Análise não invasiva do fuso celular de oócitos e os resultados dos procedimentos de reprodução assistida em mulheres inférteis com endometriose

DIB, LA. Living human oocytes with first polar body extrusion from patients with moderate and severe endometriosis contain a higher percentage of telophase I oocytes . Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.

Although it has been a controversial i ssue for decades, a deleterious role of endometriosis on assisted reproductive techni ques (ART) outcomes is questioned, which may be related to oocyte quality. For a mature oocyte be prepared for fertilization is necessary that the meiotic spindle keeps its integrity and its function.

To compare the presence and localization of the meiotic spindle and the oocyte nuclear maturation with the visible first polar body of infertile patients with and without endometriosis. To compare ICSI outcomes betw een oocytes on telophase I and metaphase II, and the ones with and without visible meiotic spindle, on those two groups. Methodology: A prospective and contro lled study with infertile patients who underwent ovarian stimulation for purposes of ICSI, select ed consecutively and divided into two groups: control (tubal and/or male f actor) and endometriosis (subdivide d in minimum and mild stage – I/II versus moderate and severe stage – I II/IV). The oocytes with the first polar body extruded (in vivo matured oocytes) were imaged using a polarization microscopy immediately before ICSI and characterized according to the presence and localization of meiotic spindle and its relation to the first polar body and the nuclear maturation stage (telophase I and metaphase II). We have analyzed the fertiliz ation rates, clivage, number of good quality embryos on the second (D2) and third (D3) da y of development from oocytes on telophase I versus the ones on metaphase II, and metaphase II visible spindle versus the non-visible ones, on the control groups, endometriosis, endometriosis stage I/II and endometriosis stage III/IV.

A total of 441 oocytes were analyzed, 254 oocytes form the control group and 187 from the endometriosis one ( 115 from endometriosis stage I/II and 72 from endometriosis stage III/IV). No significant diffe rences between the percentage of metaphase II with visible and non-visible meiotic spindle were f ound (88,6%, 91,3%, and 88,2%, in the control, endometriosis I/II and endometriosis III/IV groups, respectively). Among the apparently matured oocytes, we have observed a signific ant increase of oocytes on telophase I on the endometriosis III/IV group ( 5,6%) when compared with the endometriosis I/II group (0%). We have observed a tendency to fewer ferti lization rates from the injected oocytes on telophase I when compared with the ones on metaphase II, on the control group (p=0,08), endometriosis (p=0,05) and endometriosis III/IV group (p=0,09). When we compared oocytes with and without visible meiotic spindle, we found no significan t difference on ICSI outcomes among the studied groups.

We have found no significant differen ce among the studied groups regarding the visualization and localization of the meiotic spindle from in vivo matured oocytes with a visible first polar body. However, we have obs erved a significant increase on the number of oocytes on telophase I from patients with m oderate and severe endometriosis, suggesting a delay or an impairment in the completion of meiosis I. Since the injected oocytes on telophase I present a worse fertilization ra tes than the ones injected on metaphase II, this finding could explain the impairment on the outcomes of ART in infertile women with moderate and severe endometriosis, besides it could be used as a prognosis tool after ICSI procedures.

Endometriosis; meiotic spindle; human oocyte quality; polarization microscopy; ICSI; stimulated cycles. Lista de Figuras Figura 1. Esquema representativo de oócitos humanos com extrusão do primeiro corpúsculo polar (CP) avaliados pela micros copia de polarização imediatamente antes da realização da Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) ..................................... 47 Lista de Tabelas Tabela 1 - Comparação dos parâmetros da estimulação ovariana controlada e os resultados de Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) entre mulheres inférteis do grupo controle (fatores tubários e/ou masculinos) e do grupo endometriose........ 48 Tabela 2 - Análise não invasiva do grau de maturação nuclear e presença/localização do fuso celular de oócitos com o primeiro cor púsculo polar visível obtidos de ciclos estimulados de pacientes inférteis do grupo c ontrole (fatores tubários e/ou masculinos) e do grupo endometriose ............................................................................................................. 49 Tabela 3 - Taxas de fertilização, clivagem e nú mero de embriões de boa qualidade no segundo e terceiro dia de desenvolvimento prove nientes de oócitos humanos injetados em metáfase II ou telófase I nos grupos controle, endometriose, grupo endometriose mínima e leve e endometriose moderada e severa ................................................................................... 50 Tabela 4 - Taxas de fertilização, clivagem e nú mero de embriões de boa qualidade no segundo e terceiro dia de desenvolvimento prove nientes de oócitos humanos injetados em metáfase II com ou sem fuso celular visível pela microscopia de polarização nos grupos controle, endometriose, grupo endometriose mínima e leve e endometriose moderada e severa........................................................................................................................................ 51 Lista de Abreviaturas TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa TRA – Técnicas de reprodução assistida FIV – Fertilização in vitro FMP – Fator promotor de metáfase MAP-K – Quinase ativadora de mitogênese DNA – ácido desoxirribonucléico MII – Metáfase II HGC – Hibridização genômica comparativa FISH – Hibridização por fluorescência in situ VEGF – Fator de crescimento endotélio vascular ICSI – Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides RA – Reprodução assisistida IMC – Índice de massa corporal FSH – Hormônio Folículo Estimulante HCG – Gonadotrofina coriônica humana CP – Corpúsculo polar Sumário 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................26 2. JUSTIFICATIVA ...............................................................................................................34 3. OBJETIVOS .......................................................................................................................36 3.1. Objetivos principais.......................................................................................................37 3.2. Objetivos secundários....................................................................................................3 7 4. CASUÍSTICA E MÉTODOS ............................................................................................38 4.1 Análise Estatística ..........................................................................................................43 5. RESULTADOS ...................................................................................................................44 6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................52 7. CONCLUSÕES...................................................................................................................58 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................60 ANEXOS .................................................................................................................................68 ARTIGO CIENTÍFICO.........................................................................................................78 1. Introdução Introdução 27 A endometriose é uma doença que afet a a mulher em idade reprodutiva e é caracterizada por implante e crescimento de teci do endometrial (glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina. Tem sido observada em 10% a 50% das pacientes submetidas a laparotomias ginecológicas. A fisiopatologi a dessa doença ainda permanece obscura. As teorias mais comuns são (a) menstruação re trógrada com implantação subseqüente, (b) metaplasia celômica, e (c) transporte hema togênico ou linfático de tecido endometrial (SANTANAM et al., 2002) A maioria dos estudos sobre endometriose pélvica são baseados na teoria da implantação de Sampson (SAMPSON, 1927). De acordo com essa teoria, as células endometriais descamadas são transportadas at é a cavidade peritonial após a menstruação retrógrada e as células viáveis implantam e crescem. Estudos mais recentes sugerem que o flui do menstrual contém fatores que induzem alterações na morfologia do mesotélio peritoni al (KOKS et al., 2000), p odendo criar sítios de adesão para as células endometriais. A adesão dessas células parece ser estimulada pela indução da adesão de moléculas e seus r eceptores (SOMIGLIANA et al., 1996; BELIARD et al., 1997; SELAM e ARICI, 2000) e pela e xpressão exagerada de ativadores de metaloproteinases e plasminogênio da matriz ce lular, que estimulam a destruição local da matriz extracelular, favorecendo o aparecime nto dos implantes de endometriose (VAN LANGENDONCKT et al., 2002). Após a adesão, as células endometriais prol iferam e, gradualmente, invadem o tecido peritoneal. Alguns fatores induzem a vascular ização de implantes endometriais, permitindo o seu desenvolvimento futuro. Já foi sugerido qu e esse processo leva à formação de lesões vasculares avermelhadas com grande atividade vascular e metabólica. As citocinas e fatores de crescimento, como o fator de crescimento-β, interleucina-8, interleucina-1, fator de necrose tumoral (TNF-α), Interferon-γ, fator de crescimento endotelial (vascular), têm sido implicados Introdução 28 como indutores de adesão, proliferaçã o, e neovascularização (DONNEZ et al., 1998; VINATIER et al., 2000). A endometriose também parece estar associada com o aumento no recrutamento e ativação de macrófa gos, que parecem ter importante papel no desenvolvimento da doença (HALME et al., 1984; VAN LANGENDONCKT et al., 2002). Esta afecção pode cursar com uma grande diversidade de manifestações clínicas. Podemos encontrar desde pacientes assintomá ticas, até quadros de dor pélvica intensa, sintomas decorrentes de lesões em órgãos nã o reprodutivos e infertil idade. Contudo, dentre o espectro de sintomas relaciona dos à endometriose, um dos mais intrigantes é a associação da doença com a infertilidade, principalmente naqu eles casos em que não há alteração mecânica do trato reprodutivo. É uma questão controversa há várias décadas, mas vários dados têm apoiado o conceito de diminui ção de fecundidade mesmo ne ste grupo de pacientes com endometriose (GARRIDO et al., 2000; GARRIDO et al., 2002). Novas abordagens terapêuticas ao problema da infertilidade relacionada a esta afecção têm surgido, destacando-se a aplicação, cada vez mais rotineira, das técnicas de reprodução assistida (TRA) de alta complexidade. A introdução da fertilização in vitro (FIV) no tratamento da infertilidade secundária à endometriose torn ou-se uma importante ferramenta para o estudo dos efeitos potenciais da endo metriose em alguns estágios específicos do processo reprodutivo, incluindo a foliculog ênese, a fertilização, o desenvolvimento embrionário e a implantação. Resultados conflitantes de alguns estudos tê m sugerido a ocorrência de menores taxas de fertilização, implantação e de gestação em portadoras de endometriose (BARNHART et al., 2002; AL-FADHLI et al., 2006). Três alterações di stintas poderiam ser as responsáveis por estes achados: a) compro metimento da qualidade oocitár ia e, conseqüentemente, embrionária; b) defeitos endometriais; e c) defeitos da interação entre o endométrio e o embrião. Os achados conflitantes da presença de algumas alterações no endométrio eutópico Introdução 29 de pacientes com endometriose, poderiam exp licar, pelo menos em parte, distúrbios na interação entre o embrião e o endométrio, ge rando anomalias no processo de implantação (GARCIA-VELASCO e ARICI, 1999). Entretan to, o achado de taxas de implantação semelhantes as do grupo controle, em ciclos de transferência de embr iões resultantes de oócitos doados por mulheres sem esta afecção pa ra o útero de portadoras de endometriose, tem reforçado o papel crucial da qualidade em brionária no comprometimento da implantação verificado neste grupo de pacientes (GARRIDO et al ., 2000; (PELLICER et al., 2001; KATSOFF et al., 2006). Sabemos que embriões de boa qualidade (a queles com habilidade para implantar e desenvolver adequadamente), originam-se de oóc itos de boa qualidade, que, por sua vez, são provenientes de folículos com um adequado meio ambiente, condicionado tanto pelo conteúdo do fluido folicular, como pela influê ncia das células vizinhas (CANIPARI, 2000). Desta forma, o comprometimento da qualidade embrionária pode ser induzido tanto por defeitos prévios à foliculogênese, como por eventos posteriores à fertilização. Alguns estudos têm sugerido a potencial influência do estresse oxidativo na etiopatogênese da endometriose e infertilidade associada a esta doença (JACKS ON et al., 2005; GUPTA et al., 2006), o que poderia, pelo menos teoricamente, promover um comprometimento da qualidade oocitária nestas pacientes. Foram descritas alte rações na qualidade do oócito, levando ao comprometimento (BRIZEK et al., 1995) ou completo bloqueio do desenvolvimento embrionário (PELLICER et al., 1995), em mulheres com endometriose, quando comparadas a controles saudáveis. Corroborando estes achados, dados clínicos de programas de doação de oócitos parecem apoiar, como descrito previament e, a teoria de que mulheres afetadas por endometriose produzem oócitos de qualidade comprometida (GARRIDO et al., 2000). A qualidade oocitária é decorrente de fatores correlacionados às competências nuclear e citoplasmática. A maturação citoplasmáti ca pode ser considerad a como o resultado do Introdução 30 processo de desenvolvimento de uma célula incompetente para uma célula com capacidade de fertilização e desenvolvimento embrionário in icial (FERREIRA et al., 2009). A competência nuclear é caracterizada pela qualidade da cromatina e do fuso oocitário (MATTSON e ALBERTINI, 1990; ALBERTINI, 1992), que é esse ncialmente regulada pela atividade do Fator Promotor de Metáfase (FPM) (HASHI MOTO e KISHIMOTO, 1988; VERDE et al., 1990; VERDE et al., 1992) e pela Quinase At ivadora de Mitogênese (MAP-K) (SUN et al., 1999). O FPM regula direta ou indiretamente t odos os processos ligados à entrada na metáfase de células eucarióticas, assim como a quebra do envelope nuclear (OOKATA et al., 1992), a fosforilação da histona (COLLAS, 1999) e a polimerização de microtúbulos (CHARRASSE et al., 2000). A MAP-K age na regulação dos eventos do ciclo celular nos oócitos de mamíferos que não têm relação co m o FPM, evitando microtúbulos e cromatina de entrar em configuração interfásica, sendo ativ ado após a quebra da vesícula germinativa (SUN et al., 1999). O fuso meiótico de oócitos humanos em metá fase II (MII) é uma estrutura temporária e dinâmica, composta por microtúbulos, que está associada com o córtex oocitário e sua rede de microfilamentos subcorticais. (LIU et al., 2000; WANG e KEEFE, 2002; NAVARRO et al., 2005). Os microtúbulos são constituídos por unidades heterodiméricas de alfa( α) e beta(β)-tubulina, capazes de rápida polimerização e despolimerização, compondo 13 protofilamentos arranjados lado a lado para formar uma parede cilíndrica. A tubulina polimerizada, contudo, está em equilíbrio com a reserva de tubulina do ooplasma. Os microtúbulos do fuso estão ligados aos ci netócoros dos cromossomos (MANDELBAUM et al., 2004) e, por isso, participam da segrega ção durante a meiose (WANG e KEEFE, 2002). Os microfilamentos, por sua vez, controlam os movimentos do citoplasma, incluindo a divisão celular (KIM et al., 1998). Desta forma, a fecundação normal e o desenvolvimento embrionário dependem deste controle. Introdução 31 Um fuso funcionante, essencial em oócitos sadios em MII, gara nte a fidelidade da segregação cromossômica (VOLARCIK et al., 1998; VAN BLERKOM e DAVIS, 2001; DE SANTIS et al., 2005). O fuso celular oocitário é extremamente sensível à ação de diversos fatores, como o envelhecimento, as mudanças térmicas, o suporte insuficiente de oxigênio durante o tempo de cultura e a manipulação oocitária (HU et al ., 2001; EICHENLAUB- RITTER et al., 2002; MULLEN et al., 2004). Existem diferentes metodologias destinadas à avaliação da qualidade oocitária. Tal avaliação pode ser realizada fisiologicamente, por meio da análise de marcadores biológicos, ou morfologicamente, de forma invasiva e não-invasiva. A avaliação da qualidade oocitária por meio da análise da sua fisiologia tem sido realizada apenas em estudos experimentais, geralmente utilizando modelos animais, não apresentando aplicabilidade clínica até o momento. Dispomos de diferentes metodologias inva sivas destinadas à avaliação morfológica oocitária, que, apesar de permitirem um adeq uado detalhamento das estruturas analisadas, requerem a fixação e a coloração oocitárias para análise, impossibilitando a utilização clínica do material estudado. O oócito pode ser avalia do, qualitativamente, por meio da análise imunocitoquímica por imunofluorescência, tant o da organização microtubular, como das configurações de ácido desoxirribonucléic o (DNA) (MIYARA et al., 2003), usando-se microscópios convencionais ou confocais. Também se pode realizar a microinjeção de sondas no interior do oócito com o obje tivo de se detectar alguns co mponentes estruturais menos acessíveis, como a gama-tubulina no centrômero, ou para se realizar a an álise da função de proteínas específicas. Na investigação de anormalidades cromossômicas numéricas, podemos lançar mão da hibridização genômica comparativa (HGC) ou da hibridização por fluorescência i n situ (FISH) (GUTIERREZ-MATEO et al ., 2004). Associad a à análise por imunocitoquímica estática, a detecção da dinâmi ca citoesquelética em oócitos vivos pode ser Introdução 32 realizada usando-se resgate fluorescente após fotobranqueamento (FRAP) ou citoquímica ativada por fluorescência. A metodologia mais utilizada na prática clínica consiste na avaliação morfológica não- invasiva, que, geralmente, utiliza como critérios a análise de alterações na forma dos oócitos em MII, a coloração, a presença de granul ações e homogeneidade do citoplasma, o tamanho do espaço perivitelínico (XIA, 1997), a presença de inclusões citoplasmáticas (SERHAL et al., 1997) e a morfologia do prim eiro corpúsculo polar e da zona pelúcida (XIA, 1997; EBNER et al., 1999; KAHRAMAN et al., 20 00; NAVARRO et al., 2009). Contudo, não há evidências de boa correlação entre a avaliação morfológica oocitária por meio da utilização destes critérios morfológicos e a capacidade desenvolvimental oocitária. Alguns autores têm utilizado a microsc opia de polarização como instrumento destinado à avaliação da qualidad e oocitária, por meio da aná lise da birrefringência do fuso meiótico e caracterização da zona pelúcida oocitária. A microscopia de polarização, como descrito em estudos anteriores (WANG et al., 2001; WANG e KEEFE, 2002; WANG et al., 2002; MOON et al., 2003; NAVARRO et al., 2005; PETERSEN et al., 2009) possibilita a visualização de estruturas birrefringentes em células vivas, sem a necessidade de fixação ou coloração, o que permite a utilização dos oó citos analisados por esta metodologia nos procedimentos de reprodução assistida. Alguns dados sugerem que análise oocitária por esta metodologia poderia ser útil na triagem de possí veis anormalidades, não só do fuso celular, como, indiretamente, do alinhamento cromossômico, uma vez que, na grande maioria das vezes, estas duas alterações estão presen tes conjuntamente ( NAVARRO et al., 2004; NAVARRO et al., 2006). Os estudos que procuraram avaliar de forma indireta a qua lidade oocitária em pacientes com endometriose, utilizaram a análise de fatores parácrinos múltiplos presentes no fluido folicular, como interleucinas, fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator Introdução 33 de necrose tumoral, além da avaliação de ap optose nas células da granulosa, análise do número e atividade dos leucócitos circunjacentes, entre outros, como preditores indiretos da qualidade oocitária (GARRIDO et al., 2002). C ontudo, não dispomos de estudos que tenham avaliado a qualidade oocitária em portadoras de endometriose por meio da análise de critérios morfológicos mais objetivos e, potencialmente, mais capazes de predizer a real capacidade desenvolvimental oocitária. Métodos não invasivos para a visualização de oócitos são muito importantes quando se trabalha com um material limitado e valioso como os óvulos humanos. A microscopia de polarização permite a análise de estruturas birr efringentes, como o fuso celular oocitário, sem comprometer a sua viabilidade e utilização clínica subsequente (LIU et al., 2000; NAVARRO et al., 2005; PETERSEN et al., 2009). A visua lização do fuso meiótico em oócitos pode ter importância clínica em predizer a fertili zação pós-ICSI (Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides) e a qualidade embrioná ria (WANG e KEEFE, 2002; HYUN et al., 2007; PETERSEN et al., 2009). Por ou tro lado, a identificação da posição do fuso meiótico em relação ao primeiro corpúsculo polar pode prev enir os embriologistas de danificarem essa importante estrutura celular durante a ICSI (M OON et al., 2003). Por isso, a visualização do fuso meiótico pode ser usada para selecionar oóc itos que serão injetados na ICSI e apresenta especial relevância clínica em países onde ex iste um limite legal do número de oócitos a serem fertilizados (PETERSEN et al., 2009). Entretanto, não encontramos nenhum estudo na literatura avaliando de mane ira não invasiva o fuso meiótico de oócitos maturados in vivo de pacientes inférteis com endometriose. 2. Justificativa Justificativa 35 Apesar dos esforços despendidos há décadas no sentido de esclarecer os mecanismos responsáveis pela redução da fecundidade e potencial piora dos resultados de reprodução assistida em portadoras de endometriose, os dados disponíveis são escassos e controversos. A observação de maiores taxas de bl oqueio do desenvolvimento embrionário in vitro em pacientes com endometriose, associada ao fato de mulheres com essa doença, ao serem submetidas a ciclos de doação de oócitos prove nientes de mulheres sem endometriose, terem taxas de implantação similares as do grupo co ntrole, sugerem, que o comprometimento da qualidade oocitária possa mediar a redução nas taxas de implantação e gestação nestas pacientes. Sugere-se que o es tresse oxidativo possa estar e nvolvido na etiopatogênese da infertilidade relacionada à endometriose, se ndo passível de promover anomalias meióticas oocitárias. Hipotetizamos que anomalias na c onclusão da meiose I ou no fuso meiótico de oócitos em metáfase II possam estar envolvida s na piora da qualidade oocitária e dos resultados dos procedimentos de reprodução assistida em portadoras de endometriose. Entretanto, não encontramos nenhum estudo na li teratura que tenha ava liado de maneira não invasiva o fuso meiótico de oócitos maturados in vivo de pacientes inférteis com endometriose. A avaliação da qualidade oocitária por meio da análise morfológica não invasiva do fuso meiótico e do real estágio de maturação nuc lear pela microscopia de polarização é um método simples, inócuo, com boa reprodutibilid ade e que poderia ajudar a esclarecer alguns dos possíveis fatores responsáveis pelas menores taxas de implantação e gestação observadas em pacientes com endometriose. 3. Objetivos Objetivos 37 3.1. Objetivos principais Avaliar o estágio de maturação nuclear e a presença e a localização do fuso meiótico, em relação ao primeiro corpúsculo polar, de oócitos obtidos em ciclos estimulados de pacientes inférteis com inferti lidade de causa tubária e/ou ma sculina (grupo controle) e com endometriose, analisados imediatamente antes da realização da ICSI; Comparar as taxas de fertilização, clivagem e número de embriões de boa qualidade entre os oócitos em metáfase II versus te lófase I e entre os oócitos com fuso celular visualizado ou não, nos grupos controle, e ndometriose, endometriose mínima/leve e endometriose moderada/severa. 3.2. Objetivos secundários Comparar a resposta à estimulação ovarian a com gonadotrofinas e os resultados de ICSI (taxas de fertilização e clivagem, formaçã o de embriões de boa qualidade e taxas de gestação química) entre paciente s inférteis com endometriose e in fertilidade de causa tubária e/ou masculina. 4. Casuística e Métodos Casuística e Métodos 39 Foi realizado um estudo pr ospectivo de Março de 2008 a Março de 2009 junto ao Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP. Esse estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Pesquisa e todos os casais submetidos à indução da ovulação para a realização de ICSI, que preencheram os critérios de inclusão e manifestaram o desejo de participar do proj eto, assinaram o termo de consentimento pós- informado. Cento e três pacientes (56 pacientes infé rteis por fatores masculino e/ou tubários correspondendo ao grupo controle, e 47 pacientes com infertilidade relacionada à endometriose, sendo 26 pacientes com endome triose mínima e leve e 21 pacientes com endometriose moderada e severa) preencheram os critérios de inclusão no período do estudo. Foram incluídas pacientes com idade menor ou igual a 38 anos, FSH basal (hormônio folículo estimulante) menor que 10 mIU/mL (ELGINDY et al., 2008) e IMC (índice de massa corporal) menor que 30 Kg/m². O critério de inclus ão das pacientes com endometriose era a confirmação do diagnóstico pela vídeolaparoscopi a, de acordo com os critérios da Sociedade Americana de Medicina Reprodut iva (Revised American Societ y for Reproductive Medicine classification of endometrio sis: 1996, 1997), que classifica a doença em quatro estágios: mínima (estádio I), leve (estádio II), moderada (estádio III) e grave (estádio IV). Pacientes do grupo controle não apresentaram doenças pé lvicas associadas à infertilidade quando submetidas à vídeolaparoscopia. Foram excluídas pacientes com diabetes mellitus ou quaisquer outras endocrinopatias, doença cardiovascular, lúpus eritematoso sistêmico e outras doenças reumatológicas, infecção pelo vírus HIV, qualquer infecção ativa, ta bagismo ou o uso de medicações hormonais e antiinflamatórias hormonais e não-hormonais nos últimos dois meses, previamente à programação para o procedimento de reprodução assistida. Casuística e Métodos 40 O bloqueio hipofisário foi iniciado us ando agonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRHa) 10 dias antes do dia de r ealização da ultrason ografia transvaginal basal (protocolo longo), por meio da administração de acetato de leuprolide (Lupron®, Abott, Brasil). As pacientes receberam 100 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSHr) (Gonal-F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Br asil), nos primeiros 6 dias da indução. Quando pelo menos dois folículos atingiram 18 mm de diâmetro médio, foi administrada gonadotrofina coriônica humana (hCG) recombin ante (Ovidrel®, Serono, Brasil). A captação dos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante. Todo material aspirado durante captação dos oó citos foi analisado para a identificação e o isolamento dos complexos oócito-cumulus. Depois de identificados, os complexos oócito- cumulus foram isolados do fluido folicular e colocados em placa separada. Os complexos oócito-cumulus foram lavados cuidadosamente em meio de cultura Human Tubal Fluid- HEPES (HTF, Irvine Scientific), para a remoção de sangue e debris. A seguir foram colocados em placas NUNC (Multidish 4 wells Nuclon, Delta SI), preenchidas com o meio de cultura HTF e cobertas com óleo mineral, e levados à incubadora em mistura gasosa de CO 2 a 5%, sob condições ideais de temperatura (37ºC) e umidade (95%) por um período de 2 a 3 horas. Após este período, para realizarmos a remoção do cumulus oophorus e da corona radiata, os complexos oócito-cumulus foram co locados em micro-gotas de 25µL de hialuronidase (H4272 tipo IV-S, Sigma), na di luição de 80 UI/mL de HTF/HEPES (Irvine Scientific), por no máximo 30 segundos e, en tão, lavados 2 ou 3 vezes com o meio HTF modificado (HTF/HEPES, Irvine Scientific) su plementado com Soro Sintético Substituto (SSS) a 10%. A remoção mecânica dos restos celu lares foi feita com o auxílio de uma pipeta de desnudação (stripper pipette 130 µm denuding pipette, Cook, Melbourne, Australia). Após a realização do desnudamento oocitário (remoção do cumulus oophorus ), realizamos a identificação do grau de ma turidade dos oócitos, sob visualização ao Casuística e Métodos 41 microscópio de luz. Os oócitos imaturos (em es tágio de vesícula germinativa ou metáfase I) foram descartados. Os oócitos maduros (carac terizados morfologicamente pela presença de um corpúsculo polar extruso) foram incubados em gotas de 25 µL de HTF + SSS 10% por mais uma hora (após o desnudamento oocitário) para, então, serem avaliados pelo OCTAX ICSI GuardTM System (Medical Technology Vertriebs- GmbH, Altdorf, Germany) e injetados por meio da realização da ICSI. Os fusos celulares dos oócitos com extrusão do primeiro corpúsculo polar foram avaliados usando um microscópio inverti do, equipado com uma vídeo câmera e com o hardware do microscópio de polarização, o qual cons iste de cristais elétricos e de um controlador eletro-óptico (OCTAX ICSI Guard TM System, Medical Technology Vertriebs- GmbH, Altdorf, Germany). Os grupos de cristais elétricos são controlados pelo computador através do software OCTAX EyeWare™ (Universal Imaging Corp., Boston, MA). Os oócitos foram avaliados a 37 °C, em gotas de 5 µl de HTF/Heppe s + SSS 10%, em placas de Petri revestidas com vidro na parte inferior ( MatTek Corp., Ashland , MA), colocadas sobre uma placa aquecida a 37°C. Para controlar os vieses metodológicos relativos à não visualização do fuso secundária à realização do desnudamento celular e ao en velhecimento oocitário, o desnudamento foi realizado 2 a 3 horas após a captação oocitária e, após o mesmo, os oócitos foram recolocados nas placas de cultivo previamente equilibradas, na incubadora, por mais uma hora, para somente depois serem submetidos ao imageame nto e à ICSI. Um número máximo de sete oócitos era analisado em cada placa, sendo o te mpo total, relativo ao necessário para a realização da análise do fuso celular pela micros copia de polarização mais a ICSI, foi inferior ou igual a 7 minutos. Os oócitos com primeiro corpúsculo polar visível (CP) foram analisados pela microscopia de polarização e caracterizados qu anto ao estágio real de maturação nuclear Casuística e Métodos 42 (telófase I ou metáfase II), presença ou não de fuso celular visível e localização do fuso celular dos oócitos em metáfase II. Foram considerados em telófase I, os oócitos que apresentavam fuso celular alongado, perpendicular à membrana oocitária, estendendo-se até o primeiro CP. Os fusos celulares em metáfase II foram caracterizados pela presença de fibras birrefringentes distribuídas radialmente, com a forma de barril e orientadas paralelamente à membrana cortical. Como os cromossomos são minimamente birrefringentes, não são adequadamente analisáveis por meio desta metodologia. A localização do fuso celular baseou- se no ângulo formado entre esta estrutura e o primeiro CP, sendo os oócitos divididos em seis grupos: com fusos formando ângulos de 0 a 30 º, 30 a 60 º, 60 a 90 º, 90 a 120 º, 120 a 150 º e 150 a 180 º em relação ao primeiro CP. Cerca de 18 a 19 horas após a ICSI foi avaliada a fertilização, caracterizada pela presença de 2 pró-nucleos e 2 corpúsculos polares (a taxa de fertilização, a ser calculada nos 2 grupos avaliados, corresponde ao número de oócito s fertilizados, dividi dos pelo número de oócitos injetados X 100). Cerca de 24 horas após a ICSI foi realizad a a caracterização da presença de clivagem embrioná ria (a taxa de clivagem, calcu lada nos 2 grupos avaliados, corresponde ao número de embriões que sofrem clivagem, ou seja, divi são celular, divididos pelo número total de oócitos fertilizados X 100). Cerca de 44 a 48 horas após a ICSI (D2) foi realizad a a análise da qualidade embrionária (quanto ao número e simetria de blastômeros, percentagem de fragmentação e presença ou não de multinucleação). Foram considerados como embriões de boa qualidade no segundo dia de desenvolvimento (D2) os que apresentaram 4 blastômeros, simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação. Cerca de 64 a 72 horas após a ICSI (D3) foi realizada novamente a análise da qualidade, sendo consider ados de boa qualidade os embriões com 8 blastômeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação. Casuística e Métodos 43 Realizou-se a transferência embrioná ria em D2 ou D3, de acordo com a individualização de cada caso. Quatorze dias a pós a transferência embrionária realizou-se a análise do β-hCG sanguíneo, sendo considerada como gravidez química a presença de β-hCG positivo (maior ou igual a 25 UI/ml). A taxa de gravidez química foi calculada dividindo-se o número de pacientes com β-hCG positivo após 14 dias da transferência embrionária pelo número de ciclos com transferência, multiplicado por 100. 4.1 Análise Estatística Inicialmente os grupos endometriose e cont role foram analisados comparativamente quanto às percentagens de oócitos em telófase I, em metáfase II com fuso celular visível e não visível e de oócitos com fuso celular localiz ado nas diferentes posições, as taxas de fertilização, de clivagem e a percentagem de ciclos com pelo menos um embrião de boa qualidade através do teste exato de Fisher. Posteriormente os subgrupos da endometriose (estádios I/II e III/IV) foram comparados para as variáveis já descrita s pelo teste exato de Fisher. Para análise comparativa das variáveis quantitativas, foram utilizados os testes t não- pareado e o teste de Mann-Whitney. Em todas as análises foi considerado o nível de significância de 5% (p<0,05). 5. Resultados Resultados 45 Não observamos diferença significativa entr e os três grupos avaliados (controle, endometriose I/II e endometriose III/IV) com relação à duração da estimulação ovariana, o número de folículos entre 14 e 17 mm, a es pessura endometrial, o número de oócitos captados, o número de oócitos maduros, a taxa de clivagem e a percentagem de ciclos com pelo menos um embrião de boa qualidade tr ansferido em D2. Entretanto, no grupo de pacientes com endometriose III/IV observamo s um aumento significativo da dose total de FSH utilizada e uma redução significativa do número de folículos ≥ 18 mm e do número de oócitos fertilizados, quando comparado aos grupos controle e endometriose I/II. (Tabela 1). Foram analisados, pela microscopia de polarização, 441 oócito s o com primeiro corpúsculo polar visível, sendo 254 do grupo controle, 115 do grupo endometriose I/II e 72 do grupo endometriose III/IV. Entre os oócitos aparentemente maduros, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I (fi gura 1A) no grupo endometriose III/IV (5,6% de oócitos em telófase I) quando comparado ao grupo endometriose I/II (0%). Não observamos diferença significativa entre a percentagem de oócitos em metáfase II com fuso celular visível (figura 1B) e não visível (figura 1C) en tre os grupos avaliados (88,6%, 91,3%, 88,3%, respectivamente, nos grupos controle, endometriose I/II e endometriose III/IV). Quase todos os oócitos apresentaram o fuso celular locali zado entre 0 – 90° em relação ao primeiro corpúsculo polar. Não observamos diferença significativa entre a percentagem de oócitos com fuso celular nas localizações entre 0° – 30° (f igura 1D), 30° – 60° (figura 1E), 60° – 90° (figura 1F) entre os três grupos analisados. Ressalta-se que a percentagem de oócitos com fusos celulares localizados entre 60 e 90º em relação ao primeiro CP foi pequena nos três grupos analisados (3,2%, 1,9% e 5%, respectivamente nos grupos controle, endometriose I/II e endometriose III/IV). (Tabela 2). Quando analisamos o grau de maturação nuc lear (metáfase II vers us telófase I) e comparamos com os resultados de reprodu ção assistida, observamos uma diminuição Resultados 46 significativa das taxas de fertilização (p= 0,01) considerando o tota l de oócitos (grupos controle e endometriose analisados conjuntam ente) injetados em telófase I (13 oócitos injetados, sendo 6 fertilizados; taxa de fertil ização de 46,1%) quando comparados ao total de oócitos injetados em metáfase II (428 oócitos injetados, sendo 338 fertilizados; taxa de fertilização de 79%). Ao analisarmos os grupos individualmente, houve uma tendência a manter essa diminuição das taxas de fertiliza ção nos grupos controle (p=0,08), endometriose (p=0,05) e endometriose III/I V (p=0,09) dos oócitos injetados em telófase I quando comparados aos em metáfase II. Não obtivemos oócitos em telófase I no grupo endometriose I/II. Não encontramos diferença significativa entre as taxas de clivagem nos diferentes grupos. Nenhum oócito fertilizado, após injeção em teló fase I, formou embrião de boa qualidade em D2 ou D3. (Tabela 3). Quando comparamos os resultados de repr odução assistida en tre os oócitos em metáfase II com ou sem fuso celular visível, nã o observamos diferença significativa nas taxas de fertilização, clivagem e no número de embriões de boa qualidade formados em D2 entre os grupos controle, endometriose I/II e endomet riose III/IV. Nas pacientes portadoras de endometriose, os oócitos sem fuso celular visível, que fertilizaram e clivaram, não formaram embriões de boa qualidade em D3. (tabela 4). Resultados 47 Figura 1. Oócitos humanos com extrusão do primei ro corpúsculo polar (CP) avaliados pela microscopia de polarização imediatamente antes da realização da Inje ção Intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). (A) Fuso celular em telófase I. (B) Fuso celular visível em metáfase II. (C) Fuso celular não visível em metáfase II. (D) Fuso celular formando ângulo de 0 a 30 º em relação ao primeiro CP. (E) Fuso celular formando ângulo de 30 a 60 º em relação ao primeiro CP. (F) Fuso celular formando ângulo de 60 a 90 º em relação ao primeiro CP. Resultados 48 Tabela 1 - Comparação dos parâmetros da estimul ação ovariana controlada e os resultados de Injeção intracitoplasmática de espermatozóide s (ICSI) entre mulheres inférteis do grupo controle (fatores tubários e/ou masculinos) e do grupo endometriose. Endometriose Variáveis Controle I – II III – IV p 32,8 ± 3,8 Idade (anos) Número de pacientes 52 33 ± 3 23 33,5 ± 3,6 19 0,73 - Número de ciclos iniciados 60 26 21 - Dose FSH total (UI) 1973 ± 654,6 1709 ± 554,9 2263 ± 671,7 0,02 Duração da estimulação ovariana (dias) 9,1 ± 1,6 8,7 ± 1,3 9,3 ± 1,6 0,36 Folículos entre 14 – 17 mm 4,6 ± 2,4 4,2 ± 2,7 3,6 ± 3,2 0,19 Folículos ≥ 18 mm 4 ± 2,8 3,2 ± 1,8 2 ± 2,2 0,02 Endométrio (mm) 11 ± 2,4 10,1 ± 1,5 10,5 ± 2 0,38 Número de ciclos com captação 60 26 21 - Número de oócitos captados 6,8 ± 3,9 6,9 ± 3,8 5 ± 3,6 0,38 Número de oócitos maduros 5,2 ± 3,4 5 ± 3,1 3,4 ± 2,9 0,23 Número de oócitos fertilizados 3,4 ± 1,8 3,6 ± 1,6 2,3 ± 1,6 0,03 Taxa de Fertilização (%) 80 (203/2 54) 80 (92/115) 68 (49/72) 0,08 Taxa de Clivagem (%) 84,2 (171/203) 87 (80/92) 90 (44/49) 0,56 Número de ciclos com transferência 57 25 19 - % de ciclos com pelo menos um embrião de boa qualidade transferido em D2 21 (12/57) 40 (10/25) 37 (7/19) 0,51 Taxa de Gravidez Química (%) 35 (20/57) 48 (12/25) 37 (7/19) 0,15 Média ± desvio padrão. Diferença significativa: p < 0,05. Oócitos maduros: oócitos com primeiro corpúsculo polar visível; Taxa de Fertilização: número de oócitos fertilizados/número de oócitos injetados x 100; Taxa de Clivagem: número de oócitos clivados/número de oócitos fertilizados x 100 % de ciclos com pelo menos um embrião de boa qualidade transferido em D2: número de ciclos com pelo menos um embrião com 4 células, simétricas e sem fragmentação em D2/número de ciclos com transferência x 100 Resultados 49 Tabela 2 - Análise não invasiva do grau de ma turação nuclear e presen ça/localização do fuso celular de oócitos com o primeiro corpúsculo po lar visível obtidos de ciclos estimulados de pacientes inférteis do grupo controle (fatores tubários e/ou masculinos) e do grupo endometriose. Endometriose Variáveis Controle I – II III – IV Maturação Nuclear - Telófase I (%) 3,5 (9/254) 0 5,6 (4/72)* - Metáfase II (%) 96,5 (245/254) 100 (115/115) 94,4 (68/72) Fuso visualização - Não visível (%) 11,4 (28/245) 8,7 (10/115) 11,8 (8/68) - Visível (%) 88,6 (217/245) 91,3 (105/115) 88,2 (60/68) Fuso Localização - 0° – 30° (%) - 30° – 60° (%) - 60° – 90°(%) - 90° – 120°(%) 85,7 (186/217) 11,1 (24/217) 3,2 (7/217) 0 80 (84/105) 18,1 (19/105) 1,9 (2/105) 0 80 (48/60) 13,3 (8/60) 5 (3/60) 1,7 (1/60) *P=0,02. Diferença significativa: p < 0,05. Resultados 50 Tabela 3 - Taxas de fertilização, clivagem e número de embriões de boa qualidade no segundo e terceiro dia de desenvolvimento provenientes de oócitos humanos injetados em metáfase II ou telófase I nos grupos controle, endometrios e, grupo endometriose mínima e leve e endometriose moderada e severa. Grupo Variável Maturação nuclear p Metáfase II Telófase I % (n/N) % (n/N) Controle Taxa de fertilização 80,8 (198/245) 55,6 (05/09) 0,08 Taxa de Clivagem 84,3 (167/198) 80 (04/05) 0,58 Embrião 4.1.0 12,6 (21/167) 0 - Embrião 8.1.0 11,5 (12/104) 0 - Endometriose Taxa de fertilização 76,5 (140/183) 25 (01/04) 0,05 Taxa de Clivagem 87,9 (123/140) 100 (01/01) 1 Embrião 4.1.0 17 (21/123) 0 - Embrião 8.1.0 18,5 (12/65) 0 - Endometriose I – II Taxa de fertilização 80 (92/115) 0 - Taxa de Clivagem 87 (80/92) 0 - Embrião 4.1.0 17,5 (14/80) 0 - Embrião 8.1.0 19 (08/42) 0 - Endometriose III – IV Taxa de fertilização 70,6 (48/68) 25 (01/04) 0,09 Taxa de Clivagem 89,6 (43/48) 100 (01/01) 1 Embrião 4.1.0 16,3 (07/43) 0 0 Embrião 8.1.0 17,4 (04/23) 0 0 Diferença significativa: p < 0,05. Taxa de Fertilização: número de oócitos fertilizados (n)/número de oócitos injetados (N) x 100; Taxa de Clivagem: número de oócitos clivados (n)/número de oócitos fertilizados (N) x 100 Embrião 4.1.0: número de embriões com 4 células, simétricas e sem fragmentação em D2 (n)/número de embriões formados em D2 (N) x 100 Embrião 8.1.0: número de embriões com 8 células, simétricas e sem fragmentação em D3 (n)/número de embriões formados em D3 (N) x 100 Resultados 51 Tabela 4 - Taxas de fertilização, clivagem e número de embriões de boa qualidade no segundo e terceiro dia de desenvolvimento provenientes de oócitos humanos injetados em metáfase II com ou sem fuso celular visível pela micr oscopia de polarização nos grupos controle, endometriose, grupo endometriose mínima e leve e endometriose moderada e severa. Grupo Variável Fuso p Visível Não visível % (n/N) % (n/N) Controle Taxa de fertilização 82 (178/217) 71,4 (20/28) 0,2 Taxa de Clivagem 83,1 (148/178) 95 (19/20) 0,33 Embrião 4.1.0 12,2 (18/148) 15,8 (03/19) 0,7 Embrião 8.1.0 11,5 (11/96) 12,5 (01/08) 1 Endometriose Taxa de fertilização 77,6 (128/165) 66,7 (12/18) 0,38 Taxa de Clivagem 86,7 (111/128) 100 (12/12) 0,36 Embrião 4.1.0 15,3 (17/111) 33,3 (04/12) 0,12 Embrião 8.1.0 18,5 (12/65) 0 - Endometriose I – II Taxa de fertili zação 81,9 (86/105) 60 (06/10) 0,11 Taxa de Clivagem 86 (74/86) 100 (06/06) 1 Embrião 4.1.0 16,2 (12/74) 33,3 (02/06) 0,28 Embrião 8.1.0 19 (08/42) 0 - Endometriose III – IV Taxa de fertilização 70 (42/60) 75 (06/08) 1 Taxa de Clivagem 88,1 (37/42) 100 (06/06) 1 Embrião 4.1.0 13,5 (05/37) 33,3 (02/06) 0,24 Embrião 8.1.0 17,4 (04/23) 0 - Diferença significativa: p < 0,05. Taxa de Fertilização: número de oócitos fertilizados (n)/número de oócitos injetados (N) x 100; Taxa de Clivagem: número de oócitos clivados (n)/número de oócitos fertilizados (N) x 100 Embrião 4.1.0: número de embriões com 4 células, simétricas e sem fragmentação em D2 (n)/número de embriões formados em D2 (N) x 100 Embrião 8.1.0: número de embriões com 8 células, simétricas e sem fragmentação em D3 (n)/número de embriões formados em D3 (N) x 100 6. Discussão Discussão 53 Encontramos resultados controversos acerca dos resultados da reprodução assistida em pacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos e hipóteses (AZEM et al., 1999; GARCIA-VELASCO e ARICI, 1999; GA RRIDO et al., 2000; AL-FADHLI et al., 2006). Estas discrepâncias parecem ser multifatorias, uma vez que esses resultados podem ser afetados por diferentes variáv eis, como o protocolo de es timulação ovariana utilizado, os critérios de seleção das pacientes avaliadas nos diferentes estudos, os procedimentos laboratoriais efetuados, a técnica de transferência embrionária usada, entre outros fatores. Dados de uma meta-análise de oito est udos relevantes (BARNHART et al., 2002) sugeriram que a implantação está comprometida de forma significativa em pacientes com endometriose e que a qualidade embrionária é ru im, possivelmente refletindo a má qualidade oocitária. A qualidade oocitária, por sua vez, depende da ade quada aquisição da maturação citoplasmática e nuclear, sendo a última dependente da presença de um fuso celular normal. O fuso meiótico, estrutura fundamental no processo de desenvolvimento oocitário, precisa manter a sua integridade e funciona bilidade para que o oócito maduro esteja preparado para a fertilização. Esta estrutura é extremamente sensível à ação de diversos fatores, entre os quais podemos citar o estr esse oxidativo, passível de promover anomalias meióticas, instabilidade cromossômica, i ndução da apoptose e comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantaçã o. (LIU et al., 2003; NAVARRO et al., 2004; NAVARRO et al., 2006). Alguns autores (MANSOUR et al., 2007) demo nstraram danos significativos ao DNA e aumento de anomalias cromossômicas em oócitos maduros de camundongos, quando incubados com o fluido peritone al de pacientes com endometri ose. Esses resultados foram evitados quando houve suplementação do antioxida nte L-carnitina nessa cultura; sugerindo que o estresse oxidativo esteja envolvido no comprometimento da qualidade oocitária em portadoras de endometriose (MANSOUR et al., 2009). Outros estudos avaliando os potenciais Discussão 54 mecanismos envolvidos na gênese das alterações do fuso celular, rela cionadas ao estresse oxidativo, evidenciaram que o mesmo pode dani ficar diversas proteí nas intracelulares (STADTMAN, 1992; BERLETT e STADTMAN, 1997) , algumas das quais são importantes para a organização do fuso celular (ANTON IO et al., 2000; FUNABIKI e MURRAY, 2000; ABRIEU et al., 2001) e, ao mesmo tempo ou independentemente, lesar o DNA e induzir o inadequado alinhamento cromossômico (B ECKMAN e AMES, 1998; LIMOLI et al., 1998) produzindo, desta forma, anormalidades no ciclo celular. Diferentes metodologias podem ser utilizad as com a finalidade de avaliar o fuso celular oocitário, entre as quais citamos a microscopia de polarização, que permite a observação e caracterização de estruturas birrefr ingentes em células vivas, sem a necessidade de fixação (PETERSEN et al., 2009). Trata- se de metodologia inócua, que permite a utilização dos oócitos avaliados para a r ealização de ICSI, sem comprometimento do desenvolvimento embrionário subseqüente. Observou-se neste estudo que o fuso meió tico foi visualizado em 89,3% dos oócitos examinados, estando de acordo com dados na literatura onde a visualização do fuso celular pode variar entre 62,8 a 91% (RIENZI et al., 2003; MADASCHI et al., 2008). A alta percentagem de oócitos com fuso celular visí vel evidenciada neste estudo, nos três grupos analisados, pode ser atribuída ao rigoroso c ontrole metodológico, incluindo a incubação dos oócitos por uma hora após desnudamento e o ad equado controle das condições ambientais (manutenção da temperatura e pH ideais e limitado tempo de exposição à luz durante a análise e fora da incubadora) (ROBERTS et al., 2002). Com relação à localização do fuso celular , não observamos dife rença significativa entre os grupos em relação à localização do fuso celular oocitário. Oitenta e três por cento do total de oócitos com fusos celulares visíveis estavam localizados entre 0° – 30° em relação ao corpúsculo polar, sendo pequena a percentagem de oócitos com fusos celulares localizados Discussão 55 entre 60 e 90º em relação ao primeiro CP nos três grupos analisados. Estudos na literatura, que avaliaram a relação do ângulo formado entre o corpúsculo polar e o fuso celular e as respectivas taxas de fertili zação, evidenciaram que quando esse ângulo é menor do que 90°não há comprometimento desta variável (R IENZI et al., 2003; FANG et al., 2007). Desta forma, sugerimos que a localização do fuso cel ular oocitário em posições anômalas não seria uma variável responsável pela piora da qualid ade oocitária em portadoras de infertilidade relacionada à endometriose. Dados de uma meta-análise (PETERSE N et al., 2009) evidenciaram aumento significativo na taxa de fertilização, clivagem e de embriões de boa qualidade no terceiro dia de desenvolvimento de oócitos com fuso celular visível quando comparados àqueles sem fuso celular visível. Esses resultados sugerem que a presença do fuso celular poderia ser um fator de predição para se obter maiores taxas de fertilização, clivagem e de embriões de boa qualidade em D3. Nossos resultados foram di scordantes com a literatura, pois não observamos diferença significativa entre as taxas de fertilização e declivagem quando avaliamos a presença ou não de fuso celular visível nos grupos es tudados. Todavia, ressaltamos que, nas pacientes portadoras de endometriose, nenhum dos oócitos sem fuso celular visível que fertilizou e clivou formou embriões de boa qualidad e no terceiro dia de desenvolvimento, sugerindo uma associação positiva entre a ausência de fuso celular visível em oócitos de mulheres inférteis com endometr iose e a não formação de embriões de boa qualidade em D3. Oócitos em telófase I ainda não finali zaram a meiose I mas podem apresentar, à microscopia óptica, características morfológi cas semelhantes a oócitos que completaram a meiose I e estão em metáfase II (HYUN et al., 2007). No presente estudo observou-se um aumento significativo de oócitos maturados in vivo, que, apesar de aparentemente maduros, estavam em telófase I, nas pacientes com infertilidade relacionada à endometriose moderada e Discussão 56 severa. Esses dados corroboram achados recen tes em que se evidenciou uma tendência a maior proporção de telófase I em oócitos maturados in vitro obtidos de ciclos estimulados de pacientes com endometriose, quando compara dos ao grupo controle (BARCELOS et al., 2009). O presente achado agrega a informação de que este potencial atraso ou comprometimento da meiose I ocorra não apenas nos oócitos maturados in vitro, como também naqueles maturados in vivo nas portadoras de infe rtilidade relacionada à endometriose. Convém ressaltar que no presente estudo este achado foi observado apenas no subgrupo de pacientes com endome triose III/IV, sugerindo que a severidade da doença possa estar associada ao comprometimento da conclusã o da meiose I e, conseqüentemente, à piora da qualidade oocitária. As anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência do desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do oócito em completar o processo de maturação, torn ando-se incapaz de se r fertilizado, até a ocorrência de erros variáveis no processo de maturação meiótica que não impossibilitam a fertilização, mas, contudo, podem comprometer o desenvolvimento embrionário pré e/ou pós- implantação, bem como a viabilidade futura do concepto (PAVLOK et al., 1992; LONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001). Assim, qualquer alteração no complemento cromossômico, que possa ser originada por um a alteração do fuso meiótico, poderia conduzir a um estado de aneuploidia por não-disjunçã o, junção desbalanceada ou disjunção prematura das cromátides e perda de cromossomos, (VAN BLERKOM e HENRY, 1992; BATTAGLIA et al., 1996; MANDELBAUM et al., 2004) comprometendo o desenvolvimento embrionário. Alguns autores (HYUN et al., 2007) demonstraram que oócitos maturados in vitro que, apesar de aparentemente maduros (com prim eiro CP visível), estavam em telófase I, segundo análise por microscopia de polarizaçã o, apresentaram taxa de fertilização significativamente menor do que os oócitos que concluíram a meiose I (15,8% x 80%, Discussão 57 respectivamente). No nosso estudo, também observamos uma diminuição significativa das taxas de fertilização quando analis amos o total de oócitos maturados in vivo que foram injetados em telófase I quando comparados ao total de oócitos injetados em metáfase II (46,1% x 79%, respectivamente) e uma tendê ncia a diminuição dessas taxas nos grupos controle e endometriose III/IV, quando estudado s individualmente. A ampliação da presente casuística poderá permi tir a aquisição de significância es tatística nestes grupos. Além disso, os oócitos em telófase I que clivaram não form aram embriões de boa qualidade, tanto em D2 quanto em D3 em ambos os grupos. Com base nos dados analisados sugere-se que a utilização de oócitos com o primeiro CP visualizado, em telófase I (ou seja, que, apesar de aparentemente maduros, não concluíram a me iose I) em procedimentos de reprodução assistida (ICSI) esteja associada a piores prognósticos re lativos ao sucesso gestacional subseqüente, relativos tanto a menores taxas de fertilização, como formação de embriões de boa qualidade. Nas pacientes inférteis com endometriose III/IV o aumento significativo de oócitos em telófase I poderia contribuir para o número significativamente menor de oócitos fertilizados neste grupo, observado na casuística analisada, corroborando estudos que evidenciaram piores taxas de fertilização em portadoras de infertil idade relacionada à endometriose (AZEM et al., 1999; AL-FADHLI et al., 2006). É possível que a an álise do estágio de maturação nuclear oocitária possa ser utilizada como fator de pred ição das taxas de fertilização neste grupo de pacientes, o que precisa ser analisado em est udos com maiores casuísticas. É possível que se postergarmos a inseminação dos oócitos em te lófase I, especialmente nas portadoras de endometriose moderada e severa, possamos ter um melhor resultado dos procedimentos de reprodução assistida, o que precisa ser av aliado por meio de es tudo com metodologias pertinentes. 7. Conclusões Conclusões 59 Não observamos diferença significativa en tre os grupos analisados quanto à visualização e localização do fu so celular em oócitos maturados in vivo com o primeiro CP visível. Todavia, observamos um aumento signi ficativo de oócitos em telófase I nos oócitos de portadoras de endometriose modera da e severa, sugerindo um retardo ou comprometimento na conclusão da meiose I. Considerando que os oócitos injetados em telófase I apresentam piores taxas de fertiliz ação do que os injetados em metáfase II, este achado poderia justificar o comprometimento dos resultados de reprodução assistida em mulheres inférteis com endometriose moderada e severa. A análise não invasiva do fuso celular oocitário, por meio da microscopia de polarização, pode ser utilizada como fator de predição das taxas de fertilização e qualidad e oocitária pós-ICSI neste grupo de pacientes, o que precisará ser mais bem analisado ampliando-se a presente casuística. 8. Referências Bibliográficas Referências Bibliográficas 61 ABRIEU, A. et al. Mps1 is a kinetochore-associated kinase essential for the vertebrate mitotic checkpoint. Cell, v.106, n.1, Jul 13, p.83-93. 2001. AL-FADHLI, R. et al. Effects of different stag es of endometriosis on th e outcome of in vitro fertilization. J Obstet Gynaecol Can, v.28, n.10, Oct, p.888-91. 2006. ALBERTINI, D.F. 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HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Campos Universitário Monte Alegre - Fone: 3602-1000 - Fax: 3633-1144 CEP: 14048-900 Ribeirão Preto - São Paulo. 1. NOME DA PESQUISA: “Avaliação do balanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários Policís ticos submetidas à indução da ovulação para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade” 2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada “Avaliação do balanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários Policísticos submetidas à indução da ovulação para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade” Sabemos que o estresse oxidativo compromete a fertilidade masculina. Temos suspeita de que o estresse oxidativo também possa comprometer a fertilid ade feminina, porém os dados disponíveis até o presente momento são escassos e controversos. A e ndometriose e a Síndrome dos Ovários Policísticos (SOMP) são causas bastante comuns de dificuldade para engravid ar (denominada infertilidade) e aventa-se a possibilidade do estresse oxidativo partic ipar da ocorrência destas duas freqüentes doenças, podendo, inclusive, contribuir para a infertilidade associada às mesmas. Desta forma, determinar os níveis de substâncias oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido folicular (fluido contido no folículo onde os óvulos se desenvolvem) de mulh eres inférteis com estas doenças poderia auxiliar a descobrir alguns dos mecanismos en volvidos na causa da infertilidade, o que, poderia auxiliar na identificação de tratamentos futuros. Contudo, pa ra podermos dizer se os níveis de substâncias oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido folicular de mulheres inférteis com estas doenças, são diferentes daqueles de mulheres inférteis sem estas doenças, precisamos comparar os mesmos com os provenientes de um grupo de pacientes tido como grupo controle, ou seja, cujos níveis sejam considerados como padrão de normalidade, aonde você estaria incluída. É possível que a estimulação da ovulação, que você realizará com o uso de medicações específicas, possa alterar o balanço de substânci as oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido folicular. Para avaliarmos se isto é verdadeiro, pro pomos avaliar os níveis de diferentes substâncias oxidantes e antioxidantes no sangue (em quatro diferentes momentos, quando vocês vêm normalmente a este serviço, visando a realização de procedimentos de reprodução assistida: no dia da consulta pré- basal, no dia de início da estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o uso da gonadotrofina coriônica humana e no dia da realização da captação de óvulos). Desta forma, autorizo a realização de coleta de sangue venoso, nos 4 dias propostos. Fui informada de que o procedimento pode ocasionar discreta dor local, podendo aparecer hematomas no lo cal da punção. Também autorizo a utilização do fluido folicular e das células da granulosa (cél ulas que envolvem o óvulo, representando a parede do folículo ovariano) obtidos, durante o procedimento de captação dos óvulos, após a identificação e separação dos óvulos pela bióloga responsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução. Fui informada de que, após o isolamento dos óvulos, o fluido folicular e as células da granulosa (que ficam misturadas ao fluido) são desprezados, uma vez que não apr esentam qualquer utilidade para o procedimento de reprodução ao qual serei submetida. Fui informada de que ser á realizada a análise dos níveis de algumas substâncias oxidantes e antioxidantes no fluido folicular, assim como a avaliação da capacidade antioxidante das células da granulosa ( por meio da análise da expressão de enzimas envolvidas na neutralização das substâncias oxidantes). Anexos 70 Temos indícios de que o estresse oxidativo possa também comprometer a qualidade dos óvulos, levando a redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam procedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometri ose e SOMP, questiona-se se um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar , seja a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualid ade e, conseqüentemente, gerar uma gestação menos viável. Contudo, na atualidade, não se rea liza a avaliação adequada da qualidade oocitária, devido à ausência de métodos bem estabelecidos capazes de predizer se os óvulos são bons ou não. A identificação da presença de alterações nos óvulos de pacientes portadoras de endometriose e SOMP, não somente ajudaria a elucidar um dos po ssíveis mecanismos caus adores da infertilidade, como também abriria perspectivas futuras de tratam ento para este grupo de pacientes. Contudo, para podermos dizer se os óvulos destas pacientes com endometriose ou SOMP são ou não são de boa qualidade, precisamos comparar a qualidade dos mesmos com a de óvulos provenientes de um grupo de pacientes tido como grupo controle, ou seja, cuja qualidade dos óvulos seja considerada como padrão de normalidade. Desta forma, você está sendo convidada para participar deste estudo na posição de paciente do grupo controle, ou seja, cujos óvulos sejam considerados como padrão de normalidade, para fins de comparação com os óvulos das pacientes com endometriose e SOMP. Uma forma indireta de avaliarmos a qualidad e dos seus óvulos, sem lhe causar qualquer risco adicional ou prejuízo do sucesso de você engravidar durante este procedimento de reprodução assistida, seria analisar a presença de algumas característi cas dos seus óvulos (como uma estrutura microscópica em seu interior chamada de “fuso celular”, um dos possíveis responsáveis pela qualidade dos seus oócitos), por meio de um microscópio de polarização, que não ocasiona qualquer dano aos óvulos e nem ao desenvolvimento dos embriões gerados a partir destes óvulos. Devemos, portanto, ressaltar que o estudo dos seus óvulos usando esta microscopia de polarização, não vai interferir no seu tratamento para engravidar, assim como não causará prejuízo algum para a sua saúde, nem para a do futuro bebê. Ressaltamos que a utilização desta metodologia já ocorre de rotina na prática diária do laboratório de reprodução do presente serviço, sendo que apenas solicitamos a autorização para utilizar os dados obtidos por meio da utilização desta metodologia. Também devemos ressaltar que a sua par ticipação no presente estudo não implicará na realização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para tentar engravidar, com exceção da coleta de sangue no dia de início de estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o uso da gonadotrofina coriônica humana e no dia da r ealização da captação de óvulos, como descrito acima. Sua colaboração, portanto, no fornecimento de am ostras de sangue, fluido folicular e células da granulosa, bem como autorizando a utilizar os dados obtidos com o uso da microscopia de polarização dos seus óvulos, será imprescindível para um melhor conhecimento do balanço oxidante e antioxidante e qualidade dos oócitos de pacientes com dificuldade para engravidar devido à Endometriose e SOMP. Este conhecimento no futuro poderá ser usado no senti do de propiciar um tratamento mais eficaz da infertilidade associada à Endometriose e à SOMP. É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu companheiro. Todo o material obtido será utilizado exclusivamente para a avaliação do balanço oxidante/antioxidante no sangue, fluido folicular e células da granulosa, e análise das características dos óvulos (não poderão ser utilizados para outros fins que não os desta pesquisa). Autorizo, caso haja amos tras remanescentes de materiais colhidos (sangue, fluido folicular e células da granulosa), ao armazenamento das mesm as, sendo que somente poderão ser utilizadas para a realização de pesquisas futuras, caso eu dê a minha autorização expressa, mediante a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido específico da nova(s) pesquisa(s). No caso de haver amostras remanescentes, eu assinarei um termo de consentimento específico, autorizando a sua estocagem e onde conste os tipos e quantidades de alíquotas armazenadas. 3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todos as dúvid as com relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente esclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você te m a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer mo mento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes dos integrantes deste estudo, bem como garantimos que será mantido o caráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso de que serão prestadas informações at ualizadas durante todo o Anexos 71 estudo, ainda que isto possa afetar a vossa vontade de continuar dele partic ipando. Asseguramos o compromisso de que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste projeto, bem como de que será ga rantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa. Eu, __________________ ___________________________, RG nº:___________ abaixo assinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e aceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras de sangue, fluido folicular e células da granulosa, bem como autorizando a utilizar os dados obtidos co m o uso da microscopia de polarização dos meus óvulos,. Autorizo a pesquisadora abaixo mencionada a utilizá-los para a pesquisa : “Avaliação do balanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários Policísticos submetidas à indução da ovulação para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade”, estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu consentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. Ribeirão Preto _______ / _______ / _________ _______________________________ ___________________________ Assinatura- Paciente Assinatura do Pesquisador 4. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP Telefone de contato: 16-3602-2231 Endereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º a ndar (Hospital das Clínicas- Setor de Reprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. Anexos 72 ANEXO B – Termo Consentimento Livre e Es clarecido para pacientes inférteis com endometriose. HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Campos Universitário Monte Alegre - Fone: 3602-1000 - Fax: 3633-1144 CEP: 14048-900 Ribeirão Preto - São Paulo. 1. NOME DA PESQUISA: “Avaliação do balanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários Policís ticos submetidas à indução da ovulação para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade” 2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada “Avaliação do balanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários Policísticos submetidas à indução da ovulação para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade”, na qualidade de membro do grupo de pacientes portadoras de endometriose. Sabemos que o estresse oxidativo compromete a fertilidade masculina. Temos suspeita de que o estresse oxidativo também possa comprometer a fertilid ade feminina, porém os dados disponíveis até o presente momento são escassos e controversos. A e ndometriose e a Síndrome dos Ovários Policísticos (SOMP) são causas bastante comuns de dificuldade para engravid ar (denominada infertilidade) e aventa-se a possibilidade do estresse oxidativo partic ipar da ocorrência destas duas freqüentes doenças, podendo, inclusive, contribuir para a infertilidade associada as mesmas. Desta forma, determinar os níveis de substâncias oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido folicular (fluido contido no folículo onde os óvulos se desenvolvem) de mulh eres inférteis com estas doenças poderia auxiliar a descobrir alguns dos mecanismos en volvidos na causa da infertilidade, o que, poderia auxiliar na identificação de tratamentos futuros. É possível que a estimulação da ovulação, que você realizará com o uso de medicações específicas, possa alterar o balanço de substânci as oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido folicular. Para avaliarmos se isto é verdadeiro, pro pomos avaliar os níveis de diferentes substâncias oxidantes e antioxidantes no sangue (em quatro diferentes momentos, quando vocês vêm normalmente a este serviço, visando a realização de procedimentos de reprodução assistida: no dia da consulta pré- basal, no dia de início de estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o uso da gonadotrofina coriônica humana e no dia da realização da captação de óvulos). Desta forma, autorizo a realização de coleta de sangue venoso, nos 4 dias propostos. Fui informada de que o procedimento pode ocasionar discreta dor local, podendo aparecer hematomas no lo cal da punção. Também autorizo a utilização do fluido folicular e das células da granulosa (cél ulas que envolvem o óvulo, representando a parede do folículo ovariano) obtidos, durante o procedimento de captação dos óvulos, após a identificação e separação dos óvulos pela bióloga responsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução. Fui informada de que, após o isolamento dos óvulos, o fluido folicular e as células da granulosa (que ficam misturadas ao fluido) são desprezados, uma vez que não apr esentam qualquer utilidade para o procedimento de reprodução ao qual serei submetida. Fui informada de que ser á realizada a análise dos níveis de algumas substâncias oxidantes e antioxidantes no fluido folicular, assim como a avaliação da capacidade antioxidante das células da granulosa ( por meio da análise da expressão de enzimas envolvidas na neutralização das substâncias oxidantes). Temos indícios de que o estresse oxidativo possa também comprometer a qualidade dos óvulos, levando a redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam procedimentos de reprodução assistida. Nas mulheres inférteis com endometri ose e SOMP, questiona-se se um dos motivos responsáveis pela maior dificuldade em engravidar , seja a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), que poderão produzir embriões também de má qualid ade e, conseqüentemente, gerar uma gestação Anexos 73 menos viável. Contudo, na atualidade, não se rea liza a avaliação adequada da qualidade oocitária, devido à ausência de métodos bem estabelecidos cap azes de predizer se os óvulos são bons ou não. A identificação da presença de alterações nos óvulos de pacientes portadoras de endometriose e SOMP, não somente ajudaria a elucidar o mecanismo cau sador da infertilidade, como também abriria perspectivas futuras de tratamento para este grupo de pacientes. Uma forma indireta de avaliarmos a qualidad e dos seus óvulos, sem lhe causar qualquer risco adicional ou prejuízo do sucesso de você engravidar durante este procedimento de reprodução assistida, seria analisar a presença de algumas característi cas dos seus óvulos (como uma estrutura microscópica em seu interior chamada de “fuso celular”, um dos possíveis responsáveis pela qualidade dos seus oócitos), por meio de um microscópio de polarização, que não ocasiona qualquer dano aos óvulos e nem ao desenvolvimento dos embriões gerados a partir destes óvulos. Devemos, portanto, ressaltar que o estudo dos seus óvulos usando esta microscopia de polarização, não vai interferir no seu tratamento para engravidar, assim como não causará prejuízo algum para a sua saúde, nem para a do futuro bebê. Ressaltamos que a utilização desta metodologia já ocorre de rotina na prática diária do laboratório de reprodução do presente serviço, sendo que apenas solicitamos a autorização para utilizar os dados obtidos por meio da utilização desta metodologia. Também devemos ressaltar que a sua par ticipação no presente estudo não implicará na realização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para tentar engravidar, com exceção da coleta de sangue no dia de início de estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o uso da gonadotrofina coriônica humana e no dia da r ealização da captação de óvulos, como descrito acima. Sua colaboração, portanto, no fornecimento de am ostras de sangue, fluido folicular e células da granulosa, bem como autorizando a utilizar os dados obtidos com o uso da microscopia de polarização dos seus óvulos, será imprescindível para um melhor conhecimento do balanço oxidante e antioxidante e qualidade dos oócitos de pacientes com dificuldade para engravidar devido à Endometriose e SOMP. Este conhecimento no futuro poderá ser usado no senti do de propiciar um tratamento mais eficaz da infertilidade associada à Endometriose e à SOMP. É importante ressaltarmos que este estudo não trará nenhuma despesa para você e seu companheiro. Todo o material obtido será utilizado exclusivamente para a avaliação do balanço oxidante/antioxidante no sangue, fluido folicular e células da granulosa, e análise das características dos óvulos (não poderão ser utilizados para outros fins que não os desta pesquisa). Autorizo, caso haja amos tras remanescentes de materiais colhidos (sangue, fluido folicular e células da granulosa), ao armazenamento das mesm as, sendo que somente poderão ser utilizadas para a realização de pesquisas futuras, caso eu dê a minha autorização expressa, mediante a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido específico da nova(s) pesquisa(s). No caso de haver amostras remanescentes, eu assinarei um termo de consentimento específico, autorizando a sua estocagem e onde conste os tipos e quantidades de alíquotas armazenadas. 3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todos as dúvid as com relação ao estudo que, porventura, possam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente esclarecidas pelos pesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você te m a liberdade de retirar o seu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer mo mento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento. Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes dos integrantes deste estudo, bem como garantimos que será mantido o caráter confidencial de toda informação relacionada a sua privacidade. Temos o compromisso de que serão prestadas informações at ualizadas durante todo o estudo, ainda que isto possa afetar a vossa vontade de continuar dele partic ipando. Asseguramos o compromisso de que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de participação neste projeto, bem como de que será ga rantida a continuidade do seu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa. Eu, __________________ ___________________________, RG nº:___________ abaixo assinada, declaro que fui informada e estou inteiramente de acordo com o exposto acima e aceito livremente participar do estudo em questão, fornecendo amostras de sangue, fluido folicular e células da granulosa, bem como autorizando a utilizar os dados obtidos co m o uso da microscopia de polarização dos meus óvulos,. Autorizo a pesquisadora abaixo mencionada a utilizá-los para a pesquisa : “Avaliação do Anexos 74 balanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários Policísticos submetidas à indução da ovulação para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade”, estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu consentimento e de deixar de participar do estudo a qualquer momento, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade do meu tratamento. Ribeirão Preto _______ / _______ / _________ _______________________________ ___________________________ Assinatura- Paciente Assinatura do Pesquisador 4. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP Telefone de contato: 16-3602-2231 Endereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º a ndar (Hospital das Clínicas- Setor de Reprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. Anexos 75 ANEXO C – Modelo de ficha de avaliação dos sujeitos do estudo Dados Clínicos e Laboratoriais Infertilidade: Primár ia Secundária G__P__C__A__ Endometriose: Mínima Leve Moderada Severa Endometrioma no ciclo atual nã o sim Número:________ Tamanho:____________ Endometrioma prévio não sim Número:________ Tamanho:____________ exérese com cápsula esvaziamento + cauterização cápsula conduta expectante Fator tubário Salpingectomia Laqueadura Tubá ria Hidrossalpinge (não visualizada ao US) Outros ____________________________ Fator masculino: Sim Não Mo rfologia > 8% > 4 % (____/___/____) Morfologia > 8% > 4 % (____/___/____) Técnica de processamento seminal: Swim up Gradiente Lavagem Qualidade seminal dia ICSI: mais de 5 milhões de sp tz móveis recuperados (SMR) 2-5 milhões de SMR e morfologia > 4% (exames prévios) < 2milhões de SMR ou morfologia < 4% (exames prévios) sptz obtido por PESA sptz obtido por TESE Sêmen Doador: Sim Não Pós-descongelamento (vide acima) Laparoscopia: Sim Não Local:________________ Data:_____________ Idade: _________ FSH Basal (____/_____/____): _________ Peso:_____________ Estatura:__________ IMC:_________ Terapia de Reprodução Assistida prévia: Sim Não N o de ciclos:________ IUI ____________ FIV- ICSI: _________ Medicações em uso: Sim Não Nome:_____________ Dose:___________ Tempo de uso:_________ _____________________________________________________ Anexos 76 Diabetes mellitus Doença cardiovascular Outras endocrinopatias _________________ Dislipidemia Lupus eritematoso sistêm ico Outras doen ças reumatológicas Infecção pelo HIV Qualquer infecção ativa Tabagismo N o cigarros dia:_____________ Consumo de Álcool Frequência:____________ Tipo de bebida:__________ Dados da indução FSH-r (total UI): __________(dose diária):_________Nº dias de indução:________ hMG-hp (total UI): ___________(dose diária):_________Nº dias de indução:_________ Nº total de dias de indução: __________ Total folículos ≥ 14mm no dia hCG: ________ OD: ______ OE: ______ Total folículos ≥ 18mm no dia hCG: _______ OD: ______ OE: ______ Dados da captação e fertilização Nº de oócitos captados: _______ Nº de folículos puncionados: _______ No de oócitos degenerados: __________ Maturidade oocitária: GV: ________MI: ________MII: _________ Nº oócitos injetados: ____ Nº de oócitos fertilizados:_____Taxa de fertilização:_____% Nº de embriões formados:____ Nº embriões clivados:____Taxa de Clivagem: ____% Qualidade Oocitária D0 Fuso Oócito Maturação Nuclear (MN) Citoplasma (CGC) Vacúolos (V) Corpúsculo Polar (CP) EIM +/- Loc 1 2 3 4 5 6 7 EIM: Estágios intermediários da meiose (TI: telófase I; AII: anáfase II; TII: telófase II) Anexos 77 Qualidade Embrionária D1 D2 D3 Embrião CP PN S N No Células S F M No Células S F M Destino 1 2 3 4 5 6 7 Dados de Transferência Dia da transferência: □ D2 □ D3 Nº embriões transferidos: ________ Numeração dos embriões transferidos:__________ Dados da Gestação ßHCG: Positivo □ Negativo □ Data: ____/___/_____Valor:_______ Gravidez Clínica: Sim Não No sacos gestacionais (US 4 semanas após TE):_______________ Taxa de implantação (no sacos gestacionais US 4 semanas após TE /no embriões transferidos): _________% Nº de sacos gestacionais (US 12 semanas): _________ Gravidez: única gemelar trigemelar quadrigemelar Perdas gestacionais: Sim Não Idade gestacional:___________________ Nascidos vivos: Sim Não N o:_______ Idade gestacional:_______________ Vitalidade:_____________________ Complicações obstétricas: Sim Não Descreva:___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ Artigo Científico Artigo Científico 79 Title Higher percentage of telophase I in living human oocytes from patients with moderate and severe endometriosis Running title Meiotic spindle in oocytes from infertile women with endometriosis Luciana A. Dib a, Maria C.P.M. Araújo a, Roberta Cristina Giorgenon a, Gustavo S. Romão a, MD, PhD, Rui A. Ferriania,b, MD, PhD, Paula A. Navarro, MD, PhDa,b* aDepartment of Obstetrics and Gynecology, Ribeirão Preto Medical School, São Paulo University, Ribeirão Preto, SP, Brazil. bNational Institute of Hormones and Women's Health, Ribeirão Preto, SP, 14049-900, Brazil *Corresponding author: Paula A. A. S. Navarro Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo Av. Bandeirantes, 3900, Ribeirão Preto, São Paulo 14049-900, Brasil Fax number: 55-16-3633 0946 E-mail: [email protected] Artigo Científico 80 FINANCIAL SUPPORT Luciana A. Dib was supported by a scholarship granted by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Brazil Conselho Nacional de Desenvolvimento Cien tífico e Tecnológico (CNPq) - Edital MCT/CNPq 15/2007 - Processo 478396/2007-4) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - 2008/58197-6 Artigo Científico 81

Lower fertilization, implantation and pregnancy rates in women with endometriosis may be related to impaired oocyte quality. Polarization microscopy permits the analysis of spindles in live oocytes without compromising assisted reproduction outcomes. Thus, the objective of this prospective study was to compare the presence/location of me iotic spindles of in vivo matured oocytes from women with endometriosis (stages I/II and III/IV ) and male or tubal causes of infertility (controls) undergoing stimulated cycles for intracytoplasmic sperm injection (ICSI). The meiotic spindles of 326 oocytes with the first polar body (PB) extruded (196 from the control group and 130 from endometriosis group, being 79 from the endometriosis I/II group and 51 from the endo metriosis III/IV group) were imaged using polarization microscopy immediately before ICSI. We did not observe a significant difference between the percentage of oocyt es in metaphase II with visi ble spindles among the analyzed groups (86.9%, 94.9%, and 91.5%, respectively, in the control, endometriosis I/II and endometriosis III/IV groups). We did not observe significant differences in the percentage of oocytes with spindles localized between 0° and 30°, 30° and 60, and 60° and 90° in relation to the first PB among the analyzed groups. Among the apparently mature oocytes, we observed a significant increase in th e percentage of oocytes in telophase I in th e endometriosis III/IV group (7.8%) when compared to the control ( 2.5%) and the endometrios is I/II groups (0%). The observation of a higher proportion of oocytes in telophase I among apparently matured oocytes in patients with moderate and severe endometriosis suggests an impairment or delay in the completion of meiosis I, which may have clinical implications.

Endometriosis; meiotic spindle; telophase I; human oocyte quality; polarization microscopy; ICSI Artigo Científico 82 Summary for lay readers Lower fertilization, implantation and pregnancy rates in women with endometriosis may be related to impaired oocyte qualit y. For a mature oocyte to be pr epared for fertilization, the meiotic spindle must maintain its integrity. Po larization microscopy permits the analysis of spindles in live oocytes without compromisi ng assisted reproduction outcomes. Thus, the

of this prospective study was to comp are the presence/location of meiotic spindles of in vivo matured oocytes from women with endome triosis (stages I/II – minimal/mild and III/IV – moderate/severe) and male or tubal ca uses of infertility (control group) undergoing stimulated cycles for intracytoplasmic sperm in jection (ICSI). The meiotic spindles of 326 oocytes with the first polar body (PB) extr uded (196 from the control group and 130 from endometriosis group, being 79 from the e ndometriosis I/II grou p and 51 from the endometriosis III/IV group) were imaged us ing polarization microscopy immediately before ICSI. Preliminary data from this prospective controlled study did not demonstrate differences in the visualization and localization of the metaphase II meiotic spindles of living oocytes obtained from stimulated cycles of infertile patients with endometriosis and controls. However, the higher proportion of oocytes in telophase I among an apparently matured cadre of oocytes observed in patients with modera te and severe endometriosis suggests an impairment or delay in the completion of meiosis I that requires further evaluation. Artigo Científico 83

In the spectrum of endometriosis-related sy mptoms, one of the most intriguing is the disease’s association with infertility, princi pally in cases where there are no mechanical alterations of the reproductive system. Although it has been a controversial issue for decades, various data have supported the concept of d ecreased fertility in endometriosis patients (GARRIDO et al., 2000; GARRIDO et al., 2002). The finding that the control group in donation cycles and patients with endometrios is have similar oocyte implantation rates suggests an important role of the embryonic quality in the comp letion of the implantation in this group of patients (GARRIDO et al., 2000; BARNHART et al., 2002; AL-FADHLI et al., 2006). Some studies have suggested that oxidative stress has a potential role in explaining the etiopathogenesis of infertility associated with endometriosis (JACKSON et al., 2005; GUPTA et al., 2006; MANSOUR et al., 2009) that could theoretically pr omote an impairment of the oocyte quality among these patients. There were a lterations in the quality of oocytes, leading to either an impairment to embryonic developm ent (BRIZEK et al., 1995) or a total block in that process (PELLICER et al., 1995), when women with endometriosis were compared to the healthy controls. Corroborating these findings, clinical data from oocyte donation programs seem to support the previously described theo ry that women affected with endometriosis produce poor quality oocytes (GARRIDO et al., 2000). For the mature oocyte to be prepared for fert ilization, it is necessa ry that the meiotic spindle, a fundamental part of the oocytic developmental proce ss, maintain its integrity and function. In a recently published study on in vitro analysis of mature oocytes obtained from stimulated cycles of infertile patients with either endometriosis or a control group, we observed that patients with endom etriosis tended to have a hi gher percentage of oocytes in telophase I (BARCELOS et al., 2009). This findi ng suggests a potential delay or impairment Artigo Científico 84 of meiosis I associated with endometriosis, which would contribut e to decreased oocyte quality. However, we highlight the fact that th e number of cases presented is small and that the data cannot necessarily be extrapolated to in vivo mature oocytes. These are usually unavailable for studies using invasive methods that would render th eir use in assisted reproduction (AR) procedures impossible. Th ese findings arouse interest in using non- invasive and innocuous methods to analy ze this important cellular structure in in vivo, mature oocytes from stimulated cycles of infertile women with endometriosis . Such an approach would make the utilization of the analyzed oocytes in subsequent AR procedures possible. Non-invasive methods for ooc yte imaging are especially important for clinicians working with limited and valuable material such as human eggs. Birefringence, which can be measured using polarized light microscopy, is an optical property that results from molecular order and allows visualization of highly ordered biological structures such as spindles (LIU et al., 2000; NAVARRO et al., 2005; PETERSEN et al., 2009). The application of birefringence imaging with the Pol-Scope to mammalian eggs and embryos has been described in detail elsewhere (KEEFE et al., 2003; PETERSEN et al., 2009). Visualization of the meiotic spindle from living oocytes may have clinical utilit y for predicting embryo quality and fertilization after ICSI (WANG e KEEFE, 2002; HYUN et al., 2007; PETERSEN et al., 2009). Otherwise, identification of the position of the meiotic spindle relative to the first polar body may prevent embryologists from damaging this important ce llular structure during ICSI (MOON et al., 2003). Thus, visualization of the me iotic spindle may be used to se lect oocytes to be injected by ICSI and might have clinical relevance, particularly in countries where there is a legal limit on the number of oocytes to be fertilized (P ETERSEN et al., 2009). Despite the benefits of this research, we could not find any literature evaluating the meiotic spindles of living in vivo matured oocytes from infertile patients with endometriosis and comparing them with a control group. Artigo Científico 85 Thus, this study has the objective of usi ng polarization micros copy to analyze, visualize and localize the meiotic spindles of mature oocytes from stimulated cycles of infertile women with endometriosis in vivo and to compare the findings to a control group composed of women who are infertile secondary to tubal and/or male factors.

A prospective study was completed from March 2008 to March 2009 with the Human Reproduction Sector of the Gyn ecology and Obstetrics Department of the FMRP-USP. This study was submitted to and approved by the Res earch Committee. All of the participating couples underwent ovulation induction for purpose s of ICSI, fulfilled the inclusion criteria, demonstrated a desire to participate in the project and completed an informed consent form. Patients with age ≤ 38 years, basal FSH (Follicle stimulating hormone) < 10 mIU/mL and BMI (body mass index) < 30 Kg/m² were in cluded. The women with endometriosis were included when diagnosed by videolaparoscopy acco rding to the protocol from the American Society of Reproductive Medicine (Revised Am erican Society for Re productive Medicine classification of endometriosis: 1996), which classifies the disease in four stages: minimum (stage I), mild (stage II), moderate (stage III) and severe (stage IV). Women included in the control group did not have pelv ic diseases associated with infertility, as demonstrated by videolaparoscopy. Patients with chronic patholog ies or tobacco or alcoholic use disorders and patients using medications that could inte rfere with ovarian foliculogenesis in the two months prior to the beginning of ovulation induction (suc h as NSAIDs anti-inflammatories, and corticosteroids) were excluded. Seventy-four patients met th e inclusion criteria for the study. Of these, 43 presented with male and/or tubal factors and were desi gnated as the control group, and 31 presented Artigo Científico 86 with infertility related to endometriosis (16 wi th minimal and mild endometriosis and 15 with moderate and severe endometriosis). The participating patients underwent p ituitary suppression using a gonadotropin- releasing hormone (GnRHa) analog 10 days prio r to the basal TVUS (long protocol), with administration of leuproliof acetate (Lupron®, Abott, Brazil). The patients received 100 to 300 IU per day of recombinant FSH (FSHr) (G onal-F®, Serono, Brazil; Puregon®, Organon, Brazil) in the first six days of induction. When at least two folli cles reached a mean diameter of 18 mm, the recombinant hC G was administered (Ovidrel®, Serono, Brazil). The oocyte collection was performed 34 to 36 hours after administration of recombinant hCG. All of the material aspirate d during oocyte collection was analyzed to identify and isolate the cumulus-oocyte complexes. After identification, the cumulus-oocyte complexes were isolated from the follicular fluid (FF) and placed upon separated plates. The cumulus- oocyte complexes were careful ly washed in Human Tuba l Fluid-HEPES (HTF, Irvine Scientific) to remove blood and debris. Subs equently, they were placed upon NUNC plates (Multidish 4 wells Nuclon, Delta SI), filled w ith HTF culture medium , covered with mineral oil, and subjwected to 5% CO 2 gas incubation under ideal temp erature (37ºC) and humidity (95%) conditions for a period of 2-3 hours. Af ter this period, in order to remove the cumulus oophorus and the corona radiata, the cumulus-oocyte complexes were placed in micro-drops of 25 µL of hyaluronidase (H4272 type IV-S, Sigma), diluted in 80 UI/mL of HTF/HEPES (Irvine Scientific), for a maximum of 30 sec onds, and then washed 2-3 times with HTF modified medium (HTF/HEPES, Irvine Scientif ic) supplemented with 10% Synthetic Serum Substitute (SSS). The mechanical removal of ce llular debris was done with a Pasteur pipette (stripper pipette 130 µm denuding pipette, Cook, Melbourne, Australia). After oocytic denuding (removal of cumulus oophorus ), the degree of oocyte maturation was identified using a light microscope. The immatu re oocytes (in germinative Artigo Científico 87 vesicle stage or metaphase I) were disc arded. The mature oocytes (morphologically characterized by the presence of an extrusion polar body ) were incubated in 25 µL of HTF + 10% SSS for one hour (after ooc yte denuding) and then anal yzed by OCTAX ICSI Guard TM System (Medical Technology Vertriebs-GmbH, Altdorf, Germany) and injected during the ICSI procedure. The oocyte cellular spindles with the first pola r body extrusion were evaluated using an inverted microscope equipped with a vi deo camera and with the hardware of the polarization microscope, which consists of electri c crystals and of an optic-electric controller (OCTAX ICSI Guard TM System, Medical Technology Vertri ebs-GmbH, Altdorf, Germany). The electric crystal groups are controlled by the comput er through the OCTAX EyeWare™ Software (Universal Imaging Corp., Boston, MA). The oocytes were analyzed at 37°C, in 5 µl drops of HTF/Hepes + 10% SSS in coated glass bottom Petri dishes ( MatTek Corp., Ashland, MA), and placed on a surface heated to 37°C. To control the methodological biases related to non-visualization of the spindle due to oocyte denuding and metaphase aging, denudi ng was done two to three hours after the cellular collection. Subsequently, the oocytes were placed on the previously balanced culture plates in the incubator for one more hour followed by imaging and ICSI. A maximum of seven oocytes were analyzed on each plate b ecause the total time, including the time necessary to analyze the cellular spindle by polar ization microscope and ICSI, was less than or equal to 7 minutes. The oocytes with a first visible polar body (PB) were anal yzed by polarization microscopy and characterized acco rding to the real nuclear matu ration stage (telophase I or metaphase II), the presence or absence of visi ble cellular spindles and the location of the cellular spindle in oocytes at metaphase II. The oocytes that presented with an elongated cellular spindle perpendicular to the oocytic membrane and extending to the first PB were Artigo Científico 88 considered to be in telophase I. The cellular spindles in metaphase II were characterized by the presence of radially distribut ed birefringent fibers in the shape of a barrel and oriented parallel to the cortical membrane. Because chromosomes are minimally birefringent, they were not properly analyzed by this methodology. The cellular sp indle localization was based on the angle formed between this structure and th e fist PB; the oocytes were divided into six groups, as follows: those with spindles making 0 to 30 º angles as related to the first PB, those with spindles making 30 to 60 º angles as relate d to the first PB, those with spindles making 60 to 90 º angles as related to the first PB, t hose with spindles making 90 to 120 º angles as related to the first PB, those w ith spindles making 120 to 150 º a ngles as related to the first PB, and those with spindles making 150 to 180 º angles as related to the first PB. At 18 to 19 hours after ICSI, fertilizati on was analyzed and characterized by the presence of two pronuclei and tw o polar bodies (the fe rtilization rate calc ulated in the two analyzed groups corresponds to the number of fe rtilized oocytes divided by the number of injected oocytes multiplied by 100). Cleavage was verified around 24 hours after fertilization with the observation of cellula r division. At about 44 hours af ter ICSI (D2), the embryonic quality was analyzed and characterized by the symmetry and number of blastomeres, fragmentation, and the percentage and presence or absence of multinuc leation. Good quality embryos in D2 were defined as having four blastomeres, being symmetric, having less than 20% fragmentation and the absence of multinuclea tion. We analyzed the percentage of cycles with at least one good quality embryo formed among the analyzed groups. Statistical Analysis Initially the endometriosis and control gr oups were comparatively analyzed using Fisher’s exact test with regard to the following parameters: the percentage of oocytes in telophase I, the pe rcentage in metaphase II with visibl e and non-visible cellular spindles, the Artigo Científico 89 oocytes with cellular spindles localized in the different positions, fertil ization rates, and the percentage of cycles producing at leas t one good quality embryo. The endometriosis subgroups (stages I/II and III/ IV) were posteriorly compared to the variables already described by Fisher’s exact test. For comparative analyses of the quantitative variables, the unpaired t-test and the Mann-Whitney test were used. The significance level was 5% (p<0.05) in all analyses.

No significant differences were found am ong the three analyzed groups (control, endometriosis I/II and endometrio sis III/IV) in relati on to the total FSH dos e used, the length of ovarian stimulation, the number of follicles between 14 and 17 mm, the number of follicles ≥ 18 mm, the number of collected oocytes, the num ber of mature oocytes, fertilization rate, and the percentage of cycles producing at least one good qual ity embryo transferred in D2 (Table 1). There were 326 oocytes with the first visi ble polar body that we re analyzed with polarization microscopy, 196 from the contro l group and 130 from the endometriosis group (79 from the endometriosis I/II group and 51 from the endometriosis III/IV group). Among the apparently mature oocytes, we observed a significant increase in the percentage of oocytes in telophase I (Figure 1A) in the endometriosis III/IV group (7.8% of oocytes in telophase I) when compared to the contro l (2.5%) and the endometriosis I/II groups (0%). We did not observe a significant difference between the per centage of oocytes in metaphase II with visible (Figure 1B) and non-visi ble (Figure 1C) cellular spindl es among the analyzed groups (86.9%, 94.9%, and 91.5%, respectiv ely, in the control, endometr iosis I/II and endometriosis III/IV groups). All of the oocytes presented a cellular spindle localized between 0° and 90° in relation to the first polar body. We did not obs erve any significant differences in the Artigo Científico 90 percentage of oocytes with cel lular spindles localized between 0° and 30° (Figure 1D), 30° and 60° (Figure 1E), and 60° and 90° (Fig ure 1F) among the analyzed groups. It is noteworthy that the percentage of oocytes with cellular spindles loca lized between 60° and 90º in relation to the first PB was small am ong the three analyzed groups (4.2%, 2.7% and 4.7%, respectively in the control, endometriosi s I/II and endometriosis III/IV groups) (Table 2).

We found controversial AR results for patien ts with endometriosi s, a topic that has been the focus of several studies and hypot heses in recent years (GARCIA-VELASCO e ARICI, 1999; GARRIDO et al., 2000). Data from a meta-analysis of ei ght relevant studies suggested that implantation is significantly compromised and embryonic quality is poor in patients with endometriosis, possibly refl ecting poor oocyte quality (BARNHART et al., 2002). Some studies (MANSOUR et al., 2007) have shown significant DNA damage and increased chromosomal anomalies in mature m ouse oocytes when incubated with peritoneal fluid from patients with endometriosis. These re sults were attenuated when the culture was supplemented with the antioxidant L-carnitine, sugge sting that oxidative stress is involved in the impaired oocytic quality found in patients with endometriosis (MANSOUR et al., 2009). Other studies evaluating the potential effects of oxidative stress on the meiotic oocytic spindle have demonstrated that it can damage vari ous intracellular proteins (STADTMAN, 1992; BERLETT e STADTMAN, 1997). Some of these da maged proteins are important for cellular spindle organization (ANTONIO et al., 2000; FUNABIKI e MURRAY, 2000; ABRIEU et al., 2001). The oxidative stress may simultaneous ly or independently damage the DNA and cause incorrect chromosomal alignment (BECKMAN e AMES, 1998; LIMOLI et al., 1998; LIU et al., 2003; NAVARRO et al., 2004; NAVARRO et al., 2006 ), creating cell cycle Artigo Científico 91 anomalies. Meiotic anomalies can contribute to failed cellular development by different routes, ranging from the inabil ity of the oocyte to complete the maturation process, which makes it incapable of being fertilized, to the appearance of variable errors in the meiotic maturation process that do not make fertiliz ation impossible but can compromise embryonic development pre- and/or post-implantation, as well as the future viability of the embryo (PAVLOK et al., 1992; LONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001). Different methodologies can be used to ev aluate the oocyte cellular spindles. Among these, polarization microscopy enables observation and charac terization of birefringent structures in live cells without the necessity of fixation (P ETERSEN et al., 2009). It is an innocuous method that permits the utilization of the analyzed oocytes for ICSI without compromising subsequent embryonic development. In this study, the meiotic spindle was visual ized in 89.6% of the examined oocytes, as supported by the data in the literature, where visualization of the cellular spindle can range from 62.8 to 91% (RIENZI et al., 2003; MADASCHI et al., 2008). The high percentage of oocytes with visible cellular spindles observed in the three analyzed groups in this study can be attributed to rigorous me thodological control, including incubating oocytes for one hour after denuding and adequate control of ambient conditions (maintenance of ideal temperature and pH and reduction of the time of light exposure during analyses and time outside incubation) (ROBERTS et al., 2002). In relation to the localization of the cellula r spindle, we did not observe significant difference between the groups. Of the total numbe r of oocytes with visible cellular spindles, 84% were localized between 0° and 30° in re lation to the polar body; the percentage of oocytes in the three analyzed groups with cellul ar spindles localized between 60° and 90º in relation to the first PB was very small. Studies in the literature have evaluated the angle formed between the polar body and the cellular spindle and concluded that when the angle Artigo Científico 92 does not exceed 90°, there are no effects on the fe rtilization rates of these oocytes (RIENZI et al., 2003; FANG et al., 2007). Therefore, we sugge st that the localizat ion of the oocytic cellular spindle in anomalous positions is not a variable responsible for the decreased oocytic quality in patients with infertility related to endometriosis. Oocytes in telophase I have not yet finished meiosis I, but by optic microscopy, these oocytes can present with morphological characteristics similar to oocytes that have completed meiosis I and are in metaphase II (HYUN et al., 2007). Among the patients with infertility related to moderate and severe endometriosis, the present study demons trates a significant increase in apparently mature oocytes in vivo that were actually in telophase I. These data corroborate recent findings indicating a tendency for a higher proportion of in vitro mature oocytes obtained from stimulated cycles of patients with endometriosis to be in telophase I, as compared to the control group (BARCELOS et al., 2009). The present finding indicates that the potential delay or impairment of meiosis I in patients with in fertility related to endometriosis occurs not only in mature oocytes in vitro, but also in the mature oocytes in vivo. It must be noted that in the present study, this finding was observed only in the subgroup of patients with endometriosis III/IV, suggesting that the se verity of disease could be associated with the impaired conclusion of me iosis I and, consequently, with the decreased oocytic quality. Some authors (HYUN et al., 2007) have shown that apparently mature oocytes (with first visible PB) that were actually in te lophase I according to analysis by polarization microscopy presented significantly lower fertiliz ation rates when compared to oocytes that had completed meiosis I (15.8% versus 80%, re spectively). We suggest that the increased percentage of oocytes in telophase I from the infertile patients with endometriosis III/IV may contribute to the decreased oocytic quality in this group of patients (AL-FADHLI et al., 2006; BARCELOS et al., 2009). It is possible that anal ysis of the oocytic nuclear maturation stage Artigo Científico 93 may be used as a prediction factor for the fertil ization rate in this group of patients, which needs to be analyzed in studies with adequa te methodology. On the othe r hand, it is possible to postpone oocyte insemination in telophase I in patients with moderate and severe endometriosis. This could have a positive im pact on assisted reproduction procedures and needs to be adequately evaluated. We can conclude from this study that sign ificant differences be tween patients with endometriosis and control patients (infertility by tubal and/or male factors) were not verified via polarization microscopy in terms of the percentage of oocytes in metaphase II with visible and non-visible cellular spindles or in relation to the spindle localization. However, we saw a significant increase in the percenta ge of oocytes in telophase I in patients with endometriosis III/IV, suggesting an impairment of meiosis I. Future studies with a well-delineated methodology will allow the analysis of the real clinical impact of this technique in this subgroup of patients. Acknowledgments The authors wish to thank the following employees of the Laboratory of Assisted Reproduction, Department of Gyn ecology and Obstetrics, University Hospital, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, fo r technical support and for contributing to the execution of the present study: Maria Ap arecida Carneiro Vasconcelos, Marilda Yamada Dantas, Maria Albina Bortoliero, Maria Auxiliadora Pádua Rosa and Sandra Viana. Artigo Científico 94

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Artigo Científico 99 Endometriosis Variables Control I – II III – IV p value 33.4 ± 3.4 Age (years) Number of patients 43 33.6 ± 2.9 16 33.1 ± 3.6 15 NS - Number of initiated cycles 49 20 18 - Total FSH Dose (UI) 1987 ± 654.7 1868 ± 476.3 2183 ±702.5 NS Length of ovarian stimulation (days) 9.1 ± 1.6 8.4 ± 1.1 9.2 ± 1.6 NS Follicles 14-17 mm 4.3 ± 2.4 3.6 ± 1.8 3.6 ± 3.4 NS Follicles ≥ 18 mm 2.7 ± 1.7 3.2 ± 1.7 3.4 ± 2.3 NS Number of cycles with oocytes retrieval 47 18 16 - Retrieved oocytes 6.4 ± 3.7 6.0 ± 3.8 5.1 ± 3.4 NS Number of mature oocytes 5.0 ± 3.2 4.9 ± 2.7 3.6 ± 2.6 NS Fertilization Rate (%) 80 (156/195) 79.7 (63/79) 72.9 (35/48) NS Number of cycles with transfer 45 18 14 - % of cycles with at least one good quality embryo transferred in D2 28.9 (13/45) 33.3 (6/18) 28.5 (4/14) NS Legend: Mean ± standard deviation/ NS: non-significant (p > 0.05) Mature oocytes: oocytes with first visible polar body; Fertilization Rate: number of fertilized oocytes /number of injected oocytes x 100; % of cycl es with at least one good quality em bryo transferred in D2: number of cycles with at least one embryo with four symmetrical and without D2 fragmentation cells/number of cycles with transfer x 100 Table 1: Comparison of the pa rameters of controlled ovari an stimulation and results o f intracytoplasmatic injection of spermatids (ICSI) into infertile women with endometriosis and control (tubal and/or male factors) Artigo Científico 100 Endometriosis Variables Total Control I – II III – IV p value Nuclear Maturation - Telophase I (%) 2.8 (9/326) 2.5 (5/196) 0 7.8 (4/51) 0.02 - Metaphase II (%) 97.2 (317/326) 97.4 (191/196) 100 (79/79) 92.1(47/51) NS Spindle visualization - Non visible (%) 10.4 (33/317) 13 (25/191) 5.0 (4/79) 8.5 (4/47) NS - Visible (%) 89.6 (284/317) 86.9 (166/191) 94.9 (75/79) 91.5 (43/47) NS Spindle Localization - 0° – 30° (%) - 30° – 60° (%) - 60° – 90° (%) 83.8 (238/284) 12.3 (35/284) 3.9 (11/284) 85.5 (142/166) 10.2 (17/166) 4.2 (7/166) 78.6 (59/75) 18.6 (14/75) 2.7 (2/75) 86 (37/43) 9.3 (4/43) 4.7 (2/43) NS NS NS Legend: NS: non-significant (p > 0.05) Mature oocytes: oocytes with first visible polar body Table 2: Non-invasive analysis of mature oocytes from stimulated cycles of infertile patients with and without endometriosis (tubal and /or male factors).