{"paper_id":"f3c13af0-5408-4b72-8ea7-6b41e0742224","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \n \n \nLUCIANA AZÔR DIB \n \n \n \n \n \nAnálise não invasiva do fuso celular oocitário e os resultados dos \nprocedimentos de reprodução assistida em mulheres inférteis com \nendometriose \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2010 \n\n \nLUCIANA AZÔR DIB \n \n \n \n \n \nAnálise não invasiva do fuso celular oocitário e os \nresultados dos procedimentos de reprodução assistida \nem mulheres inférteis com endometriose \n \n \n \nDissertação apresentada à Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Pre to da Universidade de \nSão Paulo para obtenção do título de Mestre em \nMedicina. \n \nÁrea de concentração: Tocoginecologia \n \n \nOrientadora: Profa. Dra. Paula Andrea de Albuquerque Salles Navarro \n \n \n \n \n \nRIBEIRÃO PRETO \n2010 \n\n \nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio \nconvencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nFICHA CATALOGRÁFICA \n \n \n \n \n \nDib, Luciana Azôr  \n \nAnálise não invasiva do fuso cel ular de oócitos de mulheres \ninférteis com endometriose e correlação com os resultados dos \nprocedimentos de reprodução assistida, 2010.  \n \n100 p. il., 30cm. \n \nDissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina \nde Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Tocoginecologia \n \nOrientador: Navarro, Paula Andrea Albuquerque Salles \n \n1. Endometriose. 2. Fuso meiótico. 3. Qualidade oocitária. \n4. Microscopia de polarização. 5. ICSI. \n6. Ciclos de estimulação ovariana controlada. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedicatória \n\n \nA minha mãe, Ana Maria Fraga Azôr Dib (in memoriam), minha fonte \ninesgotável de fé e otimismo. Mulher determinada que, através de seu exemplo \nde luta, coragem e perseverança, contribuiu imensamente para minha formação \npessoal. \n \nA meu pai, Carlos Antonio Dib, médico extremamente dedicado e altruísta. \nCom seu jeito amoroso ensinou-me a buscar meus objetivos e batalhar por \neles, assim como ele o fez.  \nÉ um orgulho enorme ser sua filha e almejo, algum dia, ser metade da pessoa \nque você é hoje.  \n  \nA meus irmãos, Frederico Azôr Dib e Marina Azôr Dib, meus amigos. Com \neles aprendi o valor do amor, da paciência e da união.  \n \nA meu noivo, Marcelo Gondim Rocha, meu companheiro e ombro amigo \ndesta jornada.  Uma pessoa que me fez entender e vivenciar o verdadeiro \nsentido da palavra felicidade. \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nA minha orientadora, Paula Andrea de Albuquerque \nSalles Navarro , por ter contribuí do indiscutivelmente \npara a minha formação profissional; por ter sido minha \nconfidente e verdadeira amiga; por ter sido uma mãe, \nacolhedora, atenciosa e conselheira em todos os \nmomentos difíceis que en frentei ao longo desta \ncaminhada. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAgradecimentos \n\n \nÀ Deus que sempre me deu força e coragem para continuar seguindo meus objetivos, apesar \ndas adversidades encontradas nesta trajetória. \n \nA todos os meus familiares que sempre estiveram ao meu lado dispostos a oferecer todo amor, \namizade, carinho e conforto mesmo estando distantes fisicamente\n. \n \nÀ Profa. Dra. Anaglória Pontes, pela dispon ibilidade em participar da minha banca de \nmestrado, acrescentando sugestões valiosas,  que em muito contribuíram para meu \naprendizado. \n \nAo Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani, por que m tenho grande admiraçã o, por ter aceitado \nparticipar da minha banca de mestrado. \n \nÀ Comissão de Pós-graduação em Tocoginecologia, pela oportunidade de fazer meu mestrado \nneste setor. À querida amiga Suelen Bezerra, pe la disponibilidade em garantir ajuda sempre \nque necessária e ao professor Antonio Alberto Nogueira pelos ensinamentos que contribuíram \npara a minha formação acadêmica. \n \nA todos que compõem o Departamento de Gi necologia e Obstetrícia da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto (docentes e médicos contratados), pela minha formação \nprofissional. \n \nA todos funcionários do Depart amento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de \nMedicina de Ribeirão Preto, pe la disponibilidade em ajudar quando necessário, em especial a \nIlza, Ricardo, Reinaldo e Rosane. \n\n \nA todos que trabalham no Setor de Reprodução  Humana, pelos inúmeros ensinamentos e \npelas oportunidades proporcionadas ao meu cresci mento profissional e pelo despertar para a \nvida acadêmica. \n \nAos funcionários do laboratório de Ginecologia e Obstetrícia: Auxiliadora, Marisa e Océlia, \npelo auxílio na coleta de sangue  das pacientes; Albina, pelo carinho; Roberta, pela ajuda no \nlaboratório; Sandra, Marilda, Cidinha, Débora entre outros, pela amizade dispensada a mim. \n \nÀ amiga Maria Cristina Araújo, que me ajudou na construção deste trabalho. Além disso, \nesteve ao meu lado, vibrando com o sucesso e, nas horas mais tristes, oferecendo consolo. \n \nAos amigos da Pós-graduação pela convivê ncia diária e sempre divertida, pelo \ncompanheirismo e pela troca de aprendizado e favores durante esse período de especialização. \n \nA todos os meus amigos que conheci em Ribe irão Preto em especial a Aline, Erci, o \nAnderson, a Jhenifer e Jacira, que muito me ajudaram para concretização desta etapa de vida. \n \nÀ minha grande amiga e vizinha Milena, irmã de coração, pela dem onstração diária de \ncarinho e afeto. \n  \nAos meus eternos amigos: Ilka, Monique, Silvan a e Bruno pela presença constante em todos \nos momentos da minha vida, me apoiando incondicionalmente. \n \nÀs mulheres que participaram deste estudo como voluntárias, pela colaboração e pela \nconfiança depositada. \n\n \nÀ FAPESP, CNPq e a CAPES pe lo apoio financeiro imprescindível na confecção desta \npesquisa. \n \nA todos os que contribuíram, di reta ou indiretamente, para re alização deste trabalho, o meu \neterno agradecimento.  \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nEpígrafe \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n\"Não faças do amanhã o sinônimo de nunca,  \nnem o ontem te seja o mesmo que nunca mais. \nTeus passos ficaram.  \nOlhes para trás... mas vá em frente  \npois há muitos que precisam  \nque chegues para poderem seguir-te.\" \n \n                                                                                                                             Charles Chaplin \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nResumo \n\n \nDIB, LA. “Análise não invasiva do fuso celul ar oocitário e os resultados dos \nprocedimentos de reprodução assistida em  mulheres inférteis com endometriose” \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. \n \nIntrodução: Apesar de controverso, questiona-se um papel deletério da endometriose nos \nresultados de procedimentos de reprodução assistida, o que pode estar relacionado ao \ncomprometimento da qualidade oocitária. Para que o oócito maduro esteja preparado para a \nfertilização, é necessário que o fuso meiótico mantenha a sua integridade e funcionabilidade.  \nObjetivos: Comparar a presença e localização do fuso meiótico e o estágio de maturação \nnuclear de oócitos com o primeiro corpúsculo polar (CP) visível de pacientes inférteis sem e \ncom endometriose. Comparar os resultados de Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides \n(ICSI) entre os oócitos em telófase I e metáfase  II, e entre aqueles com e sem fuso celular \nvisível, nos grupos analisados.  \nMetodologia: Estudo prospectivo e controlado com pacientes inférteis, submetidas à \nestimulação ovariana para realização de ICSI, selecionadas consecutivamente e divididas em \ndois grupos: Controle (fator tubário e/ou ma sculino) e Endometriose (subdividido em \nendometriose mínima e leve – I/II versus mo derada e severa – III/IV). Os oócitos com \nextrusão do primeiro CP foram avaliados pe la microscopia de polarização imediatamente \nantes da realização da ICSI e caracterizados qua nto à presença/localização do fuso celular em \nrelação ao primeiro CP e ao estágio de matur ação nuclear (telófase I ou metáfase II). Foram \nanalisados as taxas de fertilização, clivag em, número de embriões de boa qualidade no \nsegundo (D2)  e terceiro (D3) dia de desenvol vimento oriundos dos oócitos em telófase I \nversus metáfase II, e metáfase II com fuso visível versus sem fuso visível, nos grupos \ncontrole, endometriose, endometriose I/II e endometriose III/IV. \nResultados: Foram analisados 441 oócitos, se ndo 254 do grupo controle e 187 do grupo \nendometriose (115 do grupo endometriose I/II  e 72 do grupo endometriose III/IV). Não \nobservamos diferença significativa entre a percen tagem de oócitos em metáfase II com fuso \n\n \ncelular visível e não visível (88,6%, 91,3%, 88,2%, respectivamente, nos grupos controle, \nendometriose I/II e endometriose III/IV) e en tre a percentagem de oócitos com fuso celular \nnas diferentes localizações nos grupos avaliados. Entre os oócitos aparentemente maduros, \nobservamos um aumento significativo de oócito s em telófase I no grupo endometriose III/IV \n(5,6%) quando comparado ao grupo endometrios e I/II (0%). Observam os uma tendência a \nmenores taxas de fertilização dos oócitos injeta dos em telófase I quando comparados aos em \nmetáfase II, nos grupos controle (p=0,08), endometriose (p=0,05) e endometriose III/IV \n(p=0,09). Comparando-se os oócitos com e se m fuso celular visível, não observamos \ndiferença significativa nos resultados de ICSI entre os grupos analisados. \nConclusão: Não observamos diferença significativ a entre os grupos analisados quanto à \nvisualização e localização do fu so celular em oócitos maturados in vivo com o primeiro CP \nvisível. Todavia, observamos  um aumento significativo de oócitos em telófase I nas \nportadoras de endometriose moderada e seve ra, sugerindo um retardo ou comprometimento \nna conclusão da meiose I. Considerando que os  oócitos injetados em telófase I apresentam \npiores taxas de fertilização do que os injetados em metáfase II, este achado poderia justificar o \ncomprometimento dos resultados de reprodu ção assistida em mulheres inférteis com \nendometriose moderada e severa, além de ser utilizado com ferramenta prognóstica pós-ICSI. \n \n \nPalavras-chave: Endometriose; fuso meiótico; qualidade oocitária; microscopia de \npolarização; ICSI; ciclos de estimulação ovariana controlada. \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbstract \n\n \nDIB, LA. Living human oocytes with first polar body extrusion from patients with \nmoderate and severe endometriosis contain a higher percentage of telophase I oocytes . \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. \n \nIntroduction: Although it has been a controversial i ssue for decades, a deleterious role of \nendometriosis on assisted reproductive techni ques (ART) outcomes is questioned, which may \nbe related to oocyte quality. For a mature oocyte be prepared for fertilization is necessary that \nthe meiotic spindle keeps its integrity and its function. \nObjectives: To compare the presence and localization of the meiotic spindle and the oocyte \nnuclear maturation with the visible first polar  body of infertile patients with and without \nendometriosis. To compare ICSI outcomes betw een oocytes on telophase  I and metaphase II, \nand the ones with and without visible meiotic spindle, on those two groups.  \nMethodology: A prospective and contro lled study with infertile patients who underwent \novarian stimulation for purposes of ICSI, select ed consecutively and divided into two groups: \ncontrol (tubal and/or male f actor) and endometriosis (subdivide d in minimum and mild stage \n– I/II versus moderate and severe stage – I II/IV). The oocytes with the first polar body \nextruded (in vivo matured oocytes) were imaged using a polarization microscopy immediately \nbefore ICSI and characterized according to the presence and localization of meiotic spindle \nand its relation to the first polar body and the nuclear maturation stage (telophase I and \nmetaphase II). We have analyzed the fertiliz ation rates, clivage, number of good quality \nembryos on the second (D2) and third (D3) da y of development from oocytes on telophase I \nversus the ones on metaphase II, and metaphase II visible spindle versus the non-visible ones, \non the control groups, endometriosis, endometriosis stage I/II and endometriosis stage III/IV.    \nResults: A total of 441 oocytes were analyzed, 254 oocytes form the control group and 187 \nfrom the endometriosis one ( 115 from endometriosis stage I/II  and 72 from endometriosis \nstage III/IV). No significant diffe rences between the percentage of metaphase II with visible \nand non-visible meiotic spindle were f ound (88,6%, 91,3%, and 88,2%, in the control, \n\n \nendometriosis I/II and endometriosis III/IV  groups, respectively). Among the apparently \nmatured oocytes, we have observed a signific ant increase of oocytes  on telophase I on the \nendometriosis III/IV group ( 5,6%) when compared with the endometriosis I/II group (0%). \nWe have observed a tendency to fewer ferti lization rates from the injected oocytes on \ntelophase I when compared with the ones on metaphase II, on the control group (p=0,08), \nendometriosis (p=0,05) and endometriosis III/IV group (p=0,09). When we compared oocytes \nwith and without visible meiotic spindle,  we found no significan t difference on ICSI \noutcomes among the studied groups.  \nConclusions: We have found no significant differen ce among the studied groups regarding \nthe visualization and localization of the meiotic spindle from in vivo matured oocytes with a \nvisible first polar body. However, we have obs erved a significant increase on the number of \noocytes on telophase I from patients with m oderate and severe endometriosis, suggesting a \ndelay or an impairment in the completion of meiosis I. Since the injected oocytes on telophase \nI present a worse fertilization ra tes than the ones injected on metaphase II, this finding could \nexplain the impairment on the outcomes of ART in  infertile women with moderate and severe \nendometriosis, besides it could be used as a prognosis tool after ICSI procedures.  \n \nKEYWORDS: Endometriosis; meiotic spindle; human oocyte quality; polarization \nmicroscopy; ICSI; stimulated cycles. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLista de Figuras \n\n \nFigura 1. Esquema representativo de oócitos humanos com extrusão do primeiro \ncorpúsculo polar (CP) avaliados pela micros copia de polarização imediatamente antes da \nrealização da Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) ..................................... 47 \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLista de Tabelas \n\n \nTabela 1 -  Comparação dos parâmetros da estimulação ovariana controlada e os \nresultados de Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) entre mulheres \ninférteis do grupo controle (fatores tubários e/ou masculinos) e do grupo endometriose........ 48 \n \nTabela 2 -  Análise não invasiva do grau de maturação nuclear e presença/localização do \nfuso celular de oócitos com o primeiro cor púsculo polar visível obtidos de ciclos \nestimulados de pacientes inférteis do grupo c ontrole (fatores tubários e/ou masculinos) e \ndo grupo endometriose ............................................................................................................. 49 \n \nTabela 3 -  Taxas de fertilização, clivagem e nú mero de embriões de boa qualidade no \nsegundo e terceiro dia de desenvolvimento prove nientes de oócitos humanos injetados em \nmetáfase II ou telófase I nos grupos controle, endometriose, grupo endometriose mínima e \nleve e endometriose moderada e severa ................................................................................... 50 \n \nTabela 4 -  Taxas de fertilização, clivagem e nú mero de embriões de boa qualidade no \nsegundo e terceiro dia de desenvolvimento prove nientes de oócitos humanos injetados em \nmetáfase II com ou sem fuso celular visível pela microscopia de polarização nos grupos \ncontrole, endometriose, grupo endometriose mínima e leve e endometriose moderada e \nsevera........................................................................................................................................ 51 \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nLista de Abreviaturas \n\n \nTNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa  \nTRA – Técnicas de reprodução assistida \nFIV – Fertilização in vitro \nFMP – Fator promotor de metáfase \nMAP-K – Quinase ativadora de mitogênese \nDNA – ácido desoxirribonucléico  \nMII – Metáfase II \nHGC – Hibridização genômica comparativa \nFISH – Hibridização por fluorescência in situ \nVEGF – Fator de crescimento endotélio vascular \nICSI – Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides  \nRA – Reprodução assisistida \nIMC – Índice de massa corporal \nFSH – Hormônio Folículo Estimulante \nHCG – Gonadotrofina coriônica humana \nCP – Corpúsculo polar \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSumário \n\n \n \n \n \n \n1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................26 \n \n2. JUSTIFICATIVA ...............................................................................................................34 \n \n3. OBJETIVOS .......................................................................................................................36 \n3.1. Objetivos principais.......................................................................................................37 \n3.2. Objetivos secundários....................................................................................................3 7 \n \n4. CASUÍSTICA E MÉTODOS ............................................................................................38 \n4.1 Análise Estatística ..........................................................................................................43 \n \n5. RESULTADOS ...................................................................................................................44 \n \n6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................52 \n \n7. CONCLUSÕES...................................................................................................................58 \n \n8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................60 \n \nANEXOS .................................................................................................................................68 \n \nARTIGO CIENTÍFICO.........................................................................................................78 \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1. Introdução \n\nIntrodução \n \n27\nA endometriose é uma doença que afet a a mulher em idade reprodutiva e é \ncaracterizada por implante e crescimento de teci do endometrial (glândulas e/ou estroma) fora \nda cavidade uterina. Tem sido observada em  10% a 50% das pacientes submetidas a \nlaparotomias ginecológicas. A fisiopatologi a dessa doença ainda permanece obscura. As \nteorias mais comuns são (a) menstruação re trógrada com implantação subseqüente, (b) \nmetaplasia celômica, e (c) transporte hema togênico ou linfático de tecido endometrial \n(SANTANAM et al., 2002)  \nA maioria dos estudos sobre endometriose pélvica são baseados na teoria da \nimplantação de Sampson (SAMPSON, 1927). De acordo com essa teoria, as células \nendometriais descamadas são transportadas at é a cavidade peritonial após a menstruação \nretrógrada e as células viáveis implantam e crescem. \nEstudos mais recentes sugerem que o flui do menstrual contém fatores que induzem \nalterações na morfologia do mesotélio peritoni al (KOKS et al., 2000), p odendo criar sítios de \nadesão para as células endometriais. A adesão  dessas células parece ser estimulada pela \nindução da adesão de moléculas e seus r eceptores (SOMIGLIANA et al., 1996; BELIARD et \nal., 1997; SELAM e ARICI, 2000) e pela e xpressão exagerada de  ativadores de \nmetaloproteinases e plasminogênio da matriz ce lular, que estimulam a destruição local da \nmatriz extracelular, favorecendo o aparecime nto dos implantes de endometriose (VAN \nLANGENDONCKT et al., 2002).  \nApós a adesão, as células endometriais prol iferam e, gradualmente, invadem o tecido \nperitoneal. Alguns fatores induzem a vascular ização de implantes endometriais, permitindo o \nseu desenvolvimento futuro. Já foi sugerido qu e esse processo leva à formação de lesões \nvasculares avermelhadas com grande atividade vascular e metabólica. As citocinas e fatores \nde crescimento, como o fator de crescimento-β, interleucina-8, interleucina-1, fator de necrose \ntumoral (TNF-α), Interferon-γ, fator de crescimento endotelial (vascular), têm sido implicados \n\nIntrodução \n \n28\ncomo indutores de adesão, proliferaçã o, e neovascularização (DONNEZ et al., 1998; \nVINATIER et al., 2000). A endometriose também  parece estar associada com o aumento no \nrecrutamento e ativação de macrófa gos, que parecem ter importante papel no \ndesenvolvimento da doença (HALME et al., 1984; VAN LANGENDONCKT et al., 2002).  \nEsta afecção pode cursar com uma grande diversidade de manifestações clínicas. \nPodemos encontrar desde pacientes assintomá ticas, até quadros de dor pélvica intensa, \nsintomas decorrentes de lesões em órgãos nã o reprodutivos e infertil idade. Contudo, dentre o \nespectro de sintomas relaciona dos à endometriose, um dos mais  intrigantes é a associação da \ndoença com a infertilidade, principalmente naqu eles casos em que não há alteração mecânica \ndo trato reprodutivo. É uma questão controversa há várias décadas, mas vários dados têm \napoiado o conceito de diminui ção de fecundidade mesmo ne ste grupo de pacientes com \nendometriose (GARRIDO et al., 2000; GARRIDO et al., 2002).  \nNovas abordagens terapêuticas ao problema da infertilidade relacionada a esta afecção \ntêm surgido, destacando-se a aplicação, cada vez mais rotineira, das técnicas de reprodução \nassistida (TRA) de alta complexidade. A introdução da fertilização in vitro  (FIV) no \ntratamento da infertilidade secundária à endometriose torn ou-se uma importante ferramenta \npara o estudo dos efeitos potenciais da endo metriose em alguns estágios específicos do \nprocesso reprodutivo, incluindo a foliculog ênese, a fertilização, o desenvolvimento \nembrionário e a implantação. \nResultados conflitantes de alguns estudos tê m sugerido a ocorrência de menores taxas \nde fertilização, implantação e de gestação em  portadoras de endometriose (BARNHART et \nal., 2002; AL-FADHLI et al., 2006). Três alterações di stintas poderiam ser as responsáveis \npor estes achados: a) compro metimento da qualidade oocitár ia e, conseqüentemente, \nembrionária; b) defeitos endometriais; e c) defeitos da interação entre o endométrio e o \nembrião. Os achados conflitantes da presença de  algumas alterações no endométrio eutópico \n\nIntrodução \n \n29\nde pacientes com endometriose, poderiam exp licar, pelo menos em parte, distúrbios na \ninteração entre o embrião e o endométrio, ge rando anomalias no processo de implantação \n(GARCIA-VELASCO e ARICI, 1999). Entretan to, o achado de taxas de implantação \nsemelhantes as do grupo controle, em ciclos de  transferência de embr iões resultantes de \noócitos doados por mulheres sem esta afecção pa ra o útero de portadoras de endometriose, \ntem reforçado o papel crucial da qualidade em brionária no comprometimento da implantação \nverificado neste grupo de  pacientes (GARRIDO et al ., 2000; (PELLICER et al., 2001; \nKATSOFF et al., 2006).   \nSabemos que embriões de boa qualidade (a queles com habilidade para implantar e \ndesenvolver adequadamente), originam-se de oóc itos de boa qualidade, que, por sua vez, são \nprovenientes de folículos com um adequado meio ambiente, condicionado tanto pelo \nconteúdo do fluido folicular, como pela influê ncia das células vizinhas (CANIPARI, 2000). \nDesta forma, o comprometimento da qualidade  embrionária pode ser induzido tanto por \ndefeitos prévios à foliculogênese, como por eventos posteriores à fertilização. Alguns estudos \ntêm sugerido a potencial influência do estresse oxidativo na etiopatogênese da endometriose e \ninfertilidade associada a esta doença (JACKS ON et al., 2005; GUPTA et al., 2006), o que \npoderia, pelo menos teoricamente, promover um comprometimento da qualidade oocitária \nnestas pacientes. Foram descritas alte rações na qualidade do oócito, levando ao \ncomprometimento (BRIZEK et al., 1995) ou completo bloqueio do desenvolvimento \nembrionário (PELLICER et al., 1995), em mulheres com endometriose, quando comparadas a \ncontroles saudáveis. Corroborando estes achados, dados clínicos de programas de doação de \noócitos parecem apoiar, como descrito previament e, a teoria de que mulheres afetadas por \nendometriose produzem oócitos de qualidade comprometida (GARRIDO et al., 2000). \nA qualidade oocitária é decorrente de fatores correlacionados às competências nuclear \ne citoplasmática. A maturação citoplasmáti ca pode ser considerad a como o resultado do \n\nIntrodução \n \n30\nprocesso de desenvolvimento de uma célula incompetente para uma célula com capacidade de \nfertilização e desenvolvimento embrionário in icial (FERREIRA et al., 2009). A competência \nnuclear é caracterizada pela qualidade da  cromatina e do fuso oocitário (MATTSON e \nALBERTINI, 1990; ALBERTINI, 1992), que é esse ncialmente regulada pela atividade do \nFator Promotor de Metáfase (FPM) (HASHI MOTO e KISHIMOTO, 1988; VERDE et al., \n1990; VERDE et al., 1992) e pela Quinase At ivadora de Mitogênese (MAP-K) (SUN et al., \n1999). O FPM regula direta ou indiretamente t odos os processos ligados à entrada na \nmetáfase de células eucarióticas, assim como  a quebra do envelope nuclear (OOKATA et al., \n1992), a fosforilação da histona (COLLAS, 1999) e a polimerização de microtúbulos \n(CHARRASSE et al., 2000). A MAP-K age na regulação dos eventos do ciclo celular nos \noócitos de mamíferos que não têm relação co m o FPM, evitando microtúbulos e cromatina de \nentrar em configuração interfásica, sendo ativ ado após a quebra da vesícula germinativa \n(SUN et al., 1999). \nO fuso meiótico de oócitos humanos em metá fase II (MII) é uma estrutura temporária \ne dinâmica, composta por microtúbulos, que está  associada com o córtex oocitário e sua rede \nde microfilamentos subcorticais. (LIU et  al., 2000; WANG e KEEFE, 2002; NAVARRO et \nal., 2005). Os microtúbulos são constituídos por unidades heterodiméricas de alfa( α) e \nbeta(β)-tubulina, capazes de rápida polimerização e despolimerização, compondo 13 \nprotofilamentos arranjados lado a lado para formar uma parede cilíndrica. A tubulina \npolimerizada, contudo, está em equilíbrio com a reserva de tubulina do ooplasma. Os \nmicrotúbulos do fuso estão ligados aos ci netócoros dos cromossomos (MANDELBAUM et \nal., 2004) e, por isso, participam da segrega ção durante a meiose (WANG e KEEFE, 2002).  \nOs microfilamentos, por sua vez, controlam os movimentos do citoplasma, incluindo a \ndivisão celular (KIM et al., 1998). Desta forma, a fecundação normal e o desenvolvimento \nembrionário dependem deste controle.  \n\nIntrodução \n \n31\nUm fuso funcionante, essencial em oócitos sadios em MII, gara nte a fidelidade da \nsegregação cromossômica (VOLARCIK et al., 1998; VAN BLERKOM e DAVIS, 2001; DE \nSANTIS et al., 2005). O fuso celular oocitário é extremamente sensível à ação de diversos \nfatores, como o envelhecimento, as mudanças térmicas, o suporte insuficiente de oxigênio \ndurante o tempo de cultura e a manipulação  oocitária (HU et al ., 2001; EICHENLAUB-\nRITTER et al., 2002; MULLEN et al., 2004).   \nExistem diferentes metodologias destinadas  à avaliação da qualidade oocitária. Tal \navaliação pode ser realizada fisiologicamente, por  meio da análise de marcadores biológicos, \nou morfologicamente, de forma invasiva e não-invasiva.  \nA avaliação da qualidade oocitária por meio da análise da sua fisiologia tem sido \nrealizada apenas em estudos experimentais, geralmente utilizando modelos animais, não \napresentando aplicabilidade clínica até o momento.  \nDispomos de diferentes metodologias inva sivas destinadas à avaliação morfológica \noocitária, que, apesar de permitirem um adeq uado detalhamento das estruturas analisadas, \nrequerem a fixação e a coloração oocitárias para análise, impossibilitando a utilização clínica \ndo material estudado. O oócito pode ser avalia do, qualitativamente, por meio da análise \nimunocitoquímica por imunofluorescência, tant o da organização microtubular, como das \nconfigurações de ácido desoxirribonucléic o (DNA) (MIYARA et al., 2003), usando-se \nmicroscópios convencionais ou confocais. Também se pode realizar a microinjeção de sondas \nno interior do oócito com o obje tivo de se detectar alguns co mponentes estruturais menos \nacessíveis, como a gama-tubulina no centrômero, ou para se realizar a an álise da função de \nproteínas específicas. Na investigação de anormalidades cromossômicas numéricas, podemos \nlançar mão da hibridização genômica comparativa (HGC) ou da hibridização por \nfluorescência i n situ  (FISH) (GUTIERREZ-MATEO et al ., 2004). Associad a à análise por \nimunocitoquímica estática, a detecção da dinâmi ca citoesquelética em oócitos vivos pode ser \n\nIntrodução \n \n32\nrealizada usando-se resgate fluorescente após  fotobranqueamento (FRAP) ou citoquímica \nativada por fluorescência. \nA metodologia mais utilizada na prática clínica consiste na avaliação morfológica não-\ninvasiva, que, geralmente, utiliza como critérios  a análise de alterações na forma dos oócitos \nem MII, a coloração, a presença de granul ações e homogeneidade do citoplasma, o tamanho \ndo espaço perivitelínico (XIA, 1997), a presença  de inclusões citoplasmáticas (SERHAL et \nal., 1997) e a morfologia do prim eiro corpúsculo polar e da  zona pelúcida (XIA, 1997; \nEBNER et al., 1999; KAHRAMAN et al., 20 00; NAVARRO et al., 2009). Contudo, não há \nevidências de boa correlação entre a avaliação morfológica oocitária por meio da utilização \ndestes critérios morfológicos e a capacidade desenvolvimental oocitária.  \nAlguns autores têm utilizado a microsc opia de polarização como instrumento \ndestinado à avaliação da qualidad e oocitária, por meio da aná lise da birrefringência do fuso \nmeiótico e caracterização da zona pelúcida oocitária. A microscopia de polarização, como \ndescrito em estudos anteriores (WANG et al., 2001; WANG e KEEFE, 2002; WANG et al., \n2002; MOON et al., 2003; NAVARRO et al., 2005; PETERSEN et al., 2009)  possibilita a \nvisualização de estruturas birrefringentes em células vivas, sem a necessidade de fixação ou \ncoloração, o que permite a utilização dos oó citos analisados por esta metodologia nos \nprocedimentos de reprodução assistida. Alguns dados sugerem que análise oocitária por esta \nmetodologia poderia ser útil na triagem de possí veis anormalidades, não só do fuso celular, \ncomo, indiretamente, do alinhamento cromossômico, uma vez que, na grande maioria das \nvezes, estas duas alterações estão presen tes conjuntamente ( NAVARRO et al., 2004; \nNAVARRO et al., 2006).  \nOs estudos que procuraram avaliar de forma indireta a qua lidade oocitária em \npacientes com endometriose, utilizaram a análise de fatores parácrinos múltiplos presentes no \nfluido folicular, como interleucinas, fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator \n\nIntrodução \n \n33\nde necrose tumoral, além da avaliação de ap optose nas células da granulosa, análise do \nnúmero e atividade dos leucócitos circunjacentes,  entre outros, como preditores indiretos da \nqualidade oocitária (GARRIDO et al., 2002). C ontudo, não dispomos de estudos que tenham \navaliado a qualidade oocitária em portadoras de endometriose por meio da análise de critérios \nmorfológicos mais objetivos e, potencialmente,  mais capazes de predizer a real capacidade \ndesenvolvimental oocitária. \nMétodos não invasivos para a visualização de oócitos são muito importantes quando \nse trabalha com um material limitado e valioso  como os óvulos humanos. A microscopia de \npolarização permite a análise de estruturas birr efringentes, como o fuso celular oocitário, sem \ncomprometer a sua viabilidade e utilização clínica subsequente (LIU et al., 2000; NAVARRO \net al., 2005; PETERSEN et al., 2009). A visua lização do fuso meiótico em oócitos pode ter \nimportância clínica em predizer a fertili zação pós-ICSI (Injeção Intracitoplasmática de \nespermatozóides) e a qualidade embrioná ria (WANG e KEEFE, 2002; HYUN et al., 2007; \nPETERSEN et al., 2009). Por ou tro lado, a identificação da posição do fuso meiótico em \nrelação ao primeiro corpúsculo polar pode prev enir os embriologistas de danificarem essa \nimportante estrutura celular durante a ICSI (M OON et al., 2003). Por isso, a visualização do \nfuso meiótico pode ser usada para selecionar oóc itos que serão injetados na ICSI e apresenta \nespecial relevância clínica em países onde ex iste um limite legal do número de oócitos a \nserem fertilizados (PETERSEN et al., 2009). Entretanto, não encontramos nenhum estudo na \nliteratura avaliando de mane ira não invasiva o fuso meiótico de oócitos maturados in vivo de \npacientes inférteis com endometriose. \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2. Justificativa \n\nJustificativa \n \n35\nApesar dos esforços despendidos há décadas  no sentido de esclarecer os mecanismos \nresponsáveis pela redução da fecundidade e potencial piora dos resultados de reprodução \nassistida em portadoras de endometriose, os dados disponíveis são escassos e controversos.  \nA observação de maiores taxas de bl oqueio do desenvolvimento embrionário in vitro \nem pacientes com endometriose, associada ao fato de mulheres com essa doença, ao serem \nsubmetidas a ciclos de doação de oócitos prove nientes de mulheres sem endometriose, terem \ntaxas de implantação similares as do grupo co ntrole, sugerem, que o comprometimento da \nqualidade oocitária possa mediar a redução nas taxas de implantação e gestação nestas \npacientes. Sugere-se que o es tresse oxidativo possa estar e nvolvido na etiopatogênese da \ninfertilidade relacionada à endometriose, se ndo passível de promover anomalias meióticas \noocitárias. Hipotetizamos que anomalias na c onclusão da meiose I ou no fuso meiótico de \noócitos em metáfase II possam estar envolvida s na piora da qualidade oocitária e dos \nresultados dos procedimentos de reprodução assistida em portadoras de endometriose. \nEntretanto, não encontramos nenhum estudo na li teratura que tenha ava liado de maneira não \ninvasiva o fuso meiótico de oócitos maturados in vivo  de pacientes inférteis com \nendometriose. \nA avaliação da qualidade oocitária por meio  da análise morfológica não invasiva do \nfuso meiótico e do real estágio de maturação nuc lear pela microscopia de polarização é um \nmétodo simples, inócuo, com boa reprodutibilid ade e que poderia ajudar  a esclarecer alguns \ndos possíveis fatores responsáveis pelas menores  taxas de implantação e gestação observadas \nem pacientes com endometriose.  \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3. Objetivos \n\nObjetivos \n \n37\n3.1. Objetivos principais \nAvaliar o estágio de maturação nuclear e a presença e a localização do fuso meiótico, \nem relação ao primeiro corpúsculo polar, de oócitos obtidos em ciclos estimulados de \npacientes inférteis com inferti lidade de causa tubária e/ou ma sculina (grupo controle) e com \nendometriose, analisados imediatamente antes da realização da ICSI; \nComparar as taxas de fertilização, clivagem e número de embriões de boa qualidade \nentre os oócitos em metáfase II versus te lófase I e entre os oócitos com fuso celular \nvisualizado ou não, nos grupos controle, e ndometriose, endometriose mínima/leve e \nendometriose moderada/severa. \n \n3.2. Objetivos secundários \nComparar a resposta à estimulação ovarian a com gonadotrofinas e os resultados de \nICSI (taxas de fertilização e clivagem, formaçã o de embriões de boa qualidade e taxas de \ngestação química) entre paciente s inférteis com endometriose e in fertilidade de causa tubária \ne/ou masculina. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4. Casuística e Métodos \n\nCasuística e Métodos \n \n39\nFoi realizado um estudo pr ospectivo de Março de 2008 a Março de 2009 junto ao \nSetor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP. \nEsse estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Pesquisa e todos os casais submetidos à \nindução da ovulação para a realização de ICSI, que preencheram os critérios de inclusão e \nmanifestaram o desejo de participar do proj eto, assinaram o termo de consentimento pós-\ninformado. \nCento e três pacientes (56 pacientes infé rteis por fatores masculino e/ou tubários \ncorrespondendo ao grupo controle, e 47 pacientes com infertilidade relacionada à \nendometriose, sendo 26 pacientes com endome triose mínima e leve e 21 pacientes com \nendometriose moderada e severa) preencheram os critérios de inclusão no período do estudo. \nForam incluídas pacientes com idade menor ou igual a 38 anos, FSH basal (hormônio folículo \nestimulante)  menor que 10\n mIU/mL (ELGINDY et al., 2008) e IMC (índice de massa corporal) \nmenor que 30 Kg/m². O critério de inclus ão das pacientes com endometriose era a \nconfirmação do diagnóstico pela vídeolaparoscopi a, de acordo com os critérios da Sociedade \nAmericana de Medicina Reprodut iva (Revised American Societ y for Reproductive Medicine \nclassification of endometrio sis: 1996, 1997), que classifica a doença em quatro estágios: \nmínima (estádio I), leve (estádio II), moderada (estádio III) e grave (estádio IV).  Pacientes do \ngrupo controle não apresentaram doenças pé lvicas associadas à infertilidade quando \nsubmetidas à vídeolaparoscopia. \nForam excluídas pacientes com diabetes mellitus ou quaisquer outras endocrinopatias, \ndoença cardiovascular, lúpus eritematoso sistêmico e outras doenças reumatológicas, infecção \npelo vírus HIV, qualquer infecção ativa, ta bagismo ou o uso de medicações hormonais e \nantiinflamatórias hormonais e não-hormonais  nos últimos dois meses, previamente à \nprogramação para o procedimento de reprodução assistida. \n\nCasuística e Métodos \n \n40\nO bloqueio hipofisário foi iniciado us ando agonista do hormônio liberador de \ngonadotrofinas (GnRHa) 10 dias antes do dia de r ealização da ultrason ografia transvaginal \nbasal (protocolo longo),  por meio da  administração de acetato de leuprolide (Lupron®, \nAbott, Brasil). As pacientes receberam 100 a 300 UI por dia de FSH recombinante (FSHr) \n(Gonal-F®, Serono, Brasil; Puregon®, Organon, Br asil), nos primeiros 6 dias da indução. \nQuando pelo menos dois folículos atingiram 18 mm de diâmetro médio, foi administrada \ngonadotrofina coriônica humana (hCG) recombin ante (Ovidrel®, Serono, Brasil). A captação \ndos oócitos foi realizada 34 a 36h após a administração do hCG recombinante.  \nTodo material aspirado durante captação dos oó citos foi analisado para a identificação \ne o isolamento dos complexos oócito-cumulus. Depois de identificados, os complexos oócito-\ncumulus foram isolados do fluido folicular e colocados em placa separada. Os complexos \noócito-cumulus foram lavados cuidadosamente  em meio de cultura Human Tubal Fluid-\nHEPES (HTF, Irvine Scientific), para a remoção de sangue e debris. A seguir foram \ncolocados em placas NUNC (Multidish 4 wells Nuclon, Delta SI), preenchidas com o  meio \nde cultura HTF e cobertas com óleo mineral, e levados à incubadora em mistura gasosa de \nCO\n2 a 5%, sob condições ideais de temperatura (37ºC) e umidade (95%) por um período de 2 \na 3 horas. Após este período, para realizarmos a remoção do cumulus oophorus e da corona \nradiata, os complexos oócito-cumulus foram co locados em micro-gotas de 25µL de \nhialuronidase (H4272 tipo IV-S, Sigma), na di luição de 80 UI/mL de HTF/HEPES (Irvine \nScientific), por no máximo 30 segundos e, en tão, lavados 2 ou 3 vezes com o meio HTF \nmodificado (HTF/HEPES, Irvine Scientific) su plementado com Soro Sintético Substituto \n(SSS) a 10%. A remoção mecânica dos restos celu lares foi feita com o auxílio de uma pipeta \nde desnudação (stripper pipette 130 µm denuding pipette, Cook, Melbourne, Australia). \nApós a realização do desnudamento oocitário (remoção do cumulus oophorus ), \nrealizamos a identificação do grau de ma turidade dos oócitos, sob visualização ao \n\nCasuística e Métodos \n \n41\nmicroscópio de luz.  Os oócitos imaturos (em es tágio de vesícula germinativa ou metáfase I) \nforam descartados. Os oócitos maduros (carac terizados morfologicamente pela presença de \num corpúsculo polar extruso) foram incubados  em gotas de 25 µL de HTF + SSS 10% por \nmais uma hora (após o desnudamento oocitário) para, então, serem avaliados pelo OCTAX \nICSI GuardTM System (Medical Technology Vertriebs- GmbH, Altdorf, Germany) e injetados \npor meio da realização da ICSI.  \nOs fusos celulares dos oócitos com extrusão  do primeiro corpúsculo polar foram \navaliados usando um microscópio inverti do, equipado com uma vídeo câmera e com o \nhardware do microscópio de polarização, o qual cons iste de cristais elétricos e de um \ncontrolador eletro-óptico (OCTAX ICSI Guard TM System, Medical Technology Vertriebs-\nGmbH, Altdorf, Germany). Os grupos de cristais  elétricos são controlados pelo computador \natravés do software OCTAX EyeWare™  (Universal Imaging Corp., Boston, MA). Os oócitos \nforam avaliados a 37 °C, em gotas de 5 µl de HTF/Heppe s + SSS 10%, em placas de Petri \nrevestidas com vidro na parte inferior ( MatTek Corp., Ashland , MA), colocadas sobre uma \nplaca aquecida a 37°C.  \nPara controlar os vieses metodológicos relativos à não visualização do fuso secundária \nà realização do desnudamento celular e ao en velhecimento oocitário, o desnudamento foi \nrealizado 2 a 3 horas após a captação oocitária e, após o mesmo, os oócitos foram recolocados \nnas placas de cultivo previamente equilibradas,  na incubadora, por mais uma hora, para \nsomente depois serem submetidos ao imageame nto e à ICSI. Um número máximo de sete \noócitos era analisado em cada placa, sendo o te mpo total, relativo ao necessário para a \nrealização da análise do fuso celular pela micros copia de polarização mais a ICSI, foi inferior \nou igual a 7 minutos. \nOs oócitos com primeiro corpúsculo polar  visível (CP) foram analisados pela \nmicroscopia de polarização e caracterizados qu anto ao estágio real de maturação nuclear \n\nCasuística e Métodos \n \n42\n(telófase I ou metáfase II), presença ou não de fuso celular visível e localização do fuso \ncelular dos oócitos em metáfase  II. Foram considerados em telófase I, os oócitos que \napresentavam fuso celular alongado, perpendicular à membrana oocitária, estendendo-se até o \nprimeiro CP. Os fusos celulares em metáfase II foram caracterizados pela presença de fibras \nbirrefringentes distribuídas radialmente, com a forma de barril e orientadas paralelamente à \nmembrana cortical. Como os cromossomos são minimamente birrefringentes, não são \nadequadamente analisáveis por meio desta metodologia. A localização do fuso celular baseou-\nse no ângulo formado entre esta estrutura e o primeiro CP, sendo os oócitos divididos em seis \ngrupos: com fusos formando ângulos de 0 a 30 º, 30 a 60 º, 60 a 90 º, 90 a 120 º, 120 a 150 º e \n150 a 180 º em relação ao primeiro CP.  \nCerca de 18 a 19 horas após a ICSI foi avaliada a fertilização, caracterizada pela \npresença de 2 pró-nucleos e 2 corpúsculos polares (a taxa de fertilização, a ser calculada nos 2 \ngrupos avaliados, corresponde ao número de oócito s fertilizados, dividi dos pelo número de \noócitos injetados X 100). Cerca de 24 horas após  a ICSI foi realizad a a caracterização da \npresença de clivagem embrioná ria (a taxa de clivagem, calcu lada nos 2 grupos  avaliados, \ncorresponde ao número de embriões que sofrem clivagem, ou seja, divi são celular, divididos \npelo número total de oócitos fertilizados X 100).   \nCerca de 44 a 48 horas após  a ICSI (D2) foi realizad a a análise da qualidade \nembrionária (quanto ao número e simetria de blastômeros, percentagem de fragmentação e \npresença ou não de multinucleação). Foram considerados como embriões de boa qualidade no \nsegundo dia de desenvolvimento (D2) os que apresentaram 4 blastômeros, simétricos, sem \nfragmentação e sem multinucleação. Cerca de 64 a 72 horas após a ICSI (D3) foi realizada \nnovamente a análise da qualidade, sendo consider ados de boa qualidade os embriões com 8 \nblastômeros simétricos, sem fragmentação e sem multinucleação.  \n\nCasuística e Métodos \n \n43\nRealizou-se a transferência embrioná ria em D2 ou D3, de acordo com a \nindividualização de cada caso. Quatorze dias a pós a transferência embrionária realizou-se a \nanálise do β-hCG sanguíneo, sendo considerada como gravidez química a presença de β-hCG \npositivo (maior ou igual a 25 UI/ml). A taxa de  gravidez química foi calculada dividindo-se o \nnúmero de pacientes com β-hCG positivo após 14 dias da transferência embrionária pelo \nnúmero de ciclos com transferência, multiplicado por 100. \n \n4.1 Análise Estatística \nInicialmente os grupos endometriose e cont role foram analisados comparativamente \nquanto às percentagens de oócitos em telófase I, em metáfase II com fuso celular visível e não \nvisível e de oócitos com fuso celular localiz ado nas diferentes posições, as taxas de \nfertilização, de clivagem e a percentagem de  ciclos com pelo menos um embrião de boa \nqualidade através do teste exato de Fisher. Posteriormente os subgrupos da endometriose \n(estádios I/II e III/IV) foram comparados para as variáveis já descrita s pelo teste exato de \nFisher. Para análise comparativa das variáveis quantitativas, foram utilizados os testes t não-\npareado e o teste de Mann-Whitney. Em todas as análises foi considerado o nível de \nsignificância de 5% (p<0,05). \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5. Resultados \n\nResultados \n \n45\nNão observamos diferença significativa entr e os três grupos avaliados (controle, \nendometriose I/II e endometriose  III/IV) com relação à duração da estimulação ovariana, o \nnúmero de folículos entre 14 e 17 mm, a es pessura endometrial, o número de oócitos \ncaptados, o número de oócitos maduros, a taxa de  clivagem e a percentagem de ciclos com \npelo menos um embrião de boa qualidade tr ansferido em D2. Entretanto, no grupo de \npacientes com endometriose III/IV observamo s um aumento significativo da dose total de \nFSH utilizada e uma redução significativa do número de folículos ≥ 18 mm e do número de \noócitos fertilizados, quando comparado aos grupos controle e endometriose I/II. (Tabela 1). \nForam analisados, pela microscopia de  polarização, 441 oócito s o com primeiro \ncorpúsculo polar visível, sendo 254 do grupo controle, 115 do grupo endometriose I/II e 72 do \ngrupo endometriose III/IV. Entre os oócitos aparentemente maduros, observamos um aumento \nsignificativo de oócitos em telófase I (fi gura 1A) no grupo endometriose III/IV (5,6% de \noócitos em telófase I) quando comparado ao grupo endometriose I/II (0%). Não observamos \ndiferença significativa entre a percentagem de oócitos em metáfase II com fuso celular visível \n(figura 1B) e não visível (figura 1C) en tre os grupos avaliados (88,6%, 91,3%, 88,3%, \nrespectivamente, nos grupos controle, endometriose  I/II e endometriose III/IV). Quase todos \nos oócitos apresentaram o fuso celular locali zado entre 0 – 90° em relação ao primeiro \ncorpúsculo polar. Não observamos diferença significativa entre a percentagem de oócitos com \nfuso celular nas localizações entre 0° – 30° (f igura 1D), 30° – 60° (figura 1E),  60° – 90° \n(figura 1F) entre os três grupos analisados. Ressalta-se que a percentagem de oócitos com \nfusos celulares localizados entre 60 e 90º em relação ao primeiro CP foi pequena nos três \ngrupos analisados (3,2%, 1,9% e 5%, respectivamente nos grupos controle, endometriose I/II \ne endometriose III/IV). (Tabela 2). \nQuando analisamos o grau de maturação nuc lear (metáfase II vers us telófase I) e \ncomparamos com os resultados de reprodu ção assistida, observamos uma diminuição \n\nResultados \n \n46\nsignificativa das taxas de fertilização (p= 0,01) considerando o tota l de oócitos (grupos \ncontrole e endometriose analisados conjuntam ente) injetados em telófase I (13 oócitos \ninjetados, sendo 6 fertilizados; taxa de fertil ização de 46,1%) quando comparados ao total de \noócitos injetados em metáfase II (428 oócitos injetados, sendo 338 fertilizados; taxa de \nfertilização de 79%). Ao analisarmos os grupos individualmente, houve uma tendência a \nmanter essa diminuição das taxas de fertiliza ção nos grupos controle (p=0,08), endometriose \n(p=0,05) e endometriose III/I V (p=0,09) dos oócitos injetados em telófase I quando \ncomparados aos em metáfase II. Não obtivemos  oócitos em telófase I no grupo endometriose \nI/II. Não encontramos diferença significativa entre as taxas de clivagem nos diferentes grupos. \nNenhum oócito fertilizado, após injeção em teló fase I, formou embrião de boa qualidade em \nD2 ou D3. (Tabela 3). \nQuando comparamos os resultados de repr odução assistida en tre os oócitos em \nmetáfase II com ou sem fuso celular visível, nã o observamos diferença significativa nas taxas \nde fertilização, clivagem e no número de embriões de boa qualidade formados em D2 entre os \ngrupos controle, endometriose I/II e endomet riose III/IV. Nas pacientes portadoras de \nendometriose, os oócitos sem fuso  celular visível, que fertilizaram e clivaram, não formaram \nembriões de boa qualidade em D3. (tabela 4). \n\nResultados \n \n47\n \n \n \n \n \nFigura 1. Oócitos humanos com extrusão do primei ro corpúsculo polar (CP) avaliados pela \nmicroscopia de polarização imediatamente antes da realização da Inje ção Intracitoplasmática \nde espermatozóides (ICSI). (A) Fuso celular em  telófase I. (B) Fuso celular visível em \nmetáfase II. (C) Fuso celular não visível em metáfase II. (D) Fuso celular formando ângulo de \n0 a 30 º em relação ao primeiro CP. (E) Fuso celular formando ângulo de 30 a 60 º em relação \nao primeiro CP. (F) Fuso celular formando ângulo de 60 a 90 º em relação ao primeiro CP.  \n \n \n\nResultados \n \n48\n \n \nTabela 1 - Comparação dos parâmetros da estimul ação ovariana controlada e os resultados de \nInjeção intracitoplasmática de espermatozóide s (ICSI) entre mulheres inférteis do grupo \ncontrole (fatores tubários e/ou masculinos) e do grupo endometriose. \n Endometriose Variáveis Controle \n    I – II                   III – IV \np \n \n \n32,8 ± 3,8 \n \nIdade (anos) \n \nNúmero de pacientes  \n \n52 \n \n33 ± 3 \n \n23 \n \n33,5 ± 3,6 \n \n19 \n \n0,73 \n \n- \nNúmero de ciclos iniciados 60 26 21 - \nDose FSH total (UI) 1973 ± 654,6 1709 ± 554,9 2263 ± 671,7 0,02 \nDuração da estimulação ovariana (dias) 9,1 ± 1,6 8,7 ± 1,3  9,3 ± 1,6 0,36 \nFolículos entre 14 – 17 mm 4,6 ± 2,4 4,2 ± 2,7 3,6 ± 3,2  0,19 \nFolículos ≥ 18 mm 4 ± 2,8 3,2 ± 1,8 2 ± 2,2 0,02 \nEndométrio (mm) 11 ± 2,4 10,1 ± 1,5 10,5 ± 2 0,38 \nNúmero de ciclos com captação 60  26 21 - \nNúmero de oócitos captados  6,8 ± 3,9 6,9 ± 3,8 5 ± 3,6 0,38 \nNúmero de oócitos maduros 5,2 ± 3,4 5 ± 3,1 3,4 ± 2,9 0,23 \nNúmero de oócitos fertilizados 3,4 ± 1,8 3,6 ± 1,6 2,3 ± 1,6 0,03 \nTaxa de Fertilização (%) 80 (203/2 54) 80 (92/115) 68 (49/72) 0,08 \nTaxa de Clivagem (%) 84,2 (171/203) 87 (80/92) 90 (44/49) 0,56 \nNúmero de ciclos com transferência 57 25 19 - \n% de ciclos com pelo menos um embrião \nde boa qualidade transferido em D2 \n \n21 (12/57) 40 (10/25) 37 (7/19) 0,51 \nTaxa de Gravidez Química (%) 35 (20/57) 48 (12/25) 37 (7/19) 0,15 \nMédia ± desvio padrão. Diferença significativa: p < 0,05. \nOócitos maduros: oócitos com primeiro corpúsculo polar visível; \nTaxa de Fertilização: número de oócitos fertilizados/número de oócitos injetados x 100; \nTaxa de Clivagem: número de oócitos clivados/número de oócitos fertilizados x 100 \n % de ciclos com pelo menos um embrião de boa qualidade transferido em D2: número de ciclos com pelo \nmenos um embrião com 4 células, simétricas e sem fragmentação em D2/número de ciclos com transferência \nx 100 \n\nResultados \n \n49\n \n \n \n \nTabela 2 - Análise não invasiva do grau de ma turação nuclear e presen ça/localização do fuso \ncelular de oócitos com o primeiro corpúsculo po lar visível obtidos de ciclos estimulados de \npacientes inférteis do grupo controle (fatores tubários  e/ou masculinos) e do grupo \nendometriose. \nEndometriose  Variáveis Controle \n I – II                   III – IV  \n \nMaturação Nuclear \n  - Telófase I (%) \n \n \n3,5 (9/254) \n \n \n0 \n \n \n5,6 (4/72)* \n \n  - Metáfase II (%) \n \n  96,5 (245/254) 100 (115/115) 94,4 (68/72)  \nFuso visualização \n  - Não visível (%)    \n \n11,4 (28/245) \n \n8,7 (10/115) \n \n 11,8 (8/68) \n \n  - Visível (%)  88,6 (217/245) 91,3 (105/115) 88,2 (60/68)  \n \nFuso Localização \n  -   0° – 30° (%) \n  - 30° – 60° (%) \n  - 60° – 90°(%) \n  - 90° – 120°(%)            \n \n \n85,7 (186/217) \n11,1 (24/217) \n3,2 (7/217) \n0 \n \n \n80 (84/105) \n18,1 (19/105) \n1,9 (2/105) \n0 \n \n \n80 (48/60) \n13,3 (8/60) \n5 (3/60) \n1,7 (1/60) \n \n \n*P=0,02. Diferença significativa: p < 0,05. \n \n \n\nResultados \n \n50\n \nTabela 3 - Taxas de fertilização, clivagem e número de embriões de boa qualidade no segundo \ne terceiro dia de desenvolvimento provenientes de oócitos humanos injetados em metáfase II \nou telófase I nos grupos controle, endometrios e, grupo endometriose mínima e leve e \nendometriose moderada e severa. \nGrupo Variável Maturação nuclear p \n  Metáfase II Telófase I  \n  % (n/N) % (n/N)  \n \nControle Taxa de fertilização 80,8 (198/245) 55,6 (05/09) 0,08 \n Taxa de Clivagem 84,3 (167/198) 80 (04/05) 0,58 \n Embrião 4.1.0 12,6 (21/167) 0 - \n Embrião 8.1.0 11,5 (12/104) 0 - \n \nEndometriose Taxa de fertilização  76,5 (140/183) 25 (01/04) 0,05 \n Taxa de Clivagem 87,9 (123/140) 100 (01/01) 1 \n Embrião 4.1.0 17 (21/123) 0 - \n Embrião 8.1.0 18,5 (12/65) 0 - \n \nEndometriose I – II Taxa de fertilização 80 (92/115) 0 - \n Taxa de Clivagem 87 (80/92) 0 - \n Embrião 4.1.0 17,5 (14/80) 0 - \n Embrião 8.1.0 19 (08/42) 0 - \n     \nEndometriose III – IV Taxa de fertilização 70,6 (48/68) 25 (01/04) 0,09 \n Taxa de Clivagem 89,6 (43/48) 100 (01/01) 1 \n Embrião 4.1.0 16,3 (07/43) 0 0 \n Embrião 8.1.0 17,4 (04/23) 0 0 \nDiferença significativa: p < 0,05.  \nTaxa de Fertilização: número de oócitos fertilizados (n)/número de oócitos injetados (N) x 100; \nTaxa de Clivagem: número de oócitos clivados (n)/número de oócitos fertilizados (N) x 100 \nEmbrião 4.1.0: número de embriões com 4 células, simétricas e sem fragmentação em D2 (n)/número \nde embriões formados em D2 (N) x 100  \nEmbrião 8.1.0: número de embriões com 8 células, simétricas e sem fragmentação em D3 (n)/número \nde embriões formados em D3 (N) x 100 \n\nResultados \n \n51\nTabela 4 - Taxas de fertilização, clivagem e número de embriões de boa qualidade no segundo \ne terceiro dia de desenvolvimento provenientes de oócitos humanos injetados em metáfase II \ncom ou sem fuso celular visível pela micr oscopia de polarização nos grupos controle, \nendometriose, grupo endometriose mínima e leve e endometriose moderada e severa. \nGrupo Variável Fuso p \n  Visível Não visível  \n  % (n/N) % (n/N)  \n \nControle Taxa de fertilização 82 (178/217) 71,4 (20/28) 0,2 \n Taxa de Clivagem 83,1 (148/178) 95 (19/20) 0,33 \n Embrião 4.1.0 12,2 (18/148) 15,8 (03/19) 0,7 \n Embrião 8.1.0 11,5 (11/96) 12,5 (01/08) 1 \n \nEndometriose Taxa de fertilização  77,6 (128/165) 66,7 (12/18) 0,38 \n Taxa de Clivagem 86,7 (111/128) 100 (12/12) 0,36 \n Embrião 4.1.0 15,3 (17/111) 33,3 (04/12) 0,12 \n Embrião 8.1.0 18,5 (12/65) 0 - \n \nEndometriose I – II Taxa de fertili zação 81,9 (86/105) 60 (06/10) 0,11 \n Taxa de Clivagem 86 (74/86) 100 (06/06) 1 \n Embrião 4.1.0 16,2 (12/74) 33,3 (02/06) 0,28 \n Embrião 8.1.0 19 (08/42) 0 - \n     \nEndometriose III – IV Taxa de fertilização 70 (42/60) 75 (06/08) 1 \n Taxa de Clivagem 88,1 (37/42) 100 (06/06) 1 \n Embrião 4.1.0 13,5 (05/37) 33,3 (02/06) 0,24 \n Embrião 8.1.0 17,4 (04/23) 0 - \nDiferença significativa: p < 0,05.\n  \nTaxa de Fertilização: número de oócitos fertilizados (n)/número de oócitos injetados (N) x 100; \nTaxa de Clivagem: número de oócitos clivados (n)/número de oócitos fertilizados (N) x 100 \nEmbrião 4.1.0: número de embriões com 4 células, simétricas e sem fragmentação em D2 (n)/número \nde embriões formados em D2 (N) x 100  \nEmbrião 8.1.0: número de embriões com 8 células, simétricas e sem fragmentação em D3 (n)/número \nde embriões formados em D3 (N) x 100\n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6. Discussão \n\nDiscussão \n \n53\nEncontramos resultados controversos acerca dos resultados da reprodução assistida em \npacientes com endometriose, o que vem sendo foco de diversos estudos e hipóteses (AZEM et \nal., 1999; GARCIA-VELASCO e ARICI, 1999; GA RRIDO et al., 2000; AL-FADHLI et al., \n2006). Estas discrepâncias parecem ser multifatorias, uma vez que esses resultados podem ser \nafetados por diferentes variáv eis, como o protocolo de es timulação ovariana utilizado, os \ncritérios de seleção das pacientes avaliadas nos diferentes estudos, os procedimentos \nlaboratoriais efetuados, a técnica de transferência embrionária usada, entre outros fatores. \nDados de uma meta-análise de oito est udos relevantes (BARNHART et al., 2002) \nsugeriram que a implantação está comprometida de forma significativa em pacientes com \nendometriose e que a qualidade embrionária é ru im, possivelmente refletindo a má qualidade \noocitária. A qualidade oocitária, por sua vez, depende da ade quada aquisição da maturação \ncitoplasmática e nuclear, sendo a última dependente da presença de um fuso celular normal. \nO fuso meiótico, estrutura fundamental no processo de desenvolvimento oocitário, \nprecisa manter a sua integridade e funciona bilidade para que o oócito maduro esteja \npreparado para a fertilização. Esta estrutura é extremamente sensível à ação de diversos \nfatores, entre os quais podemos citar o estr esse oxidativo, passível de promover anomalias \nmeióticas, instabilidade cromossômica, i ndução da apoptose e comprometimento do \ndesenvolvimento embrionário pré-implantaçã o. (LIU et al., 2003; NAVARRO et al., 2004; \nNAVARRO et al., 2006). \nAlguns autores (MANSOUR et al., 2007) demo nstraram danos significativos ao DNA \ne aumento de anomalias cromossômicas em oócitos maduros de camundongos, quando \nincubados com o fluido peritone al de pacientes com endometri ose. Esses resultados foram \nevitados quando houve suplementação do antioxida nte L-carnitina nessa cultura; sugerindo \nque o estresse oxidativo esteja envolvido no comprometimento da qualidade oocitária em \nportadoras de endometriose (MANSOUR et al., 2009). Outros estudos avaliando os potenciais \n\nDiscussão \n \n54\nmecanismos envolvidos na gênese das alterações  do fuso celular, rela cionadas ao estresse \noxidativo, evidenciaram que o mesmo pode dani ficar diversas proteí nas intracelulares \n(STADTMAN, 1992; BERLETT e STADTMAN, 1997) , algumas das quais são importantes \npara a organização do fuso celular (ANTON IO et al., 2000; FUNABIKI e MURRAY, 2000; \nABRIEU et al., 2001) e, ao mesmo tempo ou independentemente, lesar o DNA e induzir o \ninadequado alinhamento cromossômico (B ECKMAN e AMES, 1998; LIMOLI et al., 1998) \nproduzindo, desta forma, anormalidades no ciclo celular.  \nDiferentes metodologias podem ser utilizad as com a finalidade de avaliar o fuso \ncelular oocitário, entre as quais citamos a microscopia de polarização, que permite a \nobservação e caracterização de estruturas birrefr ingentes em células vivas, sem a necessidade \nde fixação (PETERSEN et al., 2009). Trata- se de metodologia inócua, que permite a \nutilização dos oócitos avaliados para a r ealização de ICSI, sem comprometimento do \ndesenvolvimento embrionário subseqüente.  \nObservou-se neste estudo que o fuso meió tico foi visualizado em 89,3% dos oócitos \nexaminados, estando de acordo com dados na literatura onde a visualização do fuso celular \npode variar entre 62,8 a 91% (RIENZI et al., 2003; MADASCHI et  al., 2008). A alta \npercentagem de oócitos com fuso celular visí vel evidenciada neste estudo, nos três grupos \nanalisados, pode ser atribuída ao rigoroso c ontrole metodológico, incluindo a incubação dos \noócitos por uma hora após desnudamento e o ad equado controle das condições ambientais \n(manutenção da temperatura e pH ideais e limitado tempo de exposição à luz durante a análise \ne fora da incubadora) (ROBERTS et al., 2002). \nCom relação à localização do fuso celular , não observamos dife rença significativa \nentre os grupos em relação à localização do fuso  celular oocitário. Oitenta e três por cento do \ntotal de oócitos com fusos celulares visíveis estavam localizados entre 0° – 30° em relação ao \ncorpúsculo polar, sendo pequena  a percentagem de oócitos com fusos celulares localizados \n\nDiscussão \n \n55\nentre 60 e 90º em relação ao primeiro CP nos três grupos analisados. Estudos na literatura, \nque avaliaram a relação do ângulo formado entre o corpúsculo polar e o fuso celular e as \nrespectivas taxas de fertili zação, evidenciaram que quando esse ângulo é menor do que \n90°não há comprometimento desta variável (R IENZI et al., 2003; FANG et al., 2007). Desta \nforma, sugerimos que a localização do fuso cel ular oocitário em posições anômalas não seria \numa variável responsável pela piora da qualid ade oocitária em portadoras de infertilidade \nrelacionada à endometriose. \nDados de uma meta-análise (PETERSE N et al., 2009) evidenciaram aumento \nsignificativo na taxa de fertilização, clivagem e de embriões de boa qualidade no terceiro dia \nde desenvolvimento de oócitos com fuso celular visível quando comparados àqueles sem fuso \ncelular visível. Esses resultados sugerem que a presença do fuso celular  poderia ser um fator \nde predição para se obter maiores taxas de fertilização, clivagem e de embriões de boa \nqualidade em D3. Nossos resultados foram di scordantes com a literatura, pois não \nobservamos diferença significativa entre as taxas de fertilização e declivagem quando \navaliamos a presença ou não de fuso celular  visível nos grupos es tudados. Todavia,  \nressaltamos que, nas pacientes portadoras de endometriose, nenhum dos oócitos sem fuso \ncelular visível que fertilizou e clivou formou embriões de boa qualidad e no terceiro dia de \ndesenvolvimento, sugerindo uma associação positiva entre a ausência de fuso celular visível \nem oócitos de mulheres inférteis com endometr iose e a não formação de embriões de boa \nqualidade em D3. \nOócitos em telófase I ainda não finali zaram a meiose I mas podem apresentar, à \nmicroscopia óptica, características morfológi cas semelhantes a oócitos que completaram a \nmeiose I e estão em metáfase II (HYUN et al., 2007). No presente estudo observou-se um \naumento significativo de oócitos maturados in vivo, que, apesar de aparentemente maduros, \nestavam em telófase I, nas pacientes com infertilidade relacionada à endometriose moderada e \n\nDiscussão \n \n56\nsevera. Esses dados corroboram achados recen tes em que se evidenciou uma tendência a \nmaior proporção de telófase I em oócitos maturados in vitro obtidos de ciclos estimulados de \npacientes com endometriose, quando compara dos ao grupo controle (BARCELOS et al., \n2009). O presente achado agrega a informação de que este potencial atraso ou \ncomprometimento da meiose I ocorra não apenas nos oócitos maturados in vitro,  como \ntambém naqueles maturados  in vivo  nas portadoras de infe rtilidade relacionada à \nendometriose. Convém ressaltar que no presente estudo este achado foi observado apenas no \nsubgrupo de pacientes com endome triose III/IV, sugerindo que a severidade da doença possa \nestar associada ao comprometimento da conclusã o da meiose I e, conseqüentemente, à piora \nda qualidade oocitária. \nAs anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para  a falência do \ndesenvolvimento celular por meio de diferentes  vias, que vão desde a inabilidade do oócito \nem completar o processo de maturação, torn ando-se incapaz de se r fertilizado, até a \nocorrência de erros variáveis no processo de  maturação meiótica que não impossibilitam a \nfertilização, mas, contudo, podem comprometer o desenvolvimento embrionário pré e/ou pós-\nimplantação, bem como a viabilidade futura do concepto (PAVLOK et al., 1992; \nLONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001). Assim, qualquer alteração no complemento \ncromossômico, que possa ser originada por um a alteração do fuso meiótico, poderia conduzir \na um estado de aneuploidia por não-disjunçã o, junção desbalanceada ou disjunção prematura \ndas cromátides e perda de cromossomos,  (VAN BLERKOM e HENRY, 1992; BATTAGLIA \net al., 1996; MANDELBAUM et al., 2004) comprometendo o desenvolvimento embrionário. \nAlguns autores (HYUN et al., 2007) demonstraram que oócitos maturados in vitro  \nque, apesar de aparentemente maduros (com prim eiro CP visível), estavam em telófase I, \nsegundo análise por microscopia de polarizaçã o, apresentaram taxa de fertilização \nsignificativamente menor do que os oócitos que concluíram a meiose I (15,8% x 80%, \n\nDiscussão \n \n57\nrespectivamente). No nosso estudo, também  observamos uma diminuição significativa das \ntaxas de fertilização quando analis amos o total de oócitos maturados in vivo que foram  \ninjetados em telófase I quando comparados ao  total de oócitos injetados em metáfase II \n(46,1% x 79%, respectivamente) e uma tendê ncia a diminuição dessas taxas nos grupos \ncontrole e endometriose III/IV, quando estudado s individualmente. A ampliação da presente \ncasuística poderá permi tir a aquisição de significância es tatística nestes grupos. Além disso, \nos oócitos em telófase I que clivaram não form aram embriões de boa qualidade, tanto em D2 \nquanto em D3 em ambos os grupos. Com base nos dados analisados sugere-se que a utilização \nde oócitos com o primeiro CP visualizado, em telófase I (ou seja, que, apesar de \naparentemente maduros, não concluíram a me iose I) em procedimentos de reprodução \nassistida (ICSI) esteja  associada a piores prognósticos re lativos ao sucesso gestacional \nsubseqüente, relativos tanto a menores taxas de fertilização, como formação de embriões de \nboa qualidade.  \nNas pacientes inférteis com endometriose III/IV o aumento significativo de oócitos em \ntelófase I poderia contribuir para  o número significativamente menor de oócitos fertilizados \nneste grupo, observado na casuística analisada, corroborando estudos que evidenciaram piores \ntaxas de fertilização em portadoras de infertil idade relacionada à endometriose (AZEM et al., \n1999; AL-FADHLI et al., 2006). É possível que a an álise do estágio de maturação nuclear \noocitária possa ser utilizada como fator de pred ição das taxas de fertilização neste grupo de \npacientes, o que precisa ser analisado em est udos com maiores casuísticas. É possível que se \npostergarmos a inseminação dos oócitos em te lófase I, especialmente nas portadoras de \nendometriose moderada e severa, possamos ter um melhor resultado dos procedimentos de \nreprodução assistida, o que precisa ser av aliado por meio de es tudo com metodologias \npertinentes. \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n7. Conclusões \n\nConclusões \n \n59\nNão observamos diferença significativa en tre os grupos analisados quanto à \nvisualização e localização do fu so celular em oócitos maturados in vivo com o primeiro CP \nvisível. Todavia, observamos um aumento signi ficativo de oócitos em telófase I nos oócitos \nde portadoras de endometriose modera da e severa, sugerindo um retardo ou \ncomprometimento na conclusão da meiose I. Considerando que os oócitos injetados em \ntelófase I apresentam piores taxas de fertiliz ação do que os injetados em metáfase II, este \nachado poderia justificar o comprometimento dos resultados de reprodução assistida em \nmulheres inférteis com endometriose moderada  e severa. A análise não invasiva do fuso \ncelular oocitário, por meio da microscopia de  polarização, pode ser utilizada como fator de \npredição das taxas de fertilização e qualidad e oocitária pós-ICSI neste grupo de pacientes, o \nque precisará ser mais bem analisado ampliando-se a presente casuística.  \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n8. Referências Bibliográficas \n\nReferências Bibliográficas \n \n61\nABRIEU, A. et al. Mps1 is a kinetochore-associated kinase essential for the vertebrate mitotic \ncheckpoint. Cell, v.106, n.1, Jul 13, p.83-93. 2001. \nAL-FADHLI, R. et al. Effects of different stag es of endometriosis on th e outcome of in vitro \nfertilization. J Obstet Gynaecol Can, v.28, n.10, Oct, p.888-91. 2006. \nALBERTINI, D.F. Cytoplasmic microtubular dynamics and chromatin organization during \nmammalian oogenesis and oocyte maturation. Mutat Res, v.296, n.1-2, Dec, p.57-68. 1992. \nANTONIO, C. et al. Xkid, a chromokinesin required for chromosome alignment on the \nmetaphase plate. Cell, v.102, n.4, Aug 18, p.425-35. 2000. \nARMSTRONG, D.T. Effects of maternal age on oocyte developmental competence. \nTheriogenology, v.55, n.6, Apr 1, p.1303-22. 2001. \nAZEM, F. et al. Patients with stages III and IV endometriosis have a poorer outcome of in \nvitro fertilization-embryo transfer th an patients with tubal infertility. Fertil Steril, v.72, n.6, \nDec, p.1107-9. 1999. \nBARCELOS, I.D. et al. Comparative analysis of  the spindle and chromosome configurations \nof in vitro-matured oocytes from patients with  endometriosis and from control subjects: a \npilot study. Fertil Steril, v.92, n.5, Nov, p.1749-52. 2009. \nBARNHART, K. et al. Effect of endometriosis on in vitro fertilization. Fertil Steril, v.77, n.6, \nJun, p.1148-55. 2002. \nBATTAGLIA, D.E. et al. Influence of maternal  age on meiotic spindle assembly in oocytes \nfrom naturally cycling women. Hum Reprod, v.11, n.10, Oct, p.2217-22. 1996. \nBECKMAN, K.B.; AMES, B.N. The free radical theory of aging matures. Physiol Rev, v.78, \nn.2, Apr, p.547-81. 1998. \nBELIARD, A. et al. Localizat ion of laminin, fibronectin, E-cadherin, and integrins in \nendometrium and endometriosis. Fertil Steril, v.67, n.2, Feb, p.266-72. 1997. \nBERLETT, B.S.; STADTMAN, E.R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. \nJ Biol Chem, v.272, n.33, Aug 15, p.20313-6. 1997. \nBRIZEK, C.L. et al. Increased incidence of aberrant morphological phenotypes in human \nembryogenesis--an associat ion with endometriosis. J Assist Reprod Genet , v.12, n.2, Feb, \np.106-12. 1995. \n\nReferências Bibliográficas \n \n62\nCANIPARI, R. Oocyte--gra nulosa cell interactions. Hum Reprod Update , v.6, n.3, May-Jun, \np.279-89. 2000. \nCHARRASSE, S. et al. The Xenopus XMAP2 15 and its human homo logue TOG proteins \ninteract with cyclin B1 to target p34cdc2 to microtubules during mitosis. Exp Cell Res, v.254, \nn.2, Feb 1, p.249-56. 2000. \nCOLLAS, P. Sequential PKC- and Cdc2-mediate d phosphorylation events elicit zebrafish \nnuclear envelope disassembly. J Cell Sci, v.112 ( Pt 6), Mar, p.977-87. 1999. \nDE SANTIS, L. et al. Polar body morphology and spindle imaging as predictors of oocyte \nquality. Reprod Biomed Online, v.11, n.1, Jul, p.36-42. 2005. \nDONNEZ, J. et al. Vascular endothelial gr owth factor (VEGF) in endometriosis. Hum \nReprod, v.13, n.6, Jun, p.1686-90. 1998. \nEBNER, T. et al. Elective transfer of embr yos selected on the basis of first polar body \nmorphology is associated with increase d rates of implantation and pregnancy. Fertil Steril , \nv.72, n.4, Oct, p.599-603. 1999. \nEICHENLAUB-RITTER, U. et al. Manipulati on of the oocyte: possible damage to the \nspindle apparatus. Reprod Biomed Online, v.5, n.2, Sep-Oct, p.117-24. 2002. \nELGINDY, E.A. et al. Anti-Mullerian hormone: correlation of early fo llicular, ovulatory and \nmidluteal levels with ovarian response and cycle outcome in intracytoplasmic sperm injection \npatients. Fertil Steril, v.89, n.6, Jun, p.1670-6. 2008. \nFANG, C. et al. Visualization of meiotic spindle and subsequent embryonic development in in \nvitro and in vivo matured human oocytes. J Assist Reprod Genet , v.24, n.11, Nov, p.547-51. \n2007. \nFERREIRA, E.M. et al. Cytoplasmic matu ration of bovine oocytes: structural and \nbiochemical modifications and acquisi tion of developmental competence. Theriogenology, \nv.71, n.5, Mar 15, p.836-48. 2009. \nFUNABIKI, H.; MURRAY, A.W. The Xenopus chromokinesin Xkid is essential for \nmetaphase chromosome alignment and must be  degraded to allow anaphase chromosome \nmovement. Cell, v.102, n.4, Aug 18, p.411-24. 2000. \nGARCIA-VELASCO, J.A.; ARICI, A. Is the endometrium or oocyte/embryo affected in \nendometriosis? Hum Reprod, v.14 Suppl 2, Dec, p.77-89. 1999. \n\nReferências Bibliográficas \n \n63\nGARRIDO, N. et al. The endometrium versus  embryonic quality in endometriosis-related \ninfertility. Hum Reprod Update, v.8, n.1, Jan-Feb, p.95-103. 2002. \nGARRIDO, N. et al. Follicular hormonal envi ronment and embryo quality in women with \nendometriosis. Hum Reprod Update, v.6, n.1, Jan-Feb, p.67-74. 2000. \nGUPTA, S. et al. Role of oxidative stress in endometriosis. Reprod Biomed Online, v.13, n.1, \nJul, p.126-34. 2006. \nGUTIERREZ-MATEO, C. et al. Aneuploidy study of human oocytes first polar body \ncomparative genomic hybridization and meta phase II fluorescence in situ hybridization \nanalysis. Hum Reprod, v.19, n.12, Dec, p.2859-68. 2004. \nHALME, J. et al. Accentuated cyclic activation of peritoneal macrophages in patients with \nendometriosis. Am J Obstet Gynecol, v.148, n.1, Jan 1, p.85-90. 1984. \nHASHIMOTO, N.; KISHIMOTO, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic \nmaturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Dev Biol , v.126, n.2, Apr, \np.242-52. 1988. \nHU, Y. et al. Effects of low O2 and ageing on spindles and chromosomes in mouse oocytes \nfrom pre-antral follicle culture. Hum Reprod, v.16, n.4, Apr, p.737-48. 2001. \nHYUN, C.S. et al. Optimal ICSI timing after th e first polar body extrusion in in vitro matured \nhuman oocytes. Hum Reprod, v.22, n.7, Jul, p.1991-5. 2007. \nJACKSON, L.W. et al. Oxida tive stress and endometriosis. Hum Reprod , v.20, n.7, Jul, \np.2014-20. 2005. \nKAHRAMAN, S. et al. Relationship between gr anular cytoplasm of oocytes and pregnancy \noutcome following intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod, v.15, n.11, Nov, p.2390-3. \n2000. \nKATSOFF, B. et al. Evaluation of the effect  of endometriosis on oocyte quality and \nendometrial environment by comparison of dono r and recipient outcomes following embryo \ntransfer in a shared oocyte program. Clin Exp Obstet Gynecol, v.33, n.4, p.201-2. 2006. \nKIM, N.H. et al. Microtubule and microfilament organizati on in maturing human oocytes. \nHum Reprod, v.13, n.8, Aug, p.2217-22. 1998. \n\nReferências Bibliográficas \n \n64\nKOKS, C.A. et al. Menstruum induces changes in mesothelial cell morphology. Gynecol \nObstet Invest, v.50, n.1, p.13-8. 2000. \nLIMOLI, C.L. et al. Apoptosis, reproductive failu re, and oxidative stress in Chinese hamster \novary cells with compromised genomic integrity. Cancer Res, v.58, n.16, Aug 15, p.3712-8. \n1998. \nLIU, L. et al. A reliable, non invasive technique for spindl e imaging and enucleation of \nmammalian oocytes. Nat Biotechnol, v.18, n.2, Feb, p.223-5. 2000. \nLIU, L. et al. Oxidative stress contributes to  arsenic-induced telomere  attrition, chromosome \ninstability, and apoptosis. J Biol Chem, v.278, n.34, Aug 22, p.31998-2004. 2003. \nLONERGAN, P. et al. Effect of follicle size on bovine oocy te quality and developmental \ncompetence following maturation, fertil ization, and culture in vitro. Mol Reprod Dev , v.37, \nn.1, Jan, p.48-53. 1994. \nMADASCHI, C. et al. Spindle imaging: a mark er for embryo development and implantation. \nFertil Steril, v.90, n.1, Jul, p.194-8. 2008. \nMANDELBAUM, J. et al. Effects of cryopreser vation on the meiotic spindle of human \noocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, v.113 Suppl 1, Apr 5, p.S17-23. 2004. \nMANSOUR, G. et al. L-carnitine supplementa tion reduces oocyte cyto skeleton damage and \nembryo apoptosis induced by incubation in perit oneal fluid from patients with endometriosis. \nFertil Steril, v.91, n.5 Suppl, May, p.2079-86. 2009. \nMANSOUR, G. et al. DNA damage to embryos in cubated in the peritoneal fluid of patients \nwith endometriosis: role in infertility. Fertility and sterility, v.88, p.S311. 2007. \nMATTSON, B.A.; ALBERTINI, D.F. Oogene sis: chromatin and microtubule dynamics \nduring meiotic prophase. Mol Reprod Dev, v.25, n.4, Apr, p.374-83. 1990. \nMIYARA, F. et al. Multiparameter analysis of human oocytes at metaphase II stage after IVF \nfailure in non-male infertility. Hum Reprod, v.18, n.7, Jul, p.1494-503. 2003. \nMOON, J.H. et al. Visualization of the metapha se II meiotic spindle in living human oocytes \nusing the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. \nHum Reprod, v.18, n.4, Apr, p.817-20. 2003. \n\nReferências Bibliográficas \n \n65\nMULLEN, S.F. et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human \noocytes, and the relevance to cryopreservation. Hum Reprod , v.19, n.5, May, p.1148-54. \n2004. \nNAVARRO, P.A. et al. Relationship be tween first polar body morphology before \nintracytoplasmic sperm injection and fertilization rate, cleavage rate, and embryo quality. Int \nJ Gynaecol Obstet, v.104, n.3, Mar, p.226-9. 2009. \nNAVARRO, P.A. et al. Arsenite induces aberrations in meiosi s that can be prevented by \ncoadministration of N-acetylcysteine in mice. Fertil Steril , v.85 Suppl 1, Apr, p.1187-94. \n2006. \nNAVARRO, P.A. et al. In vivo effects of arseni te on meiosis, preimplantation development, \nand apoptosis in the mouse. Biol Reprod, v.70, n.4, Apr, p.980-5. 2004. \nNAVARRO, P.A. et al. Noninva sive imaging of spindle dynamics during mammalian oocyte \nactivation. Fertil Steril, v.83 Suppl 1, Apr, p.1197-205. 2005. \nOOKATA, K. et al. Relocation and distinct subcellular local ization of p34c dc2-cyclin B \ncomplex at meiosis reinitiation in starfish oocytes. EMBO J, v.11, n.5, May, p.1763-72. 1992. \nPAVLOK, A. et al. Fertiliza tion and developmental competen ce of bovine ooc ytes derived \nfrom different categories of antral follicles. Mol Reprod Dev, v.31, n.1, Jan, p.63-7. 1992. \nPELLICER, A. et al. Endometrial quality in infertile women with endometriosis. Ann N Y \nAcad Sci, v.943, Sep, p.122-30. 2001. \nPELLICER, A. et al. Exploring the mechanism( s) of endometriosis-re lated infer tility: an \nanalysis of embryo development and implantation in assisted reproduction. Hum Reprod, v.10 \nSuppl 2, Dec, p.91-7. 1995. \nPETERSEN, C.G. et al. Relationship between visualization of meiotic spindle in human \noocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis. Reprod Biomed Online, v.18, n.2, Feb, p.235-43. \n2009. \nRevised American Society for Reproductive Me dicine classification of endometriosis: 1996. \nFertil Steril, v.67, n.5, May, p.817-21. 1997. \nRIENZI, L. et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body \nposition and oocyte developmental potential after ICSI. Hum Reprod, v.18, n.6, Jun, p.1289-\n93. 2003. \n\nReferências Bibliográficas \n \n66\nROBERTS, R. et al. Culture environment mo dulates maturation and metabolism of human \noocytes. Hum Reprod, v.17, n.11, Nov, p.2950-6. 2002. \nSAMPSON, J.A. Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial \ntissue into the peritoneal cavity. Am J Obstet Gynecol, v.14, p.422-69. 1927. \nSANTANAM, N. et al. Macrophages, oxidation, and endometriosis. Ann N Y Acad Sci, v.955, \nMar, p.183-98; discussion 19-200, 396-406. 2002. \nSELAM, B.; ARICI, A. Implanta tion defect in endometriosis:  endometrium or peritoneal \nfluid. J Reprod Fertil Suppl, v.55, p.121-8. 2000. \nSERHAL, P.F. et al. Oocyte morphology pred icts outcome of intracytoplasmic sperm \ninjection. Hum Reprod, v.12, n.6, Jun, p.1267-70. 1997. \nSOMIGLIANA, E. et al. Human endometrial stroma l cells as a source of soluble intercellular \nadhesion molecule (ICAM)-1 molecules. Hum Reprod, v.11, n.6, Jun, p.1190-4. 1996. \nSTADTMAN, E.R. Protein oxidation and aging. Science, v.257, n.5074, Aug 28, p.1220-4. \n1992. \nSUN, Q.Y. et al. Role of the MA PK cascade in mammalian germ cells. Reprod Fertil Dev , \nv.11, n.7-8, p.443-50. 1999. \nVAN BLERKOM, J.; DAVIS, P. Differential eff ects of repeated ovarian stimulation on \ncytoplasmic and spindle organization in metaph ase II mouse oocytes matured in vivo and in \nvitro. Hum Reprod, v.16, n.4, Apr, p.757-64. 2001. \nVAN BLERKOM, J.; HENRY, G. Oocyte dysmo rphism and aneuploidy in meiotically \nmature human oocytes after ovarian stimulation. Hum Reprod, v.7, n.3, Mar, p.379-90. 1992. \nVAN LANGENDONCKT, A. et al . Oxidative stress and pe ritoneal endometriosis. Fertil \nSteril, v.77, n.5, May, p.861-70. 2002. \nVERDE, F. et al. Control of microtubule dyna mics and length by cyc lin A- and cyclin B-\ndependent kinases in Xenopus egg extracts. J Cell Biol, v.118, n.5, Sep, p.1097-108. 1992. \nVERDE, F. et al. Regulation of microtubule d ynamics by cdc2 protein kinase in cell-free \nextracts of Xenopus eggs. Nature, v.343, n.6255, Jan 18, p.233-8. 1990. \n\nReferências Bibliográficas \n \n67\nVINATIER, D. et al. Is endometri osis an endometrial disease? Eur J Obstet Gynecol Reprod \nBiol, v.91, n.2, Aug, p.113-25. 2000. \nVOLARCIK, K. et al. The meiotic competen ce of in-vitro matured human oocytes is \ninfluenced by donor age: evidence that follicu logenesis is compromised in the reproductively \naged ovary. Hum Reprod, v.13, n.1, Jan, p.154-60. 1998. \nWANG, W.H.; KEEFE, D.L. Prediction of chromosome misalignment among in vitro \nmatured human oocytes by spindle imaging with the PolScope. Fertil Steril, v.78, n.5, Nov, \np.1077-81. 2002. \nWANG, W.H. et al. Developmental ability of human oocyt es with or without birefringent \nspindles imaged by Polscope before insemination. Hum Reprod , v.16, n.7, Jul, p.1464-8. \n2001. \nWANG, W.H. et al. Rigorous thermal control during intracytoplasmic sperm injection \nstabilizes the meiotic spindle and impr oves fertilization and pregnancy rates. Fertil Steril , \nv.77, n.6, Jun, p.1274-7. 2002. \nXIA, P. Intracytoplasmic sperm injection: co rrelation of oocyte gr ade based on polar body, \nperivitelline space and cytoplasmic inclusions with fertilization rate and embryo quality. Hum \nReprod, v.12, n.8, Aug, p.1750-5. 1997. \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAnexos \n\nAnexos \n \n69\nANEXO A – Termo Consentimento Livre e Esclar ecido para pacientes inférteis por fatores \ntubários e/ou masculino (grupo controle). \n \nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE \nRIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nCampos Universitário Monte Alegre - Fone: 3602-1000 - Fax: 3633-1144 \nCEP: 14048-900 Ribeirão Preto - São Paulo. \n \n \n1. NOME DA PESQUISA: “Avaliação do balanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis \ncom endometriose e Síndrome dos Ovários Policís ticos submetidas à indução da ovulação para a \nrealização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade” \n \n2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro \n \n Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada “Avaliação do balanço oxidante \ne antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários Policísticos \nsubmetidas à indução da ovulação para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta \ncomplexidade” \n Sabemos que o estresse oxidativo compromete a fertilidade masculina. Temos suspeita de que o \nestresse oxidativo também possa comprometer a fertilid ade feminina, porém os dados disponíveis até o \npresente momento são escassos e controversos. A e ndometriose e a Síndrome dos Ovários Policísticos \n(SOMP) são causas bastante comuns  de dificuldade para engravid ar (denominada infertilidade) e \naventa-se a possibilidade do estresse oxidativo partic ipar da ocorrência destas duas freqüentes doenças, \npodendo, inclusive, contribuir para a infertilidade associada às mesmas. Desta forma, determinar os \nníveis de substâncias oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido folicular (fluido contido no \nfolículo onde os óvulos se desenvolvem) de mulh eres inférteis com estas doenças poderia auxiliar a \ndescobrir alguns dos mecanismos en volvidos na causa da infertilidade, o que, poderia auxiliar na \nidentificação de tratamentos futuros. Contudo, pa ra podermos dizer se os níveis de substâncias \noxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido folicular de mulheres inférteis com estas doenças, são \ndiferentes daqueles de mulheres inférteis sem estas doenças, precisamos comparar os mesmos com os \nprovenientes de um grupo de pacientes tido como  grupo controle, ou seja, cujos níveis sejam \nconsiderados como padrão de normalidade, aonde você estaria incluída. \n É possível que a estimulação da ovulação, que você realizará com o uso de medicações \nespecíficas, possa alterar o balanço de substânci as oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido \nfolicular. Para avaliarmos se isto é verdadeiro, pro pomos avaliar os níveis de diferentes substâncias \noxidantes e antioxidantes no sangue (em quatro diferentes momentos, quando vocês vêm normalmente a \neste serviço, visando a realização de procedimentos de reprodução assistida: no dia da consulta pré-\nbasal, no dia de início da estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o uso da gonadotrofina \ncoriônica humana e no dia da realização da captação de  óvulos). Desta forma, autorizo a realização de \ncoleta de sangue venoso, nos 4 dias propostos. Fui informada de que o procedimento pode ocasionar \ndiscreta dor local, podendo aparecer hematomas no lo cal da punção. Também autorizo a utilização do \nfluido folicular e das células da granulosa (cél ulas que envolvem o óvulo, representando a parede do \nfolículo ovariano) obtidos, durante  o procedimento de captação dos óvulos, após a identificação e \nseparação dos óvulos pela bióloga responsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução. \nFui informada de que, após o isolamento dos óvulos,  o fluido folicular e as células da granulosa (que \nficam misturadas ao fluido) são desprezados, uma vez que não apr esentam qualquer utilidade para o \nprocedimento de reprodução ao qual serei submetida.  Fui informada de que ser á realizada a análise dos \nníveis de algumas substâncias oxidantes e antioxidantes no fluido folicular, assim como a avaliação da \ncapacidade antioxidante das células da granulosa ( por meio da análise da expressão de enzimas \nenvolvidas na neutralização das substâncias oxidantes). \n\nAnexos \n \n70\n Temos indícios de que o estresse oxidativo possa também comprometer a qualidade dos óvulos, \nlevando a redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam procedimentos de reprodução \nassistida. Nas mulheres inférteis com endometri ose e SOMP, questiona-se se um dos motivos \nresponsáveis pela maior dificuldade em engravidar , seja a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), \nque poderão produzir embriões também de má qualid ade e, conseqüentemente, gerar uma gestação \nmenos viável. Contudo, na atualidade, não se rea liza a avaliação adequada  da qualidade oocitária, \ndevido à ausência de métodos bem estabelecidos capazes de predizer se os óvulos são bons ou não.  \n A identificação da presença de alterações nos  óvulos de pacientes portadoras de endometriose e \nSOMP, não somente ajudaria a elucidar um dos po ssíveis mecanismos caus adores da infertilidade, \ncomo também abriria perspectivas futuras de tratam ento para este grupo de pacientes. Contudo, para \npodermos dizer se os óvulos destas pacientes com endometriose ou SOMP são ou não são de boa \nqualidade, precisamos comparar a qualidade dos mesmos com a de óvulos provenientes de um grupo de \npacientes tido como grupo controle, ou seja, cuja qualidade dos óvulos seja considerada como padrão de \nnormalidade. Desta forma, você está sendo convidada  para participar deste estudo na posição de \npaciente do grupo controle, ou seja, cujos óvulos sejam considerados como padrão de normalidade, para \nfins de comparação com os óvulos das pacientes com endometriose e SOMP. \n Uma forma indireta de avaliarmos a qualidad e dos seus óvulos, sem lhe causar qualquer risco \nadicional ou prejuízo do sucesso de você engravidar durante este procedimento de reprodução assistida, \nseria analisar a presença de algumas característi cas dos seus óvulos (como uma estrutura microscópica \nem seu interior chamada de “fuso celular”, um dos possíveis responsáveis pela qualidade dos seus \noócitos), por meio de um microscópio de polarização, que não ocasiona qualquer dano aos óvulos e nem \nao desenvolvimento dos embriões gerados a partir  destes óvulos. Devemos, portanto, ressaltar que o \nestudo dos seus óvulos usando esta microscopia de polarização, não vai interferir no seu tratamento para \nengravidar, assim como não causará prejuízo algum para a sua saúde, nem para a do futuro bebê. \nRessaltamos que a utilização desta metodologia já ocorre de rotina na prática diária do laboratório de \nreprodução do presente serviço, sendo que apenas solicitamos a autorização para utilizar os dados \nobtidos por meio da utilização desta metodologia. \n Também devemos ressaltar que a sua par ticipação no presente estudo não implicará na \nrealização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para tentar engravidar, com \nexceção da coleta de sangue no dia de início de estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o \nuso da gonadotrofina coriônica humana e no dia da r ealização da captação de óvulos, como descrito \nacima. \n Sua colaboração, portanto, no fornecimento de am ostras de sangue, fluido folicular e células da \ngranulosa, bem como autorizando a utilizar os dados  obtidos com o uso da microscopia de polarização \ndos seus óvulos, será imprescindível para um melhor  conhecimento do balanço oxidante e antioxidante \ne qualidade dos oócitos de pacientes com dificuldade para engravidar devido à Endometriose e SOMP. \nEste conhecimento no futuro poderá ser usado no senti do de propiciar um tratamento mais eficaz da \ninfertilidade associada à Endometriose e à SOMP. É importante ressaltarmos que este estudo não trará \nnenhuma despesa para você e seu companheiro. Todo o material obtido será utilizado exclusivamente \npara a avaliação do balanço oxidante/antioxidante no sangue, fluido folicular e células da granulosa, e \nanálise das características dos óvulos (não poderão ser utilizados para outros fins que não os desta \npesquisa). Autorizo, caso haja amos tras remanescentes de materiais colhidos (sangue, fluido folicular e \ncélulas da granulosa), ao armazenamento das mesm as, sendo que somente poderão ser utilizadas para a \nrealização de pesquisas futuras, caso eu dê a minha autorização expressa, mediante a assinatura do \ntermo de consentimento livre e esclarecido específico da nova(s) pesquisa(s). No caso de haver \namostras remanescentes, eu assinarei um termo de consentimento específico, autorizando a sua \nestocagem e onde conste os tipos e quantidades de alíquotas armazenadas. \n \n3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todos as dúvid as com relação ao estudo que, porventura, \npossam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente esclarecidas pelos \npesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você te m a liberdade de retirar o seu consentimento e \nde deixar de participar do estudo, a qualquer mo mento, sem que isto traga qualquer prejuízo à \ncontinuidade do seu tratamento.  Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes dos integrantes deste \nestudo, bem como garantimos que será mantido o caráter  confidencial de toda informação relacionada a \nsua privacidade. Temos o compromisso de que serão prestadas informações at ualizadas durante todo o \n\nAnexos \n \n71\nestudo, ainda que isto possa afetar a vossa vontade de  continuar dele partic ipando. Asseguramos o \ncompromisso de que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de \nparticipação neste projeto, bem como de que será ga rantida a continuidade do seu tratamento, após a \nconclusão dos trabalhos da pesquisa. \n \n \nEu, __________________ ___________________________, RG nº:___________ abaixo assinada, \ndeclaro que fui informada e estou inteiramente de  acordo com o exposto acima e aceito livremente \nparticipar do estudo em questão, fornecendo amostras de  sangue, fluido folicular e células da granulosa, \nbem como autorizando a utilizar os dados obtidos co m o uso da microscopia de polarização dos meus \nóvulos,. Autorizo a pesquisadora abaixo mencionada  a utilizá-los para a pesquisa : “Avaliação do \nbalanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários \nPolicísticos submetidas à indução da ovulação para  a realização de procedimentos de reprodução \nassistida de alta complexidade”, estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu consentimento e de \ndeixar de participar do estudo a qualquer momento, sem  que isto traga qualquer prejuízo à continuidade \ndo meu tratamento. \n \n \nRibeirão Preto _______ / _______ / _________ \n \n \n_______________________________           ___________________________ \nAssinatura- Paciente    Assinatura do Pesquisador \n \n \n4. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: \n  Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP \n  Telefone de contato: 16-3602-2231 \nEndereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º a ndar (Hospital das Clínicas- Setor de \nReprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. \n  \n\nAnexos \n \n72\nANEXO B – Termo Consentimento Livre e Es clarecido para pacientes inférteis com \nendometriose. \n \nHOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE \nRIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nCampos Universitário Monte Alegre - Fone: 3602-1000 - Fax: 3633-1144 \nCEP: 14048-900 Ribeirão Preto - São Paulo. \n \n \n1. NOME DA PESQUISA: “Avaliação do balanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis \ncom endometriose e Síndrome dos Ovários Policís ticos submetidas à indução da ovulação para a \nrealização de procedimentos de reprodução assistida de alta complexidade” \n \n2. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro \n \n Você está sendo convidada a participar da pesquisa intitulada “Avaliação do balanço oxidante \ne antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários Policísticos \nsubmetidas à indução da ovulação para a realização de procedimentos de reprodução assistida de alta \ncomplexidade”, na qualidade de membro do grupo de pacientes portadoras de endometriose. \n Sabemos que o estresse oxidativo compromete a fertilidade masculina. Temos suspeita de que o \nestresse oxidativo também possa comprometer a fertilid ade feminina, porém os dados disponíveis até o \npresente momento são escassos e controversos. A e ndometriose e a Síndrome dos Ovários Policísticos \n(SOMP) são causas bastante comuns  de dificuldade para engravid ar (denominada infertilidade) e \naventa-se a possibilidade do estresse oxidativo partic ipar da ocorrência destas duas freqüentes doenças, \npodendo, inclusive, contribuir para a infertilidade associada as mesmas. Desta forma, determinar os \nníveis de substâncias oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido folicular (fluido contido no \nfolículo onde os óvulos se desenvolvem) de mulh eres inférteis com estas doenças poderia auxiliar a \ndescobrir alguns dos mecanismos en volvidos na causa da infertilidade, o que, poderia auxiliar na \nidentificação de tratamentos futuros.  \n É possível que a estimulação da ovulação, que você realizará com o uso de medicações \nespecíficas, possa alterar o balanço de substânci as oxidantes e antioxidantes, no sangue e no fluido \nfolicular. Para avaliarmos se isto é verdadeiro, pro pomos avaliar os níveis de diferentes substâncias \noxidantes e antioxidantes no sangue (em quatro diferentes momentos, quando vocês vêm normalmente a \neste serviço, visando a realização de procedimentos de reprodução assistida: no dia da consulta pré-\nbasal, no dia de início de estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o uso da gonadotrofina \ncoriônica humana e no dia da realização da captação de  óvulos). Desta forma, autorizo a realização de \ncoleta de sangue venoso, nos 4 dias propostos. Fui informada de que o procedimento pode ocasionar \ndiscreta dor local, podendo aparecer hematomas no lo cal da punção. Também autorizo a utilização do \nfluido folicular e das células da granulosa (cél ulas que envolvem o óvulo, representando a parede do \nfolículo ovariano) obtidos, durante  o procedimento de captação dos óvulos, após a identificação e \nseparação dos óvulos pela bióloga responsável, como realizado na prática do laboratório de reprodução. \nFui informada de que, após o isolamento dos óvulos,  o fluido folicular e as células da granulosa (que \nficam misturadas ao fluido) são desprezados, uma vez que não apr esentam qualquer utilidade para o \nprocedimento de reprodução ao qual serei submetida.  Fui informada de que ser á realizada a análise dos \nníveis de algumas substâncias oxidantes e antioxidantes no fluido folicular, assim como a avaliação da \ncapacidade antioxidante das células da granulosa ( por meio da análise da expressão de enzimas \nenvolvidas na neutralização das substâncias oxidantes). \n Temos indícios de que o estresse oxidativo possa também comprometer a qualidade dos óvulos, \nlevando a redução das chances de gravidez, mesmo quando se realizam procedimentos de reprodução \nassistida. Nas mulheres inférteis com endometri ose e SOMP, questiona-se se um dos motivos \nresponsáveis pela maior dificuldade em engravidar , seja a inadequada qualidade dos óvulos (oócitos), \nque poderão produzir embriões também de má qualid ade e, conseqüentemente, gerar uma gestação \n\nAnexos \n \n73\nmenos viável. Contudo, na atualidade, não se rea liza a avaliação adequada  da qualidade oocitária, \ndevido à ausência de métodos bem estabelecidos cap azes de predizer se os óvulos são bons ou não. A \nidentificação da presença de alterações nos óvulos  de pacientes portadoras de endometriose e SOMP, \nnão somente ajudaria a elucidar o mecanismo cau sador da infertilidade, como também abriria \nperspectivas futuras de tratamento para este grupo de pacientes.  \n Uma forma indireta de avaliarmos a qualidad e dos seus óvulos, sem lhe causar qualquer risco \nadicional ou prejuízo do sucesso de você engravidar durante este procedimento de reprodução assistida, \nseria analisar a presença de algumas característi cas dos seus óvulos (como uma estrutura microscópica \nem seu interior chamada de “fuso celular”, um dos possíveis responsáveis pela qualidade dos seus \noócitos), por meio de um microscópio de polarização, que não ocasiona qualquer dano aos óvulos e nem \nao desenvolvimento dos embriões gerados a partir  destes óvulos. Devemos, portanto, ressaltar que o \nestudo dos seus óvulos usando esta microscopia de polarização, não vai interferir no seu tratamento para \nengravidar, assim como não causará prejuízo algum para a sua saúde, nem para a do futuro bebê. \nRessaltamos que a utilização desta metodologia já ocorre de rotina na prática diária do laboratório de \nreprodução do presente serviço, sendo que apenas solicitamos a autorização para utilizar os dados \nobtidos por meio da utilização desta metodologia. \n Também devemos ressaltar que a sua par ticipação no presente estudo não implicará na \nrealização de nenhum procedimento complementar durante o seu tratamento para tentar engravidar, com \nexceção da coleta de sangue no dia de início de estimulação da ovulação, no dia em que for prescrito o \nuso da gonadotrofina coriônica humana e no dia da r ealização da captação de óvulos, como descrito \nacima. \n Sua colaboração, portanto, no fornecimento de am ostras de sangue, fluido folicular e células da \ngranulosa, bem como autorizando a utilizar os dados  obtidos com o uso da microscopia de polarização \ndos seus óvulos, será imprescindível para um melhor  conhecimento do balanço oxidante e antioxidante \ne qualidade dos oócitos de pacientes com dificuldade para engravidar devido à Endometriose e SOMP. \nEste conhecimento no futuro poderá ser usado no senti do de propiciar um tratamento mais eficaz da \ninfertilidade associada à Endometriose e à SOMP. É importante ressaltarmos que este estudo não trará \nnenhuma despesa para você e seu companheiro. Todo o material obtido será utilizado exclusivamente \npara a avaliação do balanço oxidante/antioxidante no sangue, fluido folicular e células da granulosa, e \nanálise das características dos óvulos (não poderão ser utilizados para outros fins que não os desta \npesquisa). Autorizo, caso haja amos tras remanescentes de materiais colhidos (sangue, fluido folicular e \ncélulas da granulosa), ao armazenamento das mesm as, sendo que somente poderão ser utilizadas para a \nrealização de pesquisas futuras, caso eu dê a minha autorização expressa, mediante a assinatura do \ntermo de consentimento livre e esclarecido específico da nova(s) pesquisa(s). No caso de haver \namostras remanescentes, eu assinarei um termo de consentimento específico, autorizando a sua \nestocagem e onde conste os tipos e quantidades de alíquotas armazenadas. \n \n3. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Todos as dúvid as com relação ao estudo que, porventura, \npossam ocorrer durante o seu tratamento para engravidar, serão prontamente esclarecidas pelos \npesquisadores responsáveis pelo presente estudo. Você te m a liberdade de retirar o seu consentimento e \nde deixar de participar do estudo, a qualquer mo mento, sem que isto traga qualquer prejuízo à \ncontinuidade do seu tratamento.  Asseguramos o total sigilo em relação aos nomes dos integrantes deste \nestudo, bem como garantimos que será mantido o caráter  confidencial de toda informação relacionada a \nsua privacidade. Temos o compromisso de que serão prestadas informações at ualizadas durante todo o \nestudo, ainda que isto possa afetar a vossa vontade de  continuar dele partic ipando. Asseguramos o \ncompromisso de que você será devidamente acompanhada e assistida durante todo o período de \nparticipação neste projeto, bem como de que será ga rantida a continuidade do seu tratamento, após a \nconclusão dos trabalhos da pesquisa. \n \n \nEu, __________________ ___________________________, RG nº:___________ abaixo assinada, \ndeclaro que fui informada e estou inteiramente de  acordo com o exposto acima e aceito livremente \nparticipar do estudo em questão, fornecendo amostras de  sangue, fluido folicular e células da granulosa, \nbem como autorizando a utilizar os dados obtidos co m o uso da microscopia de polarização dos meus \nóvulos,. Autorizo a pesquisadora abaixo mencionada  a utilizá-los para a pesquisa : “Avaliação do \n\nAnexos \n \n74\nbalanço oxidante e antioxidante em mulheres inférteis com endometriose e Síndrome dos Ovários \nPolicísticos submetidas à indução da ovulação para  a realização de procedimentos de reprodução \nassistida de alta complexidade”, estando ciente que terei a liberdade de retirar o meu consentimento e de \ndeixar de participar do estudo a qualquer momento, sem  que isto traga qualquer prejuízo à continuidade \ndo meu tratamento. \n \n \nRibeirão Preto _______ / _______ / _________ \n \n \n_______________________________           ___________________________ \nAssinatura- Paciente    Assinatura do Pesquisador \n \n \n4. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: \n  Prof. Dra. Paula Andrea de A. Salles Navarro – CRM: 84930 – SP \n  Telefone de contato: 16-3602-2231 \nEndereço: Av. Bandeirantes, 3900 - 1º a ndar (Hospital das Clínicas- Setor de \nReprodução Humana), Ribeirão Preto – SP. CEP: 14049-900. \n  \n\nAnexos \n \n75\nANEXO C – Modelo de ficha de avaliação dos sujeitos do estudo \n \nDados Clínicos e Laboratoriais \nInfertilidade:    Primár ia  Secundária  G__P__C__A__ \n \nEndometriose:    Mínima         Leve          Moderada         Severa  \nEndometrioma no ciclo atual  nã o   sim  Número:________ Tamanho:____________ \nEndometrioma prévio   não   sim  Número:________ Tamanho:____________ \n exérese com cápsula   esvaziamento + cauterização cápsula   conduta expectante \n \nFator tubário  Salpingectomia   Laqueadura Tubá ria    Hidrossalpinge (não visualizada ao \nUS)   Outros ____________________________ \n \nFator masculino:  Sim      Não   Mo rfologia  > 8%     > 4 %   (____/___/____) \n            Morfologia  > 8%     > 4 %   (____/___/____) \nTécnica de processamento seminal:   Swim up       Gradiente       Lavagem \n \nQualidade seminal dia ICSI:  \n   mais de 5 milhões de sp tz móveis recuperados (SMR) \n  2-5 milhões de SMR e morfologia > 4% (exames prévios) \n  < 2milhões de SMR ou  morfologia < 4% (exames prévios) \n   sptz obtido por PESA  \n   sptz obtido por TESE  \nSêmen Doador:    Sim        Não       Pós-descongelamento  (vide acima) \n \nLaparoscopia:    Sim      Não      Local:________________      Data:_____________ \n \nIdade: _________ FSH Basal (____/_____/____): _________ \nPeso:_____________         Estatura:__________ IMC:_________ \nTerapia de Reprodução Assistida prévia:  Sim    Não   N\no de ciclos:________ \n                              IUI ____________  FIV- ICSI: _________ \nMedicações em uso:   Sim    Não  \nNome:_____________ Dose:___________    Tempo de uso:_________ \n           _____________________________________________________ \n \n \n \n\nAnexos \n \n76\n Diabetes mellitus      Doença cardiovascular   \n Outras endocrinopatias  _________________ \n Dislipidemia     Lupus eritematoso sistêm ico     Outras doen ças reumatológicas   \n Infecção pelo HIV             Qualquer infecção ativa   \n Tabagismo   N\no cigarros dia:_____________ \n Consumo de Álcool    Frequência:____________    Tipo de bebida:__________ \n \nDados da indução \n \nFSH-r (total UI): __________(dose diária):_________Nº dias de indução:________ \nhMG-hp (total UI): ___________(dose diária):_________Nº dias de indução:_________  \nNº total de dias de indução: __________ \nTotal folículos ≥ 14mm no dia hCG: ________      OD: ______                   OE: ______ \nTotal folículos ≥ 18mm no dia hCG: _______        OD: ______             OE: ______ \n \nDados da captação e fertilização \n \nNº de oócitos captados: _______  Nº  de folículos puncionados: _______ \nNo de oócitos degenerados: __________ \nMaturidade oocitária: GV: ________MI: ________MII: _________ \nNº oócitos injetados: ____  Nº de oócitos fertilizados:_____Taxa de fertilização:_____% \nNº de embriões formados:____       Nº embriões clivados:____Taxa de Clivagem: ____% \n \nQualidade Oocitária\n  \nD0 \nFuso  \nOócito \nMaturação \nNuclear \n(MN) \nCitoplasma \n(CGC) \nVacúolos \n(V) \nCorpúsculo \nPolar (CP) EIM +/- Loc \n1        \n2        \n3        \n4        \n5        \n6        \n7        \nEIM: Estágios intermediários da meiose (TI: telófase I; AII: anáfase II; TII: telófase II) \n \n\nAnexos \n \n77\nQualidade Embrionária \n \n                    D1                                 D2                                D3 \n \nEmbrião \n \nCP \n \nPN \n \n \nS \n \n \nN \n \n \nNo \nCélulas \n \n \nS \n \n \nF \n \n \nM \n \nNo \nCélulas \n \n \nS \n \nF \n \n \n \nM \n \nDestino \n \n 1              \n2              \n3              \n4              \n5              \n6              \n7              \n \nDados de Transferência \nDia da transferência:     □  D2                    □   D3  \nNº embriões transferidos: ________  Numeração dos embriões transferidos:__________ \n \nDados da Gestação \n \nßHCG:  Positivo □   Negativo □       Data: ____/___/_____Valor:_______ \n \nGravidez Clínica:    Sim    Não  \nNo sacos gestacionais (US 4 semanas após TE):_______________ \nTaxa de implantação (no sacos gestacionais US 4 semanas após TE /no embriões transferidos): \n_________% \nNº de sacos gestacionais (US 12 semanas): _________ \nGravidez:    única   gemelar   trigemelar   quadrigemelar \nPerdas gestacionais:    Sim    Não      Idade gestacional:___________________ \nNascidos vivos:   Sim   Não    N\no:_______  Idade gestacional:_______________ \nVitalidade:_____________________ \nComplicações obstétricas:  Sim   Não  \nDescreva:___________________________________________________________________\n___________________________________________________________________________ \n \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nArtigo Científico \n\nArtigo Científico \n \n79\nTitle  \nHigher percentage of telophase I in living human oocytes from  patients with moderate and \nsevere endometriosis \n \nRunning title \nMeiotic spindle in oocytes from infertile women with endometriosis \n \nLuciana A. Dib\na, Maria C.P.M. Araújo a, Roberta Cristina Giorgenon a, Gustavo S. Romão a, \nMD, PhD, Rui A. Ferriania,b, MD, PhD, Paula A. Navarro, MD, PhDa,b* \n \naDepartment of Obstetrics and Gynecology, Ribeirão Preto Medical School, São Paulo \nUniversity, Ribeirão Preto, SP, Brazil. \nbNational Institute of Hormones and Women's Health, Ribeirão Preto, SP, 14049-900, Brazil \n \n*Corresponding author: \nPaula A. A. S. Navarro \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo \nAv. Bandeirantes, 3900, Ribeirão Preto, São Paulo 14049-900, Brasil \nFax number: 55-16-3633 0946 \nE-mail: paasnavarro@uol.com.br \n \n\nArtigo Científico \n \n80\n \nFINANCIAL SUPPORT \nLuciana A. Dib was supported by a scholarship granted by Coordenação de Aperfeiçoamento \nde Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Brazil \nConselho Nacional de Desenvolvimento Cien tífico e Tecnológico (CNPq) - Edital \nMCT/CNPq 15/2007 - Processo 478396/2007-4) \nFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - 2008/58197-6 \n\nArtigo Científico \n \n81\nAbstract \nLower fertilization, implantation and pregnancy rates in women with endometriosis may be \nrelated to impaired oocyte quality. Polarization microscopy permits the analysis of spindles in \nlive oocytes without compromising assisted reproduction outcomes. Thus, the objective of \nthis prospective study was to compare the presence/location of me iotic spindles of in vivo \nmatured oocytes from women with endometriosis  (stages I/II and III/IV ) and male or tubal \ncauses of infertility (controls) undergoing stimulated cycles for intracytoplasmic sperm \ninjection (ICSI). The meiotic spindles of 326 oocytes with the first polar body (PB) extruded \n(196 from the control group and 130 from endometriosis group, being 79 from the \nendometriosis I/II group and 51 from the endo metriosis III/IV group) were imaged using \npolarization microscopy immediately before ICSI. We did not observe a significant difference \nbetween the percentage of oocyt es in metaphase II with visi ble spindles among the analyzed \ngroups (86.9%, 94.9%, and 91.5%, respectively, in the control, endometriosis I/II and \nendometriosis III/IV groups). We did not observe  significant differences in the percentage of \noocytes with spindles localized between 0° and 30°, 30° and 60, and 60° and 90° in relation to \nthe first PB among the analyzed groups. Among the apparently mature oocytes, we observed a \nsignificant increase in th e percentage of oocytes  in telophase I in th e endometriosis III/IV \ngroup (7.8%) when compared to the control ( 2.5%) and the endometrios is I/II groups (0%). \nThe observation of a higher proportion of oocytes  in telophase I among apparently matured \noocytes in patients with moderate and severe endometriosis suggests an impairment or delay \nin the completion of meiosis I, which may have clinical implications. \nKEYWORDS: Endometriosis; meiotic spindle; telophase I; human oocyte quality; \npolarization microscopy; ICSI \n\nArtigo Científico \n \n82\nSummary for lay readers \nLower fertilization, implantation and pregnancy rates in women with endometriosis may be \nrelated to impaired oocyte qualit y. For a mature oocyte to be pr epared for fertilization, the \nmeiotic spindle must maintain its integrity. Po larization microscopy permits the analysis of \nspindles in live oocytes without compromisi ng assisted reproduction outcomes. Thus, the \nobjective of this prospective study was to comp are the presence/location of meiotic spindles \nof in vivo matured oocytes from women with endome triosis (stages I/II – minimal/mild and \nIII/IV – moderate/severe) and male or tubal ca uses of infertility (control group) undergoing \nstimulated cycles for intracytoplasmic sperm in jection (ICSI). The meiotic spindles of 326 \noocytes with the first polar body (PB) extr uded (196 from the control group and 130 from \nendometriosis group, being 79 from the e ndometriosis I/II grou p and 51 from the \nendometriosis III/IV group) were imaged us ing polarization microscopy immediately before \nICSI. Preliminary data from this prospective controlled study did not demonstrate differences \nin the visualization and localization of the metaphase II meiotic spindles of living  oocytes \nobtained from stimulated cycles of infertile patients with endometriosis and controls. \nHowever, the higher proportion of oocytes in telophase I among an apparently matured cadre \nof oocytes observed in patients with modera te and severe endometriosis suggests an \nimpairment or delay in the completion of meiosis I that requires further evaluation. \n \n\nArtigo Científico \n \n83\nIntroduction \nIn the spectrum of endometriosis-related sy mptoms, one of the most intriguing is the \ndisease’s association with infertility, princi pally in cases where there are no mechanical \nalterations of the reproductive system. Although it  has been a controversial issue for decades, \nvarious data have supported the concept of d ecreased fertility in endometriosis patients \n(GARRIDO et al., 2000; GARRIDO  et al., 2002). The finding that the control group in \ndonation cycles and patients with endometrios is have similar oocyte implantation rates \nsuggests an important role of the embryonic quality in the comp letion of the implantation  in \nthis group of patients (GARRIDO et al., 2000;  BARNHART et al., 2002; AL-FADHLI et al., \n2006).  \nSome studies have suggested that oxidative stress has a potential role in explaining the \netiopathogenesis of infertility associated with endometriosis (JACKSON et al., 2005; GUPTA \net al., 2006; MANSOUR et al., 2009)  that could theoretically pr omote an impairment of the \noocyte quality among these patients. There were a lterations in the quality of oocytes, leading \nto either an impairment to embryonic developm ent (BRIZEK et al., 1995) or a total block in \nthat process (PELLICER et al., 1995), when women with endometriosis were compared to the \nhealthy controls. Corroborating these findings, clinical data from oocyte donation programs \nseem to support the previously described theo ry that women affected with endometriosis \nproduce poor quality oocytes (GARRIDO et al., 2000). \nFor the mature oocyte to be prepared for fert ilization, it is necessa ry that the meiotic \nspindle, a fundamental part of the oocytic developmental proce ss, maintain its integrity and \nfunction. In a recently published study on  in vitro  analysis of mature oocytes obtained from \nstimulated cycles of infertile patients with  either endometriosis or a control group, we \nobserved that patients with endom etriosis tended to have a hi gher percentage of oocytes in \ntelophase I (BARCELOS et al., 2009). This findi ng suggests a potential delay or impairment \n\nArtigo Científico \n \n84\nof meiosis I associated with endometriosis,  which would contribut e to decreased oocyte \nquality. However, we highlight the fact that th e number of cases presented is small and that \nthe data cannot necessarily be extrapolated to in vivo mature oocytes. These are usually \nunavailable for studies using invasive methods  that would render th eir use in assisted \nreproduction (AR) procedures impossible. Th ese findings arouse interest in using non-\ninvasive and innocuous methods to analy ze this important cellular structure in in vivo, mature \noocytes from stimulated cycles of infertile women with endometriosis . Such an approach \nwould make the utilization of the analyzed oocytes in subsequent AR procedures possible. \nNon-invasive methods for ooc yte imaging are especially important for clinicians \nworking with limited and valuable material such  as human eggs. Birefringence, which can be \nmeasured using polarized light microscopy, is an  optical property that results from molecular \norder and allows visualization of highly ordered biological structures such as spindles (LIU et \nal., 2000; NAVARRO et al., 2005; PETERSEN et al., 2009). The application of birefringence \nimaging with the Pol-Scope to mammalian eggs and embryos has been described in detail \nelsewhere (KEEFE et al., 2003; PETERSEN et al., 2009). Visualization of the meiotic spindle \nfrom living oocytes may have clinical utilit y for predicting embryo quality and fertilization \nafter ICSI (WANG e KEEFE, 2002; HYUN et al., 2007; PETERSEN et al., 2009). Otherwise, \nidentification of the position of the meiotic spindle relative to the first polar body may prevent \nembryologists from damaging this important ce llular structure during  ICSI (MOON et al., \n2003). Thus, visualization of the me iotic spindle may be used to se lect oocytes to be injected \nby ICSI and might have clinical relevance, particularly in countries where there is a legal limit \non the number of oocytes to be fertilized (P ETERSEN et al., 2009). Despite the benefits of \nthis research, we could not find any literature evaluating the meiotic spindles of living in vivo \nmatured oocytes from infertile patients with endometriosis and comparing them with a control \ngroup. \n\nArtigo Científico \n \n85\nThus, this study has the objective of usi ng polarization micros copy to analyze, \nvisualize and localize the meiotic spindles of mature oocytes from stimulated cycles of \ninfertile women with endometriosis  in vivo  and to compare the findings to a control group \ncomposed of women who are infertile secondary to tubal and/or male factors. \n \nMETHOD \nA prospective study was completed from March 2008 to March 2009 with the  Human \nReproduction Sector of the Gyn ecology and Obstetrics Department of the FMRP-USP. This \nstudy was submitted to and approved by the Res earch Committee. All of  the participating \ncouples underwent ovulation induction for purpose s of ICSI, fulfilled the inclusion criteria, \ndemonstrated a desire to participate in the project and completed an informed consent form. \nPatients with age ≤ 38 years, basal FSH (Follicle stimulating hormone) < 10  mIU/mL \nand BMI (body mass index) < 30 Kg/m² were in cluded. The women with endometriosis were \nincluded when diagnosed by videolaparoscopy acco rding to the protocol from the American \nSociety of Reproductive Medicine (Revised Am erican Society for Re productive Medicine \nclassification of endometriosis:  1996), which classifies the disease in four stages: minimum \n(stage I), mild (stage II), moderate (stage III) and severe (stage IV). Women included in the \ncontrol group did not have pelv ic diseases associated with infertility, as demonstrated by \nvideolaparoscopy. \nPatients with chronic patholog ies or tobacco or alcoholic use disorders and patients \nusing medications that could inte rfere with ovarian foliculogenesis in the two months prior to \nthe beginning of ovulation induction (suc h as NSAIDs anti-inflammatories, and \ncorticosteroids) were excluded. \nSeventy-four patients met th e inclusion criteria for the study. Of these, 43 presented \nwith male and/or tubal factors and were desi gnated as the control group, and 31 presented \n\nArtigo Científico \n \n86\nwith infertility related to endometriosis (16 wi th minimal and mild endometriosis and 15 with \nmoderate and severe endometriosis).  \nThe participating patients underwent p ituitary suppression using a gonadotropin-\nreleasing hormone (GnRHa) analog 10 days prio r to the basal TVUS (long protocol), with \nadministration of leuproliof acetate (Lupron®, Abott, Brazil). The patients received 100 to \n300 IU per day of recombinant FSH (FSHr) (G onal-F®, Serono, Brazil; Puregon®, Organon, \nBrazil) in the first six days of  induction. When at least two folli cles reached a mean diameter \nof 18 mm, the recombinant hC G was administered (Ovidrel®,  Serono, Brazil). The oocyte \ncollection was performed 34 to 36 hours after administration of recombinant hCG.  \nAll of the material aspirate d during oocyte collection was analyzed to identify and \nisolate the cumulus-oocyte complexes. After identification, the cumulus-oocyte complexes \nwere isolated from the follicular fluid (FF)  and placed upon separated plates. The cumulus-\noocyte complexes were careful ly washed in Human Tuba l Fluid-HEPES (HTF, Irvine \nScientific) to remove blood and debris. Subs equently, they were placed upon NUNC plates \n(Multidish 4 wells Nuclon, Delta SI), filled w ith  HTF culture medium , covered with mineral \noil, and subjwected to 5% CO 2 gas incubation under ideal temp erature (37ºC) and humidity \n(95%) conditions for a period of 2-3 hours. Af ter this period, in order to remove the cumulus \noophorus and the corona radiata, the cumulus-oocyte complexes were placed in micro-drops \nof 25 µL of hyaluronidase (H4272 type IV-S, Sigma), diluted in 80 UI/mL of HTF/HEPES \n(Irvine Scientific), for a maximum of 30 sec onds, and then washed 2-3 times with HTF \nmodified medium (HTF/HEPES, Irvine Scientif ic) supplemented with 10% Synthetic Serum \nSubstitute (SSS). The mechanical removal of ce llular debris was done with a Pasteur pipette \n(stripper pipette 130 µm denuding pipette, Cook, Melbourne, Australia). \nAfter oocytic denuding (removal of cumulus oophorus ), the degree of oocyte \nmaturation was identified using a light microscope. The immatu re oocytes (in germinative \n\nArtigo Científico \n \n87\nvesicle stage or metaphase I) were disc arded. The mature oocytes (morphologically \ncharacterized by the presence of an extrusion polar body ) were incubated in  25 µL of HTF + \n10% SSS for one hour (after ooc yte denuding) and then anal yzed by OCTAX ICSI Guard TM \nSystem (Medical Technology Vertriebs-GmbH, Altdorf, Germany) and injected during the \nICSI procedure.  \nThe oocyte cellular spindles with the first pola r body extrusion were evaluated using \nan inverted microscope equipped with a vi deo camera and with the hardware of the \npolarization microscope, which consists of electri c crystals and of an optic-electric controller \n(OCTAX ICSI Guard TM System, Medical Technology Vertri ebs-GmbH, Altdorf, Germany). \nThe electric crystal groups are controlled by the comput er through the OCTAX EyeWare™  \nSoftware (Universal Imaging Corp., Boston, MA). The oocytes were analyzed at 37°C, in 5 µl \ndrops of HTF/Hepes + 10% SSS in coated glass bottom Petri dishes  ( MatTek Corp., Ashland, \nMA), and placed on a surface heated to 37°C.  \nTo control the methodological biases related to non-visualization of the spindle due to \noocyte denuding and metaphase aging, denudi ng was done two to three hours after the \ncellular collection. Subsequently, the oocytes were  placed on the previously balanced culture \nplates in the incubator for one more hour followed by imaging and ICSI. A maximum of \nseven oocytes were analyzed on each plate b ecause the total time, including the time \nnecessary to analyze the cellular spindle by polar ization microscope and  ICSI, was less than \nor equal to 7 minutes. \nThe oocytes with a first visible polar body (PB) were anal yzed by polarization \nmicroscopy and characterized acco rding to the real nuclear matu ration stage (telophase I or \nmetaphase II), the presence or absence of visi ble cellular spindles and the location of the \ncellular spindle in oocytes at metaphase II. The oocytes that  presented with an elongated \ncellular spindle perpendicular to the oocytic membrane and extending to the first PB were \n\nArtigo Científico \n \n88\nconsidered to be in telophase I. The cellular spindles in metaphase II were characterized by \nthe presence of radially distribut ed birefringent fibers in the shape of a barrel and oriented \nparallel to the cortical membrane. Because chromosomes are minimally birefringent, they \nwere not properly analyzed by this methodology. The cellular sp indle localization was based \non the angle formed between this structure and th e fist PB; the oocytes were divided into six \ngroups, as follows: those with spindles making 0 to 30 º angles as related to the first PB, those \nwith spindles making 30 to 60 º angles as relate d to the first PB, those with spindles making \n60 to 90 º angles as related to the first PB, t hose with spindles making 90 to 120 º angles as \nrelated to the first PB, those w ith spindles making 120 to 150 º a ngles as related to the first \nPB, and those with spindles making 150 to 180 º angles as related to the first PB.  \nAt 18 to 19 hours after ICSI, fertilizati on was analyzed and characterized by the \npresence of two pronuclei and tw o polar bodies (the fe rtilization rate calc ulated in the two \nanalyzed groups corresponds to the number of fe rtilized oocytes divided by the number of \ninjected oocytes multiplied by 100). Cleavage was verified around 24 hours after fertilization \nwith the observation of cellula r division. At about 44 hours af ter ICSI (D2), the embryonic \nquality was analyzed and characterized by the symmetry and number of blastomeres, \nfragmentation, and the percentage and presence  or absence of multinuc leation. Good quality \nembryos in D2 were defined as having four blastomeres, being symmetric, having less than \n20% fragmentation and the absence of multinuclea tion. We analyzed the percentage of cycles \nwith at least one good quality embryo formed among the analyzed groups. \n \nStatistical Analysis \nInitially the endometriosis and control gr oups were comparatively analyzed using \nFisher’s exact test with regard to the following parameters: the percentage of oocytes in \ntelophase I, the pe rcentage in metaphase II with visibl e and non-visible cellular spindles, the \n\nArtigo Científico \n \n89\noocytes with cellular spindles localized in the different positions, fertil ization rates, and the \npercentage of cycles producing at leas t one good quality embryo. The endometriosis \nsubgroups (stages I/II and III/ IV) were posteriorly compared  to the variables already \ndescribed by Fisher’s exact test. For comparative analyses of the quantitative variables, the \nunpaired t-test and the Mann-Whitney test were used. The significance level was 5% (p<0.05) \nin all analyses. \n \nRESULTS \nNo significant differences were found am ong the three analyzed groups (control, \nendometriosis I/II and endometrio sis III/IV) in relati on to the total FSH dos e used, the length \nof ovarian stimulation, the number of follicles between 14 and 17 mm, the number of follicles \n≥ 18 mm, the number of collected oocytes, the num ber of mature oocytes, fertilization rate, \nand the percentage of cycles  producing at least one good qual ity embryo transferred in D2 \n(Table 1). \nThere were 326 oocytes with the first visi ble polar body that we re analyzed with \npolarization microscopy, 196 from the contro l group and 130 from the endometriosis group \n(79 from the endometriosis I/II group and 51 from the endometriosis III/IV group). Among \nthe apparently mature oocytes, we observed a significant increase in the percentage of oocytes \nin telophase I (Figure 1A) in the endometriosis III/IV group (7.8% of oocytes in telophase I) \nwhen compared to the contro l (2.5%) and the endometriosis I/II groups (0%). We did not \nobserve a significant difference between the per centage of oocytes in metaphase II with \nvisible (Figure 1B) and non-visi ble (Figure 1C) cellular spindl es among the analyzed groups \n(86.9%, 94.9%, and 91.5%, respectiv ely, in the control, endometr iosis I/II and endometriosis \nIII/IV groups). All of the oocytes  presented a cellular spindle localized between 0° and 90° in \nrelation to the first polar body. We did not obs erve any significant differences in the \n\nArtigo Científico \n \n90\npercentage of oocytes with cel lular spindles localized between  0° and 30° (Figure 1D), 30° \nand 60° (Figure 1E), and 60° and 90° (Fig ure 1F) among the analyzed groups. It is \nnoteworthy that the percentage of oocytes with  cellular spindles loca lized between 60° and \n90º in relation to the first PB was small am ong the three analyzed groups (4.2%, 2.7% and \n4.7%, respectively in the control, endometriosi s I/II and endometriosis III/IV groups) (Table \n2). \n \nDISCUSSION \nWe found controversial AR results for patien ts with endometriosi s, a topic that has \nbeen the focus of several studies and hypot heses in recent years (GARCIA-VELASCO e \nARICI, 1999; GARRIDO et al., 2000). Data from a meta-analysis of ei ght relevant studies \nsuggested that implantation is significantly compromised and embryonic quality is poor in \npatients with endometriosis, possibly refl ecting poor oocyte quality (BARNHART et al., \n2002). Some studies (MANSOUR et al., 2007) have shown significant DNA damage and \nincreased chromosomal anomalies in mature m ouse oocytes when incubated with peritoneal \nfluid from patients with endometriosis. These re sults were attenuated when the culture was \nsupplemented with the antioxidant L-carnitine, sugge sting that oxidative stress is involved in \nthe impaired oocytic quality found in patients  with endometriosis (MANSOUR et al., 2009). \nOther studies evaluating the potential effects of oxidative stress on the meiotic oocytic spindle \nhave demonstrated that it can damage vari ous intracellular proteins (STADTMAN, 1992; \nBERLETT e STADTMAN, 1997). Some of these da maged proteins are important for cellular \nspindle organization (ANTONIO et al., 2000;  FUNABIKI e MURRAY, 2000; ABRIEU et \nal., 2001). The oxidative stress may simultaneous ly or independently damage the DNA and \ncause incorrect chromosomal alignment (BECKMAN e AMES, 1998; LIMOLI et al., 1998; \nLIU et al., 2003; NAVARRO et al., 2004; NAVARRO et al., 2006 ), creating cell cycle \n\nArtigo Científico \n \n91\nanomalies. Meiotic anomalies can contribute to failed cellular development by different \nroutes, ranging from the inabil ity of the oocyte to complete the maturation process, which \nmakes it incapable of being fertilized, to the appearance of variable errors in the meiotic \nmaturation process that do not make fertiliz ation impossible but can compromise embryonic \ndevelopment pre- and/or post-implantation, as well as the future viability of the embryo \n(PAVLOK et al., 1992; LONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001). \nDifferent methodologies can be used to ev aluate the oocyte cellular spindles. Among \nthese, polarization microscopy enables observation and charac terization of birefringent \nstructures in live cells without  the necessity of fixation (P ETERSEN et al., 2009). It is an \ninnocuous method that permits the utilization of the analyzed oocytes for ICSI without \ncompromising subsequent embryonic development.  \nIn this study, the meiotic spindle was visual ized in 89.6% of the examined oocytes, as \nsupported by the data in the literature, where visualization of the cellular spindle can range \nfrom 62.8 to 91% (RIENZI et al., 2003; MADASCHI et al., 2008). The high percentage of \noocytes with visible cellular spindles observed in  the three analyzed groups in this study can \nbe attributed to rigorous me thodological control, including incubating oocytes for one hour \nafter denuding and adequate control of ambient conditions (maintenance of ideal temperature \nand pH and reduction of the time of light  exposure during analyses and time outside \nincubation) (ROBERTS et al., 2002). \nIn relation to the localization of the cellula r spindle, we did not observe significant \ndifference between the groups. Of the total numbe r of oocytes with visible cellular spindles, \n84% were localized between 0° and 30° in re lation to the polar body; the percentage of \noocytes in the three analyzed groups with cellul ar spindles localized between 60° and 90º in \nrelation to the first PB was very small. Studies  in the literature have evaluated the angle \nformed between the polar body and the cellular spindle and concluded that when the angle \n\nArtigo Científico \n \n92\ndoes not exceed 90°, there are no effects on the fe rtilization rates of these oocytes (RIENZI et \nal., 2003; FANG et al., 2007). Therefore, we sugge st that the localizat ion of the oocytic \ncellular spindle in anomalous positions is not a variable responsible for the decreased oocytic \nquality in patients with infertility related to endometriosis. \nOocytes in telophase I have not yet finished  meiosis I, but by optic microscopy, these \noocytes can present with morphological characteristics similar to oocytes that have completed \nmeiosis I and are in metaphase II (HYUN et al., 2007). Among the patients with infertility \nrelated to moderate and severe endometriosis,  the present study demons trates a significant \nincrease in apparently mature oocytes in vivo that were actually in telophase I. These data \ncorroborate recent findings indicating a tendency for a higher proportion of in vitro mature \noocytes obtained from stimulated cycles of patients with endometriosis to be in telophase I, as \ncompared to the control group (BARCELOS et al., 2009). The present finding indicates that \nthe potential delay or impairment of meiosis I in patients with in fertility related to \nendometriosis occurs not only in mature oocytes in vitro, but also in the mature oocytes  in \nvivo. It must be noted that in the present study, this finding was observed only in the subgroup \nof patients with endometriosis III/IV, suggesting that the se verity of disease could be \nassociated with the impaired conclusion of me iosis I and, consequently, with the decreased \noocytic quality. \nSome authors (HYUN et al., 2007) have shown that apparently mature oocytes (with \nfirst visible PB) that were actually in te lophase I according to analysis by polarization \nmicroscopy presented significantly lower fertiliz ation rates when compared to oocytes that \nhad completed meiosis I (15.8% versus 80%, re spectively). We suggest that the increased \npercentage of oocytes in telophase I from the infertile patients with endometriosis III/IV may \ncontribute to the decreased oocytic quality in this group of patients (AL-FADHLI et al., 2006; \nBARCELOS et al., 2009). It is possible that anal ysis of the oocytic nuclear maturation stage \n\nArtigo Científico \n \n93\nmay be used as a prediction factor for the fertil ization rate in this group of patients, which \nneeds to be analyzed in studies with adequa te methodology. On the othe r hand, it is possible \nto postpone oocyte insemination in telophase I in patients with moderate and severe \nendometriosis. This could have a positive im pact on assisted reproduction procedures and \nneeds to be adequately evaluated. \nWe can conclude from this study that sign ificant differences be tween patients with \nendometriosis and control patients (infertility by tubal and/or male factors) were not verified \nvia polarization microscopy in terms of the percentage of oocytes in metaphase II with visible \nand non-visible cellular spindles or in relation to  the spindle localization. However, we saw a \nsignificant increase in the percenta ge of oocytes in telophase I in  patients with endometriosis \nIII/IV, suggesting an impairment of meiosis I. Future studies with a well-delineated \nmethodology will allow the analysis of the real clinical impact of this technique in this \nsubgroup of patients. \n \nAcknowledgments \nThe authors wish to thank the following employees of the Laboratory of Assisted \nReproduction, Department of Gyn ecology and Obstetrics, University Hospital, Faculty of \nMedicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, fo r technical support and for \ncontributing to the execution of  the present study: Maria Ap arecida Carneiro Vasconcelos, \nMarilda Yamada Dantas, Maria Albina Bortoliero, Maria Auxiliadora Pádua Rosa and Sandra \nViana. \n\nArtigo Científico \n \n94\nReferences \n \n1997 Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: \n1996. Fertil Steril 67, 817-821. \nAbrieu A, Magnaghi-Jaulin L, Kahana JA et al. 2001 Mps1 is a kinetochore-associated kinase \nessential for the vertebrate mitotic checkpoint. Cell 106, 83-93. \nAl-Fadhli R, Kelly SM, Tulandi T et al. 2006 Eff ects of different stages  of endometriosis on \nthe outcome of in vitro fertilization. J Obstet Gynaecol Can 28, 888-891. \nAntonio C, Ferby I, Wilhelm H et al. 2000 Xkid, a chromokine sin required for chromosome \nalignment on the metaphase plate. Cell 102, 425-435. \nArmstrong DT 2001 Effects of maternal ag e on oocyte developmental competence. \nTheriogenology 55, 1303-1322. \nBarcelos ID, Vieira RC, Ferreira EM et al. 2009 Comparative analysis of the spindle and \nchromosome configurations of in vitro-matured oocytes from patients with endometriosis and \nfrom control subjects: a pilot study. Fertil Steril 92, 1749-1752. \nBarnhart K, Dunsmoor-Su R, Coutifaris C 2002 Effect of endometriosis on in vitro \nfertilization. Fertil Steril 77, 1148-1155. \nBeckman KB, Ames BN 1998 The free ra dical theory of aging matures. Physiol Rev 78, 547-\n581. \nBerlett BS, Stadtman ER 1997 Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol \nChem 272, 20313-20316. \nBrizek CL, Schlaff S, Pellegrini VA et al. 1995 Increased incidence of aberrant morphological \nphenotypes in human embryogenesis--an association with endometriosis. J Assist Reprod \nGenet 12, 106-112. \n\nArtigo Científico \n \n95\nFang C, Tang M, Li T et al. 2007 Visualization of meiotic spindle and subsequent embryonic \ndevelopment in in vitro and in vivo matured human oocytes. J Assist Reprod Genet  24, 547-\n551. \nFunabiki H, Murray AW 2000 The Xenopus chrom okinesin Xkid is essential for metaphase \nchromosome alignment and must be degraded  to allow anaphase chromosome movement. \nCell 102, 411-424. \nGarcia-Velasco JA, Arici A 1999 Is the en dometrium or oocyte/ embryo affected in \nendometriosis? Hum Reprod 14 Suppl 2, 77-89. \nGarrido N, Navarro J, Garcia-Velasco J et  al. 2002 The endometrium versus embryonic \nquality in endometriosis-related infertility. Hum Reprod Update 8, 95-103. \nGarrido N, Navarro J, Remohi J et al. 2000 Follicular hormonal environment and embryo \nquality in women with endometriosis. Hum Reprod Update 6, 67-74. \nGupta S, Agarwal A, Krajcir N et al. 2006 Ro le of oxidative stress in endometriosis. Reprod \nBiomed Online 13, 126-134. \nHyun CS, Cha JH, Son WY et al. 2007 Optimal  ICSI timing after the first polar body \nextrusion in in vitro matured human oocytes. Hum Reprod 22, 1991-1995. \nJackson LW, Schisterman EF, Dey-Rao R et al. 2005 Oxidative stress and endometriosis. \nHum Reprod 20, 2014-2020. \nKeefe D, Liu L, Wang W et al. 2003 Imagi ng meiotic spindles by polarization light \nmicroscopy: principles and applications to IVF. Reprod Biomed Online 7, 24-29. \nLimoli CL, Hartmann A, Shephard L et al . 1998 Apoptosis, reproductive failure, and \noxidative stress in Chinese hamster ovary cells with compromised genomic integrity. Cancer \nRes 58, 3712-3718. \nLiu L, Oldenbourg R, Trimarchi JR et al. 2000 A reliable, noninvasive technique for spindle \nimaging and enucleation of mammalian oocytes. Nat Biotechnol 18, 223-225. \n\nArtigo Científico \n \n96\nLiu L, Trimarchi JR, Navarro P et al. 2003 Oxid ative stress contributes to arsenic-induced \ntelomere attrition, chromosome instability, and apoptosis. J Biol Chem 278, 31998-32004. \nLonergan P, Monaghan P, Rizos D et al. 1994 Eff ect of follicle size on bovine oocyte quality \nand developmental competence following matura tion, fertilization, an d culture in vitro. Mol \nReprod Dev 37, 48-53. \nMadaschi C, de Souza Bonetti TC, de Almeid a Ferreira Braga DP et al. 2008 Spindle \nimaging: a marker for embryo development and implantation. Fertil Steril 90, 194-198. \nMansour G, Abdelrazik H, Sharma RK et al. 2009 L-carnitine supplementation reduces \noocyte cytoskeleton damage and embryo apoptosis induced by incubation in peritoneal fluid \nfrom patients with endometriosis. Fertil Steril 91, 2079-2086. \nMansour G, Radwan E, Sharma  R et al. 2007 DNA damage to  embryos incubated in the \nperitoneal fluid of patients with endometriosis: role in infertility. Fertility and sterility  88, \nS311. \nMoon JH, Hyun CS, Lee SW et al. 2003 Visualiza tion of the metaphase II meiotic spindle in \nliving human oocytes using the Polscope enab les the prediction of embryonic developmental \ncompetence after ICSI. Hum Reprod 18, 817-820. \nNavarro PA, Liu L, Ferriani RA et al. 2006 Arsen ite induces aberrations in meiosis that can \nbe prevented by coadministration of N-acetylcysteine in mice. Fertil Steril 85 Suppl 1, 1187-\n1194. \nNavarro PA, Liu L, Keefe DL 2004 In vivo effect s of arsenite on meiosis, preimplantation \ndevelopment, and apoptosis in the mouse. Biol Reprod 70, 980-985. \nNavarro PA, Liu L, Trimarchi JR et al. 2005 Noninvasive imaging of spindle dynamics \nduring mammalian oocyte activation. Fertil Steril 83 Suppl 1, 1197-1205. \n\nArtigo Científico \n \n97\nPavlok A, Lucas-Hahn A, Niemann H 1992 Ferti lization and developmental competence of \nbovine oocytes derived from different  categories of antral follicles. Mol Reprod Dev  31, 63-\n67. \nPellicer A, Oliveira N, Ruiz A et al. 1995 E xploring the mechanism(s) of endometriosis-\nrelated infertility: an anal ysis of embryo development and implantation in assisted \nreproduction. Hum Reprod 10 Suppl 2, 91-97. \nPetersen CG, Oliveira JB, Mauri AL et al. 2009 Relationship between visualization of meiotic \nspindle in human oocytes and IC SI outcomes: a meta-analysis. Reprod Biomed Online  18, \n235-243. \nRienzi L, Ubaldi F, Martinez F et al. 2003 Relationship between meiotic spindle location with \nregard to the polar body position and oocyt e developmental potential after ICSI. Hum Reprod \n18, 1289-1293. \nRoberts R, Franks S, Hardy K 2002 Culture  environment modulates maturation and \nmetabolism of human oocytes. Hum Reprod 17, 2950-2956. \nStadtman ER 1992 Protein oxidation and aging. Science 257, 1220-1224. \nWang WH, Keefe DL 2002 Predic tion of chromosome misalignment among in vitro matured \nhuman oocytes by spindle imaging with the PolScope. Fertil Steril 78, 1077-1081. \n \n \n\nArtigo Científico \n \n98\nFigure legend \n \nFigure 1. Birefringent spindles in  living human oocytes imaged w ith the Polscope just before \nICSI. (A) Birefringent spindles  at Telophase I stage. (B) Oo cytes had visible spindles at \nMetaphase II stage. (C) Oocytes had no visible spindles at Metaphase II stage. (D) Oocytes \nwith the spindle located between 0° and 30° relative to the polar body. (E) Oocytes with the \nspindle located between 30° and 60° relative to the polar body. (F) Oocytes with the spindle \nlocated between 60° and 90° relative to the polar body. \n \n \n \n \n\nArtigo Científico \n \n99\n \n \n \n \n Endometriosis Variables Control \n   I – II          III – IV \np \nvalue \n \n33.4 ± 3.4 \n \nAge (years)  \n \nNumber of patients  \n \n43 \n \n33.6 ± 2.9 \n \n16 \n \n33.1 ± 3.6 \n \n15 \n \n \nNS \n \n- \nNumber of initiated cycles  \n \n49 20 18 - \nTotal FSH Dose (UI) 1987 ± 654.7 1868 ± 476.3 2183 ±702.5 NS \nLength of ovarian stimulation (days) 9.1 ± 1.6 8.4 ± 1.1  9.2 ± 1.6 NS \nFollicles 14-17 mm 4.3 ± 2.4 3.6 ± 1.8 3.6 ± 3.4  NS \nFollicles ≥ 18 mm 2.7 ± 1.7 3.2 ± 1.7 3.4 ± 2.3 NS \nNumber of cycles with oocytes retrieval \n \n47 \n \n18 16 \n \n- \nRetrieved oocytes 6.4 ± 3.7 6.0 ± 3.8 5.1 ± 3.4 NS \nNumber of mature oocytes 5.0 ± 3.2 4.9 ± 2.7 3.6 ± 2.6 NS \nFertilization Rate (%) 80 (156/195) 79.7 (63/79) 72.9 (35/48) NS \nNumber of cycles with transfer \n \n45 \n \n18 \n \n14 \n \n- \n% of cycles with at least one good quality \nembryo transferred in D2 \n \n28.9 (13/45) 33.3 (6/18) 28.5 (4/14) \n \nNS \nLegend: \nMean ± standard deviation/ NS: non-significant (p > 0.05) \nMature oocytes: oocytes with first visible polar body; Fertilization Rate: number of fertilized oocytes /number \nof injected oocytes x 100; % of cycl es with at least one good quality em bryo transferred in D2: number of \ncycles with at least one embryo with four symmetrical  and without D2 fragmentation cells/number of cycles \nwith transfer x 100 \n \n \nTable 1: Comparison of the pa rameters of controlled ovari an stimulation and results o f \nintracytoplasmatic injection of spermatids (ICSI) into infertile women with endometriosis and \ncontrol (tubal and/or male factors) \n\nArtigo Científico \n \n100\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nEndometriosis  Variables Total \n \nControl \n \nI – II          III – IV  \np \nvalue \n \n \n Nuclear Maturation \n - Telophase I (%) \n \n \n2.8 (9/326) \n \n \n2.5 (5/196) \n \n \n0 \n \n \n7.8 (4/51) \n  \n \n0.02 \n - Metaphase II (%) \n \n97.2 (317/326) 97.4 (191/196) 100 (79/79) 92.1(47/51)  NS \nSpindle visualization \n - Non visible (%)   \n \n10.4 (33/317) \n \n13 (25/191) \n \n5.0 (4/79) \n \n8.5 (4/47) \n  \nNS \n - Visible (%)  89.6 (284/317) 86.9 (166/191) 94.9 (75/79) 91.5 (43/47)  NS \n \nSpindle Localization \n -  0° – 30° (%) \n - 30° – 60° (%) \n - 60° – 90° (%) \n \n \n \n83.8 (238/284) \n12.3 (35/284) \n3.9 (11/284) \n \n \n85.5 (142/166) \n10.2 (17/166) \n4.2 (7/166) \n \n \n78.6 (59/75) \n18.6 (14/75) \n2.7 (2/75) \n \n \n \n86 (37/43) \n9.3 (4/43) \n4.7 (2/43) \n \n  \n \nNS \nNS \nNS \n \nLegend:  \n      \nNS: non-significant (p > 0.05) \nMature oocytes: oocytes with first visible polar body  \n \n \n \nTable 2: Non-invasive analysis of mature oocytes from stimulated cycles of infertile patients with \nand without endometriosis (tubal and /or male factors).","source_license":"CC0","license_restricted":false}