{"paper_id":"cc2bb329-7241-4ded-a57a-e57b858045fc","body_text":"EDUARDO HIDEKI MIYADAHIRA \n \n \n \n \n \n \n \nEfeito da remoção cirúrgica das lesões de \nendometriose profunda na expressão dos  \nmicroRNAs -21, -451 e -29c e da proteína FKBP52 \n \n \n \n \nDissertação apresentada à Faculdade de \nMedicina da Universidade de São Paulo para \na obtenção do título de Mestre em Ciências \nPrograma de Obstetrícia e Ginecologia  \nOrientador: Prof. Dr. Paulo Cesar Serafini \n \n \n \n \n \nSÃO PAULO \n2016 \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) \nPreparada pela Biblioteca da \nFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo \n \n”reprodução autorizada pelo autor \n   \n             Miyadahira, Eduardo Hideki \nEfeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose profunda na expressão \ndos microRNAs -21, -451 e -29c e da proteína FKBP52  /  Eduardo Hideki \nMiyadahira.  --  São Paulo, 2016. \n \n D i s s e r t a ç ã o ( m e s t r a d o ) - - F a c u l d a d e  d e  M e d i c ina da Universidade de São Paulo. \nPrograma de Obstetrícia e Ginecologia. \n \n O r i e n t a d o r :  P a u l o  C e s a r  S e r a f i n i .   \n      \n   \n D e s c r i t o r e s :   1 . E n d o m e t r i o s e   2 . M i c r o RNAs  3.Proteínas de ligação a tacrolimo  \n4.Infertilidade \n \n \n \n U S P / F M / D B D - 1 5 9 / 1 6   \n    \n \n\n\t\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nDedicatória \n \n\n\t\n \n \nAos meus pais, Ana e Seizo, \nPelo amor e carinho incondicionais. \nPela vida e educação que nos proporcionaram. \nPelo exemplo e suporte na vida acadêmica. \nNão pouparam esforços para nos fornecer o melhor. \n \n \nÀ minha irmã, Mariana, \nPela companhia de estrada e \nPela cumplicidade de todos os momentos. \nNas perdas e nas conquistas. \n \n \nÀ minha esposa, Juliana, \nMeu eterno amor! \nMeu brinde à vida de todas as manhãs e \nMeu aconchego de todas as noites! \nPelo jeito simples de trazer felicidade! \nPelo incentivo e suporte na confecção desta dissertação. \n \n \nPor fim, mas representando um começo, \nAo nosso querido filho, Eric. \nSua chegada nos trouxe a reflexão sobre \nNossas origens e nosso legado. \nEste sentimento indescritível da paternidade, \nRemonta àqueles que nos criaram, \nExaltando a ciclicidade da vida! \nDando vida ao amor ou \nAmor à vida! \n\n\t\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAgradecimentos \n \n\n\t\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAo Prof. Dr. Edmund Chada Baracat, digníssimo Prof. Titular da Disciplina \nde Ginecologia do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade \nde Medicina da Universidade de São Paulo. \nPor permitir que mantivesse minha atividade acadêmica, primeiramente, na \nPreceptoria da Disciplina e, posteriormente, no Centro de Reprodução \nHumana Governador Mário Covas. \nPelo exemplo de comando e incentivo ao estado da arte em pesquisa. \n \n \n \nAo Prof. Dr. Paulo Cesar Serafini, pela orientação desta dissertação. \nPelos ensinamentos que apenas os mestres nos trazem. \nPelo exemplo de dedicação ao trabalho, cuidado aos pacientes e incansável \nincentivo às pesquisas. \nPelas sábias palavras e orientações, não apenas acadêmicas, mas de vida. \n \n \n\n\t\n \nAos meus queridos sogros, Elizabette e Fernando, pelo exemplo de \neducação às filhas e a mim. Pelo apoio em diversas fases do nosso convívio. \nAos meus queridos cunhados, Danielle, Lilian, Bruno e Lucas, pelo \nsuporte a esta etapa importante da minha vida. \nAo Prof. Asgerally T. Fazleabas, diretor e chefe do Departamento de \nObstetrícia, Ginecologia e Medicina Reprodutiva da Michigan State \nUniversity, por permitir minha estadia e análise de amostras no laboratório \nsob sua responsabilidade. Pelo incentivo e suporte desta pesquisa. \nAo Dr. Niraj R. Joshi, pesquisador associado do Departamento de \nObstetrícia, Ginecologia e Medicina Reprodutiva da Michigan State \nUniversity, pela ajuda irrestrita durante toda a passagem por Grand Rapids e \npelos ensinamentos e treinamento das técnicas de biologia molecular. \nAo Dr. Eduardo Leme Alves da Motta, por permitir meu ingresso no grupo \nHuntington Medicina Reprodutiva e pelos valiosos ensinamentos na área. \nÀ Dra. Luciana Pardini Chamié, pela realização das ultrassonografias. \nExemplo de profissional e de pessoa. \nAos Drs. Duarte Miguel Rodrigues Ribeiro e  Ricardo Mendes Alves \nPereira, pela maestria, minúcia e destreza no tratamento cirúrgico das \npacientes.  \nÀ Dra. Tatiana Bonetti, pela ajuda com as análises estatísticas e correções \nno exame de qualificação dessa dissertação. \nAo Prof. Dr. José Maria Soares Junior e ao Prof. Dr. Gustavo Arantes \nRosa Maciel, pelas sugestões auferidas no exame de qualificação dessa \ndissertação. \n\n\t\nÀ minha querida tia e madrinha, Mitsuko, pelas correções gramaticais e \nortográficas. \nÀ Sra. Lucinda Cristina Pereira, pelas orientações e ajuda nos processos \nrequisitados pela Pós-Graduação do Departamento de Obstetrícia e \nGinecologia para confecção dessa dissertação. \nA todos os docentes e assistentes da Disciplina de Ginecologia do \nDepartamento de Obstetrícia e Ginecologia, pela minha formação como \nginecologista e pelo excelente convívio. \nA todas as pacientes e seus companheiros e famílias, motivo maior da \nincessante vontade de aprender e melhorar. \n \n \n\n\t\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nNORMALIZAÇÃO ADOTADA \n \nEsta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento \ndesta publicação:  \nReferências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors  \n(Vancouver).  \nUniversidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e \nDocumentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. \nElaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. \nCrestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a \ned. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.  \nAbreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in \nIndex Medicus.  \n \n\n\t\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nSumário \n \n\n\t\n \n \n \nLista de Siglas, Símbolos e Abreviações \nLista de Figuras, Quadros e Gráficos \nLista de Tabelas \nResumo \nAbstract \n1  INTRODUÇÃO......................................................................................... 1 \n1.1  Endometriose.................................................................................... 2 \n1.2  Endometriose e proteína FKBP52.................................................... 5 \n1.3  MiRNA............................................................................................... 6 \n1.3.1 MiRNAs e doenças ginecológicas............................................ 8 \n1.4  Endometriose e miRNA................................................................... 14 \n2 OBJETIVOS.............................................................................................. 17 \n2.1  Geral ............................................................................................... 18 \n2.2  Específicos...................................................................................... 18 \n3 MÉTODOS................................................................................................ 19 \n3.1  Ética em pesquisa........................................................................... 20 \n3.2  Casuística ....................................................................................... 21 \n3.2.1 Critérios de inclusão............................................................... 21 \n3.2.2 Critérios de não inclusão........................................................ 22 \n3.2.3 Constituição dos grupos de estudo........................................ 22 \n3.3 Ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal ..................... 23 \n3.4 Tratamento cirúrgico....................................................................... 23 \n3.5 Obtenção de amostras de tecido .................................................... 24 \n3.5.1 Grupo de estudo.................................................................... 24 \n3.5.2 Grupo controle....................................................................... 25 \n3.6 Extração de RNA............................................................................ 25 \n3.7 Análise pelo RT-qPCR.................................................................... 25 \n3.8 Análise Estatística........................................................................... 26 \n\n\t\n4 RESULTADOS......................................................................................... 27 \n4.1 Análise de miRNAs......................................................................... 31 \n4.1.1 MiRNA-21 .............................................................................. 31 \n4.1.2 MiRNA-451 ............................................................................ 33 \n4.1.3 MiRNA-29c............................................................................. 34 \n4.2 Análise da proteína FKBP52........................................................... 36 \n5  DISCUSSÃO.......................................................................................... 39 \n5.1  Conduta cirúrgica na endometriose ................................................ 40 \n5.2  Diagnóstico ultrassonográfico da endometriose ............................. 40 \n5.3  MiRNAs e fase do ciclo menstrual .................................................. 41 \n5.4  MiRNA-21 ....................................................................................... 43 \n5.5  MiRNA-451 ..................................................................................... 44 \n5.6  MiRNA-29c...................................................................................... 45 \n5.7  FKBP52........................................................................................... 46 \n6  CONCLUSÕES ......................................................................................49 \n7  ANEXOS................................................................................................. 51 \nAnexo A -  Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade \nde Medicina da Universidade de São Paulo.......................... 52 \nAnexo B -  Termo de consentimento livre e esclarecido do grupo de \nestudo ................................................................................... 54 \nAnexo C -  Termo de consentimento livre e esclarecido do grupo \ncontrole................................................................................. 59 \nAnexo D -  Ilustração auxiliar ao laudo da ultrassonografia \ntransvaginal com preparo intestinal....................................... 64 \nAnexo E -  Inventário pélvico cirúrgico (relacionado ao caso do \nAnexo C)............................................................................... 65 \nAnexo F -  Aspecto pós-cirúrgico (relacionado ao caso do Anexo C)..... 66 \n8  REFERÊNCIAS ......................................................................................67 \n \n\n\t\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nListas \n \n\n\t\nSIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES \n \ncDNA DNA complementar \nC$ Dólar canadense \nDNA Ácido desoxirribonucleico \n€ Euro \nFIV Fertilização in vitro \nIMC Índice de Massa Corporal \nKg/m2 kilogramas/metro 2 \nmiRNA microRNA \nmRNA RNA mensageiro \nng nanograma \npre-miRNA microRNA-precursor \npri-miRNA microRNA-primário \nPCR Reação em cadeia da polimerase \nRT-qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo \nreal \nR$ Reais \nRISC Complexo de inat ivação induzido por RNA \nRNA Ácido ribonucleico \nsiRNA RNA interferente pequeno \nsnRNA RNA nuclear pequeno \nμL Microlitro \n \n \n\n\t\nFIGURAS, QUADROS E GRÁFICOS \n \nFigura 1 -  Biogênese dos miRNAs............................................................ 8 \nFigura 2 -  MiRNAs envolvidos na patogênese da endometriose ............ 15 \nFigura 3 -  Sítio de ligação miRNA-29c e FKBP52................................... 47 \n \nQuadro 1 -  Estudos de miRNA no câncer de endométrio......................... 10 \nQuadro 2 -  Estudos de miRNA no câncer de colo do útero ...................... 11 \nQuadro 3 -  Estudos de miRNA no câncer de ovário ................................. 12 \n \nGráfico 1 -  Expressão do miRNA-21 - São Paulo, SP- 2012 a 2014........ 31 \nGráfico 2 -  Expressão do miRNA-451 - São Paulo, SP- 2012 a 2014...... 33 \nGráfico 3 -  Expressão do miRNA-29c - São Paulo, SP- 2012 a 2014 ...... 35 \nGráfico 4 -  Expressão da proteína FKBP52 - São Paulo, SP- 2012 a \n2014........................................................................................ 37 \n \n\n\t\nLISTA DE TABELAS \n \nTabela 1 -  Características dos grupos de estudo e controle - São \nPaulo, SP- 2012 a 2014 ......................................................... 28 \nTabela 2 -  Estadiamento cirúrgico da endometriose segundo a \nAmerican Fertility Society - São Paulo, SP- 2012 a 2014....... 29 \nTabela 3 -  Caracterização das amostras teciduais analisadas \nsegundo a fase do ciclo menstrual - São Paulo, SP- 2012 \na 2014.....................................................................................30 \nTabela 4 -  Relação da expressão de miRNA-21 nas amostras e \ncomparação com o grupo controle - São Paulo, SP- 2012 \na 2014 .................................................................................... 32 \nTabela 5 -  Comparação da expressão do miRNA-21 entre as \namostras do grupo de estudo - São Paulo, SP- 2012 a \n2014 .......................................................................................32 \nTabela 6 -  Relação da expressão de miRNA-451 nas amostras e \ncomparação com o grupo controle - São Paulo, SP- 2012 \na 2014 .................................................................................... 33 \nTabela 7 -  Comparação da expressão do miRNA-451 entre as \namostras do grupo de estudo - São Paulo, SP- 2012 a \n2014 .......................................................................................34 \nTabela 8 -  Relação da expressão de miRNA-29c nas amostras e \ncomparação com o grupo controle - São Paulo, SP- 2012 \na 2014 .................................................................................... 35 \n\n\t\nTabela 9 -  Comparação da expressão do miRNA-29c entre as \namostras do grupo de estudo - São Paulo, SP- 2012 a \n2014 .......................................................................................36 \nTabela 10 -  Relação da expressão da FKBP52 nas amostras e \ncomparação com o grupo controle - São Paulo, SP- 2012 \na 2014 .................................................................................... 37 \nTabela 11 -  Comparação da ex pressão da FKBP52 entre as \namostras do grupo de estudo - São Paulo, SP- 2012 a \n2014........................................................................................ 38 \n\n\t\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nResumo \n \n\n\t\nMiyadahira EH. Efeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose \nprofunda na expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c e da proteína \nFKBP52 [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de \nSão Paulo; 2016. \nINTRODUÇÃO: O tratamento cirúrgico da endometriose profunda tem se \nmostrado benéfico para os resultados de Reprodução Assistida. O motivo \nque leva aos melhores resultados ainda é desconhecido, mas remete à \netiologia multifatorial dessa doença. Observa-se, então, a oportunidade de \ninvestigar mecanismos moleculares que possam justificar este fato. Nesse \ncontexto, os microRNAs podem desempenhar papel fundamental na medida \nem que alteram a expressão de diferentes genes por meio da inibição pós-\ntranscricional. OBJETIVO: Analisar o efeito da remoção cirúrgica das lesões \nde endometriose profunda na expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c, \nalém da expressão da proteína FKBP52. MÉTODOS: Trata-se de estudo \nclínico, prospectivo, longitudinal e comparativo no qual foram incluídas 26 \npacientes que foram divididas em dois grupos, segundo o resultado da \nultrassonografia transvaginal com preparo intestinal. As pacientes que não \napresentaram alterações sugestivas de endometriose compuseram o grupo \ncontrole (n = 11) e foram submetidas à coleta de amostra de endométrio. As \npacientes do grupo de estudo (n = 15) f o r a m  s u b m e t i d a s  à  a m o s t r a g e m  \nendometrial antes e após o tratamento cirúrgico da endometriose, além de \nter sido realizada a coleta de amostra da lesão profunda durante o ato \noperatório. Foi realizada a extração total de RNA dessas amostras e, \nposteriormente, PCR em tempo r eal para análise de expressão dos \nmicroRNAs -21, -451 e -29c, além da proteína FKBP52. RESULTADOS: A \ncomparação da expressão relativa dos m i c r o R N A s  - 2 1  e  - 4 5 1  e n t r e  a s  \namostras, de forma geral, não most rou diferença estatisticamente \nsignificante. A expressão relativa do microRNA-29c foi maior no endométrio \nde pacientes com endometriose em relação ao grupo controle e ainda maior \nnas lesões de endometriose profunda. Após a cirurgia, a expressão do \nmicroRNA-29c no endométrio, foi equivalente à do grupo controle. A \nexpressão da FKBP52 foi menor no endométrio das mulheres com \nendometriose e nas lesões da doença em c o m p a r a ç ã o  a o  g r u p o  c o n t r o l e .  \nApós o tratamento cirúrgico houve aumento da expressão de FKBP52 nas \namostras de endométrio nas pacientes com endometriose que passou a ser \nsemelhante à do grupo controle. CONCLUSÕES: Os resultados sugerem \nque a presença das lesões de endometriose pode aumentar a expressão do \nmicroRNA-29c no endométrio e, por conseguinte, diminuir a expressão de \num dos seus RNA mensageiros alvos que codifica a proteína FKBP52. Após \no tratamento cirúrgico, com remoç ão das lesões de endometriose, a \nexpressão do microRNA-29c e da FKBP52 se assemelhou à do grupo \ncontrole. \nDescritores: endometriose; microRNA; proteínas de ligação a tacrolimo; \ninfertilidade. \n \n\n\t\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \nAbstract \n \n\n\t\nMiyadahira EH. The effect of surgical removal of deeply infiltrating \nendometriosis (DIE) on the microRNAs -21, -451, -29c and the protein \nFKBP52. [ D i s s e r t a t i o n ] .  S ã o  P a u l o :  “ Faculdade de Medicina, Universidade \nde São Paulo”; 2016. \nINTRODUCTION: Surgical treatment of deeply infiltrating endometriosis \nappears to yield benefits to the affected women and also to the assisted \nreproduction treatments. Although the mechanisms involved on the \nimprovement of the outcomes are still unknown; yet, they are similar to the \nmultifactorial origin of the endometriosis. Considering that the microRNAs \ncan modify different genes expression,  i t  w a s  i n v e s t i g a t e d  t h e i r  r o l e  \nconcerning the molecular pathways leading to endometriosis and the clinical \nbetterment of the assisted reproducti ve procedures after the surgical \ntreatment. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the effect of \nsurgical treatment in women with endometriosis focusing the microRNAs -21, \n-451 and -29c expression, as well as the protein FKBP52 expression. \nMETHODS: This is a clinical, prospective, longitudinal and comparative study \nwhich included 26 patients that were divided into two groups according to the \nfindings of the transvaginal ultras ound with bowel preparation. Eleven \nwomen without evidence of DIE composed the control group and were \nsubmitted to eutopic endometrium sampling. Fifiteen women presented with \nevidence for DIE detected by pelvic ultrasound were also submitted to \neutopic endometrium sampling before and after surgical treatment. Surgical \nprocedures revealed the presence of relevant DIE. Total RNA extraction of \nall samples was performed and followed by real time PCR to evaluate \nmicroRNAs -21, -451, -29c and protein FKBP52 expression. RESULTS: \nMicroRNAs -21 and -451 expression anal ysis did not show statistically \nsignificant difference among samples. Nonetheless, expression of \nmicroRNA-29c was elevated in eutopic endometrium of women suffering \nfrom DIE in comparison to the control group. After surgery, the microRNA-\n29c expression in eutopic endometrium became equivalent to the control \ngroup. The expression for FKBP52 was lower in women having DIE than \nthose without endometriosis. The su rgical treatment increased the \nexpression of the protein FKBP52 in eutopic endometrial samples, turning it \nsimilar to the control group. CONCLUS IONS: The results of this study \nsuggest that the presence of DIE mi ght increase the expression of \nmicroRNA-29c in eutopic endometrium and consequently decrease the \nexpression of one of its target messenger RNA that codifies the protein \nFKBP52. After surgical removal of endometriosis lesions, the microRNA-29c \nand the FKBP52 expression returned to a level similar to the control group. \nDescriptors: endometriosis; microRNA; tacrolimus binding proteins; infertility. \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n1 Introdução \n \n \n\nIntrodução  \n  \n\t\n2\n1 INTRODUÇÃO \n\t\n\t\nA mudança no papel social da mulher, sobretudo após a introdução \ndos anticoncepcionais hormonais e outras tecnologias para o controle da \nnatalidade, trouxe desafios ao consultório do ginecologista. O controle e a \nautonomia sobre o planejam ento familiar possibilitaram às mulheres \nassumirem papel de igualdade em relação ao seu parceiro. Dessa forma, \nelas passaram a ocupar novos espaços s o c i a i s ,  p o l í t i c o s  e  e c o n ô m i c o s .  \nComo resultado dessas transformações, a programação gestacional passou \na ocorrer após a consolidação das prioridades socioeconômicas femininas, \nem idades menos favoráveis. Isso acrescentou a essas mulheres uma série \nde inconvenientes, como maiores taxas de morbimortalidade materno-fetal1,2 \ne elevação da incidência de câncer de mama 3. Consequentemente, a \nendometriose vem ganhando posiç ão de destaque no cotidiano do \nginecologista. \n \n1.1 Endometriose \nA endometriose é definida como a presença ectópica de células \nendometriais glandulares e estromais em diferentes compartimentos, \ngeralmente na cavidade pélvica4. Tal definição demanda, portanto, uma \navaliação anatomopatológica para confirmação diagnóstica. Considerada \npadrão ouro, a laparoscopia com visualização direta da lesão permite, via de \nregra, a obtenção dessa amostra tecidual. Na medida que o diagnóstico é \nconcluído de forma invasiva, muitas vezes, a suspeição diagnóstica é \nbaseada na história clínica (dismenorreia, dor pélvica acíclica e infertilidade) \ne nos exames de imagem (ultrassono grafia transvaginal com preparo \nintestinal ou ressonância nuclear magnética). Assim, o cálculo de incidência \ne de prevalência é prejudicado pela não uniformização da obtenção de \ndados epidemiológicos. No e n t a n t o ,  e s t i m a - s e  q u e  a  p r e v a l ê n c i a  d e s s a  \n\nIntrodução  \n  \n\t\n3\ndoença seja de, aproximadamente, 10% na população em geral de mulheres \nem idade reprodutiva, atingindo 50 - 60% nas mulheres inférteis5,6.  \nO impacto da doença extrapola o âmbito d o s  c o n s u l t ó r i o s ,  p o i s  t r a z  \nprejuízos para a qualidade de vida da paciente, refletindo também na família \ne na sociedade. Um estudo conduzido em 12 centros médicos de 10 países \ncom objetivo de analisar custos e impacto na qualidade de vida mostra uma \nmédia de 6,4 anos de sintomas até o diagnóstico de endometriose e um \nprejuízo de 19% na qualidade de vida, e m  c o m p a r a ç ã o  c o m  p e s s o a s  e m  \nsituação ideal de saúde. Além disso, mostra custo anual médio de 33.526 \nreais (R$) ou 9.579 Euros (€) por pessoa, sendo R$ 10.895 (€ 3.113) de \ngastos diretos (cirurgia, hospitalização, exames, honorários médicos, etc.) e \nR$ 22.043 (€ 6.298) de gastos indiretos (perda de produtividade). Compara, \nainda, os gastos diretos com outras doenças crônicas que apresentam \ncustos semelhantes em países europeus, como diabete melito (R$ 10.003), \ndoença de Crohn (R$ 10.885 - 26.064) e artrite reumatoide (R$ 14.994)7. \nNnoaham et al. calcularam que cada mulher com endometriose perde 10,8 \nhoras de trabalho por semana8. \nNo Canadá, estima-se custo de R$ 12.740 ou 5.200 dólares \ncanadenses (C$) por ano, por paciente, com diagnóstico confirmado de \nendometriose, sendo 78% devido à perda de produtividade e à perda de \ntempo de lazer. O custo anual para a sociedade canadense seria de R$ 4,41 \nbilhões (C$ 1,8 bilhões)9. No Brasil, infelizmente, faltam estudos que \nestimam os custos com a endometriose10. \nA etiologia e a fisiopatologia da endometriose ainda não estão \ntotalmente elucidadas. Acredita-se que a endometriose seja uma doença \nmultifatorial e que algumas teorias formuladas podem explicar a presença e \no desenvolvimento ectópico do tecido endometrial. \nA teoria da menstruação retrógrada tem melhores evidências e, por \nisso, é a mais aceita. Atribui-se a Sampson, em 1927, a primeira menção \ndessa hipótese, em estudo que preconizava a disseminação venosa e \nlinfática do tecido endometrial11. As evidências foram sustentando tal \n\nIntrodução  \n  \n\t\n4\nhipótese12 e até modelos animais de endometriose foram criados com base \nnessa teoria13. \nA teoria imunológica e a das células tronco podem ser \ndesdobramentos da primeira. Acr edita-se que as pacientes com \nendometriose tenham alterações na resposta imune o que favoreceria a \nperpetuação das células endometriais que atingiram a cavidade pélvica pela \nmenstruação retrógrada14. Pela mesma via, células progenitoras do epitélio \nendometrial e células tronco mesenquimais originariam implantes \nectópicos15. \nAlém disso, a teoria da metaplasia celômica, originalmente proposta \npor Ferguson, em 196916, ainda pode ser aventada principalmente para \nexplicar a gênese dos endometriomas15 e ,  d e  i g u a l  m o d o ,  a  t e o r i a  d o s  \nremanescentes dos ductos Müllerianos, para explicar as lesões no fundo de \nsaco vaginal e ligamentos útero-sacros15. \nÉ clara a relação entre endometriose e infertilidade. Sabe-se que a \ntaxa de fecundidade dos casais cujas mulheres têm endometriose não \ntratada é de, aproximadamente, 2 a 10%, enquanto daqueles, sem \nproblemas de fertilidade essa taxa é de 15 a 20%17. Após seguimento de 3 \nanos de mulheres submetidas à videolaparoscopia por infertilidade, aquelas \ncom endometriose tiveram menor chance de gravidez em relação às com \ninfertilidade sem causa aparente, 36% e 55%, respectivamente 18. \nAlguns mecanismos explicam a infertilidade relacionada à \nendometriose. A exacerbação de células inflamatórias e de citocinas pode \nafetar a função tubária e a sincronia das contrações miometriais, \nprejudicando o transporte dos gamet as e do embrião. Alterações na \novulação e na produção oocitária, igualmente, são creditadas à inflamação \nassociada aos endometriomas. Ademai s, a receptividade endometrial \ntambém pode estar comprometida, não apenas pelo ambiente inflamatório, \nmas também pela resistência à progesterona14,19. \nDe fato, apesar de não consensual  n a  l i t e r a t u r a ,  a l g u n s  a u t o r e s  \ndemonstram que o tratamento cirúrgico pode beneficiar o tratamento de \n\nIntrodução  \n  \n\t\n5\nreprodução assistida. Em estudo clínico e prospectivo, em 2008, Bianchi et \nal. demostraram o benefício da cirurgia laparoscópica para as pacientes com \nendometriose profunda que se submeteram ao tratamento de fertilização in \nvitro após a laparoscopia. Nesse estudo, foram comparados dois grupos de \npacientes: um grupo que optou pela fertilização in vitro sem a cirurgia prévia \ne outro que foi submetido à ressecção laparoscópica dos focos de \nendometriose profunda e, posteriormente, à fertilização in vitro. A chance de \ngravidez no grupo operado foi 2,45 vezes maior20. \nDessa forma, uma vez que a endometriose se associa a alterações \nmoleculares que dificultam a gestação, questiona-se a possibilidade de \nreverter tais distúrbios, após o tratamento cirúrgico da endometriose e, por \nconseguinte, obter melhores resultados nos tratamentos de reprodução \nassistida14. Com a intenção de investigar essa hipótese, foram selecionados \na proteína FKBP52 e os microRNAs (miRNAs) para analisar as modificações \nendometriais pós tratamento cirúrgico. \n \n1.2 Endometriose e proteína FKBP52 \nDescoberta em 1985, a proteína FKBP52 pertence à subclasse das \nimunofilinas devido a sua característica de poder se ligar ao \nimunossupressor FK506 (tacrolimus). É composta por quatro regiões que lhe \nconferem diversas propriedades, dentre e l a s  d e s t a c a - s e  a  m o d u l a ç ã o  d o s  \nreceptores de esteroides por meio de sua interação com a heat shock \nprotein 90 kDa (Hsp90). Trata-se de um regulador positivo para o receptor \nde glicocorticoide, de androgênio e de progesterona, mas não de estrogênio \ne de mineralocorticoide. Essa ação é competitiva e antagonizada pela \nproteína FKBP51 que é um regulador negativo para os receptores de \nesteroides21,22. \nTranguch et al. estudaram ratos knock-out para o gene que codifica a \nFKBP52 e observaram um fenótipo com função ovulatória normal, mas \nesses animais eram inférteis devido à alteração na receptividade uterina \n\nIntrodução  \n  \n\t\n6\nconferida pela redução da atividade do receptor de progesterona23. Em \nestudo posterior, os mesmos autores mostraram evidências sugerindo que a \ndeficiência da FKBP52 está envolvida na gênese da endometriose em ratos \ne em humanos, por meio da alteração de móleculas que estimulariam o \ncrescimento das células endometrióticas, aumentariam a inflamação e \npromoveriam a angiogênese24. \nAinda para corroborar a preservação dessa alteração entre espécies, \nJackson et al. d e s c r e v e r a m  a  d e f i c i ê n c i a  da FKBP52 no endométrio do \nmodelo de endometriose induzida em  b a b u í n o s  c o m p a r a n d o  c o m  a s  \namostras de animais do grupo controle25. De forma similar, Yang et al. \nrelataram menor expressão dessa proteína no endométrio de mulheres com \nendometriose em comparação ao en dométrio de pacientes sem \nendometriose26. \nA alteração na receptividade uterina pela modificação da expressão \nda FKBP52 é um mecanismo que pode prejudicar a implantação embrionária \nnas pacientes com endometriose submetidas à fertilização in vitro (FIV) e \ntransferência embrionária. \nDessa forma, pelos motivos expostos, incluiu-se a análise dessa \nproteína no presente estudo. \n \n1.3 MicroRNA \nEm 1993, um grupo de pesquisado res publicaram a primeira \ndescrição dos miRNAs27. Estudando o gene lin-4 que age no controle do \ndesenvolvimento larval do Caenorhabditis elegans, descobriram que esse \ngene não traduzia uma proteína, mas dois pequenos RNAs de 22 e 61 \nnucleotídeos. Posteriormente, notou-se que o maior era precursor do menor \ne esses pequenos RNAs tinham uma complementaridade antisense no gene \nlin-14, gene esse que já se sabia ser modulado pelo lin-4. Logo após, \nobservou-se que esse controle da expressão do lin-14 pelo lin-4 ocorria \n\nIntrodução  \n  \n\t\n7\nreduzindo o nível de proteína traduzido pelo lin-14, sem alterar seus níveis \nde RNA mensageiro (mRNA)28. \nDecorridos sete anos, um s egundo gene, let-7, também do \nnematódeo C. elegans f o i  d e s c r i t o  c o m o  t r a n s c ritor de um RNA com 21 \nnucleotídeos29. E, em menos de um ano, outros três grupos descreveram \nmais de 100 genes que transcrevem miRNAs30–32. \nAté o presente momento, são descritos mais de 1880 sequências de \nmiRNAs nos Homo sapiens33. Estima-se que, aproximadamente, 30% das \nproteínas codificadas pelo genoma humano (mais de 5.300 genes) podem \nser alvos dos miRNAs34. Lim et al., utilizando a ferramenta MirScan, \ncalcularam que aproximadamente 1 %  d o s  g e n e s  p r e d i t o s  n o  g e n o m a  \nhumano (entre 200 a 255 genes) são possíveis codificadores de miRNAs35. \nDiferentemente dos RNAs interferentes pequenos (siRNA), a maioria \ndos genes que codificam os miRNAs estão localizados em regiões intrônicas \ndo genoma humano. Esses genes são tr anscritos pela polimerase II, \noriginando os miRNA primários (pri-miRNA). Os pri-miRNA têm o formato de \ngrampo de cabelo e são processados pela enzima Drosha, liberando os \nmiRNA precursores (pre-miRNA) que têm aproximadamente 70 nucleotídeos. \nOs pre-miRNA são exportados para o citoplasma pela Exportina-5 e \nprocessados pela enzima Dicer para formar duplas de miRNA-miRNA* de 21 \na 24 nucleotídeos. As helicases quebram essas duplas em fitas únicas de \nmiRNA e a que apresentar o pareamento de bases mais fraco na região 5’, \njunta-se às proteínas Argonautas para formar o complexo de inativação \ninduzido por RNA (RISC)36,37. \nO complexo RISC, por sua vez, guiado pela fita única de miRNA liga-\nse ao mRNA alvo. Após esse processo, o mRNA pode ser degradado ou \npode ocorrer a inibição da tradução (mais comum). O grau de homologia \nentre miRNA e o mRNA alvo parece determinar o mecanismo que será \nsucedido. Em geral, a complementaridade parcial leva à inibição da tradução, \nao passo que, a alta complementaridade leva à degradação do mRNA38 \n(Figura 1). \n\nIntrodução  \n  \n\t\n8\n \n \nFonte: Teague et al., 201037. \nFigura 1 - Biogênese dos miRNAs \n \n \n1.3.1 MiRNA e doenças ginecológicas \nAlgumas características dos miRNAs facilitam o seu estudo, como o \nfato de estarem presentes em diversos tecidos e fluidos corporais e a \nnecessidade de pouca amostra de material para sua análise. Além disso, a \npossibilidade de modular diversas expressões gênicas confere aos miRNAs \npotencial objeto de investigações vinculadas não somente a etiopatogenia, \n\nIntrodução  \n  \n\t\n9\nmas também como biomarcadores ou ainda alvos terapêuticos ou de \nseguimento terapêutico de algumas doenças. \nOs miRNAs foram estudados em algumas doenças benignas e \nmalignas ginecológicas, por exem plo: leiomioma, endometriose, \nabortamento de repetição, câncer do endométrio, do colo uterino, do ovário \ne das mamas. Grande parte dessas pesquisas descreve perfis de miRNAs \nque apresentam maior ou menor expressão em alguma situação patológica \ncomparada a um grupo controle. Em estudo de revisão, Gilabert-Estelles et \nal. agruparam em quadros os princi pais estudos de algumas doenças \nginecológicas e os miRNAs envolvidos39.  \n \n\nIntrodução  \n  \n\t\n10\nQuadro 1 - Estudos de miRNA no câncer de endométrio \n \nmiRNA com  \nregulação para cima \nmiRNA com \nregulação para baixo Grupos Associação Métodos Referência \nLet-7c, miR-103, -106a, -\n107, -181a, -185, -210, -\n423 \nlet 7i, miR-30c, -152,-\n193,-221 \nCEE vs HA vs \nendométrio \nnormal \n microssérie \nRT-qPCR Boren 2008 \nmiR-10a, -17-5p, -23a*, -\n25, -28, -34a, -95, -103, -\n106a,-107, -130b, -141, -\n151, -155, -182, -183, \n-184, -191, -194, -200a/c, \n-203, -205, -210, -215, -\n223, -301, -325, -326, -\n330 \nmiR-10a, \n \nCEE vs \nendométrio \nnormal \n microssérie \nRT-qPCR Chung 2009 \nmiR-10a, -31, -96, -141, \n142-5p, -155, -182, -\n200a/b/c, -203, -205, -\n210, -363, -429, -432, -\n449 \nmiR-99b, -133b, -193a, \n-193b, -204, -368 \nCEE vs \nendométrio \nadjacente \n m i c r o s s é r i e  W u  W  2 0 0 9  \nmiR-9, -19b; -146, -181c, \n-183, -200c, -205, -223, -\n423, -425 \nlet-7a, miR-32, -33b, -\n369, -409, -424, -431, -\n451, -496, -503,-516 \nCEE \n(estádio I) vs \nendométrio \nnormal \n↑ miR-199c \nvs ↑ \nsobrevida \nmicrossérie \nRT-qPCR Cohn 2010 \nmiR-34a, -182, -183, -\n200a, -205, -572, -622, -\n650 \nmiR-411, 487b \nCEE vs \nendométrio \nnormal \n microssérie \nRT-qPCR Ratner 2010 \nmiR-7, -10a/a*, -17, \n18a/b, -23a*, -30c2*, -31, \n-33b*, -95, -96, -106a, -\n125a-3p, -134, -135a*/b, -\n150*, -182, -183, -188-5p, \n-193a-5p, -198, \n-200a/a*/b/b*/c, -202, -\n203, -205, -210, -223, -\n224, -330-3p, -371-5p, -\n425, -429, -483-5p, \n-494, -501-5p, -505*, -\n513a-5p, -513b, -518c*, -\n557, -564, -575, -601, -\n622, -623, -629*, -630, -\n652, -663, -760, -765, -\n768-5p, -801, -877, -\n892b, -923, -939, -1224-\n5p, -1225-5p,-1226* \nmiR-1, -10b*, -23b, -24-\n1*, -27b, -29b, -33a, -\n34b/b*, -34c-5p, -101, \n-127-3p, -132*, -\n133a/b, -136/136*, -\n139-5p,-140-3p/5p, -\n142-3p/5p, \n-143/143*, -145/145*, -\n152, -195, -196b, -\n199a-5p, -199b-3p/5p, -\n214/214*, -299-3p/5p, -\n337-5p, \n-376a/c, -377, -379, -\n381, -410, -411, -424, -\n450a, -455-3p/5p, -497, \n-503, -542-3p, -542-5p, \n-654-3p, -873 \nCES vs \nendométrio \nnormal \n↓ miR-152 \n& miR-101 \nvs \nprognóstico \nreservado \nmicrossérie \nRT-qPCR Hiroki 2010 \nmiR-15b, -135a/b, -141, -\n142-5p/3p, -200a/b/c, -\n203, -205, -210, -429, -\n519a, -888 \nmiR-1, -125b-2, -129-\n3p, -133a/b, -137, -504 \nCEE vs \nendométrio \nnormal \nCES vs \nendométrio \nnormal \n TLDA \nRT-qPCR Devor 2011 \nmiR-9/-9*, -18a, -96, -\n141, -146a, -200a/b/b*/c, \n-203, -205, -210, -421, -\n429, -516a-5p, -605, -\n614, -936 \nmiR-10b*, 23a*, -100, -\n127-3p, -152, -199b-3p, \n-199b-5p, -370, -\n376a/c, -381, -410,-\n424, -424*, -431, -432, \n-503, -542-3p/5p, -596, \n-610, -630, -632, -760 \nCEE vs HA \nvs \nendométrio \nnormal \n microssérie \nRT-qPCR \nSnowdon \n2011 \nCEE: carcinoma endometrial endometrióide; CES: carcinoma endometrial seroso; HA: hiperplasia atípica; TLDA: \nTaqman Low Density Array; RT-qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; miR: miRNA \nFonte: Gilabert-Estelles et al., 201239\n \n\nIntrodução  \n  \n\t\n11\nQuadro 2 - Estudos de miRNA no câncer de colo do útero \n \nmiRNA com \nregulação para \ncima \nmiRNA com \nregulação para \nbaixo \nGrupos Associação Métodos Referência \nmiR-21 miR-143 \nmiR-126,-143, \n6 amostras de \ncâncer cervical vs 5 \namostras normais \n29 amostras \npareadas de cancer \ncervical e amostras \nnormais \n \nSequência \ne análise \nNorthern \nLui 2007 \nmiR-15b, 16, -146a, \n-155, -223 \nmiR-126,-143, -145, \n-218, -424 \nTecido de câncer \ncervical vs amostra \nnormal \n \nmicrossérie \nanálise \nNorthernblot \nWang 2008 \nmiR-193b, -200c miR-143, -145, -218, \n-497 \nLinhagens celulares \nde câncer cervical vs \namostra normal \n \nmicrossérie \nanálise \nNorthernblot \nRT-qPCR \nMartinez \n2008 \nmiR-9, -127, 133a/b, \n-199a/a*, \n-199b,-214 \nmiR-149, -203 \n10 amostras de \ncâncer cervical e 10 \namostras cervicais \nnormais \nmiR-127 \nmarcador \npara \nmetástase \nlinfática e \nmiR-199a um \npotencial \nalvo \nterapêutico \nRT-qPCR Lee 2008 \nmiR-10a, -148a, -\n196a \nmiR-29a, -143, -145, \n-199a, \n-203 \n19 amostras \ncervicais normais vs \n4 carcinomas de \ncélulas escamosas, \n5 lesões \nintraepiteliais de alto \ngrau e 9 de baixo \ngrau \n m i c r o s s é r i e  Pereira \n2010 \n  102 amostras de \ncâncer cervical \nmiR-200a e \nmiR-9 com \nsobrevida ao \ncâncer \nRT-qPCR Hu 2010 \nmiR-10a*, -30a*, -\n610, -886-5p \nmiR-302d, -346, -\n518b \n12 pares de tumor \ncervical vs tecido \nsão adjacente \nmiR-886-5p \ninibe \napoptose por \nregular para \nbaixo a \nexpressão de \nBax \nmicrossérie Li 2011 \nRT-qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; miR: miRNA \nFonte: Gilabert-Estelles et al., 201239\n \n \n\nIntrodução  \n  \n\t\n12\nQuadro 3 - Estudos de miRNA no câncer de ovário \n \nmiRNA com \nregulação para \ncima \nmiRNA com \nregulação para \nbaixo \nGrupos Associação Métodos Referência \nmiR-200 family \n(mIR-200a/b/c, -\n141, -429), miR-21, \n-203,-205 \nmiR-199a, -140, -\n145, -125b1 \nCâncer vs tecido \novariano normal  microssérie \nRT-qPCR Iorio 2007 \n let-7 family, miR-\n125a/b \nCâncer vs tecido \novariano normal   Spizzo \n2009 \nmIR-200a/b/c, -\n141, -16, -21, -93 \nlet-7b, miR-99a, -\n100, -125b,- 145, -\n214 \nCâncer vs tecido \novariano normal  microssérie \nRT-qPCR Nam 2008 \nlet-7f, miR-23a, -\n182, -200, -210, -\n222 \nmiR-145, -214 Metástase vs \ntumor primário  microssérie \nRT-qPCR \nVaksman \n2011 \n  Amostras de câncer \novariano avançado \nmiR-410, 645 \nnegativamente \nassociado \ncom sobrevida \nmicrossérie \nRT-qPCR Shih 2011 \n  Amostra de câncer \novariano \n27 miRNAs e \nresposta à \nquimioterapia \nmicrossérie \nRT-qPCR \nBoren \n2009 \n  Amostra de câncer \novariano \nmiR-214 \nregulado para \nbaixo em \ntumors \nresistentes à \nplatina \nmicrossérie \nRT-qPCR \nYang H \n2008 \n  Amostra de câncer \novariano \nfamília miR-\n200 e \nresultado \nclínico \n(controverso) \nmicrossérie \nRT-qPCR \nShih, Nam, \nHu, Eitan \nmiR-21, -141, -\n200a/b/c, -203, -\n214 \n \nExossomos \n(câncer vs doença \nbenigna) \n m i c r o s s é r i e  Taylor \n2008 \nmiR-21, -29a, -92, -\n93, -126 \nmiR-99b, -127, -\n155 Soro  TLDA \nRT-qPCR \nResnick \n2009 \nmiR-30c1* miR-181a*, -342-\n3p, - 450b-5p Sangue  microssérie Häusler \n2010 \nRT-qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; TLDA: Taqman Low Density Array; miR: \nmiRNA \nFonte: Gilabert-Estelles et al., 201239\n \n \n\nIntrodução  \n  \n\t\n13\nA análise dos quadros revela o perfil dos estudos que associam os \nmiRNAs com alguns cânceres ginecológicos. Observa-se que são pesquisas \ncom menos de 10 anos, em sua maioria, descrevendo perfis de miRNAs \ndiferentemente expressos na doença em estudo. Ressalta-se, ainda, que os \ngrupos de comparação não são homogêneos, fato que pode enviesar a \ncomparação entre eles. No entanto, d e m o n s t r a - s e  a  c o m p l e x i d a d e  d e  \ninterações e vias moleculares envol vidas, bem como o potencial de \nutilização para o diagnóstico, prognóstico, tratamento e seguimento das \ndoenças. \nA descrição do perfil de alteração de miRNAs em determinada \ndoença pode servir como biomarcador e, a s s i m ,  p r o p i c i a r  u m  d i a g n ó s t i c o  \nprecoce e/ou menos invasivo dessas enfermidades. Por exemplo, para o \ncâncer de ovário que é uma doença oligossintomática e cujo diagnóstico em \nmuitos casos é feito somente em estádios avançados, a detecção precoce \npode mudar o prognóstico do tratamento. Nesse sentido, Resnick et al., \ncomparando amostras do soro de pacientes com câncer de ovário com \ncontroles saudáveis, demonstraram cinco miRNAs com expressão para cima \n(-21, -92, -93, -126 e -29a) e três com expressão para baixo (-155, -127 e  \n-99b). Destacaram os miRNAs -21, -92 e -93 que já eram descritos como \noncomirs e podem ser candidatos a biomarcadores dessa doença40. Häusler \net al. submeteram o sangue total de pac ientes com câncer de ovário e \ncontroles saudáveis à análise de microsséries, tendo identificado 147 \nmiRNAs com expressão alterada. Após análise de bioinformática e cálculos \nestatísticos, avaliaram a eficácia de detecção da doença por meio do perfil \nde miRNAs e concluíram que não há sensibilidade e especifidade suficiente \npara ser aplicada na população. No entanto, destacaram que os cânceres \nproduzem perfis de miRNAs característicos no sangue e, sendo assim, \npodem ser utilizados para melhorar a detecção do câncer de ovário 41. \nA utilização dos miRNAs como alvos de terapia de doenças ainda é \nrecente e predominantemente em experimentos com animais42. No entanto, \ndestaca-se um estudo clínico de fase 2 que demonstrou a eficácia de uma \n\nIntrodução  \n  \n\t\n14\nmedicação que antagoniza o miRNA-122 para controle do vírus da hepatite \nC em portadores crônicos da doença43. \n \n1.4 Endometriose e miRNA \nA pluralidade funcional de cada miRNA nos diversos processos \ncelulares confronta-se à idéia da etiologia multifatorial da endometriose. \nDessa forma, questiona-se a atuação dos miRNAs na endometriose. Os \nresultados do estudo in silico de Wren et al., em 2007, sugerem que alguns \ngenes potencialmente envolvidos na fisiopatologia da endometriose eram \nregulados após a transcrição44.  \nO primeiro trabalho a relacionar os miRNAs com a endometriose foi \npublicado, em 2007, por Pan et al.45. Nesse estudo, foram comparadas \namostras endometriais de pacientes com e sem endometriose e, utilizando \nmicrosséries, observaram 48 miRNAs diferentemente expressos nessa \ndoença. Confirmaram ainda essa diferença de expressão pela PCR (reação \nem cadeia da polimerase) em tempo real de sete miRNAs selecionados, \nalém de demonstrarem que os esteroides ovarianos podem influenciar na \nexpressão de alguns miRNAs. \nA partir de então, outros estudos acrescentaram outros miRNAs que \npodem estar envolvidos na fisiopatologia da endometriose. Teague et al., \n201037, propuseram alguns miRNAs candidatos a contribuir para os diversos \nmecanismos que levam à endometriose (Figura 2). \n \n\nIntrodução  \n  \n\t\n15\n \nFonte: Teague et al., 201037. \nFigura 2 -  MiRNAs envolvidos na patogênese da endometriose \n \n \nEm estudo utilizando o model o de endometriose em babuínos, \nrealizaram-se microsséries em amostras endometriais de animais com \nendometriose e sem endometriose. Foram encontrados 8 miRNAs \ndiferentemente expressos dentre esses grupos, a saber: hsa-miR-451, hsa-\nmiR-181a, hsa-miR-200a, hsa-miR-19b, hsa-miR-424, hsa-miR-21, hsa-miR-\n29c e hsa-miR-14146. Os miRNAs -21, -29c e -451 apresentaram maior \ndiferença de expressão e foram selecionados para as análises do presente \nestudo. \nDiante das observações clínic as que sugerem benefícios do \ntratamento cirúrgico da endometriose, antecedendo a reprodução assistida e \nos conhecimentos moleculares envolvidos, poder-se-ia formular a hipótese \nde que, na endometriose, existam miRNAs que alteram a síntese de \nproteínas essenciais ao preparo endometrial para o sucesso da implantação \nembrionária.  \n\nIntrodução  \n  \n\t\n16\nPortanto, considerando-se que essa hipótese seja uma questão a ser \ntestada, o objetivo da presente pesquisa é investigar o papel da remoção do \ntecido ectópico de endometriose na expressão dos miRNAs -21, -451 e -29c \ne da proteína FKBP52. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n2 Objetivos \n \n \n\nObjetivos  \n  \n\t\n18\n2 OBJETIVOS \n \n \n2.1 Geral \n-  Analisar o efeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose na \nexpressão dos miRNAs -21, -451 e -29c e da proteína FKBP52 no \nendométrio de pacientes com endometriose. \n \n2.2 Específicos \na)  Avaliar a expressão do miRNA-21 nas amostras obtidas: endométrio pré-\noperatório, endométrio pós-operatório e lesão de endometriose e \ncompará-las entre si e com amos tra endometrial de mulheres sem \nendometriose; \nb)  Avaliar a expressão do miRNA-451 nas amostras obtidas: endométrio \npré-operatório, endométrio pós-operatório e lesão de endometriose e \ncompará-las entre si e com amostr a endometrial de mulheres sem \nendometriose; \nc)  Avaliar a expressão do miRNA-29c n a s  a m o s t r a s  o b t i d a s :  e n d o m é t r i o  \npré-operatório, endométrio pós-operatório e lesão de endometriose e \ncompará-las entre si e com amos tra endometrial de mulheres sem \nendometriose; \nd)  Avaliar a expressão da prot eína FKBP52 nas amostras obtidas: \nendométrio pré-operatório, endométrio pós-operatório e lesão de \nendometriose e compará-las entre si e  c o m  a m o s t r a  e n d o m e t r i a l  d e  \nmulheres sem endometriose. \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n3 Métodos \n \n \n\nMétodos  \n  \n\t\n20\n3 MÉTODOS \n \n \nEsta pesquisa clínica, prospectiva, longitudinal e comparativa foi \nrealizada no período de fevereiro de 2012 a fevereiro de 2014, com \npacientes portadoras de endometriose e submetidas à cirurgia laparoscópica, \nfruto da parceria entre a Disciplina de Ginecologia do Departamento de \nObstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São \nPaulo, a Huntington Medicina Reprodutiva e o Departamento de Obstetrícia, \nGinecologia e Medicina Reprodutiva da Michigan State University. Trata-se \nde um estudo de pesquisa molecula r, que analisou fragmentos de \nendométrio ectópico e tópico. \nA análise laboratorial de expressão dos miRNA e da expressão da \nproteína FKBP52 foi realizada na Michigan State University n o  Van Andel \nInstitute, laboratório coordenado pelo Prof. Asgerally T. Fazleabas. \n \n3.1 Ética em Pesquisa \nO presente estudo foi desenvolvido segundo o projeto de pesquisa \nque foi elaborado obedecendo todas as orientações contidas na Resolução \n466 do Conselho Nacional de Saúde47 e recebeu aprovação dos seguintes \ncomitês: \n- Comitê de Ética e Conselho de Departamento do Departamento de \nObstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade \nde São Paulo \n- Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da \nUniversidade de São Paulo (Anexo A) \nTodos os sujeitos envolvidos receberam e consentiram em participar \nno estudo por meio do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexos \nB e C). \n\nMétodos  \n  \n\t\n21\n3.2 Casuística \nA presente casuística é constituída por pacientes que procuraram a \nHuntington Medicina Reprodutiva para aconselhamento e tratamento de \ninfertilidade. Nesse serviço, o atendimento incluiu propedêutica clínica e \nexames subsidiários completos e adequados às queixas para a condução do \ntratamento dessas pacientes. \nO enfoque do estudo foi direcionado às mulheres com suspeita clínica \ne diagnóstico ultrassonográfico de endometriose. Nos casos selecionados, \nessas pacientes foram submetidas à cirurgia laparoscópica para a exérese \ndas lesões endometrióticas com o intuito de propiciar otimização das taxas \nde gestação da FIV20. Dessa maneira, as pacientes com endometriose e \ncom a proposta cirúrgica de trat amento, antecedendo a FIV, foram \nconvidadas a participar do estudo. Para o grupo controle foram convidadas \nas pacientes que não apresentavam endometriose. \n \n3.2.1 Critérios de inclusão \nForam considerados os seguintes critérios de inclusão: \n1)  Idade entre 18 e 44 anos; \n2)  Índice de massa corporal (IMC) menor que 30 Kg/m2 ( c a l c u l a d o  d e  \nacordo com a seguinte fórmula: peso (kg)/altura x altura (m2)); \n3)  Presença de ambos ovários; \n4)  Não apresentar doença sistêmica clinicamente significativa, como \ndiabete melito, hipertensão arterial, cardiopatia, doenças autoimunes, \nentre outras; \n5)  Ter aceito e assinado voluntariamente o termo de consentimento livre e \nesclarecido. \n\nMétodos  \n  \n\t\n22\n6)  Para o grupo de estudo: apres entar diagnóstico de endometriose \nprofunda realizado pela ultrassonografia transvaginal com preparo \nintestinal; \n7)  Para o grupo controle: apresentar u l t r a s s o n o g r a f i a  t r a n s v a g i n a l  c o m  \npreparo intestinal negativo para endometriose. \n \n3.2.2 Critérios de não inclusão \nOs critérios de não inclusão foram: \n1)  Estar reconhecidamente infectada pelo vírus da imunodeficiência \nhumana (HIV), hepatite C ou hepatite B; \n2)  Apresentar sangramento ginecológico anormal, não diagnosticado na \nseleção; \n3)  Ciência de abuso de qualquer substância ou uso de hormônios, além dos \nsugeridos pelo médico, no período do tratamento; \n4)  Revogação do termo de consentimento livre e esclarecido. \n\t\n3.2.3 Constituição dos grupos de estudo \nGrupo de estudo \nO grupo de estudo foi constituído por 15 pacientes que apresentaram \nalterações à ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal, sugestivas \nde endometriose profunda. Essas mulheres f o r a m  s u b m e t i d a s  à  c i r u r g i a  \nlaparoscópica com exérese extensa das lesões endometrióticas para \naumentar a probabilidade de sucesso na FIV. \n \n\nMétodos  \n  \n\t\n23\nGrupo controle \nAs pacientes que não apresentaram alterações ultrassonográficas \nsugestivas de endometriose foram convidadas a participar e compor o grupo \ncontrole (11 pacientes). \n \n3.3 Ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal \nConsiderando a alta prevalência da endometriose na população de \nmulheres inférteis, a ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal tem \npapel fundamental na propedêutica a rmada. Não apenas possibilita a \ndescrição minuciosa das lesões, ma s também auxilia o planejamento \ncirúrgico do tratamento48,49 (Anexo D e E). \nNeste estudo, todas as pacientes realizaram esse exame com um \núnico examinador e seguindo protocolo estabelecido50. \n \n3.4 Tratamento cirúrgico \nApós avaliação pré-cirúrgica completa, todas as pacientes do grupo \nde estudo foram submetidas à videolaparoscopia para ressecção dos focos \nde endometriose. Vale ressaltar que todos os procedimentos foram \nrealizados por dois cirurgiões experientes, utilizando técnicas semelhantes e \ncom táticas praticamente idênticas51 (Anexo F). \nDestacam-se algumas premissas que norteiam o sucesso da \ncirurgia52,53: \n-  Jejum de pelo menos 8 horas; \n-  Preparo intestinal prévio ao procedimento; \n-  Profilaxia infecciosa e antitrombótica; \n-  Ressecção ampla de todas as lesões superficiais e profundas; \n\nMétodos  \n  \n\t\n24\n-  Preservação da inervação pélvica, principalmente, nos casos em que as \nlesões intestinais encontravam-se a 8,0 centímetros ou menos da borda \nanal; \n-  Cautela com a introdução da dieta oral pós-cirúrgica. \n \n3.5 Obtenção de amostras de tecido \n3.5.1 Grupo de estudo \nNo grupo de estudo, foram obtidas a m o s t r a s  e n d o m e t r i a i s  a p ó s  a  \nanestesia e antes do início da cirurgia laparoscópica, bem como amostras \nde lesões de endometriose profunda dur ante o procedimento cirúrgico. \nPosteriormente, aproximadamente 6 meses após a cirurgia, novas amostras \nendometriais foram adquiridas. As biópsias endometriais foram realizadas \ncom a cânula de Pipelle.  \nAs amostras endometriais e de tecidos obtidas durante a cirurgia \nforam armazenadas em criotubos estéreis, livres de DNA humano, DNase e \nRNase (Cryo.s, Greiner Bio-One, Germany), imersas em RNA later (Ambion, \nAustin/Texas/USA) e mantidas a -80qC. \nNo momento da coleta dos tecidos, separou-se parte deles para \nanálise anatomopatológica. Nas amostras endometriais, esses estudos \npermitiram confirmar a fase do ciclo menstrual e, nas lesões endometrióticas, \nhouve a confirmação histológica da doença. A técnica de parafinação e a \nconfecção dos blocos de tecidos foram realizadas de acordo com as \npadronizações de cada laboratório, bem como os parâmetros para datação \nendometrial. \nPosteriormente, as amostras foram separadas de acordo com a fase \ndo ciclo menstrual em que foram coletadas para a análise comparativa entre \nos grupos. Vale ressaltar que apenas as amostras obtidas durante a fase \nsecretória foram analisadas. \n \n\nMétodos  \n  \n\t\n25\n3.5.2 Grupo controle \nNas pacientes do grupo controle , procedeu-se a obtenção de \namostras endometriais utilizando-se a cânula de Pipelle (Pipelle de Cornier, \nLaboratoire C. C. D., Paris-France) sem sedação, sob técnica padronizada. \nEsse procedimento foi executado pelo pesquisador e outros médicos afeitos \nao procedimento. \n \n3.6 Extração de RNA \nA extração de RNA total das am ostras endometriais e de tecido \nendometriótico foi realizada utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, \nCA), segundo o protocolo do fabric ante. O RNA extraído foi, então, \nsubmetido à análise quantitativa pelo NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, \nUSA). A seguir, as amostras foram diluídas para 20 ng/uL \n(nanogramas/microlitro) com a intenção de facilitar o manuseio para as \nreações seguintes. \n \n3.7 Análise pelo RT-qPCR \nPara os miRNAs, foi realizada a reação de transcrição reversa com \nprobes e s p e c í f i c o s  p a r a  o s  m i R N A s  a n a l i s a d o s ,  u t i l i z a n d o  o  TaqMan® \nMicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA). A seguir, a \nexpressão do DNA complementar (cDNA) foi realizada utilizando o \nTaqMan® miR Assays e  o  TaqMan® Universal PCR Master Mix ( A p p l i e d  \nBiosystems, USA). \nPara a análise da expressão gênica de mRNA alvos, obteve-se o \ncDNA utilizando o kit High Capacity cDNA synthesis ( A p p l i e d  B i o s y s t e m s ,  \nUSA). A seguir, utilizou-se primers específicos para FKBP52 e RPS17 e o kit \nPCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) para sua análise de RT-qPCR. \n\nMétodos  \n  \n\t\n26\nPor fim, confeccionaram-se os pratos de PCR com 96 poços os quais \nforam analisados pelo sistema de RT-qPCR Vii A7 (Applied Biosystems, \nUSA). \nTodas as reações de RT-qPCR foram realizadas em duplicata e por \n40 ciclos. A expressão relativa foi calculada pelo método delta-delta Ct 54. \nPara estimar a diferença de expressão, utilizou-se o fold change q u e  f o i  \ncalculado pela razão entre as médias de expressão relativa. Para os miRNA, \nutilizou-se o siRNA U6 como controle interno e para a expressão gênica, o \ngene codificador da proteína RPS17. \n \n3.8 Análise estatística \nAs variáveis numéricas foram apresentadas como média e desvio \npadrão e, devido ao tamanho amostral limitado, optou-se pelos testes \nestatísticos não paramétricos. Dessa forma, para a comparação dos dados \nentre os grupos, utilizou-se o teste de Mann Whitney. As variáveis nominais \nforam apresentadas como porcentagem e as frequências comparadas por \nmeio do teste de qui-quadrado. O nível de significância considerado foi de \n5%. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n4 Resultados \n \n \n\nResultados  \n  \n\t\n28\n4 RESULTADOS \n \n \nForam incluídas, neste estudo, 26 pacientes cujas características \npodem ser observadas na Tabela 1. Quinze mulheres com média de idade \nde 35,2 anos (± 3,5) e índice de massa corporal (IMC) médio de 22,1 kg/m2 \n(± 1,9) apresentaram altera ções de endometriose profunda à \nultrassonografia transvaginal com preparo intestinal e foram incluídas no \ngrupo de estudo. Para o grupo controle, foram incluídas 11 mulheres com \nmédia de idade de 37,9 anos (± 4,8) e IMC médio de 22,4 kg/m2 (± 3,4). \nNenhuma das pacientes era tabagista. Nove indivíduos (60%) do \ngrupo de estudo já haviam realizado tratamento de reprodução assistida \n(fertilização in vitro) e do grupo controle, cinco mulheres (45%). No que se \nrefere ao antecedente de abortamento recorrente definido por dois episódios \nou mais de perda gestacional55, houve duas pacientes (13%) do grupo de \nestudo e nenhuma do grupo controle. \nNa análise comparativa entre os dois grupos, não se observou \ndiferença estatisticamente significante no que diz respeito às seguintes \ncaracterísticas: idade, IMC, falhas de FIV e abortamento recorrente. \n \nTabela 1 -  Características dos grupos endometriose e controle - São \nPaulo, SP - 2012 a 2014 \n \n G r u p o  d e  e s t u d o  G r u p o  c o n t r o l e  p  \nIdade (anos)1 35,2 ± 3,5 37,9 ± 4,8 0,121 \nIMC (kg/m2) 1 22,1 ± 1,9 22,4 ± 3,4 0,600 \nFalhas de FIV (%) 60 45 0,918 \nAbortamento \nrecorrente (%) 13 0 0,525 \nIMC = índice de massa corporal; FIV = fertilização in vitro \n1 Valores expressos em média ± desvio padrão \n\nResultados  \n  \n\t\n29\nÉ importante destacar que a maioria das pacientes com endometriose, \nincluídas neste estudo, segundo classificação da American Fertility Society56, \nforam consideradas moderada ou severa. Como revela a Tabela 2, nenhuma \ndas mulheres operadas apresentava a classificação mínima, ao passo que \n80% delas era moderada ou severa. \n \nTabela 2 -  Estadiamento cirúrgico da endometriose segundo a American \nFertility Society, 1996 - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \nEstadiamento Grupo de estudo \nMínima (rAFS I) 0 \nLeve (rAFS II) 3 (20%) \nModerada (rAFS III) 3 (20%) \nSevera (rAFS IV) 9 (60%) \nrAFS - revised American Fertility Society \nValores expressos em número e porcentagem \n \n\nResultados  \n  \n\t\n30\nA seguir, para a análise da expressão de RNAs, as amostras foram \nseparadas de acordo com a fase do ciclo menstrual, como mostra a Tabela \n3. No grupo controle, obtiveram-se três (27%) amostras endometriais da \nfase proliferativa e oito (73%}, da fase secretória. No grupo de estudo, os \nespécimes analisados incluem endométrio no pré-operatório, lesão de \nendometriose e endométrio no p ó s - o p e r a t ó r i o .  D a s  a mostras endometriais \npré-operatórias, seis (40%) são de fase proliferativa e nove (60%), de fase \nsecretória. Das lesões de endomet riose, cinco (36%) são de fase \nproliferativa e nove (64%), de fase  s e c r e t ó r i a .  E ,  d o s  e s p é c i m e s  \nendometriais pós-operatórios, sete (64%) são de fase proliferativa e quatro \n(36%), de fase secretória. \nVale ressaltar que em umas das pacientes com endometriose, não \nhouve coleta de amostra de lesão de endometriose profunda. Em quatro \npacientes, não foi possível realizar  a  a m o s t r a g e m  e n d o m e t r i a l  p ó s -\noperatória. \n \nTabela 3 -  Caracterização das amostras t e c i d u a i s  a n a l i s a d a s  s e g u n d o  f a s e  \ndo ciclo menstrual - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \n G r u p o  d e  e s t u d o  G r u p o  c o n t r o l e  \nEndométrio pré-operatório fase \nproliferativa 6 (40%) 3 (27%) \nEndométrio pré-operatório fase \nsecretória 9 (60%) 8 (73%) \nLesão peritoneal fase proliferativa 5 (36%) NA1 \nLesão peritoneal fase secretória 9 (64%) NA 1 \nEndométrio pós-operatório fase \nproliferativa 7 (64%) NA1 \nEndométrio pós-operatório fase \nsecretória 4 (36%) NA 1 \nValores expressos em número e porcentagem \n1 NA - não se aplica \n \n\nResultados  \n  \n\t\n31\n4.1 Análise de MiRNAs \n4.1.1 MiRNA-21 \nO Gráfico 1, em diagrama de barras, mostra a expressão de miRNA-\n21 nos diferentes tecidos em relação ao RNA nuclear pequeno (snRNA) U6. \nSemelhantemente, a Tabela 4 demons tra as relações entre essas \nexpressões em relação ao grupo controle. \nObserva-se que não houve diferença estatisticamente significante nas \nexpressões de miRNA-21, entre os diferentes tecidos, ao serem comparados \ncom o grupo controle. \n \nGráfico 1 - Expressão do miRNA-21 - São Paulo, SP - 2012 a 2014\t\n\t\nmiR: miRNA; Eosis: grupo de estudo \n \n\nResultados  \n  \n\t\n32\nTabela 4 -  Relação da expressão de miRNA-21 nas amostras e comparação \ncom o grupo controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \n Média da expressão \nrelativa \nDesvio \npadrão p Fold \nchange \nControle 1,01 0,34   \nEstudo pré-\noperatório 1,25 0,64 0,396 1,24 \nLesão 2,32 2,19 0,396 2,30 \nEstudo pós-\noperatório 1,01 0,23 0,759 1,00 \n \n \nAs comparações entre as amostras do grupo de estudo pré-operatório \ne lesão, pré-operatório e pós-operatório e lesão e pós-operatório não foram \nestatisticamente significantes, como mostra a Tabela 5. \n \nTabela 5 -  Comparação da expressão do miRNA-21 entre as amostras do \ngrupo de estudo - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \n p  Fold change \nPré-op x Lesão 0,773 1,85 \nPré-op x Pós-op 0,724 1,24 \nLesão x Pós-op 0,724 2,30 \n \n \n\nResultados  \n  \n\t\n33\n4.1.2 MiRNA-451 \nOs dados do Gráfico 2, bem co mo da Tabela 6, revelam as \nexpressões do miRNA-451 nas a m o s t r a s  e  s u a s  r e l a ç õ e s .  N o t a - s e  q u e  a  \nexpressão desse miRNA tem maior nível nas lesões de endometriose em \ncomparação ao endométrio do grupo controle (p = 0,007 e fold change =  \n13,0). Nas outras análises, não foram observadas relações estatisticamente \nsignificantes no que concerne à contraposição da expressão do miRNA-451 \nem relação ao grupo controle. \n \nGráfico 2 - Expressão de miRNA-451 - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n\t\nmiR: miRNA; Eosis: grupo de estudo \n \nTabela 6 -  Relação da expressão de miRNA-451 nas amostras e \ncomparação com o grupo controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \n Média da \nexpressão relativa \nDesvio \npadrão p Fold \nchange \nControle 0,98 0,46   \nEstudo pré-\noperatório 1,17 0,84 0,86 1,20 \nLesão 12,68 16,99 0,007 13,00 \nEstudo pós-\noperatório 2,41 2,07 0,153 2,47 \n\nResultados  \n  \n\t\n34\nComparando as amostras do grupo de estudo, observa-se que a \nexpressão relativa de miRNA-451 nas l e s õ e s  d e  e n d o m e t r i o s e  p r o f u n d a  é  \nsignificativamente maior do que no endométrio dessas pacientes (p = 0,043 \ne fold change = 10,86). Já as comparações das amostras pré-operatório e \npós-operatório e lesão e pós-operatório não mostrou diferença estatística, \napesar de apresentarem fold change significativo (Tabela 7). \n \nTabela 7 -  Comparação da expressão do miRNA-451 entre as amostras do \ngrupo de estudo - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \n p  Fold change \nPré-op x Lesão 0,043 10,86 \nPré-op x Pós-op 0,289 2,06 \nLesão x Pós-op 0,157 5,27 \n \n \n4.1.3 MiRNA-29c \nDiferentemente dos miRNAs -21 e-451, a análise de expressão \nrelativa do miRNA-29c revela diferenças de expressão entre os tecidos, \ncomo mostram o Gráfico 3 e a Tabela 6. \nA expressão é maior no endométrio de pacientes com endometriose \nao comparar com as do grupo controle (p = 0,002). Parece ser ainda maior \nnas lesões de endometriose quando comparadas a esse mesmo grupo. \nNesse caso, apesar de não apresentar diferença estatística significante  \n(p = 0,059), tem fold change expressivo (6,53). Após a cirurgia, os níveis de \nmiRNA-29c caem e equiparam-se aos níveis do grupo controle (p = 0,734). \n \n\nResultados  \n  \n\t\n35\nGráfico 3 - Expressão de miRNA-29c - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n\t\nmiR: miRNA; Eosis: grupo de estudo \n \n \nTabela 8 -  Relação da expressão de miRNA-29c nas amostras e \ncomparação com o grupo controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \n Média da expressão \nrelativa \nDesvio \npadrão p Fold \nchange \nControle 1,08 0,41   \nEstudo pré-\noperatório 2,62 1,39 0,002 2,44 \nLesão 7,03 6,91 0,059 6,53 \nEstudo pós-\noperatório 0,98 0,47 0,734 1,09 \n \n\nResultados  \n  \n\t\n36\nVerifica-se, na Tabela 9, que a análise das amostras do endométrio \npré-operatório mostrou maior expressão do miRNA-29c em relação às \namostras do endométrio pós-operatório (p = 0,021 e fold change =  2 , 6 7 ) .  \nResultado não obtido ao comparar os grupos pré-operatório e lesão e lesão \ne pós-operatório, apesar da expressão gênica comparativa apresentar fold \nchange significativo. \n \nTabela 9 -  Comparação da expressão do miRNA-29c entre as amostras do \ngrupo de estudo - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \n p  Fold change \nPré-op x Lesão 0,501 2,68 \nPré-op x Pós-op 0,021 2,67 \nLesão x Pós-op 0,089 7,15 \n \n \n4.2 Análise da proteína FKBP52 \nA expressão relativa do mRNA que codifica a proteína FKBP52 \nutilizando a RPL17 como controle in terno é menor no endométrio das \npacientes com endometriose em relação àquelas do grupo controle (p = \n0,005 e fold change =  1 , 8 8 ) ,  a s s i m  c o m o  n a s  l e s õ e s  e n d o m e t r i ó t i c a s  \ncomparadas ao mesmo grupo (p < 0,001 e fold change =  3 , 1 9 ) .  A p ó s  o  \ntratamento cirúrgico da endometriose, a expressão da FKBP52 aumenta e \nassemelha-se à do grupo controle (p = 0,61), como mostram o Gráfico 4 e a \nTabela 10. \n \n \n\nResultados  \n  \n\t\n37\nGráfico 4 - Expressão da proteína FKBP52 - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n\t\nEosis: grupo de estudo \n \n \nTabela 10 -  Relação da expressão da FKBP52 nas amostras e comparação \ncom o grupo controle - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n Média da \nexpressão relativa Desvio padrão p Fold \nchange \nControle 1,05 0,30   \nEstudo pré-\noperatório 0,56 0,14 0,005 1,88 \nLesão 0,33 0,15 <0,001 3,19 \nEstudo pós-\noperatório 1,19 0,62 0,61 1,13 \n \n \n\nResultados  \n  \n\t\n38\nA expressão relativa das lesões de endometriose é menor quando \ncomparada ao endométrio pré-operatório (p = 0,009 e fold change= 1,69) e \nao pós-operatório (p = 0,02 e fold change = 3,62). A despeito de apresentar \nexpressão 2,14 maior no endométrio pós-operatório, quando comparada ao \npré-operatório, essa diferença não se mostrou estatisticamente significativa, \ncomo mostra a Tabela 11. \n \nTabela 11 -  Comparação da expressão da FKBP52 entre as amostras do \ngrupo de estudo - São Paulo, SP - 2012 a 2014 \n \n p  Fold change \nPré-op x Lesão 0,009 1,69 \nPré-op x Pós-op 0,09 2,14 \nLesão x Pós-op 0,02 3,62 \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n5 Discussão \n \n \n\nDiscussão  \n  \n\t\n40\n5 DISCUSSÃO \n \n \n5.1 Conduta cirúrgica na endometriose \nA opção pelo tratamento cirúrgico da endometriose associado à \ninfertilidade é um desafio corriqueiro no cotidiano dos que militam na \nmedicina reprodutiva. Trata-se de decisão que envolve diversas informações \ncomo a idade, reserva ovariana e outras causas de infertilidade. \nPara os casos de endometriose mínima ou leve (rAFS I e II), em \nrelação ao tratamento cirúrgico, os consensos apontam melhores taxas de \ngravidez espontânea ou quando realizam  t r a t a m e n t o  d e  r e p r o d u ç ã o  \nassistida57–59. Por outro lado, o benefício da cirurgia para os casos de \nendometriose moderada ou severa (rAFS III e IV) não é unânime na \nliteratura17,58. No entanto, fruto de uma rotina rígida e completa na \nabordagem das pacientes com endometriose, demonstrou-se, em pesquisa \nanterior, que aquelas pacientes que fo ram submetidas ao tratamento \ncirúrgico dessa doença, antes do tr atamento de reprodução assistida, \ntiveram melhores taxas de gravidez20. Dessa maneira, com a intenção de \nexplorar os caminhos moleculares que possam explicar os resultados do \nestudo referido, sob a mesma rotina de abordagem das p a c i e n t e s  c o m  \nendometriose do estudo mencionado, construiu-se o presente estudo. \n \n5.2 Diagnóstico ultrassonográfico da endometriose \nTrata-se de um ponto de discussão a divisão dos grupos de estudo \nbaseada no resultado da ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal. \nSabe-se que o padrão ouro para o diagnóstico da endometriose é a \nlaparoscopia com biópsia das áreas s u s p e i t a s  e  c o r r o b o r a ç ã o  a n a t o m o -\npatológica57. No entanto, do ponto de vista prático, submeter todas as \n\nDiscussão  \n  \n\t\n41\npacientes inférteis à intervenção vi deolaparoscópica sob a premissa \ninvestigativa não é factível. \nA alta prevalência dessa enfermidade nas mulheres inférteis obriga o \nclínico a incluir essa hipótese em sua propedêutica6. Considerando que uma \nparcela das mulheres com endometriose relata pouco ou nenhum sintoma60, \nnota-se uma demanda de exames dirigidos para o seu diagnóstico. Nesse \ncontexto, incluiu-se a ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal na \npropedêutica do casal infértil. Em estudo comparativo em relação ao exame \nde toque vaginal e à ressonância nucle ar magnética, a ultrassonografia \ntransvaginal com preparo intestinal  m o s t r o u  m e l h o r sensibilidade, \nespecificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia \npara o diagnóstico de endometriose profunda retrocervical e do \nretossigmóide61. \nNo presente estudo, o grupo controle é constituído de mulheres sem \nalterações na ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal. Apesar \nde apresentar a desvantagem de não passarem pelo teste padrão ouro para \no diagnóstico da endometriose, refletem melhor a prática clínica e, assim, \nseus desdobramentos práticos são mais condizentes com a aplicabilidade \nno cotidiano do clínico em medicina reprodutiva. \n \n5.3 MiRNAs e fase do ciclo menstrual \nAs alterações hormonais que controlam o ciclo menstrual causam \nmodificações nos órgãos pélvicos. Imagina-se, por isso, que os processos \nmoleculares envolvidos, incluindo os miRNAs, também sofram alterações \ndurante o ciclo. \nRekker et al. recrutaram 9 pacientes saudáveis e coletaram amostras \nde sangue em 4 períodos do ciclo menstrual: primeiro dia do ciclo, sétimo \ndia do ciclo, dia do pico de LH e sétimo dia após pico de LH. Analisaram o \nperfil de miRNAs (375 miRNAs) nessas diferentes fases de amostras de \nsangue total e de plasma. Não houve diferença na expressão dos miRNAs \n\nDiscussão  \n  \n\t\n42\nnos diferentes momentos do ciclo menstrual e, por fim, concluíram que as \nalterações cíclicas nas mulheres não afetaram a expressão de miRNAs no \nsangue62. \nPor outro lado, apesar de não haver evidências de diferenças no nível \nsérico, a expressão de miRNAs no endométrio não é a mesma nos \ndiferentes momentos do ciclo menstrual. Kuokannen et al. realizaram estudo \na fim de relacionar o perfil de miRNAs e mRNAs no endométrio de fase \nproliferativa tardia e de fase secretória média. Submeteram essas amostras \nendometriais a estudo de microssérie de miRNAs e de mRNAs. Além de \ndescreverem perfis diferentes de miRNAs expressos nessas duas diferentes \nfases do ciclo menstrual, notaram que alguns miRNAs reguladores do ciclo \ncelular estavam com expressão maior na fase secretória média em relação à \nproliferativa tardia63. \nOutros estudos similarmente corroboram a expressão dos miRNAs \nrelacionada à fase do ciclo menstr ual. Alguns estudos descrevem a \nexpressão dos miRNAs influenciada pelos esteroides, como o estradiol e a \nprogesterona64: por exemplo, o miRNA 145 que pode diminuir a tradução do \nreceptor de estrogênio alfa por se ligar ao mRNA dessa proteína e inibir sua \ntradução65. Outro estudo demonstra diferença de expressão de alguns \nmiRNAs entre a fase proliferativa e secretória, em amostras de endométrio \nde pacientes sem endometriose e de endometriomas, mas não em amostras \nde endométrio de pacientes com endometriose e de lesões peritoneais e \nretrocervicais66. \nDe maneira semelhante, a ex pressão da FKBP52 também é \ndependente da fase do ciclo menstrual. Yang et al., ao demostrar uma \nprovável regulação da expressão da FKBP52 pelo fator de transcrição \nhomeobox A10 (HOXA10), notaram que ambas as moléculas tinham \nexpressão diferente nas fases proliferativa e secretória em um modelo de \ncultura de células estromais de endométrio humano26. \nConsiderando-se essas observações e que a racionalidade do \npresente estudo baseia-se em um possível benefício do tratamento cirúrgico \n\nDiscussão  \n  \n\t\n43\nda endometriose no que concerne à infertilidade, mais especificamente à \nimplantação embrionária, optou-se pela inclusão apenas das amostras \ncoletadas durante a fase secretória do ciclo menstrual. Tal fato reduziu o \ntamanho da amostra o que incorreu na restrição do poder de distinção das \nanálises estatísticas. Nesse sentido, a i n d a  c a b e  m e n c i o n a r  a  d i f i c u l d a d e  \nencontrada para incluir amostras de endométrio do pós-operatório. Não \napenas relacionada à fase menstrual , mas também outros fatores \ndificultaram a amostragem desse grupo, como: gravidez espontânea após a \ncirurgia, falta de indicação de biópsia endometrial após a cirurgia e demora \nou não retorno ao tratamento reprodutivo após o procedimento cirúrgico. \n \n5.4 MiRNA-21 \nO miRNA-21 é um dos mais antigos descrito nos mamíferos e tem a \nsua sequência bem conservada por meio da evolução. É codificado pelo \ngene MIR-21 localizado em região intrônica do cromossomo 17q23.267. \nEssa molécula é bastante associada aos cânceres pois tem a função \nrelacionada à proliferação celular e à metástase. Por tal sorte, é considerada \num oncomir. Apresenta expressão aumentada em glioblastomas, câncer de \nmama, pulmão, próstata, cólon,  e s t ô m a g o ,  e s ô f a g o ,  g a r g a n t a ,  \nleiomiossarcoma uterino e linfoma difuso de grandes células B. Além disso, \nno câncer de pâncreas, sua expressão elevada relaciona-se com metástase \nhepática e no câncer de mama, com doença avançada, metástase linfática e \npior prognóstico68. \nEm relação à endometriose, Rámon et al. demonstraram expressão \naumentada em amostra de endometrioma e de lesão retovaginal em \ncomparação ao endométrio tópico de pacientes com endometriose e \ntambém em relação ao endométrio de mulheres sem endometriose66. Já, em \nestudo no qual mensurou-se a expressão de miRNAs no plasma sanguíneo, \no miRNA-21 apresentou maior expressão em pacientes com endometriose \nem relação às sem a doença na análise de microssérie (fold change = 2,36 e \n\nDiscussão  \n  \n\t\n44\np = 0,034). No entanto, em confirmação com PCR quantitativo em tempo \nreal, essa informação não foi corroborada (p = 0,41)69. \nNo presente estudo, a expressão desse miRNA não apresentou \ndiferença estatística significante entre as diversas amostras. Considerando-\nse que sua função esteja vinculada à proliferação celular, esperava-se \nencontrar maior expressão nas amostras de lesões em relação ao \nendométrio das pacientes com e sem endometriose, supondo-se que o \nendométrio refluído para a cavidade abdominal teria maior capacidade de \nproliferação. Apesar de não apresent arem significância estatística, \nanalisando apenas os fold changes, poder-se-ia inferir algo semelhante ao \nesperado. As lesões de endometriose apresentam fold change de 2,30 em \nrelação ao endométrio do grupo controle e de 1,85 e 2,30 em relação ao \nendométrio do grupo endometriose, antes e após a cirurgia, respectivamente. \n \n5.5 MiRNA-451 \nEm estudo realizado por meio de a m o s t r a s  d e  s a n g u e  d e  m u l h e r e s  \nsaudáveis, dos 375 miRNAs analisados, o miRNA-451 foi o mais \nabundante62. Trata-se de uma molécula traduzida pelo gene MIR451 \nlocalizado no cromossomo 17q11.270.  \nDentre suas funções, pode-se citar:  p r o l i f e r a ç ã o ,  d i f e r e n c i a ç ã o ,  \nmigração e invasão celular. Semelh ante ao miRNA-21, também está \nrelacionado a diversos tipos de cânc er, como gastrointestinal, glioma, \nesofageano, mama, osteossarcoma e vesical71. \nNo que tange à endometriose, Nothnick et al. demonstraram, a partir \nde modelos em ratos, que a expr essão diminuída do miRNA-451 \nendometrial não é causa, mas consequência da doença. Relataram também \nque esse perfil de expressão diminuída não contribui para o tecido que reflui \npara a cavidade abdominal originar uma lesão de endometriose71. Os dados \nobtidos por meio do modelo de babuínos são consoantes com esses dados \ne também mostraram expressão reduzida do miRNA-451, após a indução da \n\nDiscussão  \n  \n\t\n45\nendometriose. No entanto, diferente do estudo anterior, esse demonstrou \nque o miRNA-451 contribui para a fisiopatologia da endometriose por \naumentar a proliferação celular devido à elevação da proteína YWHAZ, um \ndos alvos desse miRNA46. \nHawkins et al. utilizaram a análise de microssérie para traçar o perfil \nde miRNAs diferentemente expressos no endométrio de pacientes com \nendometriose em relação ao tecido de endometrioma. Dentre outros \nmiRNAs, demonstraram que o -451 tem maior expressão no endometrioma72. \nOs dados obtidos neste estudo são condizentes com o trabalho de \nHawkins et al. pois se verificou maior expressão do miRNA-451 nas \namostras de lesão de endometriose em relação ao endométrio do grupo \ncontrole (p = 0,07 e fold change = 13,00) e em relação ao endométrio das \npacientes com endometriose (p = 0,04 e fold change = 10,86). Porém, não \nfoi condizente com os estudos de modelos em animais pois, a expressão \ndesse miRNA, comparando o grupo controle com aquele com endometriose \npré-operatório, não apresentou diferenç a estatisticamente significante, \ncontrariando a expectativa de diminuição nesse grupo. \n \n5.6 MiRNA-29c \nO miRNA-29c é codificado pelo gene MIR29c que está localizado no \ncromossomo 1q32.273,74. Considerando as diferentes fases do ciclo \nmenstrual, apresenta expressão mais alta na fase secretória média em \nrelação à proliferativa tardia, como mostra o estudo de Kuokkanen et al.63. \nPortanto, isso sugere que esse miRNA tem relação com a progesterona. \nAlém disso, atribui-se como funções, o remodelamento da matriz \nextra-celular e ação como supressor de metástase. Está relacionado a \nalguns tipos de cânceres, como de nasofaringe e leucemia linfocítica crônica, \nprincipalmente naqueles com elevada capacidade de invasão e metástase68. \nEm relação à endometriose, os resultados obtidos no presente estudo \nmostram que a expressão do miRNA-29c é maior no endométrio das \n\nDiscussão  \n  \n\t\n46\npacientes com endometriose profunda em relação ao grupo controle. É \nainda maior nas lesões de endometriose e, após a cirurgia, restaura-se para \nníveis similares ao do grupo controle. A comparação do grupo lesão e o \ngrupo controle não apresenta diferença estatisticamente significante (p = \n0,059), no entanto, apresenta fold change expressivo (6,53). \nEsses dados são condizentes co m alguns dados da literatura. \nOhlsson Teague et al. mostraram que esse miRNA está aumentado no \nendométrio ectópico em relação ao tópico em amostras pareadas75. Hawkins \net al. notaram expressão aumentada do miRNA-29c ao comparar amostras \nde endometriomas à de endométrio de pacientes sem endometriose. Ruan \net al. descreveram níveis aumentados d e  m i R N A - 2 9 c  n o  e n d o m é t r i o  d e  \npacientes com endometriose em relação ao de pacientes sem \nendometriose76. \nContrapondo a maioria das evidências, há um estudo que relatou \nexpressão para baixo do miRNA-29c em endométrio ectópico em relação ao \ntópico. Concluiu, ainda, que essa molécula é um supressor da endometriose \npor inibir a proliferação, invasão e apoptose das células endometriais77. \n \n5.7 FKBP52 \nA FKBP52 é uma proteína codifi cada pelo gene FKBP4 que se \nencontra no cromossomo 12p13.33 78. Como foi mencionado, está \nrelacionada ao receptor de progesterona e o regula positivamente. Na \nendometriose, parece ter papel na etiopatogenia24 e  n a  r e c e p t i v i d a d e  \nendometrial e infertilidade associada26. \nA ferramenta Targetscan (www.targetscan.org) revela que o mRNA \nque traduz a proteína FKBP52 é um dos a l v o s  d o  m i R N A - 2 9 c .  O  s í t i o  d e  \nligação está descrito na Figura 3. \n\nDiscussão  \n  \n\t\n47\n \nFigura 3 - Sítio de ligação miRNA-29c e FKBP52 \n \nOs dados obtidos neste estudo mostram que o comportamento da \nexpressão dessa proteína é inversa ao do miRNA-29c. O endométrio de \npacientes com endometriose apresenta menor expressão da FKBP52 em \nrelação ao grupo controle. Após o tratamento cirúrgico, ocorre aumento dos \nníveis de expressão do mRNA dessa proteína, níveis esses que se tornam \nequiparáveis aos do grupo controle. Além disso, a expressão da FKBP52 é \nmenor na lesão de endometriose quando comparada ao endométrio do \ngrupo controle e ao das pacientes com endometriose antes e após a cirurgia. \nOs níveis diminuídos da expressão dessa proteína no endométrio de \npacientes com endometriose também foram descritos em outros estudos24,26 \ne podem explicar a decidualização alterada e a infertilidade relacionada à \nimplantação embrionária. Nota-se, também, que os menores níveis de \nexpressão da FKBP52 ocorrem nas lesões de endometriose, o que \ncorrobora o estudo de Hirota et al., no qual descreveram a  p r o m o ç ã o  d a s  \nlesões de endometriose pela redução da FKBP5224. \nA relação entre as expressões do miRNA-29c e da FKBP52 não tem \nprecedentes na literatura médica. Apesar de carecer de outras evidências \ncomo expressão em nível proteico ou estudos funcionais, os dados obtidos \nno presente estudo, mesmo que de forma inicial, mostram um provável \npapel do miRNA-29c por meio da modulação da expressão da FKBP52 na \netiopatogenia da endometriose, bem como um mecanismo que explica a \nalteração na decidualização e consequente contribuição para a infertilidade. \nEsses processos podem ser reverti dos pelo tratamento cirúrgico da \nendometriose com remoção das lesões, como se pode inferir pelo retorno da \nexpressão do miRNA-29c e da FKBP52 p a r a  n í v e i s  s e m e l h a n t e s  a o  d o  \n3’ UTR da FKBP52 (Posição 426-432)…UGUGGCCUCCAUGUGGGUGCUAG....... \nSítio de ligação do miRNA-29c.....….….AUUGGCUAAAGUUUACCACGAU…..... \n\n\nDiscussão  \n  \n\t\n48\nendométrio de mulheres sem endometriose após a cirurgia, conforme se \nconstatou no presente estudo. \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n6 Conclusões \n \n \n\nConclusões  \n  \n\t\n50\n6 CONCLUSÕES \n \n \nA análise dos dados obtidos permite concluir: \na)  A análise da expressão do miRNA-21 nas diferentes amostras não \ndemonstrou diferenças estatisticamente significantes; \nb)  A análise da expressão do miRNA-451 não evidenciou diferença \nestatística significante no endométrio das pacientes com \nendometriose em comparação às das mulheres sem endometriose. \nPor outro lado, a expressão do miRNA-451 nas lesões de \nendometriose foi significativamente maior do que no endométrio \ndo grupo controle, bem como no das pacientes do grupo \nendometriose pré-operatório; \nc)  Em relação ao miRNA-29c, verificou-se expressão aumentada no \nendométrio de pacientes do grupo endometriose em relação ao  \ncontrole. Após o tratamento cirúrgico, a expressão desse miRNA \nretorna a níveis semelhantes aos do grupo controle. Além disso, \nnas lesões de endometriose a sua expressão não mostrou \ndiferença estatística significante em relação ao endométrio do \ngrupo controle (p = 0,059), porém, o fold change f o i  e x p r e s s i v o  \n(6,53); \nd)  A avaliação da proteína FKBP52 analisada pela expressão de seu \nmRNA apresentou comportamento inverso ao do miRNA-29c. A \nexpressão foi menor no endométrio de pacientes com \nendometriose em relação às sem endometriose e ainda menor nas \nlesões de endometriose. Após a remoção das lesões \nendometrióticas, a expressão da FKBP52 é restaurada para níveis \nsemelhantes ao do endométrio de mulheres do grupo controle. \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n7 Anexos \n \n \n\nAnexos  \n  \n\t\n52\n7 ANEXOS \nAnexo A - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de \nMedicina da Universidade de São Paulo \n \n\nAnexos  \n  \n\t\n53\n \n\nAnexos  \n  \n\t\n54\nAnexo B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Grupo de \nEstudo \nFACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n_____________________________________________________________ \nDADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL \nLEGAL \n1. NOME: .:.................................................................................................................... \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ...................................... SEXO :    .M Ƒ   F  Ƒ \nDATA NASCIMENTO: ......../......../......  \nENDEREÇO ............................................................... Nº ................... APTO: .......... \nBAIRRO:  ...............................................................CIDADE  ..................................... \nCEP:..............................  TELEFONE: DDD (............) …........................................... \n2. RESPONSÁVEL LEGAL: ......................................................................................... \nNATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.): ............................................... \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE:....................................SEXO:  M Ƒ   F Ƒ   \nDATA NASCIMENTO.: ....../......./...... \nENDEREÇO…............................................................. Nº ............... APTO: ............. \nBAIRRO: ................................................. CIDADE: .................................................. \nCEP:....................................TELEFONE: DDD(............)............................................. \n___________________________________________________________________ \nDADOS SOBRE A PESQUISA \n1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA “Perfil de expressão de MicroRNAs \nem pacientes inférteis com endometriose antes e após a remoção cirúrgica do \ntecido ectópico” \n2. PESQUISADOR Executante: Eduardo Hideki Miyadahira \nPESQUISADOR Responsável : Edmund Chada Baracat \nCARGO/FUNÇÃO: Professor Titular da Disciplina de Ginecologia. \nINSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 28.085 \n3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: \nRISCO MÍNIMO X   RISCO MÉDIO Ƒ \nRISCO BAIXO Ƒ  R I S C O  M A I O R  Ƒ \n4.DURAÇÃO DA PESQUISA: 36 meses \n\nAnexos  \n  \n\t\n55\nFACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \n1 – Desenho do estudo e objetivo(s): Essas informações estão sendo fornecidas \npara sua participação voluntária neste estudo. Sabe-se que algumas \npacientes beneficiam-se da cirurgia de remoção do tecido ectópico da \nendometriose. Dessa forma, os objetivos deste estudo são identificar \nmicroRNAs (pequenas moléculas de RNA) diferentemente expressos em \npacientes com endometriose e pacientes sem endometriose; verificar se após \na remoção cirúrgica do tecido endometrial ectópico há alteração na \nexpressão de microRNAs em pacientes com endometriose; relacionar a \nexpressão de microRNAs endometriais com as características gerais e \nreprodutivas de pacientes com ou sem endometriose. \n2 – Descrição dos procedimentos que serão realizados: Serão executados:\t\na) Ultrassom transvaginal com preparo intestinal e/ou ressonância \nmagnética para pesquisa de endometriose profunda. Estes exames são \npouco invasivos, com raras complicações e têm duração de \naproximadamente uma hora ambos. No caso do ultrassom, o desconforto se \ndeve somente pela via o qual é realizada, a transvaginal e não tem \ncomplicações. E, no caso da ressonância, é um exame indolor, apenas \nchama-se a atenção para as pessoas que tem claustrofobia (incômodo ao \npermanecer em lugares fechados), pois ele é realizado em uma câmara \nfechada. A complicação mais comum é a reação alérgica ao contraste \nutilizado no exame. \nb) Biópsia endometrial, antes e após cirurgia para tratamento da \nendometriose, através da técnica utilizada na rotina clínica, não \nhavendo, portanto, maior risco durante ou após o procedimento \ncirúrgico. Neste procedimento, iremos realizar um exame especular \nginecológico e, após visualização do colo do útero, um fino catéter é \ncolocado dentro da cavidade do útero. Por meio de vácuo, uma pequena \namostra de endométrio (camada interna do útero) é aspirada. Este pequeno \nprocedimento, não requer obrigatoriamente uma anestesia, porém pode \ncausar dor em cólica no momento que o catéter é inserido dentro da \ncavidade do útero que, geralmente, é suportável. Tem duração de \naproximadamente 15 minutos. As complicações são raras e as mais comuns \n\nAnexos  \n  \n\t\n56\nsão o falso trajeto dentro do útero e o sangramento aumentado após o \nprocedimento. \nc)  Retirada de amostra de sangue por punção periférica, antes e após a \ncirurgia para tratamento da endometriose, a qual também é utilizada na \nrotina clínica. A punção de veia periférica é um pequeno procedimento \nrápido (aproximadamente 5 minutos) e pouco doloroso. Utilizamos uma \nagulha fina para acessar o interior do vaso sanguíneo e coletar amostra de \nsangue. A complicação mais comum é a transfixação da veia puncionada. \nd) Cirurgia laparoscópica por técnica convencional previamente indicada \npor suspeita clínica e/ou radiológica de endometriose, no qual serão \nrealizadas biópsias do tecido endometrial e do tecido ectópico. A \ntécnica cirúrgica aplicada será a mesma utilizada normalmente na \nprática clínica, não havendo, portanto, maior risco durante ou após o \nprocedimento cirúrgico. Trata-se de cirurgia realizada por técnica \nconhecida como ”minimamente invasiva” pois os cortes realizados na pele \nsão pequenos. A duração da cirurgia é variável e depende da extensão da \nsua doença. As complicações mais comuns são a dor pós-operatória e a \nlentidão do trânsito intestinal, quadro conhecido como íleo paralítico.\t\n3 – Relação dos procedimentos rotineiros e como são realizados: Ultrassom \ntransvaginal realizado por técnica convencional e por operador qualificado ou \nressonância nuclear magnética; biópsia endometrial realizada com Catéter de \nPipelle sob técnica convencional; coleta de sangue por punção periférica da \nveia do antebraço; cirurgia para tratamento da endometriose por vídeo-\nlaparoscopia realizada por cirurgião especializado. \n4 – Descrição dos desconfortos e riscos esperados nos procedimentos: Não \nhaverá nenhum desconforto ou risco adicional durante a realização da \npesquisa já que os procedimentos fazem parte do tratamento proposto para \ndor e/ou infertilidade. \n5 – Benefícios para o participante: Não há benefício direto para o participante \nvisto que o presente estudo não tem por objetivo estabelecer novo tratamento \npara a endometriose. No entanto, o avanço na compreensão dos mecanismos \nenvolvidos nesta doença pode proporcionar o estudo de novas alternativas \nde tratamento. Além disso, seus dados serão mantidos em sigilo absoluto. \n\nAnexos  \n  \n\t\n57\n6 – Relação de procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais \no paciente pode optar: O tratamento proposto contempla o quadro clínico de \ncada paciente, desta forma, entende-se que esta é a alternativa mais \nadequada. \n7 – Garantia de acesso: e m  q u a l q u e r  m o m e n t o  d o  e s t u d o ,  a  s e n h o r a  t e r á  \nacesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de \neventuais dúvidas. O investigador principal é o Dr. Eduardo Hideki Miyadahira \nque pode ser encontrado no endereço: Av. Dr. Enéas de Carvalho, 255, \nInstituto Central, Ginecologia, 10º andar, fone: 2661-6647 (Clínica \nGinecológica). Caso tenha alguma consideração ou dúvida sobre a ética da \npesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Av. \nDr. Arnaldo, 455 – Instituto Oscar Freire – 2º andar– tel: 3061-8004, FAX: 3061-\n8004 – E-mail: cep.fm@usp.br  \n8 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e \ndeixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu \ntratamento na Instituição; \n09 – Direito de confidencialidade – As informações obtidas serão analisadas em \nconjunto com as demais pacientes, não sendo divulgada a sua identificação; \n10 – Direito de ser mantida atualizada sobre os resultados parciais e totais das \npesquisas, quando em estudos abertos, ou de resultados que sejam do \nconhecimento dos pesquisadores; \n11 – Despesas e compensações: não há despesas adicionais para o \nparticipante em qualquer fase do estudo, apenas os relacionados ao \ntratamento proposto. Também não há compensação financeira relacionada à \nsua participação. \n12 – Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou \ntratamentos propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante tem \ndireito a tratamento médico na Instituição. \n13 - Compromisso do pesquisador de armazenar as amostras coletadas em local \nseguro e utilizá-las somente para este estudo. \n\t\n\nAnexos  \n  \n\t\n58\nAcredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou \nque foram lidas para mim, descrevendo o estudo ” Perfil de expressão de \nMicroRNAs em pacientes inférteis com endometriose antes e após a remoção \ncirúrgica do tecido ectópico”. \nEu discuti com o Dr. Eduardo Hideki Miyadahira sobre a minha decisão em \nparticipar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do \nestudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as \ngarantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro \ntambém que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do \nacesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em \nparticipar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, \nantes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer \nbenefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço.\t\n\t\n-------------------------------------------------  \nAssinatura do paciente/representante \nlegal Data         /       /        \n \n-------------------------------------------------------------------------  \nAssinatura da testemunha Data         /       /        \n(para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semi-analfabetos ou \nportadores de deficiência auditiva ou visual) \n \n(Somente para o responsável do projeto) \nDeclaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e \nEsclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo. \n \n-------------------------------------------------------------------------  \nAssinatura do responsável pelo estudo Data         /       /        \n\nAnexos  \n  \n\t\n59\nAnexo C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Grupo \nControle \nFACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \nTERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO \n_______________________________________________________________ \nDADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL \nLEGAL \n1. NOME: .:.................................................................................................................... \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ..................................... SEXO :    .M Ƒ   F  Ƒ \nDATA NASCIMENTO: ......../......../......  \nENDEREÇO: ................................................... Nº: ..................... APTO: .................. \nBAIRRO: .............................................................. CIDADE:  .................................... \nCEP: ...................................  TELEFONE: DDD (............) ........................................ \n2.RESPONSÁVEL LEGAL ........................................................................................... \nNATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.)................................................ \nDOCUMENTO DE IDENTIDADE :....................................SEXO:  M Ƒ   F Ƒ   \nDATA NASCIMENTO.: ....../......./...... \nENDEREÇO: .................................................. Nº .................. APTO: ....................... \nBAIRRO: ........................................................ CIDADE: ............................................ \nCEP:...................................TELEFONE: DDD(............)............................................. \n___________________________________________________________________ \nDADOS SOBRE A PESQUISA \n1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA “Perfil de expressão de MicroRNAs \nem pacientes inférteis com endometriose antes e após a remoção cirúrgica do \ntecido ectópico” \n2. PESQUISADOR Executante: Eduardo Hideki Miyadahira \nPESQUISADOR Responsável : Edmund Chada Baracat \nCARGO/FUNÇÃO: Professor Titular da Disciplina de Ginecologia. \nINSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 28.085 \n3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: \nRISCO MÍNIMO X   RISCO MÉDIO Ƒ \nRISCO BAIXO Ƒ  R I S C O  M A I O R  Ƒ \n4.DURAÇÃO DA PESQUISA: 36 meses \n\nAnexos  \n  \n\t\n60\nFACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO \n1 – Desenho do estudo e objetivo(s): Essas informações estão sendo fornecidas \npara sua participação voluntária neste estudo. Sabe-se que algumas \npacientes beneficiam-se da cirurgia de remoção do tecido ectópico da \nendometriose. Dessa forma, os objetivos deste estudo são identificar \nmicroRNAs (pequenas moléculas de RNA) diferentemente expressos em \npacientes com endometriose e pacientes sem endometriose; verificar se após \na remoção cirúrgica do tecido endometrial ectópico há alteração na \nexpressão de microRNAs em pacientes com endometriose; relacionar a \nexpressão de microRNAs endometriais com as características gerais e \nreprodutivas de pacientes com ou sem endometriose. No seu caso, como não \nhá evidência clínica ou radiológica de endometriose gostaríamos de incluí-la \ndentro do grupo de comparação às pacientes com endometriose, \naproveitando a biópsia endometrial que faz parte do seu tratamento. \n2 – Descrição dos procedimentos que serão realizados: Serão executados:\t\na)  Ultrassom transvaginal com preparo intestinal e/ou ressonância \nmagnética para pesquisa de endometriose profunda. Estes exames são \npouco invasivos, com raras complicações e têm duração de \naproximadamente uma hora ambos. No caso do ultrassom, o desconforto se \ndeve somente pela via o qual é realizada, a transvaginal e não tem \ncomplicações. E, no caso da ressonância, é um exame indolor, apenas \nchama-se a atenção para as pessoas que tem claustrofobia (incômodo ao \npermanecer em lugares fechados), pois ele é realizado em uma câmara \nfechada. A complicação mais comum é a reação alérgica ao contraste \nutilizado no exame. \nb)  Biópsia endometrial através da técnica utilizada na rotina clínica, não \nhavendo, portanto, maior risco durante ou após o procedimento \ncirúrgico. Neste procedimento, iremos realizar um exame especular \nginecológico e, após visualização do colo do útero, um fino catéter é \ncolocado dentro da cavidade do útero. Por meio de vácuo, uma pequena \namostra de endométrio (camada interna do útero) é aspirada. Este pequeno \nprocedimento, não requer obrigatoriamente uma anestesia, porém pode \ncausar dor em cólica no momento que o catéter é inserido dentro da \ncavidade do útero que, geralmente, é suportável. Tem duração de \n\nAnexos  \n  \n\t\n61\naproximadamente 15 minutos. As complicações são raras e as mais comuns \nsão o falso trajeto dentro do útero e o sangramento aumentado após o \nprocedimento. \nc) Retirada de amostra de sangue por punção periférica a qual também é \nutilizada na rotina clínica. A punção de veia periférica é um pequeno \nprocedimento rápido (aproximadamente 5 minutos) e pouco doloroso. \nUtilizamos uma agulha fina para acessar o interior do vaso sanguíneo e \ncoletar amostra de sangue. A complicação mais comum é a transfixação da \nveia puncionada. \n3 – Relação dos procedimentos rotineiros e como são realizados: Ultrassom \ntransvaginal realizado por técnica convencional e por operador qualificado ou \nressonância nuclear magnética; biópsia endometrial realizada com Catéter de \nPipelle sob técnica convencional; coleta de sangue por punção periférica da \nveia do antebraço. \n4 – Descrição dos desconfortos e riscos esperados nos procedimentos: Não \nhaverá nenhum desconforto ou risco adicional durante a realização da \npesquisa já que os procedimentos fazem parte do tratamento proposto para \ndor e/ou infertilidade. \n5 – Benefícios para o participante: Não há benefício direto para o participante \nvisto que o presente estudo não tem por objetivo estabelecer novo tratamento \npara a endometriose. No entanto, o avanço na compreensão dos mecanismos \nque causam esta doença pode contribuir para a descoberta ou investigação \nde novas alternativas de tratamento. Além disso, seus dados serão mantidos \nem sigilo absoluto. \n6 – Relação de procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais \no paciente pode optar: O tratamento proposto contempla o quadro clínico de \ncada paciente, desta forma, entende-se que esta é a alternativa mais \nadequada. \n7 – Garantia de acesso: e m  q u a l q u e r  m o m e n t o  d o  e s t u d o ,  a  s e n h o r a  t e r á  \nacesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de \neventuais dúvidas. O investigador principal é o Dr. Eduardo Hideki Miyadahira \nque pode ser encontrado no endereço: Av. Dr. Enéas de Carvalho, 255, \nInstituto Central, Ginecologia, 10º andar, fone: 2661-6647 (Clínica \n\nAnexos  \n  \n\t\n62\nGinecológica). Caso tenha alguma consideração ou dúvida sobre a ética da \npesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Av. \nDr. Arnaldo, 455 – Instituto Oscar Freire – 2º andar– tel: 3061-8004, FAX: 3061-\n8004 – E-mail: cep.fm@usp.br  \n8 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e \ndeixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu \ntratamento na Instituição; \n09 – Direito de confidencialidade – As informações obtidas serão analisadas em \nconjunto com as demais pacientes, não sendo divulgada a sua identificação; \n10 – Direito de ser mantida atualizada sobre os resultados parciais e totais das \npesquisas, quando em estudos abertos, ou de resultados que sejam do \nconhecimento dos pesquisadores; \n11 – Despesas e compensações: não há despesas adicionais para o \nparticipante em qualquer fase do estudo, apenas os relacionados ao \ntratamento proposto. Também não há compensação financeira relacionada à \nsua participação. \n12 – Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou \ntratamentos propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante tem \ndireito a tratamento médico na Instituição. \n13 - Compromisso do pesquisador de armazenar as amostras coletadas em locais \nseguros e utilizá-las somente para este estudo. \n\t\nAcredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou \nque foram lidas para mim, descrevendo o estudo ” Perfil de expressão de \nMicroRNAs em pacientes inférteis com endometriose antes e após a remoção \ncirúrgica do tecido ectópico”. \n\nAnexos  \n  \n\t\n63\nEu discuti com o Dr. Eduardo Hideki Miyadahira sobre a minha decisão em \nparticipar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do \nestudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as \ngarantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro \ntambém que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do \nacesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em \nparticipar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, \nantes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer \nbenefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. \n \n-------------------------------------------------  \nAssinatura do paciente/representante \nlegal Data         /       /        \n \n-------------------------------------------------------------------------  \nAssinatura da testemunha Data         /       /        \n(para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semi-analfabetos ou \nportadores de deficiência auditiva ou visual) \n \n(Somente para o responsável do projeto) \nDeclaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e \nEsclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo. \n \n-------------------------------------------------------------------------  \nAssinatura do responsável pelo estudo Data         /       /        \n\nAnexos  \n  \n\t\n64\nAnexo D -  Ilustração auxiliar ao laudo da ultrassonografia \ntransvaginal com preparo intestinal \n \n* Cedido por Dra. Luciana Chamié \n \n\nAnexos  \n  \n\t\n65\nAnexo E - Inventário pélvico cirúrgico (relacionado ao caso do Anexo C) \n \n \n \n \n\nAnexos  \n  \n\t\n66\nAnexo F - Aspecto pós-cirúrgico (relacionado ao caso do Anexo C) \n \n \n \n \n \n\n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n \n8 Referências \n \n \n\nReferências  \n  \n\t\n68\n8 REFERÊNCIAS \n \n \n1.  Donoso E, Carvajal JA, Poblete JA. La edad de la mujer como factor \nde riesgo de mortalidad materna, fetal, neonatal e infantil. Rev Med \nChil. 2014:142(2):168-74. \n2.  Carolan M, Frankowska D. Advanced maternal age and adverse \nperinatal outcome: a review of the evidence. Midwifery. 2011;27(6): \n793-801.  \n3.  INCA. INCA - CÂNCER - Tipo - Mama. [cited 2015 Apr 3]. Available \nfrom: \nhttp://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/ma\nma/cancer_mama++ \n4.  Giudice LC. Endometriosis. N Engl J Med. 2010;362(25):2389-98. \n5.  Viganò P, Parazzini F, Somigliana E, Vercellini P. 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