Padrão de metilação do receptor de progesterona (PGR) em endométrio eutópico de pacientes com infertilidade relacionada à endometriose durante a fase secretora

ROCHA JUNIOR, CV. Methylation pattern of progesterone receptor ( PGR) on eutopic endometrium of patients with infertility related to endometriosis during stage secretory. Medicine University of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. Endometriosis is a disease characterized by ectopic growth of endometrial tissue histologically similar to the eutopic endometrium. Among this symptoms, is infertility accounts which is related to decreased endometrial receptivity and resistance to progesterone, important hormone involved in the establishment of this process and the maintenance of pregnancy. The etiology of endometriosis is not well known, but studies suggest that this disorder can be linked to epigenetic mechanisms of regulation of gene expression such as DNA methylation. The endometrial responsiveness to progesterone is mediated by receptors (PR-A and PR-B) which seem to be suppressed in these patients, possibly reducing or inactivity of these receptors, which could be a mechanism involved in the infertility associated with endometriosis. Studies in methylation of the gene encoding the A and B isoforms of progesterone receptor (PGR) showed that exon 1 of the PR-B isoform is hypermethylated and silenced have its expression in patients with the disease. However it has not been rated the methylation profile of this gene in infertile women with the disease, which could be involved in the infertility presented by these patients. The goal from study was to evaluate the methylation pattern of the PGR gene in eutopic endometrium of women with infertility related to endometriosis and infertile controls during the secretory phase. Endometrial biopsies were performed on 12 23 patients, divided into two groups: 12 infertile women without endometriosis (infertile Control) and 11 infertile women with endometriosis (Endometriosis). All endometrium collected were confirmed in the secretory phase of the cycle by classical histological analysis according to the criteria of Noyes. Genomic DNA was extracted with the QIAamp DNA Mini Kit and using the modified EpiTec Bissulfite Kit. The methylation pattern of PR-A and PR-B isoforms was assessed by HRM technique (Melting High Resolution) Methylation analysis of PR isoform The analyzed showed that the region is hipometilada, wherein the percentage of methylation was found 0% in both the groups with and without endometriosis. However, in the group with endometriosis, the PR-B isoform showed partially methylated in most patients with methylation percentage of 50% (n = 8), only one patient showed methylation in 80% of isoform B. In the group without endometriosis the PR-B isoform was shown hipometilada (0%). The hypomethylation of PR-A isoform suggests that this gene be in its active form, without change in his expression. However, hypermethylation of the PR-B isoform in women with endometriosis may be associated with gene silencing or reducing the expression, suggesting that the low response to progesterone in women with endometriosis can be directly linked to the reduction of its receptors in these patients.

Endometriosis, Infertility, PGR, PR-B, methylation, Secretory Phase 13 Lista de figuras Figura 1. Mecanismo de metilação do DNA..................................................................24 Figura 2. Regulação epigenética em ilhas CpG mediada pela metilação do DNA........25 Figura 3. Esquema representativo do gene PGR............................................................27 Figura 4. Esquema representativo da localização das regiões promotoras da PR-A e PR- B localizadas no gene PGR.............................................................................................29 Figura 5. Fluxograma da metodologia............................................................................40 Figura 6. Eletroforese com DNA extraído das biopsias endometriais...........................42 Figura 7. Eletroforese evidenciando as bandas formadas pelos primers PR-A (100bps) e PR-B (200 bps)................................................................................................................43 Figura 8 . Curva de diluição seriada de controle de DNA padrão com diferentes porcentagens de metilação para isoforma PR-A..............................................................44 Figura 9. Resultado do HRM para isoforma PR-A........................................................44 14 Figura 10 . Curva de diluição seriada de controle de DNA padrão com diferentes porcentagens de metilação para isoforma PR-B..............................................................45 Figura 11. Resultado do HRM para isoforma PR-B.......................................................45 Figura 12. Gráfico comparativo das porcentagens de metilação da isoforma PR -B nos grupo endometriose e controle infértil.............................................................................48 15 Lista de siglas DNA – Ácido Desoxiribonucleico RNA – Ácido Ribonucleico IMC – Índice de Massa Corporal PGR/ PR – Gene que expressa o receptor de progesterona PR-A – Isoforma A do receptor de progesterona PR-B – Isoforma B do receptor de progesterona DNMTs – DNA metil transferases ncRNAs – RNAs não codificadores VEGF-A – Fator de crescimento vascular endotelial LH – Hormônio Luteinizante CpG – Citosina – Fosfato – Guanina (Ilha CpG) 16 Lista de tabelas e quadros Quadro 1. Sequencia dos nucleotídeos iniciadores.......................................................37 Tabela 1. Datação histológica........................................................................................41 Tabela 2. Homogeneidade dos grupos avaliados...........................................................42 Tabela 3. Avaliação comparativa das porcentagens de metilação entre as isoformas PR - A e PR-B em pacientes inférteis com endometriose.......................................................46 Tabela 4. Avaliação comparativa das porcentagens de metilação entre as isoformas PR - A e PR-B em pacientes inférteis sem endometriose (Controle Infértil)..........................47 Tabela 5. Teste exato de Fisher para avaliação estatística da comparação das porcentagens aproximadas de metilação da isoforma PR -B entre pacientes inférteis com e sem endometriose.........................................................................................................49 17 Sumário Introdução..........................................................................................................18 Justificativa........................................................................................................30 Objetivo..............................................................................................................31 Hipótese.............................................................................................................32 Casuística e Metodologia...................................................................................33 Resultados.........................................................................................................40 Discussão..........................................................................................................49 Conclusão..........................................................................................................54 Referências Bibliográficas.................................................................................55 18 1. Introdução 1.1. Endometriose: A endometriose é uma doença ginecológica benigna caracterizada pela presença e crescimento de tecido endometrial ectópico funcional, que acomete entre 10 a 15% das mulheres no período reprodutivo [1]. O tecido ectópico é histologicamente semelhante ao endométrio de mulheres sem endometriose e ao endométrio eutópico de mulheres com a doença . Contudo , estes tecidos podem ser distintos tanto bioquímica quanto funcionalmente, incluindo sua receptividade a esteroides, potencial proliferativo e invasivo [2]. Em pacientes com a doença, o tecido endometriótico é comumente encontrado na cavidade pélvica, no peritônio pélvico, ovários, septo reto -vaginal, bexiga,e, mais raramente, no pericárdio, pleura, fígado, rim, e cérebro [3]. A apresentação clínica da endometriose é caracterizada por dismenorréia, dispareunia (dor durante o ato sexual), dor pélvica não cíclica e infertilidade [4]. Contudo, a endometriose pode se mostrar assintomática em 2 a 22% das mulheres. Já a ocorrência de endometriose em mulheres com dismenorréia é de 40 a 60%[5]. A laparoscopia é o método padrão -ouro para o diagnóstico da doença , mas é fortemente sugestiva por meio de exames ginecológicos, ultra-sonografia transvaginal e a ressonância magnética [6] e permite que os implantes peritoneais e ovarianos sejam qualificados de acordo com o tipo de lesão ( lesões vermelhas, negras ou brancas). Além disso, para melhor diagnosticar a evolução da doença, a American So ciety for Reproductive Medicine elaborou um sistema de classificação da endometriose em quatro está gios mundialmente aceitos: forma mínima (está gio I), leve ( estágio II), 19 moderada (estágio III) e severa ( estágio IV), cuja análise se baseia em um sistema de escores unificados considerando a extensão, profundidade e percentual das lesões , assim como a presença, de endometriomas e aderências pélvicas.. Algumas teorias tentam explicar o surgimento da endometriose. A primeira delas, descrita em 1919 por Meyer, é a teoria da metaplasia celômica , a qual sugere que o epitélio celômico se transforme por metaplasia em tecid o semelhante ao endométrio[8]. Partindo deste pressuposto é possível explicar a endometriose ovariana, a serosa peritoneal e a endometriose na ausência de menstruação [9]. Porém, esta teoria não explica a presença de endometriose em locais onde os tecidos não sejam derivados de epitélio celômico. Neste caso, se a metaplasia celômica fosse semelhante à metaplasia comum, a frequência de endometriose seria maior com a idade[8]. Outra teoria, proposta em 1927 por Sampson, é a teoria da implantação metastática, que procura explicar a endometriose através do refluxo menstrual via tuba uterina para dentro da cavidade abdominal , onde algumas célula s conseguem se implantar. Esta é a teoria mais aceita devido a o fato d o fluxo menstrual retrógrado ocorrer em 90% das mulheres[10], da presença de células epiteliais endometriais viáveis no fluido peritoneal [11] e da associação entre fluxo menstrual obstruído e endometriose[12]. Embora a teoria de Sampson seja a mais aceita, somente o refluxo tubário não basta para que a endometriose se estabeleça, pois 90% das mulheres possuem o refluxo menstrual e somente 10 a15% desenvolvem a doença. Dessa forma, para a ocorrência e manutenção da doença devem ocorrer: 20 1- O escape do sistema imunológico – onde acredita -se que o estabelecimento da doença dependa da capacidade das células endometriais implantadas ectopicamente neutralizarem a resposta imune[13, 14]; 2- O mecanismo de adesão – através de integrinas e caderinas, importantes para a adesão celular inicial[15]; 3- O mecanismo de invasão - dependente de metaloproteases da matriz (MMP) e de seus inibidores teciduais específicos (TIMPs)[16]; 4- O mecanismo de apoptose - em mulheres que apresentam endometriose a porcentagem de células que passa por apoptose é menor, indicando que algumas células podem continuar a exibir atividades fisiológicas fora de seus padrões normais[17]; 5- Neovascularização - O ambiente peritoneal é altamente angiogênico e o aumento na atividade e nas quantidades do VEG F-A ( vascular endothelial growth factor) é demonstrado no fluido peritoneal e no endométrio de mulheres com endometriose[18]; 6- Proliferação das células ectópicas – Acredita-se que a expressão aberrante de aromatase (enzima que catalisa biossíntese de estrógeno) esteja envolvida na patogênese da doença, pois é um estímulo de cres cimento independente do ovário[19, 20]. 1.2. Infertilidade e endometriose: A infertilidade está associada à endometriose e ocorre em 30 a 50 % das mulheres com esta desordem [21], contudo esta associação não est á completamente elucidada[22]. Estudos corroboram a diminuição da fecundidade em portadoras de endometriose[23]. Entretanto os mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese, 21 principalmente nos casos de endometriose mínima e leve, na s quais não se observa alteração mecânica do trato reprodutivo, ainda não foram esclarecidos[21]. Alguns autores sugerem a ocorrência de menores taxas de fertil ização, implantação e gestação em pacientes portadoras de endometriose [24, 25] . Este fato poderia ser decorrente do comprometimento da qualidade oocitária e, consequentemente, embr ionária e/ou de defeitos endometriais ou ainda da interação entre o endométrio e o embrião [26-28]. Evidências sugerem que defeitos funcionais do endométrio possam contribuir com a di minuída fecundidade apresentada por pacientes com esta doença[29]. Estudos moleculares sobre a falha de implantação embrionária em pacientes com endometriose sugerem a ocorrência de alterações na expressão e tradução de genes do endométrio eutópico envolvidos no processo de implantação [30]. Os receptores de progesterona, fatores de transcriçã o, enzimas envolvidas no metabolismo de esteroides, entre outros, são genes com expressão aberrante na endometriose durante o período favorável à implantação (janela de implantação) [31]. Entretanto, não há estudos com casuísticas e metodologias adequadas que nos permitam o completo entendimento dos mecanismos envolvidos na redução da fecundidade e potencial piora dos resultados dos procedimentos de reprodução assistida em portadoras de infertilidade relacionada à endometriose. 1.2.1. Receptividade Endometrial: A implantação é um processo altamente controlado que envolve a interação entre o endométrio e o embrião [32]. O sucesso depende do correto desenvolvimento do 22 embrião até o estágio de blastocisto e da chegada do embrião em um endométrio receptivo[31, 33, 34]. O endométrio humano passa por mudanças histológicas e estruturais ao longo do ciclo menstrual, que viabilizam a implantação do embrião e o desenvolvimento de uma gestação ou, em caso de ciclos sem concepção, a descamação endometria l luminal e sua posterior regeneração. Estas alterações cíclicas ocorrem nas diferentes fases do ciclo, proliferativa inicial, média e tardia, secretora inicial, média e tardia [35] . Contudo, o endométrio apenas se torna receptivo 6 -10 dias após o pico de LH da fase secretora média. [36, 37]. Durante este período receptivo do ciclo menstrual, ocorre no tecido eutópico do endométrio uma maior expressão de diversos fatores de crescimento, citocinas, moléculas de adesão e receptores de hormônios, envolvidos diretamente no processo de implantação embrionária [37]. Irregularidades no controle da expressão gênica, incluindo modificações epigenéticas, podem resultar em expressão aberrante de genes e/ou proteínas reguladoras do crescimento e diferenciação endometriais. Os receptores hormonais para progesterona são susceptíveis à modulação epigenética por possuírem em seus promotores regiões passíveis de receberem metilação, um dos mecanismos epigenéticos a ser detalhado no próximo tópico [32]. 1.3. Epigenética como uma possível causa para a Endometriose: Uma outra teoria tem sido formada sobre a etiologia da endometriose, soma ndo- se aos fatos já conhecidos de que a endometriose seja uma doença hormonal com anomalias imunológicas, esta apresenta -se como uma doença multifatorial com a associação de fatores ambientais e genéticos. . Estudos mostram que alguns genes estão 23 desregulados na endometriose e que essas alterações na expressão gênica estariam relacionadas aos mecanismos epigenéticos de controle como a metilação do DNA, as modificações de histonas e aos RNAs não codificadores[38]. O termo epigenética refere-se as alterações estáveis na expressão gênica que não são explicadas por mudanças na sequência de DNA. Os mecanismos epigenéticos atuam modificando a estrutura da cromatina e/ou de um determinado domínio cromossômico permitindo a ativação de alguns genes e o sil ênciamento de outros [39, 40] . Dentre os mecanismos epigenéticos de controle da expressão gênica estão as modificações de histonas que alteram a estrutura da cromatina pela adição de grupos químicos às caudas dessas proteínas que formam o nucleossomo. Tais modificações podem ser do tipo fosforilação, ubiquitinação , metilação e acetilação. Essas modificações geram um “código de histonas” que possui importante papel na modulação da transcrição[41, 42]. Outro mecanismo epigenético são os RNAs não codificadores (ncRNAs) que ativam ou silenciam genes em um determinado domínio cromossômico ou pela modulação da estrutura da cromatina[43]. O terceiro mecanismo epigenético de controle da exp ressão genica e o mais estudado até o momento é a metilação do DNA que consiste na ligação covalente de um radical metil ao carbono 5 de citosinas que precedem uma guanina, estrutura conhecida como dinucleotídeo CpG (Citosina -fosfato-Guanina), resultando n a conversão de citosina para 5 -metilcitosina na sequencia de DNA [44, 45] (Figura 1). Esta reação é reversível e catalisada pelas enzimas DNMTs (DNA metiltransferase)[45]. 24 Figura 1. Mecanismo de metilação do DNA. O radical metil é adicionado ao carbono 5 da citosina sob a ação da enzima DNA metiltransferase. Esta ligação é reversível [modificado de[45]]. As DNMTs se dividem em duas categorias, de acordo com suas funções biológicas. A primeira categoria diz respeito à manutenção da metilação do DNA, onde encontramos a DNMT1, a metiltransferase mais estudada nos mamíferos e principal metiltransferase. A segunda categoria compreende as enzimas envolvidas na na metilação de novo do DNA, sendo responsáveis pela estabilização de padrões de metilação do DNA durante o desen volvimento embrionário. Dentro destas c ategorias encontramos a DNMT3A e DNMT3B[45]. Acredita -se que o aumento da expressão dessas enzimas é pré-requisito para ocorrer a hipermetilação do DNA. Foi demonstrado que as três enzimas citadas encontram -se altamente expressas no epitélio de implantes endometrióticos quando comparados a um grupo controle sadio ou com tecido endometrial eutópico em mulheres com endometriose, sendo que neste último tecido somente o gene DNMT3A é expresso. Com base nestes dados acredita -se que a endometriose possa estar relacionada a hipermetilação do DNA [45]. A metilação do DNA geralmente está relacionada ao silenciamento gênico ou a redução da sua atividade[46, 47] (Figura 2) e, como dito, nos mamíferos este processo é 25 catalisado pelas DNMTs [48](Figura 1). O mecanismo de metilação do DNA , somado aos outros fatores epigenéticos de regulação da expressão gênica , é fundamental para o correto desenvolvimento de um organismo e auxilia na manutenção da estabilidade genômica atuando no silenciamento de retrotransposons [10]. Figura 2. Regulação epigenética em ilhas CpG mediada pela metilação do DNA. Na ausência de metilação nos dinucleotideos CpG a transcrição ocorre normalmente, mas quando encontram-se metilado o fator de transcrição não conseg ue se ligar e o gene é silenciado [modificado de 60] Dentre as alterações epigenéticas encontradas em pacientes com endometriose, a primeira evidência foi relatada em estudos envolvendo o gene HOXA 10 , gene com regiões conservadas de fatores transcricionais durante o desenvolvimento do organismo e de importância para a função uterina [45], o qual apresenta -se hipermetilado em mulheres com endometriose [58]. Uma segunda evidência é dada através de estudo que mostra o promotor da isoforma PR-B do gene PGR B hipermetilado na endometriose. Este fato é concomitante com a redução da expressão do PR-B, sugerindo então uma 26 regulação epigenética na expressão e silenciamento da isoforma B [38], entretanto este estudo não traz informações a respeito da fertilidade do grupo estudado. Outro indí cio relevante da atuação dos mecanismos epigenéticos na endometriose é a elevada expressão dos genes DNMT1, DNMT3A e DNMT3B em mulheres com essa doença [49]. Apesar das células somáticas serem geneticamente homogêneas, o que confere diferenças estruturais e funcionais é um sistema de diferenciação da expressão gênica que tem in ício durante o desenvolvimento embrionário e permanece nas sucessivas mitoses. Essas diferenciações ocorrem devido aos mecanismos epigenéticos de controle da expressão gênica que conferem a cada célula um fenótipo característico[50, 51]. Dentre os genes responsáveis pela expressão dos receptores de esteroides, os receptores de progesterona ( PGR) apresentam uma região de metilacão diferencial em sua região promotora, e estudos mostram que a região promotora da isoforma PR-B, mas não a região promotora da isoforma PR-A, encontra-se hipermetilada em pacientes com endometriose quando comparadas a pacientes sem a doença [49]. 1.4. Receptores de Progesterona: 1.4.1. Progesterona: A progesterona é um hormônio esteroide que atua neutralizando o efeito de estimulação do crescimento do estrógeno pela indução da diferenciação glandular e estromal do endométrio. Em pacientes com endometriose , o tratamento com progesterona é efetivo n a redução do cresci mento de tumores endometriais nos quais são expressos os receptor es de progesterona. Algumas respostas a este hormônio esteroide são mediad as por receptores. Entretanto, vários estudos tem mostrado que a 27 regulação da expressão dos receptores de progesterona é complexa [52]. A resistência à progesterona é comumente observada em paci entes portadoras de endometriose e este fato pode ser atribuído a níveis extremamente baixos de receptores deste hormô nio no tecido endometriotico [45]. Contudo não há estudos que confrontem dados de pacientes inférteis com endometriose e a diminuição dos receptores. 1.4.2. Receptores de Progesterona: O gene PGR, também conhecido como PR, que codifica o receptor de progesterona, é membro da superfamília dos receptores nucl eares e necessário para a implantação embrionária e subsequentemente para a decidualização. Localizado na região cromossômica 11q22-q23 e com oito exons [56], este gene possui dois diferentes promotores e sítios de inicio de tradução no primeiro éxon que produz duas isoformas, A e B (Figura 3)[53]. Figura 3. Esquema representativo do gene PGR codificador dos receptores de progesterona PR -A e PR -B evidenciando a localização dos promotores (F1 e F2) e a sobreposição que ocorre durante a transcrição das isoform as proteicas [modificado de 49] 28 Nos humanos existem duas distintas isoformas do PGR, denominados PR-A e PR-B, ambos codificados por um único gene e diferem pois a isoforma PR-B possui 164 aminoácidos a mais na porção N-terminal. A função do PR-B está relacionada a ativação transcricional dominante dos promotores sensíveis à progesterona, enquanto o PR-A atua como um repressor dominante sobre o PR-B e outros receptores de esteroides (estrogênio, andrógeno, receptores glucocorticóides e mineralocorticoides). Portanto a expressão relativa de PR- A/PR-B determina, em partes, a característica c elular de responder à progesterona [54]. Embora sejam expressos pelo mesmo gene, cada uma de suas isoformas possui uma região promotora distinta [52]. No endométrio, o nível de ambas isoformas aumenta progressivamente durante a fase proliferativa , pico imediatamente anterior à ovulação e diminui logo após a ovulação, sugerindo que o estrad iol estimule os níveis de PR [45 ].Contudo, a expressão de PR-B é indetectável e a PR-A é notadamente reduzida em tecidos endometrioticos. Um estudo demonstrou que o promotor do gene PR-B possui uma região rica em dinucleotídeos CpG, denominadas ilhas CpG as quais encontram -se hipermetiladas em tecidos endometrióticos de pacientes com endometriose em estágios II a IV. Este fato é concomitante com a redução da expressão do PR-B, sugerindo então uma regulação epigenética na expressão e silenciamento da isoforma PR-B [49] (Figura 4). 29 Figura 4. Esquema representativo da localização das regiões p romotoras da PR-A e PR- B localizadas no gene PGR. Nas caixas em cinza acima temos evidenciado a localização das ilhas CpG nas regiões promotoras [modificado de [45]]. 30 2. Justificativa A progesterona desempenha um papel regulador chave no processo de implantação embrionária, mobilizando diversos moduladores moleculares que sustentam a nidação embrionária. A insensibilidade à ação da progesterona, entre outros fatores, como epigenéticos, está ligada a defeitos no s receptores deste esteróide (PR -A e/ou PR-B) no endométrio eutópico de portadoras de endometriose, podendo contribuir tanto para a patogênese da doença, como para o comprometimento da implantação embrionária. Visto que a regulação epigenética desempenh a um papel na estabilização da receptividade do endométrio e subsequentemente na implantação do embrião e que a metilação do DNA tem sido diretamente correlacionada com a expressão de genes ligados à implantação, acredita-se que a hipermeti lação da região p romotora do gene PGR em pacientes com infertilidade associada à endometriose possa interferir na eficácia da atuação desse hormônio durante a fase secretora do ciclo , o que poderia justificar o quadro clínico. . 31 3. Objetivo 3.1 Objetivo Geral: Avaliar o padrão de metilação do gene que codifica o receptor de progesterona (PGR) em tecido endometrial eutópico de pacientes com infertilidade relacionada à endometriose durante a fa se secretora d o ciclo menstrual comparado ao tecido endometrial eutópico de mulheres inférteis sem endometriose na mesma fase do ciclo. 3.2 Objetivos Específicos: - Verificar o padrão de metilaçao da isoforma PR-A em tecido endometrial de mulheres com endometriose e mulheres inférteis sem endometriose - Verificar o padrão de metilaçao da isoforma PR-B em tecido endometrial de mulheres com endometriose e mulheres inférteis sem endometriose 32 2. Hipótese Alterações relacionadas à isoforma PR-B no padrão de metilação podem afetar a expressão do gene PGR durante a fase secretora de pacientes com infertilidade relacionada à endometriose, já que esta é a isoforma efetora da atuação do hor mônio progesterona no interior das células. 33 5. Casuística e Metodologia 5.1 Casuística: Trata-se de um estudo caso controle comparativo de pacientes inférteis com endometriose comparadas a mulheres controles inférteis sem endometrio se, realizado junto ao Laboratório de Ginecologia - Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP) e Laboratório de Biologia da Reprodução do Multiusuário – FMRP-USP. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas FMRP-USP, processo HCRP nº6383/2011. 5.2 -Pacientes: Foram incluídas pacientes que preencheram os critérios de inclus ão preestabelecidos e consentira m em participar do estudo após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Foram incluídas no estudo 23 pacientes, divididas em dois grupos: Controle infértil (12 pacientes) e endometriose (11 pacientes). Amostras endometriais de todas as pacientes foram obtidas com uso de Pipel le de Cornier durante a fase secretora do ciclo menstrual. 34 5.3 - Critérios de Inclusão: 5.3.1 - Grupo controle infértil: Mulheres com infertilidade por fator masculino e/ou tubário, ciclos menstruais regulares, sem endometriose, doença inflamatória pélvica ou outras anormalidades pélvicas avaliada por laparoscopia diagnóstica, e idade entre 18 e 45 anos. 5.3.2 - Grupo Endometriose: Mulheres com infertilidade relacionada à endometriose sem outros fatores de infertilidade, diagnosticada com qualquer estágio da doença durante a videolaparoscopia diagnóstica, segundo os critérios definidos pela American Society for Reproductive Medicine (1997), que classifica a doença em quatro estágios: mínima (estádio I), leve (estádio II), moderada (estádio III) e grave (estádio IV); ciclos menstruais regulares e idade entre 18 e 45 anos. 5.4 - Critérios de exclusão: Obesidade, definida pelo índice de massa corporal (IMC) maior ou igual a 30 Kg/m²; presença de doenças sistêmicas tais como: D iabetes mellitus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, lup us eritematoso sistêmico e outras doenças reumatológicas; infecção pelo vírus HIV ou qualquer infecção ativa; tabagismo, alcoolismo ou drogadição; uso de medicações hormonais e de antiinflamatórios hormonais e não-hormonais nos três meses anteriores à inclusão no estudo. 35 5.5 - Coleta e processamento do material: Foram revisados os prontuários das pacientes que buscaram os serviços de Reprodução Humana do Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto onde foram selecionadas as pacientes que previamente foram submetidas à videolaparoscopia diagnóstica há menos de 2 anos , que atenderam aos critérios de inclusão e exclusão e possuíam ciclos menstruais norma is (intervalos de 24 a 32 dias ± 3 dias; 2 a 7 dias de duração e fluxo de até 80 mL por ciclo) . A bi ópsia endometrial foi realizada ambulatoriamente por médico experiente em data agendada conforme o ciclo individual de cada paciente coincidindo com a fase secretora de seus ciclos menstruais . Para a confirmação de que a biópsia endometrial foi realizada no período secretor, todas as amostras foram submetidas à análise histológica clássica com coloração hematoxilina - eosina ( HE) e a determinação da fase se cretora do ciclo menstrual foi adequada de acordo com o resultado da datação endometrial, segundo os critérios de Noyes (Noyes et al.,1975) realizada por um patologista experiente. Imediatamente após a coleta, as amostras de endométrio foram armazenadas a -80Cº imersas em PBS. 5.6 - Extração do DNA: Aproximadamente 25mg de tecido endométrial foram cortados e lavados em PBS ( Phosphate Buffered Saline ) e armazenados em freezer -80 até a utilização. A extração de DNA foi realizada utilizando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, local) segundo recomentações do fabricante. Resumidamente, em cada amostra foram adicionados 180 µl de tampão ATL e 20µl de proteinase K, posteriormente col ocados em banho-maria a 56ºC até que o tecido estivesse totalmente digerido. Foi acrescido ao

200 µl de tampão AL e 200 µl de etanol absoluto. O material foi transferido 36 para coluna e centrifugado, com isso o DNA se aderiu à membrana da mesma. Sucessivas lavagens foram feitas com os tampões AW1 e AW2 (500 µl de cada) para purificação d o DNA extraído e ao final foi realizada a eluição do material genômico aderido à membrana com água aquecida a 56ºC. O DNA extraído foi mantido congelado a -20ºC e sua qualidade e integridade foram avaliadas em gel de agarose a 2% corado com GelRed (Biotium). 5.7 - Modificação por Bissulfito de Sódio: A seguinte etapa foi a modificação do material genômico utilizando o reagente bissulfito de sódio. Esta modificação permite a conversão in vitro das citosinas não metiladas presentes na moléc ula de DNA em uracilas para assim ser possível a análise do padrão de metilação pela presença das citosinas metiladas que permaneceram no DNA após a modificaçã o. Para tant o, foi utilizado o EpiTec Bissulfite Kit (Qiagen, Hilden Germany) . C onforme especificações do fabr icante 1,5 µg de DNA de cada amostra foram utilizados para a modificação, acrescido s de 85µl de bissulfite mix e 35 µl de protect buffer. A mistura foi levada ao termoc iclador onde se dá a modificação do DNA obedecendo á ciclagem de 95ºC por 5 minutos, 60ºC por 25 minutos, 95ºC por 5 minutos, 60ºC por 85 minutos, 95ºC por 5 minutos, 60ºC por 175 minutos e 20ºC por 5 minutos. Ao término da ciclagem, o material presente nos tubos foi acrescido de 560 µl de tampão BL e levado para colunas onde o DNA, agora já modificado, se prende à membrana presente na coluna e através de sucessivas centrifugações e lavagens com os tampões BW e BD (500 µl cada) purificando o DNA. A eluição do material aderido à membrana foi rea lizada finalmente com 20 µl do tampão de eluição EB. O DNA modificado foi estocado à -20º Cº. 37 5.8 – PCR convencional Para confirmarmos que os primers (quadro 1) estavam se anelando ás regiões corretas foi realizada uma PCR convencional onde foi utilizado 1 µl de DNA modificado, 2,5 µl de tampão, 1,5 µl de MgCL2 (1,5 mM), 0,5 µl de DNTPs (0,2 mM) 1 µl de Primer (0,5 µl do Foward e 0,5 µl do Reverse (0,5 µ)), 0,15 µl de TaqDNA Polimerase (1,25 u) e 18,35 µl de água totalizando um volume de 25 µl por reação. A ciclagem no termociclador obedeceu a sequencia de um primeiro estagio a 95 ºC por 12 minutos, um segundo estagio que se repetiu por 40 vezes de 94ºC por 30 segundos, 55ºC por 45 segundos, 72 ºC por 1 minutos e um terceiro estagio de 72 ºC por 8 minutos e 10ºC por 10 minutos. Ao final o produto de PCR foi submetido á eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed. Quadro 1. Sequencia dos nucleotídeos iniciadores Primer PR-A Primer PR-B Foward 5’-GGTTTTGTTAGGGATAGGATTTTTT-3’ Foward 5’- AGTATGGAGTTAGTAGAAGTT-3’ Reverse 5’-ACTACCTCCAACACCCCTTATAACT-3’ Reverse 5’-TCACAAGTCCAACACTTAAATAACT-3’ 5.9 –High Resolution Melting (HRM): Após a modificação por bissulfito, foi empregada a técnica de High Resolution Melting (HRM) onde, a princípio, o DNA é amplificado utilizando a técnica de PCR em tempo real (qPCR) . Nesta amplificação, as uracilas presentes na molécula de DNA modificado são copiadas nos novos fragmentos como timina, portanto , onde inicialmente no DNA genômico encontrávamos uma citos ina, base nitrogenada pirimídica, passamos a encontrar uma timina, base nitrogenada púrica. 38 Logo em seguida o fragmento recém sintetizado passa por um aumento sucessivo e gradual de temperatura até 95 ºC para se observar o ponto de dissociação da dupla fita dos fragmentos. A temperatura em que ocorre essa dissociação é chamada de ponto de dissociação ( melting) e através dela podemos estimar a porcentagem de metilação do DNA, visto que, quanto maior o número de timinas, mais fácil se dará sua dissociação pois se tratando de uma base púrica realiza somente 2 ligações de hidrogênio no pareamento com a base da fita hom óloga de DNA. Em contrapartida, quanto mais citosinas, mais tarde se dará sua dissociação , já que, esta sendo uma base pirimídica, realiza 3 ligações de hidrogênio, o que torna a fita de DNA mais estável em relação a uma fita rica em timinas e pobre em citosinas [57]. Para esta técnica, foram utilizados 2,5 µl de DNA modificado pelo tratamento de bissulfito de sódio de cada uma das amostra, 10 µl de MeltDoctor (Applied Biosystems) e 1 µl de cada oligonucleotideos iniciadores ( Primers). Os Primers aqui utili zados foram baseados nos já descritos por Wu et al. 2006 [49], e expostos no Quadro 1, que se anelam nas regiões em que se encontram os promotores das isoformas (Figura 3) e cujas sequencias estão dispostas no quadro 1. Junto às amostras, na mesma placa , foi acrescentada uma curva de diluição seriada utilizando DNA metilado proveniente do PCR control DNA Set kit (Quiagen) contendo DNA a 0%, 20%, 50%, 80% e 100% metilado. A placa contendo todas as amostras e a curva de referência foi levada ao termociclador 77500 FAST (Applied). A reação apresentava um volume total de 20 µl por reação que continha 2,5 µl de DNA modificado ou curva de diluiçã o, 10 µl de MelthDoctor, 0,5 µl de primer foward (PR -A ou PR -B) à 0,5 µ e 0,5 µl de primer reverse (PR-A ou PR-B) à 0,5 µ e 6,5 µl de água. 39 5.10– Dosagem sérica de progesterona: No momento de cada coleta de endométrio, foi também coletado sangue de cada uma das pacientes para dosagem sérica do nível de progestero 5.10na, afim de se confirmar a ovulação, confirmando assim que as coletas foram realizadas após a ovulação (progesterona ≥3 ng/ml). A dosagem foi realizada por quimiluminescência com o kit IMMULITE 2000 (Siemens). Também foi avaliada a homogeneidade dos grupos avaliando as variáveis IMC, idade, peso, altura e tamanho do ciclo (período compreendido entre o primeiro dia da menstruação e o primeiro dia da menstruação seguinte) 5.11 – Análise dos Resultados Obtidos por HRM e Análise estatística: As variáveis quantitativas avaliadas foram comparadas entre os grupos utilizando-se o teste t-Student. Os dados obtidos pelo HRM foram lidos pelo programa HRM Software que nos mostra a porcentagem de metila ção encontrada em cada amostra. Para comparação das porcentagens de metilação das isoformas PR -A e PR -B dos grupos amostrais foi realizado o teste exato de Fisher através do programa SAS 9.0. O nível se significância utilizado foi de 5% (P ≤ 0,05) . Um fluxograma contendo a sequê ncia de toda a metodologia descrita está disposto na Figura 5 40 Figura 5. Fluxograma da metodologia Análise de prontuários Contato com a paciente Coleta do material Dosagem da progesterona e datação histológica Extração de DNA Modificação por Bissulfito de Sódio High Resolution Melting Resolution Análise estatística 1335 analisados 130 Elegíveis 25 Aceitaram 23 Coletadas Eletroforese 41 6. Resultados Para dar inicio aos experimentos que avaliaram o padrão de metilação de cada uma das isoformas do PGR foi realizada a datação histológica das amostras segundo os critérios estabelecidos por Noyes 1975, para confirmação da amostra nos parâmetros estabelecidos. O resultado da datação (Tabela 1) confirma que todas as amostras foram coletadas dentro da fase secretora do período menstrual das pacientes. Tabela 1. Datação histológica Legenda da Amostra Grupo Estagio Datação (dia do ciclo) Intervalo do ciclo (dias) 2 Endometriose 2 24 28 3 Endometriose 1 24 28 4 Controle Infértil - 24 28 5 Endometriose 3 16 24 6 Controle Infértil - 17 28 8 Controle Infértil - 21 28 9 Controle Infértil - 17 27 10 Controle Infértil - 17 29 12 Endometriose 1 21 28 13 Controle Infértil 15 25 14 Endometriose 4 26 28 15 Controle Infértil - 15 28 17 Controle Infértil - 18 28 19 Controle Infértil - 19 28 20 Controle Infértil - 24 30 21 Controle Infértil - 26 32 22 Endometriose 1 23 28 25 Endometriose 4 19 30 26 Endometriose 3 22 30 27 Endometriose 4 23 28 28 Endometriose 2 23 28 31 Controle Infértil - 24 28 32 Endometriose 1 24 28 42 Os valores de média e desvio padrão das idades, altura, peso, IMC e dia do ciclo das pacientes estão apresentadas na tabela 2 . Não foram observadas diferenças em nenhuma características avaliadas entre os grupos com endometriose e controle infértil Tabela 2. Características quantitativas dos grupos avaliados. Grupo Idade (Anos) Altura (Metros) Peso (KG) IMC Tamanho do Ciclo (Dias) Controle Infértil 36,27 1,6 62,03 24,12 27,92 Endometriose 35,48 1,64 67,68 25,29 28 Valor p* 0,67 0,21 0,28 0,55 0,88 P*=nível de significância Após a confirmação de que as amostras estavam adequadas ao proposto, o DNA foi extraído como descrito anteriormente e uma eletroforese foi realizada em algumas amostras para validação da integridade do material genétic o extraído, como mostra a Figura 6. O material se mostrou íntegro e apto para dar prosseguimento aos experimentos. Figura 6. Eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed com DNA extraído das biópsias endometriais . 43 Após a amplificação do DNA modificado foi observado que os primers para as isoformas se anelavam nas regiões que compreendiam às regiões para as quais foram desenhados devido às bandas formadas de tamanho molecular correspondente como mostra a Figura 7. Figura 7. Eletroforese evidenciando as bandas formadas pelos primers PR -A (100bps) e PR-B (200 bps) A curva de diluição seriada segundo as porcentagens de metilaçã o adicionadas estão apresntadas nas figuras 8 e 10, em que pode-se observar a separação das curvas de acordo com sua porcentagem de metilação.A analises da porcentagem de metilaçao dos genes PR-A e PR-B estão evidenciada pela técnica HRM estão apresentas nas Figura s 9 e 11. 200 bps 100 bps 44 Figura 8 . Curva de diluição seriada de controle de DNA padrão com diferentes porcentagens de metilação para isoforma PR-A. Figura 9. Resultado do HRM para isoforma PR-A 45 Figura 10 . Curva de diluição seriada de controle de DNA padrão com diferentes porcentagens de metilação para isoforma PR-B. Figura 11. Resultado do HRM para isoforma PR-B. 46 O observado nas figuras foi transposto para a Tabelas 3 e 4 para facilitar a interpretação dos resultados. Tabela 3. Avaliação comparativa das porcentagens de metilação entre as isofo rmas PR- A e PR-B em pacientes inférteis com endometriose. Amostra % aproximada de Metilação (PR-A) % aproximada de Metilação (PR-B) 2 0% 50% 3 0% 0-20% 5 0% 50% 12 0% 50% 14 0% 80% 22 0% ND 25 0% 0-20% 26 0% 50% 27 0% 50% 28 0% 50% 32 0% 50% *ND - representa amostra que não mostrou amplificação, portando não sendo lida durante o procedimento Podemos observar que no grupo endometriose , a isoforma PR-A encontra -se hipometilada com 0% porcentagem de metilaçao , Contudo a isoforma PR-B mostrou-se parcialmente metilada na maioria das pacientes com porcentagem de metilaçao de 50% (n=8), somente uma paciente apresentou 80% de metilacão na isoforma B. 47 Tabela 4. Avaliação comparativa das porcentagens de metilação entre as isoformas PR - A e PR-B em pacientes inférteis sem endometriose (Controle Infértil). Amostra % aproximada de Metilação (PR-A) % aproximada de Metilação (PR-B) 4 0% 0-20% 6 0% 50% 8 0% 50% 9 0% 0-20% 10 0% 0-20% 13 0% ND 15 0% 0-20% 17 0% 0-20% 19 0% 0-20% 20 0% ND 21 0% ND 31 0% 0-20% *ND representa amostra s que não mostr am amplificação, portan do não sendo lidas durante o procedimento Observando o resultado obtido no grupo controle , a isoforma PR -A se mostrou hipometilada, contudo a isoforma PR-B mostrou diferentes níveis de metilação também neste grupo, porém as porcentagens variando somente na ampliação de 0 a 50% com a maioria das pacientes com metilação de 0 -20% (n=7) e duas com porcentagem igual a 50%. A Figura 12 correlaciona os dados obtidos em ambos os grupos . 48 Figura 12. Gráfico comparativo das porcentagens de metilação da isoforma PR -B nos grupo endometriose e controle infértil *ND – Amostras que não mostraram amplificação durante o experimento Analisando a isoforma PR -B, o grupo controle infértil mostrou a maioria das pacientes com metilação em somente 0-20% das ilhas CpGs do gene. Já no grupo endometriose, a maioria das pacientes mostrou metilação em 50% das ilhas CpGs. Para quantificar estatisticamente foi realizado o teste exato de Fisher para comparação das porcentagens de m etilação entre os grupos pa ra a isoforma e PR-B e o resultado está demonstrado na Tabela 5. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0-20% 50% 80% ND Número de Pacientes Porcentagem de Metilação Endometriose Controle Infertil 49 Tabela 5. Teste exato de Fisher para avaliação estatística da comparação das porcentagens aproximadas de metilação da isoforma PR -B entre pacientes inférteis com e sem endometriose PR-B Porcentagem (%) Metilação Controle Infértil Endometriose Total 0 - 20% 7 2 9 77,8% 20,0% 50% 2 7 9 22,2% 70,0% 80% 0 1 1 0,0% 10,0% Total 9 10 19 Valor p* 0,04 P*=nível de significância A análise estatística nos permite verificar uma diferença significativa (p = 0,04) entre os grupos. Confrontando os dados , observamos que no grupo Controle I nfértil a prevalência de pacientes com porcentagem entre 0 -20% de metilação é de 77,8% comparando-se com o grupo Endometriose , enquanto que no grupo Endometriose a prevalência de porcentagem de metilação de 50% é de 70% em relação ao grupo Controle Infértil. 50 7. Discussão A endometriose é um a doença ginecológica que est á vinculada à infertilidade, contudo as relações de causa e efeito não estão plenamente estabelecidas. A resistência à progesterona é uma condição apresentada por grande parte das pacientes portadoras de endometriose e colabora para a infertilidade apresentada neste grupo [45]. A atuação deste hormônio ocorre através de seus receptores que encontram -se com sua expressão suprimida em pacientes com endometriose[45]. É sabido que a região promotora do PR- B encontra-se parcialmente metilada em pacientes com endometriose [49] contudo, nenhuma pesquisa objetivou-se em avaliar o perfil epigenético deste gene em pacientes inférteis com endometriose e elucidar seu possível papel no comprometimento da receptividade endometrial e, consequentemente, na infertilidade apresentada por grande parte das portadoras da doença . A baixa contagem de receptores de progesterona pode ser o elo de ligação entre infertilidade e endometriose e a investigaçao do perfil epigenético dos promotores do gene que codificam para os receptores de progesterona se faz importante para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nessa doença. Em nosso trabalho , confrontamos um grupo de pacientes infért eis com endometriose a um grupo infértil sem endometriose. Encontramos que , na endometriose, o gene PR-B encontra-se p arcialmente metilado (50%) na região analisada. Diferentemente, nas pacientes inférteis sem endometriose , observou-se uma menor porcentagem de metilação (0-20%) na região analisada do gene PR-B, o que sugere que a doença possa estar afetando diretamente a expressão desta isoforma . O gene PR-B, que codifica para a isoforma B, é um ativador transcricional dominante dos 51 promotores sensíveis à progesterona [54]. Sabe-se que a progesterona é o esteroide predominante da fase secretora e controla todas as alteraçõ es moleculares que promovem o estabelecimento da receptividade endometrial e propiciam a interação entre o endométrio e o embrião visando a implantação embrionária [64]. Sua ação se dá em ligações específicas ligante -receptor, que de sencadeiam uma cascata gênica cujos transcritos atuam autocrina, parácrina ou endocrinamente , com consequentes alterações histológicas, moleculares e funcionais [64]. Já é sabido que a metilação do promotor leva à diminuiçao da expressão ou até ao sil enciamento total do gene [59]. Esta maior porcentagem de metilação observada possa estar contribuindo para as alterações no endometriais, e consequentemente afetando a implantação embrionária e a fertilidade destas pacientes. Ainda, visto que o grupo controle é constituído por pacien tes inférteis sem endometriose, com critérios restritos de elegibilidade, o aumento da porcentagem de metilação nas pacientes inférteis com endometriose pode ser atribuído à presença da doença. O estudo de Wu, et al. 2006 [49] utilizou a técnica Methilation Specific PCR (MSP), que analisa a metilação do DNA através da técnica de PCR utilizando primers específicos para o DNA metilado e outro para o segmento nao metilado , para avaliar a metilação do gene PR-B em amostras de células epiteliais de focos endometrióticos de pacientes com a doença, tendo encontrado que a isoforma apresentava bandas de DNA metiladas e não metiladas , sugerindo que a região promotora d o PR-B tem uma tendência a estar parcialmente metilada na endometriose, resultado confirmado a través de sequenciamento e que vai ao encontro do que observamos em nosso estudo. No entanto, o foco destes autores foi avaliar o papel da metilação deste gene na patogenia da endometriose e não da infertilidade associada a essa condição , uma vez que inclu iu 52 pacientes com a doença independentemente da presença de infertilidade e avaliou os implantes ectópicos ao invés do endométrio eutópico. O gene PR-A por sua vez, atua como modulador da transcrição, podendo reprimir a atividade transcricional do próprio PR-B e de outros receptores esteroides [49[54]] . Em nosso grupo de estudo o ge ne que expressa esta proteína não mostro u sinais de metilação em seu promotor , sugerindo não haver alterações na sua expressão . No estudo de Wu et al.[49] o gene PR-A também mostrou-se não metilado revelando, possivelmente, que na endometriose não há interferência quanto à metilação desse gene. Em um trabalho recente, [60] nosso grupo avaliou ultraestruturalmente o endométrio eutópico de pacientes inférteis com e sem endometriose mínima/leve (também incluídas no presente estudo) durante a janela de implantação , com o objetivo de avaliar a presença e o desenvolviment o de pinopodes, estruturas epiteliais que parecem ser importantes marcadores ultraestruturais de receptividade endometrial [62] , apontados como biomarcadores clássicos da janela de implantação no epitélio endometrial humano [63]. O desenvolvim ento destas estruturas est á associado à concentração de progesterona e a seus receptores [61]. Em uma análise descritiva, f oi observado o predomínio de pinopodes em regressão e menor porcentagem de pinopodes desenvolvidos e em desenvolvimento em pacientes inférteis co m endometriose inicial comparadas a um grupo controle infértil , porém, sem endometriose. Isto sugere uma assincronia na expressão destas estruturas em pacientes inférteis com endometriose e consequente interferência na implantação e fertilidade destas pacientes[60]. Uma vez que o desenvolvimento dos pinopodes est á vinculado à atuação da progesterona através de seus receptores , podemos observar um paralelo interessante entre o aumento da metilação da isoforma PR -B, receptor dominante na atuação da 53 progestetona no interior da célula [54], e o declínio da presença e desenvolvimento de pinopodes no endométrio eutópico de pacientes inférteis com endometriose[60]. A alteração no desenvolvimento de pinopodes num grupo com amostras também incluídas neste estudo corrobora a idéia de que a metilação parcial do promotor do PR-B pode interferir em sua expressão, acarretando em comprometimento da receptividade endometrial (alterações dos pinopodes) e consequentemente , d a fertilidade da paciente. Para conclusões mais precisas, futuros estudos sobre a expressão do gene PGR, em especial do gene que codifica para a isoforma B, o PR-B, em pacientes inférteis com endometriose seria importante para confirmar os presentes achados e aprofundar o entendimento da metilação deste gene como um mecanismo envolvido na etiopatogênese da infertilidade associada à endometriose . C ontudo, os dados aqui mostrados indicam que há um importante aumento da metilação da região promotora do gene PR-B em pacientes inférteis com endometriose , e no s permitem sugerir que a metilação parcial na região promotora d esse gene possa resultar em alterações na expressão desse gene e tradução da sua proteína, levando a crer que fatores epigenéticos possam estar envolvidos no comprometimento da fertilidade das mulheres com endometriose. 54 8.Conclusão Concluímos que o promotor do gene que expressa o receptor de progesterona (isoforma PR -B) encontra -se parcialmente metilado em pacientes inférteis com endometriose, de maneira distinta de pacientes com endometriose e sem infertilidade. A metilação parcial deste promotor pode causar alterações na expressão deste gene e influenciar diretamente a resposta das células endometriais à progesterona , consequentemente, impactando a implantação embrionária e a fer tilidade desta s pacientes. 55 9.Referências Bibliográficas 1. 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Furtado, C.L.M.; Navarro, P.A.A.S.; Meola, J. Ferriani, R.A. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP – USP Depto. De Ginecologia e Obstetrícia RESUMO Objetivo: A infertilidade esta associada á ate 50% das pacientes com endometriose, contudo esta relação não tem suas causas bem estabelecidas. A receptividade á progesterona encontra -se suprimida nestas pacientes e a regulação da expressão de seus receptores, expressos pelo gene PGR em duas isoformas (PR-A e PR- B) pode estar sob modulação epigenética. Este trabalho objetivou avaliar o padrão epigenético da região promotora do gene PGR em mulheres inférteis com endometriose durante a fase secretora do cilco menstrual comparado com mulheres inférteis sem endometriose no mesmo período. Metodologia: Biópsias endometriais foram obtidas de 27 pacientes divididas em dois grupo, endometriose e contre infértil. Sangue de cada pacientes foi coletado para dosagem sérica de prog esterona. Parte de cada amostra foi enviada para avaliação histológica para validação do período menstral.O restante de cada biopsia foi utilizada para extração de DNA. O DNA oi extraído com KIT e 63 posterior a isso foi submetido á tecnica de modificação por bissulfito de sódio. Ao final todas as amostras de DNA modificado foram utilizadas para a tecninca de High Melting Resolution (HRM). A análise estatística realizada foi o teste exato de Fisher. Resultados: A isoforma A não apresentou alteração em sua meti lação sugerindo que na endometriose não há interferência quanto á metilação na expressão da isoforma PR -A. A isoforma B apresentou-se parcialmente metilada (50% da região promotora) no grupo endometriose, o que pode levar á redução da expressão do receptor afetando a fertilidade das pacientes diagnosticadas com endometriose. INTRODUÇÃO Endometriose e infertilidade A endometriose é uma doença ginecológica benigna caracterizada pela presença e crescimento de tecido endometrial ectópico funcional que acomet e entre 10 a 15% das mulheres no período reprodutivo[1]. O tecido ectópico é histologicamente semelhante ao endométrio de mulheres sem endometriose e ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Contudo estes tecidos podem ser distintos tanto bioquímica quanto funcionalmente, incluindo sua receptividade a esteroides, pot encial proliferativo e invasivo [2]. O tecido endometriótico é comumente encontrado na cavidade pélvica, no peritônio pélvico, ovários, septo reto -vaginal, pericárdio, pleura, fígado, rim, bexiga, cérebro e raramente em homens[3]. A apresentação clínica da endometriose é caracterizada por dismenorréia, dispareunia (dor durante o ato sexual), dor pélvica não cíclica e infertilidade [4]. 64 Contudo a endometriose pode se mostrar assintomática em 2 a 22% das mulheres. Já a ocorrência de endometriose em mulheres com dismenorréia é de 40 a 60%[5]. A laparoscopia é o método padrão -ouro para o diagnóstico da doença , mas é fortemente sugestiva por meio de exames ginecológicos, ultra-sonografia transvaginal e a ressonância magnética[6]. De acordo com a American Society for Reproductive Medicine , os implantes peritoneais e ovarianos podem ser qualificados em lesões vermelhas, negras e brancas. Além disso, para melhor diagnosticar a evolução da doença, esta mesma entidade elaborou um sistema de classificação da endometriose em quatro estádios mundialmente aceitos: forma mínima (estádio I), leve (II), moderada (III) e severa (IV). Esta análise se baseia em um sistema de escores unificados nos quatro estádios, na avaliação percentual e volume das lesões. Contudo, este método de classificação, que é feito de acordo com a observação de cada patologista, pouco pode predizer a chance de gravidez após terapia[7]. Algumas teorias tentam explicar as causas da endometriose. A mais aceita delas foi proposta em 1927 por Sampson, é a teoria da implan tação metastática, que procura explicar a endometriose através do refluxo menstrual via tuba uterina para dentro da cavidade abdominal, onde algumas células conseguem se implantar. Esta é a teoria mais aceita devido ao fato d o fluxo menstrual retrógrado oc orrer em 90% das mulheres [10], da presença de células epiteliais endometria is viáveis no fluido peritoneal [11] e da associação entre fluxo menstrual obstruído e endometriose[12]. Embora a teoria de Sampson seja a mais aceita, somente o refluxo tubário não basta para que a endometriose se estabeleça, pois 90% das mulheres possuem o refluxo menstrual e somente 10 a15% desenvolvem a doença. 65 A infertilidade está associada à endometriose e ocorre em 30 a 50 % das mulheres com esta desordem [21], contudo esta associação não est á completamente elucidada[22]. Estudos corroboram a diminuição da fecundidade em portadoras de endometriose[23]. Entretanto os mecanismos envolvidos na sua etiopatogênese, principalmente nos casos de endometrios e mínima e leve, nas quais não se observa alteração mecânica do trato reprodutivo, ainda não foram esclarecidos[21]. Alguns autores sugerem a ocorrência de meno res taxas de fertilização, implantação e gestação em pacientes portadoras de endometriose [24, 25] . Este fato poderia ser decorrente do comprometimento da qualidade oocitária e, con sequentemente, embrionária e/ou de defeitos endometriais ou ainda da interação entre o endométrio e o embrião[26-28]. Evidências sugerem que defeitos funcionais do endométrio possam contribuir com a diminuída fecundidade apresentada por pacientes com esta doença[29]. Estudos moleculares sobre a falha de implantação emb rionária em pacientes com endometriose sugerem a ocorrência de alterações na expressão e tradução de genes do endométrio eutópico envolvidos no processo de implantação [30]. Os receptores de progesterona, fatores de transcrição, enzimas envolvidas no metabolismo de esteroides, entre outros, são genes com expressão aberrante na endometriose durante o período favorável à implantação (janela de implantação) [31]. Entretanto, não há estudos com casuísticas e metodologias adequadas que nos permitam o completo entendimento dos mecanismos envolvidos na redução da fecundidade e potencial piora dos resultados dos procedimentos de reprodução assistida em portadoras de infertilidade r elacionada à endometriose. 66 Receptividade endometrial e epigenética O endométrio humano passa por mudanças histológicas e estruturais ao longo do ciclo menstrual, que viabilizam a implantação do embrião e o desenvolvimento de uma gestação, contudo, o endométrio apenas se torna receptivo 6 -10 dias após o pico de LH da fase secretora média. [36, 37]. Durante este período receptivo do ciclo menstrual, ocorre no tecido eutópico do endométrio uma maior expressão de diversos fatores de crescimento, citocinas, moléculas de adesão e receptores de hormônios, envolvidos diretamente no processo de implantação embrionária [37]. Irregularidades no controle da expressão gênica, incluindo modificações epigenéticas, podem resultar em expressão aberrante de genes e/ou proteínas reguladoras do crescimento e diferenciação e ndometriais. Os receptores hormonais para progesterona são susceptíveis à modulação epigenética por possuírem em seus promotores regiões passíveis de receberem metilação [32]. Uma outra teoria tem sido formada sobre a etiologia da endometriose, somando - se aos fatos já conhecidos de que a endometriose seja uma doença hormonal com anomalias imunológicas, podendo estar relacionada com alterações ambientais e com a predisposição genética. Estudos mostram que alguns genes estão desregulados na endometriose e qu e essas alterações na expressão gênica estariam relacionadas aos mecanismos epigenéticos de controle, como a metilação do DNA [38]. Em pacientes com endometriose foi demonstrado que as DNA metil-transferases (DNMT) encontram-se superexpressas no epitélio de implantes endometrióticos quando comparados a um grupo controle sadio ou com tecido endometrial eutópico em mulheres com endometriose, sendo que neste último teci do somente a DNMT3A está 67 superexpressa. Com base nestes dados acredita -se que a hipermetilação ocorra na endometriose[45]. Receptores de Progesterona A progesterona é um hormônio esteroide que atua neutralizando o efeito de estimulação do crescimento d o estrógeno pela indução da diferenciação glandular e estromal do endométrio. A resistência à progesterona é comumente observada em pacientes portadoras de endometriose e este fato pode ser atribuído a níveis extremamente baixos de receptores deste hormôni o em tecido endometriotico [45], contudo não há estudos que confrontem dados de pacientes inférteis com endometriose e a diminuição dos receptores. O gene PGR codifica o receptor de progesterona, é membro da superfamília dos receptores nucleares e necessá rio para a implantação embrionária e subsequentemente para a decidualização. Localizado na região cromossômica 11q22 -q23 e com oito exons [56], e ste gene possui dois diferentes promotores e sítios de inicio de tradução no primeiro éxon que produz duas isoformas, A e B Nos humanos existem duas distintas isoformas do receptor de progesterona denominados PR-A e PR-B, ambos codificados por um único gene e diferem entre si pela isoforma PR-B conter 164 aminoácidos N-terminal. A função do PR-B é ser um ativador transcricional dominante dos promotores sensíveis à progesterona, enquanto o PR-A atua como um repressor dominante sobre o PR-B e outros receptores de esteroides (estrogênio, andrógeno, receptores glucocorticóides e mineralocorticoides). Portanto a express ão relativa de PR-A/PR-B determina, em partes, a característica celu lar de responder à progesterona [54]. Embora 68 sejam expressos pelo mesmo gene, cada uma de suas isoformas possui uma região promotora distinta[52]. No endométrio, o nível de ambas isoformas aumenta progressivamente durante a fase proliferativa , pico imediatamente anterior à ovulação e diminui logo após a ovulação, sugerindo que o estradiol estimule os níveis de PR [45].Contudo, a PR -B é indetectável e a PR -A é notadamente reduzida em tecidos endometrioticos. A baixa relação PR -A/PR-B tem sido sugerida como um dos possíveis mecanismos de resistência à progesterona na endometriose. Um estudo demonstrou que o promotor do gene PGR para a isoforma PR-B esta hipermetilado em suas ilhas CpG, em tecidos endometrióticos de pacientes com endometriose em estágios II a IV. Este fato é concomitante com a redução da expressão do PR-B, sugerindo então uma regulação epigenética na expressão e silenciamento da isoforma PR-B [49] OBJETIVO Avaliar o padrão de metilação do receptor de progesterona das isoformas A (PR - A) e B (PR -B) do gene ( PGR) em tecido endometrial eutópico de pacientes com infertilidade relacionada à endometriose durante a fase secretora de seu ciclo menstrua l comparado ao tecido endometrial eutópico de mulheres inférteis sem endometriose na mesma fase do ciclo. METODOLOGIA Trata-se de um estudo caso controle comparativo de pacientes inférteis com endometriose comparadas a mulheres controles inférteis sem endometriose.Foram 69 incluídas pacientes que preencheram os critérios de inclus ão preestabelecidos e consentiram em participar do estudo após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, aplicado na sala de espera do Centro Cirúrgico do Hospit al das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP). Foram avaliadas 23 pacientes, divididas em dois grupos: C ontrole infértil ( 12 pacientes) e endometriose (11 pacientes).Amostras endometriais de todas as pac ientes foram ob tidas com uso de cureta de Pipel le, após a realização da como parte da propedêutica da infertilidade conjugal (controle infértil e infertilidade relacionada à endometriose), de acordo com os protocolos assistenciais do Setor de Reprodução Humana-DGO-FMRP-USP. O estudo foi realizado ju nto ao Laboratório de Ginecologia - Setor de Reprodução Humana do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – FMRP-USP e Laboratório de Biologia da Reprodução do Multiusuário – FMRP-USP. Foram inc luídas para o gr upo controle infértil mulheres com infertilidade por fator masculino e/ou tubário, ciclos menstruais regulares, submetidas à laparoscopia diagnóstica, excluindo a presença de endometriose, doença inflamatória pélvica e outras anormalidades pélvicas, e idade entre 18 e 45 anos. No grupo endometriose, mulheres com infertilidade relacionada à endometriose sem outros fatores de infertilidade, diagnosticada com qualquer estágio da doença durante a videolaparoscopia diagnóstica, segundo os critérios definidos pel a American Society for Reproductive Medicine (1997), que classifica a doença em quatro estágios: mínima (estádio I), leve (estádio II), moderada (estádio III) e grave (estádio IV); ciclos menstruais regulares e idade entre 18 e 45 anos. 70 Foram critérios de exclusão Obesidade, definida pelo índice de massa corporal (IMC) maior ou igual a 30 Kg/m²; presença de doenças sistêmicas tais como: D iabetes mellitus ou outras endocrinopatias, doença cardiovascular, lupus eritematoso sistêmico e outras doenças reumatol ógicas; infecção pelo vírus HIV ou qualquer infecção ativa; tabagismo, alcoolismo ou drogadição; uso de medicações hormonais e de antiinflamatórios hormonais e não -hormonais nos três meses anteriores à inclusão no estudo. Coleta e processamento do material: Foram revisados os prontuários das pacientes que buscaram os serviços de reprodução humana do Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto onde foram selecionadas as pacientes que previamente foram submetidas à videolaparoscopia diagnóstica a menos de 2 anos ou laqueadura tubaria, que atenderam aos critérios de inclusão e exclusão e possuíam ciclos menstruais normais (intervalos de 24 a 32 dias ± 3 dias; 2 a 7 dias de duração e fluxo de até 80 mL por ciclo) . A biopsia endometrial foi realizada ambulatoriamente por médico experiente em data agendada conforme o ciclo individual de cada paciente coincidindo com a fase secretora de seus ciclos menstruais (do 15º ao 26º dia do ciclo).Para a confirmação de que a biópsia endometrial foi realizada no período secretor, todas as amostras foram submetidas à análise histológica clássica com coloração hematoxilina -eosina ( HE) e a determinação da fase se cretora do ciclo menstrual foi adequada de acordo com o resultado da datação endometrial, segundo os critérios de Noyes (No yes et al.,1975), realizada por um patologista, considerado o intervalo de 28 dias como o de um ciclo menstrual ideal. Imediatamente após a coleta, as amostras de endométrio foram armazenadas a -80Cº imersas em PBS. 71 Extração do DNA e Eletroforese: A extração de DNA foi realizada utilizando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, 51304). Pedaços de ate 25mg de cada amostra de endométrio foram cortados e acrescidos de proteinase K e seu buffer, posteriormente colocados em banho -maria a 56ºC até que o tecido estivesse totalmente digerido. O material foi transferido para coluna e centrifugado, com isso o DNA se aderiu à membrana da mesma. Sucessivas lavagens foram feitas com as soluções apresentadas pelo kit para purificação do DNA extraído e ao final foi realizada a elu ição do material genômico aderido à membrana com água aquecida a 56ºC . O DNA extraído foi mantido congelado a -20ºC. O DNA extraído foi então avaliado pela técnica de eletroforese em gel de agarose a 2% para avaliar sua integridade. Modificação por Bissulfito de Sódio: A seguinte etapa foi a modificação do material genomico pela tecninca do bissulfito de sódio. Esta modificado permite a conversão in vitro das citosinas não metiladas presentes na molécula de DNA em uracilas para assim ser possível a análise do padrão de metilação pela presença das citosinas metiladas que permaneceram no DNA após a modificaçã o. Para tanto foi utilizado o EpiTec Bissulfite Kit (Qiagen, Hilden Germany) . C onforme especificações do fabricante 1,5 µg de DNA de c ada amostra foram utilizados para a modificação, acrescidos de bissulfite mix e protect buffer, oferecidos pelo fabricante, em tubos para PCR. A mistura foi levada ao termociclador segundo especificações do kit onde se da a modificação do DNA. Ao termino da ciclagem o material presente nos tubos foi levado para colunas onde o DNA, agora já modificado, se prende à membrana presente na coluna e através de sucessivas 72 centrifugações e lavagens, com buffers oferecidos pelo kit purificando o DNA. A eluição do mat erial aderido á membrana foi realizada finalmente com o buffer de eluição fornecido pelo fabricante. O DNA modificado foi estocado á -20º Cº. High Resolution Melting (HRM): Após a modificação por bissulfito, foi empregada a técnica de High Resolution Melting (HRM) onde a princípio o DNA passa por amplificação através de PCR Real Time. Nesta amplificação, as uracilas presentes na molécula de DNA modificado são copiadas nos novos fragmentos como timina, portanto onde inicialmente no DNA genômico encontrávamo s uma citosina, base nitrogenada pirimídica, passamos a encontrar uma timina, base nitrogenada purica. Logo em seguida este produto de PCR recém sintetizado passa por um aumento sucessivo e gradual de temperatura até 95 ºC para se observar o ponto de dissociação da dupla fita dos fragmentos. A temperatura em que ocorre essa dissociação é chamada de ponto de melting e através dela podemos estimar o grau de metilação do DNA. A porcentagem de metilação é estimada na temperatura de dissociação pois, quanto maior o número de timinas , mais fácil se dará sua dissociação pois se tratando de uma base púrica realiza somente 2 ligações de hidrogênio no pareamento com a base da fita homologa de DNA. Ou seja quanto mais timinas encontramos no fragmento de DNA, mais ba ixo seu ponto de dissociação. Em contrapartida, quanto mais citosinas, mais tarde se dará sua dissociação, já que esta sendo uma base pirimídica realiza 3 ligações de hidrogênio, o que torna a fita de DNA mais estável em relação a uma fita rica em timinas e pobre em citosinas [57]. 73 Para esta técnica foram utilizados 2,5 µl de DNA modificado pelo tratamento de bissulfito de sódio de cada uma das amostra, 10 µl de MeltDoctor (Applied Biosystems) e 1 µl de cada oligonucleotideos iniciadores (Primers). Os Primers aqui utilizados foram baseados nos já descritos por Wu et al.[49] que se anelam nas regiões em que se encontram os promotores das isoformas . Junto às amostras, na mesma placa, foi acrescentada uma curva de referência com controles já conhecidos por estarem 0%, 20%, 50%, 80% e 100% metilados, pertencentes ao kit PCR control DNA Set (Quiagen). A placa contendo todas as amostras e a curva de referência foi levada ao termociclador 9500 FAST onde ocorre a amplificação do DNA modificado e a leitura do seu ponto de melting. Analise dos Resultados Obtidos por HRM e Analise estatística Os dados obtidos pelo HRM foram lidos pelo programa HRM Software que nos mostra a porcentagem de metilação encontrada em cada amostra. Para comparação das porcentagens de meti lação das isoformas PR -A e PR -B dos grupos amostrais foi realizado o teste exato de Fisher Dosagem sérica de progesterona: No momento de cada coleta de endométrio, foi também coletado sangue de cada uma das pacientes para dosagem sérica do nível de progesterona, afim de se confirmar a ovulação, confirmando assim que as coletas foram realizadas na fase secretora do ciclo menstrual (progesterona ≥3 ng/ml). A dosagem foi realizada por quimiluminescência com o kit IMMULITE 2000 (Siemens). 74 RESULTADOS Após a extração do DNA e validação de sua integridade em eletroforese, a modificação por bissulfito de sódio foi realizada como descrito na metodologia e em seguida foi realizada a técnica HRM ( High Resolution Melting ) onde foi avaliada, em relação a uma curva padrão, a porcentagem de metilação das isoformas A e B de cada amostra. O observado no HRM foi submetido á analise estatística através do teste exato de Fisher e esta disposto na Tabela 1 Tabela 1 . Teste exato d e Fisher para avaliação estatística da comparação das porcentagens aproximadas de metilação da isoforma PR -B entre pacientes inférteis com e sem endometriose % aproximada de Metilação (PR-B) Controle Infértil Endometriose Total 0 - 20% 7 2 9 77,8% 20,0% 50% 2 7 9 22,2% 70,0% 80% 0 1 1 0,0% 10,0% Total 9 10 19 Valor p 0,04 A analise estatística nos permite verificar uma diferença significativa (p < 0,05) entre os grupos. Confrontando os dados observamos que no grupo Controle Infértil a prevalência de pacientes com porcentagem entre 0 -20% de metilação é de 77,8% comparando-se com o grupo Endometriose, enquanto que no grupo Endometriose a 75 prevalência de porcentagem de metilação de 50% é de 70% em relação ao grupo Controle Infértil. DISCUSSÃO Como visto anteriormente a baixa contagem de receptores de progesterona pode ser o elo de ligação entre infertilidade e endometriose e para tanto nos propomos a estudar o perfil epigenético dos promotores do gene que sintetizam tais receptores (isoformas PR-A e PR-B), visando a metilação deste gene. A isoforma PR -A do gene PGR atua como modulador transcrição da isoforma PR-B além de outros hormônios esteroides [54 ]. Em nosso grupo de estudo o gene que expressa esta proteína não mostrou sinais de metilação em seu promotor, sugerindo não haver alterações na sua expressão quando empregada a técnica de HRM. No estudo de Wu, Y., et al.[49] foi realizada a técnica de Me thilation Specific PCR (MSP), que analisa a metilação do DNA através de uma PCR sensível a metilação, em células epiteliais de focos endometrióticos. Neste estudo a isoforma PR -A também não mostrou sinais de metilação revelando possivelmente que na endometriose não há interferência quanto á metilação na expressão da isoforma PR-A. A isoforma PR-B, ativador transcricional dominante dos promotores sensíveis à progesterona, contudo mostrou -se parcialmente metilada nas pacientes inférteis com endometriose com 70% do grupo com 50% de metilação no promotor gene. No grupo controle infértil a metilação apresentou -se em 0 -20% do promotor do gene em 77,8% das pacientes contidas neste grupo. Já é sabido que a metilação do promotor leva á depressão da expressão ou até ao silênciamento total do gene[59]. Como o grupo 76 controle é constituído por pacientes inférteis sem endometriose podemos sugerir que o aumento da metilação pode ser atribuído á presença da endometriose. O estudo de Wu, Y., et al.[49] utilizou a técnica MSP também para avaliar a metilação da isoforma PR -B nas mesmas amostras de células epiteliais de focos endometrióticos. Foi encontrado que a isoforma apresentava bandas de DNA metiladas e não metiladas sugerindo fortemente que a região promotora da PR -B tem uma tendência á estar parcialmente metilada na endometriose, resultado confirmado através de sequenciamento e que vai de encontro com o que observamos em nosso estudo. O trabalho de Da Broi, M.G., et al [60] avaliou ultraestruturalmente o endométrio eut ópico de pacientes inférteis com e sem endometriose mínima/leve durante a janela de implantação no mesmo grupo de pacientes aqui analisado. O foco deste estudo foi avaliar a presença e o desenvolvimento de pinopodes, estruturas epiteliais responsáveis pela implantação[61]. O desenvolvimento destas estruturas esta associado à concentração de progesterona e a seus receptores[61]. Foi constatado neste estudo o predomínio de pinopodes regredindo e menor porcentagem de pinopodes desenvolvidos e em desenvolvimen to em pacientes inférteis com endometriose comparadas a um grupo controle infértil porém sem endometriose. Isto sugere uma assincronia na expressão destas estruturas em pacientes inférteis com endometriose e consequente interferência na implantação e ferti lidade desta pacientes[60]. Uma vez que o desenvolvimento dos pinopodes esta vinculado à atuação da progesterona através de seus receptores, podemos observar um paralelo interessante entre o aumento da metilação da isoforma PR -B, receptor dominante na atuação da 77 progestetona no interior da célula [54], e o declínio da presença e desenvolvimento de pinopodes no endométrio eutópico de pacientes inférteis com endometriose[60]. A alteração no desenvolvimento de pino podes num grupo com amostras idênticas ao abordado neste estudo corrobora a idéia de que a metilação parcial do promotor da isoforma PR -B foi suficiente para interferir em sua expressão, acarretando em uma resposta que afetou diretamente a implantação embr ionária (alterações dos pinopodes) e consequentemente a fertilidade da paciente. Para conclusões mais precisas, futuros estudos sobre a expressão do gene PGR, em especial da isoforma PR -B, em pacientes inférteis com endometriose seria importante. Contudo os dados aqui mostrados nos permitem sugerir que há uma importante relação entre a metilação da região promotora da isoforma PR -B em pacientes inférteis com endometriose e a fertilidade destas pacientes levando a crer que a endometriose possa mesmo ser uma doença causada por fatores epigenéticos e que a metilação parcial na região promotora do gene PGR isoforma PR -B foi suficiente para causar alterações na expressão de sua proteína. CONCLUSÃO Concluímos que o promotor do gene que expressa o receptor de pr ogesterona (isoforma PR -B) encontra -se parcialmente metilado em pacientes inférteis com endometriose. A metilação parcial deste promotor foi suficiente para causar alterações na expressão deste gene que influenciaram diretamente á resposta das células à progesterona e consequentemente impactando a implantação embrionária e a fertilidade destas pacientes.