Avaliação de marcadores de proliferação celular e apoptose em tecido endometrial eutópico e ectópico em modelo experimental de endometriose em coelhas

............................................................................................................................ xv 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 18 2 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 24 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 26 4 ARTIGO............................................................................................................................... 28 4.1 Introdução........................................................................................................................... 29 4.2 Material e Métodos............................................................................................................. 32 4.3 Resultados........................................................................................................................... 35 4.4 Discussão............................................................................................................................ 36 4.5 Referências Bibliográficas.................................................................................................. 41 4.6 Tabelas................................................................................................................................ 46 4.7 Figuras ................................................................................................................................ 50 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 51 6. ANEXOS ............................................................................................................................. 55 Figuras extras Aprovação do Comitê de Ética em experimentação animal da FMRP Artigo publicado do mestrado ix LISTA DE FIGURAS EXTRAS Figura 1E – ............................................................................................................................... 56 Figura 2E – ............................................................................................................................... 56 Figura 3E – ............................................................................................................................... 57 Figura 4E – ............................................................................................................................... 57 Figura 5E -................................................................................................................................ 58 Figura 6E -................................................................................................................................ 58 Figura 7E -................................................................................................................................ 59 Figura 8E -................................................................................................................................ 59 Figura 9E -................................................................................................................................ 60 Figura 10E -.............................................................................................................................. 60 Figura 11E -.............................................................................................................................. 61 Figura 12E -.............................................................................................................................. 61 x LISTA DE TABELAS Tabela 1 .................................................................................................................................... 46 Tabela 2 .................................................................................................................................... 47 Tabela 3 .................................................................................................................................... 48 Tabela 4 .................................................................................................................................... 49 xi LISTA DE ABREVIATURAS PCNA: Antígeno nuclear celular proliferativo IPC: Índice de proliferação celular IA: Índice de apoptose IHT: Índice de homeostase tecidual MMP: Metaloprotease TIMP: Inibidor tecidual de metaloprotease VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular DNA: Ácido desóxi-rubonucléico TNF: Fator de necrose tumoral HE: Hematoxilina-eosina TGF: Fator de crescimento tumoral EGF: Fator de crescimento epidermal CPI: Cell Proliferation Index AI: Apoptotic Index HTI: Homeostatic Tissue Index xii Resumo xiii RESUMO Rosa e Silva, J.C. Avaliação de marcadores de prolif eração celular e apoptose em tecido endometrial eutópico e ectópico em modelo experimental de endometriose em coelhas. 2007. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. Objetivo: Caracterizar o padrão de homeostase (p roliferação celular e apoptose) de tecido endometrial eutópico e ectópico de coelhas s ubmetidas à indução de lesões de endometriose por modelo experimental já conhecido, quatro e oito semanas após o procedimento de implantação endometrial.

e Métodos: Estudo experimental animal sendo utilizado 20 coelhas adultas Nova Zelândia, fêmeas e virgens, submetidas à laparo tomia para indução da lesão de endometriose, através da ressecção de um corno uterino e fixação no peritônio pélvico de fragmento de 5mm. As coelhas foram dividi das em dois grupos de 10 animais, sendo os animais do grupo 1, sacrificados após 4 semanas da indução da lesão endometrial ectópica e os do grupo 2 após 8 semanas. A lesão foi excisada para anális e histológica juntamente com o corno uterino contralateral, comprovando a presença de tecido endometrial glandular e estromal. Reações de imunohistoquímica foram realizadas, no tecido endometrial eutópico e ectópico, para proliferação celular através do PCNA e para apoptose através do fas, na glândula e estroma, sendo obtido o índice de proliferação celular (IP C) e de apoptose (IA) através do número de células marcadas por 1000 contadas, e o índice de homeostase tecidual através do coeficiente entre o IPC e IA. Resultados: Observou-se maior índice de prolifer ação no tecido ectópico, tanto glandular como estromal, quando comparado com o endom étrio eutópico, com 4 e 8 semanas após a xiv indução da lesão. Contudo, quando as lesões ect ópicas foram comparadas entre si, com 4 e 8 semanas, não foi observada diferença sign ificativa. Quando comparamos o índice de apoptose, observamos que não houve diferença entre o tecido ectópico e o eutópico, tanto glandular como estromal nas lesões induzidas e analisadas com 4 semanas, porém no tecido glandular das lesões analisadas com 8 sema nas houve diferença significativa entre a lesão ectópica e o tecido endometrial eutópico 0,0819 ± 0,0213 e 0,0995 ± 0,01336, respectivamente (p=0,04). A homeostase tecidu al foi calculada e obs ervou-se uma tendência destes tecidos a proliferação, sempre com índices de homeostase tecidual (IPC/IA) acima de 1. Conclusão: As lesões ectópicas parecem ter uma proliferação celular maior que o endométrio eutópico levando a uma tendência ao crescime nto tecidual descontrolado nas lesões de endometriose induzidas. Palavras-chave: endometriose experimental, prolif eração celular, apoptose, homeostase tecidual, coelha xv

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Rosa e Silva, J.C. Evaluation of cell proliferation and apoptosis markers on eutopic and ectopic endometrium in a r abbit experimental model . Thesis (Doctoral) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.

To characterize the pattern of tissue homeostasis (cell proliferation and apoptosis) of eutopic and ectopic endometrium in rabbits four and eight weeks after endometrium implantation for induction of endometriotic lesions by experimental standardized method.

Animal experimental study with 20 female, virgins and adult New Zeland rabbits, submitted to laparotomy for endometriosis induction by resection of one uterine horn, isolation of the correspondent endometrium and fixation of a 5mm tissue segment to the pelvic peritoneum. The animals were divided in two groups of 10, group 1 was sacrificed after 4 weeks of endometriosis induction and group 2 eight weeks after the procedure. The lesion was excised for later hi stological analysis toge ther with the opposite uterine horn, just to verify the pres ence of endometrial gland and stroma. Immunohistochemistry reactions were performe d in order to study cell proliferation (by PCNA technique) and apoptosis (by fas technique) in the eutopic and ectopic endometrium, and a Cell Proliferation Index (CPI) and an Ap optotic Index (AI) were calculated based on these findings, considering the number of marked cells per 1000 counted cells. The Homeostatic Tissue Index (HTI) was considered to be the relation between CPI and AI (CPI/AI). Gland and stroma were analyzed separately.

There was an increase in the CPI of the ectopic tissue, considering gland and stroma, after four and eight weeks of endometriosis induction when comparing to the eutopic one. However, when comparing the ectopic lesions, there was no difference between four and eight xvii weeks of induction. Analyzing the only the AI, there was no difference between the eutopic and the ectopic endometrium with four weeks, nevertheless there was a significant difference in the glandular tissue of the lesions with eight weeks when compar ing eutopic and ectopic tissues (0.0819 ± 0.0213 e 0.0995 ± 0.01336, respectiv ely (p=0,04)). Based on HTI there was a tendency to cell proliferation on these tissues, always with and HTI (CPI/AI) higher than 1.

Ectopic lesions seem to have a highe r cell proliferation than the eutopic endometrium, tending to present an uncontrolled tissue growth in the endometriotic inducted lesions. Key words: Experimental endometriosis, cell proliferation, apoptosis, tissue homeostasis, rabbit 1. Introdução 19 A etiopatogenia da endometriose continua controversa e várias são as teorias atuais para explicá-la, embora nenhuma dela s o faça completamente quando isolada. A mais aceita é a teoria de Sampson que aponta a presença de células endometriais viáveis no fluxo menstrual retrógrado como causador das lesõ es (Sampson, 1927), porém praticamente 90% das mulheres têm trompas pérvias (Halme et al, 1984) e apresentam fluxo retrógrado e, no entanto, a maioria não apresenta endometriose. Há também a teoria da metaplasia celômica (Suginami, 1991), e, mais recentemente, a teor ia imunológica (Chung et al, 2002; Braun et al, 2002; Witz et al, 2002 e Nogueira & Abrão, 2000). Hoje se acredi ta na confluência destas teorias para a verdadeira exp licação da etiopatogenia da endo metriose, haveria realmente um fluxo menstrual retrógrado asso ciado a uma predisposição imunológica no micro-ambiente peritonial que facilitaria o implante de células endometriais viáveis e com potencial para implantação. Alguns fatores que justificariam a predispos ição de algumas pacientes à formação de implantes de endometriose estariam re lacionadas com alterações no micro-ambiente peritonial. Já é descrito por alguns autores o provável mecanismo de invasão do tecido endometrial descamado no peritônio abdominal . A adesão entre o tecido endometrial e o peritônio ocorreria por meio das integrinas, que são receptores heterodiméricos trans- membrana de adesão celular (Witz et al, 2002). O peritônio ao qual está aderido o fragmento de endométrio teria sua matriz extracelular invadida. Acredita -se que esta invasão ocorra devido a um desequilíbrio entre enzimas de degradação de componentes da matriz extracelular e seus reguladores. As metalopr oteases (MMPs) são enzi mas zinco-dependentes como as colagenases, gelatinases e as enzimas estromais, que tem expressão mutagênica, com capacidade de promover a remodelação da matriz extracelular quando associados a seus inibidores (TIMPs- tissue inhibitors of metalloproteases ). Vários estudos têm observado um aumento na quantidade de algumas MMPs e redu ção de TIMPs produzidos pelo endométrio 20 eutópico e ectópico de pacien te com endometriose em comp aração com o endométrio de pacientes sem a doença, o que justificaria uma maior capacidade invasora deste tecido no fluxo menstrual retrógrado (Chung et al, 2002). Após a invasão pe ritonial a viabilidade do foco endometriótico seria mantida pela neo- formação vascular local desenvolvida sob estímulo de substâncias angiogênicas como o VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular). O VEGF seria produzido e secreta do no fluido peritonial por macrófagos ali presentes, e teria capacidade de promover cres cimento endotelial, aumento da permeabilidade vascular e modulação da secreção de enzima s proteolíticas relacionadas a angiogênese (Nogueira & Abrão, 2000). Há estudos descre vendo a presença de VEGF aumentado no fluido peritonial e no soro de pacientes com endometriose (Oliveira et al, 2005). A “Homeostase Tecidual” é dada por um equilíbrio entre células em proliferação e células em processo de degradação (morte cel ular programada - apoptose). Acredita-se que nestas pacientes haveria alterações nesta homeo stase tecidual dada por uma maior viabilidade das células endometriais descamadas secundárias a um aumento na capacidade de proliferação tecidual e pela diminuição dos processos de apoptose. A apoptose é um processo de morte celular programada que acontece após estímulo específico, no qual há condensação da cromatina e fragmentação do DNA, do núcleo e da célula em si, com posterior fagocitose por macrófagos. A apoptose é controlada pela proporção de BCL2 e BAX, duas proteínas intracelulares, sendo que a BCL2 tem função de bloquear a apoptose, aumentando a sobrevida da célula e a BAX tem função contra-regula dora, acelerando o processo de apoptose (Nogueira & Abrão, 2000). No endométrio, a pr oteína BCL-2 tem sua máxima expressão durante a fase proliferativ a, gradualmente diminuindo at é a fase secr etora, quando praticamente não é encontrada, coincidindo com o aumento da incidência de apoptose nessa fase do ciclo menstrual. 21 Tem sido observado um aume nto de macrófagos BCL2+ em tecido endometrial ectópico analisado por imunohistoquímica, sugerindo maior "resistência" do tecido (Nogueira & Abrão, 2000). Além disso, também tem si do descrita uma redução do número de macrófagos e de células apoptó ticas no endométrio eutópico de pacientes com endometriose quando comparado com endométrio de pacientes sem a doença, podendo justificar um aumento na viabilidade deste tecido para implantação futura (Braun et al, 2002). Mc Laren et al mediram as proteínas BCL-2 e BAX em tecido endometrial e em macrófagos de líquido peritoneal de pacientes com endometriose e concluíram que, em tecido endometrial eutópico ou ectópico, a expressão do BCL-2 acompanha o ciclo menstrual, com aumento na fase proliferativa e declínio até níveis não mensuráveis na segunda metade da fase secretora, enquanto a expressão do BAX não se altera, independente da fase do ciclo ou tecido endometrial eutópico ou ectópico. Adicionalmen te, macrófagos expressando a proteína BCL- 2 estavam presentes em número significativamen te maior em pacientes com endometriose e apresentavam variação cíclica, com declínio de seu número até próximo de valores encontrados em pacientes sem endometriose, na fase secretora. Nas pacientes sem endometriose, não houve variação cíclica destes macrófagos. Em relação aos macrófagos que expressavam proteína BAX, um número expr essivamente maior deles foi encontrado em pacientes sem endometriose, porém em ambos os grupos, sem alterações com a fase do ciclo. O estudo imunohistoquímico revelou população de macrófagos BCL-2 positivo e BAX negativo presentes apenas em tecido ectópico e ndometrial (presentes em todas as fases do ciclo, sem descrição de variações quantitativa s de acordo com a fase do ciclo). Especula-se que a expressão da proteína BCL-2 com a ausênc ia da proteína BAX pode ria conferir a estas células maior resistência a estímulos apoptótic os, aumentando a expectativa de vida destas células, ou seja, a viabilidade deste tecido. Os autores postularam ainda que, apesar de ser reconhecido que a ativação de macrófagos fr eqüentemente resulte em apoptose, a maior 22 quantidade de macrófagos BCL-2 positivos em pacientes com endometriose pode resultar em maior número de células que sobrevivam ao pr ocesso de ativação e, portanto, ser um dos mecanismos pelo qual se observa maior qua ntidade de macrófagos ativados no líquido peritoneal de pacientes com endometriose (Mc Laren et al, 1997). A apoptose pode ser regulada através da ativ ação de sinais chamados sinais de morte (“death signals”), que aumentam a expressão de proteína p53 e ativam receptores de membrana como as proteínas do sistema fas-fas ligante. O receptor fas, também chamado CD95, é uma proteína de membrana que pertence à família TNF, que está expressa em uma grande variedade de tipos celulares. Seu ligante, fasL, também é uma proteína de membrana, mais restrita a linfócitos T. A interação destas proteínas desencadeia mecanismos intracelulares que culminam com o processo de apoptose através do estímulo da enzima caspase-8 (Nagara, 1997). Alguns marcadores de proliferação celular estão sendo implicados na gênese da endometriose. O PCNA ( proliferative cell nuclear antigen ) é avaliado através de estudo imunohistoquímico e está sendo bastante estudado em neoplasias, estando relacionado a neoplasias mais indiferenciadas. Fujis hita et al., em 1999, avaliando o PCNA em endometriose mostrou maior expressão do PCNA entre lesões vermelhas, quando comparadas a lesões brancas e negras (Fujishita et al, 1999). A complexidade na fisiopatologia da e ndometriose e a heterogeneidade da doença levaram ao desenvolvimento de alguns modelo s experimentais. O achado de endometriose espontânea em 25% de animais primatas não humanos (D'Hooghe et al, 1991) com histologia e localização semelhantes às encontradas em hum anos (Cornillie et al, 1985; Clement, 1990; Cornillie, 1990; Vernon & Wils on, 1985), levou à uti lização destes animais como modelo experimental, porém sua utilização vem sendo progressivamente reduzida devido às dificuldades éticas e pela heterogeneidade da s lesões. A utilização de coelhas passa a ser uma 23 boa opção de modelo experimental, pois se ca racteriza pelo desenvolvimento de lesões homogêneas, geralmente massas sólidas hemo rrágicas, facilmente obtidas através de autotransplante de fragmentos endometriais ou abertura e exposição da cavidade endometrial (Manyak et al, 1990; Hahn et al , 1986; Rosa e Silva et al, 2004). Além disso, a escolha da coelha como animal para experimentação se deve ao baixo índice de infecção, sem necessidade de utilização de antibióticos (Schor et al, 1999) e pela ausência de ciclo estral, o que dispensa a necessidade de programação dos procedimentos de acordo com a fase do ciclo do animal. Em modelo experimental desenvolvido em nosso serviço por Rosa e Silva em 2004, o desenvolvimento das lesões após o implante do tecido endometrial foi de 100% após quatro e oito semanas, com presença de estroma e glândulas à histologia (Rosa e Silva et al, 2004), fato também relatado em outros estudos experimentais (Schor et al, 1999; Schenken & Asch, 1980). Os implantes eram bem vascularizados e bem delimitados, com incremento substancial de tamanho após oito semanas da fixação ao peritônio quando comparado com as lesões de quatro semanas. Esta facilidad e de implantação do tecido endometrial ectópico traduz a alta eficácia deste modelo experime ntal para desenvolvimento da endometriose. A utilização deste tecido para av aliação de marcadores de prol iferação tecidual e apoptose pode ser extremamente útil para identificar o padrão de comportamento destas lesões, elucidando alguns pontos na etiopatogenia da endometriose. A verdadeira correlação destes focos de tecido endometrial implantado na parede abdo minal das coelhas com a endometriose humana não é conhecida, por isso estudos comparativos são necessários para que os resultados destes experimentos possam ser extrapolados para humanos. 24 2. Justificativa 25 Sendo a endometriose uma doença de grande importância clínica e com tantos pontos obscuros em sua etiopatogenia, o desenv olvimento de modelos experimentais passa a ter papel fundamental na descoberta de características e padrões de comportamento da doença e para o desenvolvimento de novas opções terapêuticas, permitindo o teste de novas medicações. Com base em estudos anteriores que sugerem haver alterações na capacidade de proliferação e apoptose do tecido endometria l em pacientes com endometriose, o que justificaria a maior viabilidad e do tecido e o desenvolvimento dos focos de lesão peritonial, este estudo propõe a avaliação da homeostase destes tecidos através de marcadores de multiplicação celular e apoptose. 26 3. Objetivos 27 Objetivos gerais: Caracterizar o padrão de homeostase (pro liferação celular e a poptose) de tecido endometrial eutópico e ectópico de coelhas s ubmetidas à indução de lesões de endometriose por modelo experimental já conhecido, quatro e oito semanas após o procedimento de implantação endometrial. A avaliação das lesões em dois tempos tem a finalidade de verificar se existe modificação tecidual ao longo da evolução das lesões assim como se existe crescimento das mesmas. Objetivos específicos: Avaliar marcadores de proliferação cel ular e apoptose em tecido endometrial eutópico e ectópico de coelhas após quatro e oito semanas de implantação das lesões: • índice de proliferação celular através da marcação do PCNA ( proliferative cell nuclear antigen). • Índice de apoptose através da marcação do anticorpo fas. • Índice de Homeostase tecidua l, caracterizado pelo coef iciente entre o índice de proliferação celular e apoptótico. 28 4. Artigo 29 4.1 Introdução A etiopatogenia da endometriose continua controversa e várias são as teorias atuais para explicá-la, embora nenhuma dela s o faça completamente quando isolada. A mais aceita é a teoria de Sampson que aponta a presença de células endometriais viáveis no fluxo menstrual retrógrado como causador das lesõ es (Sampson, 1927), porém praticamente 90% das mulheres têm trompas pérvias (Halme et al, 1984) e apresentam fluxo retrógrado e, no entanto, a maioria não apresenta endometriose. Há também a teoria da metaplasia celômica (Suginami, 1991), e, mais recentemente, a teor ia imunológica (Chung et al, 2002; Braun et al, 2002; Witz et al, 2002 e Nogueira & Abrão, 2000). Hoje se acredi ta na confluência destas teorias para a verdadeira exp licação da etiopatogenia da endo metriose, haveria realmente um fluxo menstrual retrógrado asso ciado a uma predisposição imunológica no micro-ambiente peritonial que facilitaria o implante de células endometriais viáveis e com potencial para implantação. A “Homeostase Tecidual” é dada por um equilíbrio entre células em proliferação e células em processo de degradação (morte cel ular programada - apoptose). Acredita-se que nestas pacientes haveriam alterações nest a homeostase tecidual dada por uma maior viabilidade das células endometriais descamadas secundárias a um aumento na capacidade de proliferação tecidual e pela diminuição dos processos de apoptose. A apoptose pode ser regulada através da ativ ação de sinais chamados sinais de morte (“death signals”)., que aumentam a expressão de proteína p53 e ativam receptores de membrana como as proteínas do sistema fas-fas ligante. O receptor fas, também chamado CD95, é uma proteína de membrana que pertence à família TNF, que está expressa em uma grande variedade de tipos celulares. Seu ligante, fasL, também é uma proteína de membrana, mais restrita a linfócitos T. A interação destas proteínas desencadeia mecanismos 30 intracelulares que culminam com o processo de apoptose através do estímulo da enzima caspase-8 (Nagara, 1997). Alguns marcadores de proliferação celular estão sendo implicados na gênese da endometriose. O PCNA ( proliferative cell nuclear antigen ) é avaliado através de estudo imunohistoquímico e está sendo bastante estudado em neoplasias, estando relacionado a neoplasias mais indiferenciadas. Estudos avaliando o PCNA em endo metriose ainda são escassos, mas um estudo de Fujishita, em 1999, mostrou maior expressão do PCNA entre lesões vermelhas, quando comparadas a lesões brancas e negras (Fujishita et al, 1999). A complexidade na fisiopatologia da e ndometriose e a heterogeneidade da doença levaram ao desenvolvimento de alguns modelos experimentais. A utilização de coelhas passa a ser uma boa opção de modelo experimental , pois se caracteriza pelo desenvolvimento de lesões homogêneas, geralmente massas sólidas hemorrágicas, facilmente obtidas através de autotransplante de fragmentos endometriais ou abertura e exposição da cavidade endometrial (Manyak et al, 1990; Hahn et al , 1986; Rosa e Silva et al, 2004). Além disso, a escolha da coelha como animal para experimentação se deve ao baixo índice de infecção, sem necessidade de utilização de antibióticos (Schor et al, 1999) e pela ausência de ciclo estral, o que dispensa a necessidade de programação dos procedimentos de acordo com a fase do ciclo do animal. Em modelo experimental desenvolvido em nosso serviço por Rosa e Silva em 2004, o desenvolvimento das lesões após o implante do tecido endometrial foi de 100% após quatro e oito semanas, com presença de estroma e glândulas à histologia (Rosa e Silva et al, 2004), fato também relatado em outros estudos experimentais (Schor et al, 1999; Schenken & Asch, 1980). Os implantes eram bem vascularizados e bem delimitados, com incremento substancial de tamanho após oito semanas da fixação ao peritônio quando comparado com as lesões de quatro semanas. Esta facilidad e de implantação do tecido endometrial ectópico 31 traduz a alta eficácia deste modelo experime ntal para desenvolvimento da endometriose. A utilização deste tecido para av aliação de marcadores de prol iferação tecidual e apoptose pode ser extremamente útil para identificar o padrão de comportamento destas lesões, elucidando alguns pontos na etiopatogenia da endometriose. A verdadeira correlação destes focos de tecido endometrial implantado na parede da s coelhas com a endometriose humana não é conhecida, por isso estudos comparativos são necessários para que os resultados destes experimentos possam ser extrapolados para humanos. Este estudo tem por objetivo caracterizar o padrão de homeostase (proliferação celular e apoptose) de tecido endometrial eutópico e ectópico de coelhas submetidas à indução de lesões de endometriose por modelo experime ntal já conhecido, quatro e oito semanas após o procedimento de implantação endometrial. A avaliação das lesões em dois tempos tem a finalidade de verificar se existe modificação te cidual ao longo da evolução das lesões assim como existe crescimento das mesmas. 32 4.2 Material e Métodos 1. Animais: o estudo foi realizado no setor de cirurgia experimental do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto e no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, laboratório de Oncopatologia. Foram utilizadas 20 coelhas adultas Nova Zelândia, fêmeas, virgens do biotério da Faculdade de Medicina de Ribe irão Preto. As coelhas foram ma ntidas em gaiolas apropriadas sob controle de temperatura, umidade e lumi nosidade do ambiente por três dias antes da indução das lesões cirurgicamente e alimentadas com água e ração ad libitum. Todas foram submetidas à laparotomia para indução da lesão de endometriose, após anestesia geral endovenosa com 3ml de tionembutal associado a 1ml de xilestasina. O procedimento foi realizado com todos os cuidados de anti-sepsia e sempre pelo mesmo pesquisador. 2. Técnica de indução das lesões de endometriose: a abertura da cavidade pélvica foi realizada com incisão longitudinal median a de aproximadamente 2cm, a 2 cm do púbis do animal. Posteriormente foi ressecado cerca de 4 cm do corno uterino direito seguido de seu fechamento. A porção uterina ressecada foi imersa em soro fisiológico 0,9% a 4°C por cerca de 2 minutos e então incisada longitudinalmen te, sendo retirado um fragmento de 5 x 5mm. Este fragmento de tecido endometrial foi sutu rado ao peritônio próximo ao trato reprodutivo da coelha utilizando-se o fio Vi cryl 6.0 com a face endometrial liv re voltada para a cavidade abdominal, com posterior fechamento da incisão cirúrgica abdominal. Nenhuma suplementação hormonal foi administrada antes ou após a laparotomia. 3. Obtenção das lesões para análise histológica: as coelhas foram divididas em dois grupos de 10 animais, sendo os animais do grupo 1, sacrificados após 4 semanas da indução da lesão endometrial ectópica e os do grupo 2 após 8 semanas. A lesão foi excisada para análise histológica juntamente com o corno uterino esquerdo (contralateral) (Figuras 1E e 2E). Os tecidos retirados foram fixados em formol 10%, processados para inclusão em parafina e 33 corados por hematoxilina e eosina (HE) para análise histológica comprovando a presença de tecido endometrial glandular e estromal (Figura 3E e 4E). 4. Técnicas de imunohistoquímica: as reações de imunohistoquímica foram realizadas nos cortes histológicos com 4 a 5µ m através de reação antígeno-anticorpo seguida de revelação da reação com marcador visível ao microscópio. As lâminas desparafinadas e hidratadas foram recuperadas antigenicamente através de incubação em panela a vapor em meio tamponado por 40 minutos. Após resfriamen to do material, as peroxidases teciduais endógenas foram removidas pela adição de peróxido de hidrogênio e ligações inespecíficas do anticorpo primário foram evitadas por adição de soro de cavalo. As lâminas foram então incubadas com anticorpo primário por 12 horas em câmara úmida. Em seguida, houve a incubação com anticorpo secundário e, por último, a etapa avidina-biotina. A reação foi identificada após a revelação por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc., USA) por cinco minutos e contra coloração com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lâminas. 5. Quantificação da proliferação celular: na avaliação do PCNA, que apresenta marcação nuclear, utilizamos método quantitativo, com contagem de células marcadas pela imunohistoquímica em 1000 células contadas na lâmina, procurando contar células nos quatro quadrantes de cada lâmina. Com ba se neste cálculo, obtivemos o Índice de Proliferação Celular (IPC): número de células marcadas pa ra o PCNA em 1000 células contadas, tanto no tecido glandular como estromal, que foram anal isadas separadamente (Figuras 5E, 6E, 7E e 8E). 6. Quantificação da apoptose: na avaliação do fas, que apresenta marcação citoplasmática, utilizamos o mesmo método quan titativo e obtivemos o Índice de apoptose (IA) tanto glandular como estromal (Figuras 9E, 10E, 11E e 12E). 7. Índice de Homeostase tecidual: caracterizado pelo coeficiente entre o índice de proliferação celular e apoptótico. 34 8. Análise estatística: foi realizada através da util ização do software GraphPad Prism® 2.01 32 Bit Executable (GraphPad Softwa re Inc., San Diego, CA, EUA), utilizando- se Teste t pareado e considerando-se nível de significância de 5%. Todas as lâminas foram analisadas por dois patologistas com experiência em imunohistoquímica, sem identificação do tipo de tecido analisado. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. 35 4.3 Resultados Observou-se maior índice de proliferação no tecido ectópico, tanto glandular como estromal, quando comparado com o endométrio eu tópico, com 4 e 8 semanas após a indução da lesão (Tabela 1). Contudo, quando as lesões ectópicas foram comparadas entre si, com 4 e 8 semanas, não foi observada diferença significativa (Tabela 2). Quando comparamos o índice de apoptose, observamos que não houve diferença entre o tecido ectópico e o eutópico, tanto glandular como estromal nas lesões induzidas e analisadas com 4 semanas (Tabela 3), porém no tecido gla ndular das lesões analisadas com 8 semanas houve diferença significativa entre a lesão ectópica e o t ecido endometrial eutópico 0,0819 ± 0,0213 e 0,0995 ± 0,0133, respectivamente (p=0,002) (Tabela 3). Ao compararmos os índices apoptóticos das lesões ectópicas de 4 e 8 sema nas, observamos que tanto no tecido glandular como estromal houve mais apoptose no grupo de lesões analisadas com 4 semanas (Tabela 2). A homeostase tecidual foi calculada e obser vou-se uma tendência destes tecidos a proliferação, sempre com índices de homeostase tecidual (IPC/IA) acima de 1. A análise comparativa entre os tecidos mostrou que o tecido ectópico tem uma tendência maior a proliferação que o tecido eutópico, tanto estr omal quanto glandular (Tabela 4). Contudo a comparação entre a homeostase tecidual da glândula entre 4 e 8 semanas não mostrou-se diferente significativamente (Tabela 2), ao co ntrário, no estroma houve diferença entre as lesões analisadas com 4 e 8 semanas (Tabela 2). 36 4.4 Discussão Os padrões de proliferação celular e apoptose no endomét rio eutópico de pacientes normais sofrem variações ao longo do ciclo. A pr oliferação do tecido glandular da camada funcional do endométrio tem um padrão cíc lico, com proliferação máxima na fase proliferativa tardia, com decréscimo importante ao longo da fase secretora, até praticamente ausente na fase menstrual. O tecido estromal , ao contrário, apre senta dois picos de proliferação celular, um na fase proliferativa e outro na fase pré-menstrual. Este mesmo padrão é mantido em mulheres com endometrios e, tanto no tecido glan dular quanto estromal, quando consideramos o tecido endometrial eutópi co (Li et al, 1993; Wi ngfield et al, 1995; Jurgensen et al, 1996; Nisolle & Donnez, 1997; Beliard et al, 2004). Entretanto, os focos ectópicos de tecido parecem perder esta ciclic idade (Jones et al, 1995; Nisolle et al, 1997; Scotti et al, 2000; Beliard et al, 2004). No desenvolvimento de ste modelo experimental em coelhas, um dos fatores considerados foi a ausê ncia de ciclo estral nestes animais, o que facilitaria a padronização da técnica, permitindo que o procedimento fosse realizado em qualquer época e mantendo uma característica de similaridade com o tecido endometrial ectópico. A teoria de Sampson do fluxo menstrual re trógrado justifica a presença do tecido endometrial na cavidade pélvica (Sampson, 1927). Entretanto, cerca de 90% das mulheres têm trompas pérvias (Halme et al, 1984) e aprese ntam fluxo menstrual retrógrado, sem no entanto desenvolverem endometriose. Complementando a et iopatogenia da doença, inúmeros estudos vêm demonstrando uma maior viabilidade deste tecido refluído naquelas pacientes portadoras da doença. Gebel et al, verifi caram que existe uma diminuição da susceptibilidade à apoptose espontânea no endométrio eutópico de pacientes com endometriose (Gebel et al, 1998), dados estes que foram corroborados por Meresman et al, em 2000 (Meresman et al, 2000). Além disso, a capacidade de proliferação celular ta mbém se encontra aumentada no endométrio 37 eutópico de pacientes com endometriose qu ando comparado a pacientes do grupo controle, em parte secundário à diminuição das concen trações de TGF beta, um regulador de proliferação e diferenciação das células endometriais. Nas células de linhagem epitelial o TGF beta mantém a homeostase tecidual limitando seu crescimento através da supressão de fatores de crescimento promotores de transcrição, co mo o cMyc, um proto-onc ongene, que no tecido endometrial das pacientes com endometriose encontra-se aumentado (Johnson et al, 2005). Este aumento na proliferação celular e redução de apoptose descrito para o endométrio eutópico de pacientes com endometr iose se mantêm no comportamento do tecido ectópico, inclusive de maneira mais proeminente. Como já mencionado, as lesões perdem sua ciclicidade (Jones et al, 1995; Ni solle et al, 1997; Scotti et al, 2000; Beliard et al, 2004) e mantém índices de proliferaç ão celular aumentado (Li et al, 1993). Em nosso estudo verificamos um aumento da capacidade pr oliferativa do teci do implantado quando o comparamos ao tecido eutópico, independente do tempo de duração do implante, mostrando um padrão de comportamento semelhante ao das lesões endometrióticas humanas. Estas alterações foram verificadas tanto para o componente glandular quanto estromal do tecido ectópico. Como a origem do implante é a mesma do tecido eutópico, acreditamos que a exposição do tecido implantado ao micro-ambiente peritoneal promoveu alterações locais que culminaram com o desbalanço na homeostase tecidual. Na composição do fluido peritoneal humano encontramos a presença de substâncias inflamatórias, mesmo em situações normais, livre de doença, apesar de níveis menos elevad os que no fluido perito neal de pacientes com endometriose (Kats et al, 2002; Akoum et al, in press). Em pacientes com endometriose já é bem documentada a presença aumentada de substâncias inflamatórias e fatores de cresci mento no fluido peritone al (Kats et al, 2002; 38 Akoum et al, in press), bem como o aumento da concentração de macrófagos peritoneais, com aumento da atividade dos fagócitos mononuclear es (Oral & Arici, 1 997). Este efeito foi demonstrado através de medidas de biossíntese de citocinas, metabolismo oxidativo e funções de citotoxicidade (Zeller et al, 1987; Braun DP et al, 1992; Taketani et al, 1992 e Braun DP et at, 1996). Braun et al, utilizando cultivo de cé lulas endometriais de pacientes com e sem endometriose, acrescentando fluido peritoneal autólogo ou heteró logo entre os grupos, verificaram que em pacientes com endometriose o acréscimo de fluido peritoneal autólogo promovia aumento da proliferação celular, enquanto que o fluido de pacientes férteis controles produzia redução na proliferação. Em contrapartida em cultura de células endometriais de pacientes férteis normais, independente do fluido acrescentado, não houve variação do índice de proliferação celular. Portanto, o aumento da capacidade de proliferação do tecido em pacientes com endometriose está re lacionado não só a alterações específicas do endométrio, mas também à mudanças no micro-ambiente peritoneal (Braun et al, 2002). Com o intuito de verificar o impacto de diversos mediadores inflamatórios secretados por macrófagos sobre a proliferação celular em cultivo de células estromais de endométrio humano, Hammond et al verificaram a existência de uma resposta pró- proliferativa dose-dependente destas células in vitro. Diversos fatores foram testados, como o fator de crescimento epidermal (EGF), o fator de crescimento tumoral alfa (TGF-α), o fator de crescimento tumoral beta (TGF- β) e o fator de crescimento de fibroblastos (Hammond et al, 1993). A presença de uma maior população de macr ófagos ativados na cavidade pélvica de pacientes com endometriose promove o au mento de secreção destes mediadores, provavelmente tendo papel importante na etiopatogenia de doença. Em relação à apoptose, neste estudo, não foi observada diferença entre os tecidos eutópicos e ectópicos nos implantes de 4 semana s, tanto para estroma como para o tecido glandular. Em contrapartida, após 8 semanas de implante o tecido glandular apresentou maior 39 índice de apoptose quando comparado ao endométr io eutópico. Este ac hado talvez possa ser explicado pelo maior tempo de exposição do tecido implantado ao fluido peritoneal, o que promoveu mudança na homeostase do tecido. Em consonância com o que ocorre no tecido ectópico das lesões de endometriose a apoptose espontânea passa a estar supressa (Gebel et al, 1998; Meresman et al, 2000; Szymanowski et al, 2006). O tecido es tromal não sofreu modificações em relação aos índices de apoptose após 8 semanas. De qualquer maneira, no cômputo geral, o índice de homeostase tecidual (IPC/IA) apresentou uma tendência dos implantes à pro liferação celular, com IHT maiores que 1 em ambos os componentes histológicos: glândula e estroma. A teoria inflamatória, uma das teorias para a etiopatogenia da endometriose, propõe que um ambiente peritoneal pró-inflamatório propiciaria o implante do tecido menstrual refluído no peritônio pélvico (Chung et al, 200 2). Em compensação, a própria presença do implante poderia promover uma agressão local co m conseqüente recrutamento de macrófagos pélvicos (Oral & Arici, 1997) e ativação de fibr oblastos peritoneais (Buckley et al, 2001), os quais levam a secreção de substâncias inflamatór ias, gerando assim um círculo vicioso . Este estudo vem de encontro à estas dúvidas, os dados aqui verificados indicam que realmente existe um papel ambiental promovendo um a mudança no comportamento do tecido endometrial e permitindo a formação das lesões de endometriose. Todavia, não podemos afirmar que esta transformação se deva à pr esença de substâncias inflamatórias no fluido peritoneal, visto que este não foi o objeti vo deste estudo e portanto seu desenho não nos permite tirar tal conclusão. A boa reprodutibilidade e eficácia do mode lo experimental proposto em coelhas já havia sido confirmada em estudos anteriores (Schor et al, 1999; Rosa e Silva et al, 2004), embora o comportamento histológico das le sões não houvesse sido estudado. Aqui foi 40 possível caracterizar o padrão de prolifer ação celular e apoptose do tecido implantado e verificar que o comportamento das lesões em termos de homeostase tecidual é semelhante àquele encontrado no tecido eutópico e ectópico de portadoras de endometriose. Portanto, este modelo experimental de endometriose reproduz satisfatoriamente a endometriose humana e pode ser utilizado para testes terapêuticos com diferentes cl asses de droga, com resultados bastante compatíveis com a realidade clínica. 41 4.5 Referências • Akoum A, Al-Akoum M, Le may A, Maheux R, Leboeuf M. Imbalance in the peritoneal levels of interleukin 1 and its decoy inhibitory receptor type II in endometriosis women with infertility and pelvic pain. 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Comparação entre IPC, IA e IHT nas di ferentes estruturas hi stológicas após 4 e 8 semanas: 4 semanas Média ± SD 8 semanas Média ± SD p IPC Glândula 0.2505 ± 0.0452 0.2210 ± 0.0368 0.127 IPC Estroma 0.2026 ± 0.0553 0.2010 ± 0.0359 0.939 IA Glândula 0.1182 ± 0.0379 0.0819 ± 0.0213 0.049 IA Estroma 0.1291 ± 0.0356 0.0921 ± 0.0184 0.0049 IHT Glândula 2.311 ± 0.826 2.935 ± 1.141 0.184 IHT Estroma 1.681 ± 0.608 2.328 ± 0.855 0.0159 IPC= Índice de proliferação celular; IA= Índice de apoptose; Índice de homeostase tecidual 48 Tabela 3. Índice de Apoptose nas diferentes estruturas histológicas após 4 e 8 semanas: IA Ectópico Média ± SD Eutópico Média ± SD p Glândula 4 sem 0.1182 ± 0.0379 0.1132 ± 0.0162 0.589 Estroma 4 sem 0.1291 ± 0.0356 0.1272 ± 0.0374 0.707 Glândula 8 sem 0.0819 ± 0.0213 0.0995 ± 0.0133 0.002 Estroma 8 sem 0.0921 ± 0.0184 0.0959 ± 0.0156 0.393 IA= Índice de Apoptose 49 Tabela 4. Índice de Homeostase Tecidual (IPC/IA) nas diferentes estruturas histológicas após 4 e 8 semanas: IHT Ectópico Média ± SD Eutópico Média ± SD p Glândula 4 sem 2.311 ± 0.826 1.659 ± 0.534 0.0043 Estroma 4 sem 1.681 ± 0.608 1.262 ± 0.569 0.0181 Glândula 8 sem 2.935 ± 1.141 1.749 ± 0.486 0.0027 Estroma 8 sem 2.328 ± 0.855 1.750 ± 0.500 0.0029 IHT= Índice de Homeostase Tecidual (IPC/IA) 50 4.7 Figuras Figura 1. Marcação pelo PCNA em endométrio ectópico Figura 2. Marcação pelo fas em endométrio ectópica 51 5. Referências Bibliográficas 52 • Braun DP, Ding J, Shen J, Rana N, Fernandez BB, Dmowski WP. Relationship between apoptosis and the number of m acrophages in eutopic endometrium from women with and without endometriosis. Fertil Steril 2002; 78(4): 830-835. • Chung HW, Lee JY, Moon HS, Hur SE, Pa rk MH, Wen Y, Polan ML. Matrix metalloproteinase-2, membranous type 1 matrix metalloproteinase, and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expr ession in ectopic and eutopic endometrium. 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As referências bibliográficas foram normatizadas de acordo com: International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver Style) . Updated Oct 2001: http://www.icmje.org/index.html. 55 6. Anexos 56 Figuras extras Figura 1E. Lesão macroscópica após 4 semanas da indução: Figura 2E. Lesão macroscópica após 8 semanas da indução: 57 Figura 3E. Lesão microscópica após 4 semanas da indução: Figura 4E. Lesão microscópica após 8 semanas da indução: 58 Figura 5E. Marcação pelo PCNA em lesão ectópica com 4 semanas de evolução: Figura 1 e 6E. Marcação pelo PCNA em lesão ectópica com 8 semanas de evolução: 59 Figura 7E. Controle positivo da marcação pelo PCNA: Figura 8E. Controle negativo da marcação pelo PCNA: 60 Figura 2 e 9E. Marcação pelo fas em lesão ectópica com 4 semanas de evolução: Figura 10E. Marcação pelo fas em lesão ectópica com 8 semanas de evolução: 61 Figura 11E. Controle positivo da marcação pelo fas: Figura 12E. Controle negativo da marcação pelo fas: 715RBGO - v. 26, nº 9, 2004 Trabalhos Originais 26 (9): 715-719, 2004RBGO Modelo Experimental para Endometriose em Coelhas com Seguimento Evolutivo das Lesões Experimental Endometriosis Model in Rabbits with Follow-up of the Lesions Julio César Rosa e Silva 1, Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva 1, Pedro Soler Coltro1, Sérgio Britto Garcia 2, Francisco Cândido dos Reis 1, Antônio Alberto Nogueira 1 1Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP2Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP Correspondência: Antônio Alberto Nogueira Departamento de Ginecologia e Obstetrícia Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo Av. Bandeirantes, 3900 – Campus da USP 14049-900 – Ribeirão Preto – SP Introdução A endometriose é, atualmente, uma das doen- ças ginecológicas mais estudadas. Sua incidên- cia é variável de acordo com a população analisa- RESUMO Objetivos: desenvolvimento de modelo experimental de endometriose em coelhas avaliando a evolução temporal da doença macro e microscopicamente. Métodos: foram utilizadas 30 coelhas nas quais induziu-se lesão de endometriose por fixação de fragmento do corno uterino no peritônio da parede pélvica. Após 4 ou 8 semanas verificou-se a viabilidade da lesão por laparoscopia. Foi documentado o aspecto visual endoscópico e feita avaliação anatomopatológica. Os grupos foram comparados quanto à presença de lesão visual à laparoscopia, seu maior diâmetro, presença de aderências e histologia da mesma. Na análise estatística foram utilizados os testes t de Student e de Mann- Whitney, com significância estatística de 5%. Resultados: em todos os casos foi identificada a presença de lesão visual à laparoscopia após 4 semanas, sendo 64% císticas, e em 80% dos casos após 8 semanas, 66% císticas. As aderências estavam presentes em 71% das coelhas após 4 semanas (sendo ausentes nos implantes) e em 80% das coelhas após 8 semanas (13% nos implantes). O diâmetro das lesões após 8 semanas de implante foi maior que após 4 semanas (p<0,0001). A análise histológica mostrou 100% de tecido endometrial (glândula e estroma) em atividade nos 2 grupos. Conclusão: a utilização desse modelo experimental de endometriose em coelhas mostrou ser possível reproduzir a doença nesse animal, sendo viável e de fácil execução. Permitiu documentar as características e a progressão dos implantes, o crescimento e o desenvolvimento histopatológico. Embora com mesmo aspecto histológico, as lesões após oito semanas foram maiores que após 4 semanas da implantação. PALAVRAS-CHAVE: Endometriose. Endometriose: modelo experimental. Laparoscopia. da, desde 2 a 7,5% em pacientes assintomáticas submetidas à laqueadura tubária 1,2 até 50% nas pacientes com dor pélvica associada à infertilida- de3. Caracteriza-se pela presença de tecido endometrial, seja ele glandular ou estromal, fora da cavidade uterina 4. As lesões de endometriose podem ter aspectos variáveis, podendo ser classi- ficadas em típicas e atípicas. As lesões típicas são as negras e as atípicas as vesiculares, brancas, vermelhas e marrons. Alguns autores defendem a teoria de que estas seriam manifestações evolutivas de doença progressiva 5,6. A etiopatogenia da endometriose continua controversa e várias são as teorias atuais para explicá-la, embora nenhuma delas o faça comple- tamente quando isolada. A mais aceita é a teoria 716 RBGO - v. 26, nº 9, 2004 de Sampson4, que aponta a presença de células endometriais viáveis no fluxo menstrual retrógra- do como causador das lesões. No entanto, pratica- mente 90% das mulheres têm trompas pérvias e apresentam fluxo menstrual retrógrado7 e a maio- ria não apresentará endometriose. Há também a teoria da metaplasia celômica 8 e, mais recente- mente, a teoria imunológica 9-11. Hoje se acredita na confluência destas teorias para a explicação da etiopatogenia da endometriose. Haveria realmen- te fluxo menstrual retrógrado associado a predispo- sição imunológica no microambiente peritoneal que facilitaria o implante de células endometriais viáveis e com potencial para implantação. A complexidade na sua fisiopatologia e a heterogeneidade da doença em humanos faz da endometriose uma das doenças mais estudadas da atualidade. Para facilitar estes estudos alguns modelos experimentais vêm sendo propostos. O achado de endometriose espontânea em 25% de animais primatas não humanos 12 com histologia e localização semelhantes às encontradas em humanos3,13-15 levou à utilização destes animais como modelo experimental, porém sua utilização vem sendo progressivamente reduzida devido às dificuldades éticas e pela heterogeneidade das le- sões. As ratas seriam modelos experimentais bem mais acessíveis com lesões homogêneas e mane- jo fácil16, mas o pequeno porte do animal dificulta a abordagem cirúrgica com material laparoscópi- co. Assim, a utilização de coelhas passa a ser boa opção de modelo experimental, pois apresenta bai- xo índice de infecção, sem necessidade, portanto, de utilização de antibióticos17. O porte do animal facilita o acesso por vídeo-laparoscopia se compa- rado com ratas, e a ausência de ciclo estral dis- pensa a necessidade de programação dos procedi- mentos de acordo com a fase do ciclo do animal. Além disso, apresentam lesões homogêneas, ge- ralmente massas sólidas hemorrágicas, facilmen- te obtidas por meio de autotransplante de fragmen- tos endometriais ou abertura e exposição da cavi- dade endometrial18. A opção pela técnica cirúrgi- ca de colocação do implante na parede abdominal foi feita pela necessidade de visualização fácil da lesão à laparoscopia. A padronização e validação de técnica facil- mente reprodutível tornam-se extremamente im- portantes para o desenvolvimento deste tipo de pesquisa, permitindo simular novas propostas diagnósticas e terapêuticas para a abordagem des- ta doença. Não encontramos na literatura nenhu- ma descrição de modelo experimental para endo- metriose em coelhas com seguimento evolutivo das lesões utilizando-se da técnica laparoscópica e acreditamos ser este um modelo prático, que permitiria caracterizar e documentar as lesões induzidas com baixas taxas de aderências pélvicas por ser método pouco invasivo. A proposta deste estudo é de produzir lesões endometrióticas com o emprego de laparotomia e realizar o seguimento evolutivo da lesão por videolaparoscopia e estudo histológico comparativo das lesões com quatro e oito semanas após o implante. Materiais e Métodos Trata-se de estudo experimental realizado no setor de cirurgia experimental do Hospital das Clínicas do Departamento de Cirurgia e Anatomia e no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Foram utilizadas 30 coelhas adultas Nova Zelândia, fêmeas, virgens, com peso aproximado de 2,5 kg. As coelhas foram mantidas em gaiolas apropriadas sob controle de temperatura, umida- de e luminosidade do ambiente por três dias an- tes da indução cirúrgica das lesões, alimentadas com água e ração ad libitum. As coelhas eram pe- sadas no dia do procedimento inicial. Todas foram submetidas a laparotomia para indução da lesão de endometriose, após anestesia geral endovenosa com 3 mL de tionembutal as- sociado a 1 mL de xilestasina. Procedeu-se à tricotomia da parede abdominal dos animais, se- guida dos cuidados de anti-sepsia. As luvas de látex foram lavadas com soro fisiológico 0,9% exaustivamente para redução da formação de aderências e o mesmo pesquisador realizou to- dos os procedimentos. A abertura da cavidade pélvica foi realizada com incisão longitudinal mediana de aproxima- damente 2 cm, iniciando 2 cm cranialmente ao púbis do animal. Posteriormente foi ressecado segmento de cerca de 4 cm do corno uterino direi- to, seguido de seu fechamento. A porção uterina ressecada foi imersa em soro fisiológico 0,9% a 4ºC por cerca de 2 minutos e então incisada lon- gitudinalmente, sendo retirado fragmento de 5 por 5 mm. Este fragmento de tecido endometrial foi suturado ao peritônio próximo ao trato reprodutivo da coelha, utilizando-se fio Vicryl 6.0, com a face endometrial livre voltada para a cavidade abdomi- nal, com posterior fechamento da incisão cirúrgi- ca abdominal. Nenhuma suplementação hormonal foi administrada antes ou após a laparotomia. As coelhas foram divididas em dois grupos, sendo o primeiro denominado grupo 8 semanas, constituído de 15 animais, que foram submetidos a laparoscopia diagnóstica para pesquisa de lesões de endometriose, documentação da lesão por meio de vídeo e medida da lesão após oito semanas de sua indução. O outro grupo, chamado grupo 4 se- manas, também composto de 15 animais, foi sub- metido aos mesmos procedimentos porém somen- te após quatro semanas de seguimento. A EndometrioseSilva et al 717RBGO - v. 26, nº 9, 2004 laparoscopia foi realizada utilizando-se óptica de 6 mm e 30° e trocarte de 7 mm. Após incisão lon- gitudinal na pele e tecido subcutâneo de 7,0 mm, sobre a linha mediana e 6,0 cm abaixo do esterno, foi introduzido de maneira direta um trocarte de 7 mm. Procedeu-se à insuflação de gás CO2 com flu- xo constante de um litro por minuto e pressão máxima de aproximadamente 3 mmHg e realiza- da a inspeção da cavidade abdômino-pélvica, com registro das imagens por meio de vídeo super VHS. Após a inspeção pélvica, identificação e documen- tação da lesão, as coelhas foram sacrificadas e a lesão foi excisada para análise histológica. Os te- cidos retirados foram fixados em formol 10%, pro- cessados para inclusão em parafina e corados por hematoxilina e eosina (HE). Os grupos foram analisados quanto ao peso médio das coelhas, ganho de peso total ao longo do seguimento e tempo cirúrgico da laparotomia du- rante indução da lesão endometriótica para homogeneização das amostras e padronização para posterior comparação. A análise estatística utili- zou o programa GraphPad Prism  2.01 32 Bit Executable (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA), utilizando-se o teste estatístico t de Student para as variáveis peso e tempo de cirur- gia, que seguiram padrão de distribuição normal sem diferença à análise de variância. O teste de Mann-Whitney foi empregado para a comparação do ganho de peso ao longo de seguimento, pois esta variável não apresentou distribuição gaussiana. Os grupos foram então comparados quanto ao as- pecto visual da lesão e tamanho da mesma; para esta comparação foi utilizado o teste de Mann- Whitney, apesar da distribuição normal, já que os grupos apresentavam variâncias diferentes. Con- siderou-se o nível de significância de 5%. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo. Resultados Os grupos apresentaram-se homogêneos quanto ao peso no início do experimento e ganho de peso ao longo do seguimento. O peso inicial foi de 2493,0±231,4 g no grupo 8 semanas e de 2453,0±269,6 g no grupo 4 semanas, com p=0,66, e o ganho de peso foi de 440,0±284,9 g e de 293,3±301,1 g para os grupos 8 e 4 semanas, res- pectivamente (p=0,18). O tempo cirúrgico médio da realização da laparotomia para indução da endo- metriose, no grupo 8 semanas, foi de 18,6 minutos e no grupo 4 semanas, de 16,0 minutos (p=0,02). Na comparação entre os achados cirúrgicos da videolaparoscopia verificamos que a lesão foi visualizada em 80% das coelhas do grupo 8 sema- nas e em 100% do grupo 4 semanas, embora após o sacrifício do animal e exploração do peritônio via aberta tenham sido encontradas lesões em todos os animais, de ambos os grupos. Das lesões visí- veis na laparoscopia, 66% foram caracterizadas como de aspecto cístico no grupo 8 semanas, se- melhante ao achado do grupo 4 semanas, em que este aspecto foi descrito em 64% das lesões. As aderências estavam presentes em 71% das coelhas após 4 semanas, porém em locais dis- tintos dos implantes endometriais, e em 80% das coelhas após 8 semanas, sendo 13% no local dos implantes. Na avaliação da medida das lesões encon- tramos diferença significante entre os dois gru- pos, sendo maiores as lesões após 8 semanas de seguimento. A média do maior diâmetro das le- sões do grupo 8 semanas foi de 1,82±0,73 cm (va- riando de 0,7 a 3,5 cm) e do grupo 4 semanas, de 0,96±0,17 cm (variando de 0,7 a 1,3 cm) (p<0,0001) (Figura 1). A análise histológica mostrou que todas as amostras eram compostas de tecido endometrial (glândula e estroma) em atividade nos dois gru- pos, com características morfológicas similares entre eles. As lesões caracterizaram-se por cistos de paredes finas localizados sobre a musculatura estriada da parede abdominal, projetando-se para a cavidade abdominal. A parede destes cistos era formada por camada delgada de tecido conjuntivo, rica em células e revestida por epitélio pavimen- toso simples. O estroma era rico em fibroblastos e apresentava alguns macrófagos e eosinófilos, além de grande quantidade de glândulas endometriais típicas. Portanto, o tecido da lesão de endometrio- se não sofreu alterações em sua composição e arquitetura ao longo do tempo, porém apresentou aumento de suas dimensões. Figura 1 - Distribuição dos diâmetros das lesões das coelhas de acordo com o período de avaliação. EndometrioseSilva et al 718 RBGO - v. 26, nº 9, 2004

Purpose: development of a new experimental model of endometriosis induction in rabbits evaluating its temporal evolution both macro-and microscopically.

thirty female rabbits were submitted to endometriosis induction through the fixation of a piece of the left uterine horn to the abdominal peritoneum. After four or eight weeks the viability of the lesions was verified by laparoscopy. The lesions were observed endoscopically. The implants were measured and histological analyses were made. The groups were compared for the presence of endometriotic lesion on laparoscopy, presence of adhesions, implant size and histological aspects. For statistical analyses we utilized Student’s t and Mann-Whitney’s tests, with a statistical significance of 5%.

endometriotic lesions were identified in all cases submitted to laparoscopy after 4 weeks of induction, 64% of them cystic, and in 80% of the rabbits after eight weeks, 66% of which cystic. The adhesions were present in 71% of the rabbits after 4 weeks (none in the implants) and in 80% of the rabbits after 8 weeks (13% in the implants). The lesions were significantly larger after 8 weeks (p<0,0001). The histological analyses showed 100% of endometrial tissue in both groups.

this experimental model showed that it is possible to simulate endometriosis in rabbits with a viable and simple technique, also allowing to record the characteristics and development of the implants macro-and microscopically. Discussão O desenvolvimento das lesões após o implan- te do tecido endometrial ocorreu em todos os ani- mais, com presença de estroma e glândulas à histologia, fato também relatado em outros estu- dos experimentais. Schor et al. 17 e Schenken e Asch19 descrevem inclusive os implantes como bem vascularizados e bem delimitados, com in- cremento substancial de tamanho após sete se- manas da fixação ao peritônio. Esta facilidade de implantação do tecido endometrial ectópico traduz a alta eficácia deste modelo experimental para desenvolvimento da endometriose, o que talvez permitisse realização do estudo com menor nú- mero de animais, apesar de que a demonstração da evolução significativa no diâmetro da lesão não teria sido possível com casuística menor. A avaliação videolaparoscópica da lesão, por ser menos invasiva que a laparotomia, possibilita a avaliação e documentação seriada do aspecto macroscópico das lesões e a demonstração de sua evolução temporal. Esta evolução é bastante evi- dente em nosso estudo, no qual houve incremen- to significativo no maior diâmetro da lesão entre a 4 a e a 8 a semana após o implante do tecido endometrial. A progressão do tecido endometrial ectópico sugere viabilidade do implante e prová- vel evolução da doença, e a predominância do as- pecto cístico das lesões caracteriza atividade secretora destes focos. Não houve, porém, mudan- ça nas características histológicas do tecido endometrial ectópico quando analisado 4 e 8 se- manas após o implante, sem mudança na cor ou aspecto visual das lesões à macroscopia e sem alterações no padrão de distribuição glandular ou estromal à microscopia. Esses dados são concor- dantes com os da literatura, que não fazem men- ção a nenhuma mudança na histologia dos im- plantes e, sim, crescimento das lesões medidas pelo maior diâmetro ou pelo volume. Um quinto das lesões endometrióticas en- contradas após a abertura da cavidade abdominal das coelhas do grupo 8 semanas não haviam sido vistas durante a laparoscopia, pois encontravam- se aderidas a estruturas adjacentes. A visualização a céu aberto e a lise destas aderências permiti- ram identificação de todas as lesões. O peso das coelhas não diferiu entre os gru- pos, mostrando, provavelmente, que foram mantidas sob mesmas condições de alimentação, luz e temperatura, não havendo, portanto, inter- ferências das condições ambientais no tamanho das lesões entre eles. As primeiras coelhas submetidas à indução de lesão de endometriose foram as do grupo 8 se- manas, o que talvez justifique o maior tempo ci- rúrgico encontrado nos procedimentos deste gru- po em relação ao grupo 4 semanas; não acredita- mos, porém, que isto possa ter influenciado na evolução dos implantes. A utilização dos modelos experimentais para testes terapêuticos com drogas já existentes no mercado, como o danazol, os agonistas do GnRH e inibidores da aromatase, e com novas substâncias ainda em fase de experimentação já vem sendo empregada por alguns autores, com sucesso 20-25. A verdadeira equivalência destes focos de tecido endometrial implantado na parede de ratas e coelhas com a endometriose humana não é co- nhecida, por isso estudos comparativos são neces- sários para que os resultados destes experimen- tos possam ser extrapolados para humanos. Com base nos achados deste estudo concluí- mos que este modelo experimental mostrou-se eficaz no desenvolvimento de focos de endométrio ectópico na parede abdominal de coelhas, man- tendo características evolutivas que sugerem pro- gressão da lesão ao longo do tempo e viabilidade do tecido implantado. A possibilidade de realiza- ção de laparoscopias ou microlaparoscopias seria- das permite a avaliação macroscópica do aspecto evolutivo da lesão, registro das imagens e coleta de material para exame histológico quando neces- sário, de maneira minimamente invasiva. EndometrioseSilva et al 719RBGO - v. 26, nº 9, 2004 Referências 1. Strathy JH, Molgaard CA, Coulam CB, Melton LJ 3rd. Endometriosis and infertility: a laparoscopic study of endometriosis among fertile and infertile women. Fertil Steril 1982; 38:667-72. 2. Kirshon B, Poindexter AN 3rd, Fast J. Endometriosis in multiparous women. J Reprod Med 1989; 34:215-7. 3. Cornillie FJ. Peritoneal endometriosis. 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Endometriosis. Endometriosis: experimental model. Laparoscopy. Recebido em: 16/8/04 Aceito com modificações em: 16/9/04 EndometrioseSilva et al