P450 arom y microambiente estrogénico en endometrios eutópicos de mujeres con endometriosis

1475 P450 Arom y microambiente estrogénico en endometrios eutópicos de mujeres con endometriosis M Cecilia Johnson Pa, Claudio Pinto Ob, Alessandra Alves Lc, Alberto Palomino A, Ariel Fuentes G, M Angélica Boric Sa, Margarita Vega Ba. P450Arom and estrogenic microenvironment of eutopic endometria in endometriosis Background: Endometriosis, a common gynecologic disorder char- acterized by endometrial glands and stroma outside the uterus, is diagnosed by direct visualiza- tion of peritoneal and ovarian implants during laparoscopy. Aim: To study the estrogenic microenvironment in eutopic endometria of women with and without endometriosis. Patients and methods : Eutopic endometria, obtained during laparoscopy from 23 women with en- dometriosis and 20 fertile cyclic women undergoing tubal sterilization, was studied. P 450Arom mRNA expression (RT-PCR) was measured. Also, P 450Arom activity was assessed measuring test- osterone conversion to estradiol and the concentration of this last hormone in cultured endometri- al explants. Results: Age and body mass index was similar in both groups studied. Seventy nine percent of endometria from women with endometriosis and in 29.4% from control group ex- pressed P 450Arom mRNA (p <0.01). The intensity of the band was higher in secretory endometria from women with endometriosis when compared to controls (p <0.01), but it was similar during the proliferative phase. Estradiol secretion to the culture media by proliferative endometria ex- plants from women with endometriosis was 3-fold higher than secretory endometria (p <0.01) and endometria from control women in both phases. P 450Arom activity, in the presence of testosterone, was 7-fold higher in endometrial cultures from women with endometriosis, when compare with the basal culture (p <0.01). However, in endometrial explant cultures from control women, this activity was not statistical different. Conclusions: These results indicate that in women with en- dometriosis, the microenvironment in the endometria is estrogenic as a consequence of an in- creased expression and activity of the P 450Arom (Rev Méd Chile 2004; 132: 1475-82). (Key Words: Aromatase; Cytochrome P450; Endometriosis; Genital neoplasms, female: P450 AROM) Recibido el 8 de abril, 2004. Aceptado en versión corregida el 29 de septiembre, 2004. Trabajo financiado por proyecto DID ENL 03/05 Universidad de Chile y parcialmente FONDECYT #1040412. Instituto de Investigaciones Materno-Infantil, Hospital Clínico San Borja Arriarán, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. aBioquímica; bTesista, Facultad de Medicina, Universidad de Chile; cTesista, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Santiago de Chile. Rev Méd Chile 2004; 132: 1475-1482 Correspondencia a: M Cecilia Johnson P. IDIMI, Santa Rosa 1234. Fax: 4247240. E mail: [email protected] A RTÍCULO DE INVESTIGACIÓN 1476 L a endometriosis es un desorden ginecológico invasivo benigno caracterizado por la presen- cia de tejido endometrial viable (glándulas y estroma) fuera de la cavidad uterina. Su etiología, pobremente entendida y aún en estudio, está asociada con la compleja fisiología reproductiva de las especies que menstrúan. Esta patología, asociada con infertilidad, requiere de terapia quirúrgica o farmacológica y constituye un proble- ma de salud mayor para la mujer en edad reproductiva 1-4. Es conocido que la endometriosis es una patología heterogénea que se desarrolla en mujeres en edad reproductiva e involuciona espontánea- mente después de la menopausia. La supresión medicamentosa de los niveles de estradiol, median- te inhibidores de la enzima aromatasa o de agonis- tas de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), produce una regresión de la patología 5-7. Sin embargo, una vez reestablecidos los niveles de estrógenos, la enfermedad puede recidivar sugi- riendo una dependencia de éstos. Se ha comunicado que la histología de endo- metrios de ubicación normotópica de mujeres con endometriosis no es diferente a la del endometrio normal; por el contrario, su fisiología estaría alterada, afectando la expresión de numerosos factores, entre otros la biosíntesis y el metabolis- mo esteroidal local, principalmente estradiol 8-10. Como es sabido, la conversión de androstenedio- na y testosterona a estrona y estradiol, respectiva- mente, es catalizada por el complejo enzimático aromatasa, constituido por el citocromo P 450 co- nocido como P450Arom, además de flavoproteína y el citocromo P 450NADPH reductasa 6. La P450Arom se expresa normalmente en las células de granulosa ovárica, cuerpo lúteo, placenta, tejido adiposo, fibroblastos de piel y cerebro, no siendo detectada en el endometrio normal 11-13. En la actualidad, el diagnóstico de endometrio- sis es establecido por laparoscopia o laparotomía. La biopsia endometrial y la detección del ARN mensajero (mRNA) de la enzima P 450Arom, podría ser una herramienta importante en la detección de esta patología en forma menos invasiva, y contri- buiría, además, a reducir el número de laparosco- pias, aportando una base racional para iniciar el tratamiento médico. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el microambiente estrogénico en endometrios provenien- tes de mujeres con endometriosis y compararlos con el de mujeres fértiles sanas. Para ello, se determinará la expresión y actividad de la enzima P 450Arom en explantes endometriales exvivo y en cultivo. MATERIALES Y MÉTODOS Sujetos. El tejido endometrial eutópico fue obteni- do de 23 mujeres sometidas a laparoscopia diag- nóstica de endometriosis asociada con dolor pélvico crónico, dismenorrea severa e infertilidad primaria, y de 20 mujeres eumenorreicas repro- ductivamente normales (paridad: 3 a 6 hijos) sometidas a esterilización tubaria por laparosco- pia. Todas las mujeres estaban en edad reproduc- tiva. Dado que el número de pacientes es reducido para una clasificación más exhaustiva de la endometriosis, ésta se dividió en endometriosis leve (11 pacientes) y severa (12 pacientes) según los criterios de Acosta 14. Ninguna paciente había recibido terapia endocrina, que incluye análogos de GnRH, danazol o anticonceptivos orales en al menos los 6 meses previos a la biopsia endome- trial. Este estudio ha sido aprobado por los Comités de Ética de la Universidad de Chile y del Hospital Clínico San Borja Arriarán y las pacientes firmaron un consentimiento escrito e informado. Las muestras endometriales obtenidas con una cánula Pipelle de Cornier desde el cuerpo del útero fueron lavadas varias veces con buffer fosfato-salino frío (PBS) para remover los glóbulos rojos. Posteriormente, fueron cortados en trozos; uno de ellos se incluyó en parafina para el estudio histológico, otros se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para estudiar la expresión del mRNA de P 450Arom o se incubaron por 18 h para estudiar la actividad enzimática. Las muestras fueron fechadas por un histopa- tólogo experimentado según el criterio estableci- do por Noyes 15, y clasificadas en endometrios de: fase proliferativa (días 5-14, n=10) o secretora (días 15-26, n=33). Cultivo de explantes endometriales . Explantes de tejido endometrial (20 mg) lavados en PBS fueron incubados como se describe previamente con algunas modificaciones 16. Brevemente, los ex- plantes de tejido se incubaron con medio Hanks’ Rev Méd Chile 2004; 132: 1475-1482 A RTÍCULO DE INVESTIGACIÓN 1477 (GibcoBRL Life Technology, Bethesda, MD) suple- mentado con 2 mmol/L glutamax-I (Invitrogen, Carlsbad, CA), solución de insulina-transferrina- selenium (ITS, Invitrogen), 0,1% (p/v) de albúmi- na sérica de bovino (BSA; Sigma Co., St Louis, MO), 26 mmol/L de NaHCO 3, 25 mmol/L de HEPES, aminoácidos, 100 IU/mL de penicilina y 5 mg/mL de estreptomicina (Sigma) por 18 h a 37°C en ausencia (basal) o presencia de testosterona (Sigma). Después de la incubación, el medio de cultivo fue recogido y guardado a -20 °C para la determinación de estradiol. Actividad de la P 450Arom y concentración de estradiol. La actividad de P450Arom fue determina- da estudiando la conversión de testosterona a estradiol como se describió previamente17. Breve- mente, los explantes endometriales fueron incuba- dos por 18 h en ausencia (basal) o en presencia de testosterona (1 µmol/L). Posteriormente, el medio se recogió y guardó a -20 °C hasta la determinación de la concentración de estradiol. El estradiol secretado al medio por los explan- tes endometriales después de 18 h de cultivo fue extraído con etanol:eter (1:1, v/v), evaporada la fase orgánica y resuspendido en buffer de reac- ción; la recuperación del esteroide fue >90%. El estradiol fue medido por el radioinmunoensayo (RIA) Diagnostic System Lab. (Webster, Texas), presentando una sensibilidad de 5,0 pg/ml y CV intra-ensayo de 4,1% e inter-ensayo de 6,7%. Preparación de ARN, síntesis de ADN complemen- tario (cDNA), reacción de polimerización en cade- na con transcripción reversa (RT-PCR). El RNA total fue preparado de endometrios proliferativos y secretores congelados como se describió previa- mente 18. Brevemente, el RNA total fue aislado de explantes de tejido endometrial con TRIzol-glicó- geno (Invitrogen); luego, el precipitado purificado fue resuspendido en agua tratada con dietilpiro- carbonato. El cDNA fue sintetizado a partir de 2 µg de RNA total previamente digerido con ADNsa I (Fermentas, Vilnius, Lituania) usando partidores al azar (Invitrogen) y 200 U de transcriptasa reversa ReverAid H Minus M-MuLV (Fermentas) según indicaciones del proveedor. Dos µL de cDNA fueron utilizados para ampli- ficar el gen de P 450Arom ajustados a un volumen de 25 µL agregando buffer PCR que contenía Taq ADN Polymerasa (0,63 U; Invitrogen), dNTP (0,25 mmol/L), MgCl2 (1,5 mmol/L) y partidores especí- ficos (0,4 µmol/L) (sentido (exon 8): 5'-TGGC- TACCCAGTGAAAAGG-3' y antisentido (exon 9): 5'- TCAAAGCACATTTGGTGGAA-3'; 652 pb) 19. La PCR consistió en 35 ciclos de: denaturación (94°C, 1 min), alineamiento de los partidores (50 °C, 1 min) y extensión (72 °C, 1 min) en Thermocycler PT-100 (MJ Research Inc. Watertown, MA). Como control interno se amplificó ARN ribosomal (rRNA) 18S. La semicuantificación de los produc- tos de PCR se realizó utilizando el Sistema de Análisis y Documentación de Electroforesis Kodak (EDAS 290) y el programa Kodak 1D Image Analysis (Rochester, NY). Estadística. Los resultados de estradiol fueron normalizados por mg de tejido húmedo. Los datos de las pacientes como edad e índice de masa corporal (IMC) y los resultados en variables conti- nuas se expresaron como la media ± error estándar de la media. Al comparar proporciones se utilizó chi cuadrado. Dada la distribución no gausiana de los datos de acuerdo al test de Kolmogorov, los resultados fueron analizados por los test no para- métricos Mann-Whitney U o Kruskal-Wallis. Se consideró estadísticamente significativo a p <0,05. RESULTADOS Las biopsias de endometrio se obtuvieron de un universo de 43 mujeres durante la laparoscopia diagnóstica de endometriosis (23 pacientes) o de esterilización tubaria (20 controles). La edad de ambos grupos fue 32,6 ± 5,8 años (rango: 23-41) y 36,2 ± 4,8 años (rango, 25-43), respectivamente y no hubo diferencia estadísticamente significativa. El IMC del grupo de mujeres con endometriosis no fue estadísticamente diferente del grupo con- trol (IMC= 24,8 ± 4,3 y 28,2 ± 6,1 kg/m 2, respectivamente). La expresión de P450Arom se realizó en endo- metrios de 19 mujeres con endometriosis y 17 mujeres controles, encontrándose que 15/19 (78,9%) de los endometrios de endometriosis (4/5 de fase proliferativa y 11/14 de fase secretora) y 5/ 17 (29,4%) de los endometrios del grupo control (2/3 de fase proliferativa y 3/14 de fase secretora) expresaron el mRNA de esta enzima durante el P450AROM Y MICROANBIENTE ESTROGÉNICO EN ENDOMETRIOS EUTÓPICOS - MC Johnson et al A RTÍCULO DE INVESTIGACIÓN 1478 Endometriosis Proliferativo Secretor Controles Endometriosis Cuerpo Lúteo Cuerpo LúteoNormal mRNA P450Arom/rRNA 18S P450Arom rRNA 18S a a 0.4 – 0.3 – 0.2 – 0.1 – 0 – 2 1.5 1 0.5 0 ciclo menstrual (p=0,0079). Al clasificar a la endometriosis en leve y severa se observó que en el 86% y 73% de los endometrios se detectó el mRNA de P 450Arom, respectivamente. La intensi- dad de banda de los amplificados por PCR fue mayor en los endometrios de fase secretora de endometriosis con respecto al grupo control (p=0,0033), siendo similar en los de fase prolifera- tiva (Figura 1). Se utilizó cDNA de cuerpo lúteo humano de fase intermedia como control positivo de la expresión de P 450Arom, siendo 7 veces mayor su expresión con respecto al endometrio. Los explantes endometriales de endometriosis de fase proliferativa secretaron 3,3 veces más estradiol al medio que los obtenidos de fase secretora (p=0,030); en tanto, la secreción obteni- da en los cultivos endometriales controles de ambas fases fue constante y similar al obtenido de endometrios secretores de las pacientes (Figura 2A). Al clasificar las endometriosis en leve y severa se observó que la secreción de estradiol se triplica a mayor severidad de la endometriosis (0,28 ± 0,07 y 1,085 ± 0,49 pg/mg de tejido, respectivamente, p=0,0596). FIGURA 1. Expresión del mRNA de P450Arom en endometrio humano durante el ciclo menstrual. Los partidores son complementarios a segmentos de los exones 8 y 9 del gen CYP19 (aromatasa) y la reacción se realizó como se indica en Materiales y Métodos. Se muestra un gel representativo con amplificados de cDNA endometrial de mujeres con endometriosis y controles. Los fragmentos obtenidos corresponden al tamaño esperado. El gráfico ilustra la amplificación relativa a rRNA 18S. Los valores corresponden al promedio ± error estándar de 17 mujeres controles (3 de fase proliferativa y 14 de fase secretora), 19 mujeres con endometriosis (5 de fase proliferativa y 14 de fase secretora) y 1 cuerpo lúteo. ap <0,05 respecto a endometrio control de fase secretora. FIGURA 2. Actividad de P 450Arom en cultivos de endometrios humanos. Explantes de endometrios fue- ron incubados en ausencia (basal) (A) y en presencia de testosterona (1 µmol/L) (B) por 18 h a 37 °C. En el medio de cultivo se determinó la concentración de estradiol. Los resultados están normalizados por mg de tejido húmedo y se expresan como promedio ± error estándar y corresponden a endometrios de 11 mujeres con endometriosis (5 de fase proliferativa y 6 de fase secretora) y 8 controles (3 de fase proliferativa y 5 de fase secretora) (A) y a 4 pacientes con endometriosis y a 4 controles (B). ap <0,05 respecto a la fase secretora. bp <0,05 respecto al basal. Rev Méd Chile 2004; 132: 1475-1482 A RTÍCULO DE INVESTIGACIÓN 1.6 – 1.2 – 0.8 – 0.1 – 0 – Proliferativo Secretor Basal Testosterona Secreción de estradiol (pg/mg tejido)Conversión de testosterona a estradiol (pg/mg tejido) 3 – 2 – 1 – 0 – b b Control Endometriosis Control Endometriosis a a A B 1479 La actividad de P 450Arom, estudiada por la conversión de testosterona a estradiol y posterior secreción al medio de cultivo, aumentó 6,8 veces el estradiol secretado por los explantes endome- triales de endometriosis en presencia de testoste- rona, respecto al basal (p=0,0022). En tanto, el estradiol sintetizado y secretado al medio de cultivo por los endometrios controles en estas condiciones no fue significativamente diferente (p=0,1074) (Figura 2B). DISCUSIÓN Los resultados de esta investigación confirman el microambiente estrogénico del endometrio eutó- pico de pacientes con endometriosis, en los cuales se estudió la expresión y actividad de la enzima P 450Arom. En forma similar, aunque con menor intensidad, algunos endometrios de mujeres con- troles fértiles, también presentaron expresión y actividad de esta enzima. Las primeras publicaciones indicando la expre- sión del mRNA de P 450Arom en endometrios provenientes de mujeres con endometriosis sugi- rieron que esta molécula podría ser un marcador bioquímico de esta patología 8. Investigaciones posteriores demostraron un fenómeno similar en otras patologías dependiente de estrógenos como leiomiomas, adenomiosis y cancer endometrial, en las cuales la P 450Arom puede aumentar el estra- diol endógeno modificando así, el microambiente endometrial 20-22. El hecho que en 20% de los endometrios de mujeres con endometriosis, independientemente de la fase menstrual, no se detectó el mRNA de P 450Arom, resta validez a esta determinación como herramienta diagnóstica. No podemos descartar que la expresión de su mRNA sea fluctuante y de vida media corta, como tampoco que la RT-PCR sea un ensayo suficientemente sensible para detec- tarlo en todas las pacientes. Resultados similares han sido reportados por otros autores al estudiar los transcritos (RT-PCR/Southern blot) 19 o la proteí- na (inmunohistoquímica)22 de P450Arom obtenien- do 18% y 8% de falsos negativos, respectivamente. Aún más, nuestros resultados también mues- tran que el 29,4% de los endometrios de mujeres sanas fértiles expresaron la P 450Arom. El reducido número de endometrios de fase proliferativa estu- diados no nos permite concluir que esta enzima se expresaría mayormente durante este estadio. En forma similar, Dheenadayalu et al 19 han repor- tado la expresión de esta enzima en 25% de los endometrios normales obtenidos durante el ciclo menstrual, en controversia con otros autores que no detectaron a la enzima P 450Arom en endome- trios obtenidos de histerectomía por prolapso uterino o patología cervical 8,23. Aunque en el presente trabajo, las mujeres control fueron estric- tamente seleccionadas cumpliendo los requisitos de fertilidad probada y menstruaciones espontá- neas cíclicas normales y regulares, la presencia de lesiones peritoneales microscópicas podrían no haber sido detectadas durante la salpingoligadura laparoscópica. Por otro lado, endometriosis asin- tomática ha sido reportada en alrededor de 4% de mujeres sometidas a esterilización tubaria 24,25. El ambiente estrogénico presente en los endo- metrios eutópicos de pacientes con endometriosis, principalmente los de fase proliferativa, estaría dado en parte, por la actividad local de P 450Arom. Esto explicaría la mayor concentración de estra- diol secretado por los endometrios de estas pacientes respecto al control. Resultados prelimi- nares en homogeneizados de endometrios exvivo han mostrado que la concentración de estradiol también es mayor en el grupo de endometriosis, sugiriendo una mayor síntesis de estradiol, más que un aumento de su secreción. A pesar de ello, no podemos descartar contaminación sanguínea como respuesta a la mayor angiogénesis descrita en la endometriosis que sería consecuencia al desbalance producido entre la mayor expresión del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y al regulador negativo de angiogénesis trombospondina-1 (TSP-1) 26,27. No obstante, explantes de endometrios de mujeres con endometriosis convierten testostero- na a estradiol sugiriendo que la enzima P450Arom expresada en este tejido presenta actividad local, indicando que el mRNA se traduciría a una proteína activa capaz de convertir andrógenos en estrógenos y que el estradiol detectado correspon- dería más a una síntesis de novo que a contamina- ción sanguínea. Bulun et al 13 demostraron la expresión del mRNA de la P 450Arom en endome- trio eutópico de mujeres con endometriosis, sin embargo, no observaron actividad enzimática. Esta discrepancia con nuestros resultados, posi- P450AROM Y MICROANBIENTE ESTROGÉNICO EN ENDOMETRIOS EUTÓPICOS - MC Johnson et al A RTÍCULO DE INVESTIGACIÓN 1480 blemente, es debido al uso de células estromales endometriales aisladas; recientemente, ha sido localizada la proteína de la enzima P 450Arom en el citoplasma de las células del epitelio glandular y muy levemente en el estroma por inmunohisto- química 22,23. Tradicionalmente, los estrógenos actúan por vía endocrina a través de sus receptores nucleares específicos, a diferencia de lo observado en patologías dependientes de estrógenos como cán- cer de mama, en donde se han demostrado mecanismos paracrinos 28. En endometriosis y leiomiomas, el estradiol actuaría vía intracrina, ya que sería sintetizado en el citoplasma de las células y actuaría a través de los receptores presentes en las mismas células 29. La endometriosis está fuertemente asociada con infertilidad por mecanismos complejos cuyos factores potenciales pueden ser defectos en la foliculogénesis, implantación embrionaria, y por la acción agresiva de los factores inflamatorios contenidos en el fluido peritoneal, entre otros 30- 33. En la literatura existe controversia en la respuesta de estas pacientes a la fertilizacion in vitro (FIV), encontrándose publicaciones en las cuales el número de ovocitos maduros, tasas de fertilización, implantación y embarazo son simila- res al compararlos con pacientes con infertilidad por factor tubario o masculino 34,35, en tanto en otras, se reporta que la endometriosis tiene efec- tos adversos que afectan estos parámetros de manera importante 33,36. En nuestro centro se ha observado que las tasas de embarazos son signifi- cativamente menores comparadas con pacientes que acuden al FIV por otras indicaciones 37. El ambiente microestrogénico, como consecuencia de la mayor actividad de P 450Arom en estas pacientes en comparación a las normales, podría contribuir o estar relacionada con una alteración en la receptividad uterina afectando a moléculas relacionadas con la implantación embrionaria. Recientemente ha sido publicado que la mayor abundancia de mRNA de P 450Arom en endome- trios de mujeres infértiles estaría asociada con el fracaso del FIV 38. La expresión cíclica de los receptores de estradiol y progesterona en el endometrio durante el ciclo menstrual y la regula- ción positiva ejercida por estradiol sobre los receptores de progesterona 39,40, pudieran estar alteradas ante la exposición a un microambiente estrogénico como el observado en estas pacientes. Se requieren más estudios para esclarecer los mecanismos moleculares de regulación de la P 450Arom y explicar así, la baja fertilidad de estas pacientes y los síntomas menstruales asociados a enfermedades benignas dependientes de estradiol. REFERENCIAS 1. W ILLIAMS TJ, P RATT JR. Endometriosis in 1000 consecutive celiotomies: incidence and manage- ment. Am J Obstet Gynecol 1977; 129: 245-50. 2. M AHMOOD TA, TEMPLETON A. Prevalence and gene- sis of endometriosis. Human Reprod 1991; 6: 544- 9. 3. M URPHY AA. 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Agradecimientos Los autores agradecen al Dr. Juan Carlos Barros (Hospital Clínico San Borja Arriarán, Servicio de Salud) por su rol de reclutar mujeres del grupo control y en el procedimiento quirúrgico utilizado. También agradecen a las mujeres que donaron tejido para este estudio. Rev Méd Chile 2004; 132: 1475-1482 A RTÍCULO DE INVESTIGACIÓN