Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente induzida em ratas

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO FERNANDO PASSADOR VALÉRIO Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente induzida em ratas Ribeirão Preto 2018 FERNANDO PASSADOR VALÉRIO Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente induzida em ratas Versão Original Dissertação apresentada ao Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo para obtenção do título d e Mestre em Ciências Médicas. Área de concentração: Tocoginecologia Orientador: Prof. Dr. Júlio César Rosa e Silva Ribeirão Preto 2018 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou elet rônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Valério, Fernando Passador. Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente induzida em ratas. / Fernando Passador Valério; orientador Júlio César Rosa e Silva. Ribeirão Preto, 2018. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, 2018. 1.Endometriose. 2.Metaloproteinase. 3. Invasão Tecidual . 4.TIMP. 5.Doxiciclina. 6. Ratas Nome: VALÉRIO, Fernando Passador Título: Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente induzida em ratas. Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para a obtenção de título de Mestre em Tocoginecologia. Aprovado em: Banca Examinadora Prof. Dr. _________________________________________________________ Instituição: _________________________________________________________ Julgamento: _________________________________________________________ Prof. Dr. _________________________________________________________ Instituição: _________________________________________________________ Julgamento: _________________________________________________________ Prof. Dr. _________________________________________________________ Instituição: _________________________________________________________ Julgamento: _________________________________________________________ Dedicatória Aos meus pais Fátima e João Marcos (in memoriam ), pelos primeiros e mais importantes ensinamentos, e todas as oportunidades e amor que me proporciona m desde o meu nascimento. À Paola, esposa amada, amor da minha vida, companheira em todas as horas, apoio incondicional a todos os meus sonhos. Ao meu irmão Maurício e sua cônjuge Mariana, pela torcida, mesmo à distância, e carinho que mutuamente nos fortalece. Agradecimento especial Ao meu orientador Prof. Dr. Júlio César Rosa e Silva , grande professor e amigo, que me ensinou muito do que sei, e que acreditou em mim quando tudo parecia não funcionar e muitos não acreditaram. Também, pela compreensão, paciência e principalmente por poder contar com sua amizade. Agradecimentos A toda minha família que sempre me apoiou e manifestou palavras de ânimo. Ao Departamento de Ginecologia e Obstetr ícia da FMUSP - Ribeirão Preto que permitiu realizar e concluir este projeto À Comissão de Pós -graduação em Tocoginecologia pelo apoio e incentivo em tantas ocasiões e a todos que compõe o Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Ribeirão Preto, pelo contínuo aprendizado, indispensável à minha formação profissional. Aos funcionários Sr. Reinaldo Tavares, Sra. Rosane Casula, Gabriela Francisco Sicca e Suelen Soares, incansáveis colaboradores de minha jornada. Aos Professores Drs. Omero B enedicto Poli-Neto, Antônio Alberto Nogueira, Pedro Sergio Magnani e Dra. Juliana Meola pelos inestimáveis conselhos, correções e co-orientações. Às amigas Cristiana Carolina Padovan e Laura Midori Kawasse , indispensáveis aos passos técnicos, e principal mente pela amizade que tornaram a caminhada mais amena e prazerosa. A todos os funcionários do Setor de Cirurgia Experimental do Hospital, José Carlos Vanni, Paulo Alves Junior, Paulo Castilho, Danniely da Silva Barros, Wagner Andrade de Oliveira, Danie l Mazetto e Ariane Mirela Saranzo Sant’Ana, por todos incontáveis momentos que me auxiliaram e se dedicaram para a conclusão do meu projeto. Aos amigos do Setor de Vídeo -endoscopia Ginecológica do Departamento em especial os grandes colegas Dra. Ana Carol ina Tagliatti Zani, Dra. Júlia K. Troncon e Dr. Rodrigo Hudari Garcia, pela alegria que tem sido conviver com vocês, dentro e fora do trabalho. Ao grande amigo Dr. José Vitor Cabral Zanardi , parceiro, sócio e grande professor, que sem seus ensinamentos nã o teria conseguido chegar onde cheguei profissionalmente. Ao chefe do Departamento de Patologia Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Prof. Dr. Alfredo Ribeiro da Silva, pelo apoio, incentivo e conhecimento repassados. Aos roedores, animais do Laborat ório de Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto que participaram deste estudo pela inestimável serventia. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho. VALÉRIO, F. P. Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente induzida em ratas. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, 2018. Resumo A endometriose é uma doença de origem multifatorial , caracterizada por presença de tecido endometrial for a da cavidade uterina, responsável por sintomas álgicos com grande impacto na qualidade de vida da paciente, além de ser um dos principais fatores de infertilidade. Muitos estudos já foram realizados no intuito de explicar a etiopatogenia da endometriose, assim como muito tem sido estudado para encontrar novas estratégias de tratamento. Várias linhas de medicamentos têm sido estudadas com este intuito, agindo em diferentes pontos da etiopatogênese da doença, uma delas na inibição de metaloproteinases da mat riz extracelular, que tem papel no remodelamento do mesotélio do peritônio e angiogênese. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de uma droga (doxiciclina) de baixo custo, com ação conhecida na inibição das metaloproteinases, em endometriose peri toneal induzida em ratas . Para isso, fo ram usadas 30 ratas adultas Wistar com lesão induzida de endometriose, divi didas em três grupos, um grupo controle (C, n=10) sem tratamento, um grupo onde foi administrado doxiciclina em baixa dose (BD, n=10) e um gru po onde foi realizado doxiciclina em alta dose (AD, n=10). Foi realizada avaliação da área das lesões de cada rata e estudo imunohistoquímico para positividade de anticorpo primário de metaloproteinase de matriz 9 (MMP9) e de inibidor de metaloproteinase d e matriz 2 (TIMP2) . A doxiciclina atuou reduzindo a área das lesões nos grupos BD e AD (p=0,0052) em relação ao grupo C e reduzindo a expressão do TIMP2 no grupo AD (p=0,0009) em relação aos grupos BD e C. Não houve resultado significativo na expressão da MMP9. Palavras-chave: Endometriose. Doxiciclina. MMP. TIMP. Metaloproteinase. Invasão Tecidual. Ratas. Matriz extracelular. VALÉRIO, F. P. Influence of doxycycline in experimentally induced endometriosis in rats. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Med icina de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, 2018. Abstract Endometriosis is a multifactorial origin disease, characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity, responsible for painful symptoms with important impact on the life quality of the patient, besides being one of the main factors of infertility. Many studies have already been carried out to explain the etiopathogenesis of endometriosis, and much has been studied to find new treatment strategies. Several lines of drugs have been studied for this purpose, acting at different points in the etiopathogenesis of the disease, one of them in the inhibition of extracellular matrix metalloproteinases, which plays a role in the remodeling of the peritoneum mesothelium and angiogenesis. The purpose of this study was to evaluate the influence of a low-cost drug (doxycycline), with known action on the inhibition of metalloproteinases, in induced peritoneal endometriosis in rats. Thirty adult Wistar rats with endometriosis -induced lesions were divided into three groups: one untreated control group (C, n = 10), one group receiving low dose doxycycline (BD, n = 10) and a group where high dose doxycycline (AD, n = 10) was performed. An evaluation of the lesion area of each rat and immunohistochemical study for primary antibody to matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and matrix metalloproteinase inhibitor 2 (TIMP2) was performed. Doxycycline worked by reducing the area of lesions in the BD and AD groups (p = 0.0052) in relation to the C group and reducing the expression of TIMP2 in the AD group (p = 0.0009) in relation to the BD and C groups. There was no significant effect on MMP9 expression in the present study. Key words: Endometriosis. Doxycycl ine. MMP. TIMP. Metal loproteinase. Tissue Invasion. Rats. Extracellular matrix. Lista de Tabelas Tabela 1: Distribuição das variáveis de peso em relação aos grupos ............ 26 Tabela 2: Área final das lesões nos diferentes grupos ................................... 28 Tabela 3: Avaliação da positividade para MMP9 na imunohistoquímica das lesões entre os diferentes grupos ................................................... 28 Tabela 4: Avaliação da positividade para TIMP2 na imunohistoquímica das lesões entre os diferentes grupos ................................................... 30 Lista de Figuras Figura 1: Aspecto macroscópico das lesões peritoneais no momento da segunda abordagem cirúrgica............................................. 27 Figura 2: Aferição das medidas após excisão das lesões....................... 27 Figura 3: Exemplo de reação positiva ao MMP9 no Grupo Controle (Microscopia, aumento 20x)..................................................... 28 Figura 4: Exemplo de reação negativa ao MMP9 no Grupo Baixa Dose (Microscopia, aumento 20x)..................................................... 29 Figuras 5 e 6: Exemplos de reação ao MMP9 positiva (à esquerda) e negativa (à direita) no Grupo Alta Dose (Microscopi a, aumento 20x)............................................................................ 29 Figuras 7 e 8: Exemplos de reação ao TIMP2 positiva (à esquerda) e negativa (à direita) no Grupo Controle (Microscopia, aumento 20x) .......................................................................................... 30 Figura 9: Exemplo de reação positiva ao TIMP2 no Grupo Baixa Dose (Microscopia, aumento 20x).................................................... 31 Figura 10: Exemplo de reação negativa ao TIMP2 no Grupo Alta Dose (Microscopia, aumento 20x).................................................... 31 Lista de Abreviaturas ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas AD Grupo Alta Dose BD Grupo Baixa Dose CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais FMRP-USP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo HE Hematoxilina e Eosina MEC Matriz extracelular MMP Metaloproteinase de Matriz MMP9 Metaloproteinase de Matriz 9 MMPs Metaloproteinases PBS Tampão de solução salina PCNA Antígeno nuclear celular proliferativo pH Potencial hidrogênio TBST Tris buffered saline e Polissorbato 20 TIMPs Inibidor tecidual de metaloproteinases de matriz TIMP2 Inibidor tecidual de metaloproteinase 2 USP Universidade de São Paulo UK United Kingdom Zn Zinco Lista de Símbolos % Porcentagem g gramas cm centímetros mm2 milímetros quadrados ºC graus Celsius ® Marca Registrada ml mililitro mg miligrama kg quilograma μl microlitro SUMÁRIO 1. Introdução………………………………………………………..…………............. 16 2. Justificativa..…………………………………………..…………………………..... 20 3. Objetivos.....………………………………………………...……………………….. 21 3.1 Objetivo geral.............................................................................................. 21 3.2 Objetivos específicos…………………………………….............………...….. 21 4. Metodologia…..................…………………………………..……………………... 22 4.1 Animais e Procedimentos para Modelo experimental ……….................... 22 4.1.1 Técnica de indução das lesões de endometriose..….…....……….... 22 4.1.2 Obtenção das lesões para análise histológica e molecular............... 23 4.2 Processamento do material para Coloração e Imunohistoquímica............ 23 4.3 Análise estatística..........................…………………..…………................... 24 5 Resultados..........................................………..…..……………………………..... 26 5.1 Do preparo e coleta do material...........…………………..…………..……… 26 5.2 Da avaliação macroscópica das lesões..................................................... 26 5.3 Da avaliação histopatológica e imunohistoquímica.................................... 28 6. Discussão………………………………………………………………..……...…... 32 7. Conclusões.................……………………………………………………………… 35 Referências bibliográficas………………………………………………...…........... 36 Anexo.................................................................................................................... 43 16 1. Introdução Endometriose é uma doença caracterizada pela presença de tecido endometrial funcionante (glândula e/ou estroma) fora da cavidade uterina. As lesões são usualmente localizadas na pelve, porém podem ocorrer em múltiplas localidades como intestino, diafragma, cavidade pleural entre outras (VERCELLINI et al., 2014) . Sua prevalência varia de 5 a 15% das mulheres no período reprodutivo, em torno de 3% na pó s-menopausa, enquanto que nas mulheres inférteis pode oscilar entre 20 a 50% (BALLARD et al., 2008) . Em uma proporção significativa de mulheres portadoras de endometriose , entre 3 a 22% , observa -se que elas são assintomáticas. Mas, na maioria das vezes, apresentam sintomas diversos, sendo os principais dismenorreia, dor pélvica crônica, infertilidade, dispareunia de profundidade e sintomas intestinais e urinários cíclicos, como dor ou sangramento ao evacuar ou urinar durante o período menstrual (VIGANÒ et al., 2004; BELLELIS et al., 2010). Várias teorias tentam explicar a etiopatogenia da endometriose, já que a mesma é multifatorial, incluindo implantação de tecido endometrial pela menstruação retrógrada via tuba uterina, alteração de imunidade, descontrole do balanço entre apoptose e proliferação celular, sinalização endocrinológica alterada e fatores genéticos (SAMPSON, 1927; RAHMIOGLU et al., 2014) . Vários novos estudos com foco na identificação de genes relacionados a endometriose não malignas evidenciaram mutações em genes associados a neoplasias em até 79% das lesões endometrióticas (ANGLESIO et al., 2017). Se levarmos em consideração que a menstruação retrógrada ocorre em 76 a 90% das mulheres que menstruam, incidência maior que a da própria endometriose, a teoria da menstruação retrógrada não é suficiente para explicá -la. Embora o mecanismo exato pelo qu al o refluxo do endométrio menstrual para implantação ectópica permaneça desconhecida, adesão, invasão e o desenvolvimento da doença exigem um aumento da expressão de metaloproteinases de matriz (MMP), levando a remodelação da camada de mesotélio peritonea l e angiogênese (SILLEM et al., 1998; BRUNER -TRAN et al., 2002; OSTEEN et al., 2002; SHARPE -TIMMS; COX, 2002). 17 As metaloproteinases são uma família de endoproteases dependentes de cálcio e zinco, que estão envolvidas na degradação da matriz extracelular e membrana basal. Elas influenciam o resultado de reações inflamatórias, angiogênese e tecido de remodelação, por conseguinte, mediam uma gran de variedade de processos biológicos normais, incluindo desenvolvimento embrionário, ovulação, menstruação e cicatrização de feridas (MOTT; WERB, 2004) . Eles também estão implicados em vário s processos patológicos tais como cancro, aterosclerose, doenças inflamatórias ou endometriose (MEDURI; BAUSERO; PERROT-APPLANAT, 2000; NELSON et al., 2000). A ligação entre a expressão das metaloproteinases e etiopatologia da endometriose tem sido amplamente estudada , (CHUNG et al., 2001; COX; PIVA; SHARPE -TIMMS, 2001; LIU; HE; PENG, 2002; RIA et al., 2002; WU et al., 2005) . As MMPs estão envolvidas na implantação ectópica e invasão dos tecidos endometriais pois facilitam a degradação da matriz extracelular e ajuda m na penetração da membrana basal. Como um membro importante da família MMPs, a metaloproteinase do tipo IX (MMP-9) é um tipo de enzima gelatinase que participa da degradação do colágeno do tipo III, IV e V, além da elastina. Também exerce funções importantes na facilitação da neo-angiogênese, que acelera a expansão seletiva das células endoteliais vasculares e aumenta o fluxo sanguíneo, beneficiando assim o crescimento invasivo do endométrio ectópico (YU et al., 2008; LIU et al., 2015). Supressão e a regulação negativa da exp ressão das MMPs inibem o estabelecimento de lesões ectópicas do endométrio humano em experimentos com ratos (BRUNER-TRAN et al., 2002, 2006) . As MMPs são reguladas em múltiplos níveis, incluindo transcrição, secreção, ativação das formas zimogênicas, inibição extracelular e internalização por endocitose. A atividade de MMP é modulada positivamente por íons e reagent es que induzem sua clivagem e ativação. Os quelantes de Zn2+ reprimem a atividade de MMP privando-os do Zn2+ crítico para sua atividade (NEWSOME et al., 2007) . As MMPs também são inibidas por inibidores endógenos e exógenos. Os inibidores de tecidos das metaloproteinases (TIMPs) são os principais regul adores endógenos das MMPs e consistem em quatro membros homólogos (TIMP1-4; 6, 7, 8). Os TIMPs são proteínas multifuncionais que inibem a invasão celular in vitro , oncogênese e metástase in vivo (GOMEZ et al., 1997) . Embora cada TIMP pare ça capaz de inibir várias MMPs, essas proteínas exibem 18 capacidade de inibição preferencial; por exemplo, TIMPs1 e 2 inibem seletivamente MMP9 e 2, respectivamente (BAKER; AHONEN; KÄHÄRI, 2002). Outras teses para a manifestação do tecido endometrióti co, como origem imunológica e metaplasia celômica, tem sido estudado para explicar o aparecimento de endometriose em mulheres pré -puberes e homens, bem como em locais como cavidade pleural e meninge. O surgimento de lesões de endometriose no espaço retroperitoneal, vagina, colo do útero, cicatriz umbilical e pleura pode ser explicado pela disseminação linfática e hematogênica de células endometriais (SUGINAMI, 1991; CHUNG et al., 2002; DING et al., 2002; WITZ et al., 2002). Na investigação de endometriose, o padrão ouro ainda para o diagnóstico se baseia na laparoscopia com visualização direta das lesões com confirmação histológica. O tratamento cirúrgico tem a intenção principal de aumentar as taxas de fertilidade e reduzir a dor. Para tanto, é necessário remover todas as lesões visíveis e restaurar a anatomia pélvica, o que torna a laparoscopia um procedimento diagnóstico e terapêutico (BULLETINS--GYNECOLOGY, 2010). Basear todo o tratamento da endometriose na cirurgia nem sempre é adequado, pois a endometriose apresenta várias aparências e nem sempre é possível identificá-las todas, além de aumentar o risc o de morbimortalidade para a paciente (HOWARD, 2011). É nesse ponto que se faz necessária a associação de medicamentos que reduzam o crescimento das lesões, bem como o aparecimento de novas e tragam melhora dos sintomas apresentados clinicamente (PETTA et al., 2009). As medicações mais usadas para tratamento clínico incluem analgésicos não esteroidais, contraceptivos hormonais, agonistas do hormônio liberador de gonadotropina (GnRH) e inibidores de aromatase. Como ainda n ão há consenso na literatura sobre eficácia de um método sobre outro, a escolha da medicação é baseada na severidade dos sintomas, preferência da paciente, efeitos secundários, resposta terapêutica, necessidade de contracepção, custo e viabilidade (DUNSELMAN et al., 2014). Como pode haver importante recidiva dos sintomas (STREULI et al., 2013) e até 25% das pacientes terão efeitos secundários intoleráveis, ou resposta clínica insuficiente (VERCELLINI et al., 2009) , novas opções terapêuticas necessitam ser descobertas. A realização de estudos em endometriose que visem a comprovar a eficácia medicamentosa necessita de métodos invasivos, o que restringe estudos 19 com humanos e torna fundamental o uso de um bom modelo animal (ROSA-E- SILVA et al., 2010). Coelhos, ratos e camundongos tem se mostrado bo ns modelos para tais estudos (VERNON; WILSON, 1985; SHARPE -TIMMS, 2002) , sendo vastamente utilizado o modelo em roedores, proposto por Jon es (JONES, 1987). Por apresentar técnica cirúrgica simples, tem altas taxas de sucesso na indução da endometriose e é altamente reprodutível (SCHOR et al., 1999). A fim de testar novas medicações no tratamento da endometriose, usando modelo animais, e conhecendo o papel da MMP na patogenia da endometriose , procuramos inibidores exógenos da via de ação da MMP. A doxiciclina, que pertence à família das tetraciclinas quimicamente modificadas, é uma droga com ação celular pluripotente, incluindo a proliferação, a migração, a ap optose e a remodelação da matriz extracelular (BENDECK et al., 2002; LEE et al., 2006) . Ela e outros derivados de tetraciclina, são potentes inibidores não -específicos de metaloproteinases (GOLUB et al., 2001; ACHARYA et al., 2004; CHOI et al., 2004; LEE et al., 2004a, 2004b). Em adição aos efeitos inibidores sobre as metaloproteinases, a doxiciclina tem ou tras propriedades não antibióticas que são: anti -angiogênicos, anti - inflamatória e anti-apoptótica (SAPADIN; FLEISCHMAJER, 2006). 20 2. Justificativa A patogênese da endometriose envolve aumento da expressão de metaloproteinases de matriz , que por sua vez facilita a degradação e invasão tecidual, por isso drogas qu e inibam essa expressão devem ter um efeito sobre as lesões experimentalmente induzidas de endometriose. 21 3. Objetivos 3.1 Objetivo geral Comparar em um estudo exploratório o efeito da doxiciclina sobre as lesões endometrióticas induzidas em ratas. 3.2 Objetivo especifico Avaliar a influência d a doxicicli na sobre lesões de endometriose através de análise objetiva do tamanho final das les ões e da análise de marcadores de remodelamento de matriz extracelular e invasão tecidual (MMP9 – matrix metallopeptidase 9 e TIMP2 – metallopeptidase inhibitor 2) por imunohistoquímica. 22 4. Metodologia O estudo , de caráter exploratório, foi realizado nos Departamentos de Ginecologia e Obstetrícia e de Patologia e Medicina Legal e no Setor de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão preto da Universidade de São Paulo e foi aprovado no Comitê de Ética no uso de animais (CEUA) desta Instituição. (Anexo 1) 4.1 Animais e Procedimentos para Modelo experimental Foram utilizadas 30 ratas Wistar virgens, com aproximadamente 190g no início do experimento, provenientes do Serviço de Biotério do Campus Universitário de Ribeirão Preto. Primeiramente, para aclimatação antes do início do experimento, as ratas foram mantidas em gaiolas apropriadas, com 41x32 centímetros de perímetro e 17 cm de altura, com no máximo 4 animais por gaiola, sob controle de temperatura, umidade e luminosidade do ambiente por sete dias e alimentadas com água e ração Purina® para ratos a livre demanda. Após esse período, todas as ratas foram submetid as a l aparotomia para indução da lesão de endometriose experimental. 4.1.1 Técnica de indução das lesões de endometriose Primeiramente foi realizado indução anestésica usando injeção intraperitoneal com 0,3ml de cloridrato de quetamina 10% (Ketamina Agener, Un ião Química Farmacêutica Nacional AS, Uso veterinário) associado a 0,2ml de xilasina a 2mg/ml (Dopaser, Hertape Calier). A seguir, foram procedidos a tricotomia pélvica, os cuidados de antissepsia e a lavagem das luvas de látex com soro fisiológico para reduzir a formação de aderências. A abertura da cavidade pélvica foi realizada através de incisão longitudinal mediana de cerca de dois centímetros, a dois centímetros do púbis do roedor. Aberta a cavidade, foram ressecados quatro centímetros do corno uterin o direito, sendo o coto fec hado na sequência. A porção uterina dissecada, após imersão em soro fisiológico 0,9% a 4˚C por 2 minutos, foi incisada longitudinalmente para retirada de dois fragmentos de 5x5 milímetros. 23 Esses fragmentos de tecido endometrial foram suturados no peritônio próximo ao trato reprodutivo da rata, usando o fio Vicryl 6 -0 (Ethicon, Inc., New Jersey, EUA), com a face endometrial voltada para a cavidade pélvica, um fragmento à direita e o outro à esquerda. Posteriormente, a cavidade pélvica foi fechada com sutura contínua da musculatura e da pele usando Nylon 4 -0 (Mononylon 3-0, Ethicon, Inc. New Jersey, EUA). Todos os procedimentos descritos acima foram realizados pelo mesmo pesquisador e nenhuma suplementação hormonal foi administrada antes ou após a laparotomia. Foi utilizada como droga analgésica pós -operatório dipirona na dose de 100mg/kg por sete dias (ABBOTT; HELLEMANS, 2000). 4.1.2 Obtenção das lesões para análise macroscópica e imunohistoquímica Após 4 semanas do primeiro procedimento cirúrgico (NOVELLA-MAESTRE et al., 2009), as ratas foram alocadas em três grupos de 10 animais cada: um grupo controle (grupo Controle) , em que foi utilizada soro fisiológico intraperitoneal diariamente por 28 dias , um grupo que recebeu a droga doxiciclina em baixa dose intraperitoneal (5mg/kg/dia) diariamente por 28 dias (grupo Baixa Dose) e um terceiro grupo que recebeu a droga doxiciclina em alta dose intrap eritoneal (40mg/kg/dia) diariamente por 28 dias (grupo Alta Dose) (PRALL et al., 2002; LEE et al., 2006). Após as quatro semanas de tratamento, as ratas foram submetidas à eutanásia através da sobredosagem de anestésicos (xilasina + quetamina), no dobro da dose utilizada a nteriormente para a anestesia, e foi realizada a inspeção da cavidade abdomino -pélvica, com identificação e documentação das lesões , sendo medida as lesões no s dois maiores di âmetros e documentada através de fotografia macroscópica das lesões. 4.2 Processamento do material para Coloração e imunohistoquímica As lesões de endometriose foram excisadas para análise, depois fixadas em formol 10% para processamento para inclusão em parafina e coloração por hematoxilina e eosina (HE) para documentação e percepção da presença ou não de tecido endometrial e reação de imunohistoquímica. Foram realizados cortes histológicos de 4µm em cada lesão de endometriose, e divididos em 2 grupos. 24 Para o preparo da imunohistoquímica foi utilizado o kit Revel (Biogen): os cortes foram desparafinizados em xileno e hidratados em uma série de álcoois em ordem decrescente e água destilada. Em seguida, foram submetidos à recuperação antigênica com tampão de citrato (pH 6,0) em panela a vapor por 40 minutos e, logo após, as amostras foram resfriadas por 30 minutos em temperatura ambiente. Após o resfriamento, os cortes foram lavados em PBS para bloqueio da peroxidase endógena por 15 minutos, em TBST por 5 minutos e foi realizado o bloqueio da proteína com Protein Block por 10 minutos. Então, o primeiro grupo de amostras foi incubado no anticorpo primário MMP9(NCL-MMP9-439, diluição 1:100, fabricante Leica Biosystem ) e o segundo grupo de foi incubado no anticorpo primário TIMP 2(Rabbit Ant -Human Timp -2 Polyclonal Antibody, diluição 1:150, f abricante Gspring Bioscience) por 1 hora em temperatura ambiente. O processo para preparo das lâminas após foi o seguinte: lavagem em TBST por 1 minuto, aplicação de Revel Complemento por 10 minutos, aspiração, aplicação de HRP conjugado por 15 minutos, la vagem em TBST por 5 minutos, aplicação de DAB (3,3 diaminobenzina) por 105 segundos, lavagem em água destilada. A coloração foi realizada com Hematoxilina de Harris e azulada em amônia a 5%. Foi realizada a desidratação na ordem crescente de álcoois e xilo l, com montagem das lâminas com Entellan (Merck). As lâminas foram analisadas por dois examinadores independentes . As células foram marcadas positiva ou negativamente, para cada marcador, segundo critérios utilizados na literatura (WEIGEL et al., 2012) . Considerando -se como positivos os casos com mais de 10% de células marcadas. 4.3 Análise estatística Inicialmente foi realizada uma análise exploratória de dados através de medidas de posição central e de dispersão para as variáveis quantitativas. As variáveis qualitativas foram descritas através de frequências absolutas e relativas. O teste qui -quadrado foi utilizado para verificar se existe associação dos marcadores em relação aos grupos em estudo. Uma análise de variância foi desempenhada para verificar se existe diferença estatística dos grupos em relação as variáveis quantitativas, contrastes ortogonais foram aplicados quando necessário. O ajuste do modelo foi verificado considerando a análise de resíduos. As an álises 25 foram implementadas no programa SAS versão 9.4 . Foi considerado um nív el de significância de teste de 5%. 26 5. Resultados 5.1. Do preparo e coleta do material A média do peso inicial das ratas do grupo Controle foi de 201,4g, das ratas do grupo Baixa Dose (BD) foi 192,5g e das ratas do grupo Alta Dose(AD) foi 194,0g. Ao final do experimento, ou seja, no dia da eutanásia e da exérese das lesões, a média de pesos entre os grupos era de: 374g (Controle), 364,2g (BD) e 370,0g (AD). Assim, calcu lamos o ganho de peso de cada rata, desde o início ao final do experimento, com a diferença entre as médias obtidas (Δ PESO), e analisamos que não houve diferença estatística entre elas. (Tabela 1) Tabela 1. Distribuição das variáveis de peso em relação aos grupos. Grupo N Média DP Mediana Q1 Q3 Mínimo Máximo P-valor PESO INICIAL AD 10 194 11,93 189 186 204 180 214 BD 10 192,5 10,21 191 184 196 180 215 Controle 10 201,4 15,46 202 190 204 180 232 PESO FINAL AD 10 370 23,66 364 358 394 328 404 BD 10 364,2 33,43 359 340 371 326 436 Controle 10 374 55,22 361 334 398 300 466 Δ PESO AD 10 176 16,14 174 164 190 148 200 0,9461 BD 10 171,7 25,5 172 148 180 146 221 Controle 10 172,6 43,26 164 136 202 120 240 P-valor referente à análise de variância. 5.2. Da avaliação macroscópica das lesões Após a coleta das lesões, foram d ocumentadas (Figura 1 e 2) e anotadas as duas maiores medidas das lesões e calculadas suas áreas, evidenciando diferença estatística entre os grupos Alta Dose(AD) e Baixa Dose(BD) quando comparados ao grupo Controle (tabela 2). 27 Figura 1. Aspecto macroscópico das lesões peritoneais no momento da segunda abordagem cirúrgica Figura 2. Aferição das medidas após excisão das lesões 28 Tabela 2. Área final das lesões nos diferentes grupos. Grupo N Média DP Mediana Q1 Q3 Mínimo Máximo P-valor ÁREA DA LESÃO (mm2) AD** 10 29 11,98 30 20 36 12 48 0,0052 BD** 10 74,1 45,89 60 36 120 25 150 Controle* 10 161,1 137,07 110 72 225 20 400 P-valor referente a análise de variância. 5.3. Da avaliação histopatológica e imunohistoquímica A imunohistoquímica para MMP9 nas lesões endometrióticas evidenciou uma diminuição na positividade quanto maior fosse a dose, porém sem significância estatística (p=0,2713). (tabela 3) Tabela 3. Avaliação da positividade para MMP9 na imunohistoquímica das lesões entre os diferentes grupos. Grupos Variável Alta Dose Baixa Dose Controle P-valor* MMP9 NEGATIVO 4 (40) 2 (20) 1 (10) 0,2713 POSITIVO 6 (60) 8 (80) 9 (90) P-valor referente ao teste qui-quadrado. No Grupo Controle, nove ratas apresentaram positividade para MMP9 no tecido endometriótico e apenas uma rata apresentou negatividade (Figura 3). Figura 3. Exemplo de reação positiva ao MMP9 em rata do Grupo Controle (Microscopia, aumento 20x) 29 No Grupo Baixa Dose, oito ratas apresentaram lesões com reação posit iva e duas ratas com lesões negativas (Figura 4). Figura 4. Exemplo de reação negativa ao MMP9 em rata do Grupo Baixa Dose (Microscopia, aumento 20x) Por fim, no grupo de Alta Dose, seis ratas apresentaram positividade e quatro ratas negatividade (Figuras 5 e 6). Figuras 5 e 6. Exemplos de reação ao MMP9 positiva (à esquerda) e negativa (à direita) no Grupo Alta Dose (Microscopia, aumento 20x) 30 Já na imunohistoquímica para TIMP -2 nas lesões endometrióticas induzidas das ratas, o grupo Alta Dose evide nciou significância estatística (p=0,0009) na diminuição de reação positiva quando comparada aos grupos Baixa Dose e Controle. (tabela 4) Tabela 4. Avaliação da positividade para TIMP2 na imunohistoquímica das lesões entre os diferentes grupos. Grupos Variável Alta Dose Baixa Dose Controle P-valor* TIMP2 NEGATIVO 9 (90) 1 (10) 3 (30) 0,0009 POSITIVO 1 (10) 9 (90) 7 (70) P-valor referente ao teste qui-quadrado. No Grupo Controle, três ratas apresentaram negatividade para TIMP2 no tecido endometriótico e sete apresentaram positividade (Figuras 7 e 8). Figuras 7 e 8. Exemplos de reação ao TIMP2 positiva (à esquerda) e negativa (à direita) no Grupo Controle (Microscopia, aumento 20x) 31 No Grupo Baixa Dose, nove ratas apresentaram lesões com reação positiva e apenas uma rata com lesão negativa (Figura 9). Figura 9. Exemplo de reação positiva ao TIMP2 em rata do Grupo Baixa Dose (Microscopia, aumento 20x) Por fim, no grupo de Alta Dose, apenas uma rata apresent ou positividade enquanto nove ratas negatividade (Figura 10). Figura 10. Exemplo de reação negativa ao TIMP2 em rata do Grupo Alta Dose (Microscopia, aumento 20x) 32 6. Discussão O processo de formação do tecido endometrial ectópico pode ser mediado por fatores que facilitam a adesão à cavidade peritoneal, fatores de crescimento celular, maior atividade da aromatase, fatores angiogênicos, linfáticos, neurogênicos e a atividade ampliada das metaloproteinases da matriz (MMPs) (KONINCKX; KENNEDY; BARLOW, 1998; VAN LANGENDONCKT; CASANAS -ROUX; DONNEZ, 2002). Para que a adesão celular e a infiltração ocorram, o tecido deve primeiro sofrer modificações estruturais, como a destruição e remodelação da mat riz extracelular. Esta ação proteolítica ocorre através da ação de 2 proteases, como as serinas e as MMP(GUPTA et al., 2008). A família das MMP consiste em 23 enzimas divididas nos seguintes subgrupos: colagenases (MMP1, MM8 e MMP 13), gelatinases (MMP2 e MMP9), estromelisinas (MMP3, MMP10, e MMP11), e metaloproteinases de membrana (MT - MMPs), entre outras (NAGASE; VISSE; MURPHY, 2006) . Sendo que as mais importantes no processo etiopatogênico da endometriose são MMP2 e MMP9. A MMP9 está relacionada na decomposição da matriz extracelular em processos fisiológicos normais, como reprodução, desenvolvimento embrionário, remodelação de tecidos, e em processos patológicos, co mo artrite, metástases e a própria endometriose. A MMP9, assim como outras MMPs, tem demonstrado ser um fator importante na progressão e invasão de tumores de endométrio (GRAESSLIN et al., 2006). O mecanismo patogênico da endometriose inclui, além de proliferação e invasão tecidual, a degradação da matriz extracelular com facilitação na penetração da camada basal pe las células endometriais . Já tendo sido demonstrado níveis elevados de MMP9 no líquido peritoneal e no plasma em pacientes com endometriose (LIU et al., 2015) . Os níveis elevados de MMP, incluindo a MMP 9, foram observados no endométrio ectópico em comparação com o endom étrio eutópico. Além disso, as mulheres sem endometriose apresentam níveis mais baixos de expressão dessa s substâncias (DI CARLO et al., 2009) . Alguns estudos observaram que a falta de expressão d a atividade de MMP está relacionada a menos lesões ectópicas em ratos (BRUNER et al., 1997) . Consequentemente, a 33 atividade de enzimas que degradam a matriz extracelul ar pode facilitar a invasão da superfície peritoneal pelo tecido. As MMPs estão sob controle de inibidores de tecidos específicos de metaloproteinases (TIMPs) no nível pós -tradução. No entanto, os TIMPs não são simplesmente inibidores da atividade proteolí tica; eles também têm papéis multifuncionais, incluindo crescimento celular, angiogênese e apoptose (LAMBERT et al., 2004) . Mulheres com endometriose possuem uma expressão diferente de MMP9 e TIMP2 no e ndométrio tópico e ectópico, sendo que baixos níveis de TIMP2 no fluído peritoneal levam a um aumento na MMP9 e tal desequilíbrio favorece a degradação da matriz extracelular e a invasão tecidual, promovendo a implantação de tecido endometrial ectópico (LONDERO et al., 2012). O uso de inibidores de metaloproteinases sintéticos (MMPI) vem sendo estudado como opção terapêutica para o tratamento da endometr iose. A doxiciclina além da sua função antibiótica, possui propriedades anti -MMP bem reconhecidas que não estão bem definidas, agindo principalmente através da inibição da síntese e da atividade das MMP (HANEMAAIJER et al., 1998; THOMPSON; BAXTER, 1999; SAPADIN; FLEISCHMAJER, 2006). Sendo assim, a doxiciclina tem sido utilizada em alguns estudos clínicos e pré-clínicos para modular a atividade de MMP. Nesse estudo, o uso da doxiciclina apresentou redução , c om significância estatística, da área das les ões endometrióticas (p=0,0052) nos grupos de alta e de baixa dose quando comparados ao grupo controle, sugerindo assim que inibidores de metaloproteinases sintéticos possam estar correlacionados a inibição do crescimento da lesão. Na literatura, Akkaya et al. e Goktolga et al. (AKKAYA et al., 2009; GOKTOLGA et al., 2015) demonstraram, com significância estatística , diminuição do tamanho dos implantes endometrióticos quando usado doxiciclina em baixa dose (5mg/kg/dia) e doxiciclina em alta dose (40mg/kg/dia) em relação a um grupo controle, apesar de terem um viés de não usar medicação nenhuma no grupo controle, não causando o efeito de stress de administração medicamentosa, e como é sabido, a endometriose por ter etiologia multifatorial, o stress está relacionado a aumento de lesões endometrióticas em estudos animais (CUEVAS et al., 2012). No estudo imunohistoquímico, observou -se uma diminuição na expressão proteica da MMP9 nos gr upos de alta e baixa dose de doxiciclina em relação ao grupo controle, porém sem significância estatística. Nos únicos dois estudos que usaram doxiciclina para observar seu efeitos sobre lesões endometrióticas, a MM9 34 também não teve diminuição quando comparadas ao grupo controle (AKKAYA et al., 2009; GOKTOLGA et al., 2015). Já quando foi mensurado a expressão proteica do TIMP2, o grupo de ratas que foi administrado doxiciclina em alta dose teve forte diminuição na quantificação (p=0,0009) em relação aos grupos que usaram doxiciclina baixa dose e controle. Mesmo sabendo que o TIMP2 está em baixas doses no fluído de pacientes com endometriose (LONDERO et al., 2012) , o presente estudo mostrou que quando usado doxiciclina em alta dose, o TIMP2 tende a diminuir mais , o que já foi evidenciado em outros estudos, como de Singh et al. que demonstrou diminuição da TIMP2 após uso da doxiciclina em tecido gástrico (SINGH et al., 2011) e com Bian et al. que evidenciou o mesmo em córnea de olhos secos (BIAN et al., 2016) . Porém outros estudos demonstraram o contrário, tendo aumento da expressão da TIMP2 quando usado dox iciclina em tecido arterial (CHUNG et al., 2008; NAGAREDDY et al., 2012). Com relação a proporção TIMP/MMP, a literatura mostra resultados conflitantes quando relacionados a doenças neoplásicas com invasão tecidual . A maior parte dos estud os mostrou que quanto maior o grau de invasão tecidual ou gravidade do tumor, maior é a expressão d os TIMPs e da s MMPs, e o inverso também é verdadeiro, mostrando que quando as MMPs vêm diminuídas, é seguida da expressão baixa dos TIMPs, como no presente e studo quando se usou doxiciclina no grupo Alta Dose com diminuição do tamanho da lesão em relação ao grupo Controle. Isso demonstra que grande parte do nexo causal está relacionada ao desequilíbrio entre os fatores que moldam a matriz extracelular, ambos aumentando ou diminuindo concomitantes em alguns casos, apesar de se pensar que seria o contrário (ROSS et al., 2003; HONKAVUORI-TOIVOLA et al., 2013). A pesquisa experimental é uma forma de se obter conclusões causais, com relação a intervenções ou tratamentos, e estabelecer se um ou mais fatores causam uma mudanç a em um resultado. Por meio desta associando análises imunohistoquímicas e avaliação macroscópica foi possível analisar a resposta das lesões experimentalmente induzidas perante o uso da doxiciclina. 35 7. Conclusões No presente estudo da ação da doxiciclin a nas lesões endometrióticas experimentalmente induzidas em ratas, observamos que: a) Houve redução significativa da área das lesões entre os gru pos, sugerindo que a doxiciclina tenha um efeito positivo no controle da doença; b) A avaliação da expressão proteic a de MMP nas lesões demonstra uma tendência a redução para os grupos que usaram a medicação quando comparados ao grupo controle; c) A quantificação de TIMP2 foi significativamente menor no grupo Alta Dose quando comparado aos outros dois grupos, concluindo qu e talvez a doxiciclina possa agir como feedback negativo na produção da TIMP2, seja ela por ter efeito anti -MMP diminuindo assim a necessidade de expressão endógena do mesmo, ou por outros fatores ainda não descobertos. Esses achados permitem concluir que inibidores da metaloproteinases sintéticos sejam opções reais para o tratamento da endometriose, com grandes perspectivas de ação seletiva na lesão, sem prejuízo da função reprodutiva da paciente. Sendo assim, a doxiciclina por ser uma medicação desta cla sse já liberada no mercado, de baixo custo , bom perfil de tolerabilidade e fácil administração, seria uma nova frente no tratamento clinico para pacientes com endometriose. Porém mais estudos adicionais deverão ser realizados para analisar sua eficácia como adjunto na terapia para endometriose. 36 Referências Bibliográficas ABBOTT, F. V.; HELLEMANS, K. G. C. Phenacetin, acetaminophen and dipyrone: Analgesic and rewarding effects. Behavioural Brain Research , v. 112, n. 1 –2, p. 177–186, 2000. ACHARYA, M. R.; VENITZ, J.; FIGG, W. D.; SPARREBOOM, A. Chemically modified tetracyclines as inhibitors of matrix metalloproteinasesDrug Resistance Updates, 2004. . 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