacto sobre as lesões de endometriose.  \nA condução de estudos em endometriose que versem sobre a resposta clínica \nfrente à intervenção medicamentosa requer métodos invasivos. E, portanto, para \nque novas opções terapêuticas sejam testadas lança -se mão de modelos animais \ndefinidos (Rosa-E-Silva et al. , 2010) . Modelos experimentais têm sido produzidos \ncirurgicamente em animais de pequeno porte, como coelhos, ratos e camundongos \n(Vernon e Wilson, 1985; Sharpe -Timms, 2002; Rosa-E-Silva et al., 2010). O modelo \nem roedores proposto por Jones é amplamente aceito (Jones, 1984). Com técnica \ncirúrgica simples, permite implantação com sucesso das lesões o que torna a \nindução de endometriose efetiva e reprodutível (Schor et al., 1999). \nEm face à sugestão de que o  propranolol possa contribuir clinicamente \nexercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese e tal efeito resultar em um \nimpacto sobre as lesões de endometriose, foi proposto o uso dessa droga em um \nmodelo experimental consagrado (Jones, 1984; Vernon e Wilson, 1985; Schor  et al., \n1999; Sharpe -Timms, 2002; Rosa -E-Silva et al. , 2010)  para a observação do \ncomportamento de lesões de endometriose in vivo, com e sem tratamento, e aventar \numa nova opção terapêutica clínica no tratamento de pacientes com endometriose. \n \n \n \n \n\n24 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2. Justificativa \n\n25 \n \n \n \nA patogênese da endometriose necessita de atividade de neoangiogênese. A \ncascata angiogênica inclue a proliferação celular endotelial, migração, organizaçã o \nem túbulos, e permeabilidade melhorada, regulada por fatores de crescimento e \ncitocinas, e regulação metabólica em que intervém agentes estimuladores e \ninibidores da matriz intersticial tumoral. Drogas com ação de inibição angiogênica \ndevem ter efeito sobre as lesões endometrióticas experimentalmente induzidas.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n26 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3. Objetivos \n\n27 \n \n \n \n3.1 Objetivo geral \n \nAvaliar o efeito do propranolol sobre endometriose experimentalmente \ninduzida em ratas. \n \n \n3.2 Objetivos específicos \n \nAvaliar a influência do propranolol e seu efeito antiangiogênico sobre o útero e \nlesões de endometriose experimentalmente induzidas: \n1) Investigar o comportamento de marcadores de diferenciação  (MT1 e MT2 \n– Metalotioneínas 1 e 2 ), invasão (MMP9  – matrix metallopeptidase 9  e \nTIMP2 – metallopeptidase inhibitor 2 ), proliferação (PCNA- proliferating \ncell nuclear antigen ) e apoptose celular  (CASP8 – caspase 8 ) por \nimunohistoquímica;  \n2) Avaliar a expressão de genes envolvidos em adesão e motilidade (Cald1 – \ncaldesmon 1), angiogênese (Vegfa – vascular endothelial growth factor A e \nSparc – secreted protein acidic and cysteine rich ), regulação da \nproliferação celular, indução de apoptose e resposta inflamatória ( Tnf – \ntumor necrosis factor ) nas lesões de endometr iose e útero por PCR em \ntempo real de ratas submetidas ao tratamento. \n  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n28 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4. Metodologia \n \n\n29 \n \n \n \n4.1 Aspectos éticos \nApós uma vasta revisão da literatura sobre o tema e aprovações pela \nComissão de Pesquisa do Departamento de Gineco logia e Obstetrícia da Faculdade \nde Medicina de Ribeirão Preto  (protocolo nº 339/2011) e pela Comissão de Ética em \nExperimentação Animal (protocolo 183/2011), foram solicitadas as ratas e aplicado o \nmodelo técnico -cirúrgico para indução de lesões de endom etriose (Jones, 1984; \nVernon e Wilson, 1985; Schor et al., 1999; Sharpe-Timms, 2002; Rosa-E-Silva et al., \n2010).  \nO estudo foi realizado no Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, \nDepartamento de Patologia e Med icina Legal e Setor de Cirurgia Experimental da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP -\nUSP). Foram utilizadas trinta ratas Wistar, virgens, da mesma ninhada, de \naproximadamente 250 g no início do experimento, idade de qu arenta e nove dias, \nprovenientes do Serviço de Biotério do Campus Universitário de Ribeirão Preto. Tais \nratas, mantidas em ad libitum  (livre acesso à água e ração Nuvilab CR1 \nautoclavável), inicialmente permaneceram por sete dias para ambientarem -se em \ngaiolas metabólicas (41 cm x 32 cm x 17 cm) sob controle de umidade e temperatura \n(22º a 25°C) e regime de luz com ciclo claro -escuro de 12/12 horas. Após este \nperíodo, os grupos, descritos abaixo, foram submetidos à laparotomia para indução \nda lesão de endometriose. \nOs animais foram alocados em 3 grupos de 10 animais divididos da seguinte \nforma: \nGrupo C (controle, n=10): ratas com endometriose induzida \nexperimentalmente e sem tratamento da droga no pós-operatório. \nGrupo PB (propranolol baixa dose, n=10): rata s que receberam diariamente \ndroga propranolol em baixa dose (0,05 mg/Kg) por 2 semanas após 4 semanas da \ncirurgia para indução das lesões. \nGrupo PA (propranolol alta dose, n=10): ratas que receberam diariamente \ndroga propranolol em alta dose (0,1 mg/kg) po r 2 semanas após 4 semanas da \ncirurgia para indução das lesões. \n \n \n4.2 Técnica de indução das lesões de endometriose \n\n30 \n \n \n \nA indução da lesão de endometriose foi realizada após injeção intramuscular \ncom 1 ml de Xilazina 2 mg/mL (Dopaser, Hertape Calier), e 1 ml cloridrato de \ncetamina 10% (Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional AS, Uso \nveterinário), sendo 0,15 unidades para cada 100 g de peso do animal.  A figura 1 \nrepresenta as estruturas observadas no momento da laparotomia. \n  Figura 1 –  Rata subme tida a laparotomia. Identificação de estruturas. A: \novário; B: trompa uterina; C: útero (lobo esquerdo); D: cérvix \nuterino; E: gordura abdominal: F: fígado; G: cécum; H: intestino \ndelgado. \n \nApós anestesia, foi realizado tricotomia pélvica, seguida dos cuid ados de \nantissepsia com lavagem das luvas de látex com soro fisiológico para redução da \nformação de aderências. Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo \npesquisador. A cavidade pélvica foi aberta com incisão longitudinal mediana de \naproximadamente 2 cm, sendo a 2 cm do púbis do animal. Posteriormente, \nressecado cerca de 4 cm do corno uterino direito seguido de sutura do coto \nproximal. A porção uterina dissecada foi imersa em soro fisiológico 0,9% a 4°C por \ncerca de 2 minutos e então incisada longi tudinalmente, sendo retirado dois \nfragmentos de 5 x 5mm. Estes fragmentos de tecido endometrial foram suturados ao \nperitônio próximo ao trato reprodutivo da rata utilizando fio Vicryl 6.0 com a face \nendometrial livre voltada para a cavidade abdominal, send o um fragmento suturado \n\n\n31 \n \n \n \na direita e outro a esquerda, com posterior fechamento da incisão cirúrgica. \nNenhuma suplementação hormonal ou antimicrobiana foi administrada antes ou \napós a laparotomia. \nFigura 2 –  Técnica de indução de lesão de endometriose. Re ssecado cerca de 4 cm do corno \nuterino direito seguido de sutura do coto proximal. \n \n\n\n32 \n \n \n \nFigura 3 – Corno uterino ressecado submetendo -se a preparo. Corno uterino ressecado submetido \na  \nincisão longitudinal e 2 fragmentos de 5mm x 5mm são suturados ao peritôni o em cada \nlado da parede abdominal com a face endometrial voltada para a cavidade  \n \n \nFigura 4 –  Fragmento de corno uterino. Fragmento de corno uterino que será suturado ao \nperitônio pélvico com a face endometrial voltada para a cavidade peritoneal.  \n \n\n33 \n \n \n \n4.3 Obtenção das lesões para análise histológica e molecular \nQuatro semanas após a cirurgia, tempo necessário para a implantação da \nlesão (Rosa E Silva, 2004; Rodriguez -Romaguera et al., 2009), os grupos de estudo \nreceberam diariamente a injeção intraperitoneal de propranolol ( PB = 0,05mg/Kg ou \nPA = 0,1mg/kg) por 2 semanas, sendo então eutanasiadas. O grupo controle foi \neutanasiado após estas quatro semanas de seguimento inicial. \nAo término do protocolo, as ratas foram e utanasiadas e realizado o inventário \nda cavidade abomino -pélvica, identificando e documentando as lesões. Após esta \netapa, as lesões de endometriose foram excisadas para análise histológica e \nmolecular. \nAs ratas foram pesadas após 4 semanas, e a cada seman a de droga \nadministrada, fizemos o ajuste de dose da medicação conforme estabelecido \npreviamente pelo protocolo dose/peso. \nOs tecidos retirados foram divididos ao meio, sendo que metade seguiu o \nprotocolo para técnicas de Imunohistoquímica e a outra metade  foi incluída em RNA \nlater Solution (Ambion, par number AM7020) e após 24hs à 4 C, o tecido foi \narmazenado à -80C para posteriores análises de expressão gênica. \n \n4.4 Protocolo de Imunohistoquímica \nA parte extraída destinada à avaliação imunohistoquímica foi fixada em formol \n10%, processada para inclusão em parafina e corada por hematoxilina e eosina (HE) \ncom objetivo de identificar a presença de lesões compatíveis com endometriose e \nposterior realização de Imunohistoquímica. Foram realizados cortes histológicos com \n4 a 5µm. Os cortes foram desparafinizados em xileno e desidratados em uma série \nde álcoois. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada em uma solução \ncontendo 0,3% de peróxido de hidrogênio por 30 minutos. Os cortes foram \nsubmetidos à recup eração antigênica com tampão de citrato a 10 mM e colocados \nem panela a vapor por 40 minutos e, logo após, as amostras foram resfriadas por 30 \nminutos em temperatura ambiente e incubadas a 4º C overnight com o anticorpo \nprimário. Aplicado o protocolo de sequências conforme o Kit Mach 4:  \n  - Primeiro dia: recuperação antigênica: Tampão citrato pH 6.0, 35 minutos, \nlavagem com Tris Buffered Saline -TBS, bloqueio da peroxidase endógena 10 \n\n34 \n \n \n \nminutos, lavagem com TBS por 5 minutos, bloqueio da proteína BSA 2% por 1 0 \nminutos, lavagem com TBS e incubação com anticorpo primário overnight;  \n- Segundo dia: lavagem, incubação no pós primário por 30 minutos, lavagem \ncom TBS por 3 minutos, incubação no polímero por 30 minutos, lavagem com TBS e \naplicação de DAB (3,3 diaminobenzina).  \nOs anticorpos utilizados neste estudo, suas diluições e respectivas marcas \nforam: PCNA (1:500, PC10:SC -56, Santa Cruz Biotechnology, INC), CASP8 (1:100, \nclone 11B6, Novacastra Laboratories, United Kingdom), MTs (1:100, clone E9, Dako, \nUSA), TIMP -2 (1:100, 3A4, Novacastra Laboratories, United Kingdom), MMP -9 \n(1:100, 15W2, Leica Biosystem, United Kingdom).    \nO tecido coletado foi analisado por Imunohistoquímica quanto aos seguintes \nmarcadores:  \n Índice de proliferação celular através da marcação do  PCNA (proliferative cell \nnuclear antigen), marcação de núcleo; \n Índice de apoptose através da marcação da Caspase -8, marcação de \ncitoplasma e núcleo;  \n Expressão de moléculas envolvidas na diferenciação celular como \nMetalotioneínas (Monoclonal Mouse  Anti-Metallothionein Clone E9), marcação de \ncitoplasma. \n Marcadores de invasão tecidual como MMP -9 (Mouse Monoclonal Antibody \nMatrix Metaloproteínases 9) e TIMP -2 (Tissue Inhibitor of Matrix Metaloproteínases \n2), marcação de citoplasma. \nAs lâminas foram analisadas  por dois médicos (ARS e JVCZ). As células \nforam marcadas positiva ou negativamente, para cada marcador, segundo critérios \nutilizados na literatura -  Imuno Reactive Score (Weigel et al., 2012).  \nAssim, para os marcadores MMP-9, MTs, TIMP-2 e CASP8: \n1) a ausência de marcação (0%) foi definida como “1+”;  \n2) marcações entre 1 e 10% foram definidas como “2+”;  \n3) marcações entre 10 e 50%, conferiram o score de “3+”;  \n4) marcações entre 51 e 80% foram definidas como “4+”; \n5) E, por f im, marcações superiores a 80% foram associadas ao score de \n“5+”.  \nEm relação às marcações de PCNA: \n\n35 \n \n \n \n1) marcações inferiores a 20% definiu-se o score “1+”; \n2)  marcações entre 20 e 70% conferiram o status de “2+”; \n3)  marcações superiores a 70% estabeleceram o score de “3+”. \n \n4.5 Expressão gênica (extração do RNA total, síntese do cDNA, quant ificação \nda expressão por PCR em tempo real) \nAs amostras de tecido congeladas em RNA later à -80ºC foram \ndescongeladas e lavadas em PBS 1X.  \nO RNA total foi extraído a partir de 50 mg de tecido utilizando Trizol Plus RNA \nPurification Kit (Ambion, part number 12183 -555) de acordo com as instruções do \nfabricante. O DNA genômico foi removido usando DNA -free Kit (Ambion, part \nnumber AM1906). Após o tratamento com DNase, o  RNA total fo i quantificado por \nespectrofotometria à OD 260/280 (NanoDrop2000c, Thermo Scientific). Em seguida, \no cDNA foi sintetizado a partir de 1000 ηg de RNA total utilizando High Capacity \ncDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (Applied Biosystems, par t \nnumber 4374966)  que faz uso de primers randômicos. A PCR em tempo real foi \nrealizada utilizando o equipamento 7500 Fast Real -time PCR System (Applied \nBiosystems). As seguintes sondas de hidrólise do tipo TaqMan (Applied Biosystems) \nforam utilizadas neste  estudo: Rn00582935_m1 ( Vegfa), Rn00565719_m1 ( Cald1), \nRn01514538_g1 (Pcna), Rn99999017_m1 (Tnf), Rn01644671_m1 (Sparc). Os ciclos \nde PCR foram os seguintes: um ciclo de 95ºC durante 20 segundos, 40 ciclos de \n95ºC por 3 segundos e a 60ºC por 30 minutos. Ca da reação de PCR foi realizada \nem triplicata. Os genes Actb (Rn00667869_m1) e B2m (Rn 00560865_m1) foram \nutilizados como gene s de referência para normalizar as reações. As eficiências das \nsondas e primers foram testadas na reação de amplificação dos genes \nselecionados. Para esse estudo, foram consideradas ideais as eficiências na faixa \nde 90 a 110%. A expressão relativa p ara os genes analisados foi calculada para \ncada amostra de acordo com o método de 2-ΔΔCT.  \n \n4.6 Análise estatística  \nPrimeiramente realizou -se análise exploratória dos dados. Esta metodologia \ntem como objetivo sintetizar uma série de valores de mesma natur eza, permitindo \nque se tenha uma visão global da variação de tais valores organizando e \n\n36 \n \n \n \ndescrevendo os dados de duas maneiras: PROC FREQ por meio de tabelas com \nmedidas descritivas e por gráficos. \nA análise descritiva foi realizada com o software SAS® 9.0, utilizando o PROC \nMEANS e os gráficos (Apêndice A) foram plotados utilizando-se o software R. \nParte 1: Para verificar a associação entre os grupos e os marcadores foi \nutilizado o teste exato de Fisher.  Os cálculos foram realizados através do software \nSAS® 9.0, utilizando o PROC FREQ. \nParte 2.1 – Para comparar os grupos em cada local, propusemos a análise de \nvariância (ANOVA).  Esta análise tem como pressuposto que seus resíduos tenham \ndistribuição normal com média 0 de variância 02 constantes. Para as var iáveis que \nnão atingiram esse pressuposto utilizou -se uma transformação logarítmica na \nvariável resposta.  Esse procedimento foi realizado através do software SAS® 9.0, \nutilizando-se o PROC GLM. \nParte 2.2 e 3 - Para a comparação o modelo de regressão com e feitos mistos \n(efeitos aleatórios e fixos).  \nOs modelos lineares de efeito misto são utilizados na análise de dados em \nque as respostas estão agrupadas e a suposição de independência entre as \nobservações num mesmo grupo não é adequada. Esses modelos têm co mo \npressuposto que seus resíduos tenham distribuição normal com média 0 de \nvariância 02 constantes.  Para as variáveis que não atingiram esse pressuposto \nusou-se a transformação logarítmica na variável resposta. Este procedimento foi \nrealizado através do s oftware SAS® 9.0, utilizando o PROC MIXED.  Para a \ncomparação foi utilizado o pós-teste por contrastes ortogonais (Team, 2011). \nÉ possível representar os resultados das análises de marcações \nImunohistoquímica em uma tabela de contingência. Na qual nas linhas são \nrepresentados os scores de marc ação para as proteínas em tecidos obtidos a partir \nde endométrio eutópico (útero). Enquanto nas colunas são representados os scores \ndas análises de tecido obtido a partir das lesões, para as mesmas proteínas. \nAs frequências em que há concordância de scores  entre os diferentes tecidos \nse encontram na diagonal da tabela. A proporção de concordância será o número de \ncasos em que os dois tecidos estão em concordância em relação ao score para a \nmesma proteína (soma das frequências da diagonal) sobre o número total de casos. \n\n37 \n \n \n \nO Kappa de Cohen é uma medida de concordância que pondera a proporção \nde concordância observada para a concordância obtida pelo acaso, ou seja, é o \nquociente entre a proporção de concordância observada menos a proporção de \nconcordância esperada pelo acaso e a concordância máxima, ou seja 1, menos a \nconcordância esperada pelo acaso(Borkowf e Gail, 1997; Borkowf et al., 1997).  \nEmbora não haja muitos critérios para avaliar os valores de Kappa entre 0 e \n1, Landis e Koch em 1977 sugeriram a seguinte escala (Koch et al., 1977; Landis e \nKoch, 1977a; b): \n \nTabela 1 - Avaliação do Kappa de Cohen. \nKappa entre: Concordância: \n0.00 e 0.20 Pobre \n0.21 e 0.40 Razoável \n0.41 e 0.60 Moderada \n0.61 e 0.80 Substancial \n0.80 e 1.00 Alta \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n38 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5. Resultados \n\n39 \n \n \n \n5.1 Caracterização dos grupos e perdas \nForam utilizadas 30 ratas da rasta Wistar. Dessas, 10 foram utilizadas em \ncada grupo conforme descrito na metodologia.  \nNão houve perda de animais, não foram observados processos infecciosos ou \ndesprezo de material por qualquer motivo . Observou-se em todos os grupos \neutanasiados a presença de lesões bilateralmente localizadas na parede abdominal \ndos animais, visíveis macroscopicamente com tamanho aproximado de 1cm de \ncomprimento. \nÀ análise imunohistoquímica, observamos que não houve material satisfatório \npara análise nas lâminas confeccionadas para o estudo dos tecidos obtidos do \nanimal de número 10 do grupo PB para os marcadores MTs, CASP8 e TIMP-2.  \nPara a análise de expressão gênica também observamos perdas no estudo \npor material apresentando quantidade insuficiente de cDNA em algumas amostras, a \nsaber: Cald1 do tecido obtido da lesão ectópica do animal 9, do grupo P A; Vegf, Tnf, \nPcna, e Sparc do tecido obtido da lesão ectópica dos animais 8, do grupo PB e 1, do \ngrupo C. \n \n5.2 Imunohistoquímica \nNa análise Imunohistoquímica dos tecidos obtidos a partir das lesões de \nendometriose induzidas e endométrio eutópico (útero) a s marcações foram \nquantificadas e realizada análise comparativa entre as diferentes variáveis.  \nNão foram observadas diferenças significativas para os marcadores MMP -9, \nTIMP-2, CASP8 e PCNA. Entretanto, para a s MTs, houve redução significativa de \nmarcação após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como \nem ectópico (Tabela 2). \n \n \n \n \n \n \n\n40 \n \n \n \nTabela 2 - Comparações entre as variáveis relacionadas a imunohistoquímica. \nVariáveis Grupos \n  \nMMP_9_UTERO \nC \n(n=10) \nPA \n(n=10) \nPB \n(n=10) \nTotal p-valor \n3+ 1 (10) 1 (10) 1 (10) 3 0,8638 \n4+ 2 (20) 3 (30) 1 (10) 6 \n \n5+ 7 (70) 6 (60) 8 (80) 21 \n \nMMP_9_LESAO \n     \n1+ 6 (60) 4 (40) 9 (90) 19 0,3423 \n2+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n3+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 \n \n5+ 2 (20) 4 (40) 1 (10) 7 \n \nMTs_UTERO \n     \n1+ 0 (0) 9 (90) \n8 \n(88,89) \n17 0,0001 \n3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 0 (0) \n1 \n(11,11) \n2 \n \n5+ 9 (90) 0 (0) 0 (0) 9 \n \nMTs_LESAO \n     \n1+ 2 (20) 9 (90) \n8 \n(88,89) \n19 0,0018 \n3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 0 (0) \n1 \n(11,11) \n2 \n \n5+ 7 (70) 0 (0) 0 (0) 7 \n \nCASP8_UTERO \n     \n1+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 0,6202 \n2+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n3+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 \n \n4+ 1 (10) 2 (20) \n1 \n(11,11) \n4 \n \n\n41 \n \n \n \n5+ 8 (80) 5 (50) \n8 \n(88,89) \n21 \n \nCASP8_LESAO \n     \n1+ 4 (40) 6 (60) \n6 \n(66,67) \n16 0,0806 \n2+ 0 (0) 2 (20) \n3 \n(33,33) \n5 \n \n3+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 \n \n5+ 5 (50) 1 (10) 0 (0) 6 \n \nTIMP2_UTERO \n     \n1+ 0 (0) 4 (40) 0 (0) 4 0,0848 \n3+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 0 (0) \n1 \n(11,11) \n2 \n \n5+ 8 (80) 6 (60) \n8 \n(88,89) \n22 \n \nTIMP2_LESAO \n     \n1+ 4 (40) 5 (50) \n6 \n(66,67) \n15 0,1266 \n2+ 0 (0) 2 (20) \n3 \n(33,33) \n5 \n \n3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 \n \n5+ 5 (50) 2 (20) 0 (0) 7 \n \nPCNA_UTERO \n     \n2+ 1 (10) 5 (50) 1 (10) 7 0,0507 \n3+ 9 (90) 5 (50) 9 (90) 23 \n \nPCNA_LESAO \n     \n1+ 4 (40) 4 (40) 8 (80) 16 0,2968 \n2+ 1 (10) 1 (10) 1 (10) 3 \n \n3+ 5 (50) 5 (50) 1 (10) 11 \n \n \n\n42 \n \n \n \nSegundo a avaliação de proporção de concordância (kappa de Cohen) obtida \nentre os scores de marcação do tecido uterino e tecido ectópico, observamos uma \ncorrelação de 1 (alta) para a análise Imunohistoquímica da s proteínas MTs, nos \ndiferentes grupos. Para as demais proteínas as corr elações são baixas (<0,20) \n(Tabela 3). \n \nTabela 3 - Concordância entre as variáveis da lesão e do útero em cada grupo. \nVariáveis Grupos \n  \nMMP_9_UTERO \nC \n(n=10) \nPA \n(n=10) \nPB \n(n=10) \nTotal p-valor \n3+ 1 (10) 1 (10) 1 (10) 3 0,8638 \n4+ 2 (20) 3 (30) 1 (10) 6 \n \n5+ 7 (70) 6 (60) 8 (80) 21 \n \nMMP_9_LESAO \n     \n1+ 6 (60) 4 (40) 9 (90) 19 0,3423 \n2+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n3+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 \n \n5+ 2 (20) 4 (40) 1 (10) 7 \n \nMETALOTIONEINA_UTERO \n     \n1+ 0 (0) 9 (90) \n8 \n(88,89) \n17 0,0001 \n3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 0 (0) \n1 \n(11,11) \n2 \n \n5+ 9 (90) 0 (0) 0 (0) 9 \n \nMETALOTIONEINA_LESAO \n     \n1+ 2 (20) 9 (90) \n8 \n(88,89) \n19 0,0018 \n3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 0 (0) \n1 \n(11,11) \n2 \n \n5+ 7 (70) 0 (0) 0 (0) 7 \n \n\n43 \n \n \n \nCASPASE8_UTERO \n     \n1+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 0,6202 \n2+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n3+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 \n \n4+ 1 (10) 2 (20) \n1 \n(11,11) \n4 \n \n5+ 8 (80) 5 (50) \n8 \n(88,89) \n21 \n \nCASPASE8_LESAO \n     \n1+ 4 (40) 6 (60) \n6 \n(66,67) \n16 0,0806 \n2+ 0 (0) 2 (20) \n3 \n(33,33) \n5 \n \n3+ 1 (10) 1 (10) 0 (0) 2 \n \n5+ 5 (50) 1 (10) 0 (0) 6 \n \nTIMP2_UTERO \n     \n1+ 0 (0) 4 (40) 0 (0) 4 0,0848 \n3+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 0 (0) \n1 \n(11,11) \n2 \n \n5+ 8 (80) 6 (60) \n8 \n(88,89) \n22 \n \nTIMP2_LESAO \n     \n1+ 4 (40) 5 (50) \n6 \n(66,67) \n15 0,1266 \n2+ 0 (0) 2 (20) \n3 \n(33,33) \n5 \n \n3+ 0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n4+ 1 (10) 0 (0) 0 (0) 1 \n \n5+ 5 (50) 2 (20) 0 (0) 7 \n \nPCNA_UTERO \n     \n2+ 1 (10) 5 (50) 1 (10) 7 0,0507 \n3+ 9 (90) 5 (50) 9 (90) 23 \n \n\n44 \n \n \n \nPCNA_LESAO \n     \n1+ 4 (40) 4 (40) 8 (80) 16 0,2968 \n2+ 1 (10) 1 (10) 1 (10) 3 \n \n3+ 5 (50) 5 (50) 1 (10) 11 \n \n \n5.3 Expressão gênica  \nDetectamos diferenças significativas entre os níveis de expressão de Pcna \nobtidos na lesão e ntre os grupos c ontrole e os grupos tratados . No presente estudo \nnão fora m observadas diferenças significativas em relação à expressão de Cald1, \nSparc, Vegfa e Tnf, nas lesões, nos três grupos analisados. Os resultados são \napresentados nas tabelas que seguem.  \n \n \nTabela 4 - Comparação da expressão gênica de Pcna (Lesão) entre os grupos. \nPcna (Lesão)     \n  \nGrupo N Média \nDesvio \nPadrão \np-valor \nPós teste de \nDunn* \n C 9 1,21 0,77 \n0,02 \na \n PA 10 0,48 0,4 b \n PB 9 0,73 0,27 ab \n *Letras diferentes representam diferenças significativas ao nível de significância de \n0,05. Expressão gêni ca em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo \ntratado com propranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 \nmg/kg. \n \nTabela 5 - Comparação da expressão gênica de Sparc (Lesão) entre os grupos. \nSparc (Lesão)   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \np-valor \nC 9 1,29 1,08 \n0,09 PA 10 0,6 0,37 \nPB 9 1,06 0,7 \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n\n45 \n \n \n \n \nTabela 6 - Comparação da expressão gênica de Cald1 (Lesão) entre os grupos. \nCald1 (Lesão)   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \np-valor \nC 9 1,49 1,51 \n0,08 PA 9 0,57 0,53 \nPB 9 0,36 0,31 \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n \n \n \n \n \n \nTabela 7 - Comparação da expressão gênica de Tnf (Lesão) entre os grupos. \nTnf (Lesão)   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \np-valor \nC 9 1,24 0,86 \n0,15 PA 10 1,16 0,5 \nPB 9 1,9 1,3 \nExpressão gênica em unidad es arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n \nTabela 8 - Comparação da expressão gênica de Vegfa (Lesão) entre os grupos. \nVegfa (Lesão)   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \np-valor \nC 9 1,2 0,64 \n0,77 PA 10 1,42 1,91 \nPB 9 1,29 1,12 \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n\n46 \n \n \n \n \nA análise de expressão gênica no fragmento ute rino entre os grupos Controle \ne grupos que receberam a medicação não revelou diferenças estatísticas \nsignificantes para Pcna, Sparc, Vegfa, Tnf e Cald1. Os resultados são apresentados \nabaixo: \n \nTabela 9 - Comparação da expressão gênica de Vegfa (Útero) entre os grupos. \nVegfa (Útero)   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \np-valor \nC 10 1,08 0,46 \n0,49 PA 10 1,19 0,56 \nPB 10 1,69 1,14 \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \nTabela 10 - Comparação da expressão gênica de Tnf (Útero) entre os grupos. \nTnf (Útero)   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \nValor p \nC 10 1,23 0,73 \n0,16 PA 10 2,42 1,71 \nPB 10 1,7 1,13 \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo co ntrole; PA=Grupo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n \nTabela 11 - Comparação da expressão gênica de Pcna (Útero) entre os grupos. \nPcna (Útero)   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \nValor p \nC 10 1,09 0,5 \n0,41 PA 10 1,32 0,52 \nPB 10 1,68 1,31 \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n \n\n47 \n \n \n \nTabela 12. Comparação da expressão gênica de Sparc (Útero) entre os grupos. \nSparc   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \nValor p \nC 10 1,04 0,3 \n0,42 PA 10 0,95 0,39 \nPB 10 0,88 0,65 \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n \n \n \n \n \n \n \nTabela 13 - Comparação da expressão gênica de Cald1 (Útero) entre os grupos. \nCald1   \nGrupo n Média \nDesvio \nPadrão \nValor p \nC 10 1,69 1,28 \n0,09 PA 10 2,08 1,81 \nPB 10 4,17 3,34 \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Gr upo tratado com propranolol a \n0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n48 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n49 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6. Discussão \n\n50 \n \n \n \nA capacidade de adesão, invasão e desenvolvimento das lesões de \nendometriose estão rel acionadas ao desequilíbrio entre as enzimas que degradam \nos componentes da matriz extracelular (como a MMP 9), e seus reguladores \nendógenos – os inibidores de tecidos de metaloproteinases (como o TIMP-2). A \nviabilidade do tecido ectópico é atribuída em partes à ocorrência de neoangiogênese \nestimulada pelo fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e citocinas.  \nO uso de inibidores de neoangiogênese têm sido amplamente estudados no \ntratamento de endometriose (Hsiao et al., 2014; Pittatore  et al., 2014; Arosh  et al., \n2015; Ozcan Cenksoy  et al. , 2015) . β -bloqueadores como o propranolol, devido à \nsua ação em inibição de neoangiogênese, possuem efeitos antitumorais em \ndiferentes tipos de tumores, e principalmente tumores vasculares (Koch et al., 1977; \nJi et al., 2012; Stiles et al., 2013; Xu et al., 2013).  \n Por meio de análises imunohistoquímicas e estudos de biologia molecular foi \npossível analisar a resposta das lesões experimentalmente induzidas, bem como \ndos tecidos obtidos a partir de endométrio eutópico. \nA presença de lesões de endometriose no modelo experimental utilizado foi \ncomprovada macroscopicamente pela presença de implantes típicos na face \nperitoneal das ratas, e também microscopicamente, por meio de estudo \nimunohistoquímico com hematoxilina -eosina e  observação de glândula e estroma \nendometrial nos tecidos excisados, confirmando o sucesso da técnica empregada no \nestudo. \nCom o intuito de avaliar os efeitos do propranolol nas lesões endometrióticas \ninduzidas, em vários aspectos, alguns marcadores foram selecionados afim de que \nalguns mecanismos como neoangiogênese, apoptose, proliferação celular, \nmotilidade e  invasão celular  fossem avaliados. Para tanto, os marcadores MTs, \nPCNA, C ASP8, MMP -9 e TIMP-2 foram analisados por imunohistoquímica, e por \nbiologia molecular foram  analisadas as expressões dos genes  Vegfa, Tnf, Sparc e \nCald1. \nA MT é uma proteína de baixo peso molecular com papéis funcionais no \ncrescimento celular, diferenciação e reparação, inversamente correlacionada com o \níndice de apoptose. A lo calização perinuclear da metalotioneína é importante para a \nfunção de proteção contra danos no DNA e apoptose induzida por estímulos \n\n51 \n \n \n \nexternos de estresse (Tsangaris e Tzortzatou -Stathopoulou, 1998; Levadoux -Martin \net al., 2001; Cherian et al., 2003; Theocharis et al., 2004). \nAs MTs têm diversas funções que continuam a ser descobertas como \narmazenamento, transporte e metabolismo de metais, proteção contra radicais livres, \ncontrole da concentração de traços de element os livres como zinco e cobre, \nproteção contra condições de estresse e proteção contra danos cerebrais (Jacob et \nal., 1998) \nO estudo de Tapiero e Tew (Tapiero e Tew, 2003)  sugere que altos níveis de \nMTs podem estar presentes em te cidos com rápido crescimento e desenvolvimento. \nAs MTs fornecem  zinco e cobre  para o metabolismo de ácidos nucléicos, síntese \nde proteínas e outros processos metabólicos, portanto pode haver uma ligação entre \nMTs e tumores cancerosos.  \nDe acordo com o estudo de Wicherek e colaboradores (Wicherek et al., 2005) \na superexpressão de MT pode proteger as células tumorais da apoptose e, assim, \ncontribuir para a expansão do tumor. A expressão de MT foi aumentada em casos \nde carcinoma endometrial quando comparado com lesões endometriais \nhiperplásicas benignas. Em adenocarcinoma endometrial, o conteúdo elevado de \nMT foi associado com alto grau de câncer e estágio da doença (Mccluggage et al., \n1999). \nNo presente estudo houve uma redução significativa de marcação  desta \nproteína após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como em \nectópico, sugerindo que o tratamento com propranol foi eficaz. \nO PCNA (antígeno de proliferação celular ) é uma proteína nuclear e sua \nexpressão se relaciona com o estado proliferativo das células (Yu et al., 1991). O \nantígeno é expresso no núcleo das células, durante a fase de síntese do DNA. Ele \npode ser usado para a classificação de diferentes lesões neoplásicas e benignas \ncom comportamento proliferativo. O PCNA é um marcador de proliferação específica \nvalidado que é resistente à fixação (Theile e Muller, 1996)   \nO estudo de Fujishita e colaboradores (Fujishita et al., 1999) avaliou o PCNA \nem endometriose e mostrou maiores níveis proteicos em lesões vermelhas, quando \ncomparadas a lesões brancas e negras. Há diferenças relevantes no padrão proteico \nde PCNA em diferentes estadios de endometriose e em câncer de endométrio. Estes \nmarcadores podem ser úteis para avaliar a agressividade e a invasão endometriótica \n\n52 \n \n \n \nem diferentes localizações. A expressão de PCNA foi significativamente maior em \nendometriose colorretal que em endometriose peritoneal e carcinoma endometrial \n(Korbel et al., 2010; Weigel et al., 2012), sugerindo uma maior atividade mitótica nas \nlesões de endometriose.  \nEstudos demonstram que drogas antiestrogênicas usadas no tratamento da \nendometriose diminuem a expressão do PCNA, provavelmente por diminuírem a \nproliferação de células mediadas por estrogênio e consequentemente diminuir as \nlesões ectópicas (Kulak et al. , 2011) . A avaliação de pacientes tratadas com \nagonistas de GnRH e com Sistema Intrauterino liberador de Levonorgestrel (SIU -\nLNG) mostrou uma redução na proliferação celular avaliada por uma menor \nexpressão de PCNA em células estromais e glandulares do endométrio eutópico e \nectópico (Gomes et al., 2009).  \nEsses resultados corroboram o nosso estudo, pois observamos uma menor \nexpressão significativa de Pcna em ratas tratadas com propranolol. Portanto a \nredução de proliferação celular, devido a uma menor expressão de Pcna poderia \nsugerir uma provável resposta terapêutica. \nTanto a apoptose e a proliferação de células são alvos de tratamentos \nhabitualmente utilizados para controlar a dor em pacientes com endometriose \n(Gomes et al., 2009). \nDurante o ciclo menstrual a apoptose auxilia a manutenção da homeostasia \ncelular, pois, durante a fase secretora tardia, ocorre  a eliminação de células \nenvelhecidas presentes na camada funcional do endométrio uterino (Suganuma et \nal., 1997) . As células mais resistentes à apoptose são as células endometriais \nectópicas obtidas de sítios da endometriose (Gebel et al., 1998). \nUm estudo de Dmowsk (Dmowski et al., 2001) reportou um baixo  índice  de  \napoptose celular em  mulheres com  endometriose  na  fase  secretora  tardia  e  \nproliferativa  precoce  do  ciclo menstrual. Esse  baixo índice de apoptose pode levar  \na  um  aumento  de  células  endometriais viáveis regurgitadas  na  cavidade  pélvica  \ndurante  a  menstruação.  Dessa forma há uma maior facilidade de sobrevivência  e  \nimplantação  ectópica. A apoptose, portanto pode  ser apenas um mecanismo de \ncontrole do desenvolvimento e evolução da endometriose.  \nAs Caspases são um grupo de proteases baseadas em cisteína. São \nimportantes para a apoptose celular e algumas caspases são essenciais para o \n\n53 \n \n \n \nsistema imunológico, pois são responsáveis pela maturação de citocinas. Existem \ndois tipos de caspases: caspases iniciadoras  e caspases efetoras . Caspases \niniciadoras ( CASP8, CASP9) clivam pro -formas inativas de caspases efetoras e \nassim as ativam. As caspases efetoras ( CASP3, CASP7) c livam outros substratos \nprotéicos da célula levando ao processo apoptótico. O início da reação em cascata é \nregulada por inibidores de caspases (Lavrik et al., 2005; Mcilwain et al., 2013)  \nNo entanto, algumas evid ências estão emergindo que suportam a existência \nde muitas outras funções não-apoptóticos destas caspases, que são essenciais para \na homeostase do tecido e recuperação pós -lesão. As caspases apoptóticas em \ncélulas que morrem induzidas pelo estresse podem ativar os sinais mitogênicos que \nconduzem à proliferação de células vizinhas, um fenómeno denominado proliferação \ninduzida por apoptose. Aparentemente, estas funções não apoptóticas das caspases \nprecisam ser controladas e contidas durante o desenvolvimento para evitar os seus \nefeitos prejudiciais. Os estudos de acumulação sugerem que a célula cancerígena é \ncapaz de utilizar estas funções de caspases para permitir a sua sobrevivência, \nproliferação e metástase, a fim de crescer e progredir (Dabrowska et al., 2016). \nEntretanto, e m nosso estudo não houve diferen ças significativas para a \nmarcação de CASP8 nos grupos tratados e controle.  \nAs metaloproteinases de matriz ( MMPs) são uma família de endopep tidases \nzinco-dependente que estão envolvidas na degradação de matriz extracelular \n(Woessner, 1991; Raza e Cornelius, 2000; Di Nezza  et al. , 2002) . Elas são de \ngrande importância em processos fisiológicos e patológ icos, tais como angiogênese, \ninfiltração e propagação de tumores malignos. Além disso, elas estão presentes em \nendométrio eutópico e ectópico (Osteen et al., 2003; Uzan  et al., 2004; Kim  et al., \n2007) As MMPs t êm e xpressão multigênica e quando estão associadas ao seus \ninibidores tissulares de  metaloproteinases ( TIMPs) são possíveis mediadores da \nremodelagem da matriz extracelular (Page-Mccaw et al., 2007). \nA MMP -2 (gelatinase A) é uma colagenase tipo IV, que é especialmente \nimportante para o a degradação da membrana basal (Stetler-Stevenson, 1994). Uma \nsobre expressão tem sido encontrada em muitos tumores malignos e também no \nendométrio de pacientes com endometriose (Chung, M. K.  et al. , 2002) . A MMP -9 \n(gelatinase B) também processa o colagénio tipo IV e além disso divide colágeno \ntipo II e V. A sua presença, em muitos tipos de câncer, incluindo células malignas e \n\n54 \n \n \n \nestroma circundante tem sido demonstrada. MMP -9 pode ser encontrada em \nendometriose infiltrante (Xin et al., 2015; Liu et al., 2016) \nAs MMP-2 e MMP -9 estão prese ntes não só no endométrio normal na fase \nproliferativa, mas também em endométrio hiperplásico e carcinoma do endométrio \n(Graesslin et al. , 2006). Por conseguinte, a MMP -2 e MMP -9, entre outras MMPs, \nparecem ser fatores importantes para a progressão de tumores e invasão de câncer \ndo endométrio. Os padrões de expressão destas MMPs também são de interesse \nem diferentes tipos de endometriose também (Amalinei et al., 2011). Em mulheres \ncom endometriose, foram observados elevados níveis de MMPs em endométrio \nectópico em relação ao endométrio tópico. A superexpressão de MMPs pode auxiliar \no desenvolvimento da endometriose (Kokorine et al., 1997; Di Carlo et al., 2009). \nO estudo de Weigel (Weigel et al., 2012) mostrou que a expressão de MMP-2 \ne MMP-9 em carcinoma maligno é mais alta que em endometriose. MMP-2 foi mais \nexpressa em  endometriose colorretal invasiva que em endometriose peritoneal \nsuperficial, portanto é possível sugerir que a MMP-2 é um forte fator de promoção da \nproliferação em tecido endometrial. \nO TIMP-2 ( Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase) é um membro da  \nfamília de genes TIMPs. Os TIMPs são uma família de inibidores naturais e \nespecíficos das MMPs. Esses dois fatores têm importante papéis na manutenção da \nestabilidade e integridade estrutural dos componentes da matriz extracelular (Taylor \net al., 2002; Loffek et al., 2011). Estudos têm mostrado que a desordem das MMPs / \nTIMPs pode promover a destruição e degradação da matriz extracelular do peritônio, \nprovocando o desenvolvimento de endometriose (Gottschalk et al., 2000; Chung, H. \nW. et al., 2002).   \nMulheres com endometri ose expressam baixos níveis de TIMP-2, levando a \numa alta atividade proteolítica da MMP e favorecendo a  invasão de  células  \nendometrióticas. O equilíbrio  entre MMPs e TIMPs é importante para manter a \natividade adequada de MMP. A incapacidade de manter esse equilíbrio pode auxiliar \na degradação da matriz e invasão celular. O estrogênio pode aumentar a expressão \nde MMP-2 e promover a implantação de tecido en dometrial ectópico, entretanto a \nprogesterona pode inibir a expressão de TIMP-2 e melhorar a invasão de endométrio \nectópico promovendo sua implantação (Hulboy et al., 1997; Londero et al., 2012). \n\n55 \n \n \n \nEm nosso estudo nã o houve diferença significativamente estatística para os \ngrupos controle e tratados em relação à marcação de MMP-9 e TIMP-2.  \nQuanto aos resultados de biologia molecular demonstrados neste trabalho, ao \nanalisar a expressão dos genes  Vegfa, Tnf, Sparc e Cald1 no grupo controle e nos \ngrupos de lesões tratadas com baixa e alta dose de propranolol, bem como no \nendométrio tópico desses animais, observamos que não houve diferença \nsignificativa da expressão gênica.  \nO Fator de crescimento endotelial vascular  (VEGF) colabora com a \npatogênese e progressão da endometriose pela indução da proliferação celular \nendotelial, migração, diferenciação, organização em t úbulos e formação de \ncapilares. Ademais, alguns trabalhos observaram aumentos tanto dos  níveis \nproteicos quanto nos transcritos de VEGF no fluido peritoneal  e soro de pacientes \ncom endometriose (Mclaren et al., 1996; Pupo -Nogueira et al., 2007). Esses dados \ndemonstram a importância do VEGF na patogênese da endometriose. \nAvaliando o resultado obtido em nosso estudo, como não houve diferença \nsignificativamente estatística entre os grupos estudados, provavelmente o \npropranolol nas doses administradas não foi capaz de inibir a angiogênese e \ndiminuir a expressão de Vegf.  \nO fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina secretada principalmente por \nmacrófagos. Em resposta ao estímulo inflamatório, o TNFα é secretado e pode \ninduzir a morte celular por apoptose ou necrose de algumas linhas de células \ntumorais. O TNF também pode ind uzir a proliferação e diferenciação celulares em \nmuitos tipos de células (Ihlenfeld, 2008).  \nA meta -análise de Lu e colaboradores (Lu et al. , 2013)  não encontrou \nnenhuma evidência de benefício clínico quando administraram medicamentos anti -\nTNF-α (infliximab) ao analisar estudos que versavam sobre a lesão de endometriose, \ndismenorreia, dispareunia e sensibilidade pélvica. Um aumento de expressão de \ncitocinas pró -inflamatórias, IL -1, 6, 8, TNF e HGF foi observada em tecido \nendometrial ectópico e tópico de mulheres com endometriose (Berbic et al., 2009).  \nEm nosso estudo não houve diferença significativa entre os grupos \nestudados, sugerindo que não houve diminuição de expressão de Tnf nas ratas \ntratadas com propranolol.  \n\n56 \n \n \n \nOsteonectina (ON), também conhecida como proteína secretada ácida e rica \nem cisteína (SPARC) ou proteína de membrana basal -40 (BM-40) (Swaroop et al., \n1988). Ela a presenta várias funções biológicas e está relacionada com a \nangiogênese, proliferação e migração de células tumorais (Maillard et al., 1992).  \nEstudos recentes demonstram que a desregulação dos genes SPARC, MYC, \nMMP3, IGFBPI e PAEP pode ser responsável pela perda da homeostase celular em \nlesões endometrióticas, consequentemente pode auxiliar a impl antação e \nsobrevivência do tecido endometrial ectópico (Meola et al., 2010) \nEm nossa amostra, não detectamos diferença significativa nos níveis de \nexpressão de Sparc entre os grupos tratados com alta e baixa dose e  o grupo \ncontrole de lesões induzidas. \n \nCaldesmon (CALD1) é uma proteína de ligação a calmodulina. A CALD1 inibe \ntonicamente a atividade ATPase da miosina no músculo liso (Hayashi et al., 1992). \nAlguns estudos demonstram que o gene CALD1 é superexpresso em lesões \nendometrióticas de pacientes com endometriose na fase proliferativa do ciclo \nmenstrual (Meola et al. , 2010)  e em endometrioma ovariano por CGH -array \n(Zafrakas et al., 2008). CALD1 auxilia a predição de desregulação endometrial em \npacientes com endometriose (Meola et al., 2009).  \nNão foram encontradas diferenças significativas de expressão de Cald1 entre \nos grupos controle e tratados com propranolol. \n \nUzunlar e colaboradores (Uzunlar et al. , 2014)  sugerem que o propranolol \npossa suprimir o desenvolvimento da lesão endometrióticas devido a sua atividade \nantiangiogênica pela inibição de VEGF, MMP -2 e MMP -9. O presente estudo não \nobservou essa inibição, entretanto observou uma redução nos níveis proteicos de \nMTs sugerindo que o propranolol possa apresentar uma provável resposta \nterapêutica.  \nTambém observamos uma redução na expressão de Pcna, não corroborada \npela redução de marcação imunohistoquímica d a p roteína PCNA nos grupos  \nestudados.  Uma análise in silico revelou uma discordância entre os níveis de \nexpressão do transcriptoma e proteínas associada com o processo da endometriose  \n(Wren et al., 2007). Isto sugere que a expressão gênica não é somente regulada em \n\n57 \n \n \n \nnível de transcriptoma, mas que mecanismos regulatórios pós -transcricionais \npossam atuar na endometriose. Um exemplo deste tipo de regulação atualmente \nmuito estudado na doença é a regulação por microRNAs (Pan et al., 2007; Burney et \nal., 2009; Ohlsson Teague et al., 2009; Filigheddu et al., 2010). \n \nA pesquisa experimental é uma maneira de se obter conclusões causais, com \nrelação a intervenções ou tratamentos e estabelecer se um ou mais fatores causam \numa mudança em um resultado . N o presente estudo observamos, de maneira \nreprodutível, a ação do propranolol sob diferentes regimes de dose diária sobre a \nmarcação proteica e expressão gêni ca de proteínas e genes envolvidos na \npatogenia da endometriose. É conveniente abordar que a  pesquisa experimental \npode criar situações artificiais que não são extrapoláveis para a prática clínica. Isto é \nem grande parte devido ao fato de que todas as outr as variáveis são rigorosamente \ncontroladas que podem não criar uma situação totalmente r eal. As principais \nlimitações desse estudo são a não utilização dos mesmos marcadores na análise \nimunohistoquímica e na quantificação de expressão gênica, reduzindo n osso poder \nde análise da interferência da medicação  estudada sobre  o comportamento da \ndoença à observação das lesões.  \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n58 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n7. Conclusões \n \n\n59 \n \n \n \nNo presente estudo de lesões endometrióticas experimentalmente induzidas \nem ratas e tratadas com propranolol observou-se que houve redução significativa de \nmarcação de Metalotioneína após tratamento, dose independente, tanto em \nendométrio tópico como em ectópico, sugerindo que o tratamento com propranol ol \nfoi eficaz. \nTais achados nos permitem crer em futuras abordagens no tratamento clínico \nda endometriose que podem incluir inibidores de neoangiogênese. Poderíamos \naventar um estudo randomizado duplo -cego em humanos, com o uso adjuvante do \npropranolol às terapêuticas já existentes, ou outras medicações com conhecida ação \nde inibição sobre a cascata de angiogênese. A descoberta de novas drogas seguras \ncom alvo sobre essa etapa do estabelecimento da lesão de endometriose poderia \nbeneficiar milhões de mulheres acometidas, que diariamente sofrem com redução da \nqualidade de vida, dor e/ou dificuldade em conceber. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\n60 \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nReferências Bibliográficas \n\n61 \n \n \n \nABRAO, M. S.  et al. Deep endometriosis infiltrating the recto-sigmoid: critical factors to consider \nbefore management. Hum Reprod Update, v. 21, n. 3, p. 329-39, May-Jun 2015. ISSN 1460-2369 \n(Electronic) \n1355-4786 (Linking). 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Tal constatação sugere qu e a supressão do desenvolvimento de vasos sanguíneos \npor meio da inibição de fatores angiogênicos específicos pode ser uma nova oportunidade terapêutica na abordagem da \nendometriose. Estudos demonstram um efeito antiangiogênico do propranolol anticanceríge no em diferentes tipos de tumores. \nTal achado sugere que o propranolol pode contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese, e tal \nefeito resultar em um impacto sobre as lesões de endometriose. Foi estudado o efeito do propranolo l sobre marcadores de \ndiferenciação (Metalotioneínas MT1 e MT2), invasão (MMP9 e TIMP2), proliferação celular (PCNA) e apoptose (CASP8 – \ncaspase 8) por coloração imunohistoquímica, e também a influência sobre a adesão, motilidade e angiogênese das lesões d e \nendometriose por quantificação da expressão relativa (RQ) por PCR em tempo real dos genes Vegf, Cald1, Pcna, Tnf e Sparc. \nForam utilizadas 30 ratas adultas Wistar, fêmeas, virgens que foram submetidas a laparotomia para indução de lesões de \nendometriose. As ratas foram separadas em três grupos, e sacrificados após 14 dias de tratamento de dose baixa (PB, n = 10) \ne dose elevada (PA, n = 10) de propranolol; e o grupo de controlo (C, n = 10) sem tratamento. As lesões foram excisadas para \nanálise histológica com o corno uterino contralateral, com confirmação da presença de tecido glandular e estroma endometrial. \nNo presente estudo foi observada uma redução na marcação imunohistoquímica para Metalotioneínas, com 60% de \npositividade no grupo controle, 10% e 11,1% para o PA, PB, respectivamente (p <0,05). Também observamos uma diminuição \nna expressão do gene de Pcna (C = 1,04; PA = 0,32; PB = 0,69). Em outros marcadores de imunohistoquímica e quantificação \nda expressão gênica nas lesões e no tecido uterino não for am observadas diferenças significativas. O tratamento com drogas \nantiangiogênicas como propranolol oferece novas perspectivas de abordagem terapêutica para pacientes com endometriose. \n \n \nPalavras-chave: Endometriose. Angiogênese. Proliferação celular. Apoptose. Propranolol. Ratas. \n \n1. Introdução \nA endometriose é definida pela presença de tecido endometrial, seja ele glandular ou estromal, fora da cavidade \nuterina, denominado endométrio ectópico 1. Afeta 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva 2. \nSemelhante aos tumores metastáticos, implantes endometrióticos dependem de neovascularização para se \nestabelecerem, implantarem e invadirem 3-5. A supressão do desenvolvimento de vasos sanguíneos por meio da inibição de \nfatores angiogênicos específicos pode ser uma nova oportunidade terapêutica no tratamento da endometriose 6-8.  \nA ação anticancerígena do propranolol em diferentes tipos de tumores 9-12, além de efeito antitumoral dos β -\nbloqueadores em sarcomas in vivo e in vitro 11,13, e por fim, pelo sinergismo entre quimioterapia e β-bloqueadores em câncer de \nmama e neuroblastoma, por mecanismos ainda não totalmente elucidados 14,15 é sugerido que o propranolol possa contribuir \nclinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese, e tal efeito resultar em um impacto sobre as lesões de \nendometriose.  \nFoi proposto o uso dessa droga em um modelo experimen tal consagrado 16-20 para a observação do comportamento \nde lesões de endometriose in vivo, com e sem tratamento, e aventar uma nova opção terapêutica clínic a no tratamento de \npacientes com endometriose. \n2. Materiais e métodos \nApós uma vasta revisão da literatura sobre o tema e aprovações pela Comissão de Pesquisa do Departamento de \nGinecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto  (protoco lo nº 339/2011) e pela Comissão de Ética em \nExperimentação Animal (protocolo 183/2011), foram solicitadas as ratas e aplicado o modelo técnico -cirúrgico para indução de \n\n84 \n \n \n \nlesões de endometriose 16-20. Foram utilizadas trinta ratas Wistar, virgens, da mesma ninhada, de aproximadamente 250 g no \ninício do experimento, idade de quarenta e nove dias, Tais ratas, mantidas em ad libitum (livre acesso à água e ração Nu vilab \nCR1 autoclavável), inicialmente permaneceram por sete dias para ambientarem -se em gaiolas metabólicas (41 cm x 32 cm x \n17 cm) sob controle de umidade e temperatura (22º a 25°C) e regime de luz com ciclo claro -escuro de 12/12 horas. Após este \nperíodo, os grupos, descritos abaixo, foram submetidos à laparotomia para indução da lesão de endometriose. \nOs animais foram alocados em 3 grupos de 10 animais divididos da seguinte forma: \nGrupo C (controle, n=10): ratas com endometriose induzida experimentalmente  e sem tratamento da droga no pós -\noperatório. \nGrupo PB (propranolol baixa dose, n=10): ratas que receberam diariamente droga propranolol em baixa dose (0,05 \nmg/Kg) por 2 semanas após 4 semanas da cirurgia para indução das lesões. \nGrupo PA (propranolol alta dose, n=10): ratas que receberam diariamente droga propranolol em alta dose (0,1 mg/kg) \npor 2 semanas após 4 semanas da cirurgia para indução das lesões. \nA indução da lesão de endometriose foi realizada após injeção intramuscular com 1 ml de Xilazina 2 mg /mL \n(Dopaser, Hertape Calier), e 1 ml cloridrato de cetamina 10% (Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional AS, \nUso veterinário), sendo 0,15 unidades para cada 100 g de peso do animal. \nApós anestesia, foi realizado tricotomia pélvica, seguida dos cuidados de antissepsia com lavagem das luvas de látex \ncom soro fisiológico para redução da formação de aderências. Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo \npesquisador. A cavidade pélvica foi aberta com incisão longitudinal mediana de aproximadamente 2 cm, sendo a 2 cm do púbis \ndo animal. Posteriormente, ressecado cerca de 4 cm do corno uterino direito seguido de sutura do coto proximal. A porção \nuterina dissecada foi imersa em soro fisiológico 0,9% a 4°C por cerca de 2 minutos e então incisada  longitudinalmente, sendo \nretirado dois fragmentos de 5 x 5mm. Estes fragmentos de tecido endometrial foram suturados ao peritônio próximo ao trato \nreprodutivo da rata utilizando fio Vicryl 6.0 com a face endometrial livre voltada para a cavidade abdominal , sendo um \nfragmento suturado a direita e outro a esquerda, com posterior fechamento da incisão cirúrgica. Nenhuma suplementação \nhormonal ou antimicrobiana foi administrada antes ou após a laparotomia. \nQuatro semanas após a cirurgia, tempo necessário para a implantação da lesão 21,22, os grupos de estudo receberam \ndiariamente a injeção intraperi toneal de propranolol (0.05mg/Kg ou 0.1mg/kg) por 2 semanas, sendo então eutanasiadas. O \ngrupo controle foi eutanasiado após estas quatro semanas de seguimento inicial. \nAo término do protocolo, as ratas foram eutanasiadas e realizado o inventário da cavida de abomino -pélvica, \nidentificando e documentando as lesões. Observou -se em todos os grupos eutanasiados a presença de lesões bilateralmente \nlocalizadas na parede abdominal dos animais, visíveis macroscopicamente com tamanho aproximado de 1cm de comprimento. \nApós esta etapa, as lesões de endometriose foram excisadas para análise histológica e molecular. \nAs ratas foram pesadas após 4 semanas, e a cada semana de droga administrada, fizemos o ajuste de dose da \nmedicação conforme estabelecido previamente pelo protocolo dose/peso. \nOs tecidos retirados foram divididos ao meio, sendo que metade seguiu o protocolo para técnicas de \nImunohistoquímica e a outra metade foi incluída em RNA later Solution (Ambion, par number AM7020) e após 24hs à 4 C, o \ntecido foi armazenado à -80C para posteriores análises de expressão gênica. \n \n\n85 \n \n \n \nOs tecidos retirados foram divididos ao meio, sendo uma parte fixada em formol 10%, processada para inclusão em \nparafina e corada por hematoxilina e eosina (HE) com objetivo de identificar a presen ça de lesões compatíveis com \nendometriose e posterior realização de Imunohistoquímica. Foram realizados cortes histológicos com 4 a 5µm. Os cortes foram \ndesparafinizados em xileno e desidratados em uma série de álcoois. A atividade da peroxidase endógena f oi bloqueada em \numa solução contendo 0,3% de peróxido de hidrogênio por 30 minutos. Os cortes foram submetidos à recuperação antigênica \ncom tampão de citrato a 10 mM e colocados em panela a vapor por 40 minutos e, logo após, as amostras foram resfriadas po r \n30 minutos em temperatura ambiente e incubadas a 4º C overnight com o anticorpo primário. Aplicado o protocolo de \nsequências conforme o Kit Mach 4:  \n  - Primeiro dia: recuperação antigênica: Tampão citrato pH 6.0, 35 minutos, lavagem com Tris Buffered Sa line-TBS, \nbloqueio da peroxidase endógena 10 minutos, lavagem com TBS por 5 minutos, bloqueio da proteína BSA 2% por 10 minutos, \nlavagem com TBS e incubação com anticorpo primário overnight;  \n- Segundo dia: lavagem, incubação no pós primário por 30 minutos , lavagem com TBS por 3 minutos, incubação no \npolímero por 30 minutos, lavagem com TBS e aplicação de DAB (3,3 diaminobenzina).  \nOs anticorpos utilizados neste estudo, suas diluições e respectivas marcas foram: PCNA (1:500, PC10:SC -56, Santa \nCruz Biotechno logy, INC), CASPASE - 8 (1:100, clone 11B6, Novacastra Laboratories, United Kingdom), \nMETALOTIONEINA(1:100, clone E9, Dako, USA), TIMP -2 (1:100, 3A4, Novacastra Laboratories, United Kingdom), MMP -9 \n(1:100, 15W2, Leica Biosystem, United Kingdom).    \nO tecido coletado foi analisado por Imunohistoquímica quanto aos seguintes marcadores:  \n Índice de proliferação celular através da marcação do PCNA (proliferative cell nuclear antigen), marcação de núcleo; \n Índice de apoptose através da marcação da Caspase-8, marcação de citoplasma e núcleo;  \n Expressão de moléculas envolvidas na diferenciação celular como Metalotioneína (Monoclonal Mouse Anti -\nMetallothionein Clone E9); \n Marcadores de invasão tecidual como MMP -9 (Mouse Monoclonal Antibody Matrix Metaloproteínases 9) e TIMP-2 \n(Tissue Inhibitor of Matrix Metaloproteínases 2), marcação de citoplasma. \nAs lâminas foram analisadas por dois médicos (ARS e JVCZ). As células foram marcadas positiva ou negativamente, \npara cada marcador, segundo critérios utilizados na literatura -  Imuno Reactive Score 23. Para MMP-9, Metalotioneína, TIMP-2 \ne Caspase-8 a ausência de marcação (0%) foi definida como “1+”. Marcações entre 1 e 10% foram defi nidas como “2+”. Por \nsua vez, marcações avaliadas entre 10 e 50%, conferiram o score de “3+”. Já para as observações que continham entre 51 e \n80% das células marcadas foram definidas como “4+”. E, por fim, marcações superiores a 80% foram associadas ao sco re de \n“5+”. Em relação às marcações de PCNA definiu -se o score “1+” para marcações inferiores a 20% das células. Marcações \nentre 20 e 70% conferiram o status de “2+”. Da mesma maneira, marcações superiores a 70% estabeleceram o score de “3+”. \nAs amostras de tecido congeladas em RNA later à -80ºC foram descongeladas e lavadas em PBS 1X.  \nO RNA total foi extraído a partir de 50 mg de tecido utilizando Trizol Plus RNA Purification Kit (Ambion, part number \n12183-555) de acordo com as instruções do fabricante. O  RNA total foi quantificado por espectrofotometria à OD 260/280 \n(NanoDrop2000c, Thermo Scientific). O DNA genômico foi removido usando DNA -free Kit (Ambion, part number AM1906). Em \nseguida, o cDNA foi sintetizado a partir de 1000 ηg de RNA total utilizando  High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with \nRNase Inhibitor (Applied Biosystems, part number 4374966). A PCR em tempo real foi realizada utilizando o equipamento 7500 \nFast Real -time PCR System (Applied Biosystems). As seguintes sondas de hidrólise d o tipo TaqMan (Applied Biosystems) \n\n86 \n \n \n \nforam utilizadas neste estudo: Rn00582935_m1 ( Vegfa), Rn00565719_m1 (Cald1), Rn01514538_g1 (Pcna), Rn99999017_m1 \n(Tnf), Rn01644671_m1 ( Sparc). Os ciclos de PCR foram os seguintes: um ciclo de 95ºC durante 20 segundos, 40 ciclos de \n95ºC por 3 segundos e a 60ºC por 30 minutos. Cada reação de PCR foi realizada em triplicata. Os genes Actb \n(Rn00667869_m1) e B2m (Rn 00560865_m1) foram utilizados como gene de referência para normalizar as reações. As \neficiências das sondas e pri mers foram testadas na reação de amplificação dos genes selecionados. Para esse estudo, foram \nconsideradas ideais as eficiências na faixa de 90 a 110%. A expressão relativa para os genes analisados foi calculada para \ncada amostra de acordo com o método de 2-ΔΔCT. \n \n3. Resultados \nForam utilizadas 30 ratas da rasta Wistar. Dessas, 10 foram utilizadas em cada grupo conforme descrito na \nmetodologia.  \nNão houve perda de animais, não foram observados processos infecciosos ou desprezo de material por qualquer \nmotivo. \nÀ análise imunohistoquímica, observamos que não houve material satisfatório para análise nas lâminas \nconfeccionadas para o estudo dos tecidos obtidos do animal de número 10 do grupo PB para os marcadores Metalotioneína, \nCaspase-8 e Timp-2.  \nPara a análi se de expressão gênica também observamos perdas no estudo por material apresentando quantidade \ninsuficiente de cDNA em algumas amostras, a saber: CALD1 do tecido obtido da lesão ectópica do animal 9, do grupo PA; \nVEGF, TNF, PCNA, e SPARC do tecido obtido da lesão ectópica dos animais 8, do grupo PB e 1, do grupo C. \n \n Imunohistoquímica \nNa análise Imunohistoquímica dos tecidos obtidos a partir das lesões de endometriose induzidas e endométrio \neutópico (útero) as marcações foram quantificadas e realizada análise comparativa entre as diferentes variáveis.  \nNão foram observadas diferenças significativas para os marcadores MMP-9, TIMP-2, Caspase-8 e PCNA. Entretanto, \npara a Metalotioneína, houve redução significativa de marcação após tratamento, dose independente,  tanto em endométrio \ntópico como em ectópico (Tabela 1). \nTabela 1 - Comparações entre as variáveis relacionadas à imunohistoquímica. \nVariáveis  Grupos \n  \n \n C (n=10) PA (n=10) PB (n=10) Total p-valor \nMETALOTIONEINA_UTERO  \n     \n1+  0 (0) 9 (90) 8 (88,89) 17 0,0001 \n3+  0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n4+  1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 \n \n5+  9 (90) 0 (0) 0 (0) 9 \n \nMETALOTIONEINA_LESAO  \n     \n1+  2 (20) 9 (90) 8 (88,89) 19 0,0018 \n3+  0 (0) 1 (10) 0 (0) 1 \n \n4+  1 (10) 0 (0) 1 (11,11) 2 \n \n5+  7 (70) 0 (0) 0 (0) 7 \n \n\n87 \n \n \n \nExpressão gênica  \nDetectamos diferenças significativas entre os níveis de expressão de PCNA obtidos na lesão entre os grupos \ncontrole e os grupos tratados. No presente estudo não foram observadas diferenças significativas em relação à expressão de \nCALD1, SPARC, VEGFA e TNF, nas lesões, nos três grupos analisados, conforme é observado na tabela 2. \n \nTabela 2 - Comparação da expressão gênica de PCNA (Lesão) entre os grupos. \nPCNA (Lesão)     \n  \nGrupo N Média \nDesvio \nPadrão \np-valor Pós teste de Dunn* \n C 9 1,21 0,77 \n0,02 \na \n PA 10 0,48 0,4 b \n PB 9 0,73 0,27 ab \n \n*Letras diferen tes representam diferenças significativas ao nível de significância de 0,05. \nExpressão gênica em unidades arbitrárias. C=Grupo controle; PA=Grupo tratado com \npropranolol a 0,1 mg/kg; PB=Grupo tratado com propranolol a 0,05 mg/kg. \n\n88 \n \n \n \nDiscussão \nA capacidade de adesão, invasão e desenvolvimento das lesões de endometriose estão relacionadas ao \ndesequilíbrio entre as enzimas que degradam os componentes da matriz extracelular (como a Metaloproteínase 9 ), e seus \nreguladores endógenos – os inibidores de tecidos de metaloproteinases (como o Timp -2). A viabilidade do tecido ectópico é \natribuída em partes à ocorrência de neoangiogênese estimulada pelo fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e \ncitocinas.  \nO uso de inibidores de neoangiogênese têm sido amplamente estudados no tratamento de endometriose 24-27.  \nβ-bloqueadores como o propranolol, devido à sua ação em inibição de neoangiogênese, possuem efeitos \nantitumorais em diferentes tipos de tumores, e principalmente tumores vasculares 10,11,13,28.  \n Por meio de análises imunohistoquímicas e estudos de biologia molecular foi possível analisar a resposta das lesões \nexperimentalmente induzidas, bem como dos tecidos obtidos a partir de endométrio eutópico. \nOs anticorpos empregados nas análises imunohistoquímica e em biologia molecular foram Metalotioneína (MT), \nPCNA, Caspase-8, MMP-9, TIMP-2, VEGFA, TNF, SPARC, CALD1. \nA MT é uma proteína de baixo peso molecular com papéis funcionais no crescimento celular, diferenciação e \nreparação, inversamente correlacionada com o índice de apoptose 29-32. Altos níveis de MTs podem estar presentes em tecidos \ncom rápido crescimento e desenvolvimento. As MTs fornecem  zinco e cobre  para o metabolismo de ácidos nucléicos, síntese \nde proteínas e outr os processos metabólicos, portanto pode haver uma ligação entre MTs e tumores cancerosos 33. A \nsuperexpressão de MT pode proteger as células tumorais da apoptose e, assim, contribuir para a expansão do tumor 34. Para \nessa proteína houve redução significativa de marcação após tratamento, dose independente, tanto em endométrio tópico como \nem ectópico, sugerindo que o tratamento com propranol foi eficaz. \nO antígeno de proliferação celular ( PCNA) é uma proteína nuclear e sua expressão se relaciona com o estado \nproliferativo das células 35. O antígeno é expresso no núcleo das células, durante a fase de síntese do DNA. Ele pode ser \nusado para a classificação de diferentes lesões neoplásicas e benignas com comportamento proliferativo. O PCNA é um \nmarcador de proliferação específica validado que é resistente à fixação 36   \nObserva-se maior expressão de PCNA entre lesões vermelhas, quando comparadas a lesões brancas e negras 3. Há \ndiferenças relevantes no padrão de expressão de PCNA em diferentes estadios de endometriose e em câncer de endométrio. \nDemonstrou-se previamente que drogas antiestrogênicas usadas no tratamento da endometriose diminuem a expressão do \nPCNA, provavelmente por diminuírem a proliferação de células mediadas por estrogênio e consequentemente diminuir as \nlesões ectópicas 37. A avaliação de paciente s tratadas com agonistas de GnRH e com Sistema Intrauterino liberador de \nLevonorgestrel (SIU -LNG) mostrou uma redução na proliferação celular avaliada por uma menor expressão de PCNA em \ncélulas estromais e glandulares do endométrio eutópico e ectópico 38. Esses resultados corroboram o nosso estudo, pois \nobservamos uma menor expressão significativa de PCNA em ratas tratadas com propranolol. Portanto a redução de \nproliferação celular, devido a uma menor expressão de PCNA sugere uma provável resposta terapêutica. \nAs Caspases são importantes para a apoptose celular e algumas caspases são essenciais para o sistema \nimunológico, algumas evidências estão emergindo que suportam a existência de muitas outras funções não-apoptóticos destas \ncaspases, que são essenciais para a homeostase do tecido e recuperação pós-lesão. As caspases apoptóticas em células que \nmorrem induzidas pelo stress podem ativar os sinais mitogênicos que cond uzem à proliferação de células vizinhas, um \n\n89 \n \n \n \nfenómeno denominado “Proliferação Induzida Por Apoptose”. Entretanto, em nosso estudo não houve diferen ça estatísticas \nsignificante para a marcação de caspases nos grupos tratados e controle. \nAs metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco -dependente que estão envolvidas \nna degradação de matriz extracelular 39-41. Elas são de grande importân cia em processos fisiológicos e patológicos, tais como \nangiogênese, infiltração e propagação de tumores malignos. Além disso, elas estão presentes em endométrio eutópico e \nectópico 42-44 As MMPs, tem expressão multigênica e quando estão associadas aos seus inibidores tissulares e  \nmetaloproteinases (TIMPs) são possíveis mediadores da remodelagem da matriz extracelular 45. Observa-se que a expressão \nde MMP-2 e MMP-9 em carcinoma maligno é mais elevada que a ob servada em endometriose. MMP-2 foi mais expressa em \nendometriose colorretal invasiva que em endometriose peritoneal superficial, portanto é possível sugerir que a MMP-2 é um \nforte fator de promoção da proliferação em tecido endometrial 23. \nO TIMP-2 (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase) é um membro da família de genes TIMPs. Os TIMPs são uma \nfamília de inibidores naturais e específicos das MMPs. Esses dois  fatores têm importante papéis na manutenção da \nestabilidade e integridade estrutural dos componentes da matriz extracelular Mulheres com endometriose expressam baixos \nníveis de TIMP-2, levando a uma alta atividade proteolítica da MMP e favorecendo a  inva são de  células  endometrióticas. O \nequilíbrio entre MMPs e TIMPs é importante para manter a atividade adequada de MMP. A incapacidade de manter esse \nequilíbrio pode auxiliar a degradação da matriz e invasão celular. O estrogênio pode aumentar a expressão de MMP-2 e \npromover a implantação de tecido endometrial ectópico, entretanto a progesterona pode inibir a expressão de TIMP-2 e \nmelhorar a invasão de endométrio ectópico promovendo sua implantação 46,47. \nEm nosso estudo não houve diferença significativamente estatística para os grupos controle e tratados em relação à \nmarcação de MMP-9 e TIMP-2.  \nQuanto aos result ados de biologia molecular demonstrados neste trabalho, ao analisar a expressão dos genes: \nVEGFA, TNF, PCNA, SPARC, CALD1 no grupo controle e nos grupos de lesões tratadas com baixa e alta dose de propranolol, \nbem como no endométrio tópico desses animais, observamos que não houve diferença significativa da expressão gênica.  \nO Fator de crescimento endotelial vascular  (VEGF) colabora com a patogênese e progressão da endometriose pela \nindução da proliferação celular endotelial, migração, diferenciação, organização em túbulos e formação de capilares. Ademais, \nalguns trabalhos observaram altos níveis de VEGF no fluido peritoneal, soro, expressão de RNAm e proteínas em pacientes \ncom endometriose 48,49. Esses dados demonstram a importância do VEGF na patogênese da endometriose. \nAvaliando o resultado obtido em nosso estudo, como não houve diferença significativamen te estatística entre os \ngrupos estudados, provavelmente o propranolol nas doses administradas não foi capaz de inibir a angiogênese e diminuir a \nexpressão de VEGF.  \nO fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina secretada principalmente por macrófagos. Em resposta ao estímulo \ninflamatório, o TNFα é secretado e pode induzir a morte celular por apoptose ou necrose de algumas linhas de células \ntumorais. O TNF também pode induzir a proliferação e diferenciação celulares em muitos tipos de células 50.  \nEm nosso estudo não houve diferença significativa entre os grupos estudados, sugerindo que não houve diminuição \nde expressão de TNF nas ratas tratadas com propranolol.  \nOsteonectina (ON), também co nhecida como proteína secretada ácida e rica em cisteína  (SPARC) ou proteína de \nmembrana basal-40 (BM-40) 51. Ela apresenta várias funções biológicas e está relacionada com a angiogênese, proliferação e \nmigração de células tumorais 52.  \n\n90 \n \n \n \nEstudos recentes demonstram que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP  pode ser \nresponsável pela perda da homeostase celular em l esões endometrióticas, consequentemente pode auxiliar a implantação e \nsobrevivência do tecido endometrial ectópico 53.  \nEm nossa amostra, não detectamos diferença significativa nos níveis de expressão de SPARC entre os grupos \ntratados com alta e baixa dose e o grupo controle de lesões induzidas. \nCaldesmona (CALD1) é uma proteína de ligação a calmodulina.  A CALD1 inibe tonicamente a atividade ATPase da \nmiosina no músculo liso 54. Alguns estudos demonstram  que o gene CALD1 é superexpresso em lesões endometrióticas de \npacientes com endometriose na fase proliferativa do ciclo menstrual. e em endometrioma ovariano por CGH -array 55,56. CALD1 \nauxilia a predição de desregulação endometrial em pacientes com endometriose 53.  \nNão foram encontradas diferenças significativas de expressão de CALD1 entre os grupos controle e tratados com \npropranolol. \nUzunlar e colaboradores 57 sugerem que o propranolol possa suprimir o desenvolvimento da lesão endometrióticas \ndevido a sua atividade antiangiogênica pela inibição de VEGF, MMP -2 e MMP -9. O presente estudo não observou essa \ninibição, entretanto observou uma redução da expressão de MTs, sugerindo que o propranolol possa apresentar uma provável \nresposta terapêutica. \nTambém observamos uma redução na expressão de Pcna, não corroborada pela redução de marcação \nimunohistoquímica da proteína PCNA nos grupos estudados.  Uma análise in silico revelou uma discordância entre os níveis de \nexpressão do transcriptoma e proteínas associada com o processo da endometriose (Wren et al., 2007). Isto sugere que a \nexpressão gênica não é somente regulada em nível de transcriptoma, mas que mecanismos regulatórios pós -transcricionais \npossam atuar na endometriose. \n \n5. Conclusões \nNo presente estudo de lesões endometrióticas experimentalment e induzidas em ratas e tratadas com propranolol \nobservou-se redução significativa de marcação de Metalotioneína após tratamento, dose independente, tanto em endométrio \ntópico como em ectópico, sugerindo que o tratamento com propranol foi eficaz.  \nTais achados nos permitem crer em futuras abordagens no tratamento clínico da endometriose que podem incluir \ninibidores de neoangiogênese.  \n \n6. Referências Bibliográficas \n1. Farquhar C. Endometriosis. Bmj 2007;334:249-53. \n2. Dabrosin C, Gyorffy S, Margetts P, Ross C, Gauldie J. Therapeutic effect of angiostatin gene transfer in a \nmurine model of endometriosis. The American journal of pathology 2002;161:909-18. \n3. 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