Efeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose profunda na expressão dos microRNAs-21, -451 e -29c e da proteína FKBP52

1 INTRODUÇÃO......................................................................................... 1 1.1 Endometriose.................................................................................... 2 1.2 Endometriose e proteína FKBP52.................................................... 5 1.3 MiRNA............................................................................................... 6 1.3.1 MiRNAs e doenças ginecológicas............................................ 8 1.4 Endometriose e miRNA................................................................... 14 2 OBJETIVOS.............................................................................................. 17 2.1 Geral ............................................................................................... 18 2.2 Específicos...................................................................................... 18 3 MÉTODOS................................................................................................ 19 3.1 Ética em pesquisa........................................................................... 20 3.2 Casuística ....................................................................................... 21 3.2.1 Critérios de inclusão............................................................... 21 3.2.2 Critérios de não inclusão........................................................ 22 3.2.3 Constituição dos grupos de estudo........................................ 22 3.3 Ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal ..................... 23 3.4 Tratamento cirúrgico....................................................................... 23 3.5 Obtenção de amostras de tecido .................................................... 24 3.5.1 Grupo de estudo.................................................................... 24 3.5.2 Grupo controle....................................................................... 25 3.6 Extração de RNA............................................................................ 25 3.7 Análise pelo RT-qPCR.................................................................... 25 3.8 Análise Estatística........................................................................... 26 4 RESULTADOS......................................................................................... 27 4.1 Análise de miRNAs......................................................................... 31 4.1.1 MiRNA-21 .............................................................................. 31 4.1.2 MiRNA-451 ............................................................................ 33 4.1.3 MiRNA-29c............................................................................. 34 4.2 Análise da proteína FKBP52........................................................... 36 5 DISCUSSÃO.......................................................................................... 39 5.1 Conduta cirúrgica na endometriose ................................................ 40 5.2 Diagnóstico ultrassonográfico da endometriose ............................. 40 5.3 MiRNAs e fase do ciclo menstrual .................................................. 41 5.4 MiRNA-21 ....................................................................................... 43 5.5 MiRNA-451 ..................................................................................... 44 5.6 MiRNA-29c...................................................................................... 45 5.7 FKBP52........................................................................................... 46 6 CONCLUSÕES ......................................................................................49 7 ANEXOS................................................................................................. 51 Anexo A - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.......................... 52 Anexo B - Termo de consentimento livre e esclarecido do grupo de estudo ................................................................................... 54 Anexo C - Termo de consentimento livre e esclarecido do grupo controle................................................................................. 59 Anexo D - Ilustração auxiliar ao laudo da ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal....................................... 64 Anexo E - Inventário pélvico cirúrgico (relacionado ao caso do Anexo C)............................................................................... 65 Anexo F - Aspecto pós-cirúrgico (relacionado ao caso do Anexo C)..... 66 8 REFERÊNCIAS ......................................................................................67 Listas SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES cDNA DNA complementar C$ Dólar canadense DNA Ácido desoxirribonucleico € Euro FIV Fertilização in vitro IMC Índice de Massa Corporal Kg/m2 kilogramas/metro 2 miRNA microRNA mRNA RNA mensageiro ng nanograma pre-miRNA microRNA-precursor pri-miRNA microRNA-primário PCR Reação em cadeia da polimerase RT-qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real R$ Reais RISC Complexo de inat ivação induzido por RNA RNA Ácido ribonucleico siRNA RNA interferente pequeno snRNA RNA nuclear pequeno μL Microlitro FIGURAS, QUADROS E GRÁFICOS Figura 1 - Biogênese dos miRNAs............................................................ 8 Figura 2 - MiRNAs envolvidos na patogênese da endometriose ............ 15 Figura 3 - Sítio de ligação miRNA-29c e FKBP52................................... 47 Quadro 1 - Estudos de miRNA no câncer de endométrio......................... 10 Quadro 2 - Estudos de miRNA no câncer de colo do útero ...................... 11 Quadro 3 - Estudos de miRNA no câncer de ovário ................................. 12 Gráfico 1 - Expressão do miRNA-21 - São Paulo, SP- 2012 a 2014........ 31 Gráfico 2 - Expressão do miRNA-451 - São Paulo, SP- 2012 a 2014...... 33 Gráfico 3 - Expressão do miRNA-29c - São Paulo, SP- 2012 a 2014 ...... 35 Gráfico 4 - Expressão da proteína FKBP52 - São Paulo, SP- 2012 a 2014........................................................................................ 37 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Características dos grupos de estudo e controle - São Paulo, SP- 2012 a 2014 ......................................................... 28 Tabela 2 - Estadiamento cirúrgico da endometriose segundo a American Fertility Society - São Paulo, SP- 2012 a 2014....... 29 Tabela 3 - Caracterização das amostras teciduais analisadas segundo a fase do ciclo menstrual - São Paulo, SP- 2012 a 2014.....................................................................................30 Tabela 4 - Relação da expressão de miRNA-21 nas amostras e comparação com o grupo controle - São Paulo, SP- 2012 a 2014 .................................................................................... 32 Tabela 5 - Comparação da expressão do miRNA-21 entre as amostras do grupo de estudo - São Paulo, SP- 2012 a 2014 .......................................................................................32 Tabela 6 - Relação da expressão de miRNA-451 nas amostras e comparação com o grupo controle - São Paulo, SP- 2012 a 2014 .................................................................................... 33 Tabela 7 - Comparação da expressão do miRNA-451 entre as amostras do grupo de estudo - São Paulo, SP- 2012 a 2014 .......................................................................................34 Tabela 8 - Relação da expressão de miRNA-29c nas amostras e comparação com o grupo controle - São Paulo, SP- 2012 a 2014 .................................................................................... 35 Tabela 9 - Comparação da expressão do miRNA-29c entre as amostras do grupo de estudo - São Paulo, SP- 2012 a 2014 .......................................................................................36 Tabela 10 - Relação da expressão da FKBP52 nas amostras e comparação com o grupo controle - São Paulo, SP- 2012 a 2014 .................................................................................... 37 Tabela 11 - Comparação da ex pressão da FKBP52 entre as amostras do grupo de estudo - São Paulo, SP- 2012 a 2014........................................................................................ 38 Resumo Miyadahira EH. Efeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose profunda na expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c e da proteína FKBP52 [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2016. INTRODUÇÃO: O tratamento cirúrgico da endometriose profunda tem se mostrado benéfico para os resultados de Reprodução Assistida. O motivo que leva aos melhores resultados ainda é desconhecido, mas remete à etiologia multifatorial dessa doença. Observa-se, então, a oportunidade de investigar mecanismos moleculares que possam justificar este fato. Nesse contexto, os microRNAs podem desempenhar papel fundamental na medida em que alteram a expressão de diferentes genes por meio da inibição pós- transcricional. OBJETIVO: Analisar o efeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose profunda na expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c, além da expressão da proteína FKBP52. MÉTODOS: Trata-se de estudo clínico, prospectivo, longitudinal e comparativo no qual foram incluídas 26 pacientes que foram divididas em dois grupos, segundo o resultado da ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal. As pacientes que não apresentaram alterações sugestivas de endometriose compuseram o grupo controle (n = 11) e foram submetidas à coleta de amostra de endométrio. As pacientes do grupo de estudo (n = 15) f o r a m s u b m e t i d a s à a m o s t r a g e m endometrial antes e após o tratamento cirúrgico da endometriose, além de ter sido realizada a coleta de amostra da lesão profunda durante o ato operatório. Foi realizada a extração total de RNA dessas amostras e, posteriormente, PCR em tempo r eal para análise de expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c, além da proteína FKBP52. RESULTADOS: A comparação da expressão relativa dos m i c r o R N A s - 2 1 e - 4 5 1 e n t r e a s amostras, de forma geral, não most rou diferença estatisticamente significante. A expressão relativa do microRNA-29c foi maior no endométrio de pacientes com endometriose em relação ao grupo controle e ainda maior nas lesões de endometriose profunda. Após a cirurgia, a expressão do microRNA-29c no endométrio, foi equivalente à do grupo controle. A expressão da FKBP52 foi menor no endométrio das mulheres com endometriose e nas lesões da doença em c o m p a r a ç ã o a o g r u p o c o n t r o l e . Após o tratamento cirúrgico houve aumento da expressão de FKBP52 nas amostras de endométrio nas pacientes com endometriose que passou a ser semelhante à do grupo controle. CONCLUSÕES: Os resultados sugerem que a presença das lesões de endometriose pode aumentar a expressão do microRNA-29c no endométrio e, por conseguinte, diminuir a expressão de um dos seus RNA mensageiros alvos que codifica a proteína FKBP52. Após o tratamento cirúrgico, com remoç ão das lesões de endometriose, a expressão do microRNA-29c e da FKBP52 se assemelhou à do grupo controle. Descritores: endometriose; microRNA; proteínas de ligação a tacrolimo; infertilidade.

Miyadahira EH. The effect of surgical removal of deeply infiltrating endometriosis (DIE) on the microRNAs -21, -451, -29c and the protein FKBP52. [ D i s s e r t a t i o n ] . S ã o P a u l o : “ Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2016.

Surgical treatment of deeply infiltrating endometriosis appears to yield benefits to the affected women and also to the assisted reproduction treatments. Although the mechanisms involved on the improvement of the outcomes are still unknown; yet, they are similar to the multifactorial origin of the endometriosis. Considering that the microRNAs can modify different genes expression, i t w a s i n v e s t i g a t e d t h e i r r o l e concerning the molecular pathways leading to endometriosis and the clinical betterment of the assisted reproducti ve procedures after the surgical treatment. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the effect of surgical treatment in women with endometriosis focusing the microRNAs -21, -451 and -29c expression, as well as the protein FKBP52 expression.

This is a clinical, prospective, longitudinal and comparative study which included 26 patients that were divided into two groups according to the findings of the transvaginal ultras ound with bowel preparation. Eleven women without evidence of DIE composed the control group and were submitted to eutopic endometrium sampling. Fifiteen women presented with evidence for DIE detected by pelvic ultrasound were also submitted to eutopic endometrium sampling before and after surgical treatment. Surgical procedures revealed the presence of relevant DIE. Total RNA extraction of all samples was performed and followed by real time PCR to evaluate microRNAs -21, -451, -29c and protein FKBP52 expression. RESULTS: MicroRNAs -21 and -451 expression anal ysis did not show statistically significant difference among samples. Nonetheless, expression of microRNA-29c was elevated in eutopic endometrium of women suffering from DIE in comparison to the control group. After surgery, the microRNA- 29c expression in eutopic endometrium became equivalent to the control group. The expression for FKBP52 was lower in women having DIE than those without endometriosis. The su rgical treatment increased the expression of the protein FKBP52 in eutopic endometrial samples, turning it similar to the control group. CONCLUS IONS: The results of this study suggest that the presence of DIE mi ght increase the expression of microRNA-29c in eutopic endometrium and consequently decrease the expression of one of its target messenger RNA that codifies the protein FKBP52. After surgical removal of endometriosis lesions, the microRNA-29c and the FKBP52 expression returned to a level similar to the control group. Descriptors: endometriosis; microRNA; tacrolimus binding proteins; infertility. 1 Introdução Introdução 2 1 INTRODUÇÃO A mudança no papel social da mulher, sobretudo após a introdução dos anticoncepcionais hormonais e outras tecnologias para o controle da natalidade, trouxe desafios ao consultório do ginecologista. O controle e a autonomia sobre o planejam ento familiar possibilitaram às mulheres assumirem papel de igualdade em relação ao seu parceiro. Dessa forma, elas passaram a ocupar novos espaços s o c i a i s , p o l í t i c o s e e c o n ô m i c o s . Como resultado dessas transformações, a programação gestacional passou a ocorrer após a consolidação das prioridades socioeconômicas femininas, em idades menos favoráveis. Isso acrescentou a essas mulheres uma série de inconvenientes, como maiores taxas de morbimortalidade materno-fetal1,2 e elevação da incidência de câncer de mama 3. Consequentemente, a endometriose vem ganhando posiç ão de destaque no cotidiano do ginecologista. 1.1 Endometriose A endometriose é definida como a presença ectópica de células endometriais glandulares e estromais em diferentes compartimentos, geralmente na cavidade pélvica4. Tal definição demanda, portanto, uma avaliação anatomopatológica para confirmação diagnóstica. Considerada padrão ouro, a laparoscopia com visualização direta da lesão permite, via de regra, a obtenção dessa amostra tecidual. Na medida que o diagnóstico é concluído de forma invasiva, muitas vezes, a suspeição diagnóstica é baseada na história clínica (dismenorreia, dor pélvica acíclica e infertilidade) e nos exames de imagem (ultrassono grafia transvaginal com preparo intestinal ou ressonância nuclear magnética). Assim, o cálculo de incidência e de prevalência é prejudicado pela não uniformização da obtenção de dados epidemiológicos. No e n t a n t o , e s t i m a - s e q u e a p r e v a l ê n c i a d e s s a Introdução 3 doença seja de, aproximadamente, 10% na população em geral de mulheres em idade reprodutiva, atingindo 50 - 60% nas mulheres inférteis5,6. O impacto da doença extrapola o âmbito d o s c o n s u l t ó r i o s , p o i s t r a z prejuízos para a qualidade de vida da paciente, refletindo também na família e na sociedade. Um estudo conduzido em 12 centros médicos de 10 países com objetivo de analisar custos e impacto na qualidade de vida mostra uma média de 6,4 anos de sintomas até o diagnóstico de endometriose e um prejuízo de 19% na qualidade de vida, e m c o m p a r a ç ã o c o m p e s s o a s e m situação ideal de saúde. Além disso, mostra custo anual médio de 33.526 reais (R$) ou 9.579 Euros (€) por pessoa, sendo R$ 10.895 (€ 3.113) de gastos diretos (cirurgia, hospitalização, exames, honorários médicos, etc.) e R$ 22.043 (€ 6.298) de gastos indiretos (perda de produtividade). Compara, ainda, os gastos diretos com outras doenças crônicas que apresentam custos semelhantes em países europeus, como diabete melito (R$ 10.003), doença de Crohn (R$ 10.885 - 26.064) e artrite reumatoide (R$ 14.994)7. Nnoaham et al. calcularam que cada mulher com endometriose perde 10,8 horas de trabalho por semana8. No Canadá, estima-se custo de R$ 12.740 ou 5.200 dólares canadenses (C$) por ano, por paciente, com diagnóstico confirmado de endometriose, sendo 78% devido à perda de produtividade e à perda de tempo de lazer. O custo anual para a sociedade canadense seria de R$ 4,41 bilhões (C$ 1,8 bilhões)9. No Brasil, infelizmente, faltam estudos que estimam os custos com a endometriose10. A etiologia e a fisiopatologia da endometriose ainda não estão totalmente elucidadas. Acredita-se que a endometriose seja uma doença multifatorial e que algumas teorias formuladas podem explicar a presença e o desenvolvimento ectópico do tecido endometrial. A teoria da menstruação retrógrada tem melhores evidências e, por isso, é a mais aceita. Atribui-se a Sampson, em 1927, a primeira menção dessa hipótese, em estudo que preconizava a disseminação venosa e linfática do tecido endometrial11. As evidências foram sustentando tal Introdução 4 hipótese12 e até modelos animais de endometriose foram criados com base nessa teoria13. A teoria imunológica e a das células tronco podem ser desdobramentos da primeira. Acr edita-se que as pacientes com endometriose tenham alterações na resposta imune o que favoreceria a perpetuação das células endometriais que atingiram a cavidade pélvica pela menstruação retrógrada14. Pela mesma via, células progenitoras do epitélio endometrial e células tronco mesenquimais originariam implantes ectópicos15. Além disso, a teoria da metaplasia celômica, originalmente proposta por Ferguson, em 196916, ainda pode ser aventada principalmente para explicar a gênese dos endometriomas15 e , d e i g u a l m o d o , a t e o r i a d o s remanescentes dos ductos Müllerianos, para explicar as lesões no fundo de saco vaginal e ligamentos útero-sacros15. É clara a relação entre endometriose e infertilidade. Sabe-se que a taxa de fecundidade dos casais cujas mulheres têm endometriose não tratada é de, aproximadamente, 2 a 10%, enquanto daqueles, sem problemas de fertilidade essa taxa é de 15 a 20%17. Após seguimento de 3 anos de mulheres submetidas à videolaparoscopia por infertilidade, aquelas com endometriose tiveram menor chance de gravidez em relação às com infertilidade sem causa aparente, 36% e 55%, respectivamente 18. Alguns mecanismos explicam a infertilidade relacionada à endometriose. A exacerbação de células inflamatórias e de citocinas pode afetar a função tubária e a sincronia das contrações miometriais, prejudicando o transporte dos gamet as e do embrião. Alterações na ovulação e na produção oocitária, igualmente, são creditadas à inflamação associada aos endometriomas. Ademai s, a receptividade endometrial também pode estar comprometida, não apenas pelo ambiente inflamatório, mas também pela resistência à progesterona14,19. De fato, apesar de não consensual n a l i t e r a t u r a , a l g u n s a u t o r e s demonstram que o tratamento cirúrgico pode beneficiar o tratamento de Introdução 5 reprodução assistida. Em estudo clínico e prospectivo, em 2008, Bianchi et al. demostraram o benefício da cirurgia laparoscópica para as pacientes com endometriose profunda que se submeteram ao tratamento de fertilização in vitro após a laparoscopia. Nesse estudo, foram comparados dois grupos de pacientes: um grupo que optou pela fertilização in vitro sem a cirurgia prévia e outro que foi submetido à ressecção laparoscópica dos focos de endometriose profunda e, posteriormente, à fertilização in vitro. A chance de gravidez no grupo operado foi 2,45 vezes maior20. Dessa forma, uma vez que a endometriose se associa a alterações moleculares que dificultam a gestação, questiona-se a possibilidade de reverter tais distúrbios, após o tratamento cirúrgico da endometriose e, por conseguinte, obter melhores resultados nos tratamentos de reprodução assistida14. Com a intenção de investigar essa hipótese, foram selecionados a proteína FKBP52 e os microRNAs (miRNAs) para analisar as modificações endometriais pós tratamento cirúrgico. 1.2 Endometriose e proteína FKBP52 Descoberta em 1985, a proteína FKBP52 pertence à subclasse das imunofilinas devido a sua característica de poder se ligar ao imunossupressor FK506 (tacrolimus). É composta por quatro regiões que lhe conferem diversas propriedades, dentre e l a s d e s t a c a - s e a m o d u l a ç ã o d o s receptores de esteroides por meio de sua interação com a heat shock protein 90 kDa (Hsp90). Trata-se de um regulador positivo para o receptor de glicocorticoide, de androgênio e de progesterona, mas não de estrogênio e de mineralocorticoide. Essa ação é competitiva e antagonizada pela proteína FKBP51 que é um regulador negativo para os receptores de esteroides21,22. Tranguch et al. estudaram ratos knock-out para o gene que codifica a FKBP52 e observaram um fenótipo com função ovulatória normal, mas esses animais eram inférteis devido à alteração na receptividade uterina Introdução 6 conferida pela redução da atividade do receptor de progesterona23. Em estudo posterior, os mesmos autores mostraram evidências sugerindo que a deficiência da FKBP52 está envolvida na gênese da endometriose em ratos e em humanos, por meio da alteração de móleculas que estimulariam o crescimento das células endometrióticas, aumentariam a inflamação e promoveriam a angiogênese24. Ainda para corroborar a preservação dessa alteração entre espécies, Jackson et al. d e s c r e v e r a m a d e f i c i ê n c i a da FKBP52 no endométrio do modelo de endometriose induzida em b a b u í n o s c o m p a r a n d o c o m a s amostras de animais do grupo controle25. De forma similar, Yang et al. relataram menor expressão dessa proteína no endométrio de mulheres com endometriose em comparação ao en dométrio de pacientes sem endometriose26. A alteração na receptividade uterina pela modificação da expressão da FKBP52 é um mecanismo que pode prejudicar a implantação embrionária nas pacientes com endometriose submetidas à fertilização in vitro (FIV) e transferência embrionária. Dessa forma, pelos motivos expostos, incluiu-se a análise dessa proteína no presente estudo. 1.3 MicroRNA Em 1993, um grupo de pesquisado res publicaram a primeira descrição dos miRNAs27. Estudando o gene lin-4 que age no controle do desenvolvimento larval do Caenorhabditis elegans, descobriram que esse gene não traduzia uma proteína, mas dois pequenos RNAs de 22 e 61 nucleotídeos. Posteriormente, notou-se que o maior era precursor do menor e esses pequenos RNAs tinham uma complementaridade antisense no gene lin-14, gene esse que já se sabia ser modulado pelo lin-4. Logo após, observou-se que esse controle da expressão do lin-14 pelo lin-4 ocorria Introdução 7 reduzindo o nível de proteína traduzido pelo lin-14, sem alterar seus níveis de RNA mensageiro (mRNA)28. Decorridos sete anos, um s egundo gene, let-7, também do nematódeo C. elegans f o i d e s c r i t o c o m o t r a n s c ritor de um RNA com 21 nucleotídeos29. E, em menos de um ano, outros três grupos descreveram mais de 100 genes que transcrevem miRNAs30–32. Até o presente momento, são descritos mais de 1880 sequências de miRNAs nos Homo sapiens33. Estima-se que, aproximadamente, 30% das proteínas codificadas pelo genoma humano (mais de 5.300 genes) podem ser alvos dos miRNAs34. Lim et al., utilizando a ferramenta MirScan, calcularam que aproximadamente 1 % d o s g e n e s p r e d i t o s n o g e n o m a humano (entre 200 a 255 genes) são possíveis codificadores de miRNAs35. Diferentemente dos RNAs interferentes pequenos (siRNA), a maioria dos genes que codificam os miRNAs estão localizados em regiões intrônicas do genoma humano. Esses genes são tr anscritos pela polimerase II, originando os miRNA primários (pri-miRNA). Os pri-miRNA têm o formato de grampo de cabelo e são processados pela enzima Drosha, liberando os miRNA precursores (pre-miRNA) que têm aproximadamente 70 nucleotídeos. Os pre-miRNA são exportados para o citoplasma pela Exportina-5 e processados pela enzima Dicer para formar duplas de miRNA-miRNA* de 21 a 24 nucleotídeos. As helicases quebram essas duplas em fitas únicas de miRNA e a que apresentar o pareamento de bases mais fraco na região 5’, junta-se às proteínas Argonautas para formar o complexo de inativação induzido por RNA (RISC)36,37. O complexo RISC, por sua vez, guiado pela fita única de miRNA liga- se ao mRNA alvo. Após esse processo, o mRNA pode ser degradado ou pode ocorrer a inibição da tradução (mais comum). O grau de homologia entre miRNA e o mRNA alvo parece determinar o mecanismo que será sucedido. Em geral, a complementaridade parcial leva à inibição da tradução, ao passo que, a alta complementaridade leva à degradação do mRNA38 (Figura 1). Introdução 8 Fonte: Teague et al., 201037. Figura 1 - Biogênese dos miRNAs 1.3.1 MiRNA e doenças ginecológicas Algumas características dos miRNAs facilitam o seu estudo, como o fato de estarem presentes em diversos tecidos e fluidos corporais e a necessidade de pouca amostra de material para sua análise. Além disso, a possibilidade de modular diversas expressões gênicas confere aos miRNAs potencial objeto de investigações vinculadas não somente a etiopatogenia, Introdução 9 mas também como biomarcadores ou ainda alvos terapêuticos ou de seguimento terapêutico de algumas doenças. Os miRNAs foram estudados em algumas doenças benignas e malignas ginecológicas, por exem plo: leiomioma, endometriose, abortamento de repetição, câncer do endométrio, do colo uterino, do ovário e das mamas. Grande parte dessas pesquisas descreve perfis de miRNAs que apresentam maior ou menor expressão em alguma situação patológica comparada a um grupo controle. Em estudo de revisão, Gilabert-Estelles et al. agruparam em quadros os princi pais estudos de algumas doenças ginecológicas e os miRNAs envolvidos39. Introdução 10 Quadro 1 - Estudos de miRNA no câncer de endométrio miRNA com regulação para cima miRNA com regulação para baixo Grupos Associação Métodos Referência Let-7c, miR-103, -106a, - 107, -181a, -185, -210, - 423 let 7i, miR-30c, -152,- 193,-221 CEE vs HA vs endométrio normal microssérie RT-qPCR Boren 2008 miR-10a, -17-5p, -23a*, - 25, -28, -34a, -95, -103, - 106a,-107, -130b, -141, - 151, -155, -182, -183, -184, -191, -194, -200a/c, -203, -205, -210, -215, - 223, -301, -325, -326, - 330 miR-10a, CEE vs endométrio normal microssérie RT-qPCR Chung 2009 miR-10a, -31, -96, -141, 142-5p, -155, -182, - 200a/b/c, -203, -205, - 210, -363, -429, -432, - 449 miR-99b, -133b, -193a, -193b, -204, -368 CEE vs endométrio adjacente m i c r o s s é r i e W u W 2 0 0 9 miR-9, -19b; -146, -181c, -183, -200c, -205, -223, - 423, -425 let-7a, miR-32, -33b, - 369, -409, -424, -431, - 451, -496, -503,-516 CEE (estádio I) vs endométrio normal ↑ miR-199c vs ↑ sobrevida microssérie RT-qPCR Cohn 2010 miR-34a, -182, -183, - 200a, -205, -572, -622, - 650 miR-411, 487b CEE vs endométrio normal microssérie RT-qPCR Ratner 2010 miR-7, -10a/a*, -17, 18a/b, -23a*, -30c2*, -31, -33b*, -95, -96, -106a, - 125a-3p, -134, -135a*/b, - 150*, -182, -183, -188-5p, -193a-5p, -198, -200a/a*/b/b*/c, -202, - 203, -205, -210, -223, - 224, -330-3p, -371-5p, - 425, -429, -483-5p, -494, -501-5p, -505*, - 513a-5p, -513b, -518c*, - 557, -564, -575, -601, - 622, -623, -629*, -630, - 652, -663, -760, -765, - 768-5p, -801, -877, - 892b, -923, -939, -1224- 5p, -1225-5p,-1226* miR-1, -10b*, -23b, -24- 1*, -27b, -29b, -33a, - 34b/b*, -34c-5p, -101, -127-3p, -132*, - 133a/b, -136/136*, - 139-5p,-140-3p/5p, - 142-3p/5p, -143/143*, -145/145*, - 152, -195, -196b, - 199a-5p, -199b-3p/5p, - 214/214*, -299-3p/5p, - 337-5p, -376a/c, -377, -379, - 381, -410, -411, -424, - 450a, -455-3p/5p, -497, -503, -542-3p, -542-5p, -654-3p, -873 CES vs endométrio normal ↓ miR-152 & miR-101 vs prognóstico reservado microssérie RT-qPCR Hiroki 2010 miR-15b, -135a/b, -141, - 142-5p/3p, -200a/b/c, - 203, -205, -210, -429, - 519a, -888 miR-1, -125b-2, -129- 3p, -133a/b, -137, -504 CEE vs endométrio normal CES vs endométrio normal TLDA RT-qPCR Devor 2011 miR-9/-9*, -18a, -96, - 141, -146a, -200a/b/b*/c, -203, -205, -210, -421, - 429, -516a-5p, -605, - 614, -936 miR-10b*, 23a*, -100, - 127-3p, -152, -199b-3p, -199b-5p, -370, - 376a/c, -381, -410,- 424, -424*, -431, -432, -503, -542-3p/5p, -596, -610, -630, -632, -760 CEE vs HA vs endométrio normal microssérie RT-qPCR Snowdon 2011 CEE: carcinoma endometrial endometrióide; CES: carcinoma endometrial seroso; HA: hiperplasia atípica; TLDA: Taqman Low Density Array; RT-qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; miR: miRNA Fonte: Gilabert-Estelles et al., 201239 Introdução 11 Quadro 2 - Estudos de miRNA no câncer de colo do útero miRNA com regulação para cima miRNA com regulação para baixo Grupos Associação Métodos Referência miR-21 miR-143 miR-126,-143, 6 amostras de câncer cervical vs 5 amostras normais 29 amostras pareadas de cancer cervical e amostras normais Sequência e análise Northern Lui 2007 miR-15b, 16, -146a, -155, -223 miR-126,-143, -145, -218, -424 Tecido de câncer cervical vs amostra normal microssérie análise Northernblot Wang 2008 miR-193b, -200c miR-143, -145, -218, -497 Linhagens celulares de câncer cervical vs amostra normal microssérie análise Northernblot RT-qPCR Martinez 2008 miR-9, -127, 133a/b, -199a/a*, -199b,-214 miR-149, -203 10 amostras de câncer cervical e 10 amostras cervicais normais miR-127 marcador para metástase linfática e miR-199a um potencial alvo terapêutico RT-qPCR Lee 2008 miR-10a, -148a, - 196a miR-29a, -143, -145, -199a, -203 19 amostras cervicais normais vs 4 carcinomas de células escamosas, 5 lesões intraepiteliais de alto grau e 9 de baixo grau m i c r o s s é r i e Pereira 2010 102 amostras de câncer cervical miR-200a e miR-9 com sobrevida ao câncer RT-qPCR Hu 2010 miR-10a*, -30a*, - 610, -886-5p miR-302d, -346, - 518b 12 pares de tumor cervical vs tecido são adjacente miR-886-5p inibe apoptose por regular para baixo a expressão de Bax microssérie Li 2011 RT-qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; miR: miRNA Fonte: Gilabert-Estelles et al., 201239 Introdução 12 Quadro 3 - Estudos de miRNA no câncer de ovário miRNA com regulação para cima miRNA com regulação para baixo Grupos Associação Métodos Referência miR-200 family (mIR-200a/b/c, - 141, -429), miR-21, -203,-205 miR-199a, -140, - 145, -125b1 Câncer vs tecido ovariano normal microssérie RT-qPCR Iorio 2007 let-7 family, miR- 125a/b Câncer vs tecido ovariano normal Spizzo 2009 mIR-200a/b/c, - 141, -16, -21, -93 let-7b, miR-99a, - 100, -125b,- 145, - 214 Câncer vs tecido ovariano normal microssérie RT-qPCR Nam 2008 let-7f, miR-23a, - 182, -200, -210, - 222 miR-145, -214 Metástase vs tumor primário microssérie RT-qPCR Vaksman 2011 Amostras de câncer ovariano avançado miR-410, 645 negativamente associado com sobrevida microssérie RT-qPCR Shih 2011 Amostra de câncer ovariano 27 miRNAs e resposta à quimioterapia microssérie RT-qPCR Boren 2009 Amostra de câncer ovariano miR-214 regulado para baixo em tumors resistentes à platina microssérie RT-qPCR Yang H 2008 Amostra de câncer ovariano família miR- 200 e resultado clínico (controverso) microssérie RT-qPCR Shih, Nam, Hu, Eitan miR-21, -141, - 200a/b/c, -203, - 214 Exossomos (câncer vs doença benigna) m i c r o s s é r i e Taylor 2008 miR-21, -29a, -92, - 93, -126 miR-99b, -127, - 155 Soro TLDA RT-qPCR Resnick 2009 miR-30c1* miR-181a*, -342- 3p, - 450b-5p Sangue microssérie Häusler 2010 RT-qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; TLDA: Taqman Low Density Array; miR: miRNA Fonte: Gilabert-Estelles et al., 201239 Introdução 13 A análise dos quadros revela o perfil dos estudos que associam os miRNAs com alguns cânceres ginecológicos. Observa-se que são pesquisas com menos de 10 anos, em sua maioria, descrevendo perfis de miRNAs diferentemente expressos na doença em estudo. Ressalta-se, ainda, que os grupos de comparação não são homogêneos, fato que pode enviesar a comparação entre eles. No entanto, d e m o n s t r a - s e a c o m p l e x i d a d e d e interações e vias moleculares envol vidas, bem como o potencial de utilização para o diagnóstico, prognóstico, tratamento e seguimento das doenças. A descrição do perfil de alteração de miRNAs em determinada doença pode servir como biomarcador e, a s s i m , p r o p i c i a r u m d i a g n ó s t i c o precoce e/ou menos invasivo dessas enfermidades. Por exemplo, para o câncer de ovário que é uma doença oligossintomática e cujo diagnóstico em muitos casos é feito somente em estádios avançados, a detecção precoce pode mudar o prognóstico do tratamento. Nesse sentido, Resnick et al., comparando amostras do soro de pacientes com câncer de ovário com controles saudáveis, demonstraram cinco miRNAs com expressão para cima (-21, -92, -93, -126 e -29a) e três com expressão para baixo (-155, -127 e -99b). Destacaram os miRNAs -21, -92 e -93 que já eram descritos como oncomirs e podem ser candidatos a biomarcadores dessa doença40. Häusler et al. submeteram o sangue total de pac ientes com câncer de ovário e controles saudáveis à análise de microsséries, tendo identificado 147 miRNAs com expressão alterada. Após análise de bioinformática e cálculos estatísticos, avaliaram a eficácia de detecção da doença por meio do perfil de miRNAs e concluíram que não há sensibilidade e especifidade suficiente para ser aplicada na população. No entanto, destacaram que os cânceres produzem perfis de miRNAs característicos no sangue e, sendo assim, podem ser utilizados para melhorar a detecção do câncer de ovário 41. A utilização dos miRNAs como alvos de terapia de doenças ainda é recente e predominantemente em experimentos com animais42. No entanto, destaca-se um estudo clínico de fase 2 que demonstrou a eficácia de uma Introdução 14 medicação que antagoniza o miRNA-122 para controle do vírus da hepatite C em portadores crônicos da doença43. 1.4 Endometriose e miRNA A pluralidade funcional de cada miRNA nos diversos processos celulares confronta-se à idéia da etiologia multifatorial da endometriose. Dessa forma, questiona-se a atuação dos miRNAs na endometriose. Os resultados do estudo in silico de Wren et al., em 2007, sugerem que alguns genes potencialmente envolvidos na fisiopatologia da endometriose eram regulados após a transcrição44. O primeiro trabalho a relacionar os miRNAs com a endometriose foi publicado, em 2007, por Pan et al.45. Nesse estudo, foram comparadas amostras endometriais de pacientes com e sem endometriose e, utilizando microsséries, observaram 48 miRNAs diferentemente expressos nessa doença. Confirmaram ainda essa diferença de expressão pela PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real de sete miRNAs selecionados, além de demonstrarem que os esteroides ovarianos podem influenciar na expressão de alguns miRNAs. A partir de então, outros estudos acrescentaram outros miRNAs que podem estar envolvidos na fisiopatologia da endometriose. Teague et al., 201037, propuseram alguns miRNAs candidatos a contribuir para os diversos mecanismos que levam à endometriose (Figura 2). Introdução 15 Fonte: Teague et al., 201037. Figura 2 - MiRNAs envolvidos na patogênese da endometriose Em estudo utilizando o model o de endometriose em babuínos, realizaram-se microsséries em amostras endometriais de animais com endometriose e sem endometriose. Foram encontrados 8 miRNAs diferentemente expressos dentre esses grupos, a saber: hsa-miR-451, hsa- miR-181a, hsa-miR-200a, hsa-miR-19b, hsa-miR-424, hsa-miR-21, hsa-miR- 29c e hsa-miR-14146. Os miRNAs -21, -29c e -451 apresentaram maior diferença de expressão e foram selecionados para as análises do presente estudo. Diante das observações clínic as que sugerem benefícios do tratamento cirúrgico da endometriose, antecedendo a reprodução assistida e os conhecimentos moleculares envolvidos, poder-se-ia formular a hipótese de que, na endometriose, existam miRNAs que alteram a síntese de proteínas essenciais ao preparo endometrial para o sucesso da implantação embrionária. Introdução 16 Portanto, considerando-se que essa hipótese seja uma questão a ser testada, o objetivo da presente pesquisa é investigar o papel da remoção do tecido ectópico de endometriose na expressão dos miRNAs -21, -451 e -29c e da proteína FKBP52. 2 Objetivos Objetivos 18 2 OBJETIVOS 2.1 Geral - Analisar o efeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose na expressão dos miRNAs -21, -451 e -29c e da proteína FKBP52 no endométrio de pacientes com endometriose. 2.2 Específicos a) Avaliar a expressão do miRNA-21 nas amostras obtidas: endométrio pré- operatório, endométrio pós-operatório e lesão de endometriose e compará-las entre si e com amos tra endometrial de mulheres sem endometriose; b) Avaliar a expressão do miRNA-451 nas amostras obtidas: endométrio pré-operatório, endométrio pós-operatório e lesão de endometriose e compará-las entre si e com amostr a endometrial de mulheres sem endometriose; c) Avaliar a expressão do miRNA-29c n a s a m o s t r a s o b t i d a s : e n d o m é t r i o pré-operatório, endométrio pós-operatório e lesão de endometriose e compará-las entre si e com amos tra endometrial de mulheres sem endometriose; d) Avaliar a expressão da prot eína FKBP52 nas amostras obtidas: endométrio pré-operatório, endométrio pós-operatório e lesão de endometriose e compará-las entre si e c o m a m o s t r a e n d o m e t r i a l d e mulheres sem endometriose. 3 Métodos Métodos 20 3 MÉTODOS Esta pesquisa clínica, prospectiva, longitudinal e comparativa foi realizada no período de fevereiro de 2012 a fevereiro de 2014, com pacientes portadoras de endometriose e submetidas à cirurgia laparoscópica, fruto da parceria entre a Disciplina de Ginecologia do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, a Huntington Medicina Reprodutiva e o Departamento de Obstetrícia, Ginecologia e Medicina Reprodutiva da Michigan State University. Trata-se de um estudo de pesquisa molecula r, que analisou fragmentos de endométrio ectópico e tópico. A análise laboratorial de expressão dos miRNA e da expressão da proteína FKBP52 foi realizada na Michigan State University n o Van Andel Institute, laboratório coordenado pelo Prof. Asgerally T. Fazleabas. 3.1 Ética em Pesquisa O presente estudo foi desenvolvido segundo o projeto de pesquisa que foi elaborado obedecendo todas as orientações contidas na Resolução 466 do Conselho Nacional de Saúde47 e recebeu aprovação dos seguintes comitês: - Comitê de Ética e Conselho de Departamento do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (Anexo A) Todos os sujeitos envolvidos receberam e consentiram em participar no estudo por meio do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexos B e C). Métodos 21 3.2 Casuística A presente casuística é constituída por pacientes que procuraram a Huntington Medicina Reprodutiva para aconselhamento e tratamento de infertilidade. Nesse serviço, o atendimento incluiu propedêutica clínica e exames subsidiários completos e adequados às queixas para a condução do tratamento dessas pacientes. O enfoque do estudo foi direcionado às mulheres com suspeita clínica e diagnóstico ultrassonográfico de endometriose. Nos casos selecionados, essas pacientes foram submetidas à cirurgia laparoscópica para a exérese das lesões endometrióticas com o intuito de propiciar otimização das taxas de gestação da FIV20. Dessa maneira, as pacientes com endometriose e com a proposta cirúrgica de trat amento, antecedendo a FIV, foram convidadas a participar do estudo. Para o grupo controle foram convidadas as pacientes que não apresentavam endometriose. 3.2.1 Critérios de inclusão Foram considerados os seguintes critérios de inclusão: 1) Idade entre 18 e 44 anos; 2) Índice de massa corporal (IMC) menor que 30 Kg/m2 ( c a l c u l a d o d e acordo com a seguinte fórmula: peso (kg)/altura x altura (m2)); 3) Presença de ambos ovários; 4) Não apresentar doença sistêmica clinicamente significativa, como diabete melito, hipertensão arterial, cardiopatia, doenças autoimunes, entre outras; 5) Ter aceito e assinado voluntariamente o termo de consentimento livre e esclarecido. Métodos 22 6) Para o grupo de estudo: apres entar diagnóstico de endometriose profunda realizado pela ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal; 7) Para o grupo controle: apresentar u l t r a s s o n o g r a f i a t r a n s v a g i n a l c o m preparo intestinal negativo para endometriose. 3.2.2 Critérios de não inclusão Os critérios de não inclusão foram: 1) Estar reconhecidamente infectada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), hepatite C ou hepatite B; 2) Apresentar sangramento ginecológico anormal, não diagnosticado na seleção; 3) Ciência de abuso de qualquer substância ou uso de hormônios, além dos sugeridos pelo médico, no período do tratamento; 4) Revogação do termo de consentimento livre e esclarecido. 3.2.3 Constituição dos grupos de estudo Grupo de estudo O grupo de estudo foi constituído por 15 pacientes que apresentaram alterações à ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal, sugestivas de endometriose profunda. Essas mulheres f o r a m s u b m e t i d a s à c i r u r g i a laparoscópica com exérese extensa das lesões endometrióticas para aumentar a probabilidade de sucesso na FIV. Métodos 23 Grupo controle As pacientes que não apresentaram alterações ultrassonográficas sugestivas de endometriose foram convidadas a participar e compor o grupo controle (11 pacientes). 3.3 Ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal Considerando a alta prevalência da endometriose na população de mulheres inférteis, a ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal tem papel fundamental na propedêutica a rmada. Não apenas possibilita a descrição minuciosa das lesões, ma s também auxilia o planejamento cirúrgico do tratamento48,49 (Anexo D e E). Neste estudo, todas as pacientes realizaram esse exame com um único examinador e seguindo protocolo estabelecido50. 3.4 Tratamento cirúrgico Após avaliação pré-cirúrgica completa, todas as pacientes do grupo de estudo foram submetidas à videolaparoscopia para ressecção dos focos de endometriose. Vale ressaltar que todos os procedimentos foram realizados por dois cirurgiões experientes, utilizando técnicas semelhantes e com táticas praticamente idênticas51 (Anexo F). Destacam-se algumas premissas que norteiam o sucesso da cirurgia52,53: - Jejum de pelo menos 8 horas; - Preparo intestinal prévio ao procedimento; - Profilaxia infecciosa e antitrombótica; - Ressecção ampla de todas as lesões superficiais e profundas; Métodos 24 - Preservação da inervação pélvica, principalmente, nos casos em que as lesões intestinais encontravam-se a 8,0 centímetros ou menos da borda anal; - Cautela com a introdução da dieta oral pós-cirúrgica. 3.5 Obtenção de amostras de tecido 3.5.1 Grupo de estudo No grupo de estudo, foram obtidas a m o s t r a s e n d o m e t r i a i s a p ó s a anestesia e antes do início da cirurgia laparoscópica, bem como amostras de lesões de endometriose profunda dur ante o procedimento cirúrgico. Posteriormente, aproximadamente 6 meses após a cirurgia, novas amostras endometriais foram adquiridas. As biópsias endometriais foram realizadas com a cânula de Pipelle. As amostras endometriais e de tecidos obtidas durante a cirurgia foram armazenadas em criotubos estéreis, livres de DNA humano, DNase e RNase (Cryo.s, Greiner Bio-One, Germany), imersas em RNA later (Ambion, Austin/Texas/USA) e mantidas a -80qC. No momento da coleta dos tecidos, separou-se parte deles para análise anatomopatológica. Nas amostras endometriais, esses estudos permitiram confirmar a fase do ciclo menstrual e, nas lesões endometrióticas, houve a confirmação histológica da doença. A técnica de parafinação e a confecção dos blocos de tecidos foram realizadas de acordo com as padronizações de cada laboratório, bem como os parâmetros para datação endometrial. Posteriormente, as amostras foram separadas de acordo com a fase do ciclo menstrual em que foram coletadas para a análise comparativa entre os grupos. Vale ressaltar que apenas as amostras obtidas durante a fase secretória foram analisadas. Métodos 25 3.5.2 Grupo controle Nas pacientes do grupo controle , procedeu-se a obtenção de amostras endometriais utilizando-se a cânula de Pipelle (Pipelle de Cornier, Laboratoire C. C. D., Paris-France) sem sedação, sob técnica padronizada. Esse procedimento foi executado pelo pesquisador e outros médicos afeitos ao procedimento. 3.6 Extração de RNA A extração de RNA total das am ostras endometriais e de tecido endometriótico foi realizada utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), segundo o protocolo do fabric ante. O RNA extraído foi, então, submetido à análise quantitativa pelo NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA). A seguir, as amostras foram diluídas para 20 ng/uL (nanogramas/microlitro) com a intenção de facilitar o manuseio para as reações seguintes. 3.7 Análise pelo RT-qPCR Para os miRNAs, foi realizada a reação de transcrição reversa com probes e s p e c í f i c o s p a r a o s m i R N A s a n a l i s a d o s , u t i l i z a n d o o TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA). A seguir, a expressão do DNA complementar (cDNA) foi realizada utilizando o TaqMan® miR Assays e o TaqMan® Universal PCR Master Mix ( A p p l i e d Biosystems, USA). Para a análise da expressão gênica de mRNA alvos, obteve-se o cDNA utilizando o kit High Capacity cDNA synthesis ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , USA). A seguir, utilizou-se primers específicos para FKBP52 e RPS17 e o kit PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) para sua análise de RT-qPCR. Métodos 26 Por fim, confeccionaram-se os pratos de PCR com 96 poços os quais foram analisados pelo sistema de RT-qPCR Vii A7 (Applied Biosystems, USA). Todas as reações de RT-qPCR foram realizadas em duplicata e por 40 ciclos. A expressão relativa foi calculada pelo método delta-delta Ct 54. Para estimar a diferença de expressão, utilizou-se o fold change q u e f o i calculado pela razão entre as médias de expressão relativa. Para os miRNA, utilizou-se o siRNA U6 como controle interno e para a expressão gênica, o gene codificador da proteína RPS17. 3.8 Análise estatística As variáveis numéricas foram apresentadas como média e desvio padrão e, devido ao tamanho amostral limitado, optou-se pelos testes estatísticos não paramétricos. Dessa forma, para a comparação dos dados entre os grupos, utilizou-se o teste de Mann Whitney. As variáveis nominais foram apresentadas como porcentagem e as frequências comparadas por meio do teste de qui-quadrado. O nível de significância considerado foi de 5%. 4 Resultados Resultados 28 4 RESULTADOS Foram incluídas, neste estudo, 26 pacientes cujas características podem ser observadas na Tabela 1. Quinze mulheres com média de idade de 35,2 anos (± 3,5) e índice de massa corporal (IMC) médio de 22,1 kg/m2 (± 1,9) apresentaram altera ções de endometriose profunda à ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal e foram incluídas no grupo de estudo. Para o grupo controle, foram incluídas 11 mulheres com média de idade de 37,9 anos (± 4,8) e IMC médio de 22,4 kg/m2 (± 3,4). Nenhuma das pacientes era tabagista. Nove indivíduos (60%) do grupo de estudo já haviam realizado tratamento de reprodução assistida (fertilização in vitro) e do grupo controle, cinco mulheres (45%). No que se refere ao antecedente de abortamento recorrente definido por dois episódios ou mais de perda gestacional55, houve duas pacientes (13%) do grupo de estudo e nenhuma do grupo controle. Na análise comparativa entre os dois grupos, não se observou diferença estatisticamente significante no que diz respeito às seguintes características: idade, IMC, falhas de FIV e abortamento recorrente. Tabela 1 - Características dos grupos endometriose e controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 G r u p o d e e s t u d o G r u p o c o n t r o l e p Idade (anos)1 35,2 ± 3,5 37,9 ± 4,8 0,121 IMC (kg/m2) 1 22,1 ± 1,9 22,4 ± 3,4 0,600 Falhas de FIV (%) 60 45 0,918 Abortamento recorrente (%) 13 0 0,525 IMC = índice de massa corporal; FIV = fertilização in vitro 1 Valores expressos em média ± desvio padrão Resultados 29 É importante destacar que a maioria das pacientes com endometriose, incluídas neste estudo, segundo classificação da American Fertility Society56, foram consideradas moderada ou severa. Como revela a Tabela 2, nenhuma das mulheres operadas apresentava a classificação mínima, ao passo que 80% delas era moderada ou severa. Tabela 2 - Estadiamento cirúrgico da endometriose segundo a American Fertility Society, 1996 - São Paulo, SP - 2012 a 2014 Estadiamento Grupo de estudo Mínima (rAFS I) 0 Leve (rAFS II) 3 (20%) Moderada (rAFS III) 3 (20%) Severa (rAFS IV) 9 (60%) rAFS - revised American Fertility Society Valores expressos em número e porcentagem Resultados 30 A seguir, para a análise da expressão de RNAs, as amostras foram separadas de acordo com a fase do ciclo menstrual, como mostra a Tabela 3. No grupo controle, obtiveram-se três (27%) amostras endometriais da fase proliferativa e oito (73%}, da fase secretória. No grupo de estudo, os espécimes analisados incluem endométrio no pré-operatório, lesão de endometriose e endométrio no p ó s - o p e r a t ó r i o . D a s a mostras endometriais pré-operatórias, seis (40%) são de fase proliferativa e nove (60%), de fase secretória. Das lesões de endomet riose, cinco (36%) são de fase proliferativa e nove (64%), de fase s e c r e t ó r i a . E , d o s e s p é c i m e s endometriais pós-operatórios, sete (64%) são de fase proliferativa e quatro (36%), de fase secretória. Vale ressaltar que em umas das pacientes com endometriose, não houve coleta de amostra de lesão de endometriose profunda. Em quatro pacientes, não foi possível realizar a a m o s t r a g e m e n d o m e t r i a l p ó s - operatória. Tabela 3 - Caracterização das amostras t e c i d u a i s a n a l i s a d a s s e g u n d o f a s e do ciclo menstrual - São Paulo, SP - 2012 a 2014 G r u p o d e e s t u d o G r u p o c o n t r o l e Endométrio pré-operatório fase proliferativa 6 (40%) 3 (27%) Endométrio pré-operatório fase secretória 9 (60%) 8 (73%) Lesão peritoneal fase proliferativa 5 (36%) NA1 Lesão peritoneal fase secretória 9 (64%) NA 1 Endométrio pós-operatório fase proliferativa 7 (64%) NA1 Endométrio pós-operatório fase secretória 4 (36%) NA 1 Valores expressos em número e porcentagem 1 NA - não se aplica Resultados 31 4.1 Análise de MiRNAs 4.1.1 MiRNA-21 O Gráfico 1, em diagrama de barras, mostra a expressão de miRNA- 21 nos diferentes tecidos em relação ao RNA nuclear pequeno (snRNA) U6. Semelhantemente, a Tabela 4 demons tra as relações entre essas expressões em relação ao grupo controle. Observa-se que não houve diferença estatisticamente significante nas expressões de miRNA-21, entre os diferentes tecidos, ao serem comparados com o grupo controle. Gráfico 1 - Expressão do miRNA-21 - São Paulo, SP - 2012 a 2014 miR: miRNA; Eosis: grupo de estudo Resultados 32 Tabela 4 - Relação da expressão de miRNA-21 nas amostras e comparação com o grupo controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 Média da expressão relativa Desvio padrão p Fold change Controle 1,01 0,34 Estudo pré- operatório 1,25 0,64 0,396 1,24 Lesão 2,32 2,19 0,396 2,30 Estudo pós- operatório 1,01 0,23 0,759 1,00 As comparações entre as amostras do grupo de estudo pré-operatório e lesão, pré-operatório e pós-operatório e lesão e pós-operatório não foram estatisticamente significantes, como mostra a Tabela 5. Tabela 5 - Comparação da expressão do miRNA-21 entre as amostras do grupo de estudo - São Paulo, SP - 2012 a 2014 p Fold change Pré-op x Lesão 0,773 1,85 Pré-op x Pós-op 0,724 1,24 Lesão x Pós-op 0,724 2,30 Resultados 33 4.1.2 MiRNA-451 Os dados do Gráfico 2, bem co mo da Tabela 6, revelam as expressões do miRNA-451 nas a m o s t r a s e s u a s r e l a ç õ e s . N o t a - s e q u e a expressão desse miRNA tem maior nível nas lesões de endometriose em comparação ao endométrio do grupo controle (p = 0,007 e fold change = 13,0). Nas outras análises, não foram observadas relações estatisticamente significantes no que concerne à contraposição da expressão do miRNA-451 em relação ao grupo controle. Gráfico 2 - Expressão de miRNA-451 - São Paulo, SP - 2012 a 2014 miR: miRNA; Eosis: grupo de estudo Tabela 6 - Relação da expressão de miRNA-451 nas amostras e comparação com o grupo controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 Média da expressão relativa Desvio padrão p Fold change Controle 0,98 0,46 Estudo pré- operatório 1,17 0,84 0,86 1,20 Lesão 12,68 16,99 0,007 13,00 Estudo pós- operatório 2,41 2,07 0,153 2,47 Resultados 34 Comparando as amostras do grupo de estudo, observa-se que a expressão relativa de miRNA-451 nas l e s õ e s d e e n d o m e t r i o s e p r o f u n d a é significativamente maior do que no endométrio dessas pacientes (p = 0,043 e fold change = 10,86). Já as comparações das amostras pré-operatório e pós-operatório e lesão e pós-operatório não mostrou diferença estatística, apesar de apresentarem fold change significativo (Tabela 7). Tabela 7 - Comparação da expressão do miRNA-451 entre as amostras do grupo de estudo - São Paulo, SP - 2012 a 2014 p Fold change Pré-op x Lesão 0,043 10,86 Pré-op x Pós-op 0,289 2,06 Lesão x Pós-op 0,157 5,27 4.1.3 MiRNA-29c Diferentemente dos miRNAs -21 e-451, a análise de expressão relativa do miRNA-29c revela diferenças de expressão entre os tecidos, como mostram o Gráfico 3 e a Tabela 6. A expressão é maior no endométrio de pacientes com endometriose ao comparar com as do grupo controle (p = 0,002). Parece ser ainda maior nas lesões de endometriose quando comparadas a esse mesmo grupo. Nesse caso, apesar de não apresentar diferença estatística significante (p = 0,059), tem fold change expressivo (6,53). Após a cirurgia, os níveis de miRNA-29c caem e equiparam-se aos níveis do grupo controle (p = 0,734). Resultados 35 Gráfico 3 - Expressão de miRNA-29c - São Paulo, SP - 2012 a 2014 miR: miRNA; Eosis: grupo de estudo Tabela 8 - Relação da expressão de miRNA-29c nas amostras e comparação com o grupo controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 Média da expressão relativa Desvio padrão p Fold change Controle 1,08 0,41 Estudo pré- operatório 2,62 1,39 0,002 2,44 Lesão 7,03 6,91 0,059 6,53 Estudo pós- operatório 0,98 0,47 0,734 1,09 Resultados 36 Verifica-se, na Tabela 9, que a análise das amostras do endométrio pré-operatório mostrou maior expressão do miRNA-29c em relação às amostras do endométrio pós-operatório (p = 0,021 e fold change = 2 , 6 7 ) . Resultado não obtido ao comparar os grupos pré-operatório e lesão e lesão e pós-operatório, apesar da expressão gênica comparativa apresentar fold change significativo. Tabela 9 - Comparação da expressão do miRNA-29c entre as amostras do grupo de estudo - São Paulo, SP - 2012 a 2014 p Fold change Pré-op x Lesão 0,501 2,68 Pré-op x Pós-op 0,021 2,67 Lesão x Pós-op 0,089 7,15 4.2 Análise da proteína FKBP52 A expressão relativa do mRNA que codifica a proteína FKBP52 utilizando a RPL17 como controle in terno é menor no endométrio das pacientes com endometriose em relação àquelas do grupo controle (p = 0,005 e fold change = 1 , 8 8 ) , a s s i m c o m o n a s l e s õ e s e n d o m e t r i ó t i c a s comparadas ao mesmo grupo (p < 0,001 e fold change = 3 , 1 9 ) . A p ó s o tratamento cirúrgico da endometriose, a expressão da FKBP52 aumenta e assemelha-se à do grupo controle (p = 0,61), como mostram o Gráfico 4 e a Tabela 10. Resultados 37 Gráfico 4 - Expressão da proteína FKBP52 - São Paulo, SP - 2012 a 2014 Eosis: grupo de estudo Tabela 10 - Relação da expressão da FKBP52 nas amostras e comparação com o grupo controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 Média da expressão relativa Desvio padrão p Fold change Controle 1,05 0,30 Estudo pré- operatório 0,56 0,14 0,005 1,88 Lesão 0,33 0,15 <0,001 3,19 Estudo pós- operatório 1,19 0,62 0,61 1,13 Resultados 38 A expressão relativa das lesões de endometriose é menor quando comparada ao endométrio pré-operatório (p = 0,009 e fold change= 1,69) e ao pós-operatório (p = 0,02 e fold change = 3,62). A despeito de apresentar expressão 2,14 maior no endométrio pós-operatório, quando comparada ao pré-operatório, essa diferença não se mostrou estatisticamente significativa, como mostra a Tabela 11. Tabela 11 - Comparação da expressão da FKBP52 entre as amostras do grupo de estudo - São Paulo, SP - 2012 a 2014 p Fold change Pré-op x Lesão 0,009 1,69 Pré-op x Pós-op 0,09 2,14 Lesão x Pós-op 0,02 3,62 5 Discussão Discussão 40 5 DISCUSSÃO 5.1 Conduta cirúrgica na endometriose A opção pelo tratamento cirúrgico da endometriose associado à infertilidade é um desafio corriqueiro no cotidiano dos que militam na medicina reprodutiva. Trata-se de decisão que envolve diversas informações como a idade, reserva ovariana e outras causas de infertilidade. Para os casos de endometriose mínima ou leve (rAFS I e II), em relação ao tratamento cirúrgico, os consensos apontam melhores taxas de gravidez espontânea ou quando realizam t r a t a m e n t o d e r e p r o d u ç ã o assistida57–59. Por outro lado, o benefício da cirurgia para os casos de endometriose moderada ou severa (rAFS III e IV) não é unânime na literatura17,58. No entanto, fruto de uma rotina rígida e completa na abordagem das pacientes com endometriose, demonstrou-se, em pesquisa anterior, que aquelas pacientes que fo ram submetidas ao tratamento cirúrgico dessa doença, antes do tr atamento de reprodução assistida, tiveram melhores taxas de gravidez20. Dessa maneira, com a intenção de explorar os caminhos moleculares que possam explicar os resultados do estudo referido, sob a mesma rotina de abordagem das p a c i e n t e s c o m endometriose do estudo mencionado, construiu-se o presente estudo. 5.2 Diagnóstico ultrassonográfico da endometriose Trata-se de um ponto de discussão a divisão dos grupos de estudo baseada no resultado da ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal. Sabe-se que o padrão ouro para o diagnóstico da endometriose é a laparoscopia com biópsia das áreas s u s p e i t a s e c o r r o b o r a ç ã o a n a t o m o - patológica57. No entanto, do ponto de vista prático, submeter todas as Discussão 41 pacientes inférteis à intervenção vi deolaparoscópica sob a premissa investigativa não é factível. A alta prevalência dessa enfermidade nas mulheres inférteis obriga o clínico a incluir essa hipótese em sua propedêutica6. Considerando que uma parcela das mulheres com endometriose relata pouco ou nenhum sintoma60, nota-se uma demanda de exames dirigidos para o seu diagnóstico. Nesse contexto, incluiu-se a ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal na propedêutica do casal infértil. Em estudo comparativo em relação ao exame de toque vaginal e à ressonância nucle ar magnética, a ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal m o s t r o u m e l h o r sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia para o diagnóstico de endometriose profunda retrocervical e do retossigmóide61. No presente estudo, o grupo controle é constituído de mulheres sem alterações na ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal. Apesar de apresentar a desvantagem de não passarem pelo teste padrão ouro para o diagnóstico da endometriose, refletem melhor a prática clínica e, assim, seus desdobramentos práticos são mais condizentes com a aplicabilidade no cotidiano do clínico em medicina reprodutiva. 5.3 MiRNAs e fase do ciclo menstrual As alterações hormonais que controlam o ciclo menstrual causam modificações nos órgãos pélvicos. Imagina-se, por isso, que os processos moleculares envolvidos, incluindo os miRNAs, também sofram alterações durante o ciclo. Rekker et al. recrutaram 9 pacientes saudáveis e coletaram amostras de sangue em 4 períodos do ciclo menstrual: primeiro dia do ciclo, sétimo dia do ciclo, dia do pico de LH e sétimo dia após pico de LH. Analisaram o perfil de miRNAs (375 miRNAs) nessas diferentes fases de amostras de sangue total e de plasma. Não houve diferença na expressão dos miRNAs Discussão 42 nos diferentes momentos do ciclo menstrual e, por fim, concluíram que as alterações cíclicas nas mulheres não afetaram a expressão de miRNAs no sangue62. Por outro lado, apesar de não haver evidências de diferenças no nível sérico, a expressão de miRNAs no endométrio não é a mesma nos diferentes momentos do ciclo menstrual. Kuokannen et al. realizaram estudo a fim de relacionar o perfil de miRNAs e mRNAs no endométrio de fase proliferativa tardia e de fase secretória média. Submeteram essas amostras endometriais a estudo de microssérie de miRNAs e de mRNAs. Além de descreverem perfis diferentes de miRNAs expressos nessas duas diferentes fases do ciclo menstrual, notaram que alguns miRNAs reguladores do ciclo celular estavam com expressão maior na fase secretória média em relação à proliferativa tardia63. Outros estudos similarmente corroboram a expressão dos miRNAs relacionada à fase do ciclo menstr ual. Alguns estudos descrevem a expressão dos miRNAs influenciada pelos esteroides, como o estradiol e a progesterona64: por exemplo, o miRNA 145 que pode diminuir a tradução do receptor de estrogênio alfa por se ligar ao mRNA dessa proteína e inibir sua tradução65. Outro estudo demonstra diferença de expressão de alguns miRNAs entre a fase proliferativa e secretória, em amostras de endométrio de pacientes sem endometriose e de endometriomas, mas não em amostras de endométrio de pacientes com endometriose e de lesões peritoneais e retrocervicais66. De maneira semelhante, a ex pressão da FKBP52 também é dependente da fase do ciclo menstrual. Yang et al., ao demostrar uma provável regulação da expressão da FKBP52 pelo fator de transcrição homeobox A10 (HOXA10), notaram que ambas as moléculas tinham expressão diferente nas fases proliferativa e secretória em um modelo de cultura de células estromais de endométrio humano26. Considerando-se essas observações e que a racionalidade do presente estudo baseia-se em um possível benefício do tratamento cirúrgico Discussão 43 da endometriose no que concerne à infertilidade, mais especificamente à implantação embrionária, optou-se pela inclusão apenas das amostras coletadas durante a fase secretória do ciclo menstrual. Tal fato reduziu o tamanho da amostra o que incorreu na restrição do poder de distinção das análises estatísticas. Nesse sentido, a i n d a c a b e m e n c i o n a r a d i f i c u l d a d e encontrada para incluir amostras de endométrio do pós-operatório. Não apenas relacionada à fase menstrual , mas também outros fatores dificultaram a amostragem desse grupo, como: gravidez espontânea após a cirurgia, falta de indicação de biópsia endometrial após a cirurgia e demora ou não retorno ao tratamento reprodutivo após o procedimento cirúrgico. 5.4 MiRNA-21 O miRNA-21 é um dos mais antigos descrito nos mamíferos e tem a sua sequência bem conservada por meio da evolução. É codificado pelo gene MIR-21 localizado em região intrônica do cromossomo 17q23.267. Essa molécula é bastante associada aos cânceres pois tem a função relacionada à proliferação celular e à metástase. Por tal sorte, é considerada um oncomir. Apresenta expressão aumentada em glioblastomas, câncer de mama, pulmão, próstata, cólon, e s t ô m a g o , e s ô f a g o , g a r g a n t a , leiomiossarcoma uterino e linfoma difuso de grandes células B. Além disso, no câncer de pâncreas, sua expressão elevada relaciona-se com metástase hepática e no câncer de mama, com doença avançada, metástase linfática e pior prognóstico68. Em relação à endometriose, Rámon et al. demonstraram expressão aumentada em amostra de endometrioma e de lesão retovaginal em comparação ao endométrio tópico de pacientes com endometriose e também em relação ao endométrio de mulheres sem endometriose66. Já, em estudo no qual mensurou-se a expressão de miRNAs no plasma sanguíneo, o miRNA-21 apresentou maior expressão em pacientes com endometriose em relação às sem a doença na análise de microssérie (fold change = 2,36 e Discussão 44 p = 0,034). No entanto, em confirmação com PCR quantitativo em tempo real, essa informação não foi corroborada (p = 0,41)69. No presente estudo, a expressão desse miRNA não apresentou diferença estatística significante entre as diversas amostras. Considerando- se que sua função esteja vinculada à proliferação celular, esperava-se encontrar maior expressão nas amostras de lesões em relação ao endométrio das pacientes com e sem endometriose, supondo-se que o endométrio refluído para a cavidade abdominal teria maior capacidade de proliferação. Apesar de não apresent arem significância estatística, analisando apenas os fold changes, poder-se-ia inferir algo semelhante ao esperado. As lesões de endometriose apresentam fold change de 2,30 em relação ao endométrio do grupo controle e de 1,85 e 2,30 em relação ao endométrio do grupo endometriose, antes e após a cirurgia, respectivamente. 5.5 MiRNA-451 Em estudo realizado por meio de a m o s t r a s d e s a n g u e d e m u l h e r e s saudáveis, dos 375 miRNAs analisados, o miRNA-451 foi o mais abundante62. Trata-se de uma molécula traduzida pelo gene MIR451 localizado no cromossomo 17q11.270. Dentre suas funções, pode-se citar: p r o l i f e r a ç ã o , d i f e r e n c i a ç ã o , migração e invasão celular. Semelh ante ao miRNA-21, também está relacionado a diversos tipos de cânc er, como gastrointestinal, glioma, esofageano, mama, osteossarcoma e vesical71. No que tange à endometriose, Nothnick et al. demonstraram, a partir de modelos em ratos, que a expr essão diminuída do miRNA-451 endometrial não é causa, mas consequência da doença. Relataram também que esse perfil de expressão diminuída não contribui para o tecido que reflui para a cavidade abdominal originar uma lesão de endometriose71. Os dados obtidos por meio do modelo de babuínos são consoantes com esses dados e também mostraram expressão reduzida do miRNA-451, após a indução da Discussão 45 endometriose. No entanto, diferente do estudo anterior, esse demonstrou que o miRNA-451 contribui para a fisiopatologia da endometriose por aumentar a proliferação celular devido à elevação da proteína YWHAZ, um dos alvos desse miRNA46. Hawkins et al. utilizaram a análise de microssérie para traçar o perfil de miRNAs diferentemente expressos no endométrio de pacientes com endometriose em relação ao tecido de endometrioma. Dentre outros miRNAs, demonstraram que o -451 tem maior expressão no endometrioma72. Os dados obtidos neste estudo são condizentes com o trabalho de Hawkins et al. pois se verificou maior expressão do miRNA-451 nas amostras de lesão de endometriose em relação ao endométrio do grupo controle (p = 0,07 e fold change = 13,00) e em relação ao endométrio das pacientes com endometriose (p = 0,04 e fold change = 10,86). Porém, não foi condizente com os estudos de modelos em animais pois, a expressão desse miRNA, comparando o grupo controle com aquele com endometriose pré-operatório, não apresentou diferenç a estatisticamente significante, contrariando a expectativa de diminuição nesse grupo. 5.6 MiRNA-29c O miRNA-29c é codificado pelo gene MIR29c que está localizado no cromossomo 1q32.273,74. Considerando as diferentes fases do ciclo menstrual, apresenta expressão mais alta na fase secretória média em relação à proliferativa tardia, como mostra o estudo de Kuokkanen et al.63. Portanto, isso sugere que esse miRNA tem relação com a progesterona. Além disso, atribui-se como funções, o remodelamento da matriz extra-celular e ação como supressor de metástase. Está relacionado a alguns tipos de cânceres, como de nasofaringe e leucemia linfocítica crônica, principalmente naqueles com elevada capacidade de invasão e metástase68. Em relação à endometriose, os resultados obtidos no presente estudo mostram que a expressão do miRNA-29c é maior no endométrio das Discussão 46 pacientes com endometriose profunda em relação ao grupo controle. É ainda maior nas lesões de endometriose e, após a cirurgia, restaura-se para níveis similares ao do grupo controle. A comparação do grupo lesão e o grupo controle não apresenta diferença estatisticamente significante (p = 0,059), no entanto, apresenta fold change expressivo (6,53). Esses dados são condizentes co m alguns dados da literatura. Ohlsson Teague et al. mostraram que esse miRNA está aumentado no endométrio ectópico em relação ao tópico em amostras pareadas75. Hawkins et al. notaram expressão aumentada do miRNA-29c ao comparar amostras de endometriomas à de endométrio de pacientes sem endometriose. Ruan et al. descreveram níveis aumentados d e m i R N A - 2 9 c n o e n d o m é t r i o d e pacientes com endometriose em relação ao de pacientes sem endometriose76. Contrapondo a maioria das evidências, há um estudo que relatou expressão para baixo do miRNA-29c em endométrio ectópico em relação ao tópico. Concluiu, ainda, que essa molécula é um supressor da endometriose por inibir a proliferação, invasão e apoptose das células endometriais77. 5.7 FKBP52 A FKBP52 é uma proteína codifi cada pelo gene FKBP4 que se encontra no cromossomo 12p13.33 78. Como foi mencionado, está relacionada ao receptor de progesterona e o regula positivamente. Na endometriose, parece ter papel na etiopatogenia24 e n a r e c e p t i v i d a d e endometrial e infertilidade associada26. A ferramenta Targetscan (www.targetscan.org) revela que o mRNA que traduz a proteína FKBP52 é um dos a l v o s d o m i R N A - 2 9 c . O s í t i o d e ligação está descrito na Figura 3. Discussão 47 Figura 3 - Sítio de ligação miRNA-29c e FKBP52 Os dados obtidos neste estudo mostram que o comportamento da expressão dessa proteína é inversa ao do miRNA-29c. O endométrio de pacientes com endometriose apresenta menor expressão da FKBP52 em relação ao grupo controle. Após o tratamento cirúrgico, ocorre aumento dos níveis de expressão do mRNA dessa proteína, níveis esses que se tornam equiparáveis aos do grupo controle. Além disso, a expressão da FKBP52 é menor na lesão de endometriose quando comparada ao endométrio do grupo controle e ao das pacientes com endometriose antes e após a cirurgia. Os níveis diminuídos da expressão dessa proteína no endométrio de pacientes com endometriose também foram descritos em outros estudos24,26 e podem explicar a decidualização alterada e a infertilidade relacionada à implantação embrionária. Nota-se, também, que os menores níveis de expressão da FKBP52 ocorrem nas lesões de endometriose, o que corrobora o estudo de Hirota et al., no qual descreveram a p r o m o ç ã o d a s lesões de endometriose pela redução da FKBP5224. A relação entre as expressões do miRNA-29c e da FKBP52 não tem precedentes na literatura médica. Apesar de carecer de outras evidências como expressão em nível proteico ou estudos funcionais, os dados obtidos no presente estudo, mesmo que de forma inicial, mostram um provável papel do miRNA-29c por meio da modulação da expressão da FKBP52 na etiopatogenia da endometriose, bem como um mecanismo que explica a alteração na decidualização e consequente contribuição para a infertilidade. Esses processos podem ser reverti dos pelo tratamento cirúrgico da endometriose com remoção das lesões, como se pode inferir pelo retorno da expressão do miRNA-29c e da FKBP52 p a r a n í v e i s s e m e l h a n t e s a o d o 3’ UTR da FKBP52 (Posição 426-432)…UGUGGCCUCCAUGUGGGUGCUAG....... Sítio de ligação do miRNA-29c.....….….AUUGGCUAAAGUUUACCACGAU…..... Discussão 48 endométrio de mulheres sem endometriose após a cirurgia, conforme se constatou no presente estudo. 6 Conclusões Conclusões 50 6 CONCLUSÕES A análise dos dados obtidos permite concluir: a) A análise da expressão do miRNA-21 nas diferentes amostras não demonstrou diferenças estatisticamente significantes; b) A análise da expressão do miRNA-451 não evidenciou diferença estatística significante no endométrio das pacientes com endometriose em comparação às das mulheres sem endometriose. Por outro lado, a expressão do miRNA-451 nas lesões de endometriose foi significativamente maior do que no endométrio do grupo controle, bem como no das pacientes do grupo endometriose pré-operatório; c) Em relação ao miRNA-29c, verificou-se expressão aumentada no endométrio de pacientes do grupo endometriose em relação ao controle. Após o tratamento cirúrgico, a expressão desse miRNA retorna a níveis semelhantes aos do grupo controle. Além disso, nas lesões de endometriose a sua expressão não mostrou diferença estatística significante em relação ao endométrio do grupo controle (p = 0,059), porém, o fold change f o i e x p r e s s i v o (6,53); d) A avaliação da proteína FKBP52 analisada pela expressão de seu mRNA apresentou comportamento inverso ao do miRNA-29c. A expressão foi menor no endométrio de pacientes com endometriose em relação às sem endometriose e ainda menor nas lesões de endometriose. Após a remoção das lesões endometrióticas, a expressão da FKBP52 é restaurada para níveis semelhantes ao do endométrio de mulheres do grupo controle. 7 Anexos Anexos 52 7 ANEXOS Anexo A - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo Anexos 53 Anexos 54 Anexo B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Grupo de Estudo FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO _____________________________________________________________ DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME: .:.................................................................................................................... DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ...................................... SEXO : .M Ƒ F Ƒ DATA NASCIMENTO: ......../......../...... ENDEREÇO ............................................................... Nº ................... APTO: .......... BAIRRO: ...............................................................CIDADE ..................................... CEP:.............................. TELEFONE: DDD (............) …........................................... 2. RESPONSÁVEL LEGAL: ......................................................................................... NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.): ............................................... DOCUMENTO DE IDENTIDADE:....................................SEXO: M Ƒ F Ƒ DATA NASCIMENTO.: ....../......./...... ENDEREÇO…............................................................. Nº ............... APTO: ............. BAIRRO: ................................................. CIDADE: .................................................. CEP:....................................TELEFONE: DDD(............)............................................. ___________________________________________________________________ DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA “Perfil de expressão de MicroRNAs em pacientes inférteis com endometriose antes e após a remoção cirúrgica do tecido ectópico” 2. PESQUISADOR Executante: Eduardo Hideki Miyadahira PESQUISADOR Responsável : Edmund Chada Baracat CARGO/FUNÇÃO: Professor Titular da Disciplina de Ginecologia. INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 28.085 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: RISCO MÍNIMO X RISCO MÉDIO Ƒ RISCO BAIXO Ƒ R I S C O M A I O R Ƒ 4.DURAÇÃO DA PESQUISA: 36 meses Anexos 55 FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 1 – Desenho do estudo e objetivo(s): Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo. Sabe-se que algumas pacientes beneficiam-se da cirurgia de remoção do tecido ectópico da endometriose. Dessa forma, os objetivos deste estudo são identificar microRNAs (pequenas moléculas de RNA) diferentemente expressos em pacientes com endometriose e pacientes sem endometriose; verificar se após a remoção cirúrgica do tecido endometrial ectópico há alteração na expressão de microRNAs em pacientes com endometriose; relacionar a expressão de microRNAs endometriais com as características gerais e reprodutivas de pacientes com ou sem endometriose. 2 – Descrição dos procedimentos que serão realizados: Serão executados: a) Ultrassom transvaginal com preparo intestinal e/ou ressonância magnética para pesquisa de endometriose profunda. Estes exames são pouco invasivos, com raras complicações e têm duração de aproximadamente uma hora ambos. No caso do ultrassom, o desconforto se deve somente pela via o qual é realizada, a transvaginal e não tem complicações. E, no caso da ressonância, é um exame indolor, apenas chama-se a atenção para as pessoas que tem claustrofobia (incômodo ao permanecer em lugares fechados), pois ele é realizado em uma câmara fechada. A complicação mais comum é a reação alérgica ao contraste utilizado no exame. b) Biópsia endometrial, antes e após cirurgia para tratamento da endometriose, através da técnica utilizada na rotina clínica, não havendo, portanto, maior risco durante ou após o procedimento cirúrgico. Neste procedimento, iremos realizar um exame especular ginecológico e, após visualização do colo do útero, um fino catéter é colocado dentro da cavidade do útero. Por meio de vácuo, uma pequena amostra de endométrio (camada interna do útero) é aspirada. Este pequeno procedimento, não requer obrigatoriamente uma anestesia, porém pode causar dor em cólica no momento que o catéter é inserido dentro da cavidade do útero que, geralmente, é suportável. Tem duração de aproximadamente 15 minutos. As complicações são raras e as mais comuns Anexos 56 são o falso trajeto dentro do útero e o sangramento aumentado após o procedimento. c) Retirada de amostra de sangue por punção periférica, antes e após a cirurgia para tratamento da endometriose, a qual também é utilizada na rotina clínica. A punção de veia periférica é um pequeno procedimento rápido (aproximadamente 5 minutos) e pouco doloroso. Utilizamos uma agulha fina para acessar o interior do vaso sanguíneo e coletar amostra de sangue. A complicação mais comum é a transfixação da veia puncionada. d) Cirurgia laparoscópica por técnica convencional previamente indicada por suspeita clínica e/ou radiológica de endometriose, no qual serão realizadas biópsias do tecido endometrial e do tecido ectópico. A técnica cirúrgica aplicada será a mesma utilizada normalmente na prática clínica, não havendo, portanto, maior risco durante ou após o procedimento cirúrgico. Trata-se de cirurgia realizada por técnica conhecida como ”minimamente invasiva” pois os cortes realizados na pele são pequenos. A duração da cirurgia é variável e depende da extensão da sua doença. As complicações mais comuns são a dor pós-operatória e a lentidão do trânsito intestinal, quadro conhecido como íleo paralítico. 3 – Relação dos procedimentos rotineiros e como são realizados: Ultrassom transvaginal realizado por técnica convencional e por operador qualificado ou ressonância nuclear magnética; biópsia endometrial realizada com Catéter de Pipelle sob técnica convencional; coleta de sangue por punção periférica da veia do antebraço; cirurgia para tratamento da endometriose por vídeo- laparoscopia realizada por cirurgião especializado. 4 – Descrição dos desconfortos e riscos esperados nos procedimentos: Não haverá nenhum desconforto ou risco adicional durante a realização da pesquisa já que os procedimentos fazem parte do tratamento proposto para dor e/ou infertilidade. 5 – Benefícios para o participante: Não há benefício direto para o participante visto que o presente estudo não tem por objetivo estabelecer novo tratamento para a endometriose. No entanto, o avanço na compreensão dos mecanismos envolvidos nesta doença pode proporcionar o estudo de novas alternativas de tratamento. Além disso, seus dados serão mantidos em sigilo absoluto. Anexos 57 6 – Relação de procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais o paciente pode optar: O tratamento proposto contempla o quadro clínico de cada paciente, desta forma, entende-se que esta é a alternativa mais adequada. 7 – Garantia de acesso: e m q u a l q u e r m o m e n t o d o e s t u d o , a s e n h o r a t e r á acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O investigador principal é o Dr. Eduardo Hideki Miyadahira que pode ser encontrado no endereço: Av. Dr. Enéas de Carvalho, 255, Instituto Central, Ginecologia, 10º andar, fone: 2661-6647 (Clínica Ginecológica). Caso tenha alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Av. Dr. Arnaldo, 455 – Instituto Oscar Freire – 2º andar– tel: 3061-8004, FAX: 3061- 8004 – E-mail: [email protected] 8 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na Instituição; 09 – Direito de confidencialidade – As informações obtidas serão analisadas em conjunto com as demais pacientes, não sendo divulgada a sua identificação; 10 – Direito de ser mantida atualizada sobre os resultados parciais e totais das pesquisas, quando em estudos abertos, ou de resultados que sejam do conhecimento dos pesquisadores; 11 – Despesas e compensações: não há despesas adicionais para o participante em qualquer fase do estudo, apenas os relacionados ao tratamento proposto. Também não há compensação financeira relacionada à sua participação. 12 – Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou tratamentos propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante tem direito a tratamento médico na Instituição. 13 - Compromisso do pesquisador de armazenar as amostras coletadas em local seguro e utilizá-las somente para este estudo. Anexos 58 Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo ” Perfil de expressão de MicroRNAs em pacientes inférteis com endometriose antes e após a remoção cirúrgica do tecido ectópico”. Eu discuti com o Dr. Eduardo Hideki Miyadahira sobre a minha decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. ------------------------------------------------- Assinatura do paciente/representante legal Data / / ------------------------------------------------------------------------- Assinatura da testemunha Data / / (para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semi-analfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual) (Somente para o responsável do projeto) Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo. ------------------------------------------------------------------------- Assinatura do responsável pelo estudo Data / / Anexos 59 Anexo C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Grupo Controle FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO _______________________________________________________________ DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME: .:.................................................................................................................... DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ..................................... SEXO : .M Ƒ F Ƒ DATA NASCIMENTO: ......../......../...... ENDEREÇO: ................................................... Nº: ..................... APTO: .................. BAIRRO: .............................................................. CIDADE: .................................... CEP: ................................... TELEFONE: DDD (............) ........................................ 2.RESPONSÁVEL LEGAL ........................................................................................... NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.)................................................ DOCUMENTO DE IDENTIDADE :....................................SEXO: M Ƒ F Ƒ DATA NASCIMENTO.: ....../......./...... ENDEREÇO: .................................................. Nº .................. APTO: ....................... BAIRRO: ........................................................ CIDADE: ............................................ CEP:...................................TELEFONE: DDD(............)............................................. ___________________________________________________________________ DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA “Perfil de expressão de MicroRNAs em pacientes inférteis com endometriose antes e após a remoção cirúrgica do tecido ectópico” 2. PESQUISADOR Executante: Eduardo Hideki Miyadahira PESQUISADOR Responsável : Edmund Chada Baracat CARGO/FUNÇÃO: Professor Titular da Disciplina de Ginecologia. INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 28.085 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: RISCO MÍNIMO X RISCO MÉDIO Ƒ RISCO BAIXO Ƒ R I S C O M A I O R Ƒ 4.DURAÇÃO DA PESQUISA: 36 meses Anexos 60 FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 1 – Desenho do estudo e objetivo(s): Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo. Sabe-se que algumas pacientes beneficiam-se da cirurgia de remoção do tecido ectópico da endometriose. Dessa forma, os objetivos deste estudo são identificar microRNAs (pequenas moléculas de RNA) diferentemente expressos em pacientes com endometriose e pacientes sem endometriose; verificar se após a remoção cirúrgica do tecido endometrial ectópico há alteração na expressão de microRNAs em pacientes com endometriose; relacionar a expressão de microRNAs endometriais com as características gerais e reprodutivas de pacientes com ou sem endometriose. No seu caso, como não há evidência clínica ou radiológica de endometriose gostaríamos de incluí-la dentro do grupo de comparação às pacientes com endometriose, aproveitando a biópsia endometrial que faz parte do seu tratamento. 2 – Descrição dos procedimentos que serão realizados: Serão executados: a) Ultrassom transvaginal com preparo intestinal e/ou ressonância magnética para pesquisa de endometriose profunda. Estes exames são pouco invasivos, com raras complicações e têm duração de aproximadamente uma hora ambos. No caso do ultrassom, o desconforto se deve somente pela via o qual é realizada, a transvaginal e não tem complicações. E, no caso da ressonância, é um exame indolor, apenas chama-se a atenção para as pessoas que tem claustrofobia (incômodo ao permanecer em lugares fechados), pois ele é realizado em uma câmara fechada. A complicação mais comum é a reação alérgica ao contraste utilizado no exame. b) Biópsia endometrial através da técnica utilizada na rotina clínica, não havendo, portanto, maior risco durante ou após o procedimento cirúrgico. Neste procedimento, iremos realizar um exame especular ginecológico e, após visualização do colo do útero, um fino catéter é colocado dentro da cavidade do útero. Por meio de vácuo, uma pequena amostra de endométrio (camada interna do útero) é aspirada. Este pequeno procedimento, não requer obrigatoriamente uma anestesia, porém pode causar dor em cólica no momento que o catéter é inserido dentro da cavidade do útero que, geralmente, é suportável. Tem duração de Anexos 61 aproximadamente 15 minutos. As complicações são raras e as mais comuns são o falso trajeto dentro do útero e o sangramento aumentado após o procedimento. c) Retirada de amostra de sangue por punção periférica a qual também é utilizada na rotina clínica. A punção de veia periférica é um pequeno procedimento rápido (aproximadamente 5 minutos) e pouco doloroso. Utilizamos uma agulha fina para acessar o interior do vaso sanguíneo e coletar amostra de sangue. A complicação mais comum é a transfixação da veia puncionada. 3 – Relação dos procedimentos rotineiros e como são realizados: Ultrassom transvaginal realizado por técnica convencional e por operador qualificado ou ressonância nuclear magnética; biópsia endometrial realizada com Catéter de Pipelle sob técnica convencional; coleta de sangue por punção periférica da veia do antebraço. 4 – Descrição dos desconfortos e riscos esperados nos procedimentos: Não haverá nenhum desconforto ou risco adicional durante a realização da pesquisa já que os procedimentos fazem parte do tratamento proposto para dor e/ou infertilidade. 5 – Benefícios para o participante: Não há benefício direto para o participante visto que o presente estudo não tem por objetivo estabelecer novo tratamento para a endometriose. No entanto, o avanço na compreensão dos mecanismos que causam esta doença pode contribuir para a descoberta ou investigação de novas alternativas de tratamento. Além disso, seus dados serão mantidos em sigilo absoluto. 6 – Relação de procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais o paciente pode optar: O tratamento proposto contempla o quadro clínico de cada paciente, desta forma, entende-se que esta é a alternativa mais adequada. 7 – Garantia de acesso: e m q u a l q u e r m o m e n t o d o e s t u d o , a s e n h o r a t e r á acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O investigador principal é o Dr. Eduardo Hideki Miyadahira que pode ser encontrado no endereço: Av. Dr. Enéas de Carvalho, 255, Instituto Central, Ginecologia, 10º andar, fone: 2661-6647 (Clínica Anexos 62 Ginecológica). Caso tenha alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Av. Dr. Arnaldo, 455 – Instituto Oscar Freire – 2º andar– tel: 3061-8004, FAX: 3061- 8004 – E-mail: [email protected] 8 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na Instituição; 09 – Direito de confidencialidade – As informações obtidas serão analisadas em conjunto com as demais pacientes, não sendo divulgada a sua identificação; 10 – Direito de ser mantida atualizada sobre os resultados parciais e totais das pesquisas, quando em estudos abertos, ou de resultados que sejam do conhecimento dos pesquisadores; 11 – Despesas e compensações: não há despesas adicionais para o participante em qualquer fase do estudo, apenas os relacionados ao tratamento proposto. Também não há compensação financeira relacionada à sua participação. 12 – Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou tratamentos propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante tem direito a tratamento médico na Instituição. 13 - Compromisso do pesquisador de armazenar as amostras coletadas em locais seguros e utilizá-las somente para este estudo. Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo ” Perfil de expressão de MicroRNAs em pacientes inférteis com endometriose antes e após a remoção cirúrgica do tecido ectópico”. Anexos 63 Eu discuti com o Dr. Eduardo Hideki Miyadahira sobre a minha decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. ------------------------------------------------- Assinatura do paciente/representante legal Data / / ------------------------------------------------------------------------- Assinatura da testemunha Data / / (para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semi-analfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual) (Somente para o responsável do projeto) Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo. ------------------------------------------------------------------------- Assinatura do responsável pelo estudo Data / / Anexos 64 Anexo D - Ilustração auxiliar ao laudo da ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal * Cedido por Dra. Luciana Chamié Anexos 65 Anexo E - Inventário pélvico cirúrgico (relacionado ao caso do Anexo C) Anexos 66 Anexo F - Aspecto pós-cirúrgico (relacionado ao caso do Anexo C) 8 Referências Referências 68 8 REFERÊNCIAS 1. Donoso E, Carvajal JA, Poblete JA. La edad de la mujer como factor de riesgo de mortalidad materna, fetal, neonatal e infantil. Rev Med Chil. 2014:142(2):168-74. 2. Carolan M, Frankowska D. Advanced maternal age and adverse perinatal outcome: a review of the evidence. Midwifery. 2011;27(6): 793-801. 3. INCA. INCA - CÂNCER - Tipo - Mama. [cited 2015 Apr 3]. Available from: http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/ma ma/cancer_mama++ 4. Giudice LC. Endometriosis. N Engl J Med. 2010;362(25):2389-98. 5. Viganò P, Parazzini F, Somigliana E, Vercellini P. Endometriosis: epidemiology and aetiological factors. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2004;18(2):177-200. 6. Meuleman C, Vandenabeele B, Fieuws S, Spiessens C, Timmerman D, D’Hooghe T. 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