Avaliação de marcadores relacionados à transição epitélio-mesênquima na endometriose pélvica

Poppe A.C.M. Evaluation of markers related to epithelial-mesenchymal transition in the patients with pelvic endometriosis [dissertação]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2013.

Endometriosis is a common gynecological disease def ined as the presence of ectopic endometrial glands and stroma o utside the uterine cavity, and its pathogenesis is not well established. The epithelia l to mesenchymal transition (EMT) is a process consisting of a series of changes in the phenotype of epithelial cells that make these cells assume the characteristics of mesenchym al cells. As observed in the EMT, endometrial cells in the context of endometriosis h ave the capacity of migration, invasiveness and high resistance to apoptosis. . Th e adhesion molecules have become progressively relevant in EMT, in view of the cell- to-cell adhesion loss, with increased invasion and metastasis. The goal of this study was to investigate the expression of markers related to EMT in superficial, ovarian and deep endometriosis. Patients and Methods: 103 women were selected who met the inclusion crit eria, constituting two independent study groups: 18 women with peritoneal, ovarian and deep concomitant endometriosis, 85 women with ovarian an d / or deep endometriosis, divided in 44 women with ovarian endometriosis and 41 with intestinal endometriosis. Through immunohistochemical reactions, the protein expression of e-cadherin, n- cadherin, beta-catenin, estrogen receptor and proge sterone receptor markers were evaluated in tissues of interest in each study grou p. In addition to the sites of the disease, menstrual phase and histological classific ation (well-differentiated, undifferentiated, mixed pattern and stromal) of the disease were recorded.

The ovarian endometrisis showed less n-cadherin mar ker than lesions of the peritoneum and bowel (p=0,032). Ovarian endometrios is also showed markedly decreased expression of estrogen and progesterone r eceptors in epithelial cells, compared with peritoneal and deep endometriosis (p= 0,002; p=0,48). The expression of N-cadherin showed a direct correlation with estroge n receptor expression in the stroma of bowel endometriosis (p = 0.036).

These results suggest that epithelial to mesenchym al transition involved in the pathogenesis of endometriosis, demonstrating th at the ovary disease behaves differently disease than peritoneal and deep diseas e, so that the n-cadherin is an important factor involved in this process, possibly influenced by the action of estrogen. Descriptors: Endometriosis, epithelial-mesenchymal transition, E -cadherin, N- cadherin, beta-catenin, Estrogen Receptor and Progesterone Receptor. SUMÁRIO Lista de figuras Lista de tabelas INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 16 1. Endometriose ................................... .............................................................................. 16 1.1 Etiopatogenia ................................. ................................................................................ 18 2. Transição epitélio-mesênquima .................. ................................................................. 20 2.1 E-caderina, n-caderina e beta-catenina......... .............................................................. 23 2.2 Receptor de estrogênio e receptor de progestero na ................................................... 25 3. Transição epitélio-mesênquima e câncer ......... ........................................................... 28 4. Transição epitélio-mesênquima e endometriose ... ...................................................... 29 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 33 PACIENTES E MÉTODOS .................................................................................................. 35 Análise estatística. ............................. ............................................................................ 44 RESULTADOS. ...................................................................................................................... 46 DISCUSSÃO. .......................................................................................................................... 60 CONCLUSÃO. ........................................................................................................................ 69 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ................................................................................ 72 ANEXOS. ................................................................................................................................ 84 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Fatores indutores da TEM fazem com que a s células epiteliais percam as junções aderentes, induzindo a perda da polaridade celular, e consequentemente a constrição apical, a remodelação do citoesqueleto celular, a desorganização da membrana basal e por f im, possibilitando que ocorra a migração através da matriz extracelula r e a invasão de tecidos adjacentes. (Fonte: figura adaptada de Acloque et al, 2009) .............. 22 Figura 2 - Células epiteliais normais possuem junçõ es aderentes que são formadas por caderinas (e-caderina ou n-caderina), cateninas (beta-cateninas) e actina, além de complexos de polaridade apical e in tegrinas que interagem com a membrana basal. (Fonte: figura adap tada de Acloque et al, 2009) .......................................................................................................... 24 Figura 3 - Representação esquemática da dinâmica do estudo. ...................................... 38 Figura 4 - Classificação da endometriose proposta p ela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) (revisada em 1996). ..................................... 40 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Características dos anticorpos relacionados avaliados ............................................ 41 Tabela 2 – Descrição da idade, paridade, IMC, estádio, sintomas e infertilidade das pacientes de acordo com os três grupos de estudo. .................................................... 46 Tabela 3 - Avaliação das medianas da fase do ciclo menstrual nas pacientes com endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes (grupo 1). .................. 48 Tabela 4 - Avaliação das medianas da fase do ciclo menstrual nas pacientes com endometriose ovariana (grupo 2A). ............................................................................ 49 Tabela 5 - Avaliação das medianas da fase do ciclo menstrual nas pacientes com endometriose intestinal (grupo 2B). ........................................................................... 49 Tabela 6 - Comparação da expressão proteica da n-caderina, e-caderina e beta- catenina nos diferentes sítios de doença e no epitélio e estroma nas pacientes do grupo 1 (endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes). ............. 50 Tabela 7 - Comparação da expressão proteica da n-caderina, e-caderina e beta- catenina nos diferentes sítios de doença e no epitélio e estroma nas pacientes dos grupos 2A e 2B (endometriose ovariana e intestinal independentes). ................. 52 Tabela 8 - Comparação da expressão proteica dos receptores de estrogênio e progesterona nos diferentes sítios de doença e no epitélio e estroma nas pacientes do grupo 1 (endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes)............................................................................................................ 53 Tabela 9 - Comparação da expressão proteica dos receptores de estrogênio e progesterona nos diferentes sítios de doença e no epitélio e estroma nas pacientes dos grupos 2A e 2B (endometriose ovariana e intestinal independentes). ........................................................................................................... 54 Tabela 10 - Avaliação das medianas da expressão proteica dos marcadores de acordo com a classificação histológica da endometriose nas pacientes com endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes (grupo 1). .................. 56 Tabela 11 - Avaliação das medianas da expressão proteica dos marcadores de acordo com a classificação histológica da endometriose nas pacientes com endometriose ovariana (grupo 2A). ............................................................................ 57 Tabela 12 - Avaliação das medianas da expressão proteica dos marcadores de acordo com a classificação histológica da endometriose nas pacientes com endometriose intestinal (grupo 2B). ........................................................................... 57 INTRODUÇÃO Introdução 16 1. Endometriose A endometriose é uma doença caracterizada pelo impl ante de tecido do tipo endometrial, células epiteliais e/ou estromais, em regiões extrauterinas e é considerada como uma das principais causas de dor pélvica e inf ertilidade em mulheres em idade reprodutiva, (Olive; Pritts, 2001; Giudice; Kao, 20 04). Acomete com mais frequência ovários e ligamentos útero-sacros e também pode afetar porções do tubo digestivo ou do trato urinário, tendo sido descrita até mesmo em sítios fora da cavidade abdominal como pulmão e cérebro (D’Hooghe; Debrock, 2002; Donnez; Langendonckt, 2004). Estima-se que esta doença afete de 10 a 15% da popu lação feminina na menacme, o que significa cerca de 7 milhões de mulheres nos Estados Unidos, e de mais de 70 milhões no mundo, sendo uma das principais causas d as hospitalizações por causas ginecológicas (Giudice; Kao, 2004; Vercellini et al , 2007). Entretanto, por ser uma doença com difícil diagnóstico e tratamento, a endo metriose causa grande morbidade às mulheres portadoras da doença, pois as mesmas podem percorrer hospitais e consultórios por até sete anos até que o diagnóstic o e tratamento adequados sejam estabelecidos (Arruda et al., 2003). Desde as primeiras descrições da doença realizadas por Von Rokitansky (1860), a endometriose tem se mostrado uma doença de difícil abordagem diagnóstica e terapêutica. Apesar de diversos estudos tentarem en contrar métodos não invasivos que permitam o diagnóstico e o tratamento da doença, es tes ainda dependem de métodos invasivos, como a vídeo-laparoscopia que possibilit a o diagnóstico definitivo pela visualização e exérese da lesão e sua subsequente c onfirmação histológica (Podgaec et al., 2007). Na tentativa de esclarecer aspectos ainda obscuros como sua etiologia, os fatores de risco de desenvolvimento da doença e sua relação com a infertilidade, a endometriose tem sido amplamente estudada nos últim os 20 anos em relação a seus aspectos clínicos, etiopatogênicos e suas repercuss ões à qualidade de vida da paciente (Abrão et al., 2003; Abrão et al., 2004; Pupo-Nogueira et al., 2007). Dismenorreia, dispareunia profunda, dor pélvica crô nica, sangramento anormal e infertilidade são os principais sintomas associados à endometriose (Kennedy et al., 2005). Sintomas intestinais como disquezia, hematoq uezia, obstipação intestinal e distensão abdominal, além de sintomas urinários com o disúria e hematúria também Introdução 17 podem ocorrer dependendo da localização das lesões (Abrão et al, 2009; Kennedy et al., 2005; Podgaec et al, 2007). De acordo com Eskenazi et al (2001), a presença de um entre os principais sintomas (dismenorreia, dispareunia, infertilidade, dor acíclica, alterações urinarias ou intestinais cíclicas) apresenta 76% de sensibilidad e e 58% de especificidade no diagnóstico da doença. Sendo a dismenorreia o sinto ma predominante, manifestando-se em diferentes intensidades, a infertilidade secunda ria à efeitos inflamatórios, a dor acíclica decorrente de aderências, inflamação e inf iltração de feixes nervosos, e as queixas urinárias e gastrointestinais são cíclicas pois apresentam intensidade maior em determinado período do ciclo menstrual (Eskenazi et al, 2001; Wu et al, 2002; Siristatidis et al, 2006). Baseado na observação de diversos aspectos da doenç a, Nisolle e Donnez (1997) propuseram que a endometriose se apresenta como trê s doenças distintas, com diferentes patogêneses: doença peritoneal, ovariana e endometriose de septo retovaginal. A doença peritoneal, ou superficial, c onsiste na presença de focos superficiais da doença; a doença ovariana inclui im plantes superficiais ou cistos ovarianos conhecidos como endometriomas ou “cistos chocolate“ e a doença de septo retovaginal corresponderia a doença profunda, com m ais de 5mm de profundidade, acometendo o compartimento posterior da pelve. (Nis olle; Donnez,1997; Dias et al., 2006). A Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM ) estabeleceu classificação para a endometriose, dividindo-a em q uatro estádios (I-IV) resultantes da quantificação de pontos de acordo com a quantidade e tamanho dos focos de doença, e com a presença de aderências, sendo o estádio IV o mais avançado (Revised American Society for Reproductive Medicine, 1996). Quanto às características morfológicas, a endometri ose se mostra uma doença bastante heterogênea, podendo ser encontrada como i mplantes polipóides, como estruturas císticas, ou como invasões do tecido con juntivo sub-peritoneal, ou apresentar lesões fibróticas e inflamatórias (Carvalho; Abrão, 2000). Na interface entre o foco do tecido heterotópico e o tecido do órgão acometido, podem ser encontradas células fibroblásticas, musculares, endoteliais e hemosside rófagos como sinais de hemorragia (Kamergorodsky et al., 2009). Introdução 18 A classificação histológica possui uma relevante im portância no entendimento da doença, podendo fornecer informações adicionais com relação ao prognóstico da doença de acordo com o grau de semelhança das lesões com o endométrio tópico (Abrão et al, 2003). A partir do entendimento de que o tecido end ometrial é dividido em dois componentes: estroma e epitélio, classificou-se o t ecido epitelial em padrões bem diferenciado, indiferenciado e misto, de modo que a doença que apresenta os padrões indiferenciado e misto esteve associada à maior intensidade da dor (Abrão et al., 2003). Embora considerada uma doença benigna, a endometrio se apresenta características semelhantes a uma doença maligna, t ais como, um desregulado crescimento celular, invasibilidade e capacidade de neoangiogênese, podendo se desenvolver como uma doença local ou apresentar div ersos focos associados, o que sugere que ocorra uma mobilidade de suas células (A brão et al, 2006; Thomas; Campbell, 2000a; Thomas; Campbell, 2000b). 1.1 Etiopatogenia Diversos estudos estão se concentrando na busca dos mecanismos pelos quais determinadas mulheres desenvolvem a endometriose, o que poderia contribuir para uma melhor abordagem no diagnóstico e tratamento (Giudi ce; Kao, 2004). Neste contexto, algumas teorias para explicar o desenvolvimento da endometriose foram propostas, embora nenhuma delas consiga explicar completamente a etiopatogenia da doença. Dentre as teorias, duas correntes de hipóteses etio patogenicas se destacam há quase um século: a teoria da metaplasia celômica (Meyer, 191 9), e a teoria da menstruação retrógrada (Sampson, 1927). A teoria da metaplasia celômica, de Meyer (1919), c ontribuiu para tentar elucidar a etiopatogenia da endometriose, sugerindo que os f ocos de endométrio ectópico se originam por meio da diferenciação de células epite liais em células características do tecido endometrial. Esta teoria parte do princípio de que o epitélio celômico dá origem a diversos epitélios do corpo humano, entre eles o ep itélio germinativo ovariano, o endométrio e o peritônio. Por terem a mesma origem e por serem constituídos de células pouco diferenciadas, estes epitélios seriam suscept íveis a sofrer transformações patológicas induzidas por estímulos inflamatórios e hormonais, dando origem às células ectópicas do endométrio, e posteriormente às lesões de endometriose (Meyer, 1919). Introdução 19 A teoria da menstruação retrógrada, sugerida por Sa mpson (1927), consiste na implantação das células endometriais em sítios extr auterinos por meio do refluxo do sangue menstrual pelas trompas uterinas para a cavi dade abdominal, o que dependeria de um ambiente hormonal favorável e de condições im unológicas específicas que fizessem com que estas células não fossem eliminada s do local impróprio, já que estima-se que 70 a 90% das mulheres saudáveis apres entam refluxo de sangue menstrual, e nem todas desenvolvem a doença (Weed; Arquembourg, 1980; Missmer; Cramer, 2003; Siristatidis et al., 2006). Evidência s como a localização predominante da doença nos ovários e nos ligamentos útero-sacros, o nde o refluxo de sangue menstrual ficaria acumulado em maior quantidade, reforçam est a teoria (Sampson, 1927; Giudice; Kao, 2004). Contudo, estas teorias não são suficientes para exp licar completamente os casos em que a endometriose acomete sítios distantes, com o diafragma, pulmão, cérebro e nervos periféricos, ou nos raros casos identificado s de endometriose em homens (Donnez; Langendonckt, 2004). Deste modo, outros au tores propõe que o tecido endometrial pode ser disseminado pela via linfática ou ainda pela via hematogênica, Abrão et al (2006) conseguiram identificar células endometriais nos linfonodos em um terço de pacientes com endometriose intestinal. Mais recentemente estudos vêm contribuindo para des vendar os mecanismos etiopatogênicos da endometriose, na tentativa de es clarecer os fatores que levam as células endometriais a sobreviver em um ambiente es tranho, implantar e invadir o epitélio, criar uma neurovascularização local e con tinuar crescendo continuamente (Burney; Giudice, 2012). Entre as linhas de pesquis a, destacam-se as que envolvem fatores genéticos hereditários ou adquiridos que pr edispõe ao desenvolvimento da doença, o sistema imunológico que permite a sobrevivência das células endometriais em um ambiente ectópico e alterações moleculares que e xpliquem a adesão, infiltração e neurovascularização dos tecidos lesionados (Burney; Giudice, 2012). Em condições normais as células endometriais são el iminadas do ambiente ectópico pelo sistema imunológico e a desregulação deste mecanismo parece ser uma das causas do desenvolvimento da endometriose que p ermitiria não só a implantação destas células como o seu continuo crescimento. Alt erações genéticas podem estar presentes tanto nas células do endométrio eutópico como no epitélio peritoneal, como no mecanismo imunológico em questão, podendo ser ad quiridas, como no caso do Introdução 20 endométrio, que por ser um tecido que apresenta gra nde capacidade de renovação celular, se torna vulnerável a erros genéticos; e h ereditária demonstrada pelo risco de desenvolvimento da doença que parece ser seis vezes maior em mulheres com parentes afetadas do que em familiares de mulheres não afeta das pela doença (Burney; Giudice, 2012; Simpson et al, 1980). Diversas moléculas têm sido estudadas para evidenciar a criação de um microambiente que estimula a implanta ção das células ectópicas e as protege da eliminação pelo sistema imunológico, com o por exemplo, as metaloproteinases de matriz (MMPs), os fatores de c rescimento (TGF-beta, VEGF, IGF e EGF), e as interleucinas (Burney; Giudice, 2012). Em todas as teorias descritas acima, a origem e a e volução da endometriose dependeriam da existência de células com caracterís ticas de células menos diferenciadas, que teriam habilidades de migração, adesão, invasibilidade e proliferação, e o mecanismos pelo qual as células endometriais ad quirem estas características no desenvolvimento da endometriose permanecem obscuros. 2. Transição Epitélio-Mesênquima (TEM) Estudos recentes têm relacionado propriedades de ma ior capacidade migratória, capacidade de invasão e elevada resistência a apopt ose que alguns tipos celulares adquirem com um processo biológico denominado trans ição epitélio-mesênquima (TEM) (Kalluri; Neilson, 2003). A TEM consiste de uma serie de mudanças no fenótipo de células epiteliais que fazem com que estas célul as assumam características de células mesenquimais (Kalluri; Weinberg, 2009; Thiery et al., 2009). As células epiteliais e as células mesenquimais são os principais tipos celulares que compõe os organismos multicelulares, diferindo entre si tanto morfológica como funcionalmente. As células epiteliais formam camada s de células justapostas, ligadas entre si por complexos de adesão celular, tight junctions , adherens junctions , gap junctions e desmossomos, e apresentam uma polaridade apicoba sal ligadas à matriz, o que separa o tecido epitelial dos demais tecidos, e as células mesenquimais podem ser encontradas como células individuais movendo-se por toda a matriz, pois não possuem ligações entre si e não apresentam polaridade celul ar (Acloque et al, 2009; Thiery et al, 2009). Introdução 21 Em etapas específicas da embriogênese e do desenvol vimento de órgãos, as células de certos epitélios possuem uma capacidade diferenciada de transformação, de modo que parecem alternar entre as características de células epiteliais e células mesenquimais, ou seja, indo e voltando no processo de transição epitélio-mesênquima (TEM). Esse mecanismo demonstra que esta série de m udanças pode ser reversível, caracterizando também o processo contrário, denomin ado transição mesênquima- epitélio (TME) (Lee et al., 2006; Gomes et al., 2011). Conhecidas por sua plasticidade fenotípica devido a o seu aparente envolvimento com a regeneração de tecidos, as células epiteliais são células justapostas, polarizadas, unidas entre si através complexos de moléculas de a desão, que interagem com a membrana basal dos tecidos através de sua aderência à superfície, formando camadas de revestimento de diversas estruturas do corpo (Zeisberg; Neilson, 2009). Esta plasticidade se deve justamente à possibilidad e da TEM, processo pelo qual as células epiteliais passariam por diversas mudanç as, como a perda da capacidade de adesão celular e da sua polaridade, como o rompimento da membrana basal e constrição apical, que as tornariam fenotipicamente semelhante s às células mesenquimais, com capacidade de locomover-se e de invadir outros teci dos, sofrendo o fenômeno de desdiferenciação, ou seja, um processo em que uma c élula diferenciada, com função especifica, se transforma em uma célula não especia lizada, com caraterísticas mais primitivas (Acloque et al., 2009; Thiery et al., 20 09). Ainda que este comportamento migratório não seja exclusivo das células mesenquim ais, em geral estas células apresentam uma motilidade e plasticidade superior à s células epiteliais, tornando as características de migração e invasibilidade estrei tamente relacionadas a TEM (Gomes et al, 2011; Thompson et al, 2005). A TEM foi identificada em diferentes situações biol ógicas com diferentes funcionalidades, o que levou autores a dividi-la em três subtipos de acordo com o processo em que estão envolvidas (Kalluri; Weinberg , 2009; Zeisberg; Neilson, 2009): a- implantação e a formação do embrião (Kalluri; Ne ilson, 2003; Kalluri; Weinberg, 2009); b- cicatrização e reparação de tecidos lesad os (Iwano et al., 2002); c- comportamento invasivo e metastático de neoplasias (Kiemer et al., 2001). A metástase é um processo que consiste na difusão d e células do tumor e invasão de órgãos distantes (Geiger; Peeper, 2009). Este pr ocesso depende de um conjunto de células especializadas capazes de completar todas a s etapas da cascata metastática, que Introdução 22 inclui a migração do local primário do tumor, a inv asão da membrana basal e estroma local, interação e adesão do endotélio e proliferaç ão em um tecido distante, (Thompson et al, 2005). Além do grande numero de etapas que e stas células têm que cumprir, para cada uma destas etapas da cascata metastática exist em barreiras fisiológicas e imunológicas a serem superadas, o que mostra a comp lexidade deste processo (Bacac; Stamenkovic, 2008; Geiger; Peeper, 2009). Portanto, em diversos estágios do processo de metástase as células têm que passar por alteraçõ es na polaridade celular, alterações na motilidade e alterações nas interações célula-cé lula e célula-matriz, o que relaciona este processo com a TEM, já que estas células aumen tam sua capacidade de motilidade e invasibilidade (Gomes et al, 2011). Diversos estudos vêm demonstrando que uma série de processos moleculares e bioquímicos são necessários para que se inicie e se desenvolva a TEM (figura 1), os quais podem ser ativados por uma associação entre a reparação tecidual e stress, observados em alguns tipos de inflamação (Gomes et al., 2011). Entre estes processos moleculares estão: a ativação de fatores de transcr ição, a alteração da expressão de proteínas específicas de superfície celular, a dimi nuição e aumento de certas proteínas do citoesqueleto, a produção de enzimas de degradaç ão da membrana extra-celular e alterações na expressão de microRNAs específicos (Kalluri; Weinberg, 2009). Figura 1 - Fatores indutores da TEM fazem com que as células e piteliais percam as junções aderentes, induzindo a perda da polarida de celular, e consequentemente a constrição apical, a remodelação do citoesqueleto celular, a desorganização da membrana basal e por f im, possibilitando que ocorra a migração através da matriz extracelula r e a invasão de tecidos adjacentes. (Fonte: figura adaptada de Acloque et al, 2009) Introdução 23 As moléculas de adesão celular são glicoproteínas e xpressas na superfície celular, responsáveis pela conexão entre duas células ou ent re células e a matriz celular. Pelo menos quatro classes de moléculas de adesão são con hecidas: integrinas, selectinas, imunoglobulinas e as caderinas, sendo estas últimas as moléculas que têm adquirido crescente relevância na TEM, pois relaciona-se a pe rda de adesão célula-célula com o aumento da invasão e metástase. De acordo com algun s autores, a perda da função da e- caderina, uma molécula de adesão celular, é um fato r crucial para o processo da TEM (Jeanes et al., 2008; Moreno-Bueno et al., 2008). A lém da e-caderina, outras moléculas de adesão da mesma família, a n-caderina e a beta-c atenina, têm se mostrado com expressão alterada em neoplasias epiteliais infiltr ativas, mostrando as suas importâncias na alteração da capacidade metastática de alguns ti pos de células malignizadas (Qi et al, 2005). As respostas celulares envolvidas no processo da TE M podem ser mediadas por diversos fatores, entre eles, estão os fatores de c rescimento, quimiocinas e citocinas (Gomes et al, 2011). Sendo a endometriose uma doenç a complexa dependente de hormônios esteroides, a alteração nos receptores de estrogênio e progesterona pode ser uma importante influência na mediação da atividade desses hormônios no desenvolvimento da TEM no endométrio tópico e ectóp ico nas mulheres com endometriose (Wang et al, 2013). 2.1 E-caderina, N-caderina e Beta-catenina As caderinas são moléculas localizadas na superfíci e celular, que possuem a função de adesão celular, e são essenciais para man ter a polaridade celular e para o desenvolvimento e arquitetura dos tecidos (Patten e t al, 2010). A e-caderina e a n- caderina se ligam a outra molélula chamada beta-cat enina, que consiste em um componente essencial das aderências epiteliais, poi s liga as caderinas às actinas do citoesqueleto das células epiteliais, constituindo, portanto, uma subunidade do complexo de proteínas denominado ‘junções aderentes ’ (figura 2), atuando como um transdutor de sinal intracelular (Acloque et al, 2009). Introdução 24 Figura 2 - Células epiteliais normais possuem junções adere ntes que são formadas por caderinas (e-caderina ou n-caderina), cateninas (beta- cateninas) e actina, além de complexos de polaridad e apical e integrinas que interagem com a membrana basal. (Fonte: figura adaptada de Acloque et al, 2009) As ‘junções aderentes’, são essenciais para a criaç ão e manutenção das camadas de células epiteliais através do controle do cresci mento celular e da aderência célula- célula e a aderência célula-matriz de diversos teci dos maduros (Goodwin; Yap, 2004). Conforme dito anteriormente, a TEM consiste em muda nças pelas quais células epiteliais adquirem habilidades de células mesenqui mais, como de invasão e migração, que incluem perda das interações célula-célula e da polaridade apico-basal, o que torna as proteínas e-caderina, a n-caderina e a beta-cate nina particularmente relevantes quando se trata da TEM (Yoshida et al, 2012). Especificamente, a diminuição da expressão da e-cad erina parece ser fundamental para a passagem pela TEM, e especula-se ainda que p ossa ser o seu ponto de partida (Jeanes et al., 2008; Moreno-Bueno et al., 2008). E studos têm mostrado que a e- caderina esta reduzida em diversas malignidades hum anas, o que sugere que esta ocorrência resulte em uma disfunção da junção célul a-célula e desencadeie a invasão de tumores malignos (Peinado et al, 2007;. Kalluri; We inberg, 2009; Yoshihara et al, 2009). Alguns sinais já foram identificados como indutores ou participantes da TEM, muitos relacionados com a regulação de fatores de t ranscrição de genes epiteliais, como Introdução 25 os da codificação de e-caderina (Moreno-Bueno et al., 2008), alguns relacionados com a supressão da atividade do promotor de e-caderina, c omo Snail, Slug, Zeb, E47 e KLF8 (Bolos et al., 2003; Wang et al., 2007), e outros r elacionados com a supressão indireta da transcrição da e-caderina, como Twist, Goosecoid , E2.2 e FOXC2 (Yang et al, 2004; Sobrado et al, 2009). Com relação à beta-catenina, em resposta a sinais exógenos, esta proteína pode ser translocada da membrana celular para o citoplasma, onde pode ser degradada ou ainda transportada para o núcleo, podendo influenciar na expressão gênica, associada a diversas vias de sinalização, entre elas a indução da ocorrência da TEM, sendo, portanto, também uma molécula associada à regulação do fenótipo epitelial (Acloque et al, 2009). Quanto à expressão destas moléculas no endométrio t ópico, constatou-se que a e- caderina mostra-se intensa durante todo o ciclo e q ue a n-caderina parece variar entre as fases secretora e proliferativa (Poncelet et al, 2002; Paten et al., 2010). Na endometriose os dados com relação à alteração, o u não, da e-caderina, da n- caderina e da beta-catenina ainda são inconsistente s, de modo que enquanto alguns autores encontraram alterações na expressão destas proteínas, outros não identificaram diferenças significativas (Patten et al, 2010; Mats uzaki; Darcha, 2012; Poncelet et al, 2002; Goodwin; Yap, 2004). 2.2 Receptor de Estrogênio e Receptor de Progesterona Assim como os demais receptores, os receptores de e strogênio e de progesterona são proteínas presentes na membrana, no citoplasma ou no núcleo, que permitem a interação de determinadas moléculas, neste caso os hormônios, com os mecanismos celulares, desencadeando uma serie de eventos, entr e eles, a multiplicação e o crescimento celular. O estrogênio e a progesterona são hormônios crucia is para o controle das funções do endométrio ao longo do ciclo menstrual, regulando a expressão de milhares de genes através da ligação com seus receptores, RE e RP, respectivamente (Kao et al, 2002). Com relação à endometriose, através dos indícios d e que os sintomas da doença aparecem após a menarca e desaparecem após a menopa usa; e de que a interrupção da Introdução 26 ovulação por gravidez, por medicamentos inibidores de estrogênio, contraceptivos orais ou progesterona reduz os sintomas da doença e até m esmo causam uma redução nas lesões; somado aos resultados de pesquisas clinicas , pode-se presumir o importante papel destes hormônios na patologia da doença (Oliv e et al, 2001; Missmer; Cramer, 2003; Kim et al 2013). Pode ser observado ainda, qu e quantidades significativas de estrogênio e progesterona são encontradas na região das lesões, aparentemente produzidas localmente por uma cascata anormal que i nclui aromatase (Bulun et al, 2005). É um consenso entre pesquisadores e médicos de que a endometriose é uma doença complexa dependente de hormônios, na qual, d e acordo com vários estudos, o estrogênio desempenha um papel chave. O fato do cre scimento dos implantes endometriais ser dependente de estrogênio é reforça do pelo aumento dos níveis de estrogênio locais mediados pela aromatase (Noble et al, 1996). Além dos níveis elevados de estrogênio locais, foi observado que a maior expressão do receptor de estrogênio no tecido endometrial esta correlacionado com a progressão da endometriose (Fujimoto et al, 1999; Han et al, 2012). Foi demonstrado em modelos de endometriose em seres humanos e primatas que o estrogênio estimula o crescimento dos implantes, enquanto os inibidores de aromatase, que bloqueiam a formação do estrogênio, e as antiprogestinas tem ação terapêutica, o que tornou a terapia com inibidores de aromatase e inibidores da produção de estrogênio, importantes alternativas para o trat amento da endometriose, demonstrando uma regressão dos implantes e uma redu ção dos sintomas (Attar; Bulun, 2006; Murphy; Castellano, 1994; Ryan; Taylor, 1997; Wang et al, 2013). O receptor de estrogênio desempenha um papel import ante na sobrevivência e manutenção destes tecidos mediando a ação estrogêni ca tanto no endométrio tópico como no ectópico. O receptor de estrogênio (RE) se apresenta em duas formas o RE- alfa e o RE-beta, aparentemente com estruturas e fu nções diferentes, mas é o ER-alfa que possui associação com o aumento da sobrevida gl obal e resposta favorável aos tratamentos clínicos no câncer (Golding et al, 1995; Shaw et al, 2002). A progesterona é um hormônio esteroide essencial p ara as funções reprodutivas femininas, como a gravidez e lactação, ovulação, im plantação, decidualização, parto e desenvolvimento mamário (Gellersen et al, 2009; Xie , 2012). Entretanto, os mecanismos complexos de ação deste hormônio tem sid o difíceis de decifrar, por Introdução 27 diversos motivos, entre eles, pela diversidade de e feitos sobre os diferentes tecidos inclusive efeitos distintos sobre diferentes tipos de células num mesmo tecido, como é o caso das células estromais e epiteliais do endométr io (Kim et al 2013). Do mesmo modo, estudos demonstram que as respostas à progest erona são contraditórias em tecidos normais e doentes, como é o caso do câncer de mama, em que a progesterona parece promover seu crescimento, enquanto no câncer de endométrio estrogênio- dependente, sua ação parece ser protetora (Donnez e t al, 2012; Poole et al, 2006; Heiss et al, 2008; Ishikawa et al, 2010). Sobre a influência da progesterona na origem e des envolvimento da endometriose, os dados são igualmente contraditório s. Primeiramente, a exposição à progesterona induz a diferenciação de células epite liais e estromais, e a proliferação de células estromais durante a fase secretora. (Kim et al 2013) Por outro lado, relacionando-se a endometriose com o câncer de endo métrio estrogênio-dependente, poderia ser dito que a progesterona possui um efeit o protetor na doença, o que pode ser questionado pelas diversas diferenças entre estas p atologias, mas pode ser reforçado pelos estudos que encontraram uma resposta escassa e uma expressão significativamente menor de marcadores relacionados a este hormônio na endometriose (Bulun et al, 2006; Yin et al 2007; Yin et al, 2012 ). Por ultimo pode ser observado que somente cerca de metade das pacientes com endometri ose que receberam algum tipo de tratamento relacionado à progesterona, parece ter a presentado benefícios (Vercellini, 1997; Vercellini, 2011). As ações da progesterona são mediadas através de su a interação com seu receptor (RP), que pode ser encontrado expresso em duas isoformas chamadas RP-A e RP-B, as duas transcritas a partir do mesmo gene, m as com promotores distintos, conferindo-as tamanhos diferentes e, portanto, ativ idades de transcrição diferentes. Entretanto, pelo fato de possuírem grande similarid ade, os estudos costumam compreender as duas formas deste receptor, sem dist ingui-las (Lessey et al, 1983; Kaster, 1990, Kim et al, 2013). Por fim, apesar de os receptores hormonais de estr ogênio e progesterona serem comumente expressos tanto nos tecidos endometriais tópicos quanto nos endometriais ectópicos, o conhecimento acerca da influência dess es receptores na progressão da doença ainda não está completamente claro e pode tr azer importantes contribuições no tratamento da doença. Introdução 28 Noel et al. (2010) investigaram a presença de recep tores de estrogênio e progesterona, não no componente endometrial das les ões, mas no tecido fibromuscular, encontrado na interface entre o tecido acometido pe la doença e o foco de tecido endometrial, e encontraram a presença desses recept ores no músculo liso em lesões de ligamento útero-sacro, bexiga, colón e septo retovaginal. Em um estudo com células epiteliais receptor-de-est rogênio-positivas realizado por Chen et al (2010), o estrogênio induziu alteraç ões morfológicas destas células para um fenótipo semelhante a fibroblastos, passando a e xpressar marcadores de células mesenquimais e apresentando características de migração e invasibilidade. 3. Transição Epitélio-Mesênquima (TEM) e Câncer O envolvimento da TEM na progressão e metástase de doenças neoplásicas tem sido amplamente estudado (Gomes et al, 2011). Autor es encontram cada vez mais evidências de que a TEM desempenha um papel fundame ntal na progressão de tumores e metástase, processo que consiste na difusão de cé lulas do tumor e invasão de órgãos distantes (Bacac, 2008). Alterações na polaridade da célula epitelial e na capacidade de motilidade e invasibilidade celular, características estreitamen te relacionadas com o processo da TEM, são essenciais em várias etapas do processo de metástase, além de que parecem existir diversas moléculas em comum envolvidas em v ias de transdução de ambos os processos, como fatores de crescimento, citocinas, metaloproteinases de matriz, receptores tirosina quinase e microRNAs (Yang, 2008 ; Gomes et al, 2011). Entre os diversos estudos relacionando a TEM com câncer, Alv es et al (2013) investigaram a expressão de um gene chamado Hotair, que tem sido a ssociado com o processo de metástase e com o mau prognóstico em diferentes tip os de tumores, no contexto da TEM e das chamadas células-tronco cancerosas, e sug eriram que a alteração na expressão deste gene esteja envolvido no controle d os múltiplos mecanismos relacionados com o processo da TEM na gênese de tumores. Em conjunto, estes dados sugerem que os fatores env olvidos no processo da TEM possuem um papel essencial na progressão e metástas e de tumores, o que pode vir a ser uma importante alternativa de tratamento da doença (Gomes et al, 2011). Introdução 29 4. Transição Epitélio-Mesênquima (TEM) e Endometriose Até o momento, poucos estudos relacionaram o proces so da TEM com a endometriose. Entre eles, Patten et al (2010) analisaram a expressão da e-caderina, da n- caderina e da beta-catenina por imunoistoquímica, e m 14 casos de endometriose peritoneal, 21 casos de endometriose gastrointesti nal, 3 casos de carcinoma endometrióide de cólon e compararam com 10 casos de endométrio proliferativo, 16 de endométrio secretor e 13 de adenomiose. Este estudo encontrou uma diminuição significativa da expressão da n-caderina nos focos de endometriose peritoneal e profunda qua ndo comparados ao endométrio proliferativo normal, e uma expressão difusa e vari ável da e-caderina tanto em endométrio tópico quanto ectópico. Ainda de acordo com os mesmos autores, existe uma diminuição na expressão da n-caderina no endomé trio secretor quando comparado ao endométrio proliferativo, e os carcinomas endome trióides apresentaram a perda total da expressão de n-caderina (Paten et al., 2010). Já que as caderinas são proteínas cruciais para man ter a aderência celular e a alteração da expressão das mesmas pode estar direta mente relacionada com as características migração e invasão adquiridas pelas células endometrióticas, Patten et al (2010) sugerem que as alterações na expressão da n- caderina encontradas no estudo desempenham um papel relevante na invasibilidade da s lesões de endometriose e possivelmente na evolução para a malignidade. Partindo da premissa de que a diminuição da expressão da e-caderina seja uma das principais evidencias da ocorrência da TEM, Yoshida et al (2012) investigaram a associação entre polimorfismos do gene da e-caderin a e endometriose na população japonesa. Este estudo consistiu na análise de 12 po limorfismos de nucleotídeo único (SNPs), entre eles 7 do gene da e-caderina, 1 relac ionado com a endometriose, 1 associado com a regulação do gene da e-caderina, 1 associado com o câncer de próstata e 2 polimorfismos de nucleotídeo único não-codificantes através da extração de DNA de sangue periférico de 511 pacientes com endometriose e 498 controles. Estes autores encontraram uma diferença na frequência de um alelo em pacientes com endometriose quando comparadas às controles, indicando que fator es genéticos podem estar envolvidos com o risco de desenvolvimento da doença e relacionando esta doença com Introdução 30 uma alteração no gene da e-caderina, um importante fator associado ao processo da TEM (Yoshida et al, 2012). Matsuzaki e Darcha (2012) avaliaram o envolvimento dos processos de TEM e TME na patogênese da endometriose, em lesões de end ometriose peritoneal, ovariana e profunda diferenciando-as em lesões brancas, vermel has e negras. De acordo com estes autores, como o tecido endometrial tem sua origem n a mesoderme intermediária e se transforma, supostamente pelo processo TME, durante o desenvolvimento do sistema urogenital, estas células poderiam conservar alguma s das características de sua origem mesenquimal e serem predispostas a retornar as suas características originais através da TEM (Matsuzaki; Darcha, 2012). Analisando os marcadores citoqueratina, e-caderina, n-caderina, vimentina, S100A4, beta-catenina e PAX8 por imunoistoquímica e m 68 amostras de endometriose profunda, 55 de endometriose ovariana, 76 de endome triose peritoneal, 18 amostras de endométrio tópico de mulheres com endometriose, 14 de endométrio tópico de mulheres sem endometriose, 43 amostras de outros cistos ovar ianos e 13 amostras de endometriose de cicatriz abdominal resultantes de cesariana, Matsuzaki e Darcha (2012) encontraram uma diminuição significativa na express ão de citoqueratina em lesões vermelhas, um aumento de e-caderina em lesões perit oneais negras e profundas, e uma expressão aumentada da proteína beta-catenina em le sões profundas, e um aumento na expressão de vimentina nas lesões peritoneais e pro fundas em comparação com o endométrio tópico e com as lesões ovarianas. Result ados estes que sugerem que a TEM e a TME estejam envolvidas na origem da doença (Mat suzaki; Darcha, 2012). Entretanto, este estudo não realizou a comparação das doenças em uma mesma paciente, não avaliou separadamente os dois componentes celulares da doença, epitélio e estroma. Considerando-se a importância que o processo da TEM vem mostrando na patogênese de diversas doenças e o seu envolvimento em diversos processos biológicos, aliado à aparente semelhança das características ce lulares deste processo com as observadas na endometriose, o pequeno numero de est udos relacionando esses tópicos e na importância da endometriose infiltrativa como fo rma mais severa da doença, propõe- se que a TEM esteja envolvida na etiopatogenia e de senvolvimento dessa doença. O desenvolvimento deste estudo pode contribuir para e lucidar os mecanismos envolvidos no estabelecimento da endometriose, acrescentado in formações ao processo Introdução 31 etiopatogênico, ainda pouco elucidado, podendo perm itir o desenvolvimento de novas estratégias para o diagnóstico precoce e tratamento desta doença. OBJETIVOS Objetivos 33 1. Objetivo Geral: Avaliação dos marcadores relacionados à transição epitélio-mesênquima (TEM) (e-caderina, n-caderina, beta-catenina) e dos recep tores hormonais (estrogênio e progesterona) na endometriose pélvica. 2. Objetivos Específicos: 1) Comparar a expressão proteica dos marcadores da TEM e dos receptores hormonais entre a endometriose superficial, ovarian a e intestinal nas pacientes acometidas com os três tipos de doença concomitantemente. 2) Comparar a expressão proteica dos marcadores da TEM e dos receptores hormonais entre a endometriose ovariana e intestina l nas pacientes acometidas com um dos tipos de doença independentemente. 3) Avaliar a expressão proteica dos marcadores da TEM e dos receptores hormonais nas células epiteliais e nas células estromais dos focos de endometriose. 4) Correlacionar a expressão dos marcadores da TEM e d os receptores hormonais em cada um dos grupos de pacientes com: - a fase do ciclo menstrual; - a classificação histológica da endometriose. 5) Correlacionar a expressão dos marcadores da TEM com a expressão dos receptores de estrogênio e progesterona. PACIENTES E MÉTODOS Pacientes e métodos 35 1. Local do estudo e casuística Este estudo foi realizado no Setor de Endometriose da Divisão de Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. As pacientes propostas foram selecionada s retrospectivamente e consecutivamente entre 2008 e 2013, e constituíram dois grupos de estudo: 18 mulheres com endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes, e 85 mulheres com endometriose ovariana e/ou profunda, dividido em 44 mulheres com endometriose ovariana e 41 com endometriose intestinal, sendo os três grupos de pacientes independentes entre si, ou seja, não existem pacien tes em comum entre eles. O projeto de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética par a Análise de Projetos de Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina d a Universidade de São Paulo, e aprovado sob nº 0547/11 (anexo A). Todas as pacient es assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), autorizan do a inclusão das amostras ao estudo. (anexo B). 2. Critérios de inclusão As pacientes foram selecionadas segundo os seguintes critérios: - mulheres entre 18 e 45 anos, em idade fértil, com períodos menstruais eumenorréicos, com intervalo entre os ciclos variando de 26-34 dias; - ausência de câncer e de doenças auto-imunes, conf irmada por anamnese, exame físico e por exames laboratoriais quando necessário; - não utilização de terapêutica hormonal (análogos do GnRH, progestagênios e contraceptivos hormonais) nos últimos três meses qu e antecederam a coleta das amostras. - mulheres que apresentaram concomitantemente os tr ês tipos de doença: endometriose peritoneal, ovariana e profunda compro vadas histologicamente, para o grupo 1. - mulheres que apresentaram doença ovariana, e/ou i ntestinal comprovadas histologicamente, independentemente, para os grupos 2A e 2B respectivamente. Pacientes e métodos 36 Os dados provenientes das pacientes portadoras de e ndometriose foram considerados após exame histológico (estadiamento, local e classificação histológica) das lesões de endometriose. A história clínica das pacientes e as característic as intra-operatórias da doença foram transcritas em formulário específico e tabula dos para uso posterior na análise dos resultados. 3. Número de Pacientes Considerando-se os critérios de inclusão acima desc ritos, o número de pacientes foi obtido por amostra de conveniência, pelo fato d e que a presença dos três locais de doença concomitantes na mesma paciente não é frequente. Além disso, muitas pacientes não preenchiam os critérios de inclusão em relação ao uso de medicações hormonais, que são utilizados como parte do tratamento da doença. Com isso, de 609 pacientes submetidas à cirurgia de 2008 à 2013, disponíveis para estudo, foram selecionadas as pacientes que se enquadravam nos critérios de inclusão, resultando em: amostras de endometriose p eritoneal, ovariana e intestinal provenientes de 18 pacientes com os três tipos da d oença concomitantemente, e amostras de endometriose ovariana e intestinal prov enientes de 85 pacientes consecutivas que não possuíam as três doenças conco mitantes, sendo 44 amostras de lesão de ovário e 41 amostras de lesão de intestino , de modo que os três grupos são independentes entre si. Grupo 1: - 18 amostras de endometriose peritônio (superficial) - 18 amostras de endometriose ovariana - 18 amostras de endometriose intestinal (profunda) Grupo 2A: - 44 amostras de endometriose ovariana Grupo 2B: - 41 amostras de endometriose intestinal (profunda) Pacientes e métodos 37 Todos os tecidos coletados foram processados e arma zenados em blocos de parafina para posterior análise histológica e imuno-histoquímica. 4. Dinâmica do estudo As pacientes com suspeita de endometriose foram ava liadas pelos sintomas clínicos, por exames laboratoriais e de imagem (ult rassonografia pélvica transvaginal e ressonância magnética, quando apropriado), fazendo parte do estudo aquelas que tiveram indicação de cirurgia para tratamento da doença. Momentos antes da cirurgia, as informações da idade , raça, numero de gestações, índice de massa corpórea e dia do ciclo menstrual foram adquiridas. As fases do ciclo menstrual foram consideradas como: menstru al do 1 ao 4 dia do ciclo, proliferativa do 5 ao 14, e secretória do 15 ao fim do ciclo. Para atingir o objetivo deste estudo, os locais de doença: peritoneal (superficial), ovariana e intestinal (profunda), para o Grupo 1, o variana para o Grupo 2A e intestinal (profunda) para o Grupo 2B, foram considerados para análise dos marcadores proteicos para a avaliação da TEM na endometriose (figura 3). Pacientes e métodos 38 Figura 3 - Representação esquemática da dinâmica do estudo. 4.1 Quadro Clínico As pacientes incluídas no estudo foram questionadas quanto à existência dos sintomas comumente associados à endometriose, são eles: • Dismenorréia: dor em cólica durante o período menstrual, de acordo com a classificação: - Leve, quando a paciente referiu dor que melhora sem utilização de medicação analgésica; - Moderada, quando a paciente referiu dor que melhora com uso de analgésicos; - Severa, quando a paciente referiu que a dor não mel hora completamente com analgésicos, mas não a impede de exercer suas atividades habituais; Pacientes e métodos 39 - Incapacitante, quando a paciente referiu que a dor não melhora e a impede de exercer suas atividades habituais (Eskenazi et al. 2001). • Dispareunia de profundidade: dor pélvica durante a relação sexual. • Dor pélvica crônica: dor pélvica sem relação com o ciclo menstrual por pelo menos seis meses, sem melhora com a utilização de analgésicos. • Alterações intestinais cíclicas: sintomas intestina is durante o período menstrual incluindo aceleração ou diminuição do trâ nsito intestinal, dor à evacuação, puxo, tenesmo e sangramento nas fezes. • Alterações urinárias cíclicas: sintomas urinários d urante o período menstrual incluindo disúria, hematúria, polaciúria e urgência miccional. • Infertilidade: tentativa de engravidar em casal pos suindo vida sexual ativa (2 ou mais relações por semana) sem utilizar método contraceptivo por pelo menos um ano de tentativa. Sendo considerada i nfertilidade primária quando a mulher nunca engravidou, e secundária quan do já possui um filho ou mais. As pacientes avaliaram a intensidade de seus sintom as de acordo com uma escala analógica de dor (anexo C). 4.2 Estadiamento Durante o procedimento cirúrgico, a doença de cada paciente foi classificada pelos critérios estabelecidos pela Sociedade Americ ana de Medicina Reprodutiva (ASRM) (1996), em estádios de I a IV (figura 4). Pacientes e métodos 40 Figura 4 - Classificação da endometriose proposta pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) (revisada em 1996). 4.3 Locais de doença e Classificação histológica As pacientes com endometriose foram avaliadas quant o à presença de focos de doença em peritônio, ovário e/ou profunda (intestin al), e a análise histológica dos tecidos utilizados seguiram os padrões da classificação proposta por Abrão et al. (2003), que divide a doença em dois componentes, estromal e glandular, e classifica o tecido glandular em bem diferenciado, indiferenciado e misto, de acordo com as especificações abaixo: Pacientes e métodos 41 • Componente estromal: presença de estroma morfologic amente similar ao do endométrio tópico em qualquer fase do ciclo; • Componente glandular bem diferenciado: presença de células epiteliais com morfologia indistinguível dos endométrios tópic os nas diferentes fases do ciclo menstrual. Estas células se apresent am em arranjos superficiais ou constituindo espaços glandulares ou císticos; • Componente glandular indiferenciado: presença de ep itélio em diferentes arranjos, sem as características morfológicas vista s no epitélio endometrial tópico; • Componente glandular misto: presença de epitélios d e padrão bem diferenciado e indiferenciado na mesma localização. 5. Método laboratorial: Imunoistoquímica Este processo permite uma compreensão da presença, distribuição e localização de proteínas em células de diferentes tipos de tecidos biológicos, através do principio da ligação especifica de antígenos (proteínas) e anticorpos (Ramos et al, 2005). 5.1 Anticorpos Os anticorpos selecionados para a avaliação imunois toquímica da TEM estão descritos na tabela 1. Tabela 1 - Características dos anticorpos avaliados Antícorpos Clones Fabricante Receptor de estrogênio 1D5 DAKO Receptor de progesterona Pgr636 DAKO Beta-catenina Beta-catenin-1 DAKO N-caderina 6G11 DAKO E-caderina NCH-38 DAKO Pacientes e métodos 42 Para análise do processo de transição epitélio-mesênquima na endometriose foram avaliadas as expressões das moléculas relacionadas à adesão celular: n-caderina, e- caderina e beta-catenina. Além das moléculas de ade são, foram avaliadas as expressões dos receptores de estrogênio (ER) e progesterona (P R), sendo o anticorpo para o receptor de estrogênio com especificidade para o ER -alfa, e o receptor de progesterona tanto para PR-A quanto para o PR-B. Devido às diferentes características entre o tecido estromal e o tecido epitelial contidos nas lesões o que decorre em diferentes exp ressões dos marcadores, e dos papéis diferenciados que estes componentes podem de sempenhar na origem e progressão da doença, esses componentes celulares foram analisados separadamente. O painel imunoistoquímico foi analisado em microscó pio óptico considerando a presença ou ausência de marcação. No caso da presen ça de marcação, verificando a porcentagem de células marcadas, o padrão de distri buição, e a localização celular (núcleo, citoplasma e membrana). Foram utilizados c ontroles positivos e negativos adequados para cada anticorpo. A expressão dos marcadores foi representada em porc entagens de células coradas e posteriormente categorizada para a realização da análise estatística, da seguinte forma: - 0 (sem marcação) - 1 a 10% de marcação - 11 a 50% de marcação - 51 a 80% de marcação - mais que 80% de marcação. 5.2 Reações Os blocos de parafina dos tecidos de interesse das pacientes selecionadas foram localizados, separados, e submetidos à cortes de 3- 5µm de espessura que foram estendidos e colados em lâminas de vidro previament e limpas. Para a seleção e identificação das áreas de interesse dos blocos de parafina, foi realizada uma análise das lâminas coradas com HE (Hematoxilina/Eosina), utilizando-se uma caneta marcadora. A seguir, foram realizadas reações de imunoistoquímica conforme técnica descrita abaixo: - Desparafinização das lâminas deixadas por 24 horas em estufa 60oC: Pacientes e métodos 43 Xilol a 60oC por 20 minutos Xilol à temperatura ambiente por 20 minutos Etanol 100% 30segundos Etanol 85% 30 segundos Etanol 70% 30 segundos - Lavar as lâminas em água corrente e destilada - Ferver a solução tampão citrato 10 mM pH 6.0 em p anela de pressão (Eterna , Nigro) destampada, mergulhar as lâminas e lacrar a panela com a válvula de segurança aberta. Após a saída do vapor saturado, abaixar a v álvula de segurança e aguardar a pressurização total. Cronometrar 4 minutos após ess e sinal. Deixar a panela fechada sob água corrente até a despressurização total. - Destampar a panela com as lâminas e lavar em água corrente e destilada - Proceder ao bloqueio da peroxidase endógena com H 2O2 3%, (água oxigenada 10 vol) com 3 trocas de 10 minutos cada. Lavar em á gua corrente e destilada e com solução salina tamponada com fosfatos (PBS-phosphat e buffered saline) 10mM pH 7.4 por 5 minutos. - Incubar as lâminas com o anticorpo primário diluí do em título pré-estabelecido, em tampão PBS contendo albumina bovina (BSA) 1% (Si gma, A9647, EUA) e azida sódica (NaN3) 0,1%, por 18 horas a 4oC em câmara úmida. - Lavar em tampão PBS com 3 trocas de 3 minutos cada. - Incubar por 30 min a 37° C com Polímero MACH-4™, marca Bio care - Lavar com tampão PBS com 3 trocas de 3 min cada. - Incubar com o Polímero MACH-4™ por 30 min a 37° C - Lavar em tampão PBS com 3 trocas de 3 minutos cada. - Incubar as lâminas em solução substrato: 100 mg% de 3,3’ Diaminobenzidine Tetrahydrochloride (DAB) (Sigma, D-5637, EUA); 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO); 1 mL de H2O2 6% (água oxigenada 20 vol); 100 mL de PBS; por 5 minutos a 37ºC, ao abrigo da luz. - Observar ao microscópio, nas lâminas controles, o desenvolvimento de precipitado castanho dourado, como produto final da reação. - Lavar em água corrente e água destilada por 3 minutos. - Contracorar com Hematoxilina de Harris por 1 minuto. - Lavar bem em água corrente e destilada Pacientes e métodos 44 - Imergir 2 vezes em água amoniacal (solução de hid róxido de amônio 0,5%), lavando em seguida em água corrente e destilada. - Desidratar as lâminas em: Etanol 80%, 30 segundos Etanol 95%, 30 segundos Etanol 100% 2 vezes, 30 segundos cada Xilol 4 vezes, 30 segundos cada - Montagem das lâminas em Entellan neu (Merck, 1.07961, Alemanha). 6. Análise Estatística Foram criadas categorias dos percentuais dos marcad ores e usados os valores percentuais observados para comparação dos marcador es entre os locais da endometriose, entre estroma e epitélio e entre os g rupos ovário e intestino. As comparações dos marcadores entre os locais da endom etriose foram realizadas com uso de testes de Friedman (Kirkwood; Sterne, 2006). Ent re estroma e epitélio foi utilizado teste Wilcoxon pareado separadamente em cada grupo de pacientes e entre os grupos ovário e intestino foi utilizado o teste Mann-Whitney (Kirkwood; Sterne, 2006). Para verificar se havia relação entre os marcadores da TEM com as características fase do ciclo menstrual e classific ação histológica da doença, e entre os marcadores da TEM e os receptores hormonais, foram calculadas as correlações de Spearman (Kirkwood; Sterne, 2006) e comparados entre as categorias com uso de testes Mann-Whitney (Kirkwood; Sterne, 2006) para apenas d uas categorias ou testes Kruskal-Wallis (Kirkwood; Sterne, 2006) para mais de duas categorias. Os testes foram realizados com nível de significância de 5%. RESULTADOS Resultados 46 A avaliação das pacientes foi realizada de acordo com o grupo a que faziam parte e os resultados comparados entre si quando ap ropriado, sendo o Grupo 1 constituído por 18 pacientes com os três tipos de doença concomitantes, o Grupo 2A por pacientes com endometriose ovariana e o Grupo 2B po r pacientes com endometriose intestinal. As pacientes apresentaram média etária de 32, 34 e 35 anos para as pacientes do grupo 1, 2A e 2B respectivamente, e índice de massa corpórea de 22 para o grupo 1 e 23 para os grupos 2A e 2B. A maioria das pacientes apresentaram os graus mais avançados para o estadiamento da endometriose, III e IV, correspondendo a 89% das pacientes no grupo 1, 95% no grupo 2A e 68% no grupo 2B (Tabela 2). Tabela 2 – Descrição da idade, paridade, IMC, estádio, sintoma s e infertilidade das pacientes de acordo com os três grupos de estudo. n % n % n % 18 44 41 32 (21 - 40) 34 (21 - 45) 35 (24 - 45) 0 (0 - 2) 0 (0 - 2) 0 (0 - 4) 22 (18,6 - 27,6) 23 (16,8 - 35,3) 23 (17,2 - 34,5) I e II 2 11 2 5 13 32 III e IV 16 89 42 95 28 68 Dismenorreia 18 100 40 91 40 98 Dor acíclica 9 50 18 41 18 44 Dispareunia 14 78 23 52 24 59 Disquezia 7 39 8 18 21 51 Disuria 1 6 3 7 4 10 8 44 18 41 18 44 * Média IMC: Indice de Massa Corpórea (peso/altura 2 ) EAD: Escala analógica de dor Infertilidade: mulher que não está conseguindo ter filhos há 1 ano ou mais Infertilidade Grupo 2B Grupo 1: mulheres com endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes Grupo 2A: mulheres com endometriose ovariana Grupo 2B: mulheres com endometriose intestinal **Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM ) Características Numero de casos Idade* Grupo 1 Grupo 2A Paridade* IMC* Estádio** Sintomas Clínicos - EAD Resultados 47 Os dados clínicos completos das pacientes participa ntes do estudo utilizados nas análises, encontram-se nos anexos D e E para o grup o 1, F e G para o grupo 2A e H e I para o grupo 2B. A expressão proteica dos marcadores relacionados à transição epitélio- mesênquima: e-caderina, n-caderina, beta-catenina, e dos receptores de estrogênio e de progesterona foram avaliados nos locais de doença d e interesse correspondentes a cada grupo de estudo e em cada um dos componentes celula res das lesões de endometriose, epitélio e estroma. As moléculas de adesão e-caderi na, n-caderina e beta-catenina mostraram-se expressas na membrana das células epit eliais e/ou estromais, e os receptores de estrogênio e progesterona demonstrara m expressão nuclear no epitélio e no estroma das lesões de endometriose. A avaliação da expressão dos marcadores de acordo c om a fase do ciclo das pacientes no momento da cirurgia esta representada na tabela 3 para o grupo 1, na tabela 4 para o grupo 2A e na tabela 5 para o grupo 2B. Resultados 48 Tabela 3 - Avaliação das medianas da fase do ciclo menstrual nas pacientes com endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes (grupo 1). Mentrual Proliferativa Secretora p Mediana Mediana Mediana N-caderina 40 50 0 0,350 E-caderina 100 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 100 >0,999 Receptor de Estrogênio 70 95 100 0,289 Receptor de Progesterona 100 100 100 0,616 N-caderina 20 0 0 0,636 E-caderina 0 0 0 >0,999 Beta-catenina 80 60 50 0,537 Receptor de Estrogênio 90 100 100 0,701 N-caderina 100 50 0 0,580 E-caderina 100 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 100 >0,999 Receptor de Estrogênio 80 90 75 0,210 Receptor de Progesterona 20 80 40 0,496 N-caderina 0 0 0 0,834 E-caderina 0 0 0 >0,999 Beta-catenina 70 55 60 0,539 Receptor de Estrogênio 100 100 100 >0,999 N-caderina 0 0 0 0,459 E-caderina 100 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 100 >0,999 Receptor de Estrogênio 80 100 100 0,281 Receptor de Progesterona 100 100 100 0,779 N-caderina 100 0 0 0,274 E-caderina 0 0 0 >0,999 Beta-catenina 50 80 75 0,545 Receptor de Estrogênio 100 100 100 >0,999 Fase menstrual: 1º ao 4º dia do ciclo Fase proliferativa: 5º ao 14º dia do ciclo Fase secretora: 15º ao fim do ciclo Ovário Epitélio Estroma Intestino Epitélio Estroma Fase do ciclo Marcador Local Peritônio Epitélio Estroma Como pode ser observado na tabela 3 não houve influ ência da fase do ciclo menstrual na expressão dos marcadores no grupo de estudo 1. Resultados 49 Tabela 4 - Avaliação das medianas da fase do ciclo menstrual nas pacientes com endometriose ovariana (grupo 2A). Mentrual Proliferativa Secretora p Mediana Mediana Mediana N-caderina 100 0 50 0,279 E-caderina 100 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 100 >0,999 Receptor de Estrogênio 100 90 90 0,436 Receptor de Progesterona 100 60 45 0,364 N-caderina 70 0 0 0,144 E-caderina 0 0 0 >0,999 Beta-catenina 90 50 70 0,230 Receptor de Estrogênio 100 100 100 0,959 Fase menstrual: 1º ao 4º dia do ciclo Fase proliferativa: 5º ao 14º dia do ciclo Fase secretora: 15º ao fim do ciclo Ovário Epitélio Estroma Fase do ciclo Local Marcador Tabela 5 - Avaliação das medianas da fase do ciclo menstrual nas pacientes com endometriose intestinal (grupo 2B). Mentrual Proliferativa Secretora p Mediana Mediana Mediana N-caderina 100 0 0 0,262 E-caderina 100 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 100 >0,999 Receptor de Estrogênio 100 100 100 0,272 Receptor de Progesterona 100 100 100 0,747 N-caderina 0 0 0 0,724 E-caderina 0 0 0 0,351 Beta-catenina 80 80 55 0,239 Receptor de Estrogênio 100 100 100 0,325 Fase proliferativa: 5º ao 14º dia do ciclo Fase secretora: 15º ao fim do ciclo Fase menstrual: 1º ao 4º dia do ciclo Fase do ciclo Marcador Estroma Epitélio Local Intestino Assim como no grupo 1, as tabelas 4 e 5 ilustram qu e a avaliação da fase do ciclo em relação aos marcadores nos grupos 2A e 2B, endom etriose ovariana e intestinal independentes, não apresentou diferenças significativas. A expressão dos marcadores representada em porcenta gens foi subsequentemente categorizada para melhor análise e com o objetivo d e avaliar se existem diferenças entre as células que constituem o tecido endometrial, epi teliais e estromais, e se existem Resultados 50 diferenças entre os três tipos de doença, superfici al, ovariana e profunda, quanto à expressão das proteínas estudadas, realizou-se uma série de comparações dos resultados das marcações entre os componentes citados (tabelas 6 a 9). A Tabela 6 ilustra os resultados correspondentes à expressão proteica das moléculas de adesão n-caderina, e-caderina e beta-c ateninam para o grupo de estudo de pacientes com as três doenças concomitantes (peritoneal, ovariana e intestinal). Tabela 6 - Comparação da expressão proteica da n-caderina, e-c aderina e beta- catenina nos diferentes sítios de doença e no epité lio e estroma nas pacientes do grupo 1 (endometriose peritoneal, ovar iana e intestinal concomitantes). n % n % n % Epitelio N-Caderina 0,446 0 7 58,3 8 47,1 14 77,8 1 a 10 0 0,0 0 0,0 0 0,0 11 a 50 3 25,0 1 5,9 0 0,0 51 a 80 0 0,0 0 0,0 1 5,6 > 80 2 16,7 8 47,1 3 16,7 Estroma N-Caderina 0,032 0 7 58,3 16 94,1 12 66,7 1 a 10 1 8,3 0 0,0 0 0,0 11 a 50 4 33,3 0 0,0 2 11,1 51 a 80 0 0,0 0 0,0 0 0,0 > 80 0 0,0 1 5,9 4 22,2 p* Epitelio E-Caderina & 0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1 a 10 0 0,0 0 0,0 0 0,0 11 a 50 0 0,0 0 0,0 0 0,0 51 a 80 0 0,0 0 0,0 0 0,0 > 80 17 100,0 16 100,0 17 100,0 p* Epitelio Beta-catenina & 0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1 a 10 0 0,0 0 0,0 0 0,0 11 a 50 0 0,0 0 0,0 0 0,0 51 a 80 0 0,0 0 0,0 0 0,0 > 80 18 100,0 16 100,0 17 100,0 p* & Não foi possível calcular & & & Variável Peritônio Ovário & & & p 0,222 0,007 0,662 Intestino Conforme está demonstrado na Tabela 6, a comparação das marcações entre os locais de doença, peritoneal, ovariana e profunda foi significativamente diferente quanto à n-caderina, que se mostrou menor no estroma do ov ário que no estroma do intestino e Resultados 51 do peritônio (p=0,032). Ainda de acordo com a Tabel a 6, as comparações entre as células epiteliais e as células estromais apresenta ram diferenças significativas: na expressão da n-caderina, que se mostrou maior no ep itélio que no estroma das lesões de ovário (p=0,007). Análises da expressão da e-caderina e da beta-catenina entre o epitélio e o estroma não puderam ser consideradas, pois estes marcadores apresentaram cem por cento de expressão no epitélio dos três tipos de lesão e não foi avaliável no estroma, pois foi observado ausência de marcação. Pelo mesmo motivo, as análises comparativas entre os locais de lesão não foram possíveis de serem avaliadas para estes marcadores. Os resultados para as expressões de n-caderina, e-c aderina e beta-catenina no epitélio e estroma e as comparações entre as lesões de ovário e intestino, nas pacientes com endometriose ovariana e intestinal independente s, estão representadas na tabela 7 correspondendo às análises dos grupos 2A e 2B. Pode ser observado que a comparação entre as lesões ovarianas e intestinais demonstrou que a expressão da n-caderina foi maior no epitélio do ovário do que no epitélio do intestino (p=0,020) e que a comparação entre as células epiteliais e as células estromais, mostrou que esta mesma molécula apresentou maior expressão no epitélio em comparação ao estroma nas lesões de ovário (p<0,001 ), e nas de intestino (p=0,041) (tabela 7). Da mesma forma que ocorreu no grupo 1, as moléculas de adesão e-caderina e beta-catenina, apresentaram cem por cento de marc ação no epitélio das lesões ovariana e intestinal, e ausência de marcação no es troma destes tecidos, impossibilitando as análises comparativas entre os componentes celulares e entre os dois tipos de lesão. Resultados 52 Tabela 7 - Comparação da expressão proteica da n-caderina, e-c aderina e beta- catenina nos diferentes sítios de doença e no epité lio e estroma nas pacientes dos grupos 2A e 2B (endometriose ovariana e intestinal independentes). n % n % Epitelio N-Caderina 0,020 0 17 44,7 26 66,7 1 a 10 0 0,0 1 2,6 11 a 50 4 10,5 4 10,3 51 a 80 1 2,6 2 5,1 > 80 16 42,1 6 15,4 Estroma N-Caderina 0,692 0 35 89,7 34 87,2 1 a 10 1 2,6 0 0,0 11 a 50 1 2,6 2 5,1 51 a 80 1 2,6 1 2,6 > 80 1 2,6 2 5,1 p* Epitelio E-Caderina & 0 0 0,0 0 0,0 1 a 10 0 0,0 0 0,0 11 a 50 0 0,0 0 0,0 51 a 80 0 0,0 0 0,0 > 80 42 100,0 40 100,0 p* Epitelio Beta-catenina & 0 0 0,0 0 0,0 1 a 10 0 0,0 0 0,0 11 a 50 0 0,0 0 0,0 51 a 80 0 0,0 0 0,0 > 80 42 100,0 38 100,0 p* & Não foi possível calcular p <0,001 0,041 Variável Ovário Intestino & & & & Foram realizadas as mesmas análises para a expressã o dos receptores de estrogênio e progesterona, ilustrados nas tabelas 8 para o grupo 1, e tabela 9 para os grupos 2A e 2B. Resultados 53 Tabela 8 - Comparação da expressão proteica dos receptores de estrogênio e progesterona nos diferentes sítios de doença e no epitélio e estroma nas pacientes do grupo 1 (endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes). n % n % n % Epitelio Receptor de Estrogênio 0,048 0 2 11,1 1 6,3 0 0,0 1 a 10 0 0,0 0 0,0 0 0,0 11 a 50 0 0,0 0 0,0 0 0,0 51 a 80 2 11,1 9 56,3 3 18,8 > 80 14 77,8 6 37,5 13 81,3 Estroma Receptor de Estrogênio 0,488 0 2 12,5 1 6,3 0 0,0 1 a 10 1 6,3 1 6,3 0 0,0 11 a 50 6 37,5 3 18,8 6 37,5 51 a 80 5 31,3 11 68,8 6 37,5 > 80 2 12,5 0 0,0 4 25,0 p* Epitelio Receptor de Progesterona 0,002 0 0 0,0 1 7,1 0 0,0 1 a 10 0 0,0 2 14,3 0 0,0 11 a 50 1 5,6 6 42,9 1 5,9 51 a 80 0 0,0 1 7,1 0 0,0 > 80 17 94,4 4 28,6 16 94,1 Estroma Receptor de Progesterona 0,018 0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1 a 10 0 0,0 0 0,0 0 0,0 11 a 50 1 5,6 0 0,0 0 0,0 51 a 80 3 16,7 0 0,0 0 0,0 > 80 14 77,8 16 100,0 17 100,0 p* p 0,317 <0,001 0,091 0,004 Peritônio Ovário Intestino 0,257 0,004 Variável No grupo 1, em que as pacientes possuíam os três ti pos de doença concomitantes, quando se comparou a expressão dos receptores no ep itélio entre os locais de lesão, observa-se que expressão do receptor de estrogênio foi maior no epitélio do intestino e do peritônio do que no epitélio do ovário (p=0,048) , assim como a expressão do receptor de progesterona se mostrou maior no peritô nio e intestino quando comparado ao ovário (p=0,002) (tabela 8). Quando analisado o estroma, o receptor de estrogênio não mostrou diferença significativa, mas o receptor de progesterona se mostrou menor no estroma do peritônio do que no ovário e intestino (p=0,018) (tabela 8). Já na comparação entre os componentes epitélio e es troma, não houve diferenças significativas no ovário para o receptor de estrogê nio, mas houve no peritônio e no Resultados 54 intestino, em que a expressão se revelou maior no e pitélio do que no estroma nos dois tipos de lesão (p<0,001, p=0,004) (tabela 8). O rec eptor de progesterona não se mostrou diferentemente expresso entre epitélio e estroma no peritônio e intestino, somente no ovário, em que se revelou maior no estroma do que no epitélio (p=0,004) (tabela 8). Tabela 9 - Comparação da expressão proteica dos receptores de estrogênio e progesterona nos diferentes sítios de doença e no e pitélio e estroma nas pacientes dos grupos 2A e 2B (endometriose ovariana e intestinal independentes). n % n % Epitelio Receptor de Estrogênio 0,146 0 4 12,5 1 2,7 1 a 10 0 0,0 1 2,7 11 a 50 4 12,5 1 2,7 51 a 80 5 15,6 7 18,9 > 80 19 59,4 27 73,0 Estroma Receptor de Estrogênio 0,269 0 6 16,7 4 11,1 1 a 10 1 2,8 1 2,8 11 a 50 10 27,8 9 25,0 51 a 80 15 41,7 14 38,9 > 80 4 11,1 8 22,2 p* Epitelio Receptor de Progesterona 80 13 37,1 38 97,4 Estroma Receptor de Progesterona 0,901 0 1 2,3 0 0,0 1 a 10 0 0,0 0 0,0 11 a 50 0 0,0 0 0,0 51 a 80 1 2,3 2 5,3 > 80 42 95,5 36 94,7 p* <0,001 <0,001 0,999 Variável Ovário Intestino p Para os grupos 2A e 2B, as comparações da expressã o do receptor de estrogênio entre as lesões de ovário e intestino não mostraram diferenças significativas no epitélio ou no estroma (p=0,146, p=269), mas a expressão do receptor de progesterona Resultados 55 mostrou-se maior no epitélio do intestino do que no do ovário (p<0,001), e não mostrou diferença no estroma (p=0,901) (tabela 9). Ainda em relação aos grupos 2A e 2B, a tabela 9 il ustra que o receptor de estrogênio se mostrou mais expresso no epitélio do que no estroma tanto nas lesões de ovário como nas lesões de intestino (p<0,001, p<0,0 01), e ao contrário, o receptor de progesterona se revelou mais expresso no estroma do que no epitélio do ovário (p0,999). Além das análises acima representadas, correlacion ou-se a expressão proteica dos marcadores selecionados com a classificação his tológica da endometriose sugerida por Abrão et al (2003), com o estadiamento de acord o com a ASRM (1996), e com os sintomas clínicos das pacientes de acordo com uma e scala analógica de dor, de modo que os dois últimos fatores não demonstraram resultados relevantes ao estudo. Com relação à classificação histológica da endomet riose nos locais de doença estudados, a tabela 10 demonstra que no grupo 1 não houve relação com a expressão dos marcadores estudados. Resultados 56 Tabela 10 - Avaliação das medianas da expressão proteica dos marcadores de acordo com a classificação histológica da endometriose nas pacientes com endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantes (grupo 1). E E+I E+M* Mediana Mediana Mediana N-caderina 20 0 0 0,744 E-caderina 100 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 100 >0,999 Receptor de progesterona 100 100 95 0,632 Receptor de estrogênio 100 100 100 0,809 N-caderina 0 0 10 0,624 Beta-catenina 0 0 0 >0,999 Receptor de progesterona 80 50 60 0,335 Receptor de estrogênio 100 90 100 0,205 N-caderina 25 100 0,622 E-caderina 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 >0,999 Receptor de progesterona 50 20 0,175 Receptor de estrogênio 80 80 0,824 N-caderina 0 0 0,232 Beta-catenina 0 0 >0,999 Receptor de progesterona 100 100 >0,999 Receptor de estrogênio 60 70 0,304 N-caderina 0 0 0,747 E-caderina 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 >0,999 Receptor de progesterona 100 100 0,460 Receptor de estrogênio 90 100 0,146 N-caderina 0 0 0,955 Beta-catenina 0 0 >0,999 Receptor de progesterona 100 100 >0,999 Receptor de estrogênio 50 80 0,061 *nenhuma paciente deste grupo apresentou doença E+B D (estroma + epitélio bem diferenciado) Epitélio Estroma p E: estroma E+I: estroma + epitélio indiferenciado E+M: estroma + epitélio misto Intestino Epitélio Estroma Ovário Peritônio Epitélio Estroma Local Marcador Entretanto, com relação aos grupos 2A e 2B, as tabe las 11 e 12 demonstram que houveram diferenças significativas. No grupo 2A (ta bela 11), a expressão da n-caderina no componente estromal do ovário mostrou-se maior n a classificação E+BD (estroma + epitélio bem diferenciado) (p=0,009). No grupo 2B (tabela 12) a expressão da n-caderina no componente estromal do intestino, foi maior na classificação E+BD (estroma + epitélio bem diferenciado) Resultados 57 (p=0,014), e a expressão da beta-catenina no compon ente estromal do intestino, mostrou-se maior também na classificação E+BD (estr oma + epitélio bem diferenciado) (p<0,001). Tabela 11 - Avaliação das medianas da expressão proteica dos marcadores de acordo com a classificação histológica da endometriose nas pacientes com endometriose ovariana (grupo 2A). E E +BD E +I p Mediana Mediana Mediana N-caderina 40 0 35 0,753 E-caderina 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 >0,999 Receptor de progesterona 50 100 50 0,564 Receptor de estrogênio 90 0,531 N-caderina 0 100 0 0,009 Beta-catenina 0 0 0 >0,999 Receptor de progesterona 100 100 100 0,798 Receptor de estrogênio 70 60 0,195 Local Marcador *nenhuma paciente deste grupo apresentou doença E+M (estroma + epitélio misto) E: estroma E+BD: estroma + epitélio bem diferenciado E+I: estroma + epitélio indiferenciado Ovário Epitélio Estroma Tabela 12 - Avaliação das medianas da expressão proteica dos marcadores de acordo com a classificação histológica da endometriose nas pacientes com endometriose intestinal (grupo 2B). E +BD E +I E +M Mediana Mediana Mediana N-caderina 0 0 0 0,656 E-caderina 100 100 100 >0,999 Beta-catenina 100 100 100 >0,999 Receptor de progesterona 100 100 100 0,756 Receptor de estrogênio 100 100 100 0,468 N-caderina 100 0 0 0,014 Beta-catenina 50 0 0 <0,001 Receptor de progesterona 95 100 100 0,343 Receptor de estrogênio 85 70 70 0,356 *nenhuma paciente deste grupo apresentou doença E ( estroma) E+BD: estroma + epitélio bem diferenciado E+I: estroma + epitélio indiferenciado E+M: estroma + epitélio misto p Intestino Epitélio Estroma Local Marcador Resultados 58 Para a análise de uma possível relação entre a exp ressão das proteínas relacionadas à transição epitélio-mesênquima e dos receptores dos hormônios esteroides, objetivou-se realizar uma correlação en tre a expressão de cada um dos marcadores da TEM com cada um dos receptores, entre tanto, conforme ilustrado na tabela 13, somente a n-caderina foi possível de ser correlacionada, pois a e-caderina e a beta-catenina não demonstraram variação de expressã o. Deste modo, de acordo com a tabela 13, a expressão da n-caderina no estroma do intestino apresentou correlação direta com a expressão do receptor de estrogênio (p=0,036). Tabela 13 – Correlação da expressão proteica dos marcadores da TEM (N-caderina, E- caderina e Beta-catenina) com os receptores de prog esterona e de estrogênio nas pacientes com endometriose peritonea l, ovariana e intestinal concomitantes (grupo 1). Receptor de Progesterona Receptor de Estrogênio Receptor de Progesterona Receptor de Estrogênio r -0,488 -0,268 -0,247 0,055 p 0,107 0,400 0,439 0,871 r -0,439 -0,263 -0,222 0,230 p 0,153 0,408 0,488 0,496 r 0,009 -0,069 -0,266 -0,014 p 0,953 0,660 0,052 0,923 r 0,277 0,192 0,076 0,267 p 0,060 0,211 0,582 0,066 r -0,063 -0,051 -0,049 0,007 p 0,646 0,723 0,723 0,963 r -0,162 -0,011 -0,007 0,297 p 0,238 0,937 0,958 0,036 Estroma Epitélio Estroma Local Correlação N-caderina Epitélio Estroma Epitélio Estroma Epitélio Intestino N-caderina N-caderina Peritônio Ovário N-caderina N-caderina N-caderina Com a finalidade de avaliar se a expressão dos marc adores estudados é influenciada pela presença de outros locais de doen ça, realizou-se a avaliação dos marcadores em cada um dos sítios analisados de acor do com os outros locais de acometimento dentro de cada grupo, o que não acresc entou informações relevantes (anexos G, H, I e J). Por fim, nenhuma relação da e xpressão proteica dos marcadores propostos com os parâmetros clínicos das pacientes foi encontrada. DISCUSSÃO Discussão 60 A endometriose é umas das principais doenças ginec ológicas estudadas nas últimas décadas, pois consiste em uma das maiores c ausas de dor e infertilidade em mulheres em idade reprodutiva e devido aos aspectos desafiadores relacionados com a sua etiopatogenia, com a dificuldade no diagnostico e tratamento que ainda dependem de métodos invasivos e com os fatores de risco e mo dos de prevenção que permanecem desconhecidos. Apesar dos enormes esforços por parte de pesquisad ores e médicos no sentido de esclarecer os aspectos obscuros da endometriose, mu itas questões ainda permanecem sem resposta o que demonstra a complexidade desta d oença. Apesar de ser considerada doença benigna, apresenta diversas características em comum com doenças malignas, como se apresentar como uma doença multifocal, o qu e sugere que as células endometriais ectópicas possuam uma capacidade de mi gração para dar origem aos diversos focos da doença na mesma paciente, além po ssuir as capacidades de proliferação, de invasão e de neoangiogênese que fa zem com que as lesões se desenvolvam e sobrevivam nos diferentes tecidos (Ab rão et al, 2006; Thomas; Campbell, 2000A). A transição epitélio-mesênquima (TEM) é um process o reconhecidamente envolvido nas transformações entre células epitelia is e mesenquimais durante o desenvolvimento embrionário, mas somente nos último s anos tem sido identificada como um fenômeno que pode estar relacionado com os processos de invasão e metástase de células malignizadas, pois é um proces so que envolve mudanças celulares como a perda da adesão celular e a remodelação do c itoesqueleto, conferindo à estas células habilidades migratórias e invasivas (Hay, 1 995; Thiery et al., 2006; Acloque et al., 2009). Nesse sentido, o presente estudo teve o objetivo d e acrescentar informações a respeito dos processos envolvidos na origem, desenv olvimento e persistência das lesões de endometriose, para colaborar na busca de melhore s formas de diagnóstico e tratamento da doença, através do estudo da expressão proteica de e-caderina, n-caderina, beta-catenina, receptor de progesterona e receptor de estrogênio em 103 casos de pacientes com endometriose, sendo 18 casos correspo ndentes a pacientes que possuem doença superficial, ovariana e profunda concomitant emente, o que possibilitou uma análise concreta das diferenças entre os três tipos de endometriose proposto por Nisolle e Donnez (1997). Discussão 61 Os casos foram divididos em dois grupos de estudo, conforme ilustrado na Tabela 2, que se mostraram homogêneos quanto à média etári a, paridade e índice de massa corpórea, e semelhantes quanto ao grau de estadiame nto da doença, sendo a maioria das pacientes afetadas pelos graus mais avançados da en dometriose (III e IV), o que corresponde ao esperado, pois as pacientes incluída s no estudo apresentam as manifestações mais graves da doença, quando há o co mprometimento do intestino e/ou do ovário. Quanto aos sintomas, a dismenorréia se confirmou c omo o principal sintoma apresentando pelas pacientes, sendo relatada por ma is de noventa por cento delas. A queixa de disquezia, conforme o esperado, foi maior no grupo 2B, em que as pacientes possuíam lesão intestinal, e os demais sintomas inc luindo a infertilidade, manifestaram- se com frequências semelhantes nos três grupos de e studo (tabela 2) (Eskenazi et al, 2001; Wu et al, 2002; Siristatidis et al, 2006). Uma questão importante que surge na avaliação de a spectos relacionados à endometriose, é que diversos aspectos da doença são alterados de acordo com a fase do ciclo menstrual das mulheres, uma vez que esta seja uma doença hormônio dependente, na qual as lesões são influenciadas pelo ciclo horm onal feminino de modo semelhante ao tecido endometrial normal. Estudos sugerem que haja uma variação na expressão da n-caderina no endométrio tópico entre as fases proliferativa e se cretora, o que poderia significar que a maior expressão de n-caderina na fase proliferativa auxilie a manter a integridade do endométrio para permitir a implantação do embrião, enquanto a expressão reduzida na fase secretora diminua a adesão célula-célula permi tindo descamação do endométrio (menstruação) (Poncelet et al., 2002; Tsuchiya et al; 2006; Patten et al; 2010). Deste modo, uma das preocupações neste estudo foi verificar se haveria alguma alteração na expressão proteica dos marcadores prop ostos nas diferentes fases do ciclo menstrual das pacientes. Conforme ilustrado nas tab elas 3, 4 e 5, a análise realizada entre a variação dos marcadores de acordo com a fas e do ciclo das pacientes no momento da cirurgia não detectou nenhuma diferença significativa, o que possibilitou que as demais análises fossem realizadas independen temente do ciclo menstrual a que as pacientes se encontravam. Os dados com relação a influencia da fase do ciclo menstrual nestes marcadores ainda são contraditórios, mas diversos estudos também não encontram diferenças na expressão dessas moléculas nas lesões de endometriose, entre Discussão 62 eles, Poncelet et al; (2002) e Beliard et al (1997) que analisaram biópsias de endometriose peritoneal, Darai, et al; (1998) que o bservaram lesões císticas de endometriose de ovário e Matsuzaki e Darcha (2012) que estudaram amostras de lesões peritoneais, ovarianas e profundas. Moléculas de adesão e endometriose As moléculas de adesão e-caderina, n-caderina e be ta-catenina têm demonstrado uma crescente relevância em diversos estudos com do enças em que células apresentam a caraterística de motilidade celular, como neoplas ias, pois possuem um papel fundamental na manutenção da estrutura e função de tecidos normais. Quando se trata das lesões de endometriose, é poss ível que alterações na expressão das moléculas de adesão possam conferir c aracterísticas de motilidade e invasibilidade às células endometriais, a perda da função da e-caderina e o aumento da expressão da n-caderina estão sendo relacionadas às transformações no fenótipo de células epiteliais para mesenquimais no processo da TEM (Patten et al.; 2010; Qi, et al.; 2005; Gomes et al.; 2011; Zeitvogel et al., 2001). No presente estudo, a expressão proteica de e-cader ina foi identificada na membrana das células epiteliais das lesões de endom etriose, mas não foi encontrada no componente estromal dessas lesões, o que ocorreu ig ualmente com a molécula beta- catenina. Já a molécula de adesão n-caderina, expre ssou-se na membrana tanto no componente epitelial como nas células estromais, o que não é um resultado inesperado já que diversos estudos vêm identificando a express ão desta molécula em células mesenquimais (Peralta-Soler, 1997; Poncelet, 2002). Neste estudo foi dado especial destaque às compara ções entre os diferentes sítios acometidos pela endometriose concomitantemente nas mesmas pacientes (endometriose superficial, ovariana e profunda). Assim, na tabela 6 onde estão apresentadas as avaliações da expressão dos marcadores relacionados à transição epitélio-mesênquima neste grupo de pacientes, pode ser observado que a expressão proteica de n-caderina foi menor no estroma da endometriose comprometendo o ov ário, em comparação às lesões intestinais e peritoneais, sugerindo que as lesões de endometriose de ovário tenham um caráter menos agressivo, já que a expressão de n-ca derina tem sido vinculada à um aumento na motilidade e invasibilidade de diversos tipos de doenças malignas como no Discussão 63 carcinoma de mama e de próstata e no melanoma (Qi e t al. 2005; Hazan et al, 2000; Tomita et al., 2000). Tal fato pode se justificar pela morfologia das le sões ovarianas, que parecem não apresentar o mesmo potencial de invasão que as lesões presentes em outros sítios, sendo identificadas como formações císticas ou superficia is ovarianas, e não como doença infiltrativa profunda como ocorre em outros locais de doença. Estes resultados confirmam a proposta de Nisolle e Donnez (1997) de que a doença ovariana possui uma patologia diferenciada das doenças superficial e pr ofunda, pois de acordo com estes autores, a doença ovariana cística tem origem a partir da invaginação do córtex ovariano após o acumulo de detritos de sangramento menstrual (Nisolle e Donnez, 1997). Estudos semelhantes que buscaram investigar o envo lvimento da transição epitélio-mesênquima na endometriose, não avaliaram os componentes celulares, epitelial e estromal, separadamente. Matsuzaki e Da rcha (2012) observaram expressão ausente ou escassa de n-caderina no epitélio da end ometriose pélvica, e dividindo as lesões peritoneais em vermelhas e negras, identific aram uma maior expressão de n- caderina no epitélio das lesões vermelhas, sugerind o que estes tipos de lesão representem diferentes estágios da evolução da endo metriose e que as lesões negras possuam uma natureza menos invasiva. Estudando amos tras de endometriose gastrointestinal, Patten et al. (2010) identificara m conservação na expressão da e- caderina e da beta-catenina no epitélio das lesões, e uma diminuição na expressão da n- caderina em comparação ao endométrio tópico. Poncelet et al. (2002), assim como o presente estu do, analisaram as células epiteliais e estromais separadamente e detectaram u ma expressão constante da e- caderina no epitélio do endométrio e uma ausência de expressão nas células estromais, e em adição não identificaram relação da expressão com a fase do ciclo menstrual. Já para a n-caderina, estes mesmos autores observaram uma e xpressão no componente epitelial e no estromal, tanto no endométrio tópico como no e ctópico, mas relacionaram uma variação na expressão desta molécula nas células es tromais com a fase do ciclo menstrual, concluindo que a n-caderina é expressa n a fase proliferativa das lesões, mas é ausente na fase secretora. Neste estudo também foi avaliada a expressão protei ca dos marcadores relacionados à transição epitélio-mesênquima em les ões de ovário e intestino de pacientes diferentes, e foi observado que a n-cader ina foi maior no epitélio das lesões Discussão 64 ovarianas quando comparadas às lesões intestinais, resultado este que pode ter tido influência da avaliação ter sido realizada em pacie ntes diferentes, o que torna este estudo único quando se trata da análise das lesões nas mesmas pacientes. A expressão proteica da e-caderina e da beta-caten ina não se mostraram diferentemente expressas nas lesões de endometriose , nem no grupo de pacientes com os três tipos de lesões concomitantes, nem no grupo com as lesões independentes, de modo que estas moléculas apresentaram expressão con stante no epitélio de todas as lesões de endometriose estudadas, e não mostraram e xpressão nas células estromais, resultados que estão em acordo com outros estudos s emelhantes existentes na literatura, apresentando o comportamento esperado destas molécu las assim como ocorre no tecido endometrial normal (Patten et al.; 2010; Poncelet et al. 2002; Zeitvogel et al.; 2001). Receptor de estrogênio e progesterona e endometriose Já está bem estabelecido que a endometriose é uma doença complexa influenciada pelos hormônios estrogênio e progesterona, e que ta nto os tecidos endometriais tópicos quanto ectópicos expressam os receptores destes hor mônios. Entretanto, o papel que estes hormônios e seus respectivos receptores possu em na origem, desenvolvimento e manutenção da doença permanecem incertos, podendo a tuar como estimuladores do crescimento dos implantes ou como fator de proteção contra a progressão da doença (Olive et al, 2001; Missmer; Cramer, 2003). Desta forma, partindo do principio que a transiç ão epitélio-mesênquima pode ser mediada por diversos fatores moleculares e bioquími cos, o presente estudo buscou avaliar a ação dos hormônios esteroides através da expressão de seus receptores, sugerindo que estes hormônios possam agir como um e stímulo para que as células endometriais desenvolvam as capacidades de motilida de, invasão e proliferação, características estas, relacionadas ao processo da transição epitélio mesênquima. A comparação da expressão proteica dos receptores hormonais entre os locais de doença concomitantes nas mesmas pacientes, demonstr ada na tabela 8, revelou que a endometriose ovariana apresenta uma menor expressão dos receptores de estrogênio e progesterona nas células epiteliais em comparação c om doença peritoneal e intestinal, resultado que foi confirmado na análise da expressã o do receptor de progesterona no Discussão 65 epitélio nas lesões ovarianas e intestinais de paci entes independentes, demonstrado na tabela 9. Corroborando os resultados encontrados no presente estudo, Fujishita et al. (1997) também observaram elevada expressão de receptor de estrogênio (ER) e de progesterona (PR) nos tecidos endometriais ectópico s, tanto no epitélio como no estroma, e esta expressão também não variou de acordo com a fase do ciclo. Em conjunto, as análises das expressões dos recept ores de estrogênio e progesterona nos diferentes tipos de lesão, mostran do que os mesmos se comportam diferentemente nas lesões ovarianas, reforçam os resultados apresentados anteriormente, que demonstram a peculiaridade das lesões de endometriose que acometem o ovário. Moléculas de adesão e Classificação Histológica da endometriose Conforme observado na tabela 10, no grupo de estud o com as três doenças concomitantes, não foram encontradas diferenças sig nificativas nas expressões dos marcadores relacionados à transição epitélio-mesênq uima de acordo com as três classificações histológicas identificadas, sendo as classificações: ‘estromal’, ‘estromal e indiferenciada’, e ‘estromal e mista’. Entretanto, uma possível razão para isto é o fato de este grupo de pacientes não ter apresentado nenhuma doença classificada como ‘estromal e bem diferenciada’, que de acordo com Ab rão et al. (2003) estaria associada ao melhor prognostico da doença, e as pacientes inc luídas neste grupo foram mulheres acometidas com as três modalidades da endometriose concomitantemente, quadro considerado como um dos mais graves. Nas tabelas 11 e 12, na qual é realizada a avaliaç ão dos marcadores de acordo com as classificações histológicas para os grupos 2 A e 2B (doença ovariana e intestinal independentes) pode ser observado que a expressão p roteica da n-caderina na doença classificada como ‘estromal e bem diferenciada’ se mostrou maior quando comparada às outras classificações, tanto nas lesões de ovári o como nas lesões de intestino, assim como houve uma diferença na expressão da beta-caten ina na endometriose intestinal, que também se mostrou maior na classificação ‘estro mal e bem diferenciada’. Estes resultados reforçam que a n-caderina parece ser uma molécula de grande relevância nas lesões de endometriose, podendo trazer informações adicionais com relação ao prognóstico da doença, influenciando a agressividad e, o potencial de migração, Discussão 66 proliferação e invasibilidade que as células das le sões apresentam. (Abrao et al, 2003; Qi et al, 2005). Moléculas de adesão e Receptores Hormonais Contudo, uma análise de grande importância pode ser observada na tabela 13, na qual a expressão proteica das moléculas de adesão f oi relacionada com a expressão dos receptores hormonais, estrogênio e progesterona. Se ndo a endometriose uma doença dependente dos hormônios esteroides, a passagem pel o processo da TEM poderia ser estimulada pela ação destes hormônios, o que seria detectado neste estudo pela relação entre a expressão das moléculas de adesão e a expre ssão dos receptores hormonais. Deste modo, pode ser observado na tabela 13 que a e xpressão da n-caderina foi diretamente proporcional à expressão do receptor de estrogênio, o que pode significar que um aumento da ação deste hormônio esteja envolv ido na mediação do aumento da expressão da n-caderina, o que atribuiria às célula s das lesões de endometriose uma maior capacidade migratória, maior capacidade de in vasibilidade e a elevada resistência à apoptose, reforçando o fato de que este hormônio esteja envolvido patogênese desta doença. Com os rápidos avanços da ciência, trazendo milhar es de novos conhecimentos a todo instante, espera-se que a compreensão dos meca nismos envolvidos na origem e desenvolvimento da endometriose ocorra em breve, fa zendo com que surjam abordagens menos invasivas e mais eficientes de dia gnóstico e tratamento desta doença. O presente trabalho buscou colaborar com o entendim ento de um possível processo envolvido na patogênese da endometriose: a transiçã o epitélio-mesênquima. Através da observação de pacientes com as três modalidades da endometriose concomitantemente, o que possibilitou a comparação da expressão dos ma rcadores propostos entre os locais de lesão, com principal destaque à alteração da mol écula de adesão n-caderina, os resultados encontrados sugerem que a TEM possui um papel importante nos mecanismos de migração, proliferação e invasibilida de que as células desta afecção apresentam. Este estudo mostrou ainda, que a endome triose ovariana apresenta peculiaridades que a faz diferente patologicamente das doenças superficial e profunda. Contudo, são necessários estudos adicionais para en tender o papel que as moléculas Discussão 67 relacionadas ao processo de transição epitélio-mesê nquima desempenham nesta doença complexa e enigmática. CONCLUSÃO Conclusão 69 Diante dos resultados apresentados e discutidos, conclui-se: /xrhombus A avaliação da expressão proteica dos marcadores r elacionados à transição epitélio-mesênquima no grupo de pacientes acometida s por endometriose peritoneal, ovariana e intestinal concomitantemente , demonstraram que a n- caderina foi menos expressa no estroma das lesões d e ovário quando comparada ás lesões de peritônio e intestino, o que indica a pec uliaridade desta manifestação da doença. A expressão da e-caderina e da beta-catenin a não apresentaram alterações, sendo invariavelmente expressas no epitélio e não apresentando nenhuma expressão no estroma de todas as lesões. A expressão proteica dos receptores hormonais revelou que a endometriose ovariana apresenta uma m enor expressão dos receptores de estrogênio e progesterona nas células epiteliais em comparação com doença peritoneal e intestinal. /xrhombus A avaliação da expressão proteica dos marcadores relacionados à transição epitélio- mesênquima no grupo de pacientes acometidas por end ometriose ovariana e intestinal independentes demonstrou a expressão pro teica das moléculas de adesão e-caderina e beta-catenina também não apresentou al terações, mas a n-caderina foi mais expressa no epitélio do ovário do que no epité lio do intestino. Com relação aos receptores hormonais, foi observado que o recep tor de progesterona esta diminuídos das lesões ovarianas em comparação às in testinais, assim como no grupo com as três doenças concomitantes. /xrhombus As variações da expressão dos marcadores propostos entre o componente epitelial e estromal se comportaram de acordo com o esperado pa ra o tecido endometrial tópico, não acrescentando informações à etiopatogenia da endometriose. /xrhombus A expressão proteica dos marcadores propostos; e-ca derina, n-caderina, beta- catenina, receptor de estrogênio e receptor de prog esterona; não é influenciada pela fase do ciclo menstrual das pacientes. /xrhombus A classificação histológica da endometriose não pos sui relação com a expressão proteica dos marcadores e-caderina, receptor de est rogênio e receptor de progesterona, mas a maior expressão da n-caderina e da beta-catenina parece estar relacionada com a classificação ‘estromal e bem dif erenciada’ o que pode estar Conclusão 70 relacionado com o grau de agressividade e consequentemente com o prognóstico da doença. /xrhombus A correlação da expressão proteica das moléculas de adesão e dos receptores hormonais demonstrou uma relação direta da quantida de de n-caderina e do receptor de estrogênio, o que pode demonstrar a imp ortância desta molécula de adesão na progressão da doença possivelmente estimulada pelo estrogênio. 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DOCUMENTO DE IDENTIDADE: SEXO: M F DATA NASCIMENTO: ./ / ENDEREÇO: Nº: APTO: BAIRRO: CIDADE: . CEP: TELEFONE: DDD ( ) ______________________________________________________________________________ _________ II - DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: A TRANSIÇÃO EPIT ÉLIO- Anexos 86 MESÊNQUIMA NA ENDOMETRIOSE. PESQUISADOR: PROF. DR. MAURÍCIO SIMÕES ABRÃO CARGO/FUNÇÃO: PROFESSOR DOUTOR INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº .CRM-SP: 52842 UNIDADE DO HCFMUSP: DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA 2. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: RISCO MÍNIMO RISCO MÉDIO RISCO BAIXO X RISCO MAIOR 3. DURAÇÃO DA PESQUISA : 02 ANOS Anexos 87 HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP 1 – A endometriose é uma doença ginecológica que ac ontece quando o tecido da parte interna do útero (endométrio) se espalha em outros órgãos e regiões do abdômen, tais como: ovário, intestino, bexiga e peritôneo. Esta d oença pode causar dores intensas no abdomen, principalmente cólicas no período menstrua l, comprometendo seriamente a qualidade de vida das mulheres portadoras de endometriose. Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste e studo. O objetivo deste estudo é pesquisar um processo que ocorre nas células (conhe cido como transição epitélio- mesênquima), que possivelmente esteja envolvido no aparecimento da endometriose. 2 – Neste estudo, não serão realizados procedimentos experimentais. 3 – A cirurgia de abdômen (laparoscopia) será reali zada nas pacientes que necessitarem de confirmação de diagnóstico de endometriose ou para aquelas que já possuem diagnóstico confirmado e estão fazendo tratamento com medicamen tos. Para essas pacientes, a laparoscopia será realizada com o objetivo de trata mento, quando a medicação utilizada não consegue diminuir ou eliminar os sintomas clínicos provocados pela doença. Será realizado procedimento rotineiro de coleta de tecido (endométrio) no abdômen, durante a cirurgia, para análise do tipo de endomet riose, fazendo parte do diagnóstico ou tratamento de sua doença. Neste mesmo material cole tado aproveitaremos para pesquisar o processo citado acima. Os dados do seu prontuário m édico, referentes a esta internação, também serão consultados. 4 – Os efeitos adversos da cirurgia serão aqueles r elacionados ao procedimento de laparoscopia: como sonolência e náuseas causadas pe la anestesia geral, leve desconforto abdominal e dor. Todos os efeitos adversos pós-cirú rgicos serão eliminados pela administração de medicamentos específicos (anti-inf lamatórios, anti-eméticos, analgésicos, antibióticos) no período pós-cirúrgico. 5 – Não há benefício direto para o participante: Tr ata-se de estudo testando a hipótese de que poderemos identificar células que possivelmente estejam envolvidas no aparecimento Anexos 88 da endometriose. Somente no final do estudo poderem os concluir algum benefício para a paciente, ou seja, conhecer melhor a causa da endom etriose e posteriormente contribuir para a escolha do melhor tratamento. 6 – Não há procedimentos alternativos que possam se r vantajosos, pelos quais a paciente possa optar. 7 – Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso a os profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimentos de eventuais dúvidas. O principal investigador é o Dr. Maurício Simões Abrão, que pode ser encontrado no endereço (Hospital das Clínicas – Av. Dr. Eneas de Carvalho, 255 – Divisão de Clínica Gin ecológica, 10° andar, sala 10.166 – São Paulo/SP, Tel.(11) 30.69.66.47). Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comité de Etica em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 – 5° andar, tel: (11)30 .69.64.42, ramais 16, 17, 18 ou 20. FAX: (11)30.69.64.42 – ramal 26. E-mail: [email protected]. 8 – É garantida a liberdade da retirada de consenti mento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à conti nuidade de seu tratamento na Instituição. 9 – As informações obtidas serão analisadas em conj unto com outras pacientes, não sendo divulgado a identificação de nenhuma paciente. 10 – A paciente tem o direito de se manter atualiza da sobre todos os resultados parciais da pesquisa. 11 – Não há despesas pessoais para o participante e m qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação finan ceira relacionada à sua participação. 12 – Os dados obtidos e o material coletado serão u tilizados somente para o estudo em questão. Acredito ter sido suficientemente informado a respe ito das informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo ”A TRANS IÇÃO EPITÉLIO- MENSENQUIMA NA ENDOMETRIOSE”. Anexos 89 HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantia s de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratament o hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu poss a ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. Assinatura do paciente/representante legal Data: ____/____/____ __________________________________ Assinatura da testemunha Data: ____/____/____ ______________________________________ (para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semi-analfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual) Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido desta paciente ou representante legal para a participação neste estudo Assinatura do responsável pelo estudo Data: ____/ ____/____ __________________________________ Dr. Prof. Dr. Maurício Simões Abrão Anexos 90 Anexo C – Escala visual analógica de dor (EAD). A Escala visual analógica de dor (EAD) auxilia na aferição da intensidade da dor no paciente, é um instrumento importante para verif icar a evolução do paciente durante o tratamento e mesmo a cada atendimento, de maneira mais fidedigna. Também é útil para analisar se o tratamento esta sendo efetivo, q ual procedimento tem surtido melhores resultados, assim como se há alguma defici ência no tratamento, de acordo com o grau de melhora ou piora da dor. A EAD pode ser utilizada no inicio e no final de cada atendimento, registrando o resultado sempre na evolução. Para utilizar a EAD o profissional deve questionar o paciente quanto ao seu grau de dor, sendo que 0 sig nifica ausência total de dor e 10 o nível de dor máximo suportado pelo paciente. Anexos 91 Anexo D - Dados demográficos e fase do ciclo menstrual (Grupo 1: N = 18). Código de identificação (N=18) Idade Estatura (m) Peso (Kg) Indice de massa corpórea - IMC FASE DO CICLO MENSTRUAL NA CIRURGIA 264 29 1,65 54 19,83 PROLIFERATIVA 370 35 1,64 57 21,19 PROLIFERATIVA 373 32 1,63 52,5 19,76 SECRETORA 398 30 1,59 70 27,69 NÃO REFERIDO* 417 31 1,67 52 18,65 SECRETORA 425 34 1,58 46,9 18,79 SECRETORA 434 40 1,72 63 21,30 MENSTRUAL 438 38 1,64 59 21,94 SECRETORA 468 35 1,70 70 24,22 NÃO REFERIDO* 469 32 1,69 68 23,81 MENSTRUAL 478 30 1,60 53 20,70 SECRETORA 480 37 1,54 48 20,24 SECRETORA 490 36 1,65 63 23,14 SECRETORA 516 21 1,58 58 23,23 NÃO REFERIDO (PAC VIRGEM)* 561 29 1,72 64 21,63 MENSTRUAL 574 33 1,58 57 22,83 NÃO REFERIDO* 590 31 1,60 63,5 24,80 MENSTRUAL 2035 32 1,58 48 19,23 PROLIFERATIVA * Para as pacientes 398, 468, 516 e 574 não foi pos sível obter a informação do dia do ciclo menstrual. na cirurgia. Anexos 92 Anexo E - Tabulação dos dados clínicos das pacientes do grupo 1. Código de identificação (N=18) Paridade Infertilidade EAD Dismenorreia EAD Dor pélvica acíclica EAD Dispareunia de profundidade EAD Alteração intestinal EAD Alteração urinária 264 0 PRIMARIA 8 0 2 0 0 370 0 PRIMARIA 7 0 2 0 0 373 0 SEM TENTATIVA 10 7 0 10 0 398 0 SEM TENTATIVA 10 5 8 5 0 417 0 PRIMARIA 5 0 0 0 0 425 0 PRIMARIA 9 4 0 0 0 434 0 PRIMARIA 9 6 7 5 0 438 1 NÃO 9 0 5 0 0 468 2 NÃO 9 0 6 0 0 469 0 PRIMARIA 8 0 0 0 0 478 0 PRIMARIA 9 0 4 0 8 480 1 NÃO 9 6 10 9 0 490 0 SEM TENTATIVA 7 8 7 0 0 516 0 SEM TENTATIVA 10 0 0 0 0 561 0 SEM TENTATIVA 5 0 3 5 0 574 0 PRIMARIA 8 6 6 0 0 590 0 SEM TENTATIVA 5 0 7 0 0 2035 0 SEM TENTATIVA 3 1 6 0 0 EAD: escala analógica de dor (0 - 10). Anexos 93 Anexo F - Dados demográficos e fase do ciclo menstrual (grupo 2A: N = 44). Código de identificação (N=44) Idade Estatura (m) Peso (Kg) Indice de massa corpórea - IMC FASE DO CICLO MENSTRUAL NA CIRURGIA 153 32 1,70 66 22,84 MENSTRUAL 174 27 1,71 64 21,89 PROLIFERATIVA 221 25 1,63 75 28,23 SECRETORA 227 29 1,57 73 29,62 SECRETORA 241 30 1,65 59 21,67 SECRETORA 250 45 1,56 51 20,96 PROLIFERATIVA 253 35 1,72 70 23,66 SECRETORA 260 33 1,67 65 23,31 PROLIFERATIVA 265 38 1,78 64,7 20,42 NÃO REFERIDO* 270 43 1,60 55,2 21,56 PROLIFERATIVA 295 31 1,68 63,6 22,53 PROLIFERATIVA 307 34 1,59 80 31,64 SECRETORA 322 29 1,61 58 22,38 NÃO REFERIDO* 348 32 1,63 54 20,32 SECRETORA 366 37 1,74 58 19,16 PROLIFERATIVA 367 45 1,72 70 23,66 SECRETORA 382 35 1,63 54 20,32 PROLIFERATIVA 395 26 1,67 51 18,29 NÃO REFERIDO* 399 29 1,56 54 22,19 PROLIFERATIVA 407 21 1,60 43 16,80 SECRETORA 416 34 1,64 60 22,31 SECRETORA 426 35 1,80 71,1 21,94 SECRETORA 443 34 1,71 54 18,47 SECRETORA 463 32 1,56 49,5 20,34 SECRETORA 486 37 1,51 62 27,19 SECRETORA 491 29 1,69 63 22,06 SECRETORA 494 43 1,70 64 22,15 PROLIFERATIVA 507 30 1,61 62 23,92 SECRETORA 515 28 1,71 58 19,84 SECRETORA 522 39 1,70 84 29,07 SECRETORA 524 37 1,60 50 19,53 SECRETORA 530 45 1,70 56 19,38 PROLIFERATIVA 2018 30 1,58 52,6 21,07 PROLIFERATIVA 2031 31 1,63 56 21,08 PROLIFERATIVA 2033 29 1,65 56 20,57 SECRETORA 2034 34 1,68 60 21,26 SECRETORA 2047 36 1,56 62,1 25,52 NÃO REFERIDO* 2068 28 1,52 42 18,18 SECRETORA 2070 34 1,58 50 20,03 SECRETORA 2078 42 1,58 70 28,04 SECRETORA 2079 39 1,65 66 24,24 SECRETORA 2080 45 1,60 83 32,42 SECRETORA 2083 30 1,69 55 19,26 NÃO REFERIDO* 2095 39 1,56 86 35,34 SECRETORA * Para as pacientes 265, 322, 395, 2047 e 2083 não foi possível obter a informação do dia do ciclo menstrual na cirurgia. Anexos 94 Anexo G - Tabulação dos dados clínicos das pacientes (grupo 2A: N = 44). Código de identificação (N=44) Paridade Infertilidade EAD Dismenorreia EAD Dor pélvica acíclica EAD Dispareunia de profundidade EAD Alteração intestinal EAD Alteração urinária 153 0 PRIMARIA 8 2 2 0 0 174 1 SEM TENTATIVA 7 0 0 7 0 221 0 SEM TENTATIVA 7 6 0 0 0 227 0 SEM TENTATIVA 7 4 7 10 0 241 0 PRIMARIA 0 0 6 0 0 250 2 NÃO 6 0 6 8 0 253 0 PRIMARIA 7 4 4 6 0 260 0 PRIMARIA 8 0 0 0 0 265 1 SECUNDARIA 0 0 0 0 0 270 0 SEM TENTATIVA 6 0 0 0 0 295 0 SEM TENTATIVA 8 0 7 10 0 307 0 SEM TENTATIVA 10 6 3 0 0 322 0 SEM TENTATIVA 5 0 0 0 0 348 0 PRIMARIA 3 0 0 0 0 366 0 SEM TENTATIVA 6 8 0 0 0 367 1 NÃO 2 0 0 0 0 382 0 NÃO 0 0 6 0 0 395 0 SEM TENTATIVA 9 0 0 0 0 399 0 PRIMARIA 7 0 0 0 0 407 0 SEM TENTATIVA 6 0 0 0 0 416 0 PRIMARIA 8 2 6 5 0 426 0 SEM TENTATIVA 5 0 0 0 0 443 0 SEM TENTATIVA 10 10 0 0 0 463 0 PRIMARIA 9 2 3 0 0 486 0 PRIMARIA 0 0 0 0 0 491 0 PRIMARIA 7 0 5 0 0 494 0 PRIMARIA 10 10 10 0 8 507 0 SEM TENTATIVA 10 7 0 6 5 515 0 PRIMARIA 8 5 7 0 0 522 2 NÃO 6 6 7 0 0 524 0 SEM TENTATIVA 0 0 6 0 0 530 1 NÃO 1 0 0 0 0 2018 0 SEM TENTATIVA 0 6 0 0 0 2031 0 PRIMARIA 5 0 0 0 0 2033 0 PRIMARIA 6 0 0 0 0 2034 0 SEM TENTATIVA 10 0 4 0 0 2047 0 PRIMARIA 9 0 5 0 0 2068 0 SEM TENTATIVA 4 2 0 0 0 2070 0 SEM TENTATIVA 9 0 7 0 0 2078 2 NÃO 8 0 5 0 0 2079 0 PRIMARIA 8 0 0 6 0 2080 0 SEM TENTATIVA 5 0 0 0 0 2083 1 NÃO 8 2 0 0 0 2095 0 PRIMARIA 0 7 0 0 0 EAD: escala analógica de dor (0 - 10). Anexos 95 Anexo H - Dados demográficos e fase do ciclo menstrual (grupo 2B: N = 41). Código de identificação (N=41) Idade Estatura (m) Peso (Kg) Indice de massa corpórea - IMC FASE DO CICLO MENSTRUAL NA CIRURGIA 102 37 1,54 57,8 24,37 MENSTRUAL 104 39 1,53 66,4 28,37 SECRETORA 106 24 1,72 55,7 18,83 SECRETORA 118 31 1,58 48 19,23 SECRETORA 122 35 1,57 58,3 23,65 SECRETORA 151 28 1,65 65 23,88 SECRETORA 177 30 1,61 53 20,45 SECRETORA 195 45 1,54 68 28,67 NÃO REFERIDO* 199 28 1,67 48 17,21 SECRETORA 229 33 1,75 72 23,51 SECRETORA 242 35 1,62 63 24,01 SECRETORA 255 34 1,60 51,2 20,00 SECRETORA 259 32 1,69 85 29,76 SECRETORA 272 35 1,70 0 0,00 PROLIFERATIVA 308 43 1,75 64,8 21,16 PROLIFERATIVA 342 45 1,57 81 32,86 SECRETORA 343 38 1,65 94 34,53 SECRETORA 347 40 1,70 59 20,42 PROLIFERATIVA 352 28 1,57 44,6 18,09 PROLIFERATIVA 372 31 1,60 47 18,36 MENSTRUAL 381 34 1,59 64 25,32 SECRETORA 389 32 1,60 49 19,14 PROLIFERATIVA 404 31 1,63 56 21,08 PROLIFERATIVA 421 26 1,55 59 24,56 SECRETORA 451 35 1,65 56 20,57 SECRETORA 486 37 1,51 62 27,19 SECRETORA 495 45 1,64 0 0,00 SECRETORA 499 27 1,60 58 22,66 SECRETORA 528 33 1,70 67 23,18 SECRETORA 534 29 1,63 53 19,95 SECRETORA 536 36 1,57 52 21,10 SECRETORA 577 42 1,58 73 29,24 SECRETORA 582 32 1,64 54,9 20,41 SECRETORA 585 32 1,52 54 23,37 MENSTRUAL 588 37 1,63 51 19,20 SECRETORA 589 38 1,60 56 21,88 SECRETORA 2048 41 1,62 63,9 24,35 SECRETORA 2049 39 1,57 56,1 22,76 SECRETORA 2074 36 1,60 64,5 25,20 PROLIFERATIVA 2081 33 1,66 58 21,05 PROLIFERATIVA 2070 34 1,58 50 20,03 SECRETORA 2082 45 1,67 70 25,10 PROLIFERATIVA * Para a paciente 195 não foi possível obter a informação do dia do ciclo menstrual na cirurgia. Anexos 96 Anexo I - Tabulação dos dados clínicos das pacientes (grupo 2B: N = 41). Código de identificação (N=44) Paridade Infertilidade EAD Dismenorreia EAD Dor pélvica acíclica EAD Dispareunia de profundidade EAD Alteração intestinal EAD Alteração urinária 153 0 PRIMARIA 8 2 2 0 0 174 1 SEM TENTATIVA 7 0 0 7 0 221 0 SEM TENTATIVA 7 6 0 0 0 227 0 SEM TENTATIVA 7 4 7 10 0 241 0 PRIMARIA 0 0 6 0 0 250 2 NÃO 6 0 6 8 0 253 0 PRIMARIA 7 4 4 6 0 260 0 PRIMARIA 8 0 0 0 0 265 1 SECUNDARIA 0 0 0 0 0 270 0 SEM TENTATIVA 6 0 0 0 0 295 0 SEM TENTATIVA 8 0 7 10 0 307 0 SEM TENTATIVA 10 6 3 0 0 322 0 SEM TENTATIVA 5 0 0 0 0 348 0 PRIMARIA 3 0 0 0 0 366 0 SEM TENTATIVA 6 8 0 0 0 367 1 NÃO 2 0 0 0 0 382 0 NÃO 0 0 6 0 0 395 0 SEM TENTATIVA 9 0 0 0 0 399 0 PRIMARIA 7 0 0 0 0 407 0 SEM TENTATIVA 6 0 0 0 0 416 0 PRIMARIA 8 2 6 5 0 426 0 SEM TENTATIVA 5 0 0 0 0 443 0 SEM TENTATIVA 10 10 0 0 0 463 0 PRIMARIA 9 2 3 0 0 486 0 PRIMARIA 0 0 0 0 0 491 0 PRIMARIA 7 0 5 0 0 494 0 PRIMARIA 10 10 10 0 8 507 0 SEM TENTATIVA 10 7 0 6 5 515 0 PRIMARIA 8 5 7 0 0 522 2 NÃO 6 6 7 0 0 524 0 SEM TENTATIVA 0 0 6 0 0 530 1 NÃO 1 0 0 0 0 2018 0 SEM TENTATIVA 0 6 0 0 0 2031 0 PRIMARIA 5 0 0 0 0 2033 0 PRIMARIA 6 0 0 0 0 2034 0 SEM TENTATIVA 10 0 4 0 0 2047 0 PRIMARIA 9 0 5 0 0 2068 0 SEM TENTATIVA 4 2 0 0 0 2070 0 SEM TENTATIVA 9 0 7 0 0 2078 2 NÃO 8 0 5 0 0 2079 0 PRIMARIA 8 0 0 6 0 2080 0 SEM TENTATIVA 5 0 0 0 0 2083 1 NÃO 8 2 0 0 0 2095 0 PRIMARIA 0 7 0 0 0 EAD: escala analógica de dor (0 - 10). Anexos 97 Anexo J - Descrição dos marcadores segundo EDT de bexiga nas pacientes dos grupos 1, 2A e 2B, respectivamente. Grupo 1 (peritonio, ovário e intestino) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Peritonio Epitelio N-Caderina 10 0 100 0 0 50 0,448 Peritonio Estroma N-Caderina 10 0 50 0 0 10 0,255 Peritonio Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Peritonio Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Peritonio Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Peritonio Epitelio Receptor de Progesterona 100 40 100 100 100 100 0,367 Peritonio Estroma Receptor de Progesterona 100 40 100 1 00 70 100 0,664 Peritonio Epitelio Receptor de Estrogeno 100 0 100 90 0 1 00 0,368 Peritonio Estroma Receptor de Estrogeno 50 0 90 60 0 90 0, 683 Ovario Epitelio N-Caderina 100 0 100 25 0 100 0,567 Ovario Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 0 0,579 Ovario Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Ovario Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Progesterona 40 0 100 25 5 80 0,432 Ovario Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Estrogeno 80 0 100 80 70 100 0 ,852 Ovario Estroma Receptor de Estrogeno 70 10 80 50 0 70 0,09 3 Intestino Epitelio N-Caderina 0 0 100 0 0 100 0,342 Intestino Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 20 0,315 Intestino Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Intestino Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Intestino Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Intestino Epitelio Receptor de Progesterona 100 30 100 100 100 100 0,519 Intestino Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 100 100 >0,999 Intestino Epitelio Receptor de Estrogeno 90 80 100 100 1 00 100 0,058 Intestino Estroma Receptor de Estrogeno 70 40 100 90 50 1 00 0,109 EDT - Bexiga Não Sim Grupo 2A (ovário) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Ovario Epitelio N-Caderina 60 0 100 0 0 100 0,240 Ovario Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 0 0,291 Ovario Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Ovario Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Progesterona 45 0 100 87,5 0 100 0,251 Ovario Estroma Receptor de Progesterona 100 0 100 100 10 0 100 0,261 Ovario Epitelio Receptor de Estrogeno 90 0 100 90 0 100 0, 742 Ovario Estroma Receptor de Estrogeno 60 0 90 70 0 90 0,952 Não Sim EDT - Bexiga Grupo 2B (intestino) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Intestino Epitelio N-Caderina 0 0 100 0 0 100 0,576 Intestino Estroma N-Caderina 0 0 60 0 0 100 0,436 Intestino Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Intestino Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Intestino Estroma Beta-catenina 0 0 100 0 0 0 0,577 Intestino Epitelio Receptor de Progesterona 100 20 100 100 100 100 0,557 Intestino Estroma Receptor de Progesterona 100 60 100 1 00 100 100 0,158 Intestino Epitelio Receptor de Estrogeno 100 0 100 100 7 0 100 >0,999 Intestino Estroma Receptor de Estrogeno 70 0 100 64,5 30 90 0,923 Não Sim EDT - Bexiga Anexos 98 Anexo K - Descrição dos marcadores segundo EDT de u reter nas pacientes dos grupos 1, 2A e 2B, respectivamente. Grupo 1 (peritonio, ovário e intestino) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Peritonio Epitelio N-Caderina 0 0 100 0 0 0 0,418 Peritonio Estroma N-Caderina 0 0 50 0 0 0 0,418 Peritonio Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Peritonio Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Peritonio Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Peritonio Epitelio Receptor de Progesterona 100 40 100 100 100 100 0,607 Peritonio Estroma Receptor de Progesterona 97,5 40 100 100 100 100 0,215 Peritonio Epitelio Receptor de Estrogeno 100 0 100 50 0 1 00 0,471 Peritonio Estroma Receptor de Estrogeno 55 0 90 25 0 50 0, 141 Ovario Epitelio N-Caderina 75 0 100 0 0 0 0,303 Ovario Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 0 0,803 Ovario Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Ovario Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Progesterona 30 0 100 20 20 2 0 0,531 Ovario Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Estrogeno 80 0 100 100 100 10 0 0,119 Ovario Estroma Receptor de Estrogeno 70 0 80 40 30 50 0,14 4 Intestino Epitelio N-Caderina 0 0 100 0 0 0 0,439 Intestino Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 0 0,312 Intestino Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Intestino Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Intestino Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Intestino Epitelio Receptor de Progesterona 100 30 100 100 100 100 0,803 Intestino Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 100 100 >0,999 Intestino Epitelio Receptor de Estrogeno 100 80 100 100 100 100 0,397 Intestino Estroma Receptor de Estrogeno 70 40 100 90 90 9 0 0,271 EDT - Ureter Não Sim Grupo 2A (ovário) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Ovario Epitelio N-Caderina 30 0 100 50 0 100 0,906 Ovario Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 0 0,425 Ovario Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Ovario Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Progesterona 50 0 100 60 5 10 0 0,794 Ovario Estroma Receptor de Progesterona 100 0 100 100 10 0 100 0,411 Ovario Epitelio Receptor de Estrogeno 90 0 100 90 0 100 0, 831 Ovario Estroma Receptor de Estrogeno 60 0 90 50 0 80 0,864 Não Sim EDT - Ureter Grupo 2B (intestino) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Intestino Epitelio N-Caderina 0 0 100 0 0 100 0,744 Intestino Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 100 0,539 Intestino Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Intestino Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Intestino Estroma Beta-catenina 0 0 100 0 0 0 0,697 Intestino Epitelio Receptor de Progesterona 100 20 100 100 100 100 0,701 Intestino Estroma Receptor de Progesterona 100 60 100 1 00 100 100 0,358 Intestino Epitelio Receptor de Estrogeno 100 0 100 100 7 0 100 0,789 Intestino Estroma Receptor de Estrogeno 70 0 100 40 20 80 0,299 Não Sim EDT - Ureter Anexos 99 Anexo L - Descrição dos marcadores segundo EDT retr ocervical nas pacientes dos grupos 1, 2A e 2B, respectivamente. Grupo 1 (peritonio, ovário e intestino) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Peritonio Epitelio N-Caderina 60 20 100 0 0 100 0,119 Peritonio Estroma N-Caderina 10 0 20 0 0 50 0,904 Peritonio Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Peritonio Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Peritonio Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Peritonio Epitelio Receptor de Progesterona 100 100 10 0 100 40 100 0,607 Peritonio Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 97,5 40 100 0,215 Peritonio Epitelio Receptor de Estrogeno 100 100 100 10 0 0 100 0,262 Peritonio Estroma Receptor de Estrogeno 85 80 90 50 0 90 0,050 Ovario Epitelio N-Caderina 50 0 100 50 0 100 >0,999 Ovario Estroma N-Caderina 0 0 0 0 0 100 0,715 Ovario Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Ovario Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Progesterona 100 100 100 30 0 100 0,168 Ovario Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Estrogeno 80 60 100 80 0 100 0 ,935 Ovario Estroma Receptor de Estrogeno 65 60 70 65 0 80 0,87 1 Intestino Epitelio N-Caderina 0 0 0 0 0 100 0,439 Intestino Estroma N-Caderina 75 50 100 0 0 100 0,053 Intestino Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Intestino Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Intestino Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Intestino Epitelio Receptor de Progesterona 100 100 10 0 100 30 100 0,715 Intestino Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 100 100 >0,999 Intestino Epitelio Receptor de Estrogeno 90 80 100 100 8 0 100 0,595 Intestino Estroma Receptor de Estrogeno 85 70 100 70 40 1 00 0,294 Não Sim EDT - Retrocervical Grupo 2A (ovário) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Ovario Epitelio N-Caderina 100 0 100 25 0 100 0,242 Ovario Estroma N-Caderina 0 0 0 0 0 100 0,482 Ovario Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Ovario Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Progesterona 20 10 100 50 0 1 00 0,882 Ovario Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 0 100 0,513 Ovario Epitelio Receptor de Estrogeno 70 50 90 90 0 100 0, 574 Ovario Estroma Receptor de Estrogeno 70 50 80 55 0 90 0,33 4 Não Sim EDT - Retrocervical Grupo 2B (intestino) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Intestino Epitelio N-Caderina 35 0 70 0 0 100 0,621 Intestino Estroma N-Caderina 0 0 0 0 0 100 0,584 Intestino Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Intestino Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Intestino Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 100 0,814 Intestino Epitelio Receptor de Progesterona 100 100 10 0 100 20 100 0,816 Intestino Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 60 100 0,578 Intestino Epitelio Receptor de Estrogeno 100 100 100 10 0 0 100 0,332 Intestino Estroma Receptor de Estrogeno 85 80 90 70 0 100 0,153 Não Sim EDT - Retrocervical Anexos 100 Anexo M - Descrição dos marcadores segundo EDT retr ocervical nas pacientes dos grupos 1, 2A e 2B, respectivamente. Grupo 1 (peritonio, ovário e intestino) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Peritonio Epitelio N-Caderina 0 0 50 20 0 100 0,371 Peritonio Estroma N-Caderina 0 0 50 15 0 30 0,210 Peritonio Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Peritonio Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Peritonio Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Peritonio Epitelio Receptor de Progesterona 100 100 10 0 100 40 100 0,146 Peritonio Estroma Receptor de Progesterona 95 40 100 10 0 70 100 0,465 Peritonio Epitelio Receptor de Estrogeno 100 0 100 90 0 1 00 0,190 Peritonio Estroma Receptor de Estrogeno 50 0 80 50 0 90 0, 414 Ovario Epitelio N-Caderina 25 0 100 100 0 100 0,627 Ovario Estroma N-Caderina 0 0 0 0 0 100 0,346 Ovario Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Ovario Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Progesterona 30 0 95 80 5 100 0,273 Ovario Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Estrogeno 90 60 100 80 0 100 0 ,215 Ovario Estroma Receptor de Estrogeno 70 50 80 50 0 80 0,13 3 Intestino Epitelio N-Caderina 0 0 100 0 0 100 0,903 Intestino Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 100 0,458 Intestino Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Intestino Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Intestino Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Intestino Epitelio Receptor de Progesterona 100 30 100 100 100 100 0,346 Intestino Estroma Receptor de Progesterona 100 100 100 100 100 100 >0,999 Intestino Epitelio Receptor de Estrogeno 90 80 100 100 8 0 100 0,348 Intestino Estroma Receptor de Estrogeno 60 40 100 80 50 1 00 0,241 EDT - Vagina Sim Não Grupo 2A (ovário) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Ovario Epitelio N-Caderina 0 0 100 70 0 100 0,303 Ovario Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 10 0,781 Ovario Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,999 Ovario Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Ovario Estroma Beta-catenina 0 0 0 0 0 0 >0,999 Ovario Epitelio Receptor de Progesterona 60 0 100 40 0 10 0 0,313 Ovario Estroma Receptor de Progesterona 100 0 100 100 10 0 100 0,329 Ovario Epitelio Receptor de Estrogeno 90 0 100 90 30 100 0 ,496 Ovario Estroma Receptor de Estrogeno 50 0 90 70 0 80 0,809 EDT - Vagina Sim Não Grupo 2B (intestino) p Marcador Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo Intestino Epitelio N-Caderina 0 0 100 0 0 100 0,379 Intestino Estroma N-Caderina 0 0 100 0 0 100 0,921 Intestino Epitelio E-Caderina 100 100 100 100 100 100 >0,9 99 Intestino Epitelio Beta-catenina 100 100 100 100 100 100 > 0,999 Intestino Estroma Beta-catenina 0 0 100 0 0 0 0,419 Intestino Epitelio Receptor de Progesterona 100 100 10 0 100 20 100 0,206 Intestino Estroma Receptor de Progesterona 100 60 100 1 00 85 100 0,938 Intestino Epitelio Receptor de Estrogeno 100 0 100 100 6 0 100 0,498 Intestino Estroma Receptor de Estrogeno 70 0 90 70 0 100 0 ,934 EDT - Vagina Não Sim