Development of an experimental model of endometriosis in rats.

250 Rev. Col. Bras. Cir. 2009; 36(3): 250-255 AmaralAmaralAmaralAmaralAmaral Desenvolvimento de modelo experimental de endometriose em ratasArtigo OriginalArtigo OriginalArtigo OriginalArtigo OriginalArtigo Original Desenvolvimento de modelo experimental de endometriose emDesenvolvimento de modelo experimental de endometriose emDesenvolvimento de modelo experimental de endometriose emDesenvolvimento de modelo experimental de endometriose emDesenvolvimento de modelo experimental de endometriose em ratasratasratasratasratas Development of an experimental model of endometriosis in ratsDevelopment of an experimental model of endometriosis in ratsDevelopment of an experimental model of endometriosis in ratsDevelopment of an experimental model of endometriosis in ratsDevelopment of an experimental model of endometriosis in rats VIVIAN FERREIRA DO AMARAL1; EDUARDO ANDREAZZA DAL LAGO2; WILLIAM KONDO, ACBC-PR3; LUIZ CÉSAR GUARITA-SOUZA4; JÚLIO CÉSAR FRANCISCO5 RESUMORESUMORESUMORESUMORESUMO ObjetivoObjetivoObjetivoObjetivoObjetivo : Desenvolver um modelo de endometriose experimental em ratas. MétodosMétodosMétodosMétodosMétodos : Foram utilizadas 30 ratas adultas da linhagem Wistar. A técnica cirúrgica consistiu em laparotomia mediana com identificação do útero bicorno e ressecção de um segmento de 2 cm do corno uterino direito. Um retalho de 0,25 cm 2 foi retirado dessa estrutura e suturado na parede abdominal com a face endometrial voltada para a cavidade peritoneal. As ratas foram divididas aleatoriamente em dois grupos de acordo com o tempo para a reoperação: grupo 1 (n=15), reoperado em 30 dias, e grupo 2 (n=15), em 60 dias. No momento da segunda laparotomia os implantes foram avaliados macroscopicamente, ressecados e encaminhados para análise microscópica com colora- ção hematoxilina-eosina e imunohistoquímica (HEMA, AE1 e AE2). ResultadosResultadosResultadosResultadosResultados : Os implantes se desenvolveram em 83,3 % do Grupo 1 e 71,4% no Grupo 2. Não houve diferença estatisticamente significativa entre o peso dos animals dos dois grupos. Também não houve diferença estatisticamente significativa no tamanho da área das lesões induzidas: no Grupo 1 a média foi 0,37 cm 2 e no Grupo 2, de 0,25 cm 2. Segundo a classificação histológica semi-quantitativa de Keenan (de acordo com a preservação da camada epitelial de endométrio), o Grupo 1 teve média de 1,9 e o Grupo 2, de 2,4. ConclusãoConclusãoConclusãoConclusãoConclusão: A técnica utilizada para o desenvolvimento de endometriose em ratas foi satisfatória. Descritores: Descritores: Descritores: Descritores: Descritores: Endometriose. Ratos. Modelos animais. Endométrio. Trabalho realizado no Trabalho realizado no Laboratório de Técnica Operatória e Cirurgia experimental da PUCPR- BR. 1. Professora adjunta de Ginecologia na PUCPR e da Pós-graduação em Ciências da Saúde na PUC - PR - BR; 2. Acadêmico de Medicina na PUC - PR - BR; 3. Mestrando de Ciências da Saúde da PUC - PR - BR; 4. Professor Técnica Operatória e da Pós-graduação em Ciências da Saúde da PUC - PR - BR; 5. Doutorando em Biotecnologia pela UFPR - BR; Graduação em Farmácia e Bioquímica na PUCPR. INTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO A endometriose é condição crônica caracterizada pela presença de tecido endometrial (glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina1. Estes depósitos ectópicos de endométrio são mais comumente encontrados em ová- rios, peritônio, ligamentos útero-sacros e fundo-de-saco retovaginal, mas implantes extra-pélvicos também podem estar presentes2. A sua prevalência nas mulheres em idade reprodutiva é estimada em 10%3. Nas com dor pélvica crô- nica, essa prevalência pode chegar a até 82%4,5 e naque- las submetidas à investigação por infertilidade, entre 20 e 50%3,6-8. Várias teorias teem sido sugeridas para explicar a patogênese desta doença 9. Dentre elas se destacam a teoria da menstruação retrógrada (teoria da implantação ou de Sampson) 10, a da metaplasia celômica 11-13 e a dos restos embrionários14,15; mas nenhuma delas foi capaz de elucidar completamente a etiopatogenia da doença. Existe tendência atual em se associar essas teorias entre si e a outros elementos como fatores imunológicos, hormonais, genéticos e ambientais. A endometriose geralmente aparece na idade reprodutiva, quando as lesões são estimuladas pelos hormônios ovarianos. Um número significativo de mulhe- res permanece assintomática. Nas sintomáticas, as mani- festações dolorosas tendem a ser mais intensas no pré- menstrual, melhorando após a parada da menstruação. A dor pélvica, na forma de dismenorréia, é o sintoma mais comum e não se correlaciona nem com o grau de endometriose visível16 nem com a profundidade de infiltra- ção tecidual17,18. Outros sintomas que podem estar presen- tes são dor lombar, disquesia, dor durante a micção e dispareunia. Esta, quando profunda, pode ser decorrente de fibrose dos ligamentos útero-sacros, nodularidade do septo reto-vaginal, obliteração do fundo de saco e/ou retroversão uterina. Além disso, a endometriose está asso- ciada à infertilidade por causa de aderências que distorcem a anatomia pélvica e causam dificuldade para a liberação e captura do óvulo. No entanto, a distorção tubária não é a única causa de infertilidade porque pacientes com endometriose parecem ter pior reserva ovariana, com pior qualidade do oócito e do embrião2. O padrão-ouro para o diagnóstico da endometriose é a visualização direta da lesão endometrial AmaralAmaralAmaralAmaralAmaral Desenvolvimento de modelo experimental de endometriose em ratas 251 Rev. Col. Bras. Cir. 2009; 36(3): 250-255 utilizando a via laparoscópica, acompanhada por confir- mação histológica da presença de pelo menos dois dos se- guintes achados: macrófagos contendo hemosiderina ou epitélio, glândulas ou estroma endometrial19. O tratamento ideal para esta doença ainda não existe20. As opções disponíveis são medicamentosas, cirúr- gicas e associação de ambos. A modalidade terapêutica a ser adotada depende de fatores como o estágio de evolu- ção da doença, a sintomatologia, a idade da paciente e o desejo futuro de uma gestação. O fato de a endometriose necessitar de um mé- todo invasivo para seu diagnóstico dificulta ou até mesmo impossibilita a realização de estudos controlados sobre o comportamento dos implantes de endometriose perante os diversos medicamentos21. Portanto, um bom modelo expe- rimental animal é necessário para elucidar o mecanismo da doença e testar novas drogas terapêuticas. No entanto, a endometriose ocorre espontaneamente apenas em primatas, que são muito onerosos para uso experimental22. Consequentemente, modelos experimentais teem sido cri- ados cirurgicamente em pequenos animais, tais como coe- lhos, ratos e camundongos23-28. O modelo murino proposto por Jones29 em 1984 é o mais amplamente utilizado, uma vez que a técnica operatória é simples e a maioria dos implantes tem sucesso, ou seja, a indução da endometriose é eficaz e reprodutível21. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de um modelo experimental de endometriose em ratas seguindo a técnica proposta por Jones29. MÉTODOSMÉTODOSMÉTODOSMÉTODOSMÉTODOS O estudo foi previamente aprovado pelo parecer número 80/07 do Comitê de Ética em Pesquisa com Ani- mais da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC- PR) e seguiu as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). As ratas da linhagem Wistar ( Rattus norvegicus albinus), adultas e virgens, foram mantidas em gaiolas apro- priadas com cinco animais, sob controle de temperatura, umidade e luminosidade do ambiente, e alimentadas com água e ração ad libitum. Após período de adaptação de três dias, o procedimento cirúrgico para indução de endometriose foi realizado. Durante o período de dezembro de 2007 a janei- ro de 2008 foram operadas 30 ratas no Laboratório de Téc- nica Operatória e Cirurgia Experimental da PUCPR. Como pré-operatório foi instituído jejum nas 12 horas que antece- deram a operação. Antes da anestesia os animais foram pesados para o cálculo da dose anestésica. A anestesia foi realizada com injeção intraperitonal de 0,2 mL para cada 100 gramas de peso da mistura de um mililitro de ketamina (50mg/mL) com um mililitro de xilazina (20 mg/mL). Após a anestesia, foi utilizado tricótomo elétrico para a realização da tricotomia da parede abdominal dos animais que foram então atados à mesa cirúrgica em decúbito dorsal, com os membros em abdução, e realizada antissepsia de rotina. A operação iniciou-se com incisão mediana de 3 cm, a 2 cm acima do púbis do animal. A operação para o desenvolvimento da lesão endometriótica foi realizada com base em trabalho publi- cado29. Para executá-la, identificou-se o útero bicorno e foi realizada a ligadura dos vasos sanguíneos do corno uterino esquerdo com fio de vicryl 3-0 (Figuras 1 e 2). Um segmen- to de 2 cm do terço médio do corno uterino esquerdo foi então ressecado. Este fragmento foi imerso em soro fisioló- gico 0,9% a 4º C por cerca de dois minutos e então incisado longitudinalmente dando origem a um retalho, de onde foi retirado um segmento de 5 x 5mm (0,25 cm 2). Este frag- mento foi suturado à parede abdominal do lado direito da rata utilizando dois pontos simples de mononáilon 6-0, pró- ximo a um vaso sanguíneo, de modo que a face endometrial sempre ficasse voltada para a cavidade abdominal (Figura 3). Após checar a hemostasia do corno uterino esquerdo e promover a limpeza da cavidade abdominal, a parede ab- dominal foi fechada por planos, sendo o músculo- aponeurótico com sutura contínua de vicryl 3-0 e a pele com sutura contínua de mononylon 3-0. Após a operação, os animais foram encaminha- dos ao Biotério da PUC-PR, onde permaneceram até a data da reoperação. Figura 1Figura 1Figura 1Figura 1Figura 1 - Útero típico de ratos, com aspecto bicorno. Figura 2Figura 2Figura 2Figura 2Figura 2 - Ressecção de segmento do corno uterino. 252 Rev. Col. Bras. Cir. 2009; 36(3): 250-255 AmaralAmaralAmaralAmaralAmaral Desenvolvimento de modelo experimental de endometriose em ratas Reoperação e análise histológicaReoperação e análise histológicaReoperação e análise histológicaReoperação e análise histológicaReoperação e análise histológica A reoperação foi realizada um mês (Grupo 1) e dois meses (Grupo 2) após o primeiro procedimento com o intuito de se comprovar macroscopicamente o desenvolvi- mento da lesão e de coletar amostra para avaliação histológica. Após abertura da parede abdominal, as lesões foram identificadas e suas dimensões, anotadas. Em segui- da, esses implantes foram ressecados (Figura 4), fixados em formol a 10% e processados para inclusão em parafi- na, para posterior análise histológica no Laboratório de Patologia Experimental da PUC-PR. As lâminas foram coradas com HE (hematoxilina/ eosina) e analisadas ao microscópio óptico (Olympus; Melville, NY) para confirmar a presença de tecido endometrial. A partir dos blocos de parafina procedeu-se a técnica de Tissue Microarray manual. As lâminas confecci- onadas foram analisadas em microscópio óptico para loca- lização das áreas com endométrio. Esse local foi marcado com caneta. Através do sistema de espelho, a lâmina marcada foi utilizada para localização da região no bloco de parafina que, por sua vez, também recebeu marcação. Foi escolhida a pinça do tipo Punch de biópsia de pele, com diâmetro de 2 mm, para retirada do fragmento do bloco de parafina. Para que o material fosse devidamente localizado, foi confeccionado um mapa. Após a retirada dos fragmentos de todos os blocos foram confeccionadas lâminas histológicas utilizando os marcadores HEMA, AE1 e AE2. A persistência de células epiteliais nos implantes foi avaliada conforme a classificação proposta por Keenan30, da seguinte maneira: camada epitelial bem preservada = escore 3, epitélio moderadamente preservado com infiltrado leucocitário = escore 2, epitélio mal preservado (apenas células epiteliais ocasionais) = escore 1, nenhum epitélio = escore zero. Os resultados obtidos no estudo foram expres- sos por médias, medianas, valores mínimos, valores má- ximos e desvios-padrão ou por frequências e percentuais. Para a comparação dos grupos em relação às variáveis quantitativas foi usado o teste t de Student para amostras independentes ou o teste não-paramétrico de Mann- Whitney, quando apropriado. Em relação a variáveis no- minais dicotômicas os grupos foram comparados usando- se o teste exato de Fisher. Valores de p<0,05 indicaram significância estatística. RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS Das 30 ratas operadas, quatro foram a óbito no período entre a primeira e a segunda operação, sendo três do Grupo 1 e uma do Grupo 2. No momento da reoperação, foi realizada análise macroscópica dos sítios de implante do tecido endometrial e em quatro animais não foi possível identificar tal tecido (dois animais em cada grupo). Além disso, em duas ratas do Grupo 2 foi observada a presença de um abscesso no local do implante. Estes animais foram considerados como não desenvolvendo a lesão, totalizando taxa de sucesso de 76,9% (20/26), sendo que discriminan- do cada Grupo, elas foram de 83,3% no grupo 1 (10/12) e de 71,4% no Grupo 2 (10/14). Não houve diferença estatisticamente significati- va entre o peso médio dos animais do Grupo 1 e 2 (271,6 g e 260 g, respectivamente; p = 0,147). Avaliando-se as dimensões da lesão de endometriose induzida cirurgicamente, não houve diferen- ça estatisticamente significativa entre os grupos em rela- ção às variáveis comprimento, largura e área (tabela 1). Todos os implantes foram submetidos à análise histológica e não houve diferença entre os dois grupos (Fi- gura 5). DISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃO Os modelos experimentais de endometriose cri- ados cirurgicamente em pequenos animais são classifi- Figura 3Figura 3Figura 3Figura 3Figura 3 - Implante de endométrio na parede abdominal. Figura 4Figura 4Figura 4Figura 4Figura 4 - Implante de endométrio no Grupo 2. AmaralAmaralAmaralAmaralAmaral Desenvolvimento de modelo experimental de endometriose em ratas 253 Rev. Col. Bras. Cir. 2009; 36(3): 250-255 cados em dois tipos: homólogos e heterólogos. Nos mo- delos homólogos, o endométrio é obtido do útero do animal e suturado ou disperso na cavidade peritonial. No modelo heterólogo, fragmentos endometriais de hu- manos são injetados em ratas imunodeficientes por via intraperitonial ou subcutânea. Em ambos, lesões endometrióticas-símiles, identificadas histologicamente, são induzidas nos animais. Embora o uso de modelos em não primatas seja vantagem com relação ao seu baixo custo e habilidade de estabelecer lesões endometriótica-símile, esses modelos teem uma série de desvantagens. As comparações são di- ficultadas pelo grande número de técnicas experimentais utilizadas e pelo grande intervalo filogenético entre os não primatas e os humanos. Mais importante, os não primatas não têm ciclos menstruais e não desenvolvem endometriose espontânea. A rata ovula espontaneamente, mas a fase lútea é mais curta que nos humanos. As lesões endometrióticas produzidas nas ratas são diferentes das em humanos, consistindo de cistos que conteem fluido seroso claro, sem evidência de neoangiogênese31. Apesar dessas diferenças, os modelos experimentais são de grande im- portância para o estudo da doença e o teste de novas mo- dalidades terapêuticas. A opção deste estudo pelo modelo experimental com ratas decorreu do baixo custo, do embasamento pré- vio de literatura e da resistência desses animais às infec- ções. A técnica descrita por Jones em 1984 29 em modelo murino é a mais amplamente utilizada na literatura mundi- al, uma vez que o procedimento cirúrgico é simples e a maioria dos implantes se desenvolve com sucesso, ou seja, a indução da endometriose é eficaz e reprodutível21,23. Pode- se, desta maneira, padronizar o tamanho dos implantes, o que é indispensável para avaliar a eficácia de novas drogas terapêuticas. Neste estudo, das 30 ratas submetidas ao proce- dimento, quatro foram descartadas pois morreram entre a primeira e a segunda operações, restando 26 animais para a análise final. A taxa de sucesso no desenvolvimento macroscópico da lesão de endometriose foi de 76,9% (20 de 26). Algumas vezes as lesões não são claras o suficiente para se distinguir do tecido normal adjacente. Isto torna difícil a determinação da área e do peso das lesões, que são variantes essenciais no experimento32. O principal parâmetro analisado neste estudo foi a área dos implantes. Ao contrário da maior parte dos tra- balhos, que demonstra estabilidade ou crescimento das le- sões no intervalo entre a segunda e a terceira operações22, encontrou-se regressão da área dos implantes (0,37 cm 2 para 0,25 cm2), mas sem diferença estatisticamente signifi- cativa. De acordo com a classificação anátomo-patoló- gica proposta por Keenan30, oito animais apresentaram es- core zero. Conceitualmente, as lesões desses animais não poderiam ser consideradas endometriose, uma vez que esta doença é caracterizada pela presença de tecido glandular e/ou estromal fora da cavidade uterina. No entanto, inclu- indo os animais com escore zero, obteve-se média de es- cores de 1,3 e 1,4 nos Grupos 1 e 2, respectivamente, o que é semelhante à média dos escores do grupo controle do estudo de Keenan30. Muito embora a literatura utilize a expressão “endometriose experimental”, a rigor, este estudo é de fragmentos de endométrio normal na parede abdominal de ratas saudáveis. A verdadeira correlação destes focos de tecido endometrial com endometriose humana não é conhecida33. No entanto, a ampla utilização de protocolos de pesquisa com endometriose experimental em modelos animais é justificada pelo fato de que a avaliação rigorosa dos implantes em humanos não é viável, uma vez que os métodos diagnósticos são invasivos (videolaparoscopia ou laparotomia). O desenvolvimento de endometriose experimen- tal em ratas segundo modelo de Jones foi satisfatório. Figura 5 -Figura 5 -Figura 5 -Figura 5 -Figura 5 - Fotomicrografia de célula epitelial bem-preservada (ani- mal do Grupo 2). Tabela 1Tabela 1Tabela 1Tabela 1Tabela 1 - Comparação das medidas de comprimento, largura e área dos grupos. VariávelVariávelVariávelVariávelVariável GrupoGrupoGrupoGrupoGrupo n nn nn MédiaMédiaMédiaMédiaMédia MedianaMedianaMedianaMedianaMediana MínimoMínimoMínimoMínimoMínimo MáximoMáximoMáximoMáximoMáximo Desvio padrãoDesvio padrãoDesvio padrãoDesvio padrãoDesvio padrão Valor de p*Valor de p*Valor de p*Valor de p*Valor de p* Comprimento 1 10 0,72 0,6 0,4 1,1 0,27 2 10 0,57 0,5 0,3 1 0,22 0,190 Largura 1 10 0,51 0,5 0,3 0,8 0,15 2 10 0,41 0,3 0,2 1 0,25 0,165 Área 1 10 0,37 0,32 0,15 0,77 0,18 2 10 0,25 0,15 0,06 0,80 0,22 0,075 254 Rev. Col. Bras. Cir. 2009; 36(3): 250-255 AmaralAmaralAmaralAmaralAmaral Desenvolvimento de modelo experimental de endometriose em ratas ABSTRACTABSTRACTABSTRACTABSTRACTABSTRACT ObjectiveObjectiveObjectiveObjectiveObjective: To develop an experimental model of endometriosis in rats. MethodsMethodsMethodsMethodsMethods: Thirty adult female Wistar rats were used. The surgical technique consisted of median laparotomy with identification of the bicornuate uterus and resection of a 2-cm segment of the right uterine horn. A 0.25 cm 2 flap was removed from that structure and sutured to the abdominal wall with the endometrial side facing the peritoneal cavity. The rats were randomly divided into two groups according to the reoperation date: group 1 (n=15) was reoperated in 30 days, and group 2 (n=15), in 60 days. On the occasion of the second laparotomy, the implants were evaluated macroscopically, resected and referred for microscopic analysis with hematoxylin-eosin and immunohistochemical staining (HEMA, AE1 and AE2). ResultsResultsResultsResultsResults: The implants developed in 83.3 % of group 1 and 71.4% of group 2. There was no statistically significant difference between the weights of the animals in the two groups. No statistically significant difference was found in the surface area of the induced lesions: in group 1, the mean was 0.37 cm 2 and in group 2, 0.25 cm 2. According to Keenan’s semiquantitative histological classification (based on the preservation status of the epithelial layer of the endometrium), the mean for group 1 was 1.9 and for group 2, 2.4. ConclusionConclusionConclusionConclusionConclusion: The technique used for inducing the development of endometriosis in rats was satisfactory. Key wordsKey wordsKey wordsKey wordsKey words : Endometriosis. Rats. Models, animal. Endometrium. REFERÊNCIASREFERÊNCIASREFERÊNCIASREFERÊNCIASREFERÊNCIAS 1. Farquhar C. Endometriosis. BMJ. 2007; 334(7587):249-53. 2. Mounsey AL, Wilgus A, Slawson DC. Diagnosis and management of endometriosis. Am Fam Physician. 2006; 74(4):594-600. 3. Eskenazi B, Warner ML. Epidemiology of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997; 24(2):235-58. 4. Laufer MR, Goitein L, Bush M, Cramer DW, Emans SJ. 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Disponível em URL: http:/ /www.scielo.br/rcbc Endereço para correspondência:Endereço para correspondência:Endereço para correspondência:Endereço para correspondência:Endereço para correspondência: William Kondo E-mail: [email protected]