Análise de marcadores protéicos no endométrio de mulheres portadoras de endometriose profunda intestinal

Endometriosis is a prevalent gynecological di sease, with a long time elapsed from onset of symptoms to definitive diag nosis. Deep intestinal endometriosis presents with more se vere symptoms, and gr eater surgical morbidity. A minimally invasive method for early diagnosis becomes necessary and would prevent pro gression to the deeper presentations of the disease. Studies of biomarkers with proteomics techniques can provide a better understanding of the molecular basis of the disease, the possibility of early diagnosis, and the development of target ed therapies. OBJECTIVE: To compare the expression of eutopic endometrial proteins be tween healthy and deep intestinal endo metriosis patients , using a shotgun mass spectrometry technique. METHODS: An exploratory case -control study with a t otal of 24 patients divided in two groups: patients with intestinal deep endometri osis with surgical c onfirmation, and patients in the healt hy control group subm itted to tubal ligation surgery. Eutopic endometrial samples were obtained by aspiration catheter. The samples were submitted to extraction, digestion, peptide desalting and ana lyzed using a DDA (data-dependent acquisition) label-free mass spectrometry approach by the Orbitrap Elite instrument (Thermo Fisher, USA).

P roteomic analysis was performed using the Progenesis QI software (Nonlinear Dyna mics, Newcastle upon Tyne, UK) to profile 595 differentially expressed proteins between the control and e ndometriosis groups. The results revealed different molecules according to the phase of the menstrual cycle and stage of disease . Top upregulated molecules included SETSIP, SRRM 2, CAPS, H2AFV, and SAFB, whereas downregulated molecules included BPIFB1, FAM184A, SLPI, PIGR, JCHAIN, HLA-A, and LTF. Among top diseases associated molecules between groups were related to cancer (p - value of 4.14E -02 - 3.91E-08), according to the analy sis performed by IPA software (In genuity Pathway Analysis System, Ingenuity Sys tems, Redwood City, CA, USA). Top upregulated proteins among patientes with advanced stage of endomeriosis were CHMP4B, DES, EIF3I, CDH13, LIMS1, HSPA4, HSP90AB1, TUBB, NPM1, MY L6. Those proteins were related t o metastasis and poor sur vival of several cancer types. CONCLUSION: CHMP4B, DES, EIF3I, CDH13, LIMS1, HSPA4, HSP90AB1, TUBB, NPM1, MYL6 are among the top upregulated proteins in patients with advanced stage of deep intestin al endomeriosis . The present stud y revealed proteins differentially expressed i n endometriosis as potential biomarkers for the development of techniques for minimally invasive diagnosis, and potential therapeutic targets for the disease. Descriptors: Endometriosis; Biomarker s; Endometriu m; Proteomics; Mass Spectrometry; Neoplasms. 1. INTRODUÇÃO ______________________________________________________________ 2 1. INTRODUÇÃO 1.1 Endometriose A endometriose é definida pela presença de g lândula e/ou estroma endometriais fora da cavidade uterina (1). Estima-se que 10 a 15% da população femin ina em idade fértil seja acometid a pela doença . Aproximadamente 50% das m ulheres com infertilidade (2) e 62% de adolescentes com dismenorréia severa podem ser diagnosticadas com endometriose (3). O quadro clínico é caracter izado por dismenorréi a, dor pélvica acíclica, dispareunia de profundidade, alterações intestinais e urinárias cíclicas, e infertilidade (4). Estima-se uma mé dia de tempo de 7 anos entre o in ício dos sintomas da endo metriose e seu diagnó stico (5). A doença, de percurso crônico, resulta em importante prejuízo na qualidade de vida, impacto sócio - econômico, além de importante problema de saúde pública (6-8). Diversas teorias são propostas p ara a patogênese da endometriose. A teoria da menstruaçã o retrógrada (9) é baseada no fato de que o tecido endometrial seria conduzido através das trompas de Falópio até a ca vidade peritoneal durante o período menstrual. No entant o esta teoria não é considerada isoladamente um mecanismo causador da doença , p ois a menstruação retrógrada é observada em mais de 90% das mulheres (10). A teoria da metaplasia ce lômica (11) explicaria a transformação de células totipotentes do mes otélio da cavidade perito neal em células endom etriais, em resposta ao estímulo de esteróides ovarianos (12). Outras te orias associadas às anteriores seri am a da disse minação vascular e/ou lin fática das células endometriais a distância (13); a neoangiogênese envolvida no estabelecimento e manutenção da endometriose (14, 15) ; a influência d e mecanismos moleculares e imunológicos do flu ido peritoneal (16-19); a predisposição genética (20) e a influência dos fatores ambientais (21). A classificação proposta pela antiga American Fertility Society em 1978 e revisada em 1985 e 1996 (22) caracterizou a endometriose em quatro estádios de acordo com a localização e extensão das lesões e aderências visualizadas 3 em cirurgia (Anexo A). Cornillie et al. (1990) classificaram a do ença em superficial e profunda para lesões menores, ou maiores e iguais a 5mm de infiltração na superfície peritoneal , respectivamente (23). A endometrio se profunda é a form a mais agressiva da doença, podendo acometer os ovários, região retrocervical, o septo retovaginal , o reto, o sigmóide, os ureteres, a bexiga, ou até envolver linfonodos da região pélvica (24, 25). Nisolle e Donnez (1997) classi ficaram a endometr iose em três afecções distin tas: a doença peritoneal, a doença ovariana e a endometriose de septo reto -vaginal. Atualmente a doença do septo reto -vaginal é considerada quando ocorre o acometimento profundo do compartimento posterior da pe lve (26). A endometriose profunda é associada a sintomas mais exuberantes, quando comparada a doença nas suas formas peritoneal ou ovariana (27, 28) . O comprometimento intestinal pode ser encontrado em 12% dos casos (29, 30), e em 90% delas o retossigmóide se encontra acometido (31-33). A endometriose intestinal apresenta-se associada a sintomas intestinais tais como disquezia e hematoquezia cíclicas, além de alterações no trânsito intestinal (32), e maior prejuízo na qualidade de vida (34). Existe uma alta prevalência de morbidade e complicações relacionadas ao tratamento cirúrgico da endometr iose profunda intestinal descritas na literatura, tais como f ístulas (0 - 4%), hemorragia (1 - 11%), infecções (1 - 3%), disfunções urinárias (1 – 17%) e intestinais (1 – 15%) (27). O diagnóstico definitivo da endom etriose depende da confirmação histológica das lesões (35), no entanto, pode-se direcionar a suspeita diagnóstica através do quadro clínico (36). Os exames de imagem como a ressonância magnética (37) e a ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal possuem boa acurácia para suspeita de casos de endometriose profunda (38), (39) (40), mas apresentam limitações no diagnóstico das formas superficiais e iniciais da doença. Existe portanto, um a necessidade no desenvolvimento de ferramentas para o diagn óstico precoce . A procura por biomarcadores através de técnicas da era “ômica” tê m sido empregadas nas pesquisas em endometriose (41), como u m possível caminho para o diagnóstico precoce da doença. A genômica e a epigenômica trazem informações relevantes em seus resultados, no entanto a proteômica se 4 correlaciona mais diretamente com os processos funcionais e bi ológicos da doença (42). 1.2 Proteômica O termo "proteômica" surgiu em 1990 pela fusão dos termos "proteína" e "genômica" (43, 44) , e objetiva ao estudo da identificação, carac terização e quantificação de todas as proteínas de um proteoma. O estudo de um proteoma é mais desafiador do que a do seqüenciamento de um genoma , devido às suas diferentes características de expressão, localização celular, inte rações, modificações pós- translacionais, turnover funcional e espacial. Estima-se que existam mais de 100.000 formas de proteínas codificadas por aproximadamente 20.235 genes do genoma humano (45). As prot eínas constituem mol éculas diretamente envolvidas em todas as reações orgânicas dos seres vivos (46). O estudo de suas funções e interações podem fornecer mais informações sobre uma doença se comparado à análise genômica, devido à baix a correlação entre o g enótipo e fenóti po nas doenças (42). Mudanças na quantificação de determinadas proteínas refletem processos biológicos específicos ou de doença , que poderiam ser usa das como biomarcadores, para melh or entendimento dos proce ssos de doença, diagnóstico precoce, monitorização clínica e desenvolvimento de terapias -alvo (47), (48). Técnicas em proteômica t êm sido amplamente aplicadas no estudo de diversas doenças oncol ógicas (49), auto-imunes (50), infecciosas (51), inflamatórias (52), (53), cardiovas culares (54), endocrinológicas entre outras (55). Fluidos biológicos como p lasma e urina , apesar de serem facilmente coletadas, apresentam pouca aplic abilidade para ident ificação de biomarcadores por técnicas proteômicas, devido a alta concentração de proteínas do plasma, dificultando a identificação de pro teínas de baixo peso molecular (56). Além disso por estar em distantes da le são a ser estud ada, 5 marcadores específic os da doença estariam presentes em menor proporção nos fluidos perféricos (57). P or esse motivo , tem sido proposto o estudo de amostras coletadas próximas à lesão, como por exemplo o endométrio para a endometriose ou o fluido ascítico no câncer de ovário (56, 58). As principais técnicas utilizadas em pesquisas sobre proteômica têm sido a eletroforese bidimensional com suas variantes, e a espectrometria de massas. Apesar das técnicas em pr oteômica reve larem marcadores em potencial, poucos têm apre sentado aplicabilidade clínica para o rastreamento de doenças e seguimento do tratamento (46). O OVA1 foi o primeiro biomarcador identificado por técnica proteômica e recentemente aprovado pela Food and Drug Adminis tration (FDA). C onstitui-se em um diagnóstico in vitro por ensaio indexado multivariado (IVDMIA) , que inclui 5 biomarcadores para avaliação pré-operatória do risco de câncer de ovário (59). 1.2.1 Eletroforese bidimensional A elet roforese é uma técnica de separação de proteínas baseada na migração de moléculas carregadas, numa solução, em função da aplicação de um campo elétrico (60). A variante bidimensional consiste em separar as proteínas em duas etapas. Na primeira , é feita a separação por ponto isoelétrico, através de géis de acrilamida em forma de tiras com PH imobilizado, e na segunda etapa em função de sua massa molecular (60). Desvantagens da técnica estão no fato de que a análise é dispendiosa no tempo, permite a identificação apenas individual de cada vez dos spots em gel, e não permite o recon hecimento de proteína s com pesos molecular es muito altos ou muito baixos (46). O grande desafio no estudo da proteômica em géis está na obtenção de amostras reprodutíveis. As técnicas em ele troforese por suas limita ções tem sido associadas ou substituídas por técnicas em larga escala por espectrometria de massas (61), que aliadas ao desenvolvimento de protocolos mai s apurados no preparo de amostras , tem permitido a identificação e a quantificação de proteínas de menor abundância envolvidas nas doenças (62). 6 1.2.2 Espectrometria de massas O espectrômetro de massa s é u m instrumento analíti co capaz de converter moléculas neutras em íons na forma gasosa e separá -las de acordo com a sua razão massa/carga, utilizando para isso campos eletromagnéticos (Figura 1) . Esse equipamento atua co mo uma balanç a de íons de altíssima precisão e, em sua gran de maioria, é composto por uma fonte ionizante, analisadora, e detectora . Como resultado é emitido um gráfico que representa a intensidade do sinal dos íons, e a razão massa/carga (63). FONTE: Optonom.com.tr Figura 1 - Equipamento de espe ctrômetro de massas: composto por uma fonte ionizante, analisadora, e detectora. O resultado é um gráfico que representa a intensidade do sinal dos íons, e a razão massa/carga. Recentemente foram desen volvidas técnicas capazes de ionizar biomoléculas de alto peso molecular e proteínas. Estas técnicas também são capazes de alterar o analito de sua fase sólida ou líquida para gasosa, estado necessário para realização da an álise da espectromet ria de massa s sem degradá-lo. Tais téc nicas foram denominad as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) (64) e electron spray ionization (ESI). Uma variante da técnica de ionização MALDI é a chamada Surface Enhanced Laser Desoption Ionization – Time of Flight (SELDI-TOF MS), que dá 7 preferência ao es tudo de peptí deos hidrof óbicos de baix o peso molecular (<10kDa) e permite a análise de amostras com menor quantidade, o que ocorre comumente em coletas de amostras clínicas (42, 64). Uma das forças que impu lsiona a proteômica nos dias atuais é o advento de softwares em bioinformática, que permitem interpretar os dados resultantes da análise por espectrometria de massas, identificando -se sequências de peptídeos em bancos de dados de proteí nas. Dois tipos de r esultados são avaliados, o primeiro us a a informação relati va à massa molecular dos peptídeos oriundos da digestão enzimática ( Peptide Mass Fingerprint ), enquanto o segundo faz uso de resultados obtidos pela fragmentação de peptídeos individuais previamente detectados (65), (66). 1.2.3 Proteômica Shotgun/ Bottom-up Proteômica "bottom-up" se refere a caracterização de pr oteínas pelo resultado da fragmentação das mesmas em um conjunto de peptídeos. Quando aplica-se essa análise a uma mistura complexa de proteínas de uma amostra biológica, chamamos de proteômica shotgun, termo batizado por Yates pela sua analogia com o seqüenciamento genômico shotgun (67). A proteômica shotgun oferece uma análise indireta, através da comparação dos peptíd eos de uma amostra bi ológica, derivados da espectrometria de massas, com um espectro de padrão de peptídeos em um banco de dados (in silico) (46). As vantagens dessa técnica estão em permitir (46): - maior precisão, sensibilidade e acurácia dentre as técnicas modernas de espectrometria de massas; - avaliação em maior escala, maior reprodutibilidade e menor temp o comparado às técnicas clássicas em gel de eletroforese; - maior capacidade de quantificação e detecção das modificações pós translacionais e de isoformas das proteínas; - maior capacidade de análise de amostras biológicas com quantidade reduzida ou escassa. 8 Recentemente novas te cnologias em aparelhos hí bridos tem sido desenvolvidos com diferentes fontes de fragmentação e ionização óptica , contribuindo para melhor acurácia da técnica para misturas complexas de peptídeos. Pode-se citar os analisador es de massas de bai xa resolução: o quadrupolo, o ion trap tridimensional ou lin ear; e analisadores de alta resolução: o tempo de vô o, transformada de Fourier de Ressonância Cíclotron de Í ons (FT -ICR) e Orbitrap. O Orbitrap tem se demonstrado vantajoso na rapidez e sensibilida de particular mente par a amostras menor es (46, 68) . Estudos publicados até hoje em proteômica e endometriose encontraram limitações em seus resultados devido a baixa reprodutibilidade das técnicas baseada em géis (46), e da baixa prec isão dos resultados derivados das análises em espect rometria de massas (67), essas por sua vez restritas pela quantidade escassa de material que é obtida em amostras biológicas, a exemplo do endométrio. A técnica shotgun de espect rometria de massas , aliada a tecnologia de aparelhos híbridos e softwares de bioinfor mática, traz uma nova proposta de análise com maior sensibilidade, maior reprodutibilidade, avaliação em larga escala com precisão e rapidez, e maior potencial em encontrar biom arcadores em seus resultados (69). 1.3 Proteômica e biomarcadores em endometriose Os primeiros estudos em endometriose e proteômica tê m publicações que datam de 2002 com um aumento exponencial nos últimos 10 anos . Os espécimes biológicos que vem sendo estudados são: plasma (8%), soro (28%), urina (8%), fluido endometrial (3%) e peritoneal (10%), endométrio eutópico (30%), endométrio ectópico da lesão de endometriose (8%) e sangue menstrual (5%) (62). Os estudos têm sido realizados em número p equeno de pacientes, com resultados preliminares não validados para o uso na prática clínica (70). Liu et al. (2015 ) e Nisenblat et al. (20 16) publicaram revisões sistemáticas s obre diversas categorias de estudos, incluindo proteômica, de biomarcadores em urina e no soro de mulheres com endometriose (71), (72). 9 Devido à heterogeneidade e ao alto ris co de viés dos estudos in cluídos, a utilidade clínica dos testes diagnósticos para endometriose permanece incerta. Nenhum dos biomarcadores avaliados nestas revisões puderam ser avaliados de forma significativa e houveram e vidências insuficien tes ou de bai xa qualidade , . May et al. (2011) e Gupta et al. (2016) publicaram revisões sistemáticas sobre as alterações endometriais e possíveis biomarcadores nas diversas categorias de estudos, e concluíram que os estudos em proteô mica do endométrio i ncluiu um des enho exploratório com núm ero pequeno de pacientres (56), (73). O endométrio de mulheres com endometriose apresenta características intrínsecas moleculares (74) , que promovem a so brevivência e adesão dos focos resultantes da mentruação retrógrada ao peritôneo. Características moleculares específicas do endométrio de mulheres com endometriose revelam resp onsividade ao estímu lo hormonal, estímulo a neoangiogênese e capacidade de inva são , além de desbalanço n a expressão gênica e da produção de proteínas (75) . A relativa facilidade na obtenção de biópsias endometri ais na prática clínica, e sua maior proximidade com o sítio da doença, faz do endométrio uma potencial ferramenta diagnóstica. A identificação de diferenças na expressão de proteínas entre mulheres com e sem a doença poderia ser utilizada como um biomarcad or para a endometrio se . As lesõe s de endometriose profund a intestinal (endomét rio ectópico) apresentam reação de fibrose e metaplasia muscular ao redor de seu componente histológico estromal e m aproximadamente 80% dos casos (76), torn ando a repres entatividade do componente estromal e glandula r por vezes escasso nas amostras da lesão. Conseqüentemente o e studo proteômico delas não seria comparável ao do endométrio tópico (77). As principais técni cas utilizada s em pesquisas sobre prot eômica e endometriose têm sido a eletroforese bidimensional e a espectrometria de massas. O principal desafio no estudo da proteômica é na obtenção de amostras reprodutíveis. As técnicas de eletrofo rese devido às suas limitações têm sido substituídas por t écnicas de espectrome tria de massas em larga escala, que permitiram a identificação e quantificação de proteínas de menor 10 abundância envolvidas em doenças (46). A espectrometria de massas fo i descrita com vantagens na velocidade, sensib ilidade e especificidade (67). A proteômica bas eada em espectrometri a de massas tem sido proposta em vários estudos na área de ginecologia em câncer de ovário, endométrio, colo de útero e mama, doença trofoblástica gestacional, pré - eclâmpsia, infertilidade e endometriose (70). Na última década , melhorias nas técnicas de espectrometria de massas aumentaram a capacidade de análise direta de amostras complexas, sem a necessidade de tratamento prévio de amostras (78). A possibilidade do est udo direto das amost ras em espect rômetros de massas tem oferecido maior precisão, sensibilidade e acurácia para os estudos em proteômica e biomarcadores (66). 2. OBJETIVO ______________________________________________________________ 12 2. OBJETIVO O presente estudo tem como objetivo, analisar a expressão quantitativa de proteínas do endométrio eutópico, comparando pacientes com en dometriose profunda intestinal e g rupo controle, por técni ca shotgun de espectrometria de massas. 3. MÉTODO ______________________________________________________________ 14 3. PACIENTES E MÉTODO 3.1 Local de estudo e pacientes O estudo foi realizado no Setor de Endometriose da D ivisão de Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC -FMUSP), onde foram recrutadas as participantes para o grupo com diagnóstico de endo metriose, em co laboração com as seguintes instituições: Maternidade Escola Assis Chateaubriand da Universidade Federal do Ceará (UFC): onde foram recrutadas as participantes para o grupo controle; Laboratório de Proteômica do Departam ento de Zootecnia da Universidade F ederal do Ceará (UFC ): onde foram realizadas o preparo das amostras para análise em espectrometria de massas; Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas - LBPQ da Universidade de Brasília (UnB ): onde foram realizada s a análise do perfi l de proteínas e dos resultados estatísticos. Laboratório de Imunologia, Instituto do Coração (InCor), do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP): onde foram realzadas análises funcionais dos resultados obtidos com software de bioinformática. As pacientes fo ram divididas em dois grupos principais: endometriose intestinal do retossigmóide (pacientes com confirmação cirúrgica e histoló gica) e controles saudáveis (pacientes sem endometriose). As pacientes foram previamente informada s sobre o estudo , e o material foi coletado após a assinatura do Termo de Co nsentimento Livre e Esclarecido (Anexos B, C e D ). A coleta das amostras respeitou os princípios éticos, práticos e de bio ssegurança estipulad os pelo Ministé rio da Saúde e pelas 15 Comissões de Ética em P esquisa com Se res Humanos da s instituições. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética das instituições sob os pareceres de nº 1.015.450/15 e nº 2.257.051/ 17 (Anexos E e F). 3.1.1 Número de paciente estudados Trata-se de a mostra consecutiva de total de 24 pacientes (grupo caso e controle), que procederam a cirurgia laparoscópica para endometriose intestinal no período de Abril de 2015 a Dezembro de 2016; e laqueadura tubária entre Agosto de 2016 a Março de 2017. O número total de pacie ntes foi determinado pelo número de procedimentos cirúrgicos realizados durante o período de tempo estipulad o. A amostra consecutiva foi validada pela escassez de estudos para c omparação, impossibilitando outro tipo de análise para obtenção do tamanho da amostra. 3.1.2 Critérios de inclusão Os critérios de inclusão para o grupo de pacientes com endometriose foram: - idade entre 18 e 45 anos; - endometriose profunda intestinal do retossigmóide comprovada cirúrgica e histologicamente; - ciclos menstruais eumenorréicos com o intervalo entre os ciclos variando de 26 a 34 dias (Bastos, 1994); - não utilização de terapêutica hormonal nos três meses que antecederem a cirurgia, incluind o análogos de GnRH, contraceptivos hormonais orais ou injetáveis, combinados ou progestagênios. Os critérios de inclusão para as pacientes do grupo controle foram os mesmos considerados para as pacientes com endometriose, exceto para a presença da doença. Selecionaram- se mulheres com desejo de esteriliz ação cirúrgica defini tiva através de laqueadura tubária por videolaparoscopia e previamente aprovadas para o procedimento, respeitando -se as normas que 16 constam da Lei N°9.263 de 12 de janeiro de 1996, que regula o § 7o do art.226 da Constitutição Federal. 3.1.3 Critérios de exclusão Os critérios de exclusão para ambos os grupos de pacientes, com endometriose e controle sem endometriose foram: - presença de afecção clínica aguda ou crônica ou qualquer patologia, associada ou não ao endométrio; - presença de doenças imunológicas, endocrinológicas, ou câncer, comprovadas por anamnese, exame físico e laboratorial quando necessário. No grupo controle sem endometriose, foram exclu ídas ainda pacientes que apresentassem toda e qualquer ano rmalidade anatômica o u afecção pélvica durante o procedimento de laqueadura tubárea. 3.1.4 Dinâmica do estudo Todas as pacientes incluídas resp onderam a um questionário ( Anexo G), que aval iou a presença dos s intomas típico s da doença (dismenorréia, dor pélvica crônic a, dispareunia de profundidade, alteração intestinal cíclica, alteração urinária cíclica e infertilidade), uso de medicações e comorbidades. Foram realizados exames físico e de imagem (ultrassonografia transvaginal e /ou ressonância magnética da pelve) de acordo com a indicação clínica. As pacientes do grupo endometriose apresentavam queixas clínicas da doença, e exames de imagem que indicavam a presença de endometriose profunda intestinal do retossigmóide, infiltrando no mínimo a camada muscular própria intestinal. Indicou -se a cirurgia para os casos de falha do tratamento clínico. As pacientes do grupo controle não apresentavam queixas clínicas, excluiu-se qualquer anormalidade pélv ica após exames de imagem , e 17 apresentavam desejo de esteril ização cirúrgica definitiva por laqueadura tubária. Ambos os grupos tiveram coletadas amostras de endométrio tópico no início das cirurgias,após o procedimento anestésico e sua datação comprovada histologicamente para a fase do ciclo. Os dados cirúrgicos foram levantados do prontuário eletrônico, bem como o estádio da doença pela classificação da American Society for Reproductive Medicine (ASRM, 1996 ) (Anexo A), r esultado do exame hi stopatológico da lesão intestinal prof unda da endometriose, e confirmação da fase do ciclo menstrual. As amostras foram processadas no Laboratório de Proteômica do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do Ceará (UFC) e a análise do perf il de proteínas e dos res ultados estat ísticos no Laboratóri o de Bioquímica e Química de Proteínas - LBPQ da Universidade de Brasília (UnB). As análises funcionais dos resultados obtidos com software de bioinformática foram realizadas no Laboratório de Imuno logia do Instituto do Cor ação (InCor) do Hospital das Clíni cas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP). 3.2 Coleta de amostras Foram coletadas biópsias de endométrio tópico de pacientes do grupo com endometriose profunda intestinal do retossigmóide e do grup o controle no início das cirurgias com auxílio de catéter de aspiração de 1,5mm de diâmetro Pipelle de Cornier (CooperSurgical®) e imediatamente congelada s em nitrogênio líquido, e armazenadas em freezer a -80oC. 3.3 Extração de proteínas Todas a s amostras de tecido foram submetidas a pesagem, maceração em nitrogênio líquido e solubilização em solução de tampão de bicarbonato de trietilamônio 0,02M (TEAB) (Sigma -Aldrich, EUA) na proporção d e 100mg / 18 200ul, contendo inibidor de proteas e (Sigma-Aldrich, EUA) na proporçã o de 1: 1000; pH 8,5. As amostras foram centrifugadas a 9.000g por 15 min para obter sobrenadante, e o pellet (debris) foi descartado. A quantificação protéica do sobrenadante foi medida em triplicata através da técnica de Bradford (Bradford, 1976) em micr oplacas. Espécimes de 30ug de proteínas foram selecionados em tubos de Eppendorf LoBind para digestão das proteínas. 3.4 Digestão de proteínas As amostras secas em Spe ed Vac® foram ressuspensas em Solução de TEAB 0,02M, Ureia 8M e DTT (Ditiotreit ol) 0,05M (pH 7,9) e incubadas por 25 minutos a 55°C e 400rpm. Sob abrigo de luz e após resfriamento, foi adicionada solução de IAA 0,5M (Iodoacetamida) suficiente para atingir concentração final d e 0,014M e incubou -se nov amente por 40 min a 21°C e 400rpm. Posteriormente foi adicionada Solução de DTT 0,5M para atingir a concentração final de 0,005M. As amostras foram diluídas na razão 1:5 com solução de TEAB 0,02M (pH 7,9), considerando a ad ição de solução de CaCl 2 (Cloreto de C álcio) 0,1M suficiente para atingir a concentração final de 0,001M , e a adição de Tripsina (Promega) na razão 1:50 (1parte de tripsina para 50 de proteína). Em seguida, as amostras foram encubadas por 13h a 37°C e 300r pm, e após o perídodo de digestão e re sfriamento, foi adici onada solução de TFA ( ácido trifluoroacético) 20% para atingir a concentração final de 1%. 3.5 Dessalinização peptídica Em ponteiras P200, foram contruídas colunas “ home made ” de fase reversa utilizando discos EmporeTM SPE C18 (Sigma-Aldrich, EUA). Para o preparo da coluna, foram realizadas sequências de centrifugação a 1.000g por 3 minutos com Metanol 100%, seguido de Solução de Acetonitrila 80% e Ácido Acético 0,5%, e por fim Solução de Ácido Acético 0,5%. 19 Finalmente, as amostras foram adicionadas à coluna, centrifugadas a 900g durante 4 min e dessalinizadas duas vezes com Solução de Ácido acético 0,5% a 1.000g por 3 minuto. A eluição dos peptí deos foi realizada e m gradiente de Acetonitri la (25%, 50%, 80% e 100%), mantend o a concentração de Ácido Acético a 0,5% nas soluções, com centrifugações lentas de 600g durante 3 min e eppendorfs de coleta do tipo LoBind. A quantificação peptídica p ré-análise por espec trometria de massas foi realizada através da plataforma QubitTM (Thermo Fisher, EUA) (Figura 2). Fonte: Myung L, 2017. Figura 2- Plataforma QubitTM (Thermo Fisher, EUA) para quantificação peptídica. 20 3.6 Espectrometria de massas As amostras foram analisadas seguindo uma abordagem espectrométrica de massa label-free de DDA (aquisição dependente de dados) utilizando o instrumento Orbitrap Elite (Thermo Fisher, EUA) (Figura 3). FONTE: Thermofischer.com 2019 Figura 3- Espectrômetro de massas hí brido Thermo Scientific O rbitrap Elite ®, combina o espectrô metro de massas ion trap de dupla pressão com analisador de massa Orbitrap TM de alto campo. O sistema oferece resolução de alta sensibilidade, e velocidade de varredura (Thermo Scientific). 21 Foram injetados 3µg da mistura de peptídeos numa coluna com 2cm x 100µm contendo partículas C18, 5µm. Os peptídeos foram eluídos desta coluna para outra (32cm x 75µm) contendo partículas C18, 3µm e finalmente eluídas para a fonte de ionizaçã o do espectrômetro d e massa. O gradiente de eluição foi co mposto de ácido fórmi co a 0,1% e acetonitrila 2 a 35% durante 155 minutos. As frações eluídas gerar am espectros de MS1 a uma resolução de 120000 entre 300 -1650 m/z. Os doze íons mais abundantes de M S1 com cargas maiore s do que dois foram automaticamente se lecionados para uma segunda fragmentação (MS2) por dissociação de colisão de energia mais alta (HCD) com um controle de ganho automático (AGC) de 1 x 10 6 e exclusão dinâmica de 10ppm para 90 segundo s. A janela de isola mento HCD (dissociação co lisional de e nergia) foi definida para 2,0 m/z, com 5x10 4 AGC (ganho de controle automático), energia de colisão normalizada de 35% e limiar para detecção de 3000. 3.7 Delineamento experimental e análise dos dados Os espectros de MS1 foram alinhados de acordo com a área de intensidade integrada dos picos gerados pelo respectivo íon, utilizando o software Progenesis QI (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). A identificação de proteínas foi realizada utilizando o software PEAKS (versão 7.0; Bioinfo rmatics Solutions, Wa terloo, Ontário, Canadá), que deduz sequências de fragmentação de informação e pesquisa as bases de dados National Center for Biotechnology Information (NCBI) e UniProt. A infor mação de identificaç ão da proteína foi reinse rida no progr ama Progenesis QI e combinada com dados previamente gerados quantitativamente. A normalização pela mediana foi conduzida, seguida da análise de variância (anova) e teste t simples para avaliar a sig nificância estatística em ρ <0,05. Para selecionar os eventos mais marcantes, a Análise de Componentes Principais (PCA) foi realizada com o agrupamento pelos valores de k-means (Queiróz et al. 2014). 22 Amostras do endométrio de indivíduos do grupo controle e pacientes com endometriose foram dividid as em cinco grupos de comparação experimental , usando a análise do software Progenesis QI d e acordo com o está dio da endometriose e a fase do ciclo menstrual: 1) Controle versus endometriose: análise quantitativa de proteínas entre os dois grupos na comparação geral, não distinguindo entre fase menstrual ou estádio da doença; 2) Controle na fase proliferativa versus endometriose está dio II na fase proliferativa; 3) Controle na fase proliferativa versus endometriose estádio IV na fase proliferativa; 4) Controle na fase secretora versus endometriose está dio II na fase secretora; 5) Controle na fase secretora versus endometriose est ádio IV na fase secretora. Os peptídeos foram considerados significativamente alterados en tre os dois grupos de amostras para valores de p<0,05 e fold-change ≥1,5. A análise estatística dos dados clínicos das pacientes de ambos os grupos foram conduzidos por Teste Exato de Fisher, Teste qui-quadrado de Pearson e Teste-t. O programa STRAP (Software Tool for Rapid Annotation of Proteins, Boston, MA) foi usado para analisar a distribuição de componentes celulares entre as proteínas de acordo com os termos de ontologia fornecidos pelo GOA (“Gene Onthology Annotation”), e pareou o resultado das análises com uma lista de proteínas presentes na base de dados UniProt (Apweiler et al., 2004). O software Ingenuity Pathway Analysis System (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA ) foi utilizado para análise das proteínas diferencialmente expressas entre os cinco grupos experimentais, das redes de interação p rotéica e sua inte rpretação molecular, biológica e funcional. Os 23 valores de p foram calculados usando o teste exato de Fisher , considerados significativos para p <0,05. 4. RESULTADOS ______________________________________________________________ 25 4. RESULTADOS 4.1 Avaliação clínica Foram incluídas um total de 24 pacientes no estudo. Para o grupo com endometriose intestinal foram analisadas amostras de endométrio de 14 pacientes. F oram realizadas 43 cirurgias para endome triose intestinal no período estipulado para as coletas , das quais foram excluídas um total de 27 pacientes não elegíveis aos critérios desse estudo , e outras 2 por apresentarem quantificação peptídica insuficiente (<3µg da mistura de peptídeos) para o protocolo de espectrometria de massas (Figura 4). Para o grupo controle, foram incluídas amostras de endométrio de 14 pacientes, das quais foram excluídas 4 pacientes por quantificação peptítica mínima insuficiente (<3µg da mistura de peptídeos) para análise shotgun, resultando em um total de 10 amostras (Figura 4). Dados clínicos, de fase do ciclo menstrual e está dio de doença (ASRM, 1996) para ambos os grupos estão representados na Tabela 1. Não houveram diferenças significativas na idade, í ndice de massa corporal e fase do ciclo menstrual entre os indivíduos. Cinqüenta por cento d as pacientes com endometriose intestinal profunda foram classificadas no está dio II , e 50% no estádio IV da doença. Os sintomas relacionados à endometriose (dismeno rréia severa 0,0% vs 85,7%, dispareunia de profundidade 0,0% vs 57,1%, sintomas cíclicos intestinais 0,0% vs 50% e infertilidade 0,0% vs 85,7%) diferiram significativamente entre os grupos controle e endometriose (p <0,05) (Tabela 1). 26 Figura 4- Fluxograma de pacientes do estudo 27 Tabela 1 - Dados clínicos, fase do ciclo menstrual e estádio de doença das pacientes incluídas no estudo nos grupos controle e endometriose VARIÁVEL GRUPO, n (%) Total P Controle (n=10) Endometriose (n=14) Idade (anos) ± desvio padrão 33,1 ± 3,6 37,0 ± 5,9 24 0,081 IMC (Kg/m2) ± desvio padrão 25 ± 4,3 24,4 ± 3,6 24 0,731 Infertilidade Sim 0 (0,0) 7 (87,5) 7 7) Sim 0 (0,0) 12 (85,7) 12 <0,0013 Não 10 (100,0) 2 (14,3) 12 Dispareunia de profundidade Sim 0 (0,0) 8 (57,1) 8 0,0062 Não 10 (100,0) 6 (42,9) 16 Dor pélvica acíclica Sim 0 (0,0) 5 (35,7) 5 0,0532 Não 10 (100,0) 9 (64,3) 19 Sintomas intestinais cíclicos Sim 0 (0,0) 7 (50,0) 7 0,0192 Não 10 (100,0) 7 (50,0) 17 Sintomas urinários cíclicos Sim 0 (0,0) 3 (21,4) 3 0,2392 Não 10 (100,0) 11 (78,6) 21 Fase do ciclo menstrual Proliferativa 5 (50,0) 8 (57,1) 13 0,9992 Secretora 5 (50,0) 6 (42,9) 14 Estádio da Endometriose (ASRM) I 0 0 0 II 0 7 7 III 0 0 0 IV 0 7 7 Dados expressos como média ± desvio padrão. 1Teste-t Student. 2Teste exato de Fisher. 3Teste qui-quadrado de Pearson (p<0,05). 28 Continua 4.2 Análise de proteínas 4.2.1 Identificação de proteín as diferencialmente expressas no endométrio A análise proteômica do tecido endometrial realizada com o software Progenesis® (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, Reino Unido) resultou em um perfil de 595 prot eínas dife rencialmente expressas entre os grupos controle e endometriose, nas diferentes fases da doença, e do ciclo menstrual (fold-change> 1,5, análise de variância p <0,05) (Anexos H, I, J, K, L - Tabelas S1 a S5). 4.2.2 Análise biológica e funcional das proteínas por softwares de bioinformática As tabela 2 apresenta as principais moléculas diferenciais resultantes da comparação quantitativa de proteínas entre grupos , e os principais processos associados às mesmas, de acordo com o software IPA. Tabela 2 - Principais proteínas com expressão aumentada no grupo endometriose Proteínas com expressão aumentada Razão de expressão (fold- change) Categorias de doenças e de função molecular SETSIP 3,4 angiogênese, diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por proteínas (PIPS) em células endoteliais, indução da transcrição da expressão da endotelial-caderina vascular (ve-caderina) SRRM2 3,3 câncer, splicing de RNAm, endocitose CAPS 3,0 ligação ao íon cálcio, perda recorrente da gravidez, metástase do câncer de pulmão, câncer de esôfago, câncer colorretal, carcinoma endometrial H2AFV 2,9 câncer de mama, câncer de bexiga SAFB 2,5 morfologia celular, montagem e organização celular, desordens do tecido conjuntivo 29 Continua Conclusão da Tabela 2 - Principais proteínas com expressão aumentada no grupo endometriose Proteínas com expressão aumentada Razão de expressão (fold- change) Categorias de doenças e de função molecular CTTN 2,1 sinalização de integrinas, sinalização de endocitose mediada por clatrina, síntese de espécies reativas de oxigênio, carcinoma de células escamosas, tumor gastrointestinal, transporte de moléculas, tumor geniturinário, tumor malar, migração de células, tumor de cabeça e pescoço DYNLL2 2,2 autofagia, homeostase celular, câncer, HBB 2,0 câncer, processamento de mRNA, endocitose, degranulação de fagócitos, metabolismo de espécies reativas de oxigênio, carcinoma geniturinário, câncer colorretal, transporte de moléculas, carcinoma do trato genital feminino CHMP2A 2,0 infecção viral, organização da organela, polimerização de proteína, homeotase celular, procecssos mitóticos RBMX 1,9 splicing de mRNA, síndrome auto-imune sistêmica, polimerização de proteína FONTE: Software Ingenuity Pathway Analysis System (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) A tabela 3 se refere às proteínas diferencialmente expressas de acordo com a fase do ciclo menstrual e estádio da doença. Tabela 3 - Principais proteínas com expressão reduzida no grupo endometriose Proteínas com expressão reduzida Razão de expressão (fold- change) Categorias de doenças e de função molecular BPIFB1 -39,1 resposta antimicrobiana FAM184A -29,9 proteína extracelular, função desconhecida SLPI -16,8 sinalização de receptores de glicocorticóides, câncer, degranulação de fagócitos, inflamação do trato gastrointestinal 30 Continua Continuação da Tabela 3 - Principais proteínas com expressão reduzida no grupo endometriose Proteínas com expressão reduzida Razão de expressão (fold- change) Categorias de doenças e de função molecular PIGR -14,0 inflamação de órgão, degranulação de neutrófilos, migração de leucócitos, glomerulonefrite auto-imune, crescimento anormal no endométrio, distúrbio inflamatório crônico, englobamento de células, migração de células, adesão de células epiteliais JCHAIN -9,5 câncer, endocitose, inflamação do trato gastrointestinal, câncer colorretal, tumor geniturinário, migração de leucócitos, resposta antibacteriana, polimerização de proteínas, migração de células HLA-A -5,9 via de sinalização de neuroinflamação, papel de NFAT na regulação da resposta imune, via de ativação th1 e th2, via de sinalização de exaustão de células t, sinalização de pkcθ em linfócitos t, sinalização cd28 em células t auxiliares, sinalização cdc42, sinalização icos- icosl em células auxiliares t , crosstalk entre células dendríticas e células natural killer, diferenciação celular t-helper, via de apresentação de antígenos, maturação de fagossomas, comunicação entre células imunes inatas e adaptativas, desenvolvimento de células b, câncer, câncer colorretal, câncer genitorunar, doenças autoimunes sistêmicas, lúpus eritematoso sitêmico, doenças reumáticas LTF -5,3 produção de espécies reativas de oxigênio, câncer gastrointestinal, doença crónica, câncer, lúpus eritematoso, inflamação do trato gastrointestinal, câncer colorretal, tumor geniturinário, tumor malar, distúrbio inflamatório crônico, crescimento de bactérias, resposta antibacteriana, atraso no início da apoptose do sangue periférico neutrófilos, doença reumática SF3A3 -3,9 splicing de RNAm RUFY2 -3,8 câncer, endocitose, carcinoma geniturinário, englobamento de células, 31 Conclusão da Tabela 3 - Principais proteínas com expressão reduzida no grupo endometriose Proteínas com expressão reduzida Razão de expressão (fold- change) Categorias de doenças e de função molecular IGHG1 -3,7 maturação de células dendríticas, via de sinalização da IL-7, comunicação entre células imunes inatas e adaptativas, sinalização autoimune da doença da tireoide, inflamação do trato gastrointestinal, inflamação do órgão, ativação do complemento, desordem inflamatória crônica, síndrome autoimune sistêmica, migração de células, doença reumática, invasão de linhagens de células endoteliais, migração de células mesenquimais FONTE: Software Ingenuity Pathway Analysis System (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) Nas tabelas 4 e 5, as proteínas com diferenciais em sua expressão no grupo endometriose foram distribuídas de acordo com a fase do ciclo menstrual e estádio da doença. 32 Tabela 4 - Principais proteínas diferencialmente expressas no grupo endometriose (estádio II), de acordo com fase do ciclo menstrual Fase menstrual Expressão aumentada Razão de expressão (fold- change) Expressão reduzida Razão de expressão (fold- change) Proliferativa EEF2 140,3 MUC5AC -72,4 S100P 33,1 FCGBP -42,7 PYGL 7,4 LTF -32,8 HSPA5 6,6 CPM -15,1 GDA 6,3 RPL13 -8,8 KRT8 5,8 SERPINA1 -7,7 VPS29 3,8 SERPINA3 -5,0 HADHA 3,4 ALB -3,0 LTA4H 3,4 CLEC3B -1,6 MGA 3,4 SERPING1 -2,6 Secretora FLNA 207,2 APOA2 -34,9 EEF1G 129,0 PSMA2 -18,9 RPLP2 125,7 LCP1 -9,4 YBX1 68,4 SAMHD1 -8,9 OGN 43,1 FGA -8,8 RPS3 38,2 CA1 -8,3 NUCKS1 34,2 HPX -7,5 KRT19 33,6 GLRX -4,9 HMGB2 33,2 APOA1 -3,9 USO1 32,2 CAT -3,9 FONTE: Software Ingenuity Pathway Analysis System (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) 33 Tabela 5 - Principais proteínas diferencialmente expressas no grupo endometriose (estádio IV), de acordo com fase do ciclo menstrual Fase menstrual Expressão aumentada Razão de expressão (fold- change) Expressão reduzida Razão de expressão (fold- change) Proliferativa CHMP4B 145,2 PAEP -18,2 DES 72,0 ALB -6,1 MATR3 59,0 APOA4 -2,6 ECH1 58,5 C3 -1,4 EIF3I 53,2 CDH13 49,0 LIMS1 48,2 POTEG 42,3 UBE2F 38,0 CD99 30,2 Secretora HSPA4 81,6 C3 -131,4 HSP90AB1 61,3 VCP -99,2 SRP14 51,0 DNAJC3 -87,7 TUBB 40,4 PIGR -36,6 SPTB 35,0 CP -15,4 MYL6 34,7 BPGM -6,5 GAPDH 33,3 IGHA2 -4,6 NPM1 28,7 TF -4,2 KRT1 25,2 IGHG1 -4,1 KRT9 10,2 ATP5F1B -2,6 FONTE: Software Ingenuity Pathway Analysis System (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) 34 O programa STRAP foi utilizado para analisar a distribuição das proteínas nos diferentes componentes celulares. As proteínas diferencialmente expressas entre os grupos apresentaram localização preferencial no citoplasma e no núcleo para proteínas com expressão reduzida na endometriose. Para as proteínas com expressão aumentada, estas estavam localizadas em sítios extracelulares de acordo com a análise do software (Gráfico 1). Gráfico 1 - Comparação entre grupos de proteínas diferencialmente expressas em endométrio de pacientes com endometriose (categoria por localização celular). Os resultados foram posteriormente subm etidos à análise com software de bioinformática Ingenuity Pathway Analysis System (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EUA). A análise das vias canônicas das proteínas entre os grupos endometriose (n = 14) e controle (n = 10) foram realizadas. As via s canônicas mais importantes do ponto de vista funcional foram relacionadas à sinalização de resposta de fase aguda, à via de sinalização da homeostase de ferro, sinalização de endocitose mediada por clatrina, ativação LXR (receptor X hepático) / XR (receptor X) e ativação de FXR (receptor X farsenóide) / RXR (receptor X retinóide) (Gráfico 2). 35 Gráfico 2 - As vias canônicas mais significativas nas pacientes com endometriose, de acordo com a análise do software Ingenuity Pathway Analysis (IPA). O gráfico de barras exibe a porcentagem de proteínas identificadas em cada via funcional. O valor de p foi calculado usando o teste exato de Fisher (p <0,05). 36 As principais doenças e distúrbios assoc iados às proteínas diferenciais entre os grupos foram relacionadas ao câncer (39 moléculas, faixa de valor de p 4,14E -02 – 3,91E-08); lesão orgânica e anormalidades (4 6 moléculas, faixa de valor de p 4,45E- 02 - 3,91E-08); e doenças gastrointestinais (25 moléculas, faixa de valor p 4,45E-02 - 3,32E-06). As principais prot eínas tiveram associação funcional com mecanismos de manutenção celular (22 moléculas, faixa de valor -P 4.45E-02-3.78E-06), montagem e organização celular (15 moléculas, faixa de valor -P 4.4 5E- 02-7.79E-06), e sistema imunológico (8 moléculas, intervalo de valores de p 4,06E-02 - 4,46E-04). A análise de interação molecular foi realizada com o software IPA. As redes relacionadas às diferentes fases do ciclo menstrual e está dios de endometriose estão representadas no Anexo M (Tabela S6). A Figura 5a representa as p rincipais interações de proteínas diferencialmente expressas no grupo endometriose em comparação ao grupo controle. As figuras 5b e 5c representam a interação de proteínas diferencialm ente expressas na forma grave da endometriose (está dio IV), nas fa ses me nstruais proliferativa e secretora respectivamente. 37 CP* CLU ALB AGT VEGFA SRSF1 LMNA BIRC5 CCND1 NUMA1 PCBP1 STIP1 CTSD RHOA HSP90B1 FSCN1 C3 IQGAP1 ACTR3 ACTR2 LIMS1COL3A1ERK1/2 PPP2CA CrebLDL AktXRCC5 Hsp90 HSP90AA1 VCP NME1 CTSB LAMP1 RPL15 NPM1 DNA-PK PI3K (complex) NFkB (complex) Vegf HMGB1 HSPD1 DESTCR RPS6 26s Proteasome ELANE JAK1 MYH14 FBLN1* HSPA8* HSPA90AB1 CASP10 c a b HADH TCR ENO1 HSF1 ATP5F1B MYL6 HSPA8 CFLAR HSPD1 PDIA6 TURB ACTB HBA1/HBA2 CDH1 SERPINA1 LDL HSPA5 APP APOH C3AR1 PARP1C3 CD46 ERK12 IL7 IL17A TLR3 TLR4 IL1B IL13 IL10IFNG ITGB2 HSF1 DDAH1 GFBP2 IL7R TLR3IGF2R LTF* ITGB2 ITGAM OSCAR TNF TGFB1 CYBAAPOH HNF1A AHSG* SLPI* miR-146a-5p (and other miRAs w/seed GAGAACU) F3 Complex/Group Cytokine Enzyme G-protein coupled receptor Growth factor Ion channel Kinase Ligand-dependent nuclear receptor Other Peptidase Phosphatase Transcription regulator Transmembrane Receptor Transporter Figura 5a - Análise das p rincipais interações de proteínas diferencialmente express as no grupo endometriose em comparação ao grupo controle pelo software IPA (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EUA ). As proteín as da rede são mostradas na graduação das cores vermelha e verde, com base na sua mudança na expressão. A cor vermelha rep resenta moléculas com expressão aumen tada, e a cor verde corresponde à expressão reduzida na endometriose. As formas brancas represent am moléculas não identificadas na análise, mas que estão associad as à regulação de algumas das proteínas identificadas. Um a linha denota ligação entre proteína s. Uma linha pontilhada mostra uma interação indireta. 38 CP* CLU ALB AGT VEGFA SRSF1 LMNA BIRC5 CCND1 NUMA1 PCBP1 STIP1 CTSD RHOA HSP90B1 FSCN1 C3 IQGAP1 ACTR3 ACTR2 LIMS1COL3A1ERK1/2 PPP2CA CrebLDL AktXRCC5 Hsp90 HSP90AA1 VCP NME1 CTSB LAMP1 RPL15 NPM1 DNA-PK PI3K (complex) NFkB (complex) Vegf HMGB1 HSPD1 DESTCR RPS6 26s Proteasome ELANE JAK1 MYH14 FBLN1* HSPA8* HSPA90AB1 CASP10 c a b HADH TCR ENO1 HSF1 ATP5F1B MYL6 HSPA8 CFLAR HSPD1 PDIA6 TURB ACTB HBA1/HBA2 CDH1 SERPINA1 LDL HSPA5 APP APOH C3AR1 PARP1C3 CD46 ERK12 IL7 IL17A TLR3 TLR4 IL1B IL13 IL10IFNG ITGB2 HSF1 DDAH1 GFBP2 IL7R TLR3IGF2R LTF* ITGB2 ITGAM OSCAR TNF TGFB1 CYBAAPOH HNF1A AHSG* SLPI* miR-146a-5p (and other miRAs w/seed GAGAACU) F3 Complex/Group Cytokine Enzyme G-protein coupled receptor Growth factor Ion channel Kinase Ligand-dependent nuclear receptor Other Peptidase Phosphatase Transcription regulator Transmembrane Receptor Transporter Figuras 5b - Análise das principais interações de proteínas diferencialmente expressas na forma grave da endometriose (estádio IV), e na fase menstrual proliferativa, pelo software IPA (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EUA ). As proteínas da rede são mostradas na graduação das cores verm elha e verde, com base na sua mudança na expressão. A cor vermelh a representa moléculas com expressão aumentada, e a cor verde corresponde à expressão reduzida na endometriose. As formas brancas representam moléculas não identificadas na análise, mas que e stão associadas à regulação de algumas das proteínas identificada s. Uma linha denota ligação entre proteínas. Uma linha po ntilhada mostra uma interação indireta. 39 CP* CLU ALB AGT VEGFA SRSF1 LMNA BIRC5 CCND1 NUMA1 PCBP1 STIP1 CTSD RHOA HSP90B1 FSCN1 C3 IQGAP1 ACTR3 ACTR2 LIMS1COL3A1ERK1/2 PPP2CA CrebLDL AktXRCC5 Hsp90 HSP90AA1 VCP NME1 CTSB LAMP1 RPL15 NPM1 DNA-PK PI3K (complex) NFkB (complex) Vegf HMGB1 HSPD1 DESTCR RPS6 26s Proteasome ELANE JAK1 MYH14 FBLN1* HSPA8* HSPA90AB1 CASP10 c a b HADH TCR ENO1 HSF1 ATP5F1B MYL6 HSPA8 CFLAR HSPD1 PDIA6 TURB ACTB HBA1/HBA2 CDH1 SERPINA1 LDL HSPA5 APP APOH C3AR1 PARP1C3 CD46 ERK12 IL7 IL17A TLR3 TLR4 IL1B IL13 IL10IFNG ITGB2 HSF1 DDAH1 GFBP2 IL7R TLR3IGF2R LTF* ITGB2 ITGAM OSCAR TNF TGFB1 CYBAAPOH HNF1A AHSG* SLPI* miR-146a-5p (and other miRAs w/seed GAGAACU) F3 Complex/Group Cytokine Enzyme G-protein coupled receptor Growth factor Ion channel Kinase Ligand-dependent nuclear receptor Other Peptidase Phosphatase Transcription regulator Transmembrane Receptor Transporter Figura 5c - Análise das p rincipais interações de proteínas diferencialmente expressas na f orma grave da endometriose (estádio IV), e na fase menstrual secr etora, pelo software IPA (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EUA ). As proteínas da rede são mostradas na graduação das cores vermelha e verde, com base na sua mudança na expressão. A c or vermelha representa moléculas com expressão aumentada, e a cor verde corresponde à expressão reduzida na endometriose. As formas brancas representam molécul as não identificadas na análise, mas que estão associadas à regulação de algumas das proteínas id entificadas. Uma linha denota ligação entre proteínas. Uma linha pontilhada mostra uma interação indireta. 40 A análise dos principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas na endometriose, para as diferentes fases do ciclo menstrual e estádios, estão especificadas nos Anexos N, O, P, Q (Tabela S7 a S10) 41 5. DISCUSSÃO ______________________________________________________________ 42 5. Discussão As an álises pro teômicas do endométrio tópico tem sido descritas recentemente em estudos sobre endometriose. Esses estudos têm demostrado que a expressão protéica do endométrio tópico está modificada em pacientes com endometriose (56), (73). A maio ria desses estudos têm utilizado técnicas de eletroforese e mais recentemente , métodos de espectrometria de massas com identificação direcionada das proteínas (análises targeted) (62), (75) . Este estudo piloto foi o primeiro a avaliar diferenças quantitativas na expressão protéica do endométrio tópico de pacientes com endometriose profunda intestinal, por m eio de téc nica proteômica shotgun de espectrometria de massas. As pr incipais descobertas do nosso estudo foram de que as proteínas expressas no endométrio tópico de pacientes com endometriose profunda intestinal mostraram um painel molecular relacionado ao câncer, a maioria das quais ainda não haviam sido previamente relac ionados à endometriose. Observou-se que a expressão protéica entre as fases do ciclo menstrual e estádios da doença apresentou diferenças, mas todas as moléculas foram comuns em apresentar um painel de proteínas relacionadas ao câncer. Ao estudarmos as pr oteínas com expressão aumentadas na fase proliferativa de pacientes com endometriose no estádio II, observamos que o EEF2 (Eukaryotic Translation Elongation Factor 2) apresentou fold-change de expressão de 140,3. Esta proteína participa da regulação da sín tese de proteínas e tem sido descrita na progressão de vários tipos de cânceres (79), (80). A EEF2 promove a proliferação de células tumorais, maior predisposição à invasão, metástases e pior prognóstico no câncer de ovário (81) e no câncer hepatocelular (82). Na mesma fase do ciclo e estadiamento, observamos que a S100P apresentou fold-change de expressão de 33,1. S100P é uma proteína de ligação ao cálcio com funções intracelulares e extracelulares. Tem sido descrita em muitos cânceres e está associada a metástase e a mal prognóstico (83). Hapangama et al. observou que a expressão de S100P poder ia induzir a metástase e aumentar a invasividade da celula endometrial, o que poderia 43 explicar sua maior expressão em pacientes com endometriose (84). Além d o S100P, a HSPA5, KRT8 e MGA foram encontrados com expressão aumentada nas pacientes com endometriose com fold-change de expressão de 6,6, 5,8, 3,4 respectivamente. Estas têm sido descritas associadas a vários tipos de cânceres (85), (86), como os de mama, ovário, gástrico , colorretal, fígado e pulmão (87), (88). Estes achados podem estar relacionados com estud os anteriores em que a endometriose têm sido associada a um risco au mentado para câncer de ovário de células claras , e epitelial endometrióide (89). Estudos também tem descrito uma maior correlação entre endometrios e e câncer de mama (90). Considerando as proteínas com expressão aumentadas na fase secretora de pacientes com endometriose no estádio II, observamos que a FLNA (Filamina A) apresentou fold-change de expressão de 207,2. Esta proteína está envolvida em funções de migraç ão celular e adesão, e tem sido descrita como uma proteína promotora do câncer de mama, câncer melanoma e câncer de pulmão (91). Esses achados podem corroborar com estudos que têm correlacionado um maior risco de pacientes com endometriose em desen volver melanoma cutâneo (92). FLNA também tem sido encontrada com expressão aumentada em pacientes com câncer do colo do út ero, e ass ociada a metástase e menor sobrevida (93). Para o mesmo grupo de pacientes, a EEF1G (Elongation factor) apresentou fold-change de expressão de 129,0. EEF1G foi descrita como um preditor de mal prognóstico em câncer de mama e pulmão (94). Adicionalmente à EE1FG, a RPLP2 (proteína r ibossomal, fold- change de expressão de 129,0 ) tem sido correlacionad a com a presença de metástases em cânceres do tipo seroso de ovário, maior invasão miometrial em carcinomas de endométrio, e a maior incidência em carcinomas de mama (95). A YBX1 (nuclease -sensitive element -binding protein 1 , fold-change de expressão de 68,4 ) está relacionada a maior resistência a fármacos no tratamento de tumores e metastases (96). Os níveis séricos de YBX1 já foram descritos com expressão aumentada em pacien tes com en dometriose comparado a pacientes controle (97). OGN, RPS3, NUCKS1, KRT19, HMGB2 e USO1 (fold-change de expressão de 43,1, 38,2, 34,2, 33,6 e 32,2 respectivamente) têm sido rel acionados a vários tipos de câncer (98), (88), 44 (99). RPS3 e KRT19 foram descritos em processos de fibrogênese , e HMGB2 em angiogênese (100), (101). A expressão aumentada dessas moléculas em pacientes com endometriose pode estar relacionada a atividade aumentada de fibrose, e neoangiogênese já descritas na doença (102), (103). Dentre as proteínas com expressão reduzida na fase proliferativa de pacientes com endometriose no estádio II, observamos que a MUC5AC (Mucin- 5AC, fold-change de expressão de -72,4) foi descrita por ter uma expressão aumentada em adenocarcinoma de cólon, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma e câncer de ovário (104), (105). FCGBP (IgGFc - binding protein, fold-change de expressão de -42.7), também foi descrita com expressão reduzida no câncer de cólon (106). LTF (lactotransferrina, fold- change de expressão de -32.8), foi de scrita associada a cânceres (107), doença d e Cro hn (108) e expressão reduzida em câncer gástrico (109). LTF também foi detectada em baixas c oncentrações nos está dios iniciais da endometriose, em comparação com os está dios mais avançados da doença no estudo de Polak et al. (110). SERPINA3 (Alpha-1-antichymotrypsin, fold change de expressão de -5,0), foi descrita em estudo anterior , como uma proteína que possui expressão aumentada no endométrio em resposta a ação da gonadrotofina coriônica humana em condições normais. Esta se encontrou com expressão reduzida em modelos animais com endometriose, o que pode ria explicar em parte a falha na implantação embrionária das pacientes com endometriose (111). A APOA2 (apolipoproteína A-II, fold-change de expressão de -34,9), com expressão reduzida na fas e sec retora do ciclo menstrual e no estádio II da endometriose, mostrou-se com expressão reduzida também em pacientes com câncer de mama (112), e aumentada em câncer de pâncreas (113) . A FGA (Fibrinogen Alpha Chain , fold-change de expressão de -8,8) tem atividade envolvida na apo ptose de células de linhagem tumoral e na adesão de neutrófilos (114), (115), (116) . Sua expressão reduzida encontrada em pacientes com endometriose no presente estu do po deria estar relacionada a menor atividade de apoptose , e menor resposta imunológica relacionada à doença. Este mecanismo já havia sido descrito no processo de falha de 45 reconhecimento do tecido e ndometrial ectópico na cavidade peritonial, levando ao au mento da tolerância imunológica e persistência dos implantes de endometriose (56). Zhao et al. publicou um estudo em que identificou o FGA como um dos potenci ais marcadores em soro de pacientes com endometriose (117) Considerando as proteínas com expressão aumentada na fase proliferativa de pacientes com endometriose no estádio IV, observamos que a CHMP4B (Charged Multivesicular Body Protein 4b, fold change de expressão 145,9) foi descrita com expressão aumentada em carcinoma hepatocellular (118). DES (Desmina , fold-change de expressão de 72,0 ), foi relacionada em estudos associada ao câncer colorretal, câncer hematológico e câncer de endométrio (119), (120). Foi considerada um marcador de diferenciação fibromuscular e de células musculares lisas em paci entes com endometriose profunda em estudo de van Kaam et al. (121). A expressão aumentada dessa proteína em pacientes deste estu do poderia estar relacionada com o fato das lesões de end ometriose profunda intestinal apresentarem reação de fibrose e metaplasia muscular ao redor de seu componente histológico estromal em aproximadamente 80% dos casos (76). EIF3I (Eukaryotic Translation Initiation Factor 3, subunit 1, fold-change de expressão de 53,2 ), é altamente express a em células endoteliais durante a angiogênese embrionária e tumoral, tendo sido descrita em metástases linfonodais, na invasão do câncer de ovário, na maior incidência de está dio avançados dos cânceres gástrico e hepatocelular (122), (123). A expressão aumentada dessa proteína pode estar relacionada aos achados de Abr ão et al. que constataram que os linfon odos são afetados por focos de endometriose em pacientes com endometriose intestinal profunda (124) Quanto mais profunda a lesão intestinal, maior o comprometimento linfonodal encontrado no estudo (13). Alguns estudos sugeriram que a EIF3I poderia ser utilizada para terapia -alvo antineoplásica (123). CDH13 (caderina - 13, fold-change de expressão de 49,9 ), é um gene supressor de tumor que desempenha um papel fundamental na adesão célula -célula. É ex pressa em células tumorais humanas e demonstrou inibir o potencial invasivo dos tumores, e reduzir acentuadamente a sua proliferação em alguns trabalhos (125), (126). Esse achado pode explicar uma maior capacidade de progressão 46 e invasão da endometriose em está dios mais avançados. LIMS1 (LIM and senescent cell antigen -like- containing do main protein 1, fold-change de expressão de 42,0 ), está associada à maior incidência tumoral, câncer do aparelho digestivo, câncer geniturinário, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial e neoplasia de cabeça e pescoço (127), (128), (129). Sua expressão aumentada foi associada a está dios mais avançados de neoplasias , e a pior prognóstico dos pacientes (130). O LIMS1 é crucial para a adaptação do tumor às condições de privação de oxigênio -glicose, e tem sido objeto de estudo como um promissor alvo terapêutico para o tratamento do câncer (131). A expressão aumentada dessa proteína em está dios mais avançados da endometriose neste estudo, pode estar relacionada ao mecanismo descrito anteriormente relacionado ao câncer, bem como uma possibilidade do desenvolvimento de terapias -alvo. A endometriose foi descrita relacionada ao aumento do risco de doença inflamatória i ntestinal e outras doenças inflamatórias e autoimunes (132). O CD99 (antígeno CD99), fold-change de expressão de 30.2 , foi relacionado a vários tipos de cânceres (133), (134), (135), doenças inflamatórias inte stinais (doença de Crohn e retocolite ulcerativa) e doenç a inf lamatória autoimune, mostrando uma correlação positiva com a atividade da doença (136). O aumento da expressão desta proteína em pacientes com endometriose do presente estudo está congruente com a associação anteriormente descrita. Dentre as proteínas com expressão aumentada na fase secretora de pacientes com endometriose no estádio IV, observamos que a HSPA4 ( Heat shock 70 kDa protein 4 , fold-change de expressã o de 81,6 ) fazem parte da família das proteínas heat shoc k que possuem expressão aumentada em tecido de carcinoma hepatocelular humano, e foram relacionadas com a agressividade e pior prognóstico da doença (137), (138). A HSP90AB1 ( Heat shock protein HSP 90 -beta) fold-change de expressão de 61.3 , pertence a um grande grupo de moléculas chaperones. Os chaperones mantêm a estabilidade da proteína após a exposição a vários tipos de estresse celular. Proteínas de choque térmico são relacionadas a regulação de processos de câncer (139). A expressão aumentada de HSP90AB1 tem sido descria correlacionada com um pior prognóstico, proliferação e invasão do câncer gástri co, do melanoma e do 47 câncer de pulmão (140), (141). TUBB (Tubulina) e NPM1 (Nucleofosmina) fold- change de expressão de 40,4 e 28,7 , estão relacionados com carcinoma endometrial, bem com o de outros tipos de cânceres como o de colorectal, mama e ovário (142), (143), (144), (145) . MYL6 (Myosin light polypeptide 6 ), GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), KRT1 ( Keratin, type II cytoskeletal 1) e KRT9 (Keratin, type I cytoskeletal 9) fold-change de expressão de 34,7, 33,3, 25,2 , 10,2 respectivamente. são diferencialmente expressos em cânceres do trato reprodutivo, fígado e mama (146), (147), (148), (149). O GAPDH também está relacionado a doenças degenerativas neurológicas (150). Ao considerarmos as proteínas com expressão reduzida na fase proliferativa de pa cientes com endometriose no estádio IV, observamos que a PAEP (glicodelina, fold-change de expressão de -18,2), está associada com uma maior incidência e freqüência de tumores, tais como de pulmão, câncer de ovário e de endométrio, câncer de mama , cancer d e pâncreas, adenocarcinoma e atividade de apoptose (151), (152), (153), (154). Mosbah et al. publicou um estudo em que níveis de glicodelina foi s ignificativamente maior em fluido peritoneal e soro de pacientes com endometriose, e correlacionou -se positivamente com o estádio da doença (155). Os achados do presente estudo não encontrou resultados semelhantes. Considerando as proteínas com expressão reduzida na fase secretora de pacientes com endometriose no estádio IV, observamos que a C3 (complemento C3 , fold-change de expressão de -131.4), está relacionada ao câncer genitu rinário, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de mama, câncer hematológico, câncer de mama e ovário, doença reumática, síndrome autoimune sistêmica e doença de Huntington (156), (157), (158), (159), (160). C3 foi descrito com expressão aumentada em epitélio endocervical de mulheres com endometriose profunda e pacientes com infertilidade em alguns estudos (161), (162). VCP (pr oteína contendo valosina) fold-change de expressão de -99,2, é um membro da família da proteína AAA + ATPase tipo II. A VCP atua em diversos processos celulares e tem sido correlacionada positivamente à proliferação e metástase do câncer colorretal (163). Com isso o estudo sugeriu que futuramente, a VCP poderia ser alvo de desenvolvimento 48 de terapia-alvo, em que a redução de sua expressão poderia ser usada para o tratamento do câncer colorretal (163). PIGR (receptor de imunoglobulin a polimérica) fold-change de expressão de -36.6, é um membro da superfamília de imunoglobulinas. Sua expressão aumentada está associada a desfechos clínicos adversos e pior prognóstico em cânceres, t ais como o de câncer de pulmão, câncer de pâncreas, gastr oesofágico, de ovário, de bexiga e de cólon (164), (165), (166), (167). A expressão reduzida dessas proteínas em pacientes com endometriose profunda nos está dios avançados do presente estudo poderia estar relacionada a um possível melhor prognóstico de alguns dos tipos de cânceres supracitados. Os resultados do presente estudo vão de encontro aos diversos estudos anteriores, em que se demonstrou que o endométrio eutópico de pacientes com endometriose é alterado (56), (73), podendo-se aventar a hipótese de que a doença se iniciaria no endométrio eutópico dessas pacientes. Uma maior expressão do fator de crescimento endotelial vascular em pacientes com endometriose intestinal profunda hav ia sido constatado em estudo anterior publicado por Machado et al. (102). May et al. publicaram uma revisão sistemática sobre potenciais biomarcadores no endométrio eutópico de pacientes com endometriose (56). Dentre os biomarcadores revisados estavam os fatores imunológicos, uma maior expressão de fatores de crescimento, e de adesão celular, bem como de moléculas r elacionadas à neoangiogênese. Tais fatores en contrados no endométrio eutópico de pacientes com endometriose coincidem com as características (“ hallmarks”) moleculares dos processos de câncer que têm sido descritas (168), e muitas delas apresentam vias em comum com a endometriose . Adicionalmente se encontram , a resistência a atividade de apoptose, a tolerância imunológica, e maior capacid ade d e invasão tecidual e potencial metastático (168). Melin et al. avaliar am um a g rande coorte de mulheres afetadas por endometriose e vários tipos de cânceres (169). Eles observaram um melh or prognóstico para câncer de mama e ovár io, mas uma menor taxa de sobrevida para melanoma maligno (169, 170). Nossos resultados revelaram aumento da expressão de várias proteínas na endometriose relacionadas a um p ior 49 prognóstico, e metástase em muitos tipos de cânceres. No e ntanto, algumas moléculas importantes tiveram expressão reduzida em pacientes com endometriose. Ao exemplo da VCP, PIGR e MUC5AC que estavam reduzidas nas pacientes com endometriose do presente estudo, foram descritas associadas ao câncer colorretal , cân cer hepatocelular e colangiocarcinoma quando encontradas em expressão aumentada, e relacionad as a metástases e pior prognóstico (163),(167),(171). Esses achados podem explicar as diferenças na prevalência , e no prognóstico dos diversos cânceres entre pacientes com endometri ose (170). A endometriose provavelmente representa uma parte de uma condição sistêmica de d esregulação, predispondo a paciente ao câncer, a doenças autoimunes e inflamatórias crônicas. Nossos achados foram os primeiros a empregar técni cas de proteômica shotgun para analisar proteínas diferencialmente expressas no endométrio eutópico de pacientes com endometriose intestinal profunda. A espectrometria de massas vem se tornando uma f erramenta importante em estudos de endometriose. Sua velo cidade, sensibilidade, precisão e reprodutibilidade são potencializadas pelo advento de softwares de bioinformática para melhorar a análise dos dados resultantes. O rastreamento da endometriose por t écnica de espectometria de massas tem se tornado uma ferr amenta a nalítica indispensável para a detecção de futuros biomarcadores. Dos pontos fortes deste estudo , podemos considerar o fato do grupo controle ter sido selecionado totalmente saudável, excluindo-se qualquer outra doença pélvica ou clínica. A presenç a de condições clínicas ou de doença poderiam afetar as análises proteômicas , devido à a lta sensibilidade desse método. Outra vantagem deste trabalho se deve a seleção homogênea de casos do grupo end ometriose, apenas com endometriose profunda intestinal , excluindo-se outras anormalidades pévicas . Como limitações podemos considerar o número pequeno de amostras, em se tratando de um estudo piloto exploratório, necessitando-se portanto de validações futu ras para cada um dos achados. A endometriose é uma doença complexa e, conforme revelado neste estudo, o biomarcador para a doença se encontra futuramente validado em 50 painéis, em detrimento de um biomarcador único. O presente estudo revelou potenciais bioma rcadores, que precisam ser validados no futuro em estudos maiores e promissores, para o desenvolvimento de ferramentas diagnósticas minimamente invasivas e de terapias-alvo para a endometriose. 51 6. CONCLUSÕES ______________________________________________________________ 52 6. Conclusões As proteínas SETSIP, SRRM2, CAPS, H2AFV e SAFB tiveram expressão aumentada, enquanto que as proteínas BPIFB1, FAM184A, SLPI, PIGR, JCHAÍNA, HLA -A e LTF tiveram expressão reduzida no endométrio d as pacientes portadoras de endometriose profunda intestinal. Os resultados revelaram diferentes moléculas expressas de acordo com a fase do ciclo menstrual, e o estádio da doença . No entanto, a maioria das proteínas do presente estudo tiveram o câncer como princ ipal doença associada. As proteínas CHMP4B, DES, EIF3I, CDH13, LIMS1, HSPA4, HSP90AB1, TUBB, NPM1, MYL6 foram as principais que apresentaram expressão aumentada, e associada a estádios mais avançados da endometriose profunda intestinal e a cânceres de pior prognóstico. 53 7. ANEXOS ______________________________________________________________ 54 Anexo A- Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive Medicine em 1996 Estadiamento da endometriose ASRM (1996) ENDOMETRIOSE 3 cm PERITÔNIO Superficial 1 2 4 Profunda 2 4 6 OVÁRIO D Superficial 1 2 4 Profunda 4 16 20 OVÁRIO E Superficial 1 2 4 Profunda 4 16 20 OBLITERACAO DO FUNDO DE SACO POSTERIOR Parcial Completa 4 40 ADERÊNCIAS 2/3 Envolvidos OVÁRIO D Velamentosa 1 2 4 Densa 4 8 16 OVÁRIO E Velamentosa 1 2 4 Densa 4 8 16 TROMPA D Velamentosa 1 2 4 Densa 4* 8* 16 TROMPA E Velamentosa 1 2 4 Densa 4* 8* 16 Estádio I (mínima): 1-5 Estádio II (leve): 6-15 Estádio III (moderada): 16-40 Estádio IV (severa): >40 *Se as fímbrias tubárias estiverem totalmente envolvidas por aderências, mude o escore para 16. Porcentagem de implantes: Lesões vermelhas (claras, vermelhas, rosadas, em chama, vesículas): ___% Lesões brancas (brancas, amareladas, marrons, defeitos de peritônio): ___% Lesões pretas (pretas, depósitos de hemossiderina, azuis): ___% Endometriose adicional: _________________________________________ Usar em caso de trompas e ovários normaisE D Usar em caso de trompas e ovários anormaisE D 55 Anexo B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (gr upo controle HCFMUSP) Continua 56 Continuação do Anexo B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo controle HCFMUSP) Continua 57 Continuação do Anexo B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo controle HCFMUSP) Continua 58 Conclusão do Anexo B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo controle HCFMUSP) 59 ANEXO C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo endometriose- HCFMUSP) Continua 60 Continuação do A nexo C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo endometriose- HCFMUSP) Continua 61 Continuação do A nexo C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo endometriose- HCFMUSP) Continua 62 Conclusão do Anexo C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo endometriose- HCFMUSP) 63 Anexo D - Termo d e C onsentimento Livre e Esclarecido (grupo controle – UFC) Continua 64 Conclusão do Anexo D - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo controle – UFC) 65 Anexo E - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq- HCFMUSP) Continua 66 Continuação do A nexo E - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq- HCFMUSP) Continua 67 Conclusão do Anexo E - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq- HCFMUSP) 68 Anexo F - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq- UFC) Continua 69 Continuação do A nexo F - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq- UFC) Continua 70 Continuação do A nexo F - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq- UFC) Continua 71 Conclusão do Anexo F - Parecer consubstanciado da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq- UFC) Continua 72 Anexo G - Questionário para coleta de dados das pacientes incluídas no estudo Continua 73 Continuação do A nexo G - Questionário para coleta de dados d as pacientes incluídas no estudo Continua 74 Continuação do Anexo G- Questionário para coleta de dados das pacientes incluídas no estudo Continua 75 Conclusão do A nexo G - Questionário para coleta de dados das pacientes incluídas no estudo 76 Continua Anexo H Tabela –S1 Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (todos os grupos) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão P0DME0 SETSIP 0,04 3,47 Q9UQ35 SRRM2 0,02 3,32 Q13938 CAPS 0,0000295 3,04 C9J386 H2AFV 0,03 3 Q15424 SAFB 0,01 2,99 Q14247 CTTN 0,03 2,5 Q96FJ2 DYNLL2 0,05 2,18 Q7Z2K5 HBB 0,03 2,05 O43633 CHMP2A 0,04 2,01 P38159 RBMX 0,02 1,94 A0A0D9SEM4 SRSF4 0,00859 1,87 Q53SS8 PCBP1 0,02 1,85 P11142 HSPA8 0,04 1,82 P38398 BRCA1 0,05 1,8 A0A024R9D7 DECR1 0,05 1,8 B7Z570 SRSF1 0,02 1,78 O43491 EPB41L2 0,02 1,77 P09496-2 CLTA 0,00545 1,76 Q14151 SAFB2 0,02 1,72 F8W1K5 CNPY2 0,05 1,7 P69892 HBG2 0,04 1,7 F8VRV5 DYNLL1 0,00538 1,68 D6RFM3 HNRNPH1 0,03 1,64 E9PP76 CCS 0,05 1,62 C9JL85 MTPN 0,04 1,61 Q14980-2 NUMA1 0,00637 1,6 B4DEA3 RAD23B 0,00123 1,59 P11021 HSPA5 0,05 1,51 Q01105-3 SET 0,04 1,51 Q01082 SPTBN1 0,00869 -1,51 C9JV77 AHSG 0,02 -1,59 Q8NHQ9 DDX55 0,02 -1,59 B7Z4L7 RBM39 0,03 -1,59 P02768 ALB 0,05 -1,6 P21291 CSRP1 0,04 -1,6 Q92599-3 0,01 -1,6 77 Conclusão da Tabela –S1 Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (todos os grupos) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão Q58FF7 HSP90AB3P 0,04 -1,61 B4E1B2 TF 0,02 -1,62 B3KMK3 NUP155 0,03 -1,63 Q7Z406-2 MYH14 0,00181 -1,64 P01024 C3 0,00766 -1,65 Q9UL89 IGHV1-69 0,02 -1,68 B4DRR0 KRT6A 0,03 -1,73 Q1L857 CP 0,03 -1,75 P00918 CA2 0,02 -1,77 P10323 ACR 0,03 -1,78 B1AHL2 FBLN1 0,04 -1,95 P01625 IGKV4-1 0,05 -2,05 G3V113 UBE2V2 0,0093 -2,12 Q5T985 ITIH2 0,01 -2,31 Q96P66 GPR101 0,05 -2,54 Q9NPP6 IGH 0,000799 -2,9 O14645 DNALI1 0,01 -3,36 Q14508-2 WFDC2 0,02 -3,51 Q16352 INA 0,04 -3,52 B4E3V1 DDAH1 0,00768 -3,75 Q6N094 IGHG1 0,00694 -3,76 Q8WXA3-2 RUFY2 0,05 -3,82 B4DW90 SF3A3 0,05 -3,95 P02788-2 LTF 0,03 -5,32 P16188 HLA-A 0,02 -5,9 P01591 JCHAIN 0,02 -9,53 P01833 PIGR 0,01 -14,03 P03973 SLPI 0,02 -16,83 Q8NB25 FAM184A 0,04 -29,97 Q8TDL5 BPIFB1 0,01 -39,16 FONTE: Software Progenesis QI (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Teste estatístico: análise de variância anova (p <0,05). 78 Continua Anexo I Tabela S2 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estádio II, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão B4DRE8 EEF2 0,01 140,32 P25815 S100P 0,04 33,12 E9PK47 PYGL 0,04 7,41 V9HWB4 HSPA5 0,04 6,62 Q9Y2T3 GDA 0,000874 6,36 F8VP67 KRT8 0,05 5,8 Q9UBQ0 VPS29 0,04 3,87 E9KL44 HADHA 0,03 3,44 A0A140VK27 LTA4H 0,02 3,4 B9EGR5 MGA 0,03 3,4 P08727 KRT19 0,00613 3,39 H3BQF1 APRT 0,03 3,37 B4DVU9 HSPA1A/HSPA1B 0,02 3,3 Q9BV28 TUBB3 0,00918 3,28 B3KXN4 WDR1 0,02 3,25 A8K2H4 CTSB 0,03 3,18 B4DPZ4 ARHGAP1 0,00253 3,15 U3KQK0 HIST1H2BN 0,05 3,12 F5GXY2 LDHA 0,02 3,08 P28838 LAP3 0,03 3,01 P46940 IQGAP1 0,04 3 R4GN08 ARPC4 0,05 2,98 A0A286SD59 DDX39B 0,05 2,98 A0A087WYR3 TPD52L2 0,05 2,95 Q5S4N1 DDX3X 0,02 2,9 F8VRP1 CS 0,03 2,86 B7Z268 SSBP1 0,04 2,82 K7EQ86 KIAA0100 0,04 2,67 B4DJQ8 CTSC 0,02 2,61 Q08211 DHX9 0,03 2,55 Q53HU8 VIM 0,01 2,53 A6NH27 ZWINT 0,04 2,52 H7BXZ5 KALRN 0,03 2,5 V9HW31 ATP5F1B 0,02 2,48 F8W180 MYL6 0,04 2,41 F6UXX1 SYNCRIP 0,02 2,41 Q53G76 ACTB 0,00892 2,36 Q15181 PPA1 0,03 2,33 V9HVZ4 GAPDH 0,02 2,32 A0A0U1RRM4 PTBP1 0,04 2,32 B2R7W4 HNRNPR 0,04 2,29 P37802 TAGLN2 0,03 2,29 79 Continua Continuação da Tabela S2 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estádio II, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão A0A024R4F1 ENO1 0,01 2,28 Q59GX5 LCP1 0,02 2,25 Q969H8 MYDGF 0,04 2,25 Q5T0R1 CAP1 0,00342 2,2 Q9H799 CPLANE1 0,01 2,2 Q9NUV1 CNDP2 0,03 2,17 F5H823 RAP1B 0,02 2,17 F5H5D3 TUBA1C 0,04 2,16 P09651 HNRNPA1 0,01 2,12 Q96GW1 HSP90B1 0,05 2,08 V9HWK2 VCL 0,00557 2,08 A0A024R5K1 CORO1B 0,04 2,07 E7EMB3 CALM1 0,05 2,06 A8MW50 LDHB 0,03 2,05 Q15019 SEPT2 0,05 2,04 A2A274 ACO2 0,00322 2,02 Q9HAP1 VCP 0,05 2 A8K0G3 AP2B1 0,03 1,99 P09211 GSTP1 0,05 1,99 P30044 PRDX5 0,02 1,99 P52209 PGD 0,02 1,97 P60174 TPI1 0,03 1,95 A0A1B0GVG2 ASAH1 0,05 1,88 B4DLV7 GDI2 0,02 1,86 V9HW62 GLO1 0,02 1,83 K7EM20 YWHAE 0,00982 1,83 B4DY04 YWHAQ 0,01 1,8 O75396 SEC22B 0,05 1,78 A0A0B4J1R6 TKT 0,05 1,78 Q53FF5 NSFL1C 0,04 1,67 Q9H4N8 YWHAH 0,02 1,55 P02753 RBP4 0,00724 -1,7 P25311 AZGP1 0,05 -1,87 A5PL27 CP 0,03 -2,04 A0A0K0Q2Z1 SERPINC1 0,02 -2,04 P02790 HPX 0,02 -2,19 P01861 IGHG4 0,03 -2,19 P15531 NME1 0,04 -2,26 V9HWA9 C3 0,00874 -2,28 Q2F831 YWHAZ 0,00678 -2,35 Q96CD0 FBXL8 0,02 -2,43 V9HWF6 ORM1 0,00803 -2,55 B1AHL2 FBLN1 0,04 -2,59 A0A286YEY4 IGHG2 0,02 -2,62 E9PGN7 SERPING1 0,04 -2,62 Q68DS3 CLEC3B 0,03 -2,66 80 Continua Conclusão da Tabela S2 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estádio II, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão B3KS79 SERPINA3 0,02 -5,04 A0A024R6I7 SERPINA1 0,02 -7,76 J3QSB4 RPL13 0,03 -8,78 F8VVI6 CPM 0,0064 -15,09 Q8IX02 LTF 0,04 -32,87 Q9Y6R7 FCGBP 0,00999 -42,71 A7Y9J9 MUC5AC 0,03 -72,44 FONTE: Software Progenesis QI (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Teste estatístico: análise de variância anova (p <0,05). 81 Continua Anexo J Tabela S3 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estágio IV, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão Q9H444 CHMP4B 0,000176 145,2 L7RDA5 DES 0,00153 72,02 B4DRS1 MATR3 0,000373 59,05 B4DVS4 ECH1 0,000171 58,52 Q9P1D9 EIF3I 0,0000145 53,28 P55290 CDH13 0,00191 49,03 P48059 LIMS1 0,0000897 48,29 L0R5C4 POTEG 0,00648 42,36 F8WD80 UBE2F 0,00000438 38,07 P14209 CD99 0,00559 30,24 D3DTX7 COL1A1 0,000405 25,14 P15531 NME1 0,00352 21,36 P0C0S5 H2AFZ 0,00214 18,69 O75367 H2AFY 0,00674 17,2 Q16778 HIST2H2BE 0,00149 15,68 B3KRY3 LAMP1 0,00145 14,01 Q5TEC6 HIST2H3PS2 0,00401 13,74 P62913 RPL11 0,000348 12,62 C9J0K6 SRI 0,0034 11,31 D6R9A6 HMGB2 0,01 11,16 A8MTJ3 GNAT3 0,02 10,72 H0YIB4 SRSF9 0,00453 10,67 B5MBZ8 PPP1R7 0,02 10,34 P16401 HIST1H1B 0,01 9,8 H3BRG4 UQCRC2 0,00612 9,54 H7C040 AGR3 0,02 9,53 P43686 PSMC4 0,00989 8,5 Q9BT78 COPS4 0,03 8,11 C9JQ41 CCDC58 0,00473 7,95 Q16777 HIST2H2AC 0,000158 7,74 Q6FGH9 DYNLL1 0,02 7,25 O75369 FLNB 0,02 7,2 A0A140T936 VARS 0,02 6,99 P10412 HIST1H1E 0,03 6,75 P31930 UQCRC1 0,01 6,54 A0A024RDQ0 HSPH1 0,04 6,45 Q6IBG1 MYL9 0,04 6,45 B4E312 TAF15 0,04 6,44 Q5SQT3 H2AFY2 0,04 6,4 A0A087X2D0 SRSF3 0,03 6,4 Q15233 NONO 0,01 6,23 S5DU27 HLA-C 0,03 5,88 A8KAQ5 SNRNP70 0,00943 5,82 P07360 C8G 0,05 5,71 82 Continua Continuação da Tabela S3 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estágio IV, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão B4DDR3 API5 0,02 5,68 Q96FJ2 DYNLL2 0,03 5,67 Q7Z4Y4 AK3 0,04 5,64 P38117 ETFB 0,00372 5,56 F8WES2 MTAP 0,00114 5,45 A2A3R6 RPS6 0,03 5,41 H7BZ35 DARS 0,03 5,4 C9JSU1 LRRFIP2 0,04 5,34 A0A024RAE4 CDC42 0,00416 5,26 H3BLU7 AKR7A2 0,03 5,24 Q9UBT2 UBA2 0,01 5,2 P62316 SNRPD2 0,00103 5,11 C9JXB8 RPL24 0,02 5,08 B3KSG0 ISYNA1 0,00622 5,06 A0A140TA33 TNXB 0,02 5,06 B4DZP5 DDB1 0,05 5,01 Q59H57 FUS 0,05 4,95 Q5T7C4 HMGB1 0,04 4,87 Q8WX93 PALLD 0,02 4,85 P55795 HNRNPH2 0,02 4,62 O00264 PGRMC1 0,01 4,61 O14561 NDUFAB1 0,03 4,59 P17987 TCP1 0,03 4,56 C9J712 PFN2 0,04 4,47 B7Z4B7 FHL1 0,006 4,44 Q59FA2 SRSF1 0,00289 4,44 Q9Y265 RUVBL1 0,00323 4,43 A0A0S2Z377 ANXA6 0,02 4,4 J3QL05 SRSF2 0,04 4,38 H0YJB9 RTRAF 0,03 4,36 Q6FHM6 SNU13 0,02 4,35 Q9BSV4 SFPQ 0,00682 4,34 F2Z388 RPL35 0,04 4,3 A6NLN1 PTBP1 0,02 4,28 E9KL35 RACK1 0,01 4,28 K7EL21 CAPS 0,03 4,27 Q6LEE2 PCBD1 0,03 4,24 Q9Y3U8 RPL36 0,04 4,24 P23396 RPS3 0,02 4,23 D6RGI3 SEPT11 0,00855 4,23 H7C233 SUCLG1 0,05 4,14 A0A0S2Z3W7 ITPA 0,02 4,02 E9PCY7 HNRNPH1 0,02 3,99 B4DNM8 P3H1 0,000502 3,99 Q9BTQ7 RPL23 0,03 3,93 83 Continua Continuação da Tabela S3 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estágio IV, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão D6W539 HADHB 0,02 3,88 Q59EY4 SEPT7 0,00406 3,86 A0A024QZV0 TXNDC5 0,00436 3,84 P31948 STIP1 0,03 3,8 P49411 TUFM 0,05 3,79 Q53GL5 IDH2 0,03 3,78 J3QLI9 SNRPD1 0,03 3,78 P61160 ACTR2 0,04 3,76 F6RFD5 DSTN 0,02 3,75 Q0VGD6 HNRNPR 0,00591 3,73 F5GYN4 OTUB1 0,03 3,73 V9HW31 ATP5F1B 0,01 3,7 B2R959 HNRNPL 0,02 3,7 Q14568 HSP90AA2P 0,00829 3,7 Q9Y266 NUDC 0,02 3,7 P62241 RPS8 0,04 3,7 Q53XJ5 FKBP2 0,05 3,69 A0A087WUK2 HNRNPDL 0,02 3,69 K7EMD6 SGTA 0,04 3,65 P62318 SNRPD3 0,02 3,65 E5RIW3 TBCA 0,02 3,65 Q8TB01 CKAP4 0,00391 3,63 P35268 RPL22 0,02 3,62 P68363 TUBA1B 0,01 3,61 P20674 COX5A 0,02 3,6 P31939 ATIC 0,03 3,59 A0A024RCM3 DDX39B 0,02 3,58 G8JLA2 MYL6 0,01 3,58 B7ZAR1 CCT5 0,01 3,57 P37108 SRP14 0,05 3,57 Q96CN7 ISOC1 0,03 3,56 V9HVX6 ALDH1A1 0,04 3,55 Q03252 LMNB2 0,01 3,55 B4DZ08 ACO2 0,05 3,54 P29373 CRABP2 0,03 3,5 P30049 ATP5F1D 0,02 3,49 K7EKP1 APOC1 0,05 3,48 B4DY09 ILF2 0,05 3,48 V9HW53 DDAH2 0,05 3,47 O94788 ALDH1A2 0,00383 3,42 Q92688 ANP32B 0,04 3,41 A0A024R8Q1 GAA 0,02 3,41 A0A024R4K3 MDH2 0,03 3,41 B3KSQ7 DBN1 0,04 3,39 B2R5U1 SND1 0,02 3,39 D6R9P3 HNRNPAB 0,04 3,36 84 Continua Continuação da Tabela S3 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estágio IV, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis Q5CAQ5 HSP90B1 0,04 3,36 P39019 RPS19 0,05 3,34 P50454 SERPINH1 0,00691 3,32 A0A0U4BW16 MYH9 0,02 3,31 P24666 ACP1 0,00142 3,29 B4DUQ1 HNRNPK 0,03 3,29 H3BPC4 UBE2I 0,0078 3,28 B5MCX3 SEPT2 0,00878 3,26 Q71U36 TUBA1A 0,02 3,25 A0A087X0X3 HNRNPM 0,04 3,24 E9PJD9 RPL27A 0,03 3,23 Q08211 DHX9 0,00322 3,22 Q60FE6 FLNA 0,04 3,22 B2R5W2 HNRNPC 0,04 3,22 Q7Z612 RPLP1 0,04 3,2 Q59GL1 SYNCRIP 0,01 3,19 Q9Y3Z3 SAMHD1 0,02 3,18 Q13263 TRIM28 0,05 3,18 Q562R1 ACTBL2 0,03 3,17 E7EX53 RPL15 0,0079 3,17 P62873 GNB1 0,03 3,14 P52209 PGD 0,00144 3,14 Q16762 TST 0,03 3,12 Q53GC7 CAPZA2 0,00273 3,1 F8W1A4 AK2 0,04 3,09 P07437 TUBB 0,02 3,09 V9HWB5 PPA1 0,04 3,08 D6RAW0 UBE2D3 0,00121 3,07 A8K6Y1 PA2G4 0,04 3,06 B8ZZU8 ELOB 0,04 3,05 Q14240 EIF4A2 0,03 3,04 P02461 COL3A1 0,04 3,03 P49458 SRP9 0,04 3,03 P05455 SSB 0,01 3,03 Q96IR1 RPS4X 0,00447 3,01 B4DHX4 GDI1 0,04 3 B7Z972 PCMT1 0,00365 2,99 P63261 ACTG1 0,02 2,97 P07195 LDHB 0,03 2,97 Q9NTK5 OLA1 0,01 2,96 O43396 TXNL1 0,05 2,96 B3KQ51 PPP2CA 0,04 2,94 A0A024RAI1 ACTR3 0,01 2,93 A0A087WTP3 KHSRP 0,03 2,92 B4DPW9 PLS3 0,02 2,92 O60701 UGDH 0,04 2,91 85 Continua Continuação da Tabela S3 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estágio IV, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis P50395 GDI2 0,00142 2,9 B4E1T4 SFRP4 0,04 2,9 P31942 HNRNPH3 0,02 2,86 A0A0S2Z4G7 NPM1 0,02 2,85 H0YNW5 DUT 0,03 2,84 P28838 LAP3 0,03 2,83 B4DVZ8 LTA4H 0,01 2,82 P50914 RPL14 0,05 2,81 B4DU58 CAPG 0,03 2,79 B4DL49 CTSB 0,03 2,77 P14618 PKM 0,01 2,77 Q9Y490 TLN1 0,02 2,77 B4DDB6 HNRNPA3 0,04 2,76 V9HW41 UBE2N 0,05 2,76 B4DH02 HSPA4 0,05 2,75 Q6IPN6 EEF1A1 0,04 2,74 V9HVZ4 GAPDH 0,03 2,73 P07900 HSP90AA1 0,03 2,73 V9HWE9 GSTP1 0,03 2,72 H3BQZ7 HNRNPUL2-BSCL2 0,02 2,72 P61970 NUTF2 0,02 2,72 A0A024RDF4 HNRNPD 0,02 2,71 B1Q3B3 FTL 0,04 2,69 F8VZ49 HNRNPA1 0,02 2,67 A0A024R4F1 ENO1 0,02 2,66 A4D177 CBX3 0,03 2,65 Q9Y3I0 RTCB 0,04 2,65 B3KTA3 FSCN1 0,03 2,64 B4DKN9 RHOA 0,0079 2,6 P22314 UBA1 0,03 2,6 P27824 CANX 0,04 2,59 Q9UPN1 PPP1CC 0,05 2,59 H0YN26 ANP32A 0,02 2,58 A0A024R3X4 HSPD1 0,02 2,58 F6WIT2 PTPA 0,00964 2,58 B4DX14 ALDH9A1 0,03 2,56 P13639 EEF2 0,04 2,54 P78417 GSTO1 0,03 2,53 Q9H2U2 PPA2 0,02 2,53 A8K7F6 EIF4A1 0,05 2,51 K7EK07 H3F3A/H3F3B 0,00872 2,5 B4DDZ5 HADHA 0,01 2,47 V9HWB9 LDHA 0,05 2,46 X6RJP6 TAGLN2 0,02 2,45 P68402 PAFAH1B2 0,01 2,39 A0A024QYX3 RBM3 0,02 2,38 86 Continua Conclusão da Tabela S3 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estágio IV, fase menstrual proliferativa) Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis B4DNR3 ABHD14B 0,02 2,37 V9HW80 VCP 0,04 2,36 F8W020 NAP1L1 0,04 2,35 D3DQ69 SERBP1 0,05 2,35 A0A1B0GW44 CTSD 0,05 2,34 O95994 AGR2 0,01 2,33 A8K590 ILF3 0,03 2,33 P63208 SKP1 0,03 2,33 P27348 YWHAQ 0,02 2,33 Q2Q9B7 G6PD 0,03 2,32 A0A024R694 ACTN1 0,03 2,31 B7Z3S4 HDAC1 0,02 2,3 A0A024R1U4 RAB5C 0,04 2,28 Q04760 GLO1 0,02 2,27 P62258 YWHAE 0,03 2,2 P63241 EIF5A 0,04 2,16 P13010 XRCC5 0,03 2,14 A4QPB0 IQGAP1 0,03 2,13 Q86V81 ALYREF 0,04 2,11 A0A024R442 DNPEP 0,05 2,1 Q04917 YWHAH 0,03 2,08 E7END7 RAB1A 0,03 2,05 Q6ZN40 TPM1 0,03 2 P61981 YWHAG 0,000772 1,83 V9HWA9 C3 0,03 -1,43 P06727 APOA4 0,02 -2,68 B4DPP6 ALB 0,00686 -6,18 H0Y6A4 PAEP 0,05 -18,22 FONTE: Software Progenesis QI (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Teste estatístico: análise de variância anova (p <0,05). 87 Continua Anexo K Tabela S4 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estádio II, fase menstrual secretora) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão A0A087WWY3 FLNA 0,05 207,18 B4DUP0 EEF1G 0,04 129,03 A0A024RCA7 RPLP2 0,00109 125,76 P67809 YBX1 0,00322 68,47 Q7Z532 OGN 0,03 43,16 F2Z2S8 RPS3 0,03 38,27 Q6IA16 NUCKS1 0,03 34,28 P08727 KRT19 0,04 33,6 D6R9A6 HMGB2 0,01 33,24 A0A024RDG1 USO1 0,00676 32,27 H0Y704 ZNF185 0,01 27,89 A0A024QZV0 TXNDC5 0,02 24,95 C9JMJ2 SFRP4 0,02 23,54 P49411 TUFM 0,02 18,89 H0YEG8 NUCB2 0,01 17,13 S4R457 HNRNPK 0,000427 16,55 H0YAG8 ADH5 0,04 16 Q53GL6 RALY 0,02 15,56 B4DLL8 GPNMB 0,02 14,82 A0A0C4DGM1 TPSAB1/TPSB2 0,03 13,7 D6R991 MATR3 0,01 13,49 Q59G24 SUB1 0,02 12,58 B2R4M6 S100A9 0,02 12,27 Q16643 DBN1 0,02 11,75 Q8NDV3 SMC1B 0,04 11,4 Q6NZI2 CAVIN1 0,02 11,36 B4DLP5 TXNDC11 0,04 11,09 B7Z6S8 RPL14 0,02 11,03 Q9Y6R7 FCGBP 0,01 10,52 A0A090N8Y2 PDIA4 0,01 10,29 J3QR68 HP 0,03 9,62 B4DHY1 HNRNPH3 0,03 9,5 Q53EU7 NDRG1 0,02 9,41 B2RTX2 PALLD 0,04 9,25 Q5D6A5 GSTP1 0,03 8,89 P08670 VIM 0,01 8,48 B2R9V7 SOD3 0,03 8,45 B7Z4W4 RAD23B 0,01 8,36 E5RIP1 RPS20 0,0096 8,31 V9HWP0 APCS 0,0098 8,07 J3QLE5 SNRPN 0,02 8,07 P02792 FTL 0,01 8,03 G8JLJ2 SOD2 0,03 8,03 P28072 PSMB6 0,02 7,94 88 Continua Continuação da Tabela S4 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estádio II, fase menstrual secretora) Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis A0A087WTP3 KHSRP 0,00711 7,21 Q6NZ44 FTH1 0,000614 7,1 G3V5M2 PNP 0,01 7,1 Q5TA02 GSTO1 0,0043 6,77 Q59FU3 FUBP1 0,03 6,57 E9PPU6 NAGK 0,05 6,41 Q8NAG3 TPM3 0,04 6,38 A0A024R5H0 BANF1 0,03 6,2 A0A024QZJ6 MYH11 0,02 6,2 A7BI36 RRBP1 0,05 6,2 F8VRK0 TUBA1B 0,00612 6,1 E9PB61 ALYREF 0,00617 6,04 H0YDS0 UBQLN1 0,04 6,02 D3DWL0 PLEC 0,04 5,98 P54687 BCAT1 0,00812 5,95 A0A1B0GV06 ASAH1 0,05 5,88 B2R4F3 ARHGDIB 0,04 5,84 B4DLX5 PTPA 0,00342 5,83 B3KY04 KCTD12 0,05 5,76 B4E3Q9 VCL 0,03 5,32 Q96HX0 TUBB4B 0,02 5,3 P67936 TPM4 0,03 5,13 Q0P5N8 TMSB10/TMSB4X 0,03 5,12 Q69YR8 GSN 0,04 5,1 P05787 KRT8 0,02 5,06 K7ELL7 PRKCSH 0,02 5,06 O14950 MYL12B 0,02 5,04 G8JLB6 HNRNPH1 0,04 4,94 Q53FV4 LUM 0,00645 4,73 A0A0J9YXB8 PSAP 0,04 4,62 Q06830 PRDX1 0,00902 4,59 I6L965 KRT18 0,04 4,56 C9JYS8 NONO 0,03 4,53 P08236 GUSB 0,03 4,49 P00747 PLG 0,03 4,45 P63261 ACTG1 0,00656 4,43 A0A024R1A3 UBA1 0,01 4,35 H0YKP3 TPM1 0,05 4,28 O00193 C11orf58 0,04 4,18 Q59FA2 SRSF1 0,01 4,17 B4E1B2 TF 0,21 4,17 O43707 ACTN4 0,03 4,12 F8VPP1 AK2 0,04 4,11 B4DHX4 GDI1 0,05 4,11 P23246 SFPQ 0,07 4,09 A0A0C4DGQ5 CAPNS1 0,04 3,98 P13010 XRCC5 0,01 3,98 89 Continua Continuação da Tabela S4 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estádio II, fase menstrual secretora) Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis B4DHR1 CALR 0,04 3,9 K7EMN2 PGD 0,04 3,89 Q5T7C4 HMGB1 0,03 3,84 P60174 TPI1 0,03 3,82 V9HW44 PAFAH1B2 0,01 3,75 B3KQK3 CALU 0,05 3,69 A0A087WXP0 AZU1 0,03 3,67 V9GYG2 AKR1A1 0,05 3,66 P55072 VCP 0,01 3,65 Q6IBN6 CBX1 0,02 3,61 P29966 MARCKS 0,05 3,6 Q09666 AHNAK 0,13 3,57 A8K2H4 CTSB 0,03 3,57 F2Z393 TALDO1 0,04 3,54 Q56G89 ALB 0,01 3,52 Q6EEV6 SUMO4 0,02 3,48 D6RC06 HINT1 0,05 3,41 O95678 KRT75 0,03 3,35 B4E022 TKT 0,03 3,35 A0A024R5Z9 PKM 0,05 3,21 G3V361 CALM1 (includes others) 0,04 3,16 H6VRG1 KRT1 0,02 3,12 A8K6U7 HNRNPUL1 0,04 3,01 E7EX29 YWHAZ 0,05 2,97 P10599 TXN 0,03 2,93 Q9UNU2 C4A/C4B 0,03 2,92 A0A140VK69 GOT1 0,05 2,91 P50395 GDI2 0,04 2,87 Q4JM47 AGR2 0,04 2,86 P62318 SNRPD3 0,03 2,78 A0A0U4BW16 MYH9 0,02 2,75 A0A087WT59 TTR 0,01 2,69 G3V5Z7 PSMA6 0,00882 2,3 P01871 IGHM 0,03 2,25 H0YM50 ANXA2 0,06 2,24 Q09028 RBBP4 0,02 2,24 B2RE56 PPIA 0,02 2,04 P00367 GLUD1 0,18 2 Q68CN4 IGHG1 0,13 1,61 Q8IZI0 HBB 0,84 1,19 A0A1S5UZ07 TLN1 0,69 1,02 A0A087WTT1 PABPC1 0,29 -1,53 A0N071 HBD 0,05 -1,84 A0A024R8S5 P4HB 0,55 -1,93 P27105 STOM 0,03 -2,33 V9HW26 ATP5F1A 0,02 -2,46 B4E216 C3 0,00639 -2,56 90 Continua Conclusão da Tabela S4 - Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estádio II, fase menstrual secretora) Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis Identificação Progenesis O14979 HNRNPDL 0,38 -3,13 V9HVZ4 GAPDH 0,04 -3,5 P04040 CAT 0,05 -3,94 P02647 APOA1 0,09 -3,97 P35754 GLRX 0,00245 -4,94 P02790 HPX 0,01 -7,52 V9HWE3 CA1 0,04 -8,35 P02671 FGA 0,006 -8,87 Q9Y3Z3 SAMHD1 0,2 -8,94 V9HWJ7 LCP1 0,01 -9,47 A0A024RA52 PSMA2 0,04 -18,88 V9GYM3 APOA2 0,00567 -34,97 FONTE: Software Progenesis QI (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Teste estatístico: análise de variância anova (p <0,05). 91 Continua Anexo L Tabela S5 – Lista de proteínas diferencialmente expressas no endométrio de mulheres com endometriose (estádio IV, fase menstrual secretora) Identificação Progenesis Código UniProt Anova (p-valor) Fold-change de expressão B0AZU6 HSPA4 0,00727 81,61 A8K3W9 HSP90AB1 0,01 61,35 H0YLA2 SRP14 0,03 51,07 Q1KSF8 TUBB 0,04 40,41 Q71VF9 SPTB 0,02 35,02 F8W180 MYL6 0,04 34,74 V9HVZ4 GAPDH 0,01 33,36 P06748 NPM1 0,02 28,73 H6VRG1 KRT1 0,03 25,23 P35527 KRT9 0,01 10,27 E9PF18 HADH 0,01 9,87 A0A024R3X4 HSPD1 0,04 9,32 Q9H7K8 CNDP2 0,03 7,72 E2DRY6 ENO1 0,03 6,8 Q15084 PDIA6 0,15 4,06 Q53T09 XRCC5 0,21 2,05 A0A0K2BMD8 HBA1/HBA2 0,44 1,97 P02768 ALB 0,15 1,71 Q53GK6 ACTB 0,3 1,61 B4DEF7 HSPA5 0,42 1,42 Q14473 HBB 0,06 -2,19 B7Z8B6 ITIH1 0,04 -2,43 V9HW31 ATP5F1B 0,05 -2,66 Q68CN4 IGHG1 0,04 -4,12 P02787 TF 0,02 -4,27 A0A0G2JMB2 IGHA2 0,03 -4,72 Q59GR5 BPGM 0,02 -6,54 A5PL27 CP 0,05 -15,38 P01833 PIGR 0,01 -36,59 X6R9L0 DNAJC3 0,02 -87,71 P55072 VCP 0,02 -99,18 V9HWA9 C3 0,000697 -131,39 FONTE: Software Progenesis QI (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Teste estatístico: análise de variância anova (p <0,05). 92 Continua Anexo M Tabela S6 - Redes de interação mais significativas das proteínas diferencialmente expressas em pacientes com endometriose. Grupo de pacientes com endometriose Proteínas da rede de interação Total de proteínas da rede Proteínas da amostra Doenças e vias funcionais Todos AGT,AHSG,AL B,APOH,BIRC5, CCND1,CLU,CP, CYBA,DDAH1,EL ANE,F3,FBLN1,H NF1A,HSF1,HSP A8,IGF2R,IGFBP 2,IL7R,ITGAM,IT GB2,JAK1,LMNA, LTF,MYH14,NUM A1,OSCAR,PCB P1,SLPI,SRSF1, TGFB1,TLR3,TN F,VEGFA,miR- 146a-5p 20 12 Sinalização e interação célula-a- célula, desenvolvimento e função do sistema hematológico, tráfico de células imunes BRCA1,CCL5,C CS,CTDP1,CXC L1,CXCL8,CYP 1A1,E2F3,EIF4 G1,ELANE,HBB ,HIF1A,HLA- A,HMGA2,HNR NPH1,HSPA5,IF NG,IGFBP3,Imu noglobulina,JAK 1,KIR,KRT6A,M TPN,NANOG,O SCAR,PIGR,PT GER2,PTGER4, RAD51,RBBP8, RNA polimerase II,SET,TLR3,TP 63,WFDC2 17 11 Resposta Inflamatória, Lesão do Organismo e Anormalidades, Câncer 93 Continua Continuação da Tabela S6 - Redes de interação mais significativas das proteínas diferencialmente expressas em pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Proteínas da rede de interação Total de proteínas da rede Proteínas da amostra Doenças e vias funcionais Endometriose, estádio II, fase proliferativa ASAH1,ATP5F1 B,Akt,C3,CD28, CD3,CS,CTSB, CTSC,Creb,ELA NE,ENO1,ERK1 /2,HSP90B1,HS PA5,IQGAP1,Ig G,KLK6,LCP1,L DHB,LDL,MAP3 K7,MUC5AC,M YD88,NME1,NR G1,RAP1B,RBP 4,SERPINA1,SE RPINA3,TCR,T PI1,VCP,VIM,Y WHAZ 36 22 Movimento Celular, Câncer, Doença Gastrointestinal CALM1,CCL2,C CL5,CCND1,CD KN1A,CELF1,C OL18A1,CXCL1 2,ELAVL1,ERK1 /2,ETV5,FH,GLI 1,GSTP1,HADH A,HNRNPA1,H NRNPR,IL15,IL1 B,Jnk,KRT18,K RT19,KRT8,LD HA,MGA,NFE2L 2,NOS3,PGD,PI K3CA,PTBP1,R PL13,TGFBR2, TKT,TLR4,TNF SF10 17 13 Desenvolvimento Celular, Crescimento Celular e Proliferação, Desenvolvimento de Órgãos 94 Continua Continuação da Tabela S6 - Redes de interação mais significativas das proteínas diferencialmente expressas em pacientes com endometriose. Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Endometriose, estádio IV, fase proliferativa 26s Proteasome,AC TR2,ACTR3,Akt ,C3,COL3A1,CT SB,CTSD,Creb, DES,DNA- PK,ERK1/2,FSC N1,HMGB1,HS P90AA1,HSP90 B1,HSPD1,Hsp 90,IQGAP1,LA MP1,LDL,LIMS 1,NFkB (complexo),NME 1,NPM1,PI3K (complexo),PPP 2CA,RHOA,RP L15,RPS6,STIP 1,TCR,VCP,Veg f,XRCC5 31 24 Comprometimento Celular, Resposta Inflamatória, Câncer AK2,APOA4,Akt ,CBL,CCL22,CC L3,CCND2,CD3, CDC42,CXCL11 ,CXCR4,ECH1, EEF2,GRM1,HN RNPK,IDH2,LD HB,MAPK14,M DH2,MYC,NFKB 1,NFKBIA,NFkB (complex),PA2G 4,PLCG1,PTK2 B,RBL1,RBL2,R PL22,RPS3,RP S4X,RUVBL1,T CR,TUFM,UQC RC1 17 16 Ciclo Celular, Desenvolvimento Função do Tecido Conjuntivo, Doenças Infecciosas 95 Continua Continuação da Tabela S6 - Redes de interação mais significativas das proteínas diferencialmente expressas em pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Endometriose, estádio II, fase secretora ANXA2,APOA1, APOA2,Actin,A kt,C3,C4A/C4B, CALR,ERK1/2,F Actin,FLNA,GS N,HMGB1,HP,H PX,IgG,KRT18, LCP1,LDL,LUM ,MARCKS,MYH 11,MYL12B,NO NO,OGN,P38 MAPK,PLEC,PL G,PPIA,PSMB6, SFPQ,VCL,VIM, YWHAZ,hemog lobina 42 27 Função e Manutenção Celular, Lesão do Organismo e Anormalidades, Doença Cardiovascular ACTN4,ANXA2, ARHGDIB,CAL M1,CASP1,CAS P14,CCL22,CD1 63,CD28,CELF1 ,CXCL11,CXCL 12,CXCL9,ELAV L1,GPNMB,GU SB,HNRNPDL, HNRNPK,IL13,I L1B,IL2,KHSRP ,LGALS1,MRC1, MYL12B,PDLIM 1,PKM,PRDX1, PRKCZ,RHOA, SRSF1,TF,TMS B10/TMSB4X,T P53COR1,ZNF1 85 20 16 Movimento Celular, Desenvolvimento e Função do Sistema Hematológico, Tráfico de Células Imunitárias 96 Continua Conclusão da Tabela S6 - Redes de interação mais significativas das proteínas diferencialmente expressas em pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Grupo de pacientes com endometriose Endometriose, estádio IV, fase secretora ACTB,APOH,A PP,ATP5F1B,C 3,C3AR1,CASP 10,CD46,CDH1, CFLAR,ENO1,E RK1/2,HADH,H BA1/HBA2,HSF 1,HSP90AB1,H SPA5,HSPA8,H SPD1,IFNG,IL1 0,IL13,IL17A,IL1 B,IL7,ITGB2,LD L,MYL6,PARP1, PDIA6,SERPIN A1,TCR,TLR3,T LR4,TUBB 21 12 Movimento Celular, Resposta Inflamatória, Doenças Infecciosas 26s Proteasome,AL B,APOH,BPGM, CEBPB,CFTR,C LU,CP,CXCL12, CXCL5,CXCL8, EIF2AK2,GAPD H,HBB,Hsp70,I L15,ITGB2,KRT 1,MBL2,NEIL2, NFkB (complexo),NPM 1,PARP1,PIGR, RNA polimerase II,SMAD7,TF,TL R3,TP53,TP63, VCP,XRCC5,let- 7a-5p,mir- 128,mir-204 19 11 Resposta Inflamatória, Lesão do Organismo e Anormalidades, Ciclo Celular FONTE: Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) 97 Continua Anexo N Tabela S7 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase proliferativa, estádio II) Gene regulador Tipo de molécula p- valor de sobreposição Proteínas diferencialmente expressas mir-122 microRNA 1,11E-06 ARHGAP1,CS,IQGAP1,SEPT2,TPD 52L2,VIM IL15 citocina 8,26E-06 ENO1,GAPDH,LDHA,PGD,TKT,TPI 1 TCR complexo 9,61E-06 ATP5F1B,CS,CTSB,ENO1,LDHB,N ME1,SERPINA3,TPI1 MDM4 enzima 1,68E-05 KRT8,SSBP1,VIM NEIL2 enzima 6,71E-05 ACTB,GAPDH HNRNPU transportador 6,71E-05 ACTB,GAPDH SERPINA1 outros 1,31E-04 HSP90B1,HSPA5,VCP HFE receptor transmembrana 1,34E-04 HSP90B1,HSPA5 C3AR1 receptor acoplado a proteína G 3,32E-04 C3,HSPA5 ELANE peptidase 4,64E-04 CTSB,MUC5AC LDL complexo 5,14E-04 C3,HSP90B1,HSPA5 POLR2A enzima 6,16E-04 ACTB,GAPDH FH enzima 7,90E-04 LDHA,TKT ESRRA receptor nuclear ligante dependente 1,43E-03 LDHA,LDHB GNA12 enzima 1,46E-03 IQGAP1,VCL,VIM CDH1 outros 2,58E-03 ACTB,VIM NR1H4 receptor nuclear ligante dependente 2,91E-03 LDHA,TPI1 NANOG regulador de transcrição 3,23E-03 HSPA1A/HSPA1B,SEC22B,YWHAE SFTPA2 outros 4,76E-03 HSPA5 KDM4B enzima 4,76E-03 VIM MSX2 regulador de transcrição 4,76E-03 VIM KISS1 outros 4,76E-03 GSTP1 IL1B citocina 5,23E-03 C3,LCP1,MUC5AC,SERPINA3 CDKN1A kinase 5,32E-03 CTSB,VIM CSF1 citocina 6,26E-03 HSP90B1,HSPA5 PPARG receptor nuclear ligante dependente 6,77E-03 MUC5AC,RBP4 NFE2L2 regulador de transcrição 6,77E-03 PGD,TKT Alpha 1 antitrypsin grupo 9,50E-03 CTSB 98 Continua Continuação da Tabela S7 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase proliferativa, estádio II) Gene regulador Tipo de molécula p- valor de sobreposição Proteínas diferencialmente expressas SOX4 regulador de transcrição 9,50E-03 VIM mir-940 microRNA 9,50E-03 ARHGAP1 NR1H2 receptor nuclear ligante dependente 9,50E-03 C3 NOS3 enzima 9,50E-03 GSTP1 TIMP3 outros 9,50E-03 VIM HNF1A regulador de transcrição 9,96E-03 ALB,SERPINA1,SERPING1 SMARCA4 regulador de transcrição 1,01E-02 GAPDH,GSTP1 IL13 citocina 1,04E-02 C3,CTSC,LTA4H,MUC5AC CTNNB1 regulador de transcrição 1,18E-02 SERPINA1,SERPINA3,VIM CACNA1C canal iônico 1,42E-02 ENO1 ZDHHC2 enzima 1,42E-02 VIM PTPN23 fosfatase 1,42E-02 VIM WDR5 enzima 1,42E-02 VIM GAB2 outros 1,42E-02 MUC5AC mir-124 microRNA 1,42E-02 PTBP1 let-7a-5p (and other miRNAs w/seed GAGGUAG) microRNA maduro 1,42E-02 VIM ACE peptidase 1,42E-02 LDHA CD99 outros 1,42E-02 TUBB3 Lh complexo 1,61E-02 ACTB,ARHGAP1,ARPC4,VCL miR-122-5p (miRNAs w/seed GGAGUGU) microRNA maduro 1,71E-02 CS,TPD52L2 IgG complexo 1,76E-02 ASAH1,CTSC,HSPA5 Tnf receptor grupo 1,89E-02 C3 N-cor grupo 1,89E-02 GSTP1 CTNND1 outros 1,89E-02 VIM DAB2IP outros 1,89E-02 VIM FOXA2 regulador de transcrição 1,89E-02 ALB MTUS1 outros 1,89E-02 VIM EGFR kinase 1,94E-02 HSPA5,VIM ELAVL1 outros 2,11E-02 CALM1 (includes others),RPL13 IL6 citocina 2,19E-02 ORM1,SERPINA3 ERVW-1 outros 2,36E-02 HSPA5 SLC9A3R1 outros 2,36E-02 KRT19 99 Continua Continuação da Tabela S7 - Principais genes r eguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacient es do grupo com endometriose (fase proliferativa, estádio II) Gene regulador Gene regulador Gene regulador Gene regulador GPI enzima 2,36E-02 VIM ATF6 regulador de transcrição 2,36E-02 HSPA5 FHIT enzima 2,36E-02 VIM CUL7 enzima 2,36E-02 VIM MAPK7 kinase 2,36E-02 VIM SRF regulador de transcrição 2,46E-02 CAP1,VCL CXCL12 citocina 2,55E-02 ARPC4,SSBP1 ESR2 receptor nuclear ligante dependente 2,82E-02 GSTP1 NRG1 fator de crescimento 2,82E-02 MUC5AC PDE4B enzima 2,82E-02 MUC5AC CTCF regulador de transcrição 2,82E-02 MUC5AC DNAJB6 regulador de transcrição 2,82E-02 VIM PPID enzima 2,82E-02 VIM SF1 regulador de transcrição 2,82E-02 MYL6 THY1 outros 3,29E-02 VIM SIN3A regulador de transcrição 3,29E-02 GSTP1 FGF7 fator de crescimento 3,29E-02 APRT AREG fator de crescimento 3,32E-02 C3,SSBP1 NEUROG1 regulador de transcrição 3,32E-02 C3,LCP1 FSH complexo 3,40E-02 ACTB,ARHGAP1,ARPC4,VCL PADI2 enzima 3,75E-02 VIM DANCR outros 3,75E-02 VIM TNF cytokine 4,16E-02 C3,CTSC,MUC5AC,SEC22B,VCL JAK grupo 4,20E-02 VIM WWC1 regulador de transcrição 4,20E-02 VIM FZD8 receptor acoplado a proteína G 4,20E-02 VIM RLIM en 4,20E-02 VIM TGFB1 enzima 4,62E-02 ALB,SERPINA1,VIM PPARD receptor nuclear ligante dependente 4,66E-02 YWHAE CCAT1 outros 4,66E-02 VIM 100 Continua Conclusão da Tabela S7 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase proliferativa, estádio II) Gene regulador Gene regulador Gene regulador Gene regulador TGFA fator de crescimento 4,66E-02 MUC5AC TCF grupo 4,74E-02 SERPINA1,SERPINA3 Nota: O objetivo do p-valor de sobreposição é identificar os reguladores transcricionais que são capazes de explicar as mudanças observadas na expressão gênica. O p-valor de sobreposição mede se existe uma sobreposição estatisticamente significativa entre os genes do conjunto de dados e os genes, que são regulados por um regulador de transcrição. O mesmo é calculado usando o Teste Exato de Fisher. Significância é atribuída a valores de p <0,01. 101 Continua Anexo O Tabela – S8 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase proliferativa, estádio IV) Gene regulador Tipo de molécula p- valor de sobreposição Proteínas diferencialmente expressas TCR complex 4,76E-12 AK2,APOA4,ATP5F1B,CTSB,ECH1,E NO1,FLNA,HSPD1,IDH2,LAMP1,LDH B,MDH2,NME1,PA2G4,RPL15,RPL22 ,RPS3,RPS4X,TUFM,UQCRC1 mir-122 MicroRNA 0,000000253 G6PD,IQGAP1,LMNB2,NUDC,NUTF2 ,PKM,PPP2CA,RBM3,SEPT2 HSF1 regulador de transcrição 0,00000604 CBX3,EIF4A2,HNRNPA3,HSP90AA1, HSPH1,RAB5C,RPL22,SERPINH1 ADGRG3 receptor acoplado a proteína G 0,000157 CDC42,RHOA Lh complexo 0,000255 ACTN1,ACTR2,GNB1,PGRMC1,RAB 1A,RAB5C,STIP1,TLN1,TPM1,TUBA1 A IL15 citocina 0,000267 ENO1,G6PD,GAPDH,LDHA,PGD,PK M,RPS6 ESRRA receptor nuclear ligante dependente 0,000395 COL1A1,LDHA,LDHB GATA4 regulador de transcrição 0,00048 COL1A1,COL3A1,DES,MYH9,TPM1 AR receptor nuclear ligante dependente 0,000572 ACTR3,CKAP4,GDI1,NAP1L1,PLS3 SATB1 regulador de transcrição 0,000794 ACTG1,ACTN1,CTSD,HSP90AA1,ILF 3,RPLP1 SMAD3 regulador de transcrição 0,000933 C3,COL1A1,COL3A1,DDB1 HAND2 regulador de transcrição 0,00104 COL1A1,COL3A1,DES,TPM1 TBX5 regulador de transcrição 0,00104 COL1A1,COL3A1,DES,TPM1 RUNX1 regulador de transcrição 0,00116 ALB,MYH9,MYL9 FSH complexo 0,00153 ACTN1,ACTR2,GNB1,PGRMC1,RAB 1A,RAB5C,STIP1,TLN1,TPM1,TUBA1 102 Continua Continuação da Tabela – S8 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase proliferativa, estádio IV) Gene regulador Tipo de molécula p- valor de sobreposição Proteínas diferencialmente expressas DRAP1 regulador de transcrição 0,0022 GAPDH,HIST1H1B,ILF2 AIF1 outros 0,00227 COL1A1,COL3A1 SF1 regulador de transcrição 0,00227 COL1A1,MYL6 ELAVL1 outros 0,00283 FLNA,KHSRP,RACK1,RPS6 PRMT1 enzima 0,00316 FTL,HSP90AA1 SIN3A regulador de transcrição 0,00316 COL1A1,GSTP1 TMPO outros 0,00316 COL1A1,COL3A1 NFE2L2 regulador de transcrição 0,0041 FTL,G6PD,PGD CARM1 regulador de transcrição 0,00418 FTL,HSP90AA1 MYOCD regulador de transcrição 0,00438 COL1A1,COL3A1,DES,TPM1 SMARCA4 regulador de transcrição 0,0074 GAPDH,GSTP1,TUBB HOXA13 regulador de transcrição 0,00952 ALDH1A1,ENO1 26s Proteasome complexo 0,0111 CTSB,CTSD,LAMP1 let-7 microRNA 0,0116 EIF4A1,NAP1L1,PA2G4,PKM Actin grupo 0,0125 FLNA F Actin complexo 0,0125 FLNA GREM1 outros 0,0125 COL1A1 KISS1 outros 0,0125 GSTP1 LAMTOR1 outros 0,0125 RHOA PACS2 outros 0,0125 HLA-C TRPV4 canal iônico 0,0125 RHOA miR-133a-3p (and other miRNAs w/seed UUGGUCC) microRNA maduro 0,0125 FSCN1 miR-183-5p (miRNAs w/seed AUGGCAC) microRNA maduro 0,0125 IDH2 103 Continua Continuação da Tabela – S8 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase proliferativa, estádio IV) Gene regulador Gene regulador Gene regulador Gene regulador miR-196a-5p (and other miRNAs w/seed AGGUAGU) microRNA maduro 0,0125 COL1A1 mir-133 microRNA 0,0125 FSCN1 RBL1 regulador de transcrição 0,0148 DDB1,PA2G4 GNA12 enzima 0,0211 IQGAP1,PPP1CC,RHOA ERG regulador de transcrição 0,0221 APOC1,DBN1,DSTN,FLNB,HMGB1 HNF1A-AS1 outros 0,0233 HIST2H2BE,HMGB2 Alpha 1 antitrypsin grupo 0,0249 CTSB CSNK1A1 kinase 0,0249 HNRNPC DDR1 kinase 0,0249 COL1A1 ELP2 outros 0,0249 HSPA4 MBD2 regulador de transcrição 0,0249 G6PD NOS3 enzima 0,0249 GSTP1 NR1H2 receptor nuclear ligante dependente 0,0249 C3 TAZ enzima 0,0249 CDC42 TSIX outros 0,0249 COL1A1 mir-196 microRNA 0,0249 COL1A1 CXCL12 citocina 0,0275 CANX,HNRNPD,SSBP1 SERPINA1 outros 0,0281 HSP90B1,VCP AHR receptor nuclear ligante dependente 0,0334 COL1A1,COL3A1 ACE peptidase 0,0372 LDHA CACNA1C canal iônico 0,0372 ENO1 HNRNPU transportador 0,0372 GAPDH IRX1 regulador de transcrição 0,0372 HIST2H2BE KAT5 regulador de transcrição 0,0372 SRSF2 MRTFA regulador de transcrição 0,0372 MYL9 NEIL2 enzima 0,0372 GAPDH mir-124 microRNA 0,0372 PTBP1 104 Continua Conclusão da Tabela – S8 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase proliferativa, estádio IV) Gene regulador Gene regulador Gene regulador Gene regulador mir-665 microRNA 0,0372 KHSRP AREG fator de crescimento 0,0396 C3,HIST2H2BE,SSBP1 NANOG regulador de transcrição 0,0429 COL3A1,HNRNPH1,YWHAE HDAC1 regulador de transcrição 0,0478 COL1A1,GSTP1 FOXA2 regulador de transcrição 0,0492 ALB HFE receptor transmembranda 0,0492 HSP90B1 N-cor grupo 0,0492 GSTP1 THBS4 outros 0,0492 COL3A1 Tnf receptor grupo 0,0492 C3 ZBTB7B regulador de transcrição 0,0492 COL1A1 mir-145 microRNA 0,0492 FSCN1 Nota: O objetivo do p-valor de sobreposição é identificar os reguladores transcricionais que são capazes de explicar as mudanças observadas na expressão gênica. O p-valor de sobreposição mede se existe uma sobreposição estatisticamente significativa entre os genes do conjunto de dados e os genes, que são regulados por um regulador de transcrição. O mesmo é calculado usando o Teste Exato de Fisher. Significância é atribuída a valores de p <0,01. 105 Continua Anexo P Tabela S9 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase secretora, estádio II) Gene regulador Tipo de molécula p- valor de sobreposiçã o Proteínas diferencialmente expressas NFE2L2 regulador de transcrição 7,01E-10 FTH1,FTL,PGD,PRDX1, SOD2,TALDO1,TKT MDM4 enzima 9,82E-07 KRT8,P4HB,SOD2,VIM CARM1 regulador de transcrição 2,29E-05 FTH1,FTL,KRT1 IL15 citocina 1,10E-04 GAPDH,PGD,PKM,TAL DO1,TKT,TPI1 GLI1 regulador de transcrição 1,87E-04 KRT19,NES,S100A9,TU FM TCR complexo 2,53E-04 AK2,CTSB,FLNA,GLUD 1,RPS3,TALDO1,TPI1,T UFM BTG2 regulador de transcrição 3,35E-04 CAT,SOD2 S100A10 outros 8,30E-04 ANXA2,PLG DNAJB6 regulador de transcrição 8,30E-04 KRT18,VIM PRMT1 enzima 1,16E-03 FTH1,FTL THY1 outros 1,16E-03 NES,VIM KRT14 outros 2,70E-03 KRT1,KRT18,KRT8 EFNA5 kinase 3,38E-03 KRT1,KRT18,KRT75 CCL5 citocina 3,63E-03 PLEC,PNP,TUBB4B EFNA4 kinase 3,88E-03 KRT1,KRT18,KRT75 EFNA3 kinase 3,88E-03 KRT1,KRT18,KRT75 ELAVL1 outros 5,34E-03 CALM1 (includes others),FLNA,KHSRP GNA12 enzima 5,34E-03 MYH11,VCL,VIM HNF1A regulador de transcrição 5,39E-03 ALB,APCS,APOA2,GOT 1 KDM1A enzima 5,55E-03 HBB,KRT18 SRF regulador de transcrição 6,71E-03 MYH11,TUBB4B,VCL EFNA2 kinase 6,71E-03 KRT1,KRT18,KRT75 EFNA1 outros 7,08E-03 KRT1,KRT18,KRT75 RUNX1 regulador de transcrição 7,12E-03 ALB,MYH9 SNAI1 regulador de transcrição 7,12E-03 KRT18,KRT8 Actin grupo 7,54E-03 FLNA Beta Secretase grupo 7,54E-03 NES 106 Continua Continuação da Tabela S9 - Principais genes reguladores d as proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometrio se (fa se secretora, estádio II) Gene regulador Gene regulador Gene regulador Gene regulador F Actin complexo 7,54E-03 FLNA KDM4B enzima 7,54E-03 VIM MSX2 regulador de transcrição 7,54E-03 VIM KISS1 outros 7,54E-03 GSTP1 SUPT16H regulador de transcrição 9,81E-03 HNRNPK,KRT8 SSRP1 regulador de transcrição 9,81E-03 HNRNPK,KRT8 CDKN1A kinase 1,29E-02 CTSB,VIM Alpha 1 antitrypsin grupo 1,50E-02 CTSB JINK1/2 grupo 1,50E-02 PLG SOX4 regulador de transcrição 1,50E-02 VIM BCL11A regulador de transcrição 1,50E-02 HBB NR1H2 ligand-dependent nuclear receptor 1,50E-02 C3 NOS3 enzima 1,50E-02 GSTP1 HEYL regulador de transcrição 1,50E-02 MYH11 PAX6 regulador de transcrição 1,50E-02 KRT1 PIK3C2B kinase 1,50E-02 KRT1 TIMP3 outros 1,50E-02 VIM APOC3 transportador 1,50E-02 APOA1 let-7 microRNA 1,59E-02 BCAT1,PKM,VIM TP63 regulador de transcrição 1,75E-02 FUBP1,GAPDH,KHSRP, KRT1,TPM1 PRL citocina 1,98E-02 CTSB,KRT19,SAMHD1 OLFM2 outros 2,24E-02 MYH11 NEIL2 enzima 2,24E-02 GAPDH CACNA1C canal iônico 2,24E-02 ANXA2 ZDHHC2 enzima 2,24E-02 VIM PTPN23 fosfatase 2,24E-02 VIM WDR5 enzima 2,24E-02 VIM HEY2 regulador de transcrição 2,24E-02 MYH11 PDGFRB kinase 2,24E-02 MYH11 KL enzima 2,24E-02 SOD2 mir-665 microRNA 2,24E-02 KHSRP 107 Continua Continuação da Tabela S9 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase secretora, estádio II) Gene regulador Gene regulador Gene regulador Gene regulador let-7a-5p (and other miRNAs w/seed GAGGUAG) microRNA maduro 2,24E-02 VIM SP4 regulador de transcrição 2,24E-02 SOD2 HNRNPU transportador 2,24E-02 GAPDH TFAP2C regulador de transcrição 2,24E-02 SOD2 SMARCA4 regulador de transcrição 2,41E-02 GAPDH,GSTP1 IL1B citocina 2,47E-02 C3,GUSB,LCP1,SOD2 SATB1 regulador de transcrição 2,81E-02 ACTG1,GLRX,HBB ERK1/2 grupo 2,98E-02 C3,CALR,PSMB6 Tnf receptor grupo 2,98E-02 C3 N-cor grupo 2,98E-02 GSTP1 APLN outros 2,98E-02 CAT CTNND1 outros 2,98E-02 VIM DAB2IP outros 2,98E-02 VIM NKX2-3 regulador de transcrição 2,98E-02 MYH11 HFE receptor transmembrana 2,98E-02 TF BCL2 transportador 2,98E-02 NES FOXA2 regulador de transcrição 2,98E-02 ALB CD69 receptor transmembrana 2,98E-02 S100A9 SMO receptor acoplado a proteína G 2,98E-02 HBB MTUS1 outros 2,98E-02 VIM CDKN2A regulador de transcrição 3,01E-02 TPM1,VIM HMG20A regulador de transcrição 3,71E-02 KRT18 SLC9A3R1 outros 3,71E-02 KRT19 GPI enzima 3,71E-02 VIM FHIT enzima 3,71E-02 VIM CUL7 outros 3,71E-02 VIM MAPK7 kinase 3,71E-02 VIM 108 Continua Conclusão da Tabela S9 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase secretora, estádio II) Gene regulador Gene regulador Gene regulador Gene regulador TFAP2B regulador de transcrição 3,71E-02 SOD2 C3AR1 receptor acoplado a proteína G 4,44E-02 C3 ESR2 receptor nuclear ligante dependente 4,44E-02 GSTP1 IL22 citocina 4,44E-02 KRT1 EIF3A outros 4,44E-02 RAD23B PPID enzima 4,44E-02 VIM FSH complexo 4,47E-02 GOT1,KRT18,TLN1,TP M1,VCL Lh complexo 6,78E-02 KRT18,TLN1,TPM1,VCL Nota: O objetivo do p-valor de sobreposição é identificar os reguladores transcricionais que são capazes de explicar as mudanças observadas na expressão gênica. O p-valor de sobreposição mede se existe uma sobreposição estatisticamente significativa entre os genes do conjunto de dados e os genes, que são regulados por um regulador de transcrição. O mesmo é calculado usando o Teste Exato de Fisher. Significância é atribuída a valores de p <0,01. 109 Continua Anexo Q Tabela S10 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase secretora, estádio IV) Gene regulador Tipo de molécula p- valor de sobreposição Proteínas diferencialmente expressas HNRNPU transportador 0,00000685 ACTB,GAPDH NEIL2 enzima 0,00000685 ACTB,GAPDH HFE receptor de membrana 0,0000137 HSPA5,TF C3AR1 receptor acoplado a proteína G 0,0000342 C3,HSPA5 POLR2A enzima 0,0000636 ACTB,GAPDH TCR complexo 0,000332 ATP5F1B,ENO1,HADH,HSPD1 SERPINA1 outros 0,000471 HSPA5,VCP IL15 citocina 0,000481 BPGM,ENO1,GAPDH SMARCA4 regulador de transcrição 0,0011 GAPDH,TUBB LDL complexo 0,00117 C3,HSPA5 ADGRV1 receptor acoplado a proteína G 0,00154 HBA1/HBA2 CYP2C9 enzima 0,00154 HBA1/HBA2 SFTPA2 outros 0,00154 HSPA5 BCL11A regulador de transcrição 0,00307 HBB ELP2 outros 0,00307 HSPA4 NR1H2 receptor nuclear dependente de ligante 0,00307 C3 PAX6 regulador de transcrição 0,00307 KRT1 PIK3C2B kinase 0,00307 KRT1 CACNA1C canal iônico 0,0046 ENO1 FOXA2 regulador de transcrição 0,00613 ALB SMO receptor acoplado a proteína G 0,00613 HBB Tnf receptor grupo 0,00613 C3 ATF6 regulador de transcrição 0,00766 HSPA5 ERVW-1 outros 0,00766 HSPA5 IL22 citocina 0,00919 KRT1 SF1 regulador de transcrição 0,00919 MYL6 CARM1 regulador de transcrição 0,0122 KRT1 110 Continua Conclusão da Tabela S10 - Principais genes reguladores das proteínas diferencialmente expressas em pacientes do grupo com endometriose (fase secretora, estádio IV) Gene regulador Gene regulador Gene regulador Gene regulador RARB receptor nuclear dependente de ligante 0,0138 KRT1 TINCR outros 0,0138 KRT1 STAU1 transportador 0,0153 KRT1 TAL1 regulador de transcrição 0,0153 HBB EPO citocina 0,0168 TF HOXA13 regulador de transcrição 0,0183 ENO1 FGFR2 kinase 0,0198 KRT1 ATM kinase 0,0213 ACTB CD46 outros 0,0228 C3 KDM1A enzima 0,0228 HBB CDH1 outros 0,0243 ACTB RNA polymerase II complexo 0,0258 HBB RUNX1 regulador de transcrição 0,0258 ALB OSM citocina 0,0273 HSPA5 DRAP1 regulador de transcrição 0,0318 GAPDH TP63 regulador de transcrição 0,0373 GAPDH,KRT1 CSF1 citocina 0,0377 HSPA5 ESR1 receptor nuclear dependente de ligante 0,0407 C3 Nota: O objetivo do p-valor de sobreposição é identificar os reguladores transcricionais que são capazes de explicar as mudanças observadas na expressão gênica. O p-valor de sobreposição mede se existe uma sobreposição estatisticamente significativa entre os genes do conjunto de dados e os genes, que são regulados por um regulador de transcrição. O mesmo é calculado usando o Teste Exato de Fisher. Significância é atribuída a valores de p <0,01. 8. REFERÊNCIAS ______________________________________________________________ 112 8. Referências 1. Giudice LC, Kao LC. Endometriosis. Lancet. 2004;364(9447):1789-99. 2. von Theobald P, Cottenet J, Iacobelli S, Quantin C. Epidemiology of Endometriosis in France: A Large, Nation-Wide Study Based on Hospital Discharge Data. Biomed Research International. 2016:6. 3. Janssen EB, Rijkers ACM, Hoppenbrouwers K, Meuleman C, D'Hooghe TM. Prevalence of endometriosis diagnosed by laparoscopy in adolescents with dysmenorrhea or chronic pelvic pain: a systematic review. Human Reproduction Update. 2013;19(5):570-82. 4. Bellelis P, Dias JA, Podgaec S, Gonzales M, Baracat EC, Abrao MS. 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