{"paper_id":"d647aeb6-2341-4b09-8cd8-818cce76c050","body_text":"UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO \n \n \n \n \nFERNANDO PASSADOR VALÉRIO \n \n \n \n \n \nInfluência da doxiciclina em endometriose  \nexperimentalmente induzida em ratas \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2018 \n\n \n \nFERNANDO PASSADOR VALÉRIO \n \n \n \n \n \nInfluência da doxiciclina em endometriose experimentalmente induzida em ratas \n \n \nVersão Original \n \n \nDissertação apresentada ao \nDepartamento de Ginecologia e \nObstetrícia da Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto - Universidade de São \nPaulo para obtenção do título d e Mestre \nem Ciências Médicas. \n \n \n \nÁrea de concentração: Tocoginecologia \n \nOrientador: Prof. Dr. Júlio César Rosa e Silva \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nRibeirão Preto \n2018 \n\n \n \nAutorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por \nqualquer meio convencional ou elet rônico, para fins de estudo e pesquisa, \ndesde que citada a fonte. \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nValério, Fernando Passador.  \n \n Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente \ninduzida em ratas. / Fernando Passador Valério; orientador  Júlio \nCésar Rosa e Silva. Ribeirão Preto, 2018. \n  \n \nDissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto  \nUniversidade de São Paulo, 2018. \n \n \n \n1.Endometriose. 2.Metaloproteinase.  3. Invasão Tecidual .  \n4.TIMP. 5.Doxiciclina. 6. Ratas \n \n \n \n \n\n \nNome: VALÉRIO, Fernando Passador \nTítulo: Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente induzida em \nratas. \nDissertação apresentada à Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto da Universidade de São Paulo para a \nobtenção de título de Mestre em Tocoginecologia. \n  \nAprovado em:  \n \n \nBanca Examinadora \n \n \nProf. Dr. _________________________________________________________ \nInstituição: _________________________________________________________ \nJulgamento: _________________________________________________________  \n \nProf. Dr. _________________________________________________________ \nInstituição: _________________________________________________________ \nJulgamento: _________________________________________________________ \n \nProf. Dr. _________________________________________________________ \nInstituição: _________________________________________________________ \nJulgamento: _________________________________________________________ \n \n \n \n \n\n \nDedicatória \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n                                               \n \nAos meus pais  Fátima e João Marcos  (in memoriam ), pelos \nprimeiros e mais importantes ensinamentos, e todas as \noportunidades e amor que me proporciona m desde o meu \nnascimento. \n \nÀ Paola, esposa amada, amor da minha vida, companheira em \ntodas as horas, apoio incondicional a todos os meus sonhos. \n \nAo meu irmão Maurício e sua cônjuge Mariana, pela torcida, \nmesmo à distância, e carinho que mutuamente nos fortalece. \n \n \n \n \n \n\n \nAgradecimento especial                                 \n \n                                                   \n \n \n \n \n \nAo meu orientador Prof. Dr. Júlio César Rosa e Silva , grande \nprofessor e amigo, que me ensinou muito do que sei, e  que \nacreditou em mim quando tudo parecia não funcionar e muitos \nnão acreditaram.  Também, pela compreensão, paciência e \nprincipalmente por poder contar com sua amizade. \n \n\n \nAgradecimentos \n A toda minha família que sempre me apoiou e manifestou palavras de \nânimo. \n Ao Departamento de Ginecologia e Obstetr ícia da FMUSP - Ribeirão Preto \nque permitiu realizar e concluir este projeto \n À Comissão de Pós -graduação em Tocoginecologia pelo apoio e incentivo \nem tantas ocasiões e a todos que compõe o Departamento de Ginecologia e \nObstetrícia da Faculdade de Ribeirão Preto, pelo contínuo aprendizado, \nindispensável à minha formação profissional.   \n Aos funcionários Sr. Reinaldo Tavares, Sra. Rosane  Casula, Gabriela \nFrancisco Sicca e Suelen Soares, incansáveis colaboradores de minha jornada. \n Aos Professores Drs. Omero B enedicto Poli-Neto, Antônio Alberto Nogueira, \nPedro Sergio Magnani e Dra. Juliana Meola pelos inestimáveis conselhos, correções \ne co-orientações.  \n Às amigas Cristiana Carolina Padovan e  Laura Midori Kawasse , \nindispensáveis aos passos técnicos, e principal mente pela amizade que tornaram a \ncaminhada mais amena e prazerosa.   \n A todos os funcionários do Setor de Cirurgia Experimental do Hospital, José \nCarlos Vanni, Paulo Alves Junior, Paulo Castilho, Danniely da Silva Barros, Wagner \nAndrade de Oliveira, Danie l Mazetto e Ariane Mirela Saranzo Sant’Ana,  por todos \nincontáveis momentos que me auxiliaram e se dedicaram para a conclusão do meu \nprojeto. \n Aos amigos do Setor de Vídeo -endoscopia Ginecológica do Departamento \nem especial os grandes colegas Dra. Ana Carol ina Tagliatti Zani, Dra. Júlia K. \nTroncon e Dr. Rodrigo Hudari Garcia, pela alegria que tem sido conviver com vocês, \ndentro e fora do trabalho. \n Ao grande amigo Dr. José Vitor Cabral Zanardi , parceiro, sócio e grande \nprofessor, que sem seus ensinamentos nã o teria conseguido chegar onde cheguei \nprofissionalmente. \n\n \n Ao chefe do Departamento de Patologia Faculdade de Medicina de Ribeirão \nPreto, Prof. Dr. Alfredo Ribeiro da Silva, pelo apoio, incentivo e conhecimento \nrepassados. \n Aos roedores, animais do Laborat ório de Cirurgia Experimental da \nFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto que participaram deste estudo pela \ninestimável serventia.  \n A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste \ntrabalho. \n \n \n \n\n \nVALÉRIO, F. P. Influência da doxiciclina em endometriose experimentalmente \ninduzida em ratas. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Medicina de \nRibeirão Preto. Ribeirão Preto, 2018.  \nResumo \nA endometriose é uma doença de origem multifatorial , caracterizada por \npresença de tecido endometrial for a da cavidade uterina, responsável por sintomas \nálgicos com grande impacto na qualidade de vida da paciente, além de ser um dos \nprincipais fatores de infertilidade. Muitos estudos já foram realizados no intuito de \nexplicar a etiopatogenia da endometriose, assim como muito tem sido estudado para \nencontrar novas estratégias de tratamento. Várias linhas de medicamentos têm sido \nestudadas com este intuito, agindo em diferentes pontos da etiopatogênese da \ndoença, uma delas na inibição de metaloproteinases da mat riz extracelular, que tem \npapel no remodelamento do mesotélio do peritônio e angiogênese. O objetivo deste \nestudo foi avaliar a influência de uma droga (doxiciclina) de baixo custo, com ação \nconhecida na inibição das metaloproteinases, em endometriose peri toneal induzida \nem ratas . Para isso, fo ram usadas 30 ratas adultas Wistar com lesão induzida de \nendometriose, divi didas em três grupos, um grupo controle (C, n=10) sem \ntratamento, um grupo onde foi administrado doxiciclina em baixa dose (BD, n=10) e \num gru po onde foi realizado doxiciclina em alta dose (AD, n=10). Foi realizada \navaliação da área das lesões de cada rata e estudo imunohistoquímico para \npositividade de  anticorpo primário de  metaloproteinase de matriz 9 (MMP9) e de \ninibidor de metaloproteinase d e matriz 2 (TIMP2) . A doxiciclina atuou reduzindo a \nárea das lesões nos grupos BD e AD (p=0,0052) em relação ao grupo C e reduzindo \na expressão do TIMP2 no grupo AD (p=0,0009) em relação aos grupos BD e C. Não \nhouve resultado significativo na expressão da MMP9.  \nPalavras-chave: Endometriose. Doxiciclina. MMP. TIMP. Metaloproteinase. Invasão \nTecidual. Ratas. Matriz extracelular. \n \n\n \nVALÉRIO, F. P. Influence of doxycycline in experimentally induced \nendometriosis in rats. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Med icina de \nRibeirão Preto. Ribeirão Preto, 2018. \nAbstract \n Endometriosis is a multifactorial origin  disease, characterized by the presence \nof endometrial tissue outside the uterine cavity, responsible for painful symptoms with \nimportant impact on the life quality of the patient, besides being one of the main factors \nof infertility. Many studies have already been carried out to explain the \netiopathogenesis of endometriosis, and much has been studied to find new treatment \nstrategies. Several lines of drugs have been studied for this purpose, acting at different \npoints in the etiopathogenesis of the disease, one of them in the inhibition of \nextracellular matrix metalloproteinases, which plays a role in the remodeling of the \nperitoneum mesothelium and angiogenesis. The purpose of this study was to evaluate \nthe influence of a low-cost drug (doxycycline), with known action on the inhibition of \nmetalloproteinases, in induced peritoneal endometriosis in rats. Thirty adult Wistar rats \nwith endometriosis -induced lesions were divided into three groups: one untreated \ncontrol group (C, n = 10), one group receiving low dose doxycycline (BD, n = 10) and a \ngroup where high dose doxycycline (AD, n = 10) was performed. An evaluation  of the \nlesion area of each rat and immunohistochemical study for primary antibody to matrix \nmetalloproteinase 9 (MMP9) and matrix metalloproteinase inhibitor 2 (TIMP2) was \nperformed. Doxycycline worked by reducing the area of lesions in the BD and AD \ngroups (p = 0.0052) in relation to the C group and reducing the expression of TIMP2 in \nthe AD group (p = 0.0009) in relation to the BD and C groups. There was no significant \neffect on MMP9 expression in the present study. \nKey words: Endometriosis. Doxycycl ine. MMP. TIMP. Metal loproteinase. Tissue \nInvasion. Rats. Extracellular matrix. \n \n \n\n \nLista de Tabelas \n \nTabela 1: Distribuição das variáveis de peso em relação aos grupos ............ 26 \nTabela 2: Área final das lesões nos diferentes grupos ................................... 28 \nTabela 3: Avaliação da positividade para MMP9 na imunohistoquímica das \nlesões entre os diferentes grupos ................................................... \n    \n28 \nTabela 4: Avaliação da positividade para TIMP2 na imunohistoquímica das \nlesões entre os diferentes grupos ................................................... \n   \n30 \n \n \n\n \nLista de Figuras \n \nFigura 1: Aspecto macroscópico das lesões peritoneais no momento \nda segunda abordagem cirúrgica............................................. \n   \n27 \nFigura 2: Aferição das medidas após excisão das lesões....................... 27 \nFigura 3: Exemplo de reação positiva ao MMP9 no Grupo Controle \n(Microscopia, aumento 20x)..................................................... \n    \n28 \nFigura 4: Exemplo de reação negativa ao MMP9 no Grupo Baixa Dose \n(Microscopia, aumento 20x)..................................................... \n   \n29 \nFiguras 5 e 6: Exemplos de reação ao MMP9 positiva (à esquerda) e \nnegativa (à direita) no Grupo Alta Dose (Microscopi a, \naumento 20x)............................................................................ \n                       \n29 \nFiguras 7 e 8: Exemplos de reação ao TIMP2 positiva (à esquerda) e \nnegativa (à direita) no Grupo Controle (Microscopia, aumento \n20x) .......................................................................................... 30 \nFigura 9: Exemplo de reação positiva ao TIMP2 no Grupo Baixa Dose \n(Microscopia, aumento 20x).................................................... 31 \nFigura 10: Exemplo de reação negativa ao TIMP2 no Grupo Alta Dose \n(Microscopia, aumento 20x).................................................... 31 \n\n \nLista de Abreviaturas \n \nABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas \nAD Grupo Alta Dose \nBD Grupo Baixa Dose \nCEUA Comitê de Ética no Uso de Animais \nFMRP-USP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo \nHE Hematoxilina e Eosina \nMEC Matriz extracelular \nMMP Metaloproteinase de Matriz \nMMP9 Metaloproteinase de Matriz 9 \nMMPs Metaloproteinases \nPBS Tampão de solução salina \nPCNA Antígeno nuclear celular proliferativo \npH Potencial hidrogênio \nTBST Tris buffered saline e Polissorbato 20 \nTIMPs Inibidor tecidual de metaloproteinases de matriz \nTIMP2 Inibidor tecidual de metaloproteinase 2 \nUSP Universidade de São Paulo \nUK United Kingdom \nZn Zinco \n  \n  \n \n \n \n\n \nLista de Símbolos \n \n% Porcentagem \ng gramas \ncm centímetros \nmm2 milímetros quadrados \nºC graus Celsius \n® Marca Registrada \nml mililitro \nmg miligrama \nkg quilograma \nμl microlitro \n \n \n\n \nSUMÁRIO \n \n1. Introdução………………………………………………………..…………............. 16 \n2. Justificativa..…………………………………………..…………………………..... 20 \n3. Objetivos.....………………………………………………...……………………….. 21 \n     3.1 Objetivo geral.............................................................................................. 21 \n     3.2 Objetivos específicos…………………………………….............………...….. 21 \n4. Metodologia…..................…………………………………..……………………... 22 \n     4.1 Animais e Procedimentos para Modelo experimental ……….................... 22 \n          4.1.1 Técnica de indução das lesões de endometriose..….…....……….... 22 \n          4.1.2 Obtenção das lesões para análise histológica e molecular............... 23 \n     4.2 Processamento do material para Coloração e Imunohistoquímica............ 23 \n     4.3 Análise estatística..........................…………………..…………................... 24 \n5 Resultados..........................................………..…..……………………………..... 26 \n     5.1 Do preparo e coleta do material...........…………………..…………..……… 26 \n     5.2 Da avaliação macroscópica das lesões..................................................... 26 \n     5.3 Da avaliação histopatológica e imunohistoquímica.................................... 28 \n6. Discussão………………………………………………………………..……...…... 32 \n7. Conclusões.................……………………………………………………………… 35 \nReferências bibliográficas………………………………………………...…........... 36 \nAnexo.................................................................................................................... 43 \n  \n \n\n16 \n \n1. Introdução \n \nEndometriose é uma doença caracterizada pela presença de tecido \nendometrial funcionante (glândula e/ou estroma) fora da cavidade uterina.  As lesões \nsão usualmente localizadas na pelve, porém podem ocorrer em múltiplas localidades \ncomo intestino, diafragma, cavidade pleural entre outras  (VERCELLINI et al., 2014) . \nSua prevalência varia de 5 a 15% das mulheres no período reprodutivo, em torno de \n3% na pó s-menopausa, enquanto que nas mulheres inférteis pode oscilar entre 20 a \n50% (BALLARD et al., 2008) . Em uma proporção significativa de mulheres \nportadoras de endometriose , entre 3 a 22% , observa -se que elas são \nassintomáticas. Mas, na maioria das vezes, apresentam sintomas diversos, sendo os \nprincipais dismenorreia, dor pélvica crônica, infertilidade, dispareunia de \nprofundidade e sintomas intestinais e urinários cíclicos, como dor ou sangramento \nao evacuar ou urinar durante o período menstrual (VIGANÒ et al., 2004; BELLELIS \net al., 2010). \nVárias teorias tentam explicar a etiopatogenia da endometriose, já que a \nmesma é multifatorial, incluindo implantação de tecido endometrial pela menstruação \nretrógrada via tuba uterina, alteração de imunidade, descontrole do balanço entre \napoptose e proliferação celular, sinalização endocrinológica alterada e fatores \ngenéticos (SAMPSON, 1927; RAHMIOGLU et al., 2014) . Vários novos estudos com \nfoco na identificação de genes  relacionados a endometriose não malignas \nevidenciaram mutações em genes associados a neoplasias em até 79% das lesões \nendometrióticas (ANGLESIO et al., 2017).  \nSe levarmos em consideração que a menstruação retrógrada ocorre em 76 a \n90% das mulheres que menstruam, incidência maior que a da própria endometriose, \na teoria da menstruação retrógrada não é suficiente para explicá -la. Embora o \nmecanismo exato pelo qu al o refluxo do endométrio menstrual para implantação \nectópica permaneça desconhecida, adesão, invasão e o desenvolvimento da doença \nexigem um aumento da expressão de metaloproteinases de matriz (MMP), levando a \nremodelação da camada de mesotélio peritonea l e angiogênese  (SILLEM et al., \n1998; BRUNER -TRAN et al., 2002; OSTEEN et al., 2002; SHARPE -TIMMS; COX, \n2002). \n\n17 \n \nAs metaloproteinases são uma família de endoproteases dependentes de \ncálcio e zinco, que estão envolvidas na degradação da matriz extracelular e \nmembrana basal. Elas influenciam o resultado de reações inflamatórias, \nangiogênese e tecido de remodelação, por conseguinte, mediam uma gran de \nvariedade de processos biológicos normais, incluindo desenvolvimento embrionário, \novulação, menstruação e cicatrização de feridas (MOTT; WERB, 2004) . Eles \ntambém estão implicados em vário s processos patológicos tais como cancro, \naterosclerose, doenças inflamatórias ou endometriose (MEDURI; BAUSERO; \nPERROT-APPLANAT, 2000; NELSON et al., 2000). A ligação entre a expressão das \nmetaloproteinases e etiopatologia da endometriose tem sido amplamente estudada ,  \n(CHUNG et al., 2001; COX; PIVA; SHARPE -TIMMS, 2001; LIU; HE; PENG, 2002; \nRIA et al., 2002; WU et al., 2005) . As MMPs estão envolvidas na implantação \nectópica e invasão dos tecidos endometriais pois facilitam a degradação da matriz \nextracelular e ajuda m na penetração da membrana basal. Como um membro \nimportante da família MMPs, a metaloproteinase do tipo IX  (MMP-9) é um tipo de \nenzima gelatinase que participa da degradação do colágeno do tipo III, IV e V, além \nda elastina. Também exerce funções importantes na facilitação da neo-angiogênese, \nque acelera a expansão seletiva das células endoteliais vasculares e aumenta o \nfluxo sanguíneo, beneficiando assim o crescimento invasivo do endométrio ectópico  \n(YU et al., 2008; LIU et al., 2015).   \nSupressão e a regulação negativa da exp ressão das MMPs inibem o \nestabelecimento de lesões ectópicas do endométrio humano em experimentos com \nratos (BRUNER-TRAN et al., 2002, 2006) . As MMPs são reguladas em múltiplos \nníveis, incluindo transcrição, secreção, ativação das formas zimogênicas, inibição \nextracelular e internalização por endocitose. A atividade de MMP é modulada \npositivamente por íons e reagent es que induzem sua clivagem e ativação. Os \nquelantes de Zn2+ reprimem a atividade de MMP privando-os do Zn2+ crítico para sua \natividade (NEWSOME et al., 2007) . As MMPs também são inibidas por inibidores \nendógenos e exógenos. Os inibidores de tecidos das metaloproteinases (TIMPs) são \nos principais regul adores endógenos das MMPs e consistem em quatro membros \nhomólogos (TIMP1-4; 6, 7, 8). Os TIMPs são proteínas multifuncionais que inibem a \ninvasão celular in vitro , oncogênese e metástase in vivo (GOMEZ et al., 1997) . \nEmbora cada TIMP pare ça capaz de inibir várias MMPs, essas proteínas exibem \n\n18 \n \ncapacidade de inibição preferencial; por exemplo, TIMPs1 e 2 inibem seletivamente \nMMP9 e 2, respectivamente (BAKER; AHONEN; KÄHÄRI, 2002). \nOutras teses para a manifestação do tecido endometrióti co, como origem \nimunológica e metaplasia celômica, tem sido estudado para explicar o aparecimento \nde endometriose em mulheres pré -puberes e homens, bem como em locais como \ncavidade pleural e meninge. O surgimento de lesões de endometriose no espaço \nretroperitoneal, vagina, colo do útero, cicatriz umbilical e pleura pode ser explicado \npela disseminação linfática e hematogênica de células endometriais  (SUGINAMI, \n1991; CHUNG et al., 2002; DING et al., 2002; WITZ et al., 2002). \nNa investigação de endometriose, o padrão ouro ainda para o diagnóstico se \nbaseia na laparoscopia com visualização direta das lesões com confirmação \nhistológica. O tratamento cirúrgico tem a intenção  principal de aumentar as taxas de \nfertilidade e reduzir a dor. Para tanto, é necessário remover todas as lesões visíveis \ne restaurar a anatomia pélvica, o que torna a laparoscopia um procedimento \ndiagnóstico e terapêutico (BULLETINS--GYNECOLOGY, 2010).  \nBasear todo o tratamento da endometriose na cirurgia nem sempre é \nadequado, pois a endometriose apresenta várias aparências e nem sempre é \npossível identificá-las todas, além de aumentar o risc o de morbimortalidade para a \npaciente (HOWARD, 2011). É nesse ponto que se faz necessária  a associação de \nmedicamentos que reduzam o crescimento das lesões, bem como o aparecimento \nde novas e tragam melhora dos sintomas apresentados clinicamente  (PETTA et al., \n2009). \n As medicações mais usadas para tratamento clínico incluem analgésicos não \nesteroidais, contraceptivos hormonais, agonistas do hormônio liberador de \ngonadotropina (GnRH) e inibidores de aromatase. Como ainda n ão há consenso na \nliteratura sobre eficácia de um método sobre outro, a escolha da medicação é \nbaseada na severidade dos sintomas, preferência da paciente, efeitos secundários, \nresposta terapêutica, necessidade de contracepção, custo e viabilidade  \n(DUNSELMAN et al., 2014). \nComo pode haver importante recidiva dos sintomas  (STREULI et al., 2013)  e \naté 25% das pacientes terão efeitos secundários intoleráveis, ou resposta clínica \ninsuficiente (VERCELLINI et al., 2009) , novas opções terapêuticas necessitam ser \ndescobertas. A realização de estudos em endometriose que visem a comprovar a \neficácia medicamentosa necessita de métodos invasivos, o que restringe estudos \n\n19 \n \ncom humanos e torna fundamental o uso de um bom modelo animal  (ROSA-E-\nSILVA et al., 2010). \nCoelhos, ratos e camundongos tem se mostrado bo ns modelos para tais \nestudos (VERNON; WILSON, 1985; SHARPE -TIMMS, 2002) , sendo vastamente \nutilizado o modelo em roedores, proposto por Jon es (JONES, 1987). Por apresentar \ntécnica cirúrgica simples, tem altas taxas de sucesso na indução da endometriose e \né altamente reprodutível (SCHOR et al., 1999). \nA fim de testar novas medicações no tratamento da endometriose, usando \nmodelo animais, e conhecendo o papel da  MMP na patogenia da endometriose , \nprocuramos inibidores exógenos da via de ação da MMP. A doxiciclina, que pertence \nà família das tetraciclinas quimicamente modificadas, é uma droga com ação celular \npluripotente, incluindo a proliferação, a migração, a ap optose e a remodelação da \nmatriz extracelular (BENDECK et al., 2002; LEE et al., 2006) . Ela e outros derivados \nde tetraciclina, são potentes inibidores não -específicos de metaloproteinases  \n(GOLUB et al., 2001; ACHARYA et al., 2004; CHOI et al., 2004; LEE et al., 2004a, \n2004b). Em adição aos efeitos inibidores sobre as metaloproteinases, a doxiciclina \ntem ou tras propriedades não antibióticas que são: anti -angiogênicos, anti -\ninflamatória e anti-apoptótica (SAPADIN; FLEISCHMAJER, 2006). \n \n \n\n20 \n \n2. Justificativa \n \nA patogênese da endometriose envolve aumento da expressão de \nmetaloproteinases de matriz , que por sua vez facilita a degradação e invasão \ntecidual, por isso drogas qu e inibam essa expressão  devem ter um efeito sobre as \nlesões experimentalmente induzidas de endometriose. \n \n\n21 \n \n3. Objetivos \n \n3.1 Objetivo geral \n \nComparar em um estudo exploratório  o efeito da doxiciclina sobre as lesões \nendometrióticas induzidas em ratas.  \n \n3.2 Objetivo especifico \n \nAvaliar a influência d a doxicicli na sobre lesões de endometriose através de \nanálise objetiva do tamanho final das les ões e da análise de  marcadores de \nremodelamento de matriz extracelular e invasão tecidual  (MMP9 – matrix \nmetallopeptidase 9 e TIMP2 – metallopeptidase inhibitor 2) por imunohistoquímica. \n \n\n22 \n \n4. Metodologia \n \nO estudo , de caráter exploratório,  foi realizado nos Departamentos de \nGinecologia e Obstetrícia e de Patologia e Medicina Legal  e no Setor de Cirurgia \nExperimental do Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de \nRibeirão preto da Universidade de São Paulo  e foi aprovado no Comitê de Ética no \nuso de animais (CEUA) desta Instituição. (Anexo 1) \n \n4.1 Animais e Procedimentos para Modelo experimental \n \nForam utilizadas 30 ratas Wistar virgens, com aproximadamente  190g no \ninício do experimento, provenientes do Serviço de Biotério do Campus Universitário \nde Ribeirão Preto. Primeiramente, para aclimatação antes do início do experimento, \nas ratas foram mantidas em gaiolas apropriadas, com 41x32 centímetros de \nperímetro e 17 cm de altura, com no máximo 4 animais por gaiola, sob controle de \ntemperatura, umidade e luminosidade do ambiente por sete dias e alimentadas com \nágua e ração Purina® para ratos a livre demanda. Após esse período, todas as ratas \nforam submetid as a l aparotomia para indução da lesão de endometriose  \nexperimental. \n \n4.1.1 Técnica de indução das lesões de endometriose \n \nPrimeiramente foi realizado indução anestésica usando injeção intraperitoneal \ncom 0,3ml de cloridrato de quetamina 10%  (Ketamina Agener, Un ião Química \nFarmacêutica Nacional AS, Uso veterinário) associado a 0,2ml de xilasina a 2mg/ml \n(Dopaser, Hertape Calier). A seguir, foram procedidos a tricotomia pélvica, os \ncuidados de antissepsia e a lavagem das luvas de látex com soro fisiológico para \nreduzir a formação de aderências. A abertura da cavidade pélvica foi realizada \natravés de incisão longitudinal mediana de cerca de dois centímetros, a dois \ncentímetros do púbis do roedor. Aberta a cavidade, foram ressecados quatro \ncentímetros do corno uterin o direito, sendo o coto fec hado na sequência. A porção \nuterina dissecada, após imersão em soro fisiológico 0,9% a 4˚C por 2 minutos, foi \nincisada longitudinalmente para retirada de dois fragmentos de 5x5 milímetros. \n\n23 \n \nEsses fragmentos de tecido endometrial foram suturados no peritônio  próximo ao \ntrato reprodutivo da rata, usando o fio Vicryl 6 -0 (Ethicon, Inc., New Jersey, EUA), \ncom a face endometrial voltada para a cavidade pélvica, um fragmento à direita e o \noutro à esquerda. Posteriormente, a cavidade pélvica foi fechada com sutura \ncontínua da musculatura e da pele usando Nylon 4 -0 (Mononylon 3-0, Ethicon, Inc. \nNew Jersey, EUA). Todos os procedimentos descritos acima foram realizados pelo \nmesmo pesquisador e nenhuma suplementação hormonal foi administrada antes ou \napós a laparotomia.  Foi utilizada como droga analgésica pós -operatório dipirona na \ndose de 100mg/kg por sete dias (ABBOTT; HELLEMANS, 2000). \n \n4.1.2 Obtenção das lesões para análise macroscópica e imunohistoquímica \n  \nApós 4 semanas do primeiro procedimento cirúrgico  (NOVELLA-MAESTRE et \nal., 2009), as ratas foram alocadas em três grupos de 10 animais cada: um grupo \ncontrole (grupo Controle) , em que foi utilizada soro fisiológico intraperitoneal  \ndiariamente por 28 dias , um grupo que recebeu a droga doxiciclina em baixa dose \nintraperitoneal (5mg/kg/dia) diariamente por 28 dias (grupo Baixa Dose) e um \nterceiro grupo que recebeu a droga doxiciclina em alta dose intrap eritoneal \n(40mg/kg/dia) diariamente por 28 dias (grupo Alta Dose) (PRALL et al., 2002; LEE et \nal., 2006). \nApós as quatro semanas de tratamento, as ratas foram submetidas à \neutanásia através da sobredosagem de anestésicos (xilasina + quetamina), no dobro \nda dose utilizada a nteriormente para a anestesia, e foi realizada a inspeção da \ncavidade abdomino -pélvica, com identificação e documentação das lesões , sendo \nmedida as lesões no s dois maiores di âmetros e documentada através de fotografia \nmacroscópica das lesões. \n \n4.2 Processamento do material para Coloração e imunohistoquímica \n \nAs lesões de endometriose foram excisadas para análise, depois fixadas em \nformol 10% para processamento para inclusão em parafina e coloração por \nhematoxilina e eosina (HE) para documentação e percepção da presença ou não de \ntecido endometrial e reação de imunohistoquímica.  Foram realizados cortes \nhistológicos de 4µm em cada lesão de endometriose, e divididos em 2 grupos. \n\n24 \n \nPara o preparo da imunohistoquímica foi utilizado o kit Revel (Biogen): os  \ncortes foram desparafinizados em xileno e hidratados em uma série de álcoois em  \nordem decrescente e água destilada. Em seguida, foram submetidos à recuperação  \nantigênica com tampão de citrato (pH 6,0) em panela a vapor por 40 minutos e, logo  \napós, as amostras foram resfriadas por 30 minutos em temperatura ambiente. \nApós o resfriamento, os cortes foram lavados em PBS para bloqueio da  \nperoxidase endógena por 15 minutos, em TBST por 5 minutos e foi realizado o  \nbloqueio da proteína com Protein Block por 10 minutos. \nEntão, o primeiro grupo de  amostras foi incubado no anticorpo primário \nMMP9(NCL-MMP9-439, diluição 1:100, fabricante Leica Biosystem ) e o segundo \ngrupo de foi incubado no anticorpo primário TIMP 2(Rabbit Ant -Human Timp -2 \nPolyclonal Antibody, diluição 1:150, f abricante Gspring Bioscience) por 1 hora em \ntemperatura ambiente. O processo para preparo das  lâminas após foi o seguinte: \nlavagem em TBST por 1 minuto, aplicação de Revel  Complemento por 10 minutos, \naspiração, aplicação de HRP conjugado por 15  minutos, la vagem em TBST por 5 \nminutos, aplicação de DAB (3,3 diaminobenzina)  por 105 segundos, lavagem em \nágua destilada. A coloração foi realizada com  Hematoxilina de Harris e azulada em \namônia a 5%. Foi realizada a desidratação na  ordem crescente de álcoois e xilo l, \ncom montagem das lâminas com Entellan (Merck).  \nAs lâminas foram analisadas por dois examinadores independentes . As \ncélulas foram marcadas positiva ou negativamente, para cada marcador, segundo \ncritérios utilizados na literatura (WEIGEL et al., 2012) . Considerando -se como \npositivos os casos com mais de 10% de células marcadas. \n \n4.3 Análise estatística \n \nInicialmente foi realizada uma análise exploratória de dados através de \nmedidas de posição central e de dispersão para as variáveis quantitativas. As \nvariáveis qualitativas foram descritas através de frequências absolutas e relativas.  \nO teste qui -quadrado foi utilizado para verificar se existe associação dos \nmarcadores em relação aos grupos em estudo. Uma análise de variância foi \ndesempenhada para verificar se existe diferença estatística dos  grupos em relação \nas variáveis quantitativas, contrastes ortogonais foram aplicados quando necessário. \nO ajuste do modelo foi verificado considerando a análise de resíduos. As an álises \n\n25 \n \nforam implementadas no programa SAS versão 9.4 . Foi considerado um nív el de \nsignificância de teste de 5%. \n \n\n26 \n \n5. Resultados \n \n5.1. Do preparo e coleta do material \n \nA média do peso inicial das ratas  do grupo Controle  foi de 201,4g, das ratas \ndo grupo Baixa Dose (BD) foi 192,5g e das ratas do grupo Alta Dose(AD) foi 194,0g. \nAo final do experimento, ou seja, no dia da eutanásia e da exérese das lesões, a \nmédia de pesos entre os grupos era de: 374g (Controle), 364,2g (BD) e 370,0g (AD). \nAssim, calcu lamos o ganho de peso de cada rata, desde o início ao final  do \nexperimento, com a diferença entre as médias obtidas (Δ PESO), e analisamos que \nnão houve diferença estatística entre elas. (Tabela 1) \n \nTabela 1. Distribuição das variáveis de peso em relação aos grupos. \n Grupo N Média DP Mediana Q1 Q3 Mínimo Máximo P-valor \nPESO INICIAL \nAD 10 194 11,93 189 186 204 180 214 \n BD 10 192,5 10,21 191 184 196 180 215 \n Controle 10 201,4 15,46 202 190 204 180 232 \n \nPESO FINAL \nAD 10 370 23,66 364 358 394 328 404   \nBD 10 364,2 33,43 359 340 371 326 436 \n Controle 10 374 55,22 361 334 398 300 466   \nΔ PESO \nAD 10 176 16,14 174 164 190 148 200 \n0,9461 BD 10 171,7 25,5 172 148 180 146 221 \nControle 10 172,6 43,26 164 136 202 120 240 \nP-valor referente à análise de variância. \n \n5.2. Da avaliação macroscópica das lesões \nApós a coleta das lesões, foram d ocumentadas (Figura 1 e 2)  e anotadas as \nduas maiores medidas das lesões e calculadas suas áreas, evidenciando diferença \nestatística entre os grupos Alta Dose(AD) e Baixa Dose(BD) quando comparados ao \ngrupo Controle (tabela 2).  \n\n27 \n \n \nFigura 1. Aspecto macroscópico das lesões peritoneais no momento da segunda \nabordagem cirúrgica \n \n \n \nFigura 2. Aferição das medidas após excisão das lesões \n \n\n28 \n \nTabela 2. Área final das lesões nos diferentes grupos. \n Grupo N Média DP Mediana Q1 Q3 Mínimo Máximo P-valor \nÁREA DA LESÃO  \n(mm2) \nAD** 10 29 11,98 30 20 36 12 48 \n0,0052 BD** 10 74,1 45,89 60 36 120 25 150 \nControle* 10 161,1 137,07 110 72 225 20 400 \nP-valor referente a análise de variância. \n \n5.3. Da avaliação histopatológica e imunohistoquímica \n \n A imunohistoquímica para MMP9 nas lesões endometrióticas evidenciou uma \ndiminuição na positividade quanto maior fosse a dose, porém sem significância \nestatística (p=0,2713). (tabela 3)  \n \nTabela 3. Avaliação da positividade para MMP9 na imunohistoquímica das lesões entre os \ndiferentes grupos. \n  Grupos   \nVariável Alta Dose Baixa Dose Controle P-valor* \nMMP9 \n    NEGATIVO 4 (40) 2 (20) 1 (10) 0,2713 \nPOSITIVO 6 (60) 8 (80) 9 (90) \n P-valor referente ao teste qui-quadrado. \n \nNo Grupo Controle, nove ratas apresentaram positividade para  MMP9 no \ntecido endometriótico e apenas uma rata apresentou negatividade (Figura 3). \n \n \nFigura 3. Exemplo de reação positiva ao MMP9 em rata do Grupo Controle (Microscopia, \naumento 20x) \n\n29 \n \n \n \nNo Grupo Baixa Dose, oito ratas apresentaram lesões com reação posit iva e \nduas ratas com lesões negativas (Figura 4). \n \n \nFigura 4. Exemplo de reação negativa ao MMP9 em rata do Grupo Baixa Dose \n(Microscopia, aumento 20x) \n \nPor fim, no grupo de Alta Dose, seis ratas apresentaram positividade e quatro \nratas negatividade (Figuras 5 e 6). \n \n \nFiguras 5 e 6. Exemplos de reação ao MMP9 positiva (à esquerda) e negativa (à direita) no \nGrupo Alta Dose (Microscopia, aumento 20x) \n\n30 \n \nJá na imunohistoquímica para TIMP -2 nas lesões endometrióticas induzidas \ndas ratas, o  grupo Alta Dose evide nciou significância estatística (p=0,0009) na \ndiminuição de reação positiva quando comparada aos grupos Baixa Dose e \nControle. (tabela 4) \n \nTabela 4. Avaliação da positividade para TIMP2 na imunohistoquímica das lesões entre os \ndiferentes grupos. \n  Grupos   \nVariável Alta Dose Baixa Dose Controle P-valor* \nTIMP2 \n    NEGATIVO 9 (90) 1 (10) 3 (30) 0,0009 \nPOSITIVO 1 (10) 9 (90) 7 (70) \n P-valor referente ao teste qui-quadrado. \n \nNo Grupo Controle, três ratas apresentaram negatividade para TIMP2 no \ntecido endometriótico e sete apresentaram positividade (Figuras 7 e 8). \n \n \nFiguras 7 e 8. Exemplos de reação ao TIMP2 positiva (à esquerda) e negativa (à direita) no \nGrupo Controle (Microscopia, aumento 20x) \n \n \n\n31 \n \nNo Grupo Baixa Dose, nove ratas apresentaram lesões com reação positiva e \napenas uma rata com lesão negativa (Figura 9). \n \n \nFigura 9. Exemplo de reação positiva ao TIMP2 em rata do Grupo Baixa Dose (Microscopia, \naumento 20x) \n \nPor fim, no grupo de Alta Dose, apenas uma  rata apresent ou positividade \nenquanto nove ratas negatividade (Figura 10). \n \n \nFigura 10. Exemplo de reação negativa ao TIMP2 em rata do Grupo Alta Dose \n(Microscopia, aumento 20x) \n\n32 \n \n6. Discussão \n \nO processo de formação do tecido endometrial ectópico pode ser mediado por \nfatores que facilitam a adesão  à cavidade peritoneal, fatores de crescimento celular, \nmaior atividade da aromatase, fatores angiogênicos, linfáticos, neurogênicos e a \natividade ampliada das metaloproteinases da matriz (MMPs)  (KONINCKX; \nKENNEDY; BARLOW, 1998; VAN LANGENDONCKT; CASANAS -ROUX; DONNEZ, \n2002). Para que a adesão celular e a infiltração ocorram, o tecido deve primeiro \nsofrer modificações estruturais, como a destruição e remodelação da mat riz \nextracelular. Esta ação proteolítica ocorre através da ação de 2 proteases, como as \nserinas e as MMP(GUPTA et al., 2008). \n  A família das MMP consiste em 23 enzimas divididas nos seguintes \nsubgrupos: colagenases (MMP1, MM8 e MMP 13), gelatinases (MMP2 e MMP9), \nestromelisinas (MMP3, MMP10, e MMP11), e metaloproteinases de membrana (MT -\nMMPs), entre outras  (NAGASE; VISSE; MURPHY, 2006) . Sendo que as mais \nimportantes no processo etiopatogênico da endometriose são MMP2 e MMP9. \nA MMP9 está relacionada na decomposição da matriz extracelular em  \nprocessos fisiológicos normais, como  reprodução, desenvolvimento embrionário,  \nremodelação de tecidos, e em processos patológicos, co mo artrite, metástases e  a \nprópria endometriose. A MMP9, assim como outras MMPs, tem demonstrado ser um \nfator importante na progressão e invasão de tumores de endométrio (GRAESSLIN et \nal., 2006). O mecanismo patogênico da endometriose inclui, além de proliferação e  \ninvasão tecidual, a degradação da matriz extracelular com facilitação na penetração \nda camada basal pe las células endometriais . Já tendo sido demonstrado níveis  \nelevados de MMP9 no líquido peritoneal e no plasma em pacientes com  \nendometriose (LIU et al., 2015) . Os níveis elevados de MMP, incluindo a MMP 9, \nforam observados no endométrio ectópico em comparação com o endom étrio \neutópico. Além disso, as mulheres sem endometriose apresentam níveis mais baixos \nde expressão dessa s substâncias  (DI CARLO et al., 2009) . Alguns estudos  \nobservaram que a falta de expressão d a atividade de MMP está relacionada  a \nmenos lesões ectópicas em ratos  (BRUNER et al., 1997) . Consequentemente, a \n\n33 \n \natividade de enzimas que degradam a matriz extracelul ar pode facilitar a invasão da \nsuperfície peritoneal pelo tecido. \nAs MMPs estão sob controle de inibidores de tecidos específicos de \nmetaloproteinases (TIMPs) no nível pós -tradução. No entanto, os TIMPs não são \nsimplesmente inibidores da atividade proteolí tica; eles também têm papéis \nmultifuncionais, incluindo crescimento celular, angiogênese e apoptose (LAMBERT \net al., 2004) . Mulheres com endometriose possuem uma expressão diferente de \nMMP9 e TIMP2 no e ndométrio tópico e ectópico, sendo que baixos níveis de TIMP2 \nno fluído peritoneal levam a um aumento na MMP9 e tal desequilíbrio favorece a \ndegradação da matriz extracelular e a invasão tecidual, promovendo a implantação \nde tecido endometrial ectópico (LONDERO et al., 2012). \n O uso de inibidores de metaloproteinases sintéticos  (MMPI) vem sendo \nestudado como opção terapêutica para o tratamento da endometr iose. A doxiciclina \nalém da sua função antibiótica, possui propriedades anti -MMP bem reconhecidas \nque não estão bem definidas, agindo principalmente através da inibição da síntese e \nda atividade das MMP (HANEMAAIJER et al., 1998; THOMPSON; BAXTER, 1999; \nSAPADIN; FLEISCHMAJER, 2006). Sendo assim, a doxiciclina tem sido utilizada em \nalguns estudos clínicos e pré-clínicos para modular a atividade de MMP. \n Nesse estudo, o uso da doxiciclina apresentou redução , c om significância \nestatística, da área das les ões endometrióticas (p=0,0052) nos grupos de alta e de \nbaixa dose quando comparados ao grupo controle, sugerindo assim que inibidores \nde metaloproteinases sintéticos possam estar correlacionados a inibição do \ncrescimento da lesão. Na literatura,  Akkaya et al. e Goktolga et al. (AKKAYA et al., \n2009; GOKTOLGA et al., 2015)  demonstraram, com significância estatística , \ndiminuição do tamanho dos implantes endometrióticos quando usado doxiciclina em \nbaixa dose (5mg/kg/dia) e doxiciclina em alta dose (40mg/kg/dia) em relação a um \ngrupo controle, apesar de terem um viés de não usar medicação nenhuma no grupo \ncontrole, não causando o efeito de stress de administração medicamentosa, e como \né sabido, a endometriose por ter etiologia multifatorial, o stress está relacionado a \naumento de lesões endometrióticas em estudos animais (CUEVAS et al., 2012).  \n No estudo imunohistoquímico, observou -se uma diminuição na expressão \nproteica da MMP9 nos gr upos de alta e baixa dose de doxiciclina em relação ao \ngrupo controle, porém sem significância estatística. Nos únicos dois estudos que \nusaram doxiciclina para observar seu efeitos sobre lesões endometrióticas, a MM9 \n\n34 \n \ntambém não teve diminuição quando comparadas ao grupo controle (AKKAYA et al., \n2009; GOKTOLGA et al., 2015).  \nJá quando foi mensurado a expressão proteica do TIMP2, o grupo de ratas \nque foi administrado doxiciclina em alta dose teve forte diminuição na quantificação \n(p=0,0009) em relação aos grupos que usaram doxiciclina baixa dose e controle. \nMesmo sabendo que o TIMP2 está em baixas doses no fluído de pacientes com \nendometriose (LONDERO et al., 2012) , o presente estudo mostrou que quando \nusado doxiciclina em alta dose, o TIMP2 tende a diminuir mais , o que já foi \nevidenciado em outros estudos, como de Singh et al. que demonstrou diminuição da \nTIMP2 após uso da doxiciclina em tecido gástrico (SINGH et al., 2011) e com Bian et \nal. que evidenciou o mesmo em córnea de olhos secos (BIAN et al., 2016) . Porém \noutros estudos demonstraram o contrário, tendo aumento da expressão da TIMP2 \nquando usado dox iciclina em tecido arterial (CHUNG et al., 2008; NAGAREDDY et \nal., 2012). \nCom relação a proporção TIMP/MMP, a literatura mostra resultados \nconflitantes quando relacionados a doenças neoplásicas com invasão tecidual . A \nmaior parte dos estud os mostrou que quanto maior o grau de invasão tecidual ou \ngravidade do tumor, maior é a expressão d os TIMPs e da s MMPs, e o inverso \ntambém é verdadeiro, mostrando que quando as MMPs vêm diminuídas, é seguida \nda expressão baixa dos TIMPs, como no presente e studo quando se usou \ndoxiciclina no grupo Alta Dose com diminuição do tamanho da lesão em relação ao \ngrupo Controle. Isso  demonstra que grande parte do nexo causal está relacionada \nao desequilíbrio entre os fatores que moldam a matriz extracelular, ambos \naumentando ou diminuindo concomitantes em alguns casos, apesar de se pensar \nque seria o contrário (ROSS et al., 2003; HONKAVUORI-TOIVOLA et al., 2013). \nA pesquisa experimental é uma forma de se obter conclusões causais, com \nrelação a intervenções ou tratamentos, e estabelecer se um ou mais fatores causam \numa mudanç a em um resultado. Por meio desta associando análises \nimunohistoquímicas e avaliação macroscópica foi possível analisar a resposta das \nlesões experimentalmente induzidas perante o uso da doxiciclina. \n\n35 \n \n7. Conclusões \n \nNo presente estudo da ação da doxiciclin a nas lesões endometrióticas \nexperimentalmente induzidas em ratas, observamos que:  \na) Houve redução significativa da área das lesões entre os gru pos, \nsugerindo que a doxiciclina tenha um efeito positivo no controle da \ndoença; \nb) A avaliação da expressão proteic a de MMP nas lesões demonstra uma \ntendência a redução para os grupos que usaram a medicação quando \ncomparados ao grupo controle; \nc) A quantificação de TIMP2 foi significativamente menor no grupo Alta \nDose quando comparado aos outros dois grupos, concluindo qu e talvez a \ndoxiciclina possa agir como feedback negativo na produção da TIMP2, \nseja ela por ter efeito anti -MMP diminuindo assim a necessidade de \nexpressão endógena do mesmo, ou por outros fatores ainda não \ndescobertos. \nEsses achados permitem concluir que inibidores da metaloproteinases \nsintéticos sejam opções reais para o tratamento da endometriose, com grandes \nperspectivas de ação seletiva na lesão, sem prejuízo da função reprodutiva da \npaciente.  Sendo assim, a doxiciclina por ser uma medicação desta cla sse já \nliberada no mercado, de baixo custo , bom perfil de tolerabilidade  e fácil \nadministração, seria uma nova frente no tratamento clinico para pacientes com \nendometriose. Porém mais estudos adicionais deverão ser realizados para analisar \nsua eficácia como adjunto na terapia para endometriose. \n\n36 \n \nReferências Bibliográficas \n \n \nABBOTT, F. V.; HELLEMANS, K. G. C. Phenacetin, acetaminophen and dipyrone: \nAnalgesic and rewarding effects. Behavioural Brain Research , v. 112, n. 1 –2, p. \n177–186, 2000.  \nACHARYA, M. R.; VENITZ, J.; FIGG, W. D.; SPARREBOOM, A. Chemically \nmodified tetracyclines as inhibitors of matrix metalloproteinasesDrug \nResistance Updates, 2004. .  \nAKKAYA, P.; ONALAN, G.; HABERAL, N.; BAYRAKTAR, N.; MÜLAYI M, B.; \nZEYNELOGLU, H. B. Doxycycline causes regression of endometriotic implants: a rat \nmodel. Human Reproduction, v. 24, n. 8, p. 1900 –1908, 1 ago. 2009. 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